ES2867924T3 - Diagnóstico de tumores malignos linfoides y detección de enfermedad residual mínima - Google Patents

Abstract

Un método para detectar enfermedad residual mínima para un tumor maligno hematológico linfoide en un sujeto después de la terapia, comprendiendo el método (a) amplificación de ADN extraído de una primera muestra en una reacción en cadena de polimerasa múltiple (PCR) utilizando cebadores del segmento V y J para producir una multiplicidad de moléculas de ADN reordenado amplificado que comprenden cada una una región que codifica CDR3 de Ig, en donde la primera muestra se ha obtenido del sujeto antes de la terapia y comprende una pluralidad de células hematopoyéticas linfoides, (b) secuenciación de alto rendimiento de dicha multiplicidad de moléculas de ADN reordenado amplificado para determinar las frecuencias relativas de regiones que codifican CDR3 de Ig reordenadas de manera única en la primera muestra, identificando así la región que codifica CDR3 de Ig reordenada de manera única de uno o más clones de células B malignas, (c) amplificación de ADN extraído de una segunda muestra en una reacción en cadena de polimerasa múltiple (PCR) utilizando los cebadores del segmento V y J para producir una multiplicidad de moléculas de ADN reordenado amplificado comprendiendo cada una una región que codifica CDR3 de Ig, en donde la segunda muestra se ha obtenido del sujeto después de la terapia y comprende una pluralidad de células hematopoyéticas linfoides, y (d) secuenciación de alto rendimiento de dicha multiplicidad de moléculas de ADN reordenado amplificado producidas a partir de la segunda muestra para determinar la frecuencia relativa de la región que codifica CDR3 de Ig reordenada de manera única de los uno o más clones de células B malignas en la segunda muestra, en donde la presencia de la región que codifica CDR3 de Ig reordenada de manera única de los uno o más clones de células B malignas a una frecuencia relativa de al menos 1 en 105 regiones que codifican CDR3 de Ig indica enfermedad residual mínima para el tumor maligno hematológico linfoide; en donde la PCR múltiple comprende adicionalmente una pluralidad de oligonucleótidos molde que tiene una pluralidad de secuencias de oligonucleótidos de fórmula general 5'-U1-B1-V-B2-R-B3-J-B4-U2-3' [I] en donde (i) V es un polinucleótido que comprende al menos 20, 30, 60, 90, 120, 150, 180, o 210, y no más de 1000, 900, 800, 700, 600 o 500 nucleótidos contiguos de una secuencia génica que codifica la región variable (V) del receptor inmunitario adaptativo, o el complemento de la misma, y en cada una de la pluralidad de secuencias de oligonucleótidos V comprende una secuencia oligonucleotídica única, (ii) J es un polinucleótido que comprende al menos 15-30, 31-60, 61-90, 91-120, o 120-150, y no más de 600, 500, 0, 300 o 200 nucleótidos contiguos de una secuencia génica que codifica la región de empalme (J) del receptor inmunitario adaptativo, o el complemento de la misma, y en cada una de la pluralidad de secuencias de oligonucleótidos J comprende una secuencia oligonucleotídica única, (iii) U1 no es nada o comprende un oligonucleótido que tiene una secuencia que se selecciona entre (1) una primera secuencia de oligonucleótido adaptador universal, y (2) una primera secuencia oligonucleotídica específica de la plataforma de secuenciación que está conectada y posicionada en 5' con respecto a la primera secuencia de nucleótido adaptador universal, (iv) U2 no es nada o comprende un oligonucleótido que tiene una secuencia que se selecciona entre (1) una segunda secuencia de oligonucleótido adaptador universal, y (2) una segunda secuencia oligonucleotídica específica de la plataforma de secuenciación que está conectada y posicionada en 5' con respecto a una segunda secuencia de oligonucleótido adaptador universal, (v) B1, B2, B3, y B4 son cada uno independientemente nada o cada uno comprende un oligonucleótido B que comprende una secuencia código de barras de oligonucleótido de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25, nucleótidos contiguos, en donde en cada una de la pluralidad de secuencias de oligonucleótidos B comprende una secuencia oligonucleotídica única que identifica de forma única, como una 0 combinación pareada, (1) la secuencia oligonucleotídica V única de (i) y (2) la secuencia oligonucleotídica J única de (ii), y (vi) R no es nada o comprende un sitio de reconocimiento para enzimas de restricción que comprende una secuencia oligonucleotídica que está ausente de (i) - (v).

Description

DESCRIPCIÓN

Diagnóstico de tumores malignos linfoides y detección de enfermedad residual mínima

Antecedentes

Campo técnico

La presente descripción se refiere en general a la cuantificación altamente sensible de la representación relativa de células inmunitarias adaptativas que tienen un reordenamiento del gen que codifica el receptor de células T (TCR) o inmunoglobulina (Ig) concreto (por ejemplo, clonotipo), en muestras obtenidas de un sujeto antes y/o después de un tratamiento terapéutico. La determinación de las frecuencias relativas de tales clonotipos se puede utilizar para diagnosticar ciertos tumores malignos hematológicos linfoides y otros trastornos. Además, la determinación de las frecuencias relativas de tales clonotipos después del tratamiento terapéutico proporciona una detección exquisitamente sensible de enfermedad residual mínima (ERM).

Descripción de la técnica relacionada

El sistema inmunitario adaptativo protege a los organismos superiores contra infecciones y otros eventos patológicos que pueden ser atribuibles a sustancias foráneas, utilizando receptores inmunitarios adaptativos, las proteínas de reconocimiento específicas de antígenos que son expresadas por células hematopoyéticas del linaje linfoide y que son capaces de distinguir las moléculas propias de las no propias en el anfitrión. Estos linfocitos se pueden encontrar en la circulación y los tejidos de un anfitrión, y se ha descrito su recirculación entre sangre y vasos linfáticos, incluida su extravasación a través de vénulas endoteliales altas de nódulos linfáticos, así como en sitios de infección, inflamación, lesión tisular y otros insultos clínicos. (Véase, por ejemplo, Stein et al., 2005 Immunol. 116:1-12; DeNucci et al., 2009 Crit. Rev. Immunol. 29:87-109; Marelli-Berg et al., 2010 Immunol. 130:158; Ward et al., 2009 Biochem. J.

418:13; Gonzalez et al., 2011 Ann. Rev. Immunol. 29:215; Kehrl et al., 2009 Curr. Top. Microb. Immunol. 334:107; Steinmetz et al., 2009 Front. Biosci. (Schol. Ed.) 1:13.)

En consecuencia, la naturaleza dinámica del movimiento de los linfocitos a través de un organismo anfitrión se refleja en cambios en la distribución cualitativa (por ejemplo, especificidad por el antígeno del receptor inmunitario adaptativo expresado clonalmente (inmunoglobulina o receptor de células T), célula T frente a célula B, célula T colaboradora (T^h) frente a célula T reguladora (T^reg), célula T efectora frente a célula T de memoria, etc.) y cuantitativa de linfocitos entre tejidos, como una función de los cambios en el estado inmunitario del anfitrión.

El sistema inmunitario adaptativo emplea varias estrategias para generar un repertorio de receptores de antígenos de células T y B con diversidad suficiente para reconocer el universo de posibles patógenos. Los linfocitos B maduran para expresar anticuerpos (inmunoglobulinas, Ig o Ig, también conocidas como receptores de células B, BCR) que se presentan como heterodímeros de un polipéptido de cadena pesada (H) o ligera (L), mientras que los linfocitos T expresan receptores de células T (TCR) heterodiméricos. La capacidad de las células T para reconocer el universo de antígenos asociados con diversos cánceres u organismos infecciosos es conferida por su receptor de antígeno de células T (TCR), que es un heterodímero que comprende una cadena a (alfa) y una cadena p (beta), o una cadena y (gamma) y una cadena ó (delta). Las proteínas que componen estas cadenas están codificadas por ADN, que emplea un mecanismo único para generar la tremenda diversidad del TCR. Este receptor de reconocimiento inmunitario de múltiples subunidades se asocia con el complejo CD3 y se une a los péptidos presentados por las proteínas de clase I y II del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) en la superficie de las células presentadoras de antígeno (APC). La unión de TCR al péptido antigénico en la APC es un evento central en la activación de células T, que se produce en una sinapsis inmunológica en el punto de contacto entre la célula T y la APC.

Cada péptido de TCR contiene regiones determinantes de complementariedad (CDR) variables, así como regiones estructurales (FR) y una región constante. La diversidad de secuencias de las células T ap está determinada en gran parte por la secuencia de aminoácidos de los bucles de la tercera región determinante de la complementariedad (CDR3) de los dominios variables de la cadena a y p, cuya diversidad es el resultado de la recombinación entre segmentos de genes variables (V^p), de diversidad (Dp), y de empalme (Jp) en el locus de la cadena p, y entre segmentos de genes V^a y J^a análogos en el locus de la cadena a, respectivamente. La existencia de múltiples de tales segmentos de genes en los loci de la cadena a y p de TCR permite codificar una gran cantidad de secuencias de CDR3 distintas. La diversidad de la secuencia de CDR3 aumenta adicionalmente mediante la adición y deleción independiente de nucleótidos a las uniones V^p-D^p, D^p-J^p, y V^a-J^a durante el proceso de reordenamiento del gen de TCR. A este respecto, la inmunocompetencia se refleja en la diversidad de los TCR.

El TCR yó es distintivo del TCR ap porque codifica un receptor que interactúa estrechamente con el sistema inmunitario innato. Tc Ryó, se expresa al inicio del desarrollo, tiene una distribución anatómica especializada, tiene especificidades únicas de patógenos y moléculas pequeñas, y tiene un amplio espectro de interacciones celulares innatas y adaptativas. En la ontogenia se establece temprano un patrón sesgado de la expresión del segmento V y J de TCRy ya que los subconjuntos restringidos de células TCRyó pueblan la boca, la piel, el intestino, la vagina y los pulmones prenatalmente. En consecuencia, el repertorio diverso de TCRy en tejidos adultos es el resultado de una amplia expansión periférica después de la estimulación por exposición ambiental a patógenos y moléculas tóxicas.

Las Ig (BCR) expresadas por las células B son proteínas que consisten en cuatro cadenas polipeptídicas, dos cadenas pesadas (cadenas H) y dos cadenas ligeras (cadenas L), que forman una estructura H²L². Cada par de cadenas H y L contiene un dominio hipervariable, que consiste en una región V^l y una V^h, y un dominio constante. Las cadenas H de las Ig son de varios tipos, p, ó, y, a y p. La diversidad de las Ig dentro de un individuo está determinada principalmente por el dominio hipervariable. De manera similar al TCR, el dominio V de las cadenas H de Ig se crea mediante la unión combinatoria de los segmentos génicos V^h, D^h y J^h. La diversidad de secuencias de los dominios hipervariables se incrementa adicionalmente mediante la adición y deleción independientes de nucleótidos a las uniones V^h-D^h, D^h-J^h, y V^h-J^h durante el proceso de reordenamiento del gen Ig. A este respecto, la inmunocompetencia se refleja en la diversidad de las Ig.

La caracterización cuantitativa de las células inmunitarias adaptativas basada en la presencia en tales células de genes que codifican Ig y TCR funcionalmente reordenados que dirigen la expresión productiva de los receptores inmunitarios adaptativos se ha logrado utilizando muestras biológicas a partir de las cuales las células inmunitarias adaptativas pueden aislarse fácilmente en cantidades significativas, tales como sangre, linfa u otros fluidos biológicos. En estas muestras, las células inmunitarias adaptativas se presentan como partículas en suspensión fluida. Véase, por ejemplo, el documento US 2010/0330571; véase también, por ejemplo, Murphy, Janeway's Immunobiology (8a Ed.), 2011 Garland Science, NY, Apéndice I, pág. 717-762.

La leucemia/linfoma linfoblástico de células T agudo (T-ALL) es una neoplasia maligna, agresiva de células T inmaduras que afecta tanto a pacientes adultos como pediátricos. Aunque ha habido un progreso significativo en el tratamiento de estos pacientes con mejoras en la obtención de respuestas duraderas, sigue estando claro que un subconjunto de estos pacientes no se tratan adecuadamente y con frecuencia presentan recaída de la enfermedad, mientras que otros pueden recibir un tratamiento excesivo debido a la incapacidad para individualizar suficientemente el tratamiento clínico. Varios estudios han confirmado la importancia de evaluar la posible presencia de enfermedad residual mínima (ERM) después de un régimen de tratamiento, para ayudar a predecir los resultados clínicos de los pacientes (1-3). Por ejemplo, los pacientes que demuestran una respuesta temprana a la terapia, y que no muestran una obtención sostenida de ERM, tienen mejores resultados que los que no lo hacen (3).

De manera similar, la leucemia/linfoma linfoblástico de células B agudo (B-ALL) es una neoplasia maligna agresiva de células B inmaduras que afecta a pacientes adultos y pediátricos. Si bien se ha logrado un progreso significativo en el aumento del número de pacientes que logran una remisión duradera a largo plazo, un subconjunto de pacientes recae. Al igual que en T-ALL, múltiples estudios han confirmado que la presencia y la frecuencia de enfermedad residual mínima son marcadores pronósticos importantes en la B-Al L. Además, varios de estos estudios también respaldan el uso de estos datos para notificar e individualizar la terapia (por ejemplo, Yamaji et al., 2010 Pediatr. Blood Cane.

55(7):1287-95; Bhojwani et al., 2009 Clin. Lymphoma Myeloma 9 (Supl. 3):S222-30.

Las estrategias clínicas actuales para la evaluación de la enfermedad residual mínima incluyen citometría de flujo multiparamétrica (mpFC) y métodos basados en PCR cuantitativa que utilizan cebadores específicos del paciente (4, 5). La mpFC típicamente permite la detección de células potencialmente responsables de la enfermedad recurrente/persistente con una sensibilidad del orden de 10^{' 4} a 10^{' 5} células nucleadas. Sin embargo, la interpretación de estos datos depende del operador y del laboratorio y, en consecuencia, está limitada por una mala normalización. Además, la expresión variable de antígenos leucémicos en el contexto posterior a la terapia confunde la detección de ERM mediante mpFC (6).

En comparación, los métodos moleculares para la detección de enfermedad residual mínima pueden lograr una sensibilidad relativamente mayor, del orden de 10^-5 a 10^-6 células (7, 8). Sin embargo, las configuraciones previas de estos ensayos moleculares, principalmente ensayos basados en PCR cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR) que utilizan cebadores específicos del paciente que se dirigen a secuencias de empalme de la región variable del receptor inmunitario adaptativo (por ejemplo, receptor de células T (TCR) o inmunoglobulina (Ig)), o translocaciones específicas del paciente, son complejas y difíciles de implementar en una materia uniforme (7). Por ejemplo, estos enfoques requieren la producción y el uso de sondas oligonucleotídicas individualizadas, específicas del paciente para cada paciente, lo que es laborioso, costoso y lento, e incompatible con el marco temporal en el que deben tomarse decisiones clínicas.

La secuenciación de alto rendimiento (HTS) es una tecnología emergente que puede proporcionar información sobre la complejidad de la respuesta inmunitaria adaptativa a través del análisis de la reorganización del gen del receptor linfoide (9). Los estudios que utilizan esta tecnología han desafiado la comprensión en la técnica de la extensión de la diversidad de los linfocitos que presentan, y comparten, los individuos (9, 10), y han proporcionado una visión mecanicista de los primeros eventos genéticos moleculares críticos para la maduración del linaje de células T (11). Recientemente, la secuenciación de alto rendimiento de los genes del receptor inmunitario adaptativo de células linfoides se ha utilizado para controlar la diversidad de linfocitos después de la inmunoterapia adoptiva con células T modificadas por receptor antigénico quimérico para el tratamiento de la leucemia linfocítica crónica refractaria a la quimioterapia (12). Por separado, la secuenciación de alto rendimiento de los genes del receptor inmunitario adaptativo de las células linfoides se ha utilizado para controlar la enfermedad en los trastornos linfoproliferativos B (13). La HTS ha demostrado la capacidad de identificar clones de células T raras (una célula T en 100.000) con alta precisión y reproducibilidad (14). Sherwood et al., 2001 describen la secuenciación profunda de los repertorios de TCRy y TCRp humanos (Sci. Trans. Med. 2011, vol. 3, núm. 90-93, páginas 90-96). Weng et al., 2011 describe la secuenciación de alto rendimiento de TCR en pacientes con micosis fungoide y síndrome de Sezary (Blood (Resúmenes de encuentros anuales de ASH) 2011, 118, Resumen 3114). El documento WO2011/139371 describe métodos para diagnosticar y pronosticar pacientes con neoplasias linfoides.

Claramente, existe una necesidad de mejorar la sensibilidad y especificidad en el diagnóstico de tumores malignos hematológicos linfoides y otras afecciones que se reflejan en la heterogeneidad y frecuencias relativas de aparición de receptores inmunitarios adaptativos únicos concretos, y en la capacidad de detectar enfermedad residual mínima (ERM). Las realizaciones descritas actualmente abordan estas necesidades y proporcionan otras ventajas relacionadas.

Breve compendio

La invención proporciona un método para detectar enfermedad residual mínima para un tumor maligno hematológico linfoide en un sujeto después de la terapia, comprendiendo el método

(a) amplificación de ADN extraído de una primera muestra en una reacción en cadena de polimerasa múltiple (PCR) utilizando cebadores del segmento V y J para producir una multiplicidad de moléculas de a Dn reordenado amplificado que comprenden cada una una región que codifica CDR3 de Ig, en donde la primera muestra se ha obtenido del sujeto antes de la terapia y comprende una pluralidad de células hematopoyéticas linfoides,

(b) secuenciación de alto rendimiento de dicha multiplicidad de moléculas de ADN reordenado amplificado para determinar las frecuencias relativas de regiones que codifican CDR3 de Ig reordenadas de manera única en la primera muestra, identificando así la región que codifica CDR3 de Ig reordenada de manera única de los uno o más clones de células B malignas,

(c) amplificación de ADN extraído de una segunda muestra en una reacción en cadena de polimerasa múltiple (PCR) utilizando los cebadores del segmento V y J para producir una multiplicidad de moléculas de ADN reordenado amplificado comprendiendo cada una una región que codifica CDR3 de Ig, en donde la segunda muestra ha sido obtenida del sujeto después de la terapia y comprende una pluralidad de células hematopoyéticas linfoides, y (d) secuenciación de alto rendimiento de dicha multiplicidad de moléculas de ADN reordenado amplificado producidas a partir de la segunda muestra para determinar la frecuencia relativa de la región que codifica CDR3 de Ig reordenada de manera única de los uno o más clones de células B malignas en la segunda muestra, en donde la presencia de la región que codifica CDR3 de Ig reordenada de manera única de los uno o más clones de células B malignas a una frecuencia relativa de al menos 1 en 105 regiones que codifican CDR3 de Ig indica enfermedad residual mínima para el tumor maligno hematológico linfoide;

en donde la PCR múltiple comprende adicionalmente una pluralidad de oligonucleótidos molde que tiene una pluralidad de secuencias de oligonucleótidos de fórmula general

5'-U 1 -B1-V-B2-R-B3-J-B4-U2-3' [I] en donde

(i) V es un polinucleótido que comprende al menos 20, 30, 60, 90, 120, 150, 180 o 210, y no más de 1000, 900, 800, 700, 600 o 500 nucleótidos contiguos de una secuencia génica que codifica la región variable (V) del receptor inmunitario adaptativo, o el complemento de la misma, y en cada una de la pluralidad de secuencias de oligonucleótidos V comprende una secuencia oligonucleotídica única,

(ii) J es un polinucleótido que comprende al menos 15-30, 31-60, 61-90, 91-120 o 120-150, y no más de 600, 500, 400, 300 o 200 nucleótidos contiguos de una secuencia génica que codifica la región de empalme (J) del receptor inmunitario adaptativo, o el complemento de la misma, y en cada una de la pluralidad de secuencias de oligonucleótidos J comprende una secuencia oligonucleotídica única,

(iii) U1 no es nada o comprende un oligonucleótido que tiene una secuencia que se selecciona entre (1) una primera secuencia de oligonucleótido adaptador universal, y (2) una primera secuencia oligonucleotídica específica de la plataforma de secuenciación que está conectada y posicionada en 5' con respecto a primera secuencia de oligonucleótido adaptador universal,

(iv) U2 no es nada o comprende un oligonucleótido que tiene una secuencia que se selecciona entre (1) una segunda secuencia de oligonucleótido adaptador universal, y (2) una segunda secuencia oligonucleotídica específica de la plataforma de secuenciación que está conectada y posicionada en 5' con respecto a una segunda secuencia de oligonucleótido adaptador universal,

(v) B1, B2, B3 y B4 son cada uno independientemente nada o cada uno comprende un oligonucleótido B que comprende una secuencia código de barras de oligonucleótido de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25, nucleótidos contiguos, en donde en cada una de la pluralidad de secuencias de oligonucleótidos B comprende una secuencia oligonucleotídica única que identifica de forma única, como una combinación emparejada, (1) la secuencia oligonucleotídica V única de (i) y (2) la secuencia oligonucleotídica J única de (ii), y

(vi) R no es nada o comprende un sitio de reconocimiento para enzimas de restricción que comprende una secuencia oligonucleotídica que está ausente de (i)-(v).

Se describe en la presente memoria un método para diagnosticar un tumor maligno hematológico linfoide en un sujeto antes de la terapia, y para detectar enfermedad residual mínima para el tumor maligno hematológico linfoide en el sujeto después de la terapia, comprendiendo el método: (I) para cada uno de (i) una o una pluralidad de muestras biológicas que comprenden cada una una pluralidad de células hematopoyéticas linfoides y que se obtienen cada una del sujeto en uno o más puntos temporales antes de la terapia, y (ii) una o una pluralidad de muestras biológicas que comprenden cada una una pluralidad de células hematopoyéticas linfoides y que se obtienen cada una del sujeto en uno o más puntos temporales después de la terapia, (a) amplificar ADN extraído de la muestra biológica en una reacción en cadena de la polimerasa múltiple (PCR) que comprende: (i) una pluralidad de cebadores oligonucleotídicos del segmento V que son capaces cada uno independientemente de hibridar específicamente con al menos un polinucleótido que codifica un polipéptido de la región V del receptor de células T (TCR) humano, en donde cada cebador del segmento V comprende una secuencia de nucleótidos de al menos 15 nucleótidos contiguos que es complementaria a al menos un segmento génico funcional que codifica Vy de TCR o que codifica Vp de TCR y en donde la pluralidad de cebadores del segmento V hibridan específicamente sustancialmente con todos los segmentos génicos funcionales que codifican Vy de TCR o que codifica Vp de TCR que están presentes en la muestra, y (ii) una pluralidad de cebadores oligonucleotídicos del segmento J que son capaces cada uno independientemente de hibridar específicamente con al menos un polinucleótido que codifica un polipéptido de la región J del receptor de células T (TCR) humano, en donde cada cebador del segmento J comprende una secuencia de nucleótidos de al menos 15 nucleótidos contiguos que es complementaria a al menos un segmento génico funcional que codifica Jy de TCR o que codifica Jp de TCR y en donde la pluralidad de cebadores del segmento J hibrida específicamente sustancialmente con todos los segmentos génicos funcionales que codifican Jy de TCR o que codifican Jp de TCR que están presentes en la muestra, en donde los cebadores del segmento V y del segmento J son capaces de promover la amplificación en dicha reacción en cadena de la polimerasa múltiple (PCR) de sustancialmente todas las regiones que codifican CDR3 de TCRy reordenadas o sustancialmente todas las regiones que codifican CDR3 de TCRp en la muestra para producir una multiplicidad de moléculas de ADN reordenado amplificado a partir de una población de células T en la muestra, siendo suficiente dicha multiplicidad de moléculas de ADN reordenado amplificado para cuantificar la diversidad de la región que codifica CDR3 de TCRy o la región que codifica CDR3 de TCRy en la población de células T, y en donde cada molécula de ADN reordenado amplificado en la multiplicidad de moléculas de ADN reordenado amplificado tiene menos de 600 nucleótidos de longitud; y (b) secuenciar dicha multiplicidad de moléculas de ADN reordenado amplificado para determinar, para cada molécula única de ADN reordenado en dicha multiplicidad de moléculas de ADN reordenado amplificado, (i) una secuencia de ADN reordenado y (ii) una frecuencia de aparición relativa de la secuencia de ADN reordenado; y (II) comparar (i) la frecuencia de aparición relativa para cada secuencia única de ADN reordenado de dichas una o una pluralidad de muestras biológicas que se obtienen cada una del sujeto en uno o más puntos temporales antes de la terapia, con (ii) la frecuencia de aparición relativa para cada secuencia única de ADN reordenado de dichas una o una pluralidad de muestras biológicas que se obtienen cada una del sujeto en uno o más puntos temporales después de la terapia, en donde (A) la presencia, en una muestra obtenida del sujeto antes de la terapia, de al menos una secuencia única de ADN reordenado que tiene una frecuencia relativa de al menos 15% de regiones que codifican CDR3 de TCRy reordenadas o regiones que codifican CDR3 de TCRp reordenadas es diagnóstica de un tumor maligno hematológico linfoide clonal en el sujeto antes de la terapia, y en donde (B) la presencia, en una muestra obtenida del sujeto después de la terapia, de dicha al menos una secuencia única de ADN reordenado que es diagnóstica del tumor maligno hematológico linfoide clonal a una frecuencia relativa de al menos una de cada 105 regiones que codifican CDR3 de TCR indica enfermedad residual mínima para el tumor maligno hematológico linfoide.

En ciertas realizaciones adicionales, cada segmento génico funcional que codifica V de Ig comprende una secuencia señal de recombinación (RSS) del gen V y cada segmento génico que codifica J de Ig comprende una RSS del gen J, y en donde cada molécula de ADN reordenado amplificado comprende (i) al menos 10, 20, 30 o 40 nucleótidos contiguos de una hebra efectora del segmento génico que codifica V de Ig, estando situados dichos al menos 10, 20, 30 o 40 nucleótidos contiguos 5' respecto a la RSS del gen V y (ii) al menos 10, 20 o 30 nucleótidos contiguos de una hebra efectora del segmento génico que codifica J de Ig, estando situados dichos al menos 10, 20 o 30 nucleótidos contiguos 3' con respecto a la RSS del gen J.

En ciertas realizaciones la pluralidad de cebadores oligonucleotídicos del segmento V y la pluralidad de cebadores oligonucleotídicos del segmento J comprenden al menos una de (1) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 5579­ 5643, (2) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 5644-5792, (3) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 5793­ 5816, (4) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 5817-6123, (5) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 6124­ 6127 y 6212-6215, (6) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 6128-6211 y 6216-6221, (7) las secuencias expuestas en s Eq ID NO: 6222-6286, y (8) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 6222-6351. En ciertas realizaciones cualquiera o ambos de: (i) los cebadores oligonucleotídicos del segmento V comprenden uno o una pluralidad de oligonucleótidos que exhiben al menos 90% de identidad de secuencia con una o más de las secuencias de nucleótidos expuestas en SEQ ID NO:5579-5630, 5644-5779, 5799-5816, 6124-6127, y 6222-6273, y (ii) los cebadores del segmento J comprenden uno o una pluralidad de oligonucleótidos que exhiben al menos 90% de identidad de secuencia con una o más de las secuencias de nucleótidos expuestas en SEQ ID NO:5631-5643, 5780-5798, 6212­ 6215, y 6274-6286.

Se describe en la presente memoria un método para diagnosticar un tumor maligno hematológico linfoide en un sujeto, que comprende (I) para cada uno de (i) una o una pluralidad de muestras biológicas que se obtienen del sujeto y que comprenden cada una una pluralidad de células hematopoyéticas linfoides, (a) amplificar ADN extraído de la muestra biológica en una reacción en cadena de polimerasa múltiple (PCR) que comprende: (i) una pluralidad de cebadores oligonucleotídicos del segmento V que son capaces cada uno independientemente de hibridar específicamente con al menos un polinucleótido que codifica un polipéptido de la región V del receptor de células T (TCR) humano, en donde cada cebador del segmento V comprende una secuencia de nucleótidos de al menos 15 nucleótidos contiguos que es complementaria a al menos un segmento génico funcional que codifica Vy de TCR o que codifica Vp de TCR y en donde la pluralidad de cebadores del segmento V hibrida específicamente sustancialmente con todos los segmentos génicos funcionales que codifican Vy de TCR o que codifican Vp de TCR que están presentes en la muestra, y (ii) una pluralidad de cebadores oligonucleotídicos del segmento J que son capaces cada uno independientemente de hibridar específicamente con al menos un polinucleótido que codifica un polipéptido de la región J del receptor de células T (TCR) humano, en donde cada cebador del segmento J comprende una secuencia de nucleótidos de al menos 15 nucleótidos contiguos que es complementaria a al menos un segmento génico funcional que codifica Jy de TCR o que codifica Jp de TCR y en donde la pluralidad de cebadores del segmento J hibridan específicamente sustancialmente con todos los segmentos génicos funcionales que codifican Jy de TCR o que codifican Jp de TCR que están presentes en la muestra, en donde los cebadores del segmento V y del segmento J son capaces de promover la amplificación en dicha reacción en cadena de la polimerasa múltiple (PCR) de sustancialmente todas las regiones que codifican CDR3 de TCRy o sustancialmente todas las regiones que codifican CDR3 de TCRp reordenadas en la muestra para producir una multiplicidad de moléculas de ADN reordenado amplificado de una población de células T en la muestra, siendo suficiente dicha multiplicidad de moléculas de ADN reordenado amplificado para cuantificar la diversidad de la región que codifica CDR3 de TCRy o CDR3 de TCRy en la población de células T, y en donde cada molécula de ADN reordenado amplificado en la multiplicidad de moléculas de ADN reordenado amplificado tiene menos de 600 nucleótidos de longitud; y (b) secuenciar dicha multiplicidad de moléculas de ADN reordenado amplificado para determinar, para cada molécula única de ADN reordenado en dicha multiplicidad de moléculas de ADN reordenado amplificado, (i) una secuencia de ADN reordenado y (ii) una frecuencia de aparición relativa de la secuencia de ADN reordenado; y (II) determinar la frecuencia de aparición relativa para cada secuencia única de ADN reordenado a partir de dichas una o una pluralidad de muestras biológicas que se obtienen cada una del sujeto, en donde (A) la presencia, en una muestra obtenida del sujeto, de al menos una secuencia única de ADN reordenado que tiene una frecuencia relativa de al menos 15% de las regiones que codifican CDR3 de TCRy reordenadas o las regiones que codifican CDR3 de TCRp reordenadas es diagnóstica de un tumor maligno hematológico linfoide clonal en el sujeto, en donde (B) la presencia, en una muestra obtenida del sujeto, de dicha al menos una secuencia única de ADN reordenado que es diagnóstica del tumor maligno hematológico linfoide clonal a una frecuencia relativa de al menos una de cada 105 regiones que codifican CDR3 de TCR, indica enfermedad residual mínima para el tumor maligno hematológico linfoide, y en donde (C) la ausencia en la muestra obtenida del sujeto de al menos una secuencia única de ADN reordenado que tiene una frecuencia relativa de al menos 15% de regiones que codifican CDR3 de TCRy reordenadas o regiones que codifican CDR3 de TCRp reordenadas indica que el sujeto debe evaluarse para detectar el inmunofenotipo del precursor tímico temprano.

En ciertos casos, cada segmento génico funcional que codifica V de TCR o Ig comprende una secuencia señal de recombinación (RSS) del gen V y cada segmento génico funcional que codifica J de TCR o Ig comprende una RSS del gen J, y en donde cada molécula de ADN reordenado amplificado comprende (i) al menos 10, 20, 30 o 40 nucleótidos contiguos de una hebra efectora del segmento génico que codifica V de TCR o Ig, estando situados dichos al menos 10, 20, 30 o 40 nucleótidos contiguos 5' con respecto a la RSS del gen V y (ii) al menos 10, 20 o 30 nucleótidos contiguos de una hebra efectora del segmento génico que codifica J de TCR o Ig, estando situados dichos al menos 10, 20 o 30 nucleótidos contiguos 3' con respecto a la RSS del gen J. En ciertos casos, la pluralidad de cebadores oligonucleotídicos del segmento V y la pluralidad de cebadores oligonucleotídicos del segmento J comprende al menos una de (1) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 5579-5643, (2) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 5644-5792, (3) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 5793-5816, (4) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 5817-6123, (5) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 6124-6127 y 6212-6215, (6) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 6128-6211 y 6216-6221, (7) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 6222-6286, y (8) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 6222-6351. En ciertos casos, cualquiera o ambos de (i) los cebadores oligonucleotídicos del segmento V comprenden uno o una pluralidad de oligonucleótidos que exhiben al menos 90% de identidad de secuencia con una o más de las secuencias de nucleótidos expuestas en SEQ ID NO:5579-5630, 5644-5779, 5799-5816, 6124-6127, y 6222-6273, y (ii) los cebadores del segmento J comprenden uno o una pluralidad de oligonucleótidos que exhiben al menos 90% de identidad de secuencia con una o más de las secuencias de nucleótidos expuestas en SEQ ID NO:5631-5643, 5780-5798, 6212-6215, y 6274-6286.

Se describe en la presente memoria un método para detectar enfermedad residual mínima para un tumor maligno hematológico linfoide en un sujeto después de la terapia, comprendiendo el método: (I) para cada una de (i) una o una pluralidad de muestras biológicas que comprenden cada una una pluralidad de células hematopoyéticas linfoides y que son obtenidas cada una del sujeto en uno o más puntos temporales antes de la terapia, y (ii) una o una pluralidad de muestras biológicas que comprenden cada una una pluralidad de células hematopoyéticas linfoides y que son obtenidas cada una del sujeto en uno o más puntos temporales después de la terapia, (a) amplificar ADN extraído de la muestra biológica en una reacción en cadena de polimerasa múltiple (PCR) que comprende: (i) una pluralidad de cebadores oligonucleotídicos del segmento V que son capaces de hibridar específicamente por separado con al menos un polinucleótido que codifica un polipéptido de la región V del receptor de células T (TCR) humano, en donde cada cebador del segmento V comprende una secuencia de nucleótidos de al menos 15 nucleótidos contiguos que es complementaria a al menos un segmento génico funcional que codifica Vy de TCR o que codifica Vp de TCR y en donde la pluralidad de cebadores del segmento V hibridan específicamente sustancialmente con todos los segmentos génicos funcionales que codifican Vy de TCR o que codifican Vp de TCR que están presentes en la muestra, y (ii) una pluralidad de cebadores oligonucleotídicos del segmento J que son capaces cada uno independientemente de hibridar específicamente con al menos un polinucleótido que codifica un polipéptido de la región J del receptor de células T (TCR) humano, en donde cada cebador del segmento J comprende un secuencia de nucleótidos de al menos 15 nucleótidos contiguos que es complementaria a al menos un segmento génico funcional que codifica Jy de TCR o que codifica Jp de TCR y en donde la pluralidad de cebadores del segmento J hibridan específicamente sustancialmente con todos los segmentos génicos funcionales que codifican Jy de TCR o que codifican Jp de TCR que están presentes en la muestra, en donde los cebadores del segmento V y del segmento J son capaces de promover la amplificación en dicha reacción en cadena de la polimerasa múltiple (PCR) de sustancialmente todas las regiones que codifican CDR3 de TCRy reordenadas o sustancialmente todas las regiones que codifican CDR3 de TCRp en la muestra para producir una multiplicidad de moléculas de ADN reordenado amplificado de una población de células T en la muestra, siendo suficiente dicha multiplicidad de moléculas de ADN reordenado amplificado para cuantificar la diversidad de la región que codifica CDR3 de TCRy o de la región que codifica CDR3 de TCRy en la población de células T, y en donde cada molécula de ADN reordenado amplificado en la multiplicidad de moléculas de ADN reordenado amplificado tiene menos de 600 nucleótidos de longitud; y (b) secuenciar dicha multiplicidad de moléculas de ADN reordenado amplificado para determinar, para cada molécula única de ADN reordenado en dicha multiplicidad de moléculas de ADN reordenado amplificado, (i) una secuencia de ADN reordenado y (ii) una frecuencia de aparición relativa de la secuencia de ADN reordenado; y (II) comparar (i) la frecuencia de aparición relativa para cada secuencia única de ADN reordenado de dichas una o una pluralidad de muestras biológicas que se obtienen cada una del sujeto en uno o más puntos temporales antes de la terapia, con (ii) la frecuencia de aparición relativa para cada secuencia única de ADN reordenado de dichas una o una pluralidad de muestras biológicas que se obtienen cada una del sujeto en uno o más puntos temporales después de la terapia, en donde (A) la presencia, en una muestra obtenida del sujeto antes de la terapia, de al menos una secuencia única de ADN reordenado que tiene una frecuencia relativa de al menos 15% de regiones que codifican CDR3 de TCRy reordenadas o regiones que codifican CDR3 de TCRp reordenadas es diagnóstica de un tumor maligno hematológico linfoide clonal en el sujeto antes de la terapia, y en donde (B) la presencia, en una muestra obtenida del sujeto después de la terapia, de dicha al menos una secuencia única de ADN reordenado que es diagnóstica de tumor maligno hematológico linfoide clonal a una frecuencia relativa de al menos una de cada 106 o de al menos una de cada 105 regiones que codifican CDR3 de TCR indica enfermedad residual mínima para el tumor maligno hematológico linfoide.

En ciertos casos, cada segmento génico funcional que codifica V de TCR o Ig comprende una secuencia señal de recombinación (RSS) del gen V y cada segmento génico funcional que codifica J de TCR o Ig comprende una RSS del gen J, y en donde cada molécula de ADN reordenado amplificado comprende (i) al menos 10, 20, 30 o 40 nucleótidos contiguos de una hebra efectora del segmento génico que codifica V de TCR o Ig, estando situados dichos al menos 10, 20, 30 o 40 nucleótidos contiguos 5' con respecto a la RSS del gen V y (ii) al menos 10, 20 o 30 nucleótidos contiguos de una hebra efectora del segmento génico que codifica J de TCR o Ig, estando situados dichos al menos 10, 20 o 30 nucleótidos contiguos 3' con respecto a la RSS del gen J. En ciertos casos, la pluralidad de cebadores oligonucleotídicos del segmento V y la pluralidad de cebadores oligonucleotídicos del segmento J comprende al menos una de (1) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 5579-5643, (2) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 5644-5792, (3) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 5793-5816, (4) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 5817-6123, (5) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 6124-6127 y 6212-6215, (6) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 6128-6211 y 6216-6221, (7) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 6222-6286, y (8) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 6222-6351. En ciertos casos cualquiera o ambos de (i) los cebadores oligonucleotídicos del segmento V comprenden uno o una pluralidad de oligonucleótidos que exhiben al menos 90% de identidad de secuencia con una o más de las secuencias de nucleótidos expuestas en SEQ ID NO:5579-5630, 5644-5779, 5799-5816, 6124-6127, y 6222-6273, y (ii) los cebadores del segmento J comprenden uno o una pluralidad de oligonucleótidos que exhiben al menos 90% de identidad de secuencia con una o más de las secuencias de nucleótidos expuestas en SEQ ID NO:5631-5643, 5780-5798, 6212-6215, y 6274-6286.

Se describe en la presente memoria un método para diagnosticar un tumor maligno hematológico linfoide en un sujeto antes de la terapia, y para detectar enfermedad residual mínima para el tumor maligno hematológico linfoide en el sujeto después de la terapia, comprendiendo el método (I) para cada uno de (i) una o una pluralidad de muestras biológicas que comprenden cada una una pluralidad de células hematopoyéticas linfoides y que se obtienen cada una del sujeto en uno o más puntos temporales antes de la terapia, y (ii) una o una pluralidad de muestras biológicas que comprenden cada una una pluralidad de células hematopoyéticas linfoides y que se obtienen cada una del sujeto en uno o más puntos temporales después de la terapia, (a) amplificar el ADN extraído de la muestra biológica en una reacción en cadena de polimerasa múltiple (PCR) que comprende: (i) una pluralidad de cebadores oligonucleotídicos del segmento V que son capaces cada uno independientemente de hibridar específicamente con al menos un polinucleótido que codifica un polipéptido de la región V del receptor de células T (TCR) humano o un polipéptido de la región V de inmunoglobulina (Ig) humano, en donde cada cebador del segmento V comprende una secuencia de nucleótidos de al menos 15 nucleótidos contiguos que es complementaria a al menos un segmento génico funcional que codifica la región V de TCR o que codifica la región V de Ig y en donde la pluralidad de cebadores del segmento V hibrida específicamente sustancialmente con todos los segmentos génicos funcionales que codifican V de TCR o que codifican V de Ig que están presentes en la muestra, y (ii) una pluralidad de cebadores oligonucleotídicos del segmento J que son capaces cada uno independientemente de hibridar específicamente con al menos un polinucleótido que codifica un polipéptido de la región J del receptor de células T (TCR) humano o un polipéptido de la región J de Ig humano, en donde cada cebador del segmento J comprende una secuencia de nucleótidos de al menos 15 nucleótidos contiguos que es complementaria a al menos un segmento génico funcional que codifica J de TCR o que codifica J de Ig y en donde la pluralidad de cebadores del segmento J hibridan específicamente sustancialmente con todos los segmentos génicos funcionales que codifican J de TCR o que codifica J de Ig que están presentes en la muestra, en donde los cebadores del segmento V y del segmento J son capaces de promover la amplificación en dicha reacción en cadena de la polimerasa múltiple (PCR) de sustancialmente todas las regiones que codifican CDR3 de TCR reordenadas o sustancialmente todas las regiones que codifican CDR3 de Ig en la muestra para producir una multiplicidad de moléculas de ADN reordenado amplificado de una población de células linfoides en la muestra, siendo suficiente dicha multiplicidad de moléculas de ADN reordenado amplificado para cuantificar la diversidad de la región que codifica CDR3 de TCR o la región que codifica CDR3 de Ig en la población de células linfoides, y en donde cada molécula de ADN reordenado amplificado en la multiplicidad de moléculas de ADN reordenado amplificado tiene menos de 600 nucleótidos de longitud; y (b) secuenciar dicha multiplicidad de moléculas de ADN reordenado amplificado para determinar, para cada molécula única de ADN reordenado en dicha multiplicidad de moléculas de ADN reordenado amplificado, (i) una secuencia de ADN reordenado y (ii) una frecuencia de aparición relativa de la secuencia de ADN reordenado; y (II) comparar (i) la frecuencia de aparición relativa para cada secuencia única de ADN reordenado de dichas una o una pluralidad de muestras biológicas que se obtienen cada una del sujeto en uno o más puntos temporales antes de la terapia, con (ii) la frecuencia de aparición relativa para cada secuencia única de ADN reordenado de dichas una o una pluralidad de muestras biológicas que se obtienen cada una del sujeto en uno o más puntos temporales después de la terapia, en donde (A) la presencia, en una muestra obtenida del sujeto antes de la terapia, de al menos una secuencia única de ADN reordenado que tiene una frecuencia relativa de al menos 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26 %, 27%, 28%, 29% o 30% de las regiones que codifican CDR3 de TCR reordenadas o las regiones que codifican CDR3 de Ig reordenadas es diagnóstica para un tumor maligno hematológico linfoide clonal en el sujeto antes de la terapia, y en donde (B) la presencia, en una muestra obtenida del sujeto después de la terapia, de dicha al menos una secuencia única de ADN reordenado que es diagnóstica de neoplasia maligna hematológica linfoide clonal a una frecuencia relativa de al menos una de cada 105 regiones que codifican CDR3 de TCR o de Ig indica enfermedad residual mínima para el tumor maligno hematológico linfoide.

En ciertos casos, cada segmento génico funcional que codifica V de TCR o Ig comprende una secuencia señal de recombinación (RSS) del gen V y cada segmento génico funcional que codifica J de TCR o Ig comprende una RSS del gen J, y en donde cada molécula de ADN reordenado amplificado comprende (i) al menos 10, 20, 30 o 40 nucleótidos contiguos de una hebra efectora del segmento génico que codifica V de TCR o Ig, estando situados dichos al menos 10, 20, 30 o 40 nucleótidos contiguos 5' con respecto a la RSS del gen V y (ii) al menos 10, 20 o 30 nucleótidos contiguos de una hebra efectora del segmento génico que codifica J de TCR o Ig, estando situados dichos al menos 10, 20 o 30 nucleótidos contiguos 3' con respecto a la RSS del gen J. En ciertos casos, las regiones que codifican CDR3 de TCR o Ig reordenadas se seleccionan entre regiones que codifican CDR3 de TCR^a , regiones que codifican CDR3 de TCR^p , regiones que codifican CDR3 de TCR^y , regiones que codifican CDR3 de TCR⁶ , regiones que codifican CDR3 de IgH, regiones que codifican CDR3 de Ig^K , y regiones que codifican CDR3 de Ig^A reordenadas.

En ciertos casos, la pluralidad de cebadores oligonucleotídicos del segmento V y la pluralidad de cebadores oligonucleotídicos del segmento J comprende al menos una de (1) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 5579­ 5643, (2) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 5644-5792, (3) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 5793­ 5816, (4) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 5817-6123, (5) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 6124­ 6127 y 6212-6215, (6) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 6128-6211 y 6216-6221, (7) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 6222-6286, y (8) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 6222-6351. En ciertos casos cualquiera o ambos de (i) los cebadores oligonucleotídicos del segmento V comprenden uno o una pluralidad de oligonucleótidos que exhiben al menos 90% de identidad de secuencia con una o más de las secuencias de nucleótidos expuestas en SEQ ID NO:5579-5630, 5644-5779, 5799-5816, 5833-6211, y 6222-6273, y (ii) los cebadores del segmento J comprenden uno o una pluralidad de oligonucleótidos que exhiben al menos 90% de identidad de secuencia con una o más de las secuencias de nucleótidos expuestas en SEQ ID NO:5631-5643, 5780-5798, 5817-5832, 6212-6221, y 6274-6286. 0025

En ciertos casos de los métodos descritos anteriormente, cualquiera o ambos de (i) los cebadores oligonucleotídicos del segmento V comprenden uno o una pluralidad de oligonucleótidos que exhiben al menos 90% de identidad de secuencia con uno o más de: (1) las secuencias de nucleótidos expuestas en SEQ ID NO:5579-5630, (2) las secuencias de nucleótidos expuestas en SEQ ID NO:5644-5779, (3) las secuencias de nucleótidos expuestas en SEQ ID NO:5799-5816, (4) las secuencias de nucleótidos expuestas en SEQ ID NO:5833-6123, (5) las secuencias de nucleótidos expuestas en SEQ ID NO:6124-6127, (6) las secuencias de nucleótidos expuestas en SEQ ID NO:6128-6211, (7) las secuencias de nucleótidos expuestas en SEQ ID NO:6222-6273, y (8) las secuencias de nucleótidos expuestas en SEQ ID NO:6287-6351; y (ii) los cebadores del segmento J comprenden uno o una pluralidad de oligonucleótidos que exhiben al menos 90% de identidad de secuencia con uno o más de: (1) las secuencias de nucleótidos expuestas en SEQ ID NO:5631-5643, (2) las secuencias de nucleótidos expuestas en SEQ ID NO:5780-5792, (3) las secuencias de nucleótidos expuestas en SEQ ID NO:5793-5798, (4) las secuencias de nucleótidos expuestas en SEQ ID NO:5817-5832, (5) las secuencias de nucleótidos expuestas en SEQ ID NO:6212-6215, (6) las secuencias de nucleótidos expuestas en SEQ ID NO:6216-6221, y (7) las secuencias de nucleótidos expuestas en SEQ ID NO:6274-6286.

En ciertas realizaciones de los métodos descritos anteriormente, el tumor maligno hematológico linfoide se selecciona entre leucemia linfoblástica de células T aguda (T-ALL), leucemia linfoblástica de células B (B-ALL), mieloma múltiple, plasmacitoma, macroglobulinemia, leucemia linfocítica crónica (CLL), leucemia linfoblástica aguda (ALL), mieloma múltiple, plasmacitoma, macroglobulinemia, leucemia linfocítica crónica (CLL), linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, linfoma cutáneo de células T, linfoma de células del manto, linfoma de células T periférico, leucemia linfocítica de células pilosas, linfoma prolinfocítico de células T, linfoma angioinmunoblástico de células T, leucemia/linfoma linfoblástico de células T, linfoma periférico de células T, leucemia/linfoma de células T adultas, micosis fungoide, síndrome de Sezary, leucemia linfoblástica de células T, neoplasia mieloproliferativa y síndrome mielodisplásico.

En ciertas realizaciones de los métodos descritos anteriormente, la PCR múltiple comprende adicionalmente una composición molde para la determinación del factor de amplificación en el que está presente un número conocido de una pluralidad de oligonucleótidos molde que tienen una secuencia oligonucleotídica única, comprendiendo el molde una pluralidad de oligonucleótidos molde que tiene una pluralidad de secuencias de oligonucleótidos de fórmula general: 5'-U1-B1-V-B2-R-B3-J-B4-U2-3' [I] en donde: (a) V es un polinucleótido que comprende al menos 20, 30, 60, 90, 120, 150, 180 o 210, y no más de 1000, 900, 800, 700, 600 o 500 nucleótidos contiguos de una secuencia génica que codifica la región variable (V) del receptor inmunitario adaptativo, o el complemento de los mismos, y en cada una de la pluralidad de secuencias de oligonucleótidos V comprende una secuencia oligonucleotídica única; (b) J es un polinucleótido que comprende al menos 15-30, 31-60, 61-90, 91-120 o 120-150, y no más de 600, 500, 400, 300 o 200 nucleótidos contiguos de una secuencia génica que codifica la región de empalme (J) de un receptor inmunitario adaptativo, o el complemento de la misma, y en cada una de la pluralidad de secuencias de oligonucleótidos J comprende una secuencia oligonucleotídica única; (c) U1 no es nada o comprende un oligonucleótido que tiene una secuencia que se selecciona entre (i) una primera secuencia de oligonucleótido adaptador universal, y (ii) una secuencia oligonucleotídica específica de la primera secuencia de secuenciación que está conectada y posicionada en 5' con respecto a la primera secuencia de oligonucleótido adaptador universal; (d) U2 no es nada o comprende un oligonucleótido que tiene una secuencia que se selecciona entre (i) una segunda secuencia de oligonucleótido adaptador universal, y (ii) una segunda secuencia oligonucleotídica específica de la plataforma de secuenciación que está conectada y posicionada en 5' con respecto a una segunda secuencia de oligonucleótido adaptador universal; (e) B1, B2, B3 y B4 son cada uno independientemente nada o cada uno comprende un oligonucleótido B que comprende una secuencia código de barras de oligonucleótido de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25, nucleótidos contiguos, en donde en cada una de la pluralidad de secuencias de oligonucleótidos B comprende una secuencia oligonucleotídica única que identifica de forma única, como una combinación pareada, (i) la secuencia oligonucleotídica de V única de (a) y (ii) la secuencia oligonucleotídica de J única (b); (f) R es o bien nada o comprende un sitio de reconocimiento para enzimas de restricción que comprende una secuencia oligonucleotídica que está ausente de (a) -(e), y en donde: (g) al menos uno de: (i) la pluralidad de oligonucleótidos molde comprende al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51-100, 101-200, 201-300, 301-400, 401 -500, 501-600, 601-700, 701-800, 801-900, 901-1000, 1001-1100, 1101-1200, 1201-1300, 1301-1400, 1401-1500, 1501­ 1600, 1601-1700, 1701-2000, o 2001-2500 secuencias de oligonucleotídidos únicas, (ii) la pluralidad de oligonucleótidos molde comprende al menos un oligonucleótido molde que tiene una secuencia oligonucleotídica de fórmula general (I) con la que cada cebador oligonucleotídico del segmento V puede hibridar específicamente y al menos un oligonucleótido molde que tiene una secuencia oligonucleotídica de fórmula general (I) con la que cada cebador oligonucleótido del segmento J puede hibridar específicamente, o (iii) la pluralidad de oligonucleótidos molde comprende al menos a o al menos b secuencias de oligonucleótidos únicas, la que sea mayor, donde a es la cantidad de segmentos génicos que codifican la región V del receptor inmunitario adaptativo único en el sujeto y b es la cantidad de segmentos génicos que codifican la región J del receptor inmunitario adaptativo único en el sujeto, y la composición comprende al menos un oligonucleótido molde para cada polinucleótido V único y al menos un oligonucleótido molde para cada polinucleótido J único; comprendiendo adicionalmente dicho método cuantificar moléculas de ADN reordenado que codifican uno o una pluralidad de receptores inmunitarios adaptativos en el ADN extraído de la muestra biológica mediante las etapas de: (1) secuenciar cuantitativamente la totalidad o una porción suficiente de cada una de dichas moléculas de ADN molde amplificado y cada una de dichas moléculas de ADN reordenado amplificado para cuantificar (a) una cantidad de producto molde de moléculas de ADN modificado que contienen al menos una secuencia código de barras de oligonucleótidos, y (b) una cantidad de producto reordenado de moléculas de ADN reordenado amplificado que carecen de una secuencia código de barras de oligonucleótidos; (2) calcular un factor de amplificación dividiendo la cantidad de producto molde de (1) (a) por la cantidad conocida de cada uno de la pluralidad de oligonucleótidos molde que tienen una secuencia oligonucleotídica única; y (3) dividir la cantidad de producto reordenado de (1) (b) por el factor de amplificación calculado en (2) para cuantificar las moléculas de ADN que codifican el receptor inmunitario adaptativo único en la muestra.

En ciertas realizaciones adicionales, en la composición molde para la determinación del factor de amplificación, todos los oligonucleótidos molde en la pluralidad de oligonucleótidos molde son de longitud sustancialmente idéntica. En determinadas realizaciones, cada cebador en el conjunto de cebadores de amplificación oligonucleotídicos es capaz de hibridar específicamente con al menos un oligonucleótido molde en la pluralidad de oligonucleótidos de la composición molde. En ciertas realizaciones, cada oligonucleótido molde en la pluralidad de oligonucleótidos molde comprende adicionalmente un codón de parada entre V y B2. En ciertas realizaciones, en la composición molde para la determinación del factor de amplificación, cada oligonucleótido molde en la pluralidad de oligonucleótidos molde está presente en una cantidad sustancialmente equimolar. En ciertas realizaciones, el receptor inmunitario adaptativo se selecciona entre IGH, IGK e IGL, en donde (i) el polinucleótido V de (a) codifica, respectivamente, un polipéptido de la región V del receptor IGH, IGK, o IGL, y (ii) el polinucleótido J de (b) codifica, respectivamente, un polipéptido de la región J del receptor IGH, IGK o IGL.

En determinadas realizaciones, el conjunto de cebadores de amplificación oligonucleotídicos es capaz de amplificar ADN reordenado productivamente que codifica uno o una pluralidad de receptores inmunitarios adaptativos, en donde en dicha etapa (A) de amplificación, el conjunto de cebadores de amplificación oligonucleotídicos no incluye ningún cebador oligonucleotídico que hibride específicamente con un pseudogen u orfón de la región V o con un pseudogen u orfón de la región J. En ciertas realizaciones, la pluralidad de oligonucleótidos molde tienen una pluralidad de secuencias de fórmula general (I) que se seleccionan entre: (1) la pluralidad de secuencias de oligonucleótidos de fórmula general (I) en donde los polinucleótidos V y J tienen las secuencias V y J de IGH expuestas en al menos un conjunto de 127 SEQ ID NO de V y J de IGH, respectivamente, como se expone en Figura 11 como conjunto 1 de V/J de IGH, conjunto 2 de V/J de IGH, conjunto 3 de V/J de IGH, conjunto 4 de V/J de IGH, conjunto 5 de V/J de IGH, conjunto 6 de V/J de IGH, conjunto 7 de V/J de IGH, conjunto 8 de V/J de IGH y conjunto 9 de V/J de IGH; (2) la pluralidad de secuencias de oligonucleótidos de fórmula general (I) como se expone en SEQ ID NO: 3157-4014; (3) la pluralidad de secuencias de oligonucleótidos de fórmula general (I) como se expone en SEQ ID NO: 4015-4084; y (6) la pluralidad de secuencias de oligonucleótidos de fórmula general (I) como se expone en SEQ ID NO: 4085-5200.

En ciertas realizaciones de los métodos descritos anteriormente, la pluralidad de cebadores oligonucleotídicos del segmento V y del segmento J es capaz de amplificar el ADN reordenado productivamente que codifica uno o una pluralidad de receptores inmunitarios adaptativos, y en dicha etapa (a) de amplificación, los cebadores oligonucleotídicos del segmento V y del segmento J no incluyen ningún cebador oligonucleotídico que hibride específicamente con un pseudogén u orfón de la región V o con un pseudogén u orfón de la región J.

Por consiguiente, en ciertas realizaciones de algunos de los métodos descritos anteriormente, el método comprende adicionalmente cuantificar moléculas de ADN reordenado que codifican uno o una pluralidad de receptores inmunitarios adaptativos en ADN extraído de cada muestra biológica que comprende ADN de células linfoides del sujeto, comprendiendo cada receptor inmunitario adaptativo una región variable y una región de empalme, comprendiendo dicha etapa de cuantificación: (A) amplificar ADN en una reacción en cadena de polimerasa múltiple (PCR) que comprende: (1) ADN de la muestra biológica que comprende células linfoides del sujeto, (2) un conjunto de cebadores de amplificación oligonucleotídicos que es capaz de amplificar ADN reordenado que codifica uno o una pluralidad de receptores inmunitarios adaptativos en el ADN de la muestra biológica, comprendiendo el conjunto de cebadores: (a) en cantidades sustancialmente equimolares, una pluralidad de cebadores oligonucleotídicos del segmento V que son capaces cada uno independientemente de hibridar específicamente con al menos un polinucleótido que codifica un polipéptido de la región V del receptor inmunitario adaptativo o con el complemento del mismo, en donde cada cebador del segmento V comprende una secuencia de nucleótidos de al menos 15 nucleótidos contiguos que es complementaria a al menos un segmento génico funcional que codifica la región V del receptor inmunitario adaptativo y en donde la pluralidad de cebadores del segmento V hibrida específicamente con todos los segmentos génicos funcionales que codifican la región V del receptor inmunitario adaptativo que están presentes en la composición molde, y (b) en cantidades sustancialmente equimolares, una pluralidad de cebadores oligonucleotídicos del segmento J que son capaces cada uno independientemente de hibridar específicamente con al menos un polinucleótido que codifica un polipéptido de la región J del receptor inmunitario adaptativo o con el complemento del mismo, donde cada cebador del segmento J comprende una secuencia de nucleótidos de al menos 15 nucleótidos contiguos que es complementaria a al menos un segmento génico funcional que codifica la región J del receptor inmunitario adaptativo y en donde la pluralidad del cebadores del segmento J hibridan específicamente sustancialmente con todos los segmentos génicos que codifican la región J del receptor inmunitario adaptativo que están presentes en la composición molde, en donde los cebadores oligonucleotídicos del segmento V y del segmento J son capaces de promover la amplificación en dicha reacción en cadena de la polimerasa múltiple (PCR) de (i) sustancialmente todos los oligonucleótidos molde en la composición molde para producir una multiplicidad de moléculas de ADN molde amplificado, siendo dicha multiplicidad de moléculas de ADN molde amplificado suficientes para cuantificar la diversidad de los oligonucleótidos molde en la composición molde, y (ii) sustancialmente todas las moléculas de ADR reordenado que codifican receptores inmunitarios adaptativos en la muestra biológica para producir una multiplicidad de moléculas de ADN reordenado amplificado, siendo dicha multiplicidad de moléculas de ADN reordenado amplificado suficiente para cuantificar la diversidad de las moléculas de ADN reordenado en el ADN de la muestra biológica, y en donde cada molécula de ADN amplificada en la multiplicidad de moléculas de ADN molde amplificado y en la multiplicidad de moléculas de ADN reordenado amplificado es inferior a 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100, 90, 80 o 70 nucleótidos de longitud, y (3) una composición molde para la determinación del factor de amplificación en la que está presente un número conocido de una pluralidad de oligonucleótidos molde que tienen una secuencia oligonucleotídica única, comprendiendo la composición molde: una pluralidad de oligonucleótidos molde que tienen una pluralidad de secuencias oligonucleotídicas de fórmula general 5-U1-B1-V-B2-R-B3-J-B4-U2-3' [I] en donde: (a) V es un polinucleótido que comprende al menos 20, 30, 60, 90, 120, 150, 180, o 210, y no más de 1000, 900, 800, 700, 600 o 500 nucleótidos contiguos de una secuencia génica que codifica una región variable (V) del receptor inmunitario adaptativo, o el complemento de la misma, y en cada una de la pluralidad de secuencias de oligonucleótidos V comprende una secuencia oligonucleotídica única; (b) J es un polinucleótido que comprende al menos 15-30, 31-60, 61-90, 91-120 o 120-150, y no más de 600, 500, 400, 300 o 200 nucleótidos contiguos de una secuencia génica que codifica la región de empalme (J) del receptor inmunitario adaptativo, o el complemento de la misma, y en cada una de la pluralidad de secuencias de oligonucleótidos J comprende una secuencia oligonucleotídica única; (c) U1 no es nada o comprende un oligonucleótido que tiene una secuencia que se selecciona entre (i) una primera secuencia de oligonucleótido adaptador universal, y (ii) una primera secuencia oligonucleotídica específica de la plataforma de secuenciación que está conectada y posicionada en 5' con respecto a una primera secuencia de oligonucleótido adaptador universal; (d) U2 no es nada o comprende un oligonucleótido que tiene una secuencia que se selecciona entre (i) una segunda secuencia de oligonucleótido adaptador universal, y (ii) una segunda secuencia oligonucleotídica específica de la plataforma de secuenciación que está conectada y posicionada en 5' con respecto a una segunda secuencia de oligonucleótido adaptador universal; (e) B1, B2, B3 y b4 son cada uno independientemente, nada o cada uno comprende un oligonucleótido B que comprende una secuencia código de barras de oligonucleótido de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24 o 25, nucleótidos contiguos, en donde en cada una de la pluralidad de secuencias de oligonucleótidos B comprende una secuencia oligonucleotídica única que identifica de forma única, como una combinación emparejada, (i) la secuencia oligonucleotídica V única de (a) ) y (ii) la secuencia oligonucleotídica J única de (b); (f) R no es nada o comprende un sitio de reconocimiento para enzimas de restricción que comprende una secuencia oligonucleotídica que está ausente de (a) -(e), y en donde: g) al menos uno de: (i) la pluralidad de oligonucleótidos molde comprende al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51-100, 101-200, 201-300, 301-400, 401-500, 501-600, 601-700, 701­ 800, 801-900, 901-1000, 1001-1100, 1101-1200, 1201-1300, 1301-1400, 1401-1500, 1501-1600, 1601-1700, 1701­ 2000 o 2001-2500 secuencias de oligonucleótidos únicas, (ii) la pluralidad de oligonucleótidos molde comprende al menos un oligonucleótido molde que tiene una secuencia oligonucleotídica de fórmula general (I) con la que puede hibridar específicamente cada cebador oligonucleótido del segmento V y al menos un oligonucleótido molde que tiene una secuencia oligonucleotídica de fórmula general (I) con la cual puede hibridar específicamente cada cebador oligonucleotídico del segmento J, o (iii) la pluralidad de oligonucleótidos molde comprende al menos a o al menos b secuencias de oligonucleotídidos únicas, la que sea mayor, donde a es la cantidad de segmentos génicos que codifican la región V del receptor inmunitario adaptativo único en el sujeto y b es la cantidad de segmentos génicos que codifican la región J del receptor inmunitario adaptativo único en el sujeto, y la composición comprende al menos un oligonucleótido molde para cada polinucleótido V único y al menos un oligonucleótido molde para cada polinucleótido J único; (B) secuenciar cuantitativamente toda o una porción suficiente de cada una de dichas moléculas de ADN molde amplificado y cada una de dichas moléculas de ADN reordenado amplificado para cuantificar (i) una cantidad de producto molde de moléculas de ADN molde amplificado que contienen al menos una secuencia código de barras de oligonucleótido, y (ii) una cantidad de producto reordenado de moléculas de ADN reordenado amplificado que carecen de una secuencia código de barras de oligonucleótido; (C) calcular un factor de amplificación dividiendo la cantidad de producto molde de (B)(i) por la cantidad conocida de cada uno de la pluralidad de oligonucleótidos molde que tienen una secuencia oligonucleotídica única de (A)(2); y (D) dividir la cantidad de producto reordenado de (B)(ii) por el factor de amplificación calculado en (C) para cuantificar las moléculas de ADN que codifican el receptor inmunitario adaptativo único en la muestra.

En ciertas realizaciones adicionales, en la composición molde para la determinación del factor de amplificación, todos los oligonucleótidos molde en la pluralidad de oligonucleótidos molde tienen una longitud sustancialmente idéntica. En ciertas otras realizaciones adicionales, cada cebador en el conjunto de cebadores de amplificación oligonucleotídicos es capaz de hibridar específicamente con al menos un oligonucleótido molde en la pluralidad de oligonucleótidos de la composición molde. En ciertas otras realizaciones adicionales, cada oligonucleótido molde en la pluralidad de oligonucleótidos molde comprende adicionalmente un codón de parada entre V y B2. En ciertas otras realizaciones adicionales, en la composición molde para la determinación del factor de amplificación, cada oligonucleótido molde en la pluralidad de oligonucleótidos molde está presente en una cantidad sustancialmente equimolar. En ciertas otras realizaciones adicionales, el receptor inmunitario adaptativo se selecciona entre IGH, IGK e IGL, en donde (i) el polinucleótido V de (a) codifica, respectivamente, un IGH, IGK o polipéptido de la región V del receptor IGL, y (ii) el polinucleótido J de (b) codifica, respectivamente, un polipéptido de la región J del receptor TCRB, TCRG, TCRA, TCRD, IGH, IGK o IGL. En ciertas otras realizaciones adicionales, el conjunto de cebadores de amplificación oligonucleotídicos es capaz de amplificar ADN reordenado productivamente que codifica uno o una pluralidad de receptores inmunitarios adaptativos, y en donde en dicha etapa (A) de amplificación, el conjunto de cebadores de amplificación oligonucleotídicos no incluye ningún cebador oligonucleotídico que hibride específicamente con un pseudogen u orfón de la región V o con un pseudogen u orfón de la región J. En ciertas otras realizaciones adicionales, la pluralidad de oligonucleótidos molde tienen una pluralidad de secuencias de fórmula general (I) que se selecciona entre: (1) la pluralidad de secuencias de oligonucleótidos de fórmula general (I) en donde los polinucleótidos V y J tienen las secuencias V y J de IGH expuestas en al menos un conjunto de 127 SEQ ID NO de V y J de iGh , respectivamente, como se expone en Figura 11 como conjunto 1 de V/J de IGH, conjunto 2 de V/J de IGH, conjunto 3 de V/J de IGH, conjunto 4 de V/J de IGH, conjunto 5 de V/J de IGH, conjunto 6 de V/J de IGH, conjunto 7 de V/J de IGH, conjunto 8 de V/J de IGH y conjunto 9 de V/J de IGH; (2) la pluralidad de secuencias de oligonucleótidos de fórmula general (I) como se expone en SEQ ID NO: 3157-4014; (3) la pluralidad de secuencias de oligonucleótidos de fórmula general (I) como se expone en SEQ ID NO: 4015-4084; ; y (4) la pluralidad de secuencias de oligonucleótidos de fórmula general (I) como se expone en SEQ ID NO: 4085-5200.

Se describe en la presente memoria un método que comprende recibir un conjunto de datos que comprende datos de secuenciación para una pluralidad de amplicones obtenidos a partir de una primera muestra que comprende secuencias de ADN reordenado de una región que codifica la región determinante de la complementariedad 3 (CDR3) del receptor de células T (TCR) reordenada, obtenida la primera muestra de un sujeto; determinar a partir del conjunto de datos: la presencia de al menos una secuencia única de ADN reordenado indicativa de un tumor maligno hematológico linfoide clonal en la primera muestra, y una frecuencia de aparición relativa de la al menos única secuencia de ADN reordenado en la primera muestra; y comparar la frecuencia de aparición relativa de la al menos única secuencia de ADN reordenado en la primera muestra con una frecuencia de aparición relativa de la secuencia única de ADN reordenado en una segunda muestra, en donde una frecuencia de aparición relativa de la al menos una secuencia única de ADN reordenado de al menos 1 de cada 105 regiones codificantes de CDR-3 DE TCR es diagnóstica de enfermedad residual mínima para tumor maligno hematológico linfoide en el sujeto.

En ciertos casos, la primera muestra comprende células T. En ciertos casos, la segunda muestra comprende células T. En ciertos casos, la primera muestra comprende una pluralidad de células hematopoyéticas linfoides obtenidas del sujeto en un momento posterior al tratamiento del tumor maligno hematológico linfoide. En ciertos casos, la segunda muestra comprende una pluralidad de células hematopoyéticas linfoides obtenidas del sujeto en un punto temporal anterior al tratamiento. En ciertos casos, la etapa para determinar a partir del conjunto de datos la presencia de al menos una secuencia única de ADN reordenado indicativa de un tumor maligno hematológico linfoide clonal en la primera muestra comprende identificar una secuencia clonal que tiene una frecuencia relativa de al menos 15% de regiones que codifican CDR3 de TCRy reordenadas o regiones que codifican CDR3 de TCRp reordenadas. En ciertos casos, el conjunto de datos se obtiene amplificando mediante una reacción en cadena de polimerasa múltiple (PCR) una pluralidad de segmentos génicos de una región que codifica CDR3 de TCRy reordenada o una región que codifica CDR3 de TCRp reordenada, comprendiendo cada segmento génico una región variable (V) y una región de empalme (J), utilizando una pluralidad de cebadores oligonucleotídicos del segmento V, cada cebador oligonucleotídico de segmento V capaz de hibridar con uno o más polinucleótidos de la región V de TCR de los segmentos génicos; una pluralidad de cebadores oligonucleotídicos del segmento J, cada cebador del segmento J capaz de hibridar con uno o más polinucleótidos de la región J de TCR de los segmentos génicos; en donde la pluralidad de cebadores oligonucleotídicos del segmento V y cebadores oligonucleotídicos del segmento J promueven la amplificación de las regiones que codifican CDR3 de TCRy o las regiones que codifican CDR3 de TCRp en la primera muestra para producir una pluralidad de amplicones; y secuenciar la pluralidad de amplicones para determinar una secuencia de nucleótidos para cada uno de la pluralidad de amplicones.

En un caso adicional, el polinucleótido de la región V de TCR codifica un polipéptido Vy de TCR o un polipéptido Vp de TCR. En otro caso adicional, el polinucleótido de la región J de TCR codifica un polinucleótido J de TCRy o un polipéptido J de TCRp. En otro caso adicional, cada uno de la pluralidad de cebadores oligonucleotídicos del segmento V comprende una secuencia de nucleótidos de al menos 15 nucleótidos contiguos. En ciertos casos, la secuencia de nucleótidos es complementaria a un segmento génico que codifica V de TCRy funcional o un segmento génico que codifica Vp de TCR funcional. En ciertos casos, el segmento génico que codifica V de TCRy funcional o el segmento génico que codifica Vp de TCR funcional comprenden una secuencia señal de recombinación (RSS) del gen V. En ciertos casos, cada uno de la pluralidad de cebadores oligonucleotídicos del segmento J comprende una secuencia de nucleótidos de al menos 15 nucleótidos contiguos. En ciertas realizaciones, la secuencia de nucleótidos es complementaria a un segmento génico que codifica J de TCRy funcional o un segmento génico que codifica J de TCRp funcional. En ciertos casos adicionales, el segmento génico que codifica J de TCRy funcional o el segmento génico que codifica J de TCRp funcional comprenden una RSS del gen J.

De acuerdo con ciertos casos, la pluralidad de cebadores oligonucleotídicos del segmento V son complementarios a al menos 10, 20, 30 o 40 nucleótidos contiguos de un segmento génico que codifica TCRV. En una realización adicional, los al menos 10, 20, 30 o 40 nucleótidos contiguos están situados 5' con respecto a un gen V de RSS. En ciertas otros casos, la pluralidad de cebadores oligonucleotídicos del segmento J es complementaria a al menos 10, 20 o 30 nucleótidos contiguos de un segmento génico que codifica J de TCR. En ciertas realizaciones adicionales, los al menos 10, 20 o 30 nucleótidos contiguos de un segmento génico que codifica J de TCR están situados 3' con respecto a la RSS del gen J.

En otro caso, la etapa de amplificación comprende amplificar sustancialmente todos los segmentos génicos que comprenden regiones que codifican CDR3 de TCRy reordenadas o regiones CDR3 de TCRp reordenadas en la primera muestra. En otro caso, la pluralidad de cebadores oligonucleotídicos del segmento V hibrida sustancialmente con todos los segmentos génicos funcionales que codifican Vy de TCR o segmentos génicos que codifican Vp de TCR en la primera muestra. En otro caso, la pluralidad de cebadores oligonucleotídicos del segmento J hibrida sustancialmente con todos los segmentos génicos funcionales que codifican Jy de TCR o segmentos génicos que codifican Jp de TCR en la primera muestra. En otro caso, la pluralidad de amplicones es suficiente para cuantificar la diversidad de las regiones que codifican CDR3 de TCRy o la región que codifica CDR3 de TCRp en la primera muestra. En otro caso, cada amplicón secuenciado tiene una longitud inferior a 600 nucleótidos. En otro caso, la pluralidad de cebadores oligonucleotídicos del segmento V y la pluralidad de cebadores oligonucleotídicos del segmento J se seleccionan entre: (1) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 5579-5643, (2) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 5644-5792, (3) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 5793-5816, (4) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 5817-6123, (5) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 6124-6127 y 6212-6215, (6) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 6128-6211 y 6216-6221, (7) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 6222-6286, y (8) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 6222-6351.

En otro caso, uno o más de los cebadores oligonucleotídicos del segmento V comprenden una secuencia de nucleótidos que comprende al menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 5579-5630, 5644-5779, 5799-5816, 6124-6127, o 6222-6273. En otro caso, uno o más de los cebadores oligonucleotídicos del segmento J comprenden una secuencia de nucleótidos que comprende al menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 5631-5643, 5780-5798, 6212-6215 o 6274­ 6286. En otro caso, uno o más de los cebadores oligonucleotídicos del segmento V comprenden una secuencia de nucleótidos que comprende al menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 5579-5630, 5644-5779, 5799-5816, 6124-6127, o 6222-6273 y en donde uno o más de los cebadores oligonucleotídicos del segmento J comprenden una secuencia de nucleótidos que comprende al menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 5631-5643, 5780-5798, 6212-6215 o 6274­ 6286.

Se describe en la presente memoria un método que comprende: recibir un conjunto de datos que comprende datos de secuenciación para una pluralidad de amplicones obtenidos a partir de una primera muestra que comprende secuencias de ADN reordenado de una región que codifica la región determinante de la complementariedad 3 (CDR3) del receptor de células T reordenada, obtenida la primera muestra de un sujeto; determinar a partir del conjunto de datos una frecuencia de aparición relativa de cada amplicón secuenciado único; y determinar si el sujeto tiene un tumor maligno hematológico linfoide clonal basándose en la presencia o ausencia de al menos una secuencia única de ADN reordenado que tiene una frecuencia de aparición relativa que excede del 15% de regiones que codifican CDR3 de TCR reordenadas en la primera muestra, en donde la frecuencia de aparición relativa de la al menos única secuencia de ADN reordenado que excede del 15% es diagnóstica de un tumor maligno hematológico linfoide clonal en el sujeto. En otro caso, la frecuencia de aparición relativa de al menos una secuencia génica reordenada única es al menos 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29% o 30% de las regiones que codifican CDR3 de TCRy o las regiones que codifican CDR3 de TCRp reordenadas en la muestra. En otro caso, el método comprende adicionalmente determinar una ausencia de la muestra de al menos una secuencia única de ADN reordenado que tiene una frecuencia relativa de al menos 15% de regiones que codifican CDR3 de TCRy reordenadas o regiones que codifican CDR3 de TCRp reordenadas. En cierto caso, la etapa de determinación indica que el sujeto debe evaluarse para determinar un inmunofenotipo tímico precursor temprano.

En ciertos casos, el conjunto de datos se obtiene amplificando mediante una reacción en cadena de polimerasa múltiple (PCR) una pluralidad de segmentos génicos de una región que codifica CDR3 de TCRy reordenada o una región que codifica CDR3 de TCRp reordenada, comprendiendo cada segmento génico una región variable (V) y una región de empalme (J), utilizando: una pluralidad de cebadores oligonucleotídicos del segmento V, cada cebador oligonucleotídico de segmento V capaz de hibridar con uno o más polinucleótidos de la región V de TCR de los segmentos génicos; una pluralidad de cebadores oligonucleotídicos del segmento J, cada cebador del segmento J capaz de hibridar con uno o más polinucleótidos de la región J de TCR de los segmentos génicos; en donde la pluralidad de cebadores oligonucleotídicos del segmento V y cebadores oligonucleotídicos del segmento J promueven la amplificación de las regiones que codifican CDR3 de TCRy reordenadas o las regiones que codifican CDR3 de TCRp reordenadas en la muestra para producir una pluralidad de amplicones; y secuenciar la pluralidad de amplicones para determinar una secuencia de nucleótidos para cada uno de la pluralidad de amplicones. En ciertos casos adicionales, la pluralidad de cebadores oligonucleotídicos del segmento V y la pluralidad de cebadores oligonucleotídicos del segmento J se seleccionan entre: (1) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 5579-5643, (2) las secuencias expuestas en SEQ. ID NOs: 5644-5792, (3) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 5793-5816, (4) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 5817-6123, (5) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 6124-6127 y 6212­ 6215, (6) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 6128-6211 y 6216-6221, (7) las secuencias expuestas en Se Q ID NO: 6222-6286, y (8) las secuencias expuestas en SEQ ID n O: 6222-6351. En algunos otros ejemplos adicionales, uno o más de los cebadores oligonucleotídicos del segmento V comprenden una secuencia de nucleótidos que comprende al menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 5579-5630, 5644-5779, 5799-5816, 6124- 6127, o 6222-6273.

De acuerdo con un caso relacionado, uno o más de los cebadores oligonucleotídicos del segmento J comprenden una secuencia de nucleótidos que comprende al menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 5631-5643, 5780-5798, 6212-6215 o 6274-6286. En otro caso, uno o más de los cebadores oligonucleotídicos del segmento V comprenden una secuencia de nucleótidos que comprende al menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 5579-5630, 5644-5779, 5799-5816, 6124­ 6127, o 6222-6273 y en donde uno o más de los cebadores oligonucleotídicos del segmento J comprenden una secuencia de nucleótidos que comprende al menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 5631-5643, 5780-5798, 6212-6215 o 6274- 6286.

Se describe en la presente memoria un método que comprende recibir un conjunto de datos que comprende datos de secuenciación para una pluralidad de amplicones obtenidos a partir de una primera muestra que comprende secuencias de ADN reordenado de una región que codifica la región determinante de la complementariedad 3 (CDR3) del receptor de células T (TCR) reordenada o una región que codifica CDR3 de inmunoglobulina (Ig), obtenida la primera muestra de un sujeto; determinar a partir del conjunto de datos: la presencia de al menos una secuencia única de ADN reordenado indicativa de un tumor maligno hematológico linfoide clonal en la primera muestra, y una frecuencia de aparición relativa de la al menos única secuencia de ADN reordenado en la primera muestra; determinar si el sujeto tiene enfermedad residual mínima comparando la frecuencia de aparición relativa de al menos una secuencia única de ADN reordenado en la muestra con una frecuencia de aparición relativa de la secuencia única de ADN reordenado en una segunda muestra, en donde una frecuencia de aparición relativa de al menos 1 en 105 regiones que codifican CDR-3 de TCR o CDR-3 de Ig en la primera muestra es diagnóstica de enfermedad residual mínima para un tumor maligno hematológico linfoide. En otro caso, el conjunto de datos se obtiene amplificando mediante una reacción en cadena de polimerasa múltiple (PCR) una pluralidad de segmentos génicos de regiones que codifican la región determinante de la complementariedad 3 del receptor de células T (TCR) reordenadas o regiones que codifican CDR3 de inmunoglobulina (Ig), comprendiendo cada segmento génico una región variable (V) y una región de empalme (J), utilizando: una pluralidad de cebadores oligonucleotídicos del segmento V, cada cebador oligonucleotídico del segmento V capaz de hibridar con una o más polinucleótidos de la región V de TCR o uno o más polinucleótidos de la región V de Ig; una pluralidad de cebadores oligonucleotídicos del segmento J, cada cebador del segmento J capaz de hibridar con uno o más polinucleótidos de la región J de TCR o uno o más polinucleótidos de la región J de Ig de los segmentos génicos; en donde la pluralidad de cebadores oligonucleotídicos del segmento V y cebadores oligonucleotídicos del segmento J promueven la amplificación de las regiones que codifican CDR3 de TCR o las regiones codificantes de CDR3 de Ig en la primera muestra para producir una pluralidad de amplicones; y secuenciar la pluralidad de amplicones para determinar una secuencia de nucleótidos para cada uno de la pluralidad de amplicones.

En un caso, el polinucleótido de la región V de TCR codifica un polipéptido de la región V de TCR o un polipéptido de la región V de Ig. En un caso, el polinucleótido de la región J de TCR codifica un polinucleótido de la región J de TCR o un polipéptido de la región J de Ig. En otro caso, la pluralidad de cebadores oligonucleotídicos del segmento V y la pluralidad de cebadores oligonucleotídicos del segmento J se seleccionan entre: (1) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 5579-5643, (2) las secuencias expuestas en la SEQ ID NO: 5644-5792, (3) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 5793-5816, (4) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 5817-6123, (5) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 6124-6127 y 6212-6215, (6) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 6128-6211 y 6216-6221, (7) las secuencias expuestas en s Eq ID NO: 6222-6286, y (8) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 6222-6351. En otro caso, uno o más de los cebadores oligonucleotídicos del segmento V comprenden una secuencia de nucleótidos que comprende al menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 5579-5630, 5644-5779, 5799-5816, 6124-6127, o 6222-6273. En otro caso, uno o más de los cebadores oligonucleotídicos del segmento J comprenden una secuencia de nucleótidos que comprende al menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 5631-5643, 5780-5798, 6212-6215 o 6274-6286. En otro caso, uno o más de los cebadores oligonucleotídicos del segmento V comprenden una secuencia de nucleótidos que comprende al menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 5579-5630, 5644-5779, 5799-5816, 6124-6127, o 6222-6273 y en donde uno o más de los cebadores oligonucleotídicos del segmento J comprenden una secuencia de nucleótidos que comprende al menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 5631-5643, 5780-5798, 6212-6215 o 6274- 6286.

De acuerdo con ciertos casos adicionales de los métodos descritos anteriormente, el tumor maligno hematológico linfoide se selecciona entre: leucemia linfoblástica de células B aguda (T-ALL), leucemia linfoblástica de células p aguda (B-ALL), mieloma múltiple, plasmacitoma, macroglobulinemia, leucemia linfocítica crónica (CLL), leucemia linfoblástica aguda (ALL), mieloma múltiple, plasmacitoma, macroglobulinemia, leucemia linfocítica crónica (CLL), linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, linfoma cutáneo de células T, linfoma de células del manto, linfocitos T periféricos linfoma, leucemia de células pilosas, linfoma prolinfocítico T, linfoma de células T angioinmunoblástico, leucemia/linfoma linfoblástico de células T, linfoma de células T periférico, leucemia/linfoma de células T adultas, micosis fungoide, síndrome de Sezary, leucemia linfoblástica de células T, neoplasia mieloproliferativa y síndrome mielodisplásico.

En ciertos casos de los métodos descritos anteriormente, el método comprende adicionalmente: recibir un segundo conjunto de datos que comprende secuenciar datos para normalizar las eficacias de amplificación de una pluralidad de conjuntos de cebadores, comprendiendo el segundo conjunto de datos de secuenciación para una pluralidad de amplicones molde. En ciertos casos adicionales, el segundo conjunto de datos se obtiene amplificando mediante PCR múltiple una pluralidad de oligonucleótidos molde únicos para producir una pluralidad de amplicones molde únicos, teniendo cada oligonucleótido molde único una concentración conocida de moléculas y una secuencia código de barras única, y comprendiendo la pluralidad de conjuntos de cebadores una pluralidad de cebadores oligonucleotídicos del segmento V y una pluralidad de cebadores oligonucleotídicos del segmento J; y secuenciando cuantitativamente la pluralidad de amplicones molde únicos. En un caso, el método comprende adicionalmente el ajuste de la concentración de uno o más cebadores oligonucleotídicos del segmento V y uno o más cebadores oligonucleotídicos del segmento J para reducir la amplificación sesgada de segmentos de genes que codifican TCR o Ig en la primera muestra. En ciertos casos, la amplificación por PCR múltiple de una pluralidad de oligonucleótidos molde únicos comprende el uso de concentraciones equimolares de cebadores oligonucleotídicos del segmento V y cebadores oligonucleotídicos del segmento J. En ciertos casos, la pluralidad de cebadores oligonucleotídicos del segmento V y la pluralidad de cebadores oligonucleotídicos del segmento J se seleccionan entre: (1) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 5579-5643, (2) las secuencias expuestas en la SEQ ID NO: 5644-5792, (3) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 5793-5816, (4) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 5817-6123, (5) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 6124-6127 y 6212-6215, (6) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 6128-6211 y 6216-6221, (7) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 6222-6286, y (8) las secuencias expuesto en SEQ ID NO: 6222-6351.

En otro caso, el método descrito anteriormente comprende adicionalmente: cuantificar basándose en el primer conjunto de datos y el segundo conjunto de datos: (a) una cantidad de producto molde de amplicones molde que contienen al menos una secuencia código de barras de oligonucleótidos, y (b) una cantidad de producto reordenado amplicones secuenciados que carecen de una secuencia código de barras de oligonucleótidos; calcular un factor de amplificación dividiendo la cantidad de producto molde por la cantidad conocida de cada una de la pluralidad de oligonucleótidos molde únicos; y determinar la cantidad de secuencias que codifican TCR o Ig reordenadas únicas en la primera muestra dividiendo la cantidad de producto reordenado por el factor de amplificación. En un caso, el método comprende además determinar la cantidad de genomas únicos de células T o genomas de células B en la primera muestra.

De acuerdo con ciertos casos relacionados, la pluralidad de oligonucleótidos molde únicos comprende una fórmula general: 5'-U1-B1-V-B2-R-B3-J-B4-U2-3' (Fórmula I), en donde V comprende un polinucleótido que comprende al menos 20, 30, 60, 90, 120, 150, 180 o 210, y no más de 1000, 900, 800, 700, 600 o 500 nucleótidos contiguos de una secuencia génica que codifica la región V, o un complemento de la misma, y donde V comprende una secuencia oligonucleotídica única, en donde J es un polinucleótido que comprende al menos 15-30, 31-60, 61-90, 91-120, o 120­ 150, y no más de 600, 500, 400, 300 o 200 nucleótidos contiguos de una secuencia génica que codifica la región J, o un complemento de la misma, y en donde J comprende una secuencia oligonucleotídica única, en donde U1 no es nada o comprende un oligonucleótido que tiene una secuencia que se selecciona entre (i) una primera secuencia de oligonucleótido adaptador universal, y (ii) una primera secuencia oligonucleotídica específica de la plataforma de secuenciación que está conectada y posicionada en 5' con respecto a una primera secuencia de oligonucleótido adaptador universal, en donde U2 no es nada o comprende un oligonucleótido que tiene una secuencia que se selecciona entre (i) una segunda secuencia de oligonucleótido adaptador universal, y (ii) una segunda secuencia oligonucleotídica específica de la plataforma de secuenciación que está conectada y posicionada en 5' con respecto a una segunda secuencia de oligonucleótido adaptador universal, en donde B1, B2, B3 y B4 son cada uno independientemente nada o cada uno comprende un oligonucleótido B que comprende una secuencia código de barras de oligonucleótido de 3-25 nucleótidos contiguos, en donde en cada una de la pluralidad de secuencias de oligonucleótidos B comprende una secuencia oligonucleotídica única que identifica de forma única, como una combinación emparejada, una secuencia oligonucleotídica V única y una secuencia oligonucleotídica J única, y en donde R no es nada o comprende un sitio de reconocimiento para enzimas de restricción que comprende una secuencia oligonucleotídica no encontrada en el oligonucleótido molde.

Breve descripción de las diversas vistas de los dibujos

La Figura 1 (Fig. 1A-1B) representa la comparación de la evaluación de la clonalidad de células T en muestras de sangre de pacientes con T-ALL, mediante secuenciación de alto rendimiento (HTS) y citometría de flujo multiparamétrica (mpFC), antes del tratamiento (Día 0) y 29 días después del tratamiento (día 29). Los clones detectados mediante HTS (color rojo) se encontraron en las 12 muestras post-tratamiento informativas que fueron positivas para ERM mediante mpFC (color azul), así como en un nivel inferior en 10 pacientes adicionales, lo que sugiere una sensibilidad superior para HTS frente a mpFC. Los pacientes 39 y 52 tenían un inmunofenotipo próximo al del precursor tímico temprano (nETP); todos los demás tenían leucemia linfoblástica aguda de células T (T-ALL) típica. La Fig. 1A muestra la clonalidad de las células T según se detectó el día 0 utilizando citometría de flujo multiparamétrica (mpFC) y secuenciación de alto rendimiento (HTS) de regiones de ADN que codifican CDR3 de TCRp amplificadas y reordenadas. Las muestras con una población clonal fueron identificadas mediante secuenciación TCRB. Los datos se representan como la frecuencia de la secuencia clonal en la población total de células T. La Fig. 1B muestra la detección de enfermedad residual mínima (ERM) el día 29 en muestras de pacientes que exhibieron un reordenamiento de TCRp clonal identificable el día 0.

La Figura 2 muestra la detección de ERM en casos de precursores tímicos tempranos (ETP) o próximos a ETP (nETP) el día 29. Todos los casos (5/5) designados como precursor tímico temprano ETP (color amarillo), y la mayoría de los casos (6/8) designados como próximos a ETP (nETP, color verde) carecían de un reordenamiento de genes de TCRB clonal, completo el día 0, según se evaluó mediante HTS de regiones de ADN que codifican CDR3 de TCRp amplificadas y reordenadas. Estos casos, sin embargo, tenían ERM detectable mediante mpFC.

La Figura 3 muestra inmunofenotipos representativos de T-ALL caracterizados mediante mpFC de subtipo ETP (fila superior), subtipo próximo a ETP (fila central) y subtipo ALL típica/no ETP (fila inferior). Las poblaciones de linfoblastos T se muestran en color verde azulado. Se utilizaron los criterios referidos para el inmunofenotipo ETP (5). Cinco de 43 casos tenían un inmunofenotipo ETP. Ocho de 43 casos tenían un inmunofenotipo próximo a ETP. Los otros 30 casos fueron T-ALL típica y no fueron ni ETP ni próximos a ETP.

La Figura 4 (Fig. 4A-4B) muestra secuencias de genes de TCRB clonales caracterizadas en muestras del Día 0 (pretratamiento) mediante secuenciación de alto rendimiento (HTS) de regiones de ADN que codifican CDR3 de TCRp amplificadas y reordenadas. Las secuencias CDR3 de TCRB (TCRp) se muestran para casos típicos de T-ALL. 31 de 43 (72,1%) muestras de pretratamiento tenían una secuencia de TCRB clonal detectable; al menos 27 también tenían una secuencia TCRG (TCR^y ) clonal. Se muestran secuencias de CDR3 de TCRB con regiones de inserciones de nucleótidos (subrayado simple) y gen D (subrayado doble) destacadas.

La Figura 5 muestra una comparación de los repertorios de TCRB clónales normal y T-ALL por medio de la frecuencia de aparición relativa de los cinco clones de TCRB de frecuencia más alta basados en secuencias de TCRB identificadas mediante HTS en muestras de sangre de seis sujetos normales sanos (izquierda) y seis casos diagnosticados de T-ALL (derecha).

La Figura 6 muestra un diagrama esquemático de un oligonucleótido molde sintético ilustrativo para su uso en la determinación de un factor de amplificación para estimar la cantidad de secuencias codificantes del receptor inmunitario adaptativo reordenado (TCR o BCR) en una muestra. U1, U2, oligonucleótidos adaptadores universales; B1-4, oligonucleótidos código de barras; V, oligonucleótido de la región variable; J, oligonucleótido de la región de empalme; R, sitio de reconocimiento para enzimas de restricción; S, codón de parada opcional.

La Figura 7 muestra los resultados del cálculo de un factor de amplificación para cada par VJ en una composición molde que se añadió a una amplificación mediante PCR multiplexada de secuencias de IGH, y de la posterior realización del promedio del factor de amplificación en todos los moldes sintéticos para estimar la multiplicidad de cobertura de secuencia. Cada barra representa la cantidad total de moléculas sintéticas con la misma multiplicidad de cobertura de secuencia estimada. La mediana de la multiplicidad de cobertura de secuencia estimada fue de 3,25. La Figura 8 muestra un gráfico del número de células B que se estimaron mediante PCR multiplexada utilizando una composición molde sintética y un factor de amplificación calculado como se describe en la presente memoria, frente al número conocido de células B utilizadas como fuente de moldes de ADN natural. Se añadieron cantidades constantes de ADN total, de las cuales una proporción variada era ADN de células B, a reacciones de PCR multiplexadas. Además, se añadieron aproximadamente 5.000 moléculas de oligonucleótido molde sintético de fórmula general (I) (aproximadamente 4-5 moléculas de cada secuencia) en cada reacción. El número de genomas de células B presentes en el ADN añadido a cada reacción de PCR, según se estima por medio de la amplificación de las moléculas de oligonucleótidos molde sintéticas, se representa en el eje Y. En el eje X se muestra la cantidad real de ADN añadido a cada reacción de PCR. La correlación entre los valores reales y esperados fue r2 = 0,9988. La Figura 9 (Figuras 9A-9L) muestra conjuntos de V/J de TCRB ilustrativos (68 V 13 J) para su uso en composiciones molde que comprenden una pluralidad de secuencias de oligonucleótidos de fórmula general 5'-U1-B1-V-B2-R-B3-J-B4-U2-3' [I], para su uso en la determinación de un factor de amplificación cuando se amplifica ADN reordenado que codifica uno o una pluralidad de polipéptidos de la cadena p del receptor de células T humanas (TCRB).

La Figura 10 (Figuras 10A-10B) muestra conjuntos de V/J de TCRG ilustrativos (14 V 5 J) para su uso en composiciones molde que comprenden una pluralidad de secuencias de oligonucleótidos de fórmula general 5'-U1-B1-V-B2-R-B3-J-B4-U2-3' [I], para su uso en la determinación de un factor de amplificación cuando se amplifica ADN reordenado que codifica uno o una pluralidad de polipéptidos de la cadena y del receptor de células T humanas (TCRG).

La Figura 11 (Figuras 11A-11M) muestra conjuntos de V/J de IGH ilustrativos (127 V 9 J) para su uso en composiciones molde que comprenden una pluralidad de secuencias de oligonucleótidos de fórmula general 5'-U1-B1-V-B2-R-B3-J-B4-U2-3' [I], para su uso en la determinación de un factor de amplificación cuando amplifica ADN reordenado que codifica uno o una pluralidad de polipéptidos de cadena pesada de inmunoglobulina humana (IGH). La Figura 12 es un diagrama de bloques de alto nivel que ilustra una vista funcional de un sistema informático típico para su uso en métodos de acuerdo con ciertas realizaciones de la invención.

Breve descripción de las secuencias

SEQ ID NO: 1-871 son secuencias oligonucleotídicas molde de TCRB de una composición molde para la determinación del factor de amplificación.

SEQ ID NO: 872-1560 son secuencias oligonucleotídicas molde de TCRB de una composición molde para la determinación del factor de amplificación.

SEQ ID NO: 1561-1630 son secuencias oligonucleotídicas molde de TCRG de una composición molde para la determinación del factor de amplificación.

SEQ ID NO: 1631-1695 son secuencias de oligonucleótidos cebadores para la amplificación de TCRB (TCRB-J, SEQ ID NO: 1631-1643; TCRB-V, SEQ ID NO: 1644-1695).

SEQ ID NO: 1696-1709 son secuencias de oligonucleótidos cebadores para secuenciación de ADN.

SEQ ID NO: 1710-1731 son secuencias de oligonucleótidos adaptadores.

SEQ ID NO: 1732-1745 son secuencias de oligonucleótidos cebadores para la amplificación de TCRG (TCRG-V, SEQ ID NO: 1732-1741; TCRG-J, SEQ ID NO: 1742-1745).

SEQ ID NO: 1746-1747 son secuencias de oligonucleótidos adaptadores.

SEQ ID NO: 1748 es una secuencia código de barras de oligonucleótido ilustrativa.

SEQ ID NO: 1749 es una secuencia de polinucleótido V ilustrativa.

SEQ ID NO: 1750 es una secuencia de polinucleótido J ilustrativa.

SEQ ID NO: 1751-1752 son secuencias de oligonucleótidos adaptadores Illumina Nextera™.

SEQ ID NO: 1753-1804 son secuencias de oligonucleótidos cebadores para la amplificación de TCRB.

SEQ ID NO: 1805-2920 son secuencias oligonucleotídicas molde de IGH de una composición molde para la determinación del factor de amplificación.

SEQ ID NO: 2921-2988 son secuencias de polinucleótidos de V de TCRB para uso en una composición molde para la determinación del factor de amplificación.

SEQ ID NO: 2989-3001 son secuencias de polinucleótidos de J de TCRB para utilizar en una composición molde para la determinación del factor de amplificación.

SEQ ID NO: 3002-3015 son secuencias de polinucleótidos de V de TCRG para uso en una composición molde para la determinación del factor de amplificación.

Las SEQ ID NO: 3016-3020 son secuencias de polinucleótidos de J de TCRG para uso en una composición molde para la determinación del factor de amplificación.

Las SEQ ID NO: 3021-3147 son secuencias de polinucleótidos de V de IGH para utilizar en una composición molde para la determinación del factor de amplificación.

SEQ ID NO: 3148-3156 son secuencias de polinucleótidos J de IGH para uso en una composición molde para la determinación del factor de amplificación.

SEQ ID NO: 3157-4014 son secuencias oligonucleotídicas molde de TCRB de una composición molde para la determinación del factor de amplificación.

SEQ ID NO: 4015-4084 son secuencias oligonucleotídicas molde de TCRG de una composición molde para la determinación del factor de amplificación.

SEQ ID NO: 4085-5200 son secuencias oligonucleotídicas molde de IGH de una composición molde para la determinación del factor de amplificación.

SEQ ID NO: 5201-5286 son cebadores directos de oligonucleótidos para la amplificación de IGH.

SEQ ID NO: 5287-5293 son cebadores inversos de oligonucleótidos para la amplificación de IGH.

SEQ ID NO: 5294-5386 son secuencias de oligonucleótidos cebadores para la amplificación de IGH (V de IGH, SEQ ID NO: 5294-5379; J de IGH, SEQ ID NO: 5380-5386).

SEQ ID NO: 5387-5578 son secuencias de oligonucleótidos para cebadores de cola adaptadores.

SEQ ID NO: 5579-6382 son secuencias de oligonucleótidos cebadores para la amplificación de secuencias que codifican el receptor inmunitario adaptativo.

SEQ ID NO: 6383-6388 son ejemplos de cebadores oligonucleotídicos para amplificar secuencias de genes de control ("constitutivos").

Descripción detallada

La presente invención proporciona, en ciertas realizaciones y como se describe en la presente memoria, métodos sorprendentemente ventajosos para detectar enfermedad residual mínima (ERM) para tumores malignos hematológicos linfoides en sujetos que siguen el tratamiento para tales afecciones. Estas y otras realizaciones relacionadas están dirigidas en la parte pertinente al uso de metodologías de secuenciación de alto rendimiento (HTS) recientemente desarrolladas para la caracterización cualitativa y cuantitativa de secuencias de ADN reordenado de genes que codifican inmunoglobulinas (Ig) de células B.

La amplificación multiplexada y la secuenciación de alto rendimiento de las secuencias de ADN que codifican TCR y BCR (Ig ) reordenadas son descritas, por ejemplo, por Robins et al., 2009 Blood 114, 4099; Robins et al., 2010 Sci. Translat. Med. 2: 47ra64; Robins et al., 2011 J. Immunol. Meth. doi: 10.1016/j.jim.2011.09. 001; Sherwood et al. 2011 Sci. Translat. Med. 3: 90ra61; Publicación de Estados Unidos Núm. 2012/0058902, Publicación de Estados Unidos Núm. 2010/0330571, documento WO/2010/151416, documento WO/2011/106738 y documento WO2012/027503.

Ciertas realizaciones presentes pueden beneficiar de forma útil el tratamiento clínico en trastornos linfoides tales como tumores malignos hematológicos linfoides u otros trastornos linfoproliferativos, por ejemplo, leucemia/linfoma linfoblástico agudo de células T (T-ALL), facilitando el diagnóstico de la enfermedad y/o permitiendo la evaluación de enfermedad residual mínima en los pacientes después del tratamiento. Como se describe en la presente memoria, la secuenciación de alto rendimiento de los loci del gen del receptor de células T ofrece ventajas significativas sobre la evaluación previa del estado de ERM mediante citometría de flujo multiparamétrica de nueve colores (mpFC), que incluye una normalización más sencilla de las metodologías de ensayo de prueba.

Por ejemplo, los presentes métodos proporcionan ventajas en uno o más de sensibilidad, especificidad, tiempo, coste, preparación de reactivos, configuración y calibración del equipo, superación de la falta de fiabilidad de los métodos anteriores debido a la dependencia de manipulaciones subjetivas del operador y otros factores, en comparación ya sea con mpFC o con enfoques moleculares específicos del paciente para la evaluación de ERM. Como se describe en la presente memoria en los Ejemplos, los presentes métodos permitieron inesperadamente la detección de ERM con una sensibilidad comparable o mayor que la mpFC, así como una sorprendente detección de ERM en muestras de pacientes para las cuales la mpFC no identificó ERM. Además, las metodologías HTS actuales identificaron casos de T-ALL que exhiben propiedades similares a las del precursor tímico temprano (ETP). Los casos de ETP/T-ALL descritos en la presente memoria carecían de un reordenamiento del gen TCRB clonal en el momento del diagnóstico, como se identifica utilizando los métodos descritos en la presente memoria. En vista del curso clínico agresivo de ETP/T-ALL, la gestión mejorada de la enfermedad y otras ventajas sin precedentes asociadas con la clasificación temprana de ETP/T-ALL se proporcionan de este modo por medio de ciertas realizaciones que se divulgan en la presente memoria.

De acuerdo con algunas de las presentes realizaciones, la capacidad para caracterizar cualitativamente (por ejemplo, identificando secuencias únicas de regiones génicas que codifican CDR3 de Ig reordenadas en una muestra) y cuantitativamente (por ejemplo, determinando la frecuencia de aparición relativa de cualquier secuencia de ADN que codifica CDR3 de Ig única reordenada como una proporción del número total de secuencias codificantes de Ig en la muestra) la diversidad de receptores inmunitarios adaptativos proporciona los medios para diagnosticar enfermedades de células linfoides (por ejemplo, un tumor maligno hematológico linfoide), y también proporciona medios para detectar la presencia de enfermedad residual mínima (ERM) en un sujeto durante y después del tratamiento.

Los ejemplos ilustrativos y no limitantes de enfermedades de células linfoides para las que las realizaciones de la presente invención divulgadas pueden ayudar útilmente en el diagnóstico y/o detección de ERM incluyen tumores malignos hematológicos linfoides tales como leucemia linfoblástica aguda (ALL), mieloma múltiple, plasmacitoma, macroglobulinemia, leucemia linfocítica crónica (CLL), otros linfomas y leucemias incluyendo linfoma Hodgkin y no Hodgkin, linfoma cutáneo de células T, linfoma de células del manto, linfoma periférico de células T, leucemia de células pilosas, linfoma prolinfocítico de células T, linfoma angioinmunoblástico de células T, leucemia linfoblástica T/linfoma, linfoma de células T periférico-no especificado de otro modo, leucemia/linfoma de células T adultas, micosis fungoide, síndrome de Sezary, leucemia linfoblástica de células T y cualquier otro cáncer que implique células T o células B; y también puede incluir otros trastornos linfoproliferativos, incluyendo neoplasmas mieloproliferativos, síndrome mielodisplásico y otros.

La detección de ERM puede jugar un papel importante no solo en el control de la respuesta de un paciente a la terapia, sino también en el diagnóstico preciso de la causa subyacente de los principales signos clínicos. La ERM típicamente se refiere a la presencia de células malignas (generalmente en referencia a células leucémicas) que no son detectables basándose en la morfología celular. Varios estudios han demostrado que la detección cuantitativa de ERM en las neoplasias linfoides predice el resultado clínico. (Szczepanski T, et al., Lancet Oncol 2001; 2:409-17; van Dongen JJ, et al., Lancet 1998; 352:1731-8; Bruggemann M, et al., Acta Haematol 2004; 112:111-9; Cave H, et al., N Engl J Med 1998; 339:591-8; Coustan-Smith E, et al., Blood 2000; 96:2691-6; Coustan-Smith E, et al., Blood 2002; 100:52-8; Wells DA, et al., Am J Clin Pathol 1998; 110:84-94; Radich J, et al., Biol Blood Marrow Transplant 1995; 1:24-31; Bahloul M, et al., Best Pract Res Clin Haematol 2005; 18:97-111; Hoshino A, et al., Tohoku J Exp Med. 2004; 203:155-64; Ciudad J, et al., Br J Haematol 1999; 104:695-705; Lucio P, et al., Leukemia 1999; 13:419-27). Ciertas realizaciones contempladas que se relacionan con el diagnóstico, por ejemplo, pueden incluir la detección de ERM en linfomas realizando en primer lugar secuenciación de alto rendimiento (HTS) como se describe en la presente memoria de ADN que codifica uno o más receptores inmunitarios adaptativos (por ejemplo, Ig) en una muestra que contiene células linfoides obtenidas de linfa o ganglios linfáticos, sangre periférica u otros tejidos, para identificar una o más secuencias clonales de Ig, y pueden implicar adicionalmente el seguimiento de la frecuencia de aparición de tales secuencias clonales de Ig en muestras de sangre en uno o más puntos temporales posteriores.

El control de la respuesta de un paciente con cáncer a un tratamiento terapéutico basado en la cuantificación de la carga tumoral (por ejemplo, mediante la detección de ERM) puede ayudar a la evaluación de un riesgo relativo de recaída y también puede utilizarse para identificar pacientes que pueden beneficiarse de la reducción de la terapia, la intensificación de la terapia, la reducción de la inmunosupresión para el efecto de injerto contra leucemia después de un trasplante de células madre o terapia de células T adoptivas. (Bradfield SM, et al., Leukemia 2004; 18: 1156-8). También se puede encontrar enfermedad mínima en situaciones de diagnóstico. Por ejemplo, los bajos niveles de células B monoclonales en pacientes que se presentan clínicamente con citopenia pueden levantar sospechas para un diagnóstico de síndrome mielodisplásico. (Wells et al., Blood 2003; 102: 394-403). La detección de enfermedad mínima también se encuentra en la estadificación del linfoma, que puede implicar la detección de niveles bajos de células tumorales sobre un fondo de células normales. La detección de enfermedad mínima como se describe en la presente memoria (por ejemplo, como la detección de ERM en pacientes con cáncer linfoide después del tratamiento) no necesita limitarse a la verificación de los efectos del tratamiento, sino que también puede encontrar usos en entornos de diagnóstico donde no hay disponible una población de referencia para la comparación.

Se describe en la presente memoria un método para detectar enfermedad residual mínima que comprende amplificar el ADN extraído de una primera muestra (por ejemplo, médula ósea, linfa o sangre, dependiendo del tipo de cáncer) obtenida del paciente en una reacción en cadena de la polimerasa múltiple (PCR) utilizando conjuntos de cebadores del segmento V y J como se describe en la presente memoria y en uno o más de Robins et al., 2009 Blood 114, 4099; Robins et al., 2010 Sci. Translat. Med. 2:47ra64; Robins et al., 2011 J. Immunol. Meth. doi:10.1016/j.jim.2011.09. 001; Sherwood et al. 2011 Sci. Translat. Med. 3:90ra61; Publicación de Estados Unidos Núm. 2012/0058902, Publicación de Estados Unidos Núm. 2010/0330571, documento WO/2010/151416, documento WO/2011/106738 y documento WO2012/027503, en donde la primera muestra se toma en un primer punto temporal antes o durante un tratamiento terapéutico, y en donde la primera muestra comprende una población de células T o B, en donde los cebadores del segmento V y del segmento J permiten la amplificación de sustancialmente todas las combinaciones de segmentos V y J de un locus de TCR o Ig reordenado en la PCR múltiple para producir una multiplicidad de moléculas de ADN amplificadas que comprenden cada una una región que codifica CDR3 de TCR o Ig; medir una frecuencia relativa de las regiones que codifican CDR3 de TCR reordenadas de manera única, identificando de este modo la región que codifica CDR3 de TCR reordenada de manera única de los uno o más clones de células T malignas; amplificar con los cebadores del segmento V y los cebadores del segmento J el ADN extraído de una segunda muestra del paciente, en una reacción en cadena de la polimerasa múltiple (PCR), en donde la segunda muestra se toma en un punto temporal posterior a la primera muestra y en donde la segunda muestra comprende una población de células T o B, que mide la frecuencia relativa de la región que codifica CDR3 de TCR o Ig reordenada de manera única de los uno o más clones de células T o B malignas en la segunda muestra; en donde la presencia de la región que codifica CDR3 de TCR o Ig reordenada de manera única de los uno o más clones de células T o B malignas en la segunda muestra indica la presencia de enfermedad residual mínima.

En ciertos casos, la presencia de la región que codifica CDR3 reordenada de manera única de los uno o más clones malignos en la segunda muestra a una frecuencia relativa mayor que 10-6 regiones que codifican CDR3 de TCR indica la presencia de enfermedad residual mínima. En ciertos otros casos, la frecuencia relativa puede ser mayor que 9 x

10-5, 8 x 10-5, 7 x 10-5, 6 x 10-5, 5 x 10-5, 4 x 10-5, 3 x 10-5, 2 x 10-5, o 1 x 10-5, 9 x 10-4, 8 x 4, 4 x 10-4, 3 x 10-4, 2 x 10-4, o 1 x 10-4

Los presentes métodos se pueden utilizar, adicional o alternativamente, para diagnosticar un trastorno que afecta a células linfoides tales como un tumor maligno hematológico linfoide, por ejemplo una enfermedad maligna asociada con clones de células B o T específicos, donde se puede identificar al menos un clonotipo maligno específico en un paciente. Se puede detectar un clonotipo por la presencia en ADN extraído de una muestra de al menos una molécula de ADN reordenado que codifica una CDR3 de TCR o Ig y que tiene una secuencia de ADN única, donde la frecuencia relativa de la secuencia única de ADN reordenado se determina cuantificando la diversidad del receptor inmunitario adaptativo de acuerdo con los métodos descritos en la presente memoria.

Preferiblemente y en ciertas realizaciones, la detección de al menos una secuencia de ADN que codifica CDR3 reordenada única que tiene una frecuencia relativa de al menos 15% de la frecuencia de aparición de todas las secuencias que codifican CDR3 reordenadas detectables para un polipéptido del receptor inmunitario adaptativo concreto (por ejemplo, IgVH o IgVL) indica la presencia de un clonotipo asociado a tumor maligno. En ciertas otras realizaciones, la detección de al menos una secuencia de ADN que codifica CDR3 reordenada única que tiene una frecuencia relativa de al menos 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29% o 30% de la frecuencia de aparición de todas las secuencias codificantes de CDR3 reordenadas detectables para un polipéptido receptor inmunitario adaptativo concreto, indica la presencia de un clonotipo asociado a tumor maligno.

En ciertas otras realizaciones, se identifica un clonotipo que es diagnóstico para un tumor maligno hematológico linfoide clonal determinando primero un valor normalizado R^c (± desviación típica, DT) para la frecuencia de aparición relativa de la secuencia que codifica CDR3 reordenada única más abundante detectable para un polipéptido receptor inmunitario adaptativo concreto (por ejemplo, IgVH o IgVL) en una muestra de uno o más sujetos de control sanos normales, apropiadamente emparejados. A continuación, se determina R^x (± DT), la frecuencia de aparición relativa de secuencias codificantes de CDR3 reordenadas detectables para el polipéptido receptor inmunitario adaptativo concreto en una muestra de un sujeto que se sabe que tiene o se sospecha que tiene un tumor maligno hematológico linfoide. La muestra puede obtenerse del sujeto antes, durante o después del tratamiento, tal como tratamiento terapéutico dirigido al tumor maligno linfoide. Se puede considerar que existe tumor maligno hematológico linfoide clonal presente, de acuerdo con ciertas realizaciones independientes contempladas en la presente memoria, cuando

Rx tiene al menos 2,5, 3,0, 3,25, 3,5, 3,75, 4,0, 4,25, 4,5, 4,75 o 5,0 desviaciones típicas más altas que Rc. Para una muestra obtenida durante o después del tratamiento, Rx por lo tanto, se puede utilizar como un indicador de ERM. Por consiguiente, se puede identificar un clonotipo maligno en estas y en realizaciones relacionadas mediante la presencia, a un nivel relativo estadísticamente significativo, de un clonotipo en la población de regiones que codifican CDR3 reordenadas de manera única que se han amplificado y secuenciado utilizando los métodos de la presente memoria.

Ciertas realizaciones divulgadas actualmente permiten de forma ventajosa la determinación del número de células inmunitarias adaptativas (por ejemplo, linfocitos B) en una muestra que contiene células linfoides y que también puede contener células no linfoides, donde el ADN se extrae de la muestra para su uso como fuente de moldes para la amplificación multiplexada de ADN de acuerdo con los presentes métodos. En estas y otras realizaciones relacionadas, que se describen con mayor detalle en otra parte de la presente memoria, se incluye (o se "incorpora") a la reacción de amplificación multiplexada una composición molde artificial para la determinación del factor de amplificación. La secuenciación cuantitativa de los productos de amplificación de la composición molde (cuyos productos son identificables en virtud de secuencias únicas código de barras de oligonucleótidos contenidas en ella) permite el cálculo de un factor de amplificación que es una característica de la reacción de amplificación multiplexada concreta (por ejemplo, moldes, cebadores de amplificación, condiciones de reacción, etc.) que se ha realizado. El factor de amplificación se puede utilizar para calcular, a partir de los datos de secuenciación cuantitativa, la cantidad de moléculas únicas de ADN que codifican el receptor inmunitario adaptativo (por ejemplo, genomas de células linfoides que contienen el ADN del receptor inmunitario adaptativo reordenado que codifica el ADN) en la muestra.

Estas y otras realizaciones relacionadas comprenden adicionalmente cuantificar moléculas de ADN reordenado que codifican uno o una pluralidad de receptores inmunitarios adaptativos en ADN extraído de muestras biológicas que comprenden ADN de células linfoides de un sujeto como se proporciona en la presente memoria, realizando las etapas de amplificación en presencia de un cantidad conocida de la composición molde para la determinación del factor de amplificación; secuenciar cuantitativamente los productos de amplificación del ADN que codifica el receptor inmunitario adaptativo reordenado en la muestra y de la composición molde; calcular un factor de amplificación; y dividir el número de productos reordenados amplificados del ADN que codifica el receptor inmunitario adaptativo reordenado por el factor de amplificación para cuantificar las moléculas de ADN que codifican el receptor inmunitario adaptativo único que están presentes en la muestra.

Muestras y sujetos

El sujeto o la fuente biológica, a partir de los cuales se puede obtener una muestra biológica de prueba, puede ser un animal humano o no humano, o un organismo transgénico o clonado o modificado mediante ingeniería tisular (incluso a través del uso de células madre). En ciertas realizaciones preferidas de la invención, se puede conocer que el sujeto o fuente biológica tiene, o puede sospecharse que tiene o está en riesgo de tener, un cáncer hematopoyético linfoide u otra afección maligna, o una enfermedad autoinmunitaria, o una afección inflamatoria, y en ciertas realizaciones preferidas de la invención, se puede conocer que el sujeto o fuente biológica está libre de un riesgo o presencia de dicha enfermedad.

Ciertas realizaciones preferidas contemplan un sujeto o fuente biológica que es un sujeto humano tal como un paciente que ha sido diagnosticado de o está en riesgo de desarrollar o adquirir cáncer de acuerdo con criterios de diagnóstico clínico aceptados en la técnica, tales como los del U.S. National Cancer Institute (Bethesda, MD, EE. UU.) o como describen DeVita, Hellman y Rosenberg en Cancer: Principles and Practice of Oncology (2008, Lippincott, Williams y Wilkins, Filadelfia/Ovid, Nueva York); Pizzo y Poplack, Principles and Practice of Pediatric Oncology (Cuarta edición, 2001, Lippincott, Williams y Wilkins, Filadelfia/Ovid, Nueva York); Vogelstein y Kinzler, The Genetic Basis of Human Cancer (Segunda edición, 2002, McGraw Hill Professional, Nueva York)); Dancey et al. (2009 Semin. Oncol. 36 Supl.3: S46); ciertas realizaciones contemplan un sujeto humano que se sabe que está libre de riesgo de tener, desarrollar o adquirir cáncer de acuerdo con dichos criterios.

Ciertas otras realizaciones contemplan un sujeto no humano o una fuente biológica, por ejemplo, un primate no humano tal como un macaco, chimpancé, gorila, vervet, orangután, mandril u otro primate no humano, incluyendo tales sujetos no humanos que pueden ser conocidos en la técnica como modelos preclínicos, que incluyen modelos preclínicos para tumores sólidos y/u otros cánceres. Ciertas otras realizaciones contemplan un sujeto no humano que es un mamífero, por ejemplo, un ratón, rata, conejo, cerdo, oveja, caballo, bovino, cabra, jerbo, hámster, cobaya u otro mamífero; muchos de tales mamíferos pueden ser sujetos que se conocen en la técnica como modelos preclínicos para ciertas enfermedades o trastornos, incluyendo tumores malignos hematopoyéticos linfoides y/u otros cánceres (por ejemplo, Li et al., 2011 Dis. Model. Mech. 4:311; von Euler et al., 2011 Vet. Comp. Oncol. 9:1; Goldstein et al., 2010 Expert Rev. Hematol. 3:301; Diamond et al., 2009 J. Bone Min. Res. 24:1150; Macor et al., 2008 Curr. Pharm. Des. 14:2023; Talmadge et al., 2007 Am. J. Pathol. 170:793; Kerbel, 2003 Cane. Biol. Therap. 2 (4 Supl 1): S134; Man et al., 2007 Cane. Met. Rev. 26:737; Cespedes et al., 2006 Clin. Transl. Oncol. 8:318). Sin embargo, no se pretende que el intervalo de realizaciones esté tan limitado, de modo que también se contemplan otras realizaciones en las que el sujeto o la fuente biológica puede ser un vertebrado no mamífero, por ejemplo, otro vertebrado superior, o un anfibio aviar o especies de reptiles, u otro sujeto o fuente biológica.

Según se menciona también en otra parte de la presente memoria, se han establecido criterios de diagnóstico clínico aceptados en la técnica para estos y otros tipos de cáncer, tales como los promulgados por el U.S. National Cancer Institute (Bethesda, MD, USA) o como describen DeVita, Hellman, y Rosenberg en Cancer: Principles and Practice of Oncology (2008, Lippincott, Williams y Wilkins, Philadelphia/ Ovid, New York); Pizzo y Poplack, Principles and Practice of Pediatric Oncology (Fourth edition, 2001, Lippincott, Williams y Wilkins, Philadelphia/ Ovid, New York); y Vogelstein y Kinzler, The Genetic Basis of Human Cancer (Second edition, 2002, McGraw Hill Professional, New York). Por ejemplo Ignatiadis et al. (2008Pathobiol 75:104); Kunz (2008 Curr. Drug Discov. Technol. 5:9); y Auman et al. (2008 Drug Metab. Rev. 40:303) describen otros ejemplos no limitantes de tipificación y caracterización de cánceres concretos.

Se pueden proporcionar muestras biológicas obteniendo una muestra de sangre, una muestra de biopsia, un explante de tejido, un cultivo de órgano, un fluido biológico o cualquier otro tejido o preparación celular de un sujeto o una fuente biológica. Las células B y las células T pueden así obtenerse de una muestra biológica, tal como de una variedad de muestras de tejidos y fluidos biológicos que incluyen médula ósea, timo, ganglios linfáticos, nódulos linfáticos, tejidos periféricos y sangre, pero se accede más fácilmente a la sangre periférica. Se puede muestrear cualquier tejido periféri

En ciertas realizaciones relacionadas, se pueden preparar preparaciones que comprenden predominantemente linfocitos (por ejemplo, células T y B) o que comprenden predominantemente células T o predominantemente células B, incluyendo preparaciones en las que están presentes células de un tumor maligno hematológico linfoide, para su uso como una muestra biológica como se proporciona en la presente memoria, de acuerdo con lo establecido en el art. metodologías aceptadas. En otras realizaciones relacionadas, pueden aislarse subpoblaciones específicas de células T o B antes del análisis utilizando los métodos descritos en la presente memoria. Diversos métodos y kits disponibles comercialmente para aislar diferentes subpoblaciones de células T y B son conocidos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, selección de subconjuntos, separación de esferas inmunomagnéticas o clasificación de células mediante inmunocitometría de flujo utilizando anticuerpos específicos para uno o más de cualquiera de una variedad de marcadores de la superficie de células T y B conocidos. Los marcadores ilustrativos incluyen, pero no están limitados a, uno o una combinación de CD2, CD3, CD4, CD8, CD14, CD19, CD20, CD25, CD28, CD45RO, CD45RA, CD54, CD62, CD62L, CDw137 (41BB), CD154, GITR, FoxP3, CD54 y CD28. Por ejemplo, y como es sabido por los expertos, se pueden utilizar los marcadores de superficie celular, tales como CD2, CD3, CD4, CD8, CD14, CD19, CD20, CD45RA y CD45RO para determinar los linajes y subpoblaciones de T, B y monocitos. en citometría de flujo. De forma similar, los marcadores de dispersión de luz frontal, de dispersión lateral y/o de superficie celular tales como CD25, CD62L, CD54, CD137, CD154 se pueden utilizar para determinar el estado de activación y las propiedades funcionales de las células.

Las combinaciones ilustrativas útiles en algunos de los métodos descritos en la presente memoria pueden incluir CD8+CD45RO+ (células T citotóxicas de memoria), CD4+CD45RO+ (T colaboradoras de memoria), CD8+CD45RO-(CD8+CD62L+CD45RA+ (células T citotóxicas de tipo no tratado previamente);

CD4+CD25+CD62LhiGITR+FoxP3+ (células T reguladoras). Los anticuerpos ilustrativos para su uso en separaciones de células inmunomagnéticas o clasificación de células por inmunocitometría de flujo incluyen anticuerpos antihumanos marcados fluorescentemente, por ejemplo, CD4 FITC (clon M-T466, Miltenyi Biotec), CD8 PE (clon RPA-T8, BD Biosciences), CD45RO ECD (clon UCHL-1, Beckman Coulter), y CD45RO APC (clon UCHL-1, BD Biosciences). La tinción de PBMC totales se puede realizar con la combinación apropiada de anticuerpos, seguida de lavado de las células antes del análisis. Los subconjuntos de linfocitos se pueden aislar por clasificación celular activada por fluorescencia (FACS), por ejemplo, mediante un sistema de clasificación de células BD FACSAria™ (BD Biosciences) y analizando los resultados con el soporte lógico FlowJo™ (Treestar Inc.), y también mediante métodos conceptualmente similares que implican anticuerpos específicos inmovilizados en superficies o esferas.

Para la extracción de ácidos nucleicos, el ADN genómico total se puede extraer de las células utilizando métodos conocidos en la técnica y/o kits disponibles comercialmente, por ejemplo, mediante el uso de QIAamp® DNA Blood Mini Kit (QIAGEN®). La masa aproximada de un solo genoma haploide es de 3 pg. Preferiblemente, se utilizan para el análisis de al menos 25.000 a 250.000 células, por ejemplo, de al menos 50.000 a 125.000 células, o de al menos 75.000 a 150.000 células, o de al menos 100.000 a 200.000 células, es decir., de aproximadamente 0,15 a 1,5 pg, o por ejemplo, de 0,6 a 1,2 pg de ADN de células T o B diploides. El número de células T o B presentes en una muestra puede variar considerablemente cuando la muestra se obtiene de un paciente que tiene un tumor maligno hematológico linfoide, tal como leucemia linfoblástica de células T aguda (T-ALL). Usando PBMC de un ser humano adulto sano normal como fuente, se puede estimar que el número de células T es aproximadamente 30% del total de células; también se puede estimar que el número de células B es aproximadamente 10% del total de células en una preparación de PBMC.

Receptores adaptativos de células inmunitarias

El TCR nativo es una proteína de superficie celular heterodimérica de la superfamilia de inmunoglobulinas que está asociada a proteínas invariables del complejo CD3 implicado en la mediación de la transducción de señales. Los TCR existen en formas ap y y§, que son estructuralmente similares pero tienen ubicaciones anatómicas y probablemente funciones bastante distintas. Los ligandos MHC clase I y clase II, que se unen al TCR, también son proteínas de la superfamilia de inmunoglobulinas pero están especializados para la presentación de antígenos, con un sitio de unión de péptidos altamente polimórficos que les permite presentar una matriz diversa de fragmentos de péptidos cortos en la superficie de la célula APC.

Las porciones extracelulares de los TCR ap y y§ heterodíméricos nativos consisten en dos polipéptidos, cada uno de los cuales tiene un dominio constante proximal a la membrana y un dominio variable distal a la membrana. Cada uno de los dominios constantes y variables incluye un enlace disulfuro intracatenario. Los dominios variables contienen los bucles altamente polimórficos análogos a las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de los anticuerpos. Las CDR3 de los TCR ap interaccionan con el péptido presentado por MHC, y las CDR 1 y 2 de los TCR ap interaccionan con el péptido y el MHC. La diversidad de las secuencias de TCR se genera a través de la reorganización somática de los genes variable (V), de diversidad (D), de empalme (J) y constante.

Los loci del gen de Ig y TCR contienen muchos segmentos diferentes de genes variable (V), de diversidad (D) y de empalme (J), que se someten a procesos de reordenamiento durante la diferenciación linfoide temprana. Las secuencias de segmentos génicos V, D y J de Ig y TCR, son conocidas en la técnica y están disponibles en bases de datos públicas tales como GENBANK. Los ejemplos no limitantes de secuencias de l segmentos génicos de la región V de TCRB se exponen en el listado de secuencias de SEQ ID NO: 5579-5630, 5644-5779, 6222-6273 y 6287-6351, y se exponen ejemplos de secuencias de segmento de la región J de TCRB en SEQ ID NO: 5631-5643, 5780-5792 y 6274-6286. Las secuencias del segmento génico de la región J de TCRG ilustrativas se exponen en SEQ ID NO: 5793­ 5798 y 6212-6215. Las secuencias del segmento génico de la región V de TCRG ilustrativas se exponen en SEQ ID NO: 5799-5816 y 6124-6127. Las secuencias del segmento génico de la región J de IgH ilustrativas se exponen en SEQ ID NO: 5817-5832 y 6216-6221; las secuencias del segmento génico de la región V de IgH se exponen en SEQ ID NO: 5833-6123 y 6128-6211.

Los reordenamientos VDJ están mediados a través de un complejo enzimático de recombinasa en el que las proteínas RAG1 y RAG2 juegan un papel clave al reconocer y cortar el ADN en las secuencias señal de recombinación (RSS), que se encuentran aguas abajo de los segmentos génicos V, a ambos lados de los segmentos génicos D, y aguas arriba de los segmentos génicos J. La RSS inapropiada reduce o incluso evita por completo el reordenamiento. La secuencia señal de recombinación (RSS) consiste en dos secuencias conservadas (heptámero, 5'-CACAGTG-3' y nonámero, 5'-ACAAAAACC-3'), separadas por un espaciador de 12 /- 1 pb ("señal 12") o 23 /- 1 pb ("señal 23"). Se han identificado varias posiciones de nucleótidos como importantes para la recombinación, incluyendo el dinucleótido de CA en la posición uno y dos del heptamero, y también se ha mostrado que una C en la posición tres del heptámero es muy preferible, así como un nucleótido A en las posiciones 5, 6, 7 del nonámero. (Ramsden et. al 1994 Nucl. C.A. Res. 22:1785; Akamatsu et. al. 1994 J. Immunol. 153:4520; Hesse et. al. 1989 Genes Dev. 3:1053). Las mutaciones de otros nucleótidos tienen efectos mínimos o inconsistentes. El espaciador, aunque es más variable, también tiene un impacto sobre la recombinación, y se ha demostrado que las sustituciones de un solo nucleótido tienen un impacto significativo sobre la eficacia de la recombinación (Fanning et. al. 1996 Cell. Immunol. Immumnopath. 79:1, Larijani et. al 1999 Nucl. C.A. Res. 27:2304; Nadel et. al. 1998 J. Immunol. 161:6068; Nadel et al., 1998 J. Exp. Med. 187:1495). Se han descrito los criterios para identificar secuencias de polinucleótidos de RSS que tienen eficacias de recombinación significativamente diferentes (Ramsden et. al 1994 Nucl. C.A. Res. 22:1785; Akamatsu et. al. 1994 J. Immunol. 153:4520; Hesse et. al. 1989 Genes Dev. 3:1053 y Lee et al., 2003 PLoS 1(1): E1).

El proceso de reordenamiento generalmente comienza con un reordenamiento de D a J seguido de un reordenamiento de V a DJ en el caso de genes de cadena pesada de Ig (IgH), TCR beta (TCRB) TCR y delta (TCRD) o afecta a los reordenamiento de V a J directos en el caso de genes Ig kappa (IgK), Ig lambda (IgL), TCR alfa (TCRA) y TCR gamma (TCRG). Las secuencias entre los segmentos génicos que se reordenan generalmente se eliminan en forma de un producto de escisión circular, también denominado círculo de escisión TCR (TREC) o círculo de escisión del receptor de células B (BREC).

Las muchas combinaciones diferentes de segmentos de genes V, D y J representan el llamado repertorio combinatorio, que se estima que es ~2x106 para moléculas de Ig, ~3x106 para TCRap y ~5x103 para moléculas de TCRy§. En los sitios de unión de los segmentos génicos V, D y J, la deleción y la inserción aleatoria de nucleótidos se produce durante el proceso de reordenamiento, lo que da como resultado regiones de empalme muy diversas, que contribuyen significativamente al repertorio total de moléculas de Ig y TCR, estimadas en > 1012.

Los linfocitos B maduros amplían adicionalmente su repertorio de Ig tras el reconocimiento del antígeno en los centros del folículo mediante hipermutación somática, un proceso que conduce a la maduración por afinidad de las moléculas de Ig. El proceso de hipermutación somática se centra en el exón V-(D-) J de los genes de cadena ligera de IgH e Ig y se refiere a mutaciones de un único nucleótido y, a veces, también a inserciones o deleciones de nucleótidos. Los genes de Ig mutados somáticamente también se encuentran en tumores malignos de células B maduras de origen folicular o posfolicular.

En ciertas realizaciones preferidas descritas en la presente memoria, se pueden emplear cebadores del segmento V y del segmento J en una reacción de PCR para amplificar regiones de ADN que codifican CDR3 de Ig reordenadas en una muestra biológica de prueba, en donde cada segmento génico funcional que codifica V de Ig comprende un secuencia de señal de recombinación (RSS) del gen V y cada segmento génico funcional que codifica J de Ig comprende una RSS del gen J. En estas realizaciones y en realizaciones relacionadas, cada molécula de ADN reordenado amplificado puede comprender (i) al menos aproximadamente 10, 20, 30 o 40 nucleótidos contiguos de una hebra efectora del segmento génico que codifica V de Ig, estando situados al menos aproximadamente 10, 20, 30 o 40 nucleótidos contiguos 5' con respecto a la RSS del gen V y/o cada molécula de a Dn reordenado amplificado puede comprender (ii) al menos aproximadamente 10, 20 o 30 nucleótidos contiguos de una hebra efectora del segmento génico que codifica J de Ig, estando situados al menos aproximadamente 10, 20 o 30 nucleótidos contiguos 3' con respecto a la RSS del gen J. En ciertas realizaciones preferidas, cada región codificante de CDR3 de Ig amplificada está presente en una molécula de ADN reordenado amplificado que tiene una longitud inferior a 600 nucleótidos. Sin desear estar limitados por la teoría, estas características de diseño para amplificar regiones de empalme VJ que codifican CDR3 permiten la hibridación de cebadores del segmento V a sustancialmente todos los segmentos génicos funcionales que codifican V de Ig, y también permiten la hibridación de cebadores del segmento J a sustancialmente todos los segmentos funcionales que codifican J de Ig, y también permiten la amplificación de regiones que codifican CDR3 que son susceptibles de secuenciarse mediante las plataformas HTS descritas en la presente memoria, al tiempo que incluyen información de secuencia adecuada para identificar todas las posibles combinaciones VDJ y VJ.

PCR cuantitativa múltiple

Como se describe en la presente memoria y en vista de Robins et al., 2009 Blood 114, 4099; Robins et al., 2010 Sci. Translat. Medi. 2:47ra64; Robins et al., 2011 J. Immunol. Meth. doi:10.1016/j.jim.2011.09. 001; Sherwood et al. 2011 Sci. Translat. Med. 3:90ra61; la Publicación de Estados Unidos Núm. 2012/0058902, la Publicación de Estados Unidos Núm. 2010/0330571, el documento WO/2010/151416, el documento WO/2011/106738 y el documento WO2012/027503, se proporciona un método para cuantificar la representación relativa del ADN de células inmunitarias adaptativas en ADN a partir de una muestra biológica de prueba, y así determinar la frecuencia de aparición relativa para cada secuencia de ADN que codifica TCR o Ig reordenada única en una muestra que contiene células linfoides. De acuerdo con ciertas realizaciones preferidas, el método implica un método de PCR múltiple que utiliza un conjunto de cebadores directos que hibridan específicamente con los segmentos V y un conjunto de cebadores inversos que hibridan específicamente con los segmentos J, donde la reacción de PCR múltiple permite la amplificación de todas las combinaciones VJ (y VDJ) posibles dentro de una población dada de células B.

Se puede extraer ADN o ARN de células en una muestra, tal como una muestra de sangre o linfa u otra muestra de un sujeto que se sabe que tiene o se sospecha que tiene un tumor maligno hematológico linfoide, utilizando métodos convencionales o kits comercialmente disponibles conocidos en la técnica. Se puede utilizar un sistema de PCR múltiple para amplificar los loci del receptor de células inmunitarias adaptadas reordenados a partir de ADN genómico, preferiblemente de una región CDR3. En ciertas realizaciones, la región CDR3 se amplifica a partir de unlocus IgH o IgL (lambda o kappa). Se proporcionan composiciones que comprenden una pluralidad de cebadores del segmento V y del segmento J que son capaces de promover la amplificación en una reacción en cadena de polimerasa múltiple (PCR) de sustancialmente todas las regiones que codifican CDR3 del receptor inmunitario adaptativo reordenadas productivamente en la muestra para una clase dada de tales receptores (por ejemplo, IgH, etc.), para producir una multiplicidad de moléculas de ADN reordenado amplificado de una población de células B (para Ig) en la muestra. Preferiblemente y en ciertas realizaciones, los cebadores se diseñan de modo que cada molécula de ADN reordenado amplificado en la multiplicidad de moléculas de ADN reordenado amplificado tiene menos de 600 nucleótidos de longitud, excluyendo de este modo los productos de amplificación de loci adaptativos del receptor inmunitario no reordenados.

En el genoma humano actualmente se cree que hay aproximadamente 70 segmentos de genes Va de TCR y aproximadamente 61 Ja, aproximadamente 52 segmentos de genes Vp de TCR, aproximadamente 2 Dp y aproximadamente 13 Jp, aproximadamente 9 segmentos de genes Vy de TCR y aproximadamente 5 Jy, y aproximadamente 46 cadena pesada de inmunoglobulina (IGH) V^h, aproximadamente 23 segmentos de genes D^h y aproximadamente 6 JH. Por consiguiente, cuando se conocen secuencias genómicas para estos loci de manera que se pueden producir fácilmente sondas moleculares específicas para cada uno de ellos, se cree de acuerdo con la teoría no limitante que las presentes composiciones y métodos se refieren sustancialmente a todos (por ejemplo, más de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99%) estos segmentos génicos que codifican la región V, D y J de receptores inmunitarios adaptativos conocidos y fácilmente detectables.

Los genes de TCR e Ig pueden generar millones de proteínas distintas a través de mutación somática. Debido a este mecanismo generador de diversidad, las regiones determinantes de complementariedad hipervariables (CDR) de estos genes pueden codificar secuencias que pueden interactuar con millones de ligandos, y estas regiones están unidas a una región constante que puede transmitir una señal a la célula que indica la unión del ligando cognado de la proteína. El sistema inmunitario adaptativo emplea varias estrategias para generar un repertorio de receptores de antígenos de células T y B con diversidad suficiente para reconocer el universo de posibles patógenos. En las células T ap y y6, que reconocen principalmente antígenos peptídicos presentados por moléculas del MHC, la mayor parte de esta diversidad de receptores está contenida dentro de la tercera región determinante de complementariedad (CDR3) de las cadenas a y p del receptor de células T (o cadenas y y 6)

La tecnología de ensayo utiliza dos conjuntos de cebadores para proporcionar una reacción de PCR altamente multiplexada. El primer agrupamiento "directo" (por ejemplo, a modo de ilustración y no de limitación, los cebadores oligonucleotídicos del segmento V descritos en la presente memoria se pueden utilizar en ciertas realizaciones preferidas como cebadores "directos" cuando los cebadores oligonucleotídicos del segmento J se utilizan como cebadores "inversos" de acuerdo con la terminología de PCR comúnmente utilizada, pero el experto en la técnica apreciará que en ciertas otras realizaciones los cebadores del segmento J pueden considerarse cebadores "directos" cuando se utilizan con cebadores "inversos" del segmento V) incluye un cebador oligonucleotídico que es específico para (por ejemplo, que tiene una secuencia de nucleótidos complementaria a una región de secuencia única de) cada segmento codificante de la región V ("segmento V) en el locus del gen de TCR o Ig respectivo. En ciertas realizaciones, se utilizan cebadores que se dirigen a una región altamente conservada, para capturar simultáneamente muchos segmentos V, reduciendo así la cantidad de cebadores requeridos en la PCR múltiple. De manera similar, en ciertas realizaciones, los cebadores de grupo "inverso" hibridan con una secuencia conservada en el segmento de empalme ("J").

Cada cebador puede diseñarse de manera que se obtenga un segmento de ADN amplificado respectivo que incluya una porción de secuencia de longitud suficiente para identificar cada segmento J inequívocamente basándose en las diferencias de secuencia entre segmentos de genes codificantes de la región J en la base de datos del genoma humano, y también incluya una porción de secuencia con la que un cebador específico del segmento J pueda hibridar para su resecuenciación. Este diseño de cebadores específicos del segmento V y J permite la observación directa de una gran fracción de los reordenamientos somáticos presentes en el repertorio del gen del receptor inmunitario adaptativo dentro de un individuo. Esta característica a su vez permite la comparación rápida de los repertorios de TCR y/o Ig (i) en individuos que tienen una enfermedad, trastorno, afección u otra indicación de interés en particular (por ejemplo, cáncer, una enfermedad autoinmunitaria, un trastorno inflamatorio u otra afección) con (ii) los repertorios de TCR y/o Ig de sujetos de control que están libres de tales enfermedades, trastornos, afecciones o indicaciones.

El término "gen" significa el segmento de ADN implicado en la producción de una cadena polipeptídica tal como la totalidad o una porción de un polipéptido de TCR o Ig (por ejemplo, un polipéptido que contiene CDR3); incluye regiones que preceden y siguen a la región codificante "líder y trailer", así como secuencias intermedias (intrones) entre segmentos codificantes individuales (exones), y también puede incluir elementos reguladores (por ejemplo, promotores, potenciadores, sitios de unión represores y similares), y también puede incluir secuencias señal de recombinación (RSS) como se describe en la presente memoria.

Los ácidos nucleicos para su uso en las presentes realizaciones, a los que también se hace referencia en la presente memoria como polinucleótidos, y que incluyen oligonucleótidos, pueden estar en forma de ARN o en forma de ADN, cuyo ADN incluye ADNc, ADN genómico y ADN sintético. El ADN puede ser de doble hebra o de hebra sencilla, y si es de hebra sencilla puede ser la hebra codificante o la hebra no codificante (antisentido). Una secuencia codificante que codifica una inmunoglobulina o una región del mismo (por ejemplo, una región V, un segmento D, una región J, una región C, etc.) puede ser idéntica a la secuencia codificante conocida en la técnica para cualquier región de gen de TCR o inmunoglobulina o dominios de polipéptido dados (por ejemplo, dominios de la región V, dominios CDR3, etc.), o puede ser una secuencia codificante diferente, que, como resultado de la redundancia o degeneración del código genético, codifica la misma región o polipéptido de TCR o inmunoglobulina.

En una realización, los métodos pueden utilizar una pluralidad de cebadores del segmento V y una pluralidad de cebadores del segmento J, en donde la pluralidad de cebadores del segmento V y la pluralidad de cebadores del segmento J amplifican sustancialmente todas las combinaciones de los segmentos V y J de un locus del receptor inmunitario reordenado. Por sustancialmente todas las combinaciones se entiende al menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de todas las combinaciones de los segmentos V y J de un locus del receptor inmunitario reordenado. En ciertas realizaciones, la pluralidad de cebadores del segmento V y la pluralidad de cebadores del segmento J amplifican todas las combinaciones de los segmentos V y J de un locus del receptor inmunitario reordenado.

En general, un sistema de PCR múltiple puede utilizar al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25, y en ciertas realizaciones, al menos 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 o 39, y en otras realizaciones 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 65, 70, 75, 80, 85, o más cebadores directos, en el que cada cebador directo hibrida específicamente o es complementario a una secuencia correspondiente a uno o más segmentos de la región V. Los cebadores de la región V ilustrativos para la amplificación de TCRp se muestran en SEQ ID NO: 5579-5630. Los cebadores de la región V de TCRy ilustrativos se proporcionan en SEQ ID NO: 6124-6127. Los cebadores de la región V de IgH ilustrativos se proporcionan en SEQ ID No : 6128­ 6211. Por lo tanto, las secuencias del segmento génico de la región V se pueden utilizar para diseñar cebadores de la región V. Las secuencias del segmento génico de la región V de TCRB ilustrativos se exponen en la lista de secuencias en SEQ ID NO: 5579-5630, 5644-5779, 6222-6273 y 6287-6351. Las secuencias del segmento génico de la región V de TCRG ilustrativos se exponen en SEQ ID NO: 5799-5816 y 6124-6127. Las secuencias del segmento génico de la región V de IgH ilustrativas se exponen en SEQ ID NO: 5833-6123 y 6128-6211. En SEQ ID NO: 5579-5643, en los oligonucleótidos RN2, "r" representa una base ribonucleotídica en la secuencia oligonucleotídica y "/3SpC3/" representa un espaciador 3' de tres carbonos en el grupo hidroxilo, que evita la extensión y amplificación por la polimerasa. La endonucleasa de reparación del ADN escinde el oligonucleótido en el ribonucleótido después de la hibridación con una secuencia complementaria, creando un grupo hidroxilo no bloqueado que se puede extender mediante una polimerasa.

El sistema de PCR múltiple también usa al menos 3, 4, 5, 6 o 7, y en ciertas realizaciones, 8, 9, 10, 11, 12 o 13 cebadores inversos, en los que cada cebador inverso hibrida específicamente con o es complementario a una secuencia correspondiente a uno o más segmentos de la región J. Los cebadores ilustrativos del segmento J de TCRp se proporcionan en SEQ ID NO: 5631-5643. Los cebadores del segmento TCRy J ilustrativos se proporcionan en SEQ ID NO: 6212-6215. Los cebadores del segmento J de IgH ilustrativos se proporcionan en SEQ iD NO: 6216-6221. Por lo tanto, las secuencias del segmento génico de la región J se pueden utilizar para diseñar cebadores de la región J. Las secuencias de segmentos de regiones J de TCRB ilustrativas se exponen en SEQ ID NO: 5631-5643, 5780-5792 y 6274-6286. Las secuencias del segmento génico de la región J de TCRG ilustrativas se exponen en SEQ ID NO: 5793-5798 y 6212-6215. Las secuencias del segmento génico de la región J de IgH ilustrativas se exponen en SEQ ID NO: 5817-5832 y 6216-6221. En una realización, existe un cebador del segmento J para cada segmento J.

Los oligonucleótidos o polinucleótidos que son capaces de hibridar o reasociarse específicamente con una secuencia de ácido nucleico diana mediante la complementariedad de bases de nucleótidos pueden hacerlo bajo condiciones de rigurosidad de moderada a alta. Con fines ilustrativos, las condiciones de rigurosidad moderada a alta adecuadas para la amplificación por PCR específica de una secuencia de ácido nucleico diana serían de entre 25 y 80 ciclos de PCR, consistiendo cada ciclo en una etapa de desnaturalización (por ejemplo, aproximadamente 10-30 segundos a más de aproximadamente 95°C), una etapa de reasociación (por ejemplo, aproximadamente 10-30 s aproximadamente a 60-68°C), y una etapa de extensión (por ejemplo, aproximadamente 10-60 s a aproximadamente 60-72°C), opcionalmente de acuerdo con ciertas realizaciones, combinando las etapas de recocido y extensión para proporcionar una PCR en dos etapas. Como reconocería el experto en la técnica, se pueden añadir o cambiar otros reactivos de PCR en la reacción de PCR para aumentar la especificidad del emparejamiento del cebador y la amplificación, tal como alterando la concentración de magnesio, opcionalmente añadiendo DMSO, y/o utilizando cebadores bloqueados, nucleótidos modificados, ácidos péptidonucleicos y similares.

En ciertas realizaciones, se pueden utilizar técnicas de hibridación de ácidos nucleicos para evaluar la especificidad de hibridación de los cebadores descritos en la presente memoria. Las técnicas de hibridación son bien conocidas en la técnica de la biología molecular. Con fines de ilustración, las condiciones moderadamente restrictivas adecuadas para someter a ensayo la hibridación de un polinucleótido como se proporciona en la presente memoria con otros polinucleótidos incluyen prelavado en una solución de 5 X SSC, SDS al 0,5%, EDTA 1,0 mM (pH 8,0); hibridación a 50°C-60°C, 5 X SSC, durante la noche; seguido de un lavado dos veces a 65°C durante 20 minutos con cada uno de 2X, 0,5X y 0,2X SSC que contiene SDS al 0,1%. Un experto en la técnica entenderá que la rigurosidad de la hibridación puede manipularse fácilmente, por ejemplo alterando el contenido de sal de la solución de hibridación y/o la temperatura a la que se realiza la hibridación. Por ejemplo, en otra realización, las condiciones de hibridación altamente rigurosas adecuadas incluyen las descritas anteriormente, con la excepción de que se aumenta la temperatura de hibridación, por ejemplo, a 65°C-70°C.

CEBADORES. De acuerdo con la presente descripción, se proporcionan cebadores oligonucleotídicos en un conjunto de cebadores oligonucleotídicos que comprende una pluralidad de cebadores del segmento V y una pluralidad de cebadores del segmento J, donde el conjunto de cebadores es capaz de amplificar el ADN reordenado que codifica receptores inmunitarios adaptativos en una muestra biológico que comprende ADN de células linfoides. En la técnica se conocen conjuntos de cebadores adecuados y se describen en esta memoria, por ejemplo, los conjuntos de cebadores de los documentos Pub. US No. 2012/0058902; Pub. US No. 2010/0330571;

WO/2011/106738; o WO2012/027503 o similares; o aquellos mostrados en la Tabla 1. En ciertas realizaciones, el conjunto de cebadores está diseñado para incluir una pluralidad de cebadores específicos de secuencia V que incluye, para cada gen de la región V único (incluyendo pseudogenes) en una muestra, al menos un cebador que se puede reasociar específicamente con una secuencia de la región V única; y para cada gen único de la región J en la muestra, al menos un cebador que pueda reasociarse específicamente con una secuencia de la región J única.

El diseño del cebador puede lograrse mediante metodologías rutinarias a la vista de las secuencias genómicas conocidas de TCR y BCR. Por consiguiente, el conjunto de cebadores es preferiblemente capaz de amplificar todas las posibles combinaciones V-J que pueden resultar de reordenamientos de ADN en el locus de TCR o BCR. Como también se describe a continuación, ciertas realizaciones contemplan conjuntos de cebadores en los cuales uno o más cebadores para V pueden ser capaces de reasociarse específicamente con una secuencia "única" que puede ser compartida por dos o más regiones V pero que no es común a todas las regiones V, y/o en donde uno o más cebadores J pueden ser capaces de reasociarse específicamente con una secuencia "única" que puede ser compartida por dos o más regiones J pero que no es común a todas las regiones J.

En realizaciones concretas, los cebadores oligonucleotídicos para su uso en las composiciones y métodos descritos en la presente memoria pueden comprender o consistir en un ácido nucleico de al menos aproximadamente 15 nucleótidos de longitud que tiene la misma secuencia que, o es complementario a, una secuencia contigua larga de 15 nucleótidos del segmento V o J (es decir, porción de polinucleótido genómico que codifica un polipéptido de la región V o de la región J). También serán útiles en ciertas realizaciones cebadores más largos, por ejemplo, los de aproximadamente 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 45 o 50, nucleótidos de longitud que tienen la misma secuencia, o una secuencia complementaria a, una secuencia contigua del segmento de polinucleótido que codifica la región V o J. Todas las longitudes intermedias de los cebadores oligonucleotídicos descritos en la presente memoria se contemplan para su uso en la presente memoria. Como reconocería el experto en la técnica, los cebadores pueden tener una secuencia adicional añadida (por ejemplo, nucleótidos que pueden no ser iguales o complementarios al segmento polinucleotídico que codifica la región J o la región diana), tales como sitios de reconocimiento para enzimas de restricción, secuencias adaptadoras para la secuenciación, secuencias código de barras, y similares (véase por ejemplo, secuencias de cebadores proporcionadas en las Tablas y en la lista de secuencias de la presente memoria). Por lo tanto, la longitud de los cebadores puede ser más larga, tal como de aproximadamente 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 80, 85, 90, 95, 100 o más nucleótidos de longitud o más, dependiendo del uso específico o la necesidad.

También se contemplan para su uso en ciertas realizaciones variantes del cebador oligonucleotídico del segmento V o del segmento J del receptor inmunitario adaptativo que pueden compartir un alto grado de identidad de secuencia con los cebadores oligonucleotídicos para los que se presentan en la presente memoria secuencias de nucleótidos, incluyendo los establecidos en la Lista de Secuencias. Por lo tanto, en estas realizaciones y en realizaciones relacionadas, las variantes del cebador oligonucleotídico adaptativo del segmento V o del segmento J pueden tener una identidad sustancial con las secuencias de cebadores oligonucleotídicos del segmento V o del segmento J del receptor inmunitario adaptativo descritas en la presente memoria, por ejemplo, tales variantes del cebador oligonucleotídico pueden comprender al menos 70% de identidad de secuencia, preferiblemente al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99 % o mayor identidad de secuencia en comparación con una secuencia de polinucleótidos de referencia tal como las secuencias de oligonucleótidos cebadores descritas en la presente memoria, utilizando los métodos descritos en la presente memoria (por ejemplo, análisis BLAST utilizando parámetros normalizados). Un experto en esta técnica reconocerá que estos valores pueden ajustarse apropiadamente para determinar la capacidad correspondiente de una variante de cebador oligonucleotídico para reasociarse con un polinucleótido que codifica un segmento de receptor inmunitario adaptativo teniendo en cuenta la degeneración de codones, el posicionamiento de los marcos de lectura y similares.

Típicamente, las variantes de cebador oligonucleotídico contendrán una o más sustituciones, adiciones, deleciones y/o inserciones, preferiblemente de manera que la capacidad de emparejamiento del oligonucleótido variante no disminuya sustancialmente con respecto a la de una secuencia de cebador oligonucleotídico del segmento V o segmento J del receptor inmunitario adaptativo que se muestra específicamente en la presente memoria.

La Tabla 1 presenta como ejemplo no limitante un conjunto de cebadores oligonucleotídicos que es capaz de amplificar el ADN reordenado productivamente que codifica cadenas p de TCR (TCRB) en una muestra biológica que comprende ADN de células linfoides de un sujeto. En este conjunto de cebadores, los cebadores del segmento J comparten una homología de secuencia sustancial, y por lo tanto pueden cebar de manera cruzada más de una secuencia polinucleotídica J diana, pero los cebadores del segmento V están diseñados para reasociarse específicamente con secuencias diana dentro de la región CDR2 de V y son por lo tanto únicos para cada segmento V. Sin embargo, una excepción está presente en el caso de varios cebadores V en los que las secuencias dentro de la familia de los genes diana estrechamente relacionados son idénticas (por ejemplo, V6-2 y V6-3 son idénticos a nivel de nucleótidos en toda la secuencia codificante del segmento V, y por lo tanto pueden tener un único cebador, TRB2V6-2/3).

Por lo tanto, se apreciará que en ciertas realizaciones la cantidad de oligonucleótidos molde diferentes en la composición molde, y/o la cantidad de cebadores oligonucleotídicos diferentes en el conjunto de cebadores, se puede reducir ventajosamente diseñando molde y/o cebadores para explotar ciertas similitudes conocidas en secuencias V y/o J. Por lo tanto, en estas realizaciones y realizaciones relacionadas, las secuencias de oligonucleótidos "únicas" como se describe en la presente memoria pueden incluir secuencias de polinucleótidos V específicas que son compartidas por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 oligonucleótidos molde distintos y/o secuencias de polinucleótidos J específicas compartidas por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13 oligonucleótidos molde distintos, donde las secuencia de tales moldes difieren entre sí en otras secuencias distintas de las secuencias V y/o J compartidas.

De acuerdo con ciertas realizaciones contempladas actualmente, puede ser útil disminuir (por ejemplo, reducir de una manera estadísticamente significativa) el sesgo de amplificación del molde tal como el potencial de amplificación de ácido nucleico no uniforme entre los miembros de un conjunto de cebadores de amplificación que pueden resultar de eficacias de cebador desiguales (por ejemplo, utilización de cebadores desiguales) solo para un subconjunto limitado de todos los genes V y J de origen natural. Por ejemplo, en análisis del repertorio inmunitario de TCR o BCR implicado en una respuesta inmunitaria, ya sea a un antígeno específico, como en una vacuna, o a un tejido, como en una enfermedad autoinmunitaria, solo pueden interesar los reordenamientos productivos de TCR o IG. En tales circunstancias, puede ser económicamente ventajoso identificar y corregir el potencial de amplificación de ácidos nucleicos no uniforme solo para aquellos cebadores del segmento V y J que contribuyen a reordenamientos productivos de ADN que codifica TCR o BCR, y excluir los esfuerzos para corregir la amplificación no uniforme de pseudogenes y orfones (es decir, segmentos codificantes de la región V de TCR o BCR que se han duplicado en otros cromosomas).

En el locus de IGH humano, por ejemplo, la base de datos ImmunoGeneTics (IMGT) (M.-P. LeFranc, Université Montpellier, Montpellier, Francia; www .imgt.org) anota 165 genes del segmento V, de los cuales 26 son orfones en otros cromosomas y 139 están en el locus IGH en el cromosoma 14. Entre los 139 segmentos V dentro del locus de IGH, 51 tienen al menos un alelo funcional, mientras que 6 son ORF (marcos de lectura abiertos) a los que les falta al menos un residuo de aminoácido altamente conservado, y 81 son pseudogenes. Los pseudogenes pueden incluir segmentos V que contienen un codón de terminación dentro del marco dentro de la secuencia codificante del segmento V, un desplazamiento del marco entre el codón de inicio y la secuencia codificante CDR3, una o más inserciones de elementos repetidos y deleciones de regiones críticas, tales como primer exón o la RSS. Para caracterizar reordenamientos de IGH funcionales en una muestra mientras se evita el tiempo y el gasto de caracterizar pseudogenes y/u orfones, se contempla por lo tanto utilizar un subconjunto de los oligonucleótidos molde sintéticos descritos en la presente memoria que está diseñado para incluir solo aquellos segmentos V que participan en un reordenamiento funcional para codificar un TCR o BCR, sin tener que sintetizar ni calibrar cebadores de amplificación y oligonucleótidos molde específicos de las secuencias de pseudogen. De este modo se obtienen eficacias ventajosas con respecto, entre otros, a tiempo y gastos.

T l 1 n n r li n l í i il r i r P R h T RB

En ciertas realizaciones preferidas, los cebadores oligonucleotídicos del segmento V y del segmento J tal como se describe en la presente memoria están diseñados para incluir secuencias de nucleótidos de modo que la información adecuada esté presente dentro de la secuencia de un producto de amplificación de un gen del receptor inmunitario adaptativo (Ig) reordenado para identificar únicamente los genes tanto específicos de V como específicos de J que dan lugar al producto de amplificación en el locus del receptor inmunitario adaptativo reordenado (por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 pares de bases aguas arriba de la secuencia señal de recombinación (RSS) del gen V, preferiblemente al menos aproximadamente 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 35, 36, 37, 38, 39 o 40 pares de bases aguas arriba de la secuencia señal de recombinación (RSS) del gen V, y en ciertas realizaciones preferidas más de 40 pares de bases de secuencia aguas arriba de la secuencia de señal de recombinación (RSS) del gen V, y al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 pares de bases aguas abajo de la RSS del gen J, preferiblemente al menos aproximadamente 22, 24, 26, 28 o 30 pares de bases aguas abajo de la RSS del gen J, y en ciertas realizaciones preferidas, más de 30 pares de bases aguas abajo de la RSS del gen J).

Esta característica contrasta con los cebadores oligonucleotídicos descritos en la técnica para la amplificación de secuencias génicas que codifican TCR o que codifican Ig, que se basan principalmente en la reacción de amplificación simplemente para detectar la presencia o ausencia de productos de tamaños apropiados para segmentos V y J (por ejemplo, la presencia en productos de reacción de PCR de un amplicón de un tamaño concreto indica la presencia de un segmento V o J pero no proporciona la secuencia del producto de PCR amplificado y por lo tanto no confirma su identidad, tal como la práctica común de espectratipificación).

En ciertas realizaciones, los cebadores están diseñados para no cruzar un límite intrón/exón. Los cebadores directos en ciertas realizaciones se reasocian con los segmentos V en una región de conservación de secuencia relativamente fuerte entre segmentos V con el fin de maximizar la conservación de la secuencia entre estos cebadores. Por consiguiente, esto minimiza el potencial de propiedades de reasociación diferencial de cada cebador, y de modo que la región amplificada entre los cebadores V y J contiene suficiente información de secuencia V de TCR o Ig para identificar el segmento específico del gen V utilizado. En una realización, los cebadores del segmento J hibridan con un elemento conservado del segmento J y tienen una resistencia a la reasociación similar. En una realización concreta, los cebadores del segmento J se reasocian con el mismo motivo de la región marco conservada.

Se pueden preparar oligonucleótidos (por ejemplo, cebadores) mediante cualquier método adecuado, incluyendo la síntesis química directa mediante un método tal como el método del fosfotriéster de Narang et al., 1979, Meth. Enzymol. 68:90-99; el método del fosfodiéster de Brown et al., 1979, Meth. Enzymol. 68:109-151; el método de dietilfosforamidita de Beaucage et al., 1981, Tetrahedron Lett. 22:1859-1862; y el método de soporte sólido de la Patente de Estados Unidos Núm. 4.458.066. Una revisión de los métodos de síntesis de productos conjugados de oligonucleótidos y nucleótidos modificados es proporcionada por Goodchild, 1990, en Bioconjugate Chemistry 1(3):165-187.

El término "cebador", según se usa en la presente memoria, se refiere a un oligonucleótido capaz de actuar como un punto de iniciación de la síntesis de ADN en condiciones adecuadas. Tales condiciones incluyen aquellas en las que se induce la síntesis de un producto de extensión de cebador complementario a una hebra de ácido nucleico en presencia de cuatro nucleósidos trifosfato diferentes y un agente de extensión (por ejemplo, una ADN polimerasa o transcriptasa inversa) en un tampón apropiado y a una temperatura adecuada.

Un cebador es preferiblemente un ADN de hebra sencilla, pero en algunas realizaciones también puede incluir ARN. La longitud apropiada de un cebador depende del uso pretendido del cebador, pero típicamente varía de 6 a 50 nucleótidos, o en ciertas realizaciones, de 15-35 nucleótidos. Las moléculas de cebador cortas generalmente requieren temperaturas más frías para formar complejos híbridos suficientemente estables con el molde. Un cebador no necesita reflejar la secuencia exacta del ácido nucleico molde, sino que debe ser suficientemente complementario para hibridar con el molde. El diseño de cebadores adecuados para la amplificación de una secuencia diana dada es bien conocido en la técnica y se describe en la bibliografía citada en la presente memoria.

Como se describe en la presente memoria, los cebadores pueden incorporar características adicionales que permiten la detección o inmovilización del cebador, pero no alteran la propiedad básica del cebador, que actúa como un punto de iniciación de la síntesis de ADN. Por ejemplo, los cebadores pueden contener una secuencia de ácido nucleico adicional en el extremo 5' que no se hibrida con el ácido nucleico diana, pero que facilita la clonación, detección o secuenciación del producto amplificado. La región del cebador que es suficientemente complementaria al molde para hibridar se denomina en la presente memoria región de hibridación.

Según se utiliza en la presente memoria, un cebador es "específico" para una secuencia diana si, cuando se usa en una reacción de amplificación en condiciones suficientemente rigurosas, el cebador hibrida principalmente con el ácido nucleico diana. Típicamente, un cebador es específico para una secuencia diana si la estabilidad del dúplex cebadordiana es mayor que la estabilidad de un dúplex formado entre el cebador y cualquier otra secuencia encontrada en la muestra. Un experto en la técnica reconocerá que diversos factores, tales como las condiciones de sal, así como la composición de bases del cebador y la ubicación de los emparejamientos erróneos, afectarán a la especificidad del cebador, y que será necesaria en muchos casos la confirmación experimental rutinaria de la especificidad del cebador. Se pueden elegir condiciones de hibridación bajo las cuales el cebador puede formar dúplex estables solo con una secuencia diana. De este modo, el uso de cebadores específicos de la diana en condiciones de amplificación adecuadamente rigurosas permite la amplificación selectiva de aquellas secuencias diana que contienen los sitios de unión del cebador diana.

En realizaciones concretas, los cebadores para su uso en los métodos descritos en la presente memoria comprenden o consisten en un ácido nucleico de al menos aproximadamente 15 nucleótidos de longitud que tiene la misma secuencia que, o es complementaria a, una secuencia larga de 15 nucleótidos contiguos del segmento V o J diana. También serán útiles en ciertas realizaciones cebadores más largos, por ejemplo, los de aproximadamente 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 45 o 50, nucleótidos de longitud que tienen la misma secuencia que, o una secuencia complementaria a, una secuencia contigua del segmento V o J diana. Todas las longitudes intermedias de los cebadores mencionados anteriormente se contemplan para su uso en la presente memoria. Como reconocería el experto en la técnica, los cebadores pueden tener una secuencia adicional añadida (por ejemplo, nucleótidos que pueden no ser iguales o complementarios al segmento V o J diana), tales como sitios de reconocimiento de enzimas de restricción, secuencias adaptadoras para la secuenciación, secuencias código de barras, y similares (véanse por ejemplo, secuencias de cebadores proporcionadas en la presente memoria y en la lista de secuencias). Por lo tanto, la longitud de los cebadores puede ser más larga, tal como 55, 56, 57, 58, 59, 60, 65, 70, 75, nucleótidos de longitud o más, dependiendo del uso específico o la necesidad. Por ejemplo, en una realización, los cebadores directo e inverso se modifican ambos en el extremo 5' con la secuencia de cebador directo universal compatible con un secuenciador de ADN.

También se contemplan para su uso en ciertas realizaciones variantes del cebador oligonucleotídico del segmento V o del segmento J del receptor inmunitario adaptativo que pueden compartir un alto grado de identidad de secuencia con los cebadores oligonucleotídicos para los que se presentan secuencias de nucleótidos en la presente memoria, incluyendo las expuestas en la Lista de Secuencias. Por lo tanto, en estas realizaciones y realizaciones relacionadas, las variantes del cebador oligonucleotídico del segmento V o del segmento J del receptor inmunitario adaptativo pueden tener una identidad sustancial con las secuencias de cebadores oligonucleotídicos del segmento V o del segmento J del receptor inmunitario adaptativo descritas en la presente memoria, por ejemplo, tales variantes del cebador oligonucleotídico pueden comprender al menos 70% de identidad de secuencia, preferiblemente al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% o mayor identidad de secuencia en comparación con una secuencia de polinucleótidos de referencia tal como las secuencias de cebadores oligonucleotídicos descritas en la presente memoria, utilizando los métodos descritos en la presente memoria (por ejemplo, análisis BLAST utilizando parámetros convencionales). Un experto en esta técnica reconocerá que estos valores se pueden ajustar apropiadamente para determinar la capacidad correspondiente de una variante de cebador oligonucleotídico para reasociarse con un polinucleótido que codifica un segmento del receptor inmunitario adaptativo teniendo en cuenta la degeneración de codones, el posicionamiento de los marcos de lectura y similares.

Típicamente, las variantes de cebador oligonucleotídico contendrán una o más sustituciones, adiciones, deleciones y/o inserciones, preferiblemente de manera que la capacidad de reasociación del oligonucleótido variante no disminuya sustancialmente con respecto a la de una secuencia del cebador oligonucleotídico del segmento V o del segmento J del receptor inmunitario adaptativo que se expone específicamente en la presente memoria. Como también se observa en otra parte de la presente memoria, en realizaciones preferidas, los cebadores oligonucleotídicos del segmento V y del segmento J del receptor inmunitario adaptativo se diseñan para que sean capaces de amplificar una secuencia de IGH reordenada que incluye la región codificante para CDR3.

De acuerdo con ciertas realizaciones contempladas en la presente memoria, los cebadores para su uso en los métodos de PCR múltiple de la presente descripción pueden bloquearse funcionalmente para prevenir el cebado no específico de secuencias de células distintas de T o B. Por ejemplo, los cebadores pueden bloquearse con modificaciones químicas como se describe en la publicación de la Solicitud de Patente de Estados Unidos US2010/0167353. De acuerdo con ciertas realizaciones descritas en la presente memoria, el uso de tales cebadores bloqueados en las presentes reacciones de PCR múltiple implica cebadores que pueden tener una configuración inactiva en donde la replicación del ADN (es decir, la extensión del cebador) está bloqueada, y una configuración activada en donde prosigue la replicación del ADN. La configuración inactiva del cebador está presente cuando el cebador es de hebra sencilla o cuando el cebador hibrida específicamente con la secuencia de a Dn diana de interés, pero la extensión del cebador permanece bloqueada por un radical químico que está unido al extremo 3' del cebador o cerca del mismo.

La configuración activada del cebador está presente cuando el cebador hibrida con la secuencia de ácido nucleico diana de interés y posteriormente se actúa con ARNasa H u otro agente de escisión para eliminar el grupo 3' bloqueante, lo que permite que una enzima (por ejemplo, una ADN polimerasa) catalice la extensión del cebador en una reacción de amplificación. Sin desear estar limitados por la teoría, se cree que la cinética de la hibridación de tales cebadores es similar a una reacción de segundo orden y, por lo tanto, es una función de la concentración de la secuencia del gen de células T o células B en la mezcla. Los cebadores bloqueados minimizan las reacciones no específicas requiriendo la hibridación con la diana seguido de escisión antes de que pueda proseguir la extensión del cebador. Si un cebador hibrida incorrectamente con una secuencia que está relacionada con la secuencia diana deseada pero que difiere por tener uno o más nucleótidos no complementarios que dan como resultado emparejamientos erróneos de emparejamiento de bases, se inhibe la escisión del cebador, especialmente cuando hay un emparejamiento erróneo que se encuentra en o cerca del sitio de escisión. Esta estrategia para mejorar la fidelidad de la amplificación reduce la frecuencia del falso cebado en tales ubicaciones, y por lo tanto aumenta la especificidad de la reacción. Como reconocerá el experto en la técnica, las condiciones de reacción, particularmente la concentración de ARNasa H y el tiempo permitido para hibridación y extensión en cada ciclo, pueden optimizarse para maximizar la diferencia en las eficacias de escisión entre la escisión altamente eficaz del cebador cuando éste hibrida correctamente con su secuencia diana verdadera, y con una pobre escisión del cebador cuando existe un emparejamiento erróneo entre el cebador y la secuencia molde con la que éste se puede reasociar de forma incompleta.

Como se describe en el documento US2010/0167353, se conocen varios grupos de bloqueo en la técnica que pueden colocarse en, o cerca del extremo 3' del oligonucleótido (por ejemplo, un cebador) para prevenir la extensión. Se pueden modificar un cebador u otro oligonucleótido en el nucleótido 3'-terminal para prevenir o inhibir la iniciación de la síntesis de ADN mediante, por ejemplo, la adición de un residuo desoxirribonucleótido 3' (por ejemplo, cordicepina), un residuo 2',3'-dideoxirribonucleótido, enlaces no nucleotídicos o modificaciones alcano-diol (Patente de Estados Unidos Núm. 5.554.516). Las modificaciones alcano-diol que se pueden utilizar para inhibir o bloquear la extensión del cebador también han sido descritas por Wilk et al., (1990 Nucleic Acids Res. 18(8):2065), y por Arnold et al. (Patente de Estados Unidos Núm. 6.031.091). Los ejemplos adicionales de grupos de bloqueo adecuados incluyen sustituciones hidroxilo 3' (por ejemplo, 3'-fosfato, 3'-trifosfato o diésteres 3'-fosfato con alcoholes tales como 3-hidroxipropilo), 2'3'-fosfato cíclico, sustituciones hidroxilo 2' de una base de ARN terminal (por ejemplo, grupos fosfato o estéricamente voluminosos tales como triisopropil sililo (TIPS) o terc-butil dimetil sililo (TBDm S)). Los grupos 2'-alquilsililo tales como TIPS y TBDMS sustituidos en el extremo 3' de un oligonucleótido son descritos por Laikhter et al., Solicitud de Patente de Estados Unidos Núm. Ser. 11/686.894. Los sustituyentes voluminosos también pueden incorporarse en la base del residuo 3'-terminal del oligonucleótido para bloquear la extensión del cebador.

En ciertas realizaciones, el oligonucleótido puede comprender un dominio de escisión que se localiza aguas arriba (por ejemplo, 5' con respecto a) del grupo de bloqueo utilizado para inhibir la extensión del cebador. Como ejemplos, el dominio de escisión puede ser un dominio de escisión de ARNasa H, o el dominio de escisión puede ser un dominio de escisión de ARNasa H2 que comprende un único residuo de ARN o el oligonucleótido puede comprender la sustitución de la base de ARN por uno o más nucleósidos alternativos. Se describen dominios ilustrativos de escisión adicionales en el documento US2010/0167353.

Por lo tanto, un sistema de PCR múltiplex puede utilizar 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, o más cebadores directos, en donde cada cebador directo es complementario a un solo segmento funcional V de TCR o Ig o una pequeña familia de segmentos funcionales V de t Cr o Ig, por ejemplo, un segmento Vp de TCR (véanse por ejemplo, los cebadores TCRBV como se expone en la Tabla 1 y en la Lista de Secuencias, SEQ ID NO: 1644-1695) y, por ejemplo, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, o más cebadores inversos, cada uno específico para un segmento J de TCR o Ig, tal como el segmento Jp de TCR (véanse por ejemplo, los cebadores TCRBJ en la Tabla 1 y en la Lista de Secuencias, SEQ ID NO: 1631-1643). En otro caso, una reacción de PCR múltiple puede utilizar cuatro cebadores directos cada uno específico para uno o más segmentos funcionales V de TCRy y cuatro cebadores inversos, cada uno específico para uno o más segmentos J de TCRy. En otra realización, una reacción de PCR múltiple puede utilizar 84 cebadores directos cada uno específico para uno o más segmentos V funcionales y seis cebadores inversos, cada uno específico para uno o más segmentos J.

Las condiciones de termociclación pueden seguir los métodos de los expertos en la técnica. Por ejemplo, utilizando un termociclador PCR Express™ (Hybaid, Ashford, Reino Unido), se pueden utilizar las siguientes condiciones de ciclación: 1 ciclo a 95°C durante 15 minutos, 25 a 40 ciclos a 94°C durante 30 segundos, 59°C durante 30 segundos y 72°C durante 1 minuto, seguido de un ciclo a 72°C durante 10 minutos. Como reconocerá el experto en la técnica, las condiciones de termociclación pueden optimizarse, por ejemplo, modificando las temperaturas de reasociación, los tiempos de reasociación, la cantidad de ciclos y los tiempos de extensión. Como reconocería el experto en la técnica, la cantidad de cebador y otros reactivos de PCR utilizados, así como los parámetros de PCR (por ejemplo, temperatura de reasociación, tiempos de extensión y números de ciclo), pueden optimizarse para lograr la eficacia de amplificación de PCR deseada.

Alternativamente, en ciertas realizaciones relacionadas también contempladas en la presente memoria, se pueden utilizar métodos de "PCR digital" para cuantificar la cantidad de genomas diana en una muestra, sin la necesidad de una curva patrón. En la PCR digital, la reacción de PCR para una sola muestra se realiza en una multitud de más de 100 microceldas o gotitas, de modo que cada gotita se amplifica (por ejemplo, la generación de un producto de amplificación proporciona evidencia de la presencia de al menos una molécula molde en la microcelda o gotita) o no se amplifica (evidencia de que el molde no estaba presente en una microcelda o gotita dadas). Simplemente contando la cantidad de microceldas positivas, es posible contar directamente la cantidad de genomas diana que están presentes en una muestra de entrada.

Los métodos de PCR digital generalmente utilizan una lectura de punto final, en lugar de una señal de PCR cuantitativa convencional que se mide después de cada ciclo en la reacción de termociclación (véase, por ejemplo, Pekin et al., 2011 Lab. Chip 11 (13):2156; Zhong et al., 2011 Lab. Chip 11 (13):2167; Tewhey et al., 2009 Nature Biotechnol.

27:1025; 2010 Nature Biotechnol. 28:178; Vogelstein y Kinzler, 1999 Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 96: 9236­ 41; Pohl y Shih, 2004 Expert Rev. Mol. Diagn. 4(1);41-7, 2004). En comparación con la PCR tradicional, la dPCR tiene las siguientes ventajas: (1) no hay necesidad de confiar en referencias o patrones, (2) la precisión deseada se puede lograr aumentando el número total de réplicas de PCR, (3) es altamente tolerante a inhibidores, (4) es capaz de analizar mezclas complejas, y (5) proporciona una respuesta lineal al número de copias presentes en una muestra para permitir que se detecte un pequeño cambio en el número de copias. Por consiguiente, cualquiera de las composiciones descritas en la presente memoria (por ejemplo, composiciones molde y conjuntos de cebadores oligonucleotídicos específicos de genes receptores inmunitarios adaptativos) y los métodos pueden adaptarse para su uso en dicha metodología de PCR digital, por ejemplo, ABI QuantStudio™ 12K Flex System (Life Technologies, Carlsbad, CA), el sistema de PCR QX100™ Droplet Digital™ (BioRad, Hercules, CA), el sistema de PCR digital QuantaLife™ (BioRad, Hercules, CA) o el sistema de PCR digital de microgotita RainDance™ (RainDance Technologies, Lexington, MA).

Cuantificación de moléculas de ADN reordenado que codifican TCR e Ig en una muestra

De acuerdo con ciertas realizaciones descritas en la presente memoria, se puede determinar la proporción de células linfoides en una muestra que son cancerosas (por ejemplo, células malignas). La presente descripción, sin embargo, también contempla realizaciones en las que se puede calcular el número de células cancerosas linfoides en una muestra, del número total de células de entrada de la muestra. La presente descripción también contempla realizaciones en las que se puede calcular la proporción de células cancerosas linfoides en una muestra, del número total de células de entrada de la muestra.

Brevemente y a modo de ejemplo no limitante, para calcular el número de células cancerosas linfoides del número total de células de entrada de una muestra, se puede añadir ("incorporar"), a cada reacción de amplificación de los métodos descritos actualmente un número conocido de moléculas de oligonucleótido molde sintéticas de la composición molde descrita en la presente memoria para la determinación del factor de amplificación, que tienen las secuencias que corresponden a los sitios de cebado V y J. Las moléculas de oligonucleótido molde sintéticas incluyen un conjunto de oligonucleótidos que hibridan con un cebador V y un cebador J, en la orientación correcta, y un conjunto de oligonucleótidos código de barras como se describe en la presente memoria que identifican de manera única cada una de las distintas moléculas molde sintéticas. Como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente memoria, estas moléculas de oligonucleótido molde sintéticas también pueden incluir códigos de barras adicionales, conjuntos de identificación únicos adicionales de secuencias de oligonucleótidos y secuencias de cebadores universales.

De acuerdo con una realización, se proporciona una composición molde para la determinación del factor de amplificación en donde está presente un número conocido de una pluralidad de oligonucleótidos molde que tienen una secuencia oligonucleotídica única, comprendiendo la composición molde: una pluralidad de oligonucleótidos molde que tienen una pluralidad de secuencias de oligonucleótidos de fórmula general

5'-U1-B1-V-B2-R-B3-J-B4-U2-3' [I]

en donde:

(a) V es un polinucleótido que comprende al menos 20, 30, 60, 90, 120, 150, 180 o 210, y no más de 1000, 900, 800, 700, 600 o 500 nucleótidos contiguos de una secuencia génica que codifica la región variable (V) del receptor inmunitario adaptativo, o el complemento de la misma, y en cada una de la pluralidad de secuencias de oligonucleótidos V comprende una secuencia oligonucleotídica única;

(b) J es un polinucleótido que comprende al menos 15-30, 31-60, 61-90, 91-120 o 120-150, y no más de 600, 500, 400, 300 o 200 nucleótidos contiguos de una secuencia génica que codifica la región de empalme (J) del receptor inmunitario adaptativo, o el complemento de la misma, y en cada una de la pluralidad de secuencias de oligonucleótidos J comprende una secuencia oligonucleotídica única;

(c) U1 no es nada o comprende un oligonucleótido que tiene una secuencia que se selecciona entre (i) una primera secuencia de oligonucleótido adaptador universal, y (ii) una primera secuencia oligonucleotídica específica de la plataforma de secuenciación que está conectada y posicionada en 5' con respecto a una primera secuencia de oligonucleótido adaptador universal;

(d) U2 no es nada o comprende un oligonucleótido que tiene una secuencia que se selecciona entre (i) una segunda secuencia de oligonucleótido adaptador universal, y (ii) una segunda secuencia oligonucleotídica específica de la plataforma de secuenciación que está conectada y posicionada en 5' con respecto a una segunda secuencia de oligonucleótido adaptador universal;

(e) B1, B2, B3 y B4 son cada uno independientemente nada o cada uno comprende un oligonucleótido B que comprende una secuencia código de barras de oligonucleótido de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25, nucleótidos contiguos, en donde en cada una de la pluralidad de secuencias de oligonucleótidos B comprende una secuencia oligonucleotídica única que identifica de forma única, como una combinación pareada, (i) la secuencia oligonucleotídica V única de (a) y (ii) la secuencia oligonucleotídica J única de (b);

(f) R no es nada o comprende un sitio de reconocimiento para enzimas de restricción que comprende una secuencia oligonucleotídica que está ausente de (a) -(e), y en donde:

(g) al menos uno de: (i) la pluralidad de oligonucleótidos molde comprende al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51-100, 101-200, 201-300, 301-400, 401-500, 501-600, 601-700, 701-800, 801-900, 901­ 1000, 1001-1100, 1101-1200, 1201-1300, 1301-1400, 1401-1500, 1501-1600, 1601-1700, 1701-2000 o 2001-2500 secuencias de oligonucleótidos únicas, (ii) la pluralidad de oligonucleótidos molde comprende al menos un oligonucleótido molde que tiene una secuencia oligonucleotídica de fórmula general (I) con la que cada cebador oligonucleótido del segmento V puede hibridar específicamente y al menos un oligonucleótido molde que tiene una secuencia oligonucleotídica de fórmula general (I) con la que cada cebador oligonucleotídico del segmento J puede hibridar específicamente, o (iii) la pluralidad de oligonucleótidos molde comprende al menos a o al menos b secuencias de oligonucleótidos únicas, la que sea mayor, donde a es la cantidad de segmentos génicos que codifican la región V del receptor inmunitario adaptativo único en el sujeto y b es la cantidad de segmentos génicos que codifican la región J del receptor inmunitario adaptativo único en el sujeto, y la composición comprende al menos un oligonucleótido molde para cada polinucleótido V único y al menos un oligonucleótido molde para cada polinucleótido J único (Figura 6).

Debido a que las moléculas de oligonucleótidos molde sintéticos incluyen cada una un sitio de cebado para al menos uno de los cebadores de V y uno para los cebadores de J, los cebadores de amplificación múltiple de TCR o IG descritos en la presente memoria también amplifican estas moléculas de oligonucleótido molde sintéticas cuando los moldes sintéticos se "incorporan" a una reacción de amplificación multiplexada. El número de moléculas molde sintéticas únicas para la determinación del factor de amplificación que se pueden añadir ("incorporar") a la reacción de amplificación debe ser de al menos dos, pero puede comprender un número mucho mayor de secuencias únicas, por ejemplo, suficientes especies únicas para que la composición del molde para la determinación del factor de amplificación incluya moldes sintéticos a los que se pueda reasociar cada posible par de cebadores de V y J.

Ciertas realizaciones contemplan así una composición molde para la determinación del factor de amplificación que comprende al menos un oligonucleótido molde que tiene una secuencia oligonucleotídica de fórmula general (I) con la que cada cebador oligonucleotídico del segmento V puede hibridar específicamente y al menos un oligonucleótido molde que tiene una secuencia oligonucleotídica de fórmula general (I) con la que cada cebador oligonucleotídico del segmento J puede hibridar específicamente.

Ciertas otras realizaciones contemplan así una composición molde para la determinación del factor de amplificación que comprende al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51-100, 101-200, 201-300, 301­ 400, 401-500, 501-600, 601-700, 701-800, 801-900, 901-1000, 1001-1100, 1101-1200, 1201-1300, 1301-1400, 1401­ 1500, 1501-1600, 1601-1700, 1701-2000, o 2001-2500 secuencias de oligonucleótidos únicas.

Ciertas otras realizaciones contemplan así una composición molde para la determinación del factor de amplificación que comprende al menos a o al menos b secuencias de oligonucleótidos únicas, la que sea mayor, donde a es la cantidad de segmentos génicos que codifican la región V del receptor inmunitario adaptativo único en el sujeto y b es la cantidad de segmentos génicos que codifican la región J del receptor inmunitario adaptativo único en el sujeto, y la composición comprende al menos un oligonucleótido molde para cada polinucleótido V único y al menos un oligonucleótido molde para cada polinucleótido J único.

En la práctica, por ejemplo, si se añade una cantidad conocida de moléculas de oligonucleótido molde sintéticas, cada una con una secuencia de seguimiento código de barras única (B), a una reacción de amplificación multiplexada para amplificar secuencias de ADN reordenado que codifican un receptor inmunitario adaptativo, cuyos productos de amplificación se secuencian después cuantitativamente, se puede utilizar la cantidad de moléculas secuenciadas para calcular la cantidad de veces que se amplificó cada molécula de entrada. Este parámetro, descrito con mayor detalle a continuación, puede denominarse factor de amplificación.

En una aplicación simplificada no limitante e ilustrativa, el factor de amplificación se puede calcular como: Factor de Amplificación = Cántidad de Moléculas de Oligonucleótidos Molde Sintéticas Secuenciadas/Cántidad de Moléculas de Oligonucleótido Molde Sintéticas de Entrada. En otras realizaciones, el factor de amplificación se puede calcular para cada especie única de secuencia de molécula de oligonucleótido molde sintética que se incluye en una reacción de amplificación multiplexada, para obtener una distribución de factores de amplificación para la reacción. La mediana de esta distribución se puede utilizar como factor de amplificación final para el cálculo de la cantidad de moléculas de ADN que codifican el receptor inmunitario adaptativo único en la muestra. Si el factor de amplificación se calcula de forma única para cada tipo de molécula de oligonucleótido molde sintético de la composición molde para la determinación del factor de amplificación, se puede obtener y utilizar información sobre el sesgo de la amplificación del cebador (por ejemplo, diferencias estadísticamente significativas detectables en las eficacias con las que diferentes cebadores de amplificación amplifican sus secuencias molde afines) para corregir dicho sesgo que se puede introducir durante la reacción de amplificación multiplexada.

Como otro ejemplo no limitante, utilizando (i) el valor del factor de amplificación que se determina cuantificando los productos de amplificación de las moléculas de oligonucleótido molde sintéticas de la composición molde para la determinación del factor de amplificación, y (ii) la cantidad de moléculas de ADN reordenado que codifican los receptores inmunitarios adaptativos que se detectan mediante secuenciación cuantitativa de productos de amplificación multiplexados, se puede calcular el número inicial de células inmunitarias adaptativas en la muestra. Este cálculo es: Cántidad de Células de Entrada que Tienen ADN Reordenado que Codifica Receptores Inmunitarios Adaptativos = Cántidad de Secuencias del Receptor Inmunitario Adaptativo/Factor de Amplificación. A partir de la determinación de esta manera de el número de células de entrada en la muestra que tienen el ADN reordenado que codifica receptores inmunitarios adaptativos, se puede calcular un recuento probable del número de células cancerosas linfoides en la muestra.

En ciertas realizaciones, alternativamente o adicionalmente (por ejemplo, en paralelo), se puede calcular la proporción de células totales en la muestra que llevan una secuencia de ADN que codifica un receptor inmunitario adaptativo reordenado que está asociado con células cancerosas linfoides. En estas y otras realizaciones relacionadas, la reacción de amplificación incluye los cebadores múltiples V y J y también incluye un conjunto de cebadores de control que amplifican una región genómica con un número de copias conocido y consistente. Los genes diana adecuados para estos cebadores de control incluyen genes constitutivos, por ejemplo, HLA-DRB1, ABO, ZFXY u otros genes expresados amplia y constitutivamente. Los ejemplos no limitantes de tales cebadores se muestran en la Tabla 2. Los cebadores de control amplifican una región establecida del genoma. Para utilizar eficazmente el espacio de la celda de flujo del secuenciador maximizando la porción usada para determinar las secuencias codificantes del receptor inmunitario adaptativo y minimizando eso para determinar las secuencias de control genómico, los cebadores pueden modificarse para reducir la amplificación por PCR eficaz. La eficacia de amplificación de los cebadores de control genómico se puede limitar, por ejemplo, alterando las secuencias de los cebadores para introducir emparejamientos erróneos, y/o estos cebadores se pueden incluir en la reacción de amplificación a baja concentración. Si bien estas modificaciones no son necesarias, pueden aumentar el rendimiento de la secuenciación. Para estimar la proporción de células totales que son células linfoides cancerosas, se puede contar a continuación el número final de secuencias del gen diana.

Tabla 2: Cebadores de control ilustrativos Gen constitutivo

A continuación se presentan detalles adicionales con respecto a la determinación de los valores del factor de amplificación utilizando la composición molde descrita en la presente memoria para la determinación del factor de amplificación. La composición molde para la determinación del factor de amplificación comprende una pluralidad de diversos oligonucleótidos molde de fórmula general (I) como se describe con mayor detalle en la presente memoria:

5'-U1-B1-V-B2-R-B3-J-B4-U2-3' (I)

Los oligonucleótidos molde constituyentes, de los que está compuesta la composición molde, son diversos con respecto a las secuencias de nucleótidos de los oligonucleótidos molde individuales. Las secuencias de nucleótidos de los oligonucleótidos molde individuales pueden variar así considerablemente entre sí en función de la variabilidad de secuencia significativa entre el gran número de polinucleótidos de la región variable (V) y de empalme (J) de TCR o BCR posibles. Las secuencias de especies de oligonucleótidos molde individuales también pueden variar entre sí en función de las diferencias de secuencia en los oligonucleótidos U1, U2, B (B1, B2, B3 y B4) y R que se incluyen en un molde concreto dentro de la diversa pluralidad de moldes.

En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos código de barras B (B1, B2, B3 y B4) pueden comprender independientemente y opcionalmente una secuencia código de barras de oligonucleótidos, en donde la secuencia código de barras se selecciona para identificar únicamente una combinación emparejada particular de una secuencia oligonucleotídica V particular única y una secuencia oligonucleotídica J particular única. El posicionamiento relativo de los oligonucleótidos código de barras B1 y B4 y de los adaptadores universales permite de forma ventajosa una rápida identificación y cuantificación de los productos de amplificación de un oligonucleótido molde único dado por lecturas de secuencia cortas y secuenciación de extremos emparejados en secuenciadores de ADN automatizados (por ejemplo, Illumina HiSeq™ o Illumina MiSEQ®, o GeneAnalyzer™ -2, Illumina Corp., San Diego, CA). En particular, estas realizaciones y realizaciones relacionadas permiten una determinación rápida de alto rendimiento de combinaciones específicas de una secuencia V y una J que están presentes en un producto de amplificación, para caracterizar de ese modo la eficacia de amplificación relativa de cada cebador específico de V y cada cebador específico de J que puede estar presente en un conjunto de cebadores que es capaz de amplificar el ADN que codifica TCR o BCR reordenado en una muestra. La verificación de las identidades y/o cantidades de los productos de amplificación se puede realizar mediante lecturas de secuencia más largas, que incluyen opcionalmente lecturas de secuencia que se extienden hasta B2.

Al utilizarlo, cada oligonucleótido molde en la pluralidad de oligonucleótidos molde está presente en una cantidad sustancialmente equimolar, que en ciertas realizaciones preferidas incluye preparaciones en las que las concentraciones molares de todos los oligonucleótidos están dentro de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24 o 25 por ciento de cada uno. En ciertas otras realizaciones preferidas proporcionadas en la presente memoria, se considera que los olignucleótidos molde están presentes en una cantidad sustancialmente equimolar cuando las concentraciones molares de todos los oligonucleótidos están dentro de un orden de magnitud entre sí, incluyendo preparaciones en las que la mayor concentración molar que cualquier especie de oligonucleótido molde única puede tener no es mayor que 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 440, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40 o 30 por ciento mayor que la concentración molar a la que está presente la única especie de oligonucleótido molde que tiene la concentración más baja en la composición.

De manera similar, ciertas realizaciones descritas en la presente memoria contemplan conjuntos de cebadores oligonucleotídicos para la amplificación, en los que los conjuntos de cebadores componente pueden proporcionarse en cantidades sustancialmente equimolares. Como también se describe en la presente memoria, de acuerdo con ciertas otras realizaciones, la concentración de uno o más cebadores en un conjunto de cebadores puede ajustarse deliberadamente de modo que ciertos cebadores no estén presentes en cantidades equimolares o en cantidades sustancialmente equimolares.

Preferiblemente, todos los moldes en la composición molde para la determinación del factor de amplificación, que se describe en la presente memoria y que comprende una pluralidad de oligonucleótidos molde que tienen diversas secuencias y la estructura general de fórmula general (I), son oligonucleótidos de longitud sustancialmente idéntica. Sin desear estar limitados por la teoría, generalmente se cree que en una reacción de amplificación de ácido nucleico tal como una reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la longitud del ADN molde puede influir en la eficacia de amplificación de cebadores oligonucleotídicos al afectar la cinética de interacciones entre cebadores y moléculas de ADN molde con las que se reasocian los cebadores mediante hibridación específica dirigida a la secuencia de nucleótidos a través de la complementariedad de las bases de nucleótidos. En general, se considera que los moldes más largos funcionan de manera menos eficaz que los moldes relativamente más cortos. En ciertas realizaciones, la composición molde descrita actualmente para la determinación del factor de amplificación comprende una pluralidad de oligonucleótidos molde de fórmula general (I) como se proporciona en la presente memoria, en donde los oligonucleótidos molde tienen una longitud idéntica o una longitud sustancialmente idéntica que no es mayor que 1000, 950, 900, 850, 800, 750, 700, 650, 600, 550, 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150 o 100 nucleótidos de longitud, incluyendo todos los valores enteros entre ellos.

Por consiguiente, para reducir, eliminar o minimizar la contribución potencial a sesgos indeseables en la utilización de cebadores oligonucleotídicos durante la amplificación multiplexada, las realizaciones preferidas descritas en la presente memoria pueden emplear una pluralidad de oligonucleótidos molde en donde todos los oligonucleótidos molde en la pluralidad diversa de secuencia oligonucleotídica molde tienen una longitud sustancialmente idéntica. Una pluralidad de oligonucleótidos molde pueden tener una longitud sustancialmente idéntica cuando todos (por ejemplo, 100%) o la mayoría (por ejemplo, más de 50%) de tales oligonucleótidos en una composición molde son oligonucleótidos que tienen cada uno el mismo número exacto de nucleótidos, o donde la longitud de uno o más oligonucleótidos molde en la composición molde puede variar de uno a otro en no más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 nucleótidos de longitud. Se apreciará a partir de la presente descripción que incluso en situaciones en las que no todos los oligonucleótidos molde tienen exactamente la misma longitud, las composiciones y métodos descritos en la presente memoria pueden emplearse todavía para determinar un factor de amplificación como se describe en la presente memoria.

De acuerdo con ciertas realizaciones descritas actualmente, (i) cada oligonucleótido molde de la composición molde actualmente descrita se proporciona en una cantidad sustancialmente equimolar, (ii) el conjunto de cebadores oligonucleotídicos que es capaz de amplificar ADN reordenado que codifica una pluralidad de receptores inmunitarios adaptativos comprende una pluralidad de cebadores oligonucleotídicos del segmento V que se proporcionan en cantidades sustancialmente equimolares, (iii) el conjunto de cebadores oligonucleotídicos que es capaz de amplificar el ADN reordenado que codifica una pluralidad de receptores inmunitarios adaptativos comprende una pluralidad de cebadores oligonucleotídicos del segmento J que se proporcionan en cantidades sustancialmente equimolares, y (iv) la amplificación aumenta a escala linealmente con la cantidad de moldes iniciales de una secuencia dada.

Por lo tanto, se puede calcular un rendimiento esperado para el producto de amplificación de cada molde y asignar arbitrariamente un valor de nivel de amplificación uniforme teórico de 100%. Después de permitir que los conjuntos de cebadores amplifiquen las secuencias de los oligonucleótidos molde en una reacción de amplificación, cualquier desviación estadísticamente significativa de la equivalencia sustancial que se observa entre las proporciones relativas de distintos productos de amplificación indica que ha habido sesgo (es decir, eficacia desigual) en la utilización del cebador durante la amplificación. En otras palabras, las diferencias cuantitativas en las cantidades relativas de diferentes productos de amplificación que se obtienen indican que no todos los cebadores en el conjunto de cebadores han amplificado sus respectivos moldes con eficacias comparables. Ciertas realizaciones contemplan la asignación de un intervalo de tolerancias por encima y por debajo de un rendimiento teórico de 100%, de modo que cualquier valor de nivel de amplificación dentro del intervalo de tolerancias se puede considerar como equivalencia sustancial.

En ciertas de tales realizaciones, el intervalo de los rendimientos del producto de amplificación puede considerarse sustancialmente equivalente cuando los rendimientos del producto están todos dentro del mismo orden de magnitud (por ejemplo, difieren en menos de un factor de diez). En ciertas otras de tales realizaciones, el intervalo de rendimientos del producto de amplificación puede considerarse sustancialmente equivalente cuando los rendimientos del producto difieren entre sí en no más de nueve veces, ocho veces, siete veces, seis veces, cinco veces, cuatro o tres veces En ciertas otras realizaciones, los rendimientos del producto que pueden considerarse dentro de un intervalo de tolerancia aceptable pueden ser mayores o menores que un rendimiento calculado de 100% en hasta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 100 o 200%.

Debido a que el método implica determinar la secuencia de nucleótidos de cada producto de amplificación utilizando técnicas conocidas como parte del procedimiento de cuantificación, se pueden identificar los cebadores responsables de la amplificación de cada producto único (según la definición de la secuencia) y su cantidad o cantidades relativas en el conjunto de cebadores se pueden ajustar (por ejemplo, aumentar o disminuir de una manera estadísticamente significativa) en consecuencia. Las concentraciones de cebadores excesivamente eficaces en el conjunto de cebadores pueden reducirse con relación a las concentraciones de otros cebadores, de modo que el nivel de amplificación específica por dichos cebadores de moldes en la composición molde descrita en la presente memoria es sustancialmente equivalente al nivel de amplificación proporcionado por la mayoría de los cebadores que entregan el nivel de amplificación uniforme teórico, o que proporcionan un nivel que está dentro del intervalo de tolerancia aceptable. Las concentraciones de cebadores poco eficaces en el conjunto de cebadores pueden aumentarse con respecto a las concentraciones de otros cebadores, de modo que el nivel de amplificación específica por dichos cebadores de los moldes en la composición molde descrita en la presente memoria es sustancialmente equivalente al nivel de amplificación proporcionado por el la mayoría de los cebadores que proporcionan el nivel de amplificación uniforme teórico, o que proporcionan un nivel dentro del intervalo de tolerancia aceptable.

Proporcionando la composición molde descrita en la presente memoria como un patrón con el que pueden calibrarse conjuntos de cebadores oligonucleotídicos, y en realizaciones concretas, cuando cada oligonucleótido molde está presente en una cantidad sustancialmente equimolar de manera que las concentraciones de cebador individuales se pueden ajustar para producir amplificación sustancialmente uniforme de un conjunto estructuralmente diverso de productos de amplificación, la presente descripción supera de manera ventajosa los problemas descritos anteriormente asociados con los sesgos en la eficacia del cebador individual.

Utilizando las composiciones y métodos proporcionados en la presente memoria, los cebadores individuales pueden identificarse por tener un potencial de amplificación no uniforme en virtud de su promoción de la amplificación no uniforme como se evidencia por el aumento (por ejemplo, mayor de una manera estadísticamente significativa) o la disminución (por ejemplo, inferior de una manera estadísticamente significativa) de la amplificación de oligonucleótidos molde específicos con respecto al nivel de amplificación uniforme, a pesar de la presencia en una reacción de amplificación (i) de todos los oligonucleótidos molde en cantidades sustancialmente equimolares entre sí, (ii) de todos los cebadores del segmento V en cantidades sustancialmente equimolares entre sí, y (iii) de todos los cebadores del segmento J en cantidades sustancialmente equimolares entre sí.

Las concentraciones relativas de dichos cebadores se pueden reducir o aumentar a continuación para obtener un conjunto completo modificado de cebadores en donde no están presentes todos los cebadores en cantidades sustancialmente equimolares entre sí, para compensar, respectivamente, el aumento o disminución del nivel de amplificación relativo al nivel de amplificación uniforme. El conjunto de cebadores se puede volver a someter a ensayo a continuación para determinar su capacidad de amplificar todas las secuencias en la composición molde descrita en la presente memoria al nivel de amplificación uniforme, o dentro de un intervalo de tolerancia aceptable.

El procedimiento de someter a ensayo conjuntos de cebadores modificados por su capacidad de amplificar la composición molde descrita en la presente memoria, en donde todos los oligonucleótidos molde se proporcionan en cantidades sustancialmente equimolares entre sí, puede repetirse iterativamente hasta que todos los productos se amplifiquen al nivel de amplificación uniforme, o dentro de un intervalo de tolerancia aceptable. Mediante un procedimiento de este tipo utilizando la composición molde descrita en la presente memoria, se puede normalizar la eficacia de amplificación de un conjunto de cebadores oligonucleotídicos, donde el conjunto de cebadores es capaz de amplificar ADN reordenado productivamente que codifica uno o una pluralidad de receptores inmunitarios adaptativos en una muestra biológica que comprende ADN de células linfoides de un sujeto.

Adicional o alternativamente, de acuerdo con la presente descripción, se puede determinar si un par concreto de cebadores de amplificación oligonucleotídicos muestra un potencial de amplificación no uniforme, tal como un aumento o disminución de amplificación de la composición molde con respecto a un nivel de amplificación uniforme exhibido por la mayoría de los cebadores de amplificación oligonucleotídicos y se pueden utilizar un factor de ajuste de normalización para calcular, respectivamente, una frecuencia relativa de aparición o disminución de los productos de amplificación promovida por cada uno de dichos pares de cebadores de amplificación. Las presentes composiciones molde de esta manera, en ciertas realizaciones, proporcionan un método para corregir el potencial de amplificación de ácidos nucleicos no uniforme entre los miembros de un conjunto de cebadores de amplificación oligonucleotídicos.

Ciertas realizaciones de este tipo pueden permitir ventajosamente la corrección, calibración, homogeneización, normalización o similar de datos que se obtienen como consecuencia de eventos de amplificación no uniformes. Por lo tanto, las presentes realizaciones permiten la corrección de imprecisiones de datos, tales como las pueden resultar de la utilización de cebadores oligonucleotídicos sesgados, sin la necesidad de ajustar iterativamente las concentraciones de uno o más cebadores de amplificación y repetir las etapas de amplificar las composiciones molde descritas en la presente memoria. De este modo, se pueden obtener eficacias ventajosas cuando se puede evitar la repetición de las etapas de secuenciación cuantitativa de los productos de amplificación. Sin embargo, algunas otras realizaciones contempladas pueden emplear tal enfoque iterativo.

Por consiguiente, y como se describe en la presente memoria, en la actualidad se proporciona una composición molde para la determinación del factor de amplificación, junto con métodos para utilizar dicha composición molde. También se describen en la presente memoria métodos para corregir tales potenciales de amplificación de ácidos nucleicos no uniformes (por ejemplo, sesgos) entre los miembros del conjunto de cebadores oligonucleotídicos. Estas realizaciones y realizaciones relacionadas explotan beneficios previamente no reconocidos que se obtienen calibrando conjuntos de cebadores oligonucleotídicos complejos para compensar los sesgos de amplificación no deseables utilizando la composición molde para la determinación del factor de amplificación que tiene las características descritas en la presente memoria, y encontrarán usos para mejorar la precisión con la cual el TCR clonotípico específico y/o las secuencias de ADN que codifican Ig pueden cuantificarse con respecto a las metodologías descritas previamente.

Como también se indicó anteriormente y se describe en otra parte de la presente memoria, antes de la presente descripción existían, en ciertas situaciones, discrepancias insatisfactorias y difíciles de discernir entre (i) la distribución cuantitativa real de moldes de ADN que codifican receptores inmunitarios adaptativos reordenados que tienen secuencias únicas en una muestra biológica que comprende ADN de células linfoides de un sujeto, y (ii) la representación relativa observada de productos de amplificación de ácidos nucleicos de tales moldes que se detectaron, después de la amplificación multiplexada utilizando un conjunto complejo de cebadores de amplificación oligonucleotídicos diseñados para amplificar sustancialmente todos los genes del receptor inmunitario adaptativo reordenados productivamente en la muestra.

MOLDES. Se proporciona por lo tanto una composición molde para la determinación del factor de amplificación, para uso en una reacción de amplificación de ácidos nucleicos multiplexada con un conjunto de cebadores oligonucleotídicos que es capaz de amplificar ADN reordenado (que en ciertas realizaciones puede referirse a ADN reordenado productivamente pero que en ciertas otras realizaciones no se necesita que esté tan limitado) que codifica uno o una pluralidad de receptores inmunitarios adaptativos en una muestra biológica que comprende ADN de células linfoides de un sujeto, comprendiendo la composición molde una pluralidad de oligonucleótidos molde de fórmula general (I):

5'-U1-B1-V-B2-R-B3-J-B4-U2-3' (I)

como se proporciona en la presente memoria. En ciertas realizaciones preferidas, cada oligonucleótido molde en la pluralidad de oligonucleótidos molde está presente en una cantidad sustancialmente equimolar, que en ciertas realizaciones y como se indicó anteriormente puede referirse a una composición en donde cada uno de los oligonucleótidos molde está presente a una concentración equimolar o a una concentración molar que se desvía de la equimolar en no más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 50, 60, 70, 80, 90, 100 o 200% en una base molar, y que en ciertas otras realizaciones puede referirse a una composición en la que están presentes todos los oligonucleótidos molde a concentraciones molares que están dentro de un orden de magnitud entre sí. La pluralidad de moldes puede comprender al menos 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100 o más especies discretas de oligonucleótidos que tienen cada una una secuencia de nucleótidos distinta, que incluye cada valor entero intermedio entre ellas.

La composición molde descrita en la presente memoria comprende así una pluralidad de oligonucleótidos molde de fórmula general:

5'-U1-B1-V-B2-R-B3-J-B4-U2-3' [I]

en donde, brevemente y según se elabora con mayor detalle en otra parte de la presente memoria, de acuerdo con ciertas realizaciones preferidas:

V es un polinucleótido que comprende al menos 20, 30, 60, 90, 120, 150, 180 o 210, y no más de 1000, 900, 800, 700, 600 o 500 nucleótidos contiguos de una secuencia génica que codifica la región variable (V) del receptor inmunitario adaptativo, o el complemento de la misma, y en cada una de la pluralidad de secuencias oligonucleotídicas molde V comprende una secuencia oligonucleotídica única;

J es un polinucleótido que comprende al menos 15-30, 31-60, 61-90, 91-120 o 120-150, y no más de 600, 500, 400, 300 o 200 nucleótidos contiguos de una secuencia génica que codifica la región de empalme (J) del receptor inmunitario adaptativo, o el complemento de la misma, y en cada una de la pluralidad de secuencias oligonucleotídicas molde J comprende una secuencia oligonucleotídica única;

U1 y U2 son cada uno o nada o comprenden un oligonucleótido que tiene, independientemente, una secuencia que se selecciona entre (i) una secuencia de oligonucleótido adaptador universal, y (ii) una secuencia oligonucleotídica específica de la plataforma de secuenciación que está conectada y posicionada en 5' con respecto a la secuencia de oligonucleótido adaptador universal;

B1, B2, B3, y B4 son cada uno independientemente nada o comprenden cada uno un oligonucleótido B que comprende una secuencia código de barras de oligonucleótido de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 o 1000 nucleótidos contiguos (incluyendo todos valores enteros entre ellos), en donde en cada una de la pluralidad de secuencias oligonucleotídicas molde B comprende una secuencia oligonucleotídica única que identifica de manera única, o identifica como una combinación emparejada, (i) la secuencia oligonucleotídica V única del oligonucleótido molde y (ii) la secuencia oligonucleotídica única J del oligonucleótido molde; y

R no es nada o comprende un sitio de reconocimiento para enzimas de restricción que comprende una secuencia oligonucleotídica que está ausente de V, J, U1, U2, B1, B2, B3 y B4.

En ciertas realizaciones preferidas, la composición molde comprende al menos un oligonucleótido molde con el que se puede reasociar cada cebador de amplificación de oligonucleótido en un conjunto de cebadores de amplificación. Es decir, en ciertas realizaciones preferidas, la composición molde comprende al menos un oligonucleótido molde que tiene una secuencia oligonucleotídica de fórmula general (I) con la que puede hibridar específicamente cada cebador oligonucleotídico del segmento V, y al menos un oligonucleótido molde que tiene una secuencia oligonucleotídica de general fórmula (I) con la que puede hibridar específicamente cada cebador oligonucleotídico del segmento J.

De acuerdo con tales realizaciones, el conjunto de cebadores oligonucleotídicos que es capaz de amplificar el ADN reordenado que codifica uno o una pluralidad de receptores inmunitarios adaptativos comprende una pluralidad a de cebadores oligonucleotídicos del segmento V únicos y una pluralidad b de cebadores oligonucleotídicos del segmento J únicos. Cada uno de la pluralidad de a cebadores oligonucleotídicos del segmento V es capaz independientemente de reasociarse o hibridar específicamente con al menos un polinucleótido que codifica un polipéptido de la región V del receptor inmunitario adaptativo o con el complemento del mismo, en donde cada cebador del segmento V comprende una secuencia de nucleótidos de al menos 15 nucleótidos contiguos que es complementaria a al menos un segmento génico que codifica la región V del receptor inmunitario adaptativo. Cada uno de la pluralidad de b cebadores oligonucleotídicos del segmento J es capaz independientemente de reasociarse o hibridar específicamente con al menos un polinucleótido que codifica un polipéptido de la región J del receptor inmunitario adaptativo o con el complemento del mismo, en donde cada cebador del segmento J comprende una secuencia de nucleótidos de al menos 15 nucleótidos contiguos que es complementaria a al menos un segmento génico que codifica la región J del receptor inmunitario adaptativo.

Por lo tanto, en ciertas realizaciones y como también se comenta en otra parte de la presente memoria, la presente composición molde puede utilizarse en reacciones de amplificación con cebadores de amplificación que están diseñados para amplificar todas las secuencias génicas que codifican el receptor inmunitario adaptativo reordenadas, incluyendo aquellas que no están expresadas, mientras que en otras realizaciones, la composición molde y los cebadores de amplificación se pueden diseñar de modo que no produzcan productos de amplificación de genes reordenados que no se expresan (por ejemplo, pseudogenes, orfones). Por lo tanto, se apreciará que en ciertas realizaciones solo un subconjunto de genes codificantes del receptor inmunitario adaptativo reordenados puede amplificarse deseablemente, de manera que se puedan diseñar y emplear subconjuntos de cebadores de amplificación adecuados para amplificar solo aquellas secuencias V-J reordenadas que sean de interés. En estas realizaciones y realizaciones relacionadas, correspondientemente, se puede utilizar una composición molde descrita en la presente memoria que comprende solo un subconjunto de interés de secuencias reordenadas V-J reordenadas, siempre que la composición molde contenga al menos un oligonucleótido molde con el que se pueda reasociar cada cebador de amplificación oligonucleotídico en un conjunto de cebadores de amplificación. El número real de oligonucleótidos molde en la composición molde puede así variar considerablemente entre las realizaciones contempladas, como una función del conjunto de cebadores de amplificación que se va a utilizar.

Por ejemplo, en ciertas realizaciones relacionadas, en la composición molde, la pluralidad de oligonucleótidos molde puede tener una pluralidad de secuencias oligonucleotídicas de fórmula general (I) en la que los polinucleótidos V y J tienen las secuencias V y J de IGH expuestas en al menos un conjunto de 127 SEQ ID NO de V y J de IGH, respectivamente, como se expone en la Figura 11 como conjunto 1 de V/J de IGH, conjunto 2 de V/J de iGh , conjunto 3 de V/J de IGH, conjunto 4 de V/J de IGH, conjunto 5 de V/J de IGH, conjunto 6 de v /j de IGH, conjunto 7 de V/J de IGH, conjunto 8 de V/J de IGH y conjunto 9 de V/J de IGH.

En ciertas realizaciones, V es una secuencia de polinucleótidos que codifica al menos 10-70 aminoácidos contiguos de una región V del receptor inmunitario adaptativo, o el complemento de la misma; J es una secuencia de polinucleótidos que codifica al menos 5-30 aminoácidos contiguos de una región J del receptor inmunitario adaptativo, o el complemento de la misma; U1 y U2 no son nada o comprenden un oligonucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que se selecciona entre (i) una secuencia de oligonucleótido adaptador universal, y (ii) una secuencia oligonucleotídica específica de la plataforma de secuenciación que está conectada y posicionada en 5' con respecto a la secuencia de oligonucleótido adaptador universal; B1, B2, B3 y B4 son cada uno independientemente nada o cada uno comprende un oligonucleótido B que comprende una secuencia código de barras de oligonucleótido de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 nucleótidos contiguos, en donde en cada una de la pluralidad de secuencias de oligonucleótidos B comprende una secuencia oligonucleotídica única que identifica de forma única, como una combinación emparejada, (i) la secuencia oligonucleotídica V única y (ii) la secuencia oligonucleotídica J única; y R no es nada o comprende un sitio de reconocimiento para enzimas de restricción que comprende una secuencia oligonucleotídica que está ausente de V, J, U1, U2, B1, B2, B3 y B4.

Un gran número de secuencias génica de la región (V) variable y de la región (J) de empalme del receptor inmunitario adaptativo se conocen como secuencias de nucleótidos y/o aminoácidos, incluyendo secuencias de ADN genómico no reordenadas de los loci de TCR e Ig, y secuencias de ADN reordenado productivamente en tales loci y sus productos codificados, y también incluyendo pseudogenes en estos loci, y también incluyendo los orfones relacionados. Véanse, por ejemplo, U.S.A.N. 13/217.126; U.S.A.N. 12/794.507; PCT/US2011/026373; PCT/US2011/049012. Estas y otras secuencias conocidas en la técnica se pueden utilizar de acuerdo con la presente descripción para el diseño y producción de oligonucleótidos molde para que sean incluidas en la composición molde proporcionada actualmente para normalizar la eficacia de amplificación de un conjunto de cebadores oligonucleotídicos, y para el diseño y producción del conjunto de cebadores oligonucleotídicos que es capaz de amplificar el ADN reordenado que codifica cadenas de polipéptidos de TCR o de Ig, cuyo ADN reordenado puede estar presente en una muestra biológica que comprende ADN de células linfoides.

En la fórmula (I), V es una secuencia de polinucleótidos de al menos 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 350, 360, 360, 380, 390, 400 o 450 y no más de 1000, 900, 800, 700, 600 o 500 nucleótidos contiguos de una secuencia génica de la región variable (V) del receptor inmunitario adaptativo (por ejemplo, TCR o BCR), o el complemento de la misma, y en cada una de la pluralidad de secuencias de oligonucleótidos V comprende una secuencia oligonucleotídica única. Las secuencias genómicas para los genes de la región V de TCR y BCR de seres humanos y otras especies son conocidas y están disponibles en bases de datos públicas tales como Genbank; las secuencias génicas de la región V incluyen secuencias de polinucleótidos que codifican los productos de genes de TCR y BCR reordenados expresados y también incluyen secuencias de polinucleótidos de pseudogenes que se han identificado en los loci de la región V. La longitud, la composición de nucleótidos (por ejemplo, contenido de GC), y la secuencia de polinucleótidos lineal real de las diversas secuencias de polinucleótidos V que se pueden incorporar a los moldes actualmente descritos de fórmula general (I) pueden variar ampliamente, y se sabe, por ejemplo, que incluyen "puntos calientes" o regiones hipervariables que exhiben diversidad de secuencia particular.

El polinucleótido V en la fórmula general (I) (o su complemento) incluye secuencias con las que se pueden reasociar específicamente los miembros de conjuntos de cebadores oligonucleotídicos específicos para genes de TCR o BCR. Los conjuntos de cebadores que son capaces de amplificar el ADN reordenado que codifica una pluralidad de TCR o BCR se describen, por ejemplo, en los documentos Pub. US No. 2012/0058902; Pub. US No. 2010/0330571; WO/2011/106738; o WO2012/027503; o similares; o como se describe allí, se pueden diseñar para que incluyan secuencias de oligonucleótidos que pueden hibridar específicamente con cada gen V único y con cada gen J en un locus del gen de TCR o BCR concreto (por ejemplo, TCR a, p, y o ó, o IgH p, y, 6, a o £, o IgL k o A). Por ejemplo, a modo de ilustración y no de limitación, un cebador oligonucleotídico de un conjunto de amplificación de cebadores oligonucleotídicos que es capaz de amplificar el ADN reordenado que codifica uno o una pluralidad de TCR o BCR puede incluir típicamente una secuencia de nucleótidos de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 o 40 nucleótidos contiguos, o más, y puede reasociarse específicamente con una secuencia complementaria de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 o 40 nucleótidos contiguos de un polinucleótido V o J como se proporciona en la presente memoria. En ciertas realizaciones, los cebadores pueden comprender al menos 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 nucleótidos, y en cierta realización los cebadores pueden comprender secuencias de no más de 15, 16., 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 o 40 nucleótidos contiguos. Los cebadores y sitios de reasociación de cebadores de otras longitudes también se contemplan expresamente, como se describe en la presente memoria.

La secuencia de polinucleótidos completa de cada polinucleótido V en la fórmula general (I) puede consistir, pero no es necesario que consista exclusivamente en nucleótidos contiguos de cada gen V distinto. Por ejemplo y de acuerdo con ciertas realizaciones, en la composición molde descrita en la presente memoria, solo se necesita que cada polinucleótido V de fórmula (I) tenga al menos una región que comprenda una secuencia oligonucleotídica V única que se encuentre en un gen V y con la que se pueda reasociar específicamente un único cebador de la región V del conjunto de cebadores. Por lo tanto, el polinucleótido V de fórmula (I) puede comprender la totalidad o cualquier porción prescrita (por ejemplo, al menos 15, 20, 30, 60, 90, 120, 150, 180 o 210 nucleótidos contiguos, o cualquier valor entero entre ellos) de una secuencia génica V de origen natural (incluyendo una secuencia de pseudogén V) siempre que al menos se incluya al menos una única región de la secuencia oligonucleotídica V (el sitio de reasociación del cebador) que no esté incluida en ningún otro polinucleótido molde V.

Se puede preferir en ciertas realizaciones que la pluralidad de polinucleótidos V que está presente en la composición molde descrita en la presente memoria tenga longitudes que simulen las longitudes globales de secuencias de nucleótidos del gen V de origen natural, conocidas, incluso cuando las secuencias de nucleótidos específicas difieren entre la región V molde y cualquier gen V de origen natural. Las longitudes de la región V en los moldes descritos en la presente memoria pueden diferir de las longitudes de las secuencias del gen V que se producen de forma natural en no más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 por ciento.

El polinucleótido V en la fórmula (I) puede, en ciertas realizaciones, comprender una secuencia de nucleótidos que tiene una longitud que es igual o similar a la longitud de un gen V típico desde su codón de inicio a su región codificante de CDR3 y puede incluir, pero no es necesario que incluya, una secuencia de nucleótidos que codifica la región CDR3. Las secuencias de nucleótidos que codifican c DR3 y las longitudes de secuencia pueden variar considerablemente y se han caracterizado por varios esquemas de numeración diferentes (por ejemplo, Lefranc, 1999 Immunologist 7:132; Kabat et al., 1991 en: Sequences of Proteins of Immunological Interest, Publicación NIH 91-3242; Chothia et al., 1987 J. Mol. Biol. 196:901; Chothia et al., 1989 Nature 342:877; Al-Lazikani et al., 1997 J. Mol. Biol. 273:927; véanse también, por ejemplo, Rock et al., 1994 J. Exp. Med. 179:323; Saada et al., 2007 Immunol. Cell Biol. 85:323).

Brevemente, la región CDR3 típicamente abarca la porción polipeptídica que se extiende desde un residuo de cisteína altamente conservado (codificado por el codón trinucleotídico TGY; Y = T o C) en el segmento V a un residuo de fenilalanina altamente conservado (codificado por TTY) en el segmento J de TCR, o a un triptófano altamente conservado (codificado por TGG) en IGH. Más de 90% de los reordenamientos productivos naturales en el locus TCRB tiene una longitud de codificación de CDR3 por este criterio de entre 24 y 54 nucleótidos, que corresponden a entre 9 y 17 aminoácidos codificados. Las longitudes de CDR3 de los oligonucleótidos molde sintéticos descritos en la actualidad, para cualquier locus de TCR o BCR dado, caen dentro del mismo intervalo que 95% de los reordenamientos naturales. Por lo tanto, por ejemplo, en una composición molde descrita en la presente memoria para la determinación del factor de amplificación, la porción codificante de CDR3 del polinucleótido V puede tener una longitud de 24 a 54 nucleótidos, incluyendo cada número entero entre ellos. Los esquemas de numeración para las regiones que codifican CDR3 descritas anteriormente denotan las posiciones de los codones conservados de cisteína, fenilalanina y triptófano, y estos esquemas de numeración también pueden aplicarse a pseudogenes en los que uno o más codones que codifican estos aminoácidos conservados pueden haber sido reemplazados por un codón que codifica un aminoácido diferente. Para los pseudogenes que no utilizan estos aminoácidos conservados, la longitud de CDR3 puede definirse con respecto a la posición correspondiente en la que se habría observado el residuo conservado sin la sustitución, de acuerdo con uno de los esquemas de numeración de posiciones de secuencia de CDR3 establecidos mencionados anteriormente.

También se puede preferir, en ciertas realizaciones, que la pluralidad de polinucleótidos V que están presentes en la composición molde descrita en la presente memoria tenga composiciones de nucleótidos (por ejemplo, porcentaje de contenido de GC) que simulen las composiciones nucleotídicas globales de secuencias de genes V de origen natural conocidas, incluso cuando difieran las secuencias de nucleótidos específicas. Tales composiciones de nucleótidos de la región V molde pueden diferir de las composiciones de nucleótidos de secuencias del gen V de origen natural en no más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 por ciento. Opcionalmente y de acuerdo con ciertas realizaciones, el polinucleótido V del oligonucleótido molde descrito en la presente memoria incluye un codón de terminación en o cerca del extremo 3' de V en la fórmula general (I).

En la fórmula (I) J es un polinucleótido que comprende al menos 15-30, 31-60, 61-90, 91-120 o 120-150, y no más de 600, 500, 400, 300 o 200 nucleótidos contiguos de una secuencia génica que codifica la región de empalme (J) del receptor inmunitario adaptativo, o el complemento de la misma, y en cada una de la pluralidad de secuencias de oligonucleótidos J comprende una secuencia oligonucleotídica única.

El polinucleótido J en la fórmula general (I) (o su complemento) incluye secuencias con las que se pueden reasociar específicamente miembros de los conjuntos de cebadores oligonucleotídicos específicos para genes de TCR o BCR. Los conjuntos de cebadores que son capaces de amplificar el ADN reordenado que codifica una pluralidad de TCR o BCR se describen, por ejemplo, en los documentos Pub. US No. 2012/0058902; Pub. US No. 2010/0330571; WO/2011/106738; o WO2012/027503; o similares; o como se describe allí, se pueden diseñar para que incluyan secuencias de oligonucleótidos que pueden hibridar específicamente con cada gen V único y con cada gen J único en un locus del gen de TCR o BCR concreto (por ejemplo, TCR a, p, y o 6, o IgH p, y, 6, a o £, o IgL k o A).

La secuencia de polinucleótidos completa de cada polinucleótido J en la fórmula general (I) puede consistir, pero es necesarios que consista exclusivamente en nucleótidos contiguos de cada gen J distinto. Por ejemplo y de acuerdo con ciertas realizaciones, solo es necesario que en la composición molde descrita en la presente memoria, cada polinucleótido J de fórmula (I) tenga al menos una región que comprenda una secuencia oligonucleotídica J única que se encuentra en un gen J y con la que se puede reasociar específicamente un único cebador de la región V en el conjunto de cebadores. Por lo tanto, el polinucleótido V de fórmula (I) puede comprender la totalidad o cualquier porción prescrita (por ejemplo, al menos 15, 20, 30, 60, 90, 120, 150, 180 o 210 nucleótidos contiguos, o cualquier valor entero entre ellos) de una secuencia génica V de origen natural (incluyendo una secuencia de pseudogén V) siempre que al menos se incluya una región de secuencia oligonucleotídica V única (el sitio de reasociación del cebador) que no esté incluida en ningún otro polinucleótido J molde.

Se puede preferir en ciertas realizaciones que la pluralidad de polinucleótidos J que están presentes en la composición molde descrita en la presente memoria tengan longitudes que simulan las longitudes globales de secuencias de nucleótidos del gen J conocidas, de origen natural, incluso cuando las secuencias de nucleótidos específicas difieran entre la región J molde y cualquier gen J de origen natural. Las longitudes de la región J en los moldes descritos en la presente memoria pueden diferir de las longitudes de las secuencias del gen J de origen natural en no más de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 por ciento.

El polinucleótido J en la fórmula (I) puede, por lo tanto, en ciertas realizaciones, comprender una secuencia de nucleótidos que tiene una longitud que es igual o similar a la longitud de un gen J de origen natural típico y puede incluir, pero no es necesario que incluya, una secuencia de nucleótidos que codifica la región CDR3, como se comentó anteriormente.

Las secuencias genómicas para los genes de la región J de TCR y BCR de seres humanos y otras especies son conocidas y están disponibles en bases de datos públicas tales como Genbank; las secuencias génicas de la región J incluyen secuencias de polinucleótidos que codifican los productos de genes de TCR y BCR reordenados expresados y no expresados. La longitud, la composición de nucleótidos (por ejemplo, contenido de GC), y la secuencia de polinucleótidos lineal real de las diversas secuencias de polinucleótidos J que se pueden incorporar a los moldes de fórmula general (I) descritos actualmente pueden variar ampliamente.

Las alternativas a las secuencias V y J descritas en la presente memoria, para su uso en la construcción de los oligonucleótidos molde y/o cebadores oligonucleotídicos del segmento V y el segmento J descritos en la presente memoria, pueden se seleccionadas por un experto basándose en la presente descripción utilizando conocimientos en la técnica referentes a secuencias génicas publicadas para las regiones que codifican V y J de los genes para cada subunidad TCR e Ig. Las entradas de Genbank de referencia para secuencias de receptor inmunitario adaptativo humano incluyen: TCRa: (TCRA/D): NC_000014.8 (chr14: 22090057..23021075); TCRp: (TCRB): NC_000007.13 (chr7: 141998851..142510972); TCRy: (TCRG): NC_000007.13 (chr7: 38279625..38407656); cadena pesada de inmunoglobulina, IgH (IGH): n C_000014.8 (chr14: 106032614..107288051); cadena ligera kappa de inmunoglobulina, IgLK (IGK): NC_000002.11 (chr2: 89156874..90274235); y cadena ligera-lambda de inmunoglobulina, IgLA (IGL): NC_000022.10 (chr22: 22380474..23265085). Las entradas de Genbank de referencia para secuencias de loci del receptor inmunitario adaptativo de ratón incluyen: TCRp: (TCRB): NC_000072.5 (chr6: 40841295..41508370) y cadena pesada de inmunoglobulina, IgH (IGH): NC_000078.5 (chr12: 114496979..117248165).

Los análisis de diseño de moldes y cebadores y las consideraciones de selección del sitio diana pueden realizarse, por ejemplo, utilizando el soporte lógico de análisis de cebadores OLIGO y/o el soporte lógico del algoritmo BLASTN 2.0.5 (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 1997, 25(17):3389-402), u otros programas similares disponibles en la técnica.

Por consiguiente, basándose en la presente descripción y a la vista de estas secuencias de genes del receptor inmunitario adaptativo y de las metodologías de diseño de oligonucleótidos conocidas, para la inclusión en los presentes oligonucleótidos molde los expertos en la técnica pueden diseñar una pluralidad de secuencias de polinucleótidos específicas de la región V y específicas de la región J que contienen independientemente secuencias de oligonucleótidos que son únicas para un gen V y J dado, respectivamente. De forma similar, a partir de la presente descripción y a la vista de las secuencias del receptor inmunitario adaptativo conocidas, los expertos en la técnica también pueden diseñar un conjunto de cebadores que comprende una pluralidad cebadores oligonucleotídicos específicos de la región V y específicos de la región J que son capaces cada uno independientemente de reasociarse con una secuencia específica que es única para un gen V y J dado, respectivamente, por lo que la pluralidad de cebadores es capaz de amplificar sustancialmente todos los genes V y sustancialmente todos los genes J en un locus que codifica el receptor inmunitario adaptativo dado (por ejemplo, un locus de TCR o IgH humano). Tales conjuntos de cebadores permiten la generación, en una PCR multiplexada (por ejemplo, utilizando múltiples pares de cebadores directos e inversos), de productos de amplificación que tienen un primer extremo que está codificado por un segmento génico que codifica la región V reordenada y un segundo extremo que está codificado por un segmento génico que codifica una región J.

Tales productos de amplificación pueden incluir una secuencia que codifica CDR3. Los cebadores pueden diseñarse preferiblemente para producir productos de amplificación que tienen porciones suficientes de secuencias V y J y/o secuencias código de barras V-J (B) como se describe en la presente memoria, de forma que secuenciando los productos (amplicones), es posible identificar basándose en secuencias que son únicas para cada segmento génico (i) el gen V concreto, y (ii) el gen J concreto en cuya proximidad el gen V experimenta reordenamiento para producir un gen que codifica el receptor inmunitario adaptativo funcional. Típicamente, y en realizaciones preferidas, los productos de amplificación por PCR no tendrán más de 600 pares de bases de tamaño, lo que de acuerdo con la teoría no limitante excluirá los productos de amplificación de los genes del receptor inmunitario adaptativo no reordenados. En ciertas otras realizaciones preferidas, los productos de amplificación tendrán un tamaño de no más de 500, 400, 300, 250, 200, 150, 125, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30 o 20 pares de bases, tal como puede proporcionar ventajosamente una cuantificación rápida y de alto rendimiento de amplicones separados de secuencia mediante lecturas cortas de secuencia.

En ciertas realizaciones preferidas, la pluralidad de oligonucleótidos molde comprende al menos un oligonucleótido molde que tiene una secuencia oligonucleotídica de fórmula general (I) con la que puede hibridar, preferiblemente hibridar específicamente, cada cebador oligonucleotídico del segmento V y al menos un oligonucleótido molde que tiene una secuencia oligonucleótido de fórmula general (I) con la que puede hibridar, preferiblemente hibridar específicamente, cada cebador oligonucleotídico del segmento J.

En ciertas realizaciones, la pluralidad de oligonucleótidos molde comprende al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21., 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51-100, 101-200, 201-300, 301-400, 401-500, 501-600, 601-700, 701-800, 801-900, 901­ 1000, 1001 -1100, 1101-1200, 1201-1300, 1301-1400, 1401-1500, 1501-1600, 1601-1700, 1701-2000, o 2001-2500 secuencias de oligonucleótidos únicas.

En ciertas realizaciones, la composición comprende al menos un oligonucleótido molde para cada polinucleótido V único y al menos un oligonucleótido molde para cada polinucleótido J único. Se apreciará que debido a que los oligonucleótidos molde tienen una pluralidad de secuencias de oligonucleótidos de fórmula general (I), que incluye un polinucleótido V y que también incluye un polinucleótido J, la composición molde puede comprender menos que (axb) secuencias de oligonucleótidos únicas, pero en ciertas realizaciones comprenderá al menos la mayor de las secuencias de oligonucleotídicas únicas a o b.

Por consiguiente, la composición puede incorporar al menos una aparición de cada secuencia de polinucleótido V única y al menos una aparición de cada secuencia de polinucleótido J única, donde en algunos casos la al menos una aparición de un polinucleótido V único concreto estará presente en el mismo oligonucleótido molde en el que se puede encontrar la al menos una aparición de un polinucleótido J único concreto. Así, por ejemplo, "al menos un oligonucleótido molde para cada polinucleótido V único y al menos un oligonucleótido molde para cada polinucleótido J único" puede referirse en ciertos casos a un único oligonucleótido molde en el que están presentes un único polinucleótido V y un único polinucleótido J.

Como también se describe en otra parte de la presente memoria, en ciertas otras realizaciones preferidas, la composición molde comprende al menos un oligonucleótido molde con el que se puede reasociar cada cebador de amplificación de oligonucleótidos en un conjunto de cebadores de amplificación. Por lo tanto, la composición puede comprender menos de a o b secuencias únicas, por ejemplo, donde un conjunto de cebadores de amplificación puede no incluir un cebador único para cada secuencia V y/o J posible.

Se observará que ciertas realizaciones contemplan una composición molde para la determinación del factor de amplificación, en donde la composición molde comprende una pluralidad de oligonucleótidos molde que tienen una pluralidad de secuencias oligonucleotídicas de fórmula general 5'-U1-B1-V-B2-R-B3-J-B4-U2-3' (I) como se describe en la presente memoria. De acuerdo con estas realizaciones y realizaciones relacionadas y también como se describe en otra parte de la presente memoria, el conjunto de cebadores de amplificación oligonucleotídicos que es capaz de amplificar el ADN reordenado productivamente puede excluir cualquier cebador oligonucleotídico que hibride específicamente con un pseudogén u orfón de la región V o con un pseudogen u orfón de la región J. Por lo tanto, en tales realizaciones, la composición molde excluirá deseablemente oligonucleótidos molde de fórmula general (I) en los que las secuencias de oligonucleótido V único y/o las secuencias de oligonucleótido J único son secuencias que son, respectivamente, únicas para un pseudogén u orfón de la región V o un pseudogen u orfón de la región J.

Se describe una composición molde de TCRB ilustrativa que comprende 858 oligonucleótidos molde distintos en la Lista de Secuencias en SEQ ID NO: 3157-4014. Otra composición molde de TCRB ilustrativa que comprende 871 oligonucleótidos molde distintos se describe en la Lista de secuencias en SEQ ID NO: 1-871. Otra composición molde de TCRB ilustrativa que comprende 689 oligonucleótidos molde distintos se describe en la Lista de Secuencias en SEQ ID NO: 872-1560.

Se describe una composición molde de TCRG ilustrativa que comprende 70 oligonucleótidos molde distintos en la Lista de Secuencias en SEQ ID NO: 4015-4084. También se describe una composición molde de TCRG ilustrativa que comprende 70 oligonucleótidos molde distintos en la Lista de Secuencias en SEQ ID NO: 1561-1630.

Se describe una composición molde de IGH ilustrativa que comprende 1116 oligonucleótidos molde distintos en la Lista de Secuencias en SEQ ID NO: 4085-5200. También se describe una composición molde de IGH ilustrativa que comprende 1116 oligonucleótidos molde distintos en la Lista de Secuencias en SEQ ID NO: 1805-2920.

También se describen en la presente memoria conjuntos ilustrativos de polinucleótidos V y J para su inclusión en los oligonucleótidos molde descritos en la presente memoria que tienen una pluralidad de secuencias de oligonucleótidos de fórmula general (I). Para TCRB, la pluralidad de oligonucleótidos molde puede tener una pluralidad de secuencias de oligonucleótidos de fórmula general (I) en la que los polinucleótidos V y J tienen las secuencias de V y J de TCRB expuestas en al menos un conjunto de 68 SEQ ID NO de V y J de TCRB, respectivamente, como se expone en la Figura 5 como Conjunto 1 de V/J de TCRB, Conjunto 2 de V/J de TCRB, Conjunto 3 de V/J de TCRB, Conjunto 4 de V/J de TCRB, Conjunto 5 de V/J de TCRB, Conjunto 6 de V/J de TCRB, Conjunto 7 de V/J de TCRB, Conjunto 8 de V/J de TCRB, Conjunto 9 de V/J de TCRB, Conjunto 10 de V/J de TCRB, Conjunto 11 de V/J de TCRB, Conjunto 12 de V/J de TCRB y Conjunto 13 de V/J de TCRB .

Para TCRG, la pluralidad de oligonucleótidos molde puede tener una pluralidad de secuencias de oligonucleótidos de fórmula general (I) en la que los polinucleótidos V y J tienen las secuencias de V y J de TCGR expuestas en al menos un conjunto de 14 SEQ ID NO de V y J de TCGR, respectivamente, como se expone en la Figura 6 como conjunto 1 de V/J de TCRG, conjunto 2 de V/J de TCRG, conjunto 3 de V/J de TCRG, conjunto 4 de V/J de TCRG y conjunto 5 de V/J de TCRG.

Para IGH, la pluralidad de oligonucleótidos molde puede tener una pluralidad de secuencias de oligonucleótidos de fórmula general (I) en la que los polinucleótidos V y J tienen las secuencias V y J de IGH expuestas en al menos un conjunto de 127 SEQ ID NO de V y J de IGH, respectivamente, como se expone en la Figura 7 como conjunto 1 de V/J de IGH, conjunto 2 de V/J de iGh , conjunto 3 de V/J de IGH, conjunto 4 de V/J de IGH, conjunto 5 de V/J de IGH, conjunto 6 de v /j de IGH, conjunto 7 de v /j de IGH, conjunto 8 de V/J de IGH y conjunto 9 de V/J de IGH.

ADAPTADORES. Los oligonucleótidos molde descritos en la presente memoria de fórmula general (I) también pueden comprender una primera (U1) y una segunda (U2) secuencias de oligonucleótido adaptador universal, o pueden carecer de una o ambas de U1 y U2. U1 por lo tanto puede comprender nada o un oligonucleótido que tiene una secuencia que se selecciona entre (i) una primera secuencia de oligonucleótido adaptador universal, y (ii) una primera secuencia oligonucleotídica específica de la plataforma de secuenciación que está conectada y posicionada en 5' con respecto a una primera secuencia de oligonucleótido adaptador universal, y U2 puede comprender nada o un oligonucleótido que tiene una secuencia que se selecciona entre (i) una segunda secuencia de oligonucleótido adaptador universal, y (ii) una segunda secuencia oligonucleotídica específica de la plataforma de secuenciación que está conectada y posicionada en 5' con respecto a una segunda secuencia de oligonucleótido adaptador universal.

U1 y/o U2 pueden comprender, por ejemplo, secuencias de oligonucleótido adaptador universal y/o secuencias de oligonucleótidos específicas de la plataforma de secuenciación que son específicas de una tecnología de secuenciación de molécula única empleada, por ejemplo sistemas HiSeq™ o GeneAnalyzer™-2 (GA-2) (Illumina, Inc., San Diego, CA) u otro paquete de secuenciación adecuado de instrumentación, reactivos y soporte lógico. La inclusión de tales secuencias adaptadoras específicas de la plataforma permite la secuenciación cuantitativa directa de la composición molde descrita actualmente, que comprende una pluralidad de diferentes oligonucleótidos molde de fórmula general (I), utilizando una metodología de secuenciación de nucleótidos tal como HiSeq™ o GA2 o equivalente. Por lo tanto, esta característica permite ventajosamente la caracterización cualitativa y cuantitativa de la composición molde.

En particular, la capacidad de secuenciar todos los componentes de la composición molde permite directamente la verificación de que cada oligonucleótido molde en la pluralidad de oligonucleótidos molde está presente en una cantidad sustancialmente equimolar. Por ejemplo, se puede generar un conjunto de los oligonucleótidos molde descritos actualmente que tienen secuencias adaptadoras universales en ambos extremos, de modo que las secuencias adaptadoras se pueden utilizar para incorporar adicionalmente oligonucleótidos específicos de la plataforma de secuenciación a cada extremo de cada molde.

Sin desear estar limitados por la teoría, los oligonucleótidos específicos de la plataforma se pueden añadir a los extremos de tales moldes modificados utilizando secuencias oligonucleótidos 5' (5'-secuencia de la plataforma -adaptador universal - secuencia 1 - 3') y 3' (5'-secuencia de la plataforma - adaptador universal - secuencia 2 - 3') en tan solo dos ciclos de desnaturalización, reasociación y extensión, de modo que la representación relativa en la composición molde de cada uno de los oligonucleótidos molde del componente no se altera cuantitativamente. Las secuencias identificadoras únicas (por ejemplo, las secuencias código de barras B que comprenden secuencias de oligonucleótidos V y B únicas que están asociadas con, y así identifican, respectivamente, regiones V y J individuales, como se describe en la presente memoria) se colocan adyacentes a las secuencias adaptadoras, permitiendo así la secuenciación cuantitativa en lecturas de secuencias cortas, para caracterizar la población de moldes mediante el criterio de la cantidad relativa de cada secuencia molde única que está presente.

Cuando tal secuenciación cuantitativa directa indica que uno o más oligonucleótidos concretos pueden estar representados de manera anormalmente alta o anormalmente baja en una preparación de la composición molde, el ajuste de la composición molde puede realizarse en consecuencia para obtener una composición molde en la que todos los oligonucleótidos están presentes en cantidades sustancialmente equimolares. La composición molde en donde todos los oligonucleótidos están presentes en cantidades sustancialmente equimolares se puede utilizar a continuación como un patrón de calibración para conjuntos de cebadores de amplificación, tal como en los métodos descritos actualmente para determinar y corregir el potencial de amplificación no uniforme entre miembros de un conjunto de cebadores.

Además de las secuencias adaptadoras descritas en los Ejemplos e incluidas en las secuencias molde ilustrativas en la Lista de Secuencias (por ejemplo, en los extremos 5' y 3' de SEQ ID NO: 1-1630), otras secuencias de oligonucleótidos que se pueden utilizar como secuencias adaptadoras universales serán conocidas por los expertos en la técnica a la vista de la presente descripción, incluyendo la selección de secuencias de oligonucleótidos adaptadores que son distintas de las secuencias encontradas en otras porciones de los moldes descritos en la presente memoria. Los ejemplos no limitantes de secuencias adaptadoras adicionales se muestran en la Tabla 3 y se exponen en SEQ ID NO: 1710-1731.

T l n i r m l

CÓDIGOS DE BARRAS. Como se describe en la presente memoria, ciertas realizaciones contemplan el diseño de las secuencias oligonucleotídicas molde para que contengan secuencias de firmas cortas que permitan una identificación inequívoca de la secuencia molde, y por lo tanto de al menos un cebador responsable de amplificar ese molde, sin tener que secuenciar el producto de amplificación completo. En el molde descrito, los oligonucleótidos de fórmula general (I), B1, B2, B3 y B4 son cada uno independientemente nada o cada uno comprende un oligonucleótido B que comprende una secuencia código de barras de oligonucleótido de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 o 1000 o más nucleótidos contiguos (incluyendo todos los valores enteros entre ellos), en donde en cada una de la pluralidad de secuencias oligonucleotídicas molde B comprende una secuencia oligonucleotídica única que identifica de manera única, como una combinación emparejada, (i) la secuencia oligonucleotídica V única del oligonucleótido molde y (ii) la secuencia oligonucleotídica J única del oligonucleótido molde.

Así, por ejemplo, los oligonucleótidos molde que tienen secuencias identificadoras código de barras pueden permitir lecturas de secuencia de producto de amplificación relativamente cortas, tales como lecturas de secuencia código de barras de no más de 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100, 90, 80, 70, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 o menos nucleótidos, seguido del emparejamiento de esta información de secuencia código de barras con las secuencias V y J asociadas que se incorporan al molde que tiene el código de barras como parte del diseño del molde. Con este enfoque, se puede secuenciar parcialmente una gran cantidad de productos de amplificación de manera simultánea mediante secuenciación paralela de alto rendimiento, para identificar cebadores que son responsables del sesgo de amplificación en un conjunto de cebadores complejo.

Los códigos de barras ilustrativos pueden comprender un primer oligonucleótido código de barras de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 16 nucleótidos que identifica de forma única cada polinucleótido V en el molde y un segundo oligonucleótido código de barras de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 16 nucleótidos que identifican de forma única cada polinucleótido J en el molde, para proporcionar códigos de barras de, respectivamente, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 o 32 nucleótidos de longitud, pero no se pretende que estas realizaciones y realizaciones relacionadas sean limitantes. Los oligonucleótidos de códigos de barras pueden comprender secuencias de oligonucleótidos de cualquier longitud, siempre que se obtenga una longitud código de barras mínima que impida la aparición de una secuencia código de barras dada en dos o más oligonucleótidos molde que tengan otras secuencias diferentes (por ejemplo, secuencias V y J).

Por lo tanto, la longitud mínima del código de barras, para evitar dicha redundancia entre los códigos de barras que se utilizan para identificar de forma única diferentes pares de secuencias V-J, es X nucleótidos, donde 4X es mayor que la cantidad de especies moldes distintas que se deben diferenciar basándose en que tienen secuencias no idénticas. Por ejemplo, para el conjunto de 871 oligonucleótidos molde expuestos en la presente memoria como SEQ ID NO: 1-871, la longitud mínima del código de barras sería de cinco nucleótidos, lo que permitiría un total teórico de 1024 (es decir, más de 871) diferentes secuencias de pentanucleótidos posibles. En la práctica, las longitudes de lectura de la secuencia de oligonucleótido código de barras pueden limitarse únicamente por los límites de longitud de lectura de secuencia del aparato de secuenciación de nucleótidos que se vaya a emplear. Para ciertas realizaciones, diferentes oligonucleótidos de códigos de barras que distinguirán especies individuales de oligonucleótidos molde deben tener emparejamientos erróneos de al menos dos nucleótidos (por ejemplo, una distancia mínima de Hamming de 2) cuando se alinea para maximizar la cantidad de nucleótidos que coinciden en posiciones concretas en las secuencias de oligonucleótidos de códigos de barras.

En realizaciones preferidas, para cada especie de oligonucleótido molde distinta que tiene una secuencia única dentro de la composición molde de fórmula general (I), B1, B2, B3 y B4 serán idénticos.

El experto en la técnica estará familiarizado con el diseño, la síntesis y la incorporación a una construcción de oligonucleótidos o polinucleótidos más grande, de secuencias código de barras de oligonucleótidos de, por ejemplo, al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 300, 500 o más nucleótidos contiguos, incluyendo todos los valores enteros entre ellos. Para ejemplos no limitantes del diseño e implementación de estrategias de identificación de secuencia código de barras de oligonucleótidos, véanse, por ejemplo, De Career et al., 2011 Adv. Env. Microbiol. 77:6310; Parameswaran et al., 2007 Nucl. A.C. Res. 35(19):330; Roh et al., 2010 Trends Biotechnol. 28:291.

Por lo general, los códigos de barras se colocan en moldes en lugares donde no se encuentran de forma natural, es decir, los códigos de barras comprenden secuencias de nucleótidos que son distintas de cualquier secuencia oligonucleotídica de origen natural que pueda encontrarse en la proximidad de las secuencias adyacentes a las que están situados los códigos de barras (por ejemplo, secuencias V y/o J). Tales secuencias código de barras se pueden incluir, de acuerdo con ciertas realizaciones descritas en la presente memoria, como elementos B1, B2 y/o B3 del oligonucleótido molde de la fórmula general (I) descrito actualmente. Por consiguiente, algunos de los oligonucleótidos molde descritos en la presente memoria de fórmula general (I) también pueden comprender, en ciertas realizaciones, uno, dos o los tres códigos de barras B1, B2 y B3, mientras que en ciertas otras realizaciones algunos o todos estos códigos de barras pueden estar ausentes. En ciertas realizaciones, todas las secuencias código de barras tendrán un contenido de GC idéntico o similar (por ejemplo, difiriendo en el contenido de GC en no más de 20% o en no más de 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11 o 10%).

En las composiciones molde de acuerdo con ciertas realizaciones descritas en la presente memoria, el elemento B que contiene el código de barras (por ejemplo, B1, B2, B3 y/o B4) comprende la secuencia oligonucleotídica que identifica de forma única una única combinación V-J emparejada. Opcionalmente y en ciertas realizaciones, el elemento B que contiene un código de barras también puede incluir un nucleótido aleatorio o una secuencia polinucleotídica aleatoria de al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 300, 500 o más nucleótidos contiguos, situados aguas arriba y/o aguas abajo de la secuencia código de barras específica que identifica de forma única cada combinación VJ emparejada específica. Cuando están presentes tanto aguas arriba como o aguas abajo de la secuencia código de barras específica, la secuencia de nucleótidos aleatoria o de polinucleótidos aleatoria son independientes entre sí, es decir, pueden comprender, pero no es necesario que comprendan la misma secuencia nucleótidos o la misma secuencia de polinucleótidos.

SITIOS PARA ENZIMAS DE RESTRICCIÓN. De acuerdo con ciertas realizaciones descritas en la presente memoria, el oligonucleótido molde puede comprender un sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción (RE) que está situado entre las secuencias V y J y no se produce en ninguna otra parte de la secuencia oligonucleotídica molde. El sitio de reconocimiento de RE puede estar opcionalmente adyacente a un sitio código de barras que identifica la secuencia de la región V. El sitio RE se puede incluir para cualquiera de una serie de propósitos, incluyendo sin limitación, como característica estructural que puede explotarse para destruir moldes de forma selectiva contactándolos con la enzima de restricción apropiada. Puede ser deseable degradar los presentes oligonucleótidos molde selectivamente poniéndolos en contacto con un RE adecuado, por ejemplo, para eliminar oligonucleótidos molde de otras composiciones en las que pueden haberse introducido deliberada o accidentalmente. Alternativamente, el sitio RE puede explotarse útilmente en el transcurso de la secuenciación de oligonucleótidos molde en la composición molde, y/o como un marcador de secuencia posicional en una secuencia oligonucleotídica molde independientemente de si se escinde o no con una enzima de restricción. Un sitio RE ilustrativo es el motivo oligonucleotídico GTCGAC, que es reconocido por la enzima de restricción Sal I. Se conoce en la técnica un gran número de enzimas de restricción adicionales y sus respectivas secuencias de sitios de reconocimiento de RE y están disponibles comercialmente (por ejemplo, New England Biolabs, Beverly, MA). Estas incluyen, por ejemplo, EcoRI (GAATTC) y Sphl (GCATGC). Aquellos que estén familiarizados con la técnica apreciarán que se puede incorporar cualquiera de una variedad de tales sitios de reconocimiento de RE a realizaciones concretas de los oligonucleótidos molde descritos actualmente.

Secuenciación

La secuenciación se puede realizar utilizando cualquiera de una variedad de máquinas y sistemas de secuenciación de moléculas individuales de alto rendimiento disponibles. Los sistemas de secuencia ilustrativos incluyen sistemas de secuencia por síntesis tales como el analizador de genoma Illumina y aparatos asociados (Illumina, Inc., San Diego, CA), el sistema de análisis genético de Helicos (Helicos BioSciences Corp., Cambridge, MA), Pacific BioCiences PacBio RS (Pacific Biosciences, Menlo Park, CA) u otros sistemas con capacidades similares. La secuenciación se logra utilizando un conjunto de oligonucleótidos de secuenciación que hibridan con una región definida dentro de las moléculas de ADN amplificadas. Los oligonucleótidos de secuenciación se diseñan de manera que los segmentos génicos que codifican V y J puedan identificarse de forma única mediante las secuencias que se generan basándose en la presente descripción y a la vista de secuencias de genes del receptor inmunitario adaptativo conocidas que aparecen en bases de datos disponibles públicamente. Véanse, por ejemplo, los documentos US2012/0058902 A1, US2010/0330571 A1, WO2011/106738 o WO2012/027503. Los cebadores de secuenciación de la región J de TCRB ilustrativos se exponen en la Tabla 4:

TABLA 4: CEBADORES DE SECUENCIACIÓN DE TCRBJ

En ciertas realizaciones, los segmentos génicos que codifica la región J amplificada pueden tener cada uno una etiqueta identificadora definida por la secuencia única de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o aproximadamente 15, 20 o más nucleótidos, situados en una posición definida con respecto a un sitio RSS. Por ejemplo, se puede utilizar una etiqueta de cuatro bases, en el segmento que codifica la región Jp de las regiones que codifican CDR3 de TCRp amplificadas, en las posiciones 11 a 14 aguas abajo del sitio RSS. Sin embargo, no es necesario que estas realizaciones y realizaciones relacionadas estén tan limitadas y también contemplan otras etiquetas identificadoras definidas por secuencia de nucleótidos relativamente cortas que pueden detectarse en segmentos génicos que codifican la región J y definidas basándose en sus posiciones relativas a un sitio RSS. Éstas pueden variar entre loci que codifican diferentes receptores inmunitarios adaptativos.

De acuerdo con esto, los oligonucleótidos de secuenciación pueden hibridar adyacentes a una etiqueta de cuatro bases dentro de los segmentos génicos que codifican J amplificados en las posiciones 11 a 14 aguas abajo del sitio RSS. Por ejemplo, los oligonucleótidos de secuenciación para TCRB se pueden diseñar para que se reasocien con un motivo de nucleótido consenso observado inmediatamente aguas abajo de esta "etiqueta", de modo que las primeras cuatro bases de una lectura de secuencia identificarán de forma única el segmento génico que codifica J (véase, por ejemplo el documento WO/2012/027503).

La longitud promedio de la región codificante de CDR3, para el TCR, definida como los nucleótidos que codifican el polipéptido TCR entre la segunda cisteína conservada del segmento V y la fenilalanina conservada del segmento J, es de 35 /- 3 nucleótidos. De acuerdo con esto y en ciertos casos, la amplificación por PCR utilizando cebadores oligonucleotídicos del segmento V con cebadores oligonucleotídicos del segmento J que se inicia a partir de la etiqueta del segmento J de una región J de TCR o de IgH concreta (por ejemplo, Jp de TCR, Jy de TCR o Jh de IgH como se describe en la presente memoria) capturarán casi siempre la unión V-D-J completa en una lectura de 50 pares de bases. La longitud promedio de la región CDR3 de IgH, definida como los nucleótidos entre la cisteína conservada en el segmento V y la fenilalanina conservada en el segmento J, está menos restringida que en el locus TCRp, pero típicamente estará entre aproximadamente 10 y aproximadamente 70 nucleótidos. Por consiguiente, y en ciertas realizaciones, la amplificación por PCR utilizando cebadores oligonucleotídicos del segmento V con cebadores oligonucleotídicos del segmento J que comienza en la etiqueta del segmento J de IgH capturará la unión V-D-J completa en una lectura de 100 pares de bases.

Los cebadores de PCR que se reasocian y soportan la extensión de polinucleótidos en secuencias molde emparejadas erróneamente se denominan cebadores promiscuos. En ciertas realizaciones, los cebadores de PCR inversa del segmento J de Ig pueden diseñarse para minimizar el solapamiento con los oligonucleótidos de secuenciación, con el fin de minimizar el cebado promiscuo en el contexto de la PCR múltiple. En una realización, los cebadores inversos del segmento J de Ig pueden estar anclados al extremo 3' mediante reasociación con el motivo del sitio de empalme consenso, con solapamiento mínimo de los cebadores de secuenciación. En general, los cebadores del segmento V y J de TCR e Ig se pueden seleccionar para operar en la PCR a temperaturas de reasociación compatibles utilizando programas de diseño y análisis de secuencia/cebador conocidos bajo parámetros por defecto.

Para la reacción de secuenciación, los cebadores de secuenciación de IGHJ ilustrativos se extienden tres nucleótidos a través de las secuencias de CAG conservadas como se describe en el documento WO/2012/027503.

Determinación del factor de amplificación

Ciertas realizaciones contemplan el uso de las composiciones molde sintéticas descritas en la presente memoria para determinar los factores de amplificación para estimar la cantidad de secuencias codificantes de receptores inmunitarios adaptativos reordenados en una muestra. Estas realizaciones y realizaciones relacionadas se pueden utilizar para cuantificar la cantidad de secuencias codificantes del receptor inmunitario adaptativo en una muestra de ADN que se ha obtenido de células linfoides, incluyendo células linfoides que están presentes en una mezcla de células que comprende células en las que el ADN que codifica un receptor inmunitario adaptativo ha experimentado reordenamiento de ADN, pero en donde la muestra también contiene ADN de células en las que no se ha producido dicho reordenamiento (por ejemplo, células no linfoides, células linfoides inmaduras y/o no linfoides, células mesenquimales, células cancerosas, etc.).

El número total de miembros diferentes de una clase dada de receptores inmunitarios adaptativos (por ejemplo, TCR o IG) en un sujeto se pueden estimar mediante PCR multiplexada utilizando un conjunto completo de cebadores de amplificación V-J seguido de secuenciación cuantitativa de productos de amplificación. La amplificación multiplexada y la secuenciación de alto rendimiento de las secuencias de ADN que codifican TCR y BCR (IG) reordenadas son descritas, por ejemplo, por Robins et al., 2009 Blood 114, 4099; Robins et al., 2010 Sci. Translat. Med. 2:47ra64; Robins et al., 2011 J. Immunol. Meth. doi: 10.1016/j.jim.2011.09. 001; Sherwood et al. 2011 Sci. Translat. Med.

3:90ra61; Publicación de Estados Unidos Núm. 2012/0058902, Publicación de Estados Unidos Núm. 2010/0330571, documento WO/2010/151416, documento WO/2011/106738 y documento WO2012/027503.

Esta metodología típicamente implica tomar muestras de ADN de una subpoblación de células linfoides, tales como células linfoides que están presentes en una muestra de sangre, que también se sabe que contienen células nucleadas que carecen de ADN que codifica TCR o IG reordenado. Las presentes composiciones y métodos pueden permitir una mejora de la exactitud y la precisión en la determinación de la cantidad de moléculas de ADN que codifican TCR e IG reordenadas en dicha muestra. Como se describe en la presente memoria, por ejemplo, "incorporando" (añadiendo) la muestra de ADN con la presente composición molde, se proporciona un patrón molde de amplificación interno para evaluar las eficacias relativas a través del intervalo de cebadores oligonucleotídicos que están presentes en el conjunto de cebadores de amplificación multiplexado. Al evaluar de este modo los productos de amplificación de la presente composición molde artificial, que se añade a la reacción de amplificación en cantidades conocidas, se puede determinar un factor de amplificación (por ejemplo, un factor multiplicador, normalizador, de aumento o disminución a escala o geométrico, etc.) para el conjunto de cebadores de amplificación oligonucleotídicos y a continuación se puede utilizar para calcular la cantidad de moldes de ADN natural en la muestra.

Como otro ejemplo, estas realizaciones y realizaciones relacionadas permiten la cuantificación de enfermedad residual mínima (ERM) en linfoma o leucemia, mediante la detección cuantitativa de ADN que codifica TCR o Ig reordenado en muestras obtenidas de preparaciones mixtas de células linfoides y no linfoides, incluyendo células de linfoma o leucemia persistentes. Los métodos anteriores determinan la ERM como el número de células malignas que son detectables como una proporción del número total de células en una muestra. Por el contrario, los presentes métodos permiten la estimación del número total de células en una muestra que tiene ADN que codifica TCR o Ig que ha experimentado reordenamiento, de modo que las células malignas (por ejemplo, aquellas que tienen un reordenamiento de TCR o Ig concreto, tal como un clonotipo) se pueden cuantificar como una proporción de tales células reordenadas en lugar de como una proporción de todas las células. A modo de teoría no limitante, se cree que debido a que la representación de todas las células reordenadas en una muestra clínica de un sujeto que tiene o se sospecha que tiene ERM es típicamente muy baja, los presentes métodos mejorarán drásticamente la sensibilidad con la que se puede detectar ERM, incluyendo la mejora de tal sensibilidad al aumentar la razón señal/ruido.

Se describe en la presente memoria un método para cuantificar moléculas de ADN reordenado que codifican uno o una pluralidad de receptores inmunitarios adaptativos en una muestra biológica que comprende ADN de células linfoides de un sujeto, comprendiendo cada receptor inmunitario adaptativo una región variable y una región de empalme. En resumen, el método comprende las etapas de:

(A) en una reacción de amplificación multiplexada que utiliza el conjunto de cebadores de amplificación oligonucleotídicos descrito que es capaz de amplificar sustancialmente todas las combinaciones codificantes de V-J para un receptor inmunitario adaptativo dado, amplificar el ADN de la muestra a la que se ha añadido una cantidad conocida de la composición molde descrita en la presente memoria para la determinación del factor de amplificación, para obtener productos de amplificación;

(B) secuenciar cuantitativamente los productos de amplificación de (A) para cuantificar (i) productos de amplificación del molde, que son productos de amplificación de la composición molde descrita en la presente memoria y serán identificables porque contienen al menos una secuencia de oligonucleótido código de barras, y (ii) productos de amplificación de las secuencias de ADN que codifican el receptor inmunitario adaptativo reordenadas en la muestra, que serán identificables porque contienen secuencias V y J específicas pero carecen de una secuencia de oligonucleótido código de barras;

(C) calcular un factor de amplificación basado en información cuantitativa obtenida en la etapa (B); y

(D) utilizar el factor de amplificación de (C) para determinar, mediante cálculo, la cantidad de moléculas de ADN que codifican el receptor inmunitario adaptativo único en la muestra.

Sin desear estar limitados por la teoría, de acuerdo con estos métodos y con métodos relacionados, se mide la cantidad de moléculas de ADN que codifican TCR o IG reordenadas que se muestrean en una reacción de amplificación multiplexada. Para hacerlo, se determina y se promedia un valor de cobertura de secuencia, por ejemplo, la cantidad de lecturas de secuencia de salida que se determinan para cada molécula de entrada (molde) a través del número completo de oligonucleótidos molde diferentes que están presentes, para obtener un valor de cobertura de secuencia promedio. Al dividir (i) la cantidad de lecturas que se obtienen para una secuencia dada por (ii) el valor de cobertura de secuencia promedio, se puede calcular la cantidad de moléculas reordenadas que están presentes como moldes al comienzo de la reacción de amplificación.

Así, por ejemplo, para calcular el valor de cobertura de la secuencia, a cada amplificación por PCR se le añade una cantidad conocida de un conjunto de moléculas sintéticas de la composición molde descrita actualmente, teniendo los moldes sintéticos la estructura básica de fórmula (I) 5' U-B1-V-B2-R-(B3)-J-B4-U 3' donde cada V es un segmento de 300 pares de bases que tiene una secuencia que coincide con una secuencia del gen V de TCR o IG y J es un segmento de 100 pares de bases que tiene una secuencia que coincide con un gen J de TCR o IG. B2 es una secuencia de oligonucleótido código de barras única que identifica cada par VJ y que también diferencia los productos de amplificación de los moldes sintéticos de ADN (que contendrán la secuencia código de barras) de los productos de amplificación de moléculas de ADN molde biológicas de origen natural que son aportadas por la muestra de ADN linfoide (que carecerá de la secuencia código de barras). En este ejemplo, B3 de fórmula (I) no es nada. Después de la amplificación y secuenciación por PCR, se cuenta el número de cada molécula sintética secuenciada (es decir, los productos de amplificación que contienen la secuencia código de barras). La cobertura de la secuencia de las moléculas sintéticas se calcula a continuación basándose en el número conocido de moléculas molde sintéticas de partida utilizadas para incorporarlas a la reacción de amplificación.

Por ejemplo, se puede añadir a la reacción de amplificación un conjunto de 5000 moléculas molde sintéticas que contienen código de barras que comprenden 4-5 copias de cada una de las 1100 secuencias oligonucleotídicas molde sintéticas únicas (que representan cada posible par VJ). Si los productos de amplificación incluyen 50.000 secuencias que coinciden con las moléculas molde sintéticas, se ha obtenido un valor de cobertura de secuencia de 10X y el factor de amplificación es 10. Para estimar la cantidad de moléculas molde VDJ reordenadas naturales en el ADN obtenido de la muestra, el número de productos de amplificación de los moldes naturales (es decir, los productos de amplificación que carecen de cualquier secuencia código de barras) se divide por el factor de amplificación. Para mayor precisión, debido a que en este ejemplo las 5000 moléculas sintéticas son un conjunto complejo de 1100 moléculas que representan cada par VJ, el factor de amplificación para cada par VJ se puede calcular individualmente. El factor de amplificación se puede promediar a través de todas las moléculas sintéticas (Fig. 7). La precisión y robustez del método se muestran en la Fig. 8 y los detalles se describen a continuación en el Ejemplo 2.

Por consiguiente, en estos casos, el método comprende:

(A) amplificar ADN en una reacción en cadena de polimerasa múltiple (PCR) que comprende: (1) ADN de la muestra biológica que comprende células linfoides del sujeto, (2) la composición molde para la determinación del factor de amplificación de fórmula general (I) como se describe en la presente memoria, en la que está presente un número conocido de cada uno de la pluralidad de oligonucleótidos molde que tienen una secuencia oligonucleotídica única, (3) un conjunto de cebadores de amplificación oligonucleotídicos que es capaz de amplificar el ADN reordenado que codifica uno o una pluralidad de receptores inmunitarios adaptativos en el ADN de la muestra biológica, comprendiendo el conjunto de cebadores: (a) en cantidades sustancialmente equimolares, una pluralidad de cebadores oligonucleotídicos del segmento V que son capaces cada uno independientemente de hibridar específicamente con al menos un polinucleótido que codifica un polipéptido de la región V de receptor inmunitario adaptativo o con el complemento del mismo, en donde cada cebador del segmento V comprende una secuencia de nucleótidos de al menos 15 nucleótidos contiguos que es complementaria a al menos un segmento génico que codifica la región V del receptor inmunitario adaptativo y en donde la pluralidad de cebadores del segmento V hibrida específicamente con todos los segmentos génicos funcionales que codifican la región V del receptor inmunitario adaptativo que están presentes en la composición molde, b) en cantidades sustancialmente equimolares, una pluralidad de cebadores oligonucleotídicos del segmento J que son capaces cada uno independientemente de hibridar específicamente con al menos un polinucleótido que codifica un polipéptido de la región J del receptor inmunitario adaptativo o con el complemento del mismo, en donde cada cebador del segmento J comprende una secuencia de nucleótidos de al menos 15 nucleótidos contiguos que es complementaria a al menos un segmento génico funcional que codifica la región J del receptor inmunitario adaptativo y en donde la pluralidad de cebadores del segmento J hibridan específicamente sustancialmente con todos los segmentos génicos funcionales que codifican la región J del receptor inmunitario adaptativo que están presentes en la composición molde, en donde los cebadores oligonucleotídicos del segmento V y del segmento J son capaces de promover la amplificación en dicha reacción de cadena de polimerasa múltiple (PCR) de (i) sustancialmente todos los oligonucleótidos molde en la composición molde para producir una multiplicidad de moléculas de ADN molde amplificadas, siendo suficiente dicha multiplicidad de moléculas de ADN molde amplificadas para cuantificar la diversidad de oligonucleótidos molde en la composición molde, y (ii) sustancialmente todas las moléculas de ADN reordenado que codifican receptores inmunitarios adaptativos en la muestra biológica para producir una multiplicidad de moléculas de ADN reordenado amplificado, siendo suficiente dicha multiplicidad de ADN reordenado amplificado las moléculas son suficientes para cuantificar la diversidad de las moléculas de ADN reordenado en el ADN de la muestra biológica, y en donde cada molécula de ADN amplificado en la multiplicidad de moléculas de ADN molde amplificado y en la multiplicidad de moléculas de ADN reordenado amplificado es menor que 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100, 90, 80 o 70 nucleótidos de longitud; (B) secuenciar cuantitativamente toda o una porción suficiente de cada una de dichas moléculas de ADN molde amplificado y cada una de dichas moléculas de ADN reordenado amplificado para cuantificar (i) una cantidad de producto molde de moléculas de ADN molde amplificado que contienen al menos una secuencia código de barras de oligonucleótido, y (ii) una cantidad de producto reordenado de moléculas de ADN reordenado amplificado que carecen de una secuencia código de barras de oligonucleótido;

(C) calcular un factor de amplificación dividiendo la cantidad de producto molde de (B) (i) por la cantidad conocida de cada uno de la pluralidad de oligonucleótidos molde que tienen una secuencia oligonucleotídica única de (A) (2); y (D) dividir la cantidad de producto reordenado de (B)(ii) por el factor de amplificación calculado en (C) para cuantificar las moléculas de ADN que codifican el receptor inmunitario adaptativo único en la muestra.

No se pretende que las realizaciones contempladas se limiten al método descrito anteriormente, de manera que a partir de la presente descripción, el experto en la técnica apreciará las variaciones que pueden emplearse. Un enfoque alternativo, por ejemplo, puede no utilizar la composición molde sintética descrita en la presente memoria como un molde de control incorporado a la amplificación por PCR multiplexada de una muestra de ADN que contiene TCR de células linfoides reordenado y/o ADN que codifica IG, así como ADN no reordenado. En cambio, de acuerdo con una de tales alternativas, a la reacción de amplificación que utiliza cebadores de amplificación de V y J se le puede añadir un conjunto conocido de cebadores de amplificación oligonucleotídicos que amplifican una región de secuencia genómica distinta, altamente conservada. Estos cebadores de control genómico pueden amplificar cada genoma que está presente en la muestra de ADN independientemente de si contiene o no secuencias codificantes de TCR y/o IG, mientras que los cebadores de V y J pueden amplificar productos solo de genomas con una región VDJ reordenada. La razón entre estas dos clases de moléculas de producto de amplificación permite la estimación del número total de genomas de células B en la muestra.

Se contempla adicionalmente para estas y otras realizaciones relacionadas de cualquiera de los métodos descritos en la presente memoria que dicho método pueda comprender adicionalmente la secuenciación de las moléculas de ADN que codifican el receptor inmunitario amplificado que se producen. Las composiciones y los métodos para la secuenciación de las secuencias génicas del receptor inmunitario adaptativo reordenado y para la determinación del clonotipo del receptor inmunitario adaptativo son descritos por Robins et al., 2009 Blood 114, 4099; Robins et al., 2010 Sci. Translat. Med. 2: 47ra64; Robins et al., 2011 J. Immunol. Meth. doi: 10.1016/j.jim.2011.09. 001; Sherwood et al.

2011 Sci. Translat. Med. 3:90ra61; Publicación de Estados Unidos Núm. 2012/0058902, Publicación de Estados Unidos Núm. 2010/0330571, documento WO/2010/151416, documento WO/2011 /106738 y documento WO2012/027503. También se pueden encontrar detalles sobre la secuenciación de productos de amplificación por PCR, procesamiento de datos de secuenciación y usos de mediciones de diversidad de receptores inmunitarios adaptativos, todos los cuales se pueden emplear para su uso de acuerdo con los métodos descritos en la presente memoria.

De acuerdo con una teoría no limitante, estas realizaciones explotan la comprensión actual en la técnica (también descrita anteriormente) de que una vez que una célula inmune adaptativa (por ejemplo, un linfocito B) ha reordenado sus genes que codifican el receptor inmune adaptativo (por ejemplo, Ig), sus células de progenie poseen el mismo reordenamiento del gen que codifica el receptor inmunitario adaptativo, dando lugar así a una población clonal que puede identificarse de manera única por la presencia en la misma de segmentos de genes V y J que codifican CDR3 reordenados que pueden amplificarse mediante una combinación de pares específica de cebadores oligonucleotídicos específicos de V y J como se describe en la presente memoria.

La práctica de ciertas realizaciones de la presente invención empleará, a menos que se indique específicamente lo contrario, métodos convencionales en técnicas de microbiología, biología molecular, bioquímica, genética molecular, biología celular, virología e inmunología que están dentro del conocimiento práctico de la técnica, y referencia a varios de los cuales se hace a continuación con el propósito de ilustración. Tales técnicas se explican completamente en la bibliografía. Véanse, por ejemplo, Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3a Edición, 2001); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a Edición, 1989); Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982)); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, actualizado en julio de 2008); Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates y Wiley-Interscience; Glover, DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (IRL Press, Oxford Univ. Press USA, 1985); Current Protocols in Immunology (Editado por: John E. Coligan, Ada M. Kruisbeek, David H. Margulies, Ethan M. Shevach, Warren Strober 2001 John Wiley & Sons, NY, NY); Real-Time PCR: Current Technology y Applications, Edited by Julie Logan, Kirstin Edwards y Nick Saunders, 2009, Caister Academic Press, Norfolk, UK; Anand, Techniques for the Analysis of Complex Genomes, (Academic Press, New York, 1992); Guthrie y Fink, Guide to Yeast Genetics y Molecular Biology (Academic Press, New York, 1991); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, Ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames y S. Higgins, Eds., 1985); Transcription y Translation (B. Hames & S. Higgins, Eds., 1984); Animal Cell Culture (R. Freshney, Ed., 1986); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); Next-Generation Genome Sequencing (Janitz, 2008 Wiley-VCH); PCR Protocols (Methods in Molecular Biology) (Park, Ed., 3a Edición, 2010 Humana Press); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); el tratado, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller y M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Harlow y Lane, Antibodies, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1998); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer y Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weir y Cc Blackwell, eds., 1986); Riott, Essential Immunology, 6th Edition, (Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1988); Embryonic Stem Cells: Methods y Protocols (Methods in Molecular Biology) (Kurstad Turksen, Ed., 2002); Embryonic Stem Cell Protocols: Volume I: Isolation y Characterization (Methods in Molecular Biology) (Kurstad Turksen, Ed., 2006); Embryonic Stem Cell Protocols: Volume II: Differentiation Models (Methods in Molecular Biology) (Kurstad Turksen, Ed., 2006); Human Embryonic Stem Cell Protocols (Methods in Molecular Biology) (Kursad Turksen Ed., 2006); Mesenchymal Stem Cells: Methods y Protocols (Methods in Molecular Biology) (Darwin J. Prockop, Donald G. Phinney, y Bruce A. Bunnell Eds., 2008); Hematopoietic Stem Cell Protocols (Methods in Molecular Medicine) (Christopher A. Klug, y Craig T. Jordan Eds., 2001); Hematopoietic Stem Cell Protocols (Methods in Molecular Biology) (Kevin D. Bunting Ed., 2008) Neural Stem Cells: Methods y Protocols (Methods in Molecular Biology) (Leslie P. Weiner Ed., 2008).

A menos que se proporcionen definiciones específicas, la nomenclatura utilizada con respecto a, y los procedimientos y técnicas de laboratorio de, biología molecular, química analítica, química orgánica sintética y química médica y farmacéutica descritos en la presente memoria son los bien conocidos y comúnmente utilizados en la técnica. Se pueden utilizar técnicas convencionales para tecnología recombinante, biología molecular, microbiología, síntesis química, análisis químicos, preparación farmacéutica, formulación y suministro, y tratamiento de pacientes.

Sistema informático

La FIG. 12 es un diagrama de bloques de alto nivel que ilustra una vista funcional de un sistema informático típico 1200 descrito en la presente memoria. Se ilustran al menos un procesador 1202 acoplado a un bus 1204. También acoplado al bus 1204 hay una memoria 1206, un dispositivo de almacenamiento 1208, un teclado 1210, un adaptador de gráficos 1212, un dispositivo señalador 1214 y un adaptador de red 1216. Una pantalla 1218 está acoplada al adaptador de gráficos 1212.

El procesador 1202 puede ser cualquier procesador de propósito general tal como una CPU compatible INTEL x86, SUN MICROSYSTEMS SPARC o con POWERPC. El dispositivo de almacenamiento 1208 es, en un caso, una unidad de disco duro, pero también puede ser cualquier otro dispositivo capaz de almacenar datos, tal como un disco compacto (CD) o DVD grabables, o un dispositivo de memoria de estado sólido. La memoria 1206 puede ser, por ejemplo, soporte lógico inalterable "firmware", memoria de solo lectura (ROM), memoria de acceso aleatorio no volátil (NVRAM) y/o RAM, y contiene instrucciones y datos utilizados por el procesador 202. El dispositivo señalador 1214 puede ser un ratón, bola de seguimiento u otro tipo de dispositivo señalador, y se utiliza combinado con el teclado 1210 para introducir datos en el sistema informático 1200. El adaptador gráfico 1212 muestra imágenes y otra información en la pantalla 1218. El adaptador de red 1216 acopla el sistema informático 1200 a la red.

Como se conoce en la técnica, el sistema informático 1200 está adaptado para ejecutar módulos de programas informáticos. Según se utiliza en la presente memoria, el término "módulo" se refiere a la lógica y/o los datos del programa informático para proporcionar la funcionalidad especificada. Se puede implementar un módulo en el equipo, soporte lógico inalterable y/o soporte lógico. En un caso, los módulos se almacenan en el dispositivo de almacenamiento 1208, se cargan en la memoria 1206 y se ejecutan en el procesador 1202. Los diversos métodos y etapas ilustrados en la presente memoria pueden ejecutarse por medio de los componentes del sistema informático 1200.

Las descripciones y representaciones algorítmicas son comúnmente utilizadas por los expertos en las técnicas de procesamiento de datos para transmitir la esencia de su trabajo de manera eficaz a otros expertos en la materia. Se entiende que estas operaciones, aunque se describen funcionalmente, computacionalmente o lógicamente, se implementan mediante programas informáticos o circuitos eléctricos equivalentes, microcódigo o similares. Además, también ha resultado conveniente a veces, referirse a estas disposiciones de operaciones como módulos, sin pérdida de generalidad. Las operaciones descritas y sus módulos asociados pueden incorporarse en soporte lógico, soporte lógico inalterable, o equipo o cualquier combinación de los mismos.

Cualquiera de los etapas, operaciones o procedimientos descritos en la presente memoria puede realizarse o implementarse con uno o más módulos de equipo o soporte lógico, solos o en combinados con otros dispositivos. En un caso, se implementa un módulo de soporte lógico con un producto de programa informático que comprende un medio legible por ordenador que contiene código de programa informático, que puede ejecutarse mediante un procesador informático para realizar cualquiera o todas las etapas, operaciones o procedimientos descritos.

Se describe en la presente memoria un aparato para realizar las operaciones de la presente memoria. Este aparato puede construirse especialmente para los fines requeridos, y/o puede comprender un dispositivo informático de propósito general activado o reconfigurado selectivamente por un programa informático almacenado en el ordenador. Tal programa informático puede almacenarse en un medio de almacenamiento legible por ordenador tangible o cualquier tipo de medio adecuado para almacenar instrucciones electrónicas, y acoplado a un bus de sistema informático. Además, todos los sistemas informáticos a los que se hace referencia en la memoria descriptiva pueden incluir un único procesador o pueden ser arquitecturas que emplean diseños de múltiples procesadores para aumentar la capacidad informática.

Se describe en la presente memoria una señal de datos informáticos incorporada en una onda portadora, en donde la señal de datos informáticos incluye cualquier realización de un producto de programa informático u otra combinación de datos descrita en la presente memoria. La señal de datos del ordenador es un producto que se presenta en un medio tangible u onda portadora y se modula o codifica de otro modo en la onda portadora, que es tangible, y se transmite de acuerdo con cualquier método de transmisión adecuado.

Además, el lenguaje utilizado en la memoria descriptiva se ha seleccionado principalmente para fines de legibilidad y explicativos, y puede no haberse seleccionado para delinear o circunscribir el tema de la invención. Por lo tanto, se pretende que el alcance de la invención esté limitado no por esta descripción detallada, sino por las reivindicaciones. En consecuencia, la descripción de las realizaciones de la invención pretende ser ilustrativa, pero no limitante, del alcance de la invención.

A menos que el contexto requiera lo contrario, a lo largo de la presente memoria descriptiva y las reivindicaciones, la palabra "comprender" y sus variaciones, tales como, "comprende" y "que comprende" deben interpretarse en un sentido abierto e inclusivo, es decir, como "incluyendo, pero sin limitarse a". Por "que consiste en" se entiende que incluye, y típicamente se limita a, lo que sigua a la frase "que consiste en". Por "que consiste esencialmente en" se entiende que incluye cualquier elemento enumerado después de la frase, y se limita a otros elementos que no interfieren ni contribuyen a la actividad o acción especificada en la descripción para los elementos enumerados. Por lo tanto, la frase "que consiste esencialmente en" indica que los elementos enumerados son requeridos u obligatorios, pero que no se requieren otros elementos y pueden o no estar presentes dependiendo de si afectan o no a la actividad o acción de los elementos enumerados.

En esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "uno", "una", "el" y "la" incluyen referencias en plural a menos que el contenido indique claramente lo contrario. Según se utiliza en la presente memoria, en realizaciones concretas, los términos "alrededor de" o "aproximadamente" cuando preceden a un valor numérico indican el valor más o menos un intervalo de 5%, 6%, 7%, 8% o 9%. En otras realizaciones, los términos "alrededor de" o "aproximadamente" cuando preceden a un valor numérico indican el valor más o menos un intervalo de 10%, 11%, 12%, 13% o 14%. En otras realizaciones más, los términos "alrededor de" o "aproximadamente" cuando preceden a un valor numérico indican el valor más o menos un intervalo de 15%, 16%, 17%, 18%, 19% o 20%.

La referencia a lo largo de esta memoria descriptiva a "una realización" o "una realización" o "un aspecto" significa que se incluye un rasgo, estructura o característica concretos descritos en relación con la realización en al menos una realización de la presente invención. De este modo, las entradas de las frases "en una realización" o "en una realización" en varios lugares a lo largo de esta memoria descriptiva no necesariamente se refieren todas a la misma realización. Además, los rasgos, estructuras o características concretos se pueden combinar de cualquier manera adecuada en una o más realizaciones.

Ejemplos

Ejemplo 1

Caracterización de la clonalidad de células T y detección de ERM en muestras de T-ALL

En este ejemplo, se obtuvieron muestras de sangre por pares de leucemia linfoblástica aguda (T-ALL) pediátrica de células T de 43 pacientes (Children's Oncology Group AALL0434) en el momento del diagnóstico y el día 29 después de la terapia de inducción. La región determinante de complementariedad (CDR3) que codifica las regiones de los genes TCRB y TCRG se secuenciaron para los 86 especímenes mediante secuenciación de alto rendimiento (HTS) utilizando una plataforma Illumina GA2 (Illumina, San Diego, CA) como se describió previamente (véanse Robins et al., Blood, 114(19):4099-4107, 2009; y Robins et al., Sci Transl Med. 3(90):90ra61, 2011). Se utilizaron muestras de pretratamiento para identificar secuencias de ADN que codifican CDR3 de TCR únicas reordenadas para el clon leucémico, y las muestras post-tratamiento se evaluaron para determinar la frecuencia de cada secuencia de ADN que codifica CDR3 de TCR reordenada como un porcentaje del total. La frecuencia de cada secuencia de ADN que codifica CDR3 de TCR reordenada también se enumeró en muestras posteriores al tratamiento de todos los demás pacientes para evaluar la especificidad. Estos resultados se compararon con los resultados de ERM obtenidos mediante citometría de flujo de 9 colores, por protocolo de prueba.

T reinta y una de 43 muestras de pretratamiento (72,1 %) tenían una población clonal de células T detectable basándose en análisis de secuencia de TCRB, y 27 de ellas también tenían una secuencia de TCRG clonal detectable. Cinco muestras exhibieron una secuencia que codificaba CDR3 de TCRG reordenada única adicional compatible con el reordenamiento de ambos loci de TCRG o con la presencia de dos subpoblaciones clonales. Cinco de 12 casos sin una secuencia del gen de TCRB clonal detectable tenían el inmunofenotipo de T-ALL del precursor tímico temprano (ETP), compatible con el hecho de que portaban genes TCRB y TCRG de línea germinal no reordenada. Ningún otro caso fue ETP. Seis de los 12 casos sin una secuencia del gen de TCRB clonal detectable tenían el inmunofenotipo de T-ALL próximo al del precursor tímico temprano (n-ETP). La muestra restante sin una secuencia del gen de TCRB clonal detectable, tenía una secuencia de gen de TCRG clonal detectable. Por el contrario, de los 31 casos en los que se identificó un reordenamiento de TCRB clonal en el momento del diagnóstico, ningún caso fue ETP, tres fueron próximos a ETP, y los 28 restantes fueron de inmunofenotipo T-ALL no ETP. En esta cohorte, hubo una asociación de la ausencia de una secuencia de TCRB clonal completa en la muestra de pretratamiento con inmunofenotipo ETP o próximo a ETP mediante mpFC (p <0,0001, Prueba exacta de Fischer).

Las 37 muestras restantes con una secuencia de TCR clonal detectable antes del tratamiento se utilizaron para comparar mpFlow con HTS. La secuenciación de alto rendimiento utilizada para detectar las secuencias de TCRB clonales originales del paciente el día 29 revelaron tres subgrupos de pacientes en esta cohorte: 1) aquellos para los que no se detectó ERM mediante HTS o mpFC, 9 casos; 2) aquellos para los que se detectó ERM solo mediante HTS pero no mediante mpFC, 10 casos; y 3) aquellos en los que no se detectó ERM mediante HTS ni mpFC, 12 casos (Figura 1B). De los diez casos para los que HTS detectó ERM y mpFC no lo hizo, la ERM fue 10 a 100 veces menor que para los 12 casos para los que tanto mpFC como HTS detectaron ERM. Estos resultados sugieren que HTS ofrece una detección de ERM de sensibilidad superior. Las frecuencias de secuencia de fondo eran muy bajas (0-10'5) en otras muestras de pacientes postratamiento, siendo ligeramente más alta para TCRG que para TCRB, compatible con la diversidad de la secuencia de línea germinal. La fuerte asociación del estado de ETP con la carencia de una secuencia de TCR clonal detectable mediante HTS en el momento del diagnóstico también sugirió la utilidad de HTS de TCR para identificar este subconjunto de malos resultados de T-ALL.

Materiales y métodos

Preparación de la muestra. Se recogió sangre (muestras de 5 ml) antes del tratamiento (Día 0) y 29 días después del tratamiento inicial (Día 29) de 43 individuos diagnosticados de T-ALL. La sangre recolectada se subdividió en una muestra para la secuenciación de alto rendimiento de TCR (HTS) y una muestra para el análisis de citometría de flujo de mpFC. Las muestras fueron codificadas a ciegas y enviadas para la h Ts . Todos los pacientes dieron su consentimiento para el uso de sus muestras como parte de la prueba COG.

Citometría de flujo. Se realizó citometría de flujo multiparamétrica de 9 colores (mpFC) en la Universidad de Washington (Seattle, WA) como parte de la evaluación de rutina para ERM (17). Los datos de flujo se revisaron, y las muestras se clasificaron como T-ALL de precursor tímico temprano (ETP) o no ETP, como se describió previamente (15). Los casos en los que el inmunofenotipo fue similar pero no suficiente para cumplir los criterios de ETP se designaron como próximos a ETP (nETP). Los datos se analizaron utilizando el soporte lógico Woodlist versión 2.7 (B. Wood, Univ. of Washington, Seattle, WA). Se informa sobre los resultados como el porcentaje de linfoblastos de células T totales, células mononucleares totales y celularidad total para su comparación con estudios moleculares.

Secuenciación de alto rendimiento (HTS)/Secuenciación de regiones CDR3: las regiones de CDR3 de TCRG y TCRB se amplificaron y secuenciaron a partir de 400 ng de muestras del Día 0 y 1200 ng del Día 29, o toda la muestra restante de ADN extraído. La amplificación y secuenciación de las regiones CDR3 de TCRp se llevaron a cabo como se describió previamente (9) y amplificación y secuenciación de las regiones CDR3 de TCRG se llevaron como se describió previamente (11). Las secuencias para las regiones CDR3 de TCRp y TCRy se delinearon de acuerdo con la definición establecida por la colaboración internacional ImMunoGeneTics (18). Las secuencias que no coincidían con las secuencias de CDR3 se eliminaron del análisis. Se utilizó un algoritmo convencional para identificar qué segmentos V, D y J contribuyeron a cada secuencia CDR3 de TCRp y qué segmentos V y J contribuyeron a cada secuencia de CDR3 de TCRy (18). Las secuencias de CDR3 reordenadas se clasificaron como no productivas si se identificaron inserciones o deleciones que daban lugar a desplazamientos de marco o codones de parada prematuros.

Identificación de secuencias de CDR3: se aislaron diez ml de sangre de seis controles sanos. Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC), se extrajo el ADN y se utilizaron 1200 ng de ADN extraído para amplificar las secuencias de TCRB utilizando el mismo protocolo que las muestras de T-ALL del día 29. La frecuencia de los clones reactivos de células T ap más comunes en PBMC de estos individuos sanos promedió el 3% del repertorio total con una desviación típica de 3%. Debido a que las células T ap portaban ambas secuencias codificantes de CDR3 de cadena TCRG y TCRb (11) reordenadas, se supuso que ambas frecuencias de las cadenas de CDR3 de TCRB y TCRG de mayor número de copias representaban los linfoblastos T neoplásicos. El día 0, las muestras con una frecuencia diez veces mayor de las secuencias de CDR3 más comunes en comparación con los controles, >30%, se consideraron población clonal. Para las muestras en las que las dos secuencias de TCR más comunes eran de frecuencia comparable, se consideró que ambas secuencias eran el clon de cáncer probable. La ERM a los 29 días del tratamiento se escrutó buscando secuencias de CDR3 que coincidieran de forma idéntica con la secuencia clonal identificada el día 0, requiriendo un emparejamiento de 60 pares de bases. Se observaron tanto la presencia como la frecuencia de ERM con respecto a el repertorio total de t Cr . Para determinar si la secuencia clonal era específica, todas las muestras del día 29 se escrutaron para determinar la presencia y la frecuencia de todas las secuencias clonales de CDR3 de TCR identificadas para determinar la especificidad cruzada del paciente.

Resultados

Utilizando 43 pares de muestras de T-ALL emparejadas derivadas de pacientes inscritos en la prueba AALL0434 del Children's Oncology Group (Universidad de Washington, Seattle, WA), se secuenciaron las regiones determinantes de complementariedad (CDR3) de TCRB (Tabla 5) y TCRG (Tablas 5 y 6) mediante HTS utilizando aproximadamente 75.000 genomas el día 0 y 150.000 genomas el día 29. Estas secuencias del día 0 permitieron la definición, para cada paciente, de las secuencias únicas del gen de TCR recombinado que representan los linfoblastos T neoplásicos clonales de cada paciente (T ablas 5 y 6). Los datos normalizados de mpFC (blast/células CD7+) también se muestran en las Tablas 5 y 6.

Tabla 5. % de células T ue eran Blast el día 0 el día 29: caracterización mediante m FC HTS de TCRB

Las muestras PT_13, 39, 42, 45, 56, 60 y 68 se clasificaron como ETP. Las muestras PT_3, 12, 54, 55 y 57 se clasificaron como nETP (Figuras 2 y 3).

Tabla 6. % de células T que fueron Blast el día 0 y caracterización del día 29 mediante mpFC y HTS de TCRB/TCRG

En general, cada una de estas secuencias clónales representaba al menos el 15% del repertorio total de células T del sujeto en el momento del diagnóstico, una proporción que era mayor que tres desviaciones típicas de la media de los clones de células T reactivas en individuos normales (Tabla 7 y Figura 5). El día 0, se identificó fácilmente una población clonal de TCRB en 31 de 43 casos (Figura 1A, Figura 4). Por el contrario, 12 muestras de pacientes no tenían una secuencia de TCRB clonal identificable en el momento del diagnóstico, definida como la que comprendía menos de 15% de las secuencias totales. De los 12 pacientes en los que no se identificó secuencia de TCRB clonal, cuatro tenían un reordenamiento de TCRG clonal en el análisis concurrente (Tabla 6).

Tabla 7. Frecuencia de a arición de clones de ma or frecuencia en suetos de control normal

Con el conocimiento de las secuencias de CDR específicas de la población clonal del paciente desde el día 0, se examinó a continuación la capacidad de HTS para identificar la secuencia clonal el día 29, y estos hallazgos se compararon con los resultados de mpFC que se realizaron como parte del protocolo actual en la Universidad de Washington en la prueba AALL0434 del Children's Oncology Group. A la luz de las secuencias de TCRB y TCRG clonales originales del paciente en el momento del diagnóstico, la secuenciación de alto rendimiento de estas muestras de pacientes el día 29 reveló tres subgrupos de pacientes en esta cohorte: 1) aquellos para quienes no se detectó ERM mediante HTS o mpFC, 9 casos; 2) aquellos para quienes se detectó ERM tanto mediante HTS como mediante mpFC, 12 casos; y 3) un subconjunto para el que la ERM era detectable mediante HTS, pero no mediante mpFC, 10 casos (Figura 1B). En general, hubo un aumento de aproximadamente 100 veces en la sensibilidad con la que la ERM podría detectarse mediante la metodología HTS descrita en la presente memoria, en comparación con mpFC.

De los casos para los que no se identificó población de TCRB clonal el día 0, la evaluación posterior mostró que estos pacientes generalmente tenían niveles altos de ERM el día 29. La revisión del inmunofenotipo de los linfoblastos T de los pacientes el día 0 mostró que de los 12 casos, 5 tenían un inmunofenotipo compatible con un subtipo precursor tímico temprano (ETP), mientras que 7 tenían un inmunofenotipo próximo a ETP, en donde se cumplieron algunos, pero no todos, los criterios inmunofenotípicos para ETP (Tabla 5) (15). La asociación de enfermedad residual mínima más alta en pacientes con linfoblastos de inmunofenotipo ETP (x = 0,1848) versus T-ALL no ETP (media = 0,01613, estadística de Fisher) fue compatible con informes previos que identificaron este subgrupo por tener un curso clínico más agresivo con aumento de la propensión a la recaída de la enfermedad. Basándose en estos datos, el grupo próximo a ETP apareció en sus características para ocupar una posición a lo largo de un continuo entre los subtipos no ETP y ETP de T-ALL.

Para evaluar la especificidad de HTS para la evaluación de ERM, se realizó una evaluación de la frecuencia de aparición de una secuencia clonal específica de TCR de un paciente que está presente en las otras 41 muestras de pacientes el día 29. Este análisis demostró 15 "falsos positivos" de 1.722 comparaciones de genes TCRG (= N2-N = 422-42 = 1.722) para TCRG y 3 "falsos positivos" de 1.722 comparaciones para TCRB. Cabe destacar que el nivel de estos clones falsos positivos fue mucho menor, en un orden de magnitud, en comparación con los verdaderos positivos de ERM.

Discusión

Datos recientes del estudio AIEOP-BFM-ALL 2000, una prueba clínica prospectiva multiinstitucional que involucró a 464 pacientes con T-ALL confirmó la importancia de la enfermedad residual mínima (ERM) para categorizar la enfermedad normal, intermedia y de alto riesgo basándose en ERM en dos puntos temporales después de la terapia (2). Pacientes con ERM detectable de más de 10'3 células en el segundo punto temporal, TP2 (día 78) no tuvieron un buen resultado, de modo que se concluyó que la ERM persistente en TP2 era un factor predictivo importante para la recaída de la T-ALL. La detección de este nivel de enfermedad se encontraba fácilmente dentro de la sensibilidad de la presente tecnología HTS como se muestra en la presente memoria, por lo que la determinación de la clonalidad se logró sin los requisitos laboriosos de PCR individualizada o diseño de oligonucleótidos específico de alelos de enfoque anteriores para ERM. La HTS era fácilmente aplicable a escala, menos compleja desde el punto de vista organizativo que las metodologías anteriores, y se adaptaba fácilmente a cualquier entorno de laboratorio clínico.

En el presente ejemplo, la secuenciación de TCRG fue adecuada para detectar la clonalidad en una proporción ligeramente mayor de casos en comparación con TCRB, pero TCRB también se consideró de gran utilidad para la evaluación de la ERM debido a la mayor diversidad de líneas germinales de TCRB con respecto a TCRG. En análisis de muestras del día 29, se encontró que las secuencias de TCR clonales eran altamente específicas con la identificación coincidente de secuencias cruzadas de pacientes, es decir, la identificación de la secuencia clonal de un paciente en los otros 41 pacientes secuenciados en este estudio, siendo generalmente poco frecuentes. Los protocolos moleculares previamente descritos para la detección de ERM utilizando cebadores personalizados específicos para el paciente (7, 8) no evaluaron de forma rutinaria la especificidad cruzada del paciente, puesto que la evaluación de la sensibilidad (por ejemplo, % de los sujetos correctamente identificados como ERM+ según los criterios dados) y la falta de especificidad (por ejemplo,% de los sujetos identificados correctamente como ERM- según los criterios dados) fue el único requisito para los ensayos previos. Como tales, los presentes métodos HTS también permitieron la identificación de un solapamiento raro y coincidente de las secuencias del gen de TCR de un paciente a otro. Notablemente, el nivel de estas secuencias compartidas detectables en tales comparaciones falsas positivas entre pacientes fue mucho más bajo que el observado en casos reales de pacientes con ERM. Es importante destacar que, para ERM de T-ALL, los reordenamientos del gen de TCR parecían ser estables, con evidencia limitada (menos del 5%) para la evolución clonal.

La metodología HTS actualmente descrita contribuyó al pronóstico de la enfermedad en el momento del diagnóstico para T-ALL para un subconjunto de casos, al identificar muestras en las que no había reordenamiento de genes TCRB en el momento del diagnóstico, a pesar de la evidencia de una alta proporción de linfoblastos T mediante mpFC. Estos casos tendían a tener un inmunofenotipo similar al precursor tímico temprano, o características inmunofenotípicas similares que se describieron en la presente memoria como cercana a ETP (15). Se ha propuesto que un subtipo de ETP de T-ALL se deriva de un subconjunto inmunogenéticamente temprano de células T antes del reordenamiento génico del TCR, aunque un estudio reciente sugiere que dicho subconjunto también puede haber representado la reversión del estado doblemente positivo de células T inmaduras a un inmunofenotipo más inmaduro (16). La comparación con los resultados de citometría de flujo de ERM el día 29 mostró que los 12 casos, para los cuales no se identificó secuencia TCRB clonal en el pretratamiento, tenía un aumento de ERM al día 29, lo que concuerda con un curso clínico más agresivo de estos tumores de tipo ETP.

La utilidad de HTS para la secuenciación de los genes que codifican el receptor inmunitario adaptativo linfoide en T-ALL es extensible al seguimiento clínico rutinario mediante HTS de los genes que codifican el receptor inmunitario adaptativo linfoide en leucemia/linfomas linfoblásticos de células B (B-ALL). La determinación de ERM en B-ALL, mediante técnicas moleculares y mpFC, ha demostrado ser importante para el pronóstico del paciente (3). La B-ALL comúnmente muestra reordenamientos de linaje cruzado (B a T) de TCRB y/o TCRG, por lo que el enfoque descrito en la presente memoria es directamente aplicable a un subconjunto de casos de B-ALL (1) De manera similar, la HTS de reordenamientos de genes de cadena pesada de inmunoglobulina también se puede realizar fácilmente basándose en a las enseñanzas proporcionadas en la presente memoria.

Referencias

1. Flohr et al., Leukemia 22, 771-782 (2008).

2. Schrappe et al., Blood 118, 2077-2084).

3. van Dongen et al., Lancet 352, 1731-1738 (1998).

4. D. Campana, Hematology Am Soc Hematol Educ Program 2010, 7-12).

5. Campana, Curr Hematol Malig Rep 5, 169-176 (2010).

6. Roshal et al., Cytometry B Clin Cytom 78, 139-146).

7. van der Velden et al., Leukemia 21, 706-713 (2007).

8. van der Velden et al., Leukemia 21, 604-611 (2007).

9. Robins et al., Blood 114, 4099-4107 (2009).

10. Robins et al., Sci Transl Med 2, 47ra64 (2010).

11. Sherwood et al., Sci Transl Med 3, 90ra61 (2011).

12. Kalos et al., Sci Transl Med 3, 95ra73 (2011).

13. Boyd et al., Sci Transl Med 1, 12ra23 (2009).

14. Robins, Desmarais, Matthis, Livingston, Andriesen, Reijonen, Carlson, Nepom, Yee, Cerosaletti, Ultra-sensitive detection of rare T cell clones. J Immunol Methods doi:10.1016/j.jim.2011.09.001 (10 de sept. de 2011, publicación electrónica antes de impresión PMID 21945395).

15. Coustan-Smith et al., Lancet Oncol 10, 147-156 (2009).

16. Berquam-Vrieze et al., Blood 118, 4646-4656).

17. Wood et al., Arch Pathol Lab Med 130, 680-690 (2006).

18. Yousfi Monod et al., Bioinformatics 20 Supl 1, i379-385 (2004).

Ejemplo 2

Uso de la composición molde para determinar el factor de amplificación

Este ejemplo describe la cuantificación de moléculas de ADN reordenado que codifican una pluralidad de moléculas de IG, utilizando la composición de oligonucleótido molde actualmente descrita como molde sintético "incorporado" a una amplificación por p Cr multiplexada de una muestra de ADN que contiene células B y ADN de fibroblastos.

ADN molde biológico: Se utilizaron como fuentes de ADN molde ocho muestras biológicas, con cada muestra biológica que contenía la misma cantidad de ADN genómico total (ADNg), 300 ng, pero en una proporción diferente de (i) ADN extraído de células B con respecto a (ii) ADN extraído de células de fibroblastos humanos, un tipo de célula en el que los genes que codifican IG y TCR no se reordenan. Las muestras contenían 0, 0,07, 0,3, 1, 4, 18, 75 o 300 ng de ADNc de células B, suministrando el ADNg de fibroblastos el resto de cada preparación de ADNg de 300 ng. Se realizaron cuatro réplicas de cada muestra.

ADN de molde sintético: A cada reacción de PCR (más abajo) se le añadieron 5000 moléculas (4-5 moléculas de cada secuencia) de una composición molde de oligonucleótido que comprendía un conjunto de 1116 moléculas de oligonucleótido molde de IGH sintéticas (SEC ID NO: 4085-5200). (También se describe una composición molde de IGH que comprende un conjunto de 1116 oligonucleótidos molde en la Lista de Secuencias como SEQ ID NO: 1805­ 2920.

Reacción de PCR: La reacción de PCR utilizó la mezcla maestra de PCR QIAGEN múltiplex Plus™ (número de componente QIAGEN 206152, Qiagen, Valencia, CA), solución Q al 10% (QIAGEN) y 300 ng de ADN molde biológico (descrito anteriormente). Los cebadores de amplificación agrupados se añadieron de modo que la reacción final tenía una concentración agregada de cebador directo 2 pM y una concentración agregada de cebador inverso 2 pM. Los cebadores directos (SEQ ID NO: 5201-5286) incluían 86 cebadores que tenían en el extremo 3' un segmento de aproximadamente 20 pb que se reasociaba con la secuencia que codifica el segmento V de IGH y en el extremo 5' un cebador universal de aproximadamente 20 pb pGEXf. Los cebadores inversos (SEQ ID NO: 5287-5293) incluían un conjunto de cebadores específicos del segmento J que en el extremo 3' tenían un segmento de aproximadamente 20 pb que se reasociaba con la secuencia que codificaba el segmento J de IGH y en el extremo 5' de los cebadores de J había un cebador universal pGEXr. Las siguientes condiciones de ciclos térmicos se utilizaron en un termociclador C100 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EE.UU.): un ciclo a 95°C durante 10 minutos, 30 ciclos a 94°C durante 30 segundos, 63°C durante 30 segundos, y 72°C durante un minuto, seguido de un ciclo a 72°C durante 10 minutos. Cada reacción se ejecutó por cuadruplicado.

Para la secuenciación, se incorporaron los adaptadores Illumina (Illumina Inc., San Diego, CA), que también incluían una etiqueta de 8 pb y un conjunto aleatorio de 6 pb de nucleótidos, en los extremos de los productos de reacción de PCR en una reacción de PCR de 7 ciclos. Los reactivos y condiciones de la PCR fueron los descritos anteriormente, excepto por las condiciones de termociclación, que fueron: 95°C durante 5 minutos, seguidos de 7 ciclos de 95°durante 30 segundos, 68°durante 90 segundos y 72°durante 30 segundos. Después de termociclación, las reacciones se mantuvieron durante 10 minutos a 72° y los cebadores fueron los cebadores de cola del adaptador Illumina (SEQ ID NO: 5387 - 5578). Las muestras se secuenciaron en un secuenciador Illumina MiSEQ™ utilizando el cebador Illumina_PE_RD2.

Resultados. Se obtuvieron datos de secuencia para cada muestra y los productos de amplificación de moldes sintéticos se identificaron por la presencia de la secuencia de oligonucleótido código de barras. Para cada muestra, el número de productos molde se dividió por la cantidad de secuencias oligonucleotídicas molde sintéticas únicas (1116) para llegar a un factor de amplificación de la muestra. El número total de productos de amplificación de los moldes biológicos para cada muestra se dividió a continuación por el factor de amplificación para calcular la cantidad de moléculas moldeadas del molde biológico (por ejemplo, recombinaciones VDJ) en la reacción de amplificación inicial como una estimación de la cantidad de moldes de genoma de células B únicos. Los valores promedio con las desviaciones típicas se representaron gráficamente frente al número conocido de moléculas molde biológicas reordenadas basándose en la entrada de células B (Figura 8). En la Figura 8, los puntos representan el factor de amplificación promedio y las barras representan la desviación típica a través de las cuatro repeticiones. El uso de factores de amplificación calculados como se describe en la presente memoria para estimar la cantidad de moléculas que codifican IG con VJ reordenadas (como un valor proxy para el número de células B) arrojó determinaciones que eran compatibles con las cantidades de células B conocidas al menos hasta una entrada de 100 células B Los valores estimados del factor de amplificación y el factor de amplificación observado estaban altamente correlacionados (Fig. 8, R2 = 0,9988).

Claims (10)

REIVINDICACIONES

1. Un método para detectar enfermedad residual mínima para un tumor maligno hematológico linfoide en un sujeto después de la terapia, comprendiendo el método

(a) amplificación de ADN extraído de una primera muestra en una reacción en cadena de polimerasa múltiple (PCR) utilizando cebadores del segmento V y J para producir una multiplicidad de moléculas de a Dn reordenado amplificado que comprenden cada una una región que codifica CDR3 de Ig, en donde la primera muestra se ha obtenido del sujeto antes de la terapia y comprende una pluralidad de células hematopoyéticas linfoides,

(b) secuenciación de alto rendimiento de dicha multiplicidad de moléculas de ADN reordenado amplificado para determinar las frecuencias relativas de regiones que codifican CDR3 de Ig reordenadas de manera única en la primera muestra, identificando así la región que codifica CDR3 de Ig reordenada de manera única de uno o más clones de células B malignas,

(c) amplificación de ADN extraído de una segunda muestra en una reacción en cadena de polimerasa múltiple (PCR) utilizando los cebadores del segmento V y J para producir una multiplicidad de moléculas de ADN reordenado amplificado comprendiendo cada una una región que codifica CDR3 de Ig, en donde la segunda muestra se ha obtenido del sujeto después de la terapia y comprende una pluralidad de células hematopoyéticas linfoides, y (d) secuenciación de alto rendimiento de dicha multiplicidad de moléculas de ADN reordenado amplificado producidas a partir de la segunda muestra para determinar la frecuencia relativa de la región que codifica CDR3 de Ig reordenada de manera única de los uno o más clones de células B malignas en la segunda muestra, en donde la presencia de la región que codifica CDR3 de Ig reordenada de manera única de los uno o más clones de células B malignas a una frecuencia relativa de al menos 1 en 105 regiones que codifican CDR3 de Ig indica enfermedad residual mínima para el tumor maligno hematológico linfoide;

en donde la PCR múltiple comprende adicionalmente una pluralidad de oligonucleótidos molde que tiene una pluralidad de secuencias de oligonucleótidos de fórmula general

5'-U1-B1-V-B2-R-B3-J-B4-U2-3' [I] en donde

(i) V es un polinucleótido que comprende al menos 20, 30, 60, 90, 120, 150, 180, o 210, y no más de 1000, 900, 800, 700, 600 o 500 nucleótidos contiguos de una secuencia génica que codifica la región variable (V) del receptor inmunitario adaptativo, o el complemento de la misma, y en cada una de la pluralidad de secuencias de oligonucleótidos V comprende una secuencia oligonucleotídica única,

(ii) J es un polinucleótido que comprende al menos 15-30, 31-60, 61-90, 91-120, o 120-150, y no más de 600, 500, 400, 300 o 200 nucleótidos contiguos de una secuencia génica que codifica la región de empalme (J) del receptor inmunitario adaptativo, o el complemento de la misma, y en cada una de la pluralidad de secuencias de oligonucleótidos J comprende una secuencia oligonucleotídica única,

(iii) U1 no es nada o comprende un oligonucleótido que tiene una secuencia que se selecciona entre (1) una primera secuencia de oligonucleótido adaptador universal, y (2) una primera secuencia oligonucleotídica específica de la plataforma de secuenciación que está conectada y posicionada en 5' con respecto a la primera secuencia de nucleótido adaptador universal,

(iv) U2 no es nada o comprende un oligonucleótido que tiene una secuencia que se selecciona entre (1) una segunda secuencia de oligonucleótido adaptador universal, y (2) una segunda secuencia oligonucleotídica específica de la plataforma de secuenciación que está conectada y posicionada en 5' con respecto a una segunda secuencia de oligonucleótido adaptador universal,

(v) B1, B2, B3, y B4 son cada uno independientemente nada o cada uno comprende un oligonucleótido B que comprende una secuencia código de barras de oligonucleótido de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25, nucleótidos contiguos, en donde en cada una de la pluralidad de secuencias de oligonucleótidos B comprende una secuencia oligonucleotídica única que identifica de forma única, como una combinación pareada, (1) la secuencia oligonucleotídica V única de (i) y (2) la secuencia oligonucleotídica J única de (ii), y

(vi) R no es nada o comprende un sitio de reconocimiento para enzimas de restricción que comprende una secuencia oligonucleotídica que está ausente de (i) -(v).

2. El método de la reivindicación 1, en donde la región que codifica CDR3 de Ig reordenada de manera única de los uno o más clones de células B malignas se identifica por su presencia en la primera muestra a una frecuencia relativa de al menos 15% de las regiones que codifican CDR3 de Ig reordenadas.

3. El método de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde cada segmento génico funcional que codifica V de Ig comprende una secuencia señal de recombinación (RSS) del gen V y cada segmento génico funcional que codifica J de Ig comprende una RSS del gen J, y en donde cada molécula de ADN reordenado amplificado comprende (i) al menos 10, 20, 30 o 40 nucleótidos contiguos de una hebra efectora del segmento génico que codifica V de Ig, estando situados dichos al menos 10, 20, 30 o 40 nucleótidos contiguos 5' respecto a la RSS del gen V y (ii) al menos 10, 20 o 30 nucleótidos contiguos de una hebra efectora del segmento génico que codifica J de Ig, estando situados dichos al menos 10, 20 o 30 nucleótidos contiguos 3' con respecto a la RSS del gen J;

4. El método de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde la pluralidad de cebadores oligonucleotídicos del segmento V y la pluralidad de cebadores oligonucleotídicos del segmento J comprenden al menos una de (1) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 5579-5643, (2) las secuencias expuestas en SEQ. ID NOs: 5644-5792, (3) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 5793-5816, (4) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 5817-6123, (5) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 6124-6127 y 6212-6215, (6) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 6128­ 6211 y 6216- 6221, (7) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 6222-6286 y (8) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 6222-6351;

5. El método de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde uno o ambos de:

(i) los cebadores oligonucleotídicos del segmento V comprenden uno o una pluralidad de oligonucleótidos que exhiben al menos 90% de identidad de secuencia con una o más de las secuencias de nucleótidos expuestas en SEQ ID NO: 5579-5630, 5644-5779, 5799-5816, 6124-6127, y 6222-6273, y

(ii) los cebadores del segmento J comprenden uno o una pluralidad de oligonucleótidos que exhiben al menos 90% de identidad de secuencia con una o más de las secuencias de nucleótidos expuestas en SEQ ID NO: 5631-5643, 5780­ 5798, 6212-6215, y 6274-6286.

6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde la pluralidad de oligonucleótidos molde comprende al menos un oligonucleótido molde que tiene una secuencia oligonucleotídica de fórmula general (I) con la que puede hibridar específicamente cada cebador oligonucleotídico del segmento V y al menos un oligonucleótido molde que tiene una secuencia oligonucleotídica de fórmula general (I) con la que puede hibridar específicamente cada cebador oligonucleotídico del segmento J.

7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde la pluralidad de oligonucleótidos molde comprende al menos a o al menos b secuencias de oligonucleótidos únicas, la que sea mayor, donde a es la cantidad de segmentos génicos que codifican la región V del receptor inmunitario adaptativo único en el sujeto y b es la cantidad de segmentos génicos que codifican la región J del receptor inmunitario adaptativo único en el sujeto, y la composición comprende al menos un oligonucleótido molde para cada polinucleótido V único y al menos un oligonucleótido molde para cada polinucleótido J único.

8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, que comprende adicionalmente cuantificar moléculas de ADN reordenado que codifican uno o una pluralidad de receptores inmunitarios adaptativos en el ADN extraído de la muestra biológica mediante las etapas de:

(i) secuenciar cuantitativamente toda o una porción suficiente de cada una de dichas moléculas de ADN molde amplificado y cada una de dichas moléculas de ADN reordenado amplificado para cuantificar (a) una cantidad de producto molde de moléculas de ADN molde amplificado que contienen al menos una secuencia código de barras de oligonucleótido, y (b) una cantidad de producto reordenado de moléculas de ADN reordenado amplificado que carecen de una secuencia código de barras de oligonucleótido;

(ii) calcular un factor de amplificación dividiendo la cantidad de producto molde de (i)(a) por la cantidad conocida de cada uno de la pluralidad de oligonucleótidos molde que tienen una secuencia oligonucleotídica única; y

(iii) dividir la cantidad de producto reordenado de (i)(b) por el factor de amplificación calculado en (ii) para cuantificar las moléculas de ADN que codifican el receptor inmunitario adaptativo único en la muestra.

9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde dicho tumor maligno hematológico linfoide se selecciona entre: leucemia linfoblástica de células B aguda (B-ALL), mieloma múltiple, plasmacitoma, macroglobulinemia, leucemia linfocítica crónica (CLL), leucemia linfoblástica aguda (ALL), linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, linfoma de células del manto, leucemia de células pilosas, micosis fungoide, neoplasia mieloproliferativa, y síndrome mielodisplásico.

10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde cada uno de los oligonucleótidos molde de la pluralidad de oligonucleótidos molde está presente en una cantidad sustancialmente equimolar.