ES2852973T3

ES2852973T3 - Composiciones de receptores de antígeno quimérico

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Publication number: ES2852973T3
Application number: ES16797121T
Authority: ES
Inventors: John Williams; Christine Brown
Original assignee: City of Hope
Current assignee: City of Hope
Priority date: 2015-05-15
Filing date: 2016-05-16
Publication date: 2021-09-14
Anticipated expiration: 2036-05-16
Also published as: US9574014B2; US10590205B2; US20160333114A1; DK3294764T3; JP2018517407A; JP2021166522A; CN107849102A; EP3294764A4; CN114990141A; JP2023179437A; US20170226223A1; EP3294764B1; EP3842448A1; AU2016265845A1; AU2021221891A1; CA2986030A1; WO2016187158A1; PL3294764T3; CN107849102B; AU2021200091B2

Abstract

Un ácido nucleico aislado que codifica una proteína que comprende: (i) una región de anticuerpo que comprende un sitio de unión al meditopo formado por una región variable de cadena pesada (VH), una región variable de cadena ligera (VL), una región constante de cadena pesada (CH) y una región constante de cadena ligera (CL), en donde dicho sitio de unión al meditopo forma un sitio de unión del péptido que comprende residuos de aminoácidos de la región marco; y (ii) un dominio transmembrana.

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones de receptores de antígeno quimérico

Antecedentes de la invención

El cáncer es la segunda causa principal de muerte en los Estados Unidos, matando a más personas que las siguientes cinco causas combinadas, que incluyen las enfermedades respiratorias crónicas, la enfermedad de Alzheimer y la diabetes. Mientras que se han logrado avances extraordinarios en la detección, prevención y tratamiento del cáncer, sigue existiendo una necesidad urgente, especialmente en casos avanzados, de producir terapias que no solo detengan la progresión del tumor sino que eliminen de manera efectiva todas las células tumorales. Un enfoque es la inmunoterapia de células T (5-7) adoptiva. Este método requiere la recolección de las células T del paciente, la modificación de estas células con un receptor de antígeno quimérico (CAR) que reconoce un antígeno tumoral, y la posterior reintroducción de las células modificadas al paciente. Después, las células T reprogramadas se dirigen directamente a las células tumorales que expresan antígenos, evitando el requerimiento del péptido MHC, y provocando una respuesta inmune poderosa pero localizada. Este método de tratamiento (8) ha producido algunos resultados positivos en los primeros ensayos clínicos de unos pocos pacientes, pero no para todos. Existe una necesidad en la técnica de comprender mejor el éxito y el fracaso de la terapia con células T CAR. Por ejemplo, existe una necesidad en la técnica de la capacidad de caracterizar la densidad de los CAR en las células transformadas, para rastrear las células T CAR administradas en cualquier momento durante la terapia y correlacionar esta distribución con los resultados terapéuticos, para funcionalizar rápidamente las células T CAR, monitoreando el número, la ubicación y la viabilidad de las células T CAR trasplantadas en el lugar y para eliminar selectivamente las células T CAR si es necesario. Las correlaciones significativas ayudarían a los médicos a determinar las mejores opciones de tratamiento y darían a los investigadores pistas importantes para modificar y mejorar este enfoque terapéutico. En la presente descripción se proporcionan composiciones y métodos que abordan estas y otras necesidades en la técnica.

Breve resumen de la invención

En un aspecto, se proporciona un ácido nucleico aislado. El ácido nucleico codifica una proteína que incluye (i) una región de anticuerpo que incluye un sitio de unión al meditopo formado por una región variable de cadena pesada (VH), una región variable de cadena ligera (VL), una región constante de cadena pesada (CH) y una región constante de cadena ligera (CL), en donde el sitio de unión al meditopo forma un sitio de unión del péptido que incluye residuos de aminoácidos de la región marco; y (ii) un dominio transmembrana.

En un aspecto, se proporciona en la presente descripción un ácido nucleico aislado que codifica una proteína que comprende:

(i) una región de anticuerpo que comprende un sitio de unión al meditopo formado por una región variable de cadena pesada (VH), una región variable de cadena ligera (VL), una región constante de cadena pesada (CH) y una región constante de cadena ligera (CL), en donde dicho sitio de unión al meditopo forma un sitio de unión del péptido que comprende residuos de aminoácidos de la región marco; y

(ii) un dominio transmembrana.

En una modalidad, la región del anticuerpo es un fragmento de anticuerpo humanizado que comprende un dominio Fc.

En una modalidad, el ácido nucleico aislado de la invención comprende además una secuencia de señalización intracelular de células T que codifica un dominio de señalización intracelular de células T CD3 Z.

En una modalidad, el ácido nucleico aislado de la invención comprende además una secuencia de señalización intracelular coestimuladora que codifica un dominio de señalización intracelular coestimulador, opcionalmente en donde dicho dominio de señalización intracelular coestimulador es un dominio de señalización intracelular coestimulador de CD28, un dominio de señalización intracelular coestimulador 4-1BB, un dominio de señalización intracelular coestimulador ICOS, o un dominio de señalización intracelular coestimulador OX-40.

En una modalidad, el ácido nucleico aislado de la invención comprende además una secuencia espaciadora que codifica una región espaciadora, en donde dicha región espaciadora está entre dicho dominio transmembrana y dicha región de anticuerpo.

En una modalidad, el ácido nucleico aislado de la invención comprende además una secuencia enlazadora que codifica un dominio enlazador, en donde opcionalmente dicho dominio enlazador está entre dicho dominio transmembrana y dicho dominio de señalización intracelular de células T; en donde dicho dominio enlazador está entre dicho dominio de señalización intracelular de células T y dicho dominio de señalización intracelular coestimulador; o en donde dicho dominio enlazador comprende la secuencia GGCGG o GGG.

En una modalidad, el ácido nucleico aislado de la invención comprende además

(i) una secuencia de cadena pesada que codifica un dominio de cadena pesada de dicha proteína, dicho dominio de cadena pesada comprende un dominio de cadena pesada variable y dicho dominio transmembrana; y

(ii) una secuencia de cadena ligera que codifica un dominio de cadena ligera de dicha proteína, dicho dominio de cadena ligera comprende un dominio de cadena ligera variable, en donde dicho dominio de cadena pesada variable y dicho dominio de cadena ligera variable forman juntos al menos una porción de dicha región de anticuerpo, opcionalmente

en donde dicha secuencia de cadena ligera es 3' con respecto a dicha secuencia de cadena pesada.

En una modalidad, el ácido nucleico de la invención comprende además una secuencia de peptidilo autoescindible entre dicha secuencia de cadena pesada y dicha secuencia de cadena ligera, en donde opcionalmente dicha secuencia de enlazador peptidilo autoescindible es una secuencia T2A o una secuencia 2A.

En una modalidad, el ácido nucleico de la invención comprende además una secuencia de gen suicida.

En un aspecto, se proporciona en la presente descripción un vector de expresión que comprende el ácido nucleico de la invención.

En un aspecto, se proporciona en la presente descripción un linfocito T que comprende el vector de expresión de la invención.

En un aspecto, en la presente descripción se proporciona una proteína recombinante que comprende:

(i) una región de anticuerpo que comprende un sitio de unión a meditopo formado por una región variable de cadena pesada (VH) y una región variable de cadena ligera (VL), una región constante de cadena pesada (CH) y una región constante de cadena ligera (CL), en donde dicho sitio de unión a meditopo forma un sitio de unión del péptido que comprende residuos de aminoácidos de la región marco; y

(ii) un dominio transmembrana.

En una modalidad, dicha región de anticuerpo comprende un dominio Fc, y/o en donde dicha región de anticuerpo es una región de anticuerpo humanizado, y/o en donde dicha región de anticuerpo no comprende una región de anticuerpo scFv, y/o en donde dicha proteína comprende además un dominio de señalización intracelular de células T, en donde opcionalmente dicho dominio de señalización intracelular de células T es un dominio de señalización intracelular de células T CD3 Z. En una modalidad, la proteína recombinante de la invención comprende además un dominio de señalización intracelular coestimulador, en donde opcionalmente dicho dominio de señalización intracelular coestimulador es un dominio de señalización intracelular coestimulador CD28, un dominio de señalización intracelular coestimulador 4-1BB, un dominio de señalización intracelular coestimulador ICOS, o un dominio de señalización intracelular coestimulador OX-40, y/o que comprende además una región espaciadora, en donde opcionalmente dicha región espaciadora está entre dicho dominio transmembrana y dicha región de anticuerpo, y/o

que comprende además un dominio enlazador, en donde opcionalmente dicho dominio enlazador está entre dicho dominio transmembrana y dicho dominio de señalización intracelular de células T y además, opcionalmente, en donde dicho dominio enlazador comprende la secuencia GGCGG o GGG o en donde dicho dominio enlazador está entre dicho dominio de señalización intracelular de células T y dicho dominio de señalización intracelular coestimulador y además, opcionalmente, dicho dominio enlazador comprende la secuencia GGCGG o GGG.

En una modalidad del ácido nucleico de la invención y/o la proteína recombinante de la invención, dicha región de anticuerpo es un dominio habilitado para meditopo de cetuximab, dominio habilitado para meditopo de trasuzumab, dominio habilitado para meditopo de pertuzumab, dominio habilitado para meditopo M5A o dominio habilitado para meditopo de rituximab.

En un caso, se describe un ácido nucleico aislado. El ácido nucleico codifica una proteína que incluye (i) una región de anticuerpo que incluye una cavidad central formada por una región variable de cadena pesada (VH) y una región variable de cadena ligera (VL), en donde la cavidad central forma un sitio de unión del péptido que incluye la región marco de residuos de aminoácidos; y (ii) un dominio transmembrana.

En otro caso, se describe un ácido nucleico aislado. El ácido nucleico aislado codifica una proteína que incluye una primera porción que incluye un dominio variable de cadena pesada de anticuerpo y una segunda porción que incluye un dominio variable de cadena ligera de anticuerpo y un dominio constante de cadena ligera de anticuerpo, en donde la primera porción incluye además un dominio transmembrana.

En otro aspecto, se proporciona un vector de expresión que incluye un ácido nucleico proporcionado en la presente descripción que incluye modalidades de este.

En otro aspecto, se proporciona un linfocito T que incluye el vector de expresión proporcionado en la presente descripción que incluye modalidades de este.

En otro ejemplo, se proporciona una célula de mamífero que incluye el vector de expresión proporcionado en la presente descripción que incluye modalidades de este.

En otro ejemplo, se proporciona una proteína recombinante. La proteína recombinante incluye (i) una región de anticuerpo que incluye una cavidad central formada por una región variable de cadena pesada (VH) y una región variable de cadena ligera (VL), en donde la cavidad central forma un sitio de unión del péptido que incluye residuos de aminoácidos de la región marco; y (ii) un dominio transmembrana.

En otro ejemplo, se proporciona una proteína recombinante. La proteína recombinante incluye una primera porción que incluye un dominio variable de cadena pesada de anticuerpo y una segunda porción que incluye un dominio variable de cadena ligera de anticuerpo y un dominio constante de cadena ligera de anticuerpo, en donde la primera porción incluye además un dominio transmembrana, y en donde el dominio variable de cadena pesada de anticuerpo, el dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo y el dominio constante de la cadena ligera del anticuerpo forman juntos una región del anticuerpo.

En otro caso, se proporciona una célula de mamífero que incluye la proteína recombinante proporcionada en la presente descripción que incluye modalidades de esta, en donde el dominio transmembrana está dentro de la membrana celular de la célula de mamífero.

En otro caso, se proporciona un linfocito T que incluye la proteína recombinante proporcionada en la presente descripción que incluye modalidades de esta, en donde el dominio transmembrana está dentro de la membrana celular del linfocito T.

En otro caso, se proporciona un método para tratar el cáncer. El método incluye administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad efectiva de una célula de mamífero proporcionada en la presente descripción que incluye modalidades de esta, en donde la región de anticuerpo es una región de anticuerpo anticanceroso.

En otro caso, se proporciona un método para tratar el cáncer. El método incluye administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad efectiva del linfocito T proporcionado en la presente descripción, que incluyen las modalidades de este, en donde la región del anticuerpo es una región del anticuerpo anticanceroso.

En otro caso, se proporciona un método para reprogramar un linfocito T. El método incluye poner en contacto un linfocito T con el vector de expresión proporcionado en la presente descripción, que incluyen las modalidades de este.

En otro caso, se proporciona un método para detectar un cáncer. El método incluye (i) administrar a un paciente con cáncer una cantidad efectiva de un linfocito T que incluye la proteína recombinante proporcionada en la presente descripción, que incluyen las modalidades de esta y un compuesto que incluye una porción peptidilo capaz de unirse al sitio de unión del péptido, en donde el compuesto incluye además una etiqueta detectable, y en donde la región de anticuerpo es una región de anticuerpo anticanceroso. El método incluye (ii) permitir que el compuesto se una al sitio de unión del péptido formando de esta manera un complejo proteína-compuesto recombinante. Y (iii) el complejo proteína recombinante-compuesto se detecta dentro del paciente con cáncer, detectando de esta manera el cáncer.

Breve descripción de las figuras

Figura 1A-1B. Figura 1A: Representación esquemática de los receptores de antígeno quimérico. Para dirigirse específicamente a los tumores, los mAb completos o los fragmentos Fab que reconocen los antígenos asociados a tumores se fusionan directamente con el dominio transmembrana y la cadena zeta. Además, el sitio de unión al meditopo puede injertarse en mAB/Fab, lo que proporciona un medio adicional de añadir funcionalidad a las células T CAR. Figura 1B. Dado que tienen que expresarse dos cadenas (por ejemplo, las cadenas ligera y pesada del mAb más los segmentos de señalización transmembrana e intracelular), existen dos posibilidades diferentes de expresar las diferentes cadenas. Específicamente, la cadena ligera seguida por la cadena pesada o la cadena pesada seguida por la cadena ligera.

Figura 2A-Figura 2B: CAR específico de HER2. Figura 2A. Diagrama del casete CAR lentiviral para expresar el CAR específico de HER2, que incluye la secuencia de omisión del ribosoma 2A y CD19 truncado (CD19t) que sirve como un marcador inmunogénico inerte de la transducción celular. Figura 2B. Tcm transducida lentiviralmente para expresar HEP2P:28Z muestra una expresión estable en la superficie celular de las proteínas CAR y CD19.

Figura 3A-3B. Tcm HEP2-28Z destruye los objetivos de HER2 tanto de alta como baja expresión. Figura 3A. Análisis de citometría de flujo que evalúa la expresión de la superficie de HER2 en un panel de líneas tumorales de mama, y la línea celular de glioblastoma U87 negativa para HER2. Figura 3B. El ensayo de liberación de cromo de 4 horas que evalúa la destrucción por células T CAR HER2-28z demuestra que se destruyen tanto las líneas tumorales HER2 de alta como de baja expresión.

Figura 4A-4D. Estudios de meditopos: Figura 4A Estructura cristalina. El meditopo 5-difenil y la proteína L se unen a trastuzumab memAb. El dominio extracelular de HER2 que define el sitio de unión al antígeno se superpuso mediante el uso de pdb 1n8z. Nota: la proteína L y el meditopo son distintos y distantes del sitio de unión del antígeno. Figura 4B FACS. Las células SKBR3 se trataron con trastuzumab marcado (parental; memAb) y ya sea de forma secuencial o premezclada con meditopo-proteína L marcado (MPL6). Solo el trastuzumab memAb desplaza el meditopo-Proteína L, lo que indica que la unión del antígeno no excluye la unión del meditopo. Figura 4C Microscopía de fluorescencia. La GFP fusionada con el meditopo-Proteína L (MPL6-GFP) se colocaliza con trastuzumab memAb mediante el uso de células SKBR3 (hilera superior) pero no con trastuzumab parental (hilera inferior). Esto indica que un biológico voluminoso no afecta la unión del antígeno. Figura 4D Microscopía de súper resolución. Los receptores HER2 individuales pueden visualizarse y cuantificarse mediante el uso de paGFP fusionado con meditopo-Proteína L (MPL6-GFP) y trastuzumab memAb. El panel izquierdo muestra la célula completa. El panel derecho muestra los receptores individuales.

Figura 5. Actividad antitumoral de HER2-scFv-CAR Tcm contra tumores de mama injertados intracraneales. Respuestas terapéuticas representativas a tumores i.c. injertados BT474 EGFP-ffLuc+ (1*105 células) después de la inyección intratumoral i.c. de células T HER2R-CAR en ratones NSG. El día 11, los ratones recibieron 1x106 HER2-CAR Tcm, Tcm simulado o PBS.

Figura 6. Células T meHER2R-CAR. Los linfocitos T humanos primarios se transdujeron lentiviralmente para expresar el HER2-scFv-CAR (HER2R-EQ-28Z) o el HER2-CAR habilitado para meditopo (meHER2R-dCH2-28Z). La expresión en la superficie celular del meHER2-dCH2-28Z se confirma mediante citometría de flujo mediante el uso anticuerpo anti-Fc. Figura 7. Expresión de CAR específicos de scFv-CEA derivados de M5A humanizado T84.66 murino en células T humanas primarias. Tanto los CEA-scFv-CAR derivados de muT84.66 como de M5A se expresan de forma estable por las células modificadas.

Figura 8A-8B. Comparación de células T CAR específicas de scFv-CEA de M5A humanizado versus T84.66 murino para la destrucción de objetivos CEA+. Figura 8A: Expresión de células objetivo de CEA. Figura 8B: Ensayo de liberación de cromo de 4 horas. Las células T CEA-scFv-CAR derivadas de muT84.66 reconocen y destruyen las células objetivo CEA+ en un ensayo de liberación de cromo de 4 horas. En comparación, las células T CEA-scFv-CAR derivadas de M5A humanizado no destruyen las células objetivo CEA+.

Figura 9. Ilustración de la configuración ilustrativa de Fab y enlazador.

Figura 10. Las células CHO-S se transfectaron ya sea con el plásmido memAb trastuzumab Fab CAR (meCAR) o trastuzumab scFv-CAR (HER2CAR) durante dos días. El constructo meCAR y HER2CAR difieren sólo en el componente de direccionamiento de HER2, cada uno enlazado a CH3, dominio transmembrana CD28 y CD3 zeta. Además puede expresarse CD19 truncado a partir de los plásmidos y sirve como control de la transfección. Las células CHO-S transfectadas se filtraron con un filtro de 40 pm para eliminar los residuos y se lavaron una vez con BSA-PBS al 0,3 %. Después, las células se marcaron en hielo durante 1 h con: PE-anti-CD19 o control de isotipo, anti-FcY biotinilado seguido de estreptavidina-PE, o marcado doblemente con HER2 soluble en Azul Pacífico y Alexa Fluor 488-meditopo Fc (MFC). Al final de las incubaciones, las células se lavaron una vez y se resuspendieron en 800 pl de tampón de lavado. Se añadió Sytox Azul a las células no marcadas para evaluar la viabilidad y la permeabilidad de la membrana. Las células se separaron con dispersión frontal y lateral solamente. Sytox Azul y Azul Pacífico tienen una superposición considerable en sus espectros, así la señal Sytox Azul de las muestras no etiquetadas se ha "filtrado" en el canal Azul Pacífico. Se ha observado que cuando las células CHO-S expresan proteínas unidas a la membrana, su membrana se vuelve más permeable al tinte Sytox Azul, como se muestra con el grupo de células en un óvalo amarillo. Tanto las células transfectadas con meCAR como con HER2CAR son positivas para CD19, CH3 y sHER2, pero solo el meCAR además es positivo para la unión a MFC.

Figura 11A-11C. Expresión de Fab-CAR habilitados para meditopos en células T humanas primarias. Figura 11A, Esquema del casete de Fab-CAR de trastuzumab habilitado para meditopo (me) (meHER2), con la secuencia de salto ribosómico T2A que separa la cadena ligera del anticuerpo (meLc) y la cadena pesada fusionada al enlazador IgG4-CH3-Fc, dominio de transmembrana (Tm) CD28 y los dominios de señalización citoplásmica CD28 y CD3Z (Hc28Z). La expresión se impulsa por el promotor EF1a y se probó en dos orientaciones: Lc-Hc28Z y Hc28Z-Lc. Figura 11B, las células T humanas primarias se transdujeron lentiviralmente y se evaluó la expresión de los meHER2-CAR mediante citometría de flujo. La tinción de la proteína L, que se une a la cadena ligera Fab, confirma la expresión en la superficie celular de ambas orientaciones CAR, con niveles de expresión más altos (MFI) observados para la orientación Hc28 Z-Lc (MFI 5357) frente a Lc-Hc28 Z (MFI 2592). La tinción con meditopo-AF647 confirma la formación funcional del bolsillo del meditopo CAR, con mayor unión a la orientación Hc28 Z -Lc (MFI 6042) frente a Lc-Hc28 Z (MFI 2121). Figura 11C, las células T meHER2-CAR preunidas al péptido del meditopo retienen la capacidad de unirse a la proteína L y al antígeno HER2 soluble, lo que sugiere que la unión al meditopo no altera las propiedades de unión al antígeno ni los componentes estructurales del Fab.

Figura 12A-12D. Los linfocitos T HER2-CAR (meHER2) habilitados para meditopo se desgranulan a niveles comparables a los de los linfocitos T scFvHER2-CAR en respuesta a los objetivos de HER2+ y el péptido del meditopo no afecta negativamente la desgranulación de los linfocitos T. Figura 12A, se evaluó la expresión de HER2 en la superficie celular de las líneas de cáncer de mama HER2+ MCF-7 y SK-BR-3 mediante citometría de flujo (Biolegend; Cat # 324413). MCF-7 expresa niveles relativamente bajos de HER2 en comparación con SK-BR-3 que sobreexpresa HER2. Figura 12B-12D Ensayo de desgranulación de CD107a. Las células T HD187.2 se modificaron para expresar ya sea meHER2(Ho-Lo):28Z CAR, meHER2(Lc-Hc):28Z CAR, scFvHER2:28Z CAR o sin CAR (simulada). Las versiones del meHER2:28Z-CAR difieren solo en la orientación de la cadena pesada (Hc) y la cadena ligera (Lc), ver Figura 11. Figura 12B los FAC representativos que muestran la desgranulación de CD107a para células T simuladas (control negativo) y células T scFvHER2-CAR (control positivo) seguido de cocultivo en una relación de efector a MCF-7 de 1:1 (basado en la expresión de CAR) durante 5 horas. La desgranulación de CD107a (BD Pharmingen™; Cat # 555800), separada en células CAR+ CD8+, se detectó mediante citometría de flujo (Miltenyi Biotec; MACSQuant) y se analizó mediante el uso FCS Express (De Novo Software). Figura 12C se incubaron células T meHER2(Hc-Lc):28Z y meHEP2(Lc-Hc):28Z con y sin meditopo-AF647 (ME;200nM) y se evaluó la desgranulación a objetivos MCF-7 como se describió en la Figura 12B. Figura 12D, gráfico de barras que representa la desgranulación comparable de todas las líneas de células T meHER2 y scFvHER2-CAR a MCF-7 o SK-BR-3. Las células T meHER2-CAR incubadas con y sin péptido meditopo muestran una activación comparable según se evaluó mediante desgranulación de CD107a. Se grafican el promedio y la desviación estándar de tres pocillos por condición. Las células se bloquearon en la población CD8+CAR+.

Figura 13A-13B. Las células T modificadas con scFvHER2-CAR y HER2-CAR habilitados para meditopo (meHER2) destruyen a los objetivos HER2+ con una eficiencia comparable y el péptido meditopo no impacta negativamente en la destrucción de los linfocitos T. Ensayo de destrucción a largo plazo para comparar la potencia de destrucción de las células T meHER2 y scFvHER2-CAR. Las células T HD187.2 se modificaron para expresar ya sea meHER2(Hc-Lc):28Z CAR, meHER2(Lc-Hc):28Z CAR, scFvHER2:28Z CAR o sin CAR (simulada). Las versiones del meHER2:28Z-CAR difieren solo en la orientación de la cadena pesada (Hc) y la cadena ligera (Lc), ver Figura 11. Las líneas de células T HER2-CAR o el control simulado se cultivaron conjuntamente con líneas de cáncer de mama HER2+, MCF-7 y SKBR3, durante 48 horas a una relación de efector a objetivo de 1:4 (basado en la expresión de CAR). La destrucción se evaluó cuantificando el número de células tumorales vivas que quedaban después de la coincubación. Se usaron una tinción de viabilidad, DAPI (Molecular Probes™; Cat # D21490) y un antígeno leucocitario humano, CD45 (BD Biosciences; Cat # 347464), para excluir las células muertas y las células T del recuento de tumores vivos. Las células meCAR-T se incubaron con y sin meditopo-AF647 (200 nM) antes del cocultivo para evaluar el impacto del péptido del meditopo en el potencial de destrucción redirigido de meHER2. La Figura 13A, el gráfico de barras representa el recuento promedio de tumores vivos (DAPI-CD45-) de tres pocillos replicados por combinación. Figura 13B, el gráfico de barras representa el porcentaje de tumor destruido por condición cuando se normaliza para simular.

Descripción detallada de la invención

Definiciones

Mientras varias modalidades y aspectos de la presente invención se muestran y describen en la presente descripción, será evidente para los expertos en la técnica que tales modalidades y aspectos se proporcionan a manera de ejemplo solamente.

Los encabezamientos de sección usados en la presente descripción son sólo para propósitos de organización y no se deben interpretar como limitativos de la materia descrita.

Las abreviaturas usadas en la presente descripción tienen su significado convencional dentro de las técnicas químicas y biológicas. Las estructuras y fórmulas químicas que se establecen en la presente descripción se construyen de acuerdo con las reglas estándar de valencia química conocidas en las técnicas químicas.

Cuando los grupos sustituyentes se especifican por su fórmula química convencional, escrita de izquierda a derecha, ellos abarcan igualmente los sustituyentes químicamente idénticos, que podrían resultar de escribir la estructura de derecha a izquierda, por ejemplo, -CH2O- es equivalente a -OCH2-.

El término "alquilo," por sí mismo o como parte de otro sustituyente, significa, a menos que se indique de cualquier otra manera, una cadena lineal (es decir, sin ramificar) o de carbono no cíclico ramificado (o carbono), o una de sus combinaciones, que pueden ser completamente saturados, monoinsaturados o poliinsaturados y pueden incluir radicales divalentes y multivalentes, que tienen el número de átomos de carbono indicados (es decir, C1-C10 significa uno a diez carbonos). Los ejemplos de radicales hidrocarburo saturados incluyen, pero sin limitarse a, grupos tales como metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, t-butilo, isobutilo, sec-butilo, (ciclohexilo)metilo, homólogos e isómeros de, por ejemplo, npentilo, n-hexilo, n-heptilo, n-octilo y similares. Un grupo alquilo insaturado es uno que tiene uno o más enlaces dobles o triples. Los ejemplos de grupos alquilo insaturados incluyen, pero sin limitarse a, vinilo, 2-propenilo, crotilo, 2-isopentilo, 2-(butadienilo), 2,4-pentadienilo, 3-(1,4-pentadienilo), etinilo, 1- y 3-propinilo, 3-butinilo, y los homólogos e isómeros superiores. Un alcoxi es un alquilo unido al resto de la molécula mediante un enlazador de oxígeno (-O-). Una porción alquilo puede ser una porción alquenilo. Una porción alquilo puede ser una porción alquinilo. Una porción alquilo puede estar completamente saturada.

El término "alquileno" por sí mismo o como parte de otro sustituyente, significa, a menos que se indique de cualquier otra manera un radical divalente derivado de un alquilo, como se ejemplifica, pero sin limitar por, -CH2CH2CH2CH2-. Típicamente, un grupo alquilo (o alquileno) tendrá de 1 a 24 átomos de carbono, con aquellos grupos que tienen 10 o menos átomos de carbono, siendo los preferidos en la presente invención. Un "alquilo inferior" o "alquileno inferior" es un grupo alquilo o alquileno de cadena más corta, que tiene generalmente ocho o menos átomos de carbono. El término "alquenileno", por sí mismo o como parte de otro sustituyente, significa, a menos que se indique de cualquier otra manera, un radical divalente derivado de un alqueno.

El término "heteroalquilo," por sí mismo o en combinación con otro término, significa, a menos que se indique de cualquier otra manera, una cadena lineal o ramificada no cíclica estable, o sus combinaciones, que incluyen al menos un átomo de carbono y al menos un heteroátomo (por ejemplo O, N, P, Si y S) y en donde los átomos de nitrógeno y azufre opcionalmente pueden estar oxidados, y el heteroátomo de nitrógeno opcionalmente puede estar en estado cuaternario. El(los) heteroátomo(s) O, N, P, S, y Si puede(n) colocarse en cualquier posición interior del grupo heteroalquilo o en la posición en la que el grupo alquilo se une al resto de la molécula. Los ejemplos incluyen, pero sin limitarse a: -CH2-CH2-O-CH3, -CH2-CH2-NH-CH3, -CH2-CH2-N(CH3)-CH3, -CH2-S-CH2-CH3, -CH2-CH2, -S(O)-CH3, -CH2-CH2-S(O)2-CH3, -CH=CH-O-CH3, -Si(CH3)3, -CH2-CH=N-OCH3, -CH=CH-N(CH3)-CH3, -O-CH3, -O-CH2-CH3 y -CN. Hasta dos o tres heteroátomos pueden ser consecutivos, tales como, por ejemplo, -CH2-NH-OCH3 y -CH2-O-Si(CH3)3. Una porción heteroalquilo puede incluir un heteroátomo (por ejemplo, O, N, S, Si, o P). Una porción heteroalquilo puede incluir dos heteroátomos opcionalmente diferentes (por ejemplo, O, N, S, Si, o P). Una porción heteroalquilo puede incluir tres heteroátomos opcionalmente diferentes (por ejemplo, O, N, S, Si, o P). Una porción heteroalquilo puede incluir cuatro heteroátomos opcionalmente diferentes (por ejemplo, O, N, S, Si, o P). Una porción heteroalquilo puede incluir cinco heteroátomos opcionalmente diferentes (por ejemplo, O, N, S, Si, o P). Una porción heteroalquilo puede incluir hasta 8 heteroátomos opcionalmente diferentes (por ejemplo, O, N, S, Si, o P).

De manera similar, el término "heteroalquileno" por sí mismo o como parte de otro sustituyente, significa, a menos que se indique de cualquier otra manera, un radical divalente derivado de heteroalquilo, como se ejemplifica, pero sin limitarse a, -CH2-CH2-S-CH2-CH2- y -CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-. Para los grupos heteroalquileno, los heteroátomos también pueden ocupar cualquiera de los terminales de la cadena o ambos (por ejemplo, alquilenoxi, alquilendioxi, alquilenamino, alquilendiamino, y similares). Más aun, para los grupos de enlace alquileno y heteroalquileno, ninguna orientación del grupo de enlace está implícita en la dirección en la que se escribe la fórmula del grupo de enlace. Por ejemplo, la fórmula -C(O)2R'-representa tanto a -C(O)2R'- como a -R'C(O)2-. Como se describió anteriormente, los grupos heteroalquilo, como se usa en la presente descripción, incluyen aquellos grupos que se unen al resto de la molécula a través de un heteroátomo, tales como -C(O)R', -C(O)NR', -NR'R", -OR', -SR', y/o -SO2R'. Cuando se enumera "heteroalquilo", seguido de enumeraciones de grupos heteroalquilo específicos, tales como -NR'R" o similares, se debe entender que los términos heteroalquilo y -NR'R" no son redundantes ni mutuamente excluyentes. Más bien, los grupos heteroalquilo específicos se enumeran para añadir claridad. Así, el término "heteroalquilo" no debe interpretarse en la presente descripción como que excluye grupos heteroalquilo específicos, tales como -NR'R" o similares.

Los términos "cicloalquilo" y "heterocicloalquilo", por sí mismos o en combinación con otros términos, significan, a menos que se indique de cualquier otra manera, versiones cíclicas no aromáticas de "alquilo" y "heteroalquilo", respectivamente, en donde los carbonos que forman el anillo o anillos no necesariamente necesitan estar unidos a un hidrógeno debido a que todas las valencias de carbono participan en enlaces con átomos que no son de hidrógeno. Adicionalmente, para el heterocicloalquilo, un heteroátomo puede ocupar la posición en la cual el heterociclo se une al resto de la molécula. Los ejemplos de cicloalquilo incluyen, pero sin limitarse a, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, 1-ciclohexenilo, 3-ciclohexenilo, cicloheptilo, 3-hidroxiciclobut-3-enil-1,2, diona, 1H-1,2,4-triazolil-5(4H)-ona, 4H-1,2,4-triazolilo y similares. Los ejemplos de heterocicloalquilo incluyen, pero sin limitarse a, 1-(1,2,5,6-tetrahidropiridil), 1 -piperidinilo, 2-piperidinilo, 3-piperidinilo, 4-morfolinilo, 3-morfolinilo, tetrahidrofurano-2-ilo, tetrahidrofurano-3-ilo, tetrahidrotien-2-ilo, tetrahidrotien-3-ilo, 1 -piperazinilo, 2-piperazinilo, y similares. Un "cicloalquileno" y un "heterocicloalquileno", solos o como parte de otro sustituyente, significa un radical divalente derivado de un cicloalquilo y heterocicloalquilo, respectivamente. Una porción heterocicloalquilo puede incluir un heteroátomo de anillo (por ejemplo, O, N, S, Si, o P). Una porción heterocicloalquilo puede incluir dos heteroátomos de anillo opcionalmente diferentes (por ejemplo, O, N, S, Si, o P). Una porción heterocicloalquilo puede incluir tres heteroátomos de anillo opcionalmente diferentes (por ejemplo, O, N, S, Si, o P). Una porción heterocicloalquilo puede incluir cuatro heteroátomos de anillo opcionalmente diferentes (por ejemplo, O, N, S, Si, o P). Una porción heterocicloalquilo puede incluir cinco heteroátomos de anillo opcionalmente diferentes (por ejemplo, O, N, S, Si, o P). Una porción heterocicloalquilo puede incluir hasta 8 heteroátomos de anillo opcionalmente diferentes (por ejemplo, O, N, S, Si, o P).

Los términos "halo" o "halógeno," por sí mismos o como parte de otro sustituyente, significa a menos que se indique de cualquier otra manera, un átomo de flúor, cloro, bromo, o yodo. Además, los términos tales como "haloalquilo," significan que incluyen monohaloalquilo y polihaloalquilo. Por ejemplo, el término "halo(C1-C4)alquilo" incluye, pero no se limita a, fluorometilo, difluorometilo, trifluorometilo, 2,2,2-trifluoroetilo, 4-clorobutilo, 3-bromopropilo y similares.

El término "acilo" significa, a menos que se indique de cualquier otra manera, -C(O)R donde R es un alquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, o heteroarilo sustituido o no sustituido.

El término "arilo" significa, a menos que se indique de cualquier otra manera, un sustituyente hidrocarbonado poliinsaturado, aromático, que puede ser un único anillo o múltiples anillos (preferentemente de 1 a 3 anillos), que se fusionan juntos (es decir, arilo de anillo fusionado) o se enlazan covalentemente. Un arilo de anillo fusionado se refiere a múltiples anillos fusionados en donde al menos uno de los anillos fusionados es un anillo de arilo. El término "heteroarilo" se refiere a grupos arilo (o anillos) que contienen al menos un heteroátomo tales como N, O, y S, en donde los átomos de nitrógeno y azufre se oxidan de manera opcional, y los átomo(s) de nitrógeno está en estado cuaternario de manera opcional. Así, el término "heteroarilo" incluye grupos heteroarilo de anillo fusionado (es decir, múltiples anillos fusionados entre sí en donde al menos uno de los anillos fusionados es un anillo heteroaromático). Un heteroarileno de anillo 5,6 fusionado se refiere a dos anillos fusionados juntos, en donde un anillo tiene 5 miembros y el otro anillo tiene 6 miembros, y en donde al menos un anillo es un anillo heteroarilo. Igualmente, un heteroarileno de anillo 6,6 fusionado se refiere a dos anillos fusionados entre sí, en donde un anillo tiene 6 miembros y el otro anillo tiene 6 miembros, y en donde al menos un anillo es un anillo heteroarilo. Y un heteroarileno de anillo 6,5 fusionado se refiere a dos anillos fusionados entre sí, en donde un anillo tiene 6 miembros y el otro anillo tiene 5 miembros, y en donde al menos un anillo es un anillo heteroarilo. Puede unirse un grupo heteroarilo al resto de la molécula a través de un carbono o heteroátomo. Los ejemplos no limitantes de los grupos arilo y heteroarilo incluyen fenilo, 1-naftilo, 2-naftilo, 4-bifenilo, 1 -pirrolilo, 2-pirrolilo, 3-pirrolilo, 3-pirazolilo, 2-imidazolilo, 4-imidazolilo, pirazinilo, 2-oxazolilo, 4-oxazolilo, 2-fenilo-4-oxazolilo, 5-oxazolilo, 3-isoxazolilo, 4-isoxazolilo, 5-isoxazolilo, 2-tiazolilo, 4-tiazolilo, 5-tiazolilo, 2-furilo, 3-furilo, 2-tienilo, 3-tienilo, 2-piridil, 3-piridil, 4-piridil, 2-pirimidilo, 4-pirimidilo, 5-benzotiazolilo, purinilo, 2-bencimidazolilo, 5-indolilo, 1 -isoquinolilo, 5-isoquinolilo, 2-quinoxalinilo, 5-quinoxalinilo, 3-quinolilo, y 6-quinolilo. Los sustituyentes para cada uno de los sistemas anulares arilo y heteroarilo anteriormente denotados son seleccionados del grupo de sustituyentes aceptables descritos más abajo. Un "arileno" y un "heteroarileno", solos o como parte de otro sustituyente, significan un radical divalente derivado de un arilo y heteroarilo, respectivamente. Los ejemplos no limitantes de grupos arilo y heteroarilo incluyen piridinilo, pirimidinilo, tiofenilo, tienilo, furanilo, indolilo, benzoxadiazolilo, benzodioxolilo, benzodioxanilo, tianaftanilo, pirrolopiridinilo, indazolilo, quinolinilo, quinoxalinilo, piridopirazinilo, quinazolinonilo, benzoisoxazolilo, imidazopiridinilo, benzofuranilo, benzotienilo, benzotiofenilo, fenilo, naftilo, bifenilo, pirrolilo, pirazolilo, imidazolilo, pirazinilo, oxazolilo, isoxazolilo, tiazolilo, furiltienilo, piridilo, pirimidilo, benzotiazolilo, purinilo, bencimidazolilo, isoquinolilo, tiadiazolilo, oxiazolilo, pirrolilo, diazolilo, triazolilo, tetrazolilo, benzotiadiazolilo, isotiazolilo, pirazolopirimidinilo, pirrolopirimidinilo, benzotriazolilo, benzoxazolilo, o quinolilo. Los ejemplos anteriores pueden estar sustituidos o no sustituidos y los radicales divalentes de cada ejemplo de heteroarilo anterior son ejemplos no limitantes de heteroarileno. Una porción heteroarilo puede incluir un heteroátomo de anillo (por ejemplo, O, N, o S). Una porción heteroarilo puede incluir dos heteroátomos de anillo opcionalmente diferentes (por ejemplo, O, N, o S). Una porción heteroarilo puede incluir tres heteroátomos de anillo opcionalmente diferentes (por ejemplo, O, N, o S). Una porción heteroarilo puede incluir cuatro heteroátomos de anillo opcionalmente diferentes (por ejemplo, O, N, o S). Una porción heteroarilo puede incluir cinco heteroátomos de anillo opcionalmente diferentes (por ejemplo, O, N, o S). Una porción arilo puede tener un solo anillo. Una porción arilo puede tener dos anillos opcionalmente diferentes. Una porción arilo puede tenertres anillos opcionalmente diferentes. Una porción arilo puede tener cuatro anillos opcionalmente diferentes. Una porción heteroarilo puede tener un anillo. Una porción heteroarilo puede tener dos anillos opcionalmente diferentes. Una porción heteroarilo puede tener tres anillos opcionalmente diferentes. Una porción heteroarilo puede tener cuatro anillos opcionalmente diferentes. Una porción heteroarilo puede tener cinco anillos opcionalmente diferentes.

Un heterocicloalquil-arilo de anillo fusionado es un arilo fusionado con un heterocicloalquilo. Un heterocicloalquilheteroarilo de anillo fusionado es un heteroarilo fusionado con un heterocicloalquilo. Un heterocicloalquil-cicloalquilo de anillo fusionado es un heterocicloalquilo fusionado con un cicloalquilo. Un heterocicloalquil-heterocicloalquilo de anillo fusionado es un heterocicloalquilo fusionado con otro heterocicloalquilo. El heterocicloalquil-arilo de anillo fusionado, el heterocicloalquil-heteroarilo de anillo fusionado, el heterocicloalquil-cicloalquilo de anillo fusionado o el heterocicloalquilheterocicloalquilo de anillo fusionado pueden estar cada uno independientemente no sustituido o sustituido con uno o más de los sustituyentes descritos en la presente descripción.

El término "oxo", como se usa en la presente descripción, significa un oxígeno que se une por doble enlace a un átomo de carbono.

El término "alquilsulfonilo", como se usa en la presente descripción, significa una porción que tiene la fórmula -S(O2)-R', donde R' es un grupo alquilo sustituido o no sustituido como se definió anteriormente. R' puede tener un número específico de carbonos (por ejemplo, "C1-C4 alquilsulfonilo").

Cada uno de los términos anteriores (por ejemplo, "alquilo", "heteroalquilo", "cicloalquilo", "heterocicloalquilo", "arilo" y "heteroarilo") incluyen tanto las formas sustituidas como las no sustituidas del radical indicado. Los sustituyentes preferidos para cada tipo de radical se proporcionan más abajo.

Los sustituyentes para los radicales alquilo y heteroalquilo (que incluyen los grupos frecuentemente denominados como alquileno, alquenilo, heteroalquileno, heteroalquenilo, alquinilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, cicloalquenilo, y heterocicloalquenilo) pueden ser uno o más de una variedad de grupos seleccionados de, pero sin limitarse a: -OR', =O, =NR', =N-OR', -NR'R", -SR', -halógeno, -SiR'R"R"', -OC(O)R', -C(O)R', -CO2R', -CONR'R", -OC(O)NR'R", -NR"C(O)R', -NR'-C(O)NR"R"', -NR"C(O)2R', -NR-C(NR'R")=NR"', -S(O)R', -S(O)2R', -S(O)2N(R)('R"-NRSO2R'), -CN, y -NO2 en un número en el intervalo de cero a (2m'+1), donde m' es el número total de átomos de carbono en dicho radical. R', R", R"' y R"" cada uno preferentemente independientemente se refiere a hidrógeno, heteroalquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido (por ejemplo, arilo sustituido con 1-3 halógenos), grupos alquilo, alcoxi o tioalcoxi, o grupos arilalquilo sustituidos o no sustituidos. Cuando un compuesto de la invención incluye más de un grupo R, por ejemplo, cada uno de los grupos R es independientemente seleccionado como son cada uno de los grupos R', R", R'", y R"" cuando más de uno de estos grupos está presente. Cuando R' y R" se unen al mismo átomo de nitrógeno, estos pueden combinarse con el átomo de nitrógeno para formar un anillo de 4-, 5-, 6-, o 7-miembros. Por ejemplo, -NR'R" incluye, pero no se limita a, 1 -pirrolidinilo y 4-morfolinilo. A partir de la discusión anterior de los sustituyentes, el experto en la técnica entenderá que el término "alquilo" significa que incluye grupos que incluyen átomos de carbono unidos a los grupos distintos de los grupos hidrógeno, tales como haloalquilo (por ejemplo, -CF3 y -CH2CF3) y acilo (por ejemplo, -C(O)CH3, -C(O)CF3, -C(O)CH2OCH3, y similares).

De manera similar a los sustituyentes descritos para el radical alquilo, los sustituyentes para los grupos arilo y heteroarilo se varían y se seleccionan de, por ejemplo: -OR', -NR'R", -s R', -halógeno, -SiR'R"R"', -OC(O)R', -C(O)R', -CO2R', -CONR'R", -OC(O)NR'R", -NR"C(O)R', -NR'-C(O)NR"R"', NR"C(O)2R', NRC(NRR")-NR", S(O)R', -S(O)2R', -S(O)2N(R')(R", -NRSO2R'), -c N, -NO2, -R', -N3, -CH(Ph)2, fluoro(C1-C4)alcoxi, y fluoro(C1-C4)alquilo, en un número en el intervalo desde cero hasta el número total de valencias abiertas en el sistema de anillo aromático; y donde R', R", R"' y R"" se seleccionan preferentemente independientemente del hidrógeno, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, y heteroarilo sustituido o no sustituido. Cuando un compuesto de la invención incluye más de un grupo R, por ejemplo, cada uno de los grupos R es independientemente seleccionado como son cada uno de los grupos R', R", R'" y R"" cuando más de uno de estos grupos está presente.

Cuando una porción se sustituye con un sustituyente R, el grupo puede denominarse "sustituido con R." Cuando una porción es sustituido con R, la porción se sustituye con al menos un sustituyente R y cada sustituyente R es opcionalmente diferente. Por ejemplo, cuando una porción en la presente descripción es alquilo sustituido o no sustituido con R1A, una pluralidad de sustituyentes R1A pueden estar unidos a la porción alquilo en donde cada sustituyente R1A es opcionalmente diferente. Cuando una porción sustituida con R se sustituye con una pluralidad de sustituyentes R, cada uno de los sustituyentes R puede diferenciarse en la presente descripción mediante el uso de un símbolo principal (') tal como R', R", etc. Por ejemplo, donde una porción es alquilo sustituido o no sustituido con R3A, y la porción se sustituye con una pluralidad de sustituyentes R3A, la pluralidad de sustituyentes R3A pueden diferenciarse como R3A', R3A", R3A'", etc. En algunas modalidades, la pluralidad de sustituyentes R es 3. En algunas modalidades, la pluralidad de sustituyentes R es 2.

Pueden unirse opcionalmente dos o más sustituyentes para formar grupos arilo, heteroarilo, cicloalquilo, o heterocicloalquilo. Tales sustituyentes denominados formadores de anillos se encuentran típicamente, aunque no necesariamente, unidos a una estructura de base cíclica. En una modalidad, los sustituyentes formadores de anillos se unen a miembros adyacentes de la estructura de base. Por ejemplo, dos sustituyentes formadores de anillos unidos a miembros adyacentes de una estructura de base cíclica crean una estructura anular fusionada. En otra modalidad, los sustituyentes formadores de anillos se unen a un solo miembro de la estructura de base. Por ejemplo, dos sustituyentes formadores de anillos unidos a un miembro simple de una estructura de base cíclica crean una estructura espirocíclica. Aun en otra modalidad, los sustituyentes formadores de anillos se unen a miembros no adyacentes de la estructura de base.

Dos de los sustituyentes en los átomos adyacentes del anillo de arilo o heteroarilo opcionalmente pueden formar un anillo de la fórmula -T-C(O)-(CRR')q-U-, en donde T y U son independientemente -NR-, -O-, -CRR'-, o un enlace simple, y q es un entero de 0 a 3. Alternativamente, dos de los sustituyentes en los átomos adyacentes del anillo de arilo o heteroarilo pueden reemplazarse opcionalmente con un sustituyente de la fórmula-A-(CH2)r-B-, en donde A y B son independientemente -CRR'-, -O-, -NR-, -S-, -S(O)-, -S(O)2-, -S(O)2NR'-, o un enlace simple, y r es un entero de 1 a 4. Uno de los enlaces simples del nuevo anillo así formado puede estar opcionalmente sustituido con un doble enlace. Alternativamente, dos de los sustituyentes en átomos adyacentes del anillo arilo o heteroarilo pueden opcionalmente reemplazarse con un sustituyente de la

fórmula -(CRR')s-X'-(C"R"R'")d-, donde las variables s y d son independientemente enteros de 0 a 3, y X' es -O-, -NR'-, -S-, -S(O)-, -S(O)2-, o -S(O)2NR'-. Los sustituyentes R, R', R", y R'" se seleccionan preferentemente independientemente de hidrógeno, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, y heteroarilo sustituido o no sustituido.

Como se usa en la presente descripción, los términos "heteroátomo" o "heteroátomo de anillo" significa que incluyen oxígeno (O), nitrógeno (N), azufre (S), fósforo (P), y silicio (Si).

Un "grupo sustituyente", como se usa en la presente descripción, significa un grupo seleccionado de las siguientes porciones:

(A) oxo, halógeno, CF3, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO2Cl, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC=(O)NHNH2, -NHC=(O) NH2, -NHSO2H, -NHC= (O)H, -NHC(O)-OH, -NHOH, -OCF3, -OCHF2, alquilo no sustituido, heteroalquilo no sustituido, cicloalquilo no sustituido, heterocicloalquilo no sustituido, arilo no sustituido, heteroarilo no sustituido, y

(B) alquilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo, heteroarilo, sustituido con al menos un sustituyente seleccionado de:

(i) oxo, halógeno, -CF3, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO2Cl, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC=(O)NHNH2, -NHC=(O) NH2, -NHSO2H, -NHC= (O)H, -NHC(O)-OH, -NHOH, -OCF3, -OCHF2, alquilo no sustituido, heteroalquilo no sustituido, cicloalquilo no sustituido, heterocicloalquilo no sustituido, arilo no sustituido, heteroarilo no sustituido y

(ii) alquilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo, heteroarilo, sustituido con al menos un sustituyente seleccionado de:

(a) oxo, halógeno, -CF3, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO2CI, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC=(O)NHNH2, -NHC=(O) NH2, - NHSO2H, -NHC= (O)H, -NHC(O)-OH, -NHOH, -OCF3, -OCHF2, alquilo no sustituido, heteroalquilo no sustituido, cicloalquilo no sustituido, heterocicloalquilo no sustituido, arilo no sustituido, heteroarilo no sustituido, y

(b) alquilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo, heteroarilo, sustituido con al menos un sustituyente seleccionado de: oxo,

halógeno,-CF3, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO2Cl, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC=(O)NHNH2, -NHC=(O) NH2, -NHSO2H, -NHC= (O)H, -NHC(O)-OH, -NHOH, -OCF3, -OCHF2, alquilo no sustituido, heteroalquilo no sustituido, cicloalquilo no sustituido, heterocicloalquilo no sustituido, arilo no sustituido, heteroarilo no sustituido.

Un "sustituyente de tamaño limitado" o "grupo sustituyente de tamaño limitado", como se usa en la presente descripción, significa un grupo seleccionado de todos los sustituyentes descritos anteriormente para un "grupo sustituyente", en donde cada alquilo sustituido o no sustituido es un C1-C20 alquilo sustituido o no sustituido, cada heteroalquilo sustituido o no sustituido es un heteroalquilo de 2 a 20 miembros sustituido o no sustituido, cada cicloalquilo sustituido o no sustituido es un C3-C8 cicloalquilo sustituido o no sustituido, cada heterocicloalquilo sustituido o no sustituido es un heterocicloalquilo sustituido o no sustituido de 3 a 8 miembros, cada arilo sustituido o no sustituido es un C6-C10 arilo sustituido o no sustituido, y cada heteroarilo sustituido o no sustituido es un heteroarilo de 5 a 10 miembros sustituido o no sustituido.

Un "sustituyente inferior" o "grupo sustituyente inferior", como se usa en la presente descripción, significa un grupo seleccionado de todos los sustituyentes descritos anteriormente para un "grupo sustituyente", en donde cada alquilo sustituido o no sustituido es un C1-C8 alquilo sustituido o no sustituido, cada heteroalquilo sustituido o no sustituido es un heteroalquilo de 2 a 8 miembros sustituido o no sustituido, cada cicloalquilo sustituido o no sustituido es un C3-C7 cicloalquilo sustituido o no sustituido, cada heterocicloalquilo sustituido o no sustituido es un heterocicloalquilo sustituido o no sustituido de 3 a 7 miembros, cada arilo sustituido o no sustituido es un C6-C10 arilo sustituido o no sustituido, y cada heteroarilo sustituido o no sustituido es un heteroarilo sustituido o no sustituido de 5 a 9 miembros.

En algunas modalidades, cada grupo sustituido descrito en los compuestos en la presente descripción se sustituye con al menos un grupo sustituyente. Más específicamente, en algunas modalidades, cada alquilo sustituido, heteroalquilo sustituido, cicloalquilo sustituido, heterocicloalquilo sustituido, arilo sustituido, heteroarilo sustituido, alquileno sustituido, heteroalquileno sustituido, cicloalquileno sustituido, heterocicloalquileno sustituido, arileno sustituido, y/o heteroarileno sustituido descritos en los compuestos en la presente descripción se sustituyen con al menos un grupo sustituyente. En otras modalidades, al menos uno o todos estos grupos se sustituyen con al menos un grupo sustituyente de tamaño limitado. En otras modalidades, al menos uno o todos estos grupos se sustituyen con al menos un grupo sustituyente inferior.

En otras modalidades de los compuestos en la presente descripción, cada alquilo sustituido o no sustituido puede ser un C1-C20 alquilo sustituido o no sustituido, cada heteroalquilo sustituido o no sustituido es un heteroalquilo de 2 a 20 miembros sustituido o no sustituido, cada cicloalquilo sustituido o no sustituido es un C3-C8 cicloalquilo sustituido o no sustituido, cada heterocicloalquilo sustituido o no sustituido es un heterocicloalquilo sustituido o no sustituido de 3 a 8 miembros, cada arilo sustituido o no sustituido es un C6-C10 arilo sustituido o no sustituido, y/o cada heteroarilo sustituido o no sustituido es un heteroarilo sustituido o no sustituido de 5 a 10 miembros. En algunas modalidades de los compuestos en la presente descripción, cada alquileno sustituido o no sustituido es un C1-C20 alquileno sustituido o no sustituido, cada heteroalquileno sustituido o no sustituido es un heteroalquileno sustituido o no sustituido de 2 a 20 miembros, cada cicloalquileno sustituido o no sustituido es un C3-C8 cicloalquileno sustituido o no sustituido, cada heterocicloalquileno sustituido o no sustituido es un heterocicloalquileno sustituido o no sustituido de 3 a 8 miembros, cada arileno sustituido o no sustituido es un C6-C10 arileno sustituido o no sustituido, y/o cada heteroarileno sustituido o no sustituido es un heteroarileno sustituido o no sustituido de 5 a 10 miembros.

En algunas modalidades, cada alquilo sustituido o no sustituido es un C1-C8 alquilo sustituido o no sustituido, cada heteroalquilo sustituido o no sustituido es un heteroalquilo de 2 a 8 miembros sustituido o no sustituido, cada cicloalquilo sustituido o no sustituido es un C3-C7 cicloalquilo sustituido o no sustituido, cada heterocicloalquilo sustituido o no sustituido es un heterocicloalquilo sustituido o no sustituido de 3 a 7 miembros, cada arilo sustituido o no sustituido es un C6-C10 arilo sustituido o no sustituido, y/o cada heteroarilo sustituido o no sustituido es un heteroarilo sustituido o no sustituido de 5 a 9 miembros. En algunas modalidades, cada alquileno sustituido o no sustituido es un C1-C8 alquileno sustituido o no sustituido, cada heteroalquileno sustituido o no sustituido es un heteroalquileno de 2 a 8 miembros sustituido o no sustituido, cada cicloalquileno sustituido o no sustituido es un C3-C7 cicloalquileno sustituido o no sustituido, cada heterocicloalquileno sustituido o no sustituido es un heterocicloalquileno sustituido o no sustituido de 3 a 7 miembros, cada arileno sustituido o no sustituido es un C6-C10 arileno sustituido o no sustituido, y/o cada heteroarileno sustituido o no sustituido es un heteroarileno sustituido o no sustituido de 5 a 9 miembros. En algunas modalidades, el compuesto es una especie química expuesta en la sección de Ejemplos, figuras o tablas más abajo.

Como se usa en la presente descripción, el término "conjugado" se refiere a la asociación entre átomos o moléculas. La asociación puede ser directa o indirecta. Por ejemplo, un conjugado entre un ácido nucleico y una proteína puede ser directa, por ejemplo, por enlace covalente, o indirecta, por ejemplo, por enlace no covalente (por ejemplo, interacciones electrostáticas (por ejemplo, enlace iónico, enlace de hidrógeno, enlace de halógeno), interacciones de van der Waals (por ejemplo, dipolo-dipolo, dipolo inducido por dipolo, dispersión de London), apilamiento de anillos (efectos pi), interacciones hidrofóbicas y similares). En las modalidades, los conjugados se forman mediante el uso de química de conjugados que incluyen, pero sin limitarse a sustituciones nucleofílicas (por ejemplo, reacciones de aminas y alcoholes con acil haluros, ésteres activos), sustituciones electrofílicas (por ejemplo, reacciones de enamina) y adiciones a múltiples enlaces carbono-carbono y enlaces carbono-heteroátomo (por ejemplo, reacción de Michael, adición de Diels-Alder). Estas y otras reacciones útiles se discuten en, por ejemplo, Marzo, ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY, 3ra Ed., John Wiley y Sons, Nueva York, 1985; Hermanson, BIo Co NJUGATE TECHNIQUES, Academic Press, San Diego, 1996; y Feeney y otros, MODIFICATION OF PROTEINS; Advances in Chemistry Series, Volumen. 198, American Chemical Society, Washington, D.C., 1982. En las modalidades, la micropartícula se une de forma no covalente al soporte sólido a través de una reacción química no covalente entre un componente de la micropartícula y un componente del soporte sólido. En otras modalidades, la micropartícula incluye uno o más porciones reactivas, por ejemplo, una porción reactiva covalente, como se describe en la presente descripción (por ejemplo, una porción reactiva con amina). En otras modalidades, la micropartícula incluye un enlazador con uno o más porciones reactivas, por ejemplo, una porción reactiva covalente, como se describe en la presente descripción (por ejemplo, una porción reactiva con amina).

Las fracciones reactivas útiles o los grupos funcionales usados para las químicas de conjugado (que incluyen las "químicas click" como se conocen en la técnica) en la presente descripción incluyen, por ejemplo:

(a) grupos carboxilo y varios derivados de estos que incluyen, pero sin limitarse a, ésteres de N-hidroxisuccinimida, ésteres de N-hidroxibenzotriazol, haluros de ácido, acilimidazoles, tioésteres, ésteres de p-nitrofenilo, alquilo, alquenilo, alquinilo y ésteres aromáticos;

(b) los grupos hidroxilo, que pueden convertirse a ésteres, éteres, aldehídos, etc.

(c) grupos haloalquilo en donde el haluro puede desplazarse posteriormente con un grupo nucleófilo tales como, por ejemplo, una amina, un anión carboxilato, anión tiol, un carbanión, o un ion alcóxido, resultando de esta manera en la unión covalente de un nuevo grupo en el sitio del átomo de halógeno;

(d) grupos dienófilos que son capaces de participaren reacciones de Diels-Alder tal como, por ejemplo, grupos maleimido; (e) grupos aldehído o cetona de manera que la posterior derivatización sea posible mediante la formación de derivados de carbonilo tales como, por ejemplo, iminas, hidrazonas, semicarbazonas u oximas, o mediante mecanismos tales como la adición de Grignard o la adición de alquil litio;

(f) grupos haluro de sulfonilo para la posterior reacción con aminas, por ejemplo, para formar sulfonamidas;

(g) grupos tiol, que pueden convertirse en disulfuros, hacerse reaccionar con haluros de acilo, o unirse a metales tales como oro;

(h) grupos amina o sulfhidrilo, que pueden estar, por ejemplo, acilados, alquilados u oxidados;

(i) alquenos, que pueden sufrir, por ejemplo, cicloadiciones, acilación, adición de Michael, etc.;

(j) epóxidos, que pueden reaccionar con, por ejemplo, aminas y compuestos hidroxílicos;

(b) fosforamiditas y otros grupos funcionales estándar útiles en la síntesis de ácidos nucleicos;

(l) unión de óxido de silicio metálico;

(m) unión de metales a grupos de fósforo reactivos (por ejemplo, fosfinas) para formar, por ejemplo, enlaces diéster de fosfato; y

(n) sulfonas, por ejemplo, vinilsulfona.

La síntesis química de composiciones uniendo pequeñas unidades modulares mediante el uso química conjugada ("click") es bien conocida en la técnica y se describe, por ejemplo, en H. C. Kolb, M. G. Finn y K. B. Sharpless ((2001). "Click Chemistry: Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions". Angewandte Chemie International Edición 40 (11): 2004-2021); R. A. Evans ((2007). "The Rise of Azide-Alkyne 1,3-Dipolar 'Click' Cycloaddition and its Application to Polymer Science and Surface Modification". Australian Journal of Chemistry 60 (6): 384-395; W.C. Guida y otros. Med. Res. Rev. p 3 1996; Spiteri, Christian y Moses, John E. ((2010). "Copper-Catalyzed Azide-Alkyne Cycloaddition: Regioselective Synthesis of 1,4,5-Trisubstituted 1,2,3-Triazoles". Angewandte Chemie International Edition 49 (1): 31-33); Hoyle, Charles E. y Bowman, Christopher N. ((2010). "Thiol-Ene Click Chemistry". Angewandte Chemie International Edición 49 (9): 1540 1573); Blackman, Melissa L. y Royzen, Maksim y Fox, Joseph M. ((2008). "Tetrazine Ligation: Fast Bioconjugation Based on Inverse-Electron-Demand Diels-Alder Reactivity". Journal of the American Chemical Society 130 (41): 13518-13519); Devaraj, Neal K. y Weissleder, Ralph y Hilderbrand, Scott A. ((2008). "Tetrazine Based Cycloadditions: Application to Pretargeted Live Cell Labeling". Bioconjugate Chemistry 19 (12): 2297-2299); Stockmann, Henning; Neves, Andre; Stairs, Shaun; Brindle, Kevin; Leeper, Finian ((2011). "Exploring isonitrile-based click chemistry for ligation with biomolecules". Organic & Biomolecular Chemistry).

Los grupos funcionales reactivos pueden elegir de manera que no participen en, o interfieran con, la estabilidad química de las proteínas o ácidos nucleicos descritos en la presente descripción. A manera de ejemplo, los ácidos nucleicos pueden incluir una vinilsulfona u otra porción reactiva (por ejemplo, maleimida). Opcionalmente, los ácidos nucleicos pueden incluir una porción reactiva que tiene la fórmula -SSR. R puede ser, por ejemplo, un grupo protector. Opcionalmente, R es hexanol. Como se usa en la presente descripción, el término hexanol incluye compuestos con la fórmula C6H13OH e incluye, 1 -hexanol, 2 -hexanol, 3-hexanol, 2 -metil-1 -pentanol, 3-metil-1-pentanol, 4-metil-1-pentanol, 2-metil-2-pentanol, 3- metil-2-pentanol, 4-metil-2-pentanol, 2-metil-3-pentanol, 3-metil-3-pentanol, 2,2-dimetil-1-butanol, 2,3-dimetil-1-butanol, 3,3-dimetil-1-butanol, 2,3-dimetil-2-butanol, 3,3-dimetil-2-butanol, y 2-etil-1 -butanol. Opcionalmente, R es 1-hexanol.

Como se usa en la presente descripción, el término "aproximadamente" significa un intervalo de valores que incluyen el valor especificado, que una persona con experiencia en la técnica consideraría razonablemente similar al valor especificado. En las modalidades, el término "aproximadamente" significa dentro de una desviación estándar mediante el uso de medidas generalmente aceptables en la técnica. En las modalidades, aproximadamente significa un intervalo que se extiende hasta /- 10 % del valor especificado. En las formas de modalidad, aproximadamente significa el valor especificado.

Los términos "un" o "una", como se usan en la presente descripción, significan uno o más. Además, la frase "sustituido con una [n]", como se usa en la presente descripción, significa que el grupo especificado puede estar sustituido con uno o más de cualquiera o todos los sustituyentes mencionados. Por ejemplo, cuando un grupo, tal como un grupo alquilo o heteroarilo, está "sustituido con un C1-C20 alquilo no sustituido, o heteroalquilo no sustituido de 2 a 20 miembros, "el grupo puede contener uno o más C1-C20 alquilos no sustituidos y/o uno o más heteroalquilos de 2 a 20 miembros no sustituidos. Además, cuando una porción se sustituye con un sustituyente R, el grupo puede denominarse "sustituido con R." Cuando una porción es sustituido con R, la porción se sustituye con al menos un sustituyente R y cada sustituyente R es opcionalmente diferente.

A menos que se defina de cualquier otra manera, todos los términos técnicos y científicos que se usan en la presente descripción tienen el mismo significado que el que se entiende comúnmente por un experto en la técnica. Ver, por ejemplo, Singleton y otros, DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY 2da ed., J. Wiley & Sons (New York, NY 1994); Sambrook y otros, MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, Cold Springs Harbor Press (Cold Springs Harbor, NY 1989). Pueden usarse cualquiera de los métodos, dispositivos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente descripción en la práctica de esta invención. Las siguientes definiciones se proporcionan para facilitar la comprensión de ciertos términos usados frecuentemente en la presente descripción y no pretenden limitar el alcance de la presente descripción.

"Muestra biológica" o "muestra" se refiere a materiales obtenidos o derivados de un sujeto o paciente. Una muestra biológica incluye secciones de tejidos, tales como muestras de biopsia y autopsia, y secciones congeladas tomadas con propósitos histológicos. Tales muestras incluyen fluidos corporales tales como sangre y fracciones o productos sanguíneos (por ejemplo, suero, plasma, plaquetas, glóbulos rojos y similares), esputo, tejido, células cultivadas (por ejemplo, cultivos primarios, explantes, y células transformadas) heces, orina, líquido sinovial, tejido articular, tejido sinovial, sinoviocitos, sinoviocitos similares a fibroblastos, sinoviocitos similares a macrófagos, células inmunes, células hematopoyéticas, fibroblastos, macrófagos, células T, etc. Una muestra biológica se obtiene típicamente de un organismo eucariota, tal como un mamífero, tal como un primate, por ejemplo, un chimpancé o ser humano; vaca; perro; gato; un roedor, por ejemplo, cobaya, rata, ratón; conejo; o un pájaro; reptil; o pez.

Una "célula", como se usa en la presente descripción, se refiere a una célula que lleva a cabo funciones metabólicas o de otro tipo suficientes para preservar o replicar su ADN genómico. Una célula puede identificarse mediante métodos bien conocidos en la técnica que incluyen, por ejemplo, la presencia de una membrana intacta, la tinción con un tinte particular, la capacidad de producir progenie o, en el caso de un gameto, la capacidad de combinarse con un segundo gameto para producir una descendencia viable. Las células pueden incluir las células procariotas y eucariotas. Las células procariotas incluyen, pero sin limitarse a, bacterias. Las células eucariotas incluyen, pero sin limitarse a, células de levadura y células derivadas de plantas y animales, por ejemplo, células de mamíferos, insectos (por ejemplo, spodoptera) y humanas. Las células pueden ser útiles cuando no son adherentes de forma natural o se han tratado para que no se adhieran a las superficies, por ejemplo, mediante tripsinización.

Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se usan indistintamente en la presente descripción para referirse a un polímero de residuos de aminoácidos, en donde el polímero puede conjugarse opcionalmente con una porción que no consiste de aminoácidos. Los términos se aplican a polímeros de aminoácidos en los que uno o más residuos de aminoácido es un mimético químico artificial de un correspondiente aminoácido de origen natural, así como a polímeros de aminoácidos de origen natural y polímeros de aminoácidos de origen no natural. Una "proteína de fusión" se refiere a una proteína quimérica que codifica dos o más secuencias de proteínas separadas que se expresan de forma recombinante como una única porción.

El término "peptidilo" y "porción peptidilo" se refiere a un péptido monovalente.

Un "marcador" o una "porción detectable" es una composición detectable por medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos, químicos, u otros medios físicos. Por ejemplo, las etiquetas útiles incluyen 32P, colorantes fluorescentes, reactivos densos en electrones, enzimas (por ejemplo, como se usa comúnmente en un ELISA), biotina, digoxigenina, o haptenos y proteínas u otras entidades que pueden hacerse detectables, por ejemplo, incorporando un radiomarcador en un péptido o anticuerpo específicamente reactivo con un péptido objetivo. Puede emplearse cualquier método apropiado conocido en la técnica para conjugar un anticuerpo al marcador, por ejemplo, mediante el uso de métodos descritos en Hermanson, Bioconjugate Techniques 1996, Academic Press, Inc., San Diego.

Una "proteína o polipéptido marcado" es uno que se une, ya sea de forma covalente, a través de un enlazador o enlace químico, o no covalentemente, a través de enlaces iónicos, van der Waals, electrostáticos o de hidrógeno a una etiqueta de manera que la presencia de la proteína o el polipéptido puede detectarse detectando la presencia del marcador unido a la proteína o polipéptido marcado. Alternativamente, los métodos que usan interacciones de alta afinidad pueden lograr los mismos resultados cuando uno de un par de parejas de unión se une al otro, por ejemplo, biotina, estreptavidina.

El término "aminoácido" se refiere a los aminoácidos sintéticos y de origen natural, así como también análogos de aminoácidos y miméticos de aminoácidos que funcionan de manera similar a los aminoácidos de origen natural. Los aminoácidos de origen natural son los codificados por el código genético, así como también los aminoácidos que se modifican después, por ejemplo, hidroxiprolina, Y-carboxiglutamato y O-fosfoserina. Los análogos de aminoácidos se refieren a los compuestos que tienen la misma estructura química básica que un aminoácido de origen natural, es decir, un carbono a que se une a un hidrógeno, un grupo carboxilo, un grupo amino, y un grupo R, por ejemplo, homoserina, norleucina, sulfóxido de metionina, metionina metil sulfonio. Tales análogos tienen grupos R modificados (por ejemplo, norleucina) o cadenas principales peptídicas modificadas, pero retienen la misma estructura química básica como un aminoácido de origen natural. Los miméticos de aminoácidos se refieren a los compuestos químicos que tienen una estructura que es diferente de la estructura química general de un aminoácido, pero que funciona de manera similar a un aminoácido de origen natural.

Los aminoácidos pueden referirse en la presente descripción ya sea por sus símbolos de tres letras comúnmente conocidos o por los símbolos de una letra recomendados por la Comisión de Nomenclatura Bioquímica IUPAC-IUB. Igualmente, puede hacer referencia a los nucleótidos por sus códigos de una sola letra comúnmente aceptados.

Una "posición" de aminoácido o base de nucleótidos se indica mediante un número que identifica secuencialmente cada aminoácido (o base de nucleótidos) en la secuencia de referencia basándose en su posición con relación al N-terminal (o extremo 5'). Debido a deleciones, inserciones, truncamientos, fusiones, y similares que pueden tenerse en cuenta al determinar un alineamiento óptimo, en general, el número de residuos de aminoácidos en una secuencia de prueba determinada simplemente contando desde el N terminal no será necesariamente el mismo que el número de su posición correspondiente en la secuencia de referencia. Por ejemplo, en un caso en donde una variante tiene una deleción con relación a una secuencia de referencia alineada, no habrá aminoácido en la variante que corresponda a una posición en la secuencia de referencia en el sitio de la deleción. Cuando existe una inserción en una secuencia de referencia alineada, esa inserción no corresponderá a una posición de aminoácidos numerada en la secuencia de referencia. En el caso de truncamientos o fusiones, puede haber tramos de aminoácidos ya sea en la secuencia de referencia o alineada que no correspondan a ningún aminoácido en la secuencia correspondiente.

Los términos "numerados con referencia a" o "correspondientes a", cuando se usan en el contexto de la numeración de una secuencia de aminoácidos o polinucleótidos dada, se refieren a la numeración de los residuos de una secuencia de referencia específica cuando la secuencia de aminoácido o polinucleótido dado se compara con la secuencia de referencia. Un residuo de aminoácido en una proteína "corresponde" a un residuo dado cuando este ocupa la misma posición estructural esencial dentro de la proteína que el residuo dado. Por ejemplo, un residuo seleccionado en un anticuerpo seleccionado (o dominio Fab) corresponde a treonina de cadena ligera en la posición de Kabat 40, cuando el residuo seleccionado ocupa la misma relación espacial esencial u otra estructural que una treonina de cadena ligera en la posición de Kabat 40. En algunas modalidades, cuando una proteína seleccionada se alinea para obtener la máxima homología con la cadena ligera de un anticuerpo (o dominio Fab), se dice que la posición en la proteína seleccionada alineada que se alinea con la treonina 40 corresponde a la treonina 40. En lugar de un alineamiento de secuencia primaria, también puede usarse un alineamiento estructural tridimensional, por ejemplo, donde la estructura de la proteína seleccionada se alinea para una correspondencia máxima con la treonina de cadena ligera en la posición de Kabat 40, y se comparan las estructuras generales. En este caso, se dice que un aminoácido que ocupa la misma posición esencial que la treonina 40 en el modelo estructural corresponde al residuo de treonina 40.

El término "variantes modificadas de manera conservadora" se aplica tanto a las secuencias de aminoácidos como de ácidos nucleicos. Con respecto a las secuencias particulares de ácidos nucleicos, las variantes modificadas de manera conservadora se refiere a aquellos ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos idénticas o esencialmente idénticas, o cuando el ácido nucleico no codifica una secuencia de aminoácidos, a secuencias esencialmente idénticas. Debido a la redundancia del código genético, un gran número de secuencias de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos codifican cualquier residuo de aminoácido dado. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU codifican el aminoácido alanina. Por lo tanto, en cada posición donde se especifica una alanina mediante un codón, el codón se puede alterar a cualquiera de los codones correspondientes descritos sin alterar el polipéptido codificado. Tales variaciones de ácidos nucleicos son "variaciones silentes", que son una especie de variaciones modificadas de manera conservadora. Cada secuencia de ácido nucleico en la presente descripción que codifica un polipéptido además describe cada posible variación silente del ácido nucleico. Alguien con experiencia reconocerá que cada codón en un ácido nucleico (excepto AUG, que es ordinariamente el único codón para metionina, y TGG, que es ordinariamente el único codón para triptófano) se puede modificar para producir una molécula funcionalmente idéntica. En consecuencia, cada variación silente de un ácido nucleico que codifica un polipéptido está implícita en cada secuencia descrita con respecto al producto de expresión, pero no con respecto a la secuencia de sonda real.

En cuanto a las secuencias de aminoácidos, alguien con experiencia reconocerá que las sustituciones individuales, supresiones o adiciones a una secuencia de ácido nucleico, péptido, polipéptido, o proteína que altera, añade o suprime un único aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos en la secuencia codificada es una "variante modificada de manera conservadora" donde la alteración resulta en la sustitución de un aminoácido con un aminoácido químicamente similar. Las tablas de sustituciones conservativas que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares se conocen en la técnica. Tales variantes modificadas de manera conservadora son además de y no excluyen las variantes polimórficas, homólogos interespecies y alelos de la descripción.

Los siguientes ocho grupos contienen cada uno aminoácidos que son sustituciones conservadoras entre sí: 1) Alanina (A), Glicina (G); 2) Ácido aspártico (D), Ácido glutámico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptófano (W); 7) Serina (S), Treonina (T); y 8) Cisteína (C), Metionina (M) (ver, por ejemplo, Creighton, Proteínas (1984)).

"Ácido nucleico" se refiere a los desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos y los polímeros de estos ya sea en forma monocatenaria o bicatenaria, y complementos de estos. El término "polinucleótido" se refiere a una secuencia lineal de nucleótidos. El término "nucleótido" se refiere típicamente a una sola unidad de un polinucleótido, es decir, un monómero. Los nucleótidos pueden ser ribonucleótidos, desoxirribonucleótidos, o versiones modificadas de estos. Los ejemplos de polinucleótidos contemplados en la presente descripción incluyen ADN monocatenario y bicatenario, ARN monocatenario y bicatenario (que incluyen ARNip), y moléculas híbridas que tienen mezclas de ADN y ARN monocatenario y bicatenario. El ácido nucleico, como se usa en la presente descripción, también se refiere a ácidos nucleicos que tienen la misma estructura química básica que un ácido nucleico de origen natural. Tales análogos tienen azúcares modificadas y/o sustituyentes de anillo modificados, pero retienen la misma estructura química básica que el ácido nucleico de origen natural. Un mimético de ácido nucleico se refiere a los compuestos químicos que tienen una estructura que es diferente de la estructura química general de un ácido nucleico, pero que funciona de manera similar a un ácido nucleico de origen natural. Los ejemplos de tales análogos incluyen, sin limitarse a, fosforotioatos, fosforamidatos, fosfonatos de metilo, fosfonatos de metilo quirales, 2-O-metil ribonucleótidos, y ácidos peptidonucleicos (PNA).

"El porcentaje de identidad de secuencia" se determina por la comparación de dos secuencias óptimamente alineadas sobre una ventana de comparación, en donde la porción de la secuencia de polinucleótidos o polipéptido en la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (es decir, interrupciones) en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o deleciones) para el alineamiento óptimo de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando el número de posiciones en las que el residuo de aminoácido o de base de ácido nucleico idéntico ocurre en ambas secuencias para producir el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes por el número total de posiciones en la ventana de comparación y multiplicando el resultado por 100 para obtener el porcentaje de identidad de secuencia.

Los términos "idéntico" o porcentaje de "identidad", en el contexto de dos o más ácidos nucleicos o secuencias de polipéptidos, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o tienen un porcentaje específico de residuos de aminoácidos o nucleótidos que son los mismo (es decir, 60 % de identidad, opcionalmente 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, o 99 % de identidad sobre una región específica, por ejemplo, de todas las secuencias de polipéptidos de la invención o dominios individuales de los polipéptidos de la invención), cuando se comparan y alinean para una correspondencia máxima sobre una ventana de comparación, o región designada como se mide mediante el uso uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencias o mediante alineamiento manual e inspección visual. Entonces se dice que tales secuencias son "sustancialmente idénticas." Esta definición además se refiere al complemento de una secuencia de prueba. Opcionalmente, la identidad existe sobre una región que tiene al menos aproximadamente 50 nucleótidos de longitud, o más preferentemente sobre una región que tiene 100 a 500 o 1000 o más nucleótidos de longitud. La presente invención incluye polipéptidos que son sustancialmente idénticos a cualquiera de las SEQ ID NO:1-35.

Para la comparación de secuencias, típicamente una secuencia actúa como una secuencia de referencia, con la que se comparan las secuencias de prueba. Al usar un algoritmo de comparación de secuencias, las secuencias de prueba y de referencia se introducen en un ordenador, si es necesario se designan coordenadas posteriores, y se designan los parámetros del programa del algoritmo de secuencia. Pueden usarse parámetros de programa predeterminados o pueden designarse parámetros alternativos. Después, el algoritmo de comparación de secuencias calcula el porcentaje de identidad de secuencia para las secuencias de prueba con relación a la secuencia de referencia, en base a los parámetros de programa.

Una "ventana de comparación", como se usa en la presente descripción, incluye la referencia a un segmento de cualquiera del número de posiciones contiguas seleccionadas del grupo que consiste en por ejemplo, una secuencia completa o de 20 a 600, aproximadamente 50 a aproximadamente 200, o aproximadamente 100 a aproximadamente 150 aminoácidos o nucleótidos en el que una secuencia puede compararse con una secuencia de referencia de este número de posiciones contiguas después de que las dos secuencias se alinean óptimamente. Los métodos de alineamiento de secuencias para comparación son bien conocidos en la técnica. El alineamiento óptimo de las secuencias para la comparación puede realizarse, por ejemplo, por el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (1970) Adv. Appl. Math. 2:482c, por el algoritmo de alineamiento por homología de Needleman and Wunsch, (1970) J. Mol. Biol. 48:443, mediante el método de búsqueda de similitudes de Pearson y Lipman (1988) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444, por implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en el paquete de software de Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), o por alineamiento manual e inspección visual (ver, por ejemplo, Ausubel y otros, Current Protocols in Molecular Biology (1995 suplemento)).

Un ejemplo de un algoritmo que es adecuado para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y la similitud de secuencias son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que se describen en Altschul y otros. (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 y Altschul y otros, (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410, respectivamente. El software para ejecutar los análisis BLAST está disponible públicamente a través del Centro Nacional para la Información Biotecnológica (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo incluye primero identificar los pares de secuencia con puntuación alta (HSP) mediante la identificación de palabras cortas de longitud W en la secuencia de búsqueda, que coincide o satisface algunas puntuaciones T umbrales de valor positivo cuando se alinean con una palabra de esta longitud en una secuencia de la base de datos. T se denomina el umbral de puntuación de palabras vecinas (Altschul y otros, más arriba). Estos aciertos de palabras vecinas iniciales actúan como semillas para iniciar las búsquedas para encontrar HSP más largos que los contengan. Los aciertos de palabras se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia hasta que pueda aumentarse la puntuación acumulativa del alineamiento. Los registros acumulativos se calculan por medio del uso de, para secuencias de nucleótidos, los parámetros M (puntuación de recompensa para un par de residuos coincidentes; siempre > 0) y N (puntuación de penalización para residuos no coincidentes; siempre < 0). Para las secuencias de aminoácidos, se usa una matriz de puntuación para calcular el registro acumulativo. Las extensiones de los aciertos de las palabras vecinas en cada dirección se detienen cuando: la puntuación de alineamiento acumulativa disminuye en una cantidad X desde su máximo valor alcanzado; la puntuación acumulativa va a cero o por debajo de cero debido a la acumulación de uno o más alineamientos de residuos con puntuación negativa; o se alcanza el extremo de cualquiera de las secuencias. Los parámetros W, T y X del algoritmo BLAST determinan la sensibilidad y la velocidad del alineamiento. El programa BLASTN (para las secuencias de nucleótidos) usa como defecto una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) o 10, M=5, N=-4, y una comparación de ambas cadenas. Para las secuencias de aminoácidos, el programa BLASTN usa como defecto una longitud de palabra de 3, y expectativa (E) de 10, y los alineamientos con la matriz de puntuación BLOSUM62 (ver Henikoff y Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915), alineaciones (B) de 50, expectativa (E) de 10, M=5, N=-4 y una comparación de ambas cadenas.

El algoritmo BLAST realiza además un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias; (ver, por ejemplo, Karlin y Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787). Una medida de la similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de la suma más pequeña (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad con que dos secuencias de nucleótidos o de aminoácidos coincidan al azar. Por ejemplo, un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de la suma más pequeña en una comparación entre el ácido nucleico de la prueba y uno de referencia es menor de aproximadamente 0,2, con mayor preferencia si es menor de aproximadamente 0,01, y con preferencia superlativa si es menor de aproximadamente 0,001.

Una indicación de que dos secuencias de ácidos nucleicos o polipéptidos son sustancialmente idénticas es que el polipéptido codificado por el primer ácido nucleico es inmunológicamente reactivo en forma cruzada con los anticuerpos generados contra el polipéptido codificado por el segundo ácido nucleico, como se describe más abajo. Por lo tanto, típicamente un polipéptido es sustancialmente idéntico a un segundo polipéptido, por ejemplo, cuando los dos péptidos difieren sólo por sustituciones conservativas. Otra indicación de que dos secuencias de ácidos nucleicos son sustancialmente idénticas es que las dos moléculas o sus complementos hibridan entre sí en condiciones rigurosas, como se describe más abajo. Aun otra indicación de que dos secuencias de ácido nucleico son sustancialmente idénticas es que pueden usarse los mismos cebadores para amplificar la secuencia.

La palabra "expresión" o "expresado" como se usa en la presente descripción en referencia a un gen significa el producto transcripcional y/o traduccional de ese gen. El nivel de expresión de una molécula de ADN en una célula puede determinarse basándose ya sea en la cantidad de ARNm correspondiente que está presente dentro de la célula o en la cantidad de proteína codificada por ese ADN producido por la célula. El nivel de expresión de moléculas de ácido nucleico no codificantes (por ejemplo, ARNip) puede detectarse mediante métodos estándar de PCR o membrana de Northern bien conocidos en la técnica. Ver, Sambrook y otros, 1989 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 18.1-18.88.

La expresión de un gen transfectado puede ocurrir de forma transitoria o estable en una célula. Durante la "expresión transitoria" el gen transfectado no se transfiere a la célula hija durante la división celular. Dado que su expresión se restringe a la célula transfectada, la expresión del gen se pierde con el tiempo. Por el contrario, la expresión estable de un gen transfectado puede ocurrir cuando el gen se cotransfecta con otro gen que confiere una ventaja de selección a la célula transfectada. Una ventaja de selección de ese tipo puede ser una resistencia hacia una determinada toxina que se presenta a la célula. La expresión de un gen transfectado puede lograrse además mediante la inserción mediada por transposón en el genoma del huésped. Durante la inserción mediada portransposones, el gen se posiciona de una manera predecible entre dos secuencias enlazadoras de transposones que permiten la inserción en el genoma del huésped así como también la posterior escisión. La expresión estable de un gen transfectado puede lograrse además infectando una célula con un vector lentivírico, que después de la infección forma parte del genoma celular (se integra en él) resultando de esta manera en una expresión estable del gen.

Los términos "plásmido", "vector" o "vector de expresión" se refieren a una molécula de ácido nucleico que codifica genes y/o elementos reguladores necesarios para la expresión de genes. La expresión de un gen a partir de un plásmido puede ocurrir en cis o en trans. Si un gen se expresa en cis, el gen y los elementos reguladores se codifican por el mismo plásmido. La expresión en trans se refiere al caso cuando el gen y los elementos reguladores se codifican por plásmidos separados.

Los términos "transfección", "transducción", "transfectar" o "transducir" pueden usarse indistintamente y se definen como un proceso para introducir una molécula de ácido nucleico o una proteína en una célula. Los ácidos nucleicos se introducen en una célula mediante el uso de métodos no virales o basados en virus. Las moléculas de ácido nucleico pueden ser secuencias de genes que codifican proteínas completas o porciones funcionales de estas. Los métodos de transfección no virales incluyen cualquier método de transfección apropiado que no use ADN viral o partículas virales como sistema de administración para introducir la molécula de ácido nucleico en la célula. Los métodos de transfección no viral ilustrativos incluyen transfección con fosfato cálcico, transfección liposomal, nucleofección, sonoporación, transfección a través de choque térmico, magnetifección y electroporación. En algunas modalidades, las moléculas de ácido nucleico se introducen en una célula mediante el uso de electroporación siguiendo procedimientos estándar bien conocidos en la técnica. Para los métodos de transfección basados en virus, puede usarse cualquier vector viral útil en los métodos descritos en la presente descripción. Los ejemplos de vectores virales incluyen, pero sin limitarse a, vectores retrovirales, adenovirales, lentivirales y virales adenoasociados. En algunas modalidades, las moléculas de ácido nucleico se introducen en una célula mediante el uso de un vector retroviral siguiendo procedimientos estándar bien conocidos en la técnica. Los términos "transfección" o "transducción" también se refieren a introducir proteínas en una célula desde el entorno externo. Típicamente, la transducción o transfección de una proteína se basa en la unión de un péptido o proteína capaz de cruzar la membrana celular a la proteína de interés. Ver, por ejemplo, Ford y otros. (2001) Gene Therapy 8:1-4 y Prochiantz (2007) Nat. Methods 4:119-20.

"Anticuerpo" se refiere a un polipéptido que comprende una región marco de un gen de inmunoglobulina o fragmentos de este que se une y reconoce específicamente un antígeno. Los genes de inmunoglobulina reconocidos incluyen los genes de la región constante kappa, lambda, alfa, gamma, delta, épsilon y mu, así como el sinnúmero de genes de región variable de las inmunoglobulinas. Las cadenas ligeras se clasifican ya sea como kappa o lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta o épsilon, las que a su vez definen las clases de inmunoglobulina, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente. Típicamente, la región de unión al antígeno de un anticuerpo juega un papel importante en la determinación de la especificidad y afinidad de la unión. En algunas modalidades, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos pueden derivarse de diferentes organismos, que incluyen humanos, ratones, ratas, hámsteres, camellos, etc. Los anticuerpos de la invención pueden incluir anticuerpos que se han modificado o mutado en una o más posiciones de aminoácidos para mejorar o modular una función deseada del anticuerpo (por ejemplo, glicosilación, expresión, reconocimiento de antígenos, funciones efectoras, unión de antígenos, especificidad, etc.).

Los anticuerpos son moléculas grandes y complejas (peso molecular de — 150000 o aproximadamente 1320 aminoácidos) con una estructura interna intrincada. Una molécula de anticuerpo natural contiene dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, cada par tiene una cadena ligera y una cadena pesada. Cada cadena ligera y cadena pesada a su vez consiste de dos regiones: una región variable ("V") involucrada en la unión del antígeno objetivo, y una región constante ("C") que interactúa con otros componentes del sistema inmunológico. Las regiones variables de la cadena ligera y pesada se unen en un espacio de 3 dimensiones para formar una región variable que se une al antígeno (por ejemplo, un receptor en la superficie de una célula). Dentro de cada región variable de cadena ligera o pesada, hay tres segmentos cortos (con un promedio de 10 aminoácidos de longitud) denominados regiones determinantes de complementariedad ("CDR"). Las seis CDR en un dominio variable de anticuerpo (tres de la cadena ligera y tres de la cadena pesada) se pliegan juntas en un espacio de 3 dimensiones para formar el sitio de unión del anticuerpo real que se acopla al antígeno objetivo. La posición y la longitud de las CDR se han definido con precisión por Kabat, E. y otros, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Departamento de Salud y Servicios Humanos de Estados Unidos, 1983, 1987. La parte de una región variable que no se contiene en las CDR se denomina marco ("FR"), que forma el entorno para las CDR.

Una unidad estructural de inmunoglobulina (anticuerpo) ilustrativa comprende un tetrámero. Cada tetrámero se compone de dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, cada par tiene una cadena "ligera" (aproximadamente 25 kDa) y una "pesada" (aproximadamente 50-70 kDa). El N-terminal de cada cadena define una región variable de aproximadamente 100 a 110 aminoácidos o más responsables principalmente del reconocimiento antigénico. Los términos cadena ligera variable (VL) o región variable de cadena ligera y cadena pesada variable (VH) o región variable de cadena pesada se refieren a estas regiones de cadena ligera y pesada, respectivamente. Los términos cadena ligera variable (VL) y región variable de cadena ligera como se hace referencia en la presente descripción pueden usarse indistintamente. Los términos cadena pesada variable (VH) y región variable de cadena pesada como se hace referencia en la presente descripción pueden usarse indistintamente. La Fc (es decir, la región cristalizable del fragmento) es la "base" o la "cola" de una inmunoglobulina y se compone típicamente por dos cadenas pesadas que contribuyen con dos o tres dominios constantes dependiendo de la clase de anticuerpo. Al unirse a las proteínas específicas, la región Fc asegura que cada anticuerpo genere una respuesta inmune apropiada para un antígeno dado. La región Fc también se une a varios receptores celulares, tales como los receptores Fc, y otras moléculas inmunes, tales como las proteínas del complemento.

El término "antígeno" como se proporciona en la presente descripción se refiere a moléculas capaces de unirse a la región del anticuerpo proporcionada en la presente descripción, en donde el sitio de unión no es el sitio de unión del péptido.

Los anticuerpos existen, por ejemplo, como inmunoglobulinas intactas o como una serie de fragmentos bien caracterizados producidos por la digestión con diversas peptidasas. Por lo tanto, por ejemplo, la pepsina digiere un anticuerpo por debajo de los enlaces disulfuro en la región bisagra para producir F(ab)'2, un dímero de Fab que a su vez es una cadena ligera unida a VH-CH1 mediante un enlace disulfuro. El F(ab)'2 puede reducirse en condiciones suaves para romper el enlace disulfuro en la región bisagra, convirtiendo así el dímero F(ab)'2 en un monómero Fab'. El monómero Fab' es sustancialmente la porción de unión al antígeno con parte de la región bisagra (ver Fundamental Immunology (Paul ed., 3ra ed. 1993). Mientras se definen varios fragmentos de anticuerpos en términos de la digestión de un anticuerpo intacto, un experto apreciará que tales fragmentos pueden sintetizarse de novo ya sea químicamente o mediante el uso de metodología de ADN recombinante. Por lo tanto, el término anticuerpo, como se usa en la presente descripción, también incluye fragmentos de anticuerpos producidos por la modificación de anticuerpos completos, o aquellos sintetizados de novo mediante el uso de metodologías de ADN recombinante (por ejemplo, Fv monocatenario) o aquellos identificados mediante el uso de bibliotecas de presentación de fagos (ver, por ejemplo, McCafferty y otros, Nature 348: 552-554 (1990)).

Un fragmento variable de cadena sencilla (scFv) es típicamente una proteína de fusión de las regiones variables de las cadenas pesada (VH) y ligera (VL) de inmunoglobulinas, conectadas con un péptido corto enlazador de 10 a aproximadamente 25 aminoácidos. El enlazador normalmente puede ser rico en glicina para la flexibilidad, así como también serina o treonina para la solubilidad. El enlazador puede conectar ya sea el N-terminal de la VH con el C-terminal de la VL, o viceversa.

El epítopo de un mAb es la región de su antígeno a la que se une el mAb. Dos anticuerpos se unen al mismo epítopo o al solapado si cada uno inhibe competitivamente (bloquea) la unión del otro al antígeno. Es decir, un exceso de 1x, 5x, 10x, 20x o 100x de un anticuerpo inhibe la unión del otro en al menos 30 %, pero preferentemente 50 %, 75 %, 90 % o incluso 99 % medido en un ensayo de unión competitiva (ver, por ejemplo,Junghans y otros, Cancer Res. 50:1495, 1990). Alternativamente, dos anticuerpos tienen el mismo epítopo si esencialmente todas las mutaciones de aminoácidos en el antígeno que reducen o eliminan la unión de un anticuerpo, reducen o eliminan la unión del otro. Dos anticuerpos tienen epítopos solapados si algunas mutaciones de aminoácidos que reducen o eliminan la unión de un anticuerpo reducen o eliminan la unión del otro.

Para la preparación de anticuerpos adecuados de la descripción y para su uso de acuerdo con la invención, por ejemplo, anticuerpos recombinantes, monoclonales, o policlonales, pueden usarse muchas técnicas conocidas en la técnica (ver, por ejemplo, Kohler y Milstein, Nature 256: 495-497 (1975).); Kozbory otros, Immunology Today 4:72 (1983); Cole y otros, págs. 77-96 en Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985); Coligan, Current Protocols in Immunology (1991); Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (1988); y Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2d ed. 1986)). Los genes que codifican las cadenas pesada y ligera de un anticuerpo de interés pueden clonarse a partir de una célula, por ejemplo, los genes que codifican un anticuerpo monoclonal pueden clonarse a partir de un hibridoma y usarse para producir un anticuerpo monoclonal recombinante. También pueden prepararse bibliotecas de genes que codifican cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos monoclonales a partir de hibridomas o células plasmáticas. Las combinaciones aleatorias de los productos génicos de las cadenas pesada y ligera generan una gran cantidad de anticuerpos con diferente especificidad antigénica (ver, por ejemplo, Kuby, Immunology (3ra ed. 1997)). Técnicas para la producción de anticuerpos monocatenarios o anticuerpos recombinantes (Patente de Estados Unidos 4,946,778, Patente de Estados Unidos Núm. 4,816,567) puede adaptarse para producir anticuerpos contra polipéptidos de esta invención. Además, pueden usarse ratones transgénicos u otros organismos tales como otros mamíferos para expresar anticuerpos humanizados o humanos (ver, por ejemplo, Patentes de Estados Unidos núms. 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016, Marks y otros, Bio/Technology 10:779-783 (1992); Lonberg y otros, Nature 368:856-859 (1994); Morrison, Nature 368:812-13 (1994).); Fishwild y otros, Nature Biotechnology 14: 845 51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14:826 (1996).); y Lonberg & Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995)). Alternativamente, la tecnología de presentación de fagos puede usarse para identificar anticuerpos y fragmentos Fab heteroméricos que se unen específicamente a antígenos seleccionados (ver, por ejemplo, McCafferty y otros, Nature 348:552-554 (1990); Marks y otros, Biotechnology 10:779-783 (1992)). Los anticuerpos también pueden volverse biespecíficos, es decir, capaces de reconocer dos antígenos diferentes (ver, por ejemplo, documento de patente núm. WO 93/08829, Traunecker y otros, EMBO J. 10: 3655-3659 (1991); y Suresh y otros, Methods in Enzymology 121: 210 (1986)). Los anticuerpos también pueden ser heteroconjugados, por ejemplo, dos anticuerpos unidos covalentemente o inmunotoxinas (ver, por ejemplo, Patente de Estados Unidos Núm. 4,676,980, documentos de Patentes núms. WO 91/00360; WO 92/200373; y EP 03089).

Los métodos para humanizar o cebar anticuerpos no humanos son bien conocidos en la técnica (por ejemplo, Patentes de Estados Unidos Núms. 4,816,567; 5,530,101; 5,859,205; 5,585,089; 5,693,761; 5,693,762; 5,777,085; 6,180,370; 6,210,671; y 6,329,511; documento de Patente Núms. WO 87/02671; Solicitud de patente núm. EP 0173494; Jones y otros (1986) Nature 321: 522; y Verhoyen y otros (1988) Science 239: 1534). Los anticuerpos humanizados se describen adicionalmente en, por ejemplo, Winter y Milstein (1991) Nature 349:293. Generalmente, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de aminoácidos introducidos en él a partir de una fuente que no es humana. Estos residuos de aminoácidos no humanos se denominan frecuentemente como residuos importados, que típicamente derivan de un dominio variable importado. La humanización puede realizarse esencialmente siguiendo el método de Winter y colaboradores (ver, por ejemplo, Morrison y otros, PNAS USA, 81:6851-6855 (1984), Jones y otros, Nature 321:522-525 (1986); Riechmann y otros, Nature 332:323-327 (1988); Morrison y Oi, Adv. Immunol., 44:65-92 (1988), Verhoeyen y otros, Science 239:1534-1536 (1988) y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992)), Padlan, Molec. Immun., 28: 489-498 (1991); Padlan, Molec. Immun., 31(3): 169-217 (1994).)), sustituyendo las secuencias de CDR o las CDR de roedor por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. En consecuencia, tales anticuerpos humanizados son anticuerpos quiméricos (Patente de Estados Unidos núm. 4,816,567), en donde sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto se ha sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son típicamente anticuerpos humanos en los cuales algunos residuos de CDR y posiblemente algunos residuos de FR se sustituyen por residuos de sitios análogos en los anticuerpos de roedor. Por ejemplo, los polinucleótidos que comprenden una primera secuencia que codifica las regiones marco de inmunoglobulina humanizada y un segundo conjunto de secuencias que codifica las regiones determinantes de complementariedad de inmunoglobulina deseada pueden producirse sintéticamente o combinando segmentos apropiados de ADNc y ADN genómico. Las secuencias de ADN de la región constante humana pueden aislarse de acuerdo con procedimientos bien conocidos de una variedad de células humanas.

Un "anticuerpo quimérico" es una molécula de anticuerpo en la cual (a) la región constante, o una parte de esta, se altera, reemplaza o intercambia de manera que el sitio de unión al antígeno (región variable) se enlaza a una región constante de una clase diferente o alterada, función efectora y/o especie, o una molécula completamente diferente que confiere nuevas propiedades al anticuerpo quimérico, por ejemplo, una enzima, toxina, hormona, factor de crecimiento, fármaco, etc.; o (b) la región variable, o una porción de esta, se altera, reemplaza o intercambia con una región variable que tiene una especificidad antigénica diferente o alterada. Los anticuerpos preferidos y para su uso de acuerdo con la invención incluyen anticuerpos monoclonales humanizados y/o quiméricos.

Un "anticuerpo terapéutico" como se proporciona en la presente descripción se refiere a cualquier anticuerpo o fragmento funcional de este que se usa para tratar cáncer, enfermedades autoinmunes, rechazo de trasplantes, enfermedad cardiovascular u otras enfermedades o afecciones como las descritas en la presente descripción. Los ejemplos no limitantes de anticuerpos terapéuticos incluyen anticuerpos murinos, anticuerpos quimera murinizados o humanizados o anticuerpos humanos que incluyen, pero no se limitan a, Erbitux (cetuximab), ReoPro (abciximab), Simulect (basiliximab), Remicade (infliximab); Orthoclone OKT3 (muromonab-CD3); Rituxan (rituximab), Bexxar (tositumomab) Humira (adalimumab), Campath (alemtuzumab), Simulect (basiliximab), Avastin (bevacizumab), Cimzia (certolizumab pegol), Zenapax (daclizumab), Soliris (eculizumab), Raptiva (efalizumab), Mylotarg (gemtuzumab), Zevalin (ibritumomab tiuxetan), Tysabri (natalizumab), Xolair (omalizumab), Synagis (palivizumab), Vectibix (panitumumab), Lucentis (ranibizumab), y Herceptin (trastuzumab).

Las técnicas para conjugar agentes terapéuticos con anticuerpos son bien conocidas (ver, por ejemplo, Arnon y otros, "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", en Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld y otros (eds.), págs. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom y otros, "Antibodies For Drug Delivery"in Controlled Drug Delivery (2da Ed.), Robinson y otros (eds.), págs. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review" en Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera y otros. (eds.), págs. 475-506 (1985); y Thorpe y otros, "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62:119-58 (1982)). Como se usa en la presente descripción, el término "conjugado anticuerpo-fármaco" o "ADC" se refiere a un agente terapéutico conjugado o unido covalentemente de cualquier otra manera a un anticuerpo. Un "agente terapéutico" como se refiere en la presente descripción, es una composición útil para tratar o prevenir una enfermedad tal como el cáncer.

La frase "se une específicamente (o selectivamente)" a un anticuerpo o "específicamente (o selectivamente) inmunorreactivo con", cuando se refiere a una proteína o péptido, se refiere a una reacción de unión que es determinante de la presencia de la proteína, frecuentemente en un población heterogénea de proteínas y otros biológicos. Por tanto, bajo condiciones de inmunoensayo designadas, los anticuerpos especificados se unen a una proteína particular al menos dos veces del fondo y más típicamente más de 10 a 100 veces del fondo. La unión específica a una proteína bajo tales condiciones requiere típicamente un anticuerpo que se selecciona por su especificidad por una proteína particular. Por ejemplo, pueden seleccionarse anticuerpos policlonales para obtener solo un subconjunto de anticuerpos que sean específicamente inmunorreactivos con el antígeno seleccionado y no con otras proteínas. Esta selección puede lograrse restando los anticuerpos que reaccionan de forma cruzada con otras moléculas. Puede usarse una variedad de formatos de inmunoensayos para seleccionar anticuerpos específicamente inmunorreactivos con una proteína particular. Por ejemplo, los inmunoensayos ELISA en fase sólida se usan de forma rutinaria para seleccionar anticuerpos específicamente inmunorreactivos con una proteína (ver, por ejemplo, Harlow & Lane, Using Antibodies, A Laboratory Manual (1998)) para obtener una descripción de los formatos y las condiciones de los inmunoensayos que pueden usarse para determinar la inmunorreactividad específica).

proteína).

Un "ligando" se refiere a un agente, por ejemplo, un polipéptido u otra molécula, capaz de unirse a un receptor.

El término "recombinante" cuando se usa con referencia, por ejemplo, a una célula, un ácido nucleico, una proteína, o un vector, indica que la célula, el ácido nucleico, la proteína o el vector se ha modificado o es el resultado de métodos de laboratorio. Por lo tanto, por ejemplo, las proteínas recombinantes incluyen proteínas producidas por métodos de laboratorio. Las proteínas recombinantes pueden incluir residuos de aminoácidos que no se encuentran dentro de la forma nativa (no recombinante) de la proteína o pueden incluir residuos de aminoácidos que se han modificados, por ejemplo, marcados.

El término "heterólogo" cuando se usa con referencia a las porciones de un ácido nucleico indica que el ácido nucleico comprende dos o más subsecuencias que no se encuentran en la naturaleza en igual relación entre sí. Por ejemplo, el ácido nucleico típicamente se produce por vía recombinante, con dos o más secuencias a partir de genes no relacionados dispuestos para preparar un nuevo ácido nucleico funcional, por ejemplo, un promotor a partir de una fuente y una región de codificación a partir de otra fuente. De manera similar, una proteína heteróloga indica que la proteína comprende dos o más subsecuencias que no se encuentran en la naturaleza en igual relación entre sí (por ejemplo, una proteína de fusión).

El término "aislado", cuando se aplica a un ácido nucleico o proteína, indica que el ácido nucleico o proteína está esencialmente libre de otros componentes celulares con los que se asocia en el estado natural. Puede estar, por ejemplo, en un estado homogéneo y puede estar ya sea en seco o solución acuosa. La pureza y la homogeneidad se determinan típicamente mediante el uso de técnicas de química analítica tales como electroforesis en gel de poliacrilamida o cromatografía líquida de alta resolución. Una proteína que es la especie predominante presente en una preparación se purifica sustancialmente.

"Poner en contacto" se usa de acuerdo con su significado corriente y se refiere al proceso de permitir que al menos dos especies distintas (por ejemplo, compuestos químicos que incluyen biomoléculas o células) se vuelvan lo suficientemente próximas para reaccionar, interactuar o tocar físicamente. Debe ser apreciado; sin embargo, el producto de reacción resultante puede producirse directamente a partir de una reacción entre los reactivos añadidos o de un intermedio de uno o más de los reactivos añadidos que pueden producirse en la mezcla de reacción.

El término "poner en contacto" puede incluir permitir que dos especies reaccionen, interactúen o se toquen físicamente, en donde las dos especies pueden ser, por ejemplo, un compuesto como se describe en la presente descripción y una molécula química de impedimento estérico. En las modalidades, poner en contacto incluye, por ejemplo, permitir que un compuesto descrito en la presente descripción interaccione con una molécula química de impedimento estérico.

Una muestra o valor de "control" se refiere a una muestra que sirve como referencia, normalmente una referencia conocida, para compararla con una muestra de prueba. Por ejemplo, una muestra de prueba puede tomarse de una condición de prueba, por ejemplo, en presencia de un compuesto de prueba, y compararse con las muestras de condiciones conocidas, por ejemplo, en ausencia del compuesto de prueba (control negativo), o en presencia de un compuesto conocido (control positivo). Un control también puede representar un valor promedio obtenido a partir de una serie de pruebas o resultados. Un experto en la técnica reconocerá que los controles pueden diseñarse para la evaluación de cualquier número de parámetros. Por ejemplo, puede diseñarse un control para comparar el beneficio terapéutico basado en datos farmacológicos (por ejemplo, vida media) o medidas terapéuticas (por ejemplo, comparación de efectos secundarios). Un experto en la técnica comprenderá qué controles son valiosos en una situación dada y podrá analizar datos basado en comparaciones con valores de control. Los controles también son valiosos para determinar la importancia de los datos. Por ejemplo, si los valores de un parámetro dado son ampliamente distintos en los controles, la variación en las muestras de prueba no se considerará como significativa.

"Paciente" o "sujeto que lo necesita" se refiere a un organismo vivo que padece o es propenso a una enfermedad o afección que puede tratarse mediante la administración de una composición o composición farmacéutica como se proporciona en la presente descripción. Los ejemplos no limitantes incluyen seres humanos, otros mamíferos, bovinos, ratas, ratones, perros, monos, cabras, ovejas, vacas, ciervos, y otros animales no mamíferos. En algunas modalidades, un paciente es un humano.

Los términos "enfermedad" o "afección" se refieren a un estado de salud o estado de salud de un paciente o sujeto capaz de ser tratado con un compuesto, composición farmacéutica, o método proporcionado en la presente descripción. En las modalidades, la enfermedad es cáncer (por ejemplo, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, osteosarcoma, cáncer de vejiga, cáncer de cuello uterino, cáncer de hígado, cáncer de riñón, cáncer de piel (por ejemplo, carcinoma de células de Merkel), cáncer de testículo, leucemia, linfoma, cáncer de cabeza y cuello, cáncer colorrectal, cáncer de próstata, cáncer de páncreas, melanoma, cáncer de mama, neuroblastoma).

Los términos "tratar", o "tratamiento" se refieren a cualquier indicio de éxito en el tratamiento o mejora de una lesión, enfermedad, patología o afección, que incluyen cualquier parámetro objetivo o subjetivo, tal como la atenuación; remisión; disminución de los síntomas o hacer la lesión, patología o afección más tolerable para el paciente; desaceleración en la tasa de degeneración o declive; hacer que el punto final de la degeneración sea menos debilitante; mejorar el bienestar físico o mental de un paciente. El tratamiento o la mejora de los síntomas puede basarse en parámetros objetivos o subjetivos; que incluyen los resultados de un examen físico, exámenes neuropsiquiátricos, y/o una evaluación psiquiátrica. El término "tratar" y las conjugaciones de esto, incluyen la prevención de una lesión, patología, afección, o enfermedad. En las modalidades, "tratar" se refiere al tratamiento del cáncer.

Una "cantidad efectiva" es una cantidad suficiente de un compuesto para cumplir un propósito establecido con relación a la ausencia del compuesto (por ejemplo, lograr el efecto para el que se administra, tratar una enfermedad, reducir la actividad enzimática, aumentar la actividad enzimática, reducir una señalización vía, o reducir uno o más síntomas de una enfermedad o afección). Un ejemplo de una "cantidad terapéuticamente efectiva" es una cantidad suficiente para contribuir al tratamiento, prevención, o reducción de un síntoma o síntomas de una enfermedad, que también podría denominarse como una "cantidad terapéuticamente efectiva." Una "reducción" de un síntoma o síntomas (y los equivalentes gramaticales de esta frase) significa la disminución de la gravedad o la frecuencia del(los) síntoma(s), o la eliminación de los síntoma(s). Las cantidades exactas dependerán del propósito del tratamiento, y un experto en la técnica podrá determinarlas mediante el uso de técnicas conocidas (ver, por ejemplo, Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vols.

1-3, 1992); Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999); Pickar, Dosage Calculations (1999); y Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20ma Edición, 2003, Gennaro, Ed., Lippincott, Williams & Wilkins).

Como se usa en la presente descripción, el término "cáncer" se refiere a todos los tipos de cáncer, neoplasma o tumores malignos que se encuentran en mamíferos, que incluyen leucemias, linfomas, melanomas, tumores neuroendocrinos, carcinomas y sarcomas. Los cánceres ilustrativos que pueden tratarse con un compuesto, composición farmacéutica, o método proporcionado en la presente descripción incluyen linfoma, sarcoma, cáncer de vejiga, cáncer de huesos, tumor cerebral, cáncer de cuello uterino, cáncer de colon, cáncer de esófago, cáncer gástrico, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de riñón, mieloma, cáncer de tiroides, leucemia, cáncer de próstata, cáncer de mama (por ejemplo, triple negativo, ER positivo, ER negativo, resistente a la quimioterapia, resistente a herceptina, HER2 positivo, resistente a la doxorrubicina, resistente al tamoxifeno, carcinoma ductal, carcinoma lobular, primario, metastásico), cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de hígado (por ejemplo, carcinoma hepatocelular), cáncer de pulmón (por ejemplo, carcinoma de pulmón de células no pequeñas, carcinoma de pulmón de células escamosas, adenocarcinoma, carcinoma de pulmón de células grandes, carcinoma de pulmón de células pequeñas, carcinoide, sarcoma), glioblastoma multiforme, glioma, melanoma, cáncer de próstata, cáncer de próstata resistente a la castración, cáncer de mama, cáncer de mama triple negativo, glioblastoma, cáncer de ovario, cáncer de pulmón, carcinoma de células escamosas (por ejemplo, cabeza, cuello, o esófago), cáncer colorrectal, leucemia, leucemia mieloide aguda, linfoma, linfoma de células B, o mieloma múltiple. Los ejemplos adicionales incluyen cáncer de tiroides, sistema endocrino, cerebro, mama, cuello uterino, colon, cabeza y cuello, esófago, hígado, riñón, pulmón, pulmón de células no pequeñas, melanoma, mesotelioma, ovario, sarcoma, estómago, útero o Meduloblastoma, enfermedad de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, mieloma múltiple, neuroblastoma, glioma, glioblastoma multiforme, cáncer de ovario, rabdomiosarcoma, trombocitosis primaria, macroglobulinemia primaria, tumores cerebrales primarios, cáncer, insulanoma pancreático maligno, carcinoide maligno, cáncer de vejiga primario, lesiones premalignas de piel, cáncer de testículo, linfomas, cáncer de tiroides, neuroblastoma, cáncer de esófago, cáncer del tracto genitourinario, hipercalcemia maligna, cáncer de endometrio, cáncer cortical suprarrenal, neoplasias del páncreas endocrino o exocrino, cáncer de tiroides medular, carcinoma de tiroides medular, melanoma, cáncer colorrectal, cáncer de tiroides papilar, carcinoma hepatocelular, enfermedad de Paget del pezón, tumores filoides, carcinoma lobular, carcinoma ductal, cáncer de células estrelladas pancreáticas, cáncer de células estrelladas hepáticas, o cáncer de próstata.

El término "leucemia" se refiere ampliamente a enfermedades malignas, progresivas de los órganos formadores de sangre y se caracteriza generalmente por una proliferación y desarrollo distorsionados de leucocitos y su precursores en la sangre y médula ósea. Generalmente la leucemia se clasifica clínicamente sobre la base de (1) la duración y el carácter de la enfermedad-aguda o crónica; (2) el tipo de célula implicada; mieloide (mielogénica), linfoide (linfogénica), o monocítica; y (3) el aumento o no aumento en el número de células anormales en la sangre-leucémica o aleucémica (subleucémica). Las leucemias ilustrativas que pueden tratarse con un compuesto, composición farmacéutica, o método proporcionado en la presente descripción incluye, por ejemplo, leucemia no linfocítica aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia granulocítica aguda, leucemia granulocítica crónica, leucemia promielocítica aguda, leucemia de células T adultas, leucemia aleucémica, una leucemia leucocitémica, leucemia basofilia, leucemia de blastocitos, leucemia bovina, leucemia mielocítica crónica, leucemia cutis, leucemia embrionaria, leucemia eosinofílica, leucemia de Gross, leucemia de células pilosas, leucemia hemoblástica, leucemia hemocitoblástica, leucemia histiocítica, leucemia de células madre, leucemia monocítica aguda, leucemia leucopénica, leucemia linfática, leucemia linfoblástica, leucemia linfocítica, leucemia linfógena, leucemia linfoide, leucemia de células de linfosarcoma, leucemia de mastocitos, leucemia de megacariocitos, leucemia micromieloblástica, leucemia monocítica, leucemia mieloblástica, leucemia mielocítica, leucemia granulocítica mieloide, leucemia mielomonocítica, leucemia Naegeli, leucemia de células plasmáticas, leucemia plasmacítica, leucemia promielocítica, leucemia de células de Rieder, leucemia de Schilling, leucemia de células madre, leucemia subleucémica, y leucemia de células indiferenciadas.

El término "sarcoma" se refiere generalmente a un tumor que se origina de una sustancia similar al tejido conectivo embrionario y está compuesto generalmente de células estrechamente compactadas embebidas en una sustancia homogénea o fibrilar. Los sarcomas que pueden tratarse con un compuesto, composición farmacéutica, o método proporcionado en la presente descripción incluyen condrosarcoma, fibrosarcoma, linfosarcoma, melanosarcoma, mixosarcoma, osteosarcoma, sarcoma de Abemety, sarcoma adiposo, liposarcoma, sarcoma de la parte blanda alveolar, sarcoma ameloblástico, sarcoma botrioide, sarcoma cloroma, carcinoma chorio, sarcoma embrionario, sarcoma tumor de Wilms, sarcoma endometrial, sarcoma del estroma, sarcoma de Ewing, sarcoma facial, sarcoma fibroblástico, sarcoma de células gigantes, sarcoma granulocítico, sarcoma de Hodgkin, sarcoma hemorrágico pigmentado múltiples idiopático, sarcoma inmunoblástico de células B, linfoma, sarcoma inmunoblástico de células T, sarcoma de Jensen, sarcoma de Kaposi, sarcoma de células de Kupffer, angiosarcoma, leucosarcoma, sarcoma mesenquimoma maligno, sarcoma parosteal, sarcoma reticulocítico, sarcoma de Rous, sarcoma seroquístico, sarcoma sinovial, o sarcoma telangiectásico.

El término "melanoma" significa un tumor que surge del sistema melanocítico de la piel y otros órganos. Los melanomas que pueden tratarse con un compuesto, composición farmacéutica, o método proporcionado en la presente descripción incluyen, por ejemplo, melanoma acral lentiginoso, melanoma amelanótico, melanoma juvenil benigno, melanoma de Cloudman, melanoma S91, melanoma de Harding-Passey, melanoma juvenil, melanoma lentigo maligno, melanoma maligno, melanoma nodular, melanoma subungueal o melanoma de extensión superficial.

El término "carcinoma" se refiere a un nuevo crecimiento maligno compuesto por células epiteliales que tienden a infiltrarse en los tejidos circundantes y dan lugar a metástasis. Los carcinomas ilustrativos que pueden tratarse con un compuesto, composición farmacéutica, o método proporcionado en la presente descripción incluyen, por ejemplo, carcinoma de tiroide medular, carcinoma de tiroides medular familiar, carcinoma acinar, carcinoma acinous, carcinoma adenoquístico, carcinoma adenoide quístico, carcinoma adenomatoso, carcinoma de la corteza suprarrenal, carcinoma alveolar, carcinoma de células alveolares, carcinoma de células basales, carcinoma basocelular, carcinoma basaloide, carcinoma de células basoescamosas, carcinoma broncoalveolar, carcinoma bronquiolar, carcinoma broncogénico, carcinoma cerebriforme, carcinoma colangiocelular, carcinoma coriónico, carcinoma coloide, comedocarcinoma, carcinoma corpus, carcinoma cribiforme, carcinoma en cuirasse, carcinoma cutáneo, carcinoma cilíndrico, carcinoma de células cilíndricas, carcinoma de los conductos, carcinoma ductal, carcinoma duro, carcinoma embrionario, carcinoma encefaloide, carcinoma epidermoide, carcinoma de adenoides epitelial, carcinoma exofítico, carcinoma ex ulcera, carcinoma fibroso, carcinoma gelatiniforme, carcinoma gelatinoso, carcinoma de células gigantes, carcinoma gigantocelular, carcinoma glandular, carcinoma de células granulosas, carcinoma matriz pilosa, carcinoma hematoide, carcinoma hepatocelular, carcinoma de células de Hurthle, carcinoma hialina, carcinoma hipernefroide, carcinoma embrionario infantil, carcinoma in situ, carcinoma intraepidérmico, carcinoma intraepitelial, carcinoma de Krompecher, carcinoma de células Kulchitzky, carcinoma de células grandes, carcinoma lenticular, carcinoma lenticular, carcinoma lipomatoso, carcinoma lobular, carcinoma linfoepitelial, carcinoma medular, carcinoma medular, carcinoma melanótico, carcinoma mole, carcinoma mucinoso, carcinoma muciparo, carcinoma mucocelular, carcinoma mucoepidermoide, carcinoma mucoso, carcinoma de mucosa, carcinoma mixomatoso, carcinoma nasofaríngeo, carcinoma de células avenoides, carcinoma osificante, carcinoma osteoide, carcinoma papilar, carcinoma periportal, carcinomas preinvasivos, carcinoma de células espinosas, carcinoma pultáceo, carcinoma de células renales del riñón, carcinoma de células de reserva, carcinoma sarcomatoide, carcinoma de Schneider, carcinoma escirroso, carcinoma del escroto, carcinoma de células en anillo de sello, carcinoma simplex, carcinoma de célula pequeña, carcinoma solanoide, carcinoma de células esferoides, carcinoma de células fusiformes, carcinoma esponjoso, carcinoma escamoso, carcinoma de células escamosas, carcinoma del intestino, carcinoma telangiectásico, carcinoma telangiectoides, carcinoma de células de transición, carcinoma tuberoso, carcinoma del túbulo, carcinoma verrugoso, o carcinoma velloso.

Como se usa en la presente descripción, los términos "metástasis", "metastásico", y "cáncer metastásico" pueden usarse indistintamente y se refieren a la propagación de una enfermedad o trastorno proliferativo, por ejemplo, cáncer, de un órgano u otro órgano no adyacente o parte del cuerpo. El cáncer ocurre en un sitio de origen, por ejemplo, mama, cuyo sitio se denomina un tumor primario, por ejemplo, cáncer de mama primario. Algunas células cancerosas en el tumor primario o en el sitio de origen adquieren la capacidad de penetrar e infiltrar el tejido normal circundante en el área local y/o la capacidad de penetrar las paredes del sistema linfático o del sistema vascular que circula a través del sistema a otros sitios y tejidos en el cuerpo. Un segundo tumor detectable clínicamente formado a partir de células cancerosas de un tumor primario se denomina tumor metastásico o secundario. Cuando las células cancerosas hacen metástasis, se presume que el tumor metastásico y sus células sean similares a los del tumor original. Por tanto, si el cáncer de pulmón hace metástasis en la mama, el tumor secundario en el sitio de la mama consiste en células pulmonares anormales y no en células mamarias anormales. El tumor secundario en la mama se denomina un cáncer de pulmón metastásico. Por tanto, la frase cáncer metastásico se refiere a una enfermedad en la cual un sujeto tiene o ha tenido un tumor primario y tiene uno o más tumores secundarios. Las frases cáncer no metastásico o sujetos con cáncer que no es metastásico se refieren a enfermedades en las que los sujetos tienen un tumor primario pero no uno o más tumores secundarios. Por ejemplo, cáncer de pulmón metastásico se refiere a una enfermedad en un sujeto con o con antecedentes de un tumor de pulmón primario y con uno o más tumores secundarios en una segunda ubicación o en múltiples ubicaciones, por ejemplo, en la mama.

"Agente anticanceroso" se usa de acuerdo con su significado ordinario y se refiere a una composición (por ejemplo, compuesto, fármaco, antagonista, inhibidor, modulador) que tiene propiedades antineoplásicas o la capacidad de inhibir el crecimiento o la proliferación de las células. En las modalidades, un agente anticanceroso es un quimioterapéutico. En las modalidades, un agente anticanceroso es un agente identificado en la presente descripción que tiene utilidad en métodos para tratar el cáncer. En las modalidades, un agente anticanceroso es un agente aprobado por la FDA o una agencia reguladora similar de un país distinto de los Estados Unidos, para tratar el cáncer.

El término "asociado" o "asociado con" en el contexto de una sustancia o actividad o función de una sustancia asociada con una enfermedad (por ejemplo, diabetes, cáncer (por ejemplo, cáncer de próstata, cáncer renal, cáncer metastásico, melanoma, cáncer de próstata resistente a la castración, cáncer de mama, cáncer de mama triple negativo, glioblastoma, cáncer de ovario, cáncer de pulmón, carcinoma de células escamosas (por ejemplo, de cabeza, cuello o esófago), cáncer colorrectal, leucemia, leucemia mieloide aguda, linfoma, linfoma de células B, o mieloma múltiple)) significa que la enfermedad (por ejemplo, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, osteosarcoma, cáncer de vejiga, cáncer de cuello uterino, cáncer de hígado, cáncer de riñón, cáncer de piel (por ejemplo, carcinoma de células de Merkel), cáncer testicular, leucemia, linfoma, cáncer de cabeza y cuello, cáncer colorrectal, cáncer de próstata, cáncer de páncreas, melanoma, cáncer de mama, neuroblastoma) se causa por (total o en parte), o un síntoma de la enfermedad es causado por (total o parcialmente) la sustancia o actividad o función de la sustancia.

"Quimioterapéutico" o "agente quimioterapéutico" se usa de acuerdo con su significado ordinario claro y se refiere a una composición química o compuesto que tiene propiedades antineoplásicas o la capacidad de inhibir el crecimiento o la proliferación de células.

El término "aberrante" como se usa en la presente descripción se refiere a diferente de lo normal. Cuando se usa para describir la actividad enzimática, aberrante se refiere a la actividad que es mayor o menor que un control normal o el promedio de las muestras de control normales no enfermas. La actividad aberrante puede referirse a una cantidad de actividad que resulta en una enfermedad, en donde devolver la actividad aberrante a una cantidad normal o no asociada a la enfermedad (por ejemplo, mediante el uso de un método como se describe en la presente descripción), resulta en la reducción de la enfermedad o uno o más síntomas de la enfermedad.

Ácidos nucleicos recombinantes

En la presente descripción se proporcionan composiciones que presentan nuevas capacidades de diagnóstico y permiten añadir rápidamente funcionalidad a la inmunoterapia adoptiva. Las proteínas recombinantes proporcionadas en la presente descripción son útiles, entre otros, para una amplia variedad de propósitos terapéuticos y de diagnóstico. Por ejemplo, las proteínas recombinantes proporcionadas en la presente descripción, que incluyen las modalidades de estas, pueden usarse como un medio no invasivo para caracterizar las células T con receptor de antígeno quimérico (CAR) antes y/o durante el tratamiento de enfermedades (por ejemplo, cáncer). Añadiendo funcionalidad a los inmunorreceptores CAR, una población de pacientes con tumores positivos a antígeno puede tratarse y monitorizarse de forma eficaz independientemente de su genotipo HLA. La inmunoterapia adoptiva mediante el uso de linfocitos T que expresan estos CAR específicos de tumores funcionalmente mejorados puede ser una poderosa estrategia terapéutica para el tratamiento del cáncer y otras enfermedades (por ejemplo, enfermedades infecciosas (por ejemplo, infección por VIH)). Además, mediante el uso de las proteínas recombinantes proporcionadas en la presente descripción, que incluyen las modalidades de estas, permite probar y mejorar la funcionalidad y seguridad de las células T CAR.

En un aspecto, se proporciona un ácido nucleico aislado. El ácido nucleico codifica una proteína que incluye (i) una región de anticuerpo que incluye una cavidad central formada por una región variable de cadena pesada (VH), una región variable de cadena ligera (VL), una región constante de cadena pesada (CH) y una constante de cadena ligera región (CL), en donde la cavidad central forma un sitio de unión del péptido que incluye residuos de aminoácidos de la región marco; y (ii) un dominio transmembrana.

En otro ejemplo, se proporciona un ácido nucleico aislado. El ácido nucleico codifica una proteína que incluye (i) una región de anticuerpo que incluye una cavidad central formada por una región variable de cadena pesada (VH) y una región variable de cadena ligera (VL), en donde la cavidad central forma un sitio de unión del péptido que incluye la región marco de residuos de aminoácidos; y (ii) un dominio transmembrana.

Una "región de anticuerpo", como se proporciona en la presente descripción, se refiere a una porción de proteína monovalente o multivalente que forma parte de la proteína proporcionada en la presente descripción, que incluyen las modalidades de esta. Por tanto, un experto en la técnica reconocería inmediatamente que la región del anticuerpo es una porción de proteína capaz de unirse a un antígeno (epítopo). Por tanto, la región de anticuerpo proporcionada en la presente descripción puede incluir un dominio de un anticuerpo o fragmento (por ejemplo, Fab) de este. En las modalidades, la región del anticuerpo es un conjugado de proteína. Un "conjugado de proteína" proporcionado en la presente descripción se refiere a una construcción que consiste de más de un polipéptido, en donde los polipéptidos se unen entre sí de forma covalente o no covalente. En las modalidades, el conjugado de proteína incluye una porción Fab (un Fab monovalente) unido covalentemente a una porción scFv (un scFv monovalente). En las modalidades, el conjugado de proteína incluye una pluralidad (al menos dos) de porciones Fab. En las modalidades, los polipéptidos de un conjugado de proteína se codifican por una molécula de ácido nucleico. En las modalidades, los polipéptidos de un conjugado de proteína se codifican por diferentes moléculas de ácido nucleico. En las modalidades, los polipéptidos se conectan a través de un enlazador. En las modalidades, los polipéptidos se conectan a través de un enlazador químico.

En las modalidades, la región del anticuerpo incluye una pluralidad de dominios de cadena ligera variable y una pluralidad de dominios de cadena pesada variable. Un "dominio de cadena ligera variable" como se proporciona en la presente descripción se refiere a un polipéptido que incluye una región variable de cadena ligera (VL). En las modalidades, el dominio de cadena ligera variable es una región variable de cadena ligera (VL). Un "dominio de cadena pesada variable" como se proporciona en la presente descripción se refiere a un polipéptido que incluye una región variable de cadena pesada (VH). En las modalidades, el dominio de cadena pesada variable es una región variable de cadena pesada (VH). En las modalidades, cada uno de dicha pluralidad de dominios de cadena ligera variable y la pluralidad de dominios de cadena pesada variable es químicamente diferente. Cuando la pluralidad de dominios de cadena ligera variable y la pluralidad de dominios de cadena pesada variable es químicamente diferente, cada uno de los dominios de cadena ligera variable y los dominios de cadena pesada variable se unen a un antígeno (epítopo) diferente. Los antígenos unidos por dominios de cadena ligera variable químicamente diferentes y dominios de cadena pesada variable diferentes pueden formar parte de esta proteína o de una proteína diferente. En las modalidades, el antígeno forma parte de una célula cancerosa. En las modalidades, la región del anticuerpo incluye un primer dominio de cadena ligera variable y un primer dominio de cadena pesada variable y un segundo dominio de cadena ligera variable y un segundo dominio de cadena pesada variable. El primer dominio de cadena pesada variable y el primer dominio de cadena ligera variable forman un primer paratopo que se une a un primer epítopo y el segundo dominio de cadena pesada variable y el segundo dominio de cadena ligera variable forman un segundo paratopo que se une a un segundo epítopo, en donde el primero y el segundo paratopo son independientemente diferentes. El término "paratopo" se refiere al sitio de unión al antígeno de un anticuerpo 0 fragmento de este.

En las modalidades, la región del anticuerpo incluye un primer dominio de cadena ligera variable y un primer dominio de cadena pesada variable, un segundo dominio de cadena ligera variable y un segundo dominio de cadena pesada variable, un tercer dominio de cadena ligera variable y un tercer dominio de cadena pesada variable, y un cuarto dominio de cadena ligera variable y un cuarto dominio de cadena pesada variable. El primer dominio de cadena pesada variable y el primer dominio de cadena ligera variable forman un primer paratopo que se une a un primer epítopo, el segundo dominio de cadena pesada variable y el segundo dominio de cadena ligera variable forman un segundo paratopo que se une a un segundo epítopo, el tercer dominio de cadena pesada variable y el tercer dominio de cadena ligera variable forman un tercer paratopo que se une a un tercer epítopo, el cuarto dominio de cadena pesada variable y el cuarto dominio de cadena ligera variable forman un cuarto paratopo que se une a un segundo epítopo, en donde el primero, el segundo, el tercer y el cuarto paratopo son independientemente diferentes.

En las modalidades, el primer, segundo, tercer y cuarto paratopo se conectan a través de un enlazador químico. En las modalidades, el enlazador químico es un enlazador covalente, un enlazador no covalente, un enlazador peptídico (un enlazador que incluye una porción de péptido), un enlazador peptídico escindible, un alquileno sustituido o no sustituido, heteroalquileno sustituido o no sustituido, cicloalquileno sustituido o no sustituido, heterocicloalquileno sustituido o no sustituido, arileno sustituido o no sustituido o heteroarileno sustituido o no sustituido o cualquiera de sus combinaciones. Por tanto, un enlazador químico como se proporciona en la presente descripción puede incluir una pluralidad de porciones químicas, en donde cada una de la pluralidad de las porciones es químicamente diferente. En las modalidades, el enlazador es un enlazador de péptido. En las modalidades, el enlazador de péptido tiene una longitud de aproximadamente 5 a aproximadamente 15 residuos de aminoácidos.

En las modalidades, la región del anticuerpo es un anticuerpo biespecífico. En las modalidades, la región del anticuerpo es un anticuerpo tetravalente. En las modalidades, la región del anticuerpo es una IgG tetravalente. En las modalidades, la región del anticuerpo es una inmunoglobulina de dominio variable doble como se describió en Jakob CG y otros, (MAbs.

1 de mayo de 2013; 5(3): 358-363) y Byrne H y otros, (Cell Volumen 31, núm. 11, p621-632, noviembre de 2013).

En las modalidades, la región del anticuerpo incluye SEQ ID NO:31 y SEQ ID NO:32. En las modalidades, la región del anticuerpo incluye SEQ ID NO:33 y SEQ iD NO:34. En las modalidades, la región del anticuerpo incluye SEQ ID NO:35 y SEQ ID NO:36. En las modalidades, la región del anticuerpo incluye SEQ ID NO:37 y SEQ ID No :38. En las modalidades, la región del anticuerpo incluye SEQ ID NO:39 y SEQ ID NO:40. En las modalidades, la región del anticuerpo incluye SEQ ID NO:41 y SEQ ID No :42. En las modalidades, la región del anticuerpo incluye SEQ ID NO:43 y SEQ ID NO:44. En las modalidades, la región del anticuerpo incluye SEQ ID NO:45 y SEQ ID NO:46. En las modalidades, la región del anticuerpo incluye SEQ ID NO:47 y SEQ ID No :48. En las modalidades, la región del anticuerpo incluye SEQ ID NO:49 y SEQ ID NO:50. En las modalidades, la región del anticuerpo incluye SEQ ID NO:51 y SEQ ID NO:52. En las modalidades, la región del anticuerpo incluye SEQ ID NO:53 y SEQ ID NO:54. En las modalidades, la región del anticuerpo incluye SEQ ID NO:55 y SEQ iD NO:56. En las modalidades, la región del anticuerpo incluye SEQ ID NO:57 y SEQ iD NO:58. En las modalidades, la región del anticuerpo incluye SEQ ID NO:59 y SEQ ID NO:60. En las modalidades, la región del anticuerpo incluye SEQ ID NO:61 y SEQ ID No :62. En las modalidades, la región del anticuerpo incluye SEQ ID NO:63 y SEQ ID NO:64. En las modalidades, la región del anticuerpo incluye SEQ ID NO:65 y SEQ ID NO:66. En las modalidades, la región del anticuerpo incluye SEQ ID NO:67 y SEQ ID NO:68. En las modalidades, la región del anticuerpo incluye SEQ ID NO:69 y SEQ iD NO:70. En las modalidades, la región del anticuerpo incluye SEQ ID NO:71 y SEQ iD NO:72. En las modalidades, la región del anticuerpo incluye SEQ ID NO:73 y SEQ ID NO:74. En las modalidades, la región del anticuerpo incluye SEQ ID NO:75 y SEQ ID No :76. En las modalidades, la región del anticuerpo incluye SEQ ID NO:77 y SEQ ID NO:78. En las modalidades, la región del anticuerpo incluye SEQ ID NO:79 y SeQ ID NO:80. En las modalidades, la región del anticuerpo incluye SEQ ID NO:81 y SEQ ID NO:82. En las modalidades, la región del anticuerpo incluye SEQ ID NO:111 y SEQ ID NO:112. En las modalidades, la región del anticuerpo incluye SEQ ID NO:113 y SEQ ID NO:114. En las modalidades, la región del anticuerpo incluye SEQ ID NO:115 y SEQ ID NO:116. En las modalidades, la región del anticuerpo incluye SEQ ID NO:117 y SEQ ID NO:118. En las modalidades, la región del anticuerpo incluye SEQ ID NO:119 y SEQ ID NO:120.

La "región variable de cadena pesada (VH)" como se proporciona en la presente descripción es un dominio que incluye la región variable de una cadena pesada de un anticuerpo o un fragmento de este. Igualmente, la "región variable de cadena ligera (VL)" como se proporciona en la presente descripción es un dominio que incluye la región variable de una cadena ligera de un anticuerpo o un fragmento de este. En las modalidades, la región variable de la cadena pesada (VH) es la región variable de la cadena pesada de un anticuerpo. En las modalidades, la región variable de la cadena pesada (VH) es la región variable de la cadena pesada de un fragmento de anticuerpo. En las modalidades, la región variable de la cadena pesada (VH) es la región variable de la cadena pesada de un Fab. En las modalidades, la región variable de cadena ligera (VL) es la región variable de la cadena ligera de un anticuerpo. En las modalidades, la región variable de cadena ligera (VL) es la región variable de la cadena ligera de un fragmento de anticuerpo. En las modalidades, la región variable de cadena ligera (VL) es la región variable de la cadena ligera de un Fab.

La región del anticuerpo incluye además una región constante de cadena pesada (CH) y una región constante de cadena ligera (CL). En las modalidades, la región constante de la cadena pesada (CH) es la región constante de la cadena pesada de un anticuerpo o fragmento de este. En las modalidades, la región constante de cadena ligera (CL) es la región constante de la cadena ligera de un anticuerpo o fragmento de este. En las modalidades, la región constante de la cadena pesada (CH) es la región constante de un Fab. En las modalidades, la región constante de cadena ligera (CL) es la región constante de la cadena ligera de un Fab. En las modalidades, la región constante de la cadena pesada (CH) es la región constante de un dímero F(ab)'2. En las modalidades, la región constante de cadena ligera (CL) es la región constante de la cadena ligera de un dímero F(ab)'2. En las modalidades, la región del anticuerpo incluye un dominio Fc. En las modalidades, la región de anticuerpo es una región de anticuerpo humanizada. En las modalidades, la región de anticuerpo es una región de anticuerpo de ratón humanizada. En las modalidades, la región de anticuerpo no incluye una región de anticuerpo scFV. Cuando la región del anticuerpo no incluye una región del anticuerpo scFv, la región del anticuerpo no incluye una proteína de fusión de las regiones variables de las cadenas pesada (VH) y ligera (VL) de las inmunoglobulinas, conectadas con un péptido enlazador corto.

La "cavidad central" con respecto a la estructura tridimensional de un Fab, se refiere a la cavidad interna del Fab revestida por porciones de las regiones variables y constantes de las cadenas pesada y ligera y que incluyen aminoácidos que recubren un agujero dentro de la cavidad. En las modalidades, la cavidad central que incluye el agujero tiene una estructura, por ejemplo, como se representa en, o similar a, la Figura 4A. En las modalidades, donde la región del anticuerpo incluye un Fab, la cavidad central se reviste por residuos de las regiones VH, VL, CH1, y CL. La cavidad central no incluye el sitio de unión al antígeno. Por tanto, en las modalidades, el compuesto que se une a la cavidad central no impacta (por ejemplo, impacta de forma mensurable) la unión de la región del anticuerpo al epítopo. En otras palabras, en las modalidades, la ocupación de este sitio no afecta la unión del antígeno. En las modalidades, la cavidad central se reviste por residuos de aminoácidos capaces de interactuar con un compuesto que incluye una porción peptidilo (por ejemplo, un meditopo) proporcionado en la presente descripción que incluye modalidades de este (por ejemplo, un péptido de fórmula (I) o (II)). Los residuos de aminoácidos capaces de interactuar con el compuesto que incluye una porción peptidilo (por ejemplo, un meditopo) pueden ser parte del sitio de unión del péptido (también denominado en la presente descripción como sitio de unión del meditopo). El sitio de unión del péptido puede modificarse en cualquier anticuerpo apropiado, formando de esta manera un anticuerpo o región de anticuerpo con el sitio de unión del péptido (también denominado en la presente descripción como un anticuerpo habilitado para meditopo o región de anticuerpo habilitado para meditopo).

En las modalidades, los residuos de aminoácidos que recubren la cavidad central incluyen un residuo en una posición correspondiente a la posición de Kabat 83, un residuo en una posición correspondiente a la posición de Kabat 30 o un residuo en una posición correspondiente a la posición de Kabat 52. En las modalidades, los residuos de aminoácidos que recubren la cavidad central incluyen un residuo en una posición correspondiente a la posición de Kabat 40, un residuo en una posición correspondiente a la posición de Kabat 41, un residuo en una posición que corresponde a la posición de Kabat 30, un residuo en una posición correspondiente a la posición de Kabat 52, un residuo en una posición correspondiente a la posición de Kabat 83, o un residuo en una posición correspondiente a la posición de Kabat 85. En las modalidades, los residuos de aminoácidos que recubren la cavidad central incluyen un residuo en una posición correspondiente a la posición de Kabat 40. En las modalidades, los residuos de aminoácidos que recubren la cavidad central incluyen un residuo en una posición correspondiente a la posición de Kabat 41. En las modalidades, los residuos de aminoácidos que recubren la cavidad central incluyen un residuo en una posición correspondiente a la posición de Kabat 30. En las modalidades, los residuos de aminoácidos que recubren la cavidad central incluyen un residuo en una posición correspondiente a la posición de Kabat 52. En las modalidades, los residuos de aminoácidos que recubren la cavidad central incluyen un residuo en una posición correspondiente a Kabat 83. En las modalidades, los residuos de aminoácidos que recubren la cavidad central incluyen un residuo en una posición correspondiente a la posición de Kabat 85.

En las modalidades, los residuos de aminoácidos que recubren la cavidad central incluyen un residuo en una posición correspondiente a la posición de Kabat 30. En las modalidades, el residuo en una posición correspondiente a la posición de Kabat 30 es un residuo de aminoácido cargado negativamente. En las modalidades, el residuo en una posición correspondiente a la posición de Kabat 30 es ácido aspártico. En las modalidades, los residuos de aminoácidos que recubren la cavidad central incluyen un residuo en una posición correspondiente a la posición de Kabat 52. En las modalidades, el residuo en una posición correspondiente a la posición de Kabat 52 es un residuo de aminoácido cargado negativamente. En las modalidades, el residuo en una posición correspondiente a la posición de Kabat 52 es ácido aspártico. En las modalidades, los residuos de aminoácidos que recubren la cavidad central incluyen un residuo en una posición correspondiente a la posición de Kabat 83. En las modalidades, el residuo en una posición correspondiente a la posición de Kabat 83 es un residuo de aminoácido cargado negativamente. En las modalidades, el residuo en una posición correspondiente a la posición de Kabat 83 es ácido glutámico. En las modalidades, el residuo en una posición correspondiente a la posición de Kabat 83 es isoleucina. En las modalidades, los residuos de aminoácidos que recubren la cavidad central incluyen un residuo en una posición correspondiente a la posición de Kabat 85.

En las modalidades, la cavidad central se reviste por (formada por) un residuo de cadena ligera en una posición correspondiente a la posición de Kabat Gln38, Thr40, Gln41, Gly42, Ser43, Asp 52, Asp85, Ile83, Tyr87, Lys103, Val163, Thr164, o Glu165. Un "residuo de cadena ligera" como se proporciona en la presente descripción se refiere a un residuo que forma parte de una cadena ligera de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo. En las modalidades, la cavidad central se reviste (por ejemplo, forma) por un residuo de cadena ligera en una posición correspondiente a la posición de Kabat Gln38. En las modalidades, la cavidad central se reviste (por ejemplo, forma) por un residuo de cadena ligera en una posición correspondiente a la posición de Kabat Thr40. En las modalidades, la cavidad central se reviste (por ejemplo, formada) por un residuo de cadena ligera en una posición correspondiente a posición de Kabat Gln41. En las modalidades, la cavidad central se reviste (por ejemplo, forma) por un residuo de cadena ligera en una posición correspondiente a la posición de Kabat Gly42. En las modalidades, la cavidad central se reviste (por ejemplo, forma) por un residuo de cadena ligera en una posición correspondiente a la posición de Kabat a Ser43. En las modalidades, la cavidad central se reviste (por ejemplo, forma) por un residuo de cadena ligera en una posición correspondiente a la posición de Kabat Asp85. En las modalidades, la cavidad central se reviste (por ejemplo, forma) por un residuo de cadena ligera en una posición correspondiente a la posición de Kabat Tyr87. En las modalidades, la cavidad central se reviste (por ejemplo, forma) por un residuo de cadena ligera en una posición correspondiente a la posición de Kabat Lys103. En las modalidades, la cavidad central se reviste (por ejemplo, forma) por un residuo de cadena ligera en una posición correspondiente a la posición de Kabat Val163. En las modalidades, la cavidad central se reviste (por ejemplo, forma) por un residuo de cadena ligera en una posición correspondiente a la posición de Kabat Thr164. En las modalidades, la cavidad central se reviste (por ejemplo, forma) por un residuo de cadena ligera en una posición correspondiente a la posición de Kabat Glu165.

En las modalidades, la cavidad central se reviste por (forma por) un residuo de cadena pesada en una posición correspondiente a la posición de Kabat Asp 30, Gln39, Pro40, Thr91, Ala92, Ile93, Tyr95, Gln112, Leu115, Glu155, Pro156, Pro174, Ala175, o Tyr183. Un "residuo de cadena pesada" como se proporciona en la presente descripción se refiere a un residuo que forma parte de una cadena pesada de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo. En las modalidades, la cavidad central se reviste (por ejemplo, forma) por un residuo de cadena pesada en una posición correspondiente a la posición de Kabat Gln39. En las modalidades, la cavidad central se reviste (por ejemplo, forma) por un residuo de cadena pesada en una posición correspondiente a la posición de Kabat. En las modalidades, la cavidad central se reviste (por ejemplo, forma) por un residuo de cadena pesada en una posición correspondiente a la posición de Kabat Pro40. En las modalidades, la cavidad central se reviste (por ejemplo, forma) por un residuo de cadena pesada en una posición correspondiente a la posición de Kabat Thr91. En las modalidades, la cavidad central se reviste (por ejemplo, forma) por un residuo de cadena pesada en una posición correspondiente a la posición de Kabat Ala92. En las modalidades, la cavidad central se reviste (por ejemplo, forma) por un residuo de cadena pesada en una posición correspondiente a la posición de Kabat Ile93. En las modalidades, la cavidad central se reviste (por ejemplo, forma) por un residuo de cadena pesada en una posición correspondiente a la posición de Kabat Tyr95. En las modalidades, la cavidad central se reviste (por ejemplo, forma) por un residuo de cadena pesada en una posición correspondiente a la posición de Kabat Gln112. En las modalidades, la cavidad central se reviste (por ejemplo, forma) por un residuo de cadena pesada en una posición correspondiente a la posición de Kabat Leu115. En las modalidades, la cavidad central se reviste (por ejemplo, forma) por un residuo de cadena pesada en una posición correspondiente a la posición de Kabat Glu155. En las modalidades, la cavidad central se reviste (por ejemplo, forma) por un residuo de cadena pesada en una posición correspondiente a la posición de Kabat Pro156. En las modalidades, la cavidad central se reviste (por ejemplo, forma) por un residuo de cadena pesada en una posición correspondiente a la posición de Kabat Pro174. En las modalidades, la cavidad central se reviste (por ejemplo, formada) por un residuo de cadena pesada en una posición correspondiente a la posición de Kabat Ala175. En las modalidades, la cavidad central se reviste (por ejemplo, formada) por un residuo de cadena pesada en una posición correspondiente a la posición de Kabat Tyr183.

La cavidad central proporcionada en la presente descripción incluye un sitio de unión del péptido (también denominado en la presente descripción como un sitio de unión de meditopo) que incluye residuos de aminoácidos de la región marco (FR). En las modalidades, el sitio de unión del péptido no incluye residuos de CDR de la cadena pesada o la cadena ligera. En las modalidades, el sitio de unión del péptido incluye residuos FR de la cadena pesada o la cadena ligera. En las modalidades, el sitio de unión del péptido incluye residuos FR de la cadena pesada y la cadena ligera. En las modalidades, el sitio de unión del péptido incluye un residuo en una posición correspondiente a la posición de Kabat 83, un residuo en una posición correspondiente a la posición de Kabat 30 o un residuo en una posición correspondiente a la posición de Kabat 52. En las modalidades, el sitio de unión del péptido incluye un residuo en una posición correspondiente a la posición de Kabat 40, un residuo en una posición correspondiente a la posición de Kabat 41, un residuo en una posición correspondiente a la posición de Kabat 30, un residuo en una posición correspondiente a la posición de Kabat 52, un residuo en una posición correspondiente a la posición de Kabat 83, o un residuo en una posición correspondiente a la posición de Kabat 85. En las modalidades, el sitio de unión del péptido incluye un residuo en una posición correspondiente a la posición de Kabat 40. En las modalidades, el sitio de unión del péptido incluye un residuo en una posición correspondiente a la posición de Kabat 41. En las modalidades, el sitio de unión del péptido incluye un residuo en una posición correspondiente a la posición de Kabat 30. En las modalidades, el sitio de unión del péptido incluye un residuo en una posición correspondiente a la posición de Kabat 52. En las modalidades, el sitio de unión del péptido incluye un residuo en una posición correspondiente a la posición de Kabat 83. En las modalidades, el sitio de unión del péptido incluye un residuo en una posición correspondiente a la posición de Kabat 85. En las modalidades, los residuos que forman un sitio de unión del péptido se describen en la solicitud de Estados Unidos publicada núm. US20120301400 A1.

En las modalidades, la cavidad central se reviste por residuos de aminoácidos capaces de unirse a un compuesto que incluye una porción peptidilo. Por tanto, en las modalidades, el sitio de unión del péptido proporcionado en la presente descripción es capaz de unirse a un compuesto que incluye una porción peptidilo. En las modalidades, el sitio de unión del péptido es capaz de unirse a la porción peptidilo. En las modalidades, el sitio de unión del péptido proporcionado en la presente descripción se une a un compuesto que incluye una porción peptidilo. En las modalidades, el sitio de unión del péptido se une a la porción peptidilo. En las modalidades, la porción peptidilo es una porción como se describe en la solicitud de Estados Unidos publicada núm. US20120301400 A1 y Avery y otros, 2015 (Scientific Reports 5:7817).

En las modalidades, el compuesto que se une al sitio de unión del péptido es un péptido o incluye una porción peptidilo. En las modalidades, el compuesto es un péptido sustituido. En las modalidades, el péptido tiene una longitud de entre 5 y 16 aminoácidos. En las modalidades, el compuesto incluye una porción peptidilo sustituido. En las modalidades, la porción peptidilo tiene una longitud de entre 5 y 16 aminoácidos. El péptido o porción peptidilo proporcionado en la presente descripción también puede denominarse "meditopo." En las modalidades, el péptido o porción peptidilo tiene la fórmula:

X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12 (I).

Cuando la secuencia de Fórmula (I) es una porción peptidilo, un experto en la técnica comprenderá inmediatamente que la porción peptidilo se une al resto del compuesto en uno o más puntos de unión. En la fórmula (I), X1 es Cys, Gly, palanina, ácido 2,3-diaminopropiónico, p-azidoalanina, o nulo; X2 es Gln o nulo; X3 es Phe, Tyr, p-p'-difenil-Ala, His, Asp, 2-bromo-L-fenilalanina, 3-bromo-L-fenilalanina, 4-bromo-L-fenilalanina, Asn, Gln, una Phe modificada, un residuo que contiene carbonilo hidratable o un residuo que contiene ácido borónico; X4 es Asp o Asn; X5 es Leu; p-p'-difenil-Ala, Phe, un análogo no natural de fenilalanina, triptófano, tirosina, un residuo que contiene carbonilo hidratable o un residuo que contiene ácido borónico; X6 es Ser o Cys; X7 es Thr, Ser o Cys; X8 es Arg, un Arg modificado (sustituido), un carbonilo hidratable o un residuo que contiene ácido borónico; X9 es Arg o Ala; X10 es Leu, Gln, Glu, p-p'-difenil-Ala, Phe, un análogo no natural de fenilalanina, triptófano, tirosina, un residuo que contiene carbonilo hidratable o un residuo que contiene ácido borónico; X11 es Lys; y X12 es Cys, Gly, ácido 7-aminoheptanoico, p-alanina, ácido diaminopropiónico, propargilglicina, ácido isoaspártico o nulo; en donde el Phe modificado es un Phe con uno o más halógenos incorporados en el anillo de fenilo y en donde el Arg modificado tiene una estructura de fórmula:

En la fórmula (IA), R, R' y R" son alquilo independientemente sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, heteroarilo sustituido o no sustituido, o NHR"' y R'" es alquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, heteroarilo sustituido o no sustituido.

En las modalidades, el péptido es un péptido cíclico. En las modalidades, la porción peptidilo es una porción peptidilo cíclico. En las modalidades, el péptido o porción peptidilo incluye un puente disulfuro, un puente tioéter, un enlace lactama, cicloadición. En las modalidades, la porción cíclica del péptido cíclico o de la porción peptidilo cíclico se forma mediante la unión entre X1 y X12, X1 y X11, X3 y X11, X4 y X11, o X2 y X12. En las modalidades, el aminoácido no natural es pp'-difenil-Ala, alquilo ramificado, arilo sustituido o no sustituido o heteroarilo sustituido o no sustituido. En las modalidades, cada uno de los uno o más halógenos es un sustituyente orto, meta o parabromofenilo.

En las modalidades, el péptido o porción peptidilo tiene la fórmula:

En la fórmula (II), R3 es hidrógeno, R3A-arilo sustituido o no sustituido, en donde R3A es hidrógeno, halógeno o C1-4 alquilo no sustituido. R3' es hidrógeno, R3A'-arilo sustituido o no sustituido, en donde R3A' es hidrógeno, halógeno o C1-4 alquilo no sustituido. R5 es R5A-C1-s (por ejemplo, C1-4) alquilo sustituido o no sustituido. R5A es oxo, acetal, cetal, -B(OH)2, éster borónico, éster fosfonato, orto éster, -CO2C1.4 alquilo, -CH=CH-CHO, -CH=CH-C(O)R5A', -CH=CH-CO2R5A',-CO2H, -CONH20 RSA"-arilo sustituido o no sustituido, RSA"-heteroarilo sustituido o no sustituido (por ejemplo, naftilo, imidazol, indol), en donde R5A' C1-4 alquilo sustituido y R5A" es -OH, flúor, cloro, bromo o yodo. R6 es -L6' OH o -L6'SH, en donde L6' es C1.4 alquileno sustituido o no sustituido. R7 es -L7' OH o -L7'SH, en donde L7' es C1.4 alquilo sustituido o no sustituido. El símbolo m es 0, 1,2, 3, 4, o 5.

En la fórmula (II), R8 es -OH, -NRaRb, -N(RC)C(O)Re, o -N(RC)C(=NRd)Re. Ra es H. Rb e s H o C1.8 alquilo opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en oxo, acetal, y cetal, -B(OH)2, -SH, éster borónico, éster fosfonato, orto éster, grupo -CH=CH-CHO, -CH=CH-C(O)C1-4 alquilo, -CH=CH-CO2C1-4 alquilo,-CO2H, o -CO2C1-4 alquilo. RC es H, C1-8 alquilo, C3.8 cicloalquilo, alquilo ramificado, o arilo. Rd es H o un grupo C1-8 alquilo, C2-8 alquenilo, C2-8 alquinilo, C3-8cicloalquilo, alquilo ramificado o arilo, cada uno opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en -N3, -NH2, -OH, -SH, halógeno, oxo, acetal, cetal, -B(OH)2, éster borónico, éster fosfonato, orto éster, -CH=CH-CHO, -CH=CH-C(O)C1-4alquilo, -CH=CH-CO2C1-4alquilo, -CO2H y grupo -CO2C1.4 alquilo. Re es H, -NHRd; o una C1.12 alquilo, C3-8 cicloalquilo, C2-12 alquenilo, C2-8 alquinilo o grupo arilo, cada uno opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en -N3, -NH2, -OH, -SH, oxo, C2-4 acetal, C2-4 cetal, -B (OH)2, éster borónico, éster fosfonato, orto éster, grupo-CH=CH-CHO, -CH=CH-C(O)C1-4 alquilo, -CH=CH-CO2C1-4 alquilo y -CO2C1-4 alquilo.

En la fórmula (II) R9 es un C1.4 alquilo sustituido o no sustituido. R10 es R10A-C1-8 alquilo sustituido o no sustituido, en donde R10A es oxo, acetal, cetal, -B(OH)2, éster borónico, éster fosfonato, orto éster, -CH=CH-CHO, -CH=CH-C(O)C1-4 alquilo, -CH=CH-CO2C1-4 alquilo, -CO2C1.4 alquilo, -CO2H, -CONH2, R10B-fenilo sustituido o no sustituido, R10B-naftilo sustituido o no sustituido, R10B -imidazolilo sustituido o no sustituido, o R10B -indolilo sustituido o no sustituido, en donde R10B es -OH o halógeno. El símbolo n es 0 o 1. El símbolo p es 0 o 1.

En la fórmula (II), X es Rx-C1-8 alquileno sustituido o no sustituido, Rx-C2-8 alquenileno sustituido o no sustituido, Rx es oxo, -C(O), -NH2, -NHC (O) o -NHC(O)Ry, en donde un carbono del alquenileno opcionalmente se reemplaza con -C(O)NH, un heteroarileno de 5 miembros, o - S-S, y Ry es -C1-4 alquilo, -CH(Rz) C (O) o -CH(Rz)CO2H, en donde Rz es -H o Rz' -C1.4 alquilo sustituido o no sustituido, en donde Rz' es -OH, -SH o -NH2. La fórmula (I) o (II) incluye todas las sales farmacéuticamente aceptables apropiadas. Puede encontrar más información sobre los conceptos de sitios de unión de péptidos (sitios de unión de meditopos) y péptidos (meditopos) en las solicitudes internacionales núms. de serie. PCT/US2011/055656, PCT/US2015/053880, PCT/US2012/032938 y solicitud de Estados Unidos núm. de serie, US 14/453,586.

Los compuestos proporcionados en la presente descripción pueden incluir un agente terapéutico, un agente de diagnóstico o un agente detectable (también denominado en la presente descripción como un agente detectable) unido a la porción peptidilo. En las modalidades, el compuesto se conjuga con un agente terapéutico, un agente de diagnóstico, o un agente detectable. En las modalidades, la porción peptidilo (por ejemplo, el péptido de fórmula (I) o (II)) se conjuga con un agente terapéutico, un agente de diagnóstico o un agente detectable. En las modalidades, la región del anticuerpo se conjuga con un agente terapéutico, un agente de diagnóstico, o un agente detectable.

El agente terapéutico, el agente de diagnóstico o el agente detectable pueden unirse a través de un enlazador químico al compuesto (por ejemplo, a la porción peptidilo) y/o la región del anticuerpo proporcionada en la presente descripción, que incluyen las modalidades de este. En las modalidades, el enlazador químico es un enlazador covalente, un enlazador no covalente, un enlazador peptídico (un enlazador que incluye una porción de péptido), un enlazador peptídico escindible, un alquileno sustituido o no sustituido, heteroalquileno sustituido o no sustituido, cicloalquileno sustituido o no sustituido, heterocicloalquileno sustituido o no sustituido, arileno sustituido o no sustituido o heteroarileno sustituido o no sustituido o cualquiera de sus combinaciones.

Un enlazador químico como se proporciona en la presente descripción puede incluir una pluralidad de porciones químicas, en donde cada una de la pluralidad de las porciones es químicamente diferente. En las modalidades, el agente terapéutico, el agente de diagnóstico o el agente detectable se une al compuesto a través de un enlazador no covalente o covalente. En las modalidades, el agente terapéutico, agente de diagnóstico o agente detectable se une a la porción peptidilo a través de un enlazador no covalente o covalente. En las modalidades, el agente terapéutico, el agente de diagnóstico o el agente detectable se une a la región del anticuerpo a través de un enlazador no covalente o covalente. Típicamente, el enlazador puede ser un enlazador covalente como se describe en la presente descripción y formado a través de la química conjugada (por ejemplo, "clic"). El enlazador puede ser además un enlazador peptídico escindible como se describe en la presente descripción. Cuando el agente terapéutico, de diagnóstico o detectable forma parte (por ejemplo, a través de unión covalente) del compuesto, la porción peptidilo y/o la región del anticuerpo proporcionados en la presente descripción, que incluyen sus modalidades, el agente terapéutico, diagnóstico o detectable puede denominarse "porción terapéutica", "porción de diagnóstico" o "porción detectable", respectivamente. En las modalidades, la porción peptídica (meditopo) contiene una funcionalidad amina reactiva (por ejemplo, Lysl 1), que se usa para la conjugación del meditopo (porción peptidilo), por ejemplo, a una armazón o enlazador o una porción funcional, tal como un diagnóstico, por ejemplo, formación de imágenes, agente o porción terapéutica como se describe en la presente descripción. En las modalidades, las funcionalidades tiol se introducen cualquier posición adecuada en el meditopo (porción peptidilo) y se modifican selectivamente con el uso de reactivos que contienen agentes formación de imágenes, otras proteínas y péptidos, quelantes de metales, ARNip, nanopartículas y fármacos citotóxicos. El acoplamiento de porciones terapéuticas o de diagnóstico a la porción peptidilo proporcionado en la presente descripción se puede realizar con el uso de una metodología de química de péptidos bien conocida en la técnica y descrita, por ejemplo en el documento de patente núm. WO 2013055404 A1.

Las porciones terapéuticas como se proporcionan en la presente descripción pueden incluir, sin limitación, péptidos, proteínas, ácidos nucleicos, análogos de ácidos nucleicos, moléculas pequeñas, anticuerpos, enzimas, profármacos, agentes citotóxicos (por ejemplo, toxinas) que incluyen, pero sin limitarse a, ricina, doxorrubicina, daunorrubicina, taxol, bromuro de etidio, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, dihidroxantracina diona, actinomicina D, toxina difteria, exotoxina de Pseudomonas (PE) A, PE40, abrina y glucocorticoide. En las modalidades, la porción terapéutica es un agente anticanceroso o un agente quimioterapéutico como se describe en la presente descripción. En las modalidades, la porción terapéutica es una porción de ácido nucleico, una porción de péptido o una porción de fármaco de molécula pequeña. En las modalidades, la porción terapéutica es una porción de ácido nucleico. En las modalidades, la porción terapéutica es una porción de anticuerpo. En las modalidades, la porción terapéutica es una porción peptídica. En las modalidades, la porción terapéutica es una porción de fármaco de molécula pequeña. En las modalidades, la porción terapéutica es una nucleasa. En las modalidades, la porción terapéutica es un inmunoestimulador. En las modalidades, la porción terapéutica es una toxina. En las modalidades, la porción terapéutica es una nucleasa.

El compuesto, porción peptidilo o región de anticuerpo proporcionado en la presente descripción puede incluir una porción detectable o de formación de imágenes. En las modalidades, la porción detectable se conecta al compuesto a través de un enlazador covalente. En las modalidades, la porción detectable se conecta a la región del anticuerpo a través de un enlazador covalente. En las modalidades, la porción detectable se conecta a la porción peptidilo a través de un enlazador covalente. Una "porción detectable o de formación de imágenes" como se proporciona en la presente descripción es un compuesto monovalente detectable por los medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos, químicos u otros físicos. En las modalidades, la porción de formación de imágenes se une covalentemente al compuesto. En las modalidades, la porción de formación de imágenes se une covalentemente a la región del anticuerpo. En las modalidades, la porción de formación de imágenes se une covalentemente a la porción peptidilo. Las porciones de formación de imágenes ilustrativas incluyen, sin limitación 32P, radionúclidos, isótopos emisores de positrones, colorantes fluorescentes, fluoróforos, anticuerpos, moléculas bioluminiscentes, moléculas quimioluminiscentes, moléculas fotoactivas, metales, reactivos densos en electrones, enzimas (por ejemplo, como se usan comúnmente en un ELISA), agentes de contraste magnético, puntos cuánticos, nanopartículas, biotina, digoxigenina, haptenos y proteínas u otras entidades que pueden hacerse detectables, por ejemplo, incorporando un radiomarcador en un péptido o anticuerpo específicamente reactivo con un péptido objetivo. Puede emplearse cualquier método conocido en la técnica para conjugar un anticuerpo a la porción, por ejemplo, con el uso de métodos descritos en Hermanson, Bioconjugate Techniques 1996, Academic Press, Inc., San Diego. Los ejemplos de fluoróforos incluyen los colorantes fluoresceína, rodamina, GFP, cumarina, FITC, Alexa flúor, Cy3, Cy5, BODIPY y cianina. Los radionucleidos ilustrativos incluyen flúor-18, galio-68 y cobre-64. Los agentes de contraste magnéticos ilustrativos incluyen gadolinio, óxido de hierro y hierro, platino y manganeso. En las modalidades, la porción de formación de imágenes es una molécula bioluminiscente. En las modalidades, la porción de formación de imágenes es una molécula fotoactiva. En algunas modalidades, la porción de formación de imágenes es un metal. En las modalidades, la porción de formación de imágenes es una nanopartícula.

Un dominio transmembrana como se proporciona en la presente descripción se refiere a un polipéptido que forma parte de una membrana biológica. El dominio transmembrana proporcionado en la presente descripción es capaz de atravesar una membrana biológica (por ejemplo, una membrana celular) desde un lado de la membrana hasta el otro lado de la membrana. En las modalidades, el dominio transmembrana se extiende desde el lado intracelular hasta el lado extracelular de una membrana celular. Los dominios transmembrana pueden incluir residuos hidrófobos, no polares, que anclan las proteínas proporcionadas en la presente descripción, que incluyen las modalidades de estas, en una membrana biológica (por ejemplo, la membrana celular de una célula T). Se contempla cualquier dominio transmembrana capaz de anclar las proteínas proporcionadas en la presente descripción, que incluyen las modalidades de estas. En las modalidades, el dominio transmembrana es L-selectina. El término "L-selectina" tal como se proporciona en la presente descripción incluye cualquiera de las formas recombinantes o de origen natural de la proteína L-selectina, también conocida como CD62L, o variantes u homólogos de esta que mantienen la actividad de L-selectina (por ejemplo, dentro de al menos el 50 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de actividad en comparación con la L-selectina). En las modalidades, las variantes u homólogos tienen al menos 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia de aminoácidos en toda la secuencia o una porción de la secuencia (por ejemplo, un 50, 100, 150 o 200 porciones de aminoácidos continuas) en comparación con un polipéptido de L-selectina de origen natural. En las modalidades, la L-selectina es la proteína identificada por la secuencia de referencia de NCBI GI:262206315, homólogo o fragmento funcional de esta. Los ejemplos no limitantes de dominios transmembrana incluyen los dominios transmembrana de CD8, CD4 o CD3-zeta.

En las modalidades, el dominio transmembrana es un dominio transmembrana CD28. El término "dominio transmembrana CD28" como se proporciona en la presente descripción incluye cualquiera de las formas recombinantes o naturales del dominio transmembrana CD28, o variantes u homólogos de esta que mantienen la actividad del dominio transmembrana CD28 (por ejemplo, dentro de al menos 50 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de actividad en comparación con el dominio transmembrana CD28). En algunos aspectos, las variantes u homólogos tienen al menos 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia de aminoácidos en toda la secuencia o una porción de la secuencia (por ejemplo, un 50, 100, 150 o 200 porciones de aminoácidos continuas) en comparación con un polipéptido de dominio transmembrana CD28 de origen natural. En las modalidades, el dominio transmembrana CD28 es la proteína identificada por la SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:2, homólogo o fragmento funcional de este. En las modalidades, c D28 es la proteína identificada por la secuencia de referencia de NCBI GI:340545506, homólogo o fragmento funcional de esta.

En las modalidades, el dominio transmembrana es la proteína identificada por la SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, homólogo o fragmento funcional de este.

En las modalidades, el ácido nucleico aislado proporcionado en la presente descripción incluye una secuencia señalización intracelular de células T que codifica un dominio de señalización intracelular de células T. En las modalidades, el dominio de señalización intracelular de células T es un dominio de señalización intracelular de células T CD3 Z. Un "dominio de señalización intracelular de células T" como se proporciona en la presente descripción incluye las secuencias de aminoácidos capaces de proporcionar la señalización primaria en respuesta a la unión de un antígeno a la región de anticuerpo proporcionada en la presente descripción, que incluyen las modalidades de este. En las modalidades, la señalización del dominio de señalización intracelular de células T da como resultado la activación de la expresión de las propias células T. En las modalidades, la señalización del dominio de señalización intracelular de células T da como resultado la proliferación (división celular) de la expresión de las propias células T. En las modalidades, la señalización del dominio de señalización intracelular de células T da como resultado la expresión por dichas células T de proteínas conocidas en la técnica como características de las células T activadas (por ejemplo, CTLA-4, PD-1, CD28, CD69). En las modalidades, el dominio de señalización intracelular de células T incluye el dominio de señalización de la cadena zeta del complejo CD3 humano. En las modalidades, el dominio de señalización intracelular de células T es un dominio de señalización intracelular de células T CD3 Z. En las modalidades, el dominio de señalización intracelular de células T es la SEQ ID NO:11.

En las modalidades, el ácido nucleico aislado proporcionado en la presente descripción incluye una secuencia de señalización intracelular coestimuladora que codifica un dominio de señalización intracelular coestimulador. Un "dominio de señalización intracelular coestimulador" como se proporciona en la presente descripción incluye las secuencias de aminoácidos capaces de proporcionar la señalización coestimuladora en respuesta a la unión de un antígeno a la región de anticuerpo proporcionada en la presente descripción, que incluyen las modalidades de este. En las modalidades, la señalización del dominio de señalización coestimulador da como resultado la producción de citoquinas y la proliferación de la expresión de las propias células T. En las modalidades, el dominio de señalización intracelular coestimulador es un dominio de señalización intracelular coestimulador de CD28, un dominio de señalización intracelular coestimulador de 4-1BB, un dominio de señalización intracelular coestimulador de ICOS o un dominio de señalización intracelular coestimulador de OX-40. En las modalidades, el dominio de señalización intracelular coestimulador incluye un dominio de señalización intracelular coestimulador de CD28, un dominio de señalización intracelular coestimulador de 4-1BB, un dominio de señalización intracelular coestimulador de ICOS, un dominio de señalización intracelular coestimulador de OX-40 o cualquiera de sus combinaciones. Los dominios intracelulares de señalización coestimuladora ilustrativos que incluyen secuencias y números de acceso se enumeran en la Tabla 2. En las modalidades, el dominio de señalización intracelular coestimulador incluye la proteína identificada por la SEQ ID NO: 12, la SEQ ID NO: 13, la SEQ ID NO: 14, la SEQ ID NO: 15 o la SEQ ID NO: 16. En las modalidades, el dominio de señalización intracelular coestimulador es la SEQ ID NO: 12, la SEQ ID NO: 13, la SEQ ID NO: 14, la SEQ ID NO:15 o la SEQ ID NO:16.

En las modalidades, el ácido nucleico aislado proporcionado en la presente descripción incluye una secuencia enlazadora que codifica un dominio enlazador. En las modalidades, el dominio enlazador está entre el dominio transmembrana y el dominio de señalización intracelular de las células T. En las modalidades, el dominio enlazador se encuentra entre el dominio de señalización intracelular de las células T y el dominio de señalización intracelular coestimulador. En las modalidades, el dominio enlazador incluye la secuencia GGCGG o GGG.

En las modalidades, el ácido nucleico aislado proporcionado en la presente descripción incluye una secuencia espaciadora que codifica una región espaciadora. En las modalidades, la región espaciadora se encuentra entre el dominio transmembrana y la región del anticuerpo. Una "región espaciadora" como se proporciona en la presente descripción es un polipéptido que conecta la región del anticuerpo con el dominio transmembrana. En las modalidades, la región espaciadora conecta la región constante de la cadena pesada con el dominio transmembrana. En las modalidades, la afinidad de unión de la región del anticuerpo a un antígeno aumenta en comparación con la ausencia de la región espaciadora. En las modalidades, el impedimento estérico entre una región de anticuerpo y un antígeno disminuye en presencia de la región espaciadora.

En las modalidades, la región espaciadora incluye una región Fc. Los ejemplos de regiones espaciadoras contempladas para las composiciones y métodos proporcionados en la presente descripción incluyen, sin limitación, moléculas de inmunoglobulina o fragmentos de estas (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) y moléculas de inmunoglobulina o fragmentos de estas (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) que incluyen mutaciones que afectan la unión al receptor de Fc. En las modalidades, la región espaciadora es un fragmento de una IgG (por ejemplo, IgG4), en donde dicho fragmento incluye una deleción del dominio CH2. La región espaciadora puede ser un péptido enlazador. En las modalidades, la región espaciadora es un enlazador serina-glicina. En las modalidades, la región espaciadora tiene la secuencia GGSG.

En las modalidades, la región espadadora tiene la secuencia GSGSGSGS. En las modalidades, la región espadadora tiene al menos 4 aminoácidos de longitud. En las modalidades, la región espadadora tiene una longitud de aproximadamente 4 aminoácidos. En las modalidades, la región espaciadora tiene una longitud de entre 4 y 250 aminoácidos. La región espaciadora puede incluir residuos capaces de extender la vida media in vivo (por ejemplo, plasma) de las proteínas proporcionadas en la presente descripción. En las modalidades, la región espaciadora tiene una longitud de 10 aminoácidos. En las modalidades, la región espaciadora tiene una longitud de 229 aminoácidos. En las modalidades, la región espaciadora es GGGSSGGGSG. La región espaciadora puede estar "pasilada." El término "pasilado" o "pasilación" se utiliza en su sentido habitual y se refiere a una secuencia de aminoácidos, que debido a su alto contenido en prolina, alanina y serina forman polímeros biológicos altamente solubles. Por tanto, en las modalidades, la región espaciadora incluye aproximadamente 200 residuos de prolina, alanina y serina combinados. En las modalidades, la región espaciadora incluye de aproximadamente 10 a aproximadamente 200 residuos de prolina, alanina y serina combinados. En las modalidades, la región espaciadora incluye residuos hidrófilos. En las modalidades, la proteína recombinante no incluye una región espaciadora. En las modalidades, el ácido nucleico no incluye una secuencia espaciadora que codifique una región espaciadora. En las modalidades, el ácido nucleico no incluye una secuencia espaciadora que codifique una región espaciadora como se describe en el documento de patente núm. WO 2015105522 A1.

En las modalidades, el ácido nucleico incluye (i) una secuencia de cadena pesada que codifica un dominio de cadena pesada de la proteína, el dominio de cadena pesada incluye un dominio de cadena pesada variable y el dominio transmembrana; y (ii) una secuencia de cadena ligera que codifica un dominio de cadena ligera de la proteína, el dominio de cadena ligera incluye un dominio de cadena ligera variable, en donde el dominio de cadena pesada variable y el dominio de cadena ligera variable juntos forman al menos una porción de la región del anticuerpo.

En las modalidades, el ácido nucleico aislado codifica desde el extremo 5' hasta el extremo 3': una secuencia de cadena ligera, una secuencia de cadena pesada, una secuencia transmembrana y una secuencia señalización intracelular coestimuladora. En las modalidades, el ácido nucleico aislado codifica desde el extremo 5' hasta el extremo 3': una secuencia de cadena pesada, una secuencia de transmembrana, una secuencia señalización intracelular coestimuladora y una secuencia de cadena ligera. En las modalidades, el ácido nucleico aislado codifica desde el extremo 5' hasta el extremo 3': una secuencia de cadena ligera, una secuencia de enlazador peptidilo autoescindible, una secuencia de cadena pesada, una secuencia espaciadora, una secuencia transmembrana, una secuencia de señalización intracelular coestimuladora y una secuencia de señalización intracelular de células T. En las modalidades, el ácido nucleico aislado codifica desde el extremo 5' hasta el extremo 3': una secuencia de cadena pesada, una secuencia espaciadora, una secuencia transmembrana, una secuencia intracelular de señalización coestimuladora, una secuencia intracelular de señalización de células T, una secuencia de enlazador peptidilo autoescindible y una secuencia de cadena ligera.

Una "secuencia de cadena ligera" como se proporciona en la presente descripción se refiere a la secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio de cadena ligera proporcionado en la presente descripción. Un dominio de cadena ligera proporcionado en la presente descripción puede incluir una región variable de cadena ligera (VL) y/o una región constante de cadena ligera (CL). Una "secuencia de cadena pesada" como se proporciona en la presente descripción se refiere a la secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio de cadena pesada proporcionado en la presente descripción. Un dominio de cadena pesada proporcionado en la presente descripción puede incluir una región variable de cadena pesada (VH) y/o una región constante de cadena pesada (CH). Una "secuencia transmembrana" como se proporciona en la presente descripción se refiere a la secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio transmembrana proporcionado en la presente descripción. Una "secuencia de señalización intracelular de células T" como se proporciona en la presente descripción se refiere a la secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio de señalización intracelular de células T proporcionado en la presente descripción. Una "secuencia de señalización intracelular coestimuladora" como se proporciona en la presente descripción se refiere a la secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio de señalización intracelular coestimulador proporcionado en la presente descripción.

En las modalidades, el ácido nucleico aislado incluye una secuencia de peptidilo autoescindible que codifica un dominio peptidilo autoescindible entre la secuencia de la cadena pesada y la secuencia de la cadena ligera. En las modalidades, la secuencia del enlazador peptidilo autoescindible es una secuencia T2A. En las modalidades, la secuencia del enlazador peptidilo autoescindible es una secuencia T2A o una secuencia 2A. En las modalidades, la secuencia del enlazador peptidilo autoescindible es una secuencia del virus de la fiebre aftosa. En las modalidades, la secuencia del enlazador peptidilo autoescindible es PVKQLLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO:83). En las modalidades, la secuencia del enlazador peptidilo autoescindible es una secuencia del virus A de la rinitis equina. En las modalidades, la secuencia del enlazador peptidilo autoescindible es QCTNYALLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO:84). En las modalidades, la secuencia del enlazador peptidilo autoescindible es una secuencia de teschovirus 1 porcino. En las modalidades, la secuencia del enlazador peptidilo autoescindible es ATNFSLLKQAGDVEENPGP (SEQ ID NO:85). En las modalidades, la secuencia del enlazador peptidilo autoescindible es la secuencia del virus Thosea Asigna. En las modalidades, la secuencia del enlazador peptidilo autoescindible es EGRGSLLTCGDVESNPGP (SEQ ID NO:86). En las modalidades, la secuencia de la cadena ligera es 3' con respecto a la secuencia de la cadena pesada. En las modalidades, la secuencia de la cadena ligera es 5' con respecto a la secuencia de la cadena pesada.

En las modalidades, la región del anticuerpo es un dominio habilitado para el meditopo de cetuximab, dominio habilitado para el meditopo de trastuzumab, dominio habilitado para el meditopo de pertuzumab, dominio habilitado para el meditopo M5A o dominio habilitado para el meditopo de rituximab. En las modalidades, la región del anticuerpo es un dominio habilitado para el meditopo de cetuximab humanizado. En las modalidades, la región de anticuerpo es un dominio habilitado para el meditopo de rituximab humanizado.

En otro ejemplo, se proporciona un ácido nucleico aislado. El ácido nucleico aislado codifica una proteína que incluye una primera porción que incluye un dominio variable de cadena pesada de anticuerpo y una segunda porción que incluye un dominio variable de cadena ligera de anticuerpo y un dominio constante de cadena ligera de anticuerpo, en donde la primera porción incluye además un dominio transmembrana. En las modalidades, la proteína es la proteína identificada por la SEQ ID NO:17. En las modalidades, la proteína es la proteína identificada por la SEQ ID NO:28. En las modalidades, la proteína es la proteína identificada por la SEQ ID NO:98. En las modalidades, la proteína es la proteína identificada por la SEQ ID NO:110.

En las modalidades, la proteína incluye desde el N-terminal hasta el C-terminal: un péptido de señalización de SEQ ID NO:18, un dominio de cadena pesada de SEQ ID NO:19, una región bisagra de SEQ ID NO:20, una región espaciadora de SEQ ID NO:21, un dominio transmembrana de SEQ ID NO:22, un dominio de señalización intracelular coestimulador de SEQ ID NO:23, un dominio enlazador de SEQ ID NO:24, un dominio de señalización intracelular de células T de SEQ ID NO:25, un primer dominio enlazador peptidilo autoescindible de SEQ ID NO:26, un péptido marcador de SEQ ID NO:29, un segundo dominio enlazador peptidilo autoescindible de SEQ ID NO:30, un péptido de señalización de SEQ ID NO:18 y un dominio de cadena ligera de SEQ ID NO:27. En las modalidades, la proteína incluye desde el N-terminal hasta el C-terminal: un péptido de señalización de SEQ ID NO:18, un dominio de cadena pesada de SEQ ID NO:19, una región bisagra de SEQ ID NO:20, una región espaciadora de SEQ ID NO:21, un dominio transmembrana de SEQ ID NO:22, un dominio de señalización intracelular coestimulador de SEQ ID NO:23, un dominio enlazador de SEQ ID NO:24, un dominio de señalización intracelular de células T de SEQ ID NO:25, un primer dominio enlazador peptidilo autoescindible de SEQ ID NO:26, un péptido marcador de SEQ ID NO:29, un segundo dominio enlazador peptidilo autoescindible de SEQ ID NO:30, un péptido de señalización de SEQ ID NO:18 o un dominio de cadena ligera de SEQ ID NO:27. En las modalidades, la proteína incluye desde el N-terminal hasta el C-terminal: un péptido de señalización de SEQ ID NO:18, un dominio de cadena pesada de SEQ ID NO:19, una región bisagra de SEQ ID NO:20, una región espaciadora de SEQ ID NO:21, un dominio transmembrana de SEQ ID NO:22, un dominio de señalización intracelular coestimulador de SEQ ID NO:23, un dominio enlazador de SEQ ID NO:24, un dominio de señalización intracelular de células T de SEQ ID NO:25, un dominio enlazador de peptidilo autoescindible de SEQ ID NO:26, un péptido de señalización de SEQ ID NO:18 y un dominio de cadena ligera de SEQ ID NO:27. En las modalidades, la proteína incluye desde el N-terminal hasta el C-terminal: un péptido de señalización de SEQ ID NO:18, un dominio de cadena pesada de SEQ ID NO: 19, una región bisagra de SEQ ID NO:20, una región espaciadora de SEQ ID NO:21, un dominio transmembrana de SEQ ID NO:22, un dominio de señalización intracelular coestimulador de SEQ ID NO:23, un dominio enlazador de SEQ ID NO:24, un dominio de señalización intracelular de células T de SEQ ID NO:25, un dominio enlazador peptidilo autoescindible de SEQ ID NO:26, un péptido de señalización de SEQ ID NO: 18 o un dominio de cadena ligera de SEQ ID NO:27.

El término "péptido de señalización" como se refiere en la presente descripción se usa de acuerdo con su significado ordinario en la técnica y se refiere a un péptido que tiene una longitud de aproximadamente 5-30 aminoácidos. Un péptido de señalización está presente en el extremo N de las proteínas recién sintetizadas que forman parte de la vía secretora. Las proteínas de la vía secretora incluyen, pero no se limitan a las proteínas que residen ya sean dentro de ciertos orgánulos (el retículo endoplásmico, Golgi o endosomas), se secretan a partir de la célula o se insertan en una membrana celular. En las modalidades, el péptido de señalización forma parte del dominio transmembrana de una proteína.

El término "dominio de cadena pesada" como se menciona en la presente descripción se usa de acuerdo con su significado ordinario en la técnica y se refiere a un polipéptido que incluye una región variable de cadena pesada (VH) y una región constante de cadena pesada (CH). El término "dominio de cadena ligera" como se menciona en la presente descripción se usa de acuerdo con su significado ordinario en la técnica y se refiere a un polipéptido que incluye una región variable de cadena ligera (VL) y una región constante de cadena ligera (CL).

En las modalidades, la proteína incluye desde el N-terminal hasta el C-terminal: un péptido de señalización de SEQ ID NO:87, un dominio de cadena ligera de SEQ ID NO:88, un dominio enlazador de peptidilo autoescindible de SEQ ID NO:89, un dominio de cadena pesada de SEQ ID NO:90, una región bisagra de SEQ ID NO:91, una primera región espaciadora de SEQ ID NO:92, una segunda región espaciadora de SEQ ID NO:93, un dominio transmembrana de SEQ ID NO:94, un dominio de señalización intracelular coestimulador de SEQ ID NO:95, un dominio enlazador de SEQ ID NO:96 y un dominio de señalización intracelular de células T de SEQ ID NO:97. En las modalidades, la proteína incluye desde el N-terminal hasta el C-terminal: un péptido de señalización de SEQ ID NO:87, un dominio de cadena ligera de SEQ ID NO:88, un dominio enlazador de peptidilo autoescindible de SEQ ID NO:89, un dominio de cadena pesada de SEQ ID NO:90, una región bisagra de SEQ ID NO:91, una primera región espaciadora de SEQ ID NO:92, una segunda región espaciadora de SEQ ID NO:93, un dominio transmembrana de SEQ ID NO:94, un dominio de señalización intracelular coestimulador de SEQ ID NO:95, un dominio enlazador de SEQ ID NO:96, o un dominio de señalización intracelular de células T de SEQ ID NO:97.

En las modalidades, la proteína incluye desde el N-terminal hasta el C-terminal: un péptido de señalización de SEQ ID NO:99, un dominio de cadena pesada de SEQ ID NO:100, una región bisagra de SEQ ID NO:101, una primera región espaciadora de SEQ ID NO:102, una segunda región espaciadora de SEQ ID NO:103, un dominio transmembrana de SEQ ID NO:104, un dominio de señalización intracelular coestimulador de SEQ ID NO: 105, un dominio enlazador de SEQ ID NO: 106, y un dominio de señalización intracelular de células T de SEQ ID NO:107, un dominio enlazador peptidilo autoescindible de SEQ ID NO:108, y un dominio de cadena ligera de SEQ ID NO:109. En las modalidades, la proteína incluye desde el N-terminal hasta el C-terminal: un péptido de señalización de SEQ ID NO:99, un dominio de cadena pesada de SEQ ID NO:100, una región bisagra de s Eq ID NO:101, una primera región espaciadora de SEQ ID NO:102, una segunda región espaciadora de SEQ ID NO:103, un dominio transmembrana de SEQ ID NO:104, un dominio de señalización intracelular coestimulador de SEQ ID NO:105, un dominio enlazador de SEQ ID NO:106, y un dominio de señalización intracelular de células T de SEQ ID NO:107, un dominio enlazador peptidilo autoescindible de SEQ ID NO:108, o un dominio de cadena ligera de SEQ ID NO:109.

En las modalidades, la primera porción incluye además un dominio de señalización intracelular de células T. En las modalidades, el dominio de señalización intracelular de células T es la SEQ ID NO:11. En las modalidades, el dominio de señalización intracelular de células T es un dominio de señalización intracelular de células T CD3 Z. En las modalidades, la primera porción incluye un dominio de señalización intracelular coestimulador. En las modalidades, el dominio de señalización intracelular coestimulador es un dominio de señalización intracelular coestimulador de CD28, un dominio de señalización intracelular coestimulador de 4-1BB, un dominio de señalización intracelular coestimulador de ICOS o un dominio de señalización intracelular coestimulador de OX-40. En las modalidades, el dominio de señalización intracelular coestimulador es la SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15 o SEQ ID NO:16.

En las modalidades, la primera porción incluye un dominio enlazador. En las modalidades, el dominio enlazador está entre el dominio transmembrana y el dominio de señalización intracelular de las células T. En las modalidades, el dominio enlazador se encuentra entre el dominio de señalización intracelular de las células T y el dominio de señalización intracelular coestimulador. En las modalidades, el dominio enlazador comprende la secuencia GGCGG o GGG

En las modalidades, la primera porción incluye un dominio de señalización intracelular de células T CD3 y un dominio de señalización intracelular coestimulador. En las modalidades, la primera porción incluye desde el extremo amino hasta el extremo carboxi: el dominio variable de la cadena pesada, un dominio constante de la cadena pesada, el dominio transmembrana, el dominio de señalización intracelular de células T CD3 y un dominio de señalización intracelular coestimulador.

En las modalidades, la molécula de ácido nucleico aislada proporcionada en la presente descripción incluye una región espaciadora colocada entre el dominio variable de la cadena pesada y el dominio transmembrana. En las modalidades, la región espaciadora incluye una región de bisagra. En las modalidades, la región de bisagra es una región de bisagra CD8. En las modalidades, la región de bisagra es una región de bisagra CD28. Una "región espaciadora" como se proporciona en la presente descripción es un polipéptido que conecta el dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo con el dominio transmembrana. Cuando la primera porción de la proteína proporcionada en la presente descripción, que incluyen las modalidades de esta, incluye un dominio constante de cadena pesada, el dominio constante de cadena pesada conecta el dominio variable de cadena pesada con la región espaciadora y la región espaciadora conecta el dominio constante de cadena pesada con el dominio transmembrana. Por tanto, en las modalidades, la región espaciadora conecta el dominio variable de la cadena pesada con el dominio transmembrana. En las modalidades, la región espaciadora conecta el dominio constante de la cadena pesada con el dominio transmembrana.

En las modalidades, el dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo y el dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo están humanizados. En las modalidades, la primera porción incluye un dominio constante de cadena pesada. En las modalidades, el ácido nucleico aislado incluye una secuencia de peptidilo autoescindible entre la primera porción y la segunda porción. En las modalidades, la secuencia codificante de peptidilo autoescindible es una secuencia codificante de T2A o una secuencia codificante de 2A. En las modalidades, la secuencia codificante de peptidilo autoescindible es una secuencia codificante de T2A o la secuencia codificante de 2A. En las modalidades, la secuencia de ácido nucleico que codifica la segunda porción es 3' con respecto a la secuencia de ácido nucleico que codifica la primera porción.

En las modalidades, la proteína o región del anticuerpo proporcionada en la presente descripción, que incluyen las modalidades de esta, compite por la unión del antígeno con, se une específicamente al mismo antígeno o epítopo y/o contiene una, más o todas las CDR (o CDR que comprenden al menos al menos 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 % de identidad con las CDR), por ejemplo, que incluyen una CDR de cadena pesada 1,2 y/o 3 y/o una CDR1, 2 y/o 3 de cadena ligera de uno o más anticuerpos conocidos, que incluyen cualquier anticuerpo comercialmente disponible, tales como abagovomab, abciximab, adalimumab, adecatumumab, alemtuzumab, altumomab, pentetato de altumomab, anatumomab, anatumomab mafenatox, arcitumabomab, atlizimab, basiliximab, bectumomab, ectumomab, belimumab, benralizumab, bevacizumab, brentuximab, canakinumab, capromab, capromab pendetida, catumaxomab, certolizumab, tetraxetan clivatuzumab, daclizumab, denosumab, eculizumab, edrecolomab, efalizumab, etaracizumab, ertumaxomab, fanolesomab, Fbta05, fontolizumab, gemtuzumab, girentuximab, golimumab, ibritumomab, igovomab, infliximab, ipilimumab, labetuzumab, mepolizumab, muromonab, muromonab-CD3, natalizumab, necitumumab, nimotuzumab, ofatumumab, omalizumab, oregovomab, palivizumab, panitumumab, ranibizumab, rituximab, satumomab, sulesomab, ibritumomab, ibritumomab tiuxetan, tocilizumab, tositumomab, trastuzumab, Trbs07, ustekinumab, visilizumab, votumumab, zalutumumab, y/o brodalumab; y/o anrukinzumab, bapineuzumab, dalotuzumab, demcizumab, ganitumab, inotuzumab, mavrilimumab, moxetumomab pasudotox, rilotumumab, sifalimumab, tanezumab, tralokinumab, tremelimumab, urelumab, el anticuerpo producido por el hibridoma 10B5 (ver Edelson & Unanue, Curr Opin Immunol, Agosto 2000;12(4):425-31), B6H12.2 (abcam) u otro anticuerpo anti-CD47 (ver Chao y otros, Cell, 142, 699-713, 3 de septiembre de 2010).

En las modalidades, la región de proteína o anticuerpo se une específicamente a un antígeno seleccionado del grupo que consiste en: CA-125, receptor de glucoproteína (GP) IIb/IIIa, TNF-alfa, CD52, TAG-72, antígeno carcinoembrionario (CEA), receptor de interleucina-6 (IL-6R), IL-2, cadena a del receptor de interleucina-2 (CD25), CD22, factor de activación de células B, receptor de interleucina-5 (CD125), VEGF, VEGF-A, CD30, IL-1beta, antígeno de membrana específico de próstata (PSMA), Cd 3, EpCAM, receptor de Eg F (EGFR), MUC1, receptor de interleucina-2 humana, Tac, ligando RANK, una proteína del complemento, por ejemplo, C5, EpCAM, CD11a, por ejemplo, CD11a humana, una integrina, por ejemplo, Integrina alfa-v beta-3, integrina alfa v beta 3 del receptor de vitronectina, HER2, neu, CD3, CD15, CD20 (asas pequeñas y/o grandes), Interferón gamma, CD33, CA-IX, TNF alfa, CTLA-4, antígeno carcinoembrionario, IL-5, CD3 épsilon, CAM, Alfa-4-integrina, IgE, por ejemplo, región Fc de IgE, un antígeno de RSV, por ejemplo, proteína F del virus sincitial respiratorio (RSV), TAG-72, Nc A-90 (antígeno de células de granulocitos), IL-6, Gd 2, GD3, IL- 12, IL-23, IL-17, CTAA16.88, IL13, interleucina-1 beta, beta-amiloide, receptor de IGF-1 (IGF-1R), ligando 4 similar al delta (DLL4), subunidad alfa del receptor del factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos, factor de crecimiento de hepatocitos, IFN-alfa, factor de crecimiento nervioso, IL-13, CD326, ligando 1 de muerte celular programada 1 (PD-L1, también conocido como CD274, B7-H1), CD47 y CD137.

En las modalidades, la proteína o región de anticuerpo es una proteína anti-CD19, proteína anti-CD20, proteína anti-CD22, proteína anti-CD30, proteína anti-CD33, proteína anti-CD44v6/7/8, proteína anti-CD123, proteína anti-CEA, proteína anti-EGP-2, proteína anti-EGP-40, proteína anti-erb-B2, proteína anti-erb-B2,3,4, proteína anti-FBP, proteína anti receptor de acetilcolina fetal, proteína anti-GD2, proteína anti-GD3, proteína anti-Her2/neu, proteína anti-IL-13R-a2, proteína anti-KDR, proteína anti cadena ligera k, proteína anti-LeY, proteína de molécula de adhesión celular anti-Ll, proteína anti-MAGE-Al, proteína anti-mesotelina, proteína celular infectada anti-CMV murino, proteína anti-MUC2, proteína anti-NKGD2, proteína anti-antígeno oncofetal, proteína anti-PCSA, proteína anti-PSMA, proteína anti-TAA (dirigida por mAb IfE), proteína anti-EGFR, proteína anti-TAG-72 o proteína anti-VEGF-72.

En las modalidades, la proteína o región de anticuerpo tiene una secuencia de cadena ligera que incluye P8, V9 o I9, I10 o L10, Q38, R39, T40, N41 G42, S43, P44, R45, D82, I83, A84, D85, Y86, Y87, G99, A100, G101, T102, K103, L104, E105, R142, S162, V163, T164, E165, Q166, D167, S168 y/o Y173, de acuerdo con la numeración de Kabat, y/o tiene una cadena pesada con Q6, P9, R38, Q39, S40, P41, G42, K43, G44, L45, S84, D86, T87, A88, I89, Y90, Y91, W103, G104, Q105, G106, T107, L108, V111, T110, Y147, E150, P151, V152, T173, F174, P175, A176, V177, Y185, S186 y/o L187, de acuerdo con la numeración de Kabat.

También se proporcionan complejos que incluyen una región de anticuerpo o proteína unida a uno o más compuestos que incluyen una porción peptidilo como se proporciona en la presente descripción. La región o proteína del anticuerpo puede ser cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, que incluyen sus fragmentos. El uno o más compuestos que incluyen una porción peptidilo como se proporciona en la presente descripción puede incluir uno o más de los compuestos descritos en la presente descripción, tales como los descritos en esta sección, que incluyen los compuestos monovalentes y multivalentes y compuestos marcados.

En otro aspecto, se proporciona un vector de expresión que incluye un ácido nucleico proporcionado en la presente descripción que incluye modalidades de este. En las modalidades, el vector es un vector viral. En las modalidades, el virus es un lentivirus u oncorretrovirus. En las modalidades, el virus es un lentivirus u oncorretrovirus.

En otro ejemplo, se proporciona una célula de mamífero que incluye el vector de expresión proporcionado en la presente descripción que incluye modalidades de este. En ejemplos, la célula de mamífero es una célula asesina natural (Nk). En ejemplos, la célula de mamífero es una célula madre pluripotente inducida. En las modalidades, la célula es una célula madre hematopoyética. En ejemplos, la célula de mamífero incluye un primer polipéptido y un segundo polipéptido, el primer polipéptido que incluye un dominio variable de cadena pesada, un dominio constante de cadena pesada, un dominio transmembrana, un dominio de señalización de CD3 y un dominio de señalización coestimulador de células T, el segundo polipéptido que incluye un dominio variable de cadena ligera y un dominio constante de cadena ligera.

En otro aspecto, se proporciona un linfocito T que incluye el vector de expresión proporcionado en la presente descripción que incluye modalidades de este. En las modalidades, el linfocito T incluye un primer polipéptido y un segundo polipéptido, el primer polipéptido que incluye un dominio variable de cadena pesada, un dominio constante de cadena pesada, un dominio transmembrana, un dominio de señalización de CD3 Z y un dominio de señalización coestimulador de células T, el segundo polipéptido que incluye un dominio variable de cadena ligera y un dominio constante de cadena ligera.

Proteínas recombinantes

En otro ejemplo, se proporciona una proteína recombinante. La proteína recombinante incluye (i) una región de anticuerpo que incluye una cavidad central formada por una región variable de cadena pesada (VH) y una región variable de cadena ligera (VL), en donde la cavidad central forma un sitio de unión del péptido que incluye residuos de aminoácidos de la región marco; y (ii) un dominio transmembrana. En las modalidades, la región del anticuerpo incluye además una región constante de cadena pesada (CH) y una región constante de cadena ligera (CL). En las modalidades, la región del anticuerpo incluye un dominio Fc. En las modalidades, la región de anticuerpo es una región de anticuerpo humanizado (por ejemplo, una región de anticuerpo de ratón humanizado). En las modalidades, la región de anticuerpo no incluye una región de anticuerpo scFv.

En las modalidades, la proteína incluye además un dominio de señalización intracelular de células T como se describe en la presente descripción. En las modalidades, el dominio de señalización intracelular de células T es un dominio de señalización intracelular de células T CD3 Z. En las modalidades, la proteína incluye además un dominio de señalización intracelular coestimulador. En las modalidades, el dominio de señalización intracelular coestimulador es un dominio de señalización intracelular coestimulador de CD28, un dominio de señalización intracelular coestimulador de 4-1BB, un dominio de señalización intracelular coestimulador de ICOS o un dominio de señalización intracelular coestimulador de OX-40.

En las modalidades, la proteína incluye además una región espaciadora. En las modalidades, la región espaciadora se encuentra entre el dominio transmembrana y la región del anticuerpo.

En las modalidades, la proteína incluye además un dominio enlazador. En las modalidades, el dominio enlazador está entre el dominio transmembrana y el dominio de señalización intracelular de las células T. En las modalidades, el dominio enlazador se encuentra entre el dominio de señalización intracelular de las células T y el dominio de señalización intracelular coestimulador. En las modalidades, el dominio enlazador incluye la secuencia GGCGG o GGG. En las modalidades, la región de anticuerpo es un dominio habilitado para el meditopo de cetuximab, dominio habilitado para el meditopo de trasuzumab, dominio habilitado para el meditopo de pertuzumab, dominio habilitado para el meditopo M5A o dominio habilitado para el meditopo de rituximab. En las modalidades, un compuesto que incluye una porción peptidilo se une al sitio de unión del péptido. En las modalidades, el compuesto es un meditopo multivalente. Un "meditopo multivalente" como se proporciona en la presente descripción es una porción peptidilo como se describe en la presente descripción. Por tanto, un meditopo multivalente es capaz de unirse al sitio de unión del péptido proporcionado en la presente descripción, que incluyen las modalidades de este. En las modalidades, el meditopo multivalente se une al FR que recubre el sitio de unión del péptido. En las modalidades, el meditopo multivalente se une a la porción terapéutica o de diagnóstico a través de un enlazador químico. En las modalidades, el meditopo multivalente tiene la estructura de fórmula (I) o (II). Las proteínas y compuestos pueden ser cualquiera de las proteínas o compuestos descritos en la presente descripción, que incluyen sus modalidades.

En otro aspecto, se proporciona una proteína recombinante. La proteína recombinante incluye una primera porción que incluye un dominio variable de cadena pesada de anticuerpo y una segunda porción que incluye un dominio variable de cadena ligera de anticuerpo y un dominio constante de cadena ligera de anticuerpo, en donde la primera porción incluye además un dominio transmembrana, y en donde el dominio variable de cadena pesada de anticuerpo, el dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo y el dominio constante de la cadena ligera del anticuerpo forman juntos una región del anticuerpo.

En otro aspecto, se proporciona una célula de mamífero que incluye la proteína recombinante proporcionada en la presente descripción que incluye modalidades de esta, en donde el dominio transmembrana está dentro de la membrana celular de la célula de mamífero. En las modalidades, la célula de mamífero es una célula asesina natural (Nk). En las modalidades, la célula de mamífero es una célula madre pluripotente inducida. En las modalidades, la célula es una célula madre hematopoyética.

En otro aspecto, se proporciona un linfocito T que incluye la proteína recombinante proporcionada en la presente descripción que incluye modalidades de esta, en donde el dominio transmembrana está dentro de la membrana celular del linfocito T.

Composiciones farmacéuticas

Las composiciones farmacéuticas proporcionadas por la presente descripción (por ejemplo, proteínas y compuestos proporcionados en la presente descripción) que incluyen composiciones en donde el ingrediente activo (por ejemplo, las composiciones descritas en la presente descripción, que incluyen modalidades o ejemplos) está contenido en una cantidad terapéuticamente efectiva, es decir, en una cantidad efectiva para lograr su propósito previsto. La cantidad efectiva real para una aplicación particular dependerá, inter alia, de la afección a tratar. Cuando se administran en los métodos para tratar una enfermedad, las proteínas recombinantes descritas en la presente descripción contendrán una cantidad de ingrediente activo eficaz para lograr el resultado deseado, por ejemplo, modular la actividad de una molécula objetivo y/o reducir, eliminar o ralentizar la progresión de síntomas de la enfermedad. La determinación de una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de la descripción está bien aceptado dentro de las capacidades de los expertos en la técnica, especialmente a la luz de la descripción detallada que se proporciona en la presente descripción.

La dosificación y la frecuencia (dosis única o múltiples) administradas a un mamífero pueden variar dependiendo de una variedad de factores, por ejemplo, si el mamífero padece otra enfermedad y su vía de administración; tamaño, edad, sexo, salud, peso corporal, índice de masa corporal y dieta del receptor; naturaleza y alcance de los síntomas de la enfermedad que se trata (por ejemplo, síntomas de cáncer y gravedad de dichos síntomas), tipo de tratamiento concurrente, complicaciones de la enfermedad que se trata u otros problemas relacionados con la salud. Otros regímenes o agentes terapéuticos pueden usarse junto con los métodos y compuestos de la descripción. El ajuste y manipulación de las dosificaciones establecidas (por ejemplo, frecuencia y duración) están dentro de la capacidad de los expertos en la técnica.

Para cualquier compuesto descrito en la presente descripción, la cantidad terapéuticamente efectiva puede determinarse inicialmente a partir de ensayos en cultivos celulares. Las concentraciones objetivo serán aquellas concentraciones de compuesto(s) activo(s) que son capaces de lograr los métodos descritos en la presente descripción, medidos con el uso de los métodos descritos en la presente descripción o conocidos en la técnica. Las cantidades efectivas para su uso en seres humanos se puede determinar a partir de los modelos animales, como es bien conocido en la técnica. Por ejemplo, una dosis para humanos puede formularse para lograr una concentración que se ha encontrado que es eficaz en animales. La dosificación en humanos puede ajustarse mediante el monitoreo efectivo y el ajuste de la dosis hacia arriba o hacia abajo, como se describió anteriormente. El ajuste de la dosis para lograr una eficacia máxima basado en los métodos descritos anteriormente y otros métodos está dentro de las capacidades del experto en la técnica.

Las dosificaciones pueden variarse en dependencia de los requerimientos del paciente y el compuesto a emplear. La dosis administrada a un paciente, en el contexto de la presente descripción, debe ser suficiente para ejercer una respuesta terapéutica beneficiosa en el paciente a lo largo del tiempo. El tamaño de la dosis se determinará también por la existencia, naturaleza, y extensión de cualquier efecto secundario adverso. La determinación de la dosis adecuada para una situación particular está dentro de la experiencia del especialista en la técnica. Generalmente, el tratamiento inicia con dosificaciones menores que son menores que la dosis óptima del compuesto. A partir de entonces, la dosificación se aumenta mediante incrementos pequeños hasta que se alcanza el efecto óptimo bajo las circunstancias.

La cantidades de dosificación e intervalos pueden ajustarse individualmente para proporcionar niveles del compuesto administrado eficaces para la indicación clínica particular a tratar. Esto proporcionará un régimen terapéutico que es acorde con la gravedad del estado de la enfermedad del individuo.

Utilizando las enseñanzas proporcionadas en la presente descripción, se puede planificar un régimen de tratamiento profiláctico o terapéutico eficaz que no cause una toxicidad sustancial y, sin embargo, sea eficaz para tratar los síntomas clínicos demostrados por el paciente en particular. Esta planificación debe involucrar la elección cuidadosa del compuesto activo considerando factores como la potencia del compuesto, la biodisponibilidad relativa, el peso corporal del paciente, la presencia y la gravedad de los efectos secundarios adversos, "Excipiente farmacéuticamente aceptable" y "portador farmacéuticamente aceptable" preferido se refieren a una sustancia que ayuda a la administración de un agente activo y a la absorción por un sujeto y puede incluirse en las composiciones de la presente descripción sin causar un efecto toxicológico adverso significativo en el paciente. Los ejemplos no limitantes de excipientes farmacéuticamente aceptables incluyen agua, NaCl, soluciones salinas normales, lactato de Ringer, sacarosa normal, glucosa normal, aglutinantes, rellenos, desintegrantes, lubricantes, revestimientos, edulcorantes, sabores, soluciones salinas (como la solución de Ringer), alcoholes, aceites, gelatinas, carbohidratos tales como lactosa, amilosa o almidón, ésteres de ácidos grasos, hidroximetilcelulosa, polivinilpirrolidina y colorantes y similares. Tales preparaciones pueden esterilizarse y, si se desea, mezclarse con agentes auxiliares tales como lubricantes, conservantes, estabilizadores, agentes humectantes, emulsionantes, sales para influir en la presión osmótica, tampones, colorantes, y/o sustancias aromáticas y similares que no reaccionan de forma perjudicial con los compuestos de la descripción. Un experto en la técnica reconocerá que otros excipientes farmacéuticos son útiles en la presente descripción.

El término "sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a sales derivadas de una variedad de contraiones orgánicos e inorgánicos bien conocidos en la técnica e incluyen, sólo a modo de ejemplo, sodio, potasio, calcio, magnesio, amonio, tetraalquilamonio y similares; y cuando la molécula contiene una funcionalidad básica, sales de ácidos orgánicos o inorgánicos, tales como clorhidrato, hidrobromuro, tartrato, mesilato, acetato, maleato, oxalato y similares.

El término "preparación" pretende incluir la formulación del compuesto activo con material encapsulado como un portador que proporciona una cápsula en la cual el componente activo con o sin otros portadores, se rodea por un portador, que está por tanto en asociación con él. Similarmente, se incluyen sobres y pastillas. Las tabletas, polvos, cápsulas, píldoras, sobres, y pastillas pueden usarse como formas de dosificación sólidas adecuadas para la administración oral.

La preparación farmacéutica está opcionalmente en forma de dosificación unitaria. En tal forma la preparación se subdivide en dosis unitarias que contienen cantidades apropiadas del componente activo. La forma de dosificación unitaria puede ser una preparación empaquetada, el paquete que contiene cantidades discretas de la preparación, tales como tabletas, cápsulas, y polvos empacados en viales o ampollas. También, la forma de dosificación unitaria puede ser una cápsula, tableta, sobre, o pastilla, o puede ser el número apropiado de cualquiera de estas en la forma empaquetada. La forma de dosificación unitaria puede ser una dispersión congelada.

Métodos de tratamiento

En otro caso, se describe un método para tratar el cáncer. El método incluye administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad efectiva de la célula de mamífero proporcionada en la presente descripción, que incluyen las modalidades de esta, en donde la región de anticuerpo es una región de anticuerpo anticanceroso.

En otro caso, se describe un método para tratar el cáncer. El método incluye administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad efectiva del linfocito T proporcionado en la presente descripción, que incluyen las modalidades de este, en donde la región del anticuerpo es una región del anticuerpo anticanceroso. En las modalidades, el linfocito T es un linfocito T autólogo. En las modalidades, el linfocito T es un linfocito T heterólogo. En ejemplos, el cáncer es un cáncer de tumor sólido o una neoplasia maligna hematológica. En ejemplos, el cáncer es cáncer de ovario, carcinoma de células renales, una neoplasia maligna de células B, leucemia, linfoma, cáncer de mama, cáncer colorrectal, cáncer de próstata, neuroblastoma, melanoma, meduloblastoma, cáncer de pulmón, osteosarcoma, glioblastoma o glioma. En ejemplos, la leucemia es leucemia linfoide aguda. En ejemplos, la leucemia es leucemia linfocítica crónica. En ejemplos, la leucemia es leucemia mieloide aguda. En ejemplos, la leucemia es leucemia mieloide crónica.

En otro ejemplo, se describe un método para reprogramar un linfocito T. El método incluye poner en contacto un linfocito T con el vector de expresión proporcionado en la presente descripción, que incluyen las modalidades de este.

En otro ejemplo, se describe un método para detectar un cáncer. El método incluye (i) administrar a un paciente con cáncer una cantidad efectiva de un linfocito T que incluye la proteína recombinante proporcionada en la presente descripción, que incluyen las modalidades de esta y un compuesto que incluye una porción peptidilo capaz de unirse al sitio de unión del péptido, en donde el compuesto incluye además una etiqueta detectable, y en donde la región de anticuerpo es una región de anticuerpo anticanceroso. El método incluye (ii) permitir que el compuesto se una al sitio de unión del péptido formando de esta manera un complejo proteína-compuesto recombinante. Y (iii) el complejo proteína recombinante-compuesto se detecta dentro del paciente con cáncer, detectando de esta manera el cáncer.

Como se usa en la presente descripción, "tratamiento" o "tratar", o "paliar" o "mejorar" se usan indistintamente en la presente descripción. Estos términos se refieren a un enfoque para obtener resultados beneficiosos o deseados que incluyen, pero sin limitarse a, un beneficio terapéutico y/o un beneficio profiláctico. Por beneficio terapéutico se entiende la erradicación o mejora del trastorno subyacente que se trata. Además, un beneficio terapéutico se logra con la erradicación o mejora de uno o más de los síntomas fisiológicos asociados con el trastorno subyacente de manera que se observa una mejora en el paciente, a pesar de que el paciente pueda aún estar aquejado con el trastorno subyacente. Para beneficio profiláctico, las composiciones pueden administrarse a un paciente en riesgo de desarrollar una enfermedad particular, o a un paciente que reporta uno o más de los síntomas sicológicos de una enfermedad, aun aunque puede no haberse hecho un diagnóstico de esta enfermedad. El tratamiento incluye prevenir la enfermedad, es decir, hacer que los síntomas clínicos de la enfermedad no se desarrollen mediante la administración de una composición protectora antes de la inducción de la enfermedad; suprimir la enfermedad, es decir, hacer que los síntomas clínicos de la enfermedad no se desarrollen mediante la administración de una composición protectora después del evento inductivo sino antes de la aparición clínica o reaparición de la enfermedad; inhibir la enfermedad, es decir, detener el desarrollo de síntomas clínicos mediante la administración de una composición protectora después de su aparición inicial; prevenir la reaparición de la enfermedad y/o aliviar la enfermedad, es decir, provocar la regresión de los síntomas clínicos mediante la administración de una composición protectora después de su aparición inicial. Por ejemplo, ciertos métodos en la presente descripción tratan el cáncer (por ejemplo, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, osteosarcoma, cáncer de vejiga, cáncer de cuello uterino, cáncer de hígado, cáncer de riñón, cáncer de piel (por ejemplo, carcinoma de células de Merkel), cáncer de testículo, leucemia, linfoma, cáncer de cabeza y cuello cáncer, cáncer colorrectal, cáncer de próstata, cáncer de páncreas, melanoma, cáncer de mama, neuroblastoma). Por ejemplo, ciertos métodos en la presente descripción tratan el cáncer mediante la disminución o reducción o prevención de la aparición, el crecimiento, la metástasis o la progresión del cáncer; o tratar el cáncer mediante la disminución de un síntoma de cáncer. Los síntomas de cáncer (por ejemplo, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, osteosarcoma, cáncer de vejiga, cáncer de cuello uterino, cáncer de hígado, cáncer de riñón, cáncer de piel (por ejemplo, carcinoma de células de Merkel), cáncer de testículo, leucemia, linfoma, cáncer de cabeza y cuello, cáncer colorrectal, cáncer de próstata, cáncer de páncreas, melanoma, cáncer de mama, neuroblastoma) se podrían conocer o pueden determinarse por una persona con experiencia en la técnica.

Como se usa en la presente descripción, los términos "tratamiento", "tratar" o "que trata" se refieren a un método para reducir los efectos de uno o más síntomas de una enfermedad o afección caracterizada por la expresión de la proteasa o síntoma de la enfermedad o afección caracterizada por expresión de la proteasa. Por lo tanto, en el método descrito, el tratamiento puede referirse a una reducción del 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, o 100 % en la gravedad de una enfermedad o afección establecidas o síntoma de la enfermedad o afección. Por ejemplo, un método para tratar una enfermedad se considera que es un tratamiento si existe una reducción del 10 % en uno o más síntomas de la enfermedad en un sujeto en comparación con un control. Por lo tanto, la reducción puede ser una reducción del 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 % o cualquier por ciento entre 10 y 100 % en comparación con los niveles nativos o controles. Se entiende que el tratamiento no necesariamente se refiere a una cura o ablación completa de la enfermedad, afección, o síntomas de la enfermedad o afección. Además, como se usa en la presente descripción, las referencias a disminuir, reducir o inhibir incluyen un cambio del 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o más en comparación con un nivel de control y tales términos pueden incluir pero no necesariamente incluyen la eliminación completa.

Una "cantidad efectiva" es una cantidad suficiente de un compuesto para cumplir un propósito establecido (por ejemplo, lograr el efecto para el que se administra, tratar una enfermedad, reducir la actividad enzimática, reducir uno o más síntomas de una enfermedad o afección). Un ejemplo de una "cantidad terapéuticamente efectiva" es una cantidad suficiente para contribuir al tratamiento, prevención, o reducción de un síntoma o síntomas de una enfermedad, que también podría denominarse como una "cantidad terapéuticamente efectiva." Una "reducción" de un síntoma o síntomas (y los equivalentes gramaticales de esta frase) significa la disminución de la gravedad o la frecuencia del(los) síntoma(s), o la eliminación de los síntoma(s). Una "cantidad profilácticamente efectiva" de un fármaco es una cantidad de un fármaco que, cuando se administra a un sujeto, tendrá el efecto profiláctico pretendido, por ejemplo, prevenir o retrasar la aparición (o reaparición) de una lesión, enfermedad, patología o afección, o reducir la probabilidad de aparición (o reaparición) de una lesión, enfermedad, patología o afección, o sus síntomas. El efecto profiláctico completo no necesariamente ocurre por la administración de una dosis, y puede ocurrir solo después de la administración de una serie de dosis. Por lo tanto, una cantidad profilácticamente efectiva puede administrarse en una o más administraciones. Una "cantidad de disminución de la actividad", como se usa en la presente descripción, se refiere a una cantidad de antagonista requerida para disminuir la actividad de una enzima o proteína en relación con la ausencia del antagonista. Una "cantidad que interrumpe la función", como se usa en la presente descripción, se refiere a la cantidad de antagonista necesaria para interrumpir la función de una enzima o proteína en relación con la ausencia del antagonista. Se puede encontrar en la literatura, la orientación para dosificaciones apropiadas de clases determinadas de productos farmacéuticos. Por ejemplo, para el parámetro dado, una cantidad efectiva mostrará un aumento o disminución de al menos 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 40 %, 50 %, 60 %, 75 %, 80 %, 90 %, o al menos 100 %. La eficacia también se puede expresar como aumento o disminución de "veces". Por ejemplo, una cantidad terapéuticamente efectiva puede tener al menos un efecto de 1,2 veces, 1,5 veces, 2 veces, 5 veces o más sobre un control. Las cantidades exactas dependerán del propósito del tratamiento, y un experto en la técnica podrá determinarlas mediante el uso de técnicas conocidas (ver, por ejemplo, Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vols. 1-3, 1992); Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999); Pickar, Dosage Calculations (1999); y Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20ma Edición, 2003, Gennaro, Ed., Lippincott, Williams & Wilkins).

Como se usa en la presente descripción, el término "administrar" significa administración oral, administración como supositorio, contacto tópico, administración intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intralesional, intratecal, intranasal o subcutánea, o la implantación de un dispositivo de liberación lenta, por ejemplo, una bomba miniosmótica, a un sujeto. La administración es por cualquier vía, que incluyen parenteral y transmucosa (por ejemplo, bucal, sublingual, palatino, gingival, nasal, vaginal, rectal o transdérmico). La administración parenteral incluye, por ejemplo, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intradérmica, subcutánea, intraperitoneal, intraventricular e intracranial. Otros modos de administración incluyen, pero no se limitan al uso de formulaciones liposomales, infusión intravenosa, parches transdérmicos, etc. Por "coadministrar" se entiende que una composición descrita en la presente descripción se administra al mismo tiempo, justo antes o justo después de la administración de una o más terapias adicionales, por ejemplo, terapias contra el cáncer como quimioterapia, terapia hormonal, radioterapia, o inmunoterapia. Los compuestos de la invención pueden administrarse solos o pueden coadministrarse al sujeto. La coadministración pretende incluir la administración simultánea o secuencial de los compuestos individualmente o en combinación (más de un compuesto). Por lo tanto, las preparaciones pueden también combinarse, cuando se desee, con otras sustancias activas (por ejemplo para reducir la degradación metabólica). Las composiciones de la presente descripción pueden administrarse por vía transdérmica, por vía tópica, formuladas como barras aplicadoras, soluciones, suspensiones, emulsiones, geles, cremas, ungüentos, pastas, jaleas, pinturas, polvos y aerosoles.

Las composiciones de la presente descripción pueden incluir adicionalmente componentes para proporcionar liberación y/o confort sostenidos. Dichos componentes incluyen polímeros mucomiméticos aniónicos, de alto peso molecular, polisacáridos gelificantes y sustratos portadores de fármacos divididos finamente. Estos componentes se analizan en mayor detalle en las patentes de Estados Unidos, Núms. 4.911.920; 5.403.841; 5.212.162; y 4.861.760.

Las composiciones de la presente descripción también se pueden administrar como microesferas para una liberación lenta en el cuerpo. Por ejemplo, las microesferas se pueden administrar mediante inyección intradérmica de microesferas que contienen fármaco, que se liberan lentamente por vía subcutánea (ver Rao, J. Biomater Sci. Polym. Ed. 7: 623-645, 1995; como formulaciones de gel biodegradables e inyectables (ver, por ejemplo, Gao Pharm. Res. 12: 857-863, 1995); o como microesferas para administración oral (ver, por ejemplo, Eyles, J. Pharm. Pharmacol. 49: 669-674, 1997). En ejemplos, las formulaciones de las composiciones de la presente descripción pueden administrarse mediante el uso de liposomas que se fusionan con la membrana celular o se endocitan, es decir, mediante el empleo de ligandos de receptor unidos al liposoma, que se unen a los receptores de proteínas de la membrana de la superficie de la célula dando como resultado la endocitosis. Mediante el uso de liposomas, particularmente cuando la superficie del liposoma lleva ligandos receptores específicos para células objetivo, o se dirigen preferentemente de otra manera a un órgano específico, se puede enfocar la administración de las composiciones de la presente invención en las células objetivo in vivo. (Ver, por ejemplo., Al-Muhammed, J. Microencapsul. 13: 293-306, 1996; Chonn, Curr. Opin. Biotechnol. 6: 698-708, 1995; Ostro, Am. J. Hosp. Pharm. 46: 1576-1587, 1989). Las composiciones de la presente invención también se pueden administrar como nanopartículas.

Utilizando las enseñanzas proporcionadas en la presente descripción, se puede planificar un régimen de tratamiento profiláctico o terapéutico eficaz que no cause una toxicidad sustancial y, sin embargo, sea eficaz para tratar los síntomas clínicos demostrados por el paciente en particular. Esta planificación debe implicar la elección cuidadosa del compuesto activo considerando factores como la potencia del compuesto, la biodisponibilidad relativa, el peso corporal del paciente, la presencia y gravedad de los efectos secundarios adversos, el modo preferido de administración y el perfil de toxicidad del agente seleccionado.

"Agente anticanceroso" se usa de acuerdo con su significado ordinario y se refiere a una composición (por ejemplo, compuesto, fármaco, antagonista, inhibidor, modulador) que tiene propiedades antineoplásicas o la capacidad de inhibir el crecimiento o la proliferación de las células. En ejemplos, un agente anticanceroso es un quimioterapéutico. En ejemplos, un agente anticanceroso es un agente identificado en la presente descripción que tiene utilidad en métodos para tratar el cáncer. En ejemplos, un agente anticanceroso es un agente aprobado por la FDA o una agencia reguladora similar de un país distinto de los Estados Unidos, para tratar el cáncer.

Las composiciones descritas en la presente descripción se pueden usar en combinación entre sí, con otros agentes activos que se sabe que son útiles en el tratamiento de un cáncer, tales como los agentes anticancerígenos.

Los ejemplos de agentes anticancerígenos incluyen, pero sin limitarse a, inhibidores de MEK (por ejemplo MEK1, MEK2, o MEK1 y MEK2) (por ejemplo XL518, CI-1040, PD035901, selumetinib/AZD6244, GSK1120212/trametinib, GDC-0973, ARRY-162, ARRY-300, AZD8330, PD0325901, U0126, PD98059, TAK-733, PD318088, AS703026, BAY 869766), agentes alquilantes (por ejemplo, ciclofosfamida, ifosfamida, clorambucilo, busulfán, melfalán, mecloretamina, uramustina, tiotepa, nitrosoureas, mostazas nitrogenadas (por ejemplo, mecloroetamina, ciclofosfamida, clorambucilo, meifalán), etilenimina y metilmelaminas (por ejemplo, hexametilmelamina, tiotepa), alquil sulfonatos (por ejemplo, busulfán), nitrosoureas (por ejemplo, carmustina, lomustina, semustina, estreptozocina), triazenos (decarbazina)), antimetabolitos (por ejemplo, 5-azatioprina, leucovorina, capecitabina, fludarabina, gemcitabina, pemetrexed, raltitrexed, análogo de ácido fólico (por ejemplo, metotrexato), o análogos de pirimidina (por ejemplo, fluorouracilo, floxouridina, citarabina), análogos de purina (por ejemplo, mercaptopurina, tioguanina, pentostatina), etc.), alcaloides vegetales (por ejemplo, vincristina, vinblastina, vinorelbina, vindesina, podofilotoxina, paclitaxel, docetaxel, etc.), inhibidores de la topoisomerasa (por ejemplo, irinotecán, topotecán, amsacrina, etopósido (VP16), fosfato de etopósido, tenipósido, etc.), antibióticos antitumorales (porejemplo, doxorrubicina, adriamicina, daunorrubicina, epirrubicina, actinomicina, bleomicina, mitomicina, mitoxantrona, plicamicina, etc.), compuestos a base de platino (por ejemplo cisplatino, oxaloplatino, carboplatino), antracenodiona (por ejemplo, mitoxantrona), urea sustituida (por ejemplo, hidroxiurea), derivado de metilhidrazina (por ejemplo, procarbazina), supresor adrenocortical (por ejemplo, mitotano, aminoglutetimida), epipodofilotoxinas (por ejemplo, etopósido), antibióticos (por ejemplo, daunorrubicina, doxorrubicina, bleomicina), enzimas (por ejemplo, L-asparaginasa), inhibidores de la señalización de la proteína quinasa activada por mitógenos (por ejemplo U0126, PD98059, PD184352, PD0325901, ARRY-142886, SB239063, SP600125, BAY 43-9006, wortmannina, o LY294002, inhibidores de Syk, inhibidores de mTOR, anticuerpos (por ejemplo, rituxan), gosifol, genasense, polifenol E, clorofusina, ácido retinoico todo trans (ATRA), briostatina, ligando inductor de apoptosis relacionado con el factor de necrosis tumoral (TRAIL), 5-aza-2'-desoxicitidina, ácido retinoico todo trans, doxorrubicina, vincristina, etopósido, gemcitabina, imatinib (Gleevec.RTM.), geldanamicina, 17-N-Alilamino-17-demetoxigeldanamicina (17-AAG), flavopiridol, LY294002, bortezomib, trastuzumab, BAY 11-7082, PKC412, PD184352, 20-epi-1, 25 dihidroxivitamina D3; 5-etiniluracilo; abiraterona; aclarrubicina; acilfulveno; adecipenol; adozelesina; aldesleukina; antagonistas de ALL-TK; altretamina; ambamustina; amidox; amifostina; ácido aminolevulínico; amrubicina; amsacrina; anagrelida; anastrozol; andrografólido; inhibidores de la angiogénesis; antagonista D; antagonista G; antarelix; proteína morfogenética anti-dorsalizante-1; antiandrógeno, carcinoma prostático; antiestrógeno; antineoplaston; oligonucleótidos antisentido; glicinato de afidicolina; moduladores de genes de apoptosis; reguladores de la apoptosis; ácido apurínico; ara-CDP-DL-PTBA; arginina desaminasa; asulacrina; atamestano; atrimustina; axinastatina 1; axinastatina 2; axinastatina 3; azasetrón; azatoxina; azatirosina; derivados de bacatina III; balanol; batimastat; antagonistas de BCR/ABL; benzoclorinas; benzoilstaurosporina; derivados de betalactamas; beta-aletina; betaclamicina B; ácido betulínico; inhibidor de bFGF; bicalutamida; bisantreno; bisaziridinilspermina; bisnafida; bistrateno A; bbizelesina; breflato; bropirimina; budotitano; butionina sulfoximina; calcipotriol; calfostina C; derivados de camptotecina; canarypox IL-2; capecitabina; carboxamida-amino-triazol; carboxiamidotriazol; CaRest M3; CARN 700; inhibidor derivado del cartílago; carzelesina; inhibidores de la caseína quinasa (ICOS); castanospermina; cecropina B; cetrorelix; clorinas; sulfonamida de cloroquinoxalina; cicaprost; cisporfirina; cladribina; análogos de clomifeno; clotrimazol; collismicina A; collismicina B; combretastatina A4; análogo de combretastatina; conagenina; crambescidina 816; crisnatol; criptoficina 8; derivados de criptoficina A; curacina A; ciclopentantraquinonas; cicloplatam; cipemicina; ocfosfato de citarabina; factor citolítico; citostatina; dacliximab; decitabina; deshidrodidemnina B; deslorelina; dexametasona; dexifosfamida; dexrazoxano; dexverapamil; diaziquona; didemnina B; didox; dietilnorespermina; dihidro-5-azacitidina; 9-dioxamicina; difenil espiromustina; docosanol; dolasetrón; doxifluridina; droloxifeno; dronabinol; duocarmicina SA; ebselen; ecomustina; edelfosina; edrecolomab; eflornitina; elemene; emitefur; epirrubicina; epristerida; análogo de estramustina; agonistas de estrógenos; antagonistas de estrógenos; etanidazol; fosfato de etopósido; exemestano; fadrozol; fazarabina; fenretinida; filgrastim; finasterida; flavopiridol; flezelastina; fluasterona; fludarabina; clorhidrato de fluorodaunorunicina; forfenimex; formestano; fostriecina; fotemustina; texafirina de gadolinio; nitrato de galio; galocitabina; ganirelix; inhibidores de gelatinasa; gemcitabina; inhibidores de glutatión; hepsulfam; heregulina; bisacetamida de hexametileno; hipericina; ácido ibandrónico; idarrubicina; idoxifeno; idramantona; ilmofosina; ilomastat; imidazoacridonas; imiquimod; péptidos inmunoestimulantes; inhibidor del receptor del factor de crecimiento 1 similar a la insulina; agonistas de interferón; interferones; interleucinas; iobenguano; yododoxorrubicina; ipomeanol, 4-; iroplact; irsogladina; isobengazol; isohomohalicondrina B; itasetrón; jasplaquinolida; kahalalida F; triacetato de lamellarina-N; lanreotida; leinamicina; lenograstim; sulfato de lentinan; leptolstatina; letrozol; factor inhibidor de la leucemia; interferón alfa leucocitario; leuprolida+estrógeno+progesterona; leuprorelina; levamisol; liarozol; análogo de poliamina lineal; péptido de disacárido lipofílico; compuestos lipofílicos de platino; lissoclinamida 7; lobaplatino; lombricina; lometrexol; lonidamina; losoxantrona; lovastatina; loxoribina; lurtotecán; texafirina de lutecio; lisofilina; péptidos líticos; maitansina; manostatina A; marimastat; masoprocol; maspina; inhibidores de matrilisina; inhibidores de metaloproteinasas de matriz; menogaril; merbarone; meterelina; metioninasa; metoclopramida; inhibidor de MIF; mifepristona; miltefosina; mirimostim; ARN bicatenario mal apareado; mitoguazona; mitolactol; análogos de mitomicina; mitonafida; factor de crecimiento de fibroblastos de mitotoxina-saporina; mitoxantrona; mofaroteno; molgramostim; anticuerpo monoclonal, gonadotropina coriónica humana; monofosforil lípido A+ pared celular sk de miobacterias; mopidamol; inhibidor de genes de resistencia a múltiples fármacos; terapia basada en el supresor de tumores múltiples 1; agente anticanceroso mostaza; micaperóxido B; extracto de pared celular micobacteriana; miriaporona; N-acetildinalina; benzamidas N-sustituidas; nafarelina; nagrestip; naloxona+pentazocina; napavin; nafterpina; nartograstim; nedaplatino; nemorrubicina; ácido neridrónico; endopeptidasa neutra; nilutamida; nisamicina; moduladores de óxido nítrico; antioxidante nitróxido; nitrulina; bencilguanina-06; octreótido; okicenona; oligonucleótidos; onapristona; ondansetrón; ondansetrón; oracina; inductor de citocinas oral; ormaplatino; osaterona; oxaliplatino; oxaunomicina; palauamina; palmitoilrizoxina; ácido pamidrónico; panaxitriol; panomifeno; parabactina; pazelliptina; pegaspargasa; peldesina; polisulfato de pentosano sódico; pentostatina; pentrozol; perflubrona; perfosfamida; alcohol perilílico; fenazinomicina; fenilacetato; inhibidores de la fosfatasa; picibanil; clorhidrato de pilocarpina; pirarrubicina; piritrexim; placetina A; placetina B; inhibidor del activador del plasminógeno; complejo de platino; compuestos de platino; complejo de platino-triamina; porfímero de sodio; porfiromicina; prednisona; propilbis-acridona; prostaglandina J2; inhibidores del proteasoma; modulador inmunológico basado en proteína A; inhibidor de la proteína quinasa C; inhibidores de la proteína quinasa C, microalgas; inhibidores de proteína tirosina fosfatasa; inhibidores de purina nucleósido fosforilasa; purpurinas; pirazoloacridina; conjugado de polioxietileno de hemoglobina piridoxilada; antagonistas de raf; raltitrexed; ramosetrón; inhibidores de ras farnesil proteína transferasa; inhibidores de ras; inhibidor de ras-GAP; reteliptina desmetilada; etidronato de renio Re 186; rizoxina; ribozimas; retinamida RII; rogletimida; rohitukina; romurtida; roquinimex; rubiginona B1; ruboxil; safingol; saintopina; SarCNU; sarcofitol A; sargramostim; miméticos de Sdi 1; semustina; inhibidor 1 derivado de la senescencia; oligonucleótidos sentido; inhibidores de la transducción de señales; moduladores de transducción de señales; proteína de unión a antígeno de cadena sencilla; sizofurano; sobuzoxano; borocaptato de sodio; fenilacetato de sodio; solverol; proteína de unión a somatomedina; sonermina; ácido esparfósico; espicamicina D; espiromustina; esplenopentina; espongistatina 1; escualamina; inhibidor de células madre; inhibidores de la división de células madre; estipiamida; inhibidores de estromelisina; sulfinosina; antagonista del péptido intestinal vasoactivo superactivo; suradista; suramina; swainsonina; glicosaminoglicanos sintéticos; tallimustina; metioduro de tamoxifeno; tauromustina; tazaroteno; tecogalan sodio; tegafur; telurapirilio; inhibidores de la telomerasa; temoporfina; temozolomida; tenipósido; tetraclorodecaóxido; tetrazomina; taliblastina; tiocoralina; trombopoyetina; mimético de trombopoyetina; timalfasina; agonista del receptor de timopoyetina; timotrinan; hormona estimulante de la tiroides; etiletiopurpurina de estaño; tirapazamina; bicloruro de titanoceno; topsentina; toremifeno; factor de células madre totipotentes; inhibidores de la traducción; tretinoína; triacetiluridina; triciribina; trimetrexato; triptorelina; tropisetrón; turosterida; inhibidores de tirosina quinasa; tirfostinas; inhibidores de UBC; ubenimex; factor inhibidor del crecimiento derivado del seno urogenital; antagonistas del receptor de uroquinasa; vapreotida; variolina B; sistema de vectores, terapia génica de eritrocitos; velaresol; veramina; verdinas; verteporfina; vinorelbina; vinxaltina; vitaxina; vorozol; zanoterona; zeniplatino; zilascorb; estimalámero de zinostatina, adriamicina, dactinomicina, bleomicina, vinblastina, cisplatino, acivicina; aclarrubicina; clorhidrato de acodazol; acronina; adozelesina; aldesleucina; altretamina; ambomicina; acetato de ametantrona; aminoglutetimida; amsacrina; anastrozol; antramicina; asparaginasa; asperlina; azacitidina; azetepa; azotomicina; batimastat; benzodepa; bicalutamida; clorhidrato de bisantreno; dimesilato de bisnafida; bizelesina; sulfato de bleomicina; brequinar sódico; bropirimina; busulfán; cactinomicina; calusterona; caracemida; carbetimer; carboplatino; carmustina; clorhidrato de carubicina; carzelesina; cedefingol; clorambucilo; cirolemicina; cladribina; mesilato de crisnatol; ciclofosfamida; citarabina; dacarbazina; clorhidrato de daunorrubicina; decitabina; dexormaplatino; dezaguanina; mesilato de dezaguanina; diaziquona; doxorrubicina; clorhidrato de doxorrubicina; droloxifeno; citrato de droloxifeno; propionato de dromostanolona; duazomicina; edatrexato; clorhidrato de eflornitina; elsamitrucina; enloplatino; enpromato; epipropidina; clorhidrato de epirrubicina; erbulozol; clorhidrato de esorrubicina; estramustina; fosfato de estramustina sódico; etanidazol; etopósido; fosfato de etopósido; etoprina; clorhidrato de fadrozol; fazarabina; fenretinida; floxuridina; fosfato de fludarabina; fluorouracilo; fluorocitabina; fosquidona; fostriecina sódica; gemcitabina; clorhidrato de gemcitabina; hidroxiurea; clorhidrato de idarrubicina; ifosfamida; iimofosina; interleucina I1 (incluida la interleucina recombinante II, o rlL.sub.2), interferón alfa-2a; interferón alfa-2b; interferón alfa-nl; interferón alfa-n3; interferón beta-la; interferón gammalb; iproplatino; clorhidrato de irinotecán; acetato de lanreotida; letrozol; acetato de leuprolida; clorhidrato de liarozol; lometrexol sódico; lomustina; clorhidrato de losoxantrona; masoprocol; maitansina; clorhidrato de mecloretamina; acetato de megestrol; acetato de melengestrol; melfalán; menogaril; mercaptopurina; metotrexato; metotrexato sódico; metoprina; meturedepa; mitindomida; mitocarcina; mitocromina; mitogilina; mitomalcina; mitomicina; mitosper; mitotano; clorhidrato de mitoxantrona; ácido micofenólico; nocodazoie; nogalamicina; ormaplatino; oxisurano; pegaspargasa; peliomicina; pentamustina; sulfato de peplomicina; perfosfamida; pipobroman; piposulfán; clorhidrato de piroxantrona; plicamicina; plomestano; porfímero sódico; porfiromicina; prednimustina; clorhidrato de procarbazina; puromicina; clorhidrato de puromicina; pirazofurina; riboprina; rogletimida; safingol; clorhidrato de safingol; semustina; simtrazeno; esparfosato sódico; esparsomicina; clorhidrato de espirogermanio; espiromustina; espiroplatino; estreptonigrina; estreptozocina; sulofenur; talisomicina; tecogalán sódico; tegafur; clorhidrato de teloxantrona; temoporfina; tenipósido; teroxirona; testolactona; tiamiprina; tioguanina; tiotepa; tiazofurina; tirapazamina; citrato de toremifeno; acetato de trestolona; fosfato de triciribina; trimetrexato; glucuronato de trimetrexato; triptorelina; clorhidrato de tubulozol; mostaza de uracilo; uredepa; vapreotida; verteporfina; sulfato de vinblastina; sulfato de vincristina; vindesina; sulfato de vindesina; sulfato de vinepidina; sulfato de vinglicinato; sulfato de vinleurosina; tartrato de vinorelbina; sulfato de vinrosidina; sulfato de vinzolidina; vorozol; zeniplatino; zinostatina; clorhidrato de zorrubicina, agentes que detienen las células en las fases G2-M y/o modulan la formación o estabilidad de los microtúbulos, (por ejemplo Taxol.TM (es decir paclitaxel), Taxotere.TM, compuestos que comprenden el esqueleto de taxano, erbulozol (es decir R-55104), dolastatina 10 (es decir DLS-10 y n SC-376128), isetionato de mivobulina (es decir, como CI-980), vincristina, NSC-639829, discodermolida (es decir, como NVP-XX-A296), ABT-751 (Abbott, es decir E-7010), altorritinas (por ejemplo, altorrirtina A y altorrirtina C), espongistatinas (por ejemplo, espongistatina 1, espongistatina 2, espongistatina 3, espongistatina 4, espongistatina 5, espongistatina 6, espongistatina 7, espongistatina 8 y espongistatina 9), clorhidrato de cemadotina (es decir LU-103793 y NSC-D-669356), epotilonas (por ejemplo, epotilona A, epotilona B, epotilona C (es decir, desoxiepotilona A o dEpoA), epotilona D (es decir KOS-862, dEpoB, y desoxieptilona B), epotilona E, epotilona F, N-óxido de epotilona B, N-óxido de epotilona A, 16-azaepotilona B, 21-aminoepotilona B (es decir BMS-310705), 21-hidroxiepotilona D (es decir, desoxiepotilona F y dEpoF), 26-fluoroepotilona, auristatina PE (es decir NSC-654663), soblidotin (es decir TZT-1027), LS-4559-P (Pharmacia, es decir LS-4577), LS-4578 (Pharmacia, es decir LS-477-P), LS-4477 (Pharmacia), LS-4559 (Pharmacia), RPR-112378 (Aventis), sulfato de vincristina, DZ-3358 (Daiichi), FR-182877 (Fujisawa, es decir WS-9885B), GS-164 (Takeda), GS-198 (Takeda), KAR-2 (Academia de Ciencias de Hungría), BSF-223651 (BASF, es decir ILX-651 y LU-223651), SAH-49960 (Lilly/Novartis), SDZ-268970 (Lilly/Novartis), AM-97 (Armad/Kyowa Hakko), AM-132 (Armad), AM-138 (Armad/Kyowa Hakko), IDN-5005 (Indena), criptoficina 52 (es decir lY-355703), AC-7739 (Ajinomoto, es decir AVE-8063Ay CS-39.HCl), AC-7700 (Ajinomoto, es decir AVE-8062, AVE-8062A, CS-39-L-Ser.HCl, y RPR-258062A), vitilevuamida, tubulisina A, canadensol, centaureidina (es decir NSC-106969), T-138067 (Tularik, es decir T-67, TL-138067 y TI-138067), COBRA-1 (Instituto Parker Hughes, es decir DDE-261 y WHI-261), H10 (Universidad Estatal de Kansas), H16 (Universidad Estatal de Kansas), oncocidina A1 (es decir BTO-956 y DIME), DDE-313 (Instituto Parker Hughes), Fijianolide B, Laulimalide, SPA-2 (Instituto Parker Hughes), SPA-1 (Instituto Parker Hughes, es decir SPIKET-P), 3-IAAb U (Cytoskeleton/Escuela de Medicina de Monte Sinaí, es decir MF-569), narcosina (también conocida como NSC-5366), nascapina, D-24851 (Asta Medica), A-105972 (Abbott), Hemiasterlin, 3-BAABU (Cytoskeleton/Escuela de Medicina de Monte Sinaí, es decir MF-191), TMPN (Universidad Estatal de Arizona), acetilacetonato de vanadoceno, T-138026 (Tularik), monsatrol, inanocina (es decir Ns C-698666), 3-IAABE (Cytoskeleton/Escuela de Medicina de Monte Sinaí), A-204197 (Abbott), T-607 (Tuiarik, es decir T-900607), RPR-115781 (Aventis), eleuterobinas (como desmetileleuterobina, desaetileleuterobina, lsoeleuterobina A y Z-eleuterobina), caribaeosida, caribaolina, halicondrina B, D-64131 (Asta Medica), D-68144 (Asta Medica), diazonamida A, A-293620 (Abbott), NPI-2350 (Nereus), taccalonolida A, TUB-245 (Aventis), A-259754 (Abbott), diozostatina, (-)-fenilahistina (es decir NSCL-96F037), D-68838 (Asta Medica), D-68836 (Asta Medica), mioseverina B, D-43411 (Zentaris, es decir D-81862), A-289099 (Abbott), A-318315 (Abbott), HTI-286 (es decir SPA-110, sal de trifluoroacetato) (Wyeth), D-82317 (Zentaris), D-82318 (Zentaris), SC-12983 (NCI), fosfato sódico de resverastatina, BPR-OY-007 (Institutos Nacionales de Investigación en Salud) y SSR-250411 (Sanofi)), steroids (por ejemplo, dexametasona), finasterida, inhibidores de la aromatasa, agonistas de la hormona liberadora de gonadotropina (GnRH) como goserelina o leuprolida, adrenocorticosteroides (por ejemplo, prednisona), progestinas (por ejemplo, caproato de hidroxiprogesterona, acetato de megestrol, acetato de medroxiprogesterona), estrógenos (por ejemplo, dietilestilbestrol, etinilestradiol), antiestrógeno (por ejemplo, tamoxifeno), andrógenos (por ejemplo, propionato de testosterona, fluoximesterona), antiandrógeno (por ejemplo, flutamida), inmunoestimulantes (por ejemplo, Bacillus Calmette-Guérin (BCG), levamisol, interleucina-2, alfa-interferón, etc.), anticuerpos monoclonales (por ejemplo, anticuerpos monoclonales anti-CD20, anti-HER2, anti-CD52, anti-HLA-DR y anti-VEGF), immunotoxinas (por ejemplo, conjugado de anticuerpo monoclonal anti-CD33-calicheamicina, conjugado de anticuerpo monoclonal anti-CD22-exotoxina de pseudomonas, etc.), radioinmunoterapia (por ejemplo, anticuerpo monoclonal anti-CD20 conjugado a 111In, 90Y o 131I, etc.), triptolida, homoharringtonina, dactinomicina, doxorrubicina, epirrubicina, topotecán, itraconazol, vindesina, cerivastatina, vincristina, desoxiadenosina, sertralina, pitavastatina, irinotecán, clofazimina, 5-noniloxitriptamina, vemurafenib, dabrafenib, erlotinib, gefitinib, inhibidores de EGFR, terapia o producto terapéutico dirigido al receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) (por ejemplo gefitinib (Iressa™), erlotinib (Tarceva™), cetuximab (Erbitux™), lapatinib (Tykerb™), panitumumab (Vectibix™), vandetanib (Caprelsa™), afatinib/BIBW2992, CI-1033/canertinib, neratinib/HKI-272, CP-724714, TAK-285, AST-1306, ARRY334543, ARRY-380, AG-1478, dacomitinib/PF299804, OSI-420/desmetil erlotinib, AZD8931, AEE788, pelitinib/EKB-569, CUDC-101, WZ8040, WZ4002, WZ3146, AG-490, XL647, PD153035, BMS-599626), sorafenib, imatinib, sunitinib, dasatinib o similares. En ejemplos, las composiciones de la presente pueden usarse en combinación con agentes adyuvantes que pueden no ser efectivos solos, pero pueden contribuir a la eficacia del agente activo en el tratamiento del cáncer.

En ejemplos, la coadministración incluye administrar un agente activo dentro de 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 20 o 24 horas de un segundo agente activo. La coadministración incluye administrar dos agentes activos simultáneamente, aproximadamente simultáneamente (por ejemplo, dentro de aproximadamente 1, 5, 10, 15, 20 o 30 minutos entre sí), o secuencialmente en cualquier orden. En ejemplos, la coadministración se puede realizar mediante coformulación, es decir, preparando una única composición farmacéutica que incluya ambos agentes activos. En ejemplos, los agentes activos se pueden formular por separado. En ejemplos, los agentes activos y/o adyuvantes pueden estar unidos o conjugados entre sí.

Ejemplos

Los solicitantes han descubierto un sitio de unión único para un péptido cíclico (también denominado en la presente descripción "meditopo") dentro de la cavidad central del brazo Fab del mAb terapéutico, cetuximab (1). Los solicitantes demostraron que este sitio es exclusivo de cetuximab y está ausente en mAb humanos. Los solicitantes también han demostrado, bioquímicamente, en cultivos celulares y en estudios de xenoinjertos de animales, que la ocupación de este sitio no afecta la unión del antígeno. Además, los solicitantes demostraron que este sitio se puede injertar en mAb humanos ("habilitadores de meditopos"), lo que indica que este sitio de unión de péptidos puede usarse, por ejemplo, como una baliza para dirigir agentes de formación de imágenes o como un "enganche" para aportar una nueva funcionalidad a los mAb. A través de una amplia modificación por ingeniería genética, los solicitantes mejoraron la afinidad de la interacción meditopo-Fab en más de 40 000 veces con una vida media estimada que excede los seis días a temperatura ambiente. Los solicitantes demostraron además que la fusión del meditopo con la proteína L, una proteína de unión a Fab, mejoró significativamente la afinidad y estimaron que la vida media de este complejo superaba los 80 días. Finalmente, los solicitantes verificaron mediante estudios SPR que la conjugación de marcadores fluorescentes, DOTA, GFP y otros dominios proteicos con el meditopo de alta afinidad y con la fusión meditopo-proteína L (MPL) no afecta la afinidad de MPL-Fab ni de interacciones Fab-antígeno. En conjunto, estos datos muestran que la funcionalidad se puede "ajustar" a cualquier mAb habilitado para el meditopo dado.

La terapia con células T CAR, que ha producido respuestas duraderas especialmente en las neoplasias malignas de células B (2-6), implica la reprogramación de las células T del paciente con un receptor artificial que consiste en una porción extracelular de direccionamiento de antígeno, un dominio transmembrana y módulos de señalización intracelular, incluido CD3Z y dominios coestimuladores de CD28 y/o CD137 (4-1BB), para activar las células T e inducir una respuesta inmune. El dominio de direccionamiento de antígeno del CAR generalmente es un antígeno tumoral que reconoce la región de anticuerpo variable F de cadena sencilla (scFv). Existe una necesidad en la técnica de la capacidad de: 1) caracterizar la densidad de los CAR en las células transformadas, 2) rastrear las células T CAR administradas en cualquier momento durante la terapia y correlacionar esta distribución con los resultados terapéuticos, 3) funcionalizar rápidamente las células T CAR, y 4) eliminar selectivamente células T CAR si es necesario. En las modalidades, los constructos proporcionados en la presente descripción son capaces de satisfacer estas necesidades.

En las modalidades, los constructos proporcionados en la presente descripción son útiles en las siguientes áreas: (i) Aplicación de microscopía de super resolución para caracterizar la expresión de CAR mediante la observación directa de la distribución del receptor en las células T. Los solicitantes han fusionado una GFP fotoactivable (paGFP) con un meditopo de alta afinidad y han demostrado que los mAb habilitados para el meditopo unidos a los receptores derivados de células pueden "contarse" y su tamaño de conglomerado puede cuantificarse. Dicha información puede correlacionarse con la eficacia terapéutica y utilizarse en la clínica para el "control de calidad." (ii) Formación de imágenes de células T CAR habilitadas para el meditopo con un meditopo de alta afinidad conjugado con DOTA in situ. Los solicitantes han demostrado que los meditopos conjugados de alta afinidad no afectan la unión del antígeno. Por tanto, las células T meCAR se pueden marcar previamente con meditopos de alta afinidad conjugados con 64Cu-DOTA y su migración se puede rastrear. Alternativamente, las células T meCAR se pueden administrar, dejar que se localicen y proliferen, y luego, posteriormente, obtener formación de imágenes. Se ha demostrado que los métodos de formación de imágenes basados en mAb prediseñados, como se proponen, producen imágenes de PET de alta calidad mediante el uso de anticuerpos diseñados (9-11). (iii) Nueva funcionalidad ortogonal que se puede agregar rápidamente a la célula T meCAR. Específicamente, los meditopos se pueden conjugar con productos biológicos que reconocen un segundo ligando asociado a un tumor, citotoxinas potentes, moduladores inmunitarios que incluyen citoquinas y profármacos activados por tumores. Estos meditopos se pueden unir directamente a las células T meCAR antes de la administración o se pueden añadir posteriormente después de que se establezcan las células T meCAR.

Ejemplo 1

Generación, caracterización e identificación de constructos CAR habilitados por meditopos para inmunoterapia. Se generan diferentes combinaciones de constructos CAR (meCAR) basados en mAb y Fab habilitados por meditopo que se dirigen a los tumores positivos a HER2, empaquetadas cada una en un lentivirus y células T transducidas para generar células T HER2+-CAR (meHER2+-CAR) T habilitada para meditopo. Se caracterizan los niveles de expresión de cada meCAR así como su afinidad por HER2 extracelular soluble con y sin meditopo conjugado con DOTA. Finalmente, la capacidad de destrucción de células tumorales de cada constructo se cuantifica en presencia y ausencia de un meditopo conjugado con DOTA in vitro.

Los CAR son una herramienta en la reprogramación del sistema inmunológico para reconocer y destruir las células cancerosas. Los CAR generalmente se componen de un dominio de reconocimiento de antígeno (por ejemplo, un scFv), un espaciador (por ejemplo, el dominio Fc de una IgG o dominio bisagra de CD8), una región transmembrana y dominios coestimuladores y de activación intracelulares (por ejemplo, CD28 y/o CD137 y CD3 cadena Z). En las modalidades, un dominio de reconocimiento de antígeno compuesto por un Fab o mAb habilitado para meditopo proporciona un sitio de unión de péptido único para añadir rápida y específicamente nueva funcionalidad a través del péptido sin recurrir a una extensa reingeniería del propio CAR. Como se indica, estas funcionalidades pueden incluir la capacidad de formación de imágenes, dirigirse a receptores adicionales asociados a tumores, modular la función inmune y destruir selectivamente las células T CAR. En la presente descripción se proporcionan varios plásmidos de expresión para trastuzumab, un mAb anti-HER2 que se encuentra en la clínica para tumores positivos a HER2 y que los solicitantes han habilitado para meditopos (i). El orden de expresión de la cadena ligera y pesada se altera y la eficacia de diferentes sitios de entrada de ribosomas internos frente a la secuencia del péptido 2A que se autoescinde (15) son probados. La unión de HER2 soluble se cuantifica así como el meditopo para cada constructo mediante el uso de una variedad de ensayos de unión y microscopía de súper resolución. La funcionalidad in vitro de los diferentes constructos CAR se caracterizan por evaluar in vitro la destrucción de células T dependientes de HER2, desgranulación, producción y proliferación de citocinas. El efecto de la ocupación del meditopo de las células T meCAR se caracteriza mediante el uso de estos mismos ensayos. Se genera y caracteriza un CAR canónico específico de HER2 basado en el scFv de trastuzumab, que puede servir como punto de referencia para ensayos funcionales y de expresión.

Varios tumores expresan de forma aberrante HER2, incluidos el cáncer de mama, los sarcomas y el cáncer de pulmón. Por lo tanto, se han realizado esfuerzos para desarrollar terapias efectivas, siendo trastuzumab uno de ellos. Sin embargo, el 70 % de los pacientes con cáncer HER2+ no responden a estas terapias sistémicas y, de hecho, pueden desarrollar rápidamente resistencia a estos agentes Q6). Como tal, se han desarrollado vacunas contra HER2 y células T CAR HER2+ para ir más allá de la inhibición de las vías de señalización de HER2 y provocar una potente respuesta inmunitaria. Dada la potencia de las células T CAR y la posibilidad de efectos secundarios adversos (17), es útil para controlar, modular y potencialmente destruir las células T CAR HER2+. La habilitación de células T CAR con un sitio de unión al meditopo aborda estos problemas.

Interacción y optimización de meditopos. En la presente descripción se describe un sitio de unión de péptidos único dentro del brazo Fab de cetuximab que incluye los residuos de aminoácidos únicos que recubren el sitio que no se encuentra en los anticuerpos humanos. Este sitio puede injertarse en los mAb humanos que incluyen trastuzumab, un anti-CEA humanizado y otros mAb. La unión de péptidos no afecta la capacidad de los anticuerpos habilitados para meditopos para unirse a sus antígenos. Debido a que la posición del sitio de unión está en la cavidad central del Fab, el péptido puede denominarse "meditopo" ("medio y "topo") (Figura 2A). Los anticuerpos meditopo-habilitados "memAb" se refieren a los Fab habilitados para para meditopo como meFab Q).

Se han producido múltiples variantes de meditopos, acumulado para cada uno su medida de afinidad y datos cristalográficos. En estos estudios se identificaron residuos críticos, se introdujeron aminoácidos no naturales así como D-aminoácidos y se utilizaron diferentes estrategias de ciclación para mejorar significativamente la afinidad de unión (Figura 2B). Además, se introdujeron mutaciones puntuales en el Fab en la interfaz de unión al meditopo (versión 2) y se observó un aumento de 100 veces en la afinidad de unión (Figura 2B). Mediante estas modificaciones, la afinidad de los meditopos aumenta de 1,2 pM a 860 pM a 37 °C (aumento de 1000 veces). Además en las modalidades, los extremos del meditopo y la proteína L están muy próximos cuando se unen al meFab trastuzumab (Figura 2A) y demostraron una avidez favorable a través de la fusión del meditopo con la proteína L a través de un conector corto (MpL). La afinidad del constructo MPL por el meFab trastuzumab original medida por los experimentos de Kinexa es Kd = 14 pM, o 87000 veces la afinidad de los componentes individuales a 25 °C (datos no mostrados). Al asumir que cada modificación actúa de forma independiente, se tiene un aumento de 258 millones de veces en la afinidad por la combinación de una MPL sintética y memAb. La fusión de GFP con el constructo MPL no afecta la unión de memAb y la unión de GFP-MPL a memAb no afecta la cinética de asociación o disociación o la afinidad de la unión de HER2 (como se muestra en Avery y otros (37)).

MPL marcado con Alexa Fluor 647 se coadministró con memAb marcado con Alexa Fluor 488 a células SKBR3 que sobreexpresan HER2 o después de que las células se trataron con memAb y se lavaron extensamente. En ambos casos, el MPL marcado se colocalizó con memAb y antígeno (datos no mostrados). Además, se demostró mediante microscopía de fluorescencia que la fusión de la GFP voluminosa con la MPL no afecta la unión celular (datos no mostrados). Por último, se fusionó una GFP fotoactivable al constructo MPL y se usó microscopía de superresolución para cuantificar los receptores HER2 en las células BT474 (datos no mostrados).

Las células T CAR derivadas de scFv específicos de HER2 se dirigen y destruyen los tumores positivos a HER2. Se generó un CAR específico de HER2 de segunda generación compuesto por un scFv basado en el anticuerpo trastuzumab y los dominios de señalización intracelular de CD28 y CD3Z. Se construyó un casete de vector lentiviral auto-inactivante (SIN) que codifica este CAR scFv específico de HER2 (HEP2-28Z), seguido de una secuencia de salto ribosómico 2A y un CD19 truncado (CD19t), un marcador de superficie celular inerte desprovisto de señalización intracelular que permite la detección específica de células T transducidas (Figura 3A). El CD19 truncado (CD19t) como se proporciona en la presente descripción también se denomina "péptido marcador". Los términos "péptido marcador" o "CD19t" pueden usarse indistintamente en todas partes. Se construyó una célula T de memoria central humana (Tcm) para expresar los polipéptidos HEP2-28Z c A r y CD19t mediante transducción lentiviral, y se expandió ex vivo mediante el uso de la estimulación CD3/CD28 Dynabeads® y el crecimiento en medios X-Vivo complementados con IL-2 e IL-15 según la plataforma de fabricación compatible con GMPc (Figura 3B) (18).

Mediante el uso de modelos de ratón y primates no humanos relevantes para la traducción humana, se observó que las células T derivadas de Tcm CD62L+ persiste en la sangre después de la transferencia adoptiva, migra a los nichos de las células T de memoria en los ganglios linfáticos y la médula ósea, vuelve a adquirir las propiedades fenotípicas de las células T de memoria y responde al desafío del antígeno in vivo (21, 22, 24, 25). Las células T de memoria/vírgenes Tcm o CD62L+ pueden diseñarse para expresar HER2-CAR habilitados para meditopos, aprovechando la persistencia intrínseca a largo plazo de las células T de memoria y la plataforma de fabricación compatible con GMPc que se ha utilizado para producir productos clínicos para dos ensayos clínicos de fase I (BB-IND 14645 y 15490) (18).

HEP2-28Z Tcm exhibe una potente actividad citolítica específica de HER2 in vitro contra un panel de líneas celulares objetivo que muestran niveles de expresión de HER2 bajos (MCF7) y altos (BT-474 y SK-BR-3) (Figura 4A-4D). Adicionalmente, la inyección intracraneal de HER2-28Z Tcm puede mediar en la regresión de tumores cerebrales establecidos derivados de la línea celular de tumor de mama BT-474 HER2+ y dar como resultado una supervivencia a largo plazo para el 100 % de los ratones (datos no mostrados).

Las cadenas pesadas y ligeras de trastuzumab con meditopo sintético pueden subclonarse en un vector de expresión lentiviral (Figura 5). Dado que cada cadena debe producirse individualmente, se incorporará un motivo IRES entre la cadena ligera y pesada o se utilizará una secuencia de salto ribosómico como la secuencia T2A o 2A [15]. Además, se puede crear un CAR monomérico mediante el uso de un Fab habilitado para meditopo. Por tanto, el Fab habilitado para meditopo monomérico puede reticularse con un meditopo bivalente, lo que permite la regulación de la actividad de la célula T CAR (Figura 5). El dominio transmembrana se reemplaza con L-selectina monomérica (26) y se usa un enlazador de poliglicina-serina simple.

Células T con CAR habilitadas para meditopos. Las células T humanas primarias, por ejemplo, las células Tcm CD62L+, se aislarán de la sangre periférica de al menos tres donantes sanos, se modificarán mediante transducción lentiviral para expresar HER2-CAR y se evaluarán in vitro para especificidad y actividad funcional. Después de la expansión de CAR Tcm HER2+ habilitado para meditopo con OKT3/CD28 Dynabead® y estimulación de citocinas (IL-2 e IL-15), el nivel de expresión de cada constructo se caracterizará por FACS mediante el uso de anti-CD19 como marcador de transducción celular y anti-Fc para la expresión de CAR, un constructo Her2-Fc extracelular marcado con Alexa fluor 488 para la unión de antígenos, y un meditopo conjugado con Alexa fluor 647 para el acoplamiento funcional del meditopo-CAR. Las células T CAR positivas se enriquecerán, si es necesario, mediante la selección de células magnéticas anti-CD19 o FACS. La capacidad de cada constructo, Fab habilitado para meditopo y mAb habilitado para meditopo, para apuntar y lisar las líneas tumorales HER2 positivas (bajas y altas que expresan HER2; Figura 3A) y las líneas celulares de cáncer de mama negativas se examinarán mediante el uso de ensayos estándar de liberación de cromo y ensayos de cocultivo a largo plazo (24-96 horas) en presencia y ausencia de un meditopo de alta afinidad conjugado con DOTA. Para examinar la función efectora de diferentes células T HER2-CAR, se medirá la producción de citocinas dependientes de HER2, incluida la secreción de IFNy y TNFa después del cocultivo con células tumorales, nuevamente en presencia y ausencia de un meditopo de alta afinidad conjugado con DOTA. Además, se incluirán marcadores de activación y actividad citolítica, a saber, CD69, Granzima-B y CD107a, así como marcadores de agotamiento celular, que incluyen PD-1. Además, la capacidad proliferativa dependiente de antígeno de las diferentes células T CAR-HER2 habilitadas para meditopo en presencia y ausencia de meditopo conjugado con DOTA se medirá mediante análisis de dilución de colorante por citometría de flujo mediante el uso CSFE. En cada caso, los resultados se compararán con los de la célula T CAR scFv. Las metodologías para realizar estos ensayos funcionales in vitro se establecen fácilmente en nuestro grupo(6, 27).

La microscopía de súper resolución y análisis de autocorrelación (28) se utilizará para investigar la distribución de receptores para cada célula T CAR habilitada para meditopo. Este enfoque permitirá determinar cuantitativamente el tamaño, la ocupación y la densidad de proteínas en los conglomerados. Como se demuestra en la presente descripción, se produjo un constructo de paGFP-MPL de afinidad ultra alta y se utilizó microscopía de súper resolución para detectar moléculas individuales con una resolución de 15 nm. Además, se produjo un meditopo de 15 mer de alta afinidad marcado con fluorescencia, que está menos restringido estéricamente que el paGFP-MPL para formación de imágenes de superresolución. Mediante el uso de estos reactivos, se analizarán ~12 células individuales que expresan el Fab o mAb habilitado para meditopo y la eficacia de la célula T meCAR se correlacionará con la distribución del receptor.

Ejemplo 2

Eficacia y formación de imágenes in vivo de CAR habilitado para meditopos en modelos animales. Se evaluará la eficacia de las células T CAR habilitado para meditopo sobre la inhibición del crecimiento tumoral y se utilizará PET para la formación de imágenes de las células T meHER2+-CAR pretratadas con meditopos conjugados con DOTA marcados con 64Cu en ratones NSG. Los ratones NSG serán tratados con las células T meHER2-CAR y se administrará meditopo conjugado con DOTA marcado con 64Cu en intervalos de tiempo definidos para evaluar la captación del meditopo por las células T meHER2-CAR in situ.

La formación de imágenes prediseñada separa la acumulación lenta de mAb en el tumor y la eliminación lenta de los mAb de la sangre a partir de la vida media relativamente corta de los metales PET útiles mediante un proceso de dos etapas. Primero, al paciente se le administra un mAb conjugado (estreptavidina o con un dominio de unión único) y luego un ligando autodirigido que porta 64Cu. El ligando autodirigido se une rápidamente al mAb modificado asociado al tumor o se excreta rápidamente. Debido a que el 64Cu sufre menos vidas medias, la señal es más alta. Además, dado que el marcador se borra rápidamente, el fondo se reduce. Las imágenes preclínicas mediante el uso de este enfoque produjeron imágenes significativamente mejores que los métodos de conjugación directa (10). La formación de imágenes de localización, expansión y longevidad de las células T CAR en pacientes será tremendamente útil en el desarrollo y evaluación clínica de esta terapia. Los modelos de ratón de células T con CARin vivo para el tratamiento de tumores sólidos, que incluyen los tumores cerebrales (Figura 6), están bien establecidos en nuestro laboratorio (27, 34).

Se empleará un modelo de xenoinjerto tumoral ortotrópico y metastásico dual mediante el uso de ratones hembra NOD-scid IL2RYnull (NSG) y la línea de cáncer de mama BT474 amplificada con HER2 que ha sido diseñada para expresar luciferasa de luciérnaga (ffLuc) para la formación de imágenes de xenógeno no invasivas y un e Gf P reportero fluorescente (27). Las células tumorales BT474 EGFP-ffLuc+ se implantarán simultáneamente en la almohadilla de grasa mamaria (1 x 106 en una mezcla de 50 pL de PBS y Matrigel) para modelar la enfermedad primaria, y por vía intracraneal (1 x 105 en 2 pl de PBS) para modelar la enfermedad metastásica. Una vez que se establecen los tumores (típicamente 7-14 días), una dosis única de 5 x 106 cada Tcm de HER2-meCAR o Tcm sin ingeniería (simulacro) o PBS se administrará por vía intravenosa. Se ha demostrado que las células T CAR administradas por vía intravenosa transitan al cerebro y median la regresión del tumor (35, 36). El crecimiento/regresión del tumor se cuantificará de forma no invasiva mediante la formación de imágenes ópticas Xenogen® IVIS y medición del calibre, y la supervivencia será analizada por Kaplan-Meier. Para estos estudios, la infiltración de células T y la persistencia en tumores se evaluarán mediante inmunohistoquímica mediante el uso de un meditopo marcado con Alexa Fluor y marcadores CD3, y la persistencia de Tcm se cuantificará mediante citometría de flujo mediante el uso de meditopos marcados con Alexa Fluor, CD45, CD4/CD8 y marcadores CD62L en tumores y tejido linfoide. La proliferación/apoptosis en tumores (Ki67, TUNEL), la activación de células T CAR y la función citolítica (CD69, Granzima B, IFNy) en tumores y en tejidos linfoides se medirán mediante citometría de flujo. La eficacia in vivo de las células T meCAR se comparará con las células T CAR T HER2-28Z scFv previamente caracterizadas. Estos estudios establecerán la capacidad de las células T meCAR para mediar en la regresión tumoral HER2+ y revelarán las posibles diferencias en la actividad antitumoral y la persistencia de las células T de las células T CAR meFab o memAb.

El meditopo de alta afinidad con un DOTA C-terminal se sintetizará directamente. El meditopo DOTA se cargará con 64Cu, purificado por cromatografía en gel y mezclado con las células T meCAR. Las células se administrarán a animales que portan tumores BT474 EGFP-ffLuc+. La formación de imágenes de MicroPET se realizará inmediatamente después de la inyección y en intervalos de tiempo definidos después de eso. El día 1 y el día 2, se sacrificarán los animales y se determinará la biodistribución del meditopo y las células T meCAR para las células T meCAR en los sitios de la enfermedad primaria y metastásica. A continuación, se aplicarán métodos de formación de imágenes prediseñados. Las células T meCAR se administrarán en el mismo modelo de xenoinjerto ortotípico y metastásico. El meditopo 64CU-DOTA se administrará 1 h después de la administración de células T meCAR y se tomarán imágenes en puntos definidos después de eso (1,2, 3 y 6 horas). El mismo programa de formación de imágenes se llevará a cabo 1 día, 3 días y 10 días después de la administración de células T meCAR. Nuevamente, los animales serán sacrificados y la distribución biológica se determinará mediante radiografía.

Tablas

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Listado informal de secuencias

SEQ ID NO:1 LCYLLDGILFIYGVILTALFL

SEQ ID NO:2: FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV

SEQ ID NO:3: MALIVLGGVAGLLLFIGLGIFF

SEQ ID NO:4: IYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT

SEQ ID NO:5: IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLY

SEQ ID NO:6: IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC

SEQ ID NO:7: IISFFLALTSTALLFLLFF LTLRFSVV

SEQ ID NO:8: VAAILGLGLVLGLLGPLAILL

SEQ ID NO:9: FWLPIGCAAFVVVCILGCILI

SEQ ID NO:10: PLFIPVAVMVTAFSGLAFIIWLA

SEQ ID NO:11:

RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLY

SEQ ID NO:12: RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS

SEQ ID NO:13: RSKRSRGGHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS (ref)

SEQ ID NO:14: KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL

SEQ ID NO:15: ALYLLRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI

SEQ ID NO:16: CWLTKKKYSSSVHDPNGEYMFMRAVNTAKKSRLTDVTL

meHer2Fab-IgG4(HL-CH3)-IgG4-CD28tm-CD28gg-Zeta-T2A-meLc:

SEQ ID NO:17:

MLLL VT S LLLC ELPHP AFLLIPE V QL VE SGGGL V QP GGS LRL S C A A S GFNDCD T Y1HW VR Q SPGKGLEWVARIYPTNG YTRYADS VKGRF TIS ADTSKNT AYLQ1VINSLRAEDTAIYYC S RWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPE PVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVD KKVEPKSCESKYGPPCPPCPGGGSSGGGSGGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLV KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVM FTEALHNHYTQKSLSLSLGKMFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFITFWVRSKRSRGGHSD YMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSGGGRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNEL NLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERR RGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRLEGGGEGRGSLLTCGDVEENPGPRML LLVTSLLLCELPHPAFLLIPDIQMTQSPILLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQRT NGSPRLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDEADYYCQQHYTTPPTFGAG TKVEIKRTVAAPSWTFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQ ESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

Péptido señal GMCSFRa SEQ ID NO:18: LLLVTSLLLCELPHPAFLLIP

Her2Fab (Her2 región constante parcial y variable de cadena pesada) SEQ ID NO19:

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTY1HWVRQSPGKGLEWVARIYPTNGYTR YADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAIYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLV TVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAV LQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNFIKPSNTKVDKKVEPKSC

IgG4(SmP)-Bisagra SEQ ID NO:20: ESKYGPPCPPCP

Espaciador (que incluye IgG4-CH3) SEQ ID NO:21:

GGG S S GGGS GGQPREPQ V YTLPP S QEEMTKNQ V SLT CL VK GF YP S DI A VE WESN GQPEN NYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

CD28 transmembrana SEQ ID NO:22:

MFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV

CD28cito (LLmGG) SEQ ID NO:23:

RSKRSRGGHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS

Enlazador ((Gly)3) SEQ ID NO:24: GGG

Dominio de señalización intracelular de células T (CD3-Zeta) SEQ ID NO 25:

RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEG LYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

Enlazador peptidilo autoescindible (T2A) SEQ ID NO:26:

LEGGGEGRGSLLTCGDVEENPGPR

Región de anticuerpo (meLc (Her2 región constante y variable de cadena ligera con mutación de meditopo)) SEQ ID NO:27:

DIQMTQSPTLLSASVGDRVTITCRASQDVNT AVAWYQQRTNGSPRLLIYS ASFLYSGVPS RF SG SRSGTDFTLTIS SLQPEDEAD YYCQQHYTTPPTF GAGTK VEIKRTVA APS VTIFPPSD EQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTL SKAD YEKHK VYACEVTHQGLS SP VTK SFNRGEC

meHer2Fab-IgG4(HL-CH3)-IgG4-CD28tm-CD28gg-Zeta-T2A-CD19t-2A-meLc.

SEQ ID NO:28:

MLLLVTSLLLCELPFTPAFLLIPEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNTKDTY1HWVR QSPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAIYYCS RWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPE PVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVD KKVEPKSCESKYGPPCPPCPGGGSSGGGSGGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLV KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVM HEALHNHYTQKSLSLSLGKMFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRGGHSD YMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSGGGRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNEL NLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERR RGKGHD GLYQGLST ATKDT YD ALFIMQ ALPPRLE G GGEGRG SLLTC GD VEENP GPRMPP PRLLFFLLFLTPMEVRPEEPLVVKVEEGDNAVLQCLKGTSDGPTQQLTWSRESPLKPFLK LSLGLPGLGIF[MRPLAIWLFIFNVSQQMGGFYLCQPGPPSEKAWQPGWTVNVEGSGELF RWNVSDLGGLGCGLKNRSSEGPSSPSGKLMSPKLYVWAKDRPEIWEGEPPCVPPRDSLN Q SL SQDLTMAPG STL WLS CG VPPD S VSRGPLS WTHVHPKGPK SLLSLELKDDRP ARDM WVMET GLLLPRAT AQDAGKYY CHRGNLTMSFHLEIT ARPVLWHWLLRTGGWKVS A V TLAYLIFCLCSLVGILHLQRALVLRRKRGGSTSEGRGSLLTCGDVEENPGPMETDTLLLW VLLLWVPGSTGDTQMTQSPILLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQRTNGSPRLLI YSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDEADYYCQQHYTTPPTFGAGTKVEIKRT VAAPSWIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDS KD S T Y S LS S TLTLSK AD YEKHK V Y ACE VTHQ GL S SP VTK S FNRGEC

Péptido marcador (CD19t) SEQ ID NO:29:

MPPPRLLFFLLFLTPMEVRPEEPLVVKVEEGDNAVLQCLKGTSDGPTQQLTWSRESPLKP FLKLSLGLPGLG1HMRPLAIWLFIFNVSQQMGGFYLCQPGPPSEKAWQPGWTVNVEGSG ELFR WNVSDLGGLGC GLKNRS SEGP S SP SGKLM SPKL Y VW AKDRPEIWEGEPPC VPPRD SLNQSLSQDLTMAPGSTLWLSCGVPPDSVSRGPLSWTHVFfPKGPKSLLSLELKDDRPAR DTVIW VME T GLLLPR A T A QD A GK Y YCHRGNLTM SFHLEIT ARP VLWFFWLLRT GG WK V S AVTLAYLIF CLC SLVGILHLQRALVLRRKR

Enlazador peptidilo autoescindible (2A) SEQ ID NO:30:

GGSTSEGRGSLLTCGDVEENPGP

Cadena ligera de CAMPATH1 (1CE1) MEFAB (183) SEQ ID NO:31:

DIQMT Q SPTLLS A S VGDR VTTTCK A SQNTDK YLNWYQQRTNGSPRLLTYNTNNLQT GVP S

RFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIADYYCLQHISRPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDE QLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLS KADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

Cadena pesada de CAMPATH1 (1CE1) MEFAB (183) SEQ ID NO:32:

QVQLQESGGGLVRPSQTLSLTCTVSGFTFTDFYMNWVRQSPGRGLEWIGFIRDKAKGYT TEYNPSVKGRVTMLVDTSKNQFSLRLSSVTAADTAIYYCAREGHTAAPFDYWGQGSLV TVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAV LQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVE

Cadena ligera de CAMPATH1 (1CE1) MEFAB (E83) SEQ ID NO:33:

DIQMTQSPILLSASVGDRVTITCKASQNIDKYLNWYQQRTNGSPRLLIYNTNNLQTGVPS RFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDEADYYCLQHISRPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSD EQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTL SKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

Cadena pesada de CAMPATH1 (1CE1) MEFAB (E83) SEQ ID NO:34:

QVQLQESGGGLVRPSQTLSLTCTVSGFTFTDFYMNWVRQSPGRGLEWIGFIRDKAKGYT TEYNPSVKGRVTArLVDTSKNQFSLRLSSVT AADT AIYYC AREGHT AAPFDYWGQGSLV TVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAV LQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVE

Cadena ligera Fab del Factor de Tejido (1jps) MEFAB SEQ ID NO:35

DIQMTQSPILLSASVGDRVTITCRASRD1KSYLNWYQQRTNGSPRLLIYYATSLAEGVPSR FSGSGSGTDYTLTISSLQPEDIADYYCLQHGESPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSD EQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTL SKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

Cadena pesada Fab del Factor de Tejido (1jps) MEFAB SEQ ID NO:36 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKEYYMHWVRQSPGKGLEWVGLIDPEQGNT IYDPKFQDRATISADNSKNTAYLQMNSLRAEDTAIYYCARDTAAYFDYWGQGTLVTVS SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT

Cadena ligera Fab del Factor de Tejido (1jps) MEFAB (183) SEQ ID NO37 DIQMTQSPILLSASVGDRVTITCRASRDIKSYLNWYQQRTNGSPRLLIYYATSLAEGVPSR FSGSGSGTDYTLTISSLQPEDEADYYCLQHGESPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSD EQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTL SKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

Cadena pesada Fab del Factor de Tejido (1jps) MEFAB (183) SEQ ID NO:38

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKEYYMHWVRQSPGKGLEWVGLIDPEQGNT IYDPKFQDR ATIS ADNSKNT AYLQMNSLR AEDT AIYYC ARDT A A YFD YWGQGTL VTVS SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT

Cadena ligera de anti-PRP-prión MEFAB (183) (Gl: 19204296) SEQ ID NO:39 EIVLTQSPIIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYQQRTNGSPRRWIYDTSKLASGVPAR FSGSGSGTSYSLTISSMEAEDIADYFCHQWRSNPYTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSS EQLTSGGASVVCFLNNFYPKEINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTL TKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC

Cadena pesada de anti-PRP-prión MEFAB (183) (Gl: 19204296) SEQ ID NO 40 EVQLQQSGGELVKPGSSVKISCKASRNTFTDYNLDWVKQSHGKTLEWIGNVYPNNGVT GYNQKFRGKATLTVDKSSSTAYMELHSLTSEDSAIYYCALYYYDVSYWGQGTLVTVSS AKTTPPSVYPLAPGSAAQTSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSD LYTLSSSVTVPSSTWPSQSVTCNVAHPASSTKVDKKITPR

Cadena ligera de anti-PRP-prión MEFAB (IE83) (Gl: 19204296) SEQ ID NO:41

EIVLTQSPIIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYQQRTNGSPRRWIYDTSKLASGVPAR FSGSGSGTSYSLTISSMEAEDEADYFCHQWRSNPYTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSS EQLTSGGASVVCFLNNFYPKEINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTL TKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC

Cadena pesada de anti-PRP-prión MEFAB (E83) (Gl: 19204296) SEQ ID NO:42

E VQLQQ SGGEL VKPG S S VKISCK A SRNTFTD YNLDW VKQ SHGKTLEWIGN VYPNNGVT GYNQKFRGKATLTVDKSSSTAYMELHSLTSEDSAIYYCALYYYDVSYWGQGTLVTVSS AKTTPPSVYPLAPGSAAQTSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSD LYTLSSSVTVPSSTWPSQSVTCNVAHPASSTKVDKKITPR

Cadena ligera de daclizumab MEFAB (183) SEQ ID NO:43

DIQMTQSPILLSASVGDRVTITCSASSSISYMHWYQQRTNGSPRLLIYTTSNLASGVPARF SGSGSGTEFTLTISSLQPDDIADYYCHQRSTYPLTFGQGTKVEVKRTVAAPSVFIFPPSDE QLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLS KADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

Cadena pesada de daclizumab (183) SEQ ID NO:44 QVQLVQSGGEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTSYRMHWVRQSPGQGLEWIGYINPSTGYT EYNQKFKDKATITADESTNTAYMELSSLRSEDTAIYYCARGGGVFDYWGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLS S VVT VPS S SLGTQTYICN VNHKPSNTKVDKKVEP

Cadena ligera de daclizumab MEFAB (E83) SEQ ID NO:45

DIQMTQSPILLSASVGDRVTITCSASSSISYMHWYQQRTNGSPRLLIYTTSNLASGVPARF SGSGSGTEFTLTISSLQPDDEADYYCHQRSTYPLTFGQGTKVEVKRTVAAPSVFTFPPSDE QLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLS KADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

Cadena pesada de daclizumab (E83) SEQ ID NO:46

QVQLVQSGGEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTSYRMHWVRQSPGQGLEWIGYINPSTGYT EYNQKFKDKATITADESTNTAYMELSSLRSEDTAIYYCARGGGVFDYWGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLY SLSS VVT VPS S SLGTQTYICNVNHKPSNTK VDKKVEP

Cadena ligera de MORAb-009 anticuerpo monoclonal anti-mesotelina MEFAB (183) SEQ ID NO:47

DIELTQSPIIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYQQRTNGSPRRWIYDTSKLASGVPGR FSGSGSGNSYSLTISSVEAEDIADYYCQQWSKHPLTFGSGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSD EQLK SGTAS VVCLLNNF YPRE AK VQWK VDN ALQ SGNSQE SVTEQD SKDSTYSLS STLTL SKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

Cadena pesada de MORAb-009 anticuerpo monoclonal anti-mesotelina MEFAB (183) ^{S E Q ID N O 48} EVQLQQSGGELEKPGASVKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGKSLEWIGLITPYNGASS YNQKFRGKATLTVDKSSSTAYMDLLSLTSEDSAIYFCARGGYDGRGFDYWGSGTPVTV

SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ SSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPC

Cadena ligera de MORAb-009 anticuerpo monoclonal anti-mesotelina MEFAB (E83) SEQ ID NO:49

DIELTQSPIIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYQQRTNGSPRRWIYDTSKLASGVPGR FSGSGSGNSYSLTISSVEAEDEADYYCQQWSKHPLTFGSGTKVEIKRTYAAPSVFIFPPSD EQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTL SK AD Y EKHK V Y ACE VTHQ GL SSPVTKSFN RGEC

Cadena pesada de MORAb-009 anticuerpo monoclonal anti-mesotelina MEFAB (E83) SEQ ID NO 50 EVQLQQSGGELEKPGASVKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGKSLEWIGLITPYNGASS YNQKFRGKATLTVDKSSSTAYMDLLSLTSEDSAIYFCARGGYDGRGFDYWGSGTPVTV SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ SSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTFITCPPC

Cadena ligera de anticuerpo anti-CD20 Ofatumumab MEFAB (183) SEQ ID NO:51

EIVLTQSPILLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQRTNGSPRLLIYDASNRATGIPAR FSGSGSGTDFTLTISSLEPEDIADYYCQQRSNWPITFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDE QLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLS KADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

Cadena pesada de anticuerpo anti-CD20 Ofatumumab MEFAB (183) SEQ ID NO52 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFNDYAMHWVRQSPGKGLEWVSTISWNSGSI GYADSVKGRFTISRDNAKKSLYLQMNSLRAEDTAIYYCAKDIQYGNYYYGMDVWGQG TTVTVS S ASTKGP S VFPLAPGS SK ST SGT A ALGCLVKD YFPEP VT V S WNSG ALT SGVHTF PAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEP

Cadena ligera de anticuerpo anti-CD20 Ofatumumab MEFAB (E83) SEQ ID NO:53 EIVLTQSPILLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQRTNGSPRLLIYDASNRATGIPAR FSGSGSGTDFTLTISSLEPEDIADYYCQQRSNWPITFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDE QLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLS KADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

Cadena pesada de anticuerpo anti-CD20 Ofatumumab MEFAB (E83) ^{S E Q ID N O 54} EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFNDYAMHWVRQSPGKGLEWVSTISWNSGSI GYADSVKGRFTISRDNAKKSLYLQMNSLRAEDTAIYYCAKDIQYGNYYYGMDVWGQG TTVTVSSASTKGPSVFPLAPGSSKSTSGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTF PAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEP

Cadena ligera del anticuerpo de la región regulatoria negativa Notchl MEFAB (183) SEQ ID NO 55

DIQMTQSPILLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQRTNGSPRLLIYSASFLYSGVPS RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDIADYYCQQFYTTPSTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSD EQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTL SKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

Cadena pesada del anticuerpo de la región regulatoria negativa Notchl MEFAB (183) SEQ ID NO56

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYW1HWVRQSPGKGLEWVARINPPNRSNQ YADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAIYYCARGSGFRWVMDYWGQGTLVT VSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL QSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT

Cadena ligera del anticuerpo de la región regulatoria negativa Notchl MEFAB (E83) SEQ ID NO57

DIQMTQSPILLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQRTNGSPRLLIYSASFLYSGVPS RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDEADYYCQQFYTTPSTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSD EQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTL SKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

Cadena pesada del anticuerpo de la región regulatoria negativa Notchl MEFAB (E83) SEQ ID NO:58

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYW1HWVRQSPGKGLEWVARINPPNRSNQ Y AD S VKGRFTIS ADTSKNT A YLQMN SLRAEDT AI YY C ARGSGFRW VMD YW GQGTL VT VSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL QSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT

Cadena ligera Fab anti-HER3 RG7116 MEFAB (183) SEQ ID NO:59

DIVMTQSPILLAVSLGERATINCKSSQSVLNSGNQKNYLTWYQQRTNGSPRLLIYWAST RESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDIADYYCQSDYSYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPS VFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTY SLSSTLTLSKADYEK1IKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

Cadena pesada Fab anti-HER3 RG7116 MEFAB (183) ^{S E Q ID N O :60}

QVQLVQSGGGVKKPGASVKVSCKASGYTFRSSYISWVRQSPGQGLEWMGWIYAGTGS PSYNQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAIYYCARHRDYYSNSLTYWGQGTL VTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA VLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNFIKPSNTKVDKKVEPKSCDKTH

Cadena ligera de Fab anti-HER3 RG7116 MEFAB (E83) SEQ ID NO:61

DIVMTQSPILLAVSLGERATINCKSSQSVLNSGNQKNYLTWYQQRTNGSPRLLIYWAST RESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDEADYYCQSDYSYPYTFGQGTKLEIKRTVAAP SVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDST YSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

Cadena pesada de Fab anti-HER3 RG7116 MEFAB (E83) SEQ ID NO:62

QVQLVQSGGGVKKPGASVKVSCKASGYTFRSSYISWVRQSPGQGLEWMGWIYAGTGS PSYNQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAIYYCARHRDYYSNSLTYWGQGTL VTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA VLQSSGLY SLS S VVTVPS S SLGT QT YICN VNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTH

Cadena ligera de Rituximab MEFAB (183) SEQ ID NO:63

QIVLSQSPIILSASPGEKVTMTCRASSSVSY1HWFQQRTNGSPRPWIYATSNLASGVPVRF SGSGSGTSYSLTISRVEAEDIADYYCQQWTSNPPTFGGGTKLETKRTVAAPSVFIFPPSDE QLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLS KAD YEKHKVY ACEVTHQGLS SP VTKSFNRGEC

Cadena pesada de Rituximab MEFAB (183) SEQ ID NO:64

QVQLQQPGGGLVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGD TSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAIYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGT TVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP AVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC

Cadena ligera de Rituximab MEFAB (E83) SEQ ID NO:65

QIVLSQSPIILSASPGEKVTMTCRASSSVSY1HWFQQRTNGSPRPWIYATSNLASGVPVRF SGSGSGTSYSLTISRVEAEDEADYYCQQWTSNPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDE QLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLS KAD YEKHKVY ACEVTHQGLS SP VTKSFNRGEC

Cadena pesada de Rituximab MEFAB (E83) SEQ ID NO:66

Cadena ligera de anticuerpo anti-osteopontina 23C3 MEFAB (I83) SEQ ID NO 67

YIQMTQSPILLSVSVGETVTITCRASENIYSFLAWYQQRTNGSPRLLVYAATNLADGVPS RFSGSGSGTQFSLKINSLQSEDIADYYCQHFWGTPFTFGSGTKLEIKRSDAAPTVSIFPPSA AQLSSGGGSVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGAERGNGVLNSWTSQDSADSTYSMSSTLT SGGDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRGEC

Cadena pesada de anticuerpo anti-osteopontina 23C3 MEFAB (I83) SEQ ID NO 68

EVQLVESGGGLVQPKGSLKISCAASGFTFNIYAMNWVRQSPGKGLEWVARIRSQSNNY TTYYADSVKDRFTISRDDSQSMLYLQMNNLKTEDTAIYYCVRQMGDYWGQGTTLTVS SAVKTPPSVYPLAPGGGAISNSMVTLGCLVNGYFPEPVTVTWNAGSLGSGVHTFPAVLQ SDLYTLSSSVTVPVSTWPSEAVTCNVAHPASATSVDKAISPV

Cadena ligera de anticuerpo anti-osteopontina 23C3 MEFAB (E83) SEQ ID NO 69

Cadena pesada de anticuerpo anti-osteopontina 23C3 MEFAB (E83) SEQ ID NO70 EVQLVESGGGLVQPKGSLKISCAASGFTFNIYAMNWVRQSPGKGLEWVARIRSQSNNY TTYYADSVKDRFTISRDDSQSMLYLQMNNLKTEDTAIYYCVRQMGDYWGQGTTLTVS SAVKTPPSVYPLAPGGGAISNSMVTLGCLVNGYFPEPVTVTWNAGSLGSGVHTFPAVLQ SDLYTLSSSVTVPVSTWPSEAVTCNVAHPASATSVDKAISPV

Cadena ligera de Fab anti-uPAR ATN-658 MEFAB (I83) SEQ ID NO:71

DVVMTQTPLLLSVTIGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWLLQRTNGSPRRLIYLVSKLD SGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDIADYYCWQGTHFPLTFGAGTKLELKRADAAPT VSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYS MSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC

Cadena pesada de Fab anti-uPAR ATN-658 MEFAB (I83) SEQ ID NO:72

EVQLQQSGGGLVKTGASVKISCKASGYSFTSYYMHWVKQSHGKSLEWIGEINPYNGGA SYNQKTKGRATFTVDTSSRTAYMQFNSLTSEDSAIYYCARSIYGHSVLDYWGQGTSVSV SSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVL QSDLYTLSS S VT VP S ST WP SQT VTCN V AEIP AS STK VDKKIVPRDC GCKPCIC

Cadena ligera de Fab anti-uPAR ATN-658 MEFAB (E83) SEQ ID NO:73

DVVMTQTPLLLSVTIGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWLLQRTNGSPRRLIYLVSKLD SGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDEADYYCWQGTHFPLTFGAGTKLELKRADAAPT VSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYS MSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC

Cadena pesada de Fab anti-uPAR ATN-658 MEFAB (E83) SEQ ID NO:74

EVQLQQSGGGLVKTGASVKISCKASGYSFTSYYMHWVKQSHGKSLEWIGEINPYNGGA SYNQKIKGRATFTVDTSSRTAYMQFNSLTSEDSAIYYCARSIYGHSVLDYWGQGTSVSV SSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVL QSDLYTLSSSVTVPSSTWPSQTVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCIC

Cadena ligera de influenza A terapéutico MEFAB (I83) SEQ ID NO:75

IVLTQSPILLSVSPGERATLSCRASQVISHNLAWYQQRTNGSPRLLIYGASTRASGIPARFS GSGSGTDYTLTITSLQPEDIADYYCQHYSNWPPRLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSD EQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTL SKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

Cadena pesada de influenza A terapéutico MEFAB (I83) SEQ ID NO76

Cadena ligera de influenza A terapéutico MEFAB (E83) SEQ ID NO:77

IVLTQSPILLSVSPGERATLSCRASQVISHNLAWYQQRTNGSPRLLIYGASTRASGIPARFS GSGSGTDYTLTITSLQPEDEADYYCQHYSNWPPRLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPS DEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTL TLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

Cadena pesada de influenza A terapéutico MEFAB (E83) SEQ ID NO:78

Proteína DIN de la envoltura del Virus Occidental en complejo con la cadena ligera del anticuerpo neutralizante E16MEFAB (I83) SEQ ID NO:79 DIVMTQSHILMSTSVGDRVSITCKASQDVSTAVAWYQQRTNGSPRLLISWASTRHTGVP DRFTGSGSGTDYTLTISSVQAEDIADYYCQQHYTTPLTFGAGTKLELKRADAAPTVSIFP PSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSST LTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRGEC

Proteína DIN de la envoltura del Virus Occidental en complejo con la cadena pesada del anticuerpo neutralizante E16MEFAB (I83) SEQ ID NO:80

QVQLQQSGGGLMKPGASVQISCKATGYTFSDYWIEWVKQSPGHGLEWIGDILCGTGRT RYNEKLKAMATFTADTSSNTAFMQLSSLTSEDSAIYYCARSASYGDYADYWGHGTTLT VSSAKTTPPSVYPLAPGC-GDTTGSSVTLGCLVKGYFPESVTVTWNSGSLSSSVHTFPALL QSGLYTMSSSVTVPSSTWPSQTVTCSVAFIPASSTTVDKKLEPS

Proteína DIII de la envoltura del Virus Occidental en complejo con la cadena ligera del anticuerpo neutralizante E16MEFAB (E83) SEQ ID NO:81 DIVMTQSHILMSTSVGDRVSITCKASQDVSTAVAWYQQRTNGSPRLLISWASTRHTGVP DRFTGSGSGTDYTLTISSVQAEDEADYYCQQHYTTPLTFGAGTKLELKRADAAPTVSIFP PSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSST LTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRGEC

Proteína DIII de la envoltura del Virus Occidental en complejo con la cadena pesada del anticuerpo neutralizante E16MEFAB (E83) SEQ ID NO:82

QVQLQQSGGGLMKPGASVQISCKATGYTFSDYWIEWVKQSPGHGLEWIGDILCGTGRT RYNEKLKAMATFTADTSSNTAFMQLSSLTSEDSAIYYCARSASYGDYADYWGHGTTLT VSSAKTTPPSVYPLAPGCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPESVTVTWNSGSLSSSVHTFPALL QSGLYTMSSSVTVPSSTWPSQTVTCSVAHPASSTTVDKKLEPS

PVKQLLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO:83)

QCTNYALLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO:84)

ATNFSLLKQAGDVEENPGP (SEQ ID NO:85)

EGRGSLLTCGDVESNPGP (SEQ ID NO:86)

Cadena pesada habilitada para meditopo de anti-CD19 humanizado SEQ ID NO111 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGVSLPDYGVSWVRQSPGKGLEWVAVIWGSETTY YADSVKGRFTISADTSKNTYLQMNSLRAEDTAIYYCSRHYYYGGSYAMDYWGQGTLV TVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAV LQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEP

Cadena ligera habilitada para meditopo de anti-CD19 humanizado SEQ ID NO:112

DIQMTQSPILLSASVGDRVTITCRASQDISKYLNWYQQ RTNGSPR LLIYHTSRLHSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDIADYYCQQGNTLPYTFGAGTKVEI KRTVAAPSVFTFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTE QDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

Cadena pesada I83E habilitada para meditopo de anti-CD19 humanizado SEQ ID NO:113

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGVSLPDYGVSWVRQSPGKGLEWVAVIWGSETTY YADSVKGRFTISADTSKNTYLQMNSLRAEDTAIYYCSRHYYYGGSYAMDYWGQGTLV TVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAV LQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEP

Cadena ligera I83E habilitada para meditopo de anti-CD19 humanizado SEQ ID NO114

DIQMTQSPILLSASVGDRVTITCRASQDISKYLNWYQQRTNGSPRLLIYHTSRLHSGVPSR FSGSRSGTDFTLTISSLQPEDEADYYCQQGNTLPYTFGAGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSD EQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTL SKADYEKF1KVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

Cadena pesada de memAb Anti-TAG72 (CC49) CC49 I83E mejorado de Chothia SEQ ID NO115

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTDHA1HWVRQSPGKGLEWVAYFSPGNDDF KYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAIYYCSRSLNMAYWGQGTLVTVSSA STKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVN1IKPSNTKVDKKVEP

Cadena ligera de memAb Anti-TAG72 (CC49) CC49 I83E mejorado de Chothia SEQ ID NO116

DIQMTQSPILLSASVGDRVTITCKSSQSLLYSGNQKNYLAWYQQRTNGSPRLLIYWASA RESGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDEADYYCQQYYSYPLTFGAGTKVEIKRTVAAPS VFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTY SLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

Cadena pesada de memAb CA19.9 humanizado I83E mejorado de Chothia SEQ ID NO:117

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un ácido nucleico aislado que codifica una proteína que comprende:

(ii) un dominio transmembrana.

2. El ácido nucleico aislado de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha región de anticuerpo es un fragmento de anticuerpo humanizado que comprende un dominio Fc.

3. El ácido nucleico aislado de una de las reivindicaciones 1 o 2, que comprende además una secuencia de señalización intracelular de células T que codifica un dominio de señalización intracelular de células T CD3 Z.

4. El ácido nucleico aislado de una de las reivindicaciones 1-3 que comprende además una secuencia de señalización intracelular coestimuladora que codifica un dominio de señalización intracelular coestimulador, en donde opcionalmente dicho dominio de señalización intracelular coestimulador es un dominio de señalización intracelular coestimulador de CD28, un dominio de señalización intracelular coestimulador de 4-1BB, un dominio de señalización intracelular coestimulador de ICOS, o un dominio de señalización intracelular coestimulador de OX-40.

5. El ácido nucleico aislado de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-4, que comprende además una secuencia espaciadora que codifica una región espaciadora, en donde dicha región espaciadora está entre dicho dominio transmembrana y dicha región de anticuerpo.

6. El ácido nucleico aislado de una de las reivindicaciones 1-5 que comprende además una secuencia enlazadora que codifica un dominio enlazador, en donde opcionalmente dicho dominio enlazador está entre dicho dominio transmembrana y dicho dominio de señalización intracelular de células T; en donde dicho dominio enlazador está entre dicho dominio de señalización intracelular de células T y dicho dominio de señalización intracelular coestimulador; o en donde dicho dominio enlazador comprende la secuencia GGCGG o GGG.

7. El ácido nucleico aislado de una de las reivindicaciones 1-6 que comprende:

(i) una secuencia de cadena pesada que codifica un dominio de cadena pesada de dicha proteína, dicho dominio de cadena pesada comprende un dominio de cadena pesada variable y dicho dominio transmembrana; y (ii) una secuencia de cadena ligera que codifica un dominio de cadena ligera de dicha proteína, dicho dominio de cadena ligera comprende un dominio de cadena ligera variable, en donde dicho dominio de cadena pesada variable y dicho dominio de cadena ligera variable forman juntos al menos una porción de dicha región de anticuerpo, opcionalmente

8. El ácido nucleico aislado de acuerdo con la reivindicación 7, que comprende una secuencia de peptidilo autoescindible entre dicha secuencia de cadena pesada y dicha secuencia de cadena ligera, en donde opcionalmente dicha secuencia de enlazador peptidilo autoescindible es una secuencia T2A o una secuencia 2A.

9. El ácido nucleico aislado de una de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende además una secuencia de gen suicida.

10. Un vector de expresión que comprende el ácido nucleico de una de las reivindicaciones 1 a 9.

11. Un linfocito T que comprende el vector de expresión de la reivindicación 10.

12. Una proteína recombinante que comprende:

(ii) un dominio transmembrana.

13. La proteína recombinante de la reivindicación 12, en donde dicha región de anticuerpo comprende un dominio Fc y/o

en donde dicha región de anticuerpo es una región de anticuerpo humanizado, y/o

en donde dicha región de anticuerpo no comprende una región de anticuerpo scFv, y/o

en donde dicha proteína comprende además un dominio de señalización intracelular de células T, en donde opcionalmente dicho dominio de señalización intracelular de células T es un dominio de señalización intracelular de células T CD3 Z.

14. La proteína recombinante de una de las reivindicaciones 12 a 13, que comprende además un dominio de señalización

intracelular coestimulador, en donde opcionalmente dicho dominio de señalización intracelular coestimulador es un dominio de señalización intracelular coestimulador de CD28, un dominio de señalización intracelular coestimulador de 4-1BB, un dominio de señalización intracelular coestimulador de ICOS, o un dominio de señalización intracelular coestimulador de OX-40, y/o

que comprende además una región espaciadora, en donde opcionalmente dicha región espaciadora está entre dicho dominio transmembrana y dicha región de anticuerpo, y/o

15. El ácido nucleico aislado de una de las reivindicaciones 1 a 8 o la proteína recombinante de una de las reivindicaciones 12 a 14, en donde dicha región de anticuerpo es un dominio habilitado para meditopo de cetuximab, dominio habilitado para meditopo de trasuzumab, dominio habilitado para meditopo de pertuzumab, dominio habilitado para meditopo de M5A o dominio habilitado para meditopo de rituximab.