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ES2897732T3 - Composición para tratar la diabetes mellitus que comprende insulina y un agonista doble de glp-1/glucagón - Google Patents

Composición para tratar la diabetes mellitus que comprende insulina y un agonista doble de glp-1/glucagón Download PDF

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ES2897732T3
ES2897732T3 ES15799077T ES15799077T ES2897732T3 ES 2897732 T3 ES2897732 T3 ES 2897732T3 ES 15799077 T ES15799077 T ES 15799077T ES 15799077 T ES15799077 T ES 15799077T ES 2897732 T3 ES2897732 T3 ES 2897732T3
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insulin
glp
conjugate
glucagon
long
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English (en)
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Sung Youb Jung
Sang Youn Hwang
Seung Su Kim
In Young Choi
Se Chang Kwon
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Hanmi Pharmaceutical Co Ltd
Hanmi Pharmaceutical Industries Co Ltd
Original Assignee
Hanmi Pharmaceutical Co Ltd
Hanmi Pharmaceutical Industries Co Ltd
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Abstract

Una composición farmacéutica para usar en un método de tratamiento o prevención de la diabetes mellitus mediante la reducción de los niveles de glucosa en sangre y la reducción del peso corporal, la composición que comprende un conjugado de insulina de acción prolongada y un conjugado de agonista doble de GLP- 1/glucagón de acción prolongada, en donde el conjugado de insulina de acción prolongada es un conjugado en el que la insulina se une a una región Fc de inmunoglobulina a través de un polímero no peptidílico; en donde el conjugado de agonista doble de GLP-1/glucagón de acción prolongada es un conjugado en el que el agonista doble de GLP- 1/glucagón se une a una región Fc de inmunoglobulina a través de un polímero no peptidílico, en donde la insulina es el análogo de insulina de acuerdo con la SEQ ID NO. 34; y en donde el agonista doble de GLP-1/glucagón comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en secuencias de aminoácidos representadas por las SEQ ID NOs: 40, 63 y 64, y activa simultáneamente el receptor de GLP-1 y los receptores de glucagón.

Description

DESCRIPCIÓN
Composición para tratar la diabetes mellitus que comprende insulina y un agonista doble de glp-1/glucagón [Campo Técnico]
La presente divulgación se refiere a una composición para tratar la diabetes mellitus que incluye insulina y un agonista doble de GLP-1/glucagón y un método para prevenir o tratar la diabetes mellitus, que incluye administrar la composición.
[Antecedentes]
La insulina es un péptido secretado por las células beta pancreáticas, que juega un papel importante en la regulación del azúcar en sangre en el cuerpo. La diabetes mellitus es un tipo de enfermedad metabólica en la que la secreción de insulina es insuficiente o no se realizan las funciones normales, lo que conduce a un aumento de los niveles de glucosa en sangre. La diabetes tipo 2 es el caso en el que la insulina no se secreta adecuadamente o la insulina secretada no se procesa adecuadamente en el cuerpo y los niveles de glucosa en sangre no se controlan y, por lo tanto, se elevan. La diabetes de tipo 2 se trata convencionalmente mediante el uso de un agente hipoglucemiante que contiene un material químico como ingrediente activo o, para algunos pacientes, se trata mediante la administración de insulina. Por otro lado, en la diabetes tipo 1, se requiere esencialmente la administración de insulina.
La terapia con insulina, que actualmente se usa ampliamente, es un método de administración de insulina a través de inyección antes y después de las comidas. La insulina ahora está disponible como inyección y se administra principalmente mediante inyección subcutánea y el método de administración es diferente de acuerdo con el tiempo de acción. La administración de insulina parece tener un efecto hipoglucemiante más rápido que los fármacos que se toman y puede usarse de manera segura incluso en entornos en los que los fármacos no están disponibles. Además, no hay limitación en la cantidad de dosis, pero la administración de insulina debe ocurrir tres veces al día. Por lo tanto, existen desventajas tales como el miedo del paciente a las agujas, la dificultad de administración, los síntomas de hipoglucemia y el aumento de peso debido a la administración prolongada de insulina. El aumento de peso aumenta el riesgo de enfermedad cardiovascular, lo que puede provocar el efecto secundario de una función de control de azúcar en sangre disminuida.
Actualmente se ha estudiado un agonista doble que puede unirse tanto a GLP-1 como a dos receptores peptídicos de glucagón como un mecanismo para tratar simultáneamente tanto la diabetes como la obesidad. El agonista doble del GLP-1 y el glucagón inhiben la ingesta alimentaria de GLP-1, promueven la saciedad, muestran la función lipolítica del glucagón, mantienen la reducción del azúcar en sangre y muestran un alto efecto en la reducción del peso corporal, por lo que tienen una alta posibilidad de uso como nuevos agentes terápicos.
Los presentes autores han encontrado que la insulina y el agonista doble son inconvenientes en que la administración debe realizarse diariamente al paciente debido a una semivida corta, y han sugerido, como una técnica para mantener la actividad del fármaco proteico y lograr una mejor estabilidad al mismo tiempo, con el fin de resolver los problemas mencionados anteriormente, un conjugado proteico de acción prolongada en el que un polipéptido fisiológicamente activo convencional y una región Fc de inmunoglobulina se combinan covalentemente entre sí mediante un enlazador polimérico no peptidilo (Patente coreana No. 10-0725315). En particular, los autores han confirmado que la sostenibilidad de los efectos in vivo tanto del conjugado de insulina de acción prolongada como del conjugado de agonista doble de acción prolongada aumentan drásticamente (Patente coreana No. 10­ 1058290, Solicitud de patente coreana No. 10-2014-0022909 y Publicación de solicitud de patente coreana No. 10­ 2012-0139579).
Sin embargo, existen problemas en que se producen efectos secundarios tales como aumento de peso tras la administración del agonista doble de GLP-1/glucagón. Por lo tanto, aún existe una necesidad de desarrollar un agente terápico para la diabetes que tenga efectos secundarios, frecuencia y dosificación reducidos.
El documento WO 2012/169798 A2 se refiere a "nuevos derivados de oxintomodulina y composición farmacéutica para tratar la obesidad que los comprenden".
El documento WO 2012/165915 A2 se refiere a una "composición para tratar la diabetes que comprende un conjugado de insulina de acción prolongada y un conjugado de péptido insulinotrópico de acción prolongada".
El documento WO 2014/017847 A1 se refiere a "una formulación líquida de conjugado de insulina de acción prolongada".
El documento EP 2017288 A1 se refiere a "nuevos análogos de insulina PEGilados que exhiben resistencia a las proteasas".
El documento WO 2014/017849 A1 se refiere a "una formulación líquida de una combinación de insulina de acción prolongada y péptido insulinotrópico".
El documento WO 2012/173422 A1 se refiere a "un conjugado que comprende oxintomodulina y un fragmento de inmunoglobulina".
El documento WO 2014/017843 A1 se refiere a "una composición para tratar hiperlipidemia, enfermedad del hígado graso o arteriosclerosis que comprende un derivado de oxintomodulina".
El documento WO 2014/073845 A1 se refiere a "una composición para tratar la diabetes o diabesidad que comprende un análogo de oxintomodulina".
El documento WO 2014/073842 A1 se refiere a "una formulación líquida sin albúmina que comprende un conjugado de oxintomodulina de larga duración".
Fosgerau y otros, Diabetes, 60 (Supl. 1) A418 Abst. 1527-P (2011) se refieren a un informe de "combinación de insulina de acción prolongada con el agonista doble de GluGLP-1 ZP2929" y "control glucémico mejorado sin aumento de peso en ratones db/db".
[Divulgación]
[Problema Técnico]
Los presentes autores han realizado muchos esfuerzos para desarrollar un agente terápico para la diabetes que pueda reducir los niveles elevados de glucosa en sangre, suprimir el aumento de peso y reducir el riesgo de hipoglucemia, que son necesarios para tratar la diabetes. Como resultado, los presentes autores han intentado una administración combinada que administra simultáneamente un receptor de insulina y un agonista doble de GLP-1/glucagón, y descubrieron específicamente que cuando una administración combinada de una insulina de acción prolongada y GLP-1/glucagón de acción prolongada puede maximizar el cumplimiento del paciente, reduce la dosificación del fármaco de insulina, reduce el riesgo de hipoglucemia y ayuda a reducir el nivel de glucosa en sangre y el peso corporal, lo que completa así la presente divulgación.
[Solución técnica]
La presente invención es como se define en las reivindicaciones. Este y otros aspectos de la divulgación pueden entenderse más completamente mediante referencia a la siguiente descripción.
Un objetivo de la presente divulgación es proporcionar una composición para tratar la diabetes mellitus que incluye insulina y un agonista doble de GLP-1/glucagón.
Otro objetivo de la presente divulgación es proporcionar un método para prevenir o tratar la diabetes, que incluye administrar la composición a un sujeto con alto riesgo de diabetes mellitus o que la tiene.
[Efectos ventajosos]
La insulina de acción prolongada o su conjugado de análogo y un conjugado de agonista de GLP-1/glucagón de acción prolongada exhiben un excelente efecto terápico sobre la diabetes y, en particular, la administración combinada es eficaz como agente terápico para la diabetes que puede estimular simultáneamente dos receptores peptídicos del receptor de insulina y GLP-1 y glucagón para mejorar la sostenibilidad y estabilidad in vivo, reducir drásticamente la dosificación de administración, reducir la hipoglucemia y el aumento de peso debido al control estable de los niveles de glucosa en sangre y tiene un cumplimiento del fármaco. En particular, la presente divulgación puede mejorar drásticamente la estabilidad en sangre, tiene un efecto farmacológico sostenible y reduce la frecuencia de administración, al maximizar así la comodidad del paciente.
[Descripción de los dibujos]
La figura 1 es un gráfico de AUC (área bajo la curva) que muestra el cambio de glucosa en ayunas medido mientras se administraba un conjugado de agonista doble de GLP/glucagón de acción prolongada-Fc de inmunoglobulina y un conjugado de análogo de insulina-Fc por vía subcutánea a los ratones db/db una vez cada dos días durante 4 semanas a través una administración única o administración combinada.
La figura 2 es un gráfico que muestra el cambio de peso corporal medido antes y después de que se administraron un conjugado de agonista doble de GLP/glucagón de acción prolongada-Fc de inmunoglobulina y un conjugado de análogo de insulina-Fc por vía subcutánea a los ratones db/db una vez cada dos días durante 4 semanas a través de una administración única o administración combinada.
[Mejor modo]
Con el fin de lograr los objetos descritos anteriormente, la presente divulgación proporciona una composición para tratar la diabetes mellitus que incluye insulina y un agonista doble de GLP-1/glucagón.
La insulina anterior es un conjugado de acción prolongada en el que la insulina y un material biocompatible o un portador se unen mediante un enlace covalente o un enlazador. El agonista doble de GLP-1/glucagón es un agonista doble de GLP-1/glucagón de acción prolongada y puede ser un conjugado de agonista doble de GLP-1/glucagón de acción prolongada en el que el agonista doble de GLP-1/glucagón y un material biocompatible o un portador se unen por un enlace covalente o un enlazador. La composición de la presente divulgación se caracteriza por una administración combinada de insulina y agonista doble de GLP-1/glucagón. La insulina y el agonista doble de GLP-1/glucagón de la presente divulgación se caracterizan por un tipo de acción prolongada.
En la composición de la presente divulgación, una relación molar de agonista doble de GLP-1/glucagón: insulina puede oscilar entre 1: 0,05 y 1:50, pero no se limita a ello siempre que muestre el efecto de la presente divulgación. Preferentemente, la insulina y el agonista doble de GLP-1/glucagón son del tipo de acción prolongada y pueden estar en forma de un conjugado en el que se une un material biocompatible o un portador.
En la presente divulgación, la insulina incluye todos los péptidos o péptidos modificados que tienen un efecto estimulante sobre los receptores de insulina. Por ejemplo, la insulina puede ser una insulina natural, una insulina de acción rápida, una insulina basal, un análogo de insulina que es un material preparado por cualquiera de sustitución, adición, eliminación y modificación, o puede ser una combinación de algunos aminoácidos de la insulina natural, o puede ser un fragmento de la misma. Además, en la presente divulgación, la insulina puede ser una insulina de acción prolongada que emplea técnicas de acción prolongada para superar la semivida corta. Preferentemente, puede ser una insulina de acción prolongada o un análogo de insulina de acción prolongada que puede administrarse una vez a la semana. Algunos ejemplos específicos de la insulina de acuerdo con la presente divulgación incluyen insulina o análogo de insulina y su tipo de acción prolongada como se describe en la Patente coreana No. 10-1058290 y las Solicitudes de patente coreana Nos. 10-2014-0022909 y 10-2014-0006938, pero no se limitan a ellos.
Como se usa en el presente documento, el término análogo de dinsulina^ se refiere a un péptido que tiene un cambio de uno o más aminoácidos de una secuencia natural.
El análogo de insulina puede ser un análogo de insulina en el que se cambia el aminoácido de la cadena A o de la cadena B de la insulina, que tiene un umbral de insulina reducido y una afinidad de unión al receptor de insulina reducida en comparación con un tipo salvaje. Las secuencias de aminoácidos de la insulina natural son las siguientes.
Cadena A:
Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn (SEQ ID NO: 37)
Cadena B:
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr (SEQ ID NO: 38)
Aunque la insulina usada en la divulgación es un análogo de insulina preparado mediante una recombinación genética, la presente divulgación no se limita a ello. Preferentemente, la insulina incluye insulina invertida, variantes de insulina, fragmentos de insulina, etc., y el método de preparación de la misma incluye recombinación génica así como un método en fase sólida, pero no se limita a ello.
El análogo de insulina es un péptido que tiene una funcionalidad de control de la glucosa en sangre in vivo que es la misma que la de la insulina. Tal péptido incluye agonistas, derivados, fragmentos, mutantes de insulina y similares. El agonista de insulina de la presente divulgación se refiere a un material que exhibe la misma actividad biológica que la insulina al unirse al receptor de insulina in vivo, independientemente de la estructura de la insulina.
El análogo de insulina de la presente divulgación muestra una homología de secuencia de aminoácidos con la cadena A y la cadena B de la insulina natural, respectivamente, y al menos un residuo aminoacídico puede ser una forma alterada seleccionada del grupo que consiste en sustitución (por ejemplo, alfa-metilación, alfa-hidroxilación), eliminación (por ejemplo, desaminación) o modificación (por ejemplo, N-metilación) y una combinación de las mismas, y puede referirse a un péptido que puede controlar el nivel de glucosa en sangre.
Como se usa en el presente documento, el análogo de insulina puede referirse a un péptido mimético y un compuesto polimérico o de bajo peso molecular que pueden unirse a un receptor de insulina para controlar los niveles de glucosa en sangre, aunque una insulina natural y una secuencia de aminoácidos no tengan homología. El fragmento de insulina de la presente divulgación se refiere a un fragmento que tiene uno o más aminoácidos añadidos o eliminados en la insulina. El aminoácido añadido puede ser un aminoácido que no está presente en un estado natural (por ejemplo, aminoácido de tipo D). Dicho fragmento de insulina tiene una función de controlar los niveles de glucosa en sangre.
La variante de insulina de la presente divulgación se refiere a un péptido que tiene una o más secuencias de aminoácidos diferentes de las de la insulina y que tiene la función de controlar los niveles de glucosa en sangre en el cuerpo.
Los métodos para preparar el agonista, derivado, fragmento y variante de insulina pueden usarse solos o en combinación. Por ejemplo, la presente divulgación incluye un péptido, que tiene uno o más aminoácidos diferentes de los del péptido natural, tiene desaminación del residuo aminoacídico terminal y tiene la función de controlar los niveles de glucosa en sangre en el cuerpo.
Específicamente, el análogo de insulina puede ser aquel en el que uno o más aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en aminoácidos en la posición 1, aminoácidos en la posición 2, aminoácidos en la posición 3, aminoácidos en la posición 5, aminoácidos en la posición 8, aminoácidos en la posición 10, aminoácidos en la posición 12, aminoácidos en la posición 16, aminoácidos en la posición 23, aminoácidos en la posición 24, aminoácidos en la posición 25, aminoácidos en la posición 26, aminoácidos en la posición 27, aminoácidos ácidos en la posición 28, aminoácidos en la posición 29, aminoácidos en la posición 30 de la cadena B; aminoácidos en la posición 5, aminoácidos en la posición 8, aminoácidos en la posición 10, aminoácidos en la posición 12, aminoácidos en la posición 14, aminoácidos en la posición 16, aminoácidos en la posición 17, aminoácidos en la posición 18, aminoácidos en la posición 19 y aminoácidos en la posición 21 de la cadena A se han sustituido por otros aminoácidos y preferentemente los sustituidos por alanina, ácido glutámico, asparagina, isoleucina, valina, glutamina, glicina, lisina, histidina, cisteína, fenilalanina, triptófano, prolina, serina, treonina o ácidos aspárticos. Adicionalmente, un análogo de insulina que tiene una eliminación de al menos un aminoácido, se incluye dentro del alcance de la presente divulgación, pero puede incluirse cualquier análogo de insulina sin limitación.
El análogo de insulina preferente es un análogo de insulina que se combina con material biocompatible o un portador para tener una semivida aumentada en comparación con la insulina de tipo salvaje, y este puede ser el análogo de insulina descrito en las Solicitudes de patente coreana Nos. 10-2014-0022909 y 10-2014-0006938, pero no se limita a ello.
En la presente divulgación, el agonista doble de GLP-1/glucagón incluye todos los péptidos o fragmentos, precursores, variantes o derivados de los mismos que tienen actividad doble de GLP-1/glucagón, como oxintomodulina, un agonista doble de GLP-1/glucagón natural. En la presente divulgación, el agonista doble de GLP-1/glucagón puede ser un agonista doble de GLP-1/glucagón que emplea la técnica de acción prolongada para superar la semivida corta, y preferentemente un agonista doble de GLP-1/glucagón de acción prolongada que puede administrarse una vez a la semana. Los ejemplos específicos del agonista doble de GLP-1/glucagón de acuerdo con la presente divulgación incluyen parcialmente, por ejemplo, el agonista doble de GLP-1/glucagón y un derivado del mismo y un tipo de acción prolongada del mismo como se describe en las Publicaciones de solicitud de patente coreana Nos. 10-2012-0137271 y 10-2012-0139579.
Como se usa en el presente documento, el término "oxintomodulina" significa un péptido derivado de un precursor de glucagón, pre-glucagón, e incluye una oxintomodulina natural, precursores, derivados, fragmentos de los mismos y variantes de los mismos. Preferentemente, puede tener la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 39 (HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTKRNRNNIA).
El término "variante de oxintomodulina" es un péptido que tiene una o más secuencias de aminoácidos diferentes de las de la oxintomodulina natural, y significa un péptido que retiene la función de activar los receptores de GLP-1 y glucagón, y puede prepararse mediante una cualquiera de sustitución, adición, eliminación y modificación o mediante una combinación de las mismas en una parte de las secuencias de aminoácidos de la oxintomodulina natural.
El término "derivado de oxintomodulina" incluye péptidos, derivados peptídicos o miméticos peptídicos que se preparan mediante adición, eliminación o sustitución de aminoácidos de la oxintomodulina para activar tanto el receptor de GLP-1 como el receptor de glucagón a un nivel alto, en comparación con la oxintomodulina natural. Preferentemente, el derivado de oxintomodulina tiene una secuencia de aminoácido de SEQ ID No. 40 y, más preferentemente, su 16to y 20mo aminoácidos forman un anillo.
El término "fragmento de oxintomodulina" significa un fragmento que tiene uno o más aminoácidos añadidos o eliminados en el extremo N o en el extremo C de la oxintomodulina natural, en el que pueden añadirse aminoácidos no naturales (por ejemplo, aminoácidos de tipo D) y tiene la función de activar tanto el receptor de GLP-1 como el receptor de glucagón.
Cada uno de los métodos de preparación para las variantes, derivados y fragmentos de oxintomodulina puede usarse individualmente o en combinación. Por ejemplo, la presente divulgación incluye un péptido que tiene uno o más aminoácidos diferentes de los del péptido natural y una desaminación del residuo aminoacídico N terminal y tiene la función de activar tanto el receptor de GLP-1 como el receptor de glucagón.
En algunos casos, el tipo de acción prolongada de la insulina y del agonista doble de GLP-1/glucagón puede estar en forma conjugada, en donde un material biocompatible o un portador se une a la insulina o agonista doble mediante un enlace covalente o un enlazador. En otro caso, dicho tipo de acción prolongada puede estar en una forma, en donde un material biocompatible o un portador no puede unirse directamente a la insulina o agonista doble mediante un enlace covalente. El tipo de acción prolongada de la insulina o del agonista doble de GLP-1/glucagón mencionados anteriormente puede mejorar la semivida o biodisponibilidad en comparación con una forma en la que la secuencia de la insulina o del agonista doble no es del tipo de acción prolongada, pero es de otra manera lo mismo. En algunos casos, la insulina de acción prolongada está en una forma en donde la región Fc de inmunoglobulina se une al análogo de insulina en el que los aminoácidos en la posición 14 de la cadena A de la insulina se sustituyen con ácidos glutámicos, a través del polímero no peptidílico como un enlazador. El agonista doble de GLP-1/glucagón de acción prolongada puede ser una composición en la que la región Fc de inmunoglobulina se une a aminoácidos en la posición 30 del agonista doble de GLP-1/glucagón por el polímero no peptidílico como enlazador, pero no se limita a ello.
Los presentes autores han encontrado que la administración combinada de insulina y agonista doble de GLP-1/glucagón puede prevenir el aumento de peso asociado con una administración única de insulina, puede reducir el riesgo de hipoglucemia al reducir la cantidad de insulina y además con el fin de exhibir un efecto de reducción de los niveles de glucosa en sangre más excelente que el de una administración única del agonista doble, la administración combinada de los dos fármacos puede reducir los efectos secundarios y aumentar los efectos en comparación con la administración única de cada fármaco. Los autores también han confirmado que la composición para administración combinada puede usarse como agentes terápicos eficaces mientras que reducen los efectos secundarios del agente terápico convencional de la diabetes.
Como se usa en el presente documento, el término "material biocompatible" o "portador" se refiere a materiales que pueden aumentar la duración de la actividad de la insulina o análogo de insulina o agonista doble de g LP-1/glucagón cuando el material biocompatible y el portador se unen covalentemente o no covalentemente a la insulina o análogo de insulina o agonista doble de GLP-1/glucagón de la presente divulgación directa o indirectamente para formar un conjugado. Por ejemplo, cuando se forma el conjugado, un material que puede aumentar la semivida in vivo de la insulina o análogo de insulina o agonista doble de GLP-1/glucagón puede ser un material o portador biocompatible de acuerdo con la presente divulgación. El tipo de material biocompatible o portador que puede usarse para aumentar la semivida varía, y los ejemplos del mismo incluyen polietilenglicol, ácido graso, colesterol, albúmina y fragmentos de los mismos, sustancia de unión a la albúmina, un polímero de unidades repetitivas de un secuencia de aminoácidos específica, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, materiales de unión al receptor neonatal de Fc (FcRn), tejido conectivo in vivo, nucleótidos, fibronectina, transferrina, sacárido, polímeros y similares. Por supuesto, pueden usarse en combinación de dos o más de los portadores o materiales biocompatibles antes mencionados. El material biocompatible o portador incluye un material biocompatible que extiende la semivida in vivo a través de un enlace covalente o no covalente.
En la presente divulgación, los métodos en los que el material biocompatible o el portador se unen a la insulina o agonista doble incluyen un método de recombinación genética y una conexión in vivo mediante el uso de polímeros o productos químicos de bajo peso molecular, pero no se limitan a ellos. El material de unión a FcRn puede ser una región Fc de inmunoglobulina. Por ejemplo, cuando se usa polietilenglicol como el portador, puede incluirse una técnica Recode de Ambrx Inc. que puede unir la posición específicamente al polietilenglicol. También puede incluirse una técnica de glicopegilación de la empresa Neose que puede unirse específicamente al resto glicosilado. Además, puede incluirse una técnica de PEG liberable en la que se elimina polietilenglicol, pero no se limita a ello. Pueden incluirse técnicas que aumenten la biodisponibilidad mediante el uso de PEG. Adicionalmente, pueden incluirse polímeros tales como polietilenglicol, polipropilenglicol, copolímero de etilenglicol-propilenglicol, poliol polioxietilado, alcohol polivinílico, polisacáridos, dextrano, poliviniletiléter, polímero biodegradable, polímero lipídico, quitinas o ácido hialurónico.
Cuando se usa la albúmina como portador, puede incluirse una técnica en la que las albúminas o fragmentos de albúmina pueden unirse covalentemente por vía directa a los péptidos de la insulina para aumentar la estabilidad in vivo. Incluso si la albúmina no se une directamente, puede incluirse una técnica en la que los materiales de unión a la albúmina, por ejemplo, anticuerpo de unión específico a la albúmina o fragmento de anticuerpo, se unen a los péptidos para unirse a la albúmina y una técnica en la que un determinado péptido/proteína que tiene una afinidad de unión a la albúmina se une a los péptidos. Adicionalmente, puede incluirse una técnica en la que un ácido graso que tiene afinidad de unión a la albúmina se une a los péptidos, pero no se limita a ello. Aquí puede incluirse cualquier técnica o método de unión que pueda aumentar la estabilidad in vivo mediante el uso de albúmina.
La técnica para unirse al péptido mediante el uso del anticuerpo o fragmento de anticuerpo como portador con el fin de aumentar la semivida in vivo también puede incluirse en la presente divulgación. Puede usarse el anticuerpo o fragmento de anticuerpo que tiene un sitio de unión a FcRn y puede usarse cualquier fragmento de anticuerpo que no contenga un sitio de unión a FcRn tal como Fab. La técnica de CovX-cuerpo de la compañía CovX que usa un anticuerpo catalítico puede incluirse en el presente documento y la técnica que aumenta la semivida in vivo mediante el uso de fragmentos Fc puede incluirse en la presente divulgación. Cuando se usa el fragmento Fc, el enlazador que se une al fragmento Fc y al péptido y su método de unión puede incluir un enlace peptídico o un polietilenglicol o similar, pero no se limita a ello y está disponible cualquier método de unión químico. Adicionalmente, la relación de unión del fragmento Fc y la insulina de la presente divulgación puede ser 1:1 o 1:2, pero no se limita a ello.
La técnica en la que se usan péptidos o fragmentos de proteínas como portadores para unirse al análogo de insulina puede incluirse en la presente divulgación con el fin de aumentar la semivida in vivo. Los péptidos o fragmentos de proteínas usados pueden ser el polipéptido de tipo elastina (ELP) que está compuesto de las unidades repetitivas de una combinación de un determinado aminoácido. La técnica del polipéptido artificial PEG Xten de la compañía Versartis se incluye en la presente divulgación. Adicionalmente, la técnica de sonda inductora de estructura (SIP) de la compañía Zealand, que aumenta la semivida in vivo mediante el uso de lisina múltiple, también se incluye en la presente divulgación. La técnica de fusión de la compañía Prolor se incluye en el presente documento. Pueden incluirse en el presente documento la transferrina que se sabe que tiene una alta estabilidad in vivo o fibronectina y derivados de la misma que son un componente del tejido conectivo. Los péptidos o proteínas que se unen a la insulina de la presente divulgación no se limitan a ello, y cualquiera de los péptidos o proteínas que aumente la semivida in vivo de la insulina se incluyen en el alcance de la presente divulgación. La unión de la insulina y los péptidos o proteínas que aumentan la semivida in vivo puede realizarse mediante un enlace covalente. Los tipos de enlazador y el método de unión usados pueden ser un péptido de unión o polietilenglicol y similares, pero no se limitan a ellos, y también es posible cualquier método de unión química.
Además, el portador que se usa para aumentar la semivida in vivo puede ser un material no peptidilo tal como un polisacárido o un ácido graso.
El enlazador que se une al portador que se usa para aumentar la semivida in vivo puede incluir péptidos, polietilenglicoles, ácidos grasos, azúcares, polímeros, compuestos de bajo peso molecular, nucleótidos y una combinación de los mismos, y puede ser cualquier enlace químico tal como un enlace químico no covalente o un enlace químico covalente, sin limitación.
La formulación que puede aumentar la biodisponibilidad o mantener continuamente la actividad puede incluir una formulación de liberación sostenida por micropartículas, nanopartículas y similares mediante el uso de PLGA, ácido hialurónico, quitosano, etc.
Además, la formulación que puede aumentar la biodisponibilidad o mantener continuamente la actividad puede ser una formulación tal como implantes, inhalantes, formulaciones transnasales o parches.
En algunos casos, los ejemplos de insulina administrada en combinación con el agonista doble de GLP-1/glucagón pueden incluir una insulina natural, un análogo de insulina, una insulina de acción prolongada y similares (por ejemplo, puede incluirse una insulina natural tal como Humulin, Novolin, una insulina de acción rápida tal como Novolog, Humalog, Apidra, una insulina de acción prolongada tal como Lantus, Levemir, Tresiba).
En otros casos, los ejemplos de agonista doble de GLP-1/glucagón que pueden administrarse en combinación con la insulina o análogo de insulina y una formulación de acción prolongada del mismo pueden incluir un agonista doble de GLP-1/glucagón natural tal como oxintomodulina y un derivado del mismo y una formulación de acción prolongada del mismo y similares.
El material portador que puede usarse en la presente divulgación puede seleccionarse del grupo que consiste en un anticuerpo, una región Fc de inmunoglobulina, una albúmina, un ácido graso, un carbohidrato, un polímero que tiene una unidad repetitiva de péptido, una transferrina y un PEG, y preferentemente, una región Fc de inmunoglobulina. En algunos casos, el agonista doble de GLP-1/glucagón de acción prolongada se une a un portador mediante el polímero no peptidílico como enlazador. En algunos otros casos, el material portador unido al enlazador polimérico no peptidilo es un fragmento Fc de inmunoglobulina.
En la presente divulgación, el conjugado de insulina de acción prolongada (o para abreviar, conjugado de insulina) o el agonista doble de GLP-1/glucagón de acción prolongada (para abreviar, conjugado de agonista doble) es una forma en la que la insulina o el agonista doble se une a una región Fc de inmunoglobulina y exhibe sostenibilidad y seguridad. La unión de la región Fc de inmunoglobulina y la insulina o el agonista doble puede ser mediante una fusión en marco sin un enlazador o puede enlazarse mediante el uso de un polímero no peptídico como enlazador.
En la presente divulgación, el Fc de inmunoglobulina puede usarse indistintamente con fragmentos de inmunoglobulina.
El término "polímero no peptidílico" se refiere a un polímero biocompatible que incluye dos o más unidades repetitivas unidas entre sí mediante cualquier enlace covalente que excluye un enlace peptídico. En la presente divulgación, el polímero no peptidílico puede usarse de manera intercambiable con el enlazador no peptidilo.
El polímero no peptidílico útil en la presente divulgación puede seleccionarse del grupo que consiste en un polímero biodegradable, un polímero lipídico, quitina, ácido hialurónico y una combinación de los mismos. El polímero biodegradable puede ser polietilenglicol, polipropilenglicol, copolímero de etilenglicol-propilenglicol, poliol polioxietilado, alcohol polivinílico, polisacárido, dextrano, poliviniletiléter, ácido poliláctico (PLA) o ácido polilácticoglicólico (PLGA) y preferentemente un polietilenglicol. Adicionalmente, sus derivados conocidos en la técnica y los derivados que pueden prepararse fácilmente mediante un método conocido en la técnica pueden incluirse en el alcance de la presente divulgación.
El enlazador peptídico que se usa en la proteína de fusión obtenida mediante un método convencional de fusión en marco tiene inconvenientes en que es fácilmente escindido in vivo por una enzima proteolítica y, por lo tanto, no puede obtenerse un efecto suficiente de aumentar la semivida en suero del fármaco activo por un portador como se esperaba. Sin embargo, en la presente divulgación, el polímero que tiene resistencia a la enzima proteolítica puede usarse para mantener la semivida en suero de un péptido que es similar al portador. Por lo tanto, cualquier polímero no peptidílico puede usarse en la presente divulgación sin limitación, siempre que sea un polímero que tenga la función mencionada anteriormente, es decir, un polímero que tenga resistencia a la enzima proteolítica in vivo. El polímero no peptidílico tiene un peso molecular en el intervalo de 1 a 100 kDa, y preferentemente de 1 a 20 kDa. El polímero no peptidílico de la presente divulgación, unido a la región Fc de inmunoglobulina, puede ser un tipo de polímero o una combinación de diferentes tipos de polímeros. El polímero no peptidílico usado en la presente divulgación tiene un grupo reactivo que puede unirse a la región Fc de inmunoglobulina y al fármaco proteico. El polímero no peptidílico tiene un grupo reactivo en ambos extremos, que se selecciona preferentemente del grupo que consiste en un grupo aldehído reactivo, un grupo propionaldehído, un grupo butiraldehído, un grupo maleimida y un derivado de succinimida. El derivado de succinimida puede ser propionato de succinimidilo, hidroxi succinimidilo, succinimidil carboximetilo o carbonato de succinimidilo. En particular, cuando el polímero no peptidílico tiene un grupo aldehído reactivo del grupo aldehído reactivo en ambos extremos del mismo, es eficaz en unirse a ambos extremos con un polipéptido fisiológicamente activo y una inmunoglobulina con reacciones no específicas mínimas. Un producto final producido mediante alquilación reductora por un enlace aldehído es mucho más estable que el que se une mediante un enlace amida. El grupo reactivo aldehído reacciona selectivamente a un extremo N a un pH bajo y se une a un residuo de lisina para formar un enlace covalente a un pH alto, tal como pH 9,0. Los grupos reactivos en ambos extremos del polímero no peptidílico pueden ser iguales o diferentes entre sí. Por ejemplo, el polímero no peptidílico puede poseer un grupo maleimida en un extremo, y un grupo aldehído, un grupo propionaldehído o un grupo butiraldehído en el otro extremo. Cuando se usa un polietilenglicol que tiene un grupo hidroxi reactivo en ambos extremos del mismo como el polímero no peptidílico, el grupo hidroxi puede activarse a varios grupos reactivos mediante reacciones químicas conocidas, o un polietilenglicol que tiene un grupo reactivo modificado disponible comercialmente puede usarse para preparar el conjugado de GLP-1/glucagón de acción prolongada de la presente divulgación.
Adicionalmente, la región Fc de inmunoglobulina es ventajosa en términos de preparación, purificación y rendimiento del conjugado porque el peso molecular es relativamente pequeño en comparación con el total molecular, así como la homogeneidad de los materiales aumenta considerablemente y el potencial de inducir antigenicidad en sangre se reduce porque las secuencias de aminoácidos son diferentes para cada anticuerpo y se elimina la porción Fab que muestra una alta no homogeneidad.
Además, el término "región Fc de inmunoglobulina" como se usa en el presente documento, se refiere a la región constante de la cadena pesada 2 (CH2) y la región constante de la cadena pesada 3 (CH3) de una inmunoglobulina, que excluye las regiones variables de las cadenas pesada y ligera, la región constante de la cadena pesada 1 (CH1) y la región constante de la cadena ligera 1 (CL1) de la inmunoglobulina. Puede incluir además una región bisagra en la región constante de la cadena pesada. Además, la región Fc de inmunoglobulina de la presente divulgación puede contener una parte o la totalidad de la región Fc que incluye la región constante de la cadena pesada 1 (CH1) y/o la región constante de la cadena ligera 1 (CL1), excepto para las regiones variables de las cadenas pesada y ligera de la inmunoglobulina, siempre que tenga un efecto fisiológico sustancialmente similar o mejor que el de la proteína natural. Además, la región Fc de inmunoglobulina puede ser un fragmento que tiene una eliminación en una porción relativamente larga de la secuencia de aminoácidos de CH2 y/o CH3. Es decir, la región Fc de inmunoglobulina de la presente divulgación puede incluir 1) un dominio CH1, un dominio CH2, un dominio CH3 y un dominio CH4, 2) un dominio CH1 y un dominio CH2, 3) un dominio CH1 y un dominio CH3, 4) un dominio CH2 y un dominio CH3, 5) una combinación de uno o más dominios y una región bisagra de inmunoglobulina (o una porción de la región bisagra) y 6) un dímero de cada dominio de las regiones constantes de la cadena pesada y la región constante de la cadena ligera. Además, la región Fc de inmunoglobulina de la presente divulgación incluye una secuencia de aminoácidos natural, así como un derivado de secuencia (mutante) de la misma. Un derivado de la secuencia de aminoácidos tiene una secuencia diferente debido a una eliminación, una inserción, una sustitución conservadora o no conservadora o combinaciones de las mismas de uno o más de los residuos aminoacídicos de las secuencias de aminoácidos naturales. Por ejemplo, en un Fc de IgG, los residuos aminoacídicos conocidos que son importantes en la unión, en las posiciones 214 a 238, 297 a 299, 318 a 322 o 327 a 331, pueden usarse como una diana adecuada para la modificación.
Además, son posibles diversos tipos de derivados, que incluyen uno en el que se elimina una región que puede formar un enlace disulfuro, o se eliminan determinados residuos aminoacídicos en el extremo N de una forma Fc natural o se le añade un residuo de metionina. Además, para eliminar las funciones efectoras, puede ocurrir una eliminación en un sitio de unión al complemento, tal como un sitio de unión a Clq y un sitio de ADCC (citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos). Las técnicas para preparar dichos derivados de secuencia de la región Fc de inmunoglobulina se divulgan en las publicaciones internacionales WO97/34631 y WO 96/32478. Los intercambios aminoacídicos en proteínas y péptidos, que generalmente no alteran las actividades de las moléculas, se conocen en la técnica (H. Neurath, R. L. Hill, The Proteins, Academic Press, Nueva York, 1979). Los intercambios más comunes son Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu y Asp/Gly, en ambas direcciones. Adicionalmente, la región Fc, si es conveniente, puede modificarse mediante fosforilación, sulfatación, acrilación, glicosilación, metilación, farnesilación, acetilación, amidación y similares. Los derivados de Fc descritos anteriormente son derivados que exhiben actividades biológicas idénticas a la región Fc de la presente divulgación o estabilidad estructural mejorada, por ejemplo, frente al calor, pH, etc., en comparación con la región Fc.
Además, estas regiones Fc pueden obtenerse a partir de formas naturales aisladas de seres humanos y otros animales que incluyen vacas, cabras, cerdos, ratones, conejos, hámsteres, ratas y cobayos, o pueden ser recombinantes o derivadas de las mismas, obtenidas de células animales o microorganismos transformados. En el presente documento, pueden obtenerse a partir de una inmunoglobulina natural mediante aislamiento de inmunoglobulinas completas a partir de organismos humanos o animales y luego su tratamiento con una enzima proteolítica. La papaína digiere la inmunoglobulina natural en las regiones Fab y Fc y el tratamiento con pepsina da como resultado la producción de los fragmentos pFc' y F(ab)2. Estos fragmentos pueden someterse, por ejemplo, a cromatografía de exclusión por tamaño para aislar fragmentos Fc o pF'c. Preferentemente, una región Fc de origen humano es una región Fc de inmunoglobulina recombinante obtenida de un microorganismo.
Adicionalmente, la región Fc de inmunoglobulina puede estar en forma de cadenas de azúcar naturales, cadenas de azúcar aumentadas en comparación con una forma natural o cadenas de azúcar disminuidas en comparación con la forma natural, o puede estar en una forma desglicosilada. El aumento, la disminución o la eliminación de las cadenas de azúcar del Fc de inmunoglobulina puede lograrse mediante métodos usados comúnmente en la técnica, tales como un método químico, un método enzimático y un método de ingeniería genética mediante el uso de un microorganismo. La eliminación de las cadenas de azúcar de una región Fc da como resultado una fuerte disminución de la afinidad de unión a la parte C1q del primer componente del complemento C1 y una disminución o pérdida de la citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos o citotoxicidad dependiente del complemento, por lo que no induce respuestas inmunitarias innecesarias in vivo. A este respecto, una región Fc de inmunoglobulina en una forma desglicosilada o aglicosilada puede ser más adecuada para el objetivo de la presente divulgación como un portador farmacológico.
Como se usa en el presente documento, el término "desglicosilación" se refiere a la eliminación enzimática de restos de azúcar de una región Fc y el término "aglicosilación" significa que una región Fc se produce en forma no glicosilada por un procariota, preferentemente E. coli.
Mientras tanto, la región Fc de inmunoglobulina puede derivarse de seres humanos u otros animales que incluyen vacas, cabras, cerdos, ratones, conejos, hámsteres, ratas y cobayos, y preferentemente de seres humanos.
Además, la región Fc de inmunoglobulina puede ser una región Fc que se deriva de IgG, IgA, IgD, IgE e IgM, o que se obtiene mediante combinaciones de las mismas, o híbridos de las mismas. Preferentemente, se deriva de IgG o IgM, que se encuentran entre las proteínas más abundantes en la sangre humana y con la mayor preferencia de IgG que se sabe que mejora la semivida de las proteínas de unión a ligando, pero no se limita a ello.
Por otra parte, el término "combinación", como se usa en el presente documento, significa que los polipéptidos que codifican regiones Fc de inmunoglobulina monocatenarias del mismo origen se unen a un polipéptido monocatenario de un origen diferente para formar un dímero o multímero. Es decir, puede formarse un dímero o multímero a partir de dos o más fragmentos seleccionados del grupo que consiste en los fragmentos Fc de IgG, Fc de IgA, Fc de IgM, Fc de IgD y Fc de IgE.
Como se usa en el presente documento, el término "híbrido" significa que una secuencia correspondiente a, al menos, dos fragmentos Fc de un origen diferente está presente en una región Fc de inmunoglobulina monocatenaria. En la presente divulgación, son posibles varios tipos de híbridos. Es decir, es posible el híbrido que consiste en 1 a 4 dominios seleccionados del grupo que consiste en CH1, CH2, CH3 y CH4 de Fc de IgG, Fc de IgM, Fc de IgA, Fc de IgE y Fc de IgD, y puede incluir una bisagra.
Por otro lado, la IgG también puede dividirse en subclases de IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4, y en la presente divulgación, es posible una combinación o hibridación de las mismas. Preferentemente, son las subclases de IgG2 e IgG4, y con la mayor preferencia la región Fc de IgG4 la que tiene una función efectora sustancial, tal como una citotoxicidad dependiente del complemento (CDC).
Es decir, la región Fc de inmunoglobulina para el portador del fármaco de la presente divulgación puede ser, por ejemplo, la región Fc aglicosilada derivada de IgG4 humana, pero no se limita a ello. La región Fc de origen humano es preferente en comparación con la región Fc de origen no humano que puede provocar respuestas inmunitarias indeseables, por ejemplo, puede actuar como un antígeno en el cuerpo humano para producir un nuevo anticuerpo. El método para preparar una insulina de acción prolongada de la presente divulgación no está particularmente limitado. Por ejemplo, los detalles del método de preparación y sus efectos se describen, por ejemplo, en las Patentes coreanas Nos. 10-1330868, 10-1324828, 10-1058290, Publicación de solicitud de patente coreana No. Patente No. 10-2011-0111267 y Solicitud de patente coreana No. 10-2014-0022909.
En algunos casos, el conjugado de análogo de insulina de acción prolongada se preparó al realizar la monopegilación en el N terminal de la región Fc de inmunoglobulina y modificar el mismo a fenilalanina en la posición 1 de la insulina y la cadena B del análogo de insulina (ejemplo 8).
El método para preparar un agonista doble de GLP-1/glucagón de acción prolongada de la presente divulgación no está particularmente limitado. Por ejemplo, los detalles del método de preparación y sus efectos se describen, por ejemplo, en la Publicación de solicitud de patente coreana No. 10-2012-0139579. En algunos casos, el conjugado de análogo de insulina de acción prolongada se preparó al realizar la monopegilación en el N terminal de la región Fc de inmunoglobulina y modificar el mismo a residuo de cisteína en la posición 30 del agonista doble de GLP-1/glucagón.
La presente divulgación también proporciona una composición que contiene una insulina de acción prolongada y un conjugado de agonista doble de GLP-1/glucagón de acción prolongada.
Cuando tal conjugado de insulina de acción prolongada y un agonista doble de GLP-1/glucagón de acción prolongada se administran en combinación de los mismos, el conjugado de insulina de acción prolongada actúa sobre el receptor de insulina y el conjugado de agonista doble de GLP-1/glucagón actúa sobre el receptor del péptido 1 similar al glucagón y el receptor de glucagón al mismo tiempo para reducir los niveles de glucosa en sangre en comparación con una administración única de cada uno de ellos y mostrar un progreso de cambio estable. Además, una administración combinada de los conjugados descritos anteriormente puede reducir el peligro de hipoglucemia que puede aparecer tras la administración única de insulina y reducir la dosificación total de insulina mediante el péptido de secreción de insulina. El uso del conjugado de insulina de acción prolongada y el agonista doble de GLP-1/glucagón de acción prolongada tiene grandes ventajas, ya que el número de administraciones a un paciente crónico, que de otro modo necesitaría administraciones diarias, puede reducirse drásticamente debido a un aumento en la semivida en sangre y sostenibilidad in vivo, lo que mejora así la calidad de vida del paciente. Por tanto, es muy eficaz en el tratamiento de la diabetes. La composición farmacéutica de la presente divulgación tiene una sostenibilidad in vivo y un umbral de dosis excelentes y reduce significativamente la dosificación usada en la administración combinada.
El conjugado de insulina de acción prolongada y el conjugado de agonista doble de GLP-1/glucagón de acción prolongada pueden administrarse simultánea, secuencial o inversamente, y administrarse simultáneamente en combinación de una cantidad eficaz adecuada. Además, preferentemente, el conjugado de insulina de acción prolongada y el conjugado de agonista doble de GLP-1/glucagón de acción prolongada pueden administrarse simultánea, secuencial o inversamente después del almacenamiento en recipientes separados.
El conjugado de insulina de acción prolongada y el conjugado de agonista doble de GLP-1/glucagón de acción prolongada que son la composición para la administración combinada de la presente divulgación pueden estar en forma de un estuche para el tratamiento de la diabetes que se incluyó en un recipiente o almacenó en un recipiente separado. Dicho estuche puede incluir un portador farmacéuticamente aceptable y una instrucción para el uso del estuche.
En la presente divulgación, el término diabetes se refiere a enfermedades metabólicas en las que la secreción de insulina es insuficiente o no se realizan funciones normales, que se caracteriza por niveles elevados de glucosa en sangre. La administración combinada de la composición de la presente divulgación a un sujeto puede controlar los niveles de glucosa en sangre para tratar la diabetes mellitus.
Como se usa en el presente documento, el término "prevención" se refiere a todas las acciones que inhiben o retrasan la diabetes mediante la administración combinada de la composición de la presente divulgación. El "tratamiento" se refiere a todas las acciones que alivian, mejoran o apaciguan los síntomas de la diabetes mediante una administración combinada de la composición de la presente divulgación. El tratamiento de la diabetes es aplicable a cualquier mamífero que pueda experimentar la diabetes mellitus y los ejemplos del mismo incluyen no solo seres humanos y primates, sino también ganado tales como vacas, cerdos, ovejas, caballos, perros y gatos, sin limitación, y preferentemente seres humanos.
Como se usa en el presente documento, el término "administración" se refiere a la introducción de una cantidad de una sustancia predeterminada en un paciente mediante un método adecuado. La composición de la presente divulgación puede administrarse a través de cualquiera de las vías comunes, siempre que pueda alcanzar un tejido deseado. Por ejemplo, puede ser una administración intraperitoneal, intravenosa, intramuscular, subcutánea, intradérmica, oral, tópica, intranasal, intrapulmonar o intrarrectal, pero no se limita a ello. Sin embargo, dado que los péptidos se digieren tras la administración oral, los ingredientes activos de una composición para administración oral deben recubrirse o formularse para su protección contra la degradación en el estómago. Preferentemente, la composición puede administrarse en forma de inyecciones. Adicionalmente, la formulación de acción prolongada puede administrarse mediante cualquier aparato en el que pueda transportarse un material activo al interior de una célula diana.
La dosis y frecuencia de administración de la composición farmacéutica de la presente divulgación están determinadas por el tipo de ingrediente activo, junto con diversos factores tales como la enfermedad a tratar, vía de administración, edad, sexo y peso corporal del paciente y gravedad de la enfermedad.
La composición farmacéutica de la presente divulgación puede incluir además un portador farmacéuticamente aceptable. En la presente divulgación, el término "portador farmacéuticamente aceptable" se refiere a un diluyente o portador que no inhibe la actividad biológica y propiedades del compuesto administrado sin estimular el organismo. Para la administración oral, el portador puede incluir un aglutinante, un lubricante, un desintegrante, un excipiente, un solubilizante, un agente dispersante, un estabilizante, un agente de suspensión, un colorante y un agente saborizante. Para preparaciones inyectables, el portador puede incluir un agente tampón, un agente conservante, un analgésico, un solubilizante, un agente isotónico y un estabilizante. Para preparaciones para administración tópica, el portador puede incluir una base, un excipiente, un lubricante y un agente conservante.
La composición de la presente divulgación puede formularse en una variedad de formas de dosificación en combinación con los portadores farmacéuticamente aceptables antes mencionados. Por ejemplo, para administración oral, la composición farmacéutica puede formularse en comprimidos, grageas, cápsulas, elixires, suspensiones, jarabes u obleas. Para las preparaciones inyectables, la composición farmacéutica puede formularse en una ampolleta como una formulación única o un recipiente multidosis. La composición farmacéutica también puede formularse en soluciones, suspensiones, comprimidos, píldoras, cápsulas y preparaciones de acción prolongada.
Mientras tanto, los ejemplos del portador, el excipiente y el diluyente adecuados para las formulaciones farmacéuticas incluyen lactosa, dextrosa, sacarosa, sorbitol, manitol, xilitol, eritritol, maltitol, almidón, goma de acacia, alginato, gelatina, fosfato de calcio, silicato de calcio, celulosa, metilcelulosa, celulosa microcristalina, polivinilpirrolidona, agua, metilhidroxibenzoato, propilhidroxibenzoato, talco, estearato de magnesio y aceites minerales. Adicionalmente, las formulaciones farmacéuticas pueden incluir además rellenos, agentes anticoagulantes, lubricantes, humectantes, saborizantes y antisépticos.
La presente divulgación también proporciona un método para prevenir o tratar la diabetes, que incluye administrar la composición que contiene insulina y un agonista doble de GLP-1/glucagón a un sujeto con alto riesgo o que tiene diabetes mellitus.
La composición y la enfermedad del hígado graso no alcohólico son las mismas que las descritas anteriormente. La presente divulgación también proporciona un método para prevenir o tratar la diabetes, que incluye administrar la composición que contiene insulina y un agonista doble de GLP-1/glucagón a un sujeto con alto riesgo o que tiene diabetes mellitus.
La composición y la enfermedad del hígado graso no alcohólico son las mismas que las descritas anteriormente. La etapa de administración puede realizarse mediante la administración combinada del conjugado de insulina de acción prolongada y el conjugado de agonista doble de GLP-1/glucagón de acción prolongada, pero no se limita a ello. Cada uno de ellos pueden administrarse simultánea, secuencial o inversamente, y pueden administrarse simultáneamente en una cantidad eficaz adecuada.
La composición de la presente divulgación, que incluye tanto un conjugado de insulina de acción prolongada como un conjugado de agonista doble de GLP-1/glucagón de acción prolongada, puede reducir en gran medida los niveles de glucosa en sangre y no tiene efectos secundarios de aumento de peso, aunque se administran una vez a la semana y, por tanto, puede usarse en la prevención y el tratamiento de la diabetes.
[Modo]
A continuación, la presente divulgación se describirá con más detalle mediante ejemplos.
Ejemplo 1
Producción de vectores de expresión de análogos de insulina monocatenarios
Con el fin de preparar un análogo de insulina en el que se cambia el aminoácido de la cadena A o de la cadena B de la insulina, mediante el uso de un vector de expresión de insulina natural como molde, se sintetizaron oligonucleótidos directos e inversos (tabla 2) y luego se realizó la PCR, lo que amplifica así, el gen análogo respectivo.
Las secuencias cambiadas de aminoácidos de la cadena A o cadena B y el nombre de análogo de las mismas se muestran en la tabla 1. Es decir, el Análogo 1 es una forma en la que la glicina en la posición 1 de la cadena A se sustituyó con alanina, y el Análogo 4 es una forma en la que la glicina en la posición 8 de la cadena B está sustituida con alanina.
[Tabla 1]
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Los cebadores para la amplificación del análogo de insulina se muestran en la tabla 2.
[Tabla 2]
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La condición de PCR para la amplificación del análogo de insulina fue a 95 °C durante 30 segundos, a 55 °C durante 30 segundos y 68 °C durante 6 minutos y este procedimiento se repitió 18 veces. El fragmento de análogo de insulina obtenido en estas condiciones se insertó en el vector de expresión pET22b para expresarlo en forma de cuerpos de inclusión dentro de la célula. El vector de expresión así obtenido se denominó pET22b-análogos de insulina 1-9. El vector de expresión incluye un ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de los análogos de insulina 1 a 9 bajo el control del promotor T7, y el vector de expresión se expresó en forma de cuerpos de inclusión en el hospedador.
Las secuencias de ADN y las secuencias de proteínas de cada uno de los análogos de insulina 1 a 9 se muestran en la tabla 3 a continuación.
[Tabla 3]
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(Continuación)
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Ejemplo 2: Expresión del polipéptido de fusión del análogo de insulina recombinante
La expresión del análogo de insulina recombinante se realizó bajo el control del promotor T7. E. coli BL21-DE3 (E coli B F-dcm ompT hsdS (rB-mB-) gal DE3.); Nova Zen) se transformó con cada vector de expresión de análogo de insulina recombinante. La transformación se realizó al seguir el método recomendado por Novagene. Se tomaron las colonias solas individuales en las que se transformó cada vector de expresión recombinante, se inocularon en medio de caldo 2XLuria (LB) que contenía ampicilina (50/ml) y se incubaron a 37 °C durante 15 horas. El cultivo de la cepa recombinante y el medio 2X LB que contenía glicerol al 30 % se mezclaron en una proporción de 1:1 (v/v). A continuación, se dispensó 1 ml por cultivo en criotubos y se mantuvo a -140 °C. Esto se usó como reserva celular para la producción de una proteína de fusión recombinante.
Para la expresión del análogo de insulina recombinante, se disolvió cada vial de reserva celular 1, se inoculó con 500 ml de caldo 2XLuria y se cultivó con agitación a 37 °C durante 14-16 horas. Cuando el valor de DO600 indica 5,0 o más, el cultivo se completó y se usó como cultivo semilla. El cultivo semilla se inoculó en 17 L de medio de fermentación mediante el uso de un fermentador de 50 L (MSJ-U2, BEMARUBISHI, Japón) y se comenzó la fermentación en baño inicial. Las condiciones de cultivo fueron una temperatura de 37 °C, un volumen de aire de 20 L/min (1 vvm) y una velocidad de agitación de 500 rpm y se mantuvo a pH 6,70 mediante el uso de agua amoniacal al 30 %. Cuando el nutriente en el medio de cultivo estaba limitado en el progreso de la fermentación, el cultivo por lotes se realizó al añadir una solución de alimentación. El crecimiento de las cepas se controló mediante valores de DO y se introdujo en IPTG con una concentración final de 500 M a los valores de DO de 100 o más. El cultivo se realizó adicionalmente aproximadamente 23 a 25 horas después de la introducción. Después de completado el cultivo, se recolectó una cepa recombinante a través de centrifugación y se almacenó a -80 °C hasta el uso.
Ejemplo 3: Número y replegamiento del análogo de insulina recombinante
Con el fin de cambiar los análogos de insulina recombinante expresados en el ejemplo 2 en una forma soluble, las células se trituraron y replegaron. Se resuspendieron 100 g (peso húmedo) de sedimento celular en 1 L de tampón de lisis (Tris-HCl 50 mM (pH 9,0), EDTA 1 mM (pH 8,0), EDTA 1 mM (pH 8,0), NaCl 0,2 M y Tritón X-100 al 0,5 %). Las células se trituraron mediante el uso de un procesador microfluidizador M-110EH (AC Technology Corp. Modelo M1475C) a una presión de 15,000 psi. El lisado de células trituradas se centrifugó a 7000 rpm a 4 °C durante 20 minutos para descartar el sobrenadante y se resuspendió en 3 L de tampón de lavado (Tritón X-100 al 0,5 % y Tris-HCl 50 mM (pH 8,0), NaCl 0,2 M, EDTA 1 mM). El sedimento se centrifugó a 7000 rpm a 4 °C durante 20 minutos y se resuspendió en agua destilada y luego se centrifugó de la misma manera. El sedimento se tomó, se resuspendió en 400 ml de solución tampón (glicina 1 M, 3,78 g de cisteína-HCl, pH 10,6) y luego se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. Para recoger el análogo de insulina recombinante resuspendido, se añadieron 400 ml de urea 8 M y luego se agitó a 40 °C durante 1 hora. Con el fin de replegar el análogo de insulina recombinante solubilizado, se centrifugó a 7000 rpm a 4 °C durante 30 minutos. Luego se tomó el sobrenadante al que se le añadieron 2 L de agua destilada a un caudal de 1000 ml/h mediante el uso de una bomba peristáltica y se agitó a 4 °C durante 16 horas. Ejemplo 4: Purificación cromatográfica de unión a catión
La muestra replegada se combinó unida a la columna Source S (GE healthcare, Inc.) equilibrada con 20 mM de citrato de sodio contenido en el sitio, se equilibró con tampón de etanol al 45 % (pH 2,0) que contenía etanol al 4 %. La proteína análoga de insulina se eluyó luego con 10 volúmenes de columna de gradiente lineal mediante el uso de tampón citrato de sodio 20 mM (pH 2,0) que contenía etanol al 45 % y cloruro de potasio 0,5 M de modo que la concentración fuera del 0 % al 100 %.
Ejemplo 5: Tratamiento de tripsina y carboxipeptidasa B
La sal se eliminó de una muestra eluida con una columna de desalinización y se reemplazó con una solución tampón (Tris-HCl 10 mM, pH 8,0). Se añadieron tripsina correspondiente a una relación molar de 1000 de la cantidad de proteína de la muestra resultante y carboxipeptidasa B correspondiente a una relación molar de 2000 y luego se agitó a 16 °C durante 16 horas. Con el fin de completar la reacción, el pH se redujo a 3,5 mediante el uso de citrato de sodio 1 M (pH 2,0).
Ejemplo 6: Purificación cromatográfica con acoplamiento catiónico
La muestra de reacción completa se combinó de nuevo con la columna Source S (GE healthcare, Inc.) equilibrada con tampón citrato de sodio 20 mM (pH 2,0) que contenía etanol al 45 %. La proteína análoga de insulina se eluyó luego con 10 volúmenes de columna de gradiente lineal mediante el uso de tampón citrato de sodio 20 mM (pH 2,0) que contenía etanol al 45 % y cloruro de potasio 0,5 M de modo que la concentración fuera del 0 % al 100 %.
Ejemplo 7: Purificación cromatográfica de unión a aniones
La sal se eliminó de una muestra eluida con una columna de desalinización y se reemplazó con una solución tampón (Tris-HCl 10 mM, pH 7,5). Con el fin de separar un análogo de insulina puro de la muestra obtenida en el ejemplo 6, la muestra se combinó con una columna de intercambio aniónico (Fuente Q: GE healthcare, Inc.) equilibrada con solución tampón tris 10 mM (pH 7,5). A continuación, la proteína análoga de insulina se eluyó con 10 volúmenes de columna de gradiente lineal mediante el uso de solución tampón tris 10 mM (pH 7,5) que contenía cloruro de sodio 0,5 M de modo que la concentración fuera del 0 % al 100 %.
La pureza del análogo de insulina purificado se analizó mediante el uso de electroforesis de proteínas (SDS-PAGE) y cromatografía de alta presión (HPLC) y los cambios de aminoácidos se confirmaron mediante un mapeo peptídico y un análisis de peso molecular de cada pico.
Como resultado, se confirmó que la secuencia de aminoácidos se cambió de acuerdo con un propósito deseado del análogo de insulina respectivo.
Ejemplo 8: Preparación del conjugado de insulina de acción prolongada
En este ejemplo, se preparó el conjugado de insulina de acción prolongada del análogo de secuencia (Glu en la posición 14 de la cadena A) de un análogo de insulina natural, un análogo de insulina típico.
Con el fin de pegilar 3,4K ALD2 PEG (NOF, Japón) en el N terminal de la cadena beta del análogo de insulina, se permitió que el análogo de insulina y el PEG reaccionaran entre sí en una relación molar de 1:4 a una concentración de análogo de insulina de 5 mg/ml a 4 ~ 8 °C durante aproximadamente 2 horas. En este momento, la reacción se llevó a cabo en citrato de sodio 50 mM, pH 6,0, isopropanol al 40 ~ 60 % y la reacción se llevó a cabo al añadir una concentración de 3,0~20,0 mM de un agente reductor de cianoborohidruro de sodio. La solución de reacción se purificó mediante el uso de una columna SP-HP (GE Healthcare, EE. UU.) que contenía etanol en citrato de sodio (pH 3,0).
Con el fin de preparar un conjugado de análogo de insulina-fragmento Fc de inmunoglobulina, se permitió que el análogo de insulina monopegilado purificado y el fragmento Fc de inmunoglobulina reaccionaran entre sí en una relación molar de 1:1 a 1:2 a una concentración de proteína total de 20 mg/ml a 25 °C durante aproximadamente 12— 16 horas. En este momento, la condición del tampón de reacción era HEPES 100 mM, pH 8,2 al que se añadieron 20 mM de hidruro de cianoborohidruro de sodio como agente reductor para preparar un conjugado de análogo de insulina modificado con PEG en el extremo N del fragmento Fc.
Una vez completada la reacción, la solución de reacción se aplicó a la columna Q HP (GE Healthcare, EE. UU.) y el conjugado de análogo de insulina-fragmento Fc de inmunoglobulina se purificó primero mediante el uso de tampón Tris-HCl (pH 7,5) con gradiente de concentración de NaCl.
Posteriormente, se obtuvo el conjugado de análogo de insulina-fragmento Fc de inmunoglobulina mediante el uso de Source 15ISO (GE Healthcare, EE. UU.) como segunda columna. En este momento, se eluyó el conjugado de análogo de insulina-fragmento Fc de inmunoglobulina mediante el uso de un gradiente de concentración de sulfato de amonio que contenía Tris-HCl (pH 7,5).
Ejemplo 9: Síntesis de derivados de oxintomodulina
En el ejemplo, se sintetizaron derivados de oxintomodulina que tienen las siguientes secuencias de aminoácidos (tabla 4).
[Tabla 4]
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En la tabla 4, los aminoácidos en negrita y subrayados en cada una de las SEQ ID NOS: 40, 58, 59, 61, 64, 65, 70, 71 y 72, tomados en conjunto, forman un anillo, y los aminoácidos representados por X significan un aminoácido no natural, ácido alfa-metil-glutámico. Adicionalmente, CA representa 4-imidazoacetilo y DA representa desaminohistidilo.
Ejemplo 10: Producción del conjugado de agonista doble de GLP-1/glucagón de acción prolongada
En este ejemplo, se preparó un conjugado de acción prolongada de una variante de oxintomodulina natural, un agonista doble típico de GLP-1/glucagón.
Primero, con el fin de pegilar MAL-10K-ALD PEG en el residuo de cisteína en la posición 30 de la secuencia de aminoácidos del agonista doble de GLP-1/glucagón y (SEQ ID NO: 40: HAibQGTFTSDYSKYLDEKRAKEFVQWLMNTC, los aminoácidos que se muestran en negrita significa una formación de anillo, Aib es 2-metilalanina), se permitió que el agonista doble de GLP-1/glucagón y el PEG MAL-10K-ALD (NOF, Japón) reaccionaran entre sí en una relación molar de 1:1 a 1:3 a una concentración de proteína de 3~5 mg/ml a temperatura ambiente durante aproximadamente 3 horas. En este momento, la reacción se llevó a cabo en un entorno en donde se añadió isopropanol al tampón Tris 50 mM (pH 8,0). Una vez completada la reacción, se aplicó la solución de reacción a la columna SP HP (GE, EE. UU.) y se purificó el agonista doble de GLP-1/glucagón monopegilado con cisteína.
El método de purificación se realizó mediante el uso de un tampón citrato de sodio pH 3,0 que contenía etanol y un gradiente de concentración de cloruro de potasio.
A continuación, se permitió que el agonista doble de GLP-1/glucagón monopegilado purificado y el Fc de inmunoglobulina reaccionaran entre sí en una relación molar de aproximadamente 1:2 a 1:5 a una concentración de proteína de aproximadamente 20 mg/ml a 4~8 °C durante 12 a 16 horas. La reacción se llevó a cabo en un entorno en donde se añadieron 20 mM de SCB como agente reductor a 100 mM de tampón fosfato de potasio (pH 6,0). Una vez completada la reacción, como solución de reacción, se usó SOURCE Q (GE, EE. UU.) para purificar primero el conjugado de agonista doble de GLP-1/glucagón-fragmento Fc de inmunoglobulina. La purificación se realizó mediante el uso de tampón bistris 20 mM pH 6,8 y un gradiente de concentración de cloruro de sodio. A continuación, se purificó finalmente el conjugado de agonista doble de GLP-1/glucagón-fragmento Fc de inmunoglobulina mediante el uso de una columna de purificación Source ISO. El conjugado de agonista doble de GLP-1/glucagón-fragmento Fc de inmunoglobulina se purificó mediante el uso de tampón Tris 20 mM pH 7,5 que contenía 1 M de sulfato de amonio y un gradiente de concentración de tampón Tris 20 mM pH 7,5.
Ejemplo 11: Evaluación del efecto mediante una administración combinada del conjugado de agonista doble de GLP-1/glucagón-Fc de inmunoglobulina y un conjugado de análogo de insulina-Fc de inmunoglobulina
La presente prueba se llevó a cabo para determinar el progreso del nivel de glucosa en sangre y el cambio de peso corporal tras la administración combinada del conjugado de agonista doble de GLP-1/glucagón de acción prolongada y el conjugado de análogo de insulina de acción prolongada preparados en los ejemplos 9 y 10. Se aclimataron 42 ratas db/db (7 semanas de edad) durante 2 semanas en una condición de dieta libre y agua y luego se dividieron 6 ratas por grupo en 7 ratas en total. Los grupos de acuerdo con los materiales de administración son 7 grupos en total que incluyen vehículo, grupo tratado solo con conjugado de agonista doble de GLP-1/glucagón-Fc de inmunoglobulina (1,4 nmol/kg), grupo tratado solo con conjugado de análogo de insulina-Fc de inmunoglobulina (8,8 y 17,6 nmol/kg), grupo tratado combinado con conjugado de agonista doble de GLP-1/glucagón de acción prolongada-Fc de inmunoglobulina (2,2, 4,4 y 8,8 nmol/kg). Todos los materiales de prueba se administraron por vía subcutánea dos veces al día. Excepto el día en que se realiza la administración, los niveles de glucosa en sangre se midieron con glucómetro después de un ayuno de 4 horas al azar dos veces por semana. El nivel de glucosa en sangre de cada grupo se comparó mediante un gráfico AUC (área bajo la curva) que muestra el cambio de glucosa en ayunas durante 4 semanas en comparación con un grupo tratado con vehículo (figura 1). Los cambios de peso se compararon después de la administración del fármaco durante 4 semanas en cada grupo en comparación con la predosis (figura 2)
Como se muestra en la figura 1, en comparación con un grupo de administración única del conjugado de agonista doble de GLP-1/glucagón-Fc de inmunoglobulina (1,4 nmol/kg) o conjugado de análogo de insulina-Fc de inmunoglobulina (8,8 nmol/kg), un efecto de sinergia se mostró en un grupo de administración combinada de los dos materiales en la misma cantidad (conjugado de agonista doble de GLP-1/glucagón-Fc de inmunoglobulina (1,4 nmol/kg) o conjugado de análogo de insulina-Fc de inmunoglobulina (8,8 nmol/kg)).
Además, el grupo de administración combinada exhibió los efectos de la reducción del nivel de glucosa en sangre similar al conjugado de análogo de insulina-Fc de inmunoglobulina (17,6 nmol/kg) administrado en una dosis más alta.
En el cambio de peso corporal (figura 2), el conjugado de análogo de insulina-Fc de inmunoglobulina exhibió un aumento de peso corporal a través de la administración repetida durante 4 semanas, mientras que un grupo de administración combinada y un grupo de administración única del conjugado de agonista doble de GLP-1/glucagón de acción prolongada-Fc de inmunoglobulina exhibió un peso corporal reducido.
Además, al comparar un grupo tratado con un único conjugado de análogo de insulina-Fc de inmunoglobulina en el que se administró la misma cantidad de análogo de insulina-inmunoglobulina con un grupo tratado combinado de conjugado de agonista doble de GLP-1/glucagón-Fc de inmunoglobulina/insulina, el aumento de peso debido a la administración de insulina podría prevenirse al administrar el conjugado de agonista doble de GLP-1/glucagón-Fc de inmunoglobulina juntos. Adicionalmente, incluso si un grupo tratado con un único conjugado de análogo de insulina-Fc de inmunoglobulina (17,6 nmol/kg) se comparó con un grupo tratado combinado (conjugado de agonista doble de GLP-1/glucagón-Fc de inmunoglobulina (1,4 nmol/kg), conjugado de análogo de insulina-Fc de inmunoglobulina (8,8 nmol/kg)), pudo observarse que hubo un efecto de reducción del peso corporal.
A partir de estos resultados, se ha visto que la composición que incluye tanto un conjugado de insulina de acción prolongada como un conjugado de agonista doble de GLP-1/glucagón de acción prolongada tiene una excelente capacidad para controlar los niveles de glucosa en sangre y no tiene efectos secundarios de aumento de peso

Claims (10)

REIVINDICACIONES
1. Una composición farmacéutica para usar en un método de tratamiento o prevención de la diabetes mellitus mediante la reducción de los niveles de glucosa en sangre y la reducción del peso corporal, la composición que comprende un conjugado de insulina de acción prolongada y un conjugado de agonista doble de GLP-1/glucagón de acción prolongada,
en donde el conjugado de insulina de acción prolongada es un conjugado en el que la insulina se une a una región Fc de inmunoglobulina a través de un polímero no peptidílico; en donde el conjugado de agonista doble de GLP-1/glucagón de acción prolongada es un conjugado en el que el agonista doble de GLP-1/glucagón se une a una región Fc de inmunoglobulina a través de un polímero no peptidílico,
en donde la insulina es el análogo de insulina de acuerdo con la SEQ ID NO. 34; y
en donde el agonista doble de GLP-1/glucagón comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en secuencias de aminoácidos representadas por las SEQ ID NOs: 40, 63 y 64, y activa simultáneamente el receptor de GLP-1 y los receptores de glucagón.
2. La composición para usar de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el agonista doble del péptido 1 similar al glucagón (GLP-1)/receptor de glucagón de acción prolongada tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.40 y el aminoácido en las posiciones 16 y 20 forman un anillo.
3. La composición para usar de acuerdo con la reivindicación 1, en donde (i) el polímero no peptidílico se selecciona del grupo que consiste en polietilenglicol, polipropilenglicol, un copolímero de etilenglicolpropilenglicol, poliol polioxietilado, alcohol polivinílico, un polisacárido, dextrano, poliviniletiléter, un polímero biodegradable, un polímero lipídico, quitina, ácido hialurónico y una combinación de los mismos; y/o (ii) la región Fc de inmunoglobulina se aglicosila.
4. La composición para usar de acuerdo con la reivindicación 3, en donde la región Fc de inmunoglobulina comprende de una a cuatro regiones seleccionadas del grupo que consiste en dominios CH1, CH2, CH3 y CH4; y opcionalmente, en donde la región Fc de inmunoglobulina comprende además una región bisagra.
5. La composición para usar de acuerdo con la reivindicación 4, en donde la región Fc de inmunoglobulina es una región Fc derivada de IgG, IgA, IgD, IgE o IgM; y opcionalmente, en donde cada dominio de la región Fc de inmunoglobulina es un híbrido de dominios que tienen un origen diferente seleccionado del grupo que consiste en IgG, IgA, IgD, IgE e IgM.
6. La composición para usar de acuerdo con la reivindicación 5, en donde la región Fc de inmunoglobulina es un dímero o un multímero que consiste en inmunoglobulinas monocatenarias que consisten en dominios que tienen el mismo origen.
7. La composición para usar de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la composición comprende además un portador farmacéuticamente aceptable.
8. La composición para usar de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el conjugado de insulina de acción prolongada y el conjugado de agonista doble de GLP-1/glucagón de acción prolongada se administran simultánea, secuencial o inversamente.
9. La composición para usar de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el polímero no peptidílico es PEG.
10. Un método para preparar un fármaco para tratar o prevenir la diabetes mellitus mediante la reducción de los niveles de glucosa en sangre y la reducción del peso corporal, la composición que comprende un conjugado de insulina de acción prolongada y un conjugado de agonista doble de GLP-1/glucagón de acción prolongada, que comprende mezclar el conjugado de insulina de acción prolongada y el conjugado de agonista doble de GLP-1/glucagón de acción prolongada con un portador farmacéuticamente aceptable, en donde el conjugado de insulina de acción prolongada es un conjugado en el que la insulina se une a una región Fc de inmunoglobulina a través de un polímero no peptidílico; y
en donde el conjugado de agonista doble de GLP-1/glucagón de acción prolongada es un conjugado en el que el agonista doble de GLP-1/glucagón se une a una región Fc de inmunoglobulina a través de un polímero no peptidílico,
en donde la insulina es el análogo de insulina de acuerdo con la SEQ ID NO. 34; y
en donde el agonista doble de GLP-1/glucagón comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en secuencias de aminoácidos representadas por las SEQ ID NOs: 40, 63 y 64, y activa simultáneamente el receptor de GLP-1 y los receptores de glucagón.
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