ES2849173T3 - Métodos combinados de inmunoensayo e inmunoensayo magnético para un intervalo extendido de sensibilidad - Google Patents

Abstract

Un metodo para realizar un inmunoensayo para determinar la concentracion de un analito en una muestra biologica que comprende: disolver un primer reactivo seco y un segundo reactivo seco en la muestra biologica, en donde el primer reactivo seco comprende anticuerpos de senal, el segundo reactivo seco comprende anticuerpos de captura inmovilizados en perlas magneticas, y los anticuerpos de senal y los anticuerpos de captura se configuran para unirse al analito; formar un primer complejo de los anticuerpos de senal y el analito; formar un segundo complejo del primer complejo y los anticuerpos de captura inmovilizados en las perlas magneticas; poner en contacto un primer inmunosensor con la muestra biologica que comprende el primer complejo y el segundo complejo para formar un tercer complejo localizado en o cerca de una superficie del primer inmunosensor, en donde el primer inmunosensor incluye una capa inmovilizada de anticuerpos de captura configurada para unirse al analito, y el tercer complejo incluye el primer complejo unido a la capa inmovilizada de anticuerpos de captura; poner en contacto un campo magnetico localizado alrededor de un segundo inmunosensor con la muestra biologica que comprende el primer complejo y el segundo complejo de manera que el segundo complejo se localice en o cerca de una superficie del segundo inmunosensor; aplicar un fluido para lavar la muestra biologica del primer inmunosensor y el segundo inmunosensor, en donde el fluido de lavado comprende un sustrato configurado para reaccionar con los anticuerpos de senal; medir una primera senal en el primer inmunosensor de una reaccion del sustrato con los anticuerpos de senal en el tercer complejo que estan localizados en o cerca de la superficie del primer inmunosensor; medir una segunda senal en el segundo inmunosensor a partir de una reaccion del sustrato con los anticuerpos de senal en el segundo complejo que estan localizados en o cerca de la superficie del segundo inmunosensor; y determinar la concentracion del analito en la muestra biologica a partir de al menos una de la primera senal y la segunda senal.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos combinados de inmunoensayo e inmunoensayo magnético para un intervalo extendido de sensibilidad

Campo de la invención

La presente invención se refiere a sistemas y métodos para determinar analitos en pruebas en el punto de atención. En particular, la presente invención se refiere a sistemas y métodos que usan una combinación de técnicas de inmunoensayo e inmunoensayo magnético para detectar un analito dentro de un intervalo extendido de concentraciones especificadas.

Antecedentes de la invención

Los sistemas de análisis de muestras en el punto de atención (POC) se basan generalmente en uno o más instrumentos de prueba reusables (por ejemplo, un aparato de lectura) que realizan pruebas de muestras mediante el uso de un dispositivo de prueba desechable de un solo uso, por ejemplo, un cartucho o tira que contiene elementos analíticos, por ejemplo, electrodos u ópticas para detectar analitos tales como pH, oxígeno y glucosa. El dispositivo de prueba desechable puede incluir elementos fluídicos (por ejemplo, conductos para recibir y suministrar la muestra a los electrodos sensores u ópticas), elementos calibrantes (por ejemplo, fluidos acuosos para estandarizar los electrodos con una concentración conocida de analito) y colorantes con coeficientes de extinción conocidos para estandarizar los ópticos. El instrumento o aparato de lectura contiene circuitos eléctricos y otros componentes para operar los electrodos o la óptica, realizar mediciones y realizar cálculos. El instrumento o aparato de lectura también tiene la capacidad de mostrar resultados y comunicar esos resultados a los sistemas de información del laboratorio y del hospital (LIS y HIS, respectivamente), por ejemplo, a través de una estación de trabajo informática u otro sistema de gestión de datos. La comunicación entre el instrumento o aparato de lectura y una estación de trabajo, y entre la estación de trabajo y un LIS o HIS, puede ser a través de, por ejemplo, un enlace de infrarrojos, una conexión por cable, comunicación inalámbrica o cualquier otra forma de comunicación de datos que sea capaz de transmitir y recibir información eléctrica, o cualquiera de sus combinaciones. Un sistema notable de punto de atención (The i-STAT® System, Abbott Point of Care Inc., Princeton, NJ) se describe en la patente de Estados Unidos núm. 5,096,669, que comprende un dispositivo desechable, que funciona junto con un analizador de mano, para realizar una variedad de mediciones en sangre u otros fluidos.

Un beneficio de los sistemas de análisis de muestras en el punto de atención es la eliminación de la necesidad de enviar una muestra a un laboratorio central para su análisis, que requiere mucho tiempo. Los sistemas de análisis de muestras en el lugar de atención permiten que una enfermera o un médico (usuario u operador), al lado de la cama de un paciente, obtenga un resultado analítico cuantitativo confiable, a veces comparable en calidad al que se obtendría en un laboratorio. En operación, la enfermera selecciona un dispositivo de prueba con el panel de pruebas requerido, extrae una muestra biológica del paciente, la dispensa en el dispositivo de prueba, opcionalmente sella el dispositivo de prueba e inserta el dispositivo de prueba en el instrumento o aparato de lectura. Si bien el orden particular en el que ocurren las etapas puede variar entre proveedores y sistemas de punto de atención diferentes, permanece la intención de proporcionar resultados rápidos de pruebas de muestras cerca de la ubicación del paciente. A continuación, el instrumento o aparato de lectura realiza un ciclo de prueba, es decir, todas las demás etapas analíticas necesarias para realizar las pruebas. Esta simplicidad le da al médico una visión más rápida del estado fisiológico de un paciente y, al reducir el tiempo de respuesta para el diagnóstico o la monitorización, permite al médico tomar una decisión más rápida sobre el tratamiento adecuado, aumentando así la posibilidad de un resultado exitoso del paciente.

Las pruebas de marcadores cardíacos, como las pruebas de troponina, son una de esas pruebas de diagnóstico que se benefician del tiempo de respuesta más rápido proporcionado a través de los sistemas de análisis de muestras en el POC. Las guías de cardiología nacionales e internacionales recomiendan un tiempo de respuesta de una hora para informar los resultados de marcadores cardíacos como la troponina al personal del departamento de emergencias, medidos desde el momento de la extracción de sangre hasta la notificación. El uso de sistemas de análisis de muestras en el POC reduce los tiempos de respuesta para informar los resultados de los marcadores cardíacos de aquellos ensayos del laboratorio central, pero los sistemas de análisis de muestras en POC corrientes no son tan precisos ni sensibles como los ensayos del laboratorio central. De hecho, la brecha en precisión y sensibilidad entre los ensayos del laboratorio central y los sistemas de análisis de muestras en el POC está creciendo a medida que los fabricantes de ensayos del laboratorio central tienen o lanzarán ensayos de troponina que tienen un 99no límite de percentil de aproximadamente 10 ng/L y un límite de detección de <1 ng/L, que actualmente no es posible para los ensayos corrientes de pruebas en POC. Estos ensayos de alta sensibilidad son capaces de detectar troponina en la mayoría de sujetos sanos y, clínicamente, esto permite la detección de más casos de lesión miocárdica.

Para competir analíticamente con estos ensayos del laboratorio central, los ensayos de pruebas en el POC de próxima generación deberán realizar avances tecnológicos. Por tanto, sigue existiendo la necesidad de sistemas y métodos para extender el intervalo de sensibilidad para los dispositivos de pruebas en muestras, por ejemplo, cartuchos de pruebas en sangre de un solo uso, usados con uno o más instrumentos de pruebas en el POC de un hospital u otro lugar para suministrar la atención médica.

El documento de Estados Unidos 2012/034633 describe aparatos y métodos para la determinación rápida de analitos en muestras líquidas mediante inmunoensayos que incorporan la captura magnética de perlas en un sensor que puede usarse en el campo de diagnóstico del punto de atención.

El documento de Estados Unidos 2014/186216 describe sistemas y métodos para la determinación rápida in situ de la existencia de un efecto gancho y la expansión del intervalo dinámico de un inmunoensayo en el punto de atención.

Resumen de la invención

En una modalidad, se proporciona un método para realizar un inmunoensayo para determinar una concentración de un analito en una muestra biológica. El método incluye disolver un primer reactivo seco y un segundo reactivo seco en la muestra biológica. El primer reactivo seco comprende anticuerpos de señal, el segundo reactivo seco comprende anticuerpos de captura inmovilizados en perlas magnéticas, y los anticuerpos de señal y los anticuerpos de captura están configurados para unirse al analito. El método incluye además disolver un primer reactivo seco y un segundo reactivo seco en la muestra biológica, en donde el primer reactivo seco comprende anticuerpos de señal, el segundo reactivo seco comprende anticuerpos de captura inmovilizados en perlas magnéticas, y los anticuerpos de señal y los anticuerpos de captura están configurados para unirse al analito, formando un primer complejo de los anticuerpos de señal y el analito, formando un segundo complejo del primer complejo y los anticuerpos de captura inmovilizados en las perlas magnéticas, y poniendo en contacto un primer inmunosensor con la muestra biológica que comprende el primer complejo y el segundo complejo para formar un tercer complejo localizado en o cerca de una superficie del primer inmunosensor. El primer inmunosensor incluye una capa inmovilizada de anticuerpos de captura configurada para unirse al analito, y el tercer complejo incluye el primer complejo unido a la capa inmovilizada de anticuerpos de captura.

El método incluye además poner en contacto un campo magnético localizado alrededor de un segundo inmunosensor con la muestra biológica que comprende el primer complejo y el segundo complejo de manera que el segundo complejo se localice en o cerca de una superficie del segundo inmunosensor, y aplicar un fluido para lavar la muestra biológica del primer inmunosensor y del segundo inmunosensor. El fluido de lavado comprende un sustrato configurado para reaccionar con los anticuerpos de señal. El método incluye además medir una primera señal en el primer inmunosensor de una reacción del sustrato con los anticuerpos de señal en el tercer complejo que están localizados en o cerca de la superficie del primer inmunosensor, midiendo una segunda señal en el segundo inmunosensor de una reacción del sustrato con los anticuerpos de señal en el segundo complejo que se localizan en o cerca de la superficie del segundo inmunosensor, y determinar la concentración del analito en la muestra biológica a partir de al menos una de la primera señal y la segunda señal.

Opcionalmente, el primer inmunosensor y el segundo inmunosensor son inmunosensores electroquímicos y la primera señal y la segunda señal son señales electroquímicas.

En algunas modalidades, los anticuerpos de señal se conjugan con una enzima tal como la fosfatasa alcalina, y el sustrato es una molécula fosforilada configurada de manera que cuando se elimina un resto fosfato, la molécula se vuelve electroactiva.

Opcionalmente, el método incluye introducir una muestra con un analito diana en una cámara de muestra de un dispositivo sensor y mover la muestra desde la cámara de muestra a un conducto que comprende un chip sensor. El chip sensor incluye el primer inmunosensor y el segundo inmunosensor.

Opcionalmente, el primer inmunosensor y el segundo inmunosensor son inmunosensores electroquímicos y la primera señal y la segunda señal son señales electroquímicas.

En algunas modalidades, los anticuerpos de señal se conjugan con una enzima tal como la fosfatasa alcalina, y el sustrato es una molécula fosforilada configurada de manera que cuando se elimina un resto fosfato, la molécula se vuelve electroactiva.

En otra modalidad, se proporciona un medio de almacenamiento legible por máquina no transitorio para tener instrucciones almacenadas sobre el mismo, que cuando son ejecutadas por uno o más procesadores hacen que uno o más procesadores realicen un método que incluye mover una muestra con un analito diana desde una cámara de muestra a un conducto que comprende un chip sensor, un primer reactivo seco y un segundo reactivo seco. El movimiento da como resultado que el primer reactivo seco y el segundo reactivo seco se disuelvan en la muestra y formen un primer complejo y un segundo complejo, el primer complejo incluye anticuerpos de señal y el analito diana, y el segundo complejo incluye el primer complejo y anticuerpos de captura inmovilizados en perlas magnéticas. El chip sensor incluye un primer inmunosensor que tiene una capa inmovilizada de anticuerpos de captura configurada para unirse al analito diana, y un segundo inmunosensor que tiene un campo magnético localizado alrededor del segundo inmunosensor. El método incluye además poner la muestra en contacto con el primer inmunosensor de manera que el primer complejo y el segundo complejo formen un tercer complejo localizado en o cerca de una superficie del primer inmunosensor. El tercer complejo incluye el primer complejo unido a la capa inmovilizada de anticuerpos de captura.

El método incluye además poner la muestra en contacto con el campo magnético localizado alrededor del segundo inmunosensor con la muestra biológica que comprende el primer complejo y el segundo complejo, de manera que el segundo complejo se localice en o cerca de la superficie del segundo inmunosensor, moviendo un sustrato en contacto con el primer inmunosensor y el segundo inmunosensor, midiendo una primera señal en el primer inmunosensor a partir de una reacción del sustrato con los anticuerpos de señal en el tercer complejo que se localizan en o cerca de la superficie del primer inmunosensor, midiendo una segunda señal en el segundo inmunosensor de una reacción del sustrato con los anticuerpos de señal en el segundo complejo que están localizados en o cerca de la superficie del segundo inmunosensor, y determinar una concentración del analito diana en la muestra biológica de al menos una de la primera señal y la segunda señal.

En algunas modalidades, mover la muestra con el analito diana desde la cámara de la muestra al conducto comprende hacer oscilar la muestra sobre el primer reactivo seco y el segundo reactivo seco, que están dispuestos en una superficie del chip sensor.

En modalidades alternativas, mover el sustrato en contacto con el primer inmunosensor y el segundo inmunosensor comprende accionar una bomba que perfora un empaque con el sustrato y expulsa el sustrato a otro conducto en comunicación fluídica con el conducto que comprende el chip sensor.

Breve descripción de los dibujos:

La presente invención se comprenderá mejor a la vista de las siguientes figuras no limitantes, en las que:

La Figura 1 ilustra la evolución de los inmunoensayos de troponina de acuerdo con algunos aspectos de la invención; La Figura 2 ilustra el principio de un inmunoensayo combinado de acuerdo con algunos aspectos de la invención; La Figura 3 muestra un sistema de instrumentos en el punto de atención de acuerdo con algunos aspectos de la invención;

Las Figuras 4 y 5A a 5J muestran dispositivos sensores o cartuchos de acuerdo con algunos aspectos de la invención; La Figura 6A muestra una vista lateral de la fabricación de un chip sensor de acuerdo con algunos aspectos de la invención;

Las Figuras 6B, 7, 8A y 8B muestran configuraciones del chip sensor de acuerdo con algunos aspectos de la invención; Las Figuras 9A a 9C ilustran varias configuraciones ilustrativas para el posicionamiento de un imán más abajo de un chip sensor dentro de un cartucho de acuerdo con algunos aspectos de la invención;

La Figura 10 ilustra una configuración ilustrativa para el posicionamiento de sensores en un chip sensor dentro de un cartucho de acuerdo con algunos aspectos de la invención;

Las Figuras 11A y 11B muestran inmunosensores ilustrativos parcialmente cubiertos con una capa magnética impresa que deja una porción del perímetro del inmunosensor expuesta de acuerdo con algunos aspectos de la invención; La Figura 12 ilustra un proceso de zanja grabada de acuerdo con algunos aspectos de la invención;

La Figura 13 ilustra una configuración ilustrativa para el posicionamiento de sensores en un chip sensor dentro de un cartucho de acuerdo con algunos aspectos de la invención;

Las Figuras 14-17 muestran procesos de acuerdo con algunos aspectos de la invención; y

La Figura 18 muestra un gráfico que ilustra el impacto de poder determinar una concentración de un analito en una muestra en un intervalo de concentración extendido de acuerdo con algunos aspectos de la invención.

Descripción detallada de la invención

Introducción

La troponina cardíaca (cTn) es el biomarcador principal usado en el diagnóstico del infarto agudo del miocardio (IAM) y la estratificación del riesgo de eventos cardíacos adversos futuros. Sin embargo, la brecha de sensibilidad analítica entre los ensayos del laboratorio central y los sistemas de análisis de muestras en el POC para las pruebas de troponina cardíaca ha aumentado y puede obstaculizar la adopción de las pruebas en el POC en algunos hospitales. También puede haber una necesidad de sistemas de análisis de muestras en el POC que puedan detectar otros biomarcadores o múltiples biomarcadores. Por ejemplo, mientras que la troponina cardíaca es el analito principal para el diagnóstico de IAM, el péptido natriurético de tipo B (BNP) y el NT-proBNP han demostrado ser útiles para la estratificación del riesgo a corto plazo. La detección de troponina cardíaca de alta sensibilidad (hs-cTn) también podría ser útil como marcador de estratificación de riesgo en la atención primaria, es decir, para pacientes asintomáticos. Esto se basa en observaciones de que el aumento de la troponina cardíaca se asocia con un alto riesgo de resultados cardíacos adversos en ausencia de síndromes coronarios agudos. Si la detección de estos biomarcadores se adopta como parte de la atención médica de rutina para pacientes de alto riesgo, las pruebas en el POC para hs-cTn pueden ser útiles y convenientes cuando se prueban en consultorios médicos y clínicas.

Las troponinas generalmente son indetectables en pacientes sanos. El valor anormal absoluto de las troponinas varía en dependencia del entorno clínico en el que se evalúa al paciente y el ensayo usado. En un paciente que presenta dolor torácico y posible infarto de miocardio (IM), un valor anormal está típicamente por encima del percentil 99 no de la población sana como punto de corte mediante el uso de un ensayo con precisión aceptable. Los percentiles 99no para la detección de cTnT y cTnI se conocen bien como 0,012 a 0,016 ng/mL y 0,008 a 0,058 ng/mL, respectivamente. El intervalo más amplio de las concentraciones del percentil 99no para el ensayo de cTnl se derivan de los muchos ensayos de detección diferentes mediante el uso de anticuerpos y enfoques del ensayo diferentes. Los ensayos de cTn en el POC a menudo tienen valores del percentil 99no debido en parte al aumento del ruido analítico y la menor sensibilidad en comparación con los ensayos de cTn de laboratorio corrientes. Por ejemplo, el punto de corte del percentil 99no para la detección de cTnT en ensayos del laboratorio central es bien conocido a 0,01 ng/mL. Por el contrario, el punto de corte del percentil 99no para la detección de cTnT en los sistemas de análisis de muestras de troponina en el POC es típicamente alrededor de 0,05 a 0,08 ng/mL.

Los sistemas de análisis de muestras de troponina en el POC se basan típicamente en la reacción del analito con anticuerpos. Dentro de los límites finitos de la zona de detección, la sensibilidad analítica es una función directa de la capacidad del ensayo para capturar la mayor cantidad posible de analito con una precisión óptima. La precisión óptima, como se describió por el coeficiente de variación (CV) en el percentil 99no del límite de referencia superior para cada ensayo (como se muestra en la Figura 1), se define generalmente como menor o igual al diez por ciento. Una mejor precisión (CV menor o igual al diez por ciento) permite ensayos más sensibles y facilita la detección de valores cambiantes y reduce los límites de decisión del percentil 99no del ensayo. No obstante, el desarrollo de sistemas de análisis de muestras en el POC que satisfagan estas necesidades y reduzcan los límites de decisión del percentil 99no del ensayo han sido un desafío.

La mejora del rendimiento del ensayo requiere aumentar la resolución entre (i) el límite del blanco (LoB) y el límite de detección (LoD) y (ii) el LoD y el percentil 99no. El LoB es la concentración aparente de analito más alta que se espera encontrar cuando se prueban réplicas de una muestra en blanco que no contiene analito. El LoD es la concentración de analito más baja que probablemente se distinga de manera confiable del LoB y en la cual la detección es factible. El LoD se determina usando tanto el LoB medido como las réplicas de prueba de una muestra que se sabe que contiene una baja concentración de analito. El límite de cuantificación (LoQ) es la concentración más baja a la que el analito no solo puede detectarse de forma fiable, sino también a la que se cumplen algunos objetivos predefinidos de sesgo e imprecisión. El LoQ puede ser equivalente al LoD o podría estar en una concentración mucho mayor. Sensibilidad, sensibilidad analítica, límite inferior de detección, LoB, LoD y LoQ son términos usados para describir la concentración más pequeña de un analito que puede medirse de forma fiable mediante el ensayo.

Una de las formas de mejorar la sensibilidad o aumentar la resolución entre (i) el LoB y el LoD y (ii) el LoD y el percentil 99no en un inmunoensayo es mejorar la relación señal/ruido. Por ejemplo, la mejora de la sensibilidad en un inmunoensayo puede lograrse aumentando la capacidad de generación de señales del sistema o disminuyendo la señal de fondo generada por el sistema. La capacidad de generación de señales puede considerarse en términos de la "pendiente de sensibilidad" o la cantidad de señal generada por unidad de analito: pendiente = (Corriente (nA))/Concentración (ng/mL)), y por lo tanto la Concentración (ng/mL) = (Corriente (nA))/(pendiente (nA/ng/mL). En sistemas convencionales de análisis de muestras en el POC como los descritos en la patente de Estados Unidos núm. 7,419,821, un sensor se recubre con una biocapa que comprende un anticuerpo anti-troponina unido covalentemente, al que se une un complejo de conjugado de troponina y enzima-anticuerpo. De esta manera, el conjugado enzima-anticuerpo se inmoviliza cerca del electrodo en proporción a la cantidad de troponina inicialmente presente en la muestra. Además de la unión específica, el conjugado enzima-anticuerpo puede unirse de forma no específica al sensor. La unión no específica proporciona una señal de fondo del sensor que no es deseable y debe minimizarse. Para resolver este problema, la patente de Estados Unidos núm.

7,419,821 describe el uso de protocolos de enjuague, y en particular el uso del fluido segmentado para enjuagar el sensor, como un medio para disminuir la señal de fondo. Sistemas de análisis de muestras en el POC como los descritos en la patente de Estados Unidos núm. 7,419,821 tienen una capacidad de generación de señales o "pendiente de sensibilidad" de aproximadamente 4 nA/ng/mL y son particularmente efectivo para la detección de niveles altos de un biomarcador como la troponina (es decir, sensibilidad de alto nivel).

Sin embargo, en base a un tamaño de muestra de 10 pL, que típicamente es de sistemas de análisis de muestras en el POC, y una cantidad de moléculas de analito que pueden estar presentes en dicho tamaño de muestra, la pendiente máxima teórica es de aproximadamente 1200 nA/ng/mL. Se cree que los sistemas convencionales de análisis de muestras en el POC tienen simplemente una capacidad de generación de señales de aproximadamente 4 nA/ng/mL porque la biocapa que comprende el anticuerpo anti-troponina unido covalentemente está inmovilizada en, o cerca de, la superficie del sensor y por lo tanto, solo el analito que se pone en contacto con la superficie del sensor está sujeto a captura y análisis (por ejemplo, un 0,3 % estimado de todo el analito en la muestra está sujeto a captura y análisis).

Con el fin de aumentar la capacidad de generación de señales o la "pendiente de sensibilidad" más allá de 4 nA/ng/mL y aumentar la eficacia de un inmunoensayo para la detección de niveles bajos de un biomarcador como la troponina (es decir, sensibilidad de gama baja),sistemas de análisis de muestras en el POC convencionales como los descritos en la patente de Estados Unidos núm. 9,233,370 se desarrollaron con técnicas de captura de perlas magnéticamente susceptibles. Las técnicas de captura de perlas magnéticamente susceptibles permiten que el conjugado enzimaanticuerpo se localice en, o cerca de, la superficie del sensor y funcione para retener sustancialmente el conjugado enzima-anticuerpo en o cerca del sensor durante la eliminación de la muestra no unida y el lavado del sensor para eliminar la unión no específica. Sistemas de análisis de muestras en el POC como los descritos en la patente de Estados Unidos núm. 9,233,370 tienen una capacidad de generación de señales o "pendiente de sensibilidad" de aproximadamente 40 nA/ng/mL (es decir, 10 veces la capacidad de generación de señales de los inmunoensayos no magnéticos) y son particularmente efectivos para la detección de niveles bajos de un biomarcador como la troponina (es decir, sensibilidad de gama baja). No obstante, los sistemas convencionales de análisis de muestras en el POC están lejos de alcanzar la pendiente máxima teórica de aproximadamente 1200 nA/ng/mL.

Con el fin de mejorar la capacidad de generación de señales de los sistemas de análisis de muestras en el POC convencionales y aumentar la eficacia de un inmunoensayo para la detección de niveles bajos de un biomarcador como la troponina (es decir, sensibilidad de gama baja), una modalidad de la presente invención se dirige a un dispositivo sensor magnético de intervalo extendido que tiene un sitio de captura de anticuerpos fijo situado sobre un primer sensor (por ejemplo, un sensor amperométrico) y otro sitio de captura de anticuerpos situado sobre un segundo sensor (por ejemplo, un sensor amperométrico) con un imán de campo alto colocado debajo. Cada uno de los dos sensores tiene sensibilidad a un analito (por ejemplo, cTn) pero con sensibilidades diferentes debido a la diferencia en los reactivos de captura que se usan para cada sensor respectivo. El primer sensor es típicamente el sensor de sensibilidad más baja (una pendiente de menos de 5 nA/ng/mL) y es particularmente efectivo para la detección de niveles altos de un analito como la troponina (es decir, sensibilidad de gama alta). El segundo sensor es típicamente el sensor de mayor sensibilidad (una pendiente superior a 7 nA/ng/mL) y es particularmente eficaz para la detección de niveles bajos de un analito como la troponina (es decir, sensibilidad de gama baja). En consecuencia, la implementación tanto del sensor de menor sensibilidad como del sensor de alta sensibilidad en un solo dispositivo amplía el intervalo de concentraciones de un analito que puede detectarse mediante el uso del dispositivo.

La diferencia en la ubicación del analito y la unión del reactivo marcador entre los dos sensores explica en gran parte su diferencia en la sensibilidad al analito. Las diferencias de sensibilidad entre los dos sensores pueden controlarse además mediante la variación del tiempo entre la disolución del reactivo paramagnético en la muestra y el posicionamiento de la muestra sobre el primer sensor. Puede lograrse un control mayor de las sensibilidades entre los dos sensores por alteración de la concentración de las partículas recubiertas del anticuerpo paramagnético usadas en el ensayo. Otra técnica para controlar las sensibilidades del sensor puede ser a través del control de la concentración de anticuerpos, afinidades o avideces en el primer sensor y los reactivos paramagnéticos.

La ventaja de la solución técnica antes mencionada para mejorar la capacidad de generación de señales de los sistemas de análisis de muestras POC y aumentar la eficacia de un inmunoensayo para la detección de niveles bajos de un biomarcador como la troponina (es decir, sensibilidad de gama baja) es que eliminará los problemas técnicos al incrementar la resolución entre (i) el límite de blanco (LoB) y el límite de detección (LoD) y (ii) el LoD y el percentil 99no. Por ejemplo, las implementaciones de la presente invención proporcionan una contribución técnica sobre los sistemas y métodos de análisis de muestras en el POC convencionales porque las características técnicas de la presente invención interactúan para proporcionar tanto el sensor de menor sensibilidad como el sensor de alta sensibilidad en un solo dispositivo, lo que extiende el intervalo de concentraciones de un analito que pueden detectarse mediante el uso del dispositivo.

Inmunoensayos

La Figura 2 ilustra el principio de un inmunoensayo combinado (por ejemplo, un inmunoensayo combinado de un solo paso) 200 de acuerdo con las modalidades específicas de la presente invención que extienden el intervalo de concentraciones de un analito diana como la troponina I (Tnl) o la troponina I cardíaca (cTnI), que puede detectarse mediante el uso un analizador. En varias modalidades, el inmunoensayo combinado 200 incluye una técnica de inmunoensayo no magnético 205 que usa un conjugado enzima-biomolécula 210 configurado para unirse al analito diana 215 y una biomolécula de captura 220 (por ejemplo, perlas de látex o microesferas recubiertas con biomolécula de captura) inmovilizada en o cerca de una superficie de un sensor no magnético (es decir, un inmunosensor de captura de superficie heterogénea). La biomolécula de captura 220 se configura para unirse al analito diana 215 que está unido al conjugado enzima-biomolécula 210 de manera que el conjugado enzima-biomolécula 210 es capturado e inmovilizado en o cerca de una superficie del sensor no magnético. El sensor no magnético puede sujetarse a un potencial electroquímico fijo suficiente para oxidar o reducir un producto de un sustrato hidrolizado pero no el sustrato directamente, o el potencial puede barrerse una o más veces a través de un intervalo apropiado. El inmunoensayo combinado 200 incluye además una técnica de inmunoensayo magnético 225 que usa el conjugado enzima-biomolécula 210 configurado para unirse al analito diana 215 y una biomolécula de captura 230 (por ejemplo, perlas magnéticas o microesferas recubiertas con biomolécula de captura). La biomolécula de captura 230 se configura para unirse al analito diana 215 que está unido al conjugado enzima-biomolécula 210. La biomolécula de captura 230 unida al analito diana 215 que está unido al conjugado enzima-biomolécula 210 puede atraerse por medio de un imán sobre o cerca de una superficie de un sensor magnético (es decir, un inmunosensor de captura de perlas magnéticas homogéneo) de manera que el conjugado enzimabiomolécula 210 se captura e inmoviliza sobre o cerca de una superficie del sensor magnético. El sensor magnético puede sujetarse a un potencial electroquímico fijo suficiente para oxidar o reducir un producto de un sustrato hidrolizado pero no el sustrato directamente, o el potencial puede barrerse una o más veces a través de un intervalo apropiado.

El conjugado enzima-biomolécula 210 incluye una enzima conjugada con biomoléculas seleccionadas para unirse a un analito de interés. En algunas modalidades, la enzima es la fosfatasa alcalina (ALP), la peroxidasa de rábano picante o la glucosa oxidasa y las biomoléculas se eligen entre ionóforos, cofactores, polipéptidos, proteínas, glucopéptidos, enzimas, inmunoglobulinas, anticuerpos, antígenos, lectinas, receptores neuroquímicos, oligonucleótidos, polinucleótidos, ADN, ARN o mezclas adecuadas. En algunas modalidades, las biomoléculas pueden seleccionarse para unirse a una o más de gonadotrofina coriónica humana, troponina I, troponina T, troponina C, un complejo de troponina, creatina quinasa, subunidad M de creatina quinasa, subunidad B de creatina quinasa, mioglobina, cadena ligera de miosina, o fragmentos modificados de estas. Dichos fragmentos modificados se generan por oxidación, reducción, deleción, adición o modificación de al menos un aminoácido, incluida la modificación química con un resto natural o con un resto sintético. Por ejemplo, las biomoléculas pueden seleccionarse como un anticuerpo anti-troponina I monoclonal o policlonal (por ejemplo, BiosPacific - Péptido 4 (G-130-C), HyTest - 560 (19C7, núm de catálogo 4T21 - Troponina I Ab monoclonal) y punto de atención internacional - 817 (núm. de catálogo MA-1040). En ciertas modalidades, la biomolécula se une al analito específicamente y tiene una constante de afinidad para unirse al ligando del analito de aproximadamente 107 a 1015 M-1.

La biomolécula de captura 220 puede proporcionarse como una biocapa depositada sobre o cerca de al menos una porción del sensor no magnético. Una biocapa es una capa porosa que comprende en su superficie una cantidad suficiente de biomoléculas que pueden unirse a un analito de interés o responder a la presencia de dicho analito produciendo un cambio que es capaz de medir. Opcionalmente, puede interponerse una capa de cribado permeoselectivo entre el sensor no magnético y la biocapa para cribar interferencias electroquímicas como se describió en la patente de Estados Unidos núm. 5,200,051.

En algunas modalidades, la biocapa se construye a partir de perlas de látex de un diámetro específico en el intervalo de aproximadamente 0,001 a 50 micras (por ejemplo, ThermoFisher OptiLink Carboxylate-Modifies Microparticles (núm de catálogo 83000591100351), 0,2 um de diámetro). Las perlas pueden modificarse mediante la unión covalente de cualquier biomolécula adecuada que pueda unirse a un analito de interés o responder a la presencia de dicho analito produciendo un cambio que sea capaz de medirse. Existen muchos métodos de unión en la técnica, incluido el suministro de grupos éster de N-hidroxisuccinimida reactivos con amina para el acoplamiento fácil de lisina o grupos de proteínas de amina N-terminal. En determinadas modalidades, las biomoléculas se eligen entre ionóforos, cofactores, polipéptidos, proteínas, glucopéptidos, enzimas, inmunoglobulinas, anticuerpos, antígenos, lectinas, receptores neuroquímicos, oligonucleótidos, polinucleótidos, ADN, ARN o mezclas adecuadas. En algunas modalidades, las biomoléculas pueden seleccionarse para unirse a una o más de gonadotropina coriónica humana, troponina I, troponina T, troponina C, un complejo de troponina, creatina quinasa, subunidad M de creatina quinasa, subunidad B de creatina quinasa, mioglobina, cadena ligera de miosina, o fragmentos modificados de estas. Dichos fragmentos modificados se generan por oxidación, reducción, deleción, adición o modificación de al menos un aminoácido, incluida la modificación química con un resto natural o con un resto sintético. Por ejemplo, las biomoléculas pueden seleccionarse como un anticuerpo anti-troponina I monoclonal o policlonal (por ejemplo, SDIX-M06 (# D2440MA06-MA) y HyTest - Capl (19C7, núm de catálogo 4T21 - Troponina I Ab monoclonal). En ciertas modalidades, la biomolécula se une al analito específicamente y tiene una constante de afinidad para unirse al ligando del analito de aproximadamente 107 a 1015 M-11.

La biomolécula de captura 230 puede proporcionarse como biomoléculas unidas a perlas magnéticamente susceptibles. Las perlas magnéticamente susceptibles pueden estar compuestas de cualquier material conocido en la técnica que sea susceptible al movimiento de un imán (por ejemplo, un imán permanente o un electroimán) usado en conjunto con el dispositivo de la presente invención. Como tal, los términos "magnético" y "magnéticamente susceptible" con respecto a las perlas pueden usarse indistintamente.

En algunas modalidades, las perlas incluyen un núcleo magnético, que preferentemente está recubierto total o parcialmente con un material de recubrimiento. El núcleo magnético puede comprender un material ferromagnético, paramagnético o superparamagnético. En modalidades preferidas, las perlas magnéticamente susceptibles comprenden un núcleo y un recubrimiento de polímero externo. En otras modalidades, las perlas magnéticas comprenden perlas de sustrato no magnéticas formadas, por ejemplo, de un material seleccionado del grupo que consiste en poliestireno, ácido poliacrílico y dextrano, sobre el cual se coloca un recubrimiento magnético. En ciertas modalidades en las que las perlas magnéticamente susceptibles comprenden un núcleo, el núcleo magnético puede comprender uno o más de ferrita, Fe, Co, Mn, Ni, metales que comprenden uno o más de estos elementos, aleaciones ordenadas de estos elementos, cristales compuestos de estos elementos, estructuras de óxido magnético, tales como ferritas, y sus combinaciones. En otras modalidades donde las perlas magnéticamente susceptibles comprenden un núcleo, el núcleo magnético puede estar compuesto de magnetita (Fe3O4), maghemita (Y-Fe2O3), o ferritas metálicas divalentes proporcionadas por la fórmula Me¹-xOFe3+xO3 donde Me es, por ejemplo, Cu, Fe, Ni, Co, Mn, Mg o Zn o combinaciones de estos materiales, y donde x varía de 0,01 a 99. Los materiales adecuados para el recubrimiento del polímero externo sobre el núcleo incluyen polímeros sintéticos y biológicos, copolímeros y mezclas de polímeros, y materiales inorgánicos. Los materiales poliméricos pueden incluir combinaciones diversas de polímeros de acrilatos, siloxanos, estirenos, acetatos, alquilenglicoles, alquilenos, óxidos de alquileno, parilenos, ácido láctico y ácido glicólico. Los materiales biopoliméricos incluyen el almidón o carbohidratos similares. Los materiales de recubrimiento inorgánicos pueden incluir cualquier combinación de un metal, una aleación de metal y una cerámica. Los ejemplos de materiales cerámicos pueden incluir hidroxiapatita, carburo de silicio, carboxilato, sulfonato, fosfato, ferrita, fosfonato y óxidos de elementos del Grupo IV de los Elementos de la Tabla Periódica.

En principio, puede usarse cualquier perla magnéticamente susceptible de tamaño correcto capaz de colocarse con el imán de la presente invención, teniendo en cuenta los requisitos de dispersabilidad de las perlas magnéticamente susceptibles. En modalidades preferidas, al menos el 50 % en peso, por ejemplo, al menos el 75 % en peso, de las perlas magnéticamente susceptibles se retienen en o cerca de la superficie del sensor. En algunas modalidades ilustrativas, el promedio medio de partícula de las perlas magnéticamente susceptibles puede variar de 0,01 gm a 20 gm, por ejemplo, de 0,1 |jm a 10 |jm, de 0,1 |jm a 5 |jm o de 0,2 |jm a 1,5 |jm. Como se usa en la presente, el término "tamaño medio de partícula" se refiere a la dimensión promedio más larga de las partículas, por ejemplo, perlas, por ejemplo, el diámetro de las partículas esféricas, determinado por métodos bien conocidos en la técnica. La distribución del tamaño de partícula de las perlas magnéticamente susceptibles es preferentemente unimodal, aunque también pueden usarse distribuciones polimodales de acuerdo con la presente invención. Aunque se prefiere usar una perla esférica magnéticamente susceptible, en otras modalidades, otras formas y estructuras de perlas, por ejemplo, partículas ovaladas, subesféricas, cilíndricas y otras de forma irregular, están dentro del significado del término "perlas" y "micropartículas" como se usa en la presente.

Las fuentes comerciales de preparados de perlas magnéticamente sensibles incluyen Invitrogen™ (Carlsbad, California, EE. UU.) de Life Technologies™, Ademtech (Pessac, Francia), Chemicell GmbH (Berlín, Alemania), Bangs Laboratories, Inc.™ (Fishers, IN) y Seradyn, Inc. (Indianapolis, IN) (por ejemplo, Invitrogen™ de Life™ Technologies - Dynabeads® MyOne™ Streptavidin T1 (núm. de catálogo 65601/65602), 1 um de diámetro). Muchos de los productos disponibles comercialmente incorporan la funcionalización de la superficie que puede emplearse para inmovilizar biomoléculas tales como anticuerpos (por ejemplo, IgG) en las superficies de las perlas. Las funcionalizaciones ilustrativas incluyen perlas magnéticamente susceptibles modificadas con carboxilo, amino o estreptavidina.

En algunas modalidades, las perlas magnéticamente susceptibles se recubren con cualquier biomolécula adecuada que pueda unirse a un analito de interés o responder a la presencia de dicho analito produciendo un cambio que sea capaz de medir. Existen muchos métodos de unión en la técnica, incluido el suministro de grupos éster de N-hidroxisuccinimida reactivos con amina para el acoplamiento fácil de lisina o grupos de proteínas de amina N-terminal. En el caso de perlas magnéticamente susceptibles modificadas con estreptavidina, las biomoléculas pueden modificarse para incluir un aglutinante tal como biotina para unir las biomoléculas en las superficies de las perlas. Por ejemplo, las biomoléculas pueden unirse a la biotina (por ejemplo, Thermo Scientific - EZ-link Sulfo-NHS-LC-LC-biotin (núm. de producto 21338) o EZ-link Sulfo-NHS-LC-biotin (núm. de producto 21335)). En determinadas modalidades, las biomoléculas se eligen entre ionóforos, cofactores, polipéptidos, proteínas, glucopéptidos, enzimas, inmunoglobulinas, anticuerpos, antígenos, lectinas, receptores neuroquímicos, oligonucleótidos, polinucleótidos, ADN, ARN o mezclas adecuadas. Las biomoléculas pueden seleccionarse para unirse a una o más de gonadotrofina coriónica humana, troponina I, troponina T, troponina C, un complejo de troponina, creatina quinasa, subunidad M de creatina quinasa, subunidad B de creatina quinasa, mioglobina, cadena ligera de miosina o fragmentos modificados de estas. Dichos fragmentos modificados se generan por oxidación, reducción, deleción, adición o modificación de al menos un aminoácido, incluida la modificación química con un resto natural o con un resto sintético. Por ejemplo, las biomoléculas pueden seleccionarse como un anticuerpo anti-troponina I monoclonal o policlonal (por ejemplo, BiosPacific - Péptido 3 (G-129-C) y HyTest - Capí (19C7, núm. de catálogo 4T21 -Troponina I Ab monoclonal). En ciertas modalidades, la biomolécula se une al analito específicamente y tiene una constante de afinidad para unirse al ligando del analito de aproximadamente 107 a 1015 M-11.

Como debe entenderse, las modalidades de la presente descripción pueden implementarse en una variedad de sistemas y contextos diferentes. Ciertas modalidades son particularmente aplicables a inmunoensayos que detectan una especie electroactiva producida enzimáticamente (por ejemplo, 4-aminofenol) a partir de la reacción de un sustrato (por ejemplo, 4-aminofenilfosfato) con el conjugado anticuerpo-enzima (por ejemplo, uno o más anticuerpos unidos a la fosfatasa alcalina (ALP). Sin embargo, los sistemas y técnicas descritas en la presente descripción pueden usarse para detectar un analito mediante el uso de biomoléculas distintas de los anticuerpos marcados con varios marcadores más allá de las enzimas. Por ejemplo, las biomoléculas descritas en la presente descripción pueden unirse a marcadores que incluyen un radiomarcador, cromóforo, fluoróforo, especies quimioluminiscentes, ionóforos, especies electroactivas y otros conocidos en la técnica.

Como debe entenderse mejor, las modalidades de la presente descripción pueden implementarse en una variedad de sistemas y configuraciones diferentes, y el término en o cerca de una superficie del sensor se usa en la presente descripción para describir la relación entre un complejo de biomoléculas y la superficie de un sensor particular. En o cerca de una superficie de un sensor define una distancia de trabajo entre el complejo de biomoléculas y la superficie del sensor particular que necesita mantenerse de manera que una señal generada por una reacción del complejo de biomoléculas con un sustrato pueda medirse en la superficie del sensor particular. En algunas modalidades, la distancia de trabajo es menor de 800 jm , por ejemplo, menor de 600 jm o menor de 500 jm .

Sistema de prueba de muestras biológicas para realizar inmunoensayos

La presente descripción se refiere a un sistema de instrumentos en el POC portátil que incluye un dispositivo sensor o cartucho (dispositivo(s)) de detección desechable autónomo y un lector o analizador (instrumentos) configurado para usar junto a la cama de un paciente. Una muestra de fluido que se va a medir se introduce en un orificio o puerto de entrada de muestra en el cartucho y el cartucho se inserta en el analizador a través de una abertura o puerto ranurado. Las mediciones realizadas por el analizador se envían a una pantalla u otro dispositivo de salida, como una impresora o un sistema de gestión de datos, a través de un puerto del analizador a un puerto de computadora. La transmisión puede ser a través de Wi-Fi, enlace Bluetooth, infrarrojos y similares. Por ejemplo, el sistema de instrumentos de IVD portátil puede tener un diseño similar a los sistemas descritos en la patente de Estados Unidos núm. 5,096,669 y la patente de Estados Unidos núm. 7,419,821.

La Figura 3 muestra los componentes y las interacciones de un sistema de instrumentos en el POC portátil típico. El sistema 300 puede incluir un analizador 305, un dispositivo sensor desechable 310 y una estación central de datos o administrador de datos 315. El analizador 305 puede incluir, por ejemplo, una pantalla 320 para referencia visual y uno o más dispositivos 325 de entrada para la entrada de datos. El uno o más dispositivos de entrada 325 pueden incluir uno o más mecanismos que permiten a un operador ingresar información al analizador 305, tal como, pero no limitado a, un panel táctil, dial, rueda de clic, rueda de desplazamiento, pantalla táctil, uno o más botones (por ejemplo, un teclado), ratón, controlador de juegos, bola de seguimiento, micrófono, cámara, sensor de proximidad, detector de luz, sensores de movimiento, sensor biométrico y sus combinaciones. El dispositivo sensor 310 puede incluir, por ejemplo, un puerto 330 para recibir una muestra del paciente y una serie de sensores 335 para detectar un analito en una muestra biológica. Por ejemplo, el dispositivo de detección 310 puede configurarse para realizar análisis en un intervalo de tipos de muestras biológicas. Estos tipos de muestras pueden incluir, por ejemplo, sangre, plasma, suero, esputo, líquido cefalorraquídeo, lágrimas, orina, tejido corporal, materia fecal y similares. El dispositivo de detección 310 puede insertarse en el analizador 305 a través de una abertura 340 de manera que el analizador 305 esté en contacto eléctrico con el dispositivo de detección 310 para implementar la funcionalidad, etapas, y/o el rendimiento de la presente invención.

El analizador 305 puede comunicarse con el administrador de datos 315 mediante el uso por ejemplo, de una conexión inalámbrica, un enlace infrarrojos, un enlace óptico, una conexión de red 345, 350 o cualquier otra forma de enlace de comunicación que use cualquier forma de protocolo de comunicación para transferir información. El administrador de datos 315 puede residir en una infraestructura de red tal como dentro de un entorno de nube, o puede ser un dispositivo informático independiente separado (por ejemplo, un dispositivo informático de un proveedor de servicios). El administrador de datos 315 puede incluir un bus, un procesador, un dispositivo de almacenamiento, una memoria del sistema (dispositivo de hardware), uno o más dispositivos de entrada, uno o más dispositivos de salida y una interfaz de comunicación. El administrador de datos 315 puede configurarse para proporcionar conectividad entre el analizador 305 y ubicaciones centrales, tales como, por ejemplo, un LIS o HIS (sistema de información del laboratorio u hospital) y el dispositivo sensor 305. El administrador de datos 315 puede conectarse con los diversos componentes del sistema mediante el uso de cualquier tipo de conexión de comunicaciones que sea capaz de transmitir y recibir información electrónica, como, por ejemplo, una conexión Ethernet u otra conexión de red informática. El administrador de datos 315 también puede proporcionar opcionalmente un enlace directo al sistema de información de un vendedor (fabricante del producto), por ejemplo, a través de Internet, una conexión de acceso telefónico u otro enlace de comunicación directo o indirecto, o a través del LIS o HIS. Una modalidad ilustrativa de este tipo puede proporcionar un reordenamiento automático de los dispositivos sensores 305 para mantener niveles predeterminados de inventario en un hospital y permitir que el vendedor pronostique la demanda y planifique adecuadamente la fabricación de los dispositivos 305. También puede proporcionar un medio para actualizar la información del dispositivo, por ejemplo, los atributos y perfiles de los cartuchos y controlar la información del fluido, por ejemplo, intervalos de prueba de analitos esperados.

El analizador 305 puede incluir además un procesador, un dispositivo de almacenamiento y una memoria del sistema. El procesador puede ser uno o más procesadores convencionales, microprocesadores o procesadores dedicados especializados que incluyen circuitos de procesamiento operativos para interpretar y ejecutar instrucciones de programa legibles por computadora, tales como instrucciones de programa para controlar la operación y desempeño de uno o más de los otros componentes del analizador 305 y/o el dispositivo sensor 310 para implementar la funcionalidad, las etapas y/o el rendimiento de la presente invención. En ciertas modalidades, el procesador interpreta y ejecuta los procesos, etapas, funciones y/u operaciones de la presente invención, que pueden implementarse operativamente por las instrucciones del programa legibles por computadora. Por ejemplo, el procesador puede medir una señal generada en un sensor del dispositivo sensor 310 (por ejemplo, una señal indicativa de la presencia y/o concentración de un analito en una muestra biológica), determinar una concentración del analito en la muestra biológica basado en la señal medida, e informar la concentración determinada (por ejemplo, mostrar la concentración determinada en la pantalla 320). En algunas modalidades, la información obtenida o generada por el procesador, por ejemplo, la identidad del dispositivo sensor 310, la vida útil del dispositivo sensor 310, la concentración determinada, etc., puede almacenarse en el dispositivo de almacenamiento.

El dispositivo de almacenamiento puede incluir medios legibles por el ordenador extraíbles/no extraíbles, volátiles/no volátiles, tales como, entre otros, medios de almacenamiento no transitorios legibles por máquina como medios de grabación magnéticos y/u ópticos y sus correspondientes unidades. Las unidades y sus medios legibles por el ordenador asociados proporcionan el almacenamiento de instrucciones de programa, estructuras de datos, módulos de programa y otros datos legibles por el ordenador para el funcionamiento del analizador 305 de acuerdo con los diferentes aspectos de la presente invención. En modalidades, el dispositivo de almacenamiento puede almacenar un sistema operativo, programas de aplicación y datos de programas de acuerdo con aspectos de la presente invención.

La memoria del sistema puede incluir uno o más medios de almacenamiento, que incluyen, por ejemplo, un medio de almacenamiento no transitorio legible por máquina, como una memoria flash, una memoria permanente como una memoria de solo lectura ("ROM"), una memoria semipermanente como una memoria de acceso aleatorio ("RAM"), cualquier otro tipo adecuado de componente de almacenamiento no transitorio, o cualquiera de sus combinaciones. En algunas modalidades, un sistema de entrada/salida (BIOS) que incluye las rutinas básicas que ayudan a transferir información entre los otros componentes del analizador 305 y el sistema 300, como durante el inicio, puede almacenarse en la ROM. Adicionalmente, módulos de datos y/o programas, tales como al menos una porción del sistema operativo, módulos de programas, programas de aplicación y/o datos de programas, que son accesibles y/o están siendo operados actualmente por el procesador, pueden estar contenidos en la RAM. En modalidades, los módulos del programa y/o programas de aplicación pueden comprender una tabla de búsqueda, un algoritmo tal como un algoritmo para identificar, para determinar una concentración de un analito en un intervalo de concentración extendido y una herramienta de comparación, que proporciona las instrucciones para la ejecución del procesador.

El analizador 305 puede incluir además un lector de código de barras para leer información de la pulsera con código de barras de un paciente, de un código de barras en un dispositivo sensor 310 o de cualquier otro elemento (por ejemplo, una caja de dispositivos sensores, una caja de fluidos de control, etc.) usado junto con el analizador 305. Pueden usarse otros arreglos de codificación de este tipo. Por ejemplo, el analizador 305 también puede incluir (alternativamente o además del lector de código de barras) un dispositivo de identificación por radiofrecuencia (RF) que es capaz de identificar un marcador de RF que está contenida sobre o en cada dispositivo sensor individual o cada caja de dispositivos. De acuerdo con otra modalidad ilustrativa de la presente invención, uno o más de los arreglos de codificación pueden basarse en una serie de arreglos de codificación binaria del tipo descrito en, por ejemplo, la patente de Estados Unidos núm.

4,954,087. Los diversos arreglos de codificación pueden transmitir información relevante como, por ejemplo, la identidad de un tipo de dispositivo específico, fecha y ubicación de fabricación, número de lote de fabricación, fecha de vencimiento, un número único asociado con un dispositivo, coeficientes para uso del analizador 305 asociado con el cálculo de sangre u otros parámetros de la muestra, y similares.

Dispositivo sensor o cartucho

En una modalidad alternativa, como se muestra en la Figura 4, un dispositivo sensor o cartucho 400 comprende una porción superior 405 (por ejemplo, un recubrimiento) y una porción inferior 410 (por ejemplo, una base) en las que están montados al menos un chip sensor microfabricado 415 con contactos eléctricos y una bolsa 420 que contiene un fluido, por ejemplo, un fluido de lavado. Al menos un chip sensor 415 puede colocarse en la región ahuecada 418 y configurarse para generar señales eléctricas basadas en una concentración de especies químicas específicas en una muestra de fluido, por ejemplo, una muestra de sangre de un paciente. En algunas modalidades, la composición del fluido en la bolsa 420 se selecciona del grupo que consiste en agua, fluido calibrante, fluido reactivo, fluido de control, fluido de lavado y sus combinaciones. Una junta 425 está situada entre la porción superior 405 y la porción inferior 410 para unirlas juntas y definir y sellar varias cavidades y conductos dentro del cartucho 400. La junta 425 puede recubrir sustancialmente toda el área entre la porción superior 405 y la porción inferior 410 del cartucho 400, como se muestra en la Figura. 4, o puede localizarse sólo sobre y entre características estructurales predeterminadas, por ejemplo, al menos un chip sensor 415, del cartucho 400 (no mostrado). La junta 425 puede incluir aberturas 430 para permitir la comunicación física, fluídica y/o gaseosa entre las características estructurales de la porción superior 405 y la porción inferior 410. La junta 425 puede tener o no una superficie adhesiva, y puede tener una superficie adhesiva en ambos lados de la misma, es decir, formando una capa adhesiva de doble cara.

Como se muestra en las Figuras 5A a 5J, en algunas modalidades, el dispositivo sensor o cartucho 500 (por ejemplo, el cartucho 400 como se describió con respecto a la Figura 4) tiene una carcasa que comprende una porción superior 502 (por ejemplo, un recubrimiento) y una porción inferior 504 (por ejemplo, una base) formada por zonas rígidas y flexibles de material. Como se muestra en las Figuras 5A a 5J, las zonas rígidas (porciones no sombreadas) del recubrimiento 502 y la base 504 respectivamente son cada una de ellas preferentemente una única zona contigua; sin embargo, el proceso de moldeo puede proporcionar una pluralidad de zonas sustancialmente rígidas no contiguas. Las zonas flexibles (porciones sombreadas) del recubrimiento 502 y la base 504, respectivamente, son preferentemente un conjunto de varias zonas no contiguas. Por ejemplo, la zona flexible alrededor de una membrana desplazable puede estar separada y distinta de la zona flexible en un miembro de sellado que puede cerrarse. Alternativamente, las zonas flexibles pueden comprender una única zona contigua.

El dispositivo sensor o cartucho 500 que comprende además un puerto de entrada de muestra sellable 506 y un miembro de sellado que puede cerrarse 508 para cerrar el puerto de entrada de muestra 502, una cámara de retención de muestra 510 ubicada aguas abajo del puerto de entrada de muestra 506, un tope capilar 512, una región de sensor 514, y una cámara de desechos 516 ubicada aguas abajo de la región 508 del sensor. Preferentemente, el área de sección transversal de una porción de la cámara de retención de muestras 510 disminuye distalmente con respecto al puerto de entrada de muestras 506, como se muestra por la rampa 518 en la Figura. 5H. Una bolsa (por ejemplo, la bolsa 420 descrita con respecto a la Figura 4) puede disponerse en una región ahuecada 520 y en comunicación de fluidos con un conducto 522 que conduce a la región de sensor 514, opcionalmente a través del conducto 524. La bolsa puede tener el diseño descrito en la patente de Estados Unidos núm. 5,096,669 o, con mayor preferencia, en la patente de Estados Unidos núm. 8,216,529. La región ahuecada 520 incluye preferentemente una punta 525 configurada para romper la bolsa, tras la aplicación de una fuerza sobre la bolsa, por ejemplo, mediante un lector o analizador (por ejemplo, el analizador 305 como se describió con respecto a la Figura 3). Una vez que se rompe la bolsa, el sistema se configura para suministrar el contenido de fluido de la bolsa al conducto 522. El movimiento del fluido hacia el interior del conducto 522 y hacia la región del sensor 514 y/o dentro del conducto 524 puede efectuarse mediante una bomba, por ejemplo, una bomba neumática conectada al(a los) conducto(s) 522 o 524. Preferentemente, la bomba neumática comprende una membrana 526 desplazable formada por una porción de una zona 527 flexible de la carcasa formada sobre una región ahuecada o vejiga 528 de aire. En la modalidad mostrada en las Figuras 5A a 5J, al presionar repetidamente la membrana 526 desplazable, el dispositivo bombea a través de los conductos 524, 529, 530 y 531 haciendo que el fluido de la bolsa 206 rota fluya a través del conducto 270, hacia el conducto 275 y sobre la región 230 del sensor.

El miembro de sellado que puede cerrarse 508, en algunas modalidades, incluye una porción de la zona rígida que forma un miembro de sellado 532, y una porción de la zona flexible que forma un sello 533. El miembro de sellado 508 puede girar alrededor de la bisagra 534 y acoplar el sello 533 con el puerto de entrada de muestra 506 cuando está en una posición cerrada, proporcionando así un sello hermético. Alternativamente, puede formarse un sello hermético mediante el contacto de dos materiales flexibles, por ejemplo, un elastómero termoplástico (TPE) sobre TPE. Opcionalmente, el puerto de entrada de la muestra sellable 506 también incluye un orificio de ventilación (no mostrado). En una modalidad alternativa, una porción de la zona rígida forma un miembro de sellado, y una porción de la zona flexible forma un sello perimetral alrededor del puerto de entrada de la muestra, de manera que el elemento de sellado puede girar alrededor de una bisagra y enganchar el sello perimetral cuando está en una posición cerrada, proporcionando así un sello hermético. Alternativamente, el sello perimetral puede formarse por contacto de dos materiales flexibles. En otra modalidad más, el miembro de sellado puede incluir un elemento de cierre deslizable como se describió en la patente de Estados Unidos núm. 7,682,833 en pendiente.

En algunas modalidades el sensor ahuecado 514, contiene una serie de sensores que comprende uno o más sensores para uno o más analitos diferentes (o análisis de sangre). Por ejemplo, la serie de sensores puede incluir un inmunosensor y/o un inmunosensor magnético para uno o más analitos diferentes (o análisis de sangre). El inmunosensor puede incluir un sensor de base o un electrodo sensor en un chip sustancialmente plano (por ejemplo, un chip sensor microfabricado como al menos un chip sensor 415 descrito con respecto a la Figura 4) en donde el electrodo sensor se coloca en el conducto 524 para recibir una muestra mezclada con un reactivo. El inmunosensor magnético puede incluir un sensor de base o un electrodo sensor en un chip sustancialmente plano (preferentemente el mismo chip sensor que incluye el inmunosensor) donde el electrodo sensor se coloca en el conducto 524 para recibir una muestra mezclada con reactivo que incluye perlas que pueden ser atraído por un imán, o responder a un campo magnético que se coloca cerca del inmunosensor magnético. En modalidades alternativas, la serie de sensores comprende una pluralidad de sensores para una pluralidad de diferentes analitos (o análisis de sangre). En consecuencia, el cartucho 500 puede tener uno o más huecos de sensor 514, cada uno con al menos un sensor.

Los analitos/propiedades a los que responden los sensores pueden seleccionarse entre pH, pCO2, pO2, glucosa, lactato, creatinina, urea, sodio, potasio, cloruro, calcio, magnesio, fosfato, hematocrito, tiempo de protrombina (PT), tiempo de tromboblastina parcial activada (APTT), tiempo de coagulación activado (ACT), dímero D, antígeno prostático específico (PSA), creatina quinasa-MB (CKMB), péptido natriurético cerebral (BNP), troponina I (TnI), traponina cardíaca (cTnI), gonadotrofina coriónica humana, troponina T, troponina C, mioglobina y similares, y sus combinaciones. Preferentemente, el analito se prueba en una muestra líquida que es sangre completa, sin embargo, pueden usarse otras muestras que incluyen sangre, suero, plasma, orina, líquido cefalorraquídeo, saliva y formas modificadas de las mismas. Las enmiendas pueden incluir dilución, concentración, adición de reactivos tales como anticoagulantes y similares. Cualquiera que sea el tipo de muestra, puede acomodarse por el puerto de entrada de muestra 502 del cartucho 500.

El cartucho 500 puede comprender además una porción de la zona flexible 536 colocada sobre la región ahuecada 520 que está configurada para ser accionada como una bomba para aplicar presión dentro de la región ahuecada 520. En algunas modalidades, la zona flexible 536 puede incluir una descripción de símbolo genérico para indicar al usuario que el usuario no debe aplicar presión a la zona flexible 536. Por ejemplo, el símbolo puede comprender un círculo en relieve con una barra transversal. La porción de la zona flexible 536 proporciona una superficie que puede acomodar una característica de actuador del analizador (por ejemplo, el analizador 305 como se describió con respecto a la Figura 3) para aplicar una fuerza y reventar la bolsa subyacente en la región ahuecada 520. El grosor del plástico en la zona flexible 536 puede ser preferentemente de aproximadamente 200 a aproximadamente 800 pm, por ejemplo aproximadamente 400 pm. Esencialmente, la zona flexible 536 debe ser lo suficientemente delgada para flexionarse fácilmente, pero lo suficientemente gruesa para mantener la integridad física y no romperse.

Diseños de sensores y chips

En una modalidad, un chip sensor microfabricado (por ejemplo, al menos un chip sensor 415 descrito con respecto a la Figura 4) comprende al menos un sensor o transductor (por ejemplo, un electrodo de trabajo o detector óptico). Por ejemplo, el chip sensor microfabricado puede comprender un par de sensores que comprenden un primer sensor (por ejemplo, un sensor de sensibilidad de gama baja) y opcionalmente un segundo sensor (por ejemplo, un sensor de sensibilidad de gama alta). En algunas modalidades, los sensores pueden fabricarse como estructuras adyacentes, respectivamente, en un chip de silicio.

En varias modalidades, los sensores pueden formarse como electrodos con superficies doradas recubiertas con una capa de poliimida fotodefinida que incluye aberturas para definir una rejilla de pequeños electrodos de oro (por ejemplo, un electrodo de micromatriz de oro) en el que puede oxidarse una especie electroactiva. Por ejemplo, la microfabricación a nivel de oblea de una modalidad preferida del chip sensor puede lograrse como se muestra en la Figura. 6A. Un sustrato 600 no conductor que tiene una superficie superior e inferior planas puede usarse como base para el chip sensor. Una capa conductora 602 puede depositarse sobre el sustrato 600 por medios convencionales, por ejemplo, impresión conductora o técnica de microfabricación conocida por los expertos en la técnica para formar al menos un transistor. La capa conductora 602 puede comprender un metal noble como oro, platino, plata, paladio, iridio o aleaciones de los mismos, aunque también pueden usarse otros metales no reactivos como titanio y tungsteno o aleaciones de los mismos, como también pueden usarse muchos electrodos de grafito no metálicos, polímeros conductores u otros materiales. El chip sensor microfabricado también puede comprender una conexión eléctrica 603 que conecta el electrodo a una clavija conductora tal como un conector eléctrico temporal.

En algunas modalidades, los sensores pueden comprender una serie de discos de metales nobles de 5-10 gm, por ejemplo, discos de metales nobles de 7 gm, en centros de 15 gm. La serie de discos o electrodos de metales nobles puede recubrir una región, por ejemplo, una región circular, de aproximadamente 300 a 900 gm de diámetro, opcionalmente de 400-800 gm o aproximadamente 600 gm de diámetro, y puede formarse mediante foto-patrón una capa delgada de poliimida o fotorresistente de hasta 1,5 gm de grosor sobre un sustrato formado por una serie de capas que comprenden Si, Siܲ , TiW y/o Au, o sus combinaciones. En algunas modalidades, los electrodos tienen un área de trabajo de aproximadamente 130,000 a 300,000 gm cuadrados (es decir, un microelectrodo), el volumen de muestra directamente sobre los electrodos puede ser de aproximadamente 0,1-0,3 gL y el volumen de la muestra sobre el chip sensor puede ser de 1-3 gL. De acuerdo con estos aspectos de la presente invención, el conducto (por ejemplo, el conducto 524 descrito con respecto a la Figura 5A) en una región de los electrodos (por ejemplo, la una o más cavidades del sensor 514 descritos con respecto a las Figuras 5A a 5J) tiene una relación de volumen a área del sensor de menos de aproximadamente 6 gl a aproximadamente 1 mm cuadrado, preferentemente menor de aproximadamente 50 mm a aproximadamente 2 mm cuadrados, con mayor preferencia menor de aproximadamente 100 gm a aproximadamente 500 gm cuadrados. En consecuencia, la serie de electrodos proporciona una alta eficiencia de recolección de un resto detectable que es una especie electroactiva con una contribución reducida de cualquier corriente de fondo electroquímica asociada con la capacitancia del metal expuesto. En particular, las aberturas en la capa aislante de poliimida o fotorresistente definen una región de los electrodos de metales nobles en la que las especies electroactivas, por ejemplo, 4-aminofenol, pueden oxidarse tal como en una reacción de dos electrones por molécula.

Pueden usarse técnicas de microfabricación (por ejemplo, fotolitografía y deposición de plasma) para la construcción de estructuras de sensores de múltiples capas en espacios confinados. Por ejemplo, los métodos para la microfabricación de inmunosensores electroquímicos sobre sustratos de silicio se describen en la patente de Estados Unidos núm.

5,200,051 e incluyen, por ejemplo, métodos de dispensación, métodos para unir sustratos y reactivos a superficies que incluyen capas fotoformadas y métodos para realizar ensayos electroquímicos.

Como se muestra en la Figura 6B, en algunas modalidades, un chip sensor 604 de intervalo extendido microfabricado incluye un primer sensor 605 (por ejemplo, un sensor amperométrico de sensibilidad de gama baja) y opcionalmente un segundo sensor 610 (por ejemplo, un sensor amperométrico de sensibilidad de gama alta). El primer y segundo sensores 605, 610 pueden fabricarse como estructuras adyacentes, respectivamente, en el chip sensor 604. Sin embargo, para que el chip sensor 604 determine concentraciones precisas de analito, el sensor de sensibilidad de gama baja 605 puede estar suficientemente separado del sensor de sensibilidad de gama alta 610. Por ejemplo, a concentraciones bajas a medias de analito, el sensor de sensibilidad de gama alta 610 puede generar una señal amperométrica alta debido a la alta concentración de reactivo marcador que se une a perlas magnéticas recubiertas de anticuerpo. En modalidades en las que el reactivo marcador usa una enzima para escindir un sustrato generando una especie electroactiva, la alta concentración de la especie electroactiva en el sensor de sensibilidad de gama alta 610 puede moverse a lo largo del chip sensor 604 y generar una señal amperométrica en el sensor de sensibilidad de gama baja 605. Alternativamente, la baja concentración de especies electroactivas en el sensor de sensibilidad de gama baja también podría moverse a lo largo del chip del sensor y generar una señal amperométrica en el sensor de sensibilidad de gama alta. La magnitud de esta diafonía entre los sensores depende de muchos factores y puede mostrar variabilidad entre las ejecuciones del dispositivo sensor, lo que provoca una imprecisión mayor en la lectura amperométrica del sensor de sensibilidad de gama baja y/o el sensor de sensibilidad de gama alta. En consecuencia, para reducir la diafonía entre sensores, puede ser beneficioso en determinadas modalidades separar los dos sensores entre sí en una distancia predeterminada.

El primer sensor 605 y el segundo sensor 610 están separados entre sí a una distancia "x" predeterminada. Por ejemplo, el primer sensor 605 puede estar espaciado al menos 0,03 mm, preferentemente al menos 0,06 mm del segundo sensor 610. El primer sensor 605 puede conectarse mediante cableado 615 a un primer pin conductor 620 (por ejemplo, conector eléctrico temporal) y el segundo sensor 610 puede conectarse mediante cableado 625 a un segundo pin conductor 630 (por ejemplo, conector eléctrico temporal). En algunas modalidades, el primer sensor 605 puede configurarse como un inmunosensor (por ejemplo, un sensor amperométrico de sensibilidad de gama baja) y el segundo sensor 610 puede configurarse como un inmunosensor magnético (por ejemplo, un sensor amperométrico de sensibilidad de gama alta), ambos se forman en el chip de sensor único 604 y se colocan dentro de uno o más conductos del cartucho de prueba del punto de atención. Aunque se muestra en la Figura 6B que el segundo sensor 610 se coloca aguas arriba del primer sensor 605, debe entenderse que modalidades alternativas de la presente invención contemplan tener el segundo sensor 610 colocado aguas abajo del primer sensor 605.

Como se ilustra en la Figura 6B, el primer sensor 605 puede construirse con una serie de discos metálicos o electrodos que recubren una región circular en una primera área del chip sensor 604 y el segundo sensor 610 puede construirse con una serie de discos metálicos o electrodos que recubren una región circular en una segunda área del chip sensor 604. El diseño y arreglo del primer y segundo sensores 605 y 610 en el chip sensor 604 se seleccionan preferentemente basándose en las características de impresión y rendimiento (por ejemplo, minimizar la diafonía entre los sensores) para cada uno del primer y segundo sensores 605 y 610. Sin embargo, los expertos en la técnica deben entender que se contempla cualquier diseño o arreglo de los sensores sin apartarse del espíritu y alcance de la presente invención. Además, aunque el primer y segundo sensores 605 y 610 en el Ejemplo de la Figura 6B se describen en la presente descripción como sensores amperométricos, pueden usarse otros procesos electroquímicos o procesos ópticos que usan otros sensores electroquímicos u ópticos, por ejemplo, puede usarse guías de ondas ópticas y chips de cámara de dispositivo acoplado por carga (CCD). Por ejemplo, puede usarse un sensor potenciométrico para detectar especies de iones como Na+ o K+.

Como se describió en la presente descripción, el primer y segundo sensores 605 y 610 pueden formarse como electrodos con superficies de oro que están expuestas (por ejemplo, sin cubierta de poliimida o fotorresistente) al entorno interior del conducto y configurados para contactar directamente con una muestra biológica dispuesta dentro del conducto. Los alambrados 615 y 620 pueden formarse con superficies de oro que están revestidas con una capa fotorresistente o de poliimida fotodefinida de manera que los alambrados 615 y 620 estén aislados de la exposición a la muestra biológica dispuesta dentro del conducto. Los cables 615 y 620 pueden formarse comprendiendo estructuras de anillo de contención 635 y 640. En algunas modalidades, la estructura de anillo de contención 635 para el primer sensor 605 puede configurarse para contener anticuerpos de captura inmovilizados sobre o cerca de la superficie de los electrodos. Por ejemplo, los anticuerpos de captura (como se describe en la presente descripción) pueden depositarse sobre al menos una porción del primer sensor 605 dentro de la estructura 635 del anillo de contención. Los cables 615 y 620 terminan en la primera clavija conductora 620 y la segunda clavija conductora 630 respectivamente, que se usan para hacer contacto con un conector en un analizador o lector de cartucho (por ejemplo, un lector de cartucho i-STAT® como se describió en la patente de Estados Unidos núm. 4,954,087).

En varias modalidades, el primer sensor 605 es un inmunosensor colocado en el conducto para recibir una muestra biológica mezclada con un conjugado anticuerpo-enzima que se configura para unirse a un analito diana dentro de la muestra biológica. El primer sensor 605 puede configurarse para detectar una especie electroactiva producida enzimáticamente (por ejemplo, 4-aminofenol) a partir de la reacción de un sustrato (por ejemplo, 4-aminofenilfosfato) con el conjugado anticuerpo-enzima (por ejemplo, uno o más anticuerpos unidos a la fosfatasa alcalina (ALP)). De acuerdo con estos aspectos, el primer sensor 605 contiene una región o regiones de captura recubiertas con anticuerpos 645 de captura que están configurados para unirse a un analito diana unido a un conjugado anticuerpo-enzima. La región de captura 645 puede definirse por la estructura de anillo de contención 635. En algunas modalidades, la estructura de anillo de contención 635 es un anillo hidrófobo de poliimida u otra capa producida fotolitográficamente. Una microgotita o varias microgotitas (de aproximadamente 5-40 nL de tamaño) que contienen anticuerpos de captura en alguna forma, por ejemplo, unidos a perlas o microesferas, pueden dispensarse sobre la superficie del primer sensor 605. La estructura anular fotodefinida 635 contiene esta gota acuosa que permite localizar la región de captura 645 con una precisión de unas pocas micras. La región de captura 645 puede hacerse desde 0,03 hasta aproximadamente 2 mm2 en tamaño. El extremo superior de este tamaño está limitado por el tamaño del conducto y del chip sensor 604 en las presentes modalidades, y no es una limitación de la invención.

En algunas modalidades, una porción del chip sensor 604 (por ejemplo, una superficie superior del sustrato), una pared del conducto (por ejemplo, el conducto 524 descrito con respecto a la Figura 5A) y/o una pared de la cámara de muestra (por ejemplo, la cámara de muestras 510 descrita con respecto a las Figuras 5G y 5H) puede recubrirse con uno o más reactivos secos para modificar la muestra biológica. Por ejemplo, el chip sensor 604 puede incluir una región del reactivo 650 recubierta con un conjugado anticuerpo-enzima para un analito de interés. La región del reactivo 650 puede definirse por una estructura de anillo de contención 655. En algunas modalidades, la estructura de anillo de contención 655 es un anillo hidrófobo de poliimida u otra capa producida fotolitográficamente. Una microgotita o varias microgotitas (aproximadamente de 5-40 nL de tamaño) o una serie de aproximadamente 100 nanogotas (aproximadamente de 50 a 1000 pL de tamaño) que contienen el conjugado anticuerpo-enzima de alguna forma pueden dispensarse o imprimir en la superficie del chip sensor 604. La estructura de anillo fotodefinida 655 contiene esta gota acuosa que permite localizar la región del reactivo 650 con una precisión de unas pocas micras. La región del reactivo 650 puede fabricarse desde 0,03 hasta aproximadamente 2 mm2 en tamaño. El extremo superior de este tamaño está limitado por el tamaño del conducto y del chip sensor 604 en las presentes modalidades, y no es una limitación de la invención.

La muestra biológica o un fluido puede pasarse al menos una vez sobre el reactivo seco, por ejemplo, la región del reactivo 650 para disolver el reactivo dentro de la muestra o fluido biológico. Los reactivos usados para modificar muestras biológicas o fluidos dentro del cartucho pueden incluir el conjugado anticuerpo-enzima, perlas magnéticas recubiertas con anticuerpos de captura o agentes bloqueantes que evitan reacciones de unión específicas o inespecíficas entre compuestos del ensayo. Dentro de un segmento de la muestra biológica o fluido, el reactivo puede disolverse y concentrarse preferentemente dentro de una región predeterminada del segmento. Esto se logra mediante el control de la posición y el movimiento del segmento. Así, por ejemplo, si sólo una porción de un segmento, tal como el borde delantero, se mueve alternativamente sobre el reactivo, entonces puede lograrse una alta concentración local del reactivo cerca del borde delantero. Alternativamente, si se desea una distribución homogénea del reactivo, por ejemplo, si se requiere una concentración conocida de un reactivo para un análisis cuantitativo, entonces un movimiento alternativo adicional de la muestra o fluido dará como resultado una mezcla y una distribución uniforme.

En las modalidades preferidas de la presente invención, el analizador aplica un potencial a través de la primera clavija conductora 620 al primer sensor 605 y un electrodo de referencia, y mide los cambios de corriente generados por la corriente de oxidación del sustrato como una señal electroquímica. La señal electroquímica es proporcional a la concentración del analito en la muestra biológica. El primer sensor 605 tiene un potencial aplicado de aproximadamente 0 mV a 90 mV, por ejemplo, 60 mV frente al electrodo de referencia y, en otra modalidad preferida, el primer sensor 605 tiene un potencial aplicado de aproximadamente 40 mV frente al electrodo de referencia. La señal generada por el producto de reacción de la enzima a aproximadamente 10 mV se distingue de la señal generada por el sustrato sin reaccionar a aproximadamente 200 mV. Se debe señalar que los voltajes exactos usados para detectar amperométricamente el sustrato y el analito variarán en dependencia de la estructura química del sustrato. Es importante que la diferencia en los voltajes usados para detectar el sustrato sea lo suficientemente grande como para evitar interferencias entre las lecturas.

En varias modalidades, el segundo sensor 610 es un inmunosensor magnético colocado en el conducto para recibir una muestra biológica mezclada con perlas que pueden ser atraídas por un imán o responder a un campo magnético. Las perlas se recubren con anticuerpos de captura que están configurados para unirse al analito diana unido al conjugado anticuerpo-enzima, por ejemplo, el conjugado anticuerpo-enzima dispuesto en la región de reactivo 650 y subsecuentemente disuelto en la muestra biológica. El segundo sensor 610 puede configurarse para detectar una especie electroactiva producida enzimáticamente (por ejemplo, 4-aminofenol) a partir de la reacción de un sustrato (por ejemplo, 4-aminofenilfosfato) con el conjugado anticuerpo-enzima (por ejemplo, uno o más anticuerpos unidos a la fosfatasa alcalina (ALP). De acuerdo con estos aspectos, un imán de alto campo, por ejemplo, un imán permanente o un electroimán, puede colocarse cerca del chip sensor 604 (por ejemplo, más abajo) o incorporarse en el chip sensor 604, para generar un campo magnético para atraer las perlas mezcladas con la muestra biológica en el conducto hasta una ubicación sustancialmente cerca del segundo sensor 610. El campo magnético se localiza alrededor del segundo sensor 610 basado en la distancia predeterminada "x" entre el primer sensor 605 y el segundo sensor 610, y funciona para retener sustancialmente las perlas en o cerca de la superficie del segundo sensor 610 durante la eliminación de la muestra no unida y el lavado de los electrodos.

El imán de campo alto de la presente invención puede incluir cualquier material que proporcione un campo magnético alto (por ejemplo, mayor de aproximadamente 0,1 Tesla, mayor de 0,4 Tesla o mayor de 1 Tesla). El campo magnético puede medirse, por ejemplo, como un campo remanente en un área superficial sustancialmente plana del imán. En algunas modalidades, el imán de campo alto está compuesto por un material como la aleación de neodimio hierro boro (NdFeB) (por ejemplo, Nd²FewB), o ferrita o aluminio-níquel cobalto (AlNiCo), que típicamente exhiben campos de más de 0,1 Tesla, por ejemplo, más de 0,5 Tesla o de 0,1 a 1 Tesla. En otras modalidades, el imán de campo alto está compuesto por aleaciones de elementos de tierras raras (por ejemplo, aleaciones de neodimio y aleaciones de samario cobalto (SmCo)), que exhiben campos de más de 0,1 Tesla, por ejemplo, más de 1,2 Tesla o más de 1.4 Tesla. En modalidades alternativas, el imán de campo alto comprende un electroimán en el que el campo magnético es producido por el flujo de corriente eléctrica. La corriente eléctrica puede ser proporcionada por un analizador, en el que se inserta el dispositivo sensor y con el que el dispositivo sensor está en contacto eléctrico.

El imán de campo alto puede proporcionarse cerca del chip sensor 604 (por ejemplo, más abajo) o incorporarse en el chip sensor 604 mediante el uso de varias técnicas como se describió en la presente descripción. En algunas modalidades, el segundo sensor 610 comprende un electrodo sensor sobre un sustrato sustancialmente plano y un imán permanente de campo alto a granel colocado cerca del electrodo (por ejemplo, más abajo o en el lado opuesto del chip sensor 604). En ciertas modalidades preferidas, el imán de campo alto permanente a granel se coloca en la carcasa (por ejemplo, un corte o una zanja en la zona rígida del cartucho) del dispositivo sensor. Por ejemplo, el imán de campo alto permanente a granel puede colocarse dentro de la base de la carcasa del cartucho (por ejemplo, no coplanar con el chip sensor). En otras modalidades, el imán de campo alto se coloca adyacente al analizador o dentro del mismo, en el que se inserta el dispositivo sensor. El imán permanente de campo alto a granel puede ser sustancialmente cilíndrico, con un diámetro en el intervalo de aproximadamente 0,1 mm a aproximadamente 5 mm y una longitud de aproximadamente 0,1 mm a aproximadamente 5 mm, y está posicionado para producir un "horizonte de eventos" (como se define en la presente descripción) en el conducto adecuado para la captura de perlas dentro de un período de tiempo corto (por ejemplo, 1-5 minutos). El conducto tiene generalmente una altura de aproximadamente 0,2 mm a aproximadamente 5 mm y un ancho de aproximadamente 0,2 mm a aproximadamente 5 mm, y un área de sección transversal uniforme o no uniforme. Alternativamente, la forma del imán a granel puede tener la forma de un cuadrado, rectángulo, óvalo, escamas, pirámide, esfera, subesfera u otra forma.

En modalidades alternativas, el segundo sensor 610 comprende un electrodo sensor sobre un sustrato sustancialmente plano y una capa magnetizada (por ejemplo, una capa magnética microfabricada). La capa magnetizada puede estar incluida (por ejemplo, colocada sobre, unida directamente, revestida o modelada sobre cualquier superficie del chip sensor 604) o incrustada en el chip (por ejemplo, colocada dentro del chip, integral al chip). Esta configuración atrae las perlas magnéticamente susceptibles sustancialmente próximas o sobre el electrodo sensor y las retiene sustancialmente en el electrodo sensor durante la extracción de la muestra no unida y el lavado del electrodo sensor.

La capa magnetizada puede ser un material compuesto formado a partir de un material magnético de partículas capaz de sostener un campo magnético permanente de campo alto, por ejemplo, una aleación de NdFeB, en un aglutinante o matriz de soporte (por ejemplo, una tinta termoendurecible, una poliimida, alcohol polivinílico (PVA) o termoplástico equivalente). Además de la tinta termoendurecible, poliimida, PVA y equivalentes termoplásticos, pueden usarse resinas epoxi de dos componentes curadas químicamente, kapton y similares como aglutinante para fijar el material magnético de partículas al chip sensor. En algunas modalidades, el aglutinante está compuesto por una tinta termoendurecible tal como una tinta de serigrafía encapsulante a base de solvente o un polímero de ácido acrílico en un solvente. En modalidades alternativas, el aglutinante se compone de otros materiales de matriz fotoformados. Los métodos de curado del material compuesto pueden basarse en un proceso fotoiniciado, térmicamente o químicamente iniciado. El material compuesto no está limitado por la viscosidad y puede incluir cualquier viscosidad adecuada para la aplicación. En algunas modalidades, el material compuesto tiene una viscosidad que varía de 0,3 a 300.000 CPS, por ejemplo, de 100 a 100.000 CPS o de 1.000 a 10.000 CPS. Las partículas magnéticas en el material compuesto de ciertas modalidades tienen un tamaño promedio de partícula de 0,01 pm a 100 pm, por ejemplo, de 0,1 pm a 10 pm o de 3 pm a 7 pm.

El material compuesto puede aplicarse en una variedad de ubicaciones en o sobre el dispositivo sensor (por ejemplo, en el lado frontal o trasero de una oblea o chip, electrodo, carcasa, lector, etc.). Por ejemplo, en algunas modalidades, el material compuesto se aplica al chip sensor de una manera modelada (por ejemplo, mediante el uso de una máscara). En otras modalidades, el material compuesto se aplica al electrodo sensor. En otras modalidades, el material compuesto se aplica en una capa magnetizada más abajo del electrodo sensor. Antes de la aplicación de la capa magnetizada, la capa magnetizada puede estar magnetizada o no. Sin embargo, después de la aplicación, la capa magnética preferentemente se magnetiza para proporcionar direccionalidad al campo magnético generado por la capa magnetizada.

En algunas modalidades, una porción del chip sensor 604 (por ejemplo, una superficie superior del sustrato), una pared del conducto (por ejemplo, el conducto 524 descrito con respecto a la Figura 5A) y/o una pared de la cámara de muestra (por ejemplo, la cámara de muestras 510 descrita con respecto a las Figuras 5G y 5H) puede recubrirse con uno o más reactivos secos para modificar la muestra biológica. Por ejemplo, el chip sensor 604 puede incluir una región del reactivo 660 recubierta con perlas magnéticas que tienen anticuerpos de captura para un analito de interés. La región del reactivo 660 puede definirse por una estructura de anillo de contención 665. En algunas modalidades, la estructura de anillo de contención 665 es un anillo hidrófobo de poliimida u otra capa producida fotolitográficamente. Una microgotita o varias microgotitas (de aproximadamente 5-40 nL de tamaño) que contienen el conjugado anticuerpo-enzima de alguna forma pueden dispensarse o imprimir en la superficie del chip sensor 604. La estructura de anillo fotodefinida 665 contiene esta gota acuosa que permite localizar la región del reactivo 660 con una precisión de unas pocas micras. La región del reactivo 665 puede fabricarse desde 0,03 hasta aproximadamente 2 mm2 en tamaño. El extremo superior de este tamaño está limitado por el tamaño del conducto y del chip sensor 604 en las presentes modalidades, y no es una limitación de la invención. Aunque se muestra en la Figura 6B que la región del reactivo 660 se coloca aguas arriba de la región del reactivo 650, debe entenderse que modalidades alternativas de la presente invención contemplan tener la región del reactivo 660 colocada aguas abajo de la región del reactivo 650.

La muestra biológica o un fluido puede pasarse al menos una vez sobre el reactivo seco, por ejemplo, la región del reactivo 660 para disolver el reactivo dentro de la muestra o fluido biológico. Los reactivos usados para modificar muestras biológicas o fluidos dentro del cartucho pueden incluir el conjugado anticuerpo-enzima, perlas magnéticas recubiertas con anticuerpos de captura o agentes bloqueantes que evitan reacciones de unión específicas o inespecíficas entre compuestos del ensayo. Dentro de un segmento de la muestra biológica o fluido, el reactivo puede disolverse y concentrarse preferentemente dentro de una región predeterminada del segmento. Esto se logra mediante el control de la posición y el movimiento del segmento. Así, por ejemplo, si sólo una porción de un segmento, tal como el borde delantero, se mueve alternativamente sobre el reactivo, entonces puede lograrse una alta concentración local del reactivo cerca del borde delantero. Alternativamente, si se desea una distribución homogénea del reactivo, por ejemplo, si se requiere una concentración conocida de un reactivo para un análisis cuantitativo, entonces un movimiento alternativo adicional de la muestra o fluido dará como resultado una mezcla y una distribución uniforme.

En las modalidades preferidas de la presente invención, el analizador aplica un potencial a través de la segunda clavija conductora 630 al segundo sensor 610 y un electrodo de referencia, y mide los cambios de corriente generados por la corriente de oxidación del sustrato como una señal electroquímica. La señal electroquímica es proporcional a la concentración del analito en la muestra biológica. El segundo sensor 610 tiene un potencial aplicado de aproximadamente 0 mV a 90 mV, por ejemplo, 60 mV frente al electrodo de referencia y, en otra modalidad preferida, el primer sensor 605 tiene un potencial aplicado de aproximadamente 40 mV frente al electrodo de referencia. La señal generada por el producto de reacción de la enzima a aproximadamente 10 mV se distingue de la señal generada por el sustrato sin reaccionar a aproximadamente 200 mV. Se debe señalar que los voltajes exactos usados para detectar amperométricamente el sustrato y el analito variarán en dependencia de la estructura química del sustrato. Es importante que la diferencia en los voltajes usados para detectar el sustrato sea lo suficientemente grande como para evitar interferencias entre las lecturas.

En algunas modalidades, el chip sensor 604 puede incluir además un sensor conductimétrico 670 (por ejemplo, sensores de hematocrito). El sensor conductimétrico 670 se configura para determinar la llegada y/o salida de la muestra biológica en las regiones del reactivo 650 y 660 y la llegada y/o salida de la muestra biológica en el primer y segundo sensores 605 y 610. Más específicamente, el sensor conductimétrico 670 se encuentra perpendicular a una longitud del conducto o conducto del sensor, y puede usarse una resistencia eléctrica entre pares de electrodos para el sensor para monitorear una posición relativa de un fluido frontal de la muestra biológica. En los extremos, una lectura de circuito abierto indica que la muestra biológica ha sido expulsada de las regiones del reactivo 650 y 660 y una lectura de circuito cerrado indica que las regiones del reactivo 650 y 660 están recubiertas con la muestra biológica.

Como se muestra en la Figura 6B, el sensor conductimétrico 670 puede comprender al menos dos electrodos 675 y 680 (es decir, un par de electrodos) situados aguas abajo del primer y segundo sensores 605 y 610. Los electrodos 675 y 680 pueden conectarse a través de los cables 685 y 690 a una patilla baja conductimétrica 692 y una fuente de CA o patilla conductimétrica alta 695, respectivamente (por ejemplo, conectores eléctricos temporales). Los alambres 685 y 690 pueden formarse con una superficie dorada que está revestida con una capa fotorresistente o de poliimida fotodefinida de manera que los alambres 685 y 690 estén aislados de la exposición a la muestra biológica dispuesta dentro de los conductos. Como tal, en algunas modalidades, la muestra biológica o el fluido alcanza el par de electrodos en un conducto (por ejemplo, antes de llegar al primer y segundo sensores 605 y 610), luego llega subsecuentemente al primer y segundo sensores 605 y 610 (por ejemplo, después de salir de las regiones reactivas 650 y 660).

Como se muestra en la Figura 7, en modalidades alternativas, un chip sensor 700 microfabricado incluye un primer sensor 705 (por ejemplo, un sensor amperométrico de sensibilidad de gama baja) y opcionalmente un segundo sensor 710 (por ejemplo, un sensor amperométrico de sensibilidad de gama alta), como se describe de manera similar con respecto a la Figura 6B. Sin embargo, como se ilustra en la Figura 7, el primer sensor 705 puede construirse con una serie de discos metálicos o electrodos que recubren una región circular en una primera área del chip sensor 700 y el segundo sensor 710 puede construirse con una serie de discos metálicos o electrodos que recubren un región cuadrada o alargada 715 en una segunda área del chip sensor 700. La región cuadrada o alargada 715 en una segunda área del chip sensor 700 proporciona un área de superficie más grande para que el imán o campo magnético capture las perlas recubiertas con anticuerpos de captura dispersos con la muestra biológica, a medida que la muestra biológica pasa a través del conducto sobre los sensores. Como debe entenderse, el chip sensor microfabricado 700 puede incluir una o más de las mismas características adicionales tales como las regiones reactivas y el sensor conductimétrico como se describe con respecto al chip sensor 604 y la Figura 6B.

Como se muestra en las Figuras 8A y 8B, en otras modalidades diseñadas para reducir la diafonía entre los dos sensores, se proporciona un chip sensor de intervalo extendido microfabricado 800 (por ejemplo, al menos un chip sensor 415 descrito con respecto a la Figura 4) que comprende un par de sensores que comprenden un primer sensor (por ejemplo, un sensor de sensibilidad de gama baja) y un segundo sensor (por ejemplo, un sensor de sensibilidad de gama alta) con un electrodo de barrido proporcionado entre los sensores. En algunas modalidades, el primer y segundo sensores pueden fabricarse como estructuras adyacentes, respectivamente, en un chip de silicio. Sin embargo, para que el chip sensor de intervalo extendido determine concentraciones precisas de analito, el sensor de sensibilidad de gama baja puede estar suficientemente aislado del sensor de sensibilidad de gama alta. Por ejemplo, a concentraciones bajas a medias de analito, el sensor de sensibilidad de gama alta puede generar una señal amperométrica alta debido a la alta concentración del reactivo marcador que se une a las perlas magnéticas recubiertas de anticuerpo. En modalidades en las que el reactivo marcador usa una enzima para escindir un sustrato generando una especie electroactiva, la alta concentración de especies electroactivas en el sensor de sensibilidad de gama alta puede moverse a lo largo del chip sensor y generar una señal amperométrica en el sensor de sensibilidad de gama baja. Alternativamente, la baja concentración de especies electroactivas en el sensor de sensibilidad de gama baja también podría moverse a lo largo del chip del sensor y generar una señal amperométrica en el sensor de sensibilidad de gama alta. La magnitud de esta diafonía entre los sensores depende de muchos factores y puede mostrar variabilidad entre las ejecuciones del dispositivo sensor, lo que provoca una imprecisión mayor en la lectura amperométrica del sensor de sensibilidad de gama baja y/o el sensor de sensibilidad de gama alta. En consecuencia, puede ser beneficioso en determinadas circunstancias reducir la diafonía entre los dos sensores en el chip sensor de intervalo extendido mediante el uso de un electrodo de barrido.

El chip sensor 800 microfabricado incluye un primer sensor 805 (por ejemplo, un sensor amperométrico de sensibilidad de gama baja) y un segundo sensor 810 (por ejemplo, un sensor amperométrico de sensibilidad de gama alta), como se describe de manera similar con respecto a la Figura 6B. Sin embargo, el primer sensor 805 y el segundo sensor 810 están separados entre sí a una distancia "y" aumentada en comparación con el chip sensor 604 mostrado en la Figura 6B. Por ejemplo, el primer sensor 805 puede estar espaciado al menos 0,2 mm, preferentemente al menos 0,5 mm del segundo sensor 810. El primer sensor 805 puede conectarse mediante cableado 815 a un primer pin conductor 820 (por ejemplo, conector eléctrico temporal) y el segundo sensor 810 puede conectarse mediante cableado 825 a un segundo pin conductor 830 (por ejemplo, conector eléctrico temporal). En algunas modalidades, el primer sensor 805 puede configurarse como un inmunosensor (por ejemplo, un sensor amperométrico de sensibilidad de gama baja) y el segundo sensor 810 puede configurarse como un inmunosensor magnético (por ejemplo, un sensor amperométrico de sensibilidad de gama alta), ambos se forman en el chip de sensor único 800 y se colocan dentro de uno o más conductos del cartucho de prueba del punto de atención.

Como se muestra en las Figuras 8A y 8B, la separación "y" aumentada entre el primer sensor 805 y el segundo sensor 810 permite colocar un electrodo de barrido 835 entre el primer sensor 805 y el segundo sensor 810. Específicamente, el diseño y el arreglo del primer y segundo sensores 805 y 810 en el chip sensor 800 se seleccionan para permitir la adición del electrodo de barrido 835 entre el primer sensor 805 y el segundo sensor 810. El electrodo eliminador 835 se configura para oxidar las especies electroactivas generadas en el segundo sensor 810 de manera que las señales altas en el segundo sensor 810 no den como resultado una diafonía significativa en el primer sensor 805 y/o señales bajas en el primer sensor 805 no resulten en diafonía significativa en el segundo sensor 810. Por ejemplo, el electrodo de barrido se configura para (i) evitar que las especies electroactivas generadas en una región del segundo sensor se difundan al primer sensor, (ii) evitar que las especies electroactivas generadas en una región del segundo sensor sean transportadas al primero sensor, (iii) evitar que las especies electroactivas generadas en una región del segundo sensor se detecten en el primer sensor, (iv) evitar que las especies electroactivas generadas en una región del primer sensor se difundan al segundo sensor, (v) evitar que las especies electroactivas las generadas en una región del primer sensor sean transportadas al segundo sensor, y/o (vi) evitar que las especies electroactivas generadas en una región del primer sensor sean detectadas en el segundo sensor.

En algunas modalidades, como se muestra en la Figura 8A, el electrodo de barrido 835 está conectado mediante el cableado 840 al segundo sensor 810. En modalidades alternativas, como se muestra en la Figura 8B, el electrodo de barrido 1735 está conectado mediante el cableado 845 a una clavija baja conductimétrica 850 (por ejemplo, conector eléctrico temporal para el sensor de conductividad). Ambas configuraciones del electrodo de barrido 835 se diseñan para minimizar la diafonía mientras dan como resultado un impacto bajo en la señal generada en el segundo sensor 810 y la señal generada en el primer sensor 805. Como debe entenderse, el chip sensor microfabricado 800 puede incluir una o más de las mismas características adicionales tales como las regiones reactivas y el sensor conductimétrico como se describe con respecto al chip sensor 604 y la Figura 6B.

Configuraciones de inmunosensores magnéticos

Las Figuras 9A a 9C muestran tres modalidades ilustrativas de un inmunosensor magnético (por ejemplo, un sensor amperométrico de alta sensibilidad 610 como se describió con respecto a la Figura 6B) donde el componente magnético se integra directamente en la base o carcasa del cartucho del dispositivo sensor. En cada modalidad mostrada en las Figuras 9A a 9C, el chip sensor 900 incluye un inmunosensor 905 dispuesto en un conducto 910 y colocado sobre una superficie de un sustrato 915 por encima de un imán 920 de alto campo. El imán de campo alto 920 puede ser cilíndrico con una longitud de 1 mm a 10 mm, por ejemplo, de 2 mm a 5 mm, preferentemente aproximadamente 3 mm, y un diámetro de 0,1 mm a 5 mm, por ejemplo, de 0,5 mm hasta 2 mm. En las Figuras 9A a 9C, el imán de campo alto 920 tiene diámetros de aproximadamente 1 mm, aproximadamente 0,5 mm y aproximadamente 0,3 mm, respectivamente. El imán de campo alto 920 está dentro de la base o carcasa del cartucho 925 (por ejemplo, una porción inferior o base 504 como se describió con respecto a las Figuras 5A a 5J) del dispositivo sensor y opcionalmente se apoya en la parte inferior del chip sensor 900, que preferentemente tiene un grosor de aproximadamente 0,2 mm a 5 mm, por ejemplo, de 0,5 mm a 2 mm o preferentemente aproximadamente 1 mm. De acuerdo con estos aspectos, un imán de campo alto, por ejemplo, un imán permanente o un electroimán, puede colocarse cerca del chip sensor 900 (por ejemplo, debajo), para atraer perlas magnéticamente susceptibles en el conducto sustancialmente cerca de o sobre el sensor 905.

Como se muestra en la Figura 10, un dispositivo 1000 para detectar un analito en una muestra biológica de acuerdo con algunos aspectos de la presente invención comprende un sustrato 1005 que incluye una superficie plana superior e inferior 1010, 1015, un primer sensor electroquímico 1020 (por ejemplo, un sensor amperométrico de sensibilidad de gama baja) colocado en la superficie superior 1010 del sustrato 1005, y un segundo sensor electroquímico 1025 (por ejemplo, un sensor amperométrico de sensibilidad de gama alta) colocado en la superficie superior 1010 del sustrato 1005 y adyacente al primer sensor electroquímico 1020. En algunas modalidades, el sustrato 1005 está dispuesto dentro de un conducto 1027 del dispositivo 1000. El sustrato 1005 puede comprender un material base seleccionado del grupo que consiste en silicio, vidrio y plástico. El primer sensor electroquímico 1020 puede incluir una capa inmovilizada de anticuerpo 1030 configurada para unirse a un analito tal como cTnI. El primer sensor electroquímico 1020 y el segundo sensor electroquímico 1025 pueden comprender un electrodo de micromatriz de oro y tener un diámetro de aproximadamente 100 pm a aproximadamente 500 pm o de aproximadamente 200 pm a aproximadamente 1500 pm.

El dispositivo 1000 incluye además (i) una primera región del reactivo 1035 en el sustrato 1005 recubierto con un conjugado anticuerpo-enzima para el analito, y/o (ii) una segunda región del reactivo 1040 en el sustrato 1005 recubierto con perlas magnéticas que tienen anticuerpos de captura para el analito. Las regiones del reactivo 1035, 1040 pueden definirse por una estructura de anillo de contención 1045, 1050, respectivamente. En otras modalidades, las regiones del reactivo 1035, 1040 pueden ubicarse en el conducto 1027 (por ejemplo, el conducto 524 descrito con respecto a la Figura 5A), y/o en la cámara de muestra (por ejemplo, la cámara de muestra 510 descrita con respecto a Figuras 5G y 5H).

El dispositivo 1000 incluye además una carcasa 1055 que soporta el sustrato 1005. La carcasa 1055 tiene una abertura o zanja 1060 que se extiende hasta una región 1065 en la carcasa más abajo del segundo sensor electroquímico 1025. La abertura o zanja 1060 comprende un imán 1070 de campo alto (por ejemplo, un imán de campo alto permanente a granel) que opcionalmente se apoya en la superficie inferior plana 1015 del sustrato 1005. El imán de campo alto 1070 tiene una forma (por ejemplo, una forma que es sustancialmente triangular, trapezoide, columna, rectángulo, cuadrado, circular, pirámide, etc.) (sustancialmente en este contexto los expertos en la técnica entenderían qué significa que visualmente la forma es en general triangular, trapezoidal, columna, rectángulo, cuadrado, circular, pirámide, etc.)que encaja dentro de la abertura o zanja 1060. Además, el imán de campo alto 1070 genera un campo magnético 1075 que está alineado (por ejemplo, en un mismo plano vertical) con respecto al segundo sensor electroquímico 1025 y/u ortogonal a un plano horizontal de la superficie superior 1010 del sustrato 1005. El campo magnético 1075 se configura para enfocar y atraer las perlas magnéticas sobre una superficie del segundo sensor electroquímico 1025 una vez que las perlas magnéticas se mezclan con la muestra biológica.

En modalidades alternativas, se proporciona un inmunosensor magnético (por ejemplo, un sensor amperométrico 610 de sensibilidad de gama alta como se describe con respecto a la Figura 6B) donde el componente magnético se integra directamente en la fabricación del sensor, en lugar de ser un componente separado (por ejemplo, imán permanente de campo alto a granel) que requiere ensamblaje en la base o carcasa del cartucho del dispositivo sensor. La capa magnetizada puede formarse a partir de un material compuesto, por ejemplo, suspensión, que comprende un material magnético de partículas capaz de mantener un campo magnético permanente de campo alto, por ejemplo, una aleación de NdFeB, en un aglutinante o matriz de soporte (por ejemplo, una poliimida, alcohol polivinílico (PVA) o termoplástico equivalente). En una modalidad, una mezcla de alcohol polivinílico fotoconformable (PVA) mezclado con polvo de Nd2Fe14B molido se imprime en una oblea mediante el uso de un aparato de microdispensación del tipo descrito en la patente de Estados Unidos núm. 5,554,339. El área impresa puede tener un diámetro de aproximadamente 400 pm, o de 200 a 600 pm. Las Figuras 11A y 11B muestran inmunosensores ilustrativos 1100 recubiertos parcialmente con una matriz 1105 de partículas de poliimida y NdFeB impresas, dejando expuesta una porción 1110 del perímetro de los inmunosensores magnéticos.

En otra modalidad, la suspensión de partículas magnetizables (por ejemplo, polvo molido de Nd2Fe14B) se deposita en una zanja dentro del sustrato no conductor o la oblea del chip sensor microfabricado. La Figura 12 ilustra el proceso de formación de zanjas que comprende grabar inicialmente un sustrato 1200 no conductor (por ejemplo, una oblea de silicio) que tiene un recubrimiento superficial del fotorresistente 1205 con ácido fluorhídrico (HF) y luego grabar el sustrato con hidróxido de potasio (KOH) caliente o hidróxido de trimetilamonio (TMAH) para dejar una zanja 1210 de perfil controlado (por ejemplo, una forma que es sustancialmente triangular, trapezoidal, columna, rectángulo, cuadrado, circular, pirámide, etc.) (sustancialmente en este contexto lo entenderían por los expertos en la técnica que significa que visualmente la forma es en general triangular, trapezoidal, columna, rectángulo, cuadrado, circular, pirámide, etc.)y dimensiones (por ejemplo, una profundidad y ancho de aproximadamente 5 pm a aproximadamente 600 pm). Una suspensión de partículas magnetizables (por ejemplo, polvo de aleación de NdFeB) en una matriz termoplástica (por ejemplo, poliimida) se microdispensa 1215 o se recubre por rotación 1220 en la zanja 1210 para formar una capa magnetizada 1225 que tiene una superficie sustancialmente plana coplanar con el sustrato 1200. El sustrato 1200 puede procesarse adicionalmente, como se describió en propiedad conjunta en las patentes de Estados Unidos núms. 7,419,821 y 7,723,099 para proporcionar una serie de inmunosensores 1230 sobre cada zanja grabada 1210 en el sustrato 1200. La serie de inmunosensores 1230 puede depositarse directamente sobre la capa magnetizada 1225 como se muestra en (a) o sobre la capa magnetizada 1225 como se muestra en (b).

Como se muestra en la Figura 13, un dispositivo 1300 para detectar un analito en una muestra biológica de acuerdo con algunos aspectos de la presente invención comprende un sustrato 1305 que incluye una superficie plana superior e inferior 1310, 1315, un primer sensor electroquímico 1320 (por ejemplo, un sensor amperométrico de sensibilidad de gama baja) colocado en la superficie superior 1310 del sustrato 1305, y un segundo sensor electroquímico 1325 (por ejemplo, un sensor amperométrico de sensibilidad de gama alta) colocado en la superficie superior 1310 del sustrato 1305 y adyacente al primer sensor electroquímico 1320. En algunas modalidades, el sustrato 1305 está dispuesto dentro de un conducto 1327 del dispositivo 1000. El sustrato 1305 puede comprender un material base seleccionado del grupo que consiste en silicio, vidrio y plástico. El primer sensor electroquímico 1320 puede incluir una capa inmovilizada de anticuerpo 1330 configurada para unirse a un anticuerpo tal como el cTnI. El primer sensor electroquímico 1320 y el segundo sensor electroquímico 1325 pueden comprender un electrodo de micromatriz de oro y tener un diámetro de aproximadamente 100 pm a aproximadamente 500 pm o de aproximadamente 200 pm a aproximadamente 1500 pm.

El dispositivo 1300 incluye además (i) una primera región del reactivo 1335 en el sustrato 1305 recubierto con un conjugado anticuerpo-enzima para el analito, y/o (ii) una segunda región del reactivo 1340 en el sustrato 1005 recubierto con perlas magnéticas que tienen anticuerpos de captura para el analito. Las regiones del reactivo 1335, 1340 pueden definirse por una estructura de anillo de contención 1345, 1350, respectivamente. En otras modalidades, las regiones del reactivo 1335, 1340 pueden ubicarse en el conducto 1327 (por ejemplo, el conducto 524 descrito con respecto a la Figura 5A), y/o en la cámara de muestra (por ejemplo, la cámara de muestra 510 descrita con respecto a Figuras 5G y 5H).

El dispositivo 1300 incluye además una abertura o zanja 1355 en la superficie inferior 1315 del sustrato que se extiende hasta una región 1360 en el sustrato 1305 más abajo del segundo sensor electroquímico 1325. La abertura o zanja 1355 comprende un material compuesto 1365 que incluye un aglutinante (por ejemplo, el aglutinante está compuesto de poliimida o alcohol polivinílico) y un material magnético en partículas (por ejemplo, el material magnético en partículas está compuesto de la aleación de neodimio hierro boro (NdFeB) o la aleación de aluminio níquel cobalto (AlNiCo)) que opcionalmente rellena la abertura o zanja 1355. El material compuesto 1365 se configura para tomar la forma de la abertura o zanja 1355 (por ejemplo, una forma que es sustancialmente triangular, trapezoidal, columna, rectángulo, cuadrado, circular, pirámide, etc. (sustancialmente en este contexto se entendería por los expertos en la técnica que significa que visualmente la forma es en general triangular, trapezoidal, en columna, rectángulo, cuadrado, circular, pirámide, etc.).

En algunas modalidades, una forma de la abertura o zanja 1355 incluye una sección transversal sustancialmente triangular, una base 1370 de la sección transversal sustancialmente triangular es coplanar con la superficie inferior 1315 del sustrato 1305, y un vértice 1375 de la sección transversal sustancialmente triangular que está más abajo del segundo sensor electroquímico 1325. La abertura o zanja 1355 puede tener un diámetro de aproximadamente 200 pm a aproximadamente 1500 pm, por ejemplo, de 500 pm a 1000 pm. La forma de la sección transversal sustancialmente triangular de la abertura puede seleccionarse del grupo que consiste en: un cono, una pirámide, un tetraedro, un polígono de forma cónica y una zanja en forma de V. La sección transversal sustancialmente triangular puede extenderse a través de al menos el 75 %, 90 % o 95 % de una distancia desde la superficie inferior 1315 hasta la superficie superior 1310 del sustrato 1305. El material compuesto 1365 genera un campo magnético 1380 que está alineado (por ejemplo, en un mismo plano vertical) con respecto al segundo sensor electroquímico 1325 y/u ortogonal a un plano horizontal de la superficie superior 1310 del sustrato 1305. El campo magnético 1380 se configura para enfocar y atraer las perlas magnéticas sobre una superficie del segundo sensor electroquímico 1325 una vez que las perlas magnéticas se mezclan con la muestra biológica.

Métodos de inmunoensayo combinados

Las Figuras 14-17 muestran diagramas de flujo ilustrativos para realizar las etapas del proceso de la presente invención. Las etapas de las Figuras 14-17 pueden implementarse mediante el uso de los dispositivos y sistemas informáticos descritos anteriormente con respecto a las Figuras 1-13. Específicamente, los diagramas de flujo de las Figuras 14-17 ilustran la arquitectura, la funcionalidad y operación de posibles implementaciones de los sistemas, métodos y productos de programas de computadoras de acuerdo con varias modalidades de la presente invención. Con respecto a esto, cada bloque en los diagramas de flujo puede representar un módulo, segmento o porción de un código, que comprende una o más instrucciones ejecutables almacenadas en un medio de almacenamiento no transitorio legible por máquina que cuando se ejecuta por uno o más procesadores (por ejemplo, un procesador del analizador) hacen que uno o más procesadores realicen las funciones lógicas especificadas dentro de una o más instrucciones ejecutables. También debe tenerse en cuenta que, en algunas implementaciones alternativas, las funciones indicadas en los bloques pueden ocurrir fuera del orden indicado en la figura. Por ejemplo, dos bloques mostrados en sucesión pueden, de hecho, ejecutarse sustancialmente simultáneamente, o los bloques pueden ejecutarse a veces en el orden inverso, dependiendo de la funcionalidad involucrada. También se observará que cada bloque de las ilustraciones del diagrama de flujo y las combinaciones de los bloques en las ilustraciones del diagrama de flujo pueden implementarse mediante sistemas basados en hardware de propósito especial que realizan las funciones o actos especificados, o combinaciones de instrucciones de computadora y hardware de propósito especial.

La Figura 14 ilustra un método 1400 (con referencia al dispositivo de detección 500 como se ilustra en las Figuras 5A a 5J) de uso de un dispositivo de detección de acuerdo con una modalidad de la invención. En la etapa 1405, puede introducirse una muestra biológica no medida en una cámara de muestra (por ejemplo, la cámara de muestra 510 descrita con respecto a las Figuras 5G y 5H) de un dispositivo sensor, a través de un puerto de entrada de muestra (por ejemplo, el puerto de entrada de muestra sellable 506 descrito con respecto a las Figuras 5B y 5C). En la etapa 1410, un tope capilar (por ejemplo, el tope capilar 512 descrito con respecto a las Figuras 5G y 5H) puede evitar el paso de la muestra a un primer conducto (por ejemplo, el conducto 531 descrito con respecto a la Figura 5A) en esta etapa, y la cámara de muestra se rellena con la muestra. El tope capilar al final de la cámara de muestra delimita una porción medida de la muestra biológica. En la etapa 1415, una tapa (por ejemplo, el miembro de sellado que puede cerrarse 508 descrito con respecto a las Figuras 5A y 5B) puede cerrarse para evitar la fuga de la muestra biológica fuera del dispositivo sensor. Mientras que la muestra biológica está dentro de la cámara de muestra, la muestra biológica puede enmendarse opcionalmente en la etapa 1420 con un compuesto o compuestos (por ejemplo, reactivos tales como perlas magnéticamente susceptibles recubiertas de anticuerpo y anticuerpo conjugado marcado con enzima) presentes inicialmente como un recubrimiento seco en la superficie interna de la cámara.

En la etapa 1425, el dispositivo de detección puede insertarse en un analizador (por ejemplo, el analizador 305 descrito con respecto a la Figura 3) de acuerdo con algunos aspectos de la presente invención. En la etapa 1430, la inserción del dispositivo sensor en el analizador puede activar una primera bomba (por ejemplo, la porción de la zona flexible 536 como se describió con respecto a las Figuras 5A y 5B) o un mecanismo que perfora un empaque que contiene líquido cuando el empaque se presiona contra una punta (por ejemplo, la punta 525 como se describió con respecto a las Figuras 5G y 5H). El fluido (por ejemplo, un sustrato) puede de esta manera expulsar a un segundo conducto (por ejemplo, el conducto 522 como se describió con respecto a las Figuras 5G y 5H) que está en comunicación fluídica con el primer conducto. Una constricción en el segundo conducto impide un movimiento mayor del fluido. En la etapa 1435, el funcionamiento de una segunda bomba (por ejemplo, la membrana desplazable 526 como se describió con respecto a las Figuras 5A, 5B, 5G y 5H) por el analizador aplica presión a una vejiga de aire del dispositivo sensor, forzando el aire a través de un tercer conducto (por ejemplo, el conducto 529 como se describió con respecto a las Figuras 5G y 5H) y dentro de la cámara de muestra en una ubicación predeterminada.

En la etapa 1440, la porción medida de la muestra biológica se expulsa a través del tope capilar mediante la presión de aire producida dentro de la cámara de aire en la etapa 1435 hacia el primer conducto. En la etapa 1445, la muestra biológica se mueve hacia adelante dentro del primer conducto a una porción del primer conducto (por ejemplo, el conducto 524 como se describió con respecto a la Figura 5A) que está expuesta a un chip sensor (por ejemplo, el chip sensor 604 como se describió con respecto a la figura 6B) por la presión de aire producida dentro de la cámara de aire. Opcionalmente, en la etapa 1450, la muestra biológica se modifica con un compuesto o compuestos (por ejemplo, reactivos tales como perlas magnéticamente susceptibles recubiertas de anticuerpo y conjugado de anticuerpo marcado con enzima) presentes inicialmente como un recubrimiento seco en una porción del chip sensor (es decir, una o más regiones reactivas). Para facilitar la disolución del compuesto o compuestos en la muestra biológica y/o promover la formación de sándwich eficiente en las perlas magnéticamente susceptibles, la muestra biológica puede oscilar sobre una o más regiones reactivas por presión de aire producida dentro de la vejiga de aire. En una modalidad, se usa una frecuencia de oscilación de entre aproximadamente 0,2 Hz y aproximadamente 5 Hz, con la máxima preferencia de aproximadamente 0,7 Hz. En la etapa 1455, la muestra biológica modificada se mueve hacia adelante dentro del primer conducto a una posición sobre un primer sensor (por ejemplo, un sensor amperométrico de sensibilidad de gama baja) y opcionalmente un segundo sensor (por ejemplo, un sensor amperométrico de sensibilidad de gama alta) mediante presión de aire producida dentro de la vejiga de aire. Opcionalmente, en la etapa 1460, para facilitar la captura de las perlas magnéticamente susceptibles dentro de un campo magnético en o cerca de una superficie del segundo sensor y/o promover una formación de sándwich eficiente en o cerca de la superficie del primer sensor que comprende una biocapa, la muestra biológica puede oscilarse sobre el primer y segundo sensores por la presión de aire producida dentro de la vejiga de aire. En una modalidad, se usa una frecuencia de oscilación de entre aproximadamente 0,2 Hz y aproximadamente 5 Hz, con la máxima preferencia de aproximadamente 0,7 Hz.

En la etapa 1465, la muestra biológica se desplaza del primer conducto aplicando presión adicional a la vejiga de aire, y la muestra biológica pasa a una cámara de desechos (por ejemplo, la cámara de desechos 516 como se describió con respecto a las Figuras 5A y 5G). En la etapa opcional 1470, pueden producirse uno o más segmentos de aire (menisco) dentro del primer conducto por cualquier medio adecuado, incluyendo un medio pasivo, cuya modalidad se describe en detalle en la patente de Estados Unidos núm. 7,682,833, o un medio activo que incluye una disminución transitoria de la presión dentro del primer conducto mediante el uso de la segunda bomba de manera que se aspira aire al primer conducto a través de una trampilla o válvula. El uno o más segmentos de aire son extremadamente efectivos para limpiar o enjuagar el fluido contaminado con muestra biológica del primer conducto. Por ejemplo, un borde anterior y/o posterior de uno o más segmentos de aire puede pasarse varias veces sobre el primer y segundo sensores para enjuagar y resuspender material extraño que pueda haberse depositado de la muestra biológica. El material extraño incluye cualquier material distinto del analito unido específicamente o del complejo conjugado analito/anticuerpo-enzima. Sin embargo, de acuerdo con varias modalidades, la etapa de aclarado o enjuague 1470 mediante el uso de uno o más segmentos de aire no es lo suficientemente prolongada o vigorosa como para promover la resuspensión sustancial de las perlas magnéticamente susceptibles o la disociación del analito o del complejo conjugado analito/anticuerpo-enzima unido específicamente a las perlas o la biocapa.

En la etapa 1475, el fluido en el segundo conducto se mueve más allá de la constricción hacia el primer conducto y entra en contacto con el primer y segundo sensores mediante la presión de aire producida por la primera bomba. El fluido puede incluir un sustrato o agente señal y la enzima que permanece dentro del primer conducto e inmovilizada en o cerca del primer y segundo sensores produce una especie electroactiva a partir de un sustrato electroinactivo o destruye un sustrato electroactivo. En algunas modalidades, el fluido puede aplicarse al primer inmunosensor y al segundo inmunosensor para lavar la muestra biológica de los primeros segundos sensores. Un cambio en la corriente o potencial generado por la producción o destrucción de las especies electroactivas en el primer y segundo sensores, según corresponda a la manera de funcionamiento del dispositivo sensor, se registra como una función del tiempo y determina la presencia de un analito diana en la muestra biológica.

La Figura 15 ilustra un método 1500 para realizar un inmunoensayo para determinar la concentración de un analito en una muestra biológica (por ejemplo, sangre completa) de acuerdo con una modalidad de la invención. En la etapa 1505, se disuelve un primer reactivo seco en la muestra biológica. El primer reactivo seco puede comprender un conjugado enzima-biomolécula (por ejemplo, anticuerpos de señal) configurado para unirse al analito tal como la troponina I (TnI) o la troponina I cardíaca (cTnI). El conjugado enzima-biomolécula incluye una enzima conjugada con biomoléculas seleccionadas para unirse al analito de interés. En la etapa 1510, se forma un primer complejo de los anticuerpos de señal y el analito en una primera fase líquida que comprende la muestra biológica. En la etapa 1515, se disuelve un segundo reactivo seco en la muestra biológica. El segundo reactivo seco puede comprender perlas magnéticas o microesferas recubiertas con biomoléculas de captura (por ejemplo, anticuerpos de captura inmovilizados en perlas magnéticas) configuradas para unirse al analito. En la etapa 1520, se forma un segundo complejo del primer complejo (por ejemplo, anticuerpos de señal unidos al analito) y los anticuerpos de captura inmovilizados en las perlas magnéticas en una segunda fase líquida que comprende la muestra biológica.

En la etapa 1525, la muestra biológica que comprende el primer complejo y el segundo complejo se pone en contacto con un primer inmunosensor. El primer inmunosensor comprende una biomolécula de captura (por ejemplo, perlas o microesferas de látex recubiertas con anticuerpos de captura) inmovilizada sobre o cerca de una superficie del primer inmunosensor. Los anticuerpos de captura están configurados para unirse al analito, para formar un tercer complejo localizado en o cerca de un límite de la fase sólida (por ejemplo, una superficie) del primer inmunosensor. El tercer complejo comprende el primer complejo (por ejemplo, anticuerpos de señal unidos al analito) y los anticuerpos de captura inmovilizados del primer inmunosensor. La localización o captura del analito en o cerca de una superficie del primer inmunosensor es el resultado de una reacción heterogénea que comprende la formación del primer complejo en la primera fase líquida y la formación del tercer complejo en o cerca del límite de la fase sólida. Por tanto, el primer inmunosensor puede reconocerse como un inmunosensor de captura de superficie heterogéneo.

En la etapa 1530, la muestra biológica que comprende el primer complejo y el segundo complejo se pone en contacto con un campo magnético localizado alrededor de un segundo inmunosensor. El campo magnético se configura para atraer las perlas magnéticas en la muestra biológica de manera que el segundo complejo del primer complejo (por ejemplo, anticuerpos de señal unidos al analito) y los anticuerpos de captura inmovilizados en perlas magnéticas se localizan en o cerca de una superficie del segundo inmunosensor. La localización o captura del analito en o cerca de una superficie del segundo inmunosensor es el resultado de una reacción homogénea que comprende la formación del primer complejo en la primera fase líquida y la formación del segundo complejo en la segunda fase líquida. Por tanto, el segundo inmunosensor puede reconocerse como un inmunosensor de captura de perlas magnéticas homogéneo.

En la etapa 1535, puede aplicarse un fluido (por ejemplo, un fluido de lavado) al primer inmunosensor y al segundo inmunosensor para lavar la muestra biológica del primer inmunosensor y el segundo inmunosensor. El fluido de lavado puede comprender un sustrato o agente señal (por ejemplo, una molécula fosforilada tal como 4-aminofenilfosfato). En la etapa 1540, se detecta y mide una primera señal en el primer inmunosensor a partir de una reacción del sustrato con el tercer complejo localizado en o cerca del primer inmunosensor. Por ejemplo, se detecta y mide una primera señal electroquímica a partir de la oxidación de una especie electroactiva producida enzimáticamente (por ejemplo, 4-aminofenol) en una superficie del primer inmunosensor. La especie electroactiva se produce enzimáticamente a partir de la reacción del sustrato con el conjugado enzima-biomolécula en el tercer complejo. En varias modalidades, el sustrato es una molécula fosforilada (por ejemplo, 4-aminofenilfosfato) configurada de manera que cuando el conjugado enzimabiomolécula elimina un resto fosfato (por ejemplo, uno o más anticuerpos unidos a la fosfatasa alcalina), la molécula se vuelve electroactiva. En la etapa 1545, se detecta y mide una segunda señal en el segundo inmunosensor a partir de una reacción del sustrato con el segundo complejo localizado en o cerca del segundo inmunosensor. Por ejemplo, se detecta y mide una segunda señal electroquímica a partir de la oxidación de una especie electroactiva producida enzimáticamente (por ejemplo, 4-aminofenol) en una superficie del segundo inmunosensor. La especie electroactiva se produce enzimáticamente a partir de la reacción del sustrato (por ejemplo, 4-aminofenilfosfato) con el conjugado enzimabiomolécula (por ejemplo, uno o más anticuerpos unidos a la fosfatasa alcalina) en el segundo complejo.

En la etapa 1550, se determina una concentración del analito en la muestra biológica a partir de al menos una de la primera señal y la segunda señal. En algunas modalidades, el primer inmunosensor se configura para generar la primera señal como indicativo de una concentración del analito en un primer intervalo (por ejemplo, un intervalo de concentración superior que es mayor que un intervalo de concentración inferior) a partir de una reacción del sustrato con el tercer complejo, mientras que el segundo inmunosensor se configura para generar la segunda señal como indicativo de una concentración del analito en un segundo intervalo (por ejemplo, un intervalo de concentración más bajo que es menor que un intervalo de concentración superior) a partir de una reacción del sustrato con el segundo complejo.

En otras modalidades en las que el analito es la troponina cardíaca, el primer inmunosensor se configura para generar la primera señal como indicativo de una concentración de la concentración de troponina cardíaca en un primer intervalo por encima de aproximadamente 1000 pg/mL a partir de una reacción del sustrato con el tercer complejo, mientras que el segundo inmunosensor se configura para generar la segunda señal como indicativo de una concentración de la concentración de troponina cardíaca en un segundo intervalo de aproximadamente 0 a aproximadamente 1000 pg/mL a partir de una reacción del sustrato con el segundo complejo (donde aproximadamente es /- 10 pg/mL alrededor del punto final de cada intervalo). Como tal, el primer inmunosensor determina la concentración de la troponina cardíaca en un primer intervalo por encima de aproximadamente 1000 pg/mL basado en la primera señal, y el segundo inmunosensor determina la concentración de la troponina cardíaca en un segundo intervalo de aproximadamente 0 a aproximadamente 1000 pg/mL basado en la segunda señal. En modalidades alternativas, el primer intervalo está por encima de 2000 pg/mL, el segundo intervalo es de 0 a 250 pg/mL, y la primera señal y la segunda señal en combinación (por ejemplo, un promedio ponderado) son indicativos de la concentración de la concentración de la troponina cardíaca en un intervalo de 250 a 2000 pg/mL (donde aproximadamente es /- 10 pg/mL alrededor del punto final de cada intervalo). El promedio puede ponderarse en función de uno o más factores, incluida la proximidad de los resultados calculados a los puntos de cruce superior e inferior definidos, la idealidad de la forma del gráfico de corriente versus tiempo del sensor y la detección de una condición de error en uno de los sensores. Como tal, el primer inmunosensor determina la concentración de la troponina cardíaca en un primer intervalo por encima de aproximadamente 2000 pg/mL basado en la primera señal, el segundo inmunosensor determina la concentración de la troponina cardíaca en un segundo intervalo de aproximadamente 0 a aproximadamente 250 pg/mL basado en la segunda señal, y una combinación del primer inmunosensor y el segundo inmunosensor determina la concentración de la troponina cardíaca en un tercer intervalo de aproximadamente 250 a aproximadamente 2000 pg/mL basado en la primera señal y la segunda señal.

El intervalo de concentración más bajo (por ejemplo de aproximadamente 0 a aproximadamente 250 pg/mL) puede controlarse mediante un período de tiempo entre la disolución de las perlas magnéticas en la muestra y la captura magnética de las perlas magnéticas en o cerca del inmunosensor de captura de perlas magnéticas homogéneo. En varias modalidades, la duración del tiempo es de entre 1 y 20 minutos, preferentemente entre 5 y 10 minutos. El intervalo de concentración más bajo puede controlarse adicionalmente mediante una concentración disuelta de las perlas magnéticas en la muestra. En algunas modalidades, la concentración disuelta de las perlas magnéticas en la muestra está en un intervalo de aproximadamente 10000 a 200000 perlas por microlitro, preferentemente entre 10000 y 40 000 perlas por microlitro. El intervalo de concentración más bajo puede controlarse adicionalmente por una afinidad de cada uno de los anticuerpos de señal, una avidez de cada uno de los anticuerpos de señal, una afinidad de cada uno de los anticuerpos de captura inmovilizados en la superficie de las perlas magnéticas y/o una avidez de cada uno de los anticuerpos de captura inmovilizados en la superficie de las perlas magnéticas. En algunas modalidades, la afinidad de cada uno de los anticuerpos de señal está en un intervalo de aproximadamente 1 x 107 a aproximadamente 1 x 1013 M-1, preferentemente en un intervalo de aproximadamente 1 x 1010 a aproximadamente 1 x 1013 M-1. En algunas modalidades, la avidez de cada uno de los anticuerpos de señal está en un intervalo de aproximadamente 1 x 107 a aproximadamente 1 x 1013 M-1, preferentemente en un intervalo de aproximadamente 1 x 1010 a aproximadamente 1 x 1013 M-1. En algunas modalidades, la afinidad de cada uno de los anticuerpos de captura inmovilizados en la superficie de las perlas magnéticas está en un intervalo de aproximadamente 1 x 107 a aproximadamente 1 x 1013 M-1, preferentemente en un intervalo de aproximadamente 1 x 1010 a aproximadamente 1 x 1013 M-1. En algunas modalidades, la avidez de cada uno de los anticuerpos de captura inmovilizados en la superficie de las perlas magnéticas está en un intervalo de aproximadamente 1 x 107 a aproximadamente 1 x 1013 M-1, preferentemente en un intervalo de aproximadamente 1 x 1010 a aproximadamente 1 x 1013 M-1. Como debe entenderse, el intervalo de concentración más bajo (por ejemplo, de aproximadamente 0 a aproximadamente 250 pg/mL) puede controlarse mediante cualquier número de los factores antes mencionados solos o en combinación, por ejemplo, el intervalo de concentración más bajo puede controlarse por al menos uno de la duración del tiempo entre la disolución de las perlas magnéticas en la muestra y la captura magnética de las perlas magnéticas en o cerca del inmunosensor de captura de perlas magnéticas homogéneo, una afinidad de cada uno de los anticuerpos de señal, una avidez de cada uno de los anticuerpos de señal, una concentración de las perlas magnéticas en la muestra, una afinidad de cada uno de los anticuerpos de captura inmovilizados en la superficie de las perlas magnéticas y una avidez de cada uno de los anticuerpos de captura inmovilizados en la superficie de las perlas magnéticas.

El intervalo de concentración superior (por ejemplo, por encima de aproximadamente 2000 pg/mL) puede controlarse mediante un período de tiempo en el que la muestra se coloca sobre el inmunosensor de captura de superficie heterogénea. En varias modalidades, la duración del tiempo es de entre 1 y 20 minutos, preferentemente entre 5 y 10 minutos. El intervalo de concentración superior puede controlarse adicionalmente por una afinidad de cada uno de los anticuerpos de señal, una avidez de cada uno de los anticuerpos de señal, una afinidad de cada uno de los anticuerpos de captura inmovilizados en o cerca del inmunosensor de captura de superficie heterogénea y/o una avidez de cada uno de los anticuerpos de captura inmovilizados sobre o cerca del inmunosensor de captura de superficie heterogénea. En algunas modalidades, la afinidad de cada uno de los anticuerpos de señal está en un intervalo de aproximadamente 1 x 107 a aproximadamente 1 x 1013 M-1, preferentemente en un intervalo de aproximadamente 1 x 1010 a aproximadamente 1 x 1013 M-1. En algunas modalidades, la avidez de cada uno de los anticuerpos de señal está en un intervalo de aproximadamente 1 x 107 a aproximadamente 1 x 1013 M-1, preferentemente en un intervalo de aproximadamente 1 x 1010 a aproximadamente 1 x 1013 M-1. En algunas modalidades, la afinidad de cada uno de los anticuerpos de captura inmovilizados en o cerca del inmunosensor de captura de superficie heterogénea está en un intervalo de aproximadamente 1 x 107 a aproximadamente 1 x 1013 M-1, preferentemente en un intervalo de aproximadamente 1 x 1010 a aproximadamente 1 x 1013 M-1. En algunas modalidades, la avidez de cada uno de los anticuerpos de captura inmovilizados en o cerca del inmunosensor de captura de superficie heterogénea está en un intervalo de aproximadamente 1 x 107 a aproximadamente 1 x 1013 M-1, preferentemente en un intervalo de aproximadamente 1 x 1010 a aproximadamente 1 x 1013 M-1. Como debe entenderse, el intervalo de concentración superior (por ejemplo, por encima de aproximadamente 2000 pg/mL) puede controlarse mediante cualquier número de los factores antes mencionados solos o en combinación, por ejemplo, el intervalo de concentración superior puede controlarse por al menos uno de la duración del tiempo de la colocación de la muestra sobre el inmunosensor de captura de superficie heterogénea, la afinidad de cada uno de los anticuerpos de señal, la avidez de cada uno de los anticuerpos de señal, la afinidad de cada uno de los anticuerpos de captura inmovilizados en o cerca del inmunosensor de captura de superficie heterogéneo, y una avidez de cada uno de los anticuerpos de captura inmovilizados en o cerca del inmunosensor de captura de superficie heterogénea.

La Figura 16 ilustra un método 1600 para determinar una concentración de un analito en una muestra en un intervalo de concentración extendido de acuerdo con una modalidad de la invención. En la etapa 1605, se detecta y mide una primera señal en un primer inmunosensor de una reacción de un sustrato con un tercer complejo localizado en o cerca del primer inmunosensor de acuerdo con las etapas 1505 a 1540 del método 1500. En la etapa 1610, se detecta y mide una segunda señal en un segundo inmunosensor a partir de una reacción de un sustrato con un segundo complejo localizado en o cerca del segundo inmunosensor de acuerdo con las etapas 1505 a 1545 del método 1500. En la etapa 1615, se determina una primera concentración del analito en la muestra biológica a partir de la primera señal y se determina una segunda concentración del analito en la muestra biológica a partir de la segunda señal. En la etapa opcional 1620, se calcula un promedio ponderado de la primera concentración y la segunda concentración. El promedio puede ponderarse en función de uno o más factores, incluida la proximidad de los resultados calculados a los puntos de cruce superior e inferior definidos, la idealidad de la forma del gráfico de corriente versus tiempo del sensor y la detección de una condición de error en uno de los sensores. En la etapa 1625, la primera concentración y la segunda concentración, u opcionalmente el promedio ponderado, se compara con un punto de concentración cruzado predeterminado. En diversas modalidades, el punto de concentración cruzado predeterminado es 1000 pg/mL, 1200 pg/mL, 1400 pg/mL, 1600 pg/mL, 1800 pg/mL o 2000 pg/mL. En la etapa 1630, cuando una o ambas de la primera concentración y la segunda concentración, u opcionalmente el promedio ponderado son mayores que el punto de concentración cruzado predeterminado, la primera concentración del analito determinada a partir de la primera señal se informa a un usuario del dispositivo como la concentración final del analito en la muestra biológica. En la etapa 1635, cuando una o ambas de la primera concentración y la segunda concentración, u opcionalmente el promedio ponderado son menores que el punto de concentración cruzado predeterminado, la segunda concentración del analito determinada a partir de la segunda señal se informa a un usuario del dispositivo como la concentración final del analito en la muestra biológica.

La Figura 17 ilustra un método 1700 para determinar una concentración de un analito en una muestra en un intervalo de concentración extendido de acuerdo con una modalidad de la invención. En la etapa 1705, se detecta y mide una primera señal en un primer inmunosensor de una reacción de un sustrato con un tercer complejo localizado en o cerca del primer inmunosensor de acuerdo con las etapas 1705 a 1745 del método 1700. En la etapa 1710, se detecta y mide una segunda señal en un segundo inmunosensor a partir de una reacción de un sustrato con un segundo complejo localizado en o cerca del segundo inmunosensor de acuerdo con las etapas 1705 a 1750 del método 1700. En la etapa 1715, se determina una primera concentración del analito en la muestra biológica a partir de la primera señal y se determina una segunda concentración del analito en la muestra biológica a partir de la segunda señal. En la etapa opcional 1720, se calcula un promedio ponderado de la primera concentración y la segunda concentración. El promedio puede ponderarse en función de uno o más factores, incluida la proximidad de los resultados calculados a los puntos de cruce superior e inferior definidos, la idealidad de la forma del gráfico de corriente versus tiempo del sensor y la detección de una condición de error en uno de los sensores. En la etapa 1725, la primera concentración y la segunda concentración, u opcionalmente el promedio ponderado, se comparan con una zona de concentración cruzada predeterminada. En varias modalidades, la zona de concentración de cruce predeterminada es de 400 a 2000 pg/mL, 600 a 1800 pg/mL, 400 a 1800 pg/mL, 800 a 1600 pg/mL o 250 a 2000 pg/mL.

En la etapa 1730, cuando una o ambas de la primera concentración y la segunda concentración, u opcionalmente el promedio ponderado son mayores que la zona de concentración cruzada predeterminada, la primera concentración del analito determinada a partir de la primera señal se informa a un usuario del dispositivo como la concentración final del analito en la muestra biológica. En la etapa 1735, cuando una o ambas de la primera concentración y la segunda concentración, u opcionalmente el promedio ponderado son menores que la zona de concentración cruzada predeterminada, la segunda concentración del analito determinada a partir de la segunda señal se informa a un usuario del dispositivo como la concentración final del analito en la muestra biológica. En la etapa 1740, cuando tanto la primera concentración como la segunda concentración, u opcionalmente el promedio ponderado están dentro de la zona de concentración cruzada predeterminada, el promedio ponderado de la primera concentración y la segunda concentración se informa a un usuario del dispositivo como la concentración final del analito en la muestra biológica.

La Figura 18 muestra un gráfico 1800 que ilustra el impacto de poder determinar una concentración de un analito en una muestra en un intervalo de concentración extendido de acuerdo con varias modalidades de la invención. Un chip sensor de intervalo extendido microfabricado puede incluir el primer inmunosensor 1805 (por ejemplo, un sensor amperométrico de sensibilidad de bajo nivel con una capa inmovilizada de anticuerpos de captura) y el segundo inmunosensor 1810 (por ejemplo, un sensor amperométrico de alta sensibilidad con un campo magnético para atraer perlas magnéticas con una capa inmovilizada de anticuerpos de captura), como se describe en la presente descripción. El gráfico 1800 muestra que el primer inmunosensor 1805 es particularmente adecuado para detectar analitos que tienen una concentración más alta, por ejemplo, más de 400 pg/mL, mientras que el segundo inmunosensor 1810 es particularmente adecuado para detectar analitos que tienen una concentración más baja, por ejemplo, menos de 2000 pg/mL. En consecuencia, mediante el uso de un sistema que tiene un chip sensor como se describió en la presente descripción con el primer inmunosensor 1805 (por ejemplo, un sensor amperométrico de sensibilidad de gama baja con una capa inmovilizada de anticuerpos de captura) y el segundo inmunosensor 1810 (por ejemplo, un sensor amperométrico de sensibilidad de gama alta con un campo magnético para atraer perlas magnéticas con una capa inmovilizada de anticuerpos de captura), es posible extender el intervalo de concentraciones en las que puede detectarse un analito mediante el uso de la primera y segunda señales generadas en los respectivos inmunosensores como se describió anteriormente con respecto a los métodos 1500, 1600 y 1700.

Se pretende que el alcance de la presente invención esté limitado únicamente por el alcance de las siguientes reivindicaciones. Además, los expertos en la técnica deberían apreciar que una pluralidad de las diversas modalidades de la invención, como se describió anteriormente, pueden acoplarse entre sí e incorporarse en un solo dispositivo lector.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un método para realizar un inmunoensayo para determinar la concentración de un analito en una muestra biológica que comprende:

disolver un primer reactivo seco y un segundo reactivo seco en la muestra biológica, en donde el primer reactivo seco comprende anticuerpos de señal, el segundo reactivo seco comprende anticuerpos de captura inmovilizados en perlas magnéticas, y los anticuerpos de señal y los anticuerpos de captura se configuran para unirse al analito; formar un primer complejo de los anticuerpos de señal y el analito;

formar un segundo complejo del primer complejo y los anticuerpos de captura inmovilizados en las perlas magnéticas;

poner en contacto un primer inmunosensor con la muestra biológica que comprende el primer complejo y el segundo complejo para formar un tercer complejo localizado en o cerca de una superficie del primer inmunosensor, en donde el primer inmunosensor incluye una capa inmovilizada de anticuerpos de captura configurada para unirse al analito, y el tercer complejo incluye el primer complejo unido a la capa inmovilizada de anticuerpos de captura; poner en contacto un campo magnético localizado alrededor de un segundo inmunosensor con la muestra biológica que comprende el primer complejo y el segundo complejo de manera que el segundo complejo se localice en o cerca de una superficie del segundo inmunosensor;

aplicar un fluido para lavar la muestra biológica del primer inmunosensor y el segundo inmunosensor, en donde el fluido de lavado comprende un sustrato configurado para reaccionar con los anticuerpos de señal;

medir una primera señal en el primer inmunosensor de una reacción del sustrato con los anticuerpos de señal en el tercer complejo que están localizados en o cerca de la superficie del primer inmunosensor;

medir una segunda señal en el segundo inmunosensor a partir de una reacción del sustrato con los anticuerpos de señal en el segundo complejo que están localizados en o cerca de la superficie del segundo inmunosensor; y determinar la concentración del analito en la muestra biológica a partir de al menos una de la primera señal y la segunda señal.

2. El método de la reivindicación 1, en donde el primer inmunosensor y el segundo inmunosensor son inmunosensores electroquímicos y la primera señal y la segunda señal son señales electroquímicas.

3. El método de la reivindicación 1, en donde los anticuerpos de señal se conjugan con una enzima.

4. El método de la reivindicación 3, en donde la enzima es la fosfatasa alcalina.

5. El método de la reivindicación 4, en donde el sustrato es una molécula fosforilada configurada de manera que cuando se elimina un resto fosfato, la molécula se vuelve electroactiva.

6. El método de la reivindicación 1, en donde el analito es la troponina I cardíaca (cTnI).

7. El método de la reivindicación 1, que comprende además:

introducir la muestra con un analito diana en una cámara de muestra de un dispositivo sensor;

mover la muestra desde la cámara de muestras a un conducto que comprende un chip sensor, en donde el chip sensor incluye el primer inmunosensor y el segundo inmunosensor.

8. El método de la reivindicación 7, en donde el primer inmunosensor y el segundo inmunosensor son inmunosensores electroquímicos y la primera señal y la segunda señal son señales electroquímicas.

9. El método de la reivindicación 7, en donde los anticuerpos de señal se conjugan con una enzima.

10. El método de la reivindicación 9, en donde la enzima es la fosfatasa alcalina.

11. El método de la reivindicación 10, en donde el sustrato es una molécula fosforilada configurada de manera que cuando se elimina un resto fosfato, la molécula se vuelve electroactiva.

12. El método de la reivindicación 7, en donde el analito diana es la troponina I cardiaca (cTnI).

13. Un medio de almacenamiento no transitorio legible por máquina que tiene instrucciones almacenadas en el mismo que cuando se ejecutan por uno o más procesadores hacen que uno o más procesadores realicen un método que comprende:

mover una muestra con un analito diana desde una cámara de muestra a un conducto que comprende un chip sensor, un primer reactivo seco y un segundo reactivo seco, en donde el movimiento da como resultado que el primer reactivo seco y el segundo reactivo seco se disuelvan en la muestra y se formen un primer complejo y un segundo complejo, el primer complejo incluye anticuerpos de señal y el analito diana, y el segundo complejo incluye el primer complejo y anticuerpos de captura inmovilizados en perlas magnéticas, y en donde el chip sensor incluye un primer inmunosensor que tiene una capa inmovilizada anticuerpos de captura configurados para unirse al analito diana y un segundo inmunosensor que tiene un campo magnético localizado alrededor del segundo inmunosensor; poner la muestra en contacto con el primer inmunosensor de manera que el primer complejo y el segundo complejo formen un tercer complejo localizado en o cerca de una superficie del primer inmunosensor, en donde el tercer complejo incluye el primer complejo unido a la capa inmovilizada de anticuerpos de captura;

poner la muestra en contacto con el campo magnético localizado alrededor del segundo inmunosensor con la muestra biológica que comprende el primer complejo y el segundo complejo de manera que el segundo complejo se localice en o cerca de una superficie del segundo inmunosensor;

poner un sustrato en contacto con el primer inmunosensor y el segundo inmunosensor;

medir una primera señal en el primer inmunosensor de una reacción del sustrato con los anticuerpos de señal en el tercer complejo que están localizados en o cerca de la superficie del primer inmunosensor;

medir una segunda señal en el segundo inmunosensor a partir de una reacción del sustrato con los anticuerpos de señal en el segundo complejo que están localizados en o cerca de la superficie del segundo inmunosensor; y determinar una concentración del analito diana en la muestra biológica a partir de al menos una de la primera señal y la segunda señal.

14. El medio de almacenamiento legible por máquina no transitorio de acuerdo con la reivindicación 13, en donde el primer inmunosensor y el segundo inmunosensor son inmunosensores electroquímicos y la primera señal y la segunda señal son señales electroquímicas.

15. El medio de almacenamiento legible por máquina no transitorio de acuerdo con la reivindicación 13, en donde los anticuerpos de señal están conjugados con una enzima.