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ES2839211T3 - Método para purificar proteínas de fusión a albúmina - Google Patents

Método para purificar proteínas de fusión a albúmina Download PDF

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ES2839211T3
ES2839211T3 ES16762595T ES16762595T ES2839211T3 ES 2839211 T3 ES2839211 T3 ES 2839211T3 ES 16762595 T ES16762595 T ES 16762595T ES 16762595 T ES16762595 T ES 16762595T ES 2839211 T3 ES2839211 T3 ES 2839211T3
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Mariko Fonseca
Christopher Thompson
Alan Hunter
Xiangyang Wang
Liu Tie
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MedImmune LLC
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Abstract

Un metodo para purificar una proteina de fusion a albumina, comprendiendo el metodo someter a una composicion que comprende una proteina de fusion a albumina a una matriz de interaccion hidrofoba y a uno o mas de los siguientes procesos de purificacion: (a) una matriz de afinidad, en donde se aplica un tampon de elucion que comprende octanoato a la matriz de afinidad; y/o (b) una matriz de intercambio anionico; en donde se lava una matriz de afinidad con un tampon de lavado que comprende: (1) de aproximadamente un 2 % a aproximadamente un 20 % de poliol, en donde el poliol se selecciona entre el grupo que consiste en 1,2-propanodiol, 1,3-propanodiol, 1,2-butanodiol, 1,3-butanodiol, 1,4-butanodiol, 1,6-hexanodiol y 2-metil- 2,4-pentanodiol; (2) sal de 0.05 M a 2.0 M, en donde la sal se selecciona entre cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, cloruro de litio, bromuro de sodio, bromuro de potasio y bromuro de litio; (3) sulfato de sodio de aproximadamente 0.02 M a aproximadamente 0.2 M; (4) de aproximadamente un 0.01 % a aproximadamente un 1 % de tensioactivo no ionico; (5) urea de aproximadamente 0.05 M a aproximadamente 1.0 M; o (6) nicotinamida de aproximadamente 0.02 M a aproximadamente 0.5 M, en donde la proteina de fusion a albumina purificada tiene menos de un 5 % de restos de triptofano oxidados en relacion con el numero de restos de aminoacido en la proteina.

Description

DESCRIPCIÓN
Método para purificar proteínas de fusión a albúmina
ANTECEDENTES
Campo
La presente divulgación se refiere, en general, a un método para purificar proteínas de fusión a albúmina que tienen bajos niveles de oxidación de los restos de triptófano y/o metionina de la proteína. Los bajos niveles de oxidación de estos restos permiten que la proteína de fusión a albúmina conserve su potencia y bioactividad relativas. La proteína de fusión a albúmina puede incluir armazones, tales como, por ejemplo, los procedentes del tercer dominio de fibronectina de tipo II de la tenascina C humana, que resultan de utilidad. La divulgación se refiere a los métodos para purificar las proteínas de fusión a albúmina, a las proteínas purificadas obtenidas del método y a composiciones que comprenden la proteína de fusión a albúmina purificada.
Antecedentes
El uso de proteínas como potenciales fármacos terapéuticos ha causado gran interés en los últimos años. Una desventaja de los fármacos proteínicos es que tienden a tener una corta semivida in vivo. Para superar este inconveniente, las proteínas y péptidos pueden conjugarse o fusionarse con otras moléculas. Una opción es extender la semivida mediante PEGilación, un proceso mediante el que se une covalentemente poli(etilenglicol) o PEG a una proteína mediante diversas químicas disponibles. Además de extender la semivida, la PEGilación también puede reducir la inmunogenicidad, probablemente debido a la protección de la superficie de la proteína por las una o más cadenas de PEG inertes. La desventaja de la PEGilación es que requiere una etapa de reacción de conjugación y normalmente una etapa de purificación adicional para retirar las cadenas de PEG sin reaccionar. A pesar de estos inconvenientes, la tecnología de PEGilación se ha empleado con éxito en varios fármacos biofarmacéuticos comerciales.
Una segunda opción para prolongar la semivida es la tecnología de proteínas de fusión. En este caso, la proteína terapéutica se fusiona genéticamente a una segunda proteína diseñada para prolongar la semivida in vivo. Esta opción proporciona una prolongación de la semivida similar a la PEGilación; sin embargo, no necesita de las etapas de fabricación adicionales (reacción de conjugación y purificación asociada) ya que la proteína de fusión se expresa y purifica como una sola entidad. Los ejemplos de proteínas de fusión incluyen fusiones con Fc, fusiones con transferrina y fusiones con albúmina. Todas estas proteínas se encuentran a altos niveles en el plasma humano, lo que mitiga el impacto de los niveles aumentados a causa del fármaco.
Además de los beneficios de la extensión de la semivida y la facilidad de fabricación, las proteínas de fusión también pueden tener la capacidad de aprovechar las estrategias de la plataforma para la purificación. Esto se debe a que en muchos casos, la proteína portadora representa una gran proporción de la proteína de fusión y por lo tanto, hay características fisicoquímicas similares entre diversas proteínas de fusión. Para que una estrategia de plataforma tenga éxito, las operaciones de purificación deben ser selectivas para la proteína portadora.
La presente divulgación se refiere a un método para purificar proteínas de fusión a albúmina.
La cita o el análisis de una referencia en el presente documento no debe interpretarse como una admisión de que esta representa la técnica anterior con respecto a la presente invención.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
La invención se define en las reivindicaciones adjuntas. Esta se refiere a un método para purificar una proteína de fusión a albúmina, comprendiendo el método someter a una composición que comprende una proteína de fusión a albúmina a una matriz de interacción hidrófoba y a uno o más de los siguientes procesos de purificación: (a) una matriz de afinidad, en donde se aplica un tampón de elución que comprende octanoato a la matriz de afinidad; y/o (b) una matriz de intercambio aniónico; en donde la matriz de afinidad es lava con un tampón de lavado que comprende: (1) de aproximadamente un 2 % a aproximadamente un 20 % de poliol, en donde el poliol se selecciona entre el grupo que consiste en 1,2-propanodiol, 1,3-propanodiol, 1,2-butanodiol, 1,3-butanodiol, 1,4-butanodiol, 1,6-hexanodiol y 2-metil-2,4-pentanodiol; (2) sal de 0.05 M a 2.0 M, en donde la sal se selecciona entre cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, cloruro de litio, bromuro de sodio, bromuro de potasio y bromuro de litio; (3) sulfato de sodio de aproximadamente 0.02 M a aproximadamente 0.2 M; (4) de aproximadamente un 0.01 % a aproximadamente un 1 % de tensioactivo no iónico; (5) urea de aproximadamente 0.05 M a aproximadamente 1.0 M; o (6) nicotinamida de aproximadamente 0.02 M a aproximadamente 0.5 M, en donde la proteína de fusión a albúmina purificada resultante tiene menos de un 5 % de restos de triptófano oxidados en relación con el número total de restos de aminoácido en la proteína. La invención también se refiere a composiciones y a formulaciones farmacéuticamente aceptables que pueden obtenerse como resultado del método.
SUMARIO DE LOS ASPECTOS GENERALES DE LA DIVULGACIÓN
Más allá del alcance de la invención, que se define por las reivindicaciones adjuntas, la presente divulgación también proporciona un marco más genérico para proporcionar métodos para reducir la oxidación del triptófano y/o la metionina durante la purificación de una proteína de fusión a albúmina. Por tanto, la presente divulgación se refiere a un método para reducir la oxidación del triptófano y/o la metionina durante la purificación en una proteína de fusión a albúmina, comprendiendo el método someter a una composición que comprende la proteína de fusión a albúmina a los siguientes procesos de purificación: (a) una matriz de afinidad; (b) una matriz de intercambio aniónico, en donde la proteína de fusión a albúmina se eluye de la matriz de afinidad aplicando un tampón de elución que comprende octanoato.
En aspectos adicionales, la divulgación del presente documento se refiere a un método para reducir la oxidación del triptófano y/o la metionina durante la purificación en una proteína de fusión a albúmina, comprendiendo el método someter a una composición que comprende la proteína de fusión a albúmina a los siguientes procesos de purificación: (a) una matriz de afinidad; (b) una matriz de intercambio aniónico, en donde la matriz se lava con un tampón de lavado que comprende: (1) de aproximadamente un 2 % a aproximadamente un 20 % de poliol, en donde el poliol se selecciona entre el grupo que consiste en 1,2-propanodiol, 1,3-propanodiol, 1,2-butanodiol, 1,3-butanodiol, 1,4-butanodiol, 1,6-hexanodiol y 2-metil-2,4-pentanodiol; (2) sal de 0.05 M a 2.0 M, en donde la sal se selecciona entre cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, cloruro de litio, bromuro de sodio, bromuro de potasio y bromuro de litio; (3) sulfato de sodio de aproximadamente 0.02 M a aproximadamente 0.2 M; (4) de aproximadamente un 0.01 % a aproximadamente un 1 % de tensioactivo no iónico; (5) urea de aproximadamente 0.05 M a aproximadamente 1.0 M; o (6) nicotinamida de aproximadamente 0.02 M a aproximadamente 0.5 M.
En aspectos adicionales, la divulgación en el presente documento se refiere a un método para obtener una composición que comprende proteína de fusión a albúmina esencialmente exenta de restos de triptófano oxidados, comprendiendo el método someter a una composición que comprende proteínas de fusión a albúmina con triptófano oxidado y proteínas de fusión a albúmina con triptófano no oxidado a una matriz de interacción hidrófoba, en donde la proteína de fusión a albúmina con triptófano oxidado y la proteína de fusión a albúmina con triptófano no oxidado se eluyen de la matriz de interacción hidrófoba a diferentes tiempos, separando de este modo la proteína de fusión a albúmina con triptófano oxidado de la proteína de fusión a albúmina con triptófano no oxidado.
En ciertos aspectos, la divulgación en el presente documento se refiere a un método para aislar una proteína de fusión a albúmina esencialmente exenta de oxidación de restos de triptófano/metionina, comprendiendo el proceso someter a una composición que comprende una proteína de fusión a albúmina a los siguientes procesos de purificación: (a) un proceso de cromatografía de matriz de afinidad; (b) un proceso de cromatografía de intercambio aniónico; y (c) un proceso de cromatografía de matriz de interacción hidrófoba, en donde se aplica un tampón de elución que comprende octanoato a la matriz de afinidad y en donde la proteína de fusión a albúmina con triptófano oxidado y la proteína de fusión a albúmina con triptófano no oxidado se eluyen de la matriz de interacción hidrófoba a diferentes tiempos, separando de este modo la proteína de fusión a albúmina con triptófano oxidado de la proteína de fusión a albúmina con triptófano no oxidado. En aspectos adicionales, la divulgación en el presente documento se refiere a un método para purificar una proteína de fusión a albúmina, comprendiendo el método someter a una composición que comprende una proteína de fusión a albúmina a una matriz de interacción hidrófoba y a uno o más de los siguientes procesos de purificación: (a) una matriz de afinidad, en donde se aplica un tampón de elución que comprende octanoato a la matriz de afinidad; y/o (b) una matriz de intercambio aniónico; en donde la matriz de afinidad es lava con un tampón de lavado que comprende: (1) de aproximadamente un 2 % a aproximadamente un 20 % de poliol, en donde el poliol se selecciona entre el grupo que consiste en 1,2-propanodiol, 1,3-propanodiol, 1,2-butanodiol, 1,3-butanodiol, 1,4-butanodiol, 1,6-hexanodiol y 2-metil-2,4-pentanodiol; (2) sal de 0.05 M a 2.0 M, en donde la sal se selecciona entre cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, cloruro de litio, bromuro de sodio, bromuro de potasio y bromuro de litio; (3) sulfato de sodio de aproximadamente 0.02 M a aproximadamente 0.2 M; (4) de aproximadamente un 0.01 % a aproximadamente un 1 % de tensioactivo no iónico; (5) urea de aproximadamente 0.05 M a aproximadamente 1.0 M; o (6) nicotinamida de aproximadamente 0.02 M a aproximadamente 0.5 M, en donde la proteína de fusión a albúmina purificada resultante está esencialmente exenta de restos de triptófano oxidados.
En aspectos adicionales, la divulgación en el presente documento se refiere a un método para purificar una proteína de fusión a albúmina, comprendiendo el método: (a) aplicar una composición que comprende la proteína de fusión a albúmina a una matriz de afinidad; (b) eluir la proteína de fusión a albúmina de la matriz de afinidad de (a) para obtener un primer eluato; (c) aplicar el primer eluato a una matriz de intercambio aniónico; (d) eluir la proteína de fusión a albúmina de la matriz de intercambio aniónico para obtener un segundo eluato; (e) aplicar el segundo eluato a una membrana de intercambio aniónico;
hacer pasar la proteína de fusión a albúmina a través de una membrana de intercambio aniónico para obtener un flujo pasante; (f) aplicar el flujo pasante a una matriz de interacción hidrófoba;
eluir la proteína de fusión a albúmina de la matriz de interacción hidrófoba para obtener un tercer eluato, en donde el tercer eluato comprende la proteína de fusión a albúmina.
La divulgación en el presente documento también se refiere a una proteína de fusión a albúmina obtenida mediante cualquiera de los métodos divulgados en el presente documento.
La divulgación en el presente documento se refiere además a una composición que comprende una proteína de fusión a albúmina, en donde la composición tiene menos de 20 ng/mg de proteína de la célula hospedadora y en donde están oxidados menos de un 15 % de los restos de triptófano.
La divulgación en el presente documento se refiere adicionalmente a una composición que comprende una proteína de fusión a albúmina, en donde la composición tiene menos de 5x10-3 ng/mg de ADN y en donde los menos de un 15 % de restos de triptófano están oxidados.
La divulgación en el presente documento se refiere además a una composición que comprende una proteína de fusión a albúmina, en donde la composición tiene menos de 20 ng/mg de proteína de la célula hospedadora y en donde la proteína de fusión a albúmina tiene una actividad relativa de >90 %.
La divulgación en el presente documento también se refiere a una composición que comprende una proteína de fusión a albúmina, en donde la composición tiene menos de 5x10-3 ng/mg de ADN y en donde la proteína de fusión a albúmina tiene una actividad relativa de >90 %.
La divulgación en el presente documento se refiere además a una composición que comprende una proteína de fusión a albúmina de SEQ ID NO: 134, 135, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207 o 208, en donde la composición tiene menos de 20 ng/mg de proteína de la célula hospedadora y en donde el triptófano en la posición 46, 151 o en ambas no está oxidado. La divulgación en el presente documento también se refiere a una formulación farmacéuticamente aceptable que comprende: (a) cualquier composición divulgada en el presente documento; (b) un tampón, (c) un azúcar; y (d) un emulsionante.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La figura 1 representa un diagrama de flujo de una realización del proceso de purificación de rHSA.
La figura 2 representa un cromatograma representativo de cromografía por azul Cibacron para rHSA empleado a 300 cm/h.
La figura 3 representa un diagrama de flujo de una realización del proceso de purificación de la proteína de fusión a albúmina.
La figura 4 representa un cromatograma representativo de cromografía por azul Cibacron para la proteína de fusión a albúmina n.° 1 (AFP-1) empleado a 300 cm/h.
La figura 5 representa un cromatograma representativo de Capto Q para AFP-1 empleado a 300 cm/h.
La figura 6 representa un cromatograma representativo de membrana Mustang Q empleado a 10 VM/h.
La figura 7 representa un cromatograma representativo de Toyopearl PPG-600M empleado en modo de banda y elución a 130 cm/h.
Las figuras 8A-8B representan una cromatografía con colorante azul Cibacron de una proteína de fusión a albúmina con (A) octanoato 25 mM y (B) tampón de elución de NaCl 2 M.
Las figuras 9A-9B representan los valores de rendimiento de etapa (figura 7A) y de reducción log de ADN (LRV) (figura 7B) en función del pH y la concentración de NaCl para la cromatografía de membrana Mustang Q.
La figura 10 representa la potencia relativa de una proteína de fusión a albúmina en función de la oxidación. El □ representa la metionina M498 de AFP-1; o representa el triptófano W46/W151 de AFP-1; ◊ representa los restos de metionina M74/M179 de AFP-1; y A representa la metionina M529 de AFP-1.
La figura 11 representa un resumen de la oxidación del triptófano con el paso del tiempo (días) para los intermedios de proceso de los procesos Capto Blue ("Blue") y Capto Q ("Q") medida mediante SEC-HPLC.
La figura 12 muestra cromatogramas representativos de HIC para AFP-1, incluyendo Capto MMC, Butil-S Fast Flow, Toyopearl PPG-600M y Toyopearl Fenilo-650M.
La figura 14 muestra la potencia relativa de la proteína de fusión a albúmina purificada en función del contenido de especies tempranas de HIC-HPLC en las fracciones de HIC tomadas durante los ciclos de cromatografía de Butil-S Fast Flow (•) o PPG-600M (o).
DESCRIPCIÓN DETALLADA
Definiciones
Antes de describir en detalle la presente divulgación, debe entenderse que la presente divulgación no se limita a composiciones o etapas de proceso específicas, ya que estas pueden variar. Debe observarse que, como se usa en esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el/la" incluyen referencias plurales, a menos que el contexto indique claramente otra cosa. En el presente documento los términos "un" (o "uno"), así como los términos "uno o más" y "al menos uno" pueden usarse indistintamente.
Además, cuando en el presente documento se usa "y/o" debe interpretarse como la divulgación específica de cada una de las dos características o componentes especificados con o sin el otro. Por lo tanto, el término "y/o" como se usa en una expresión tal como "A y/o B" en el presente documento pretende incluir "A y B", "A o B", "A" (en solitario) y "B" (en solitario). Del mismo modo, el término "y/o" como se usa en una expresión como "A, B y/o C" pretende incluir cada uno de las siguientes realizaciones: A, B, y C; A, B, o C; A o C; A o B; B o C; A y C; A y B; B y C; A (en solitario); B (en solitario); y C (en solitario).
A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que comúnmente entiende un experto en la técnica con la que se relaciona esta invención. Por ejemplo, el Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2.a ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3.a ed., 1999, Academic Press; y el Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revisado, 2000, Oxford University Press, proporcionan a un experto un diccionario general de muchos de los términos utilizados en esta invención.
Las unidades, prefijos y símbolos se indican en su forma aceptada por el Sistema Internacional de Unidades (SI). Los intervalos numéricos incluyen los números que definen el intervalo. A menos que se indique lo contrario, las secuencias de aminoácidos se escriben de izquierda a derecha en orientación de amino a carboxi. Los títulos proporcionados en el presente documento no son limitaciones de los diversos aspectos o realizaciones de la invención, que pueden obtenerse haciendo referencia a la memoria descriptiva en su conjunto. Por consiguiente, los términos definidos a continuación se definen más completamente por referencia a la memoria descriptiva en su totalidad.
Se entiende que siempre que en el presente documento se describan realizaciones con la expresión "que comprenden", también se proporcionan realizaciones análogas descritas en términos de "que consisten en" y/o "que consisten esencialmente en".
Los aminoácidos se citan en el presente documento o bien por sus símbolos de tres letras convencionales o por los símbolos de una letra recomendados por la Comisión de Nomenclatura Bioquímica de la IUPAC-IUB. Asimismo, los nucleótidos se citan por sus códigos de una sola letra comúnmente aceptados.
El término "epítopo", como se usa en el presente documento, se refiere a un determinante proteínico capaz de unirse a un armazón de la invención. Los epítopos consisten generalmente en agrupamientos superficiales químicamente activos de moléculas, tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar y normalmente tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Los epítopos conformacionales y no conformacionales se distinguen porque se pierde la unión al primero pero no al último en presencia de disolventes desnaturalizantes.
Las expresiones "dominio de fibronectina de tipo III (FnlII)", "dominio FnlII" y "armazón de FnlII" se refieren a polipéptidos homólogos al dominio de fibronectina de tipo III que tiene al menos 7 hebras beta que están distribuidas entre dos láminas beta, que en sí se empacan opuestas entre sí para formar el núcleo de la proteína y que además contiene bucles expuestos al disolvente que conectan las hebras beta entre sí. Hay al menos tres de dichos bucles en cada borde del sándwich de lámina beta, donde el borde es el límite de la proteína perpendicular a la dirección de las hebras beta. En ciertas realizaciones, un dominio FnIII comprende 7 hebras beta denominadas A, B, C, D, E, F y G enlazadas a seis regiones de bucle denominadas AB, BC, CD, DE, ED y FG, en donde una región de bucle conecta a cada hebra beta.
La expresión "armazón de Tn3" usada en el presente documento, se refiere a moléculas que comprenden al menos un armazón de FnIII, en donde la hebra beta A comprende la SEQ ID NO: 11, la hebra beta B comprende la SEQ ID NO: 12, la hebra beta C la SEQ ID NO: 13 o 14, la hebra beta D comprende la SEQ ID NO: 15, la hebra beta E comprende la SEQ ID NO: 16, la hebra beta F comprende la SEQ ID NO: 17 y la hebra beta G comprende la SEQ ID NO: 18, en donde al menos un bucle es una variante de origen no natural de los bucles en el "armazón de Tn3 precursor". En ciertas realizaciones, una o más de las hebras beta de una molécula de Tn3 comprende al menos una sustitución de aminoácidos, excepto por que los restos de cisteína en la hebra beta C (por ejemplo, la cisteína en las SEQ ID NO: 13 o 14) y las hebras beta F (Se Q ID NO: 17) no están sustituidas.
La expresión "Tn3 precursor", como se usa en el presente documento, se refiere a un armazón de FnIII que comprende la SEQ ID NO: 3, es decir, un armazón de FnIII modificado con cisteína estabilizado térmicamente procedente del 3.er dominio FnIII de tenascina C humana.
Los términos "multímero" o "armazón multimérico" se refieren a una molécula que comprende al menos dos armazones de FnIII en asociación. Los armazones que forman un armazón multimérico pueden unirse mediante un enlazador que permite que cada armazón funcione de manera independiente.
Los términos "monómero", "subunidad de monómero" o "armazón de monómero" se refieren a una molécula que comprende únicamente el armazón de FnIII.
La expresión "subunidad de monómero específica para CD40L", como se usa en el presente documento, se refiere a un monómero de Tn3 procedente de un "Tn3 precursor", en donde el monómero de Tn3 se une específicamente a CD40L o a un fragmento del mismo, por ejemplo, una forma soluble de CD40L.
El término "ADN" se refiere a una secuencia de dos o más desoxirribonucleótidos de origen natural o modificados unidos covalentemente.
La expresión "proteína de fusión" se refiere a una proteína que incluye (i) una o más proteínas terapéuticas o fragmentos unidos a (ii) una segunda proteína diferente (es decir, una proteína "heteróloga"). Dentro del alcance de la presente invención, la albúmina (HSA, una HSA variante o un variante de HSA) se une a una proteína terapéutica o un fragmento.
Tabla 1: S n i E ID N l m n n "Tn r r r"
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La expresión "resto heterólogo" se usa en el presente documento para indicar la adición de una composición a un armazón de Tn3 de la invención, en donde la composición normalmente no forma parte de un dominio FnIII. Los restos heterólogos ilustrativos incluyen proteínas, péptidos, dominios de proteína, enlazadores, fármacos, toxinas, agentes de obtención de imágenes, compuestos radiactivos, polímeros orgánicos e inorgánicos y cualesquiera otras composiciones que pueden proporcionar una actividad que no es inherente en el dominio FnIII en sí, incluyendo, pero sin limitación, polietilenglicol (PEG), un agente citotóxico, un radionúclido, un agente de obtención de imágenes, biotina, un dominio de dimerización (por ejemplo, un dominio de cremallera de leucina), seroalbúmina humana (HSA) o una porción de unión a FcRn de la misma, un dominio o fragmento de un anticuerpo (por ejemplo, el dominio variable de un anticuerpo, un dominio CH1, un dominio Ckappa, un dominio Clambda, un dominio c H2 o uno CH3), un anticuerpo monocatenario, un anticuerpo de dominio, un dominio de unión a albúmina, una molécula de IgG, una enzima, un ligando, un receptor, un péptido de unión, un armazón distinto de FnIII, un marcador epitópico, un polímero de polipéptido recombinante, una citocina y similares.
El término "enlazador", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier conjunto molecular que une o conecta dos o más armazones. El enlazador puede ser una molécula cuya función es actuar como "espaciador" entre módulos en un armazón o también puede ser una molécula con función adicional (es decir, un "resto funcional"). Una molécula incluida en la definición de "resto heterólogo" también puede funcionar como un enlazador.
Los términos "enlazado", "conjugado" y "fusionado" se usan indistintamente. Estos términos se refieren a la unión entre sí de dos o más armazones, restos heterólogos o enlazadores por cualquier medio, incluyendo conjugación química o medios recombinantes.
Los términos "dominio" o "proteína de dominio" se refieren a una región de una proteína que pueden plegarse en una estructura tridimensional estable, normalmente de manera independiente del resto de la proteína y que pueden estar dotados de una función particular. Esta estructura mantiene una función específica asociada con la función del dominio en la proteína original, por ejemplo, actividad enzimática, creación de un motivo de reconocimiento para otra molécula o para proporcionar los componentes estructurales necesarios para que exista una proteína en un ambiente de proteínas particular. Tanto dentro de una familia de proteínas como dentro de superfamilias de proteínas relacionadas, los dominios de proteína pueden ser regiones evolutivamente conservadas. Cuando se describen los componentes de un armazón multimérico, pueden usarse indistintamente los términos "dominio", armazón monomérico", "subunidad de monómero" y "módulo". Por "dominio de FnIII nativo" se entiende cualquier dominio de FnIII no recombinante que está codificado por un organismo vivo.
Una "secuencia de proteína" o "secuencia de aminoácidos" significa una representación lineal de los constituyentes aminoacídicos en un polipéptido en dirección de aminoterminal a carboxiterminal, en la que los restos vecinos entre sí en la representación son contiguos en la estructura primaria del polipéptido.
La expresión "ácido nucleico" se refiere a cualesquiera dos o más nucleótidos o análogos de nucleótidos o derivados unidos covalentemente. Como se usa en el presente documento, esta expresión incluye, sin limitación, ADN, ARN y PNA. "Ácido nucleico" y "polinucleótido" se usan indistintamente en el presente documento.
El término "polinucleótido" pretende abarcar un ácido nucleico singular, así como múltiples ácidos nucleicos y se refiere a una molécula o construcción de ácido nucleico aislada, por ejemplo, ARN mensajero (ARNm) o ADN plasmídico (ADNp). La expresión "ácido nucleico o polinucleótido aislado" se refiere a una molécula de ácido nucleico, ADN o ARN, que se ha extraído de su ambiente nativo. Por ejemplo, un polinucleótido recombinante que codifica, por ejemplo, un armazón de la invención contenido en un vector se considera aislado a efectos de la presente invención. Los ejemplos adicionales de un polinucleótido aislado incluyen polinucleótidos recombinantes mantenidos en células hospedadoras heterólogas o polinucleótidos purificados (parcial o sustancialmente) en solución. Las moléculas de ARN aisladas incluyen transcritos de ARN in vivo o in vitro de polinucleótidos de la presente invención. Los polinucleótidos o ácidos nucleicos aislados de acuerdo con la presente invención incluyen además dichas moléculas producidas de manera sintética. Además, un polinucleótido o un ácido nucleico puede ser o puede incluir un elemento regulador, tal como un promotor, sitio de unión a ribosomas o un terminador de la transcripción.
La expresión "farmacéuticamente aceptable" se refiere a un compuesto o proteína que puede administrarse a un animal (por ejemplo, un mamífero) sin consecuencias médicas adversas significativas.
La expresión "portador fisiológicamente aceptable" se refiere a un portador que no tiene un impacto perjudicial en el hospedador tratado y que conserva las propiedades terapéuticas del compuesto con el que se administra. Un portador fisiológicamente aceptable ilustrativo es la solución salina fisiológica. Los expertos en la materia conocen otros portadores fisiológicamente aceptables y sus formulaciones y se describen, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, (18.a edición), ed. A. Gennaro, 1990, Mack Publishing Company, Easton, Pa.
Por un "polipéptido" se entiende cualquier secuencia de dos o más aminoácidos unidos linealmente mediante enlaces de amida (enlaces peptídicos) independientemente de la longitud, la modificación postraduccional o la función. "Polipéptido", "péptido" y "proteína" se usan indistintamente en el presente documento. Por lo tanto, en la definición de "polipéptido" se incluyen péptidos, dipéptidos, tripéptidos u oligopéptidos y el término "polipéptido" puede usarse en lugar de o indistintamente con cualquiera de estos términos. El término "polipéptido" también pretende hacer referencia a los productos de las modificaciones posteriores a la expresión del polipéptido, incluyendo, sin limitación, glucosilación, acetilación, fosforilación, amidación, derivatización mediante grupos protectores/de bloqueo conocidos, escisión proteolítica o modificación por aminoácidos de origen no natural. Un polipéptido puede proceder de una fuente biológica natural o producirse mediante tecnología recombinante, pero no se traduce necesariamente a partir de una secuencia de ácido nucleico indicada. Un polipéptido puede generarse de cualquier modo, incluyendo mediante síntesis química. También se incluyen como polipéptidos de la presente invención los fragmentos, derivados, análogos o variantes de los polipéptidos anteriores y cualquier combinación de los mismos. Las variantes pueden ser de origen natural o de origen no natural. Las variantes de origen no natural pueden producirse usando técnicas de mutagénesis conocidas en la técnica. Los polipéptidos variantes pueden comprender sustituciones conservativas o no conservativas, eliminaciones o adiciones de aminoácidos. También se incluyen como "derivados" aquellos péptidos que contienen uno o más derivados de aminoácidos de origen natural de los veinte aminoácidos convencionales.
Por "aleatorizado" o "mutado" se entiende que incluye una o más alteraciones de aminoácidos, incluyendo eliminación, sustitución o adición, en relación con una secuencia molde. Por "aleatorización" o "mutación" se entiende el proceso de introducir, en una secuencia, dicha alteración de aminoácidos. La aleatorización o mutación puede lograrse mediante variación de secuencias intencional, ciega o espontánea, generalmente de una secuencia codificante de ácido nucleico y puede producirse mediante cualquier técnica, por ejemplo, PCR, PCR propensa a errores o síntesis química de ADN. Los términos "aleatorizadón", "aleatorizado", "mutación", "mutado" y similares se usan indistintamente en el presente documento.
Por "afín" o "proteína afín no mutada" se entiende una proteína que es idéntica en secuencia a una proteína variante, excepto por las mutaciones de aminoácidos introducidas en la proteína variante, en donde la proteína variante está aleatorizada o mutada.
Por "ARN" se entiende una secuencia de dos o más ribonucleótidos de origen natural o modificados unidos covalentemente. Un ejemplo de un ARN modificado incluido en este término es el ARN de fosforotioato.
Las expresiones "armazón de la invención" o "armazones de la invención", como se usan en el presente documento, se refieren a armazones de Tn3 multiméricos, así como a armazones de Tn3 monoméricos. El término "diana" se refiere a un compuesto reconocido por un armazón específico de la invención. Los términos "diana" y "antígeno" se usan indistintamente en el presente documento. El término "especificidad" como se usa en el presente documento, por ejemplo, en las expresiones "se une específicamente" o "unión específica", se refiere a la afinidad relativa con la que un armazón de Tn3 de la invención se une a uno o más antígenos por medio de uno o más dominios de unión a antígeno y dicha unión implica cierto grado de complementariedad entre uno o más dominios de unión a antígeno y uno o más antígenos. De acuerdo con esta definición, se dice que un armazón de Tn3 de la invención "se une específicamente" a un epítopo cuando se une a dicho epítopo más fácilmente de lo que se uniría a un epítopo aleatorio no relacionado.
Un armazón "con afinidad madurada" es un armazón con una o más alteraciones, generalmente en un bucle, que dan como resultado una mejora en la afinidad del armazón de Tn3 por un epítopo, en comparación con un armazón de Tn3 precursor que no posee dichas una o más alteraciones.
El término "afinidad", como se usa en el presente documento, se refiere a una medida de la fuerza de la unión de un armazón de Tn3 concreto de la invención a un epítopo individual.
El término "avidez", como se usa en el presente documento, se refiere a la estabilidad general del complejo entre una población de armazones de Tn3 de la invención y un epítopo determinado, es decir, la fuerza funcionalmente combinada de la unión de una pluralidad de armazones de Tn3 con el antígeno. La avidez está relacionada tanto con la afinidad de los dominios de unión a antígeno individuales como con la valencia del armazón de la invención.
La expresión "acción de la diana" se refiere a la unión de un armazón de Tn3 de la invención a una o más dianas y a los efectos biológicos que resultan de dicha unión. A este respecto, múltiples unidades de unión a antígeno en un armazón de Tn3 pueden interactuar con diversas dianas y/o epítopos y, por ejemplo, aproximan físicamente dos dianas, desencadenan cascadas metabólicas mediante la interacción con distintas dianas, etc. En referencia a CD40L, la "acción en la diana" se refiere al efecto logrado, por ejemplo, mediante la potenciación, estimulación o activación de una o más actividades biológicas de CD40L.
El término "valencia", como se usa en el presente documento, se refiere al número de potenciales módulos de unión a antígeno, por ejemplo, el número de módulos de FnIII en un armazón de la invención. Cuando un armazón de Tn3 de la invención comprende más de un módulo de unión a antígeno, cada módulo de unión puede unirse específicamente, por ejemplo, al mismo epítopo o a un epítopo diferente, en la misma diana o en diferentes dianas.
La expresión "enlace disulfuro", como se usa en el presente documento, incluye el enlace covalente formado entre dos átomos de azufre. El aminoácido cisteína comprende un grupo tiol, que puede formar un enlace o puente disulfuro con un segundo grupo tiol.
El término "inmunoglobulina" y "anticuerpo" comprende diversas clases amplias de polipéptidos que pueden distinguirse bioquímicamente. Los expertos en la materia apreciarán que las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta o épsilon. La naturaleza de esta cadena es la que determina la "clase" del anticuerpo como IgG, IgM, IgA, IgG o IgE, respectivamente. Las versiones modificadas de cada una de estas clases son fácilmente discernibles por los expertos en la materia. Como se usa en el presente documento, el término "anticuerpo" incluye, pero sin limitación, un anticuerpo intacto, un anticuerpo modificado, un dominio VL o VL de anticuerpo, un dominio CH1, un dominio Ckappa, un dominio Clambda, un dominio Fc (véase más adelante), un dominio CH2 o uno CH3.
Como se usa en el presente documento, la expresión "dominio Fc" se refiere a una porción de una región constante de anticuerpo. Tradicionalmente, la expresión "dominio Fc" se refiere a un producto de escisión por proteasa (por ejemplo, papaína) que abarca las regiones CH2, CH3 y bisagra emparejadas de un anticuerpo. En el contexto de la presente divulgación, el dominio Fc o Fc se refiere a cualquier polipéptido (o ácido nucleico que codifica dicho polipéptido), independientemente de los medios de producción, que incluye la totalidad o parte de las regiones CH2, CH3 y bisagra de un polipéptido de inmunoglobulina.
Como se usa en el presente documento, la expresión "anticuerpo modificado" incluye formas sintéticas de anticuerpos que se alteran de tal forma que no son de origen natural, por ejemplo, anticuerpos que comprenden al menos dos porciones de cadena pesada pero no dos cadenas pesadas completas (como, por ejemplo, anticuerpos con dominio eliminado o minicuerpos); formas multiespecíficas de anticuerpos (por ejemplo, biespecíficos, triespecíficos, etc.) alteradas para unirse a dos o más antígenos o a dos o más epítopos de un solo antígeno). Además, la expresión "anticuerpo modificado" incluye formas multivalentes de anticuerpos (por ejemplo, trivalentes, tretravalentes, etc., anticuerpos que se unen a tres o más copias del mismo antígeno). (Véase, por ejemplo, Antibody Engineering, Kontermann y Dubel, ed., 2010, Springer Protocols, Springer).
La expresión "semivida in vivo" se usa con su significado normal, es decir, el tiempo en el cual sigue estando presente un 50 % de la actividad biológica de un polipéptido en el organismo/órgano diana o el tiempo en el que la actividad del polipéptido es un 50 % de su valor inicial. Como alternativa a la determinación de la semivida funcional in vivo, puede determinarse la "semivida en suero", es decir, el tiempo en el cual circulan un 50 % de las moléculas de polipéptido en el plasma o torrente sanguíneo antes de eliminarse. La determinación de la semivida en suero es normalmente más sencilla que la determinación de la semivida funcional in vivo y la magnitud de la semivida en suero es normalmente una buena indicación de la magnitud de la semivida funcional in vivo. Las expresiones alternativas para la semivida en suero incluyen "semivida en plasma", "semivida en circulación", "semivida circulatoria", "eliminación sérica", "eliminación plasmática" y "semivida de eliminación". La funcionalidad que se ha de conservar se selecciona normalmente entre actividad procoagulante, proteolítica, de unión a cofactor, de unión a receptor u otro tipo de actividad biológica asociada con la proteína particular.
El término "aumentado", con respecto a la semivida funcional in vivo o la semivida en plasma se usa para indicar que la semivida relevante del polipéptido está aumentada de manera estadísticamente significativa en relación con la de una molécula de referencia (por ejemplo, un polipéptido no modificado), determinada en condiciones comparables.
El término "reducido", con respecto a la semivida funcional in vivo o la semivida en plasma se usa para indicar que la semivida relevante del polipéptido está reducida de manera estadísticamente significativa en relación con la de una molécula de referencia (por ejemplo, un polipéptido no modificado), determinada en condiciones comparables.
El término "expresión", como se usa en el presente documento, se refiere a un proceso mediante el que un gen produce un agente bioquímico, por ejemplo, un armazón de la invención o un fragmento del mismo. El proceso incluye cualquier manifestación de la presencia funcional del gen dentro de la célula, incluyendo, sin limitación, el silenciamiento génico, así como tanto la expresión transitoria como la expresión estable. Este incluye, sin limitación, la transcripción del gen en uno o más ARNm y la traducción de dichos ARNm en uno o más polipéptidos. En caso de que el producto final deseado sea un agente bioquímico, la expresión incluye la creación de dicho agente bioquímico y cualquiera de sus precursores.
Un "producto de expresión" puede ser o bien un ácido nucleico, por ejemplo, un ARN mensajero producido mediante la transcripción de un gen o un polipéptido. Los productos de expresión descritos en el presente documento incluyen además ácidos nucleicos con modificaciones postranscripcionales, por ejemplo, poliadenilación o polipéptidos con modificaciones postraduccionales, por ejemplo, metilación, glucosilación, la adición de lípidos, asociación con otras subunidades de proteína, escisión proteolítica y similares.
El término "vector" o "vector de expresión" se usa en el presente documento para hacer referencia a vectores de acuerdo con la presente invención como vehículo para introducir y expresar un producto de expresión deseado en una célula hospedadora. Como saben los expertos en la materia, dichos vectores pueden seleccionarse fácilmente entre el grupo que consiste en plásmidos, fagos, virus y retrovirus. En general, los vectores compatibles con la presente invención comprenderán un marcador de selección, sitios de restricción adecuados para facilitar la clonación del ácido nucleico deseado y la capacidad para entrar y/o replicarse en células eucariotas o procariotas.
La expresión "células hospedadoras" se refiere a células que portan vectores construidos usando técnicas de ADN recombinante y que codifican al menos un producto de expresión. En las descripciones de los procesos para el aislamiento de un producto de expresión a partir de hospedadores recombinantes, los términos "célula" y "cultivo celular" se usan indistintamente para indicar la fuente del producto de expresión, a menos que se especifique claramente otra cosa, es decir, la recuperación del producto de expresión de las "células" significa o bien la recuperación de células enteras centrifugadas o la recuperación del cultivo celular que contiene tanto el medio como las células suspendidas.
El término "CD40L", como se usa en el presente documento, se refiere, sin limitación a CD40L expresado en la superficie de linfocitos T, a CD40L expresado recombinantemente, a CD40L expresado y purificado de E. coli u otros sistemas de expresión de proteínas adecuados, a CD40L aglucosilado y a fragmentos solubles de CD40L. Como se usa en el presente documento, "CD40L" también se refiere a MegaCD40L. MegaCD40L™ es una construcción de alta actividad en la que se unen artificialmente dos ligandos de CD40 mediante el dominio de colágeno de ACRP30/adiponectina. Esta construcción simula con alta eficacia la agregación natural asistida por membrana de CD40L in vivo. Proporciona una alternativa sencilla e igualmente potente a las combinaciones de [cD40L+potenciador] (Alexis biochemicals). El término "CD40L" se refiere a formas monoméricas de CD40L, así como a formas oligoméricas, por ejemplo, CD40L trimérico.
El término "CD40L" se refiere tanto a CD40L de longitud completa como a fragmentos solubles, por ejemplo, formas de dominio extracelular de CD40L que son el resultado de la proteólisis. Las secuencias de aminoácidos de las formas unidas a membrana y solubles de CD40L humano (Swissprot: P29965) se muestran en la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2, respectivamente.
Los términos "antagonista de CD40L" o "antagonista" se usan en el sentido más amplio e incluyen cualquier molécula que parcial o totalmente inhiba, reduzca o inactive una o más actividades biológicas de CD40L y variantes biológicamente activas del mismo, in vivo, in situ o in vivo. Por ejemplo, un antagonista de CD40L puede funcionar para total o parcialmente inhibir, reducir o inactivar una o más actividades biológicas de una o más moléculas de CD40L o una o más moléculas de CD40L unidas a CD40 u otras dianas in vivo, in vitro o in situ, como resultado de su unión a CD40L.
El término "agonista de CD40L" o "agonista" se usa en el sentido más amplio e incluye cualquier molécula que total o parcialmente potencie, estimule o active una o más actividades biológicas de CD40L y variantes biológicamente activas del mismo, in vitro, in situ o in vivo. Por ejemplo, un agonista de CD40L puede funcionar para total o parcialmente potenciar, estimular o activar una o más actividades biológicas de una o más moléculas de CD40L o una o más moléculas de CD40L unidas a CD40R u otras dianas in vivo, in vitro o in situ, como resultado de su unión a CD40L.
La expresión "función efectora" se refiere a aquellas actividades biológicas de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo atribuibles a la región Fc (una región Fc nativa o una variante de secuencia de aminoácidos de la región Fc) de un anticuerpo y varían con el isotipo de anticuerpo. Los ejemplos de funciones efectoras de anticuerpo incluyen: unión a C1q y citotoxicidad dependiente de complemento; unión a receptor de Fc; citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo (ADCC); fagocitosis; regulación negativa de receptores de la superficie celular (por ejemplo, receptores de linfocitos B); y activación de linfocitos B.
La expresión "citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos" o "ADCC" se refiere a una forma de citotoxicidad en la que una Ig unida a los receptores de Fc (FcR) presentes en ciertas células citotóxicas (por ejemplo, linfocitos citolíticos naturales (NK), neutrófilos y macrófagos) permiten que estas células efectoras citotóxicas se unan específicamente a una célula diana portadora del antígeno y posteriormente eliminen a las células diana con citotoxinas.
La expresión "receptor de Fc" o "FcR" describe un receptor que se une a la región Fc de un anticuerpo. El FcR puede ser una secuencia nativa de FcR. El FcR puede unirse a un anticuerpo IgG (un receptor gamma) e incluye receptores de las subclases FcyRI, FcyRII y FcyRIII, incluyendo variantes alélicas y formas de corte y empalme alternativo de estos receptores. El término también incluye el receptor neonatal, FcRn.
La expresión "secuencia consenso" se refiere a una secuencia de proteína que muestra la mayor cantidad de aminoácidos comunes en una posición particular después de alinearse múltiples secuencias. Una secuencia consenso es un modo de representar los resultados de un alineamiento de múltiples secuencias, donde las secuencias relacionadas se comparan entre sí. La secuencia consenso muestra qué restos son más abundantes en el alineamiento en cada posición y el grado de variabilidad en cada posición.
La expresión "esencialmente exenta" se refiere a una composición que tiene menos de un 10 % de restos de triptófano oxidados en relación con el número total de restos de aminoácido en la proteína, menos de un 8 % de restos de triptófano oxidados en relación con el número total de restos de aminoácido en la proteína, menos de un 5 % de restos de triptófano oxidados en relación con el número total de restos de aminoácido en la proteína, menos de un 4 % de restos de triptófano oxidados en relación con el número total de restos de aminoácido en la proteína, menos de un 3 % de restos de triptófano oxidados en relación con el número total de restos de aminoácido en la proteína, menos de un 2 % de restos de triptófano oxidados en relación con el número total de restos de aminoácido en la proteína, menos de un 1 % de restos de triptófano oxidados en relación con el número total de restos de aminoácido en la proteína. En algunas realizaciones, la expresión "esencialmente exenta" se refiere a una composición que tiene menos de un 5 % de restos de triptófano oxidados en relación con el número total de restos de aminoácido en la proteína.
El término "bioactividad" o "actividad" se refiere a la actividad biológica de la proteína terapéutica, por ejemplo, el armazón de TN3 y su capacidad para funcionar del modo previsto in vivo, por ejemplo, uniéndose a CD40L. En algunas realizaciones, la actividad se refiere a la "actividad relativa", es decir, la actividad de la proteína terapéutica purificada, en relación con una proteína terapéutica no oxidada. En algunas realizaciones, la actividad relativa de la proteína terapéutica purificada es mayor de un 80 %, mayor de un 85 %, mayor de un 90 %, mayor de un 92 %, mayor de un 94 %, mayor de un 95 %, mayor de un 98 % o mayor de un 99 %.
Se ha observado que la fusión de albúmina a proteínas terapéuticas aumenta o prolonga la semivida in vivo o sérica de la proteína terapéutica fusionada. Sin embargo, se ha descubierto que durante la purificación de dichas proteínas de fusión a albúmina, ciertos restos de aminoácido pueden ser susceptibles a la oxidación, reduciendo o limitando de este modo la bioactividad de la proteína de fusión a albúmina. La presente invención se refiere a un método para reducir la oxidación de los restos de aminoácido susceptibles en las proteínas de fusión a albúmina y a la purificación de dichas proteínas de fusión a albúmina. En una realización, las proteínas de fusión a albúmina incluyen un armazón. En otra realización, el armazón comprende un dominio Fn3. En otra realización más, el armazón comprende un armazón de Tenascina C (Tn3) humana capaz de unirse a CD40L.
Proceso para reducir la oxidación de las proteínas de unión a albúmina
Durante el proceso de purificación de las proteínas de fusión a albúmina, ciertos restos de aminoácido pueden volverse susceptibles a la oxidación, lo que puede inhibir la bioactividad y la potencia relativa de la proteína de fusión a albúmina. Por ejemplo, uno o más restos de triptófano y/o metionina pueden volverse susceptibles a la oxidación. De acuerdo con la presente invención, la oxidación de los restos de aminoácido susceptibles de las proteínas de unión a albúmina se reduce sometiendo a una solución que comprende las proteínas de fusión a albúmina a una matriz de cromatografía de afinidad y una matriz de cromatografía de intercambio aniónico en condiciones adecuadas.
Cromatografía de matriz de afinidad
La etapa de cromatografía de afinidad utiliza una matriz de afinidad que se une preferencialmente a albúmina. Por ejemplo, las matrices adecuadas incluyen colorante azul Cibacron, Reactive Blue 2, Procion Blue HB, Capto Blue, Capto Blue (High Sub), Toyopearl, AF-Blue HC-650M, Blue Sefarosa, Blue Trisacryl, Mimetic Blue 1, Mimetic Blue SA, Mimetic Blue SA HL y otros compuestos de tipo antraquinona, matriz de nitrocelulosa y matriz a base de anticuerpos, tales como Capture Select de Life Technologies, una matriz a base de ácidos grasos. En una realización, la cromatografía de colorante azul Cibacron es una elección ideal para la purificación de proteínas de fusión a albúmina a partir de medio de cultivo debido a su afinidad por la albúmina. Aunque se encuentran disponibles comercialmente varias resinas de cromatografía de colorante azul Cibacron, muchas de estas distan de ser ideales para la purificación a gran escala de proteínas de fusión a albúmina. Para la purificación a gran escala, la resina debe estar hecha de un material que minimiza las interacciones no específicas con impurezas relacionadas con el hospedador, tienen buenas características de presión-flujo y son estables a extremos de pH con una finalidad de higienización (preferentemente estables en condiciones causticas). Teniendo estas propiedades en mente, unas cuantas resinas de cromatografía de colorante azul Cibacron destacan como resinas potenciales para la purificación a escala clínica y comercial: Capto Blue y Capto blue (High Sub) de GE Healthcare, y Toyopearl AF-Blue HC-650M de Tosoh Biosciences. De las dos opciones Capto Blue, en algunas realizaciones, resulta preferible la versión High Sub debido a su mayor densidad de ligando y por tanto, su mayor capacidad de unión.
En un proceso de purificación típico, la columna de colorante azul Cibacron se equilibra con un tampón (tal como fosfato, tris, bis-tris, etc.) aproximadamente a pH neutro o pH ligeramente ácido y después se cargan con caldo de cultivo celular clarificado o un intermedio de proceso (en caso de que la columna de colorante azul Cibacron no sea la etapa de purificación inicial) que contiene la proteína de fusión a albúmina.
Pueden cargarse varias cantidades de proteína en la columna. En algunas realizaciones, pueden cargarse en la columna de afinidad de aproximadamente 5 g de proteína/l de resina a aproximadamente 100 g de proteína/l de resina, de aproximadamente 10 g de proteína/l de resina a aproximadamente 50 g de proteína/l de resina o aproximadamente 25 g de proteína/l de resina.
Después de cargar la muestra, la columna de cromatografía de afinidad que contiene la proteína de unión a albúmina unida se reequilibra opcionalmente y después puede lavarse adicionalmente con tampones más agresivos para retirar adicionalmente las impurezas de la célula hospedadora que están unidas a la columna (mediante interacciones no específicas) o unidas a la proteína de fusión a albúmina (mediante interacciones proteína-proteína). El tampón de lavado puede optimizarse para retirar estas impurezas. En una realización, el tampón de lavado contiene un poliol; una sal; un sulfato de sodio; un tensioactivo no iónico; urea; y/o una nicotinamida.
En una realización, el tampón de lavado comprende de aproximadamente un 2 % a aproximadamente un 20 % de poliol. El poliol puede seleccionarse entre el grupo que consiste en 1,2-propanodiol, 1,3-propanodiol, 1,2-butanodiol, 1,3-butanodiol, 1,4-butanodiol, 1,6-hexanodiol y 2-metil-2,4-pentanodiol.
Pueden estar presentes diversas concentraciones de sal en el tampón de lavado. En algunas realizaciones, la sal está presente en una cantidad adecuada, por ejemplo, sal a de aproximadamente 0.05 M a aproximadamente 2.0 M, sal a de aproximadamente 0.1 M a aproximadamente 1.8 M, sal a de aproximadamente 0.2 M a aproximadamente 1.5 M, sal a de aproximadamente 0.3 M a aproximadamente 1.0 M, sal a de aproximadamente 0.4 M a aproximadamente 0.8 M o sal a aproximadamente 0.5 M. La sal puede seleccionarse entre las comúnmente usadas en la técnica, por ejemplo, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, cloruro de litio, bromuro de sodio, bromuro de potasio y bromuro de litio.
Pueden usarse diversas concentraciones de sulfato de sodio. El sulfato de sodio puede estar presente en una cantidad de aproximadamente 0.01 M a aproximadamente 0.5 M, de 0.02 M a aproximadamente 0.3 M, de aproximadamente 0.04 M a aproximadamente 0.2 M o de aproximadamente 0.05 M a aproximadamente 0.1 M.
Pueden usarse diversos tensioactivos no iónicos. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el tensioactivo no iónico puede seleccionarse entre el grupo que consiste en Triton X-100, Tween 80, polisorbato 20, polisorbato 80, nonoxinol-9, polioxámero, alcohol estearílico o monoestearato de sorbitano. Pueden usarse diversas concentraciones del tensioactivo no iónico. Por ejemplo, en algunas realizaciones, los tensioactivos no iónicos están presentes en el tampón de lavado a una concentración de aproximadamente un 0.01 % a aproximadamente un 1 %, de aproximadamente un 0.02 % a aproximadamente un 0.4 %, de aproximadamente un 0.05 % a aproximadamente un 0.2 % o de aproximadamente un 0.08 % a aproximadamente un 0.01 %.
Se conocen en la técnica diversos agentes caotrópicos. En la presente invención, la urea es un agente caotrópico para su uso en el tampón de lavado. La urea puede estar presente en una cantidad de aproximadamente 0.02 M a aproximadamente 1.5 M, de aproximadamente 0.05 M a aproximadamente 1.0 M o de aproximadamente 0.08 M a aproximadamente 1.0 M del tampón de lavado.
En algunas realizaciones, se usa nicotinamida en el tampón de lavado. La nicotinamida puede estar presente en una cantidad de aproximadamente 0.01 M a aproximadamente 1.0 M, de aproximadamente 0.02 M a aproximadamente 0.5 M, de aproximadamente 0.04 M a aproximadamente 0.3 M, de aproximadamente 0.06 M a aproximadamente 0.2 M o aproximadamente 0,1 M del tampón de lavado.
El tampón de lavado puede tener diversos niveles de pH. En algunas realizaciones, el pH del tampón de lavado es mayor de aproximadamente 5.0, mayor de aproximadamente 5.5 o mayor de aproximadamente 6.0. En algunas realizaciones, el pH del tampón de lavado es menor de aproximadamente 8.0, menor de aproximadamente 7.5, menor de aproximadamente 7.0 o menor de aproximadamente 6.5. En algunas realizaciones, el pH del tampón de lavado es de aproximadamente 5.0 a aproximadamente 8.0, de aproximadamente 5.5 a aproximadamente 7.5, de aproximadamente 5.5 a aproximadamente 7.0, de aproximadamente 6.0 a aproximadamente 7.0 o de aproximadamente 6.5 a aproximadamente 7.0.
En otra realización de la invención, el tampón de lavado comprende de aproximadamente un 5 % a aproximadamente un 15 % de poliol, sal a de aproximadamente 0.2 M a aproximadamente 0.8 M, sulfato de sodio a de aproximadamente 0.2 M a aproximadamente 0.8 M, de aproximadamente un 0.02 % a aproximadamente un 0.2 % de tensioactivo no iónico y/o urea a de aproximadamente 0.2 M a aproximadamente 1.0 M. En un aspecto de la invención, el tampón de lavado comprende el poliol, 1,2-propanodiol, la sal, cloruro de sodio y el tensioactivo no iónico, Triton X-100. En otro aspecto de la invención, el tampón de lavado comprende cloruro de sodio a aproximadamente 0.5 M; sulfato de sodio a aproximadamente 0.5 M; o aproximadamente un 10 % de 1,3-propanodiol. De acuerdo con un aspecto de la invención, el tampón de lavado tiene un pH de aproximadamente 5.5 a aproximadamente 7.0.
En algunas realizaciones, el tampón de lavado es adecuado para reducir la concentración de ADN hasta menos de aproximadamente 5 x 102 ng/mg de ADN, menos de aproximadamente 2 x 102 ng/mg de ADN o menos de aproximadamente 50 ng/mg de ADN. En algunas realizaciones, el tampón de lavado es adecuado para reducir las proteínas de la célula hospedadora (HCP) hasta menos de 50,000 ng/mg, menos de 20,000 ng/mg o menos de 10,000 ng/mg.
En algunas realizaciones, el producto purificado se eluye de la columna de matriz de afinidad aplicando un tampón a alto pH a la columna o añadiendo altas concentraciones de sales, disolventes orgánicos suaves o una combinación para alterar la unión del producto. En una realización, el tampón de elución comprende una base, tal como bis-tris, tris o base de fosfato. En otro aspecto de la invención, la base del tampón de elución es bis-tris 50 mM. El tampón de elución comprende octanoato. La sal puede estar presente en el tampón de elución en una cantidad de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 500 mM, de aproximadamente 20 mM a aproximadamente 250 mM, de aproximadamente 50 mM a aproximadamente 200 mM o de aproximadamente 75 mM a aproximadamente 150 mM. En otra realización, el tampón de elución comprende EDTA u otros agentes quelantes. En una realización, el tampón de elución de la matriz de afinidad comprende EDTA, en una cantidad adecuada, tal como EDTA de aproximadamente 2 mM a aproximadamente 20 mM.
De acuerdo con la presente invención, la cromatografía de afinidad tiene bajos niveles de producto oxidado. En una realización, el producto intermedio que contiene la proteína de fusión a albúmina después de la cromatografía de afinidad tiene menos de aproximadamente un 100 %, menos de aproximadamente un 90 %, menos de aproximadamente un 80 %, menos de aproximadamente un 70 %, menos de aproximadamente un 60 %, menos de aproximadamente un 50 %, menos de aproximadamente un 40 %, menos de aproximadamente un 30 %, menos de aproximadamente un 20 %, menos de aproximadamente un 10 %, menos de aproximadamente un 9 %, menos de aproximadamente un 8 %, menos de aproximadamente un 7 %, menos de aproximadamente un 6 %, menos de aproximadamente un 5 % o menos de aproximadamente un 4 % de producto oxidado, en relación con la proteína completa. En otra realización, el producto intermedio que contiene la proteína de fusión a albúmina después de la cromatografía de afinidad tiene menos de aproximadamente un 50 %, menos de aproximadamente un 40 %, menos de aproximadamente un 30 %, menos de aproximadamente un 20 %, menos de aproximadamente un 10 %, menos de aproximadamente un 9 %, menos de aproximadamente un 8 %, menos de aproximadamente un 7 %, menos de aproximadamente un 6 %, menos de aproximadamente un 5 % o menos de aproximadamente un 4 % de restos de triptófano oxidados en relación con el número total de restos de triptófano. En otra realización, la etapa de matriz de afinidad elimina al menos 1, 2, 3, 1-2 o 2­ 3 órdenes de magnitud de proteínas de la célula hospedadora de la muestra original. En una realización de la invención, la etapa de matriz de afinidad elimina al menos 1, 2, 3, 4, 1-2, 2-3, 3-4 órdenes de magnitud de las impurezas de ADN de la muestra original.
Inactivación vírica
En una realización de la invención, la fracción o muestra que contiene la proteína de fusión a albúmina puede tratarse para inactivar los virus que puedan estar presentes. De este modo, la fracción/muestra puede tratarse con un agente de inactivación vírica, por ejemplo, Triton X-100, Tween 80, Tween 20, fosfato de tri-n-butilo o urea. En una realización, la etapa de inactivación vírica se produce entre las una o más etapas de cromatografía de afinidad y de cromatografía de intercambio aniónico. De este modo, el agente de inactivación vírica, por ejemplo, Triton X-100, puede añadirse en una cantidad de aproximadamente un 0.05 % a aproximadamente un 3 %, de aproximadamente un 0.01 % a aproximadamente un 1 % o de aproximadamente un 0.1 % a aproximadamente un 0.5 % durante un periodo de aproximadamente 1 segundo a aproximadamente 10 horas, de aproximadamente 30 segundos a aproximadamente 5 horas, de aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 3 horas o de aproximadamente 2 horas. En una realización, el agente de inactivación vírica es Triton X-100 al 0.5 % (p/p) que se mantiene durante de aproximadamente 30 a aproximadamente 240 minutos, por ejemplo, 130 minutos.
Cromatografía de intercambio aniónico
En otro aspecto de la invención, la fracción o muestra que contiene la proteína de fusión a albúmina se somete a cromatografía de intercambio aniónico. El intercambio aniónico puede llevarse a cabo mediante un sistema de unión y elución o un sistema de flujo pasante o ambos. Puede usarse cualquier matriz de intercambio aniónico. En una realización, la matriz de intercambio aniónico puede ser una resina, tal como agarosa o sefarosa, por ejemplo o membranas microporosas o macroporosas. Las matrices de intercambio aniónico de unión y elución incluyen, por ejemplo, resina Q, aminas cuaternarias, DEAE. Las matrices comercialmente disponibles incluyen, por ejemplo, Capto Q, Toyopearl SuperQ, ANX, DEAE, Q-Sefarosa, Q-Sefarosa FF, Q-Sefarosa HP y Q-Sefarosa XL, Q-Hyper D, DEAE-celulosa, QAE-celulosa, TMAE, DMAE o DEAE Fractogel, Mustang Q, Sartobind Q o Sartobind STIC PA. Dichas matrices pueden comprender agarosa altamente reticulada o ser poliméricas que tienen, por ejemplo, una base de poliétersulfona, polipropileno, metacrilato o polipropilato. La exposición de carga de columna se encuentra en un intervalo de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 50 g/l, de aproximadamente 0.5 a aproximadamente 40 g/l, de aproximadamente 1 a aproximadamente 30 g/l o de aproximadamente 5 a aproximadamente 25 g/l. La exposición de carga de membrana se encuentra en un intervalo de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 10 g/ml, de aproximadamente 0.2 a aproximadamente 5.0 g/ml, de aproximadamente 0.5 a aproximadamente 2.5 g/ml o de aproximadamente 1.0 a aproximadamente 2.0 g/ml.
En otra realización, las matrices se modifican para potenciar la purificación de la proteína de fusión a albúmina. Por ejemplo, en una realización, la matriz es agarosa altamente reticulada con extensores de superficie de dextrano. En otra realización, se modifica una matriz de base de poliétersulfona con aminas cuaternarias. En otra realización, se modifica una matriz de base de polipropileno con aminas cuaternarias.
Cuando se usa el sistema de unión y elución, la etapa de cromatografía de intercambio aniónico puede implicar una etapa de equilibrado con un tampón, tal como fosfato, tris y bis-tris a pH neutro o ligeramente ácido. Se carga la muestra y la matriz se reequilibra opcionalmente. El tampón de carga se optimiza basándose en el pH y la resina que se esté usando, como es sabido en la técnica y para optimizar la separación de la proteína de fusión a albúmina diana. Los tampones de carga adecuados incluye una base, tal como tris o bis-tris, en un intervalo de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 200 mM, de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 150 mM, de aproximadamente 20 mM a aproximadamente 100 mM, de aproximadamente 30 mM a aproximadamente 80 mM o de aproximadamente 50 mM y sal, tal como NaCl u octanoato, en una cantidad de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 100 mM, de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 50 mM o de aproximadamente 20 mM. En una realización, un tampón de carga adecuado para el intercambio aniónico comprende bis-tris 50 mM, NaCl 20 mM a pH 7.0.
En el sistema de unión y elución, después de equilibrar la matriz de intercambio aniónico, se carga la muestra que contiene la proteína de fusión a albúmina y la proteína deseada se une a la matriz de intercambio aniónico. La columna de cromatografía de afinidad que contiene la proteína de fusión a albúmina unida se lava con un tampón de lavado para retirar los materiales presentes en la solución distintos de la proteína de fusión a albúmina. En algunas realizaciones, el tampón de lavado es el mismo que el tampón de carga. En algunas realizaciones, el tampón de lavado comprende bistris 50 mM, NaCl 20 mM a pH 7.0.
La proteína de fusión a albúmina unida se eluye de la matriz de intercambio aniónico ya sea mediante elución por etapas o elución de gradiente. En una realización, el tampón de elución de la matriz de intercambio aniónico emplea sales, tales como NaCl, CaCl2 o KCl. La concentración de sal del tampón varía de más de por encima de 10 mM, de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 150 mM, de aproximadamente 20 mM a aproximadamente 400 mM, de aproximadamente 50 mM a aproximadamente 300 mM, de aproximadamente 20 mM a aproximadamente 140 mM, de aproximadamente 30 mM a aproximadamente 130 M, de aproximadamente 40 mM a aproximadamente 120 mM o de aproximadamente 50 mM a aproximadamente 110 mM. El intervalo de pH para la elución varía entre un pH de menos de aproximadamente 9, de aproximadamente 6 a aproximadamente 8, de aproximadamente 6 a aproximadamente 7.5, de aproximadamente 6 a aproximadamente 7 o de aproximadamente 6.5 a aproximadamente 7. En algunas realizaciones, la proteína de fusión a albúmina unida se eluye de la matriz usando un gradiente lineal de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 600 mM de sal, por ejemplo, NaCl o de aproximadamente 20 mM a aproximadamente 400 mM de sal, por ejemplo, NaCl.
De acuerdo con la presente invención, el sistema de unión y elución de intercambio aniónico da como resultado un contenido de monómero aumentado mediante la reducción del producto agregado y elimina las impurezas responsables de la oxidación de la proteína de fusión a albúmina y que tienen bajos niveles de producto oxidado. En una realización, el producto intermedio de esta etapa que contiene la proteína de fusión a albúmina tiene menos de aproximadamente un 100 %, menos de aproximadamente un 90 %, menos de aproximadamente un 80 %, menos de aproximadamente un 70 %, menos de aproximadamente un 60 %, menos de aproximadamente un 50 %, menos de aproximadamente un 40 %, menos de aproximadamente un 30 %, menos de aproximadamente un 20 %, menos de aproximadamente un 10 %, menos de aproximadamente un 9 %, menos de aproximadamente un 8 %, menos de aproximadamente un 7 %, menos de aproximadamente un 6 %, menos de aproximadamente un 5 %, menos de aproximadamente un 4 %, menos de aproximadamente un 3 % o menos de aproximadamente un 2 % de producto oxidado en relación con la proteína completa. En una realización, el producto intermedio de esta etapa que contiene la proteína de fusión a albúmina tiene menos de aproximadamente un 50 %, menos de aproximadamente un 40 %, menos de aproximadamente un 30 %, menos de aproximadamente un 20 %, menos de aproximadamente un 10 %, menos de aproximadamente un 9 %, menos de aproximadamente un 8 %, menos de aproximadamente un 7 %, menos de aproximadamente un 6 %, menos de aproximadamente un 5 %, menos de aproximadamente un 4 %, menos de aproximadamente un 3 % o menos de aproximadamente un 2 % de restos de triptófano oxidados en relación con el número total de restos de triptófano. En otra realización, la etapa de intercambio aniónico de unión y elución elimina más de 5, 10, 15, 20 o 30 o al menos 5-30, 10-30, 10-40, 15-30, 15-40, 20-30 o 20-40 órdenes de magnitud de proteínas de la célula hospedadora procedentes de la muestra original. En una realización de la invención, la etapa de intercambio aniónico de unión y elución elimina al menos 3, 4, 5 o 6 o entre 1-2, 2-3, 3-4 órdenes de magnitud de las impurezas de ADN de la muestra original.
En algunas realizaciones, la matriz de cromatografía de intercambio aniónico es una en modo de flujo pasante que utiliza una membrana. En algunas realizaciones, la proteína de fusión a albúmina se somete tanto a una matriz de cromatografía de intercambio aniónico como a una membrana de intercambio aniónico. La membrana puede preacondicionarse y equilibrarse antes de la carga. Además, puede ajustarse el pH del tampón de carga, de tal forma que la proteína de fusión a albúmina no se une a la matriz de intercambio aniónico. De este modo, cualquier material contaminante, incluyendo ADN, proteínas de las células hospedadoras (HCP), virus e impurezas de molécula pequeña pueden separarse de la proteína de fusión a albúmina diana.
De acuerdo con la presente invención, en una realización, la membrana se emplea a un pH de menos de aproximadamente 9, un intervalo de aproximadamente 6 a aproximadamente 8, de aproximadamente 6.5 a aproximadamente 7.5, de aproximadamente 6 a aproximadamente 7.5 o de aproximadamente 7 a aproximadamente 7.5 o un pH de aproximadamente 6, 7, 8 o 9. En otra realización, la concentración de sal del tampón será mayor de 10 mM o un intervalo de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 200 mM, de aproximadamente 40 mM a aproximadamente 180 mM, de aproximadamente 50 mM a aproximadamente 150 mM, de aproximadamente 60 mM a aproximadamente 120 mM, de aproximadamente 60 mM a aproximadamente 80 mM. En algunas realizaciones, la concentración de sal del tampón es de aproximadamente 50 mM, aproximadamente 60 mM o aproximadamente 70 mM. En otras realizaciones, el tampón de flujo pasante tiene una concentración salina de 10 mM a 150 mM y un pH de 6 a 8. En otra realización, el tampón de flujo pasante tiene una concentración de sal de más de 10 mM y un pH de menos de 8. De manera destacable, se ha observado que tanto el rendimiento como la eliminación de ADN eran óptimos para las proteínas de fusión a albúmina a bajo pH, por ejemplo, de aproximadamente 7 a aproximadamente 7.5 y mayores concentraciones de sal, por ejemplo, mayores de 60 mM de sal.
De acuerdo con la presente invención, el sistema de intercambio aniónico de flujo pasante da como resultado un contenido de monómero aumentado, con bajos niveles de producto oxidado y eliminación de impurezas, incluyendo HCP y ADN. En una realización, el producto de esta etapa que contiene la proteína de fusión a albúmina tiene menos de aproximadamente un 10 %, menos de aproximadamente un 9 %, menos de aproximadamente un 8 %, menos de aproximadamente un 7 %, menos de aproximadamente un 6 %, menos de aproximadamente un 5 %, menos de aproximadamente un 4 %, menos de aproximadamente un 3 % o menos de aproximadamente un 2 % de producto oxidado en relación con la proteína completa. En otra realización, el producto de esta etapa que contiene la proteína de fusión a albúmina tiene menos de aproximadamente un 10 %, menos de aproximadamente un 9 %, menos de aproximadamente un 8 %, menos de aproximadamente un 7 %, menos de aproximadamente un 6 %, menos de aproximadamente un 5 %, menos de aproximadamente un 4 %, menos de aproximadamente un 3 % o menos de aproximadamente un 2 % de restos de triptófano oxidados en relación con el número total de restos de triptófano. En otra realización, la etapa de intercambio aniónico de flujo pasante elimina más de 1 o más de 2 órdenes de magnitud de proteínas de la célula hospedadora de la muestra original. En una realización de la invención, la etapa de intercambio aniónico de flujo pasante elimina al menos 3, 4, 5 o 6, 8, 9 o 10 o entre 3-6, 4-6 o 5-6, 8-10 o 9-10 órdenes de magnitud de las impurezas de ADN de la muestra original.
De acuerdo con la presente invención, el modo de unión y elución del intercambio aniónico puede llevarse a cabo en combinación con el modo de flujo pasante del intercambio aniónico. Pueden llevarse a cabo etapas de purificación opcionales adicionales antes, entre medias o después de las una o más etapas de intercambio aniónico. Por ejemplo, puede tratarse una muestra que comprende la proteína de fusión a albúmina con Triton X-100 para inactivar virus envueltos. Como alternativa, la muestra puede someterse a diafiltración o ultrafiltración. La sal puede añadirse a una concentración adecuada. En una realización, el eluyente que contiene la proteína de fusión a albúmina se diafiltra frente a bis-tris 50 mM, NaCl 20 mM a pH 7.0.
Etapas de purificación adicionales
Las etapas de purificación adicionales pueden incluir someter al eluyente/fracción que comprende la proteína de fusión a albúmina a una matriz de interacción hidrófoba o multimodal. La matriz de interacción hidrófoba puede encontrarse en cualquier matriz adecuada. En algunos casos, la matriz de interacción hidrófoba comprende un grupo hidrófobo de fenilo, octilo o butilo. Los expertos en la materia conocen matrices de interacción hidrófobas y estas se encuentran disponibles comercialmente, por ejemplo, Capto Butilo, Capto Fenilo, Capto Butilo, Butil-S Fast Flow (GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ), Toyopearl Hexilo, Toyopearl Butilo, Toyopearl Fenilo, Toyopearl PPG, Toyopearl Éter, Toyopearl PPG-600M y Toyopearl Fenilo-650M, Toyopearl PPG-600M, TSKgel Fenilo, TSKgel Éter (TOSOH Corporations, Tokio, Japón), Macro-Prep Metilo (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). La matriz multimodal puede ser cualquier matriz adecuada. En algunos casos, la matriz multimodal comprende un grupo hidrófobo de fenilo, octilo o butilo, junto con un grupo de intercambio catiónico o aniónico. Las matrices multimodales se encuentran disponibles comercialmente y son conocidas por los expertos en la materia, por ejemplo, Capto MMC, Eshmuno HCX, Nuvia cPrime o Toyopearl MX-Trp-650M. Se ha observado que la proteína de fusión a albúmina se equilibra opcionalmente con un tampón que contiene una sal, tal como sales en forma de cationes de amonio, litio, potasio, magnesio, calcio, aluminio o guanidinio y/o sales en forma de cationes de sulfato, fosfato, citrato, tartrato, cloruro, bromuro, yoduro, nitrato o clorato. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la sal es cloruro de sodio, sulfato de sodio, citrato de sodio o sulfato de amonio, en una cantidad adecuada, por ejemplo, de aproximadamente 100 mM a aproximadamente 2 M, de aproximadamente 200 mM a aproximadamente 1.5 M, de aproximadamente 300 mM a aproximadamente 1 M, de aproximadamente 400 mM a aproximadamente 800 mM de sal, por ejemplo, sal de citrato. Después del equilibrado, la muestra/fracción que contiene la proteína de fusión a albúmina se carga en la columna. En una realización, la columna se vuelve a equilibrar y después se eluye con una etapa o gradiente hasta un gradiente con una concentración de sal reducida.
En otra realización, las fracciones pueden purificarse adicionalmente sometiendo al eluyente/fracción que comprende la proteína de fusión a albúmina a nanofiltración. En algunas realizaciones, puede usarse nanofiltración para retirar las potenciales partículas de virus y puede llevarse a cabo con métodos convencionales para los expertos en la materia.
En otras realizaciones, las fracciones pueden someterse a cromatografía de exclusión por tamaños para purificar adicionalmente la proteína de fusión a albúmina.
En el presente documento también se proporciona un método para obtener una composición que comprende la proteína de fusión a albúmina esencialmente exenta de restos de triptófano oxidados. De acuerdo con esta realización, el método comprende someter a una composición que comprende proteínas de fusión a albúmina con triptófano oxidado y proteínas de fusión a albúmina con triptófano no oxidado a una matriz de interacción hidrófoba, en donde la proteína de fusión a albúmina con triptófano oxidado y la proteína de fusión a albúmina con triptófano no oxidado se eluyen de la matriz de interacción hidrófoba a diferentes tiempos, separando de este modo la proteína de fusión a albúmina con triptófano oxidado de la proteína de fusión a albúmina con triptófano no oxidado.
En el presente documento también se proporciona un método para aislar una proteína de fusión a albúmina esencialmente exenta de oxidación de los restos de triptófano y/o metionina. De acuerdo con esta realización, la composición que comprende una proteína de fusión a albúmina se somete a los siguientes procesos de purificación: (a) un proceso de cromatografía de matriz de afinidad; (b) un proceso de cromatografía de intercambio aniónico; y (c) un proceso de cromatografía de matriz de interacción hidrófoba. El tampón de elución para el proceso de cromatografía de matriz de afinidad que comprende caprilato/octanoato y en algunas realizaciones, EDTA adicional, se aplica a la matriz de afinidad. Además, la proteína de fusión a albúmina con triptófano oxidado y la proteína de fusión a albúmina con triptófano no oxidado se eluyen de la matriz de interacción hidrófoba a diferentes tiempos, separando de este modo la proteína de fusión a albúmina con triptófano oxidado de la proteína de fusión a albúmina con triptófano no oxidado.
En el presente documento también se proporciona un método para purificar una proteína de fusión a albúmina, que comprende someter a una composición que comprende una proteína de fusión a albúmina a una matriz de interacción hidrófoba y a uno o más de los siguientes procesos de purificación: (a) una matriz de afinidad, en donde se aplica a la matriz de afinidad un tampón de elución que comprende caprilato/octanoato y en algunas realizaciones, EDTA adicional; y/o (b) una matriz de intercambio aniónico, en donde la matriz de afinidad se lava con un tampón de lavado que comprende: (1) de aproximadamente un 2 % a aproximadamente un 20 % de poliol, en donde el poliol se selecciona entre el grupo que consiste en 1,2-propanodiol, 1,3-propanodiol, 1,2-butanodiol, 1,3-butanodiol, 1,4-butanodiol, 1,6-hexanodiol y 2-metil-2,4-pentanodiol; (2) sal de 0.05 M a 2.0 M, en donde la sal se selecciona entre cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, cloruro de litio, bromuro de sodio, bromuro de potasio y bromuro de litio; (3) sulfato de sodio de aproximadamente 0.02 M a aproximadamente 1 M; (4) de aproximadamente un 0.01 % a aproximadamente un 1 % de tensioactivo no iónico; (5) urea de aproximadamente 0.05 M a aproximadamente 1.0 M; y/o (6) nicotinamida de aproximadamente 0.02 M a aproximadamente 0.5 M. La proteína de fusión a albúmina purificada resultante está esencialmente exenta de restos de triptófano oxidados.
Un método para purificar una proteína de fusión a albúmina, comprendiendo el método: aplicar una composición que comprende la proteína de fusión a albúmina a una matriz de afinidad; eluir la proteína de fusión a albúmina de la matriz de afinidad para obtener un primer eluyente; aplicar el primer eluyente a una matriz de intercambio aniónico; eluir la proteína de fusión a albúmina de la matriz de intercambio aniónico para obtener un segundo eluyente; aplicar el segundo eluyente a una membrana de intercambio aniónico; hacer pasar la proteína de fusión a albúmina a través de una membrana de intercambio aniónico para obtener un flujo pasante; aplicar el flujo pasante a una matriz de interacción hidrófoba; eluir la proteína de fusión a albúmina de la matriz de interacción hidrófoba para obtener un tercer eluyente, en donde el tercer eluyente comprende la proteína de fusión a albúmina purificada. La proteína de fusión a albúmina purificada resultante tiene un 5 % o menos de restos de triptófano oxidados.
Composiciones de proteínas de fusión a albúmina purificadas
Se encuentran dentro del alcance de la presente invención composiciones que comprenden las proteínas de fusión a albúmina purificadas. A estas composiciones se les atribuyen bajos niveles de proteínas de la célula hospedadora, de ADN y de actividad vírica. Además, estas composiciones que comprenden las proteínas de fusión a albúmina purificadas tienen bajos niveles de oxidación y bioactividad conservada.
La composición o las fracciones que comprenden la proteína de fusión a albúmina purificada de acuerdo con la invención tiene menos de 20 ng/mg de proteínas de la célula hospedadora. En algunas realizaciones, la composición de proteína de fusión a albúmina tiene un nivel de proteínas de la célula hospedadora aceptable para una agencia gubernamental, por ejemplo, la Agencia de Medicamentos y Alimentos de los Estados Unidos, para su administración a un sujeto humano.
Además, la composición o las fracciones que comprenden la proteína de fusión a albúmina purificada de acuerdo con la invención tiene menos de aproximadamente 5x10-2, 1x10-2, 5x10-3, 1x10-3, 5x10-4 o 1x10-4 ng/mg. En una realización, la proteína de fusión a albúmina purificada de acuerdo con la invención tiene menos de 5x10-3 ng/mg de ADN. En algunas realizaciones, la composición de proteína de fusión a albúmina tiene un nivel de ADN aceptable para una agencia gubernamental, por ejemplo, la Agencia de Medicamentos y Alimentos de los Estados Unidos, para su administración a un sujeto humano.
Se ha observado que la oxidación de los restos de triptófano/metionina en las proteínas de fusión a albúmina puede afectar a la bioactividad y la potencia relativa de la proteína. Las proteínas de fusión a albúmina purificadas y obtenidas de acuerdo con los métodos de la presente invención tienen bajos niveles de oxidación. En una realización de la presente invención, la potencia relativa de la proteína de fusión a albúmina es de al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 % o al menos un 95 %. En otro caso, la proteína de fusión a albúmina tiene menos de un 25%, menos de un 20 %, menos de un 15 %, menos de un 10 % o menos de un 5 % de los restos de triptófano oxidados en relación con la cantidad total de restos de triptófano en la proteína. En un caso, la proteína de fusión a albúmina tiene menos de aproximadamente un 20 % de los restos de triptófano oxidados en relación con la cantidad total de la proteína. En otro caso, la proteína de fusión a albúmina tiene menos de un 10 %, menos de un 9 %, menos de un 8 %, menos de un 7 %, menos de un 6 % o menos de un 5 % de los restos de triptófano oxidados en relación con el número total de restos de triptófano en la proteína. En una realización de la invención, la proteína de fusión a albúmina tiene menos de aproximadamente un 5 % de los restos de triptófano oxidados en relación con el número total de restos de triptófano en la proteína.
Otra composición de la invención comprende una proteína de fusión a albúmina, en donde la composición tiene menos de 20 ng/mg de proteína de la célula hospedadora y en donde la proteína de fusión a albúmina tiene una actividad relativa de >90 %.
Una realización de la invención es una composición que comprende una proteína de fusión a albúmina, en donde la composición tiene menos de 5x10-3 ng/mg de ADN y en donde la proteína de fusión a albúmina tiene una actividad relativa de >90 %.
Proteínas de fusión a albúmina
La albúmina, tal como la seroalbúmina humana (HSA) o los fragmentos o variantes de la misma, pueden fusionarse o conjugarse a una proteína terapéutica para aumentar o extender la semivida de la proteína en el torrente sanguíneo y/o su penetración en tejidos. En algunas realizaciones, la propiedad mejorada mediante conjugación con una variante de HSA es la semivida en plasma. La mejora en la semivida en plasma de la proteína de fusión a albúmina puede ser una alteración en dicha propiedad, tal como un aumento o reducción en la semivida en plasma o cambios en otros parámetros farmacocinéticos.
Los fragmentos o variantes de albúmina o HSA que extienden o aumentan la semivida in vivo o sérica de la proteína terapéutica se encuentran dentro del alcance de la presente invención. Las variantes de HSA, es decir, una molécula procedente de HSA de longitud completa (SEQ ID NO: 139) que comprenden al menos una sustitución, una eliminación o un truncamiento de secuencia de aminoácidos, se han divulgado anteriormente. Por ejemplo, las siguientes publicaciones describen variantes de HSA que pueden usarse: WO 2011/103076, WO2011/051489 y WO 2012/112188. En una realización, la albúmina es HSA. En otra realización, la albúmina es una HSA variante.
En algunas realizaciones, la variante de HSA es un mutante procedente de HSA de longitud completa (SEQ ID NO: 138). En una realización específica, la variante de HSA comprende una sustitución de cisteína en la posición 34 a serina (SEQ ID NO: 133). Por ejemplo, las variantes de HSA que pueden usarse para modificar la semivida en plasma de un armazón de Tn3, se describen, por ejemplo, en las Publicaciones Internacionales WO 2011/103076 y WO 2011/051489. En algunas realizaciones, se aumenta la semivida en plasma de una proteína terapéutica de la invención fusionándola con una variante de HSA que comprende al menos una sustitución de aminoácidos en el dominio III de HSA. Otra realización incluye casos donde la secuencia de aminoácidos de la HSA variante es la SEQ ID NO: 133.
En algunas realizaciones, la proteína de fusión a albúmina de la invención comprende una variante de HSA que comprende la secuencia de h Sa madura de longitud completa (SEQ ID NO: 138) o un fragmento de la misma, excepto por al menos una sustitución de aminoácidos, numerada en relación con la posición en la HSA madura de longitud completa, en una posición seleccionada entre el grupo que consiste en 407, 415, 463, 500, 506, 508, 509, 511, 512, 515, 516, 521, 523, 524, 526, 535, 550, 557, 573, 574 y 580; en donde la al menos una sustitución de aminoácidos no comprende una de lisina (K) a ácido glutámico (E) en la posición 573 y en donde la proteína terapéutica tiene una semivida en plasma mayor que la semivida en plasma de una proteína terapéutica idéntica no conjugada a la variante de HSA.
En algunas realizaciones diferentes, al menos una sustitución de aminoácidos, numerada en relación con la posición en la HSA madura de longitud completa, se encuentra en una posición seleccionada entre el grupo que consiste en 463, 508, 523 y 524, en donde la proteína terapéutica tiene una semivida en plasma mayor que la semivida en plasma de la proteína terapéutica no conjugada a la variante de HSA.
En otras realizaciones, una proteína de fusión a albúmina de la invención comprende una variante de HSA que comprende la secuencia de HSA madura de longitud completa (SEQ ID NO: 133 o 138) o un fragmento de la misma, excepto por al menos una sustitución de aminoácidos, numerada en relación con la posición en HSA madura de longitud completa, seleccionada entre el grupo que consiste en:
(a) sustitución de leucina (L) en la posición 407 a asparagina (N) o tirosina (Y);
(b) sustitución de valina (V) en la posición 415 a treonina (T);
(c) sustitución de leucina (L) en la posición 463 a asparagina (N);
(d) sustitución de lisina (K) en la posición 500 a arginina (R);
(e) sustitución de treonina (T) en la posición 506 a tirosina (Y);
(f) sustitución de treonina (T) en la posición 508 a arginina (R);
(g) sustitución de fenilalanina (F) en la posición 509 a metionina (M) o triptófano (W);
(h) sustitución de alanina (A) en la posición 511 a fenilalanina (F);
(i) sustitución de ácido aspártico (D) en la posición 512 a tirosina (Y);
(j) sustitución de treonina (T) en la posición 515 a glutamina (R);
(k) sustitución de leucina (L) en la posición 516 a treonina (T) o triptófano (W);
(l) sustitución de arginina (R) en la posición 521 a triptófano (W);
(m) sustitución de isoleucina (I) en la posición 523 a ácido aspártico (D), ácido glutámico (E), glicina (G), lisina (K) o arginina (R);
(n) sustitución de lisina (K) en la posición 524 a leucina (L);
(o) sustitución de glutamina (Q) en la posición 526 a metionina (M);
(p) sustitución de histidina (H) en la posición 535 a prolina (P);
(q) sustitución de ácido aspártico (D) en la posición 550 a ácido glutámico (E);
(r) sustitución de lisina (K) en la posición 557 a glicina (G);
(s) sustitución de lisina (K) en la posición 573 a fenilalanina (F), histidina (H), prolina (P), triptófano (W) o tirosina (Y); (t) sustitución de lisina (K) en la posición 574 a asparagina (N);
(u) sustitución de glutamina (Q) en la posición 580 a lisina (K); y,
(v) una combinación de dos o más de dichas sustituciones,
en donde la proteína terapéutica tiene una semivida en plasma mayor que la semivida en plasma de una proteína terapéutica idéntica no conjugada a dicha variante de HSA.
En algunas realizaciones, la proteína de fusión a albúmina comprende una variante de HSA que comprende la secuencia de HSA madura de longitud completa (SEQ ID NO: 133 o 138) o un fragmento de la misma, excepto por al menos una sustitución de aminoácidos, numerada en relación con la posición en HSA madura de longitud completa, seleccionada entre el grupo que consiste en:
(a) sustitución de leucina (L) en la posición 463 a asparagina (N);
(b) sustitución de treonina (T) en la posición 508 a arginina (R);
(c) sustitución de isoleucina (I) en la posición 523 a ácido aspártico (D), ácido glutámico (E), glicina (G), lisina (K) o arginina (R);
(d) sustitución de lisina (K) en la posición 524 a leucina (L); y,
(e) una combinación de dos o más de dichas sustituciones,
en donde dicha proteína terapéutica tiene una semivida en plasma mayor que la semivida en plasma de una proteína terapéutica idéntica no conjugada a dicha variante de HSA.
Pueden generarse proteínas de fusión a albúmina mediante técnicas convencionales, por ejemplo, mediante expresión de la proteína de fusión a partir de un gen de fusión recombinante construido usando secuencias génicas públicamente disponibles.
La proteína terapéutica puede ser cualquier proteína que puede fusionarse o conjugarse a albúmina para aumentar o prolongar su semivida. En una realización, la proteína terapéutica comprende un resto de armazón que comprende un resto de triptófano, en donde la oxidación del triptófano reduce la actividad biológica de la proteína de fusión a albúmina. En otra realización, la proteína es capaz de unirse a CD40L. En otra realización, la proteína terapéutica es un resto de armazón capaz de unirse a CD40L. Otra realización proporciona que el resto de armazón comprenda un tercer dominio de fibronectina de tipo III (FnIIII). Se han descrito con anterioridad armazones que comprenden dominios FnIII, por ejemplo, en los documentos WO 98/56915, WO 2009/023184, WO 2009/05379, WO 2010/051274. WO 2010/093627). En algunas realizaciones, el dominio FnIII puede proceder de tenascina C humana (armazones de Tn3). Se han descrito dichos armazones de Tn3, por ejemplo, en los documentos WO 2009/05379, WO 2010/051274 y WO2013/055745.
Albúmina fusionada a armazones
En una realización de la invención, la proteína de fusión a albúmina comprende un armazón. Por ejemplo, los armazones pueden comprender subunidades de monómero específicas para CD40L procedentes del tercer dominio FnIII de tenascina C humana (Tn3), en los que se ha introducido por ingeniería genética al menos un enlace disulfuro intramolecular de origen no natural. Las subunidades de monómero que forman los armazones de Tn3 de la invención se pliegan correctamente de manera independiente entre sí, conservan su especificidad y afinidad de unión y cada uno de los armazones monoméricos conserva sus propiedades funcionales. Cuando las subunidades de monómero se ensamblan en armazones de Tn3 multiméricos de alta valencia, las subunidades de monómero se pliegan independientemente entre sí, conservan su especificidad de unión y cada uno de los monómeros conserva sus propiedades funcionales.
Los armazones de la invención que comprenden más de una subunidad de monómero pueden unirse a múltiples epítopos, por ejemplo (i) se unen a múltiples epítopos en una sola diana, (ii) se unen a un solo epítopo en múltiples dianas, (iii) se unen a múltiples epítopos ubicados en diferentes subunidades de una diana o (iv) se unen a múltiples epítopos en múltiples dianas, aumentando de este modo la avidez.
Además, debido a la posibilidad de variar la distancia entre múltiples monómeros por medio de enlazadores, los armazones de Tn3 multiméricos tienen la capacidad de unirse a múltiples moléculas diana en una superficie (ya sea sobre la misma célula/superficie o en diferentes células/superficies). Como resultado de su capacidad para unirse simultáneamente a más de una diana, un armazón de Tn3 multimérico de la invención puede usarse para modular múltiples vías, reticularse con receptores en una superficie celular, unirse a receptores de la superficie celular en células separadas y/o unir moléculas o células diana a un sustrato.
Además, la presente invención proporciona armazones con afinidad madurada, en donde se modula mediante mutación la afinidad de un armazón por una diana específica. Asimismo, la invención proporciona métodos para producir los armazones de la invención, así como métodos para modificar armazones con propiedades fisicoquímicas, farmacológicas o inmunológicas deseables. Además, la presente invención proporciona usos para dichos armazones y métodos de uso terapéutico, profiláctico y diagnóstico.
En una realización, la proteína de fusión a albúmina tiene un armazón de Tn3, tal como el descrito en la Publicación de Solicitud PCT n.° WO 2013/055745, presentada el 10 de octubre de 2012. Cuando se purifica la proteína de fusión de albúmina-armazón de Tn3, se ha observado que los restos de triptófano y metionina son susceptibles a la oxidación. Por ejemplo, cuando el armazón de Tn3 se selecciona entre una proteína de fusión a albúmina de las SEQ ID NO: 134, 135, 201,202, 203, 204, 205, 206, 207 o 208, se ha observado que la oxidación puede producirse en los restos de aminoácido de triptófano W46/151, en el bucle de unión de Tn3 y los restos de aminoácido de metionina, M74/179, M498, M529 en Tn3 y la seroalbúmina humana durante el proceso de purificación. Los estudios de impacto revelaron que la oxidación en W46/151, M74/179, M498 y M529 de la proteína de albúmina-armazón de Tn3 pueden tener impacto en la bioactividad. En particular, se ha observado que la oxidación en W46/151 en el bucle de unión de Tn3 tenía un impacto negativo en la bioactividad y potencia relativa de MEDI4920. Sin embargo, la oxidación en M74/179, M498 y M529 tuvo un impacto menor en la bioactividad de la proteína de fusión. Sin embargo, el objetivo de la presente invención es reducir las especies de oxidación de las proteínas de fusión a albúmina mediante un proceso de purificación previsto para controlar la oxidación de los aminoácidos susceptibles de las proteínas de fusión a albúmina.
El motivo estructural FnIII
Los armazones adecuados de la presente invención incluyen aquellos basados en la estructura de un módulo de fibronectina de tipo III (FnIII), un dominio que se encuentra ampliamente entre los tres dominios de vida y los virus y en múltiples clases de proteínas. En realizaciones específicas, los armazones de la invención proceden del tercer dominio FnIII de tenascina C humana (véanse las Solicitudes Internacionales n.° PCT/US2008/012398, publicada como el documento WO 2009/058379; PCT/US2011/032184, publicada como el documento WO 2011/130324; y la Solicitud Internacional n.° PCT/US2011/032188, publicada como el documento WO2011130328).
En una realización específica, los armazones de Tn3 de la invención comprenden una subunidad de monómero específica para CD40L procedente de un armazón de Tn3 precursor. El pliegue tridimensional general del monómero está estrechamente relacionado con el del fragmento de anticuerpo funcional más pequeño, la región variable de la cadena pesada (VH), que en los anticuerpos de un solo dominio de camellos y camélidos (por ejemplo, llamas), comprende la unidad de reconocimiento de antígeno completa.
Las subunidades de monómero de Tn3 de la invención y el dominio FnlII nativo de tenascina C se caracterizan por la misma estructura tridimensional, a saber, una estructura de sándwich beta con tres hebras beta (A, B y E) en un lado y cuatro hebras beta (C, D, F y G) en el otro lado, conectadas mediante seis regiones de bucle. Estas regiones de bucle se diseñan de acuerdo con las hebras beta conectadas a los extremos amino y carboxilo de cada bucle. Por consiguiente, el bucle AB está ubicado entre las hebras beta A y B, el bucle BC está ubicado entre las hebras beta B y C, el bucle CD está ubicado entre las hebras beta C y D, el bucle DE está ubicado entre las hebras beta D y E, el bucle EF está ubicado entre las hebras beta E y F y el bucle FG está ubicado entre las hebras beta F y G. Los dominios de FnIII poseen bucles expuestos al disolvente que toleran la aleatorización, lo que facilita la regeneración de diversos grupos de armazones de proteínas capaces de unirse a dianas específicas con alta afinidad.
En un aspecto de la invención, las subunidades de monómero de Tn3 se someten a evolución dirigida diseñada para aleatorizar uno o más de los bucles que son análogos a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de una región variable de anticuerpo. Dicho enfoque de evolución dirigida da como resultado la producción de moléculas similares a anticuerpos con altas afinidades por las dianas de interés, por ejemplo, CD40L.
Además, en algunas realizaciones, los armazones de Tn3 descritos en el presente documento pueden usarse para presentar bucles expuestos definidos (por ejemplo, bucles previamente aleatorizados y seleccionados basándose en la unión a la diana) para dirigir la evolución de las moléculas que se unen a dichos bucles introducidos. Este tipo de selección puede llevarse a cabo para identificar moléculas de reconocimiento para cualquier bucle similar a CDR individual o, como alternativa, para el reconocimiento de dos o los tres bucles similares a CDR combinados en un resto de unión a epítopo no lineal. Un grupo de tres bucles (denominados BC, DE y FG), que pueden conferir unión específica a la diana, se encuentra entre las hebras beta B y C; las hebras beta D y E y las hebras beta F y G, respectivamente. Los bucles BC, DE y FB del tercer dominio FnIII de tenascina C humana tienen 9, 6 y 10 aminoácidos de longitud, respectivamente. La longitud de estos bucles se encuentra dentro del estrecho intervalo de los bucles de reconocimiento de antígeno afines en las cadenas pesadas de los anticuerpos, es decir, de 7-10, 4-8 y 4-28 aminoácidos de longitud, respectivamente. De manera similar, un segundo grupo de bucles, los bucles AB, CD y EF (de 7, 7 y 8 aminoácidos de longitud, respectivamente) se encuentran entre las hebras beta A y B; las hebras beta C y D; y las hebras beta E y F, respectivamente.
Una vez aleatorizados y seleccionados por su unión de alta afinidad a una diana, los bucles en el armazón de monómero Tn3 pueden establecer contactos con las dianas de manera equivalente a los contactos de los bucles de CDR afines en los anticuerpos. Por consiguiente, en algunas realizaciones, los bucles AB, CD y EF se aleatorizan y seleccionan por su unión de alta afinidad a una o más dianas, por ejemplo, CD40L. En algunas realizaciones, este proceso de aleatorización y selección puede llevarse a cabo en paralelo con la aleatorización de los bucles BC, DE y FG, mientras que en otras realizaciones, este proceso de aleatorización y selección se lleva a cabo en series.
Subunidades monoméricas específicas para CD40L
La invención proporciona armazones de T n3 recombinantes de origen no natural específicos para CD40L que comprenden una pluralidad de dominios de hebra beta unidos a diversas regiones de bucle, en donde una o más de dichas regiones de bucle varían mediante la eliminación, sustitución o adición de al menos un aminoácido de los bucles afines en Tn3 de tipo silvestre (SEQ ID NO: 3) (véase la tabla 1).
Para generar subunidades de monómero de Tn3 mejoradas específicas para CD40L con nuevas características de unión, se somete al Tn3 precursor a adiciones, eliminaciones o sustituciones de aminoácidos. Se entenderá que, cuando se compara la secuencia de una subunidad de monómero de Tn3 específica para CD40L con la secuencia de Tn3 precursora, se utiliza la misma definición de las hebras beta y los bucles. En algunas realizaciones, las subunidades de monómero de Tn3 específicas para CD40L de la invención comprenden la secuencia de aminoácidos:
IEV(XAB)nALITW(XBc)nCELXlYGI(XcD)nTTIDL(XDE)nYSI(XEF)nYEVSLIC
(Xfg)iiKETFTT
en donde:
(a) Xab , Xbc, Xcd, Xde, Xef y Xfg representan los restos de aminoácidos presentes en las secuencias de los bucles AB, BC, CD, DE, EF y FG, respectivamente;
(b) X 1 representa el resto de aminoácido alanina (A) o treonina (T); y,
(c) la longitud del bucle n es un número entero entre 2 y 26.
Tabla 2: Secuencias de bucle de los clones de Tn3 usados en estos estudios
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En algunas realizaciones, las subunidades de monómero de Tn3 específicas para CD40L de la invención consisten en la secuencia de aminoácidos:
IEV(XAB)nALITW(XBC)nCELXlYGI(XcD)nTTIDL(XDE)nYSI(XEF)nYEVSLIC(XFG)nKETFT
T
en donde:
(a) Xab , Xbc, Xcd, Xde, Xef y Xfg representan los restos de aminoácidos presentes en las secuencias de los bucles AB, BC, CD, DE, EF y FG, respectivamente;
(b) X 1 representa el resto de aminoácido alanina (A) o treonina (T); y,
(c) la longitud del bucle n es un número entero entre 2 y 26.
En una realización, las hebras beta del armazón de monómero de Tn3 específico para CD40L tienen al menos un 90 % de identidad de secuencia respecto de las hebras beta del armazón de Tn3 precursor (SEQ ID NO: 3). Para calcular dicho porcentaje de identidad de secuencia, se alinean las secuencias de aminoácidos aplicando métodos conocidos en la técnica. El porcentaje de identidad de secuencia se define como la relación entre (a) el número de aminoácidos ubicados en las hebras beta que son idénticos en el alineamiento de secuencias y (b) el número total de aminoácidos ubicados en las hebras beta.
En una realización, la secuencia del bucle AB comprende la SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 136. En otra realización, la secuencia del bucle CD comprende la SEQ ID NO: 6. En otra realización, la secuencia del bucle EF comprende la SEQ ID NO: 8 o la SEQ ID NO: 137. En una realización, la secuencia del bucle AB consiste en la SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 136. En otra realización, la secuencia del bucle CD consiste en la SEQ ID NO: 6. En otra realización, la secuencia del bucle EF consiste en la SEQ ID NO: 8 o la SEQ ID NO: 137.
En una realización, la secuencia del bucle BC comprende una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 83, 84, 85, 86 , 87, 88 , 89, 90, 91, 92 y 93. En otra realización, la secuencia del bucle BC consiste en una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 83, 84 , 85, 86 , 87, 88 , 89, 90, 91,92 y 93. En una realización, la secuencia del bucle DE comprende una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 94, 95, 96, 97 y 98. En otra realización, la secuencia del bucle DE consiste en una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 94, 95, 96, 97 y 98.
En una realización, la secuencia del bucle FG comprende una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 9, 99 y 139. En otra realización, la secuencia del bucle FG consiste en una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 9, 99 y 139.
En una realización, la secuencia del bucle BC comprende una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116 y 117. En otra realización, la secuencia del bucle BC consiste en una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116 y 117.
En algunas realizaciones, la secuencia del bucle DE comprende una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127 y 128. En otras realizaciones, la secuencia del bucle DE consiste en una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127 y 128.
En algunas realizaciones, la secuencia del bucle FG comprende una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 129 y 130. En otras realizaciones, la secuencia del bucle FG consiste en una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 129 y 130.
En algunas realizaciones, la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 83, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 94 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 9 o 139. En algunas realizaciones, la secuencia del bucle BC consiste en la SEQ ID NO: 83, la secuencia del bucle DE consiste en la SEQ ID NO: 94 y la secuencia del bucle FG consiste en la SEQ ID NO: 9 o 139.
En algunas realizaciones, la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 83, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 94 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 99. En otras realizaciones, la secuencia del bucle BC consiste en la SEQ ID NO: 83, la secuencia del bucle DE consiste en la SEQ ID NO: 94 y la secuencia del bucle FG consiste en la SEQ ID NO: 99.
En algunas realizaciones, la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 84, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 95 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 9 o 139. En otras realizaciones, la secuencia del bucle BC consiste en la SEQ ID NO: 84, la secuencia del bucle DE consiste en la SEQ ID NO: 95 y la secuencia del bucle FG consiste en la SEQ ID NO: 9 o 139.
En algunas realizaciones, la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 85, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 94 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 9 o 139. En otras realizaciones, la secuencia del bucle BC consiste en la SEQ ID NO: 85, la secuencia del bucle DE consiste en la SEQ ID NO: 94 y la secuencia del bucle FG consiste en la SEQ ID NO: 9 o 139.
En algunas realizaciones, la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 86, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 96 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 9 o 139. En otras realizaciones, la secuencia del bucle BC consiste en la SEQ ID NO: 86, la secuencia del bucle DE consiste en la SEQ ID NO: 96 y la secuencia del bucle FG consiste en la SEQ ID NO: 9 o 139.
En algunas realizaciones, la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 87, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 97 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 9 o 139. En otras realizaciones, la secuencia del bucle BC consiste en la SEQ ID NO: 87, la secuencia del bucle DE consiste en la SEQ ID NO: 97 y la secuencia del bucle FG consiste en la SEQ ID NO: 9 o 139.
En algunas realizaciones, la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 88, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 95 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 9 o 139. En otras realizaciones, la secuencia del bucle BC consiste en la SEQ ID NO: 88, la secuencia del bucle DE consiste en la SEQ ID NO: 95 y la secuencia del bucle FG consiste en la SEQ ID NO: 9 o 139.
En algunas realizaciones, la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 89, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 94 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 9 o 139. En otras realizaciones, la secuencia del bucle BC consiste en la SEQ ID NO: 89, la secuencia del bucle DE consiste en la SEQ ID NO: 94 y la secuencia del bucle FG consiste en la SEQ ID NO: 9 o 139.
En algunas realizaciones, la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 90, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 94 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 9 o 139. En otras realizaciones, la secuencia del bucle BC consiste en la SEQ ID NO: 90, la secuencia del bucle DE consiste en la SEQ ID NO: 94 y la secuencia del bucle FG consiste en la SEQ ID NO: 9 o 139.
En algunas realizaciones, la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 91, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 95 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 9 o 139. En otras realizaciones, la secuencia del bucle BC consiste en la SEQ ID NO: 91, la secuencia del bucle DE consiste en la SEQ ID NO: 95 y la secuencia del bucle FG consiste en la SEQ ID NO: 9 o 139.
En algunas realizaciones, la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 92, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 98 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 9 o 139. En otras realizaciones, la secuencia del bucle BC consiste en la SEQ ID NO: 92, la secuencia del bucle DE consiste en la SEQ ID NO: 98 y la secuencia del bucle FG consiste en la SEQ ID NO: 9 o 139.
En algunas realizaciones, la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 93, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 94 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 9 o 139. En otras realizaciones, la secuencia del bucle BC consiste en la SEQ ID NO: 93, la secuencia del bucle DE consiste en la SEQ ID NO: 94 y la secuencia del bucle FG consiste en la SEQ ID NO: 9 o 139.
En algunas realizaciones, la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 168, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 169 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 170. En otras realizaciones, la secuencia del bucle BC consiste en la SEQ ID NO: 168, la secuencia del bucle DE consiste en la SEQ ID NO: 169 y la secuencia del bucle FG consiste en la SEQ ID NO: 170.
En algunas realizaciones, la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 100, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 118 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 129. En otras realizaciones, la secuencia del bucle BC consiste en la SEQ ID NO: 100, la secuencia del bucle DE consiste en la SEQ ID NO: 118 y la secuencia del bucle FG consiste en la SEQ ID NO: 129.
En algunas realizaciones, la secuencia del bucle AB comprende la SEQ ID NO: 136, la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 101, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 119 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 129. En otras realizaciones, la secuencia del bucle AB consiste en la SEQ ID NO: 136, la secuencia del bucle BC consiste en la SEQ ID NO: 101, la secuencia del bucle DE consiste en la SEQ ID NO: 119 y la secuencia del bucle FG consiste en la SEQ ID NO: 129.
En algunas realizaciones, la secuencia del bucle AB comprende la SEQ ID NO: 136, la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 102, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 120 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 129. En otras realizaciones, la secuencia del bucle AB consiste en la SEQ ID NO: 136, la secuencia del bucle BC consiste en la SEQ ID NO: 102, la secuencia del bucle DE consiste en la SEQ ID NO: 120 y la secuencia del bucle FG consiste en la SEQ ID NO: 129.
En algunas realizaciones, la secuencia del bucle AB comprende la SEQ ID NO: 136, la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 103, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 121 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 129. En otras realizaciones, la secuencia del bucle AB consiste en la SEQ ID NO: 136, la secuencia del bucle BC consiste en la SEQ ID NO: 103, la secuencia del bucle DE consiste en la SEQ ID NO: 121 y la secuencia del bucle FG consiste en la SEQ ID NO: 129.
En algunas realizaciones, la secuencia del bucle AB comprende la SEQ ID NO: 136, la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 104, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 122 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 129. En otras realizaciones, la secuencia del bucle AB consiste en la SEQ ID NO: 136, la secuencia del bucle BC consiste en la SEQ ID NO: 104, la secuencia del bucle DE consiste en la SEQ ID NO: 122 y la secuencia del bucle FG consiste en la SEQ ID NO: 129.
En algunas realizaciones, la secuencia del bucle AB comprende la SEQ ID NO: 136, la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 105, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 121 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 129. En otras realizaciones, la secuencia del bucle AB consiste en la SEQ ID NO: 136, la secuencia del bucle BC consiste en la SEQ ID NO: 105, la secuencia del bucle DE consiste en la SEQ ID NO: 121 y la secuencia del bucle FG consiste en la SEQ ID NO: 129.
En algunas realizaciones, la secuencia del bucle AB comprende la SEQ ID NO: 136, la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 106, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 123 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 129. En otras realizaciones, la secuencia del bucle AB consiste en la SEQ ID NO: 136, la secuencia del bucle BC consiste en la SEQ ID NO: 106, la secuencia del bucle DE consiste en la SEQ ID NO: 123 y la secuencia del bucle FG consiste en la SEQ ID NO: 129.
En algunas realizaciones, la secuencia del bucle AB comprende la SEQ ID NO: 136, la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 107, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 123 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 129. En otras realizaciones, la secuencia del bucle AB consiste en la SEQ ID NO: 136, la secuencia del bucle BC consiste en la SEQ ID NO: 107, la secuencia del bucle DE consiste en la SEQ ID NO: 123 y la secuencia del bucle FG consiste en la SEQ ID NO: 129.
En algunas realizaciones, la secuencia del bucle AB comprende la SEQ ID NO: 136, la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 108, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 118 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 129. En otras realizaciones, la secuencia del bucle AB consiste en la SEQ ID NO: 136, la secuencia del bucle BC consiste en la SEQ ID NO: 108, la secuencia del bucle DE consiste en la SEQ ID NO: 118 y la secuencia del bucle FG consiste en la SEQ ID NO: 129.
En algunas realizaciones, la secuencia del bucle AB comprende la SEQ ID NO: 136, la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 109, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 123 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 129. En otras realizaciones, la secuencia del bucle AB consiste en la SEQ ID NO: 136, la secuencia del bucle BC consiste en la SEQ ID NO: 109, la secuencia del bucle DE consiste en la SEQ ID NO: 123 y la secuencia del bucle FG consiste en la SEQ ID NO: 129.
En algunas realizaciones, la secuencia del bucle AB comprende la SEQ ID NO: 136, la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 110, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 121 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 129. En otras realizaciones, la secuencia del bucle AB consiste en la SEQ ID NO: 136, la secuencia del bucle BC consiste en la SEQ ID NO: 110, la secuencia del bucle DE consiste en la SEQ ID NO: 121 y la secuencia del bucle FG consiste en la SEQ ID NO: 129.
En algunas realizaciones, la secuencia del bucle AB comprende la SEQ ID NO: 136, la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 111, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 123 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 130. En otras realizaciones, la secuencia del bucle AB consiste en la SEQ ID NO: 136, la secuencia del bucle BC consiste en la SEQ ID NO: 111, la secuencia del bucle DE consiste en la SEQ ID NO: 123 y la secuencia del bucle FG consiste en la SEQ ID NO: 130.
En algunas realizaciones, la secuencia del bucle AB comprende la SEQ ID NO: 136, la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 108, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 121 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 129. En otras realizaciones, la secuencia del bucle AB consiste en la SEQ ID NO: 136, la secuencia del bucle BC consiste en la SEQ ID NO: 108, la secuencia del bucle DE consiste en la SEQ ID NO: 121 y la secuencia del bucle FG consiste en la SEQ ID NO: 129.
En algunas realizaciones, la secuencia del bucle AB comprende la SEQ ID NO: 136, la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 112, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 124 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 129. En otras realizaciones, la secuencia del bucle AB consiste en la SEQ ID NO: 136, la secuencia del bucle BC consiste en la SEQ ID NO: 112, la secuencia del bucle DE consiste en la SEQ ID NO: 124 y la secuencia del bucle FG consiste en la SEQ ID NO: 129.
En algunas realizaciones, la secuencia del bucle AB comprende la SEQ ID NO: 136, la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 113, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 125 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 129. En otras realizaciones, la secuencia del bucle AB consiste en la SEQ ID NO: 136, la secuencia del bucle BC consiste en la SEQ ID NO: 113, la secuencia del bucle DE consiste en la SEQ ID NO: 125 y la secuencia del bucle FG consiste en la SEQ ID NO: 129.
En algunas realizaciones, la secuencia del bucle AB comprende la SEQ ID NO: 136, la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 114, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 118 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 129. En otras realizaciones, la secuencia del bucle AB consiste en la SEQ ID NO: 136, la secuencia del bucle BC consiste en la SEQ ID NO: 114, la secuencia del bucle DE consiste en la SEQ ID NO: 118 y la secuencia del bucle FG consiste en la SEQ ID NO: 129.
En algunas realizaciones, la secuencia del bucle AB comprende la SEQ ID NO: 136, la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 115, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 126 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 129. En otras realizaciones, la secuencia del bucle AB consiste en la SEQ ID NO: 136, la secuencia del bucle BC consiste en la SEQ ID NO: 115, la secuencia del bucle DE consiste en la SEQ ID NO: 126 y la secuencia del bucle FG consiste en la SEQ ID NO: 129.
En algunas realizaciones, la secuencia del bucle AB comprende la SEQ ID NO: 136, la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 116, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 127 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 129. En otras realizaciones, la secuencia del bucle AB consiste en la SEQ ID NO: 136, la secuencia del bucle BC consiste en la SEQ ID NO: 116, la secuencia del bucle DE consiste en la SEQ ID NO: 127 y la secuencia del bucle FG consiste en la SEQ ID NO: 129.
En algunas realizaciones, la secuencia del bucle AB comprende la SEQ ID NO: 136, la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 117, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 128 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 129. En otras realizaciones, la secuencia del bucle AB consiste en la SEQ ID NO: 136, la secuencia del bucle BC consiste en la SEQ ID NO: 117, la secuencia del bucle DE consiste en la SEQ ID NO: 128 y la secuencia del bucle FG consiste en la SEQ ID NO: 129.
En algunas realizaciones, la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 174, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 175 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 177. En otras realizaciones, la secuencia del bucle BC consiste en la SEQ ID NO: 174, la secuencia del bucle DE consiste en la SEQ ID NO: 175 y la secuencia del bucle FG consiste en la SEQ ID NO: 177.
En algunas realizaciones, la subunidad de monómero específica para CD40L comprende una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42 y 146. En otras realizaciones, la subunidad de monómero específica para CD40L consiste en una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42 y 146.
En algunas realizaciones, la subunidad de monómero específica para CD40L comprende la SEQ ID NO: 28 o 146. En otras realizaciones, la subunidad de monómero específica para CD40L consiste en la SEQ ID NO: 28 o 146.
En algunas realizaciones, las subunidades de monómero de Tn3 específicas para CD40L de la invención comprenden la secuencia de aminoácidos:
IEVKD VTDTTALITWX1DX2X3X4X5X6X7X8CELT Y GIKDVPGDRTTIDLWX9HX10 AX i 1
YSIGNLKPDTEYEVSLICRX12GDMSSNPAKETFTT (SEQ ID NO: 167)
en donde:
(a) X 1 representa el resto de aminoácido serina (S) o leucina (L);
(b) X2 representa el resto de aminoácido ácido aspártico (D) o ácido glutámico (E);
(c) X3 representa el resto de aminoácido histidina (H), isoleucina (I), valina (V), fenilalanina (F) o triptófano (W);
(d) X4 representa el resto de aminoácido alanina (A), glicina (G), ácido glutámico (E) o ácido aspártico (D);
(e) X5 representa e
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resto de aminoácido ácido glutámico (E), leucina (L), glutamina (Q), serina (S), ácido aspártico (D) o asparagina (N);
(f) X6 representa el resto de aminoácido fenilalanina (F) o tirosina (Y);
(g) X 7 representa el resto de aminoácido isoleucina (I), valina (V), histidina (H), ácido glutámico (E) o ácido aspártico (D); (h) Xs representa el resto de aminoácido glicina (G), triptófano (W) o valina (V);
(i) X9 representa el resto de aminoácido triptófano (W), fenilalanina (F) o tirosina (Y);
(j) X 10 representa el resto de aminoácido serina (S), glutamina (Q), metionina (M) o histidina (H);
(k) X 11 representa el resto de aminoácido triptófano (W) o histidina (H); y,
(l) X 12 representa el resto de aminoácido arginina (R) o serina (S).
En algunas realizaciones, las subunidades de monómero de Tn3 específicas para CD40L de la invención consisten en la secuencia de aminoácidos:
IEVKD VTDTTALITWX1DX2X3X4X5X6X7X8CELT Y GIKDVPGDRTTIDLWX9HX10 AXi 1
YSIGNLKPDTEYEVSLICRX12GDMSSNPAKETFTT (SEQ ID NO: 167)
en donde:
(a) X 1 representa el resto de aminoácido serina (S) o leucina (L);
(b) X2 representa el resto de aminoácido ácido aspártico (D) o ácido glutámico (E);
(c) X3 representa el resto de aminoácido histidina (H), isoleucina (I), valina (V), fenilalanina (F) o triptófano (W);
(d) X4 representa el resto de aminoácido alanina (A), glicina (G), ácido glutámico (E) o ácido aspártico (D);
(e) X5 representa el resto de aminoácido ácido glutámico (E), leucina (L), glutamina (Q), serina (S), ácido aspártico (D) o asparagina (N);
(f) X6 representa el resto de aminoácido fenilalanina (F) o tirosina (Y);
(g) X 7 representa el resto de aminoácido isoleucina (I), valina (V), histidina (H), ácido glutámico (E) o ácido aspártico (D); (h) X8 representa el resto de aminoácido glicina (G), triptófano (W) o valina (V);
(i) X9 representa el resto de aminoácido triptófano (W), fenilalanina (F) o tirosina (Y);
(j) X 10 representa el resto de aminoácido serina (S), glutamina (Q), metionina (M) o histidina (H);
(k) X 11 representa el resto de aminoácido triptófano (W) o histidina (H); y,
(l) X 12 representa el resto de aminoácido arginina (R) o serina (S).
En algunas realizaciones, la subunidad de monómero específica para CD40L comprende una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80 y 82. En algunas realizaciones, la subunidad de monómero específica para CD40L consiste en una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80 y 82.
En algunas realizaciones, las subunidades de monómero de Tn3 específicas para CD40L de la invención comprenden la secuencia de aminoácidos:
IEVX1DVTDTTALITWX2X3RSX4X5X6X7X8X9X10CELX11YGIKDVPGDRTTIDLX12X13X1
4X15YVHYSIGNLKPDTX16YEVSLICLTTDGTYX17NPAKETFTT (SEQ ID NO: 171)
en donde:
(a) X 1 representa el resto de aminoácido lisina (K) o ácido glutámico (E);
(b) X2 representa el resto de aminoácido treonina (T) o isoleucina (I);
(c) X3 representa el resto de aminoácido asparagina (N) o alanina (A);
(d) X4 representa el resto de aminoácido serina (S), leucina (L), alanina (A), fenilalanina (F) o tirosina (Y);
(e) X5 representa el resto de aminoácido tirosina (Y), alanina (A), glicina (G), valina (V), isoleucina (I) o serina (S); (f) X6 representa el resto de aminoácido tirosina (Y), serina (S), alanina (A) o histidina (H);
(g) X 7 representa el resto de aminoácido asparagina (N), ácido aspártico (D), histidina (H) o tirosina (Y);
(h) Xs representa el resto de aminoácido leucina (L), fenilalanina (F), histidina (H) o tirosina (Y);
(i) X9 representa el resto de aminoácido histidina (H), prolina (P), serina (S), leucina (L) o ácido aspártico (D);
(j) X 10 representa el resto de aminoácido glicina (G), fenilalanina (F), histidina (H) o tirosina (Y);
(k) X 11 representa el resto de aminoácido alanina (A) o treonina (T);
(l) X 12 representa el resto de aminoácido serina (S), asparagina (N), ácido glutámico (E), asparagina (R) o ácido aspártico (D);
(m) X 13 representa el resto de aminoácido serina (S), glutamina (Q), treonina (T), asparagina (N) o alanina (A);
(n) X 14 representa el resto de aminoácido prolina (P), valina (V), isoleucina (I) o alanina (A) o ningún aminoácido;
(o) X 15 representa el resto de aminoácido isoleucina (I) o ningún aminoácido;
(p) X 16 representa el resto de aminoácido ácido glutámico (E) o lisina (K); y,
(q) X 17 representa el resto de aminoácido serina (S) o asparagina (N).
En algunas realizaciones, las subunidades de monómero de Tn3 específicas para CD40L de la invención consisten en la secuencia de aminoácidos:
IEVX1DVTDTTALITWX2X3RSX4X5X6X7X8X9X10CELX11YGIKDVPGDRTTIDLX12X13X1
4X15YVHYSIGNLKPDTX16YEVSLICLTTDGTYX17NPAKETFTT (SEQ ID NO: 171)
en donde:
(a) X 1 representa el resto de aminoácido lisina (K) o ácido glutámico (E);
(b) X2 representa el resto de aminoácido treonina (T) o isoleucina (I);
(c) X3 representa el resto de aminoácido asparagina (N) o alanina (A);
(d) X4 representa el resto de aminoácido serina (S), leucina (L), alanina (A), fenilalanina (F) o tirosina (Y);
(e) X5 representa el resto de aminoácido tirosina (Y), alanina (A), glicina (G), valina (V), isoleucina (I) o serina (S); (f) X6 representa el resto de aminoácido tirosina (Y), serina (S), alanina (A) o histidina (H);
(g) X7 representa el resto de aminoácido asparagina (N), ácido aspártico (D), histidina (H) o tirosina (Y);
(h) X8 representa el resto de aminoácido leucina (L), fenilalanina (F), histidina (H) o tirosina (Y);
(i) X9 representa el resto de aminoácido histidina (H), prolina (P), serina (S), leucina (L) o ácido aspártico (D);
(j) X 10 representa el resto de aminoácido glicina (G), fenilalanina (F), histidina (H) o tirosina (Y);
(k) X 11 representa el resto de aminoácido alanina (A) o treonina (T);
(l) X 12 representa el resto de aminoácido serina (S), asparagina (N), ácido glutámico (E), asparagina (R) o ácido aspártico (D);
(m) X 13 representa el resto de aminoácido serina (S), glutamina (Q), treonina (T), asparagina (N) o alanina (A);
(n) X 14 representa el resto de aminoácido prolina (P), valina (V), isoleucina (I) o alanina (A) o ningún aminoácido;
(o) X 15 representa el resto de aminoácido isoleucina (I) o ningún aminoácido;
(p) X 16 representa el resto de aminoácido ácido glutámico (E) o lisina (K); y,
(q) X 17 representa el resto de aminoácido serina (S) o asparagina (N).
En algunas realizaciones, un armazón de monómero específico para CD40L comprende un módulo de Tn3, en donde una o más de las hebras beta comprenden al menos una sustitución de aminoácido, excepto por que los restos de cisteína en las hebras beta C y F (SEQ ID NO: 13 o 14; y SEQ ID NO: 17, respectivamente) pueden estar sin sustituir.
Los bucles que conectan las diversas hebras beta de una subunidad de monómero específica para CD40L pueden aleatorizarse para la longitud y/o diversidad de secuencia. En una realización, una subunidad de monómero específica para CD40L tiene al menos un bucle que está aleatorizado para la longitud y/o diversidad de secuencia. En una realización, al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco o al menos seis bucles de una subunidad de monómero específica para CD40L se aleatorizan para la longitud y/o diversidad de secuencia. En una realización, al menos un bucle de una subunidad de monómero específica para CD40L se mantiene constante, mientras que al menos un bucle adicional se aleatoriza para la longitud y/o diversidad de secuencia. En otra realización, al menos uno, al menos dos o los tres bucles AB, CD y EF se mantienen constantes, mientras que al menos uno, al menos dos o los tres bucles BC, DE y FG se aleatorizan para la longitud o diversidad de secuencia. En otra realización, al menos uno, al menos dos o al menos los tres bucles a B, CD y EF se aleatorizan mientras que al menos uno, al menos dos o los tres bucles BC, DE y FG se aleatorizan para la longitud y/o diversidad de secuencia. En otra realización más, al menos uno, al menos dos, al menos tres de los bucles, al menos 4, al menos cinco o los seis bucles AB, CD, EF, BC, DE y FG se aleatorizan para la longitud o diversidad de secuencia.
En algunas realizaciones, uno o más restos dentro de un bucle se mantienen constantes, mientras que los otros restos se aleatorizan para la longitud y/o diversidad de secuencia. En algunas realizaciones, uno o más restos en un bucle se mantienen en un número predeterminado y limitado de aminoácidos diferentes, mientras que otros restos se aleatorizan para la longitud y/o diversidad de secuencia. Por consiguiente, una subunidad de monómero específica para CD40L de la invención puede comprender uno o más bucles que tienen una secuencia consenso degenerada y/o uno o más restos de aminoácidos invariantes.
En una realización, la subunidad de monómero específica para CD40L de la invención comprende un bucle AB que está aleatorizado. En otra realización, la subunidad de monómero específica para CD40L de la invención comprende un bucle BC que está aleatorizado. En una realización, la subunidad de monómero específica para CD40L de la invención comprende un bucle CD que está aleatorizado. En una realización, la subunidad de monómero específica para CD40L de la invención comprende un bucle DE que está aleatorizado. En una realización, la subunidad de monómero específica para CD40L de la invención comprende un bucle EF que está aleatorizado.
En ciertas realizaciones, la subunidad de monómero específica para CD40L de la invención comprende un bucle FG que se mantiene para que sea al menos un resto de aminoácido más corto que el bucle FG afín del tercer dominio FnIII de tenascina C humana y se aleatoriza adicionalmente en una o más posiciones.
En realizaciones específicas, al menos uno de los bucles BC, DE y FG está aleatorizado, en donde la hebra beta A comprende la SEQ ID NO: 10 u 11, la hebra beta B comprende la SEQ ID NO: 12, la hebra beta C comprende la SEQ ID NO: 13 o 14, la hebra beta D comprende la SEQ ID NO: 15, la hebra beta E comprende la SEQ ID NO: 16, la hebra beta F comprende la SEQ ID NO: 17 y la hebra beta G comprende la SEQ ID NO: 18, el bucle AB comprende la SEQ ID NO: 4 o 136, el bucle CD comprende la SEQ ID NO: 6 y el bucle EF comprende la SEQ ID NO: 8 o 137.
En otras realizaciones específicas, al menos uno de los bucles AB, CD y EF se aleatorizan, en donde la hebra beta A comprende la SEQ ID NO: 10 u 11, la hebra beta B comprende la SEQ ID NO: 12, la hebra beta C comprende la SEQ ID NO: 13 o 14, la hebra beta D comprende la SEQ ID NO: 15, la hebra beta E comprende la SEQ ID NO: 16, la hebra beta F comprende la SEQ ID NO: 17 y la hebra beta G comprende la SEQ ID NO: 18, el bucle BC comprende la SEQ ID NO: 5, el bucle DE comprende la Se Q ID NO: 7 y el bucle FG comprende la SEQ ID NO: 9 o 139.
La estabilidad de los armazones de Tn3 de la invención puede aumentarse mediante diferentes enfoques. En algunas realizaciones, los armazones de Tn3 de la invención pueden estabilizarse elongando las regiones amino y/o carboxilo terminales. Las regiones amino y/o carboxilo terminales pueden alargarse en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más de 10 aminoácidos. En otras realizaciones, los armazones de Tn3 de la invención pueden estabilizarse introduciendo una alteración que aumenta la semivida en suero, como se describe en el presente documento. En otra realización más, los armazones de Tn3 de la invención comprenden una adición, eliminación o sustitución de al menos un resto de aminoácido para estabilizar el núcleo hidrófobo del armazón.
Los armazones de Tn3 de la invención pueden estabilizarse eficazmente creando enlaces disulfuro no naturales, como se divulga en la Solicitud Internacional de Patente n.° PCT/US2011/032184. En algunas realizaciones, los armazones de la invención comprenden enlaces disulfuro de origen no natural, como se describe en la Publicación PCT n.°: WO 2009/058379. Puede usarse un enfoque de bioinformática para identificar las posiciones candidatas adecuadas para la inserción de enlaces disulfuro.
En una realización, una subunidad de monómero de Tn3 de la invención comprende al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro o al menos cinco enlaces disulfuro intramoleculares de origen no natural. En una realización, una subunidad de monómero de Tn3 de la invención comprende al menos un enlace disulfuro intramolecular de origen no natural, en donde dicho al menos un enlace disulfuro de origen no natural estabiliza el monómero. En otra realización más, los armazones de Tn3 de la invención comprenden al menos un enlace disulfuro de origen no natural, en donde el enlace está ubicado entre dos armazones de Tn3 monoméricos o multiméricos distintos, es decir, el enlace disulfuro es un enlace disulfuro intermolecular. Por ejemplo, un enlace disulfuro puede unir diferentes armazones (por ejemplo, dos armazones de monómero específicos para CD40L), un armazón de Tn3 y un enlazador, un armazón de Tn3 y un dominio Fc o un armazón de Tn3 y un anticuerpo o fragmento del mismo.
En algunas realizaciones, los armazones de Tn3 de la invención comprenden un enlace disulfuro intermolecular de origen no natural que une una subunidad de monómero de Tn3 y un resto heterólogo aislado, una subunidad de monómero de Tn3 y un resto heterólogo fusionado o conjugado al mismo armazón de Tn3 o una subunidad de monómero de Tn3 y un resto heterólogo fusionado o conjugado a un armazón de Tn3 diferente.
En algunas realizaciones, los armazones de Tn3 de la invención comprenden un enlace disulfuro que forma un armazón multimérico de Tn3 de al menos 2, al menos 3, al menos 4 o más subunidades de monómero.
En otra realización, los armazones de Tn3 de la invención pueden comprender una elongación de las regiones amino y/o carboxilo terminales. En una realización, el armazón de Tn3 de la invención comprende una alteración para aumentar la semivida en suero, como se describe en el presente documento. En otra realización más, los armazones de la invención comprenden una adición, eliminación o sustitución de al menos un resto de aminoácido para estabilizar el núcleo hidrófobo del armazón.
Armazones de Tn3 multiméricos
Un aspecto de la presente invención proporciona armazones de Tn3 multiméricos que comprenden al menos dos subunidades de monómero de Tn3 de la invención unidas en tándem y en donde al menos uno de los monómeros es una subunidad de monómero específica para CD40L. Dichos armazones de Tn3 multiméricos pueden ensamblarse en múltiples formatos. En un aspecto específico, la invención proporciona armazones de Tn3 multiméricos, en donde al menos dos subunidades de monómero específicas para CD40L están conectadas en tándem mediante un péptido enlazador. En algunas realizaciones, el armazón de Tn3 multimérico muestra un aumento en la valencia y/o la avidez de unión a la diana u otra acción de las una o más dianas. En algunas realizaciones, el aumento en la valencia y/o la avidez de unión a la diana se logra cuando múltiples subunidades de monómero se unen a la misma diana. En algunas realizaciones, el aumento en la valencia mejora una acción específica en la diana, tal como aumentando la dimerización de una proteína diana.
En una realización específica, un armazón de Tn3 multimérico de la invención comprende al menos dos subunidades de monómero específicas para CD40L conectadas en tándem, en donde cada subunidad de monómero específica para CD40L se une a al menos una diana y en donde cada subunidad de monómero específica para CD40L comprende una pluralidad de hebras beta unidas a una pluralidad de regiones de bucle, en donde al menos un bucle es una variante de origen no natural del bucle afín en el armazón de Tn3 precursor (SEQ ID NO: 3).
En una realización, los armazones de Tn3 multiméricos se generan mediante unión covalente entre subunidades de monómero específicas para CD40L, por ejemplo, enlazando directamente las subunidades de monómero específicas para CD40L o mediante la inclusión de un enlazador, por ejemplo, un péptido enlazador. En ejemplos particulares, los armazones de Tn3 unidos covalentemente se generan construyendo genes de fusión que codifican las subunidades de monómero específicas para CD40L o como alternativa, modificando codones para restos de cisteína en subunidades de monómero específicas para CD40L y permitiendo que se produzca la formación de enlaces disulfuro entre los productos de expresión.
En una realización, los armazones de Tn3 multiméricos de la invención comprenden al menos dos subunidades de monómero específicas para CD40L que están conectadas directamente entre sí sin aminoácidos intermedios adicionales. En otra realización, los armazones de Tn3 multiméricos de la invención comprenden al menos dos subunidades de monómero específicas para CD40L que están conectadas en tándem por medio de un enlazador, por ejemplo, un péptido enlazador.
En una realización específica, los armazones de Tn3 multiméricos de la invención comprenden al menos dos subunidades de monómero específicas para CD40L que se conectan en tándem mediante un péptido enlazador, en donde el péptido enlazador comprende de 1 a aproximadamente 1000 o de 1 a aproximadamente 500 o de 1 a aproximadamente 250 o de 1 a aproximadamente 100 o de 1 a aproximadamente 50 o de 1 a aproximadamente 25 aminoácidos. En una realización específica, el armazón de Tn3 multimérico comprende al menos dos subunidades de monómero específicas para CD40L que se conectan en tándem mediante un péptido enlazador, en donde el péptido enlazador comprende de 1 a aproximadamente 20 o de 1 a aproximadamente 15 o de 1 a aproximadamente 10 o de 1 a aproximadamente 5 aminoácidos.
En una realización específica, el armazón de Tn3 multimérico comprende al menos dos subunidades de monómero específicas para CD40L que se conectan en tándem por medio de un enlazador, por ejemplo, un péptido enlazador, en donde el enlazador es un resto funcional. El resto funcional se seleccionará basándose en la función y/o las características deseadas del armazón de Tn3 multimérico. Por ejemplo, puede usarse como enlazador un resto funcional útil para la purificación (por ejemplo, un marcador de histidina). Los restos funcionales útiles como enlazadores incluyen, pero sin limitación, polietilenglicol (PEG), un agente citotóxico, un radionúclido, un agente de obtención de imágenes, biotina, un dominio de dimerización, seroalbúmina humana (HSA) o una porción de unión a FcRn de la misma, un dominio o fragmento de un anticuerpo, un anticuerpo monocatenario, un anticuerpo de dominio, un dominio de unión a albúmina, una molécula de IgG, una enzima, un ligando, un receptor, un péptido de unión, un armazón distinto de Tn3, un marcador epitópico, un polímero de polipéptido recombinante, una citocina y similares. Los péptidos enlazadores y restos funcionales específicos que pueden usarse como enlazadores se divulgan más adelante.
En realizaciones específicas, el resto funcional es una inmunoglobulina o un fragmento de la misma. En algunas realizaciones, la inmunoglobulina o un fragmento de la misma comprende un dominio Fc. En algunas realizaciones, el dominio Fc no logra inducir al menos una función efectora mediada por FcyR, tal como ADCC (citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo). Es conocido en la técnica que el dominio Fc puede alterarse para reducir o eliminar al menos una función efectora mediada por FcyR, véase, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos n.° 5,624,821 y 6,737,056.
En algunas realizaciones, el armazón de Tn3 multimérico comprende al menos dos subunidades de monómero específicas para CD40L que están conectadas por medio de uno o más enlazadores, en donde los enlazadores interpuestos entre cada subunidad de monómero específica para CD40L pueden ser los mismos enlazadores o diferentes enlazadores. En algunas realizaciones, un enlazador puede comprender múltiples enlazadores, que pueden ser el mismo enlazador o diferentes enlazadores. En algunas realizaciones, cuando se concatena una pluralidad de enlazadores, algunos o todos pueden ser restos funcionales.
Estequiometría de unión al armazón
En algunas realizaciones, un armazón de Tn3 monomérico o multimérico puede comprender una subunidad de monómero específica para CD40L específica para diferentes epítopos, que pueden ser diferentes epítopos en una sola molécula de CD40L o en diferentes moléculas de CD40L diana. En algunas realizaciones, un armazón de Tn3 multimérico puede comprender subunidades de monómero específicas para CD40L, en donde cada subunidad se dirige a uno o más epítopos diferentes en una o más moléculas de CD40L.
En otras realizaciones, un armazón de Tn3 monomérico o multimérico puede unirse a dos o más epítopos diferentes en la misma molécula de CD40L. En algunas realizaciones, los diferentes epítopos son epítopos no solapantes. En otras realizaciones, los diferentes epítopos son epítopos solapantes.
En otra realización específica más, un armazón de Tn3 monomérico o multimérico puede unirse a uno o más epítopos en una molécula de CD40L y además unirse a uno o más epítopos en una segunda molécula de CD40L. En algunas realizaciones, las diferentes moléculas diana forman parte de un complejo oligomérico, por ejemplo, un complejo de CD40L trimérico.
En otra realización específica más, puede unirse un armazón de Tn3 monomérico o multimérico a un solo epítopo en un trímero de CD40L. En otra realización más, puede unirse un armazón de Tn3 monomérico o multimérico al mismo epítopo en al menos dos trímeros de CD40L.
En ciertas realizaciones, un armazón de Tn3 monomérico o multimérico puede unirse al mismo epítopo en dos o más copias de una molécula de CD40L en una superficie celular adyacente. En ciertas realizaciones, un armazón de Tn3 monomérico o multimérico puede unirse al mismo epítopo en dos o más copias de una molécula de CD40L en solución. En algunas realizaciones, un armazón de Tn3 monomérico o multimérico puede unirse al mismo epítopo o a diferentes epítopos en CD40L con la misma o diferente afinidad y/o avidez de unión.
En otra realización, un armazón de Tn3 monomérico o multimérico puede unirse a epítopos en una o más copias de CD40L y lograr o potenciar (por ejemplo, de manera sinérgica) una acción deseada en la diana, por ejemplo, prevenir la unión a un receptor o prevenir la oligomerización.
Además, cuando un armazón de Tn3 monomérico o multimérico de la invención comprende múltiples subunidades de monómero específicas para CD40L, por ejemplo, diferentes monómeros en donde cada monómero se dirige a diferentes epítopos en CD40L, dichas subunidades de monómero pueden estas dispuestas de acuerdo con un patrón concreto u orientación espacial para lograr o potenciar un cierto efecto biológico. Dichas combinaciones de subunidades monoméricas pueden ensamblarse y posteriormente evaluarse usando métodos conocidos en la técnica.
Además, los armazones de Tn3 de la invención pueden fusionarse a secuencias marcadoras, tales como un péptido, para facilitar la purificación. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos marcadora es un péptido de polihistidina (marcador de His), por ejemplo, un marcador de octahistidina (marcador de His-8) o marcador de hexahistidina (marcador de His-6) tal como el marcador proporcionado en un vector de expresión pQE (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, Calif, 91311), entre otros vectores, muchos de los cuales se encuentran disponibles comercialmente. Como se describe en Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824, 1989, por ejemplo, la polihistidina posibilita una purificación conveniente de la proteína de fusión. Otros marcadores peptídicos útiles para la purificación incluyen, pero sin limitación, un marcador de hemaglutinina ("HA"), que corresponde a un epítopo procedente de la proteína hemaglutinina de la gripe (véase, por ejemplo, Wilson et al., Cell 37:767, 1984), un marcador FLAG, un marcador de Strep, un marcador de myc, un marcador V5, un marcador de GFP, un marcador AU1, un marcador AU5, un marcador ECS, un marcador GST o un marcador OLLAS.
Pueden generarse proteínas de fusión adicionales que comprenden armazones de Tn3 de la invención mediante las técnicas de reordenamiento génico, reordenamiento de motivos, reordenamiento de exones y/o reordenamiento de codones (denominadas colectivamente "reordenamiento de ADN").
El reordenamiento de ADN puede emplearse para alterar la acción de los armazones de Tn3 en la diana (por ejemplo, generar armazones con mayores afinidades y menores velocidades de disociación). Los armazones de Tn3 pueden alterarse mediante mutagénesis aleatoria mediante PCR propensa a errores, inserción de nucleótidos aleatorios u otro métodos antes de la recombinación. Una o más porciones de un polinucleótido que codifica un armazón, que se une a una diana específica, pueden recombinarse con uno o más componentes, motivos, secciones, partes, dominios, fragmentos, etc. de una o más moléculas heterólogas.
Fusiones de anticuerpo y dominio Fc
En algunas realizaciones, el armazón de Tn3 de la invención comprende una subunidad de monómero específica para CD40L fusionado a un dominio o fragmento de un anticuerpo (por ejemplo, una IgG) que incluye, pero sin limitación, un dominio Fc.
En algunas realizaciones, se conjuga o fusiona solo una subunidad de monómero específica para CD40L a un dominio o fragmento de un anticuerpo. Por ejemplo, puede fusionarse una sola subunidad de monómero específica para CD40L al extremo aminoterminal de un polipéptido de un dominio o fragmento de un anticuerpo (por ejemplo, una cadena pesada o una cadena ligera de un anticuerpo). En otras realizaciones, se crean armazones de Tn3 fusionando o conjugando una o más subunidades de monómero específicas para CD40L al extremo aminoterminal y/o carboxiterminal de un dominio o fragmento de un anticuerpo (por ejemplo, una cadena pesada y/o una cadena ligera de un anticuerpo o un dominio Fc).
En algunas realizaciones, algunas o todas las subunidades de monómero específicas para CD40L fusionadas a un dominio o fragmento de un anticuerpo son idénticas. En algunas realizaciones, algunas o todas las subunidades de monómero específicas para CD40L fusionadas a un dominio o fragmento de un anticuerpo son diferentes.
En una realización específica, el armazón de Tn3 de la invención comprende una subunidad de monómero específica para CD40L fusionada a un dominio Fc. En otras realizaciones, el armazón de Tn3 de la invención comprende al menos dos subunidades de monómero específicas para CD40L fusionadas a un dominio Fc. En otra realización específica, dos subunidades de monómero específicas para CD40L fusionadas a un dominio Fc son idénticas. En otra realización específica, dos subunidades de monómero específicas para CD40L fusionadas a un dominio Fc son diferentes. En una realización específica, se conectan entre sí en tándem dos subunidades de monómero específicas para CD40L fusionadas a un dominio Fc y una de las subunidades de monómero específicas para CD40L se fusiona al dominio Fc.
En algunas realizaciones, pueden dimerizarse diferentes armazones de Tn3 de la invención mediante el uso de mutaciones en el dominio Fc que favorecen la formación de heterodímeros. Es sabido en la técnica que las variantes de la región Fc (por ejemplo, sustituciones y/o adiciones y/o eliminaciones de aminoácidos) potencian o reducen la función efectora del anticuerpo y pueden alterar las propiedades farmacocinéticas (por ejemplo, la semivida) del anticuerpo. Por lo tanto, en ciertas realizaciones de la invención, los armazones de Tn3 de la invención comprenden uno o más dominios Fc que comprenden una región Fc alterada, en la que se han efectuado una o más alteraciones en la región Fc para cambiar las propiedades funcionales y/o farmacocinéticas del armazón de Tn3. En ciertas realizaciones, los armazones de Tn3 de la invención comprenden uno o más dominios Fc que comprenden una región Fc alterada, en la que se han efectuado una o más alteraciones en la región Fc para reducir o eliminar al menos una función efectora mediada por FcyR.
También es sabido que la glucosilación de la región Fc puede modificarse para aumentar o reducir la función efectora y/o la actividad antiinflamatoria. Por consiguiente, en una realización, un armazón de Tn3 de la invención comprende una región Fc con glucosilación alterada de los restos de aminoácido para cambiar las propiedades citotóxicas y/o antiinflamatorias de los armazones de Tn3.
Topologías del armazón de Tn3
Los armazones de Tn3 de la invención pueden fusionarse al carboxiterminal de los dominios Fc, las cadenas ligeras del anticuerpo y las cadenas pesada del anticuerpo en cualquier disposición espacial adecuada. Véase, por ejemplo, la Publicación Internacional PCT/US2011/032184 para una descripción detallada de las topologías del armazón contempladas.
Generación de armazones
Los armazones de Tn3 descritos en el presente documento pueden usarse en cualquier técnica para desarrollar proteínas de unión a la diana nuevas o mejoradas. En un ejemplo particular, se inmoviliza la diana sobre un soporte sólido, tal como una columna de resina o un pocillo de una placa de microtitulación y la diana se pone en contacto con una biblioteca de proteínas de unión candidatas basadas en el armazón. Dicha biblioteca puede consistir en clones construidos a partir de un armazón de Tn3, mediante aleatorización de la secuencia y/o la longitud de los bucles similares a CDR.
A este respecto, la presentación en bacteriófagos (fagos) es una técnica bien conocida que permite explorar grandes bibliotecas de oligopéptido para identificar uno o más miembros de dichas bibliotecas que son capaces de unirse específicamente a una diana. La presentación en fagos es una técnica mediante la que se presentan polipéptidos variantes como proteínas de fusión a la proteína de la envuelta en la superficie de las partículas de bacteriófago (Scott, J. K. y Smith, G. P. (1990) Science 249: 386). Puede emplearse una estrategia bioinformática para determinar las preferencias de longitud y diversidad del bucle de los dominios FnIII de origen natural. Usando este análisis, pueden emplearse las preferencias de longitud y diversidad de secuencia del bucle para desarrollar una estrategia de "aleatorización restringida". En esta aleatorización restringida, se incorporan la longitud relativa del bucle y las preferencias de secuencia en el desarrollo de una estrategia de biblioteca. La integración de la longitud del bucle y el análisis de diversidad de secuencia en el desarrollo de la biblioteca da como resultado una aleatorización restringida (es decir, ciertas posiciones en el bucle aleatorizado tienen una limitación en cuanto a qué aminoácido puede encontrarse en dicha posición).
La invención también proporciona bibliotecas recombinantes que comprenden diversas poblaciones de armazones de Tn3 de origen no natural. En una realización, las bibliotecas comprenden armazones de Tn3 de origen no natural que comprenden una pluralidad de dominios de hebra beta unidos a una pluralidad de regiones de bucle, en donde uno o más de dichos bucles varían por la eliminación, sustitución o adición de al menos un aminoácido. En una realización preferida, las bibliotecas comprenden armazones de Tn3 procedentes del armazón de Tn3 de tipo silvestre.
Como se ha detallado anteriormente, los bucles que conectan las diversas hebras beta de los armazones pueden aleatorizarse para la longitud y/o diversidad de secuencia. En una realización, las bibliotecas de la invención comprenden armazones de Tn3 que tienen al menos un bucle que está aleatorizado para la longitud y/o diversidad de secuencia. En una realización, al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco o al menos seis bucles de los armazones de Tn3 están aleatorizados para la longitud y/o diversidad de secuencia. En una realización, al menos un bucle se mantiene constante, mientras que al menos un bucle adicional se aleatoriza para la longitud y/o diversidad de secuencia. En otra realización, al menos uno, al menos dos o los tres bucles AB, c D y EF se mantienen constantes, mientras que al menos uno, al menos dos o los tres bucles BC, DE y FG se aleatorizan para la longitud o diversidad de secuencia. En otra realización, al menos uno, al menos dos o al menos los tres bucles AB, CD y EF se aleatorizan mientras que al menos uno, al menos dos o los tres bucles BC, DE y FG se aleatorizan para la longitud y/o diversidad de secuencia.
En una realización específica, las bibliotecas de la invención comprenden armazones de FnIII, en donde la hebra beta A comprende la SEQ ID NO: 10 u 11, la hebra beta B comprende la SEQ ID NO: 12, la hebra beta C comprende la SEQ ID NO: 13 o 14, la hebra beta D comprende la SEQ ID NO: 15, la hebra beta E comprende la SEQ ID NO: 16, la hebra beta F comprende la SEQ ID NO: 17 y la hebra beta G comprende la SEQ ID NO: 18.
En una realización específica, las bibliotecas de la invención comprenden armazones de FnIII, en donde la hebra beta A consiste en la SEQ ID NO: 10 u 11, la hebra beta B consiste en la SEQ ID NO: 12, la hebra beta C consiste en la SEQ ID NO: 13 o 14, la hebra beta D consiste en la SEQ ID NO: 15, la hebra beta E consiste en la SEQ ID NO: 16, la hebra beta F consiste en la SEQ ID NO: 17 y la hebra beta G consiste en la SEQ ID NO: 18.
En una realización específica, las bibliotecas de la invención comprenden armazones de FnIII, en donde la hebra beta A consiste esencialmente en la SEQ ID NO: 10 u 11, la hebra beta B consiste esencialmente en la SEQ ID NO: 12, la hebra beta C consiste esencialmente en la SEQ ID NO: 13 o 14, la hebra beta D consiste esencialmente en la SEQ ID NO: 15, la hebra beta E consiste esencialmente en la SEQ ID NO: 16, la hebra beta F consiste esencialmente en la SEQ ID NO: 17 y la hebra beta G consiste esencialmente en la SEQ ID NO: 18.
Como se ha detallado anteriormente, pueden mantenerse constantes uno o más restos en un bucle, mientras que los otros restos se aleatorizan para la longitud y/o diversidad de secuencia. Opcionalmente o como alternativa, uno o más restos en un bucle pueden mantenerse en un número predeterminado y limitado de aminoácidos diferentes, mientras que otros restos se aleatorizan para la longitud y/o diversidad de secuencia. Por consiguiente, las bibliotecas de la invención comprenden armazones de Tn3 que pueden comprender uno o más bucles que tienen una secuencia consenso degenerada y/o uno o más restos de aminoácidos invariantes. En otra realización, las bibliotecas de la invención comprenden armazones de Tn3 que tienen bucles BC que están aleatorizados. En otra realización, las bibliotecas de la invención comprenden armazones de Tn3 que tienen bucles BC que están aleatorizados. En otra realización más, las bibliotecas de la invención comprenden armazones de Tn3 que tienen bucles BC que están aleatorizados.
En una realización, las bibliotecas de la invención comprenden armazones de Tn3 que tienen bucles DE que están aleatorizados. En una realización, las bibliotecas de la invención comprenden armazones de Tn3 que tienen bucles FG que están aleatorizados. En otra realización, las bibliotecas de la invención comprenden armazones de FnIII que tienen bucles FG que están aleatorizados.
En una realización específica, las bibliotecas de la invención comprenden armazones, en donde los armazones comprenden la secuencia de aminoácidos:
IEV(XAB)nALITW(XBc)nCELXlYGI(XcD)nTTIDL(XDE)nYSI(XEF)nYEVSLIC(XFG)nKETFT
T
en donde:
(a) Xab , Xbc, Xcd, Xde, Xef y Xfg representan los restos de aminoácidos presentes en las secuencias de los bucles AB, BC, CD, DE, EF y FG, respectivamente;
(b) X 1 representa el resto de aminoácido A o T; y,
(c) la longitud del bucle n es un número entero entre 2 y 26.
En algunas realizaciones, las bibliotecas de la invención comprenden subunidades de monómero de Tn3 específicas para CD40L de la invención que comprenden la secuencia de aminoácidos:
IEVKD VTDTTALITWX1DX2X3X4X5X6X7X8CELT Y GIKDVPGDRTTIDLWX9HX10 AXi 1
YSIGNLKPDTEYEVSLICRX12GDMSSNPAKETFTT (SEQ ID NO: 167)
en donde:
(a) X 1 representa el resto de aminoácido serina (S) o leucina (L);
(b) X2 representa el resto de aminoácido ácido aspártico (D) o ácido glutámico (E);
(c) X3 representa el resto de aminoácido histidina (H), isoleucina (I), valina (V), fenilalanina (F) o triptófano (W);
(d) X4 representa el resto de aminoácido alanina (A), glicina (G), ácido glutámico (E) o ácido aspártico (D);
(e) X5 representa el resto de aminoácido ácido glutámico (E), leucina (L), glutamina (Q), serina (S), ácido aspártico (D) o asparagina (N);
(f) X6 representa el resto de aminoácido fenilalanina (F) o tirosina (Y);
(g) X 7 representa el resto de aminoácido isoleucina (I), valina (V), histidina (H), ácido glutámico (E) o ácido aspártico (D); (h) X8 representa el resto de aminoácido glicina (G), triptófano (W) o valina (V);
(i) X9 representa el resto de aminoácido triptófano (W), fenilalanina (F) o tirosina (Y);
(j) X 10 representa el resto de aminoácido serina (S), glutamina (Q), metionina (M) o histidina (H);
(k) X 11 representa el resto de aminoácido triptófano (W) o histidina (H); y,
(l) X 12 representa el resto de aminoácido arginina (R) o serina (S).
En algunas realizaciones, las bibliotecas de la invención comprenden subunidades de monómero de Tn3 específicas para CD40L de la invención que comprenden la secuencia de aminoácidos:
IEVX1DVTDTTALITWX2X3RSX4X5X6X7X8X9X10CELX11YGIKDVPGDRTTIDLX12X13X1
4X15YVHYSIGNLKPDTX16YEVSLICLTTDGTYX17NPAKETFTT (SEQ ID NO: 171)
en donde:
(a) X 1 representa el resto de aminoácido lisina (K) o ácido glutámico (E);
(b) X2 representa el resto de aminoácido treonina (T) o isoleucina (I);
(c) X3 representa el resto de aminoácido asparagina (N) o alanina (A);
(d) X4 representa el resto de aminoácido serina (S), leucina (L), alanina (A), fenilalanina (F) o tirosina (Y);
(e) X5 representa el resto de aminoácido tirosina (Y), alanina (A), glicina (G), valina (V), isoleucina (I) o serina (S); (f) X6 representa el resto de aminoácido tirosina (Y), serina (S), alanina (A) o histidina (H);
(g) X 7 representa el resto de aminoácido asparagina (N), ácido aspártico (D), histidina (H) o tirosina (Y);
(h) X8 representa el resto de aminoácido leucina (L), fenilalanina (F), histidina (H) o tirosina (Y);
(i) X9 representa el resto de aminoácido histidina (H), prolina (P), serina (S), leucina (L) o ácido aspártico (D);
(j) X 10 representa el resto de aminoácido glicina (G), fenilalanina (F), histidina (H) o tirosina (Y);
(k) X 11 representa el resto de aminoácido alanina (A) o treonina (T);
(l) X 12 representa el resto de aminoácido serina (S), asparagina (N), ácido glutámico (E), asparagina (R) o ácido aspártico (D);
(m) X 13 representa el resto de aminoácido serina (S), glutamina (Q), treonina (T), asparagina (N) o alanina (A);
(n) X 14 representa el resto de aminoácido prolina (P), valina (V), isoleucina (I) o alanina (A) o ningún aminoácido;
(o) X 15 representa el resto de aminoácido isoleucina (I) o ningún aminoácido;
(p) Xi6 representa el resto de aminoácido ácido glutámico (E) o lisina (K); y,
(q) X 17 representa el resto de aminoácido serina (S) o asparagina (N).
La invención proporciona además métodos para identificar un armazón de Tn3 recombinante que se une a una diana, por ejemplo, CD40L y tiene estabilidad aumentada o acción mejorada sobre la diana, por ejemplo, CD40L, en comparación con un armazón de Tn3 precursor mediante la exploración de las bibliotecas de la invención.
En ciertas realizaciones, el método para identificar un armazón de Tn3 recombinante que tiene estabilidad de proteína aumentada en comparación con un armazón de Tn3 precursor y que se une específicamente a una diana, comprende: poner en contacto el ligando diana con una biblioteca de la invención en condiciones adecuadas para formar un complejo de armazón:ligando diana;
obtener del complejo, el armazón que se une al ligando diana;
determinar si la estabilidad del armazón obtenido en la etapa (b) es mayor que la del armazón de Tn3 de tipo silvestre.
Puede usarse el mismo método para identificar un armazón de Tn3 recombinante con afinidad de unión, avidez, etc. mejorada para la diana. En una realización, en la etapa (a), la biblioteca de armazón de la invención se incuba con diana inmovilizada. En una realización, en la etapa (b), el complejo de armazón:ligando diana se lava para retirar las moléculas de unión no específica y se eluyen las moléculas de unión más fuertes en condiciones muy rigurosas y se someten a PCR para recuperar la información de secuencia. Se contempla específicamente que las moléculas de unión y/o la información de secuencia obtenidos en la etapa (b) pueden usarse para crear una nueva biblioteca usando los métodos divulgados en el presente documento o conocidos por un experto en la materia, que pueden usarse para repetir el proceso de selección, con o sin mutagénesis adicional de la secuencia. En algunas realizaciones, puede llevarse a cabo una serie de rondas de selección hasta que se obtienen moléculas de unión con afinidad suficiente por el antígeno.
Una realización adicional de la invención es una colección de moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican una biblioteca que comprende los armazones de la invención y como se han descrito anteriormente.
Los armazones de la invención pueden someterse a maduración de la afinidad. En este proceso aceptado en la técnica, se somete una proteína de unión específica a un esquema que selecciona respecto de una afinidad reducida por una diana específica (véase Wu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95(11):6037-42). Los armazones resultantes de la invención pueden mostrar características de unión al menos igual de elevadas, en comparación con los armazones antes de la maduración de la afinidad.
La invención también proporciona métodos para identificar la secuencia de aminoácidos de un armazón de proteína capaz de unirse a una diana a fin de formar un complejo de armazón:diana. En una realización, el método comprende: (a) poner en contacto una biblioteca de la invención con una diana inmovilizada o separada; (b) separar los complejos de armazón:diana de los armazones libres; (c) provocar la replicación de los armazones separados de (b) para obtener como resultado una nueva biblioteca de presentación de polipéptidos que se distingue de la de (a) por que tiene una diversidad reducida y por que está enriquecida en armazones presentados capaces de unirse a la diana; d) opcionalmente, repetir las etapas (a) y (b) con la nueva biblioteca de (c); y (e) determinar la secuencia de ácido nucleico de la región que codifica el armazón presentado de una especie de (d) y de este modo, deducir la secuencia de péptido capaz de unirse a la diana.
En otra realización, los armazones de Tn3 de la invención pueden aleatorizarse adicionalmente después de la identificación a partir de una exploración de la biblioteca. En una realización, los métodos de la invención comprenden aleatorizar adicionalmente al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco o al menos seis bucles de un armazón identificado a partir de una biblioteca usando un método descrito en el presente documento. En otra realización, el armazón aleatorizado adicionalmente se somete a un método posterior para identificar un armazón capaz de unirse a una diana. Este método comprende (a) poner en contacto dicho armazón aleatorizado adicionalmente con una diana inmovilizada o separable, (b) separar los complejos de armazón:diana aleatorizados adicionalmente de los armazones libres, (c) provocar la replicación de los armazones separados de (b), repitiendo opcionalmente las etapas (a)-(c) y (d) determinar la secuencia de ácido nucleico de la región que codifica dicho armazón aleatorizado adicionalmente y de este modo, deducir la secuencia de péptido capaz de unirse a la diana.
En una realización adicional, los armazones aleatorizados adicionales comprenden al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco o al menos seis bucles aleatorizados, que se aleatorizaron previamente en la primera biblioteca. En una realización adicional alternativa, los armazones aleatorizados adicionales comprenden al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco o al menos seis bucles aleatorizados, que se aleatorizaron previamente en la primera biblioteca.
La invención también proporciona un método para obtener al menos dos armazones de Tn3 que se unen a al menos una o más dianas. Este método permite explorar agentes que actúan de manera cooperativa para provocar una respuesta particular. Puede ser ventajoso usar dicha exploración cuando se necesita una actividad agonista que requiera la cooperación de más de un armazón. Este método permite explorar agentes cooperativos sin reformatear la biblioteca para formar complejos multiméricos. En una realización, el método de la invención comprende poner en contacto un ligando diana con una biblioteca de la invención en condiciones que permiten la formación de un complejo de armazón:ligando diana, acoplando dichos armazones con un agente de reticulación (definido como un agente que junta, en estrecha proximidad, al menos dos armazones idénticos o distintos) en donde la reticulación de los armazones provoca una respuesta detectable y obtener a partir del complejo, dichos armazones que se unen a la diana. En una realización adicional, el agente de reticulación es un anticuerpo específico para el armazón o un fragmento del mismo, un anticuerpo específico para el marcador epitópico o un fragmento del mismo, un dominio de dimerización, tal como una región Fc, un motivo de hélice superenrollada (por ejemplo, pero sin limitación, una cremallera de leucina), un reticulante químico u otro dominio de dimerización conocido en la técnica.
Maduración de la afinidad
El desarrollo de armazones de Tn3 de la invención puede implicar una o más etapas de maduración de la afinidad in vitro o in vivo. En algunas realizaciones, las subunidades de monómero de Tn3 pueden someterse a una sola etapa de maduración de la afinidad. En otras realizaciones, las subunidades de monómero de Tn3 pueden someterse a dos o más etapas de maduración de la afinidad. Puede emplearse cualquier estrategia de maduración de la afinidad que dé como resultado, en general, cambios de aminoácidos en un armazón de Tn3 precursor o específicamente, cambios de aminoácidos en uno de los bucles del armazón de Tn3 precursor que mejoran la unión del armazón de Tn3 con afinidad madurada para el antígeno deseado.
Estos cambios de aminoácidos pueden lograrse, por ejemplo, mediante mutagénesis aleatoria, mutagénesis de "desplazamiento completo" y mutagénesis "por revisión". Dichas mutagénesis pueden lograrse usando, por ejemplo, PCR propensa a errores, cepas "muradoras" de levaduras o bacterias, incorporación de cambios de ácidos nucleicos aleatorios o definidos durante la síntesis desde el inicio de la totalidad o parte de una molécula de unión basada en FnIII. Los métodos para llevar a cabo la maduración de la afinidad y/o la mutagénesis se describen, por ejemplo, en las Patentes de los Estados Unidos n.° 7,195,880; 6,951,725; 7,078,197; 7,022,479; 5,922,545; 5,830,721; 5,605,793, 5,830,650; 6,194,550; 6,699,658; 7,063,943; 5,866,344 y la Publicación PCT WO06023144.
Dichos métodos de maduración de la afinidad pueden requerir además el aumento de la rigurosidad de los ensayos de exploración de la unión al antígeno para seleccionar armazones de Tn3 con afinidad mejorada por un antígeno. En este caso pueden usarse métodos reconocidos en la técnica para aumentar la rigurosidad de un ensayo de interacción de proteína-proteína. En una realización, se varían una o más de las condiciones de ensayo (por ejemplo, la concentración de sal del tampón de ensayo) para reducir la afinidad del armazón de Tn3 por el antígeno deseado. En otra realización, se reduce el espacio de tiempo que se deja para que el armazón de Tn3 se una al antígeno deseado.
En otra realización, puede añadirse una etapa de unión competitiva al ensayo de interacción de proteína-proteína. Por ejemplo, puede dejarse en primer lugar que el armazón de Tn3 se una a un antígeno inmovilizado deseado. Después, se añade una concentración específica de antígeno no inmovilizado, que sirve para competir por la unión con el antígeno inmovilizado, de tal forma que se eluyen del antígeno inmovilizado los armazones de Tn3 con la menor afinidad por el antígeno, dando como resultado la selección de armazones de Tn3 con afinidad de unión al antígeno mejorada. Puede aumentarse adicionalmente la rigurosidad de las condiciones de ensayo aumentando la concentración del antígeno no inmovilizado que se añade al ensayo.
Los métodos de exploración también pueden requerir múltiples rondas de selección para enriquecer uno o más armazones de Tn3 con unión al antígeno mejorada. En una realización, en cada ronda de selección, se introducen mutaciones de aminoácidos adicionales en el armazón de T n3. En otra realización, en cada ronda de selección, se aumenta la rigurosidad de la unión al antígeno deseado para seleccionar armazones de Tn3 con afinidad aumentada por el antígeno.
En algunas realizaciones, la maduración de la afinidad se lleva a cabo mediante mutagénesis de saturación de porciones de los bucles BC, DE y FG de Tn3. En algunas realizaciones, la mutagénesis por saturación se lleva a cabo usando mutagénesis de Kunkel. En otras realizaciones, la mutagénesis por saturación se lleva a cabo usando la PCR.
En algunas realizaciones, se aplican al menos una, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco o más de cinco rondas de maduración de la afinidad. En algunas realizaciones, se aplica mutagénesis por saturación solo a un bucle, mientras que en otras realizaciones, se muta solo un bucle o una porción de un bucle durante una ronda de maduración de la afinidad. En algunas realizaciones, se mutan más de un bucle o porciones de uno o más de un bucle durante la misma ronda de maduración de la afinidad.
En otras realizaciones, se mutan simultáneamente los bucles BC, DE y FG durante la misma ronda de maduración de la afinidad.
En el caso de los monómeros para su ensamblaje en armazones de Tn3 multiméricos que se unen a diferentes epítopos de la misma diana, puede explorarse independientemente cada especificidad de unión.
En algunas realizaciones, se aleatorizan los bucles usando una biblioteca de presentación en fagos. En algunas realizaciones, puede determinarse la unión de un armazón de Tn3 a una diana deseada usando métodos reconocidos en la técnica. Asimismo, pueden determinarse las secuencias de aminoácidos de los armazones de Tn3 identificadas en las exploraciones usando métodos reconocidos en la técnica.
En algunas realizaciones, los armazones monoméricos con maduración de la afinidad de la invención muestran un aumento en la afinidad por CD40L de al menos 5 veces, al menos 10 veces, al menos 20 veces, al menos 40 veces, al menos 60 veces, al menos 80 veces o al menos 100 veces o más, en comparación con el mismo armazón de Tn3 antes de la maduración de la afinidad, medida mediante resonancia de plasmón superficial o mediante otros ensayos conocidos en la técnica. En algunas realizaciones, los armazones monoméricos con maduración de la afinidad de la invención tienen una constante de disociación (Kd) de menos de 5 |jM, menos de 1 |jM, menos de 500 |jM, menos de 250 |jM, menos de 100 jiM o menos de 50 jiM, medida mediante resonancia de plasmón superficial o mediante otros ensayos conocidos en la técnica.
Pueden aplicarse estos métodos de maduración de la afinidad para desarrollar armazones de Tn3 con propiedades de unión mejoradas deseables, tales como afinidad aumentada u otras características deseables, tales como propiedades farmacocinéticas favorables, alta potencia, baja inmunogenicidad, reactividad cruzada aumentada o reducida, etc.
Generación de repeticiones en tándem
Uniendo construcciones en tándem, puede generarse un dímero formado uniendo dos subunidades de monómero específicas para CD40L, mediante ligamiento de oligonucleótidos en los sitios de restricción usando enzimas de restricción conocidas en la técnica, incluyendo, pero sin limitación, enzimas de restricción de tipo II y de tipo IIS.
Los armazones de Tn3 multiméricos de la invención pueden comprender un enlazador en el carboxiterminal y/o el aminoterminal y/o entre dominios, como se describe en el presente documento. Además, los armazones de la invención que comprenden al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7 o al menos 8 armazones de polipéptido puede fusionarse o conjugarse a un dominio de dimerización, incluyendo, pero sin limitación, un resto de anticuerpo seleccionado entre:
(i) un fragmento Fab que tiene los dominios VL, CL, VH y CH1;
(ii) un fragmento Fab' que es un fragmento Fab que tiene uno o más restos de cisteína en el carboxiterminal del dominio CH1;
(iii) un fragmento Fd que tiene los dominios VH y CH1;
(iv) un fragmento Fd' que tiene los dominios VH y CH1 y uno o más restos de cisteína en el carboxiterminal del dominio CH1;
(v) un fragmento Fv que tiene los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo;
(vi) un fragmento dAb que consiste en un dominio VH;
(vii) regiones CDR aisladas;
(viii) fragmentos F(ab')2, un fragmento bivalente que incluye dos fragmentos Fab' unidos mediante un puente disulfuro en la región bisagra;
(ix) moléculas de anticuerpo monocatenarias (por ejemplo, Fv monocatenario; scFv);
(x) un "diacuerpo" con dos sitios de unión a antígeno, que comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena de polipéptido;
(xi) un "anticuerpo lineal" que comprende un par de segmentos Fd en tándem (VH-CH1-VH-CH1) que, junto con polipéptidos complementarios de cadena ligera, forman un par de regiones de unión a antígeno;
(xii) un anticuerpo de longitud completa; y
(xiii) una región Fc que comprende CH2-CH3, que puede comprender además la totalidad o una porción de una región bisagra y/o una región CH1.
Producción del armazón de Tn3
La expresión recombinante de un armazón de Tn3 de la invención requiere la construcción de un vector de expresión que contiene un polinucleótido que codifica el armazón de Tn3. Una vez que se ha obtenido un polinucleótido que codifica un armazón de Tn3, puede producirse el vector para la producción del armazón de Tn3 mediante tecnología de ADN recombinante, usando técnicas bien conocidas en la técnica. Por tanto, en el presente documento se describen métodos para preparar una proteína expresando un polinucleótido que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica el armazón de Tn3. Pueden usarse métodos de sobra conocidos para los expertos en la materia para construir vectores de expresión que contienen secuencias codificantes del armazón de polipéptido y señales de control transcripcional y traduccional adecuadas. Estos métodos incluyen, por ejemplo, técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas y recombinación genética in vivo. Por lo tanto, la invención proporciona vectores replicables que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica un armazón de Tn3 de la invención, ligada operativamente a un promotor.
El vector de expresión se transfiere a una célula hospedadora mediante técnicas convencionales y las células transfectadas se cultivan después mediante técnicas convencionales para producir un armazón de Tn3 de la invención. Por lo tanto, la invención incluye células hospedadoras que contienen un polinucleótido que codifica un armazón de la invención, unido operativamente a un promotor heterólogo. Las células hospedadoras adecuadas incluyen, pero sin limitación, microorganismos tales como bacterias (por ejemplo, E. co liy B. subtilis).
Pueden utilizarse diversos sistemas de hospedador-vector de expresión para expresar los armazones de Tn3 de la invención. Dichos sistemas de hospedador-vector de expresión representan vehículos mediante los que pueden producirse y posteriormente purificarse las secuencias codificantes de interés, pero también representan células que, cuando se transforman o transfectan con las secuencias codificantes de nucleótidos adecuadas, pueden expresar un armazón de la invención in situ. Estas incluyen, pero sin limitación, microorganismos tales como bacterias (por ejemplo, E. coli y B. subtilis) transformadas con vectores de expresión de ADN de bacteriófago, ADN de plásmido o ADN de cósmido recombinantes que contienen secuencias codificantes del armazón o sistemas de células de mamífero (por ejemplo, células COS, CHO, BHK, 293, NSO y 3T3).
Se divulgan métodos útiles para la producción de los armazones de Tn3 de la invención, por ejemplo, en la Publicación de Solicitud de Patente Internacional n.° WO 2009/058379. Una vez que se ha producido un armazón de la invención mediante expresión recombinante, puede purificarse mediante cualquier método conocido en la técnica para la purificación de una proteína.
En algunas realizaciones, los armazones de la invención pueden producirse en forma aglucosilada reemplazando los restos de aminoácidos que pueden glucosilarse durante la expresión recombinante. En una realización específica, los aminoácidos de serina en un enlazador de glicina-serina (por ejemplo, la SEQ ID NO: 131 o la SEQ ID NO: 132) pueden reemplazarse por otros restos de aminoácidos, tales como alanina, glicina, leucina, isoleucina o valina (véanse, por ejemplo, las SEQ ID NO: 140, 141, 142 y 143) para prevenir la glucosilación durante la expresión recombinante. En algunas realizaciones específicas, se elimina un sitio de N-glucosilación de uno de los armazones de Tn3 de la invención. En otras realizaciones, puede desglucosilarse un armazón de la invención después de la expresión recombinante. Se conocen en la técnica métodos de desglucosilación in vitro después de la expresión recombinante usando, por ejemplo, cócteles enzimáticos (por ejemplo, los kits de desglucosilación pFGase F, Enodo F Multi, Orela O-linked Glycan Release, Enzymatic CarboRelease y Enzymatic DeGlycoMx, comercializados por QA-bio, Palm Desert, CA).
Puede aumentarse la escala de producción de los armazones de Tn3 de la invención en el laboratorio de investigación para producir armazones en reactores a escala analítica o reactores a escala de producción, como se describe en la Publicación de Patente de los Estados Unidos n.° US 2010-0298541 A1.
Producción escalable de los armazones de Tn3 secretados
Los armazones de Tn3 de la invención pueden producirse por vía intracelular o como una forma secretada. En algunas realizaciones, los armazones secretados se pliegan adecuadamente y son completamente funcionales. Los armazones de Tn3 de la invención pueden producirse mediante un proceso escalable. En algunas realizaciones, los armazones pueden producirse mediante un proceso escalable de la invención en el laboratorio de investigación, que puede aumentarse de escala para producir los armazones de la invención en biorreactores a escala analítica (por ejemplo, pero sin limitación, biorreactores de 5 l, 10 l, 15 l, 30 l o 50 l). En otras realizaciones, los armazones de Tn3 pueden producirse mediante un proceso escalable de la invención en el laboratorio de investigación que puede aumentarse de escala para producir los armazones de Tn3 de la invención en biorreactores a escala de producción (por ejemplo, pero sin limitación, hasta 75 l, 100 l, 150 l, 300 l o 500 l). En algunas realizaciones, el proceso escalable de la invención da como resultado una reducción escasa o nula de la eficiencia de producción, en comparación con el proceso de producción llevado a cabo en el laboratorio de investigación.
Enlazadores
Las subunidades de monómeros en un armazón de T n3 multimérico pueden conectarse mediante enlazadores proteínicos y/o no proteínicos, en donde cada enlazador se fusiona a al menos dos subunidades de monómero. Un enlazador adecuado puede consistir en un enlazador proteínico, un enlazador no proteínico y combinaciones de los mismos. Las combinaciones de enlazadores pueden ser homoméricas o heteroméricas. En algunas realizaciones, un armazón de Tn3 multimérico de la invención comprende diversas subunidades de monómero, en donde todos los enlazadores son idénticos. En otras realizaciones, un armazón de Tn3 multimérico comprende diversas subunidades de monómero, en donde al menos uno de los enlazadores es funcional o estructuralmente diferente al resto de los enlazadores. En algunas realizaciones, los enlazadores en sí pueden contribuir a la actividad de un armazón de Tn3 multimérico participando directa o indirectamente en la unión a una diana.
En algunas realizaciones, el enlazador proteínico es un polipéptido. El polipéptido enlazador puede tener una longitud, que es adecuada para unir dos o más subunidades de monómero de tal forma que adoptan la conformación correcta en relación con el otro, de tal forma que conservan la actividad deseada.
En una realización, en polipéptido enlazador comprende de 1 a aproximadamente 1000 restos de aminoácido, de 1 a aproximadamente 50 restos de aminoácido, 1-25 restos de aminoácido, 1-20 restos de aminoácido, 1-15 restos de aminoácido, 1-10 restos de aminoácido, 1-5 restos de aminoácido, 1-3 restos de aminoácido. La invención proporciona además ácidos nucleicos, tales como ADN o ARN o combinaciones de ambos, que codifican la secuencia de polipéptido enlazador. Los restos de aminoácido seleccionados para su inclusión en el polipéptido enlazador deben mostrar propiedades que no interfieren significativamente con la actividad o función del armazón de Tn3 multimérico de la invención. Por tanto, un polipéptido enlazador no debe mostrar en general una carga que pueda ser inconsistente con la actividad o función del armazón de Tn3 multimérico de la invención o que interfiera con el plegamiento interno o que forme enlaces u otras interacciones con restos de aminoácido en una o más de las subunidades de monómero que podrían impedir gravemente la unión del armazón de Tn3 multimérico de la invención a CD40L.
Se conoce bien en la bibliografía el uso de péptidos enlazadores tanto de origen natural como artificiales para conectar polipéptidos, formando nuevos polipéptidos de fusión enlazados. Por consiguiente, los enlazadores que fusionan dos o más subunidades de monómero son enlazadores naturales, enlazadores artificiales o combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, las secuencias de aminoácido de todos los péptidos enlazadores presentes en un armazón multimérico de Tn3 de la invención son idénticas. En otras realizaciones, las secuencias de aminoácidos de al menos dos de los péptidos enlazadores presentes en un armazón de Tn3 multimérico de la invención son diferentes.
En algunas realizaciones, un polipéptido enlazador posee flexibilidad conformacional. En algunas realizaciones, una secuencia de polipéptido enlazador comprende una secuencia de aminoácidos (G-G-G-G-X)m donde X es alanina (A), serina (S), glicina (G), isoleucina (I), leucina (L) o valina (V) y m es un número entero positivo (véase, por ejemplo, la SEQ ID NO: 209). En una realización específica, una secuencia de polipéptido enlazador comprende una secuencia de aminoácidos (G-G-G-G-S)m donde m es un número entero positivo (véase, por ejemplo, la SEQ ID NO: 147). En otra realización específica, una secuencia de polipéptido enlazador comprende una secuencia de aminoácidos (G-G-G-G-G)m donde m es un número entero positivo (véase, por ejemplo, la SEQ ID NO: 148). En otra realización específica más, una secuencia de polipéptido enlazador comprende una secuencia de aminoácidos (G-G-G-G-A)m donde m es un número entero positivo (véase, por ejemplo, la SEQ ID NO: 149). En algunas realizaciones, un polipéptido enlazador es un polipéptido natural o artificial inherentemente no estructurado (véase, por ejemplo, Schellenberger etal., NatureBiotechnol.
27:1186-1190, 2009; véase también, Sickmeier et al., Nucleic Acids Res. 35:D786-93, 2007).
El péptido enlazador puede modificarse de tal forma que se introduce un resto de aminoácido que comprende un grupo de unión para un resto no polipeptídico. Los ejemplos de dichos restos de aminoácido pueden ser un resto de cisteína (al que se une posteriormente el resto no polipeptídico) o la secuencia de aminoácidos puede incluir un sitio de N-glucosilación in vivo (acoplando de este modo un resto de azúcar (in vivo) al péptido enlazador).
En algunas realizaciones, las secuencias de aminoácidos de todos los péptidos enlazadores presentes en el multímero de polipéptido son idénticas. Como alternativa, las secuencias de aminoácidos de todos los péptidos enlazadores presentes en el multímero de polipéptido pueden ser diferentes.
La presente invención abarca además usos de armazones de Tn3 conjugados a un resto terapéutico. Puede conjugarse un armazón de Tn3 a un resto terapéutico, tal como una citotoxina, por ejemplo, un agente citostático o citocida, un agente terapéutico o un ion de metal radiactivo, por ejemplo, emisores alfa. Una citotoxina o agente citotóxico incluye cualquier agente que sea perjudicial para las células.
Armazones de Tn3 específicos para CD40L
La invención proporciona armazones de Tn3 que se unen específicamente a CD40L. En realizaciones específicas, los armazones de la invención se unen específicamente a CD40L humano. En otras realizaciones específicas, los armazones de Tn3 de la invención se unen a homólogos de CD40L de ratón, pollo, macaco de la india, macaco cangrejero, rata o conejo. En algunas realizaciones, los armazones de Tn3 de la invención se exponen a un epítopo expuesto de CD40L. Dichas realizaciones incluyen CD40L expresado de manera endógena en células y/o células transfectadas para expresar el receptor de manera ectópica.
En algunas realizaciones, los armazones de Tn3 de la invención reconocen epítopos presentados en un CD40L monomérico. En otras realizaciones, los armazones de Tn3 de la invención reconocen epítopos presentados en una forma trimérica de CD40L. En otras realizaciones, los armazones de Tn3 de la invención reconocen epítopos presentados en un CD40L unido a membrana. En otras realizaciones, los armazones de Tn3 de la invención reconocen epítopos presentados en un CD40L soluble.
En otras realizaciones más, los armazones de Tn3 de la invención se unen a CD40L monomérico y previenen o interfieren con la oligomerización de moléculas de CD40L. En otras realizaciones más, los armazones de la invención reducen o inhiben la interacción de CD40L con CD40. En otras realizaciones, los armazones de Tn3 de la invención agonizan la señalización celular mediada por CD40L. En otras realizaciones más, los armazones de Tn3 de la invención antagonizan la señalización celular mediada por CD40L.
Sin desear quedar ligados a cualquier teoría particular, los armazones de CD40L de la presente invención podrían funcionar previniendo la unión de CD40L a CD40, uniéndose y secuestrando a CD40L soluble, alterando la interacción de CD40L con CD40 pero sin prevenir la unión, previniendo o potenciando la escisión enzimática mediada por metaloproteasas de CD40L de la superficie celular para producir CD40L soluble, previniendo o potenciando la endocitosis de CD40L de la superficie celular, etc.
Secuencias de unión a CD40L específicas
En algunas realizaciones, el armazón de Tn3 de la invención comprende subunidades de monómero específicas para CD40L que comprenden al menos una, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco o al menos seis secuencias de bucle que se unen a CD40L.
En algunas realizaciones, las subunidades de monómero específicas para CD40L comprenden al menos una, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco o al menos seis secuencias de bucle de clones de monómero de unión a CD40L seleccionados entre: 309 (clon de la familia 309 precursora aislado de la biblioteca de Tn3 nativa; SEQ ID NO: 20), 309FGwt (clon de 309 precursor con bucle FG humanizado; SEQ ID NO: 22), 340 (clon 309 con afinidad madurada; SEQ ID No : 24), 341 (clon 309 con afinidad madurada; SEQ ID NO: 26), 342 (clon 309 con afinidad madurada; SEQ ID NO: 28 o la SEQ iD NO: 146), 343 (clon 309 con afinidad madurada; SEQ ID n O: 30), 344 (clon 309 con afinidad madurada; SEQ ID NO: 32), 345 (clon 309 con afinidad madurada; SEQ ID NO: 34), 346 (clon 309 con afinidad madurada; SEQ ID NO: 36), 347 (clon 309 con afinidad madurada; SEQ ID NO: 38), 348 (clon 309 con afinidad madurada; SEQ ID NO: 40), 349 (clon 309 con afinidad madurada; SEQ ID NO: 42), 311 (clon de la familia 311 precursora aislado de la biblioteca de Tn3 nativa; SEQ ID NO: 44), 311K4E (clon de la familia 311 de la primera ronda de maduración de la afinidad; SEQ ID NO: 46); 311K4E_1 (clon de la familia 311 de la segunda ronda de maduración de la afinidad; SEQ ID NO: 48), 311K4E_2 (clon variante de la familia 311 de la segunda ronda de maduración de la afinidad; SEQ ID NO: 50), 311K4E_3 (clon variante de la familia 311 de la segunda ronda de maduración de la afinidad; SEQ ID NO: 52), 311K4E_4 (clon variante de la familia 311 de la segunda ronda de maduración de la afinidad; SEQ ID NO: 54), 311K4E_5 (clon variante de la familia 311 de la segunda ronda de maduración de la afinidad; SEQ ID NO: 56), 311K4E_7 (clon variante de la familia 311 de la segunda ronda de maduración de la afinidad; SEQ ID NO: 58), 311 K4E_8 (clon variante de la familia 311 de la segunda ronda de maduración de la afinidad; SEQ ID NO: 60), 311K4E_9 (clon variante de la familia 311 de la segunda ronda de maduración de la afinidad; SEQ ID NO: 62), 311K4E_10 (clon variante de la familia 311 de la segunda ronda de maduración de la afinidad; SEQ ID NO: 64), 311 K4E_11 (clon variante de la familia 311 de la segunda ronda de maduración de la afinidad SEQ ID NO 66 ), 311K4E_12 (clon variante de la familia 311 de la segunda ronda de maduración de la afinidad SEQ ID NO 68 ), 311K4E_13 (clon variante de la familia 311 de la segunda ronda de maduración de la afinidad SEQ ID NO 70), 311K4E_14 (clon variante de la familia 311 de la segunda ronda de maduración de la afinidad SEQ ID NO 72), 311K4E_15 (clon variante de la familia 311 de la segunda ronda de maduración de la afinidad SEQ ID NO 74), 311K4E_16 (clon variante de la familia 311 de la segunda ronda de maduración de la afinidad SEQ ID NO 76), 311K4E_19 (clon variante de la familia 311 de la segunda ronda de maduración de la afinidad; SEQ ID NO: 78), 311K4E 20 (clon variante de la familia 311 de la segunda ronda de maduración de la afinidad; SEQ ID NO: 80) y 311K4E_21 (clon variante de la familia 311 de la segunda ronda de maduración de la afinidad; SEQ ID NO: 82).
En algunas realizaciones, las subunidades de monómero específicas para CD40L comprenden al menos una secuencia de bucle seleccionada entre las secuencias de bucle listadas en la tabla 2. En otras realizaciones, las subunidades de monómero específicas para CD40L comprenden al menos una secuencia de bucle BC seleccionada entre las secuencias de bucle BC listadas en la tabla 2. En otras realizaciones, las subunidades de monómero específicas para CD40L comprenden al menos una secuencia de bucle DE seleccionada entre las secuencias de bucle DE listadas en la tabla 2.
En otras realizaciones, las subunidades de monómero específicas para CD40L comprenden al menos una secuencia de bucle FG seleccionada entre las secuencias de bucle FG listadas en la tabla 2.
En algunas realizaciones, las subunidades de monómero específicas para CD40L comprenden una secuencia de bucle BC seleccionada entre las secuencias de bucle BC listadas en la tabla 2; y una secuencia de bucle DE seleccionada entre las secuencias de bucle DE listadas en la tabla 2. En otras realizaciones, las subunidades de monómero específicas para CD40L comprenden una secuencia de bucle BC seleccionada entre las secuencias de bucle BC listadas en la tabla 2 ; y una secuencia de bucle FG seleccionada entre las secuencias de bucle FG listadas en la tabla 2. En otras realizaciones, las subunidades de monómero específicas para CD40L comprenden una secuencia de bucle DE seleccionada entre las secuencias de bucle DE listadas en la tabla 2 ; y una secuencia de bucle FG seleccionada entre las secuencias de bucle FG listadas en la tabla 2. En algunas realizaciones, una subunidad de monómero específica para CD40L comprende secuencias de bucle correspondientes a las secuencias de bucle de uno, dos o tres clones de Tn3 diferentes.
En ciertas realizaciones, donde la secuencia de armazón de monómero específico para CD40L contiene un enlazador y/o un marcador de histidina (por ejemplo, un marcador His-8 ) en el carboxiterminal de la secuencia o aminoácidos aminoterminales adicionales, este enlazador carboxiterminal y/o marcador de histidina y los aminoácidos aminoterminales adicionales pueden eliminarse, conteniendo de este modo la secuencia de aminoácidos correspondiente una eliminación del enlazador carboxiterminal y secuencias de marcador His y el aminoácido o los aminoácidos adicionales aminoterminales.
En algunas realizaciones, el armazón de Tn3 específico para CD40L comprende una sola subunidad de monómero, por ejemplo, la secuencia del clon 342 (clon 309 con afinidad madurada; SEQ ID NO: 28 y/o SEQ ID NO: 146). En otras realizaciones, el armazón específico para CD40L comprende más de una subunidad de monómero, por ejemplo, dos subunidades de monómero del clon 342 (SEQ ID NO: 28 y/o SEQ ID NO: 146) en tándem (véase, por ejemplo, la SEQ ID NO: 135). En realizaciones específicas, los armazones de Tn3 de la invención se conjugan a una HSA variante (véase, por ejemplo, la SEQ ID NO: 134 y la SEQ ID NO: 135). En realizaciones adicionales, la HSA puede conjugarse o bien al aminoterminal o al carboxiterminal del armazón de Tn3 multimérico.
En una realización específica, el armazón de Tn3 específico para CD40L comprende una sola subunidad de monómero de 311K4E_12, un enlazador de GS y una variante de HSA C34S (véase, por ejemplo, la SEQ ID NO: 201). En otra realización específica, el armazón de Tn3 específico para CD40L comprende una sola subunidad de monómero de 311K4E_12 con una variante CELTYG de hebra beta C, un enlazador de todo glicina y una variante de HSA C34S (véase, por ejemplo, la SEQ ID NO: 202). En otra realización específica, el armazón de Tn3 específico para CD40L comprende dos subunidades de 311K4E_12 en tándem y dos enlazadores GS, en donde un enlazador GS conecta las subunidades entre sí y un segundo enlazador GS conecta una subunidad a una variante de HSA C34S (véase, por ejemplo, la SEQ ID NO: 203). En otra realización específica más, el armazón de Tn3 específico para CD40L comprende dos subunidades de 311K4E_12 en tándem y dos enlazadores totalmente de glicina, en donde un enlazador totalmente de glicina conecta las subunidades entre sí y un segundo enlazador totalmente de glicina conecta una subunidad a una variante de HSA C34S (véase, por ejemplo, la SEQ ID NO: 204).
En una realización específica, el armazón de T n3 específico para CD40L comprende dos subunidades de 309 conectadas en tándem mediante un enlazador de GS (véase, por ejemplo, la SEQ ID NO: 205). En otra realización específica, el armazón de Tn3 específico para CD40L comprende una sola subunidad de 309 conectada a una variante de HSA C34S (véase, por ejemplo, la SEQ ID NO: 206). En otra realización específica, el armazón de Tn3 específico para CD40L comprende dos subunidades de 309 en tándem y dos enlazadores GS, en donde un enlazador GS conecta las subunidades entre sí y un segundo enlazador GS conecta una subunidad a una variante de HSA C34S (véase, por ejemplo, la SEQ ID NO: 207).
En una realización específica, el armazón de Tn3 específico para CD40L comprende una sola subunidad de monómero de 342, un enlazador de GS y una variante de HSA C34S (véase, por ejemplo, la SEQ ID NO: 134). En otra realización específica, el armazón de T n3 específico para CD40L comprende una sola subunidad de monómero de 342, un enlazador totalmente de glicina y una variante de HSA C34S (véase, por ejemplo, la SEQ ID NO: 144). En otra realización específica, el armazón de Tn3 específico para CD40L comprende dos subunidades de 342 en tándem y dos enlazadores GS, en donde un enlazador GS conecta las subunidades entre sí y un segundo enlazador GS conecta una subunidad a una variante de HSA C34S (véase, por ejemplo, la SEQ ID NO: 135). En otra realización específica más, el armazón de Tn3 específico para CD40L comprende dos subunidades de 342 en tándem y dos enlazadores totalmente de glicina, en donde un enlazador totalmente de glicina conecta las subunidades entre sí y un segundo enlazador totalmente de glicina conecta una subunidad a una variante de HSA C34S (véase, por ejemplo, la SEQ ID NO: 145). En otra realización específica más, el armazón de Tn3 específico para CD40L comprende dos subunidades de 342 conectadas en tándem mediante un enlazador de GS (véase, por ejemplo, la SEQ ID NO: 208).
En una realización específica, el armazón de Tn3 específico para CD40L comprende una subunidad de 311 o una subunidad procedente de 311 (por ejemplo, 311K4E_12) y una subunidad de 309 o una subunidad procedente de 309 (por ejemplo, 342) en tándem y dos enlazadores GS, en donde un enlazador GS conecta las subunidades entre sí y un segundo enlazador GS conecta una subunidad a una variante de HSA C34S (véase, por ejemplo, la SEQ ID NO: 135). En otra realización específica más, el armazón de Tn3 específico para CD40L comprende una subunidad de 311 o una subunidad procedente de 311 (por ejemplo, 311K4E_12) y una subunidad de 309 o una subunidad procedente de 309 (por ejemplo, 342) en tándem y dos enlazadores totalmente de glicina, en donde un enlazador completamente de glicina conecta las subunidades entre sí y un segundo enlazador completamente de glicina conecta una subunidad a una variante de HSA C34S (véase, por ejemplo, la SEQ ID NO: 145).
Los ejemplos de fusiones de armazones de Tn3 bivalentes en tándem específicos para CD40L y seroalbúmina (SA) se muestran en la FIG. 2A (véase también la FIG. 9A). Aunque en la FIG. 2A se proporcionan enlazadores específicos, se contemplan como proporcionados en el presente documento otros enlazadores). Aunque puede usarse SA madura de tipo silvestre, por ejemplo, seroalbúmina murina (MSA) o seroalbúmina humana (HSA), se contempla que puedan sustituirse uno o más restos de aminoácido de cisteína (C) en la SA madura, por ejemplo, por serina (S), alanina (A), glicina (G), etc.
A continuación se muestran construcciones representativas. La secuencia de la SA se encuentra subrayada. Los enlazadores están recuadrados. Se entenderá que numerosas variaciones se encuentran dentro del ámbito de la invención. Por ejemplo, los enlazadores pueden alterarse (en el presente documento se proporcionan varios ejemplos no limitantes), el primero o dos restos de aminoácido aminoterminales (SQ) pueden estar ausentes y/o sustituidos con restos de aminoácido alternativos, puede incorporarse un marcador (por ejemplo, un marcador de 6xHis), pueden utilizarse armazones específicos para CD40L alternativos (por ejemplo, los basados en el 10.° dominio Fn3 de fibronectina) en una construcción similar, etc.
Construcción 1 de HSA monovalente de 342 (SEQ ID NO: 134)
[monómero de 342] - enlazador de (G4S) 2 ~HSAc34s SQIEVKDVTDTTALITWSDDFGEYVWCELTYGIKDVPGDRTTIDLWYHHAHYSIGNLKPD
teyevslicrsgdmssnpaketftt|ggggsggggs|dahksevahrfkdlgeenfkalvli AFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYG EMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARR HPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQK FGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYIC ENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDV FLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQ NLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKR MPCAEDYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAE TFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKE TCFAEEGKKLVAASQAALGL
Construcción 2 de HSA monovalente de 342 (SEQ ID NO: 144)
[monómero de 342 ]-enlazador de Gio-HSAC 34 s:
SQIEVKDVTDTTALITWSDDFGEYVWCELTYGIKDVPGDRTTIDLWYHHAHYSIGNLKPD TEYEVSLICRSGDMSSNPAKETFTT|GGGGGGGGGG|DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLI AFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYG EMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLYRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARR HPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQK FGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYIC ENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDV FLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQ NLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSP.NLGKVGSKCCKHPEAKR MPCAEDYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAE TFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKE TCFAEEGKKLVAASQAALGL
Construcción 1 de HSA bivalente de 342 (SEQ ID NO: 135)
[monómero de 342]-enlazador de (G4S)3-[monómero de 342]-enlazador de {G4S)2-HSAC34e:
SQIEVKDVTDTTALITWSDDFGEYVWCELTYGIKDVPGDRTTIDLWYHHAHYSIGNLKPD
teyevslicrsgdmssnpaketftt|ggggsggggsggggs|rldapsqievkdvtdttali TWSDDFGEYVWCELTYGIKDVPGDRTTIDLWYHHAHYSIGNLKPDTEYEVSLICRSGDMS SNPAKETFTTGGGGSGGGGS]dahksevahrfkdlgeenfkalvliafaqylqqspfedhv klvnevtefaktcvadesaencdkslhtlfgdklctvatlretygemadccakqeperne cflqhkddnpnlprlvrpevdvmctafhdneetflkkylyeiarrhpyfyapellffakr YKAñFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLS qrfpkaefaevsklvtdltkvhtecchgdllecaddradlakyicenqdsissklkecce kpllekshciaevendempadlpslaadfveskdvcknyaeakdvflgmflyeyarrhpd yswlllrlaktyettlekccaaadphecyakvfdefkplveepqnlikqncelfeqlge ykfqnallvrytkkvpqvstptlvevsrnlgkvgskcckhpeakrmpcaedylswlnql cvlhektpvsdrvtkccteslvnrrpcfsalevdetyvpkefnaetftfhadictlseke rqikkqtalvelvkhkpkatkeqlkavmddfaafvekcckaddketcfaeegkklvaasq AALGL
Construcción 2 de HSA bivalente de 342 (SEQ ID NO: 145)
[monómero de 342]-enlazador de G15-[monómero de 342]-enlazador de Gio-HSAc34s:
SQIEVKDVTDTTALITWSDDFGEYVWCELTYGIKDVPGDRTTIDLWYHHAHYSIGNLKPD TEYEVSLICRSGDMSSNPAKETFTT|GGGGGGGGGGGGGGG|RLDAPSQIEVKDVTDTTALI TWSDDFGEYVWCELTYGIKDVPGDRTTIDLWYHHAHYSIGNLKPDTEYEVSLICRSGDMS SNPAKETFTT|GGGGGGGGGG|DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHV KLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNE CFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKR YKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLS QRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCE KPLLEKSHCIAEVENDEMPAPEPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPD YSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGE YKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSWLNQL CVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKE RQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQ AALGL
Construcción 1 de HSA monovalente de 311K4E_12 (SEQ ID NO: 201)
[monómero de 311K4E 12] - enlazador de (G4S)2_HSAC34s:
SQIEVEDVTDTTALITWTNRSSYSNLHGCELAYGIKDVPGDRTTIDLNQPYVHYSIGNLK
pdteyevsliclttdgtynnpaketftt|ggggsggggs|dahksevahrfkdlgeenfkal VLIAFAQYLQQSPFEDHVKLWEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRE TYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEI ARRHPYFYAPELEFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCAS LQKFGEPAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAK YICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEA KDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADBHECYAKVFDEFKPLVE EPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPE AKRMPCAEDYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEF MAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKAD DKETCFAEEGKKLVAASQAALGL
Construcción 2 de HSA monovalente de 311 K4E_12 (SEQ ID NO: 202)
[monómero de 311K4E_12]-enlazador de Gio-HSAC34s:
SQIEVEDVTDTTALITWTNRSSYSNLHGCELTYGIKDVPGDRTTIDLNQPYVHYSIGNLK
pdteyevsliclttdgtynnpaketftt|gggggggggg|dahksevahrfkdlgeenfkal VLIAFAQYLQQSPFEDHVKLWEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRE TYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEI ARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCAS LQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAK YICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEA KDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKT YETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVE EPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPE AKRMPCAEDYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEF NAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKAD DKETCFAEEGKKLVAASQAALGL
Construcción 1 de HSA bivalente de 311K4E_12 (SEQ ID NO: 203)
[monómero de 311K4E_12]-enlazador de (G4S) 3-[monómero de 311K4E_12]-enlazador
de (G4S)2“HSAc34S
SQIEVEDVTDTTALITWTNRSSYSNLHGCELAYGIKDVPGDRTTIDLNQPYVHYSIGNLK
pdteyevsliclttdgtynnpaketftt|ggggsggggsggggs|rldapsqievedvtdtt
ALITWTNRSSYSNLHGCELAYGIKDVPGDRTTIDLNQPYVHYSIGNLKPDTEYEVSLICL TTDGTYNNPAKETFTTGGGGSGGGGSDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQS PFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQ EPERNECFLQHKDDMPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPEL LFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAW AVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSK LKECCEKPLLEKSHCIAEVEMDEMPADLPSLAADFVESKDVCKHYAEAKDVFLGMFLYEY ARRHPDY3WLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQMLIKQNCEL
FEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLS WLNQLGVLHEKTPVS DRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADIC TLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKK LVAASQAALGL
Construcción 2 de HSA bivalente de 311 K4E_12 (SEQ ID NO: 204)
[monómero de 311K4E_12]-enlazador de G15-[monómero de 311K4E_12]-enlazador de Gio-HSAC34s:
SQIEVEDVTDTTALITWTNRSSYSNLHGCELTYGIKDVPGDRTTIDLNQPYVHYSIGNLK
pdteyevsliclttdgtynnpaketftt|ggggggggggggggg|rldapsqievedvtdtt
ALITWTNRSSYSNLHGCELAYGIKDVPGDRTTIDLNQPYVHYSIGNLKPDTEYEVSLICL
ttdgtynnpaketftt|gggggggggg|dahksevahrfkdlgeenfkalvliafaqylqqs
PFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQ EPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPEL LFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAW AVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDPADLAKYICEMQDSISSK LKECCEKPLLEKSHCIAEVEMDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEY ARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCEL FEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLS WLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADIC TLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKK LVAASQAALGL
Composiciones farmacéuticas
En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición, por ejemplo, pero sin limitación, una composición farmacéutica, que contiene una o una combinación de proteínas de fusión a albúmina de la presente invención, formulada junto con un portador farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende una proteína de fusión a albúmina que tiene un armazón, tal como un armazón de Tn3. En otra realización, la composición farmacéutica comprende una proteína de fusión a albúmina de SEQ ID NO: 134, 135, 201,202, 203, 204, 205, 206, 207 o 208, en donde la composición tiene menos de 20 ng/mg de proteína de la célula hospedadora y en donde el triptófano en la posición 46, 151 o en ambas no está oxidado. Otras realizaciones se refieren a una formulación farmacéuticamente aceptable que comprende una proteína de fusión a albúmina purificada de acuerdo con la invención. De manera adecuada, la formulación puede incluir un tampón, un azúcar y un emulsionante. En una realización, el tampón es un tampón de fosfato de sodio, el azúcar es sacarosa y el emulsionante es polisorbato 80. La formulación farmacéutica de la reivindicación 100 o 101, en donde la formulación está liofilizada.
EJEMPLOS
A continuación se describe la invención haciendo referencia a los siguientes ejemplos. Estos ejemplos son únicamente ilustrativos y en ningún caso debe interpretarse que la invención se limita a estos ejemplos. Debe interpretarse que esta abarca cualquiera y todas las variaciones que resulten evidentes como resultado de las enseñanzas proporcionadas en el presente documento.
Ejemplo 1
Compuestos químicos
El propilenglicol se obtuvo de Alfa Aesar (Ward Hill, MA, EE. UU.). La sacarosa se obtuvo de Pfanstiehl (Waukegan, IL, EE. UU.). El Triton X-100 y el sulfato de sodio se obtuvieron de EMD Millipore (Billerica, MA, EE. UU.). El bis-tris, el bistris HCl y la nicotinamida se obtuvieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.). El ácido acético glacial, la arginina, la glicina, el acetato de sodio, el caprilato de sodio, el cloruro de sodio, el citrato de sodio, el hidróxido de sodio, el fosfato de sodio, el tris y la urea se obtuvieron de JT Baker (Center Valley, PA, EE. UU.).
Proteínas
La proteína usada en este trabajo, la proteína de fusión a albúmina n.° 1 (AFP-1) (SEQ ID NO: 145), es un antagonista de CD40L formado por dos dominios idénticos de tenascina C (TnC), procedentes de un dominio de proteína de fibronectina de tipo III humana, fusionado a una seroalbúmina humana. Cada dominio Tn3 (procedente del tercer dominio de proteína de fibronectina de tipo II de TnC humana) se une a CD40L humano e inhibe su interacción con CD40 humano. La fusión a seroalbúmina humana garantiza propiedades farmacocinéticas adecuadas de la molécula. La proteína se expresa en células de ovario de hámster chino (CHO) usando técnicas familiares para los expertos en la materia. La albúmina humana recombinante (rHSA; expresada en arroz) se adquirió en forma de un polvo liofilizado de Sigma-Aldrich (n.° de cat. A9731). La tabla 3 resume las propiedades de la rHSA y de AFP-1.
Tabla 3. R m n l r i l r ín
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Mediciones de la concentración total de proteína
Se midieron las concentraciones de proteínas en todos los intermedios de proceso (excepto el medio clarificado y en algunos casos, los grupos de cromatografía de colorante azul Cibacron) mediante absorbancia a 280 nm usando procedimientos espectrofotométricos estándar comunes en la industria. Se usó un coeficiente de extinción de 0.98 (mg/ml)'1cm'1 para AFP-1 y de 0.531 (mg/ml)'1cm'1 para rHSA.
Cromatografía líquida de alto rendimiento de afinidad a HSA
Se llevó a cabo una cromatografía de afinidad de HSA analítica de alto rendimiento (HSA-HPLC) usando una columna Poros CaptureSelect HSA obtenida de Life Technologies (Grand Island, NY, EE. UU.) con un sistema HPLC Agilent 1200 (Palo Alto, CA, EE. UU.). La fase de tampón de equilibrado fue de fosfato de sodio 10-50 mM, pH 7.2 a 3.5 ml/min y el producto se eluyó con tampón de glicina 100 mM a pH 2.0. Se inyectaron muestras de 10-100 ug puras y se monitorizó el perfil de elución usando un espectrofotómetro a 280 nm. Los datos se recogieron y analizaron usando el programa informático ChemStation de Agilent y se determinaron las concentraciones específicas de producto a partir de las curvas patrón generadas con proteína purificada.
Cromatografía de afinidad por el colorante
Se llevó a cabo una cromatografía de afinidad por el colorante azul Cibacron en condiciones de unión y elución convencionales en columnas de cromatografía a pequeña escala con alturas del lecho de 20 cm. Todos los ciclos se llevaron a cabo usando un sistema de cromatografía líquida AKTA Explorer de GE Healthcare (Piscataway, NJ, EE. UU.) y la columna se empleó a 300 cm/h. En condiciones iniciales, la columna se equilibró con bis-tris (o fosfato) 50 mM, NaCl 50 mM, pH 6.0 y después se cargaron hasta 25 g de proteína/l de resina (basándose en los títulos de HSA-HPLC en el caldo de cultivo celular clarificado). Después de la carga, se reequilibró la columna, se lavó con bis-tris (o fosfato) 50 mM a pH 7.0 y después se eluyó con bis-tris (o fosfato) 50 mM, octanoato de sodio 25 mM, EDTA 10 mM a pH 7.0. El pico de producto se recogió basándose en los criterios de absorbancia de 100 mUA en los lados de cabeza y cola del pico de producto. Durante la optimización (véase el ejemplo 2), se aplicaron lavados adicionales a la columna entre el reequilibrado y el lavado con fosfato 50 mM a pH 7. La resina Capto Blue (High Sub) se obtuvo de GE Healthcare (Piscataway, Nj , EE. UU.). La resina Toyopearl AF-Blue HC-650M se obtuvo de Tosho Biosciences (King of Prussia, PA, EE. UU.).
Cromatografía de intercambio aniónico
La cromatografía de intercambio aniónico (AEX) se llevó a cabo en condiciones de unión y elución típicas en columnas de cromatografía pequeñas empaquetadas hasta una altura del lecho de 20 cm. Todos los ciclos se llevaron a cabo usando un sistema de cromatografía líquida AKTA Explorer de GE Healthcare y la columna se empleó a 300 cm/h. En condiciones iniciales, la columna se equilibró con bis-tris 50 mM, cloruro de sodio 20 mM a pH 7.0, se cargó con proteína y después se lavó con tampón de equilibrado. La columna se eluyó usando un gradiente lineal por etapas o de 10 volúmenes de columna (VC) de cloruro de sodio 20-400 mM en tampón bis-tris a pH 7.0. El pico de producto se recogió basándose en los criterios de absorbancia de 100 mUA en los lados de cabeza y cola del pico de producto. La resina Capto Q se obtuvo de GE Healthcare (Piscataway, NJ, EE. UU.).
Cromatografía de membrana de intercambio aniónico
La cromatografía de membrana de intercambio aniónico (AEMC) se llevó a cabo en condiciones de flujo pasante convencionales. Todos los ciclos se llevaron a cabo usando un sistema de cromatografía líquida AKTA Explorer de GE Healthcare y la columna se empleó a 10 VM/min. En condiciones iniciales, la membrana se equilibró con bis-tris 50 mM, cloruro de sodio 50 mM a pH 7.0 y después se hizo pasar el material de carga a través de la membrana. El pico de producto de flujo pasante se recogió basándose en los criterios de absorbancia de 100 mUA en los lados de cabeza y cola del pico de producto. Durante la optimización (véase el ejemplo 2), se usaron condiciones de tampón de NaCl entre 10-220 mM y pH de 6 a 8. Se obtuvieron membranas Mustang Q de Pall Life Sciences (Port Washington, NY, EE. UU.).
Cromatografía de interacción hidrófoba
La cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) se llevó a cabo en condiciones de unión y elución típicas en columnas de cromatografía a pequeña escala con alturas del lecho de 20 cm. Todos los ciclos se llevaron a cabo usando un sistema de cromatografía líquida AKTA Explorer de GE Healthcare (Piscataway, NJ, EE. UU.) y la columna se empleó a 130­ 300 cm/h. En condiciones iniciales, la columna se equilibró con bis-tris 50 mM, citrato de sodio 1 M a pH 7.0. La carga se preparó diluyendo 1 parte (en peso) de solución de proteína con 2 partes de bis-tris 50 mM, citrato de sodio 2 M a pH 7.0 y después se cargó la columna hasta 25 g de proteína/l de resina. Después de la carga, se reequilibró la columna con tampón de equilibrado y después se eluyó en un gradiente lineal de citrato de sodio de 1 M a citrato de sodio 0 mM a lo largo de 20 volúmenes de columna. El pico de producto se recogió en fracciones, estando el material de elución temprana enriquecido en producto oxidado. Las resinas Toyopearl PPG 600M y Toyopearl Phenyl 650M fueron de Tosoh Bioscience (King of Prussia, PA, EE. UU.); Las resinas Capto MMC y Butil-S Fast Flow fueron de GE Healthcare (Piscataway, NJ, EE. UU.).
Cromatografía de exclusión por tamaños analítica
La cromatografía de exclusión por tamaños analítica de alto rendimiento (SEC-HPLC) se llevó a cabo usando una columna TSK-GEL G3000SWXL (7.8 mm * 30 cm) obtenida de Tosoh Biosciences (King of Prussia, PA, EE. UU.) con un sistema HPLC Agilent 1200 (Palo Alto, CA, EE. u U.). La fase móvil fue fosfato de sodio 0.1 M, sulfato de sodio 0.1 M, isopropanol al 10 % a pH 6.8 a 0.8 ml/min durante 22 minutos a 30 °C. Se inyectaron muestras de 250 ug puras y la columna se calibró usando patrones de peso molecular de Bio-Rad (Hercules, CA, EE. UU.). El perfil de elución se monitorizó usando un espectrofotómetro a 280 nm y los datos se recogieron y analizaron usando el programa informático ChemStation de Agilent. Los resultados se comunican como el porcentaje de área del pico de producto de monómero, en comparación con todos los demás picos, excluyendo el pico relacionado con el tampón observado aproximadamente a los 12 minutos. Cuando el método de SEC-HPLC se lleva a cabo sin isopropanol al 10 % en la fase móvil, se observa un hombro frontal (no completamente resuelto) en el pico de monómero que se identificó como monómero con triptófano oxidado. Por tanto, dependiendo de cómo se lleva a cabo el ensayo de SEC-HPLC, este puede usarse para medir el monómero y los agregados o estimar la oxidación de triptófano.
Ejemplo 2
Purificación de una proteína de fusión a albúmina (escala de 500 l)
Se purificó albúmina humana recombinante (rHSA) con un proceso que incluye tres columnas de cromatografía de unión y elución, una membrana de cromatografía de flujo pasante, una etapa de inactivación vírica con Triton y una etapa de ultrafiltración/diafiltración. Para preparar el material de partida para el proceso de rHSA, se eliminaron los anticuerpos de un sobrenadante de cultivo celular procedente de un proceso para anticuerpos monoclonales (mAb) recogiendo el material no unido durante un ciclo de cromatografía de proteína A y después se disolvió polvo de rHSA liofilizada en el sobrenadante exento de anticuerpos. Este material de partida incluye proteínas de la célula hospedadora, ADN e impurezas de molécula pequeña que normalmente están presentes en el sobrenadante de cultivo celular de una proteína de fusión a albúmina expresada en un cultivo de células CHO.
El proceso de purificación de rHSA mostrado en la figura 1 se usó para purificar ~700 ml de sobrenadante. La tabla 4 muestra los parámetros de rendimiento de las purificaciones a escala de 1 l. Como puede observarse en la tabla, los rendimientos de etapas para las operaciones de unidad de cromatografía fueron generalmente elevados, con la excepción de Capto Blue (High Sub). La figura 2 muestra un cromatograma de afinidad de colorante azul Cibacron (High Sub) de rHSA. Como puede observarse en la figura, se observa un gran pico de absorbancia durante la carga y durante el lavado con NaCI 0.5 M. A partir únicamente de este ciclo, se desconoce si el bajo rendimiento se debía a que la columna estuviese sobrecargada (es decir, la columna se saturó con rHSA y no se capturó toda la rHSA del sobrenadante) o debido al lavado con NaCl 0.5 M. En cualquiera de los casos, es probable que se puedan minimizar las pérdidas de rendimiento optimizando las condiciones de carga de columna y de la etapa de lavado.
Tabla 4. Resumen de los arámetros de rendimiento de urificación de rHSA
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En la tabla 5 se muestra un resumen de los atributos de calidad de producto de los intermedios de proceso de rHSA. Como puede observarse en la tabla, las HCP y el ADN se controlaron bien a bajos niveles con el proceso de purificación, midiéndose las HCP a <10 ng/mg y midiéndose el ADN a 1.7 x 10-4 ng/mg en el material completamente purificado. Las HCP se reducen en más de 2 log a lo largo de la columna de Capto Blue y 1 log adicional (o más) mediante las columnas CaptoQ y PPG-600M. Se eliminan más de 5 log de ADN mediante la columna CaptoQ y se retira 1 log adicional (o más) mediante las etapas de Capto Blue o Mustang Q. Se observó eliminación de agregado adicional a lo largo de múltiples etapas en el proceso de purificación. En general, el proceso fue exitoso a la hora de purificar rHSA y se puede usar como punto de partida para la purificación de proteínas de unión a albúmina.
Tabla 5. R m n l li r rH A
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Ejemplo 3
Purificación de una proteína de fusión a albúmina (escala de 500 l)
Se expresa AFP-1, una proteína de fusión a seroalbúmina humana recombinante (fusión a HSA o fusión a albúmina), en células CHO y se purifica con un proceso que incluye tres columnas de cromatografía de unión y elución, una membrana de cromatografía de flujo pasante, una etapa de inactivación vírica con Triton, un nanofiltro y dos etapas intermedias de ultrafiltración/diafiltración.
El proceso de purificación de la fusión a albúmina se muestra en la figura 3. Se aumentó la escala del proceso de purificación mostrado en la figura 3 para purificar dos biorreactores de 500 l. La tabla 6 muestra los parámetros de rendimiento de dos purificaciones a escala de biorreactor de 500 l. Como puede observarse en la tabla, los rendimientos de etapa y los volúmenes de grupo para las operaciones unitarias de cromatografía se mantienen constantes de un lote a otro. El rendimiento general del proceso (incluyendo UF/DF y nanofiltración) fue del 48 % y del 53 % para el lote 1 y el lote 2, respectivamente. En la tabla 7 se muestra un resumen de los atributos de calidad de producto de los intermedios de proceso. El rendimiento general (es decir, rendimientos de proceso) y la calidad del producto (niveles absolutos y VRL) es altamente comparable con el proceso de purificación usado para purificar la rHSA. Esto es especialmente cierto para la etapa responsable de la mayor parte de la eliminación de HCP (Capto Blue (High Sub) y Capto Q) y la eliminación de ADN (Capto Q y Mustang Q).
Tabla 6. Resumen de los parámetros de rendimiento de purificación de AFP-1.
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Tabla 7. R m n l li r AFP-1.
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Se usa cromatografía de afinidad de colorante azul Cibacron, usando resina Capto Blue (High Sub) como columna de captura para el proceso de purificación de AFP-1. La figura 4 muestra un cromatograma representativo de la cromatografía de colorante azul Cibacron para AFP-1 empleada a 300 cm/h. Como puede observarse en la figura 4 , se observa un gran pico de flujo pasante durante la carga, indicado por una gran señal de DO que comienza aproximadamente a los 6 volúmenes de columna (VC). Este pico de flujo pasante contiene una mayoría de las impurezas relacionadas con el proceso que están presentes en el medio acondicionado, que incluye proteínas de la célula hospedadora (HCP) y ADN. Después de la carga, se vuelve a equilibrar la columna y después se lava con diferentes tampones; el primero contiene NaCl 0.5 M a pH 6.0, seguido de reequilibrado y después con propilenglicol al 10 % a pH 7.0. Los lavados reducen los niveles de HCP y ADN en el grupo de producto disociando estas impurezas del ligando de colorante azul Cibacron y/o la proteína de fusión a albúmina. Después, se eluye la columna con un tampón que contiene octanoato de sodio y EDTA. Como puede observarse en la tabla 7, después de la cromatografía Capto Blue (High Sub), el producto intermedio tiene menos ADN (reducción de 0.6-0.7 log) en comparación con el medio condicionado y menos HCP (reducción de 2.7-2.9 log). Además, el producto de Capto Blue (High Sub) tiene niveles elevados de monómero (>98.0%) y reducidos de producto oxidado.
Después de la captura inicial con cromatografía de colorante azul Cibacron, el producto se trata con Triton X-100 para inactivar los potenciales virus envueltos. En este ejemplo, se añade al grupo de Capto Blue (High Sub) Triton X-100 al 10 % hasta una concentración final de Triton X-100 del 0.5 % (p/p) y se mantiene durante 130 minutos a temperatura ambiente. En estas condiciones, se logra una eficiente inactivación del virus (para más detalles véase el ejemplo 5).
Después del tratamiento con Triton X-100, se purifica la proteína de fusión a albúmina con cromatografía de intercambio aniónico usando una columna Capto Q en modo de unión y elución. La figura 5 muestra un cromatograma de Capto Q representativo para AFP-1 empleado a 300 cm/h. Como puede observarse en la figura 5, se observa un gran pico de flujo pasante durante la carga, indicado por una gran señal de DO que comienza aproximadamente a los 7 VC. Este pico de flujo pasante contiene Triton X-100 de la etapa anterior. Después de la carga, se reequilibra la columna y después se eluye con un gradiente lineal de NaCl hasta NaCl 0.4 M a lo largo de 10 VC (a pH 7.0). Como puede observarse en la tabla 7, el intermedio de Capto Q tiene menos HCP (reducción de 1.3-1.5 log) y mucho menos ADN (reducción de 6-6.7 log) que el grupo de Capto Blue (High Sub). También puede observarse que Capto Q tiene la capacidad de aumentar el contenido de monómero (reduciendo el producto agregado) y también elimina la impureza que es responsable de la oxidación de AFP-1 (para más detalles, véase el ejemplo 7).
El producto de Capto Q se diafiltra frente a bis-tris 50 mM, NaCl 50 mM a pH 7.0 para prepararlo para la purificación usando una etapa de cromatografía en membrana Mustang Q. La figura 6 muestra un cromatograma representativo de membrana Mustang Q empleado a 10 VM/h. Después de acondicionar y equilibrar la membrana, se aplica el producto a la membrana y se recoge en el flujo pasante, mientras que las impurezas se unen a la membrana. Cuando se desprenden con NaCl 2 M, se observa un gran pico que contiene tanto impurezas como cierta cantidad de producto (el pico de desprendimiento no se incluye en el cromatograma en la figura 6). Como puede observarse en la tabla 7, el ADN se reduce adicionalmente mediante la membrana Mustang Q (reducción de 0.6-1 log).
La etapa de cromatografía final es una columna de interacción hidrófoba que usa Toyopearl PPG-600M. La figura 7 muestra un cromatograma de Toyopearl PPG-600M representativo para AFP-1 empleado a 130 cm/h. Después de equilibrar en un tampón que contiene citrato 1 M, se carga el producto en la columna. Ya que el producto es altamente puro en esta etapa del proceso de purificación, no se observa un pico de flujo pasante. Después de la carga, se vuelve a equilibrar la columna y después se eluye con un gradiente hasta un tampón que no contiene citrato. El producto se eluye en un pico abrupto, que se recoge en fracciones que se analizan respecto de su contenido de producto oxidado mediante HIC-HPLC. Todas las fracciones que contienen menos de un 15 % de especies oxidadas mediante HIC-HPLC se reúnen y se emplean para la nanofiltración.
La nanofiltración usando Viresolve Vpro+ se lleva a cabo usando técnicas convencionales para los expertos en la técnica de purificación de proteínas. El objetivo de la nanofiltración es eliminar las potenciales partículas víricas. Después de la nanofiltración, se concentra el producto, se diafiltra y se formula en fosfato 10 mM, sacarosa 250 mM, polisorbato 80 al 0.02 %. Tras completarse la nanofiltración (o la formulación) se evalúan las impurezas adicionales en el grupo de producto que se introducen en el producto durante el proceso de purificación. La tabla 8 resume los análisis de impurezas relacionadas con el producto. Como se observa en la tabla 8, los componentes del tampón y el ligando de colorante azul Cibacron que se introducen en el proceso en las etapas de proceso tempranas (etapas de cromatografía de colorante azul y de inactivación vírica) se reducen hasta niveles muy bajos mediante las etapas de purificación posteriores.
Tabla 8. R m n l im r z r l i n n l r
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Ejemplo 4
Cromatografía de afinidad de colorante azul Cibacron
Se comparó la capacidad de unión y la eliminación de impurezas de Capto Blue (High Sub) y Toyopearl AF-Blue HC-650M del caldo de cultivo celular clarificado. La tabla 9 resume las capacidades de unión dinámica de AFP-1 en caldo de cultivo celular clarificado. Para Capto Blue (High Sub), la capacidad de unión dinámica mostró una correlación indirecta con el pH, donde el pH 5 tuvo la mayor capacidad de unión (37.4 g de AFP-1 por l de resina) y el pH 8 tuvo la menor capacidad de unión (12.3 g/l). Aunque es deseable una alta capacidad de unión, el funcionamiento a pH 5 es menos deseable debido a las mayores tasas de agregación para la molécula a pH 6 y menor (datos no mostrados). Por tanto, se eligió como pH óptimo el pH 6 para equilibrar la alta capacidad de unión y la estabilidad del producto. La comparación de las capacidades de unión dinámica para Capto Blue (High Sub) y Toyopearl AF-Blue HC-650M reveló una capacidad de unión dinámica de prácticamente el doble para Capto Blue (High Sub) a pH 6.
Tabla 9. Comparación de las capacidades de unión dinámica en las resinas de colorante azul Cibacron.
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Para comparar la eliminación de impurezas del caldo de cultivo celular clarificado con estas dos resinas, se empleó cada columna en condiciones iniciales con la columna cargada al 75-80 % de su capacidad de unión dinámica (17.5 g/l para Capto Blue (High Sub) y 10.0 g/l para Toyopearl AF-Blue HC-650M) y se eluyeron de la columna usando octanoato de sodio 25 mM. La tabla 10 muestra una comparación de dos resinas de colorante azul Cibacron usadas para la captura y purificación de AFP-1 del caldo de cultivo celular clarificado. Como puede observarse en la tabla 10, los rendimientos para ambas resinas son similares (para la elución con octanoato 25 mM), con rendimientos típicos >90 %. Además, ambas resinas reducen eficazmente los niveles de HCP y ADN a partir del caldo de cultivo clarificado; sin embargo, la cromatografía Toyopearl AF-Blue HC-650M mostró una eliminación de HCP y ADN ligeramente mejor en comparación con Capto Blue (High Sub).
Tabla 10. imiz i n l rifi i n f i n l min n r m r fí l r n z l i ron.
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Para AFP-1, se seleccionó la resina Capto Blue (High Sub) para los procesos de fabricación debido a su mayor capacidad de unión. Para optimizar la etapa de captura con Capto Blue (High Sub), se tomaron en consideración varios factores, incluyendo la carga de la columna y la composición del tampón de lavado y elución. Como puede observarse en la tabla 10, la carga de la columna no tuvo efecto en el ADN; pero mostró un ligero efecto en la eliminación de HCP. En los extremos de carga de columna ensayados (10 g/l o 25 g/l de carga), la eliminación de HCP es más eficaz que a una carga intermedia (17.5 g/l de carga). Por lo tanto, resulta beneficioso emplear la columna en o próxima a su capacidad de unión dinámica tanto para aumentar el rendimiento como para aumentar la eliminación de HCP.
Se optimizó la composición del tampón de elución para la etapa de captura por cromatografía de colorante azul Cibacron. La figura 8 muestra una comparación de los tampones de elución para la cromatografía de colorante azul Cibacron. Como puede observarse en la figura 8 y en la tabla 10, el octanoato es una elección mucho más eficaz para la elución a partir de la columna de colorante azul Cibacron, en comparación con NaCI 2 M. Para este ejemplo, el NaCI 2 M proporcionó una elución incompleta de AFP-1 de la columna basándose en un rendimiento del 60 % y observándose un amplio perfil de elución en el cromatograma. La calidad del producto del ciclo de NaCl 2 M mostró que los niveles de HCP eran mucho mayores y los niveles de monómero eran mucho menores, en comparación con la elución usando octanoato 25 mM. Además, el uso de NaCl 2 M (solo o en combinación con disolventes) podría ser menos deseable desde el punto de vista de la fabricación, ya que estos tampones de elución podrían ser costosos y el proceso puede requerir una etapa de intercambio del tampón para facilitar la unión a la siguiente columna de cromatografía en el proceso.
La etapa final en el desarrollo de una etapa de captura de colorante azul Cibacron fue la optimización del lavado. Es de sobra conocido que la albúmina puede unirse a muchos tipos de moléculas y esto también se cumple para las proteínas de fusión a albúmina. Por lo tanto, se espera que las impurezas (tales como HCP y ADN) puedan interactuar con la proteína de fusión a albúmina y purificarse junto con el producto deseado. Aprovechando la fuerte unión de la proteína de fusión a albúmina a la resina de cromatografía de colorante azul Cibacron, se evaluaron varios lavados en un intento de mejorar la eliminación de impurezas rompiendo las interacciones entre las impurezas y el ligando de colorante azul Cibacron o entre las impurezas y la proteína de fusión a albúmina que está unida al ligando. Se emplearon diversos tipos de lavados, incluyendo iónicos, caotrópicos, cosmotrópicos, tensioactivos y disolventes suaves. Además, se evaluó cada lavado a pH 6 y pH 7 para determinar el efecto, en caso de haberlo, del pH.
La tabla 11 resume los lavados evaluados en la cromatografía de colorante azul Cibacron. Como puede observarse en la tabla 11, el pH del lavado es muy importante para la eliminación de las HCP. A pH 7, todos los lavados evaluados fueron más eficaces para reducir las h Cp , reduciendo la mayoría de los lavados las HCP a la mitad o más en comparación con lavados idénticos a pH 6. De los lavados evaluados, NaCl 0.5 M a pH 7 fue el más eficaz para reducir las HCP, mostrando una reducción de más de siete veces en las HCP en comparación con el ciclo de control. A diferencia de la eliminación de HCP, la eliminación de ADN no se vio afectada por el pH a un pH de entre 6 y 7. De todos los lavados evaluados, solo los lavados iónicos (NaCl y Na2SO4) mostraron una eliminación mejorada del ADN, en comparación con el ciclo de control. En estos casos, se observó una reducción de 4-5 veces en el ADN en comparación con el ciclo de control. También cabe destacar que se observaron mayores niveles de monómero con los ciclos que contenían propilenglicol al 10 %; sin embargo, se observaron aumentos marginales en el nivel de monómero con varios de los lavados evaluados. No se observó impacto en la pureza del monómero con el pH.
Basándose en los datos en la tabla 11, NaCl 0.5 M es un lavado muy eficaz en cuanto a la eliminación de las HCP y el ADN y propilenglicol al 10 % es un lavado eficaz para aumentar la pureza del monómero. Cabe destacar en este caso que el lavado con propilenglicol al 10 % también fue eficaz para reducir el potencial de oxidación del producto en el grupo de Capto Blue (véase el ejemplo 7 para detalles adicionales). El rendimiento se vio especialmente afectado negativamente por los lavados con NaCl 0.5 M, con una pérdida de rendimiento del 5 % y el 14 % a pH 6 y 7, respectivamente. De manera interesante, no se observó pérdida de rendimiento con los otros lavados evaluados. Basándose en estos resultados, se incorporaron un lavado que contenía NaCl 0.5 M a pH 6 y un lavado que contenía propilenglicol al 10 % a pH 7 al proceso de producción en el ejemplo 3.
Tabla 9. Resumen de la optimización del lavado de la cromato rafía de colorante azul Cibacron.
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Ejemplo 5
Inactivación vírica con Tritón X-100
Para AFP-1, una molécula de fusión a albúmina con un punto isoeléctrico en el intervalo de 5.4-5.5, se determinó que era perjudicial un tratamiento a bajo pH (se observó agregación y precipitación) para la calidad de producto de la molécula. Por tanto, para la inactivación vírica se seleccionó tratamiento con Triton X-100. De manera similar al tratamiento a bajo pH, la adición de Triton X-100 alterará la envuelta alrededor del virus, inactivándolo. A diferencia del tratamiento a bajo pH, el Triton X-100 no tiene un impacto medible en la calidad de producto de AFP-1.
La inactivación vírica con Triton X-100 se evaluó usando como modelo de virus envuelto el virus de la leucemia murina xenotrópica (XMuLV). Brevemente, se añadió al material purificado mediante cromatografía de colorante azul Cibacron Triton X-100 al 10 % (p/p) hasta una concentración final de Triton X-100 del 0.5 % (p/p), se incubó durante un tiempo determinado y después, se evaluó su infectividad usando métodos basados en placa comunes para los expertos en la materia. Se calcularon los valores de reducción log (VRL) basándose en los títulos de XMuLV de ensayos de infectividad llevados a cabo en muestras antes y después del tratamiento con Triton X-100.
La tabla 12 resume los VRL obtenidos de la inactivación vírica de XMuLV. Como puede observarse en la tabla, el tratamiento con Triton X-100 al 0.5 % (p/p) es un método eficaz de inactivación de XMuLV. Para las muestras medidas inmediatamente después del tratamiento con Triton X-100, se obtuvieron valores de VRL de 4.73 y >5.15 de experimentos duplicados. Al final de una incubación de 120 minutos, ambos estudios mostraron inactivación de >5.15 lg de XMuLV. Estos VRL se encuentran en el mismo intervalo que los valores obtenidos con el tratamiento a bajo pH para anticuerpos monoclonales.
Tabla 10. R m n l VRL XM LV r l r mi n n Tri n X-1 n r ín f i n lbúmina
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Después del tratamiento con Triton X-100, se purifica el producto con una cromatografía de intercambio aniónico (véase la figura 3 para el proceso de purificación). Durante la cromatografía de intercambio aniónico, la proteína de fusión a albúmina está fuertemente unida a la fase estacionaria, mientras que algunas impurezas fluyen a través de la columna. El Triton X-100 no se retiene por la columna de intercambio aniónico y puede observarse en el flujo pasante de la columna de intercambio aniónico debido a su absorbancia a 280 nm. La figura 5 muestra un cromatograma de intercambio aniónico representativo con una fuerte señal de absorbancia a 280 nm durante la carga de la columna. Puede lograrse una eliminación adicional del Triton X-100 durante la cromatografía de interacción hidrófoba; sin embargo, se espera que el Triton X-100 se una a la columna hidrófoba junto con el producto. Por tanto, la eliminación del Triton X-100 del producto es menos robusta y dependiente de la selectividad entre el Triton X-100 y la proteína de fusión a albúmina. Después de la purificación mediante el proceso mostrado en la figura 3 , se midieron niveles de Triton X-100 menores de 0.1 |jg/ml (véase la tabla 5).
Ejemplo 6
Cromatografía de membrana de intercambio aniónico
Las membranas de intercambio aniónico empleadas en modo de flujo pasante pueden ofrecer una excelente eliminación de las impurezas de células hospedadoras, tales como proteínas de las células hospedadoras (HCP), ADN y virus. Para un anticuerpo monoclonal (mAb), donde el pl normalmente se encuentra en el intervalo de 7.5 a 9.5, la unión del producto tiene una importancia mínima cuando se emplea una membrana de AEX de flujo pasante a un pH aproximadamente neutro y el rendimiento es normalmente >95 % (independientemente de la concentración de sal y la conductividad). A medida que el pH operativo se aproxima al pl del mAb, puede producirse unión y se puede perder el rendimiento. Para los mAb, la eliminación de impurezas de las células hospedadoras se logra en condiciones alto pH y baja salinidad (o conductividad). Por tanto, para un mAb típico, se optimizan las condiciones operativas, de tal forma que se minimiza la conductividad y el pH es lo más alto posible, manteniéndose por debajo del pl.
Para las proteínas de fusión a albúmina con un bajo pI, el desarrollo y optimización de una etapa de cromatografía de membrana AEX de flujo pasante es más complejo y no puede predecirse a priori. A diferencia de un mAb típico, es probable que haya cierta unión de la molécula diana a la membrana AEX a todos los valores de pH próximos al neutro y se espera menos unión a un pH más bajo (debido a la menor carga de proteína) y altas concentraciones salinas (que pueden bloquear las interacciones entre la proteína de fusión a albúmina y el ligando de cromatografía). Por tanto, se pueden esperar rendimientos más elevados a un pH menor y mayores concentraciones salinas. Por otra parte, se espera que las tendencias de eliminación de impurezas con respecto a la salinidad y el pH imiten a las tendencias observadas con los mAb, donde un mayor pH y una menor concentración salina dan como resultado una mayor eliminación de impurezas. Por tanto, se debe obtener un equilibrio entre un alto rendimiento (bajo pH y alta salinidad) y alta pureza (alto pH y baja salinidad) y deben optimizarse el pH, la concentración salina y la carga de membrana para un producto dado.
Para optimizar la etapa de cromatografía de membrana AEX para AFP-1, se investigaron el pH (pH de 6.0 a 8.0), la concentración de NaCl (10-220 mM) y la exposición a carga de la membrana (0.5-2.5 g/ml de membrana) en un diseño de experimentos (DoE) de múltiples variables. Para este estudio, se usó un diseño de exploración donde se evaluaron las esquinas del espacio de diseño, junto con dos condiciones en el punto central y dos puntos adicionales junto con los bordes para determinar el efecto en el rendimiento de la etapa y la eliminación de impurezas. La tabla 13 resume los experimentos de optimización de membrana de AEX para AFP-1. Como puede observarse en la tabla 13, el rendimiento se vio afectado por los tres factores y en general, siguió las tendencias esperadas con mayores rendimientos obtenidos a bajo pH, baja salinidad y mayor carga. Por otra parte, la eliminación de ADN no siguió la tendencia esperada de una mejor eliminación a mayor pH y menor salinidad. En cambio, se observó que la eliminación de ADN era peor a pH 8 y NaCl 10 mM. De manera interesante, el efecto no estaba causado por un solo factor. Por ejemplo, se observó una eliminación aumentada de impurezas en condiciones de unión débiles (pH 6, NaCl 220 mM) e intermedias (pH 6, NaCl 10 mM o pH 8, NaCl 110 mM) en comparación con las condiciones de unión fuertes (pH 8.0, NaCl 10 mM). La eliminación de impurezas se vio afectada negativamente únicamente en las condiciones de unión más fuertes. Una explicación para este resultado puede ser la unión competitiva entre la proteína de fusión a albúmina y las impurezas. En condiciones de unión fuertes, la proteína de fusión a albúmina puede vencer en la competición por los sitios de unión, lo que podría dar como resultado menores capacidades de unión para el ADN y un menor rendimiento para el producto. Obsérvese también que no se observó eliminación de las HCP y los niveles de agregado se mantuvieron relativamente sin cambios para todas las condiciones evaluadas.
Antes de completar el estudio de optimización anterior para la etapa de Mustang Q, cabía esperar tener que hallar un equilibrio entre el rendimiento y la eliminación de impurezas. Sin embargo, se observó justo lo contrario en el estudio. La figura 9 muestra los valores de rendimiento de la etapa y de reducción log del ADN (VRL), en función del pH y de la concentración de NaCl. Como puede observarse en la figura, se demostró que tanto el rendimiento como la eliminación del ADN son óptimos a bajo pH y mayores concentraciones de NaCl (mostrados por los contornos de color rojo). Este fue un hallazgo inesperado para el ADN y puede observarse un efecto similar con la eliminación vírica.
Tabla 11. Resumen de los datos del roceso analíticos ara la cromato rafía de membrana Mustan Q.
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Ejemplo 7
Control de una variante de oxidación usando cromatografía de interacción hidrófoba
La proteína usada en este estudio es una proteína de fusión a albúmina que contiene dos armazones de Tn3 unidos a la seroalbúmina humana recombinante. Cada armazón de Tn3 contiene un sitio activo capaz de unirse al ligando de CD40L.
La proteína de fusión a albúmina contiene ocho restos de metionina (seis en la porción de albúmina de la molécula y uno en cada armazón de Tn3) y siete restos de triptófano (cinco en la porción de albúmina de la molécula y uno en cada armazón de Tn3). Los restos de metionina y triptófano que se encuentran próximos al área superficial pueden oxidarse durante el proceso de cultivo celular y/o de purificación. La figura 10 muestra la potencia relativa en función de la oxidación determinada mediante espectrometría de masas de mapeo de péptidos. Como puede observarse, la oxidación de la metionina en la porción de albúmina (M498 y M529) o de Tn3 (M74 y M17) de la molécula no contribuye a la pérdida de potencia. Por otra parte, la oxidación del triptófano (W46 y W151), que se produce en el armazón de Tn3 próximo a los sitios activos (en los bucles BC) de la molécula, da como resultado una pérdida de potencia para la molécula. Por lo tanto, la oxidación del triptófano debe estar bien controlada durante el proceso de producción.
Para monitorizar la oxidación del triptófano durante el desarrollo y la producción de AFP-1, se utilizaron espectrometría de masas de mapeo de péptido, SEC-HPLC e HIC-HPLC en las diversas etapas de desarrollo. Aunque puede usarse espectrometría de masas para determinar los niveles de metionina y triptófano de manera bastante precisa, esta es de bajo rendimiento e implica más tiempo y recursos y por tanto, normalmente se usa para la caracterización de muestras importantes. Por otra parte, pueden usarse los métodos de HPLC más rápidos para las pruebas en proceso; sin embargo, ambos ensayos HPLC tienen desventajas. Por ejemplo, la SEC-HPLC puede medir la oxidación del triptófano, pero es solo una estimación, ya que el hombro de triptófano no se resuelve completamente a partir de la molécula nativa, mientras que la HIC-HPLC puede medir con precisión los niveles de oxidación, pero no puede diferenciar entre oxidación de metionina y triptófano. Se emplearon los tres métodos durante el desarrollo y la producción para entender mejor la oxidación de AFP-1. Para mejorar la especificidad de la cuantificación de la oxidación de AFP, se desarrolló un método de RP-HPLC para centrarse en la detección de péptidos que contienen oxidación en el triptófano de Tn3 (W46 y W151). El método puede usarse para futuras pruebas en proceso y control de calidad de AFP-1.
Una estrategia de control de la oxidación exitosa incorpora tanto la inhibición de la oxidación como la eliminación de especies oxidadas que se forman durante el proceso de producción. La figura 11 muestra la oxidación del triptófano en función del tiempo para el grupo de Capto Blue y Capto Q. Para estos ciclos, los grupos se encontraban nominalmente a un pH de pH 7 a pH 8, que es típico para el pH operativo para el proceso de purificación. Como puede observarse en la figura 11, la oxidación del triptófano (medida mediante s EC-HPLC) en los grupos de Capto Blue varió dependiendo del biorreactor y se redujo cuando se empleó lavado con propilenglicol al 10 % y también cuando el grupo se almacenó a menores temperaturas. Además, la adición de EDTA 10 mM al grupo de Capto Blue también frenó la oxidación del triptófano (datos no mostrados). Como puede observarse en la figura 9 , la oxidación del triptófano en el grupo de Capto Q parece ser despreciable y el grupo de Capto Q es bastante estable, incluso a temperatura ambiente.
Para estudiar adicionalmente la causa principal de la oxidación del triptófano de AFP-1, se llevaron a cabo experimentos para revelar que la presencia del colorante azul Cibacron y/o las altas concentraciones salinas no provocan oxidación. Se observó que la oxidación de triptófano de AFP-1 requiere una combinación única de componentes hallados en las muestras de proceso tempranas (medio condicionado o grupo de Capto Blue) y exposición a la luz. Una potencial fuente de oxidación del triptófano es una enzima, tal como la triptófano 2,3-dioxigenasa (TDO2) o la triptófano hidroxilasa (TPH), pudiendo ambas oxidar específicamente el triptófano. Obsérvese que la TDO2 se ha identificado positivamente en la CM usando transferencia de Western anti-TDO2 (véase la figura 12) y puede provocar la oxidación del triptófano de AFP-1.
Una vez que se produce oxidación durante las etapas tempranas del proceso, puede ser necesario controlar el nivel de variante oxidada después en el proceso posterior. Para AFP-1, se empleó una etapa de cromatografía de interacción hidrófoba para eliminar las cantidades en exceso de oxidación, incluyendo la oxidación del triptófano. La figura 13 muestra cromatogramas de HIC representativos para AFP-1. Como puede observarse en la figura, se investigaron múltiples resinas de HIC y una resina multimodal (intercambio catiónico/HIC) para la purificación de AFP-1. Para todas las reinas evaluadas, AFP-1 se eluyó cerca del centro del gradiente y fue adecuada para la eliminación de la oxidación del triptófano. Cuando se emplea HIC en una elución de gradiente para AFP-1, el producto oxidado (incluyendo la oxidación de metionina y triptófano) se eluyó más pronto que el producto nativo y se concentra en el frente del pico. En condiciones a escala preparativa, las especies oxidadas se concentran en el frente del pico; sin embargo, no hay suficiente resolución para observar un pico de producto oxidado distinto.
Durante el desarrollo, se aumentaron de escala tanto Butil-S Fast Flow (Butil-S) como Toyopearl PPG-600M (PPG-600M) y se emplearon en modo de gradiente lineal para observar si se podía usar cada columna para eliminar el producto oxidado. En cada caso, se fraccionó el producto de elución con una fracción de 0.5 volúmenes de columna hasta el máximo del pico y después, se recogió el resto de pico de producto en una sola fracción final. En ambos ciclos, se evaluó el contenido oxidado (mediante HIC-HPLC) y la potencia de las fracciones. La figura 14 muestra la potencia relativa frente al contenido de especies tempranas de HIC-HPLC para las fracciones tomadas durante los ciclos de cromatografía de Butil-S o PPG-600M. En ambos casos, las fracciones de elución temprana (comenzando desde el lado derecho de la figura) contenían más producto oxidado (medido mediante HIC-HPLC) y tenían una menor potencia que las fracciones de elución posterior (lado izquierdo de la figura). En estas condiciones, puede usarse HIC preparativa para controlar el nivel de oxidación y como resultado, controlar la potencia del producto.
Conclusiones
La descripción anterior explica diversas estrategias para purificar albúmina humana recombinante (rHSA) y proteínas de fusión a albúmina usando técnicas escalables que pueden ser adecuadas para la producción clínica o comercial. Las etapas iniciales en el proceso se optimizaron para reducir las impurezas relacionadas con el hospedador, tales como HCP, ADN y virus. La etapa de captura de cromatografía de colorante azul Cibacron incluyó lavados agresivos para reducir las HCP y usaron elución selectiva con octanoato. Se observó que la inactivación vírica con Triton X-100 es un método robusto para la inactivación de virus envueltos sin impacto en la calidad del producto. Las etapas de columna AEX y de cromatografía de membrana se optimizaron para reducir el ADN hasta niveles muy bajos. De manera interesante, se demostró que la etapa de cromatografía de membrana es óptima a bajo pH y elevada salinidad, lo que no se esperaba antes de este estudio. Finalmente, el proceso de purificación se diseñó para controlar el nivel de una variante oxidada, que se demostró que es menos potente. La estrategia de control incluyó un lavado con propilenglicol durante la etapa de cromatografía de azul Cibacron, así como la adición de EDTA al tampón de elución para ayudar a limitar la oxidación del triptófano. Además, se usó cromatografía de interacción hidrófoba como una opción eficaz para la eliminación del producto oxidado. Se aumentó la escala del proceso de purificación hasta purificar biorreactores de 500 l y se demostró que es constante en cuanto al rendimiento y la calidad del producto de un lote a otro.

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Un método para purificar una proteína de fusión a albúmina, comprendiendo el método someter a una composición que comprende una proteína de fusión a albúmina a una matriz de interacción hidrófoba y a uno o más de los siguientes procesos de purificación:
(a) una matriz de afinidad, en donde se aplica un tampón de elución que comprende octanoato a la matriz de afinidad; y/o (b) una matriz de intercambio aniónico; en donde se lava una matriz de afinidad con un tampón de lavado que comprende: (1) de aproximadamente un 2 % a aproximadamente un 20 % de poliol, en donde el poliol se selecciona entre el grupo que consiste en 1,2-propanodiol, 1,3-propanodiol, 1,2-butanodiol, 1,3-butanodiol, 1,4-butanodiol, 1,6-hexanodiol y 2-metil-2,4-pentanodiol; (2) sal de 0.05 M a 2.0 M, en donde la sal se selecciona entre cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, cloruro de litio, bromuro de sodio, bromuro de potasio y bromuro de litio; (3) sulfato de sodio de aproximadamente 0.02 M a aproximadamente 0.2 M; (4) de aproximadamente un 0.01 % a aproximadamente un 1 % de tensioactivo no iónico; (5) urea de aproximadamente 0.05 M a aproximadamente 1.0 M; o (6) nicotinamida de aproximadamente 0.02 M a aproximadamente 0.5 M,
en donde la proteína de fusión a albúmina purificada tiene menos de un 5 % de restos de triptófano oxidados en relación con el número de restos de aminoácido en la proteína.
2. El método de la reivindicación 1, en donde la albúmina en la proteína de fusión a albúmina es una seroalbúmina humana (HSA).
3. El método de la reivindicación 2, en donde la HSA es una HSA variante, que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 133.
4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la proteína de fusión a albúmina comprende un resto de armazón que comprende un tercer dominio de fibronectina de tipo III (FnIII).
5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la proteína de fusión a albúmina comprende un armazón.
6. El método de la reivindicación 5, en donde el armazón se une específicamente a CD40L.
7. El método de la reivindicación 6, en donde el armazón comprende una subunidad de monómero específica para CD40L que comprende la secuencia de aminoácidos:
IEV(XAB)nALITW(XBc)nCELXlYGI(XcD)nTTIDL(XDE)nYSI(XEF)nYEVSLIC(XFG)nKETFT
T
en donde:
(a) Xa b , Xb c , Xc d , Xd e , Xe f y X f g representan los restos de aminoácidos presentes en las secuencias de los bucles AB, BC, CD, DE, EF y FG, respectivamente;
(b) X 1 representa el resto de aminoácido A o T; y,
(c) la longitud del bucle n es un número entero entre 2 y 26.
8. El método de la reivindicación 7, en donde la secuencia del bucle AB comprende la SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 136, la secuencia del bucle CD comprende la SEQ ID NO: 6 y la secuencia del bucle EF comprende la SEQ ID NO: 8 o la SEQ ID NO: 137.
9. El método de la reivindicación 8, en donde:
(a) la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 83, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 94 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 9 o 139;
(b) la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 83, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 94 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 99;
(c) la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 84, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 95 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 9 o 139;
(d) la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 85, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 94 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 9 o 139;
(e) la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 86, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 96 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 9 o 139;
(f) la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 87, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 97 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 9 o 139;
(g) la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 88, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 95 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 9 o 139;
(h) la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 89, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 94 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 9 o 139;
(i) la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 90, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 94 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 9 o 139;
(j) la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 91, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 95 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 9 o 139;
(k) la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 92, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 98 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 9 o 139; o,
(l) la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 93, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 94 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 9 o 139.
10. El método de la reivindicación 8, en donde:
(a) la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 100, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 118 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 129;
(b) la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 101, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 119 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 129;
(c) la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 102, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 120 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 129;
(d) la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 103, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 121 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 129;
(e) la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 104, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 122 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 129;
(f) la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 105, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 121 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 129;
(g) la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 106, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 123 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 129;
(h) la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 107, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 123 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 129;
(i) la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 108, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 118 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 129;
(j) la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 109, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 123 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 129;
(k) la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 110, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 121 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 129;
(l) la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 111, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 123 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 130;
(m) la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 108, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 121 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 129;
(n) la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 112, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 124 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 129;
(o) la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 113, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 125 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 129;
(p) la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 114, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 118 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 129;
(q) la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 115, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 126 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 129;
(r) la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 116, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 127 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 129; o,
(s) la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 117, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 128 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 129.
11. El método de la reivindicación 10, en donde la subunidad de monómero específica para CD40L comprende una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42 y 146.
12. Una composición que comprende una proteína de fusión a albúmina de la SEQ ID NO: 134, 135, 201,202, 203, 204, 205, 206, 207 o 208, en donde la composición tiene menos de 20 ng/mg de proteína de la célula hospedadora y en donde el triptófano en la posición 46, 151 o en ambas no está oxidado.
13. Una formulación farmacéuticamente aceptable que comprende:
(a) una composición de la reivindicación 12;
(b) un tampón;
(c) un azúcar; y
(d) un emulsionante.
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