ES2860988T3

ES2860988T3 - Anticuerpos anti-TFR y su uso en el tratamiento de trastornos proliferativos e inflamatorios

Info

Publication number: ES2860988T3
Application number: ES16744353T
Authority: ES
Inventors: Pierre Launay; Coralie Belanger; Hervé Souchet
Original assignee: Inatherys
Current assignee: Inatherys
Priority date: 2015-07-22
Filing date: 2016-07-21
Publication date: 2021-10-05
Anticipated expiration: 2036-07-21
Also published as: LT3325509T; SI3325509T1; EP3325509A1; RU2018106364A3; US12037408B2; US20190092870A1; CY1123941T1; CA2992509A1; RU2018106364A; US20220119543A1; RU2737637C2; MX2018000569A; AU2016296321A1; DK3325509T3; HRP20210393T1; IL257065B; RS61586B1; EP3325509B1; JP2018521691A; AU2016296321B2

Abstract

Un anticuerpo anti-receptor de la transferrina (anti-TfR) humanizado aislado o una proteína con una porción de unión al antígeno de un anticuerpo anti-TfR humanizado, que comprende o, (a) un polipéptido de cadena pesada variable que comprende HCDR1 de la SEQ ID NO:1, HCDR2 de la SEQ ID NO:2, HCDR3 de la SEQ ID NO:3 y un polipéptido de cadena ligera variable que comprende LCDR1 de la SEQ ID NO:4, LCDR2 de la SEQ ID NO:5 y LCDR3 de la SEQ ID NO:6; (b) un polipéptido de cadena pesada variable que comprende HCDR1 de la SEQ ID NO:1, HCDR2 de la SEQ ID NO:2, HCDR3 de la SEQ ID NO:3 y un polipéptido de cadena ligera variable que comprende LCDR1 de la SEQ ID NO:4, LCDR2 de la SEQ ID NO:8 y LCDR3 de la SEQ ID NO:6; (c) un polipéptido de cadena pesada variable que comprende VH de la SEQ ID NO:11 y un polipéptido de cadena ligera variable que comprende VL de la SEQ ID NO:13; (d) un polipéptido de cadena pesada variable que comprende VH de la SEQ ID NO:11 y un polipéptido de cadena ligera variable que comprende VL de la SEQ ID NO:14; (e) un polipéptido de cadena pesada variable que comprende VH de la SEQ ID NO:12 y un polipéptido de cadena ligera variable que comprende VL de la SEQ ID NO:13; o, (f) un polipéptido de cadena pesada variable que comprende VH de la SEQ ID NO:12 y un polipéptido de cadena ligera variable que comprende VL de la SEQ ID NO:14; en donde dicho anticuerpo anti-TfR o proteína se une específicamente al receptor de la transferrina (TfR) de la SEQ ID NO:16.

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos anti-TFR y su uso en el tratamiento de trastornos proliferativos e inflamatorios

Sector de la técnica

A continuación se divulgan anticuerpos que se unen específicamente a TfR, el receptor de la transferrina. Dichos anticuerpos son útiles en particular en el tratamiento de trastornos proliferativos e inflamatorios, tales como el linfoma o la leucemia. La divulgación se refiere más específicamente a anticuerpos anti-TfR humanizados específicos, con propiedades equivalentes o mejoradas de A24 en comparación con el correspondiente anticuerpo murino parental, o su versión quimérica con la región constante de la IgG1 humana.

Estado de la técnica

El receptor de la transferrina (CD71) (en lo sucesivo denominado "TfR") es una glicoproteína transmembrana homodimérica unida por enlaces disulfuro que consiste en dos monómeros de 760 aminoácidos de aproximadamente 90 kDa cada uno. TfR juega un papel crucial en la regulación de la absorción de hierro y el crecimiento celular (Gill et al., N Engl J Med., 332,1744-1748, 1995 - Hermine et al., N Engl J Med., 332, 1749-1751, 1995). Cuando la transferrina diférrica se une a su receptor de la superficie celular, se internaliza a través de cavidades recubiertas de clatrina a vesículas ácidas donde se disocia el complejo de hierro-transferrina. Después de la liberación, el receptor y la apotransferrina se reciclan de nuevo a la superficie celular.

TfR se expresa constitutivamente en la membrana plasmática celular de tejidos que se renuevan constantemente, tales como los precursores de las células sanguíneas en la médula ósea, los hepatocitos en el hígado, los queratinocitos en la epidermis y los enterocitos en las criptas del epitelio intestinal.

Varios estudios han demostrado que TfR se expresa más abundantemente en tejidos malignos que en sus homólogos sanos (Gatter et al., J Clin Pathol., 36, 539-545, 1983 - Faulk et al, Lancet., 2, 390-392, 1980 - Shindelman et al., Int J Cancer, 27, 329-334, 1981). Varios autores han descrito enfoques terapéuticos basados en esta idea utilizando anticuerpos anti-TfR o la propia transferrina conjugada con fármacos para destruir células malignas.

También se ha propuesto utilizar anticuerpos anti-TfR para bloquear la interacción entre transferrina y TfR y, en consecuencia, prevenir la absorción de hierro, lo que conduce a la privación de hierro y la regulación negativa del crecimiento celular. Sin embargo, aunque muchas publicaciones describen la preparación de anticuerpos anti-TfR, existen muy pocas referencias de anticuerpos monoclonales (mAb) anti-TfR que tengan actividad antiproliferativa.

Trowbridge y Lopez (Proc. Natl Acad Sci USA, 79, 1175- 1179, 1982) describen las propiedades de un anticuerpo monoclonal, denominado 42/6 y tipificado como IgA (k), que bloquea la unión de la transferrina a su receptor y es capaz de inhibir in vitro el crecimiento de la línea celular leucémica de linfocitos T humanos, bloqueando las células en la fase S del ciclo celular. El anticuerpo 42/6 y el hibridoma que lo produce (ATCC HB-8094) se divulgan en la patente de Estados Unidos 4.434.156.

Lesley et al. (Mol Cell Biol. 5, 1814-21, 1985) han estudiado los efectos de los anticuerpos monoclonales anti-receptor de la transferrina murina pertenecientes a la clase IgG o IgM, sobre la unión de la transferrina y sobre el crecimiento celular del linfoma murino in vitro. Observaron que la IgM inhibía el crecimiento celular pero la IgG no, aunque eran capaces de inducir una regulación negativa y una degradación del TfR. Sin embargo, la IgG reticulada con un anticuerpo antiinmunoglobulina pudo inhibir el crecimiento celular. en un trabajo posterior, el mismo equipo (Lesley et al., Exp Cell Res., 182, 215-33, 1989) ha estudiado los efectos de los anticuerpos monoclonales anti-TfR IgG e IgM y de sus fragmentos mono y divalentes sobre el crecimiento de células de linfoma murino y la expresión de TfR. Describen que estos efectos dependen del grado de reticulación de los receptores de transferrina por el anticuerpo, que es una consecuencia de la valencia del anticuerpo. Los fragmentos de anticuerpos monovalentes no tuvieron efectos significativos; los fragmentos de anticuerpos divalentes indujeron una regulación negativa de la expresión del receptor de la superficie celular sin alterar su internalización y reciclaje y sin alterar el crecimiento celular; la IgM multivalente indujo la acumulación de receptor formando un complejo con anticuerpos en la superficie celular, bloqueando su internalización y dando como resultado una fuerte inhibición del crecimiento celular.

A partir de la técnica anterior citada anteriormente, parece que las propiedades antiproliferativas de los anticuerpos anti-TfR varían mucho de un anticuerpo a otro y que no pueden predecirse basándose en su capacidad para bloquear o no la unión de la transferrina a su receptor.

En una publicación anterior (Moura et al., J. Exp. Med., 194, 417-425, 2001), los inventores han descrito una IgG monoclonal de ratón (IgG2kappa), denominada A24, que se une al TfR humano.

El documento WO2005/111082 divulga el anticuerpo A24, un anticuerpo murino capaz de bloquear la proliferación de linfocitos T, y que parecía ser más eficaz que el mAb 42/6 descrito anteriormente para inhibir la proliferación de linfocitos T. A24 evita que Tf se una al TfR de manera competitiva. A24 también redujo la expresión de TfR y afectó al reciclaje de TfR. A24 también puede bloquear la proliferación ex vivo de linfocitos T malignos de las formas agudas y crónicas de la ATL (Moura et al., Blood, 103,5, 1838-45,1 March 2004, Callens et al., 2010; J. Exp. Med. , Vol 207 No 4, págs. 731-750). Este anticuerpo también se ha descrito como capaz de prevenir el desarrollo de tumores de linfoma de células del manto tanto in vitro como in vivo (Lepelletier et al. Cancer Res 2007; 67:1145-1154; Callens et al. 2008, Leukemia, 22, 42-48).

El documento WO2014/020140 divulga además un antagonista de TfR tal como anticuerpos anti-TfR para su uso en el tratamiento de la p talasemia.

Para la administración a sujetos humanos, hoy en día es obligatorio humanizar anticuerpos de origen murino, para evitar reacciones de inmunogenicidad. Sin embargo, al realizar el primer proceso de humanización del anticuerpo A24, los inventores encontraron una pérdida de propiedades de unión y apoptóticas entre todas las variantes humanizadas. Por tanto, los inventores tuvieron que diseñar variantes específicas de A24 en varias etapas de humanización, que combinan las propiedades funcionales mantenidas del anticuerpo parental A24 con la disminución prevista de la inmunogenicidad para seres humanos.

Objeto de la invención

La invención se define mediante las reivindicaciones.

Por tanto, la divulgación se refiere a un anticuerpo anti-TfR aislado o una proteína con una porción de unión al antígeno de un anticuerpo anti-TfR, que comprende o,

(a) un polipéptido de cadena pesada variable que comprende HCDR1 de la SEQ ID NO:1, HCDR2 de la SEQ ID n O:2, Hc Dr 3 de la SEQ ID NO:3 y un polipéptido de cadena ligera variable que comprende LCDR1 de la SEQ ID NO:4, LCDR2 de la SEQ ID NO:5 y LCDR3 de la SEQ ID NO:6;

(b) un polipéptido de cadena pesada variable que comprende HCDR1 de la SEQ ID NO:1, HCDR2 de la SEQ ID n O:2, Hc Dr 3 de la SEQ ID NO:3 y un polipéptido de cadena ligera variable que comprende LCDR1 de la SEQ ID NO:4, LCDR2 de la SEQ ID NO:8 y LCDR3 de la SEQ ID NO:6;

(c) un polipéptido de cadena pesada variable que comprende VH de la SEQ ID NO:11 y un polipéptido de cadena ligera variable que comprende VL de la SEQ ID NO:13;

(d) un polipéptido de cadena pesada variable que comprende VH de la SEQ ID NO:11 y un polipéptido de cadena ligera variable que comprende VL de la SEQ ID NO:14;

(e) un polipéptido de cadena pesada variable que comprende VH de la SEQ ID NO:11 y un polipéptido de cadena ligera variable que comprende VL de la SEQ ID NO:15;

(f) un polipéptido de cadena pesada variable que comprende VH de la SEQ ID NO:12 y un polipéptido de cadena ligera variable que comprende VL de la SEQ ID NO:13;

(g) un polipéptido de cadena pesada variable que comprende VH de la SEQ ID NO:12 y un polipéptido de cadena ligera variable que comprende VL de la SEQ ID NO:14;

(h) un polipéptido de cadena pesada variable que comprende VH de la SEQ ID NO:12 y un polipéptido de cadena ligera variable que comprende VL de la SEQ ID NO:15;

en donde dicho anticuerpo anti-TfR o proteína se une específicamente al receptor de la transferrina de la SEQ ID NO:16.

En una realización específica, dicho anticuerpo o proteína se une al receptor de la transferrina con una Kd de 10 nM o menos, preferentemente con una Kd de 1 nM o menos.

En otra realización específica, dicho anticuerpo o proteína induce la apoptosis de la línea celular HL-60 a un nivel igual o superior al nivel de inducción medido con el correspondiente anticuerpo quimérico con regiones variables murinas parentales que tienen VH de la SEQ ID NO:9 y VL de SEQ ID NO:10.

Preferentemente, dicho anticuerpo anti-TfR de acuerdo con la presente divulgación es un anticuerpo anti-TfR humanizado.

En otra realización específica que puede combinarse con las realizaciones anteriores, dicho anticuerpo anti-TfR comprende una región constante de isotipo IgG4 humana, o una región constante mutante o modificada químicamente, en donde dicha región constante mutante o modificada químicamente no confiere o confiere una actividad reducida de ADCC a dicho anticuerpo cuando se compara con un anticuerpo correspondiente con la región constante de isotipo IgG1 de tipo silvestre. Como alternativa, dicho anticuerpo anti-TfR o proteína puede comprender una región constante de isotipo IgG1 humana, o una región constante mutante o modificada químicamente, en donde dicha región constante mutante o modificada químicamente confiere una mayor actividad de ADCC a dicho anticuerpo en comparación con un anticuerpo correspondiente con región constante de isotipo IgG1 de tipo silvestre.

Los ejemplos de anticuerpos de acuerdo con la divulgación incluyen el anticuerpo anti-TfR humanizado mAb1 a mAb16 como se describe más adelante, en particular en la Tabla 1.

También se divulgan en el presente documento anticuerpos anti-TfR aislados o proteínas como se han definido anteriormente, para su uso como un medicamento, o en el diagnóstico, por ejemplo, para su uso en el tratamiento de un tumor. Dicho tumor es preferiblemente un tumor hematológico, por ejemplo, un linfoma o leucemia.

Como alternativa, dicho anticuerpo anti-TfR aislado o proteína también puede usarse en el tratamiento de enfermedades relacionadas con HTLV-1, para reducir la carga viral en trastornos inflamatorios asociados con la infección por HTLV-1, incluyendo HAM/TSP, polimiositis y artritis.

La divulgación se refiere además a una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo anti-TfR o proteína como se ha definido anteriormente, en combinación con uno o más excipientes, diluyentes o vehículos farmacéuticamente aceptables. La composición farmacéutica puede incluir adicionalmente otros principios activos. En una realización específica, dicha composición es una formulación liofilizada, o una jeringa precargada o un vial precargado, que comprende una cantidad terapéuticamente aceptable de un anticuerpo anti-TfR o proteína como se ha definido anteriormente.

La divulgación también se refiere a un ácido nucleico aislado que codifica al menos la región o regiones variables de cadena pesada y/o ligera del anticuerpo o proteína como se ha definido anteriormente; un vector de clonación o expresión que comprende uno o más de dichos ácidos nucleicos, o un vector de clonación o expresión para la producción recombinante de un anticuerpo anti-TfR como se ha definido anteriormente en una célula hospedadora. En una realización específica, el vector de clonación o expresión comprende al menos uno de los siguientes ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos de cadena pesada y ligera de uno cualquiera de los mAb1 a mAb16 como se define en los Ejemplos más adelante.

La presente divulgación también se refiere a una célula hospedadora que comprende uno o más vectores de clonación o expresión como se ha definido anteriormente.

La divulgación se refiere además a un proceso para la producción de un anticuerpo anti-TfR o una proteína como se ha definido anteriormente, que comprende: (i) cultivar la célula hospedadora de la divulgación para la expresión de dicho anticuerpo o proteína por la célula hospedadora; opcionalmente (ii) purificar dicho anticuerpo o proteína; y, (iii) recuperar dicho anticuerpo o proteína.

Descripción de las Figuras

La Figura 1 es un gráfico que muestra la falta de inducción de apoptosis de las primeras 6 variantes humanizadas de INA01 (INA01 variantes 1-6) en comparación con el anticuerpo INA01 quimérico con regiones variables del A24 parental medido de acuerdo con el ensayo de inducción de apoptosis de HL-60.

La Figura 2 es un gráfico que muestra el efecto de apoptosis mejorado de la segunda ronda de variantes humanizadas (INA01 variantes 7-11), sin embargo, todavía está por debajo del anticuerpo INA01 quimérico con regiones variables del A24 parental, medido de acuerdo con el ensayo de inducción de apoptosis de HL-60. La Figura 3 es un gráfico que muestra la inducción efectiva de la apoptosis de la tercera ronda de variantes humanizadas (INA01 variantes 12-17), superior a la del anticuerpo iNa 01 quimérico con regiones variables del A24 parental, medido de acuerdo con el ensayo de inducción de apoptosis de HL-60.

La Figura 4 Rendimiento de la productividad de mAb1 a mAb16: La cantidad (mg) de cada anticuerpo producido de mAb1 a mAb16 se muestra basándose en 2 lotes de producción.

La Figura 5 muestra la alineación de las secuencias VL de acuerdo con la divulgación con la VL del A24 parental (Figura 5a) y la alineación de las secuencias VH de acuerdo con la divulgación con la VH del A24 parental (Figura 5b).

Descripción detallada de la invención

Definiciones

Con el fin de que se pueda entender más fácilmente la presente divulgación, se definen en primer lugar determinados términos. Se exponen definiciones adicionales a lo largo de la descripción detallada.

La expresión "respuesta inmunitaria" se refiere a la acción de, por ejemplo, linfocitos, células presentadoras de antígenos, células fagocíticas, granulocitos y macromoléculas solubles producidas por las células anteriores o el hígado (incluyendo anticuerpos, citoquinas, y complemento) que da como resultado un daño selectivo sobre, la destrucción de o la eliminación en el cuerpo humano de patógenos invasores, células o tejidos infectados por patógenos, células cancerosas o, en los casos de autoinmunidad o inflamación patológica, células o tejidos humanos normales.

Una "vía de transducción de señales" o "actividad de señalización" se refiere a una relación causal bioquímica generalmente iniciada por una interacción proteína-proteína, tal como la unión de un factor de crecimiento a un receptor, lo que da como resultado la transmisión de una señal de una parte de una célula a otra. En general, la transmisión implica la fosforilación específica de uno o más restos de tirosina, serina o treonina de una o más proteínas en la serie de reacciones que provocan la transducción de señales. Los penúltimos procesos generalmente incluyen eventos nucleares, dando como resultado un cambio en la expresión génica.

El término CD71 o receptor de la transferrina o TfR se refiere al TfR humano como se define en la SEQ ID NO:16, a menos que se describa lo contrario.

El término "anticuerpo" al que se hace referencia en el presente documento incluye anticuerpos completos y cualesquiera fragmentos de unión a antígeno (es decir, la "porción de unión a antígeno") o cadenas simples de los mismos.

Un "anticuerpo" natural es una glicoproteína que comprende al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro. Cada cadena pesada está compuesta por una región variable de la cadena pesada (abreviada en el presente documento como VH) y una región constante de la cadena pesada. La región constante de la cadena pesada está compuesta por tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera está compuesta por una región variable de la cadena ligera (abreviada en el presente documento como VL) y una región constante de la cadena ligera. La región constante de la cadena ligera está compuesta por un dominio, CL. Las regiones VH y VL pueden subdividirse adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco (FR). Cada VH y VL está compuesta por tres CDR y cuatro FR dispuestas desde el extremo amino al extremo carboxi en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras contienen un dominio de unión que interacciona con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar en la unión de la inmunoglobulina con los tejidos o factores del hospedador, incluyendo diversas células del sistema inmunitario (por ejemplo, células efectoras) y el primer componente (Clq) del sistema del complemento clásico.

La expresión "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo (o simplemente la "porción de antígeno"), como se usa en el presente documento, se refiere a la longitud completa o uno o más fragmentos de un anticuerpo que conservan la capacidad de unirse específicamente a un antígeno (por ejemplo, una parte de TfR). Se ha demostrado que la función de unión a antígeno de un anticuerpo puede realizarse mediante fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Los ejemplos de los fragmentos de unión abarcados en la expresión "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo incluyen un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios Vl, Vh, Cl y CH1; un fragmento F(ab)2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra; un fragmento Fd que consiste en los dominios Vh y CH1; un fragmento Fv que consiste en los dominios Vl y Vh de un solo brazo de un anticuerpo; un UniBody que consiste en un solo brazo con una cadena pesada de IgG modificada, por ejemplo IgG4, en la región bisagra, un fragmento de anticuerpo de dominio (Ward et al., 1989 Nature 341:544-546), o un fragmento de nanoanticuerpo que consiste en un dominio Vh; y una región determinante de la complementariedad (CDR) aislada, o cualquier proteína de fusión que comprenda tal porción de unión al antígeno.

Asimismo, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, estén codificados por genes distintos, estos pueden unirse, usando métodos recombinantes, mediante un enlazador sintético que les permite formarse como una proteína de cadena sencilla en donde las regiones VL y VH se emparejan para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv monocatenario (scFv); véase, p. ej., Bird et al., 1988 Science 242:423-426; y Huston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883). También se pretende que tales anticuerpos de cadena sencilla estén abarcados por la expresión "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo. Estos fragmentos de anticuerpo se obtienen usando técnicas convencionales conocidas por los expertos en la materia y los fragmentos se exploran para determinar su utilidad del mismo modo que los anticuerpos intactos.

Un "anticuerpo aislado", como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo que está sustancialmente exento de otros anticuerpos que tienen especificidades antigénicas diferentes (por ejemplo, un anticuerpo aislado que se une específicamente a TfR está sustancialmente exento de anticuerpos que se unen específicamente a antígenos distintos de TfR). Un anticuerpo aislado que se une específicamente a TfR puede, sin embargo, tener reactividad cruzada con otros antígenos, tales como moléculas de TfR de otras especies. Por otra parte, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente libre de otro material celular y/o agentes químicos. Las expresiones "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpo monoclonal" tal como se usa en el presente documento, se refieren a una preparación de moléculas de anticuerpo de una única composición molecular. Una composición de anticuerpo monoclonal muestra una especificidad y afinidad de unión única por un epítopo particular.

Como se usa en el presente documento, "isotipo" se refiere a la clase de anticuerpo (por ejemplo, IgM, IgE, IgG, tal como IgG1 o IgG4) que está codificada por los genes de la región constante de la cadena pesada.

Las expresiones "un anticuerpo que reconoce un antígeno" y "un anticuerpo específico para un antígeno" se usan indistintamente en el presente documento con la expresión "un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno".

Como se usa en el presente documento, un anticuerpo o una proteína que "se une específicamente a un antígeno", por ejemplo, que "se une específicamente a TfR" pretende hacer referencia a un anticuerpo o proteína que se une a dicho antígeno (por ejemplo, el TfR humano de la SEQ ID NO:16) con una Kd de 100 nM o menos, 10 nM o menos, 1 nM o menos.

El término "Kd", como se usa en el presente documento, pretende hacer referencia a la constante de disociación, que se obtiene de la relación de Kd a Ka (es decir Kd/Ka) y se expresa como una concentración molar (M). Los valores de Kd para anticuerpos se pueden determinar usando métodos bien establecidos en la técnica. Un método para determinar la Kd de un anticuerpo es usar resonancia de plasmón superficial, o usar un sistema de biosensor, tal como el sistema Biacore®. Un ensayo para medir la Kd de un anticuerpo anti-TfR con el sistema Biacore® se describe en los Ejemplos más adelante.

El término "Kasoc" o " Ka", como se usa en el presente documento, pretende hacer referencia a la velocidad de asociación de una interacción particular antígeno-anticuerpo, mientras que el término "Kdis" o "Kd", como se usa en el presente documento, pretende hacer referencia a la velocidad de disociación de una interacción particular anticuerpoantígeno.

Como se usa en el presente documento, el término "afinidad" se refiere a la fuerza de interacción entre el anticuerpo y el antígeno en sitios antigénicos únicos. Dentro de cada sitio antigénico, la región variable del "brazo" del anticuerpo interacciona a través de fuerzas no covalentes débiles con el antígeno en numerosos sitios; cuantas más interacciones, más fuerte es la afinidad.

Como se usa en el presente documento, el término "avidez" se refiere a una medida informativa de la estabilidad o fuerza global del complejo anticuerpo-antígeno. Está controlado por tres factores principales: afinidad del epítopo del anticuerpo; la valencia del antígeno y el anticuerpo; y la disposición estructural de las partes que interaccionan. En última instancia, estos factores definen la especificidad del anticuerpo, es decir, la probabilidad de que el anticuerpo particular se una a un epítopo antigénico preciso. En una realización específica, dicho anticuerpo anti-TfR de la divulgación es un anticuerpo bivalente.

Como se usa en el presente documento, la expresión "línea celular HL-60" se refiere a la promielocítica obtenida por Collins et al. (PNAS 1978, 75:2458-1462) y descrita también en Gallagher et al (Blood, 1979, 54:713-733), por ejemplo disponible en la colección ATCC® con el número de catálogo CCL-240™.

Como se usa en el presente documento, el anticuerpo A24 se refiere al anticuerpo como se divulga en el documento WO2005/111082.

Como se usa en el presente documento, el término "ADCC" o actividad de "citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos" se refiere a la actividad de depleción celular. La actividad de ADCC se puede medir mediante ensayos de ADCC comercializados, por ejemplo, ADCC Reporter Bioassay comercializado por Promega con la Ref N.° G7015, y como se describe brevemente en los Ejemplos.

Como se usa en el presente documento, el término "sujeto" incluye cualquier animal humano o no humano. El término "animal no humano" incluye todos los vertebrados, por ejemplo, mamíferos y no mamíferos, tales como primates no humanos, ovejas, perros, gatos, caballos, vacas, pollos, anfibios, reptiles, etc.

Como se usa en el presente documento, el término, "optimizada" significa que una secuencia de nucleótidos ha sido alterada para codificar una secuencia de aminoácidos usando codones que son preferidos en la célula u organismo de producción, generalmente una célula eucariota, por ejemplo, una célula de ovario de hámster chino (CHO) o una célula humana. La secuencia de nucleótidos optimizada está diseñada para retener completamente o tanto como sea posible la secuencia de aminoácidos codificada originalmente por la secuencia de nucleótidos de partida. Las secuencias de aminoácidos codificadas por secuencias de nucleótidos optimizadas también se denominan optimizadas.

Como se usa en el presente documento, el porcentaje de identidad entre dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, % de identidad = número de posiciones idénticas/número total de posiciones multiplicado por 100), teniendo en cuenta el número de huecos y la longitud de cada hueco, que es necesario introducir para una alineación óptima de las dos secuencias. La comparación de secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias pueden conseguirse usando un algoritmo matemático, como se describe a continuación.

El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos también puede determinarse usando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988) que se ha incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0), usando una tabla de restos ponderados PAM120, una penalización por longitud de hueco de 12 y una penalización por hueco de 4. Como alternativa, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos puede determinarse usando el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol, Biol. 48:444-453 (1970) que se ha incorporado en el programa GAP en el paquete de programa informático GCG (disponible en http://www.gcg.com), usando una matriz Blosum 62 o una matriz PAM250 y una ponderación por hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6 o 4 y una ponderación por longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6.

El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos o de nucleótidos también se puede determinar usando, por ejemplo, algoritmos tales como el programa BLASTN para secuencias de ácidos nucleicos usando como valores predeterminados una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) de 10, M=5, N =4 y una comparación de ambas cadenas.

Anticuerpos recombinantes

Los anticuerpos de la divulgación incluyen los anticuerpos recombinantes humanizados mAb1-mAb16, aislados y caracterizados estructuralmente por sus secuencias de aminoácidos de cadena pesada y ligera variables e isotipo constante humano como se describe en la Tabla 1 a continuación:

T l 1 n i min i l r i n ri l l n li r mA 1-mA 16

La correspondiente secuencia codificante de aminoácidos y nucleótidos de las regiones de isotipo constante de IgG4, IgG1 y sus versiones mutantes IgG1 AA e IgG1 N297A utilizadas para generar mAb1 a mAb16 son bien conocidas en la técnica.

Las cadenas ligeras y pesadas de longitud completa y las correspondientes secuencias codificantes de mAb1 se muestran en la Tabla 2 a continuación.

T l 2 n i ifi n l AD l n li r l n i m l

Los ejemplos de las secuencias de aminoácidos de las CDR1 de VH (también denominadas HCDR1), CDR2 de VH (también denominadas HCDR2), CDR3 de VH (también denominadas HCDR1), CDR1 de VL (también denominadas LCDR1), CDR2 de VL (también denominadas LCDR2), CDR3 de VL (también denominadas HCDR3), de algunos anticuerpos de acuerdo con la divulgación se muestran en la Tabla 3.

En la Tabla 3, las regiones CDR de algunos anticuerpos de la presente divulgación se delinean usando el sistema Chothia (Clothia C, Lesk AM. 1987, J Mol Biol 196, 901-917).

Para facilitar la lectura, las regiones CDR se denominan en lo sucesivo HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCDR3, respectivamente.

T l R i n DR mA 1 mA 1 n i r r f r n i A24 r n l fini i n h hi

En una realización, un anticuerpo recombinante aislado tiene: una región variable de la cadena pesada que comprende HCDR1 de la SEQ ID NO:1; HCDR2 de la SEQ ID NO:2; HCDR3 de la SEQ ID NO:3; una región variable de la cadena ligera que comprende LCDR1 de la SEQ ID NO:4; LCDR2 de las SEQ ID NOs: 5 u 8; y LCDR3 de las SEQ ID NOs: 6; en donde dicho anticuerpo o se une específicamente al receptor de la transferrina de la SEQ ID NO:16.

En realizaciones específicas, el anticuerpo recombinante aislado de acuerdo con la invención comprende o:

(c) un polipéptido de cadena pesada variable que comprende VH de la SEQ ID NO:11 y un polipéptido de cadena ligera variable VL de la SEQ ID NO:13;

(d) un polipéptido de cadena pesada variable que comprende VH de la SEQ ID NO:11 y un polipéptido de cadena ligera variable VL de la SEQ ID NO:14;

(e) un polipéptido de cadena pesada variable que comprende VH de la SEQ ID NO:12 y un polipéptido de cadena ligera variable VL de la SEQ ID NO:13;

(f) un polipéptido de cadena pesada variable que comprende VH de la SEQ ID NO:12 y un polipéptido de cadena ligera variable VL de la SEQ ID NO:14;

en donde dicho anticuerpo anti-TfR se une específicamente al receptor de la transferrina de la SEQ ID NO:16.

En una realización específica, dicho anticuerpo anti-TfR recombinante como se ha definido anteriormente tiene una o más de las siguientes propiedades:

(i) Se une al receptor de la transferrina con una Kd de 10 nM o menos, preferentemente con una Kd de 1 nM o menos, medido por SPR, por ejemplo, como se describe en los Ejemplos más adelante;

(i) se une al receptor de la transferrina con una CE50 de 0,1 pg/ml o menos, preferentemente de 0,05 pg/ml o menos, medido en un ensayo de ELISA como se describe en los Ejemplos más adelante;

(iii) induce la apoptosis de la línea celular HL-60 a un nivel igual o superior al nivel de inducción medido con el correspondiente anticuerpo quimérico de referencia que tiene las regiones variables murinas parentales con VH de la SEQ ID NO:9 y VL de la SEQ ID NO:10, por ejemplo, medido usando un ensayo de inducción de la apoptosis de HL-60. Normalmente, se puede analizar una cantidad de 10 pg/ml de un anticuerpo recombinante de la presente divulgación para la inducción de la apoptosis de la línea celular HL-60 en comparación con la misma cantidad del anticuerpo quimérico de referencia con las regiones variables murinas parentales de A24 que comprenden VH de la SEQ ID NO:9 y VL de la SEQ ID NO:10. La inducción de la apoptosis en el ensayo de inducción de la apoptosis de HL-60 de un anticuerpo probado es igual a un anticuerpo de referencia si el porcentaje de células positivas medido con el anticuerpo probado no es significativamente menor que el porcentaje de células positivas medido con el anticuerpo de referencia.

Como se usa en el presente documento, un anticuerpo quimérico de referencia "correspondiente" se refiere al anticuerpo de referencia con una región constante de isotipo 100 % idéntica a la región constante de isotipo del anticuerpo que se va a probar para una propiedad particular, por ejemplo, la inducción de la apoptosis.

En ciertas realizaciones que pueden combinarse con las realizaciones anteriores, un anticuerpo proporcionado en el presente documento es un fragmento de anticuerpo de los anticuerpos definidos anteriormente. Los fragmentos de anticuerpo incluyen, pero sin limitación, fragmentos Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv, UniBody, dAb, y scFv, diacuerpos, dominio único o nanoanticuerpos y otros fragmentos.

El término "diacuerpos" se refiere a pequeños fragmentos de anticuerpos con dos sitios de unión al antígeno, cuyos fragmentos comprenden un dominio variable de la cadena pesada (VH) conectado con un dominio variable de la cadena ligera (VL) en la misma cadena polipeptídica (VH-VL). Usando un enlazador que sea demasiado corto como para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, se obliga a los dominios a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión a antígeno.

Los anticuerpos de dominio único son fragmentos de anticuerpo que comprenden la totalidad o una porción del dominio variable de la cadena pesada o la totalidad o una porción del dominio variable de la cadena ligera de un anticuerpo. En determinadas realizaciones, un anticuerpo de dominio único es un anticuerpo de un solo dominio humano (Domantis, Inc., Waltham, MA; véanse, por ejemplo, patente de los Estados Unidos n.° 6.248.516 B1).

Los fragmentos de anticuerpo se pueden preparar mediante diversas técnicas, incluyendo, pero sin limitación, la digestión proteolítica de un anticuerpo intacto, así como la producción por células hospedadoras recombinantes como se describen en el presente documento.

En determinadas realizaciones, el anticuerpo de la presente divulgación es un anticuerpo humanizado. Normalmente, un anticuerpo no humano se humaniza para reducir la inmunogenicidad para seres humanos, a la vez que tiene al menos la misma afinidad (o afinidad superior) del anticuerpo no humano parental. En realizaciones preferidas, los anticuerpos de la presente divulgación son anticuerpos humanizados del anticuerpo parental A24.

Generalmente, un anticuerpo humanizado comprende uno o más dominios variables en los que, las CDR, (o porciones de las mismas) proceden de un anticuerpo no humano, por ejemplo, el anticuerpo A24 murino y las FR (o porciones de las mismas) proceden de secuencias de anticuerpos humanos. Un anticuerpo humanizado también comprenderá opcionalmente al menos una porción de una región constante humana. En algunas realizaciones, se sustituyen algunos restos de FR en un anticuerpo humanizado por los restos correspondientes de un anticuerpo no humano (por ejemplo, el anticuerpo A24 del que proceden los restos de la CDR), por ejemplo, para restaurar o mejorar la especificidad o afinidad del anticuerpo. En algunas realizaciones específicas, también se sustituyen algunos restos de la CDR en un anticuerpo humanizado, por ejemplo, para restaurar o mejorar la especificidad o afinidad del anticuerpo.

Los anticuerpos humanizados y los métodos para producirlos se revisan, por ejemplo, en Almagro y Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008) y se describen adicionalmente, por ejemplo, en Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 86: 10029-10033 (1989); patentes de EE.UU. N.° 5.821.337, 7.527.791, 6.982.321 y 7.087.409; Kashmiri et al, Methods 36:25-34 (2005) (que describen el injerto de regiones determinantes de la especificidad (SDR)); Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) (que describe la "modificación de la superficie"); Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005) (que describen el "reordenamiento de FR"); y Osbourn et al, Methods 36:61-68 (2005) y Klimka et al, Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) (que describen la estrategia de "selección guiada" para el reordenamiento de FR).

Preferentemente, el anticuerpo recombinante de acuerdo con la divulgación es un anticuerpo silencioso humanizado, preferentemente un anticuerpo IgG1 o IgG4 silencioso humanizado.

Como se usa en el presente documento, el término anticuerpo "silencioso" se refiere a un anticuerpo que presenta una actividad de ADCC baja o nula medida en un ensayo de actividad de ADCC.

En una realización, la expresión "actividad de ADCC baja o nula" significa que el anticuerpo silencioso presenta una actividad de ADCC que está al menos por debajo del 10 %, por ejemplo por debajo del 50 % de la actividad de ADCC que se observa con el correspondiente anticuerpo con isotipo IgG1 humano de tipo silvestre.

Las funciones efectoras silenciadas se pueden obtener mediante mutación en la parte constante Fc de los anticuerpos y se han descrito en la técnica: Strohl 2009 (AA y N297A); Baudino 2008, D265A (Baudino et al., J. Immunol. 181 (2008): 6664-69, Strohl, CO Biotechnology 20 (2009): 685-91). Los ejemplos de anticuerpos IgG1 silenciosos comprenden el denominado mutante AA que comprende la mutación L234A y L235A en la secuencia de aminoácidos de Fc de IgG1. Otro anticuerpo IgG1 silencioso comprende la mutación N297A, que da como resultado anticuerpos aglucosilados o no glucosilados.

Los anticuerpos con secuencias de aminoácidos mutantes se pueden obtener mediante mutagénesis (por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio o mediada por PCR) de las moléculas de ácido nucleico codificantes, seguido de la prueba del anticuerpo alterado codificado para la función retenida (es decir, las funciones descritas anteriormente) utilizando los ensayos funcionales descritos en el presente documento.

Anticuerpos con modificaciones conservadoras

En determinadas realizaciones, un anticuerpo (o una proteína de unión que comprende una porción de unión al antígeno del mismo) de la divulgación tiene una región variable de la cadena pesada que comprende las secuencias de HCDR1, HCDR2 y HCDR3 y una región variable de la cadena ligera que comprende las secuencias de LCDR1, LCDR2 y LCDR3, en donde una o más de estas secuencias CDR tienen secuencias de aminoácidos especificadas basadas en los anticuerpos mAb1 a mAb16 descritos en el presente documento o modificaciones conservadoras de los mismos, y en donde el anticuerpo o proteína retiene las propiedades funcionales deseadas de los anticuerpos anti-TfR de la divulgación.

Las propiedades funcionales deseadas de los anticuerpos anti-TfR incluyen sin limitación:

(i) se une al receptor de la transferrina con una Kd de 10 nM o menos, preferentemente con una Kd de 1 nM o menos, por ejemplo, medido mediante el ensayo de SPR, por ejemplo usando Biacore®;

Como se usa en el presente documento, la expresión "modificaciones de secuencia conservadoras" pretende hacer referencia a sustituciones de aminoácidos en las que el resto de aminoácido se reemplaza con un resto de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Se han definido en la técnica familias de restos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptófano), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Así, uno o más restos de aminoácidos dentro de las regiones CDR de un anticuerpo de la divulgación se pueden reemplazar por otros restos de aminoácidos de la misma familia de cadenas laterales y el anticuerpo alterado se puede ensayar para determinar la función retenida usando los ensayos funcionales descritos en el presente documento.

Se pueden introducir modificaciones en un anticuerpo de la divulgación mediante técnicas convencionales conocidas en la técnica, tales como mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis mediada por la PCR.

Manipulación genética en la región marco o Fc

Los anticuerpos diseñados por ingeniería genética de la divulgación incluyen aquellos en los que se han efectuado modificaciones en los restos de la región marco en VH y/o VL, por ejemplo para mejorar las propiedades del anticuerpo. Generalmente, tales modificaciones en la región marco se hacen para disminuir la inmunogenicidad del anticuerpo. Por ejemplo, una estrategia es "retromutar" uno o más restos de la región marco a la correspondiente secuencia de la línea germinal. Más específicamente, un anticuerpo que se ha sometido a mutación somática puede contener restos de la región marco que difieren de la secuencia de la línea germinal de la que procede el anticuerpo. Dichos restos se pueden identificar mediante la comparación de las secuencias marco del anticuerpo con las secuencias de la línea germinal de la que proviene el anticuerpo. Para reestablecer las secuencias de la región marco a su configuración de la línea germinal, las mutaciones somáticas se pueden "retromutar" a la secuencia de la línea germinal mediante, por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio o mutagénesis mediada por PCR. También se pretende que dichos anticuerpos "retromutados" estén abarcados por la divulgación.

Otro tipo de modificación en la región marco implica mutar uno o más restos en la región marco o incluso en una o más regiones CDR, para eliminar los epítopos de linfocitos T para reducir de ese modo la posible inmunogenicidad del anticuerpo.

En particular, la empresa Antitope (Cambridge, Reino Unido) ha desarrollado una gama de tecnologías patentadas para evaluar y eliminar la inmunogenicidad, que se basan en la identificación de la ubicación de los epítopos de linfocitos T en proteínas y anticuerpos terapéuticos. Estas tecnologías se resumen a continuación:

□ iTope™ - una tecnología in silico para la predicción de la unión de péptidos a alelos humanos de las moléculas del CMH de clase II (Perry et al 2008 Drugs en R&D, 9(6):385-396).

□ TCED™ - una base de datos de epítopos de linfocitos T conocidos identificados en estudios que utilizan ensayos de mapeo de epítopos de linfocitos T EpiScreen™ especialmente de regiones V de anticuerpos (Bryson et al 2010 Biodrugs 24(1):1-8). La base de datos puede ser consultada por BLAST haciendo una búsqueda para identificar motivos comunes (Altschul et al 1997 Nucleic Acids Res. (1997) 25:3389-3402).

Además o como alternativa a las modificaciones efectuadas en la región marco o en las regiones CDR, los anticuerpos de la divulgación se pueden modificar por ingeniería genética para que incluyan modificaciones en la región Fc, generalmente, para alterar una o más propiedades funcionales del anticuerpo, tal como la semivida en suero, la fijación del complemento, la unión al receptor Fc y/o la citotoxicidad celular dependiente de antígeno.

Asimismo, un anticuerpo de la divulgación se puede modificar químicamente (por ejemplo, se pueden unir uno o más grupos químicos al anticuerpo) o modificar para alterar su glucosilación, para alterar de nuevo una o más propiedades del anticuerpo. Cada una de estas realizaciones se describe con más detalle a continuación.

Como se usa en el presente documento, la expresión "región constante de isotipo" o "región Fc" se usa indistintamente para definir la región C terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina, que incluye la región Fc de secuencia nativa y regiones Fc variantes. La región Fc de la cadena pesada de la IgG humana generalmente se define como que comprende el resto de aminoácido desde la posición C226 o desde P230 hasta el extremo carboxilo terminal del anticuerpo IgG. La numeración de los restos en la región Fc es la del índice EU de Kabat. La lisina del extremo C (K447) de la región Fc puede eliminarse, por ejemplo, durante la producción o purificación del anticuerpo. Por consiguiente, una composición de anticuerpos de la divulgación puede comprender poblaciones de anticuerpos con todos los restos K447 eliminados, poblaciones de anticuerpos sin restos K447 eliminados y poblaciones de anticuerpos que tienen una mezcla de anticuerpos con y sin el resto K447.

En una realización específica, se modifica la región bisagra de CH1, de tal forma que se altera el número de restos de cisteína en la región bisagra, por ejemplo, se aumenta o reduce. Este enfoque se describe con más detalle en la Patente de los Estados Unidos n.° 5.677.425, concedida a Bodmer et al. Se altera el número de restos de cisteína en la región bisagra de CH1 para, por ejemplo, facilitar el ensamblaje de las cadenas ligeras y pesadas o para aumentar o disminuir la estabilidad del anticuerpo.

En otra realización, la región bisagra de Fc de un anticuerpo se muta para disminuir la semivida biológica del anticuerpo. Más específicamente, se introducen una o más mutaciones de aminoácidos en la región de la interfaz del dominio CH2-CH3 del fragmento bisagra-Fc de manera que el anticuerpo tiene una unión a la proteína A estafilocócica (SpA) deteriorada en relación con la unión a SpA de Fc-bisagra natural. Este enfoque se describe con más detalle en la Patente de los Estados Unidos n.° 6.165.745, concedida a Ward et al.

En otra realización, el anticuerpo se modifica para incrementar su semivida biológica. Son posibles diversas estrategias. Por ejemplo, pueden introducirse una o más de las siguientes mutaciones: T252L, T254S, T256F, como se describe en la Patente de los Estados Unidos n.° 6.277.375 concedida a Ward. Como alternativa, para aumentar la semivida biológica, se puede alterar el anticuerpo en la región CH1 o CL para que contenga un receptor de rescate de unión al epítopo tomado de dos bucles de un dominio CH2 de una región Fc de una IgG, como se describe en las Patentes de los Estados Unidos n.° 5.869.046 y 6.121.022 concedidas a Presta et al.

Incluso en otras realizaciones, se altera la región Fc sustituyendo al menos un resto de aminoácido por un resto de aminoácido diferente para alterar las funciones efectoras del anticuerpo. Por ejemplo, se pueden sustituir uno o más aminoácidos por un resto de aminoácido diferente de manera que el anticuerpo tenga una afinidad alterada por un ligando efector pero mantenga la capacidad de unión a antígeno del anticuerpo original. El ligando efector para el que se altera la afinidad puede ser, por ejemplo, un receptor Fc del componente C1 del complemento. Este enfoque se describe con más detalle en las Patentes de los Estados Unidos n.° 5.624.821 y 5.648.260, ambas concedidas a Winter et al.

En otra realización, uno o más aminoácidos seleccionados de los restos de aminoácidos se pueden sustituir por un resto de aminoácido diferente de manera que el anticuerpo tenga una unión a C1q alterada y/o una citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) reducida o abolida. Este enfoque se describe con más detalle en la Patente de los Estados Unidos n.° 6.194.551 concedida a Idusogie et al.

En otra realización, se alteran uno o más restos de aminoácidos para alterar de este modo la capacidad del anticuerpo para fijarse al complemento. Este enfoque se describe con más detalle en la Publicación PCT WO 94/29351, concedida a Bodmer et al.

En aún otra realización, se modifica la región Fc para aumentar la capacidad del anticuerpo para mediar la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (CCDA) y/o para aumentar la afinidad del anticuerpo por un receptor Fcy modificando uno o más aminoácidos. Este enfoque se describe con más detalle en la Publicación PCT WO 00/42072 concedida a Presta. Por otra parte, los sitios de unión en la IgG1 humana para FcyR1, FcyRII, FcyRIII y FcRn se han mapeado y se han descrito variantes con unión mejorada (véase Shields, R.L. et al., 2001 J. Biol. Chem 276:6591-6604).

En otras realizaciones, se modifica la región Fc para disminuir la capacidad del anticuerpo para mediar la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (CCDA) y/o para disminuir la afinidad del anticuerpo por un receptor Fcy modificando uno o más aminoácidos. Dichos anticuerpos con funciones efectoras disminuidas, y en particular ADCC disminuida, incluyen anticuerpos silenciosos.

En determinadas realizaciones, se usa el dominio Fc de isotipo IgG1. En algunas realizaciones específicas, se usa una variante mutante del fragmento Fc de la IgG1, por ejemplo un Fc de IgG1 silencioso que reduce o elimina la capacidad del polipéptido de fusión para mediar en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y/ o unirse a un receptor Fcy. Un ejemplo de un mutante silencioso de isotipo IgG1 es una IgG1 en donde la leucina se reemplaza por alanina en las posiciones de aminoácidos 234 y 235 como se describe en J. Virol 2001 Dec;75(24):12161-8 por Hezareh et al.

En determinadas realizaciones, el dominio Fc es un mutante Fc silencioso que evita la glucosilación en la posición 297 del dominio Fc. Por ejemplo, el dominio Fc contiene una sustitución del aminoácido asparagina en la posición 297. Un ejemplo de dicha sustitución de aminoácidos es la sustitución de N297 por una glicina o una alanina.

En otra realización más, se modifica la glucosilación de un anticuerpo. Por ejemplo, se puede preparar un anticuerpo aglucosilado (es decir, que el anticuerpo carece de glucosilación). Se puede alterar la glucosilación para, por ejemplo, aumentar la afinidad del anticuerpo por el antígeno. Dichas modificaciones de hidratos de carbono se pueden lograr mediante, por ejemplo, la alteración de uno o más sitios de glucosilación en la secuencia del anticuerpo. Por ejemplo, se pueden realizar una o más sustituciones de aminoácidos que den como resultado la eliminación de uno o más sitios de glucosilación de la región marco variable para eliminar de este modo la glucosilación en ese sitio. Tal aglucosilación puede aumentar la afinidad del anticuerpo por el antígeno. Dicho enfoque se describe con más detalle en las Patentes de Estados Unidos n.° 5.714.350 y 6.350.861 concedidas a Co et al.

Adicionalmente, o como alternativa, se puede preparar un anticuerpo que tenga un tipo de glucosilación alterado, tal como un anticuerpo hipofucosilado que tenga cantidades reducidas de restos de fucosilo o un anticuerpo que tenga estructuras GlcNAc bisectadas aumentadas. Se ha demostrado que dichos patrones de glucosilación alterados aumentan la capacidad de ADCC de los anticuerpos. Dichas modificaciones de hidratos de carbono se pueden lograr mediante, por ejemplo, la expresión del anticuerpo en una célula hospedadora con maquinaria de glucosilación alterada. En la técnica se han descrito células con maquinaria de glucosilación alterada y se pueden usar como células hospedadoras en las que expresar los anticuerpos recombinantes de la divulgación para producir de este modo un anticuerpo con glucosilación alterada. Por ejemplo, el documento EP 1 176 195 de Hang et al. describe una línea celular con un gen FUT8 funcionalmente alterado, que codifica una fucosiltransferasa, de manera que los anticuerpos expresados en dicha línea celular presentan hipofucosilación. Por tanto, en una realización, los anticuerpos de la divulgación se producen mediante expresión recombinante en una línea celular que presenta un patrón de hipofucosilación, por ejemplo, una línea celular de mamífero con expresión deficiente del gen FUT8 que codifica la fucosiltransferasa. La Publicación PCT WO 03/035835 concedida a Presta describe una variante de la línea celular CHO, células Lecl3, con capacidad reducida para unir fucosa a los hidratos de carbono unidos a Asn(297), que también da como resultado una hipofucosilación de anticuerpos expresados en esa célula hospedadora (véase también Shields, R.L. et al., 2002 J. Biol. Chem. 277:26733-26740). La Publicación PCT WO 99/54342 concedida a Umana et al. describe líneas celulares diseñadas por ingeniería genética para expresar glucosiltransferasas modificadoras de glucoproteínas (por ejemplo beta(1,4)-N acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII)), de manera que dichos anticuerpos expresados en las líneas celulares diseñadas por ingeniería genética presentan estructuras GlcNac bisectadas aumentadas que dan como resultado una actividad de ADCC aumentada de los anticuerpos (véase también Umana et al., 1999 Nat. Biotech. 17:176-180).

Otra modificación de los anticuerpos en el presente documento que se contempla en la presente divulgación es la pegilación o hesilación o tecnologías relacionadas. Se puede someter a pegilación un anticuerpo para, por ejemplo, incrementar la semivida biológica (por ejemplo, en el suero) del anticuerpo. Para pegilar un anticuerpo, el anticuerpo o fragmento del mismo, normalmente se hace reaccionar con polietilenglicol (PEG), tal como un éster o derivado aldehído reactivo de PEG, en condiciones en las que uno o más grupos de PEG se unen al anticuerpo o fragmento de anticuerpo. La pegilación se puede llevar a cabo mediante una reacción de acilación o una reacción de alquilación con una molécula de PEG reactiva (o un polímero reactivo análogo soluble en agua). Como se usa en el presente documento, el término "polietilenglicol" pretende incluir cualquiera de las formas de PEG que se han usado para derivatizar otras proteínas, tales como monoalcoxi (C1-C10) o ariloxi-polietilenglicol o polietilenglicol-maleimida. En determinadas realizaciones, el anticuerpo que se va a pegilar es un anticuerpo aglucosilado. Los métodos para pegilar proteínas son conocidos en la técnica y se pueden aplicar a los anticuerpos de la divulgación. Véase, por ejemplo, el documento EP 0154 316 concedido a Nishimura et al. y el documento EP 0401 384 concedido a Ishikawa et al.

Otra modificación de los anticuerpos que se contempla en la presente divulgación es un conjugado o una fusión de proteína de al menos la región de unión al antígeno del anticuerpo de la divulgación con una proteína sérica, tal como la seroalbúmina humana o un fragmento de la misma para aumentar la semivida de la molécula resultante. Este enfoque se describe, por ejemplo, en Ballance et al., documento EP 0322 094.

Otra posibilidad es una fusión de al menos la región de unión al antígeno del anticuerpo de la divulgación con proteínas capaces de unirse a proteínas séricas, tales como la seroalbúmina humana para aumentar la semivida de la molécula resultante. Este enfoque se describe, por ejemplo, en Nygren et al., documento EP 0486 525.

En una realización específica, la función efectora o la función de activación del complemento de un anticuerpo de acuerdo con la divulgación se ha reducido o eliminado respecto a un anticuerpo de tipo silvestre del mismo isotipo. En un aspecto, la función efectora se reduce o se elimina mediante un método seleccionado entre reducción de la glucosilación del anticuerpo, modificación de isotipo del anticuerpo a un isotipo que naturalmente tiene una función efectora reducida o eliminada y modificación de la región Fc. En una realización relacionada específica, dicho isotipo con función efectora reducida o eliminada es el isotipo IgG4.

Moléculas de ácido nucleico que codifican los anticuerpos de la divulgación

También se divulgan en el presente documento las moléculas de ácido nucleico que codifican los anticuerpos anti-TfR o proteínas relacionadas de la presente divulgación. Ejemplos de secuencias de nucleótidos de cadena ligera variable son aquellas que codifican las secuencias de aminoácidos de cadena ligera variable de una cualquiera de mAb1 a mAb16, siendo las últimas secuencias fácilmente extraídas de la Tabla 1 y la Tabla 2, y utilizando el código genético y, opcionalmente, teniendo en cuenta el sesgo de los codones dependiendo de la especie de la célula hospedadora.

La presente divulgación también se refiere a moléculas de ácido nucleico que se obtienen a partir de las últimas secuencias que se han optimizado para la expresión de proteínas en células de mamífero, por ejemplo, líneas de células CHO.

Los ácidos nucleicos pueden estar presentes en células enteras, en un lisado celular, o pueden ser ácidos nucleicos en una forma parcialmente purificada o sustancialmente pura. Un ácido nucleico se "aísla" o "se obtiene sustancialmente puro" cuando se purifica de otros componentes celulares u otros contaminantes, por ejemplo, otros ácidos nucleicos o proteínas celulares, mediante técnicas convencionales, incluyendo tratamiento alcalino/SDS, purificación de bandas en CsCl, cromatografía en columna, electroforesis en gel de agarosa y otras bien conocidas en la técnica. Véanse, F. Ausubel, et al., ed. 1987 Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, Nueva York. Un ácido nucleico de la divulgación puede ser, por ejemplo, ADN o ARN y puede o no puede contener secuencias intrónicas. En una realización, el ácido nucleico puede estar presente en un vector tal como un vector de presentación en fagos o en un vector plasmídico recombinante.

Los ácidos nucleicos de la divulgación se pueden obtener usando técnicas de biología molecular convencionales. Una vez obtenidos los fragmentos de ADN que codifican, por ejemplo, los segmentos VH y VL, estos fragmentos de ADN se pueden manipular además mediante técnicas de ADN recombinante convencionales, por ejemplo, para convertir genes de la región variable en genes de la cadena del anticuerpo de longitud completa, en genes del fragmento Fab o en un gen de scFv. En estas manipulaciones, un fragmento de ADN que codifica VL o VH (por ejemplo, VL y VH como se define en la Tabla 1) se une operativamente a otra molécula de ADN, o a un fragmento que codifica otra proteína, tal como una región constante de anticuerpo o un enlazador flexible. La expresión "unido operativamente", como se usa en este contexto, pretende significar que los dos fragmentos de ADN están unidos de manera funcional, por ejemplo, de manera que las secuencias de aminoácidos codificadas por los dos fragmentos de ADN permanecen en marco, o de manera que la proteína se exprese bajo el control de un promotor deseado.

El ADN aislado que codifica la región VH se puede convertir en un gen de la cadena pesada de longitud completa uniendo operativamente el ADN codificante de VH a otra molécula de ADN que codifica las regiones constantes de la cadena pesada (CH1, CH2 y CH3). Las secuencias de los genes de la región constante de la cadena pesada son conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, Kabat, E. A., et al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta edición, U.S. Department of Health and Human Services, El documento de publicación NIH N.° 91-3242) y los fragmentos de ADN que abarcan estas regiones se pueden obtener mediante amplificación por PCR convencional. La región constante de la cadena pesada puede ser una región constante de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM o IgD. En algunas realizaciones, la región constante de la cadena pesada se selecciona de los isotipos IgG1, por ejemplo, el isotipo IgG1 humano. En otras realizaciones, la región constante de la cadena pesada se selecciona de los isotipos IgG4, por ejemplo, el isotipo IgG4 humano. Para un gen de la cadena pesada de fragmento Fab, El ADN codificante de VH se puede unir operativamente a otra molécula de ADN que codifica solamente la región constante de CH1 de la cadena pesada.

El ADN aislado que codifica la región VL se puede convertir en un gen de la cadena ligera de longitud completa (así como un gen de la cadena ligera de Fab) uniendo operativamente el ADN que codifica VL a otra molécula de ADN que codifica la región constante de la cadena ligera, CL. Las secuencias de los genes de la región constante de la cadena ligera humana son conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, Kabat, E. A., et al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta edición, U.S. Department of Health and Human Services, El documento de publicación NIH N.° 91-3242) y los fragmentos de ADN que abarcan estas regiones se pueden obtener mediante amplificación por PCR convencional. La región constante de la cadena ligera puede ser una región constante kappa o lambda.

Para crear un gen de scFv, los fragmentos de ADN codificantes de VH y VL se unen operativamente a otro fragmento que codifica un enlazador flexible, por ejemplo, que codifica la secuencia de aminoácidos (Gly4-Ser)3, de manera que las secuencias VH y VL puedan expresarse como una proteína monocatenaria contigua, con las regiones VL y VH unidas por el enlazador flexible (véase, por ejemplo, Bird et al., 1988 Science 242:423-426; Huston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., 1990 Nature 348:552-554).

Generación de transfectomas que producen anticuerpos monoclonales

Los anticuerpos de la presente divulgación se pueden producir en un transfectoma de célula hospedadora usando, por ejemplo, una combinación de técnicas de ADN recombinante y métodos de transfección génica como es bien conocido en la técnica (por ejemplo, Morrison, S. (1985) Science 229:1202).

Por ejemplo, para expresar los anticuerpos, o fragmentos de anticuerpo de los mismos, se pueden obtener los ADN que codifican cadenas ligeras y pesadas de longitud parcial o total mediante técnicas estándar de biología molecular o bioquímica (por ejemplo, síntesis química de ADN, amplificación por PCR o clonación de ADNc usando un hibridoma que expresa el anticuerpo de interés) y los ADN se pueden insertar en vectores de expresión de manera que los genes se unen operativamente a secuencias de control transcripcional y traduccional. En este contexto, la expresión "unido operativamente" pretende significar que un gen de anticuerpo se une en un vector de modo que las secuencias de control transcripcional y traduccional dentro del vector cumplen con su función prevista de regular la transcripción y traducción del gen del anticuerpo. El vector de expresión y las secuencias de control de la expresión se eligen para que sean compatibles con la célula de expresión hospedadora utilizada. El gen de la cadena ligera del anticuerpo y el gen de la cadena pesada del anticuerpo pueden insertarse en un vector separado o, más normalmente, se insertan ambos genes en el mismo vector de expresión. Los genes de anticuerpos se pueden insertar en el vector de expresión mediante métodos convencionales (p. ej., unión de sitios de restricción complementarios en el fragmento de gen de anticuerpo y en el vector o unión de extremos romos si no hay sitios de restricción). Las regiones variables de la cadena ligera y pesada de los anticuerpos descritos en el presente documento se pueden usar para crear genes de anticuerpos de longitud completa de cualquier isotipo de anticuerpo insertándolos en los vectores de expresión que ya codifican regiones constantes de la cadena pesada y de la cadena ligera de isotipo deseado de manera que el segmento VH se une operativamente al(a los) segmento(s) CH dentro del vector y el segmento VL se une operativamente al segmento CL dentro del vector. Adicionalmente, o como alternativa, el vector de expresión recombinante puede codificar un péptido de señal que facilita la secreción de la cadena de anticuerpo de una célula hospedadora. El gen de la cadena de anticuerpo se puede clonar en el vector de tal manera que el péptido señal se une en marco al extremo amino del gen de la cadena de anticuerpo. El péptido de señal puede ser un péptido de señal de inmunoglobulina o un péptido de señal heterólogo (es decir, un péptido de señal de una proteína no de inmunoglobulina).

Además de los genes de cadenas de anticuerpos, los vectores de expresión recombinantes divulgados en el presente documento pueden portar secuencias reguladoras que controlan la expresión de los genes de cadenas de anticuerpos en una célula hospedadora. La expresión "secuencia reguladora" pretende incluir promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación) que controlan la transcripción o la traducción de los genes de la cadena del anticuerpo. Tales secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA 1990). Los expertos en la materia apreciarán que el diseño del vector de expresión, incluyendo la selección de secuencias reguladoras, puede depender de tales factores como la elección de la célula hospedadora a transformar, el nivel de expresión de proteína deseado, etc. Las secuencias reguladoras para la expresión en células hospedadoras de mamífero incluyen elementos víricos que dirigen altos niveles de expresión de proteína en células de mamífero, tales como promotores y/o potenciadores derivados de citomegalovirus (CMV), el virus del simio 40 (SV40) (por ejemplo, el promotor principal tardío de adenovirus (AdMLP)) y polioma. Como alternativa, se pueden usar secuencias reguladoras no víricas, tales como el promotor de ubiquitina o el promotor de p-globina. Aún más, los elementos reguladores compuestos de secuencias de diferentes fuentes, tales como el sistema promotor SRa, el cual contiene secuencias del promotor temprano de SV40 y la repetición terminal larga del virus de la leucemia de linfocitos T humana tipo 1 (Takebe, Y. et al., 1988 Mol. Cell. Biol. 8:466-472).

Además de los genes de cadenas de anticuerpos y de las secuencias reguladoras, los vectores de expresión recombinantes de la presente divulgación pueden portar secuencias adicionales, tales como secuencias que regulan la replicación del vector en células hospedadoras (p. ej. orígenes de replicación) y genes marcadores seleccionables. El gen marcador seleccionable facilita la selección de células hospedadoras en las que se ha introducido el vector (véase, por ejemplo, Patentes de los Estados Unidos N.° 4.399.216, 4.634.665 y 5.179.017, todas concedidas a Axel et al.). Por ejemplo, el gen marcador seleccionable confiere generalmente resistencia a fármacos, tales como G418, higromicina o metotrexato, a una célula hospedadora en donde se ha introducido el vector. Los genes marcadores seleccionables incluyen el gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR) (para su uso en células hospedadoras dhfr con selección/amplificación en metotrexato) y el gen neo (para selección de G418).

Para la expresión de las cadenas ligeras y pesadas, el o los vectores de expresión que codifican las cadenas pesadas y ligeras se transfectan en una célula hospedadora mediante técnicas convencionales. Se pretende que las diversas formas del término "transfección" abarquen una amplia variedad de técnicas comúnmente usadas para la introducción de ADN exógeno en una célula hospedadora procariota o eucariota, por ejemplo, electroporación, precipitación con fosfato de calcio, transfección con DEAE-dextrano y similares. Teóricamente es posible expresar los anticuerpos de la presente divulgación en células hospedadoras procariotas o eucariotas. La expresión de anticuerpos en células eucariotas, por ejemplo en células hospedadoras de mamífero, levaduras u hongos filamentosos, es la que se describe debido a que tales células eucariotas, y en particular las células de mamífero, son más propensas que las células procariotas a ensamblar y secretar un anticuerpo adecuadamente plegado e inmunitariamente activo.

En una realización específica, un vector de clonación o expresión de acuerdo con la divulgación comprende una de las secuencias codificantes de las cadenas pesada y ligera de cualquiera de mAb1 a mAb16 unida operativamente a secuencias promotoras adecuadas.

Las células hospedadoras de mamífero para la expresión de los anticuerpos recombinantes de la divulgación incluyen células de ovario de hámster chino (CHO) (incluyendo células CHO dhfr-, descritas en Urlaub y Chasin, 1980 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220 usadas con un marcador seleccionable de DHFR, por ejemplo, como se describe en R.J. Kaufman y P.A. Sharp, 1982 Mol. Biol. 159:601-621), líneas celulares CHOK1 dhfr+, células de mieloma NSO, células COS y células SP2, por ejemplo líneas de células GS CHO junto con el sistema de expresión génica GS Xceed™ (Lonza).

Cuando se introducen vectores de expresión recombinantes que codifican genes de anticuerpos en células hospedadoras de mamífero, los anticuerpos se producen cultivando las células hospedadoras durante un periodo de tiempo suficiente para la expresión del anticuerpo en las células hospedadoras y, opcionalmente, la secreción del anticuerpo en el medio de cultivo en donde crecen las células hospedadoras. Los anticuerpos pueden recuperarse y purificarse, por ejemplo, del medio de cultivo después de su secreción utilizando métodos estándar de purificación de proteínas (Véase por ejemplo Abhinav et al. 2007, Journal of Chromatography 848: 28-37).

En una realización específica, la célula hospedadora de la divulgación es una célula hospedadora transfectada con un vector de expresión que tiene las secuencias codificantes adecuadas para la expresión de mAb1-mAb16 respectivamente, unidas operativamente a las secuencias promotoras adecuadas.

Las últimas células hospedadora se pueden cultivar posteriormente en condiciones adecuadas para la expresión y producción de un anticuerpo de la divulgación seleccionado del grupo que consiste en mAb1-mAb16 respectivamente.

Inmunoconjugados

En otro aspecto, la presente divulgación presenta un anticuerpo anti-TfR como se divulga en el presente documento, o un fragmento del mismo, conjugado a una fracción terapéutica, tal como una citotoxina, un fármaco (por ejemplo, un inmunosupresor) o una radiotoxina. Dichos conjugados se denominan en el presente documento "inmunoconjugados". Los inmunoconjugados que incluyen una o más citotoxinas se denominan "inmunotoxinas". Una citotoxina o agente citotóxico incluye cualquier agente que sea perjudicial para las células (por ejemplo, las mata). Los ejemplos incluyen taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxiantracindiona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propanolol y puromicina y análogos u homólogos de los mismos. Los agentes terapéuticos también incluyen, por ejemplo, antimetabolitos (por ejemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracil decarbazina), agentes ablativos (por ejemplo, mecloretamina, tioepa clorambucilo, melfalán, carmustina (BSNU) y lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfán, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C y cis-diclorodiamina-platino (II) (DDP) cisplatino), antraciclinas (por ejemplo, daunorrubicina (anteriormente daunomicina) y doxorrubicina), antibióticos (por ejemplo, dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, mitramicina y antramicina (AMC)) y agentes antimitóticos (por ejemplo, vincristina y vinblastina).

Las citotoxinas se pueden conjugar con los anticuerpos de la presente divulgación usando tecnología con enlazadores disponible en la técnica. Los ejemplos de tipos de enlazadores que se han usado para conjugar una citotoxina con un anticuerpo incluyen, pero sin limitación, hidrazonas, tioéteres, ésteres, disulfuros y enlazadores que contienen péptido. Puede elegirse un enlazador que sea, por ejemplo, susceptible de escisión por pH bajo dentro del compartimento lisosómico o susceptible de escisión por proteasas, tales como proteasas expresadas preferentemente en tejido tumoral tales como catepsinas (por ejemplo, las catepsinas B, C, D).

Para una descripción adicional de los tipos de citotoxinas, enlazadores y métodos para conjugar agentes terapéuticos con anticuerpos, véase también Panowksi S et al. 2014 Jan 1; 6(1): 34-45 para una revisión sobre conjugados de anticuerpos y fármacos.

Los anticuerpos de la presente divulgación también se pueden conjugar con un isótopo radiactivo para generar radiofármacos citotóxicos, también citados como radioinmunoconjugados. Los ejemplos de isótopos radiactivos que se pueden conjugar con anticuerpos para uso diagnóstico o terapéutico incluyen, pero sin limitación, yodo131, indio111, itrio90, y lutecio177. Los métodos para preparar radioinmunoconjugados se encuentran establecidos en la técnica.

Moléculas biespecíficas o multiespecíficas

En otro aspecto, se divulgan adicionalmente en el presente documento moléculas biespecíficas o multiespecíficas que comprenden un anticuerpo anti-TfR de la presente divulgación. Un anticuerpo se puede derivar o unir a otra molécula funcional, por ejemplo, otro péptido o proteína (por ejemplo, otro anticuerpo o ligando para un receptor) para generar una molécula biespecífica que se une a al menos dos sitios de unión diferentes o moléculas diana. El anticuerpo de hecho se puede derivar o unir a más de una otra molécula funcional para generar moléculas multiespecíficas que se unen a más de dos sitios de unión diferentes y/o moléculas diana; tales moléculas multiespecíficas también se pretende que se abarquen por la expresión "molécula biespecífica" como se usa en el presente documento. Para crear un anticuerpo biespecífico, un anticuerpo de la divulgación puede unirse de forma funcional (por ejemplo, por acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otra manera) a una o más moléculas de unión diferentes, tal como otro anticuerpo, fragmento de anticuerpo, péptido o mimético de unión, de manera que resulta una molécula biespecífica.

Por consiguiente, la presente divulgación incluye moléculas biespecíficas que comprenden al menos una primera especificidad de unión para TfR, por ejemplo, una porción de unión a antígeno de cualquiera de mAb1-mAb16 y una segunda especificidad de unión para un segundo epítopo diana. Por ejemplo, el segundo epítopo diana es otro epítopo de TfR diferente del primer epítopo diana.

Adicionalmente, para la realización en donde la molécula biespecífica es multiespecífica, la molécula además puede incluir una tercera especificidad de unión, además del primer y segundo epítopo diana.

En una realización, las moléculas biespecíficas divulgadas en el presente documento comprenden como una especificidad de unión al menos un anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo del mismo, incluyendo, por ejemplo, un Fab, Fab', F(ab')2, Fv, UniBody o un Fv de cadena sencilla. El anticuerpo también puede ser un dímero de cadena ligera o cadena pesada, o cualquier fragmento mínimo del mismo tal como un Fv o una construcción de cadena sencilla como se describe en Ladner et al, documento de patente de Estados Unidos N.° 4.946.778.

Otros anticuerpos que se pueden emplear en las moléculas biespecíficas divulgadas en el presente documento son anticuerpos monoclonales murinos, quiméricos y humanizados.

Las moléculas biespecíficas de la presente divulgación se pueden preparar conjugando las especificidades de unión de los constituyentes, utilizando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, cada especificidad de unión de la molécula biespecífica puede generarse por separado y luego conjugarse entre sí. Cuando las especificidades de unión son proteínas o péptidos, se puede usar una variedad de agentes de acoplamiento o reticulación para la conjugación covalente. Los ejemplos de agentes de reticulación incluyen proteína A, carbodiimida, N-succinimidil-S-acetiltioacetato (SATA), 5,5'-ditiobis(ácido 2-nitrobenzoico) (DTNB), o-fenilendimaleimida (oPDM), N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP), y sulfosuccinimidil 4-(N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato (sulfo-SMCC) (véase por ejemplo, Karpovsky et al., 1984 J. Exp. Med. 160:1686; Liu, MA et al., 1985 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648). Otros métodos incluyen los descritos en Paulus, 1985 Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132; Brennan et al., 1985 Science 229:81-83), y Glennie et al., 1987 J. Immunol. 139: 2367-2375).

Como alternativa, ambas especificidades de unión pueden codificarse en el mismo vector y expresarse y ensamblarse en la misma célula hospedadora. Este método es particularmente útil cuando la molécula biespecífica es un mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab')2 o ligando x proteína de fusión de Fab. Una molécula biespecífica de la divulgación puede ser una molécula de cadena sencilla que comprende un anticuerpo de cadena sencilla y un determinante de unión, o una molécula biespecífica de cadena sencilla que comprende dos determinantes de unión.

La unión de las moléculas biespecíficas a sus dianas específicas se puede confirmar mediante, por ejemplo, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), radioinmunoensayo (REA), análisis FACS, bioensayo (por ejemplo, inhibición del crecimiento y apoptosis), o ensayo de transferencia Western. Cada uno de estos ensayos generalmente detectan la presencia de complejos proteína-anticuerpo de particular interés empleando un reactivo marcado (por ejemplo, anticuerpo) específico para el complejo de interés.

Los anticuerpos de la presente divulgación también pueden usarse para preparar receptores de linfocitos T artificiales (también conocidos como receptores de linfocitos T quiméricos o receptores de antígenos quiméricos (CAR)). Por ejemplo, las regiones variables de los anticuerpos pueden usarse para formar un scFv que se une mediante un espaciador a un dominio transmembrana y un endodominio de señalización de un TCR (por ejemplo CD3 zeta) y puede producirse en la superficie de los linfocitos T. Dichos CAR se pueden usar en terapia de transferencia adoptiva, por ejemplo, para tratar trastornos proliferativos.

Composiciones farmacéuticas

En otro aspecto, la presente divulgación proporciona una composición, por ejemplo, una composición farmacéutica, que contiene uno o una combinación de anticuerpos divulgados en el presente documento, por ejemplo, un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en mAb1-mAb16, formulado junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Tales composiciones pueden incluir uno o una combinación de (por ejemplo, dos o más diferentes) anticuerpos o inmunoconjugados o moléculas biespecíficas como se ha descrito anteriormente.

Las composiciones farmacéuticas divulgadas en el presente documento también pueden administrarse en terapia de combinación, es decir, combinadas con otros agentes. Por ejemplo, la terapia de combinación puede incluir un anticuerpo anti-TfR de la presente divulgación, por ejemplo un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en mAb1-mAb16, combinado con al menos un agente antivírico, antiinflamatorio u otro agente antiproliferativo. Los ejemplos de agentes terapéuticos que se pueden usar en la terapia de combinación se describen en mayor detalle a continuación en la sección sobre usos de los anticuerpos de la divulgación.

Como se usa en el presente documento, "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción, y similares, que sean fisiológicamente compatibles. El vehículo debe ser adecuado para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, parenteral, espinal o epidérmica (por ejemplo, mediante inyección o infusión). En una realización, el vehículo debe ser adecuado para la vía subcutánea. Dependiendo de la vía de administración, el compuesto activo, es decir, anticuerpo, inmunoconjugado o molécula biespecífica, se puede recubrir con un material para proteger el compuesto de la acción de los ácidos y de otras condiciones naturales que pueden inactivar el compuesto.

La solución salina tamponada con fosfato estéril es un ejemplo de un vehículo farmacéuticamente aceptable. Otros vehículos adecuados son bien conocidos por los expertos en la materia. (Véanse, por ejemplo, Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, 19th ed. 1995)). Las formulaciones pueden incluir además uno o más excipientes, conservantes, solubilizantes, agentes tamponantes, albúmina para prevenir la pérdida de proteínas en superficies de viales, etc.

La forma de las composiciones farmacéuticas, la vía de administración, la dosis y el régimen naturalmente dependerán de la afección a tratar, la gravedad de la enfermedad, la edad, el peso y el sexo del paciente, etc.

Las composiciones farmacéuticas de la divulgación pueden formularse para administración tópica, oral, parenteral, intranasal, intravenosa, intramuscular, subcutánea o intraocular y similares.

Preferentemente, las composiciones farmacéuticas contienen vehículos, que son farmacéuticamente aceptables para una formulación que puede inyectarse. Estas pueden ser en particular soluciones salinas isotónicas, estériles, (fosfato monosódico o disódico, cloruro de sodio, potasio, calcio o magnesio y similares o mezclas de dichas sales) o composiciones secas, especialmente liofilizadas que tras la adición, dependiendo del caso, de agua esterilizada o solución salina fisiológica, permiten la constitución de las soluciones inyectables.

Las dosis usadas para la administración pueden adaptarse como una función de diversos parámetros y en particular como una función del modo de administración usado, de la patología pertinente o como alternativa, de la duración deseada del tratamiento.

Para preparar composiciones farmacéuticas, puede disolverse o dispersarse una cantidad eficaz del anticuerpo en un vehículo farmacéuticamente aceptable o medio acuoso.

Las formas farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles; incluyendo las formulaciones aceite de sésamo, aceite de cacahuete o propilenglicol acuoso; y polvos estériles o liofilizados para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. En todos los casos, la forma debe ser estéril y debe ser fluida hasta el punto de que pueda inyectarse fácilmente. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe protegerse frente a la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos.

Las soluciones de los compuestos activos como base libre o sales farmacológicamente aceptables pueden prepararse en agua mezclada adecuadamente con un tensioactivo, tales como hidroxipropilcelulosa. También se pueden preparar dispersiones en glicerol, polietilenglicoles líquidos y mezclas de los mismos y en aceites. En condiciones normales de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservante para prevenir el crecimiento de microorganismos.

Un anticuerpo de la divulgación puede formularse en una composición en una forma neutra o de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición de ácido (formadas con los grupos amino libres de la proteína) y que se forman con ácidos inorgánicos, tales como, por ejemplo, los ácidos clorhídrico o fosfórico o ácidos orgánicos, tales como acético, oxálico, tartárico, mandélico y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también pueden obtenerse de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, cloruro de sodio, potasio, amonio, calcio o hidróxidos férricos, y bases orgánicas, tales como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína y similares.

El vehículo también puede ser un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido y similares), mezclas de los mismos y aceites vegetales. La fluidez adecuada puede mantenerse, por ejemplo, usando un recubrimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula necesario en el caso de una dispersión y mediante el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de microorganismos puede llevarse a cabo con diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal y similares. En muchos casos, se preferirá incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares o cloruro de sodio. Puede lograrse la absorción prolongada de las composiciones inyectables mediante el uso en las composiciones de agentes que retrasan la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Las soluciones inyectables estériles se preparan incorporando los compuestos activos en la cantidad necesaria en el disolvente apropiado con otros diversos ingredientes enumerados anteriormente, según sea necesario, seguido de esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando los diversos principios activos esterilizados en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y los otros principios necesarios de entre los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación preferidos son las técnicas de secado al vacío y liofilización, que producen un polvo del principio activo más cualquier ingrediente adicional deseado, a partir de la solución de los mismos previamente esterilizada por filtración.

También se contempla la preparación de soluciones más, o fuertemente, concentradas para inyección directa, donde se prevé el uso de DMSO como disolvente para dar como resultado una penetración extremadamente rápida, suministrando altas concentraciones de los principios activos en un área tumoral pequeña.

Tras la formulación, las soluciones se administrarán de una manera compatible con la formulación de dosificación y en una cantidad tal que sea terapéuticamente eficaz. Las formulaciones se administran fácilmente en una diversidad de formas farmacéuticas, tal como el tipo de soluciones inyectables descritas anteriormente, pero también pueden emplearse cápsulas de liberación de fármaco y similares.

Para la administración parenteral en una solución acuosa, por ejemplo, la solución debe tamponarse de manera adecuada en caso necesario y el diluyente líquido en primer lugar tiene que volverse isotónico con suficiente solución salina o glucosa. Estas soluciones acuosas particulares son especialmente adecuadas para la administración intravenosa, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal. A este respecto, los medios acuosos estériles que pueden emplearse serán conocidos por los expertos en la materia a la luz de la presente divulgación. Por ejemplo, una dosificación podría disolverse en 1 ml de solución de NaCl isotónica y añadirse a 1000 ml de líquido de hipodermoclisis o inyectarse en el sitio propuesto de infusión, (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences" 15.a Edición, páginas 1035-1038 y 1570-1580). Se producirá necesariamente alguna variación en la dosificación dependiendo de la afección del sujeto que se está tratando. La persona responsable de la administración, en todo caso, determinará la dosis adecuada para el sujeto individual.

Los anticuerpos de la divulgación pueden formularse en una mezcla terapéutica de forma que comprenda de aproximadamente 0,0001 a 1,0 miligramos o de aproximadamente 0,001 a 0,1 miligramos o de aproximadamente 0,1 a 1,0 o incluso 1,0 a aproximadamente 10 miligramos por dosis. También pueden administrarse múltiples dosis.

Además de los compuestos formulados para administración parenteral, tal como inyección intravenosa o intramuscular, otras formas farmacéuticamente aceptables incluyen, por ejemplo, comprimidos u otros sólidos para administración oral; cápsulas de liberación controlada; y cualquier otra forma usada en la actualidad.

En determinadas realizaciones, se contempla el uso de liposomas y/o nanopartículas para la introducción de anticuerpos en las células hospedadoras. La formación y el uso de liposomas y/o nanopartículas son conocidos por los expertos en la materia.

Las nanocápsulas pueden en general inmovilizar compuestos de una manera estable y reproducible. Para evitar efectos secundarios debidos a la sobrecarga polimérica intracelular, dichas partículas ultrafinas (de un tamaño de aproximadamente 0,1 pm) deben diseñarse generalmente usando polímeros capaces de degradarse in vivo. Se contemplan para el uso en la presente divulgación nanopartículas biodegradables de polialquil-cianoacrilato que cumplen con estos requisitos, y tales partículas pueden fabricarse fácilmente.

Los liposomas se forman a partir de fosfolípidos que se dispersan en un medio acuoso y forman espontáneamente vesículas de bicapas concéntricas multilaminares (denominadas también vesículas multilaminares (MLV)). Las MLV tienen generalmente diámetros desde 25 nm a 4 pm. La sonicación de las MLV da como resultado la formación de pequeñas vesículas unilaminares (SUV) con diámetros en el intervalo de 200 a 500 A, que contienen una solución acuosa en el núcleo. Las características físicas de los liposomas dependen del pH, la fuerza iónica y la presencia de cationes divalentes.

Usos y métodos de los anticuerpos o proteínas de la divulgación

Los anticuerpos o proteínas de la presente divulgación tienen utilidades diagnósticas y terapéuticas in vitro e in vivo. Por ejemplo, estas moléculas se pueden administrar a células en cultivo, por ejemplo, in vitro o in vivo o a un sujeto, por ejemplo, in vivo, para tratar, prevenir o diagnosticar una variedad de trastornos.

Los anticuerpos de la divulgación no solo pueden inhibir la proliferación celular, sino también inducir apoptosis de células muy proliferativas, tales como linfocitos T.

Se contempla en el presente documento usar el anticuerpo anti-TfR o proteína de la presente divulgación como un fármaco, en particular para su uso en el tratamiento, prevención o diagnóstico de trastornos proliferativos celulares, tales como tumores que expresan un elevado nivel de TfR, más específicamente, tumores hematológicos, tales como linfoma, y en particular, a Tl , MCL, enfermedad de Hodgkin, linfoma de linfocitos B grandes, linfoma periférico de linfocitos T, leucemia aguda (mieloide y linfoide), así como tumores sólidos, tales como carcinoma renal, cáncer de pulmón (microcítico), etc.

Se divulgan además anticuerpos de la presente divulgación para su uso en el tratamiento, prevención o diagnóstico de trastornos relacionados con el HTLV-1, en particular para reducir la carga viral en trastornos inflamatorios asociados con la infección por HTLV-1, incluyendo HAM/TSP, polimiositis y artritis.

La divulgación también se refiere a métodos para disminuir o suprimir la captación de transferrina en células sanguíneas humanas mediante la administración de una composición que comprende una dosis terapéuticamente eficaz de los anticuerpos de la divulgación.

Los compuestos o proteínas para su uso como se ha divulgado anteriormente pueden administrarse como el único principio activo o junto con, por ejemplo, como adyuvante de, o en combinación con, otros fármacos, por ejemplo, agentes antivíricos, antiinflamatorios o citotóxicos, antiproliferativos, quimioterapéuticos o antitumorales, por ejemplo, para el tratamiento o prevención de las enfermedades mencionadas anteriormente.

Por ejemplo, los anticuerpos para su uso como se ha divulgado anteriormente se pueden usar en combinación con AZT, IFN-alfa, mAb anti-CD20, mAb anti-CD25, agentes quimioterapéuticos.

Agentes antineoplásicos adecuados pueden incluir sin limitación, agentes alquilantes (tales como ciclofosfamida, mecloretamina, clorambucilo, melfalán, nitrosureas, temozolomida), antraciclinas (tales como daunorrubicina, doxorrubicina, epirrubicina, idarrubicina, mitoxantrona, valrrubicina), taxanos (tales como paclitaxel y docetaxel), epotilonas, inhibidores de la topoisomerasa I (tales como irinotecán o topotecán), inhibidores de la topoisomerasa II (tales como etopósido, tenipósido o taflupósido), análogos de nucleótidos y análogos de precursores (tales como azacitidina, azatioprina, capecitabina, citarabina, fluorouracilo, gemcitabina, hidroxiurea, mercaptopurina, metotrexato, o tioguanina), antibióticos peptídicos (tales como carboplatino, cisplatino y oxaliplatino), retinoides (tales como tretinoína, alitretinoína, bexaroteno), alcaloides de la vinca y derivados (tales como vinblastina, vincristina, vindesina, vinorelbina), terapias dirigidas tales como inhibidores de quinasa (tales como ibrutinib, idelalisib, erlotinib, gefitinib, imatinib, vemurafenib, vismodegib), inhibidores del proteasoma (tales como bortezomib, carfilzomib), inhibidores de la histona desacetilasa (tales como vorinostat o romidepsina).

De acuerdo con lo anterior, la presente divulgación proporciona en otro aspecto más:

Un método como se ha definido anteriormente que comprende la administración conjunta, por ejemplo, concomitantemente o por orden, de una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo anti-TfR o proteína de la divulgación, y al menos un segunda sustancia farmacológica, siendo dicha segunda sustancia farmacológica un agente antivírico o antiproliferativo, por ejemplo, como se ha indicado anteriormente.

En una realización, los anticuerpos o proteínas de la divulgación pueden usarse para detectar niveles de TfR o niveles de células que contienen TfR. Esto se puede lograr, por ejemplo, poniendo en contacto una muestra (tal como una muestra in vitro) y una muestra de control con el anticuerpo anti-TfR en condiciones que permitan la formación de un complejo entre el anticuerpo y TfR. Cualquier complejo formado entre el anticuerpo y TfR se detecta y se compara en la muestra y el control. Por ejemplo, los métodos de detección estándar, bien conocidos en la técnica, tales como los ensayos de ELISA y citometría de flujo, se pueden utilizar en las composiciones de la divulgación.

Por consiguiente, en un aspecto, la divulgación proporciona además métodos para detectar la presencia de TfR (por ejemplo, antígeno de TfR humano) en una muestra, o medir la cantidad de TfR, que comprenden poner en contacto la muestra y una muestra de control, con un anticuerpo o proteína de la divulgación, o una región de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a TfR, en condiciones que permiten la formación de un complejo entre el anticuerpo o la porción del mismo y TfR. A continuación se detecta la formación de un complejo, en donde una diferencia en la formación del complejo entre la muestra en comparación con la muestra de control es indicativa de la presencia de TfR en la muestra.

También dentro del alcance de la presente divulgación se encuentran kits que consisten en las composiciones (por ejemplo, anticuerpos, proteínas, anticuerpos humanizados, anticuerpos conjugados y moléculas multiespecíficas) divulgadas en el presente documento e instrucciones de uso. El kit puede contener además al menos un reactivo adicional, o uno o más anticuerpos adicionales o proteínas (por ejemplo, un anticuerpo que tiene una actividad complementaria que se une a un epítopo en el antígeno diana distinto del primer anticuerpo). Los kits incluyen normalmente un texto informativo que indica el uso pretendido de los contenidos del kit. La expresión texto informativo incluye cualquier material escrito o grabado suministrado en o con el kit, o que de otro modo acompaña al kit. El kit puede comprender además herramientas para diagnosticar si un paciente pertenece a un grupo que responderá a un tratamiento con anticuerpos anti-TfR, tal como se ha definido anteriormente.

Ejemplos

Métodos

1. Prueba de afinidad por ELISA

Para la determinación de la especificidad del anticuerpo, se puede aplicar una prueba ELISA utilizando el siguiente protocolo. Los TfR humanos recombinantes (obtenidos de R&D Systems, número de catálogo 2474-TR) se aplican directamente sobre una placa de 96 pocillos, se dejan durante la noche y se lavan dos veces antes de la incubación con varias diluciones (10) del anticuerpo (mAb murino y humanizado) (la dilución puede comenzar en la concentración de 50 |jg/ml a 0,001 jg/m l) e incubar 1 hora a temperatura ambiente. Después de dos lavados, se incuba un anticuerpo secundario anti-IgG humana de cabra. Se incuba 1 hora a temperatura ambiente en la oscuridad, se lava dos veces y se incuba con la solución de TMB durante 10 minutos antes de leer la absorbancia a 450 nm.

2. Determinación de la afinidad mediante resonancia de plasmón superficial (sistema Biacore)

Para determinar los valores de Kd, se puede aplicar la tecnología de resonancia de plasmón superficial utilizando la tecnología Biacore™ como se describe a continuación: El TfR humano marcado con histidina (obtenido de R&D Systems, número de catálogo 2474-TR) se unió después del pase en un chip sensor Penta-His mAb CM5 inmovilizado covalentemente. Se inyectaron diez concentraciones diferentes de anticuerpo (de 1 a 500 nM) a través de la superficie anti-His/TfR-His durante 4 minutos y los complejos de disociación se siguieron durante 5 minutos. Tanto los perfiles de asociación como los de disociación se analizan con un algoritmo cuadrado no lineal implementado en el software BIAevalution utilizando funciones de tiempo de una sola exponencial.

3. Ensayo de ADCC

La citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos es un mecanismo deseable para destruir las células cancerosas diana utilizando fármacos a base de anticuerpos. El anticuerpo se une a los antígenos diana en la superficie celular. Cuando la parte efectora de Fc de los anticuerpos unidos a la diana también se une a los receptores FcYRIIIa en la superficie celular de las células efectoras (predominantemente linfocitos citolíticos naturales), se produce una reticulación múltiple de los dos tipos de células, lo que conduce a la activación de la vía de ADCC. La destrucción de las células diana es un criterio de valoración de la activación de esta vía y se utiliza en los bioensayos de ADCC clásicos, que utilizan células mononucleares de sangre periférica del donante (PBMC) o la subpoblación de linfocitos citolíticos naturales (NK) como células efectoras. El kit ADCC Reporter Bioassay Complete (Promega, G7015) contiene todos los componentes y reactivos necesarios para realizar un ensayo ADCC Reporter Bioassay basado en anti-CD20. El ADCC Reporter Bioassay utiliza una lectura alternativa en un punto más temprano en la activación de la vía de ADCC: la activación de la transcripción génica a través de la vía NFAT (factor nuclear de linfocitos T activados) en la célula efectora. Además, el ADCC Repórter Bioassay utiliza células Jurkat diseñadas de forma estable que expresan el receptor FcYRIIIa y un elemento de respuesta NFAT que impulsa la expresión de luciferasa de luciérnaga como células efectoras. La actividad biológica del anticuerpo en ADCC se cuantifica a través de la luciferasa producida como resultado de la activación de la vía NFAT; La actividad luciferasa en la célula efectora se cuantifica con lectura de luminiscencia. Como control positivo para comparar con mAb humanizado, el kit proporciona un anticuerpo anti-CD20.

4. Ensayo de inducción de la apoptosis de linfocitos T activados por HL-60 y PHA

Para el ensayo de apoptosis, las células se incubaron en la placa de 24 pocillos a la concentración de 100.103 células por pocillo en 400 |j¡. Posteriormente, las células se incuban durante 3 y 4 días en presencia de varias diluciones en el anticuerpo murino o humanizado (desde 200 jg/m l hasta 3 jg/ml). Después del tiempo de incubación, las células se centrifugan y marcan en presencia de anexina V y Tropo 3 durante 15 minutos antes del análisis de citometría de flujo.

5. Ensayo de productividad (400 ml)

Para la prueba de productividad, se sintetizaron los genes VH y se clonaron en el vector de expresión pXCIgG (AK) para la cadena pesada. Las cadenas ligeras se subclonaron previamente en el vector pXCKappa. Los 16 anticuerpos se expresaron transitoriamente en células CHOK1SV GS-KO en un volumen de 400 ml (matraz agitado). Los anticuerpos producidos se purificaron usando cromatografía de afinidad de proteína A. Las concentraciones de anticuerpos se determinaron usando un coeficiente de extinción previsto (1,49) para todas las variantes de anticuerpos. La integridad de las variantes se determinó mediante SDS-PAGE tanto en condiciones reductoras como no reductoras. Ejemplos m Abl a mAb16

Los Ejemplos mAbl a mAb16 como se describen en la Tabla 1 se pueden producir usando procesos de producción y purificación de anticuerpos recombinantes convencionales.

Por ejemplo, las secuencias codificantes se han clonado en un vector de producción para la expresión recombinante en una línea celular de producción de mamíferos.

Las siguientes Tablas 4 y 5 proporcionan secuencias detalladas de aminoácidos y nucleótidos de la divulgación y, en particular, para producir los ácidos nucleicos, vectores de expresión y anticuerpos de la presente divulgación.

Tabla 4: Descri ción breve de secuencias de aminoácidos nucleótidos útiles

continuación

Tabla 5: Descri ción breve de secuencias de aminoácidos nucleótidos útiles

(continuación)

(continuación)

Resultados

Diseño funcional de anticuerpos humanizados de A24

Hum anización

El procedimiento de humanización se realizó como se describe a continuación:

1. Se identificaron dominios y regiones de anticuerpos parentales.

2. Las secuencias de anticuerpos parentales se alinearon con un conjunto de secuencias de referencia.

3. Se construyó un modelo estructural 3D de la proteína parental.

4. A partir de los datos recopilados, se realizó una evaluación inicial de la posibilidad de sustituir cada posición y se categorizaron las posiciones.

5. Se construyeron modelos estructurales de variantes humanizadas cuando fue necesario y se compararon con el modelo parental para el análisis estructural de posibles sustituciones.

6. El injerto de CDR se realizó analizando posiciones que difieren entre las secuencias parental y aceptora. Las posiciones contribuyentes se mantuvieron en general y solo se sustituyeron si dichas sustituciones son relativamente favorables en función de su influencia potencial en la afinidad y compatibilidad con el marco del aceptor.

Se diseñó un conjunto final de combinaciones variantes de cadenas ligeras y pesadas humanizadas. Anotación de secuencia

Se usó la base de datos de dominios conservados (CDD) (Marchler-Bauer et al. 2011) para determinar el contenido de dominio de cada cadena de aminoácidos y los límites aproximados de cada dominio. Los límites de los dominios variables se determinaron exactamente junto con los límites de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de acuerdo con varias definiciones de uso común (Kabat and Wu 1991, Chothia and Lesk 1987 actualizado en Al-Lazikani et al. 1997, Honegger y Plücktuhn 2001). Se ha usado la definición de CDR de Chothia actualizada (Al-Lazikani et al. 1997) y se ha usado la numeración posicional, en cuyo caso se ha usado la numeración de Chothia 1987.

A lineaciones de la secuencia

Se generaron múltiples alineaciones de la secuencia parental con las secuencias de la línea germinal humana y de ratón utilizando MAFFT (Katoh et al. 2002) y las entradas en cada alineación se ordenaron según la identidad de secuencia (SeqID) con la secuencia parental. Los conjuntos de referencia se redujeron a un conjunto único de secuencias agrupando al 100 % de SeqID y excluyendo las entradas redundantes.

Identificación de restos en posiciones críticas

Los Fv de anticuerpos tienen una serie de posiciones críticas que forman la interfaz entre cadenas VH/VL o son responsables del conjunto discreto de estructuras canónicas que se han definido para cinco de las CDR (Chothia and Lesk 1987, Martin and Thornton 1996, Al Laziniki et al. 1997); estas posiciones deben ser consideradas en detalle antes de que se propongan sustituciones para ellas. Basándose en la alineación de la secuencia del anticuerpo parental con las líneas germinales humanas, se identificaron las entradas coincidentes más cercanas. La identificación de la línea germinal humana óptima como aceptor se basó en los criterios ordenados que se enumeran a continuación:

1. Identidad de secuencia en todo el marco

2. Restos de la interfaz entre cadenas idénticos o compatibles

3. Bucles de soporte con las conformaciones canónicas de las CDR parentales

4. La combinación de líneas germinales pesadas y ligeras se encuentra en anticuerpos expresados

C onstrucción de m odelos 3D

Los modelos estructurales de la región Fv para el anticuerpo murino parental y variantes del mismo, se generaron utilizando la plataforma de modelado de Lonza. Se puntuaron los fragmentos del molde estructural candidatos para el marco (FR) y las regiones determinantes de la complementariedad (CDR), así como el Fv completo, se clasificaron y se seleccionaron de una base de datos de anticuerpos interna basándose en la identidad de la secuencia con la diana, así como en las medidas cristalográficas cualitativas de la estructura del molde, tal como la resolución (en Angstrom (A)).

Con el fin de alinear estructuralmente las CDR con los moldes de FR, se incluyeron cinco restos a cada lado de la CDR en el molde de la CDR. Se generó una alineación de los fragmentos basada en segmentos superpuestos y se generó una alineación de secuencia estructural. Los fragmentos de molde junto con la alineación fueron procesados mediante MODELLER (Sali et al. 1993).

Este protocolo crea restricciones conformacionales derivadas del conjunto de moldes estructurales alineados. Se crea un conjunto de estructuras que satisfacen las restricciones mediante procedimientos de optimización de hibridación simulada y gradiente conjugado. Se seleccionan una o más estructuras modelo de este conjunto basándose en una puntuación de energía, derivada de la puntuación de la estructura de la proteína y la satisfacción de las restricciones conformacionales. Se inspeccionaron los modelos y las cadenas laterales de las posiciones, las cuales difieren entre la diana y el molde, se optimizaron mediante un algoritmo de optimización de la cadena lateral y se minimizó la energía. Se utilizó un conjunto de herramientas informáticas y de visualización para evaluar la variabilidad conformacional de las CDR, así como el empaquetamiento central y local de los dominios y regiones y un análisis de superficie para seleccionar uno o más modelos preferidos.

Com paración de estructuras m odeladas

Los modelos estructurales para las regiones Fv parental y humanizada se modelan individualmente, como se ha descrito anteriormente, para garantizar que los modelos variantes no se construyan con ningún sesgo inherente respecto a la estructura del modelo parental. Sin embargo, la alta identidad de secuencia de las variantes humanizadas con la secuencia parental a menudo da como resultado la selección de moldes estructurales idénticos para muchos modelos.

Para evaluar el impacto de diferentes sustituciones en la afinidad y la estabilidad, se utilizan una serie de criterios estructurales. La accesibilidad al disolvente, el empaquetamiento atómico local y la ubicación de la sustitución en relación con la interfaz de unión al antígeno prevista o la interfaz del dímero Fv son criterios clave. La observación de un estado de solvatación desfavorable, malos contactos interatómicos o la colocación errónea de un resto inadecuado en una posición clave conduce al rechazo de una posible sustitución. Otros criterios, tales como los efectos electrostáticos, los patrones de enlaces de hidrógeno o los posibles patrones de enlaces de hidrógeno también se usan para evaluar la idoneidad de una sustitución. Algunas posiciones son más adecuadas que otras para la aceptación de sustituciones, ya que un conjunto de posiciones críticas juega un papel en el soporte de la clase canónica de las CDR, el empaquetado de los núcleos de dominio individuales o las interfaces entre dominios.

Evaluación de posib les sustituciones

Todas las posiciones que difieren entre los marcos parental y aceptor o los epítopos casi pronosticados se evaluaron basándose en su impacto potencial sobre la afinidad y estabilidad de unión.

Hay muchos factores que contribuyen a esta categorización, que se originan a partir de preocupaciones tanto por la afinidad como por la estabilidad. Los factores que contribuyen a la clasificación son:

• Posiciones responsables de la unión al antígeno

• Posiciones críticas

o Restos conservados dentro de la interfaz VH/VL

o Posiciones que determinan la clase canónica de la CDR

Distancia desde las CDR

Conservación o variación en la posición en la alineación de referencia

Accesibilidad al disolvente

Empaquetamiento atómico local

Estructura secundaria local

Efectos electrostáticos

Patrones de enlace de hidrógeno

Potencial de enlace de hidrógeno

Modificaciones postraduccionales

o N-glucosilación

o Desamidación

Las posiciones críticas se definen inicialmente como aquellas en las CDR de Chothia, determinadas como posiciones críticas en la interfaz VH/VL; en posiciones que ayudan a determinar la conformación de la CDR o que están muy conservadas en la alineación de referencia. Muchas posiciones están conservadas y solo aceptarán un pequeño conjunto, o solo un, tipo de aminoácido.

Selección del m arco de aceptor óptim o

Se generaron alineamientos de secuencia que comparan dominios de variables parentales con la línea germinal humana. Dada la identidad de secuencia general, las posiciones de interfaz coincidentes y las posiciones canónicas de CDR clasificadas de manera similar, la cadena ligera todavía tenía varios marcos de aceptor igualmente adecuados; frecuentemente uno era un poco más adecuado para una región pero menos para otra. En consecuencia, se seleccionaron dos marcos de aceptor de cadena ligera VK6-A26 y VK3-L6.

La cadena pesada se correspondía mejor con la línea germinal humana VH7-7-4.1. La familia de la línea germinal VH7 contiene solo un miembro, que puede incluirse en la familia VH1 (Knappik et al. 2000). Como es probable que la línea germinal VH7 se encuentre con menos frecuencia que la línea germinal VH1, se consideró preferible utilizar esta última como marco aceptor. Sin embargo, cuando se analizaron las posiciones con posibles retromutaciones, quedó claro que la línea germinal VH7 ya contenía los restos apropiados. Por consiguiente, se utilizaron dos líneas germinales de IGHV como marcos de aceptor; VH7-7-4.1 y VH1-1-03.

Los genes del segmento J se compararon con las secuencias parentales A24 en los segmentos FR4 y J. JK4 y JH4 se identificaron como la mejor coincidencia para la cadena ligera y pesada respectivamente y, por lo tanto, se seleccionaron como marcos aceptor del segmento J.

Hum anización

Se generó una lista de todas las posiciones con restos diferentes entre el marco parental y aceptor. Todas las posiciones fueron analizadas y consideradas tanto de forma aislada como en el contexto de otras posibles sustituciones. Se clasificó cada posición y se hizo una sugerencia sobre qué residuos sustituir y evaluar en variantes humanizadas. Se propusieron tres cadenas humanizadas para la cadena ligera; una usando el aceptor VK3-L6 y dos con el aceptor VK6-A26 donde uno tenía posiciones contribuyentes adicionales retenidas de la secuencia parental (mutaciones inversas). Se propusieron dos cadenas humanizadas para la cadena pesada; una usando cada aceptor seleccionado. El injerto VH7-7-4.1 es el más conservador; véase la tabla 6.

Tabla 6 Cadenas humanizadas

La prim era generación de 6 anticuerpos hum anizados no logró m antener las propiedades funcionales de A24 Basándonos en los métodos descritos en la sección anterior, primero diseñamos 3 variantes de cadena ligera humanizada de A24, (en lo sucesivo denominadas VL1, VL2 y VL3) y 2 variantes de cadena pesada humanizada de A24 (en lo sucesivo denominadas VH1 y VH2). Denominamos VH0 y VL0 a las correspondientes VH y VL de A24. Generamos los siguientes 6 anticuerpos humanizados con la siguiente combinación de VH y VL humanizadas e isotipo IgG1 humano:

INA01 Anticuerpo humanizado variante 1: VH1/VL1

INA01 Anticuerpo humanizado variante 2: VH2/VL1

INA01 Anticuerpo humanizado variante 3: VH1/VL2

INA01 Anticuerpo humanizado variante 4: VH2/VL2

INA01 Anticuerpo humanizado variante 5: VH1/VL3

INA01 Anticuerpo humanizado variante 6: VH2/VL3

Analizamos estos 6 anticuerpos humanizados para determinar la inducción de la apoptosis de células HL-60 de acuerdo con el ensayo descrito anteriormente y comparamos dicha propiedad de inducir apoptosis con la de la forma quimérica del anticuerpo murino de referencia A24 (VH0/VL0) con el mismo isotipo IgG1 humano. Los resultados se muestran en la Figura 1.

Como se muestra en la Figura 1, encontramos sorprendentemente que todos los anticuerpos humanizados de prueba habían perdido sus propiedades de unión. Esto es particularmente sorprendente considerando el hecho de que, algunas de las variantes tenían las 6 CDR en común con su anticuerpo a 24 murino parental.

Generación de 5 anticuerpos humanizados nuevos

A continuación diseñamos una nueva cadena pesada (VH3) y generamos los siguientes anticuerpos humanizados:

INA01 Anticuerpo humanizado variante 7: VH0/VL1

INA01 Anticuerpo humanizado variante 8: VH3/VL1

INA01 Anticuerpo humanizado variante 9: VH3/VL2

INA01 Anticuerpo humanizado variante 10: VH3/VL3

INA01 Anticuerpo humanizado variante 11: VH3A/L0

De nuevo, probamos estos anticuerpos humanizados para determinar su capacidad para inducir apoptosis basándose en el ensayo de inducción de la apoptosis de HL-60 como se ha descrito anteriormente en comparación con el INA01 quimérico correspondiente a un anticuerpo con regiones variables A24 murinas parentales e isotipo IgG1 humano. Los resultados se muestran en la Figura 2.

Como se muestra en la Figura 2, los anticuerpos humanizados han perdido de nuevo al menos parcialmente sus propiedades de inducir apoptosis.

Generación de 6 anticuerpos humanizados nuevos

Basándonos en los resultados obtenidos con los 3 nuevos anticuerpos anteriores, diseñamos otra vez 3 nuevas cadenas ligeras y 2 nuevas cadenas pesadas.

En particular, usamos el análisis in silico para predecir cambios de aminoácidos (ya sea en el marco o en las regiones CDR) que reducen la inmunogenicidad mientras mantienen las propiedades ventajosas del anticuerpo parental A24. En el análisis actual, se utilizó iTope™ para analizar las secuencias derivadas de A24 en busca de ligantes promiscuos de alta afinidad para el CMH de clase II humano. Se cree que los péptidos promiscuos de unión al CMH de clase II de alta afinidad se correlacionan con la presencia de epítopos de linfocitos T (Hill et al 2003. (2003) 1:R40-R48) aunque los ligantes de afinidad media y baja también pueden desencadenar respuestas de linfocitos T. Por tanto, iTope™ se utilizó para proporcionar un filtro útil de "baja resolución" inicial para la ubicación de los epítopos de linfocitos T potenciales. Además, las secuencias se analizaron mediante la búsqueda TCED™ BLAST para localizar cualquier epítopo de linfocitos T previamente identificado mediante el análisis EpiScreen™ de otra secuencia de proteínas. Como se muestra en la Tabla 7; el análisis in silico iTope ™ reveló que las sustituciones de aminoácidos L53R y/o S55T en LCDR2 pueden reducir la inmunogenicidad.

Tabla 7

Por consiguiente, decidimos probar 3 cadenas ligeras nuevas, una (VL4) que incluye 2 sustituciones de aminoácidos en LCDR2 en comparación con LCDR2 de A24, una (VL5) que incluye solo una sustitución de aminoácidos en LCDR2 y una (VL6) que tiene LCDR2 idéntica en comparación con A24.

Los siguientes 6 anticuerpos humanizados nuevos se generaron usando la región constante de isotipo IgG1.

INA01 variante 12 VH4/VL4

INA01 variante 13 VH5/VL4

INA01 variante 14 VH4/VL5

INA01 variante 15 VH5/VL5

INA01 variante 16 VH4/VL6

INA01 variante 17 VH5/VL6

La Figura 5a muestra la alineación de VL4, VL5, VL6 con VL del anticuerpo A24.

La Figura 5b muestra la alineación de VH4 y VH5 con VH del anticuerpo A24.

Probamos estos anticuerpos humanizados para determinar su capacidad para inducir apoptosis basándonos en el ensayo de apoptosis de HL-60 a las 72h como se ha descrito anteriormente y en comparación con el INA01 quimérico correspondiente a un anticuerpo con regiones variables de A24 murino parental e isotipo IgG1 humano. Los resultados se muestran en la Figura 3.

Como se muestra en la Figura 3, los 6 nuevos anticuerpos humanizados probados tienen ahora propiedades similares o incluso superiores en comparación con el INA01 quimérico correspondiente a un anticuerpo con regiones variables de A24 murino parental e isotipo IgG1 humano.

En particular, la variante 12 y la variante 13 de los anticuerpos con 2 sustituciones de aminoácidos en LCDR2 mostraron ahora sorprendentemente propiedades de inducción superiores en comparación con el anticuerpo INA01 quimérico parental.

Conversión en IgG

Para expresar la IgG de longitud completa, los fragmentos de dominio variable de las cadenas pesada (Vh) y ligera (Vl) de las cuatro variantes candidatas principales 12, 14, 15 y 17 se subclonaron a partir de vectores de expresión de Fab en vectores de expresión apropiados para IgG4 humana, IgG1 humana de tipo silvestre, IgG1L234AL235A humana e IgG1N297A humana, denominándose dicha IgG1 L234AL235A humana en el presente documento "AA", dando como resultado vectores de expresión para la producción de los 16 anticuerpos de acuerdo con la divulgación, mAb1-mAb16 como se describe en la Tabla 8 a continuación:

T l D ri i n l r i n ri l l r i n F I mA 1-mA 1

Expresión transitoria y purificación de la IgG humana

Las células se transfectaron con ADN del vector de expresión que codifica las cadenas pesadas y ligeras de las IgG mAb1 a mAb16.

Los resultados se muestran en la Figura 4. Los resultados revelaron que los anticuerpos producidos con el isotipo IgG4 se producen con un mejor rendimiento en comparación con otro isotipo, IgG1 y mutante silencioso de IgG1. Datos del p e rfil relacionados con mAb1

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo anti-receptor de la transferrina (anti-TfR) humanizado aislado o una proteína con una porción de unión al antígeno de un anticuerpo anti-TfR humanizado, que comprende o,

(e) un polipéptido de cadena pesada variable que comprende VH de la SEQ ID NO:12 y un polipéptido de cadena ligera variable que comprende VL de la SEQ ID NO:13; o,

(f) un polipéptido de cadena pesada variable que comprende VH de la SEQ ID NO:12 y un polipéptido de cadena ligera variable que comprende VL de la SEQ ID NO:14;

en donde dicho anticuerpo anti-TfR o proteína se une específicamente al receptor de la transferrina (TfR) de la SEQ ID NO:16.

2. El anticuerpo anti-TfR humanizado aislado o proteína de la reivindicación 1, en donde dicho anticuerpo o proteína se une al receptor de la transferrina con una Kd de 10 nM o menos, preferentemente con una Kd de 1 nM o menos.

3. El anticuerpo anti-TfR humanizado aislado o proteína de la reivindicación 1 o 2, en donde dicho anticuerpo o proteína induce la apoptosis de la línea celular HL-60 a un nivel igual o superior al nivel de inducción del correspondiente anticuerpo quimérico de referencia que tiene VH de la SEQ ID NO:9 y VL de la SEQ ID NO:10.

4. El anticuerpo anti-TfR humanizado aislado o proteína de acuerdo con la reivindicación 1,2 o 3, que comprende una región constante de isotipo IgG4 humana, o una región constante mutante o modificada químicamente, en donde dicha región constante mutante o modificada químicamente no confiere o confiere una actividad reducida de ADCC a dicho anticuerpo cuando se compara con un anticuerpo correspondiente con la región constante de isotipo IgG1 de tipo silvestre.

5. El anticuerpo anti-TfR humanizado aislado o proteína de acuerdo con la reivindicación 1,2 o 3, que comprende una región constante de isotipo IgG1 humana, o una región constante mutante o modificada químicamente, en donde dicha región constante mutante o modificada químicamente confiere una mayor actividad de ADCC a dicho anticuerpo en comparación con un anticuerpo correspondiente con región constante de isotipo IgG1 de tipo silvestre.

6. El anticuerpo anti-TfR humanizado aislado o proteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que es mAb1 que comprende la cadena pesada de la reivindicación de la SEQ ID NO:18 y la cadena ligera de la SEQ ID NO:17.

7. El anticuerpo anti-TfR humanizado aislado o proteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, para su uso (i) como un medicamento, o (ii) como diagnóstico.

8. El anticuerpo anti-TfR humanizado aislado o proteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, para su uso en el tratamiento de un tumor, por ejemplo un tumor hematológico, y más específicamente un linfoma o leucemia.

9. El anticuerpo anti-TfR humanizado aislado o proteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, para su uso en el tratamiento de un tumor sólido o de la enfermedad de injerto contra hospedador.

10. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo anti-TfR humanizado o proteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en combinación con uno o más excipientes, diluyentes o vehículos farmacéuticamente aceptables, comprendiendo opcionalmente otros principios activos.

11. Una formulación liofilizada, una jeringa precargada o un vial que comprende un anticuerpo anti-TfR humanizado o proteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6.

12. Un anticuerpo anti-TfR humanizado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, conjugado a una fracción terapéutica, por ejemplo, una citotoxina, un fármaco o una radiotoxina.

13. Un vector de clonación o expresión para la producción recombinante de un anticuerpo anti-TfR humanizado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 en una célula hospedadora, que comprende al menos un ácido nucleico que codifica dicho anticuerpo anti-TfR.

14. Un vector de clonación o expresión de acuerdo con la reivindicación 13, que comprende al menos uno de los ácidos nucleicos que codifican mAb1 como se define en la reivindicación 6.

15. Una célula hospedadora que comprende un vector de clonación o expresión de acuerdo con la reivindicación 13 o 14.

16. Un proceso para la producción de un anticuerpo anti-TfR humanizado o una proteína de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, que comprende: (i) cultivar la célula hospedadora de la reivindicación 15 para la expresión de dicho anticuerpo o proteína por la célula hospedadora; opcionalmente (ii) purificar dicho anticuerpo o proteína; y, (iii) recuperar dicho anticuerpo o proteína.