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ES2856838T3 - Métodos de cultivo semicontinuo - Google Patents

Métodos de cultivo semicontinuo Download PDF

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ES2856838T3 ES15850279T ES15850279T ES2856838T3 ES 2856838 T3 ES2856838 T3 ES 2856838T3 ES 15850279 T ES15850279 T ES 15850279T ES 15850279 T ES15850279 T ES 15850279T ES 2856838 T3 ES2856838 T3 ES 2856838T3
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Michael Milway
Kevin Berryman
Mercia Valentine
Roberto E Armenta
Laura Purdue
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Abstract

Un método de cultivo de un microorganismo Traustoquítrido que comprende las etapas de (a) crecer, usando un método por lote alimentado, uno o más microorganismos en un medio que comprende una primera relación de carbono a nitrógeno de 30:1 a 60:1 en un recipiente; (b) cultivar los microorganismos hasta que el cultivo alcance un indicador umbral, en donde el indicador umbral es la concentración de nutriente en el medio de cultivo, en donde el nutriente es carbono y en donde la concentración de carbono se reduce a cero o casi cero; (c) recoger una porción del cultivo mientras se mantiene la mayor parte del cultivo en el recipiente, en donde la porción recolectada comprende del 5 % al 20 % del cultivo; y (d) añadir medio fresco que comprende una segunda relación de carbono a nitrógeno de 70:1 a 95:1 al recipiente que comprende la mayoría del cultivo que comprende los microorganismos, en donde el medio fresco comprende carbono y nitrógeno.

Description

DESCRIPCIÓN
Métodos de cultivo semicontinuo
Antecedentes
Las fermentaciones heterótrofas de microorganismos que incluyen especies de Traustoquítridos son vías eficientes para generar productos de aceite y biomasa de alto valor. En determinadas condiciones de cultivo, los microorganismos sintetizan aceite intracelular, que puede extraerse y usarse para producir biocombustible (biodiesel, bio-combustible para aviones, y similares) y lípidos nutricionales (ácidos grasos poliinsaturados, por ejemplo, DHA, EPA, DPA). La biomasa de microorganismos tales como especies de Traustoquítridos también es de gran valor nutricional debido al alto contenido de PUFA y proteínas y puede usarse como suplemento nutricional para la alimentación animal.
Los procesos de fermentación de microorganismos se llevan a cabo principalmente en procesos por lotes o por lotes alimentados (en inglés “fed-batch”). Los procesos por lotes típicamente implican un cultivo de sistema cerrado en el cual las células se cultivan en un volumen fijo de medio de cultivo de nutrientes en condiciones específicas (por ejemplo, nutrientes, temperatura, presión, y similares) a una cierta densidad en un fermentador, se cosechan y se procesan como un lote. En procesos típicos por lotes alimentados, uno o más nutrientes son alimentados o suministrados a un fermentador, en el que permanecen hasta el final del proceso de cultivo. Los procesos de cultivo por lotes alimentados pueden ser superiores a los procesos de cultivo por lotes cuando el control de las concentraciones de un nutriente (o nutrientes) afecta al rendimiento o la actividad de un producto deseado. Tales procesos de fermentación se componen típicamente por dos fases de cultivo, una fase de proliferación celular, durante la cual todos los nutrientes necesarios están disponibles para un crecimiento de cultivo ilimitado, seguido de una fase de acumulación de aceite, durante la cual un nutriente clave para el crecimiento (típicamente nitrógeno) se limita intencionalmente en el medio mientras se proporciona un exceso de nutrientes de carbono y se canaliza hacia la síntesis de aceite. Cuando se alcanza la concentración de células y el contenido de aceite diana, se detiene el proceso de fermentación y se recolecta biomasa rica en aceite. A continuación debe limpiarse el recipiente del fermentador, esterilizarse y volver a cargarse por lotes con medio fresco, y un tren de semillas debe estar listo para inocular nuevamente el recipiente de producción (por ejemplo, una operación de "cambio" entre fermentaciones por lotes/por lotes alimentados). Una operación de cambio de este tipo a menudo consume tiempo y energía y limita el total de horas de funcionamiento disponibles del recipiente de producción para un proceso de producción establecido. Como alternativa, los microorganismos pueden cultivarse usando métodos continuos donde se añade continuamente medio fresco al fermentador, mientras que el líquido de cultivo se retira continuamente para mantener constante el volumen de cultivo. Pueden usarse procesos de cultivo continuo para mantener el microorganismo a una tasa de crecimiento específica o en un estado fisiológico estable, pero pueden ser difíciles de mantener sin interrupciones y normalmente se usan con fines de investigación, ya que los cultivos por lotes alimentados o por lotes tienden a proporcionar mejores resultados (por ejemplo, mayor rendimiento de aceite) y son más fáciles de usar para fines de producción a gran escala.
Breve resumen
En el presente documento se proporcionan métodos optimizados como se define en las reivindicaciones de cultivo de un microorganismo y métodos para producir aceite y promover la productividad prolongada de la biomasa usando un proceso semicontinuo. Los métodos incluyen proporcionar un recipiente que comprende uno o más microorganismos en un medio que comprende una primera relación de carbono a nitrógeno, cultivar los microorganismos hasta que el cultivo alcance un indicador de umbral, recolectar una parte del cultivo mientras se mantiene la mayor parte del cultivo en el recipiente y añadir medio fresco que comprende una segunda relación de carbono a nitrógeno al recipiente que comprende la mayor parte del cultivo que comprende los microorganismos.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 es un gráfico que ilustra una curva de crecimiento microbiana típica en forma de S. La productividad instantánea de biomasa/aceite está en su nivel más alto más adelante en el proceso, pero antes de que el cultivo alcance la fase estacionaria, que puede indicarse por la pendiente más pronunciada en la curva S.
La Figura 2 es un gráfico que muestra la biomasa global (■) y la productividad del aceite (A) de ONC-T18 cultivado en condiciones semicontinuas. Los altos valores de productividad mostrados en la Figura 2 superaron con creces el valor alcanzable en un proceso típico por lotes o por lotes alimentados.
La Figura 3 es un gráfico que muestra los efectos de los métodos de fermentación continua en ONC-T18. La fermentación continua resultó en una fermentación insostenible, una disminución de la biomasa y un aumento de la concentración de glucosa en el efluente. La fermentación se detuvo debido a la obstrucción de la línea.
La Figura 4 es un gráfico que muestra la biomasa global (■) y la productividad del aceite (A) de ONC-T18 cultivado en condiciones continuas. La fermentación continua resultó en una fermentación insostenible y una biomasa y productividad del aceite reducidas.
La Figura 5 es un gráfico que muestra la productividad de la biomasa de ONC-T18 cultivado en fermentación semicontinua y continua. La fermentación semicontinua resultó en una productividad de biomasa prolongada. La Figura 6 es un gráfico que muestra la productividad de biomasa instantánea (determinada en los puntos de tiempo dados) de ONC-T18 cultivado en condiciones de fermentación continua y semicontinua.
La Figura 7 es un gráfico que muestra la productividad de aceite instantánea (determinada en los puntos de tiempo dados) de ONC-T18 cultivado en condiciones de fermentación continua y semicontinua.
Descripción detallada
Los métodos de cultivo de microorganismos y los métodos de producción de aceite mediante un proceso semicontinuo se proporcionan en el presente documento como se define en las reivindicaciones. Los métodos dan como resultado una biomasa volumétrica global y una productividad de aceite más altas en comparación con los procesos típicos por lotes, continuos y por lotes alimentados. Resumiendo, los microorganismos se proporcionan en un cultivo inicial (por ejemplo, cultivo de semillas) y se cultivan mediante un proceso de fermentación por lotes alimentados hasta un cierto parámetro umbral, por ejemplo, alta concentración celular y/o alto contenido de aceite, momento en el cual la fuente de nitrógeno se limita o se agota en el medio, la fuente de carbono es cero o cercana a cero y la productividad de biomasa/aceite está dentro de su intervalo máximo para el microorganismo dado. Se recolecta un cierto volumen del caldo de cultivo (por ejemplo, el 10 % del volumen de trabajo) y se añade al fermentador el mismo volumen de medio fresco que contiene una concentración predefinida de nutrientes de carbono y nitrógeno, así como todos los demás nutrientes minerales necesarios. La relación de carbono y nitrógeno usada en el medio de alimentación es para obtener y mantener un alto contenido de aceite en el cultivo. El cultivo continúa con el cultivo desarrollando biomasa y aceite adicionales usando el medio recién proporcionado. El cultivo se hace crecer hasta que se alcanza un parámetro de umbral, es decir, la concentración de carbono se reduce a cero o casi cero, y se repite el ciclo de recolección parcial de caldo y suministro de medio fresco. Usando un proceso tal, La biomasa de alta densidad que contiene un alto contenido de aceite puede producirse y recolectarse de manera semicontinua y la duración total del proceso es mucho más larga que cualquier cultivo de tales microorganismos en modo por lotes o por lotes alimentados. La recolección semicontinua de biomasa de alta densidad con alto contenido de aceite reduce significativamente el tiempo de respuesta del fermentador, minimiza la necesidad de un procedimiento de reposición de recipientes fermentadores y un procedimiento de esterilización, lo que reduce el coste de operación y puede resultar en una productividad volumétrica general muy alta de biomasa y aceite, superando con creces lo que puede lograrse con métodos de fermentación por lotes, continua o por lotes alimentados.
Microorganismos
Los métodos descritos en el presente documento incluyen la extracción de lípidos de una población de microorganismos. Los microorganismos descritos en el presente documento son Traustoquítridos del orden Thraustochytriales, más específicamente Thraustochytriales del género Thraustochytrium. Opcionalmente, la población de microorganismos incluye Thraustochytriales como se describe en las Patentes de EE.Uu . N.° 5.340.594 y 5.340.742. El microorganismo puede ser una especie de Thraustochytrium, tales como las especies de Thraustochytrium depositadas como N.° de registro de ATCC PTA-6245 (es decir, ONC-T18) como se describe en la Patente de EE.UU. N.° 8.163.515. Por lo tanto, el microorganismo puede tener una secuencia de ARNr 18S que es al menos el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 %, el 99,1 %, el 99,2 %, el 99,3 %, el 99,4 %, el 99,5 %, el 99,6 %, el 99,7 %, el 99,8 %, el 99,9 % o más (por ejemplo, incluyendo el 100 %) idéntica a SEQ ID NO:1.
Los microorganismos para su uso en los métodos descritos en el presente documento pueden producir una diversidad de compuestos lipídicos. Como se usa en el presente documento, el término lípido incluye fosfolípidos, ácidos grasos libres, ésteres de ácidos grasos, triacilgliceroles, esteroles y ésteres de esteroles, carotenoides, xantofilas (por ejemplo, oxicarotenoides), hidrocarburos y otros lípidos conocidos por un experto habitual en la materia. Opcionalmente, los compuestos lipídicos incluyen lípidos insaturados. Los lípidos insaturados pueden incluir lípidos poliinsaturados (es decir, lípidos que contienen al menos 2 enlaces carbono-carbono insaturados, por ejemplo, dobles enlaces) o lípidos altamente insaturados (es decir, lípidos que contienen 4 o más enlaces carbono-carbono insaturados). Algunos ejemplos de lípidos insaturados incluyen ácidos grasos poliinsaturados omega-3 y/u omega-6, tales como ácido docosahexaenoico (es decir, DHA), ácido eicosapentaenoico (es decir, EPA) y otros compuestos insaturados, poliinsaturados y altamente insaturados de origen natural.
Procesos
En el presente documento se proporciona un método de cultivo de un microorganismo. El método incluye proporcionar un recipiente de uno o más microorganismos en un medio, que tiene una primera relación de carbono a nitrógeno; cultivar los microorganismos hasta que el cultivo alcance un indicador de umbral; recolectar una porción del cultivo mientras se mantiene la mayor parte del cultivo en el recipiente; y añadir medio fresco que tiene una segunda relación de carbono a nitrógeno al recipiente que contiene la mayor parte del cultivo con los microorganismos.
Los métodos son aplicables tanto a la fermentación a gran escala como a la fermentación a pequeña escala. La fermentación a gran escala, como se usa en el presente documento, se refiere a la fermentación en un fermentador que tiene al menos aproximadamente 1000 l de capacidad volumétrica (es decir, volumen de trabajo), dejando suficiente hueco para el espacio de cabeza. La fermentación a pequeña escala se refiere generalmente a la fermentación en un fermentador que generalmente no tiene más de aproximadamente 100 l de capacidad volumétrica, tales como 5 l, 10 l, 50 l o 100 l. Una ventaja demostrada del presente proceso de fermentación por lotes alimentados es que puede utilizarse para la producción de aceite en la escala del fermentador de 5-10 l y es escalable a cualquier volumen, por ejemplo, 100 l, 150 l, 250 l, 500 l, 1000 l o más, sin limitación.
Como se discutió a lo largo de todo el documento, se proporciona en el presente documento un método para cultivar un microorganismo que incluye proporcionar un recipiente con uno o más microorganismos en un medio que comprende una primera relación de carbono a nitrógeno. Normalmente, los medios incluyen fuentes de carbono en una concentración de aproximadamente 5 g/l a aproximadamente 200 g/l y tienen una relación molar C:N (carbono a nitrógeno) entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 40:1. En los métodos proporcionados, la primera relación molar de carbono a nitrógeno es de 30:1 a 60:1. Opcionalmente, la primera relación molar de carbono a nitrógeno es de 40:1 a 50:1. Como se analiza con mayor detalle a lo largo de todo el documento, las fuentes de carbono incluyen, pero no se limitan a, ácidos grasos, lípidos, gliceroles, trigliceroles, carbohidratos, polioles y aminoazúcares. Opcionalmente, la fuente de carbono es glucosa, fructosa o glicerol. Como se analiza con mayor detalle a lo largo de todo el documento, las fuentes de nitrógeno incluyen, pero no se limitan a, soluciones de amonio, amonio o sales de amina, peptona, triptona, extracto de levadura, extracto de malta, harina de pescado, glutamato sódico, extracto de soja, casaminoácidos y granos destiladores. Opcionalmente, la fuente de nitrógeno es sulfato de amonio.
Los métodos proporcionados incluyen cultivar los microorganismos hasta que el cultivo alcanza un indicador de umbral como se define en las reivindicaciones. Como se usa en el presente documento, el término parámetro se refiere a un indicador o variable que se usa para monitorizar y controlar el progreso de un cultivo de microorganismos. Dichos parámetros incluyen, pero no se limitan a, densidad óptica (DO), concentración celular, tasa de producción de dióxido de carbono, pH, oxígeno disuelto (OD), tiempo, concentración de nutriente en medio de cultivo, acumulación de subproductos metabólicos, temperatura, productividad de biomasa y productividad de aceite. Se contempla el uso de cualquier parámetro o combinación de parámetros adecuados como lo entendería una persona experta habitual en la materia y basándose en la orientación proporcionada en el presente documento. En el método de la invención, el parámetro es una concentración de nutriente o nutrientes en el medio de cultivo. El nutriente medido en el medio de cultivo es carbono.
Los métodos proporcionados incluyen recolectar una parte del cultivo mientras se mantiene la mayor parte del cultivo en el recipiente. En los métodos, la porción recolectada comprende de aproximadamente el 5 a aproximadamente el 20 % del cultivo. Opcionalmente, la porción recolectada comprende aproximadamente el 10 % del cultivo.
Los métodos proporcionados también incluyen la adición de medio fresco que comprende una segunda relación de carbono a nitrógeno al recipiente que comprende la mayoría del cultivo con los microorganismos. Como se usa en el presente documento, el término mayoría significa que el 50 % o más del cultivo que comprende los microorganismos permanece en el recipiente mientras se recoge la porción restante del cultivo. En los métodos proporcionados, la segunda relación carbono-nitrógeno es más alta que la primera relación carbono-nitrógeno. La segunda relación de carbono a nitrógeno varía de aproximadamente 70:1 a aproximadamente 95:1. Opcionalmente, la segunda relación de carbono a nitrógeno es de aproximadamente 80:1 a aproximadamente 90:1. Como se analiza con mayor detalle a lo largo de todo el documento, las fuentes de carbono incluyen, pero no se limitan a, ácidos grasos, lípidos, gliceroles, trigliceroles, carbohidratos, polioles y aminoazúcares. Opcionalmente, la fuente de carbono es glucosa, fructosa o glicerol. Como se analiza con mayor detalle a lo largo de todo el documento, las fuentes de nitrógeno incluyen, pero no se limitan a, soluciones de amonio, amonio o sales de amina, peptona, triptona, extracto de levadura, extracto de malta, harina de pescado, glutamato sódico, extracto de soja, casaminoácidos y granos destiladores. Opcionalmente, la fuente de nitrógeno es sulfato de amonio.
Los métodos proporcionados incluyen opcionalmente repetir las etapas de (i) cultivar los microorganismos hasta que el cultivo alcanza un indicador de umbral; (ii) recolectar una porción del cultivo mientras se mantiene la mayor parte del cultivo en el recipiente; y (iii) añadir medio fresco con la segunda relación de carbono a nitrógeno al recipiente que comprende la mayor parte del cultivo que comprende los microorganismos. De esta manera, los métodos proporcionados permiten ventajosamente que el cultivo se mantenga durante un período de tiempo más largo durante el cual el cultivo mantiene un alto nivel de biomasa y/o productividad de aceite. Opcionalmente, el cultivo se mantiene durante un período de horas, días, semanas o meses. Opcionalmente, el cultivo se mantiene durante al menos 150 a 500 horas. Por ejemplo, el cultivo puede mantenerse durante al menos 250 horas. Opcionalmente, el cultivo se mantiene durante una, dos, tres, cuatro o cinco semanas.
Los métodos proporcionados permiten que el cultivo se mantenga a un alto nivel de productividad de biomasa. Como se usa en el presente documento, la expresión "alto nivel de productividad de la biomasa" se refiere a un nivel que es más alto que la productividad promedio de la biomasa para un microorganismo dado. Normalmente, los niveles de productividad promedio tienden a estar en el intervalo de 40 g/l-d o menos, es decir, de 0 g/l-d a aproximadamente 40 g/l-d pero puede variar dependiendo del microorganismo. Opcionalmente, la productividad de la biomasa comprende de 60 g/l-d a 180 g/l-d. Opcionalmente, la productividad de la biomasa comprende de 80 g/l-d a 130 g/l-d. Opcionalmente, la productividad de la biomasa comprende de 90 g/l-d a 100 g/l-d.
Los métodos proporcionados también permiten que el cultivo se mantenga a un alto nivel de productividad de aceite. Como se usa en el presente documento, la expresión "alto nivel de productividad de aceite" se refiere a un nivel que es más alto que la productividad promedio de aceite para un microorganismo dado. Normalmente, los niveles de productividad promedio tienden a estar en el intervalo de 25 g/l-d o menos, es decir, de 0 g/l-d a aproximadamente 25 g/l-d pero puede variar dependiendo del microorganismo. Opcionalmente, la productividad del aceite comprende de 35 g/l-d a 130 g/l-d. Opcionalmente, la productividad del aceite comprende de 60 g/l-d a 90 g/l-d. Opcionalmente, la productividad del aceite comprende de 70 g/l-d a 80 g/l-d. Por lo tanto, por ejemplo, el cultivo de microorganismos comprende una biomasa que comprende del 60 % al 85 % de aceite. Opcionalmente, el cultivo de microorganismos comprende una biomasa que comprende del 65 % al 75 % de aceite.
Los términos alto, más alto, aumenta, elevar o elevación se refieren a aumentos por encima de un control. Los términos bajo, más bajo, reduce o reducción se refiere a cualquier disminución por debajo de los niveles de control. A modo de ejemplo, los niveles de control son los niveles de biomasa y/o productividad de aceite cultivados en condiciones por lotes, por lotes alimentados o continuas. Los métodos proporcionados proporcionan niveles de productividad de biomasa y/o aceite que son más altos que los niveles cuando los mismos microorganismos se cultivan utilizando un proceso diferente, por ejemplo, un proceso discontinuo, por lotes alimentados o continuo. Pueden determinarse los niveles de productividad de la biomasa, por ejemplo, suponiendo que se incluya un tiempo de respuesta de 24 horas en el tiempo total del proceso, la productividad total de la biomasa (X) en cualquier momento dado del proceso puede calcularse como: X (gramos) / Volumen de cultivo (litros) / Tiempo (hora) x 24 (horas/día) siendo la unidad final g/l-día. La productividad global del en cualquier momento dado puede calcularse de manera similar como: Aceite (gramos)/Volumen de cultivo (litros)/Tiempo (hora) x 24 (horas/día).
Fermentación
Los métodos proporcionados incluyen o pueden usarse junto con etapas adicionales para cultivar microorganismos de acuerdo con métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, un Traustoquítrido, por ejemplo, un Thraustochytrium sp., puede cultivarse de acuerdo con los métodos descritos en las publicaciones de patente de EE.UU. 2009/0117194 o US 2012/0244584. Los microorganismos se cultivan en un medio de crecimiento (también conocido como "medio de cultivo"). Cualquiera de una diversidad de medios puede ser adecuado para su uso en el cultivo de los microorganismos descritos en el presente documento. Opcionalmente, el medio suministra diversos componentes nutricionales, incluyendo una fuente de carbono y una fuente de nitrógeno, para el microorganismo.
El medio para el cultivo de Traustoquítridos puede incluir cualquiera de una diversidad de fuentes de carbono. Algunos ejemplos de fuentes de carbono incluyen ácidos grasos, lípidos, gliceroles, trigliceroles, carbohidratos, polioles, aminoazúcares y cualquier clase de biomasa o flujo de desechos. Los ácidos grasos incluyen, por ejemplo, ácido oleico. Los carbohidratos incluyen, pero no se limitan a, glucosa, celulosa, hemicelulosa, fructosa, dextrosa, xilosa, lactulosa, galactosa, maltotriosa, maltosa, lactosa, glucógeno, gelatina, almidón (maíz o trigo), acetato, m-inositol (por ejemplo, derivado de extracto soluble de maíz), ácido galacturónico (por ejemplo, derivado de pectina), L-fucosa (por ejemplo, derivada de galactosa), gentiobiosia, glucosamina, alfa-D-glucosa-1-fosfato(por ejemplo, derivado de glucosa), celobiosa, dextrina, alfa-ciclodextrina (por ejemplo, derivada de almidón) y sacarosa (por ejemplo, de melazas). Los polioles incluyen, pero no se limitan a, maltitol, eritritol y adonitol. Los aminoazúcares incluyen, pero no se limitan a, N-acetil-D-galactosamina, N-acetil-D-glucosamina y N-acetil-beta-D-manosamina. Opcionalmente, la fuente de carbono es glucosa. Como se ha indicado anteriormente, en los métodos proporcionados, la fuente de carbono se proporciona en una alta concentración, por ejemplo, al menos 200 g/l.
Opcionalmente, los microorganismos descritos en el presente documento se cultivan en condiciones que aumentan la biomasa y/o la producción de un compuesto de interés (por ejemplo, contenido de aceite o ácidos grasos totales (TFA)). Los traustoquítridos, por ejemplo, se cultivan generalmente en medio salino. Opcionalmente, los traustoquítridos pueden cultivarse en un medio que tiene una concentración de sal de aproximadamente 0,5 g/l a aproximadamente 50,0 g/l. Opcionalmente, los traustoquítridos se cultivan en un medio que tiene una concentración de sal de aproximadamente 0,5 g/l a aproximadamente 35 g/l (por ejemplo, de aproximadamente 18 g/l a aproximadamente 35 g/l). Opcionalmente, los traustoquítridos descritos en el presente documento pueden crecer en condiciones bajas en sal. Por ejemplo, los traustoquítridos pueden cultivarse en un medio que tiene una concentración de sal de aproximadamente 0,5 g/l a aproximadamente 20 g/l (por ejemplo, de aproximadamente 0,5 g/l a aproximadamente 15 g/l). El medio de cultivo opcionalmente incluye NaCl. Opcionalmente, el medio incluye sal marina natural o artificial y/o agua de mar artificial.
El medio de cultivo puede incluir sales de sodio que no contienen cloruro como fuente de sodio. Los ejemplos de sales de sodio sin cloruro adecuadas para su uso de acuerdo con los presentes métodos incluyen, pero no se limitan a, ceniza de sosa (una mezcla de carbonato sódico y óxido sódico), carbonato sódico, bicarbonato sódico, sulfato sódico y mezclas de los mismos. Véanse, por ejemplo, las Pat. de EE.UU. N.° 5.340.742 y 6.607.900. Una parte significativa del sodio total, por ejemplo, puede suministrarse por sales sin cloruro de manera que menos de aproximadamente el 100 %, el 75 %, el 50 % o el 25 % del sodio total en medio de cultivo se suministra por cloruro sódico.
Opcionalmente, el medio de cultivo tiene concentraciones de cloruro de menos de aproximadamente 3 g/l, 500 mg/l, 25o mg/l o 120 mg/l. Por ejemplo, el medio de cultivo para su uso en los métodos proporcionados puede tener concentraciones de cloruro de entre e incluyendo aproximadamente 60 mg/l y 120 mg/l.
El medio para el cultivo de Traustoquítridos puede incluir cualquiera de una diversidad de fuentes de nitrógeno. Las fuentes de nitrógeno de ejemplo incluyen soluciones de amonio (por ejemplo, NH4 en H2O), sales de amonio o amina (por ejemplo, (NH4)2SO4, (NH4)3PO4, NH4NO3, NH4OOCH2CH3 (NH4Ac)), peptona, triptona, extracto de levadura, extracto de malta, harina de pescado, glutamato sódico, extracto de soja, casaminoácidos y granos destiladores. Las concentraciones de fuentes de nitrógeno en un medio adecuado generalmente varían entre e incluyen aproximadamente 1 g/l y aproximadamente 25 g/l.
El medio incluye opcionalmente un fosfato, tales como fosfato potásico o fosfato sódico. Las sales inorgánicas y los nutrientes traza en el medio pueden incluir sulfato de amonio, bicarbonato sódico, ortovanadato sódico, cromato potásico, molibdato sódico, ácido selenoso, sulfato de níquel, sulfato de cobre, sulfato de cinc, cloruro de cobalto, cloruro de hierro, cloruro de manganeso, cloruro cálcico y EDTA. Pueden incluirse vitaminas tales como clorhidrato de piridoxina, clorhidrato de tiamina, pantotenato cálcico, ácido p-aminobenzoico, riboflavina, ácido nicotínico, biotina, ácido fólico y vitamina B12.
El pH del medio puede ajustarse entre e incluyendo 3,0 y 10,0 usando ácido o base, cuando sea apropiado, y/o usando la fuente de nitrógeno. Opcionalmente, el medio se ajusta a un pH bajo como se define anteriormente. El medio puede esterilizarse.
Generalmente un medio usado para el cultivo de un microorganismo es un medio líquido. Sin embargo, el medio usado para el cultivo de un microorganismo puede ser un medio sólido. Además de las fuentes de carbono y nitrógeno como se analiza en el presente documento, un medio sólido puede contener uno o más componentes (por ejemplo, agar o agarosa) que proporcionen soporte estructural y/o permitan que el medio esté en forma sólida.
Las células pueden cultivarse durante un período de tiempo. Opcionalmente, las células se cultivan durante cualquiera de 1 día a 60 días. Opcionalmente, el cultivo se mantiene durante un período de horas, días, semanas o meses. Opcionalmente, el cultivo se mantiene durante al menos 150 a 500 horas. Opcionalmente, el cultivo se mantiene durante al menos 250 horas. Opcionalmente, el cultivo se mantiene durante una, dos, tres, cuatro o cinco semanas. El cultivo se lleva a cabo opcionalmente a temperaturas de aproximadamente 4 °C a aproximadamente 30 °C, por ejemplo, de aproximadamente 18 °C a aproximadamente 28 °C. El cultivo puede incluir cultivo de agitación por aireación, cultivo de agitación, cultivo estacionario, cultivo por lotes, cultivo semicontinuo, cultivo continuo, cultivo por lotes rodantes, cultivo por ondas o similares. El cultivo puede realizarse usando un fermentador de agitación convencional, un fermentador de columna de burbujas (cultivos por lotes o continuos), un fermentador de puente aéreo, un fermentador de ondas y similares.
Los cultivos pueden airearse mediante uno o más de una diversidad de métodos, incluyendo agitación. Opcionalmente, la agitación varía de aproximadamente 100 rpm a aproximadamente 1000 rpm, por ejemplo, de aproximadamente 350 rpm a aproximadamente 600 rpm o de aproximadamente 100 a aproximadamente 450 rpm. Opcionalmente, los cultivos se airean usando diferentes velocidades de agitación durante las fases de producción de biomasa y durante las fases de producción de lípidos. Como alternativa o adicionalmente, las velocidades de agitación pueden variar dependiendo del tipo de recipiente de cultivo (por ejemplo, la forma o el tamaño del matraz).
La producción de lípidos deseables puede potenciarse cultivando células de acuerdo con métodos que implican un cambio de una o más condiciones de cultivo para obtener cantidades más altas de compuestos deseables. Las células se cultivan primero en condiciones que maximizan la biomasa, seguido de un cambio de una o más condiciones de cultivo a condiciones que favorecen la productividad de los lípidos. La condición que se cambia de baja a alta es la relación C:N. Otras condiciones que pueden cambiarse incluyen adicionalmente concentración de oxígeno, temperatura y combinaciones de las mismas. Se realiza un cultivo en dos fases en el cual una primera fase favorece la producción de biomasa (por ejemplo, usando condiciones de alto contenido de oxígeno (por ejemplo, generalmente o en relación con la segunda fase), baja relación C:N y temperatura ambiente), seguido de una segunda fase que favorece la producción de lípidos (por ejemplo, en la cual se disminuye el oxígeno, se aumenta la relación C:N y se disminuye la temperatura, en comparación con la primera fase). A diferencia de los métodos descritos anteriormente, los métodos proporcionados permiten mantener el cultivo durante un tiempo prolongado en condiciones de altos niveles de producción de aceite o lípidos.
Pasteurización
Opcionalmente, la biomasa resultante se pasteuriza para inactivar las sustancias indeseables presentes en la biomasa. Por ejemplo, la biomasa puede pasteurizarse para inactivar sustancias degradadoras de compuestos. La biomasa puede estar presente en el medio de fermentación o aislada del medio de fermentación para la etapa de pasteurización. La etapa de pasteurización puede realizarse calentando la biomasa y/o el medio de fermentación a una temperatura elevada. Por ejemplo, la biomasa y/o el medio de fermentación pueden calentarse a una temperatura de aproximadamente 50 °C a aproximadamente 95 °C (por ejemplo, de aproximadamente 55 °C a aproximadamente 90 °C o de aproximadamente 65 °C a aproximadamente 80 °C). Opcionalmente, la biomasa y/o el medio de fermentación pueden calentarse de aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 120 minutos (por ejemplo, de aproximadamente 45 minutos a aproximadamente 90 minutos o de aproximadamente 55 minutos a aproximadamente 75 minutos). La pasteurización puede realizarse usando un medio de calentamiento adecuado como es conocido por aquellos expertos en la materia, tal como por inyección directa de vapor.
Opcionalmente, no se realiza etapa de pasteurización. Dicho de manera diferente, el método enseñado en el presente documento carece opcionalmente de una etapa de pasteurización.
Cosecha y Lavado
Opcionalmente, la biomasa puede recolectarse de acuerdo con una diversidad de métodos incluyendo aquellos conocidos actualmente por un experto en la materia. Por ejemplo, la biomasa puede recolectarse del medio de fermentación usando, por ejemplo, centrifugación (por ejemplo, centrífugas de expulsión de sólidos) o filtración (por ejemplo, filtración de flujo cruzado), opcionalmente con un agente de precipitación para la recolección acelerada de biomasa celular (por ejemplo, fosfato sódico o cloruro cálcico).
Opcionalmente, la biomasa se lava con agua. Opcionalmente, la biomasa puede concentrarse hasta aproximadamente el 20 % de sólidos. Por ejemplo, la biomasa puede concentrarse de aproximadamente el 5 % a aproximadamente el 20 % de sólidos, de aproximadamente el 7,5 % a aproximadamente el 15 % de sólidos o de aproximadamente sólidos a aproximadamente el 20 % de sólidos o cualquier porcentaje dentro de los intervalos enumerados. Opcionalmente, la biomasa puede concentrarse a aproximadamente el 20 % de sólidos o menos, aproximadamente el 19 % de sólidos o menos, aproximadamente el 18% de sólidos o menos, aproximadamente el 17% de sólidos o menos, aproximadamente el 16 % de sólidos o menos, aproximadamente el 15 % de sólidos o menos, aproximadamente el 14% de sólidos o menos, aproximadamente el 13% de sólidos o menos, aproximadamente el 12% de sólidos o menos, aproximadamente el 11 % de sólidos o menos, aproximadamente el 10 % de sólidos o menos, aproximadamente el 9 % de sólidos o menos, aproximadamente el 8 % de sólidos o menos, aproximadamente el 7 % de sólidos o menos, aproximadamente el 6 % de sólidos o menos, aproximadamente el 5 % de sólidos o menos, aproximadamente el 4 % de sólidos o menos, aproximadamente el 3 % de sólidos o menos, aproximadamente el 2 % de sólidos o menos o aproximadamente el 1 % de sólidos o menos.
Aislamiento y extracción
Los métodos proporcionados, opcionalmente, incluyen el aislamiento de ácidos grasos poliinsaturados de la biomasa o microorganismos usando una diversidad de métodos, incluyendo aquellos actualmente conocidos por un experto en la materia. Por ejemplo, se describen métodos para aislar ácidos grasos poliinsaturados en la Patente de EE.UU. N.° 8.163.515. Opcionalmente, el medio no se esteriliza antes del aislamiento de los ácidos grasos poliinsaturados. Opcionalmente, la esterilización comprende un aumento de temperatura. Opcionalmente, los ácidos grasos poliinsaturados producidos por los microorganismos y aislados a partir de los métodos proporcionados son ácidos grasos de cadena media. Opcionalmente, el uno o más ácidos grasos poliinsaturados se seleccionan del grupo que consiste en ácido alfa linolénico, ácido araquidónico, ácido docosahexaenoico, ácido docosapentaenoico, ácido eicosapentaenoico, ácido gamma-linolénico, ácido linoleico, ácido linolénico y combinaciones de los mismos.
Productos
El aceite que incluye ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) y otros lípidos producidos de acuerdo con el método descrito en el presente documento puede utilizarse en cualquiera de una diversidad de aplicaciones explotando sus propiedades biológicas, nutricionales o químicas. Por lo tanto, los métodos proporcionados incluyen opcionalmente aislar aceite del cultivo recolectado. Opcionalmente, el aceite se usa para producir combustible, por ejemplo, biocombustible. Opcionalmente, el aceite puede usarse en productos farmacéuticos, suplementos alimenticios, aditivos para piensos animales, cosméticos y similares. Los lípidos producidos de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento también pueden usarse como intermedios en la producción de otros compuestos.
A modo de ejemplo, el aceite producido por los microorganismos cultivados usando los métodos proporcionados puede comprender ácidos grasos. Opcionalmente, los ácidos grasos se seleccionan del grupo que consiste en ácido alfa linolénico, ácido araquidónico, ácido docosahexaenoico, ácido docosapentaenoico, ácido eicosapentaenoico, ácido gamma-linolénico, ácido linoleico, ácido linolénico y combinaciones de los mismos. Opcionalmente, el aceite contiene triglicéridos. Opcionalmente, el aceite comprende ácidos grasos seleccionados del grupo que consiste en ácido palmítico (C16:0), ácido mirístico (C14:0), ácido palmitoleico (C16:1(n-7)), ácido cis-vaccénico (C18:1(n-7)), ácido docosapentaenoico (C22:5(n-6)), ácido docosahexaenoico (C22:6(n-3)) y combinaciones de los mismos. Opcionalmente, la concentración de ácido docosahexaenoico en los ácidos grasos aislados es del 20 % o menos de la concentración total de ácidos grasos.
Opcionalmente, los lípidos producidos de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento pueden incorporarse en un producto final (por ejemplo, un alimento o suplemento alimenticio, una fórmula infantil, un producto farmacéutico, un combustible, etc.) Los suplementos alimenticios o de piensos adecuados en los que pueden incorporarse los lípidos incluyen bebidas tales como leche, agua, bebidas deportivas, bebidas energéticas, tés y zumos; confitería tales como caramelos, gelatinas y galletas; alimentos y bebidas que contienen grasa tales como productos lácteos; productos alimenticios procesados tales como arroz blando (o gachas); fórmulas infantiles; cereales para el desayuno; o similares. Opcionalmente, uno o más lípidos producidos pueden incorporarse en un suplemento dietético, tales como, por ejemplo, una vitamina o multivitamina. Opcionalmente, un lípido producido de acuerdo con el método descrito en el presente documento puede incluirse en un suplemento dietético y opcionalmente puede incorporarse directamente en un componente de alimento o pienso (por ejemplo, un suplemento alimenticio).
Algunos ejemplos de piensos en los que pueden incorporarse los lípidos producidos por los métodos descritos en el presente documento incluyen alimentos para mascotas tales como alimentos para gatos; alimentos para perros y similares; alimentos para peces de acuario, peces o crustáceos cultivados, etc.; piensos para animales criados en granjas (incluyendo ganado y peces o crustáceos criados en acuicultura). El material alimenticio y para piensos en el cual pueden incorporarse los lípidos producidos de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento es preferentemente agradable al organismo que es el receptor previsto. Este material alimenticio y para piensos puede tener cualquier propiedad física conocida actualmente para un material alimenticio (por ejemplo, sólido, líquido, blando).
Opcionalmente, uno o más de los compuestos producidos (por ejemplo, PUFA) pueden incorporarse a un producto nutracéutico o farmacéutico. Algunos ejemplos de tales productos nutracéuticos o farmacéuticos incluyen diversos tipos de comprimidos, cápsulas, agentes bebibles, etc. Opcionalmente, el producto nutracéutico o farmacéutico es adecuado para aplicación tópica. Las formas de dosificación pueden incluir, por ejemplo, cápsulas, aceites, gránulos, gránulos sutiles, polvos, comprimidos, píldoras, trociscos o similares.
El aceite o los lípidos producidos de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento pueden incorporarse en productos como se describe en el presente documento en combinación con cualquiera de una diversidad de agentes distintos. Por ejemplo, tales compuestos pueden combinarse con uno o más aglutinantes o cargas, agentes quelantes, pigmentos, sales, tensioactivos, hidratantes, modificadores de la viscosidad, espesantes, emolientes, fragancias, conservantes, etc., o cualquier combinación de los mismos.
Se desvelan materiales, composiciones y componentes que pueden usarse para, pueden usarse junto con, pueden usarse en la preparación de, o son productos de los métodos y composiciones desvelados. Estos y otros materiales se desvelan en el presente documento, y se entiende que cuando las combinaciones, subconjuntos, interacciones, grupos, etc. de estos materiales se desvelan, aunque la referencia específica a cada una de diversas combinaciones colectivas e individuales y permutaciones de estos compuestos puede no desvelarse explícitamente, cada uno se contempla específicamente y se describe en el presente documento. Por ejemplo, si un método se desvela y se analiza y se describe una serie de modificaciones que pueden realizarse a varias moléculas incluidas en el método, todas y cada una de las combinaciones y permutaciones específicas del método y las modificaciones que sean posibles se contemplan específicamente salvo que se indique específicamente lo contrario. Igualmente, cualquier subconjunto o combinación de estos también se contempla y se desvela específicamente. Este concepto se aplica a todos los aspectos de esta divulgación incluyendo, pero no limitado a, las etapas en métodos que usan las composiciones desveladas. Por lo tanto, si existe una diversidad de etapas adicionales que puedan realizarse, se entiende que cada una de estas etapas adicionales pueden realizarse con cualquier etapa específica del método o combinación de etapas específicas de los métodos desvelados y que cada una de tal combinación o subconjunto de combinaciones se contempla específicamente y deberá considerarse desvelada.
Como se usa todo el tiempo, los intervalos (por ejemplo, 1-10) y las referencias a aproximadamente un valor dado (por ejemplo, aproximadamente 1 o aproximadamente 10) incluyen el valor o los valores indicados (por ejemplo, 1 y/o 10). Los ejemplos a continuación pretenden ilustrar adicionalmente determinados aspectos de los métodos descritos en el presente documento, y no pretenden limitar el alcance de las reivindicaciones.
Ejemplos
Fermentación semicontinua para la producción de biomasa y aceite
En el campo de la producción de aceite microbiano, la fermentación oscura heterótrofa se considera generalmente superior al cultivo microbiano autótrofo en términos de eficiencia del proceso y rendimiento del producto. Sin embargo, a menudo se ve obstaculizado por un coste de capital fijo más alto (el coste de construir una planta de fermentación basada en recipientes es generalmente mucho más alto que el coste de capital de un sistema de cultivo tipo estanque abierto y canalización). Usando tales procesos de producción semicontinuos como se describe en el presente documento, puede lograrse una productividad global más alta con un coste operativo más bajo (minimizando el procedimiento de producción del recipiente del fermentador y el procedimiento de esterilización del recipiente). Esto significa una mejor utilización de la inversión de capital fijo (fermentadores y equipo de capital asociado) y una mayor

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un método de cultivo de un microorganismo Traustoquítrido que comprende las etapas de
(a) crecer, usando un método por lote alimentado, uno o más microorganismos en un medio que comprende una primera relación de carbono a nitrógeno de 30:1 a 60:1 en un recipiente;
(b) cultivar los microorganismos hasta que el cultivo alcance un indicador umbral, en donde el indicador umbral es la concentración de nutriente en el medio de cultivo, en donde el nutriente es carbono y en donde la concentración de carbono se reduce a cero o casi cero;
(c) recoger una porción del cultivo mientras se mantiene la mayor parte del cultivo en el recipiente, en donde la porción recolectada comprende del 5 % al 20 % del cultivo; y
(d) añadir medio fresco que comprende una segunda relación de carbono a nitrógeno de 70:1 a 95:1 al recipiente que comprende la mayoría del cultivo que comprende los microorganismos, en donde el medio fresco comprende carbono y nitrógeno.
2. El método de la reivindicación 1, en donde la primera relación de carbono a nitrógeno es de 40:1 a 50:1; y/o en donde la segunda relación de carbono a nitrógeno es de 80:1 a 90:1.
3. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en donde la porción recogida comprende el 10 % del cultivo.
4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el método comprende además medir la densidad óptica (DO), tasa de producción de dióxido de carbono, pH, oxígeno disuelto (OD), tiempo o cualquier combinación de los mismos.
5. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que comprende repetir las etapas de (i) cultivar los microorganismos hasta que el cultivo alcanza un indicador umbral; (ii) recoger una porción del cultivo mientras se mantiene la mayor parte del cultivo en el recipiente; y (iii) añadir medio fresco que comprende la segunda relación de carbono a nitrógeno al recipiente que comprende la mayor parte del cultivo que comprende los microorganismos.
6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde el carbono es una fuente de carbono seleccionada del grupo que consiste en ácidos grasos, lípidos, gliceroles, trigliceroles, carbohidratos, polioles y aminoazúcares, en donde opcionalmente la fuente de carbono es glucosa, fructosa o glicerol.
7. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde el nitrógeno es una fuente de nitrógeno seleccionada del grupo que consiste en incluir soluciones de amonio, sales de amina o amonio, peptona, triptona, extracto de levadura, extracto de malta, harina de pescado, glutamato sódico, extracto de soja, casaminoácidos y granos destiladores, en donde opcionalmente la fuente de nitrógeno es sulfato de amonio.
8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, que comprende además aislar el aceite del cultivo recogido, en donde el aceite comprende opcionalmente ácidos grasos seleccionados del grupo que consiste en ácido alfa linolénico, ácido araquidónico, ácido docosahexaenoico, ácido docosapentaenoico, ácido eicosapentaenoico, ácido gamma-linolénico, ácido linoleico, ácido linolénico y combinaciones de los mismos.
9. El método de la reivindicación 8, en donde el aceite comprende triglicéridos; o en donde el aceite comprende ácidos grasos seleccionados del grupo que consiste en ácido palmítico (C16:0), ácido mirístico (C14:0), ácido palmitoleico (C16:1(n-7)), ácido cis-vaccénico (C18:1(n-7)), ácido docosapentaenoico (C22:5(n-6)), ácido docosahexaenoico (C22:6(n-3)) y combinaciones de los mismos, en donde opcionalmente la concentración de ácido docosahexaenoico en los ácidos grasos aislados es del 20 % o menos de la concentración total de ácidos grasos.
10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde el cultivo se mantiene a un alto nivel de productividad de biomasa, en donde opcionalmente la productividad de biomasa comprende de 60 g/L-d a 180 g/L-d; o en donde opcionalmente la productividad de biomasa comprende de 80 g/L-d a 130 g/L-d; o en donde opcionalmente la productividad de biomasa comprende de 90 g/L-d a 100 g/L-d.
11. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en donde el cultivo se mantiene a un alto nivel de productividad de aceite, en donde opcionalmente la productividad de aceite comprende de 35 g/L-d a 130 g/L-d; o en donde opcionalmente la productividad del aceite comprende de 60 g/L-d a 90 g/L-d; o en donde la productividad de aceite comprende de 70 g/L-d a 80 g/L-d.
12. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en donde el cultivo de microorganismos comprende una biomasa que comprende del 60 % al 85 % de aceite; o en donde el cultivo de microorganismos comprende una biomasa que comprende del 65 % al 75 % de aceite.
13. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en donde el cultivo se mantiene durante un período de tiempo, en donde opcionalmente el cultivo se mantiene durante un período de horas, días, semanas o meses; o en donde opcionalmente el cultivo se mantiene durante al menos 150 a 500 horas; o en donde opcionalmente el cultivo se mantiene durante al menos 250 horas; o en donde opcionalmente el cultivo se mantiene durante una, dos, tres, cuatro o cinco semanas.
14. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en donde el microorganismo es del género Thraustochytrium, o en donde el microorganismo es de la familia Thraustochytriaceae.
15. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el método comprende además detectar la concentración celular, la productividad de biomasa, la productividad de aceite o una combinaciones de los mismos.
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