ES2874582T3

ES2874582T3 - Estructuras poliméricas no uniformemente rígidas y métodos de producción de las mismas

Info

Publication number: ES2874582T3
Application number: ES17731267T
Authority: ES
Inventors: Peter Frey; Jeffrey A Hubbell; Hans M Larsson; Elif Vardar; Eva-Maria Balet; Ganesh Vythilingam; Kalitha Pinnagoda
Original assignee: Regenosca SA
Current assignee: Regenosca SA
Priority date: 2016-04-13
Filing date: 2017-03-29
Publication date: 2021-11-05
Anticipated expiration: 2037-03-29
Also published as: EP3442608B1; WO2017178915A1; US11266764B2; MY196309A; EP3442608A1; DK3442608T3; US20220088270A1; US20190117838A1

Abstract

Un método para producir una estructura polimérica no uniformemente rígida para utilizar en la ingeniería de tejido, diagnóstico o procedimientos quirúrgicos, caracterizado por que comprende las siguientes etapas: a) proporcionar, al menos, una capa de un gel de material polimérico; b) realizar una primera etapa de secado rápido al aplicar una compresión mecánica en dicha capa de gel de material polimérico; y c) realizar una segunda etapa de secado lento del gel hasta alcanzar una fracción de masa de material polimérico de, al menos, 60 % en peso, dicha etapa se realiza con medios de filtración de agua, secado al aire o cualquier combinación de los mismos; d) realizar una etapa de hidratación donde la estructura vuelve a hincharse con más del 4 % en peso.

Description

DESCRIPCIÓN

Estructuras poliméricas no uniformemente rígidas y métodos de producción de las mismas

Campo técnico

La invención se refiere a la ingeniería de tejido, el diagnóstico y la intervención quirúrgica, particularmente a las estructuras poliméricas que no son uniformemente rígidas y a los métodos para producir los objetos de este tipo. Antecedentes de la técnica

El colágeno es uno de los primeros polímeros naturales utilizados como biomaterial. Al ser la proteína de matriz extracelular estructural más abundante en el cuerpo humano, es, por lo tanto, ampliamente utilizada como un componente de estructura para aplicaciones de ingeniería de tejidos y se considera entre las primeras opciones para materiales de estructuras naturales.

Los geles de colágeno se forman mediante un proceso llamado fibrilogénesis. La fibrilogénesis comienza cuando una disolución ácida de colágeno diluido se ajusta in vitro al pH y la temperatura fisiológicos (Gross y Kirk, J. Bio. Chem 233 (1958): 355-360). Los geles de colágeno son interesantes como estructuras debido a su buena biocompatibilidad, su baja inmunogenicidad y su facilidad de remodelación por parte de las células. Sin embargo, el gran exceso de líquido atrapado entre las fibras de colágeno las hace inherentemente débiles y, por lo tanto, difíciles de manipular. Se propusieron varias estrategias para obtener estructuras de colágeno que tuvieran mejores propiedades mecánicas. El cultivo simple de células dentro de geles de colágeno resulta en la expulsión de parte del líquido intersticial por contracción del gel, pero la compactación celular no es un proceso fácilmente controlable y el aumento en la densidad del colágeno se relaciona con una reducción de la superficie de la estructura (es decir, encogimiento de la estructura). El entrecruzamiento de las fibras de colágeno mejora las propiedades mecánicas de las estructuras de colágeno sin cambiar la superficie de la estructura. Los métodos de entrecruzamiento físico, químico y biológico del colágeno están bien informados en la literatura (Paul y Bailey, The Scientific World Journal 3 (2003): 138-155). Una opción es la liofilización (secado por congelación) de una solución acuosa de colágeno seguida del entrecruzamiento químico (EP1561480). Otra posibilidad es el secado por congelación de un gel de colágeno seguido del entrecruzamiento de deshidratación térmica (EP1098024).

El agente de entrecruzamiento de aldehído más común es el glutaraldehído. Sin embargo, su utilización para aplicaciones médicas es cuestionado debido a su citotoxicidad. Se han identificado varios agentes químicos de entrecruzamiento que logran niveles comparables de entrecruzamiento con el de glutaraldehído y, al mismo tiempo, mejoran la citocompatibilidad (es decir, difenilfosforilazida, 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida, genipina) (Petite H. et al., Biomaterials 16 (1995): 1003-1008).

Otro método para producir geles de colágeno con propiedades mecánicas mejoradas consiste en aplicar compresión plástica. Durante el proceso de compresión plástica, el líquido intersticial es expulsado de un gel de colágeno y no regresa al retirar la carga. Este proceso sencillo, rápido, controlable y fácil de utilizar con células para diseñar matrices de colágeno con propiedades mecánicas adecuadas para la ingeniería de tejidos blandos fue descrito en detalle por Brown y sus colegas (publicación internacional WO 2006/003442; publicación internacional WO 2012/004564; Abou Neel E.A. et al., Soft Matter 2 (2006): 986-992; Brown R.A. et al., Adv Funct Mater 15 (2005): 1762-1770). Adicionalmente, se han informado estructuras híbridas de colágeno donde un componente de polímero sintético proporcionó el soporte mecánico (Kawazoe N. et al., Biotechnol Prog 26 (2010): 819-826; Lu H. et al., Sci Technol Adv Mater 13 (2012)). Sin embargo, este enfoque disminuye la biocompatibilidad de la matriz.

La mayoría de las estrategias de diseño de estructuras tienen como objetivo imitar las propiedades mecánicas del tejido nativo tanto como sea posible y, al mismo tiempo, proporcionar una estructura que sea fácil de manipular y apta para sutura. Se informaron en la literatura las siguientes matrices de colágeno aptas para sutura: esponja de colágeno o esponja de colágeno/glicosaminoglicanos entrecruzados con gel de colágeno (documento US5567806), matriz de colágeno de doble capa producto de un procedimiento de fundición, secado por congelación y liofilización donde las capas de colágeno difieren en densidad (publicación internacional WO 2007/082295) y una matriz de colágeno con secado por congelación de alta densidad (publicación internacional WO 2000/029484).

Adicionalmente, está comprobado que las propiedades mecánicas de una estructura influyen en el comportamiento celular. La miogénesis se logra mejor en estructuras de colágeno que son moderadamente rígidas (Engler A.J. et al., J Cell Biology 166 (2004): 877-887) mientras que la osteogénesis se logra en estructuras rígidas de colágeno (Huebsch N. et al., Nat Matter 9 (2010): 518-526). Los investigadores pueden cambiar las propiedades mecánicas de los hidrogeles de colágeno al variar la concentración de colágeno y al utilizar diferentes métodos de entrecruzamiento. Sin embargo, estas estructuras son matrices uniformes y una estructura blanda de colágeno que muestra un excelente comportamiento celular en términos de proliferación y diferenciación podría no ser adecuada para una aplicación clínica (es decir, no apta para sutura, difícil de manipular).

Compendio de la invención

Con el fin de abordar y superar los inconvenientes asociados con las soluciones de la técnica anterior con respecto a los productos poliméricos para la ingeniería de tejidos y la intervención quirúrgica, los inventores desarrollaron un nuevo método para producir estructuras poliméricas que muestran varias ventajas cuando se utilizan en un enfoque in vivo. Particularmente, la estructura de la presente invención presenta características superiores en términos de resistencia en la sutura cuando se realiza el injerto in vivo en tejidos blandos, mientras que, al mismo tiempo, exhibe excelentes características mecánicas y funcionales en términos de facilitación de la infiltración de la célula anfitriona tras el injerto, reducción de las reacciones inflamatorias/rechazo y mejora de la cicatrización de los tejidos, con una recuperación asociada más rápida de un sujeto sometido a una intervención quirúrgica. La estructura de la invención puede almacenarse lista para utilizar y, por lo tanto, reducir los costes asociados a la intervención quirúrgica y proporcionar resultados de injerto exitosos, incluso en un escenario libre de células. En un aspecto particular, la presente invención propone un proceso fácil y controlable para proporcionar estructuras poliméricas no uniformemente rígidas que consisten en áreas más densas que aseguran la capacidad de sutura y la manipulación fácil para los cirujanos, así como zonas más blandas para inducir el comportamiento celular y el destino adecuados en términos de proliferación y diferenciación celular.

Por consiguiente, es un objeto de la presente invención proporcionar un método para producir una estructura polimérica no uniformemente rígida para utilizar en la ingeniería de tejido, diagnóstico o procedimientos quirúrgicos, caracterizado por que comprende las siguientes etapas:

a) proporcionar, al menos, una capa de un gel de material polimérico;

b) realizar una primera etapa de secado rápido al aplicar una compresión mecánica en dicha capa de gel de material polimérico; y

c) realizar una segunda etapa de secado lento del gel hasta alcanzar una fracción de masa de material polimérico de, al menos, 60 % en peso;

d) realizar una etapa de hidratación donde la estructura vuelve a hincharse con más del 4 % en peso.

El método se caracteriza por que la etapa c) se realiza por medios de filtración de agua, secado al aire o cualquier combinación de los mismos. En una realización particular, el método se caracteriza por que la filtración de agua se realiza mediante diálisis.

En una realización particular, el método se caracteriza por que el secado al aire se realiza por gravedad durante, al menos, 1 hora.

En una realización, el método comprende adicionalmente la etapa de envolver circunferencialmente la estructura polimérica alrededor de un soporte con el fin de tener una estructura polimérica tubular que comprende un lumen. En una realización, el método comprende la etapa a') en lugar de la etapa a) de verter una disolución de precursor de gel polimérico en un molde sustancialmente cilíndrico que comprende en él un soporte alargado coaxial para crear una sola capa tubular de gel de material polimérico.

En una realización, el método se caracteriza por que la estructura polimérica está libre de células.

En una realización, el método se caracteriza por que el material polimérico es material polimérico natural o un material polimérico derivado de una matriz extracelular (ECM).

En una realización, el método se caracteriza por que el material polimérico natural o material polimérico derivado de ECM es gelatina, elastina, colágeno, agar/agarosa, quitosán, fibrina, proteoglicanos, un poliaminoácido o sus derivados, preferiblemente polilisina o gelatina metilcelulosa, carbometilcelulosa, polisacáridos y sus derivados, preferiblemente glicosaminoglicanos, como puede ser ácido hialurónico, condroitinsulfato, dermatansulfato, heparansulfato, heparina, queratansulfato o alginato, o cualquier combinación de lo precedente.

En una realización, el método se caracteriza por que ningún agente entrecruzante se añade al gel del material polimérico.

En una realización particular, el método se caracteriza por que el gel polimérico de la etapa a) se obtiene de una disolución de precursor de gel de colágeno que tiene una concentración de colágeno de, al menos, 2,1 mg/ml, preferiblemente entre 2,5 y 40 mg/ml.

Un aspecto adicional de la presente invención se refiere a una estructura polimérica no uniformemente rígida para utilizar en la ingeniería de tejido, diagnósticos o procedimientos quirúrgicos producidos según los métodos previamente descritos, dicha estructura se caracteriza por que tiene, al menos, una capa de material polimérico que tiene una fracción de masa polimérica de, al menos, 52 % en peso en estado de equilibrio tras la rehinchazón, con una estructura polimérica más densa en la superficie y menos densa en el núcleo de la estructura.

En una realización, la estructura polimérica no uniformemente rígida se caracteriza por que es apta para sutura.

En una realización, la estructura polimérica no uniformemente rígida se caracteriza por que comprende un agente bioactivo.

Otro objeto de la presente invención se refiere a un kit que comprende:

a) un recipiente;

b) una disolución acuosa; y

c) la estructura polimérica no uniformemente rígida como se ha descrito anteriormente. En una realización, el kit se caracteriza por que se esteriliza mediante haz de electrodo, radiación de rayos gamma o radiación de rayos X. Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 representa un boceto del método de la invención para la producción de láminas (1A) o tubos (1B) de una estructura polimérica no uniformemente rígida.

La Figura 2 muestra una realización de un molde utilizado para producir una estructura tubular polimérica con un lumen interno.

La Figura 3 muestra una representación esquemática de la “técnica de calcetín” según la invención para producir estructuras poliméricas no uniformemente rígidas.

La Figura 4 muestra imágenes de la “técnica de calcetín” y la estructura final de un tubo de colágeno de doble capa y de una sola capa, así como una lámina de colágeno obtenida al abrir un tubo de doble capa. (A) La mitad superior de un tubo de colágeno está hidratada. (B-E) La mitad hidratada del colágeno se coloca sobre la mitad seca. (F) Un tubo de colágeno compatible con sutura de una sola capa en un fórceps. (G) Un tubo compatible con sutura de doble capa en un fórceps. (H) El tubo abierto de doble capa que forma una lámina de doble capa.

La Figura 5 muestra la influencia del método de secado y el estado final de secado en el comportamiento de rehinchazón de las estructuras de colágeno. (A) La compresión mecánica seguida de secado al aire se compara con solo el secado al aire del colágeno, con el control del contenido de agua y el tiempo de secado al aire. Hay una clara tendencia en el tiempo de secado al aire y contenido de agua (B) Ningún secado de las estructuras de colágeno producidas deriva en un contenido de agua del 100 % en la estructura de colágeno (barras blancas después del secado), y el contenido de agua no cambia tras la incubación en un entorno hidratante (barras negras después de volver a hincharse). La utilización del método de secado por congelación para reducir el contenido de agua en la estructura de colágeno deriva en una estructura seca con un promedio de 1,3 % de contenido de agua y alcanza un promedio de alrededor de 20 % de contenido de agua después de volver a hincharse. La utilización de solo el secado al aire permite obtener un nivel seco promedio de 1,5 % de contenido de agua que aumenta a 9,5 % después de volver a hincharse. La utilización de la compresión mecánica con secado al aire permite obtener un promedio de 0,8 % de contenido de agua que aumenta a 5,2 % después de volver a hincharse. La utilización de solo la compresión mecánica permite obtener un nivel seco promedio de 47,6 % de contenido de agua que aumenta a 48,3 % después de volver a hincharse. (C) El método de secado al aire puede utilizarse para manipular el comportamiento de rehinchazón de las estructuras de colágeno al cambiar el estado seco final (% de agua); se observa una tendencia lineal entre el estado seco final de la estructura de colágeno y el grado en que se vuelve a hinchar; al menos, 1 h de secado al aire después de la compresión mecánica produce un material diferente con un contenido de agua diferente en comparación con solo una estructura comprimida mecánicamente.

La Figura 6 muestra el estado en equilibrio de la rehinchazón de la estructura de colágeno. Las estructuras de colágeno con secado por congelación, secado al aire y mecánicamente comprimidas con secado al aire se vuelven a hinchar rápidamente (en 30 minutos) en un entorno hidratante. El comportamiento de rehinchazón en estado de equilibrio ocurre en 72 h en condiciones de hidratación.

La Figura 7 muestra la relación entre las propiedades mecánicas y el porcentaje de agua presente dentro de las estructuras de colágeno compatibles con intervención quirúrgica. (A y B) Las estructuras de colágeno secadas al aire muestran que el porcentaje de agua es un parámetro crucial para las propiedades mecánicas (módulo de Young y resistencia a la rotura por tracción) de la estructura. (C y D) Una estructura de colágeno secada al aire (1,5 % de contenido de agua) y que se volvió a hinchar (9,5 % de contenido de agua) se anastomosa a una uretra de cabra con suturas de Vicryl 6.0. (E) Incluso una estructura de colágeno con compresión mecánica más secado al aire durante 1 h (38 % de contenido de agua) y que se volvió a hinchar (45 % de contenido de agua) se anastomosa a una uretra de perro con sutura de Vicryl 6.0. (F y G) Tinción de hematoxilina y eosina de muestras de tejido recolectadas 1 mes y 3 meses después de la intervención quirúrgica en conejos. Las flechas blancas muestran las suturas y las flechas negras apuntan al colágeno restante de la estructura implantada que lentamente se reemplaza con el tejido anfitrión y finalmente desapareció por completo 3 meses después de la intervención quirúrgica.

La Figura 8 muestra la estructura del colágeno microscópica en micro-nano escala después de diferentes métodos de secado. A y D muestran un tubo de colágeno producido por compresión mecánica (compresión plástica) seguido de secado por aire (compresión semielástica) que produce una estructura de colágeno heterogénea o “no uniforme”.

La estructura no uniforme es el resultado de la aplicación de dos métodos de secado diferentes durante el procedimiento de fabricación. B y E muestran un tubo de colágeno que solo se ha secado al aire y que produce una estructura de colágeno homogénea o “uniforme”. C y F muestran un tubo de colágeno que se ha secado por congelación y que produce una estructura de colágeno aleatoria, no uniforme, con orificios pronunciados distribuidos aleatoriamente en la red de colágeno.

La Figura 9 visualiza las diferentes áreas de colágeno presentes dentro de una estructura tubular que se produjo mediante la aplicación de ambas compresiones, la plástica (carga mecánica) y la semielástica (secado al aire). (A) Descripción esquemática de las manipulaciones para obtener una estructura de colágeno tubular no uniformemente rígida. (B) Representación esquemática de la estructura de colágeno de la estructura tubular final. (C y D) lmmunohistoquímica con anticuerpos anticolágeno tipo 1 en muestras de una estructura tubular de colágeno bovino para visualizar la densidad de la fibra de colágeno tipo 1. Las imágenes tomadas bajo un microscopio confocal LSM700 (Zeiss) visualizan la superficie del lumen (D) interno y el lado (C) externo de una sección transversal de un tubo de colágeno.

La Figura 10 muestra la morfología de las células uroteliales cultivadas en estructuras de colágeno con diferentes densidades. Se utilizaron células uroteliales transducidas con GFP-lentivírico para visualizarlas fácilmente bajo un estereomicroscopio de fluorescencia (Leica). Después de 24 h de la siembra celular, las células uroteliales que crecen en (A) estructuras de colágeno menos densas forman más unidades individuales y menos colonias conectadas en comparación con (B) células uroteliales que crecen en geles de colágeno de mayor densidad.

Descripción de las realizaciones

La presente descripción puede comprenderse más fácilmente por referencia a la siguiente descripción detallada presentada en relación con las figuras de los dibujos que la acompañan, los cuales forman parte de esta descripción. Se ha de entender que esta divulgación no se limita a las condiciones o parámetros específicos descritos y/o mostrados en la presente memoria y que la terminología que se utiliza en la presente memoria tiene el propósito de describir realizaciones particulares solamente a modo de ejemplo y no tiene como objeto limitar la descripción reivindicada.

Tal y como se utiliza en la presente memoria y en las reivindicaciones anejas, las formas singulares “un”, “una” y “la/el” incluyen referentes plurales, a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a “un agente bioactivo” incluye una pluralidad de ese tipo de agentes y la referencia a “una capa” incluye la referencia a una o más capas, y así sucesivamente.

Además, la utilización de “o” significa “y/o”, a menos que se indique lo contrario. Del mismo modo, “comprenden”, “comprende”, “que comprende”, “incluyen”, “incluye” y “que incluye” son intercambiables y no tienen como objeto ser limitantes. Se ha de entender adicionalmente que donde las descripciones de varias realizaciones utilizan el término “que comprende”, los expertos en la técnica entenderán que, en algunos casos específicos, una realización puede describirse alternativamente con el lenguaje “que consiste esencialmente en” o “que consiste en”.

El objeto principal de la presente invención depende, al menos en parte, de un método novedoso para producir una estructura de material polimérico para utilizar en la ingeniería de tejido o procedimientos quirúrgicos, así como para el diagnóstico y la investigación básica, con características mecánicas y funcionales muy peculiares. De hecho, una vez producida con los métodos según la invención, las estructuras de la invención muestran sorprendentemente una arquitectura no uniforme, en donde algunas zonas dentro de la estructura polimérica muestran diferencias en la densidad de polímero y, por lo tanto, también en la rigidez. Dado que existe una estrecha relación entre la concentración de polímero y las propiedades mecánicas de la estructura, como pueden ser la rigidez y la elasticidad, esta característica guía de forma ventajosa la migración celular, la proliferación y la diferenciación in vivo gracias a la presencia de una o más áreas poliméricas menos densas que se pueden remodelar fácilmente al invadir las células anfitrionas y, por lo tanto, mejorar la capacidad de regeneración del tejido de la estructura y, al mismo tiempo, mantener una porción de la estructura con una fuerza mecánica suficiente para ser suturada durante la intervención quirúrgica.

El método de la invención abarca dos enfoques principales para la fabricación de las estructuras poliméricas no uniformemente rígidas de la invención. Contrariamente a algunos enfoques de la técnica anterior que implican un proceso de compresión plástica para crear matrices de polímero uniforme (por ejemplo, colágeno), el presente método aprovecha un nuevo método renombrado por los inventores “compresión semielástica” de geles poliméricos. A diferencia de una compresión elástica, donde el gel polimérico vuelve a hincharse a su estado inicial después de la retirada de la fuerza de compresión aplicada en él, los geles procesados según el presente método solo vuelven a hincharse a un estado intermedio, el cual depende de la concentración de polímero inicial y del estado seco final. Sorprendentemente, estas estructuras poliméricas con compresión semielástica y rehidratadas son lo suficientemente estables para manipularse fácilmente y suturadas en un enfoque quirúrgico in vivo. Esto se consigue al aplicar una primera etapa de compresión mecánica rápida con carga mecánica seguida de una fase de secado lento, preferiblemente seguida de una rehidratación final.

La invención se comprenderá mejor con la ayuda de las siguientes definiciones.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, un “material polimérico” es cualquier material que comprende polímeros, moléculas grandes (también conocidas como macromoléculas) compuestas de muchas unidades más pequeñas repetidas, o subunidades, llamadas monómeros, estrechamente unidas preferentemente mediante enlaces covalentes. La arquitectura de polímeros a escala molecular puede ser bastante diversa. Un polímero lineal consiste en una larga cadena lineal de monómeros. Un polímero ramificado comprende una larga cadena principal con varias ramificaciones cortas de cadena lateral unidas de forma covalente. Los polímeros entrecruzados tienen monómeros de una cadena larga o corta enlazadas de forma covalente con monómeros de otra cadena corta o larga. El entrecruzamiento deriva en una red molecular tridimensional; todo el polímero es una macromolécula gigante. Otra clasificación útil de polímeros es a partir del tipo químico de los monómeros: los homopolímeros consisten en monómeros del mismo tipo, los copolímeros tienen diferentes unidades repetitivas. Adicionalmente, dependiendo de la disposición de los tipos de monómeros en la cadena de polímero, se encuentra la siguiente clasificación: las diferentes unidades repetitivas se distribuyen aleatoriamente (copolímero aleatorio) o hay secuencias alternas de los diferentes monómeros (copolímeros alternos) en secuencias largas de copolímeros en bloque de un tipo de monómero que están seguidas de secuencias largas de otro tipo; y los copolímeros de injerto consisten en una cadena de un tipo de monómero con ramificaciones de otro tipo. Una disolución de polímero suficientemente densa puede entrecruzarse para formar un gel de polímero, incluido un hidrogel o un criogel, el cual es un sólido blando.

Los materiales poliméricos también pueden formarse al combinar dos o más polímeros en mezclas físicas. Por ejemplo, la escasa resistencia a los impactos de un polímero puede mejorarse en gran medida mediante la incorporación de pequeñas partículas de un elastómero. Muchas propiedades de los materiales poliméricos dependen de la disposición microscópica de sus moléculas. Los polímeros pueden tener una estructura amorfa (desordenada) o semicristalina (parcialmente cristalina, parcialmente ordenada). Los polímeros pueden mezclarse con partículas inorgánicas (generalmente en forma de fibras continuas, como puede ser vidrio o partículas, como puede ser mica, talco y arcilla) con el fin de modificar y mejorar (principalmente, pero no exclusivamente) sus propiedades mecánicas.

Los materiales poliméricos adecuados incluyen, pero no se limitan a, polímeros sintéticos, como puede ser poliuretanos, poliolefinas, polietilenglicol (PEG), poli(glicolida) (PGA), poli(L-lactida) (PLA) o poli(lactida-co-glicolida) (PLGA); materiales poliméricos naturales (es decir, polímeros no sintéticos, polímeros que se pueden encontrar en la naturaleza) y/o polímeros derivados de la matriz extracelular (ECM) como gelatina, laminina, elastina, colágeno, agar/agarosa, quitosán, fibrina, proteoglicanos, un poliaminoácido o sus derivados, preferiblemente polilisina o gelatina metilcelulosa, carboximetilcelulosa (CMC), polisacáridos y sus derivados, preferiblemente glicosaminoglicanos, como puede ser ácido hialurónico, condroitinsulfato, dermatansulfato, heparansulfato, heparina, queratansulfato o alginato, nucleótidos, polilipidas, ácidos grasos, así como cualquier derivado de los mismos, fragmento de los mismos y cualquier combinación de lo precedente. Los polímeros naturales y derivados de ECM son un biomaterial de primera elección para las aplicaciones de ingeniería de tejido previstas en la presente descripción, debido a sus similitudes biológicas y químicas con los tejidos naturales y a la presencia de sitios biológicamente activos en sus estructuras. Por ejemplo, el colágeno y el ácido hialurónico pueden considerarse como las realizaciones más preferidas para constituir las estructuras poliméricas de la invención.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, el término “gel” se refiere a una red coloidal no fluida o a una red polimérica que se expande a lo largo de todo su volumen mediante un líquido. Un gel es una sólida red tridimensional que abarca el volumen de un medio líquido y lo atrapará mediante los efectos de tensión superficial. La estructura de la red interna puede ser el resultado de enlaces físicos (geles físicos) o enlaces químicos (geles químicos).

Tal y como se utiliza en la presente memoria, el término “hidrogel” se refiere a un gel en el cual el agente de hinchazón es agua. Un hidrogel es un gel de polímero macromolecular construido de una red de cadenas de polímeros entrecruzadas. Se sintetiza a partir de monómeros hidrófilos, que a veces se encuentran como un gel coloidal en el cual el agua es el medio de dispersión. Los hidrogeles son redes poliméricas naturales o sintéticas altamente absorbentes (pueden contener más del 90 % de agua). Como resultado de sus características, los hidrogeles desarrollan propiedades mecánicas normalmente firmes, pero elásticas.

Varias propiedades físicas de los (hidro)geles dependen de la concentración. El aumento en la concentración (hidro)de gel puede cambiar su radio de poro, morfología o su permeabilidad a proteínas de peso molecular diferentes. Un experto en la técnica apreciará que el volumen o las dimensiones (longitud, amplitud y grosor) de un (hidro)gel se pueden seleccionar en función de las necesidades instantáneas, como puede ser, por ejemplo, la región o el entorno en el cual se implantará una estructura substancialmente fabricada de un (hidro)gel.

En la presente memoria se entiende por “colágeno” cualquier tipo de colágeno natural o recombinante de origen animal, preferiblemente mamíferos, como puede ser bovino, porcino, de rata, de humanos y similares. Por consiguiente, el colágeno tipo 1 a 28 puede utilizarse en el marco de la presente invención, así como fragmentos del mismo o cualquier combinación de lo precedente. El colágeno también puede derivar posiblemente de cualquier ubicación corporal de dichos animales, como puede ser piel, intestino, cartílago y así sucesivamente, siempre que se ajuste a los requisitos de biocompatibilidad o con el traslado a un enfoque in vivo. En una realización preferida, se utiliza colágeno tipo 1 de origen bovino.

El gel polimérico de la invención puede ser fabricado/procesado mediante cualquier método de fabricación adecuado conocido en la técnica que permita crear una red altamente interconectada de poro en el material, como puede ser, p. ej., (foto)litografía incluida la litografía de dos fotones, fundición y moldeo, impresión de 3D, impresión de inyección de tinta, lixiviación de porógeno, técnica de secado por congelación/congelación de emulsión, hidrogelación de ópalo inverso, criogelación, extrusión y unión de fibra o electrohilado, espuma de gas, separación de fase inducida térmicamente y así sucesivamente.

En una realización, el gel polimérico puede fabricarse mediante los procesos descendentes, como puede ser la impresión 3D. Esta técnica permite un control total sobre la distribución y el tamaño de los poros y del material de pared en geometrías casi arbitrarias y, por lo tanto, ofrece grandes posibilidades en términos de diseño y fabricación de órganos específicos de 3D.

En el marco de la presente descripción, una “estructura” es cualquier material tridimensional que tenga una arquitectura de marco, es decir, una estructura de soporte que generalmente comprende espacios huecos dentro de él. En términos generales, un material de estructura es una estructura de plantilla artificial, generalmente temporal, capaz de soportar la formación tridimensional de tejido corporal/órgano in vivo, ex vivo o in vitro. En este contexto, un material de estructura también se denomina “biomaterial” o “bioestructura”. Una bioestructura, entre otros, permite la adhesión celular y la migración, entrega y retiene células y factores bioquímicos, permite la difusión de nutrientes de células vitales y productos expresados, ejerce ciertas influencias mecánicas y biológicas para modificar el comportamiento de las células y así sucesivamente.

El material de estructura de la invención se ha concebido y fabricado con el fin de actuar como un agente de estructura biocompatible, no migratorio y no carcinógeno. El objetivo general era el desarrollo de un material que tuviera mejor eficacia a largo plazo, el cual puede estimular la infiltración de células anfitrionas y se integra con el tejido circundante una vez implantado en un anfitrión y, por lo tanto, desencadena la formación de neotejido mediante la promoción de un entorno bioactivo dentro del lugar de aplicación y dando lugar a una reparación funcional a largo plazo. El material de estructura descrito en la presente memoria aborda y resuelve, entre otros, este problema.

El material de estructura es, además, al menos en algunas partes de él, altamente poroso. En una realización preferida de la invención, los poros están todos interconectados con el fin de crear una red continua de material que puede actuar como un soporte físico viable para otros elementos, como pueden ser células o agentes bioactivos, al mismo tiempo que proporciona características clave adicionales a la estructura, como puede ser, su blandura/rigidez, facilidad de invasión celular/tisular y así sucesivamente. Por consiguiente, cuando están presentes, los diámetros de poro comprendieron preferiblemente entre aproximadamente 0,2 y 200gm en las áreas menos densas, con diámetros de poro más preferidos comprendidos entre aproximadamente 0,5 y 10 gm. Como será evidente para un experto en la técnica, estas áreas menos densas dentro de la estructura están presentes, debido a la rigidez no uniforme (y, por lo tanto, la densidad) de la estructura misma, en la porción más blanda (y, por lo tanto, menos densa), mientras que la porción más rígida (y, por lo tanto, más densa) de la misma se caracteriza por una porosidad insignificante, con poros, cuando están presentes, con un diámetro promedio inferior a 0,2 gm. Además, se prefiere que la porción más rígida de la estructura polimérica tenga un módulo de Young comprendido entre alrededor de 5 y 1500 kPa, mientras que los valores del módulo de Young preferidos para la porción más blanda abarcan entre alrededor de 0,1 y alrededor de 20 kPa. Sin embargo, en cualquier realización, está presente, al menos, una diferencia de 2,5 kPa en términos de módulo de Young entre la parte más blanda y más rígida de la estructura.

Con el fin de optimizar las propiedades mecánicas del material de estructura de la invención y, en algunos aspectos, su tasa de reabsorción/biodegradación, en las realizaciones preferidas se contempla que la estructura comprende un peso de polímero final en una forma seca de, al menos, el 60 % del peso total de la estructura (es decir, 60 % en peso, también llamada fracción de masa, en donde el 40 % restante o menos está sustancialmente compuesto de agua o de una disolución acuosa). Una fracción de masa de polímero adecuada depende, por ejemplo, del peso molecular del monómero, de la naturaleza del monómero, de la estrategia de entrecruzamiento y de la relación de polímeros. Sin embargo, este valor está estrechamente asociado a las etapas de fabricación del método para producir dicha estructura polimérica; de hecho, como se detallará mejor posteriormente, la fracción de masa de polímero final en la estructura puede incluso ser de, al menos, 52 % en peso después de que la estructura se vuelve a hinchar (rehidratar) en una disolución acuosa, al final del procedimiento de producción.

En cuanto a la posible tasa de degradación/reabsorción de la estructura tras la aplicación/implantación in vivo en un sujeto, esto depende principalmente de las propiedades fisicoquímicas del material polimérico del cual está compuesto, así como de factores adicionales, como puede ser el entrecruzamiento de los polímeros, la concentración del polímero, el sitio de implantación en un anfitrión y similares. La tasa de degradación/reabsorción puede calibrarse al ajustar dichos parámetros fisicoquímicos, como puede ser, por ejemplo, mediante entrecruzamiento de polímeros, la utilización de moléculas inhibidoras, al cambiar la densidad de polímeros, la cristalinidad y/o su distribución del peso molecular, al cambiar la porosidad de los materiales y así sucesivamente. En términos generales, el material de la estructura puede ser, al menos en parte y al menos en alguna porción del mismo, intrínsecamente biodegradable in vivo.

Las estructuras y los geles de la invención están preferentemente libres de células, pero pueden sembrarse in vitro o in vivo con células antes, durante y/o después de su producción. La estructura, si se va a utilizar para trasplantar células en un enfoque de ingeniería de tejido, comprende poros para permitir que la estructura se siembre con células y, por ejemplo, para permitir que las células proliferen. Por ejemplo, las estructuras se siembran al incubar la estructura en una disolución que contiene las células durante un período adecuado. Alternativamente, una estructura multicomponente se construye en etapas con cada capa sembrada antes de la colocación de otra capa o antes de adhesiones de otro componente preformado. Alternativamente, cada compartimiento de la estructura de varios compartimentos puede sembrarse por separado. En el material de la estructura pueden sembrarse diferentes tipos de células, p. ej., madre frente a diferenciada, y/o con varios fenotipos en términos de diferenciación, activación, estado metabólico o funcional. Las estructuras son adecuadas para utilizar con cualquier tipo de célula, preferiblemente que formen tejidos blandos, que uno puede querer trasplantar. Las células de este tipo incluyen, pero no se limitan a, varias poblaciones de células madre (células madre embrionarias diferenciadas en varios tipos de células), células madre adultas derivadas de médula ósea o tejido adiposo, células madre mesenquimales, células madre cardíacas, células madre pancreáticas, células neuronales, neurogliocitos, espermatozoides y ovocitos, células progenitoras endoteliales, células endoteliales de crecimiento avanzado, células dendríticas, células madre hematopoyéticas, células madre neurales, células satélite, células de población lateral. Las células de este tipo pueden incluir, pero no se limitan a, poblaciones de células diferenciadas, incluidos osteoprogenitoras y osteoblastos, condrocitos, queratinocitos para la piel, células epiteliales intestinales, células de músculo liso, células musculares cardíacas, células epiteliales, células endoteliales, células uroteliales, fibroblastos, mioblastos, condroblastos, osteoclastos, hepatocitos, células de las vías biliares, células de los islotes pancreáticos, tiroides, paratiroides, suprarrenales, hipotalámicas, hipofisarias, ováricas, testiculares, células de la glándula salival, adipocitos y combinaciones de las mismas. Por ejemplo, las células del músculo liso y las células endoteliales pueden utilizarse para estructuras musculares o tubulares, p. ej., estructuras destinadas a estructuras vasculares, esofágicos, intestinales, rectales o ureterales; los condrocitos se pueden utilizar en estructuras cartilaginosas; las células musculares cardíacas se pueden utilizar en estructuras cardíacas; los hepatocitos y las células de las vías biliares se pueden utilizar en estructuras hepáticas; los mioblastos se pueden utilizar en la regeneración muscular; las células epiteliales, endoteliales, fibroblastos y nerviosas se pueden utilizar en estructuras destinadas a funcionar como sustitutos o mejoras para cualquier variedad amplia de tipos de tejidos que contienen estas células. En general, las estructuras de la invención pueden comprender cualquier población celular competente para participar en la regeneración, la sustitución o la reparación de un tejido u órgano objetivo, particularmente (semi)blando o apenas-accesible, como pueden ser riñones, cerebro, meninges, pulmones, hígado, estómago, esfínteres, intestino, vejiga, tejidos del oído, cartílagos, piel, faringe, tráquea, vasos sanguíneos, uretra, uréter, vagina, suelo pélvico o páncreas.

Algunas propiedades mecánicas/funcionales de la estructura se pueden adaptar según las necesidades al cambiar las propiedades físicas o químicas de la misma (como puede ser, p. ej., la longitud de la cadena molecular del colágeno). En cuanto al colágeno, con el fin de optimizar estos parámetros y, en algunos aspectos, la tasa de reabsorción/biodegradación, en las realizaciones preferidas se contempla un peso molecular promedio para las moléculas de colágeno que componen sustancialmente la estructura comprendida entre alrededor de 30 y alrededor de 250 kDa. En cuanto al ácido hialurónico, se prefiere particularmente un peso molecular promedio comprendido entre alrededor de 50 kDa y alrededor de 2 MDa.

En la mayoría de las realizaciones preferidas, la estructura final no está entrecruzada o está mínimamente entrecruzada, con el fin de eliminar o reducir tanto como sea posible, p. ej., la toxicidad in vivo potencial asociada con algunos agentes entrecruzantes como puede ser glutaraldehído. Cuando se utiliza un proceso de entrecruzamiento, los agentes entrecruzantes y su cantidad pueden elegirse a discreción del operador, y un experto en la técnica podría prever fácilmente los parámetros de este tipo a partir de la práctica común. Al practicar el método de producción de la invención que se detallará posteriormente, es posible producir estructuras con este tipo de propiedades mecánicas y funcionales para permitir al mismo tiempo injertos exitosos en un anfitrión con facilidad de sutura, sin la necesidad impelente de utilizar agentes entrecruzantes. Para ser considerado exitoso, un injerto no debe mostrar complicaciones en el sitio del injerto, como puede ser la ausencia de estructuras abiertas como fístulas, estrechez o estenosis, y/o el área del tejido/órgano tratado debe verse histológicamente normal.

En algunas realizaciones, la estructura puede ser diferencialmente permeable y permitir el desplazamiento celular solo en ciertas áreas físicas de la misma. La permeabilidad de la composición de la estructura se regula, por ejemplo, mediante la ingeniería del material polimérico para obtener mayor o menor tamaño de poro, porosidad, densidad, entrecruzamiento de polímeros y/o viscoelasticidad.

El material de la estructura de la invención puede ser organizado, durante o después del método de producción, en una variedad de conformaciones geométricas, como pueden ser gránulos, microesferas, tira, bloque, toroide, capilar, parches, tubos, capas planas (por ejemplo, láminas delgadas) y así sucesivamente, la conformación final depende del contexto particular en el que se utilizará, y puede comprender en algunas realizaciones, al menos dos áreas o compartimientos que tienen diferentes propiedades estructurales/funcionales. Por ejemplo, las estructuras multicomponente se construyen, p. ej., en capas concéntricas, cada una de las cuales se caracteriza por diferentes propiedades fisicoquímicas (% polímero, % entrecruzamiento de polímero, composición química de la estructura, tamaño y/o arquitectura de poro, rigidez, porosidad, presencia o concentración diferente de agentes bioactivos, y demás). Cada nicho puede albergar una o más poblaciones celulares y/o tener un efecto específico en ellas, p. ej., al promover o inhibir una función celular específica, proliferación, diferenciación, migración y así sucesivamente. Una configuración de este tipo es particularmente útil para mantener durante largos períodos la “pluripotencialidad” de una población de células, mientras que simultáneamente empuja las células hijas a que se multipliquen rápidamente y se diferencien adecuadamente para la participación en la regeneración del tejido.

Una compartimentación del dispositivo puede obtenerse mediante procesos racionales de diseño y fabricación con diferentes composiciones o concentraciones de composiciones para cada compartimento. Por ejemplo, una población de células madre puede encapsularse dentro de hidrogeles, con técnicas de encapsulación estándar. Alternativa o adicionalmente, se pueden formar dos áreas o compartimentos diferentes dentro de la bioestructura que contiene factores distintos (p. ej., morfógenos, factores de crecimiento, ligandos de adhesión), o el material en una forma distinta (p. ej., propiedades mecánicas variables o porosidad). En algunas realizaciones, los compartimientos pueden fabricarse individualmente y, luego, acoplarse operativamente el uno al otro con cualquier método apropiado conocido en la técnica, como puede ser la utilización de un adhesivo o la explotación de la adhesividad intrínseca de cada compartimiento, polimerización o entrecruzamiento de un compartimiento a otro y así sucesivamente. La estructura puede diseñarse para tener un número de compartimientos o áreas en las cuales las células entran en paralelo y se distribuyen según sus características (p. ej., tamaño o movilidad), atraviesan en serie todos o algunos de los compartimientos, o una combinación de ambos. Los diferentes compartimentos pueden incluso interpretarse para inducir distintos destinos para las células contenidas durante el paso en ellos.

Durante o después del proceso de fabricación, el material de la estructura se puede funcionalizar con elementos adicionales como pueden ser, por ejemplo, moléculas bioactivas. Dichos elementos se pueden recubrir o incrustar en la bioestructura con cualquier medio adecuado conocido en la técnica, ya sea de forma homogénea o no homogénea y pueden proporcionar propiedades funcionales adicionales al material, como puede ser la biodegradación mejorada/reducida, la estabilización física, la actividad biológica y similares. Tal y como se utiliza en la presente memoria, una “molécula bioactiva”, así como un “compuesto (bio)activo” o “agente terapéutico”, es cualquier agente activo que tenga un efecto sobre un organismo, tejido o célula vivos. La expresión se utiliza en la presente memoria para referirse a cualquier compuesto o entidad que altera, inhibe, activa o afecta de otra manera a eventos biológicos o químicos.

Un experto en la técnica apreciará que una variedad de compuestos bioactivos se puede utilizar dependiendo de las necesidades. Los agentes terapéuticos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, una molécula pequeña, un factor de crecimiento, una proteína, un péptido, una enzima, un anticuerpo o cualquier derivado del mismo (como pueden ser, p. ej., anticuerpos multivalentes, anticuerpos multiespecíficos, scFvs, scFvs bivalentes o trivalentes, triacuerpos, minicuerpos, nanocuerpos, diacuerpos, etc.), un antígeno, una secuencia de ácido nucleico (p, ej., ADN o ARN), una hormona, un agente antiinflamatorio, un agente antivírico, un agente antibacteriano, una citocina, un oncogén, un supresor tumoral, un receptor transmembrana, un receptor de proteínas, una proteína sérica, una molécula de adhesión, una molécula lipídica, un neurotransmisor, una proteína morfogenética, un factor de diferenciación, un analgésico, moléculas orgánicas, partículas metálicas, agentes radioactivos, polisacáridos, una proteína de matriz y cualquier fragmento funcional o derivado (quimérico) de lo anterior, así como cualquier combinación de los mismos. Por “fragmento funcional” se entiende en la presente memoria cualquier porción de un agente activo capaz de ejercer su actividad fisiológica/farmacológica. Por ejemplo, un fragmento funcional de un anticuerpo podría ser una región Fc, una región Fv, una región Fab/F(ab')/F(ab')², y así sucesivamente.

Los compuestos bioactivos se pueden añadir al material de la estructura o a los geles poliméricos al utilizar cualquier método adecuado conocido en la técnica, como puede ser la absorción de superficie, la inmovilización física, p. ej., al utilizar un cambio de fase para atrapar la sustancia en el material de la estructura y similares. Por ejemplo, un factor de crecimiento puede mezclarse con una composición polimérica (p. ej., colágeno) mientras se encuentra en una fase acuosa o líquida y, después de un cambio en las condiciones ambientales (p. ej., pH, temperatura, concentración de iones), el líquido se vuelve gel o se solidifica y, de ese modo, atrapa la sustancia bioactiva. Alternativamente, el acoplamiento covalente, p. ej., la utilización de alquilantes o acilantes, se utiliza para proporcionar una presentación estable y a largo plazo de una sustancia bioactiva en la estructura en una conformación definida. Alternativamente, se puede utilizar la adsorción no covalente, por ejemplo, electroestática, hidrófoba, dipolo-dipolo, enlace de hidrógeno, fisisorción y similares. En una realización adicional o alternativa, las moléculas bioactivas pueden encapsularse dentro de nano/micro esferas o gránulos incluidos dentro de la estructura y/o un gel polimérico durante o después de una etapa de fabricación. Los nano/micro gránulos especialmente adecuados son los descritos en la solicitud de patente europea EP15193284.5, que se incorporan en la presente memoria en su totalidad por referencia.

El material de estructura descrito en la presente memoria es útil en el tratamiento de una variedad de enfermedades, trastornos y defectos donde la intervención quirúrgica o un enfoque de ingeniería de tejido puede ser una solución terapéutica adecuada. Esto es particularmente cierto para los tejidos blandos y el material de la estructura puede, por lo tanto, utilizarse en una variedad de procedimientos quirúrgicos así como para propósitos cosméticos y para el tratamiento o la prevención de una plétora de condiciones patológicas. El material de la estructura de los resultados de la invención particularmente convenientes para tratar tejidos u órganos como componentes del tracto genitourinario, incluidos riñón, vejiga, uretra, uréter, tejido vaginal y del suelo pélvico, un vaso sanguíneo (incluidas grandes venas y arterias), un músculo, un cartílago, piel, hígado, una porción del ojo, como puede ser córnea, conjuntiva o esclerótica, un componente del sistema nervioso central (SNC) o del sistema nervioso periférico (SNP) que incluye tejidos cerebrales o meníngeos, tráquea, esófago, pulmones, estómago, corazón, esfínteres, páncreas, intestino, faringe o tejido del oído interno.

La estructura generalmente se trasplanta en o cerca de un tejido objetivo, se introduce en o sobre un tejido corporal/órgano de un sujeto o un anfitrión que utiliza una variedad de métodos y herramientas conocidas en la técnica, preferiblemente mediante dispositivos y procedimientos quirúrgicos mínimamente invasivos.

El término “sujeto” o “anfitrión”, tal y como se utiliza en la presente memoria, se refiere a los animales, en particular a los mamíferos. Por ejemplo, los mamíferos contemplados por la presente invención incluyen humanos, primates, mascotas, animales domésticos, como puede ser ganado, ovejas, cerdos, caballos, conejos, roedores y similares.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, “tratamiento”, “tratar” y similares generalmente significan obtener un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado. El efecto puede ser profiláctico en términos de prevención o prevención parcial de una enfermedad, síntoma o condición de la misma y/o puede ser terapéutico en términos de una cura parcial o completa de una enfermedad, condición, síntoma o efecto adverso atribuido a la enfermedad. El término “tratamiento” o “tratar”, tal y como se utiliza en la presente memoria abarca cualquier tratamiento de una enfermedad en un animal, especialmente en un mamífero, más particularmente un ser humano, e incluye: (a) inhibir la enfermedad, es decir, detener su desarrollo; o (b) aliviar la enfermedad, es decir, causar la regresión de la enfermedad y/o sus síntomas o condiciones, como puede ser la mejora o la reparación del daño. El término “prevención” o “prevenir” se refiere a obstaculizar, bloquear o evitar que una enfermedad se presente en un sujeto el cual puede estar, por cualquier razón, predispuesto a la enfermedad, pero que aún no se ha diagnosticado, por ejemplo, a partir de los antecedentes familiares, el estado de salud o la edad.

Inicialmente, el método para producir la estructura de la invención prevé una primera etapa de secado rápido mediante una compresión mecánica de un gel polimérico, preferiblemente hidrogel, capa (Figura 1A). Se ha evaluado que esta primera etapa de compresión mecánica permite lograr una micro/nano estructura no uniformemente rígida del gel y, por consiguiente, de la estructura final. Al trabajar con capas de gel polimérico en forma de láminas, la compresión mecánica se realiza generalmente mediante la aplicación de una fuerza de compresión lineal o de rodadura, la cual debe ser ortogonal a la superficie plana de la lámina. Esta última se coloca, p. ej., en una malla de nailon colocada en papel de seda para aumentar la absorción de agua tras la fuga después de la compresión. Cuando se trabaja con capas de gel polimérico ya en forma de tubos (Figura 1B), estos últimos pueden enrollarse contra un tejido adsorbente, con o sin, p. ej., una malla de nailon colocada entre ellos, p. ej., mediante una varilla de vidrio o, de lo contrario, un mandril cilíndrico colocado dentro del lumen del tubo, hasta que no se vea más agua en el papel de seda, por ejemplo, al hacer 10 revoluciones de alrededor de 30 segundos cada una en el papel de seda. En algunas realizaciones, se puede realizar una etapa adicional de la filtración para aspirar mecánicamente el agua de un filtro en contacto con el lumen. Las capas simples poliméricas tubulares se pueden obtener al verter una disolución precursora de gel polimérico en un molde sustancialmente cilíndrico que comprende en él un soporte retirable, coaxial alargado (p. ej., una varilla de vidrio) de cualquier diámetro adecuado para crear un espacio vacío, el lumen del tubo, sobre la formación del gel polimérico (p. ej., mediante la gelificación de la disolución precursora; Figura 2).

Una característica clave del método según la invención depende de una segunda etapa de secado lento del gel polimérico con el fin de obtener la estructura polimérica de una sola capa final. Esta etapa contempla la utilización de técnicas, como puede ser filtración de agua o preferiblemente secado al aire, así como combinaciones de ellas, para reducir gradual y suavemente el contenido de agua de un gel polimérico hasta una fracción de masa de polímero en la estructura final de, al menos, 60 % en peso. Los medios preferidos de filtración de agua pueden ser, por ejemplo, medios de diálisis. En la realización más preferida, el método se caracteriza por que la segunda etapa de secado lento se realiza mediante secado al aire bajo gravedad durante, al menos, 1 hora, preferiblemente durante, al menos, 4 horas. El proceso de secado al aire se realiza preferiblemente a temperatura ambiente (es decir, entre alrededor de 20° y alrededor de 30°C), y en algunas realizaciones en una atmósfera controlada para mantener la esterilidad de la estructura final. Una vez obtenida una estructura polimérica de una sola capa, esta puede posiblemente envolverse de manera circunferencial alrededor de un soporte adecuado de cualquier conformación, como puede ser, por ejemplo, una varilla de vidrio renovable, con el fin de realizar una estructura tubular de colágeno que comprende un lumen en ella.

Las estructuras de secado lento obtenidas presentan características peculiares tanto en términos de valores mecánicos cuando se suturan en un enfoque quirúrgico, así como para lo que concierne a la regeneración y cicatrización de tejidos en un anfitrión, en comparación con las disoluciones conocidas en la técnica. De hecho, las estructuras de la invención ofrecen un excelente compromiso entre estas dos cuestiones, que deben considerarse contemporáneamente en lo que respecta a las clínicas. Los materiales naturales que se utilizan clínicamente en la actualidad que se venden como disoluciones listas para utilizar se incluyen, por ejemplo, estructuras de colágeno de secado por congelación, estructuras de colágeno entrecruzadas y estructuras derivadas de tejidos humanos y animales descelularizados. Estos productos se diseñaron con una mentalidad quirúrgica para ser fáciles de utilizar quirúrgicamente. Las estructuras de la invención, por otro lado, son lo suficientemente fuertes para ser suturadas mientras que proporcionan en paralelo una matriz celular “más amigable” en comparación con las disoluciones comercialmente disponibles, es decir, estructuras fáciles de utilizar por los cirujanos y rígidas con respuestas celulares deficientes. A modo de ejemplo, los materiales acelulares tubulares comercialmente disponibles no funcionan en el reemplazo uretral de defectos de longitud mayores de 1 cm; si las células se colocan dentro de estos materiales comerciales disponibles pueden lograr injertos exitosos para los pacientes. Por otro lado, las presentes estructuras fabricadas de colágeno según los métodos de la invención muestran resultados exitosos con injertos tubulares de 1 cm de largo o aún más grandes (p. ej., 2 cm de largo) sin la adición de ninguna célula. Del mismo modo, las estructuras planas, como pueden ser láminas o parches de un tamaño de, al menos, 1 cm2, se pueden utilizar in vivo con éxito.

En este contexto, sin estar ligados a esta teoría, los presentes inventores observaron que los tejidos de donantes muy estables mecánicamente, los cuales se han descelularizado o desvitalizado para no provocar respuesta inmunitaria en los pacientes anfitriones del injerto, son demasiado rígidos, o de lo contrario no son lo suficientemente blandos, para dar una repoblación funcional de la estructura injertada por las células anfitrionas. La extrema complejidad interna y/o densidad crea una especie de “desajuste de la matriz extracelular (ECM)” entre la matriz injertada y el lugar de regeneración lesionado/tisular. Este desajuste probablemente sea la causa de un crecimiento infiltrante de células mal favorecidas, lo que conduce al fracaso de la terapia para los pacientes. La estructura de la invención apunta, en cambio, a un “nicho mecánico y de complejidad de ECM” novedoso: es estructuralmente menos compleja, menos rígida, menos densa y, por lo tanto, más fácil de ser invadida por las células anfitrionas endógenas sin dar una respuesta inflamatoria fuerte y, por lo tanto, favorece un perfil de regeneración mejor y acelerado que otros materiales, pero todavía apta para suturar fácilmente. El método de la invención permite producir estructuras que apuntan a este “nicho mecánico y de complejidad de ECM” específico.

Por ejemplo, en el caso del tracto urinario, la rigidez superficial de la estructura favorece una cobertura urotelial mejor y más rápida, la cual probablemente se vincula a un mejor entorno protector para la regeneración del tejido suburotelial (como la regeneración muscular y vascular). Sin estar necesariamente ligado a esta teoría, al menos una capa en la estructura deberá estar cerca del tejido adulto natural en términos de propiedades mecánicas para tener una mejor experiencia quirúrgica, pero debe protegerse un componente importante para que sea blando. Esto podría explicar por qué los tejidos naturales descelularizados, que tienen propiedades mecánicas muy cercanas a las de los tejidos naturales adultos, fallan o no tienen resultados perfectos; que imitan la mecánica de los tejidos de desarrollo temprano, al menos, en porciones de un material de la estructura, podrían ser fisiológicamente más apropiados y “mejor percibido” por un anfitrión receptor. En este contexto, en las realizaciones preferidas de la invención, la porción más rígida de la estructura polimérica debe tener una fuerza de retención de, al menos, 0,2 N en la sutura, preferiblemente de, al menos, 0,4 N, incluso más preferiblemente con valores comprendidos entre alrededor de 1,5 y 2 N.

En términos de comportamiento de la hinchazón, el cual también refleja las propiedades mecánicas de la estructura de la invención (el contenido de agua en las estructuras poliméricas se sabe que se relaciona con las propiedades mecánicas, es decir, cuanto más contenido de agua menos fuerza mecánica), sorprendentemente los inventores han evaluado que las estructuras producidas con los presentes métodos, cuando se sumergen en una disolución acuosa, como puede ser solución salina tamponada con fosfato (PBS), se vuelven a hinchar y aumentan su contenido de agua solo hasta un máximo de 12 % en peso en estado en equilibrio. En comparación con otras técnicas de fabricación, esta tiene importantes ventajas en términos de propiedades funcionales y mecánicas de la estructura final: al aplicar una compresión mecánica rápida a un primer gel polimérico seguido de una etapa de secado lento se puede lograr fácilmente una estructura lista para suturar. En comparación, un gel de colágeno secado por congelación se hincha y aumenta su contenido de agua a más del 20 % en peso (Figura 5B). El gel de colágeno comprimido mecánicamente se hincha y aumenta su contenido de agua solo en un 0,7 %. Sustancialmente, el método desarrollado permite controlar mejor el comportamiento de rehinchazón de la estructura obtenida y, luego, en última instancia las propiedades mecánicas y funcionales ideales para la cirugía.

Esta propiedad representa además una gran ventaja para lo que concierne al almacenamiento y el embalaje de la estructura de la invención, ya que podría proporcionarse a un cirujano como una disolución existente y lista para utilizar. De hecho, se puede imaginar una estructura polimérica de la invención preparada y empaquetada en una disolución líquida/acuosa ya adaptada para utilizar en un enfoque in vivo, sin ningún cambio en sus propiedades en estado en equilibrio, incluso cuando está hidratada. El “estado en equilibrio de rehinchazón” se define como el estado en términos de contenido de agua de la estructura polimérica producida con los métodos de la invención en la cual las propiedades mecánicas y el contenido de agua de dicha estructura no cambia más.

Con el objetivo de acentuar las diferencias mecánicas entre dos áreas diferentes de una estructura polimérica de la invención, los inventores desarrollaron un método muy ingenioso y elegante para producir estructuras no uniformemente rígidas, dicho método se caracteriza por que comprende las siguientes etapas:

a) proporcionar una sola capa de un gel de material polimérico comprimido mecánicamente envuelto alrededor de un soporte;

b) sumergir una porción de la capa de gel polimérico envuelto en soporte en una disolución acuosa y, al mismo tiempo, dejar otra porción de secado al aire bajo gravedad durante una cantidad determinada de tiempo;

c) voltear la porción de la capa de gel polimérico previamente sumergida en la disolución acuosa sobre la porción secada al aire; y

d) opcionalmente secar al aire bajo gravedad ambas capas durante una cantidad de tiempo determinado en donde, al menos, una capa de la estructura polimérica obtenido tiene una fracción de masa de polímero de, al menos, 60 % en peso. Este método, renombrado por los inventores “la técnica de calcetín” y que se muestra en las Figuras 4 y 5, puede aplicarse, con las modificaciones pertinentes, a geles poliméricos formados, p. ej., al verter una disolución de precursor de gel polimérico en un molde sustancialmente cilíndrico que comprende un soporte alargado coaxial en él para crear una sola capa tubular de gel polimérico, y gelificarlo y comprimirlo mecánicamente. Un objeto adicional de la invención se refiere a un kit que comprende un contenedor, una solución acuosa y la estructura polimérica de la invención. Los tres componentes se pueden proporcionar separados dentro del kit, o el recipiente puede incluir ya la disolución líquida y también posiblemente la estructura polimérica en una forma que se ha vuelto a hinchar, en estado en equilibrio. Preferiblemente, todo el kit está esterilizado o se puede esterilizar mediante haz de electrodos, rayos gamma o radiaciones de rayos X.

Ejemplos

Los presentes ejemplos, no limitantes, presentan una realización del método de fabricación de una estructura tubular de colágeno no uniformemente rígida según la invención. El método puede adaptarse fácilmente para hacer estructuras con conformación de lámina y cúpula, y las dimensiones y la conformación de la estructura de colágeno dependen solo del molde utilizado. Para la fabricación de una estructura tubular de colágeno no uniformemente rígida con un lumen interno de 3 mm, 8,5 ml de disolución líquida de colágeno bovino disoluble en ácido (5 mg/ml, Symatese, Francia) se mezclan con 0,8 ml 10x MEM (Invitrogen) y se neutralizan mediante la adición de aproximadamente 1,85 ml de 0,1M NaOH. El volumen exacto de NaOH que se debe añadir se determina mediante la observación de un cambio de color de amarillo a rosa. La disolución de colágeno neutralizada se vierte en un molde con conformación tubular de acero inoxidable (longitud 70 mm, diámetro interno 12 mm). El lumen de la estructura tubular de colágeno está formado por una varilla de vidrio (diámetro 3 mm) colocada dentro del molde tubular. La gelificación del colágeno tiene lugar a temperatura ambiente durante 15 min. Después de la gelificación, el tubo de colágeno se retira del molde, pero se mantiene en la varilla de vidrio. Este tubo de colágeno gelificado es la matriz inicial para producir estructuras de colágeno tubular no uniformes (paredes externas más densas y un lado interno menos denso).

El gel tubular de colágeno se comprime mecánicamente al enrollarse alrededor de su propio eje, para asegurar una compresión y drenaje desiguales del agua dentro de la estructura final. El gel de colágeno se enrolla sobre una malla de nailon colocada en cinco capas de papel de seda de doble capa (Weita, Arlesheim, Suiza) hasta que no salga más agua. Posteriormente, se realiza una etapa de secado adicional al exponer el tubo de colágeno al aire a temperatura ambiente durante 1 a 24 horas. La sequedad deseada corresponde al 0,5-40 % del contenido inicial de agua del gel, preferiblemente 18-22 % de agua. El peso del gel de colágeno después de la gelificación representa el 100 % del agua. El porcentaje de agua en cada estructura de colágeno seco se calcula al tomar la diferencia del peso del gel de colágeno antes y después del secado:

% de agua = 1 -[(peso antes del secado-peso después del secado)/peso antes del secado]

Una vez que el tubo de colágeno haya alcanzado la sequedad deseada, el tubo se coloca en PBS (pH 7,4) durante 3 días con el fin de volver a hincharlo a un contenido de agua en estado en equilibrio. El contenido de agua de la estructura de colágeno final está en el intervalo de 5 a 48 %, preferiblemente 24-30 % del contenido de agua.

Para la fabricación de un tubo de colágeno multicapa mediante la “técnica de calcetín”, la mitad de un tubo secado con una primera etapa de rodadura como se ha descrito anteriormente se coloca en un baño de rehidratación (PBS, pH 7,4) durante 1 a 60 minutos, preferiblemente durante 30 minutos. La mitad del tubo rehidratado se coloca sobre la porción seca del tubo o la porción seca se empuja debajo de la parte rehidratada para crear un tubo multicapa. Se pueden obtener tubos multicapa (con más de dos capas) mediante la iteración de las etapas descritas anteriormente.

La resistencia a la rotura por tracción (UTS) y el módulo de Young se determinaron en condiciones de tensióndeformación con una máquina de tracción Instron (Norwood, MA, EE. UU.), al aplicar una carga de 250 N con una velocidad de deformación de 1 mm/min hasta el punto de ruptura. Las muestras tubulares de 5 mm de longitud se extrajeron del lado de lumen en una dirección con ganchos con conformación en L colocados en el lumen. Los valores del módulo de Young se obtuvieron de la pendiente de la región lineal inicial de las curvas de tensióndeformación, mientras que la UTS se obtuvo de la resistencia por tracción máxima registrada.

Para determinar la densidad y porosidad del colágeno en la estructura, se realizó microscopía de exploración electrónica (SEM). Las muestras se fijaron con ácido tánico al 1 % y glutaraldehído al 1,25 %, luego se lavaron con cacodilato de 0,1 M y se deshidrataron en concentraciones de etanol crecientes antes del punto crítico de secado (CPD). Estaban recubiertas con oro/paladio y se visualizaron a una tensión de 10kV con un microscopio electrónico de exploración (SEM, XLF30, Philips). Para visualizar adicionalmente la densidad y porosidad del colágeno dentro de la estructura, se tiñeron secciones de corte fijadas en formol (4 % PFA) y en parafina (8gm de espesor) con anticuerpos anticolágeno tipo 1 (dilución 1:250, anticolágeno de conejo tipo 1, Abcam, Suiza). Se utilizaron los correspondientes anticuerpos secundarios AlexaFluor (Abcam, Suiza) para visualizar la distribución de colágeno tipo 1 bajo un microscopio LSM700 (Zeiss, Alemania).

Para determinar la capacidad de sutura in vitro, se realizó la anastomosis de dos tubos de colágeno producidos con suturas Vicryl 6.0®. Adicionalmente, para determinar la capacidad de sutura in vivo de los tubos producidos, al menos 9 conejos tuvieron una intervención quirúrgica de reemplazo uretral, donde se realizaron anastomosis dobles de extremo a extremo a la uretra natural con suturas interrumpidas (Viryl 6.0®). Los conejos se sacrificaron después de 1 y 3 meses. Posteriormente, se recolectaron y fijaron los penes de conejo en formol al 4 %, se incluyeron en parafina y se seccionaron en 8pm de espesor para tinción de hematoxilina-eosina. Las imágenes se tomaron con un microscopio Leica DM5500 (Alemania).

Para comprender el comportamiento de diferentes tipos de células (p. ej., células uroteliales y células del músculo liso) en varias estructuras basadas en colágeno con diferente rigidez y densidad de fibra de colágeno, se sembraron células uroteliales humanas que se transdujeron con lentivirus con GFP sobre estas estructuras de colágeno y se observó la morfología celular bajo un estereomicroscopio de fluorescencia (Leica). Las células humanas se colocaron en una gota de fibrina para controlar la distribución espacial de las células en el colágeno, y se visualizaron, entonces, las células en varios puntos temporales para verificar las opciones de destino de las células.

Resultados

En primer lugar, la compresión mecánica con secado al aire y solo secado al aire produce diferentes materiales, tal y como se muestra en la Figura 5A, también se tarda más tiempo en alcanzar diferentes estados secos solo para el material secado al aire en comparación con la compresión mecánica con secado al aire. Una compresión rápida produce menos rehinchazón en comparación con el otro método de secado lento. Tal y como se muestra en la Figura 5B, las estructuras de colágeno secadas con secado por congelación (FD), secado al aire (AD) o compresión mecánica con secado al aire (M-AD) se vuelven a hinchar cuando se colocan en condiciones de hidratación (FD seco: 1,3 % a rehinchazón de FD: 20 %, AD seco: 1,5 a rehinchazón de AD: 9,5 %, M-AD seca: 0,8 % a rehinchazón de M-AD con 5,2 % de contenido de agua). Sin embargo, la compresión mecánica (M) tiene una capacidad de hinchazón muy baja cuando se coloca en condiciones de hidratación (M seca: 47,6 % a rehinchazón de M: 48,3 % de contenido de agua). Adicionalmente, la rehinchazón de la estructura de colágeno comprimida mecánicamente más secada al aire puede controlarse por su estado seco, tal y como se muestra en la Figura 5C. Existe una relación lineal entre el estado seco y el estado de rehinchazón de las estructuras de colágeno producidas. La rehinchazón en la hidratación (en el baño de PBS) es un proceso rápido donde la mayor parte de la hinchazón se ha producido en los primeros 30 minutos (Figura 6). Después de 72 h se observa un estado en equilibrio de rehinchazón más estable en un entorno hidratante. Las propiedades mecánicas, el módulo de Young y la UTS de las estructuras de colágeno con diferentes contenidos de agua siguen una curva exponencial (Figura 7A y 7B). Tal y como se muestra en las Figuras 7C y 7D, el tubo de colágeno seco y que se volvió a hinchar a un 9,5 % de contenido de agua se sutura con facilidad en la uretra de conejos y de cabra (la uretra de cabra se muestra en la Figura 7D). También la estructura de colágeno que se volvió a hinchar con un contenido de agua del 45 % se sutura a la uretra de conejo y de perro (la intervención quirúrgica de la uretra de perro se observa en la Figura 7E). Clasificar lo que es compatible con suturas es difícil ya que depende en gran medida del cirujano y solo puede hacerse sobre una base empírica. Sin embargo, a partir de las propiedades mecánicas registradas y la opinión de los cirujanos al manipular los injertos de colágeno de diferente contenido de agua, un material que tiene un estado seco de, al menos, una capa de colágeno de no más del 40 % en peso de contenido de agua (es decir, al menos, el 60 % en peso de la fracción de masa de colágeno) se clasificó como compatible con sutura directamente después de que se volvió a hinchar en estado en equilibrio en una condición hidratante, cuando se produjo a partir de una disolución líquida de precursor de colágeno de mamíferos con un intervalo de concentración de colágeno comprendido entre 2,1 y 40 mg/ml.

El potencial de regeneración funcional alto de la estructura de la invención se realiza en un entorno quirúrgico donde tubos de colágeno producidos según los métodos de la invención se implantaron y suturaron en una uretra de conejo. Las estructuras de colágeno permanecen en el área suturada tal y como se muestra en una sección de histología de 1 mes después de la intervención quirúrgica (Figura 7E), las flechas negras muestran el colágeno no degradado de las partes restantes de las estructuras de colágeno). Después de 3 meses, no se puede visualizar más colágeno implantado por la histología, ya que las propias células de los conejos han remodelado el colágeno y poblado el área (Figura 7F).

Una observación crucial hecha por los inventores es que un procedimiento de secado lento crea una arquitectura de colágeno uniforme y homogénea en una micro y nanoescala (Figura 8B y 8D). Mientras que una estructura de colágeno secada por congelación produce una arquitectura no uniformada, no organizada con distribución aleatoria de agujeros (diámetro de 50-150gm) (Figura 8C y 8F) en micro y nanoescala. En comparación, si se combina una primera compresión mecánica seguida de una etapa de secado lento, esto produce una arquitectura de colágeno no uniforme, pero heterogénea y organizada en una micro y nanoescala, donde la superficie que está en contacto estrecho con la fuerza mecánica obtiene una estructura más densa en comparación con el lado interno (Figura 8A y 8C). En la Figura 9, la misma característica se muestra al utilizar inmunohistoquímica para visualizar el colágeno tipo 1.

En muchos estudios se informa que la rigidez del material, la densidad de la fibra y la porosidad influyen en las opciones de destino de las células y que los diferentes tipos de células se comportan de forma diferente al cambiar las propiedades del material. La Figura 10 muestra el comportamiento de las células uroteliales en respuesta a matrices de colágeno que difieren en rigidez. En una matriz de colágeno menos densa, las células uroteliales están menos en contacto con las vecinas y migran lejos de su posición inicial. Por otro lado, las células uroteliales sembradas en una estructura más densa permanecen más en contacto con las células vecinas y migran menos. Para aumentar adicionalmente la estabilidad mecánica y el potencial de crear materiales rígidos, no uniformes, con una opción de distribuir espacialmente factores de crecimiento y reactivos para modificar el colágeno en varias posiciones en una estructura, se desarrolló un método adicional, que se muestra en la Figura 3. Describe una “técnica de calcetín” que aprovecha el comportamiento de secado e hinchazón del colágeno descrito anteriormente. Se pueden realizar varias manipulaciones con el fin de obtener una estructura con capas simples o múltiples, al traccionar o empujar sobre una estructura húmeda sobre la otra. En la Figura 4 se muestra la técnica y la estructura final de un tubo de doble capa y de una sola capa, en donde el primero es claramente más estable ya que puede sostener su propio peso sin que colapse el lumen. Adicionalmente, los tubos producidos de esta forma también se pueden abrir mediante, p. ej., el corte de la cuchilla, lo que deriva en láminas de una sola capa o de múltiples capas, las cuales se pueden utilizar como parches para uso quirúrgico. En la Figura 4H se muestra una lámina de doble capa, originada a partir de un tubo abierto de doble capa con una tijera.

Adicionalmente, la bioactividad de las estructuras de colágeno no uniforme podría mejorarse mediante la adición de moléculas bioactivas al baño de rehidratación con una de las plataformas conocidas para unir eficazmente moléculas bioactivas al colágeno, lo que deriva en una liberación controlada de la estructura de colágeno.

Las estructuras de colágeno preparadas según el método descrito son muy útiles para la ingeniería de tejidos blandos o aplicaciones quirúrgicas de órganos/tejidos, como puede ser el sistema genitourinario (es decir, para el aumento de la vejiga, la reconstrucción vaginal y del suelo pélvico, la reconstrucción del uréter y/o de la uretra), para la ingeniería del tejido vascular, para la reparación del esófago o como parches para la reparación de hernia.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para producir una estructura polimérica no uniformemente rígida para utilizar en la ingeniería de tejido, diagnóstico o procedimientos quirúrgicos, caracterizado por que comprende las siguientes etapas:

a) proporcionar, al menos, una capa de un gel de material polimérico;

c) realizar una segunda etapa de secado lento del gel hasta alcanzar una fracción de masa de material polimérico de, al menos, 60 % en peso, dicha etapa se realiza con medios de filtración de agua, secado al aire o cualquier combinación de los mismos;

2. El método de la reivindicación 1, caracterizado por que la filtración de agua se realiza mediante diálisis.

3. El método de la reivindicación 1 o 2, que comprende adicionalmente la etapa de envolver circunferencialmente la estructura polimérica alrededor de un soporte con el fin de tener una estructura polimérica tubular que comprende un lumen.

4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en donde dicha capa de gel de material polimérico es tubular y se obtiene al verter primero una disolución de precursor de gel polimérico en un molde sustancialmente cilíndrico que comprende en él un soporte alargado coaxial para crear dicha capa tubular simple de gel de material polimérico.

5. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por que la estructura polimérica está libre de células.

6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado por que el material polimérico es material polimérico natural o un material polimérico derivado de una matriz extracelular (ECM).

7. El método de la reivindicación 6, caracterizado por que el material polimérico natural o material polimérico derivado de ECM es gelatina, elastina, laminina, colágeno, agar/agarosa, quitosán, fibrina, proteoglicanos, un poliaminoácido o sus derivados, preferiblemente polilisina o gelatina metilcelulosa, carbometilcelulosa, polisacáridos y sus derivados, preferiblemente glicosaminoglicanos, como puede ser ácido hialurónico, condroitinsulfato, dermatansulfato, heparansulfato, heparina, queratansulfato o alginato, o cualquier combinación de lo precedente.

8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado por que no se añaden agentes entrecruzantes al gel de material polimérico.

9. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 caracterizado por que el gel polimérico de la etapa a) se obtiene de una disolución de precursor de gel de colágeno que tiene una concentración de colágeno de, al menos, 2,1 mg/ml, preferiblemente entre 2,5 y 40 mg/ml.

10. Una estructura polimérica no uniformemente rígida para utilizar en la ingeniería de tejido, diagnósticos o procedimientos quirúrgicos producidos según los métodos de las reivindicaciones 1-9, dicha estructura se caracteriza por que tiene, al menos, una capa de material polimérico que tiene una fracción de masa polimérica de, al menos, 52 % en peso en estado de equilibrio tras la rehinchazón, con una estructura polimérica más densa en la superficie y menos densa en el núcleo de la estructura.

11. La estructura polimérica no uniformemente rígida de la reivindicación 10, caracterizada por que es apta para sutura.

12. La estructura polimérica no uniformemente rígida de la reivindicación 10 u 11, caracterizada por que comprende un agente bioactivo.

13. Un kit que comprende:

a) un recipiente;

b) una disolución acuosa; y

c) la estructura polimérica no uniformemente rígida de las reivindicaciones 10 a 12.

14. El kit de la reivindicación 13, caracterizado por que se esteriliza mediante haz de electrodo, radiación de rayos gamma o radiación de rayos X.