ES2847575T3 - Utilización de un extracto de parte de planta de rúcula para estimular las defensas de plantas y árboles, y composición y procedimiento asociados - Google Patents

Abstract

Utilización de un extracto obtenido mediante extracción acuosa de al menos una parte de plantas de Rúcula, preferentemente seleccionada entre el grupo de plantas de Rúcula del género Eruca (E. sativa, E. vesicaria⋯), Diplotaxis (D. erucoides, D. tenuifolia, D. muralis⋯), Bunias (B. erucago, B. orientalis⋯), Erucastrum (E. nasturtiifolium, E. incanum⋯) y Cakile, para estimular las defensas de las plantas o árboles y reducir los efectos de: - la bacteria Xyllela fastidiosa sobre polígalas de hojas de mirto, vides, olivos, cítricos, adelfas, almendros, cafetos, melocotoneros y árboles frutales de hueso, robles, lavanda, romero o retama, - la bacteria Pseudomonas syringae pv actinidiae en las plantas del género Actinidia, - la bacteria Xantomonas arboricola pv juglandis sobre el nogal, - la bacteria Xanthomonas arboricola pv. pruni en los Prunus spp., y preferentemente del grupo de los siguientes árboles frutales: albaricoquero, almendro, cerezo, melocotonero, ciruelo, P. salicina, laurel cerezo, así como otros Prunus exóticos u ornamentales, incluidos el P. davidiana y el P. laurocerasus, - la bacteria fitoplasma del decaimiento del peral o Candidatus Phytoplasma pyri en el peral, - la bacteria Candidatus Phytoplasma solani en la vid, la lavanda, la patata, el tomate, la berenjena, el pimiento y el tabaco, - el hongo Plasmapora viticola en la vid, o Phytophtora infestans en las patatas y tomates, Phytophtora citrophtora en los cítricos, Phytophtora cactorum en los perales y manzanos, Bremia lactucae en la alcachofa, o - los hongos de tipo oídio como Podosphaera pannosa en el rosal, y Erysiphe necator, anteriormente Uncinula necator, en la vid, pero también los oídios en el tomate, la lechuga, el pepino, el fresal, el frambueso, el grosellero, el melocotonero, el peral, la alheña y el clavel.

Description

DESCRIPCIÓN

Utilización de un extracto de parte de planta de rúcula para estimular las defensas de plantas y árboles, y composición y procedimiento asociados

Ámbito técnico

La presente invención se refiere a una utilización de un extracto obtenido por extracción acuosa de al menos una parte de planta de rúcula para estimular las defensas de plantas o árboles.

El objetivo de la presente invención es reducir los efectos de un ataque de un elemento patógeno en una planta o árbol para permitir al menos que la planta o el árbol sigan creciendo correctamente pese a esta infección, superando la enfermedad, es decir, permitiendo que la planta o el árbol se desarrollen a pesar del agente patógeno, reduciendo o eliminando el impacto del agente patógeno. El extracto de planta de rúcula puede también, en algunos usos, permitir que la planta erradique determinados agentes patógenos. Este uso puede ser curativo o preventivo.

Se refiere, en particular, al tratamiento de:

- plantas y árboles infectados por la bacteria Xyllela fastidiosa, en particular las siguientes plantas y árboles:

- Polígala de hojas de mirto,

- Vid,

- Olivo,

- Cítricos,

- Adelfa,

- Almendro,

- Cafeto,

- Melocotonero, árboles frutales de hueso,

- Roble,

- Lavanda,

- Romero y

- Retama.

- plantas del género Actinidia infectadas por la bacteria Pseudomonas syringae pv actinidiae,

- un árbol infectado por la bacteria Xantomonas arboricola pv juglandis, en particular el nogal, o la bacteria Xantomonas arboricola pv. pruni, especialmente el Prunus spp., y en particular los árboles frutales como albaricoquero, almendro, cerezo, melocotonero, ciruelo, P. salicina, laurel cerezo así como otros Prunus exóticos u ornamentales, incluidos el P. davidiana y el P. laurocerasus,

- perales infectados por el fitoplasma bacteriano del decaimiento del peral o Candidatus Phytoplasma pyri, - un ataque de la bacteria Candidatus Phytoplasma solani de la vid, la lavanda, la patata, el tomate, la berenjena, el pimiento y el tabaco,

- viñas atacadas por el mildiu (Plasmapora viticola), pero también patatas y tomates (infectados por Phytophtora infestans), cítricos (infectados por Phytophtora citrophtora), perales y manzanos (infectados por Phytophtora cactorum), las alcachofas (infectadas por Bremia lactucae) o

- rosales y viñas atacadas por el oídio, hongos, denominados respectivamente, Podosphaera pannosa y Erysiphe necator, anteriormente Uncinula necator, pero también el tomate, la lechuga, el pepino, el fresal, el frambueso, el grosellero, el melocotonero, el peral, la alheña, el clavel infectados por el oídio.

En materia de protección de los cultivos, el futuro ya no está en los pesticidas sintéticos. Estos deberán ceder su lugar progresivamente a productos más naturales, capaces de eliminar agentes patógenos evitando al mismo tiempo los efectos adversos bien conocidos de toxicidad y daños en el medio ambiente. Dan lugar a elevadas facturas ecológicas y sanitarias que la sociedad está cada vez menos dispuesta a pagar.

La presión social y normativa para reducir el uso de plaguicidas químicos no deja de crecer. Muchos agricultores buscan productos menos contaminantes que puedan incorporarse a nuevos sistemas agrícolas, fáciles de aplicar y que transmitan una imagen positiva de sus productos. Los consumidores, por su parte, quieren una alimentación sana, sin los efectos nocivos de los pesticidas que se han ido descubriendo de forma creciente en los últimos años.

Existen varios factores que explican la disparidad que aún persiste entre el rechazo de los pesticidas químicos y la accesibilidad a productos más respetuosos con el medio ambiente. De forma más particular, pero no exhaustiva, suelen indicarse las siguientes razones:

- La producción comercial más difícil de los biopesticidas.

- La formulación de los biopesticidas (estabilidad limitada).

- La eficacia de los biopesticidas (raramente equiparable a la de las moléculas químicas de síntesis). - Financiación de la investigación sobre biopesticidas.

- El elevado coste de las homologaciones.

A continuación se detallan los efectos conocidos de la utilización de plantas de rúcula en la lucha contra los agentes patógenos. En el ámbito de la protección de las plantas contra los agentes patógenos, la literatura recoge diversas acciones relativas a la rúcula (Eruca sativa):

La extracción con disolventes de compuestos bioactivos a partir de hojas, semillas, flores y raíces de rúcula (Eruca sativa) permite observar una actividad antimicrobiana in vitro (Solana et al. 2014; Koubaa et al., 2015). Esta actividad antimicrobiana se ha estudiado tanto en bacterias grampositivas como gramnegativas. Los resultados muestran un gradiente de eficacia in vitro y diferencias significativas en función de los disolventes utilizados.

También se ha demostrado que los compuestos derivados de los glucosinolatos (GLS), producidos durante la hidrólisis catalizada por la enzima mirosinasa (MYR), tienen acciones antimicrobianas: Los GLS, en presencia de la enzima MYR, se hidrolizan con formación de p-D-glucosa, iones sulfato y determinados compuestos como los isotiocianatos, nitrilos o tiocianatos.

Los isotiocianatos han demostrado in vitro propiedades citotóxicas frente a los nematodos (Lazzeri et al., 1993) así como efectos antifúngicos en el suelo (Manici et al., 1997).

Para obtener específicamente los isotiocianatos, la extracción es compleja y a base de disolventes.

Una de las soluciones que se aportan en la literatura es el uso directo de polvo de semilla que contiene al menos un glucosinolato y al menos una enzima (enzima glucosidasa o tioglucosidasa), que puede utilizarse como mejorador del suelo, luchando contra los parásitos del mismo. Para optimizar el contenido de GLS y enzimas, se elimina el aceite y la grasa de las semillas a temperatura ambiente para proteger el complejo GLS/enzima. El polvo de semillas obtenido de esta forma puede esparcirse en el suelo. En contacto con el agua, se inicia entonces la hidrólisis de los compuestos, así como la acción citotóxica contra los parásitos. En este contexto, el polvo de semilla de Eruca sativa ha sido citado como uno de los ejemplos que pueden presentar estas características (Lazzeri et al., 2004).

La biofumigación, por su parte, es un método biológico para reducir el número de patógenos, plagas y semillas de malas hierbas en el suelo. Se basa en el uso de plantas ricas en glucosinolatos, que pertenecen principalmente a la familia de las crucíferas. Durante la descomposición de estas plantas, los glucosinolatos se transforman en isotinatos y tiocinatos por la acción de la enzima mirosinasa. Los isotinatos y tiocinatos son volátiles y tóxicos para determinados organismos del suelo. En este contexto, también se conoce en la literatura que el enterramiento de plantas enteras de Eruca sativa en el suelo, en combinación con nematicidas sintéticos, permite controlar la invasión de nematodos (Meloidogyne chitwoodi, Meloidogyne hapla, Meloidogyne incógnita) (Riga et al., 2006). La Eruca sativa serviría, en este caso concreto, como trampas para nematodos y depósito de compuestos citotóxicos.

Objeto de la invención

La finalidad de la presente invención es solucionar total o parcialmente estos inconvenientes.

Para ello, según un primer aspecto, la presente invención se refiere al uso de un extracto obtenido por extracción acuosa de al menos una parte de planta de Rúcula, preferentemente seleccionada entre el grupo de plantas de rúcula del género Eruca (E. sativa, E. vesicaria...), Diplotaxis (D. erucoides, D. tenuifolia, D. muralis...), Bunias (B. erucago, B. orientalis...), Erucastrum (E. nasturtiifolium, E. incanum...) y Cakile, para estimular, por aplicación, las defensas de las plantas o árboles y reducir los efectos de:

- la bacteria Xyllela fastidiosa sobre polígalas de hojas de mirto, vides, olivos, cítricos, adelfas, almendros, cafetos, melocotoneros y árboles frutales de hueso, robles, lavanda, romero o retama,

- la bacteria Pseudomonas syringae pv actinidiae en las plantas del género Actinidia,

- la bacteria Xantomonas arboricola pv juglandis sobre el nogal,

- la bacteria Xanthomonas arboricola pv. pruni en los Prunus spp., y preferentemente del grupo de los siguientes árboles frutales: albaricoquero, almendro, cerezo, melocotonero, ciruelo, P. salicina, laurel cerezo, así como otros Prunus exóticos u ornamentales, incluidos el P. davidiana y el P. laurocerasus,

- el fitoplasma bacteriano del decaimiento del peral o Candidatus Phytoplasma pyri en el peral,

- la bacteria Candidatus Phytoplasma solani en la vid, la lavanda, la patata, el tomate, la berenjena, el pimiento y el tabaco,

- el hongo Plasmapora viticola en la vid, o Phytophtora infestans en las patatas y tomates, Phytophtora citrophtora en los cítricos, Phytophtora cactorum en los perales y manzanos, Bremia lactucae en la alcachofa, o

- los hongos de tipo oídio como Podosphaera pannosa en el rosal, y Erysiphe necator, anteriormente Uncinula necator, en la vid, pero también los oídios en el tomate, la lechuga, el pepino, el fresal, el frambueso, el grosellero, el melocotonero, el peral, la alheña y el clavel.

Se recuerda aquí que la rúcula (Eruca sativa) es una planta anual de la familia de las Brassicaceae (o crucíferas), con flores blancas o amarillentas veteadas de marrón o púrpura, cuyas hojas, generalmente alargadas y desiguales, tienen un sabor picante. En función de las regiones, se llama ruca, arúgula, roqueta o rúgula. La rúgula es una forma salvaje de rúcula con hojas pequeñas muy sabrosas. Existen otras plantas similares del género Diplotaxis que se llaman rúcula. Cuando sea necesario diferenciarlas, se denominará a las Diplotaxis «rúcula silvestre» y a la Eruca «rúcula doméstica». La presente invención no se limita a esta especie de rúcula, y va más allá de la Eruca sativa. La descripción de la rúcula también puede variar en función del origen y de las regiones. Cabe destacar que el nombre común de la rúcula también incluye a la ruca y la arúgula.

La rúcula empleada para la presente invención pertenece a los géneros Eruca (E. sativa, E. vesicaria, etc.), Diplotaxis (D. erucoides, D. tenuifolia, D. muralis, etc.), Bunias (B. erucago, B. orientalis, etc.), Erucastrum (E. nasturtiifolium, E. incanum, etc.) o Cakile (Cakile maritima, etc.). En el marco de la presente invención, la Rúcula comprende todas estas especies que pueden mezclarse. La rúcula mencionada más adelante pertenece a la orden de las Capparales y a la familia de las Brassicaceae.

También se observa que el principio activo (o compuesto activo, ingrediente activo o principio activo) es el conjunto de ingredientes de los productos que estimula las defensas de las plantas y árboles anteriormente mencionados infectados por alguno de los agentes patógenos anteriormente indicados.

Dicha composición puede consistir en un extracto bruto total obtenido por trituración y extracción de la planta de rúcula, en una fracción enriquecida con compuestos activos de dicho extracto total o en uno o varios compuestos activos mezclados. Una composición de este tipo presenta la ventaja de combatir, en cantidad eficaz en una composición, los síntomas de la infección de una planta o un árbol anteriormente mencionados causados por una bacteria u hongo anteriormente indicados.

Se observa que la reducción de los efectos de los agentes patógenos en las plantas o árboles implica en algunos casos la reducción total o parcial de los síntomas, e incluso la erradicación del agente patógeno. En efecto, cuando su sistema de defensa es funcional —en particular gracias a la estimulación obtenida por la aplicación de la invención—, las plantas y árboles tienen la capacidad de vencer a un parásito. La finalidad de la utilización del extracto de planta de rúcula objeto de la presente invención es estimular lo que las plantas ya saben hacer, pero que no hacen en los casos de «sensibilidad», ya que no reconocen a su agresor. La regresión de la patología aparece así en algunos ejemplos de la descripción.

En algunos modos de realización, la aplicación en la planta o el árbol se lleva cabo mediante pulverización foliar, riego en el suelo, goteo, utilización en cultivos hidropónicos, en tratamiento de simientes y/o recubrimiento de semillas.

En algunos modos de realización, la aplicación en la planta o el árbol se lleva a cabo con una dilución en el agua de la composición entre 2 g/l y 150 g/l expresada en gramos de plantas en las que se ha realizado la extracción por litro de producto.

En algunos modos de realización, la aplicación en la planta o el árbol se lleva a cabo con una dilución en el agua de la composición entre 5 g/l y 70 g/l expresada en gramos de plantas en las que se ha realizado la extracción por litro de producto.

En algunos modos de realización, dicho extracto de al menos una parte de planta de Rúcula es un extracto líquido de Rúcula del género Eruca obtenido a partir de un triturado de dichas plantas de Rúcula, y:

- dicho extracto de al menos una parte de planta de Rúcula contiene al menos algunas hojas de Rúcula, de preferencia esencialmente hojas y

- el procedimiento que permite obtener dicho extracto líquido consta de las siguientes etapas:

a) una etapa de trituración en medio acuoso de dichas plantas de Rúcula del género Eruca;

b) la filtración del triturado obtenido; y

c) la recogida del extracto líquido de Rúcula del género Eruca obtenido tras la filtración.

El término «que comprende esencialmente» significa en el presente documento que comprende al menos (por ejemplo) entre un 75 y un 80 % de hoja de Rúcula en peso, por ejemplo seco, en relación con el peso total de rúcula, antes de mezclarla con disolvente acuoso.

En algunos modos de realización, dicho extracto de al menos una parte de planta de Rúcula es un extracto líquido de Rúcula de la especie Eruca sativa.

Según un segundo aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento para estimular las defensas de las plantas o árboles y reducir los efectos de:

- la bacteria Xyllela fastidiosa sobre polígalas de hojas de mirto, vides, olivos, cítricos, adelfas, almendros, cafetos, melocotoneros y árboles frutales de hueso, robles, lavanda, romero o retama,

- la bacteria Pseudomonas syringae pv actinidiae en las plantas del género Actinidia,

- la bacteria Xantomonas arboricola pv juglandis sobre el nogal,

- la bacteria Xanthomonas arboricola pv. pruni, especialmente el Prunus spp., y en particular los árboles frutales como albaricoquero, almendro, cerezo, melocotonero, ciruelo, P. salicina, laurel cerezo así como otros Prunus exóticos u ornamentales, incluidos el P. davidiana y el P. laurocerasus,

- el fitoplasma bacteriano del decaimiento del peral o Candidatus Phytoplasma pyri en el peral,

- la bacteria Candidatus Phytoplasma solani en la vid, la lavanda, la patata, el tomate, la berenjena, el pimiento y el tabaco, - el hongo Plasmapora viticola en la vid, o Phytophtora infestans en las patatas y tomates, Phytophtora citrophtora en los cítricos, Phytophtora cactorum en los perales y manzanos, Bremia lactucae en la alcachofa, o

- los hongos Podosphaera pannosa en el rosal, y Erysiphe necator, anteriormente Uncinula necator en la vid, pero también los oídios en el tomate, la lechuga, el pepino, el fresal, el frambueso, el grosellero, el melocotonero, el peral, la alheña y el clavel;

procedimiento que incluye la aplicación sobre dicha planta o dicho árbol de un extracto obtenido por extracción acuosa de al menos una parte de planta de Rúcula, por ejemplo del género Eruca (E. vesicaria.), Diplotaxis (D. erucoides, D. tenuifolia, D. muralis...), Bunias (B. erucago, B. orientalis...), Erucastrum (E. nasturtiifolium, E. incanum...) o Cakile.

En algunos modos de realización, la aplicación en la planta o el árbol se lleva a cabo mediante vaporización foliar, riego del suelo, irrigación del suelo, goteo, cultivo hidropónico, tratamiento de simientes y/o recubrimiento de semillas.

En algunos modos de realización, la composición aplicada a dicha planta o a dicho árbol es una composición que comprende un extracto líquido de Rúcula del género Eruca obtenido a partir de un triturado de dichas plantas de Rúcula y:

- dicho extracto de al menos una parte de planta de Rúcula incluye al menos algunas hojas de Rúcula, de preferencia esencialmente hojas y

- el procedimiento que permite obtener dicho extracto líquido consta de las siguientes etapas:

a) una etapa de trituración en medio acuoso de dichas plantas de Rúcula del género Eruca;

b) la filtración del triturado obtenido; y

c) la recogida del extracto líquido de Rúcula del género Eruca obtenido tras la filtración.

En algunos modos de realización, dicho extracto de al menos una parte de planta de Rúcula es un extracto líquido de Rúcula de la especie Eruca sativa.

Según un tercer aspecto, se divulga una composición, que incluye un extracto de al menos una parte de planta de Rúcula, por ejemplo del género Eruca (E. sativa; E. vesicaria .), Diplotaxis (D. erucoides, D. tenuifolia, D. m ura lis .), Bunias (B. erucago, B. orientalis.), Erucastrum (E. nasturtiifolium, E. incanum .) o Cakile, para estimular las defensas de las plantas o árboles y reducir los efectos de:

- la bacteria Xyllela fastidiosa sobre polígalas de hojas de mirto, vides, olivos, cítricos, adelfas, almendros, cafetos, melocotoneros y árboles frutales de hueso, robles, lavanda, romero o retama,

- la bacteria Pseudomonas syringae pv actinidiae en las plantas del género Actinidia,

- la bacteria Xantomonas arboricola pv juglandis sobre el nogal,

- la bacteria Xanthomonas arboricola pv. pruni, especialmente el Prunus spp., y en particular los árboles frutales como albaricoquero, almendro, cerezo, melocotonero, ciruelo, P. salicina, laurel cerezo así como otros Prunus exóticos u ornamentales, incluidos el P. davidiana y el P. laurocerasus,

- el fitoplasma bacteriano del decaimiento del peral o Candidatus Phytoplasma pyri en el peral,

- la bacteria Candidatus Phytoplasma solani en la vid, la lavanda, la patata, el tomate, la berenjena, el pimiento y el tabaco,

- el hongo Plasmapora viticola en la vid, o Phytophtora infestans en las patatas y tomates, Phytophtora citrophtora en los cítricos, Phytophtora cactorum en los perales y manzanos, Bremia lactucae en la alcachofa, o

- los hongos de tipo oídio como Podosphaera pannosa en el rosal, y Erysiphe necator, anteriormente Uncinula necator en la vid, pero también los oídios en el tomate, la lechuga, el pepino, el fresal, el frambueso, el grosellero, el melocotonero, el peral, la alheña y el clavel.

En algunos modos de realización, al menos un principio activo se obtiene a partir de hojas de plantas de rúcula.

En algunos modos de realización, al menos un principio activo se obtiene a partir de semillas de plantas de tipo rúcula.

En algunos modos de realización, al menos un principio activo se obtiene a partir de tallos de plantas de tipo rúcula.

En algunos modos de realización, al menos un principio activo se obtiene a partir de las raíces de plantas de tipo rúcula.

En algunos modos de realización, al menos un principio activo se obtiene a partir de flores de plantas de tipo rúcula.

En algunos modos de realización, al menos un principio activo se obtiene mediante trituración de al menos una parte de planta de tipo rúcula.

En algunos modos de realización, la composición se formula en forma de polvo, polvo soluble, polvo mojable, granulado, granulado dispersable o granulado mojable o de difusión lenta, que debe diluirse en agua en el momento de su utilización.

En algunos modos de realización, la composición se formula en forma de líquido, líquido concentrado soluble, concentrado emulsionable, suspensión concentrada, o lista para su uso.

Según un cuarto aspecto, se divulga un procedimiento de producción de una composición objeto de la invención, que comporta una etapa de trituración de al menos una parte de planta de rúcula para proporcionar un triturado y una etapa de filtrado para extraer partes sólidas de dicho triturado y obtener un líquido.

Habida cuenta de que las ventajas, fines y características particulares de esta composición y de estos procedimientos son similares a los de la composición objeto de la presente invención, se divulgan en documento FR3003131A1 y no se reiteran en el presente documento.

Breve descripción de las figuras

Otras ventajas, fines y características de la presente invención se pondrán de manifiesto a partir de la siguiente descripción, realizada con un objetivo explicativo y en absoluto limitativo, a la vista de los dibujos adjuntos, en los que:

- La figura 1 representa, en forma de diagrama de flujo, algunas etapas de un modo de realización de un procedimiento para producir y utilizar una materia triturada, que es un ejemplo preferente del producto objeto de la invención.

- La figura 2 representa un punto de inserción en el que se cuentan las hojas de los olivos para evaluar el desarrollo de la última rama del año en curso.

- La figura 3 es un diagrama que muestra la recuperación de la vegetación (número de hojas nuevas por vástago) de olivos tratados y olivos de «control».

- La figura 4 muestra los resultados de inhibición potencial del producto objeto de la invención en algunas especies de hongos cuando se introduce el producto en el medio de cultivo.

- La figura 5 muestra los resultados de inhibición potencial del producto objeto de la invención en algunas especies fúngicas cuando el producto es aplicado en la superficie del medio de cultivo.

- En la figura 6 se compara el contenido de clorofila de las hojas (Spad Index) de los olivos tratados y de los olivos de «control».

- La figura 7 compara la conductancia estomática (potencial de agua) de las hojas de los olivos tratados y de los olivos de «control».

- La figura 8 muestra la recuperación de la vegetación (número de nuevas hojas jóvenes por vástago) de los olivos tratados y los olivos de «control» en las diferentes fechas de muestreo.

- La figura 9 muestra la recuperación de la vegetación (longitud de ramas nuevas) de los olivos tratados y los olivos de «control» en las diferentes fechas de muestreo.

- La figura 10 compara el contenido de clorofila de las hojas (Spad Index) de los olivos tratados y de los olivos de «control» en las diferentes fechas de muestreo.

- La figura 11 compara la conductancia estomática (potencial de agua) de las hojas de los olivos tratados y de los olivos de «control» en las diferentes fechas de muestreo.

- La figura 12 representa cromatogramas obtenidos en los exámenes de una solución analítica estándar y tres réplicas de muestras para demostrar la ausencia de Erucina en el producto objeto de la invención.

- La figura 13 representa los resultados de una campaña de ensayos en forma de porcentaje de la enfermedad Xyllela fastidiosa (DAMDIS) que representa la criticidad/gravedad media de la enfermedad por parcela de olivos. - La figura 14 representa una evaluación del número de nuevos brotes por vástago de olivo.

- La figura 15 representa una evaluación del vigor del cultivo de olivo durante un programa de pruebas.

- La figura 16 representa una evaluación de la longitud de los nuevos brotes de olivo durante un programa de ensayos.

- La figura 17 representa una evaluación del Índice de Vegetación de Diferencia Normalizada (IVDN) de olivos durante un programa de ensayos.

- La figura 18 representa una evaluación de la conductancia estomática de olivos durante un programa de ensayos. - La figura 19 representa una evaluación del peso en fresco de aceituna por parcela durante un programa de ensayos.

- La figura 20 representa una evaluación del peso en fresco de aceitunas por cada 100 frutos durante un programa de ensayos.

- La figura 21 representa una evaluación de la concentración de aceite durante un programa de ensayos.

- La figura 22 representa un calendario de tratamiento de nogales.

- La figura 23 representa un desarrollo de parámetros fisiológicos de crecimiento en plantas de lavanda tratadas, en comparación con las plantas de «control» no tratadas.

- Y la figura 24 representa fotografías que muestran una evolución de la enfermedad causada por el fitoplasma de Stolbur (Candidatus phytoplasma solani) en plantas de referencia y plantas tratadas con el producto objeto de la invención.

Descripción de los ejemplos de realización de la invención

El producto probado en la presente invención, denominado en lo sucesivo «PP1», no corresponde a lo que la literatura describe:

1/ PP1 (hojas, tallos, flores, semillas, raíces) se extrae, según un modo de extracción preferente, con agua, según el procedimiento descrito más adelante (figura 1). Durante la utilización en campos, el producto se diluye aún más en los depósitos (tanques) de pulverización para pulverizarse a nivel foliar (u otro uso previsto en la descripción de los usos)

2/ El producto PP1, obtenido en estas condiciones de extracción, no posee ninguna actividad antimicrobiana directa (ninguna actividad antibacteriana ni antifúngica). Esta demostración se realiza durante tres experimentos in vitro distintos:

2.a/ Durante un experimento específico realizado por la sociedad BIOPRESERV (Grasse, Francia) con el producto PP1 listo para su uso. En las condiciones de análisis de laboratorio, tras tres y siete días de contacto, la muestra PP1 no mostró ningún efecto tóxico sobre las cepas microbianas estudiadas (Ejemplo 1)

Ejemplo 1 - Ausencia de efectos antibacterianos y antifúngicos

Con el fin de probar el efecto antimicrobiano de PP1, se evaluó el efecto de PP1 sobre el crecimiento de seis cepas microbianas:

Bacterias: Burkholderia cepacia, Pseudomonas cichorii, Pseudomonas fluorescens.

Mohos: Alternaría alternata, Aspergillus brasiliensis, Aureobasidium melanogenum (anteriormente A. pullulans).

La muestra analizada es el producto PP1 listo para su uso, en la dosis de utilización.

Condiciones experimentales:

El protocolo seguido se basa en la Farmacopea Europea, 9.a edición, sección 5.1.3. Eficacia de la conservación antimicrobiana.

La muestra se filtra a 0,22 pm y se conserva fresca antes de su utilización.

Las cepas estudiadas se detallan en la siguiente tabla de composición de los inóculos:

Para cada cepa, se pone en contacto con el producto un inóculo a 104-106 ufc/ml durante un periodo de tres a siete días a 22 °C ± 2 °C. El suero fisiológico (NaCl 9 g/l) se somete al mismo tratamiento a modo de control.

Con el fin de cuantificar la contaminación en cada tiempo de medición, se realiza un recuento por extensión en superficie o en masa de diluciones decimales a partir de 0,1 ml de muestra en los medios siguientes:

- Agar triptona de soja (Tryptic Soy Agar, marca registrada) para el recuento bacteriano (incubación: de 2 a 5 días a 30 °C ± 2 °C)

- Agar Gélose Sabouraud (marca registrada) para el recuento de mohos (incubación: de 3 a 7 días a 23 °C ± 2 °C).

Los resultados se expresan como «unidad formadora de colonias» por mililitro (ufc/ml).

Este método de análisis permite detectar una contaminación a partir de 10 ufc/ml (límite de detección). No podrá detectarse una contaminación inferior a 10 ufc/ml (<10).

Resultados:

Los resultados se muestran en la siguiente tabla, que resume el número de microorganismos viables (ufc/ml) en los diferentes tiempos de contacto.

Conclusión:

En lo relativo a las bacterias, se observa el mismo comportamiento en las tres cepas (B. cepacia, P. cichorii, P. fluorescens). Se observa un mantenimiento de la población en el suero fisiológico y un aumento en contacto con la muestra PP1.

En lo relativo a los mohos,

- Respecto a A. alternata, se observa una disminución de las poblaciones con el tiempo en el suero fisiológico y en la muestra PP1.

- Respecto a A. melanogenum, se observa un mantenimiento de la población en el suero fisiológico y un aumento en la muestra PP1.

- Respecto a A. brasiliensis, se observa una ligera disminución de la población en el suero fisiológico y un mantenimiento en la muestra PP1.

No obstante, cabe mencionar que los resultados para los mohos deben matizarse debido a la formación de filamentos que hacen que el recuento sea menos preciso que en el caso de las bacterias.

En las condiciones de análisis de laboratorio, tras tres y siete días de contacto, la muestra PP1 no mostró ningún efecto tóxico sobre las cepas estudiadas.

2.b/ Durante el ensayo con Nogal y Xanthomonas arboricola pv juglandis presentado en esta patente. El producto PP1 no muestra ninguna actividad bactericida sobre la bacteria Xanthomonas in vitro, mientras que actúa eficazmente en la lucha contra este parásito en los nogales en el campo (Ejemplo 8).

2.c/ En Xyllela fastidiosa, la aplicación directa del producto PP1 en la bacteria in vitro no tiene un efecto antibacteriano (Ejemplo 3 y 4), mientras que la eficacia contra esta bacteria se demuestra en los ensayos realizados en el campo en el sur de Italia.

Además, en estos mismos ensayos, el producto PP1 también se prueba en condiciones in vitro en otras especies fúngicas principales asociadas a la enfermedad del síndrome del decaimiento rápido del olivo «SDIRO»: Phaeoacremonium, Phaeomoniella, Pleurostomophora, Colletotrichum, Botryosphaeriaceae. El producto PP1 no parece inhibir directamente el crecimiento fúngico in vitro, y todo microorganismo se desarrolla. Sin embargo, en el campo no se encuentra ninguno de estos microorganismos en las drupas de los árboles tratados, mientras que sí se encuentran en los árboles de control. No se ha aislado ningún hongo patógeno en las aceitunas (700) procedentes de los árboles tratados con el producto de la presente invención (Ejemplos 3 y 4).

Asimismo,

3/ una empresa especializada en extracción vegetal (AKINAO, marca registrada, Perpiñán, Francia) ha dosificado el isotiocianato principal de la planta Eruca sativa, y no es detectable en el producto listo para su uso de PP1 (Ejemplo 2).

Una de las principales características de la familia de las Brasicáceas, a la que pertenece la rúcula, es la producción de metabolitos secundarios específicos, denominados glucosinolatos (tioglucósidos aniónicos) (Fahey et al.

2001; Bones and Rossiter 2006). Los glucosinolatos son un grupo importante de metabolitos secundarios no volátiles que contienen azufre.

Sin embargo, los glucosinolatos por sí mismos tienen poca actividad biológica, aunque son hidrolizados por las enzimas tioglucosidasas, llamadas mirosinasas, para formar una variedad de productos de hidrólisis, incluidos los isotiocianatos, nitrilos, epitionitrilos y tiocianatos (Bones and Rossiter 1996). Estos productos de hidrólisis son responsables de la toxicidad de los glucosinolatos para los herbívoros, del sabor y del olor, de su actividad anticancerosa y de casi todas las demás actividades biológicas de los glucosinolatos (Halkier and Gershenzon 2006). Se evita la hidrólisis espontánea de los glucosinolatos en la planta, ya que los glucosinolatos y la mirosinasa se separan en diferentes tejidos o compartimentos celulares. El sistema de defensa glucosinolato/mirosinasa se distribuye en todos los órganos de la planta, incluyendo hojas, raíces, flores, frutos y semillas (Textor and Gershenzon 2009). Cuando se producen daños en los tejidos vegetales, los glucosinolatos se hidrolizan rápidamente por la enzima mirosinasa inherente (p-tioglucósido glucohidrolasa, tioglucosidasa), produciendo los metabolitos de hidrólisis, según el pH y otras condiciones (Bones and Rossiter 2006; 1996; Fenwick et al 1983). El sistema en el que el glucosinolato y la mirosinasa entran en contacto en caso de destrucción tisular se denomina «sistema glucosinolato-mirosinasa» (Bones and Rossiter 2006; 1996).

Así, el complejo glucosinolato-mirosinasa es un sistema de defensa química desarrollado evolutivamente contra los herbívoros y encontrado en los miembros de la familia de las Brasicáceas a la que pertenece la Rúcula (Eruca sativa). Este complejo se considera un sistema de defensa constitutivo e inducible. Es muy dinámico, interactúa con insectos dañinos y constituye un mecanismo bien consolidado de gestión integrada contra plagas (Bones and Rossiter 2006; 1996; Rask et al. 2000; Wittstock et al. 2004; Müller and Sieling 2006). El complejo de defensa permanece inactivo entre las defensas de las plantas mientras que las dos moléculas se mantienen almacenadas en sus respectivos compartimentos en las hojas de las plantas hasta que un herbívoro desgarra la hoja (Tong-Xian Liu and Le Kang 2011).

Los isotiocianatos (ITC) producidos después de la hidrólisis de los glucosinolatos por las mirosinasas desempeñan un papel ecológico crucial en la protección de las plantas contra diversas plagas, incluidos los insectos y los sistemas microbianos.

Diversos estudios han demostrado que los ITC presentan actividades biocidas contra diversas bacterias patógenas. No existe una regla general sobre la eficacia de los ITC frente a diversos tipos de bacterias. Los ITC aromáticos y/o hidroxi parecen presentar sistemáticamente una actividad antimicrobiana superior a la de los alifáticos (Dudour et al.

2015). Sin embargo, este efecto está muy relacionado con la dosis (Aires y al. 2009).

Debido a estas características, se han estudiado los glucosinolatos y sus productos de degradación por su posible uso como pesticidas agrícolas en una técnica conocida como biofumigación. En la biofumigación, un cultivo rico en glucosinolatos se cubre con mantillo en el campo, liberando subproductos secundarios tóxicos de glucosinolatos, con el fin de reducir la incidencia de plagas, malas hierbas y enfermedades en los cultivos herbáceos y hortícolas siguientes (Ngala et al. 2015; Lord et al. 2011).

Sin embargo, obtener este complejo en un producto de extracción vegetal es muy complejo. Los productos hidrolíticos de glucosinolatos son metabolitos volátiles importantes que son difíciles de extraer. El éxito de las extracciones depende de las diferentes condiciones, como el método de extracción, el disolvente y los métodos de secado. Así, un método de extracción preciso y eficaz es primordial para extraer estos valiosos compuestos, que posteriormente pueden utilizarse para diferentes actividades biológicas: anticancerígenas, antimutágenicas, bioherbicidas, antimicrobianas, antigenotóxicas y antitumorales (Arora et al. 2014).

En nuestro caso, en el proceso de producción de PP1, las hojas, tallos, semillas, raíces o flores son trituradas y altamente diluidas en agua lo que hace muy difícil la formación del complejo glucosinolato-mirosinasa, ya que la probabilidad de que la enzima mirosinasa entre en contacto con su sustrato glucosinolato es muy baja y, de esta forma, se evita la formación de productos tóxicos.

Ejemplo 2 - Demostración de la ausencia de Erucina en el extracto PP1

En el caso de la rúcula (Eruca sativa Mill. y Diplotaxis tenuifolia L.), la glucoerucina es un glucosinolato encontrado en concentración elevada que puede hidrolizarse en Erucina.

Como se ha indicado anteriormente, los isotiocianatos (ITC) son el producto de la reacción de los glucosinolatos vegetales con la mirosinasa, una enzima liberada por la desintegración de los tejidos vegetales. Este sistema mirosinasaglucosinolato está presente en las plantas de la familia de las Brasicáceas, como la rúcula. Los ITC son sustancias volátiles que ejercen un efecto inhibidor sobre muchos microorganismos patógenos en concentraciones bajas, lo que los convierte en candidatos antimicrobianos prometedores (Dufour et al. 2015). Los isotiocianatos naturales estrechamente relacionados con el sulforafano (SF) ya han demostrado su efecto bactericida (erucina, berteroina, hirsutina, isotiocianato de fenetilo y alisina) (Wittstock and Gershenzon 2002; Fahey et al. 2013). Por ejemplo, Ganin (2013) descubrió que el sulforafano y la erucina, dos isotiocianatos naturales muy abundantes en el brócoli, la rúcula y otras hortalizas crucíferas, inhiben fuertemente la percepción de cuórum y la virulencia de la Pseudomonas aeruginosa.

De acuerdo con el protocolo seguido, el procedimiento de extracción de PP1 se basa en la trituración y extracción acuosa de hojas, tallos, flores, semillas o raíces de rúcula, y el resultado de esta extracción se diluye muy bien en agua durante su uso. Esta técnica hace muy difícil la formación del complejo glucosinolato/glucoerucina/mirosinasa.

Para confirmar esta afirmación, hemos optado por detectar la Erucina, isotiocianato principal en las hojas de rúcula (Eruca sativa), en el producto probado en la invención, extraído aquí a partir de Eruca sativa:

Las dosificaciones se confiaron a un laboratorio especializado en extracción vegetal: AKINAO, sito en Perpiñán (Francia). AKINAO desarrolló un método de análisis de Erucina en una muestra de PP1, con la dilución de uso.

Material y método:

Estándares analíticos y reactivos:

Las referencias de los estándares analíticos y los reactivos se indican en la siguiente tabla:

Los principales equipos empleados en este estudio se indican en la siguiente tabla:

Ejecución:

Se ha desarrollado y validado un método de extracción de la erucina en términos de rendimiento mediante el método de los añadidos dosificados. La erucina se ha obtenido mediante extracción líquido/líquido con un disolvente orgánico. Se ha realizado una segunda extracción en fase sólida (SPME por sus siglas en inglés) para validar los resultados.

Los extractos fueron analizados por cromatografía de gases y espectrómetro de masas (marca registrada). El desarrollo del método analítico se realizó a partir de una solución de estándar analítico de erucina. La detección y cuantificación se realizaron en los iones específicos de la erucina para aumentar la sensibilidad del análisis mediante calibración externa.

Resultados:

En la figura 12 se representan los cromatogramas obtenidos en los análisis de una solución de estándar analítico y de las tres réplicas de muestra: Cromatograma en modo SIM del estándar de erucina (1 pg/ml) de las tres réplicas de muestra.

El intervalo de linealidad oscila entre 0,1 y 50 pg/ml de muestra. El límite de detección de erucina en estas condiciones se estima en 0,2 pg/ml.

No se observó erucina en la muestra.

La invención se refiere a la utilización de un extracto obtenido mediante extracción acuosa de al menos una parte de plantas de Rúcula, preferentemente seleccionada entre el grupo de plantas de Rúcula del género Eruca (E. sativa, Eruca vesicaria...), Diplotaxis (D. erucoides, D. tenuifolia, D. muralis....), Bunias (B. erucago, B. orientalis...), Erucastrum (E. nasturtiifolium, E. incanum...) y Cakile, para estimular las defensas de las plantas o árboles y reducir los efectos de:

- la bacteria Xyllela fastidiosa sobre polígalas de hojas de mirto, vides, olivos, cítricos, adelfas, almendros, cafetos, melocotoneros y árboles frutales de hueso, robles, lavanda, romero o retama,

- la bacteria Pseudomonas syringae pv actinidiae en las plantas del género Actinidia,

- la bacteria Xantomonas arboricola pv juglandis sobre el nogal,

- la bacteria Xanthomonas arboricola pv. pruni en los Prunus spp., y preferentemente del grupo de los siguientes árboles frutales: albaricoquero, almendro, cerezo, melocotonero, ciruelo, P. salicina, laurel cerezo, así como otros Prunus exóticos u ornamentales, incluidos el P. davidiana y el P. laurocerasus,

- el fitoplasma bacteriano del decaimiento del peral o Candidatus Phytoplasma pyri en el peral,

- la bacteria Candidatus Phytoplasma solani en la vid, la lavanda, la patata, el tomate, la berenjena, el pimiento y el tabaco,

- el hongo Plasmapora viticola en la vid, o Phytophtora infestans en las patatas y tomates, Phytophtora citrophtora en los cítricos, Phytophtora cactorum en los perales y manzanos, Bremia lactucae en la alcachofa, o

- los hongos de tipo oídio como Podosphaera pannosa en el rosal, y Erysiphe necátor, anteriormente Uncinula necator, en la vid, pero también los oídios en el tomate, la lechuga, el pepino, el fresal, el frambueso, el grosellero, el melocotonero, el peral, la alheña y el clavel.

En aras de la claridad y la concisión, aunque los ejemplos de la siguiente descripción no cubren todas las combinaciones de agentes patógenos y de plantas o árboles indicados anteriormente, demuestran la eficacia de la presente invención en todas estas combinaciones.

En ausencia de efectos antibacterianos y antifúngicos, PP1 actúa estimulando las defensas de las plantas y permitiendo que las plantas tratadas se defiendan por sí mismas frente a los agentes patógenos. PP1 puede definirse como un elicitor, dado que las moléculas que poseen la propiedad de inducir en la planta una cascada de reacciones de defensa frente a los agentes patógenos se denominan elicitores.

La demostración de la actividad elicitora de los mecanismos de defensa se demuestra asimismo en varios niveles:

4.1/ PP1 no presenta ninguna actividad directa antibacteriana o antifúngica como se ha descrito anteriormente.

4.2/ La demostración de la producción de moléculas de defensa, como el ácido jasmónico, el ácido salicílico o las peroxidasas, se realizó después del tratamiento con PP1, en condiciones de infección en el nogal tratado con PP1 e infectado por Xanthomonas arboricaola pv juglandis, y en la vid tratada con PP1, e infectada por Candidatus phytoplasma solani (demostración de eficacia y estimulación de la defensa) (Ejemplos 8 y 11).

De hecho, en ausencia de actividad antibacteriana y antifúngica directa, PP1 tiene la particularidad de estimular las defensas de las plantas, y permitir que estas reaccionen eficazmente, incluso en el caso de agentes patógenos invasivos, difíciles de combatir.

En efecto, la eficacia de PP1 se ha demostrado en los siguientes casos, junto con una estimulación de las defensas de las plantas:

- eficacia de PP1 frente a Xanthomonas campestris pv juglandis: Una prueba in vitro muestra que PP1 no tiene ninguna actividad antibacteriana frente a Xanthomonas. Se observa una fuerte producción de ácido salicílico y peroxidasa en plantas tratadas e infectadas.

- eficacia de PP1 frente al Candidatus phytoplasma solani (fitoplasma de Stolbur) de la Vid (Vitis vinifera). Se detectó ácido jasmónico en los árboles tratados con PP1 e infectados.

- En el caso del ataque de la plaga cuarentenaria de Xyllela fastidiosa en el olivo, se ha demostrado que PP1 no tiene ningún efecto sobre el crecimiento de la bacteria in vitro. Pero como en el resto de modelos, PP1 muestra una eficacia significativa contra la Xyllela fastidiosa del olivo (Ejemplos 3 a 5), permitiéndoles recuperar vigor y volver a producir nuevos brotes y frutos (Ejemplos 3 a 5).

- Para entender el funcionamiento de PP1 en olivos enfermos, es muy importante descifrar cómo los síntomas observados en los olivos infectados se producen por la infección por Xyllela fastidiosa. Tras una infección por un patógeno específico del xilema, las plantas despliegan diversas respuestas de defensa, que incluyen compuestos implicados en la constitución de barreras físicas (como la formación de tilosis, por ejemplo) o incluso compuestos que integran las vías metabólicas relacionadas con la defensa (como compuestos fenólicos, proteínas PR, fitoalexinas y peroxidasas, por ejemplo). La finalidad de estos es detener la propagación de los patógenos e inhibir así su replicación (Rapicavoli et al.

2018).

En algunos casos muy específicos, las células del Xilema sufren la muerte celular programada y, por consiguiente, no son capaces de desencadenar las respuestas de defensa por sus propios medios (Yadeta and Bart 2013; Hilaire et al. 2001; Berne and Javornik 2016; Rep et al. 2002). Los patógenos vasculares son entonces probablemente reconocidos por receptores en las células del parénquima vivo que rodea el xilema (Yadeta and Bart 2013; Berne and Javornik 2016).

En el caso específico de la Xyllela fastidiosa, las bacterias colonizan los vasos del xilema de las plantas huéspedes y provocan la producción de oclusiones prolíficas del xilema, que reducen la conductividad hidráulica en la planta (Sun et al. 2013; Choat et al. 2009). El marchitamiento de las partes de la planta como consecuencia de una disfunción del xilema es el síntoma más visible de este tipo de enfermedad. Daugherty (2010) demostró claramente en sus estudios que la Xyllela genera estrés hídrico en la alfalfa. Existen muchos factores que pueden contribuir a la oclusión del xilema, como los polisacáridos de alto y bajo peso molecular, secretados por la bacteria durante la colonización del xilema, o la presencia de la biomasa patógena (células bacterianas) (Yadeta and Bart 2013).

Sin embargo, las respuestas de defensa de las plantas también pueden contribuir a la oclusión del xilema, como la formación de tilosis por las células parenquimatosas y la secreción de gomas y geles (Fradin and Thomma 2006; Klosterman et al. 2009; Beattie 2011). La embolia (la formación de burbujas de aire) en los vasos del xilema es asimismo otro factor que puede reducir la conductividad hidráulica del xilema (Pérez-Donoso et al. 2007).

No obstante, esta respuesta de estrés eficaz puede volverse contra la propia planta. Diversos estudios, especialmente en la vid (Vitis vinifera), han demostrado que la formación extensiva de oclusiones vasculares en la planta no impide la propagación sistémica del patógeno, pero puede reducir significativamente la conductividad hídrica de la planta y contribuir así al desarrollo de los síntomas de la enfermedad (Sun et al. 2013).

Gracias a los estudios realizados en otros cultivos atacados por Xyllela fastidiosa, como la vid, se sugiere que la multiplicación de la bacteria es el único factor responsable del bloqueo del movimiento del agua en el xilema de la planta. Sin embargo, diversos estudios realizados por Pérez-Donoso (2007) muestran (utilizando la resonancia magnética) que las obstrucciones vasculares resultantes de las respuestas activas de la vid a la presencia de Xylella provocan una disminución de la conductividad del xilema y probablemente otros aspectos de la enfermedad. Estos síntomas de asfixia estarían relacionados con la defensa de la planta más que con la acción directa de la bacteria.

Sin embargo, los resultados obtenidos con PP1 demuestran que los olivos infectados y tratados con PP1 logran superar estas oclusiones en los vasos provocadas por la formación de tilosis, gomas, geles y el síndrome de asfixia se hace reversible (Ejemplos 3 a 5). Los árboles infectados recuperaron su crecimiento tras el tratamiento con PP1. Esto nos permite proponer dos hipótesis que pueden no ser exclusivas sino complementarias:

1. PP1 permite activar mecanismos de degradación de las tilosis, gomas o geles que obstruyen los vasos del olivo mediante enzimas o procedimientos específicos (combinados con mecanismos metabólicos relacionados con la defensa como los compuestos fenólicos, las proteínas PR, las fitoalexinas, etc.).

2. PP1 permite el desarrollo activo, en respuesta a la infección, de nuevos vasos de xilema que conducirán la savia.

4.3/ Aunque no tiene actividad antimicrobiana, PP1 tiene una eficacia significativa contra diferentes patógenos en pleno campo, difíciles de vencer (Ejemplos 3 a 15).

Como se ilustra en la figura 1, en un modo de realización, el procedimiento de fabricación y de utilización de la composición aquí divulgada incluye una etapa 105 de extracción de un extracto de planta de rúcula. Por ejemplo, esta extracción se realiza según el siguiente procedimiento:

- Durante una etapa de trituración 110, las hojas, las raíces, los tallos, las semillas y/o las flores de rúcula se trituran finamente con agua corriente durante quince minutos en un aparato mezclador apropiado, para obtener un triturado homogéneo.

- Durante una etapa de filtración 115, el triturado se filtra para separar los restos de hojas y obtener un líquido verde sin residuos (el filtrado), que constituye el producto objeto de la presente invención.

En una variante, al menos uno de los principios activos de la materia triturada se obtiene mediante extracción de aceite.

En una variante, al menos uno de los principios activos de la materia triturada se obtiene mediante extracción con disolvente, mediante extracción mecánica o por microondas o por extracción de tortas o de pastas.

En una variante, al menos uno de los principios activos se obtiene mediante extracción mecánica o extracción en microondas.

Como variante, la etapa de extracción 105 consta de una etapa de compresión de las hojas, raíces, tallos, semillas o flores de rúcula y de recogida del líquido extraído, por simple gravedad o por centrifugación. Como variante, se aplica una simple centrifugación durante la etapa de extracción 105, para extraer el líquido de las partes de rúcula utilizadas.

Como se expone en la siguiente descripción, el inventor ha descubierto que el uso de este producto obtenido mediante extracción acuosa tiene un efecto significativo en los árboles y plantas mencionados anteriormente infectados por los agentes patógenos mencionados supra.

Se observa que el producto líquido obtenido al final de la etapa 105 puede formularse para facilitar su utilización. Por ejemplo, puede utilizarse en forma de polvo, polvo soluble, polvo mojable, granulado, granulado dispersable o granulado mojable o de difusión lenta, que debe diluirse en agua en el momento de su utilización, líquido, líquido concentrado soluble, concentrado emulsionable, suspensión concentrada, o lista para su uso, en función de la formulación elegida y de la utilización prevista. Las formulaciones se realizan a partir del producto de la etapa de extracción 105 según técnicas conocidas por los especialistas.

Las fracciones activas pueden purificarse potencialmente por cualquier medio para facilitar la formulación. Pueden añadirse diferentes etapas de extracciones para mejorar su calidad.

El producto objeto de la invención puede diluirse en agua, en función de la dosis requerida, en el momento de su utilización.

En lo relativo a la utilización durante la etapa 120 y la formulación del producto, el producto acabado puede aplicarse en cualquier forma (formulación líquida, polvo, polvo soluble, granulados, granulados dispersables, granulados de dispersión lenta y cualquier formulación) según los usos y la formulación prevista. El producto puede utilizarse por vaporización foliar, riego del suelo, irrigación del suelo, goteo, cultivos hidropónicos, tratamiento de semillas y/o recubrimiento de semillas, etc.

El producto puede utilizarse con una frecuencia comprendida entre un día y ciento veinte días, o de forma continua, o según las etapas clave del desarrollo vegetal, o de acuerdo con las buenas prácticas agrícolas y el calendario de tratamientos previstos para cada especie vegetal. El producto puede mezclarse con otros productos (productos fitosanitarios, soportes de cultivos y materias fertilizantes, fertilizantes, abonos, biocidas o cualquier otro producto destinado a la agricultura).

Las dosis y frecuencia de aplicación se adaptan a los usos y los modelos vegetales.

Las dosis de aplicación están comprendidas, por ejemplo, entre 0,001 g/L y 500 g/L de plantas extraídas, preferentemente comprendida entre 2 g/L y 150 g/L de plantas extraídas y, más preferentemente, comprendidas entre 5 g/L y 70 g/L de plantas extraídas, expresadas en gramos de plantas de las que se ha realizado la extracción por litro de producto.

Las dosis por litro o por hectárea podrán adaptarse a los tipos de plantas infectadas, al grado de infección y a los síntomas causados por las bacterias. Las dosis y frecuencias de tratamientos con el producto objeto de la presente invención también se adaptarán a la estrategia de acción preventiva o curativa contra estas bacterias.

Las plantas de rúcula de las que se obtienen los extractos utilizados en la presente invención deben estar preferentemente recién recolectadas. De manera alterna, las plantas de rúcula o las partes útiles se secan de manera adecuada, según un método conocido por los especialistas.

La trituración puede realizarse con dos trituradoras (de una potencia de 1000 W y 700 W), que se utilizan con diferentes velocidades de cuchilla. El primer triturado obtenido en 10 minutos de trituración se vierte a continuación en la segunda trituradora con una velocidad de cuchilla más rápida. El triturado es homogéneo, sin residuos visibles de partes de hojas, tallos o flores. La cantidad de agua añadida durante la trituración es de 200 ml de agua a temperatura ambiente por cada 100 g de hojas, tallo, raíz, flor o semilla.

Se realizan dos filtraciones sucesivas con un tejido de filtración de nylon (Dutcher, marca registrada) de 1000 pm y después de 500 pm. La filtración se realiza a temperatura ambiente, sin presión.

Para la recogida del filtrado, que está activo, en función de la cantidad a pulverizar, se adapta la dilución (dosis por hectárea). Según los usos, entre 5 g de plantas extraídas por litro de producto para pulverizar y 20 g de plantas extraídas por litro de producto para pulverizar, como se describe a la vista de los ejemplos.

La inventora comprobó que el filtrado obtenido se conserva al menos seis días en bidón a temperatura ambiente, sin perder su actividad de estimulación de las defensas de plantas y árboles.

El extracto de al menos una parte de plantas de Rúcula puede ser, por lo tanto, un extracto líquido de Rúcula del género Eruca obtenido a partir de un triturado de dichas plantas de Rúcula, y:

- dicho extracto de al menos una parte de planta de Rúcula contiene al menos algunas hojas de Rúcula, de preferencia esencialmente hojas y

- el procedimiento que permite obtener dicho extracto líquido comprende las siguientes etapas:

a) una etapa de trituración en medio acuoso de dichas plantas de Rúcula del género Eruca;

b) la filtración del triturado obtenido; y

c) la recogida del extracto líquido de Rúcula del género Eruca obtenido tras la filtración.

En relación con la formulación en forma de polvo, granulados, granulados dispersables o granulados de difusión lenta, se aplica una temperatura de secado y, en algunos modos de realización, las partículas se recubren con otras moléculas naturales (preferentemente muy hidrófilas) que permiten una disolución muy buena en agua. Se trata de formulaciones clásicas en agricultura, en particular para los productos fitosanitarios, destinadas a ser transportadas y almacenadas en forma de polvo, etc., y diluirse en agua justo antes de su aplicación.

En un modo de realización, la presente invención se refiere a la utilización de un extracto de planta obtenido a partir de al menos una parte de planta de rúcula para estimular las defensas de plantas o árboles y reducir los efectos de la bacteria X. fastidiosa en alguno de los árboles siguientes:

- Polígala de hojas de mirto,

- Vid,

- Olivo,

- Cítricos,

- Adelfa,

- Almendro,

- Cafeto,

- Melocotonero, árboles frutales de hueso,

- Roble,

- Lavanda,

- Romero y

- Retama.

La Xylella fastidiosa es una bacteria gramnegativa que causa graves enfermedades en muchos cultivos económicamente importantes, como la enfermedad de Pierce en la vid, la clorosis abigarrada (variegated chlorosis) en los cítricos o las quemaduras foliares (leaf scorch) en el almendro, etc.

La X. fastidiosa es la única especie del género Xylella. Esta bacteria tiene seis subespecies y varias cepas (líneas genéticas), cuyo espectro de hospedadores, virulencia y expresión de síntomas resultan variables.

La X. fastidiosa coloniza exclusivamente los vasos del xilema (tejido conductor) de las plantas infectadas. Esta bacteria se transmite de las plantas enfermas a las plantas sanas a través de los insectos (picadores, chupadores) que se alimentan de la savia bruta del xilema.

La colonización de X. fastidiosa en los vasos del xilema bloquea el transporte de agua y nutrientes de la raíz al tallo y las hojas, lo que provoca la muerte de las plantas infectadas.

La infección geográfica afecta a la mayoría de los países del mundo.

Ante la ausencia de soluciones fitosanitarias, la X. fastidiosa causa daños irreparables en un gran número de cultivos económicamente importantes en todo el mundo. La pérdida económica causada por la X. fastidiosa en las cosechas se estima en varios miles de millones de dólares cada año.

Ejemplo 3 - Los elementos que demuestran la eficacia del producto probado en la invención contra la Xyllela fastidiosa en plantones de olivos se indican a continuación. Con el fin de facilitar la lectura de la descripción y de reducir su extensión, a continuación solo se indican los elementos relativos al olivo.

En las figuras 3 y de 6 a 11, las barras verticales representan, de izquierda a derecha, los datos de las tablas, recorridas de arriba a abajo. Así, por cada fecha, las siete barras verticales más a la izquierda afectan a los árboles tratados y las siete barras más a la derecha, a los árboles de «control».

A continuación se indican los resultados obtenidos con dicho producto en un primer ensayo con olivos infectados por X. fastidiosa, en una zona declarada de cuarentena (decisión oficial de las autoridades italianas). El experimento consistió en seis tratamientos con el producto en las siguientes fechas:

- 3 de septiembre

- 16 de septiembre

- 26 de septiembre

- 5 de octubre

- 31 de octubre y

- 12 de noviembre.

La recogida de datos en la zona se realizó en las siguientes fechas:

- 5 de octubre

- 27 de octubre

- 30 de noviembre

- 18 de diciembre y

- 20 de enero.

En esa parcela, los olivos mostraban síntomas acusados de la enfermedad causada por la Xyllela fastidiosa, y las ramas fueron objeto de una intensa poda. Por este motivo, no se mide en este experimento el peso de la cosecha ya que esta intensa poda impidió que los olivos produjesen aceitunas.

Durante los estudios mencionados anteriormente, se realizaron las siguientes lecturas.

1. El porcentaje de superficies foliares necrosadas o superficies pardas (estimación) en las plantas tratadas y las plantas de control, adoptando una escala de evaluación empírica que permita evaluar un índice de infección. Las hojas nuevas pueden medirse una vez transcurrido un mes desde el inicio del tratamiento.

2. El nivel de decaimiento de los olivos asociado a la X. fastidiosa en las plantas tratadas y en las plantas de «control».

3. El nivel de recuperación de la vegetación (número de nuevas hojas jóvenes) en los olivos tratados y los olivos de «control».

4. El producto se prueba in vitro con la bacteria X. fastidiosa (en un laboratorio acreditado) y otras especies fúngicas principales asociadas a la enfermedad SDIRO (síndrome de decaimiento rápido del olivo causado por X. fastidiosa): Phaeoacremonium, Phaeomoniella, Pleurostomophora, Colletotrichum, Botryosphaeriaceae.

5. El contenido de clorofila de las hojas (Spad index) de las plantas tratadas y de las plantas de «control». 6. La conductancia estomática (potencial de agua) en las plantas tratadas y en las plantas de «control».

Los resultados obtenidos se comentan punto por punto a continuación.

Actividades/resultados:

1. Porcentaje de superficies foliares necrosadas o de superficies pardas (estimación), adoptando una escala de evaluación empírica que permita evaluar un índice de infección.

Resultados:

Durante todos los controles, en los árboles tratados con el producto no se observaron los síntomas asociados a la X. fastidiosa (hojas necrosadas). El crecimiento de todos los árboles tratados es bueno y exento de síntomas hasta el 20 de enero (última evaluación).

2. El nivel de decaimiento de los olivos relacionado con la X. fastidiosa

Resultados:

Durante los cuatro primeros controles, no se observaron síntomas asociados al decaimiento en los árboles tratados con el producto de la presente invención. Durante el último control de 20 de enero, solo un olivo mostró síntomas de decaimiento. En cambio, en todas las plantas de «control» no tratadas, aparecieron y progresaron los síntomas.

Los resultados del análisis de inmunoadsorción enzimática (ELISA por sus siglas en inglés) realizados en hojas sintomáticas fueron positivos, demostrando la presencia de X. fastidiosa. Además, los resultados también fueron positivos en todas las muestras de todos los árboles tratados o no.

3. El nivel de recuperación de la vegetación (número de hojas nuevas jóvenes)

Resultados:

Como se muestra en la figura 3, todos los árboles muestran una buena respuesta a los tratamientos con el producto. La evaluación del desarrollo de las últimas ramas del año en curso se realiza mediante recuento de las hojas a partir del punto de inserción (figura 2).

En efecto, los olivos controlados no tratados produjeron un número reducido de hojas nuevas, menos de veinte por rama, mientras que los olivos tratados produjeron un número muy superior a veinte, en algunos casos hasta veintisiete. En los gráficos, los números hacen referencia a los valores medios de doce datos, tres por cada punto cardinal.

Tratamientos 5 octubre 27 octubre 30 noviembre 18 diciembre 20 enero

TRT1 9 17 19 19 19

TRT2 12 16 16 16 16

TRT3 11 14 17 18 18

TRT4 15 18 19 20 21

TRT5 14 22 24 24 24

TRT6 11 25 27 27 27

TRT7 16 22 25 26 26

CTR1 5 13 17 18 18

CTR2 7 13 14 15 15

CTR3 6 12 15 15 15

CTR4 5 9 11 11 12

CTR5 4 14 15 16 16

CTR6 3 12 17 18 18

CTR7 5 13 14 14 15

4. El producto se prueba in vitro con la bacteria X. fastidiosa (en un laboratorio acreditado) y otras especies de hongos destacadas asociadas a la enfermedad SDIRO: Phaeoacremonium, Phaeomoniella, Pleurostomophora, Colletotrichum, Botryosphaeriaceae.

Resultados:

Se realizaron dos tipos diferentes de ensayos como se indica:

Vaporización: el producto se vaporizó en cajas de Petri que contenían un medio de cultivo de agar de papa y destroxa (en inglés Potato Dextrose Agar, PDA). Cuando el producto es totalmente absorbido por el medio, las especies de hongos se han transferido. El crecimiento fúngico de cada especie se observó cada siete días durante veintiún días. La figura 4 representa la última observación. Las columnas de cajas representan sucesivamente de izquierda a derecha 100 ppm, 10 ppm, 1 ppm, 100 ppm, 10 ppm, 1 ppm. A la izquierda se encuentran de arriba a abajo las cajas de Botryosphaeriaceae, C. gloeasporioides, R. necatrix, V. dahliae, Pl. richardsiae. A la derecha se encuentran de arriba a abajo las cajas de Pm. scolyti, Pm. italicum, Pm. minimum, Pm. Parasiticum y Phaeomoniella spp.

Introducción: el producto se introdujo en el medio PDA antes de la solidificación. Se utilizaron tres concentraciones diferentes: 100, 10 y 1 ppm. Cuando las cajas de Petri se solidificaron completamente, las especies de hongos se transfirieron. El crecimiento fúngico de cada especie se observó cada siete días durante veintiún días. La figura 5 representa la última observación.

En la fila superior de la figura 5, de izquierda a derecha, se observa Phaeomoniella spp, Pl. richardsiae, Pm. parasiticum y Pm. minimum. En la fila inferior de la figura 5, de izquierda a derecha, se observa Pm. italicum, Pm. scolyti, V. dahliae y R. necatrix.

Resultados:

Como el producto es un extracto natural no esterilizado en autoclave, al vaporizarlo sobre la superficie del medio de cultivo o introducirlo en este medio, numerosas bacterias saprófitas ralentizaron y dificultaron el crecimiento de los hongos patógenos analizados (véanse las figuras 4 y 5). El mismo problema se detectó en las pruebas con X. fastidiosa. En efecto, la X. fastidiosa es una bacteria de crecimiento muy lento, por lo que su desarrollo se frena fácilmente por las bacterias saprófitas de crecimiento más rápido. Pese a estas observaciones, el producto no parece inhibir directamente el crecimiento de hongos, y cada microorganismo probado parece ser capaz de desarrollarse en ambas situaciones (vaporización e introducción del producto).

5. El contenido en clorofila de las hojas (Spad Index)

Resultados:

Este parámetro ha sido detectado por el medidor de clorofila SPAD-50 Minolta (marca registrada). Es un aparato de medición in vivo de la cantidad total de clorofila contenida en los tejidos de la planta y que mide así indirectamente el estado nutricional de la planta. Como se muestra en la figura 6, el resultado de la calidad fotosintética de las hojas tratadas con el producto es mejor que el de las hojas de las plantas no tratadas. Puede afirmarse que las plantas tratadas con el producto presentan una mayor capacidad para transportar los nutrientes y el agua que las plantas no tratadas.

Tratamientos 5 octubre 27 octubre 30 noviembre 18 diciembre 20 enero

TRT1 70,5 81,4 70,5 67,2 66,6

TRT2 75,1 81,6 75,1 70,2 68,1

TRT3 75,3 85,8 75,3 65,4 69,8

TRT4 80,2 98,7 80,2 62,3 66,1

TRT5 78,7 88,2 78,7 66,4 67,0

TRT6 91,3 104,5 91,3 69,5 64,9

TRT7 88,7 95,5 88,7 63,9 65,1

CTR1 67,1 76,4 67,1 58,4 49,9

CTR2 58,4 67,5 58,4 54,0 57,2

CTR3 47,8 58,9 47,8 50,2 51,8

CTR4 63,2 68,9 63,2 55,2 51,9

CTR5 71,0 78,9 71,0 49,5 51,6

CTR6 64,9 81,3 64,9 55,4 54,5

CTR7 69,9 79,3 69,9 59,1 55,9

6. La conductancia estomática (potencial de agua)

Resultados:

En la figura 7 se trasladan los valores de la conductancia estomática. Están directamente relacionados con el potencial de transporte del agua de la planta (es decir, su capacidad para desplazar la savia de las raíces a las hojas). Los valores más elevados de la conductancia estomática indican la excelente capacidad de los vasos para transportar la savia bruta hacia las hojas. Como se muestra en la figura 7, durante los controles, los valores son siempre más elevados en los olivos tratados con el producto probado en la invención que en los olivos no tratados. Las diferencias disminuyen durante los periodos de invierno, lo que debe relacionarse con el metabolismo del árbol durante este periodo.

Tratamientos 5 octubre 27 octubre 30 noviembre 18 diciembre 20 enero

TRT1 98,3 135,1 96,3 65,9 64,2

TRT2 89,3 97,8 92,2 72,8 73,9

TRT3 85,5 122,6 101,9 88,2 79,5

TRT4 108,2 108,6 97,2 69,9 74,3

TRT5 91,3 92,5 90,4 71,5 67,9

TRT6 87,6 98,6 88,1 65,3 68,5

TRT7 97,2 92,4 86,5 69,9 66,3

CTR1 53,8 63,5 56,9 55,2 54,4

CTR2 58,4 56,5 62,7 60,1 61,3

CTR3 64,1 68,7 64,7 60,6 59,4

CTR4 52,1 62,9 78,5 58,9 55,4

CTR5 46,7 76,3 66,3 57,7 58,6

CTR6 56,9 76,1 80,5 57,6 58,9

CTR7 51,2 66,2 78,4 69,0 58,9

Conclusión

Sobre la base de los resultados obtenidos, puede determinarse que el tratamiento con dicho producto ha sido capaz de limitar los síntomas de X. fastidiosa en todas las plantas tratadas, aunque los análisis ELISA efectuados en muestras recogidas el 5 de octubre y el 20 de enero siguen siendo positivos en lo que respecta a la presencia de la bacteria.

Esto quiere decir que el producto, en estas condiciones de experimentación, no es capaz de erradicar completamente la bacteria de las plantas, pero que permite a los olivos, después de solo seis tratamientos, recuperar una capacidad de crecimiento normal (aumento del número de hojas, aumento de la fotosíntesis, aumento de la conductancia estomática). El producto permite limitar significativamente los efectos de la bacteria X. fastidiosa. Además, los tratamientos comenzaron a finales del verano (el peor momento para comenzar un ensayo), y continuaron durante el otoño (época en que las plantas no son fácilmente receptivas).

Con la finalidad de confirmar los efectos del producto en los olivos, se realizó otro ensayo.

Ejemplo 4 - Los resultados obtenidos se presentan a continuación en este segundo ensayo contra la Xyllela fastidiosa del olivo, con el producto probado en la presente invención. El olivar utilizado en el ensayo se encuentra en una zona infectada donde la presencia de X. fastidiosa fue referenciada en octubre de 2013.

El ensayo consistió en siete tratamientos con el producto de la presente invención, efectuados en las siguientes fechas:

- 19 de mayo

- 26 de mayo

- 10 de junio

- 22 de julio

- 10 de agosto

- 7 de septiembre y

- 7 de octubre

La recogida de datos en la zona se realizó en las siguientes fechas:

- 13 de mayo

- 15 de junio

- 6 de octubre y

- 24 de noviembre.

1. El porcentaje de superficies foliares necrosadas o superficies pardas (estimación) en las plantas tratadas y las plantas de «control», adoptando una escala de evaluación empírica que permita evaluar un índice de infección. Las hojas nuevas podrían medirse una vez transcurrido un mes desde el inicio del tratamiento.

2. El nivel de decaimiento de los olivos asociado a la X. fastidiosa en las plantas tratadas y en las plantas de «control».

3. El nivel de recuperación de la vegetación (número de nuevas hojas jóvenes) en los olivos tratados y los olivos de «control».

4. El peso de la cosecha (si hay). Es probable que los olivos utilizados en el ensayo no sean capaces de producir aceitunas porque se han sometido a una intensa poda.

5. El producto se prueba in vitro con la bacteria X. fastidiosa (en un laboratorio acreditado) y otras especies de hongos destacadas asociadas a la enfermedad SDIRO: Phaeoacremonium, Phaeomoniella, Pleurostomophora, Colletotrichum y Botryosphaeriaceae.

6. El contenido en clorofila de las hojas (Spad Index) de las plantas tratadas y de las plantas de «control». 7. La conductancia estomática (potencial en agua) en las plantas de referencia y las plantas tratadas.

8. Un análisis ELISA que detecta la presencia de la bacteria X. fastidiosa en muestras de aceitunas extraídas durante cada fase de recogida, incluso antes de los tratamientos (5 pruebas).

Los resultados obtenidos se comentan punto por punto a continuación.

Actividades/resultados:

1. Porcentaje de superficies foliares necrosadas o de superficies pardas (estimación)

Resultados:

Todas las plantas fueron podadas el 13 de mayo para eliminar todas las partes sintomáticas. El 19 de mayo se realizó una primera lectura para anotar los niveles de clorofila y de conductancia estomática, así como para confirmar la presencia de la bacteria X. fastidiosa. Posteriormente, y a lo largo de todos los controles, no se observaron los síntomas de X. fastidiosa asociados a las hojas necrosadas en las plantas tratadas con el producto de la presente invención. El crecimiento de todas las plantas tratadas con el producto fue bueno y exento hasta el 24 de noviembre, mientras que las plantas de «control» no tratadas mostraban síntomas de decaimiento como la necrosis apical de las hojas y su amarilleamiento.

2. El nivel de decaimiento de los olivos asociado a la X. fastidiosa

Resultados:

Durante el ensayo no se observaron los síntomas asociados al decaimiento en los árboles tratados con el producto de la presente invención, y los árboles tratados mostraron un desarrollo normal durante a lo largo de todo el periodo. Las plantas de «control» no tratadas mostraron rápidamente síntomas de decaimiento.

Durante el último control de 24 de noviembre, solo un olivo tratado mostró síntomas de decaimiento. En este caso, estos síntomas se han asociado con la presencia de hongos patógenos como Phaeoacremonium spp., Botryosphaeriaceae spp. y Phaeocaremonium spp. Estos aislados son agentes patógenos vasculares de la madera de los olivos, responsables del ennegrecimiento de la madera así como del debilitamiento y decaimiento de ramas y tallos. Los aislados de Botryosphaeriaceae son agentes patógenos responsables del decaimiento en las plantas leñosas, incluido el olivo. Las muestras recogidas entre las plantas de «control» no tratadas y que presentan los síntomas del deterioro característico de la X. fastidiosa están asimismo infectadas por los mismos hongos anteriormente mencionados. La presencia de hongos vasculares y hongos de la madera está en correlación con la edad de la planta. Estos hongos son comunes en los olivos y son la causa de un lento deterioro del árbol infectado. Algunos hongos pueden ser más agresivos y causar un rápido decaimiento de una parte o de la planta entera. Por lo general, una buena práctica agrícola como la poda permite reducir los efectos de estos patógenos y su agresividad.

Los resultados de los análisis ELISA realizados en las hojas sintomáticas fueron positivos respecto a la bacteria X. fastidiosa. Además, los resultados también fueron positivos en todos los ejemplos de hojas recogidas de plantas tratadas o no tratadas.

3. El nivel de recuperación de la vegetación (número de nuevas hojas jóvenes).

Resultados:

En la Figura 8 / Tabla 1, todas las plantas tratadas muestran una buena respuesta a los tratamientos con el producto de la presente invención. La evaluación del desarrollo de las últimas ramas del año en curso se realiza mediante recuento de las hojas a partir del punto de inserción y la longitud de la misma rama hasta la siguiente recogida (24 de noviembre).

Última evaluación: Los olivos no tratados produjeron un número reducido de hojas nuevas, menos de 21 por rama (Este, control árbol T7, 24 de noviembre) mientras que los olivos tratados con el producto producen un número de hojas nuevas mayor de 25, en algunos casos el número de hojas fue de 41 (Oeste, control árbol T5, 24 de noviembre).

Además, la diferencia de longitud de las mismas ramas fue significativa (Figura 9 / Tabla 2). En efecto, la mayor longitud alcanzada en los árboles de control fue de 63 cm (Sur, control árbol T7, 24 de noviembre), mientras que la mayor longitud de rama en los árboles tratados fue de 111 cm (Oeste, control árbol T5, 24 de noviembre). Los números indicados en la Figura 9 / Tabla 2 representan los valores medios de doce datos, tres para cada punto cardinal. Los datos se sometieron a un análisis de la varianza (Anova) y a una prueba de Fisher de P<0,01.

4. El peso de la cosecha (si hay)

Resultados:

Desde la intensa poda realizada en los árboles antes de los tratamientos, la producción de aceitunas ha sido muy escasa. La cifra de producción de cada árbol osciló entre 11,5 kg y 25,8 kg.

Pero el diferente nivel de poda inicial entre los árboles no permite demostrar seriamente una diferencia significativa en la cosecha total para cada árbol.

5. Análisis micológicos:

Para los análisis micológicos se utilizaron cien aceitunas de cada árbol tratado y no tratado. No se ha aislado ningún hongo patógeno en las aceitunas (700) procedentes de los árboles tratados con el producto objeto de la presente invención. Solo se detectaron hongos saprobe como Penicillium spp., Aspergillus spp., Mucor spp., Rhizopus spp., (en total 17 aislados), etc.

En cambio, en las aceitunas (700) de los de «control» no tratados, los hongos aislados son:

- 442 aislados de Collototrichum spp. (antracnosis),

- 136 aislados de Botryosphaeriaceae spp. (putrefacción de la drupa),

- 42 aislados de Alternaria/Stemphyllium (fumagina),

- 55 aislados de Fusarium spp. (saprobes o putrefacción de la drupa),

- 25 aislados de Penicillium spp., Aspergillus spp., Mucor spp., Rhizoctonia spp., etc.

5. El producto se prueba in vitro con la bacteria X. fastidiosa (en un laboratorio acreditado) y otras especies de hongos destacadas asociadas a la enfermedad SDIRO: Phaeoacremonium, Phaeomoniella, Pleurostomophora, Colletotrichum y Botryosphaeriaceae.

Se realizaron dos tipos diferentes de ensayo como se indica:

Vaporización: el producto se vaporizó en cajas de Petri que contenían un medio de cultivo de agar de papa y destroxa (en inglés Potato Dextrose Agar, PDA). Cuando el producto es totalmente absorbido por el medio, las especies de hongos se han transferido. El crecimiento fúngico de cada especie se observó cada siete días durante veintiún días.

Introducción: el producto se introdujo en el medio PDA antes de la solidificación. Se utilizaron tres concentraciones diferentes: 100, 10 y 1 ppm. Cuando las cajas de Petri se solidificaron completamente, las especies de hongos se transfirieron. El crecimiento fúngico de cada especie se observó cada siete días durante veintiún días.

Resultados:

Como el producto es un extracto natural no esterilizado en autoclave, al vaporizarlo sobre la superficie del medio de cultivo o introducirlo en el medio, se desarrollaron numerosas bacterias saprófitas que ralentizaron el crecimiento de los hongos patógenos analizados. El mismo problema se detectó con X. fastidiosa. El producto no parece impedir el crecimiento fúngico directamente.

Este resultado es el mismo que el del 1.er ensayo.

6. El contenido en clorofila de las hojas (Spad Index).

Resultados:

Este parámetro ha sido detectado por el medidor de clorofila SPAD-50 Minolta. Es un aparato de medición in vivo de la cantidad total de clorofila contenida en los tejidos de la planta y que mide así indirectamente el estado nutricional de la planta. Como se muestra en la Figura 10 / Tabla 3, puede observarse que el resultado de la calidad fotosintética de las hojas tratadas con el producto es mejor que el de las hojas de las plantas no tratadas. Puede afirmarse que las plantas tratadas con el producto presentan una mayor capacidad para transportar los nutrientes y el agua que las plantas no tratadas.

Los datos se sometieron a un análisis de la varianza (Anova) y a una prueba de Fisher de P<0,01.

Los resultados son significativamente mejores después de varios tratamientos (último control).

7. La conductancia estomática (potencial de agua)

Resultados:

En la Figura 11 / Tabla 4 se trasladan los valores de la conductancia estomática. Están directamente relacionados con el potencial de agua de la planta (es decir, su capacidad para transportar la savia bruta de la raíz a las hojas). Los valores más elevados de la conductancia estomática indican la excelente capacidad de los vasos para transportar la savia bruta hacia las hojas. En todos los controles, los valores son siempre más elevados en los olivos tratados con el producto de la invención que en los olivos no tratados. Los datos se sometieron a un análisis de la varianza (Anova) y a una prueba de Fisher de P<0,01. Los resultados son mejores después de varios tratamientos (último control).

Figura 8 / Tabla 1. Recuperación de la vegetación (número de nuevas hojas jóvenes) en cada planta tratada, incluidas las plantas de «control» (*los valores indicados representan la media de 12 datos, 3 para cada punto cardinal).

Número de hojas

Tratamientos 13 mayo 15 junio 06 octubre 24 noviembre

TRT_1 3,00 26,50 33,25 36,75

TRT_2 3,25 14,75 24,50 28,25

TRT_3 3,00 14,50 23,00 25,75

TRT_4 2,75 18,00 25,50 29,75

TRT_5 2,75 19,25 30,75 35,00

TRT_6 3,00 17,00 24,25 28,25

TRT_7 2,75 17,50 25,50 29,50

CTR_1 3,00 7,75 12,25 13,00

CTR_2 3,50 8,75 15,50 15,75

CTR_3 3,25 9,50 16,25 17,25

CTR_4 2,75 9,00 15,50 16,00

CTR_5 3,00 10,00 15,25 15,50

CTR_6 3,25 10,75 17,00 17,25

CTR_7 3,25 11,25 17,25 19,25

Figura 9 / Tabla 2. Recuperación de la vegetación (longitud de las nuevas ramas) en cada planta tratada, incluidas las plantas de referencia (*los valores indicados representan la media de 12 datos, 3 para cada punto cardinal). Las mismas letras indican que no existen diferencias significativas entre los valores.

Tratamiento 13 mayo 15 junio 6 octubre 24 noviembre

TRT_1 3,25 A* 66,25 B 88,75 B 93,75 B

TRT_2 3,50 A 53,75 B 78,18 B 84,00 B

TRT_3 3,00 A 56,00 B 78,25 B 83,00 B

TRT_4 3,25 A 62,50 B 86,75 B 92,00 B

TRT_5 2,75 A 65,75 B 93,25 B 99,00 B

TRT_6 3,00 A 59,00 B 79,75 B 84,25 B

TRT_7 2,25 A 60,00 B 83,25 B 89,00 B

CTR_1 3,25 A 12,08 A 52,13 A 54,25 A

CTR_2 3,50 A 18,15 A 51,03 A 52,00 A

CTR_3 3,00 A 16,50 A 44,35 A 46,75 A

CTR_4 3,25 A 16,85 A 50,40 A 52,25 A

CTR_5 2,75 A 14,65 A 49,85 A 51,13 A

CTR_6 3,00 A 14,33 A 38,30 A 39,58 A

CTR_7 2,25 A 12,38 A 36,25 A 39,25 A

Figura 10 / Tabla 3. El contenido de clorofila (índice Spad) (*los valores indicados representan la media de 12 datos, 3 para cada punto cardinal). Las mismas letras indican que no existen diferencias significativas entre los valores.

Índice de clorofila

Tratamientos 13 mayo 15 junio 6 octubre 24 noviembre

TRT_1 70,80 A* 76,73 AB 88,45 AB 87,90 B

TRT_2 72,73 A 73,88 AB 104,48 AB 91,08 B

TRT_3 68,45 A 76,83 AB 96,03 AB 92,95 B

TRT_4 62,65 A 90,13 B 113,48 AB 89,75 B

TRT_5 69,00 A 78,40 AB 102,85 AB 90,03 B

TRT_6 72,33 A 75,73 AB 111,18 AB 90,00 B

TRT_7 73,55 A 70,13 A 117,08 B 93,93 B

CTR_1 60,58 A 65,88 A 78,50 A 69,08 A

CTR_2 62,15 A 63,03 A 98,70 AB 71,60 A

CTR_3 58,23 A 66,60 A 83,23 AB 69,25 A

CTR_4 55,65 A 79,55 B 97,75 AB 72,23 A

CTR_5 61,98 A 74,23 AB 94,85 AB 71,15 A

CTR_6 65,58 A 65,50 A 103,18 AB 69,48 A

CTR_7 63,33 A 63,10 A 103,18 AB 72,40 A

Figura 11 / Tabla 4. El potencial de agua de las hojas y la conductancia estomática. (*los valores indicados representan la media de 12 datos, 3 para cada punto cardinal).

Tratamientos 13 mayo 15 junio 6 octubre 24 noviembre

TRT_1 52,13 89,38 100,63 116,30

TRT_2 63,63 151,43 139,68 146,45

TRT_3 43,98 97,93 143,13 144,13

TRT_4 45,15 137,60 142,85 139,88

TRT_5 40,95 129,00 149,65 157,68

TRT_6 52,90 133,48 147,05 133,93

TRT_7 45,75 127,83 141,75 144,93

CTR_1 59,55 92,60 91,23 87,00

CTR_2 58,75 118,45 110,10

CTR_3 55,25 88,75 118,50 96,78

CTR_4 53,73 117,05 125,23 110,90

CTR_5 46,65 126,10 126,23 118,65

CTR_6 47,88 133,48 128,30 102,70

CTR_7 55,65 112,85 126,53 121,08

Conclusiones

Sobre la base de los resultados obtenidos, el tratamiento con el producto aquí divulgado ha permitido limitar los síntomas de la bacteria X. fastidiosa en todos los árboles tratados, aunque los análisis ELISA efectuados en muestras recogidas el 24 de noviembre siguen siendo positivos en lo que respecta a la presencia de X. fastidiosa. Esto significa que, en las condiciones de experimentación, el producto no es capaz de erradicar totalmente la bacteria de las plantas. Sin embargo, el producto permite a los árboles reducir de manera muy significativamente los efectos patógenos de la bacteria X. fastidiosa, y evitar los síntomas.

Además, sobre la base de los resultados obtenidos por los análisis de hongos, el producto fue capaz de preservar completamente las aceitunas de hongos patógenos como Colletotrichum, Botryosphaeriaeae, Alternaria/Stemphylium y Fusarium spp, responsables de enfermedades graves en el olivo, y generalmente asociadas a los daños causados por X. fastidiosa.

El uso del producto en los olivos demuestra que constituye también una buena protección para otras enfermedades de la aceituna.

Las plantas tratadas con el producto se han desarrollado bien, porque la corona vegetal de los olivos es rica, el color de las hojas espléndido, la longitud de las ramas jóvenes considerable, la calidad de las aceitunas excelente; el estado de los árboles era perfecto, parecían sanos.

Este producto representa un gran interés en el contexto fitosanitario de urgencia, cuando el apremia y es necesario encontrar una solución para preservar los árboles de esta gravísima enfermedad causada por la bacteria X. fastidiosa. Se está estudiando un protocolo para ser utilizado también como tratamiento preventivo durante varios años, y contener la epidemia causada por la X. fastidiosa para preservar y conservar el legado de los olivos en el sur de Italia y en el resto del mundo.

Ejemplo 5 - Para comprobar la eficacia del producto contra la Xyllela, un organismo que haya recibido la autorización de buenas prácticas de experimentación (BPE) emitida por el comité francés de acreditación somete de nuevo a prueba el producto en los olivos en zona de cuarentena, en el sur de Italia. En este ensayo, el nombre del producto es PP1.

Se observa que el ensayo debe realizarse a lo largo de tres años con objeto de tener una perspectiva suficiente para juzgar la eficacia del producto en la lucha contra la Xyllela fastidiosa (recuperación del vigor de los árboles, aumento de la producción de aceitunas), pero también su capacidad para limitar la propagación de la bacteria y contener la epidemia.

Resumen

El objetivo del ensayo era evaluar la eficacia del bioestimulante experimental contra la bacteria patógena Xylella fastidiosa. El producto experimental se probó en tres concentraciones diferentes (0,5N, 1N y 2N) y se comparó con Ossiclor (marca registrada) 35 WG estándar (oxicloruro de cobre 35 %, WG), especialidad a base de cobre, la única referencia utilizada contra las enfermedades bacterianas, sin gran eficacia en el caso de la Xyllela. La lista de tratamientos se presenta en la siguiente tabla:

Introducción

El ensayo se realizó cerca de Ugento en la provincia de Lecce en la región de Apulia (sur de Italia), en una granja representativa de esta región en cuanto a variedades y técnicas de cultivo de la aceituna para la producción de aceite. Se confirmó previamente la presencia de olivos con síntomas debidos a Xylella fastidiosa.

Para realizar este ensayo, se seleccionaron olivos pertenecientes al genotipo Olea europea de la variedad Carolea, de un olivar trasplantado en enero de 1993.

El ensayo consistía en un bloque completo aleatorio (RCB por sus siglas en inglés) con cuatro repeticiones. La superficie de la parcela era de 96 m2 (6 x 16 m) con cuatro plantas por parcela.

Las condiciones meteorológicas registradas durante el periodo de la prueba se volvieron más secas y cálidas que los valores estacionales medios, especialmente en los primeros periodos de puesta en marcha del ensayo, es decir, de junio a finales de agosto, lo que condicionó negativamente la exuberancia de la vegetación de los olivos en general, así como la progresión de la enfermedad.

Sobre la base del protocolo, se realizaron un total de 11 aplicaciones foliares, excepto el tratamiento a base de cobre para el que solo se planificaron tres aplicaciones (de acuerdo con las instrucciones de uso), según las prácticas locales. La primera aplicación (aplicación A) tuvo lugar el 1 de junio de 2017 en el estadio BBCH 70 (primer fruto visible), mientras que la última aplicación (aplicación K) se llevó a cabo el 26 de octubre de 2017 en el estadio BBCH 81 (inicio de maduración de los frutos). La totalidad de las aplicaciones experimentales se realizaron con un intervalo de 13-15 días entre sí.

Todas las modalidades se aplicaron con un pulverizador de mochila a una presión de 4 bares, con un volumen de agua de 80 litros por tratamiento.

Evaluación:

Se realizaron ocho evaluaciones durante el ensayo: justo antes de la aplicación A (0 DA-A (por «Day After A» o «día después de A»), 0 DA-D, 0 DA-E, 0 DA-G, 0 DA-I, 7 Da -J, 0 DA-K y 11 DA-K. Las evaluaciones incluyeron los siguientes parámetros:

• Porcentaje de la enfermedad (DAMDIS): gravedad media de la enfermedad por parcela,

• Número de nuevos brotes por vástago,

• Vigor del cultivo, expresado en una escala de 0 a 10, donde «10» = vigor máximo del cultivo y «0» = planta muerta,

• Longitud media de los nuevos brotes,

• Índice IVDN (0 -1): (en inglés, Normalized Difference Vegetation Index, NDVI). El Índice de Vegetación de Diferencia Normalizada (IVDN) cuantifica la vegetación midiendo la diferencia entre el infrarrojo cercano (que la vegetación refleja intensamente) y la luz roja (que la vegetación absorbe).

• Transpiración de las hojas, expresada en conductancia estomática (mmol/m2 x segundo) medida con un porómetro (valor medio obtenido a partir de cuatro mediciones por árbol).

• En la cosecha (11 DA-K), evaluación del rendimiento (kg/parcela), el peso de 100 aceitunas (g) y el contenido de aceite (%).

• Se efectuaron evaluaciones de selectividad de los cultivos (0 DA-B; 0 DA-C; 0 DA-D; 0 DA-F; 0 DA-G; 0 DA-I. 0 DA-H) durante el cultivo para detectar todos los síntomas de fitotoxicidad (PHYGEN) debida a la aplicación del producto experimental, como la clorosis o el amarillamiento, mediante comparaciones con las parcelas no tratadas. Los resultados se expresaron en porcentaje, donde «0» significa ausencia de síntomas, mientras que «100» significa un máximo daño en el cultivo.

Análisis estadísticos

Los datos se analizaron utilizando análisis de la varianza (ANOVA) en el software de base de datos de investigación Agriculture Research Manager (ARM) versión 2017.4. Cuando ello implicaba diferencias estadísticamente significativas, los análisis fueron seguidos por una prueba de Student-Newman-Keuls, del 95 %. Cuando dos medias comparten la misma notación alfabética, no son significativamente diferentes.

Resultados: porcentaje de la enfermedad (DAMDIS): intensidad/gravedad media de la enfermedad por parcela (figura 13). En la figura 13 se observa:

El 1 de junio de 2017 (0 DA-A, en estadio BBCH 70), antes de la primera aplicación de los productos (aplicación A), se caracterizó la presión de la enfermedad en el ensayo (DAMDIS), que osciló entre el 10,8% y el 18,8% (véase la figura 13).

El 24 de agosto de 2017 (0 DA-G, en estadio BBCH 76), los valores DAMDIS no cambiaron con respecto a la evaluación anterior, variando del 10,8% al 18,8% (véase la figura 13).

La distribución de la enfermedad es homogénea entre las modalidades, lo que confirma la validez del ensayo.

1. Número de nuevos brotes por vástago

El 22 de septiembre de 2017 (0 DA-I, estadio BBCH 78), en lo que respecta al número medio de nuevos brotes por vástago registrada, el control no tratado dio como resultado 0,0 brotes por vástago (véase la figura 14). Los resultados obtenidos con otros tratamientos evolucionaron poco durante el ensayo. El tratamiento 4 (PP1 2N) obtuvo el resultado más elevado con 2,13 nuevos brotes por vástago, seguidos del tratamiento 3 (PP1 1N) y el tratamiento 2 (PP1 0,5N) con 1,23 y 1,15 nuevos brotes por vástago, respectivamente. Por último, el tratamiento 5 (Ossiclor 35 WG) registró el menor número de nuevos brotes por vástago, igual a 0,28.

El 26 de octubre de 2017 (0 DA-K, estadio BBCH 81), los resultados registrados son idénticos a la evaluación anterior de 22 de septiembre de 2017.

Cabe señalar que las condiciones climáticas afectaron al crecimiento de los árboles de forma general (aguda sequía) en la región. Además, en el caso de ataque con Xyllela fastidiosa, los árboles tienden a decaer y morir en lapsos de 3 a 5 años. Por otra parte, las plantas de la modalidad de control no produjeron ningún nuevo brote (Figura 14).

El hecho de que los árboles tratados con el producto aquí divulgado puedan producir nuevos brotes en cada vástago refleja el hecho de que la estimulación del metabolismo funciona.

Observamos que el tratamiento con la referencia cúprica (acción antibacteriana) no permite a los árboles generar tantos nuevos brotes, lo que muestra su límite de acción contra la bacteria (figura 14). Figura 14: Evaluación del número de nuevos brotes por vástago.

2. Vigor del cultivo: Figura 15: Evaluación del vigor del cultivo

El 14 de julio de 2017 (0 DA-D, estadio BBCH 73)/ el 28 de julio de 2017 (0DA-E, estadio BBCH 74)/ el 10 de agosto de 2017 (0 DA-F, estadio BBCH 75)/ y el 24 de agosto de 2017 (0 DA-G, estadio BBCH 78), no se observó ninguna diferencia estadística entre los tratamientos (figura 15).

El 22 de septiembre de 2017 (0 DA-I, estadio BBCH 78), el mejor resultado lo obtuvo el tratamiento 4 (PP1 2N, véase la figura 15), que mantuvo el valor máximo de vigor de 10,0. El tratamiento 3 (PP1 1N) presentó un valor ligeramente inferior de 9,5, seguido a su vez del tratamiento 2 (PP1 0,5N) con 9,0. El vigor inferior del cultivo tratado se obtuvo con el tratamiento comercial a base de cobre (Ossiclor 35 WG) con 8,8, que no es estadísticamente diferente de las plantas de control, con 8,3.

El 26 de octubre de 2017 (0 DA-K, estadio BBCH 81), el mejor resultado se obtuvo con el tratamiento 4 (PP1 2N, véase la figura 15), que mantuvo el valor de vigor máximo de 10,0. El tratamiento 3 (PP1 1N) presentó un valor ligeramente inferior de 9,5, seguido a su vez del tratamiento 2 (PP1 0,5N) con 9,0. El vigor inferior del cultivo tratado se obtuvo con el tratamiento comercial a base de cobre (Ossiclor 35 WG) con 8,8, mientras que las plantas de control no tratadas obtuvieron 7,5.

Las últimas valoraciones muestran, por lo tanto, los primeros efectos positivos de PP1 en el vigor de los árboles de forma significativa, mientras que la enfermedad sigue progresando en los árboles de referencia.

3. Longitud media de los nuevos brotes: Figura 16: Evaluación de la longitud de los nuevos brotes El 22 de septiembre de 2017 (0 DA-I, estadio BBCH 78), la longitud media más elevada de los brotes se obtuvo con el tratamiento 4 (2N), (6,18 cm, véase la figura 16), seguido de los tratamientos 3 y 2 (1N y 0,5N) que miden 2,69 cm y 2,10 cm de media, respectivamente, mientras que el tratamiento 5 (Referencia cúprica) registra de nuevo el resultado más bajo, con solo 0,65 cm.

El 26 de octubre de 2017 (0 DA-K, estadio BBCH 81), la longitud media más elevada de los brotes se obtuvo con el tratamiento 4 (2N), (8,72 cm, véase la figura 16), seguido de los tratamientos 3 y 2 (1N y 0,5N) con 5,38 cm y 3,43 cm de media, respectivamente, mientras que el tratamiento 5 (Referencia cúprica) registra de nuevo el resultado más bajo, con solo 1,22 cm.

Como se indica en el apartado 2 anterior, los tratamientos con el producto no solo permiten una producción significativamente superior de nuevos brotes en comparación con las plantas de «control», sino que también permiten un crecimiento significativamente superior de los nuevos brotes.

4. IVDN: Figura 17: Evaluación del carácter IVDN

El 22 de septiembre de 2017 (0 DA-I, estadio BBCH 78), los tratamientos 4 y 3 (PP1 N y 2N) obtuvieron los mejores resultados, con un IVDN medio de 0,77 y 0,76, seguido del tratamiento 2 (PP1 0,5N) que obtuvo un IVDN medio igual a 0,74. El IVDN más bajo se registró con el tratamiento 5 (Ossiclor 35 WG), comparable al del control (IVDN igual a 0,71; véase la figura 17).

El 26 de octubre de 2017 (0 DA-I, estadio BBCH 81), los tratamientos 4 y 3 (PP1 N y 2N) obtuvieron los mejores resultados, con un IVDN medio de 0,78 y 0,77, seguido del tratamiento 2 (PP1 0,5N) que obtuvo un IVDN medio igual a 0,75. El IVDN más bajo se registró con el tratamiento 5 (Ossiclor 35 WG), comparable al del control (IVDN igual a 0,71; véase la figura 17).

5. Conductancia estomática: Figura 18: Evaluación de la conductancia estomática

El 12 de octubre de 2017 (7 DA-J, estadio BBCH 78), se midió la conductancia estomática mediante un porómetro (valor medio tomado a partir de cuatro mediciones por árbol). Los resultados más elevados se obtuvieron con el tratamiento 4 (2N) y el tratamiento 3 (1N), con valores medios de 374,5 y 378,2 mmol/m2 x segundo, respectivamente, seguidos del tratamiento 2 (0,5N), con valores medios de 360,1 mmol/m2 x segundo. El valor de conductancia estomática más bajo se obtuvo con el tratamiento 5 (Ossiclor 35 WG) con 331,6 mmol/m2 x segundo que no es estadísticamente diferente de las plantas de «control- no tratadas (308,8 mmol/m2 x segundo; véase la figura 18).

El 6 de noviembre de 2017 (11 DA-K, estadio BBCH 87), los resultados más elevados se obtuvieron con el tratamiento 4 (2N) y el tratamiento 3 (1N), que presentan valores medios de 383 y 379,5 mmol/m2 x segundo, respectivamente, seguidos del tratamiento 2 (0,5N), que presenta un valor de 348,1 mmol/m2 x segundo). El valor de conductancia estomática más bajo se obtuvo con el tratamiento 5 (Ossiclor 35 WG) con 329,5 mmol/m2 x segundo que no es estadísticamente diferente de las plantas de «control- no tratadas (299.6 mmol/m2 x segundo; véase la figura 18).

Por lo tanto, el producto PP1 permite a los árboles adquirir una conductancia estomática significativamente superior a los árboles de referencia, lo que refleja indirectamente el retroceso de la infección por Xf.

6. Evaluación del rendimiento

a/ Peso en fresco de aceituna por parcela (kg/parcela): Figura 19: Evaluación del peso en fresco de aceituna en kg/parcela El 6 de noviembre de 2017 (11 DA-K, estadio BBCH 87), el peso en fresco más elevado de aceituna por parcela se registró con el tratamiento 4 (PP1 2N), con 176,30 kg/parcela (véase la figura 19). El tratamiento 3 (PP1 1N) obtuvo un resultado ligeramente inferior, igual a 167,74 kg/parcela, seguido a su vez por el tratamiento 2 (PP1 0,5N) con 157,51 kg/parcela. El tratamiento 5 (Ossiclor 35 WG) registró 140,02 kg/parcela y resultó ligeramente inferior a las plantas de «control» (141,79 kg/parcela, véase la figura 19).

b/ Peso de los frutos (g/100 frutos): Figura 20: Evaluación del peso en fresco de las aceitunas (g/100 frutos)

El tratamiento 4 también logró el peso significativamente más elevado de 100 frutos, igual a 439,99 g, seguido del tratamiento 3 (PP1 1N) con 426,99 g y del tratamiento 2 (PP1 0,5N) con 406,19 g. El tratamiento 5 (Ossiclor 35 WG) obtuvo 349,02 g, que es inferior al de las plantas de «control» (358,15 g, véase la figura 20). El producto PP1 no solo permite producir el rendimiento significativamente más elevado por parcela (kg de aceitunas/parcela), ya que se observan casi 40 kg de diferencia de producción (lo que teniendo en cuenta el tamaño de la parcela es considerable), sino también el rendimiento más elevado en términos de peso de las aceitunas por cada 100 frutos.

c/ Concentración de aceite: Figura 21: Evaluación de la concentración de aceite

En lo que respecta al contenido de aceite (% peso, véase la figura 21), aunque se observan diferencias, estas no son significativas. El tratamiento 5 (Ossiclor 35 WG) y las plantas de «control» no tratadas obtuvieron resultados estadísticamente similares, del 21,27 % y el 21,28 %, respectivamente, seguidos del tratamiento 3 (PP1 1N) y del tratamiento 2 (PP1 0,5N) con un 19,63 % y un 19,14 %. El tratamiento 4 (PP1 2N) registró un 17,89 % de contenido de aceite (véase la figura 21).

Conclusión. Según los datos recogidos, en este ensayo se realizaron las siguientes observaciones: El producto probado demuestra una respuesta vegetativa interesante en los olivos afectados por Xylella fastidiosa con independencia de las dosis analizadas (0,5N, 1N y 2N). Estos resultados se traducen en una mejora de la actividad vegetativa de las plantas evidenciada por un aumento del número de nuevos brotes, de la longitud de los nuevos brotes, del vigor del cultivo, así como del índice IVDN. El rendimiento global del producto probado, con la totalidad de los parámetros descritos anteriormente, ha sido siempre mejor que la formulación a base de cobre (Ossiclor 35 WG), normalmente adoptada por los agricultores.

También es importante señalar que ha aparecido un efecto de dosis. La dosis 2N tiene una mayor eficacia global que la dosis 1N o 0,5N.

En cuanto al peso en fresco de las aceitunas y al tamaño de los frutos (peso de 100 frutos en g), el producto del ensayo muestra una mejora significativa con independencia de la dosis utilizada, en relación con las plantas de «control» no tratadas y la formulación a base de cobre. La dosis 2N aporta sistemáticamente los efectos más elevados, con diferencia. La producción de aceite, en % respecto al peso de las aceitunas, es estadísticamente equivalente para todas las modalidades. La aplicación del producto del ensayo en la dosis 2N parece reducir el porcentaje de producción de aceite (diferencia no significativa). Esto podría explicarse, si el fenómeno perdurara, por la estimulación por PP1 del metabolismo orientado a la defensa contra una bacteria tan invasiva como la Xyllela fastidiosa...

La aplicación del producto del ensayo no produjo ningún síntoma de fitotoxicidad en los olivos de la variedad Carolea durante el ensayo, con independencia de la dosis utilizada.

No se observaron problemas durante la manipulación de los productos objeto de experimentación.

En un modo de realización particular, la presente invención se refiere a la utilización de triturados obtenidos por extracción acuosa de al menos una parte de plantas de rúcula para estimular las defensas de las plantas y reducir los efectos de la bacteria Pseudomonas syringae pv actinidiae («PSA») en la planta del género Actinidia.

El extracto se utiliza aquí por pulverización foliar.

Ejemplo 6 - Eficacia de PP1 frente a la bacteria Pseudomonas syringae pv actinidiae del kiwi (Actinidia chinensis).

Introducción:

La bacteriosis del kiwi, causada por Pseudomonas syringae pv actinidiae, provoca un debilitamiento de las plantas de kiwi que lleva a la muerte de las plantas a más o menos largo plazo.

La bacteriosis del kiwi se propaga por el viento y la lluvia, así como por los equipos utilizados para la poda.

Las flores, las heridas de poda, las causadas por los animales y las dejadas por la caída de las hojas, suponen todas una puerta de entrada a la bacteria. Por consiguiente, el periodo de infección alcanza su punto álgido a finales del otoño o principios de la primavera.

En la actualidad, no existe ningún producto fitosanitario disponible para el tratamiento curativo de esta enfermedad. Solo es posible realizar tratamientos preventivos —en general a base de cobre—, durante el otoño y el período invernal. Sin embargo, cabe temer problemas de fitotoxicidad con la molécula de cobre, y cada vez aparecen más resistencias bacterianas contra este principio activo.

I/ Puesta en marcha del ensayo:

• Año: 2016

• Variedad de Kiwi: Hayward

• Edad de los árboles: 5 años

• Lugar: Dróme (Francia)

• Inoculación: Natural.

• Número de modalidades: Se someten a prueba tres modalidades:

Se utilizan quince árboles por modalidad.

Las modalidades son las siguientes:

1/ Referencia

2/ Pulverización de PP1 (f) a nivel foliar. PP1 (f) se extrae de las hojas de Eruca sativa

3/ Tratamiento preventivo Cobre el año anterior n-1 y el año en curso n Pulverización de PP1 (f) a nivel foliar.

• Recomendaciones:

Se realizan aplicaciones de cobre inmediatamente después de la recolección, al inicio de la caída de las hojas, así como en la fase del 50 % de la caída de las hojas.

Aplicación de PP1 cada 10 días, desde el estadio de 2-3 hojas, hasta la maduración de los frutos.

• Volumen: 700 l/ha (volumen de producto final aplicado a las plantas. Aquí, por ejemplo, para 700 l de agua/ha, se tritura el equivalente a 10 g de planta/l, es decir, 7 kg de plantas. El filtrado obtenido se obtiene inicialmente en un volumen inferior, para el transporte, y se diluye en los 700 l antes de la aplicación). II/ Observaciones realizadas:

A/ Porcentaje medio de hojas atacadas por la PSA por planta de kiwi.

B/ Gravedad de los síntomas en las hojas (% media de superficie foliar con síntomas)

Notación: Presencia de manchas necróticas rodeadas de un halo amarillo.

Las valoraciones se realizan en 100 hojas al azar por modalidad.

C/ Porcentaje medio de ramas por planta que presentan secreción.

Notación: Presencia observable en el conjunto de la madera (troncos, ramas) con secreción de un exudado gomoso cuyo color puede variar del beige al parduzco.

III/ Resultados:

A/ Porcentaje medio de hojas atacadas por PSA por planta de kiwi: tabla 1

Las valoraciones se realizan en 100 hojas al azar por modalidad

Las diferentes letras representan resultados significativamente diferentes según la prueba de Newman-Keuls en el nivel del 5 % de error.

B/ Gravedad de los síntomas en las hojas (% media de superficie foliar con síntomas): tabla 2

En esta tabla, las valoraciones se realizan en 100 hojas al azar por modalidad. Las diferentes letras representan resultados significativamente diferentes según la prueba de Newman-Keuls en el nivel del 5 % de error.

C/ Porcentaje medio de ramas por planta que presentan secreciones: tabla 3

IV/ Conclusión:

La parcela elegida presenta síntomas de bacteriosis causada por PSA desde hace varios años. Cada año se realizan podas drásticas para eliminar las ramas afectadas y evitar la contaminación de los huertos vecinos. No obstante, la enfermedad reaparece cada año, de manera creciente.

PP1 se utiliza para aportar una nueva solución en la lucha contra esta bacteria, como tratamiento preventivo al inicio de los síntomas. Por tanto, PP1 se aplica a partir de la reactivación vegetativa, a razón de una aplicación cada 10 días.

Los tratamientos preventivos con cobre se mantuvieron únicamente en dos parcelas.

El tratamiento con PP1 reduce significativamente los síntomas. Este efecto es visible no solo en el % medio de las hojas atacadas (tabla 1), sino también en la gravedad de la enfermedad (tabla 2).

Visualmente, la parcela tratada con PP1 parece sana y libre de enfermedad, aunque pueden detectarse los síntomas de la bacteriosis en valoraciones rigurosas (un 32 % de hojas atacadas/planta en la parcela de referencia, un 5 % de hojas atacadas/planta en la modalidad tratada con PP1, un 0 % de hojas atacadas/planta en la modalidad tratada con PP1 cobre de manera preventiva, y un 12 % de hojas atacadas/planta en la modalidad tratada con cobre de manera preventiva (tabla 1).

No obstante, en las hojas atacadas por la bacteriosis en las parcelas tratadas con PP1, la gravedad de los síntomas se reduce considerablemente (un 39 % de superficie foliar con síntomas en la parcela de referencia, un 5 % de superficie foliar con síntomas en la parcela PP1, un 0 % de superficie foliar con síntomas en la parcela PP1 Cobre (preventivo), un 29 % de superficie foliar con síntomas en la parcela Cobre (preventivo) (tabla 2).

Si tiene en cuenta la observación de secreción de exudado, solo los tratamientos con PP1 permiten estimular las defensas de las plantas o árboles y reducir prácticamente totalmente estos síntomas (tabla 3)

El cobre, utilizado como tratamiento preventivo, permite también reducir significativamente los síntomas. Sin embargo, su nivel de eficacia sigue siendo inferior al observado en los tratamientos con PP1 (tablas 1, 2 y 3).

Habida cuenta del modo de acción totalmente diferente de los 2 principios activos (cobre y PP1), parece interesante combinar ambos tratamientos. En las condiciones de experimentación, la combinación de ambos tratamientos permite una lucha eficaz contra la bacteriosis del kiwi, ya que este programa permite limitar la enfermedad a su nivel más bajo.

En un modo de realización, la presente invención se refiere a la utilización de un extracto obtenido por extracción acuosa de al menos una parte de plantas de rúcula para estimular las defensas de las plantas o árboles y reducir los efectos de la bacteria Xantomonas arboricola pv juglandis en el nogal y de la bacteria Xanthomonas arboricola pv. pruni en los Prunus spp., y especialmente los árboles frutales como albaricoquero, almendro, cerezo, melocotonero, ciruelo, P. salicina, laurel cerezo, así como otros Prunus exóticos u ornamentales, incluidos el P. davidiana y el P. laurocerasus.

El triturado puede utilizarse mediante pulverización foliar o a través de riego en el suelo.

Ejemplos 7 y 8: Eficacia de PP1 frente la bacteria Xanthomonas arboricola pv juglandis del nogal (Juglans regia). Demostración de la estimulación de las defensas de los árboles por PP1.

Introducción

La bacteriosis del nogal se debe a la bacteria Xanthomonas arboricola juglandis (Xaj). En la actualidad, no existe ningún tratamiento realmente eficaz contra las necrosis y las caídas de nueces ocasionadas por esta enfermedad. La infección por esta bacteria puede causar más del 50 % de pérdida de las cosechas. La bacteria puede atacar todos los órganos en crecimiento: hojas, vástagos, flores hembras, amentos y frutas.

La intensidad de los ataques por Xaj se ha acentuado con el tiempo, por varias razones: Intensificación de los cultivos, implantación de los huertos en suelos no adecuados y aparición creciente de resistencias de la bacteria al cobre.

En ausencia de una solución de lucha contra esta bacteria, en un contexto de limitación de las dosis de cobre y en presencia de resistencias bacterianas incrementadas, es importante encontrar otras soluciones de lucha contra la Xaj.

En 2017 se llevaron a cabo dos ensayos en nogales con el producto PP1:

• Ensayo en un huerto con la variedad GrandJean, en árboles de 19 años, contaminados de forma natural (ejemplo 7).

• Ensayo en vivero con la variedad Chandler, en arbustos de 7 años y contaminados de forma artificial. En este segundo ensayo se puso de manifiesto el hecho de que PP1 actúa estimulando la defensa de los árboles (ejemplo 8).

Ejemplo 7:

I/ Puesta en marcha del ensayo:

• Año: 2017

• Variedad de nogal: GrandJean

• Huerto plantado en: 1998

• Lugar: Grenoble (Isére, Francia)

• Inoculación: Natural: Este huerto está infectado desde 2013

• Número de modalidades: 3

Tres modalidades probadas: 6 filas de 10 árboles (60 árboles). Cada modalidad consta de 2 filas de 10 árboles (20 árboles).

Las modalidades son las siguientes:

1/ Referencia

2/ Pulverización de PP1 (t) a nivel foliar. PP1 (t) se extrae de los tallos de Eruca sativa

3/ Pulverización de PP1 (f) a nivel foliar. PP1 (f) se extrae de las hojas de Eruca sativa

• Recomendación: Aplicación de PP1 cada 14 días, desde el estadio del desborre (estadio Cf) - 7 Aplicaciones • Ventaja de PP1: No presenta fitotoxicidad en la fase de floración.

• Volumen: 600 l/ha

II/ Observaciones realizadas:

A/ Recuento de nueces caídas en el suelo desde el cuajado del fruto hasta la recolección.

Estos recuentos se realizan en 10 árboles tomados al azar por modalidad. Durante el recuento se diferenciarán las nueces de diámetro inferior a 1 cm y que no presenten síntomas. Este fenómeno de abscisión se considera un proceso fisiológico (aborto).

Las nueces se recogen cada 5 días, sobre una lona extendida alrededor de cada árbol.

Los resultados se expresarán en % medio de nueces por árbol, en relación con el número total de nueces contabilizadas al final de la temporada (caída fisiológica y nueces recogidas en el árbol).

B/ Rendimiento (kg de nueces por árbol)

Se contabilizan todas las nueces (caídas y recogidas).

C/ Calibre:

Este resultado se expresará en % medio de nueces por árbol con un calibre superior a 32 mm.

D/ Presencia de vástagos con síntomas de abolladura en las hojas.

III: Resultados:

A/ Recuento de las nueces caídas en el suelo desde el cuajado del fruto hasta la recolección (tabla 1):

En esta tabla, las diferentes letras representan resultados significativamente diferentes según la prueba de Newman-Keuls en el nivel del 5 % de error.

B/ Rendimiento (kg de nueces por árbol) (tabla 2)

En esta tabla, las diferentes letras representan resultados significativamente diferentes según la prueba de Newman-Keuls en el nivel del 5 % de error.

C/ Calibre (tabla 3):

En esta tabla, las diferentes letras representan resultados significativamente diferentes según la prueba de Newman-Keuls en el nivel del 5 % de error.

D/ Presencia de vástagos con síntomas de abolladura en las hojas.

En las plantas de referencia no tratadas con PP1, un gran número de vástagos presentan un desecamiento con abolladura en las hojas.

Este fenómeno no se observa en las demás modalidades tratadas con PP1.

IV / Conclusión:

Los tratamientos PP1 (t) o PP1 (f) no afectan a la caída fisiológica de las nueces (tabla 1).

Por el contrario, el porcentaje de nueces caídas al suelo debido a la contaminación por Xaj se ha reducido significativamente gracias a los dos tratamientos con PP1, tanto si el producto se extrae de las hojas o los tallos de Eruca sativa (un 35 % de nueces caídas al suelo por árbol para la modalidad de referencia, un 12 % y un 9 % de nueces caídas al suelo por árbol para PP1 (t) y PP1 (f), respectivamente (tabla 1).

Los dos tratamientos con PP1 tienen asimismo un efecto significativo en el rendimiento, que se incrementa considerablemente (24 kg de nueces por árbol para la modalidad de referencia, 38 kg y 41 kg de nueces por árbol, respectivamente, para las modalidades PP1 (t) y PP1 (f)) (tabla 2).

En cuanto al calibre de las nueces, los 2 tratamientos con PP1 tienen un efecto significativo, aunque se observa un efecto superior con el producto PP1 (f) extraído de las hojas (un 39,6 % de nueces presentan un calibre > 32 mm en los árboles de la modalidad de referencia, mientras que el 52,3 % y el 61,0 % de las nueces presentan un diámetro > 32 mm en las modalidades PP1 (t) y PP1 (f) (tabla 3).

Cabe señalar que los síntomas de abolladura de las hojas de los brotes, asociados a una contaminación grave del árbol, solo se observan en las plantas de referencia. Ningún vástago presenta síntomas de abolladura en las hojas en los árboles de la modalidad PP1 (t) y PP1 (f).

Los tratamientos con PP1 muestran una acción significativa en la lucha contra Xanthomonas arboricola pv juglandis del nogal. Los nogales tratados con PP1 no parecen debilitados por la enfermedad durante todo el ensayo.

Ejemplo 8:

I/ Puesta en marcha del ensayo:

• Año: 2016

• Variedad de nogal: CHANDLER

• Edad de los árboles: 4 años

• Lugar: Grenoble

• Inoculación: Artificial

Las cepas de Xaj se cultivan en medio LPGA. La cepa se conserva a 5 °C para reducir el riesgo de pérdida de virulencia. Los inóculos utilizados en este estudio se prepararon transfiriendo, tras controlar la pureza de la cepa, una colonia a 100 ml de medio líquido LPG. Los cultivos se incuban bajo agitación a 30 °C durante 12 horas. La suspensión bacteriana se centrifuga a 6000 g durante 10 minutos. La suspensión bacteriana final se ajusta al espectrofotómetro con DO⁶⁰⁰ de 0,1, correspondiente a 108 ufc/ml.

Se infectan dos hojas de todos los vástagos de todos los árboles de las modalidades «inoculadas» con la suspensión bacteriana (108 ufc/ml) con una jeringa sin aguja, aplicando la jeringa en la cara inferior de las hojas. La infiltración se realiza a presión forzando al líquido a penetrar las hojas por los estomas.

La suspensión se infiltra en las hojas se infiltran de forma que la infiltración cubra visualmente toda la superficie de la hoja.

Para las plantas de referencia, se llevará a cabo el mismo protocolo de infiltración con agua estéril.

• Número de modalidades: Se someten a prueba cuatro modalidades. Cada modalidad está constituida por 12 árboles.

1/ Referencia no inoculada, no tratada (T0)

2/ Referencia inoculada, no tratada (Tin)

3/ Pulverización de PP1 (P) a nivel foliar de manera preventiva (tratamientos realizados 7 días antes de la inoculación con Xaj)

4/ Pulverización de PP1 (C) a nivel foliar de manera curativa (tratamientos realizados 7 días después de la inoculación con Xaj)

• Recomendación: Aplicación de PP1 cada 14 días, desde el estadio del desborre (estadio Cf) - 7 Aplicaciones • Volumen: Equivalente 600 l/ha

El calendario de tratamientos se presenta en la figura 22.

II/ Observaciones realizadas:

A/ Porcentaje de hojas contaminadas por brote, en función del tiempo.

B/ Gravedad de los daños en las hojas según el porcentaje de la superficie de la hoja afectada visualmente por la enfermedad, en función del tiempo.

En el caso de A y B, las valoraciones se realizan en 10 brotes por modalidad, a razón de dos por árbol, tomados al azar. La observación afecta a todas las hojas del brote.

C/ Prueba antibacteriana de PP1 en Xaj.

Para entender el modo de acción de PP1 y su elevada eficacia contra Xaj aunque esta bacteria apenas puede tratarse con productos fitosanitarios, se ha sometido a prueba su potencial antibacteriano.

24 después de esparcir el cultivo de Xanthomonas, se deposita en la caja de Petri un mililitro de PP1 (en la dosis de uso y eficacia y en las dosis X2).

Se realizan tres replicaciones por modalidad (aplicación de 1 ml de PP1, o 1 ml de agua estéril).

El diámetro medio de las colonias se registra una vez transcurridos 3 días y 7 días tras la aplicación de PP1 en las cajas de Petri.

D/ Análisis cuantitativo de la actividad peroxidásica en las hojas, en función del tiempo.

Aunque también interviene en otras funciones además de las relacionadas con la defensa frente a los parásitos, la actividad peroxidásica está no obstante muy relacionada con la defensa de las plantas frente a las bacterias fitopatógenas.

Las hojas de nogal (5 hojas por árbol tomadas al azar) se recogen en diferentes tiempos. Se mezcla un gramo de hoja en 2 ml de tampón de fosfato sódico (pH 5, 0,05 m). El extracto se centrifuga a 10000 g durante 5 minutos. El análisis cuantitativo de las peroxidasas en el sobrenadante se realiza en un tampón de citrato-fosfato (pH 6, 0,05 m), utilizando el guayacol como donador de hidrógeno en presencia de agua oxigenada. Las actividades se evalúan a partir de A 470. La actividad total se expresa en nkat/mg de proteínas.

El análisis cuantitativo se realiza en 2 hojas de 6 vástagos diferentes tomadas al azar, por modalidad. Por lo tanto, el resultado es la expresión de la actividad media obtenida en 12 hojas.

El análisis cuantitativo de ácido salicílico (AS) endógeno libre en las hojas

En diferentes momentos tras la inoculación, se extraen las hojas y sus peciolos (2 hojas por planta). Las hojas se cortan longitudinalmente en tiras muy finas y se colocan verticalmente en un tubo de centrifugado. El líquido intercelular y el floema se obtienen mediante centrifugación (5000 g), y se recogen en una solución acuosa al 50 % de metanol (v/v). Cada muestra se analiza mediante cromatografía líquida de alta resolución (CLAR) en columna C18 equilibrada en una mezcla formada en un 95 % de tampón de acetato de sodio 50 mM, pH 4,5 y un 5 % de acetonitrilo. El AS, eluído tras un tiempo de retención de 15 min. a una velocidad de 2 ml/min, se detecta por florescencia por un espectrofluorímetro (excitación a 290 nm, emisión a 402 nm). La concentración AS se expresa en |jg AS g-1 of de materia fresca.

El análisis cuantitativo se realiza en 2 hojas de 6 vástagos diferentes tomados al azar, por modalidad. El resultado es la expresión de la cantidad media de ácido salicílico obtenida en 12 hojas.

III/ Resultados:

A/ Porcentaje medio de hojas contaminadas por vástago, en función del tiempo (Tabla 4):

Las valoraciones se realizan acerca de 10 vástagos por modalidad, a razón de dos por árbol, tomados al azar. La observación afecta a todas las hojas del vástago.

Las diferentes letras representan resultados significativamente diferentes según la prueba de Newman-Keuls en el nivel del 5 % de error.

B/ Gravedad de los daños en las hojas según el porcentaje medio de la superficie de la hoja afectada visualmente por la enfermedad, en función del tiempo (Tabla 5).

Las valoraciones se realizan acerca de 10 vástagos por modalidad, a razón de dos por árbol, tomados al azar. La observación afecta a todas las hojas del vástago.

Las diferentes letras representan resultados significativamente diferentes según la prueba de Newman-Keuls en el nivel del 5 % de error.

C/ Prueba antibacteriana de PP1 en Xaj (tabla 6)

No se observan reducciones del número ni del diámetro de las colonias.

D/ Análisis cuantitativo de la actividad peroxidásica en las hojas, en función del tiempo (nkat/mg de proteína) (tabla 7).

El análisis cuantitativo se realiza en 2 hojas de 6 vástagos diferentes tomados al azar, por modalidad. Por lo tanto, el resultado es la expresión de la actividad media obtenida en 12 hojas.

Las diferentes letras representan resultados significativamente diferentes según la prueba de Newman-Keuls en el nivel del 5 % de error.

E/ Análisis cuantitativo de ácido salicílico (AS) endógeno (pg/g materia fresca) libre en las hojas (tabla 8)

El análisis cuantitativo se realiza en 2 hojas de 6 vástagos diferentes tomadas al azar, por modalidad. Por lo tanto, el resultado es la expresión de la actividad media obtenida en 12 hojas.

Las diferentes letras representan resultados significativamente diferentes según la prueba de Newman-Keuls en el nivel del 5 % de error.

IV / Conclusión:

En este ensayo, el producto PP1 se prueba contra la bacteria Xaj en el nogal, de manera preventiva y curativa. En lo relativo a la aparición de síntomas, el tratamiento con PP1 (P) de manera preventiva reduce de forma importante y significativa el número de hojas que presentan síntomas. En efecto, los primeros síntomas aparecen a partir del 04/07/2017 en los árboles inoculados con Xanthomonas y NO tratados con PP1, mientras que en los tratamientos preventivos con PP1 (P) los síntomas aparecen débilmente solo el 18/07 (tabla 4).

PP1 (C), como tratamiento curativo, no retrasa la fecha de aparición de los síntomas (04/06/2017), pero no permite que la enfermedad se desarrolle (tabla 4).

En lo relativo a la frecuencia de ataque, ambos tratamientos con PP1 (P) y PP1 (C) reducen significativamente el número de hojas infectadas en comparación con la modalidad de Referencia (un 32 % de hojas atacadas en la modalidad de Referencia con inoculación, un 5 % y un 7 % de hojas atacadas en la modalidad PP1 (P) y PP1 (C) el 01/08 (tabla 4).

Ambos tratamientos, PP1 (P) y PP1 (C), reducen también significativamente la gravedad de la enfermedad e impiden que la enfermedad se desarrolle (un 38 % de superficie foliar atacada en la modalidad de Referencia, un 5 % y un 5 % de superficies foliares atacadas en la modalidad PP1 (P) y PP1 (C) el 01/08 (tabla 5).

La prueba de actividad antibacteriana muestra que el producto PP1 no actúa directamente contra la bacteria Xaj (tabla 6).

En este contexto, se realizó el análisis cuantitativo de dos marcadores bioquímicos conocidos por su implicación en la defensa de las plantas:

El análisis cuantitativo de las peroxidasas, conocidas por su implicación en la defensa de las plantas frente agentes patógenos bacterianos, se realizó de la siguiente forma:

En el caso de PP1 (P) como tratamiento preventivo, se observa una actividad peroxidásica muy fuerte 3 días después de la inoculación con Xaj (16/06), y esta actividad no deja de aumentar posteriormente, hasta la última extracción (01/08) (tabla 7)

En el caso del tratamiento curativo con PP1, la actividad peroxidásica aumenta también considerablemente a partir del 20/06, pero con una cinética más lenta en el tiempo (tabla 7).

El 01/08 las actividades medias peroxidásicas son de 580 nkat de AS/mg de proteína en las plantas de la modalidad de Referencia sin inoculación, 790 nkat/mg de proteína en las plantas de Referencia con inoculación, 2408 nkat/mg de proteína y 1852 nkat/mg de proteína respectivamente en las plantas de la modalidad PP1 (P) y PP1 (C) (tabla 7).

Se llevó a cabo asimismo el análisis cuantitativo del AS:

En la modalidad de Referencia con Inoculación, la síntesis de AS tiene lugar de forma tardía (04/07) y aumenta regularmente después, hasta alcanzar un valor medio de 0,8 |jg de AS/g materia fresca el 01/08 (tabla 8).

En la modalidad PP1 (P) utilizado de manera preventiva, se observa una fuerte síntesis de ácido salicílico (1 jg de AS/g de materia fresca) una vez transcurridos 3 días tras la infección, el 16/06. Este valor no deja de aumentar hasta alcanzar 2 jg de AS/g de materia fresca el 01/08. En la modalidad PP1 (C) utilizada de manera curativa, el aumento de la síntesis de AS también se observa a partir del 16/06, pero con una tasa más baja (0,5 jg de AS/g de materia fresca), hasta alcanzar 1,9 jg de AS/g de materia fresca el 01/08 (tabla 8).

La síntesis de AS se estimula considerablemente en el caso de los tratamientos preventivos y curativos con PP1. Hay que señalar que la interacción seguida no corresponde a la introducción de una resistencia «gen por gen» entre la planta y la bacteria. En efecto, sin tratamiento, la bacteria invade progresivamente la planta.

Los resultados observados, tanto en el plano de la reducción de los síntomas con los tratamientos de PP1, como en el plano de las dosificaciones de peroxidasa y AS, sugieren un fenómeno de potenciación, con un aumento de los mecanismos de defensa a partir de la infección por el patógeno.

En ambos casos (tratamientos preventivos y curativos) PP1 permite a los nogales, mediante la estimulación de sus defensas, luchar eficazmente contra la bacteriosis.

Ejemplo 9 - Eficacia de PP1 contra la Xanthomonas arboricola pv pruni del melocotonero (Prunus pérsica) Introducción

Xanthomonas arboricola pv. pruni es responsable de la enfermedad de las manchas bacterianas de los frutales de hueso (Prunus spp.).

Este agente patógeno ataca en efecto principalmente a los albaricoques (Prunus armeniaca), cerezos (Prunus avium), ciruelos (Prunus domestica) y melocotoneros (Prunus pérsica).

Esta bacteria está actualmente extendida por todo el mundo y está catalogada prácticamente en todas partes donde se cultivan los frutos de hueso. En los casos graves de infección, los daños causan un 70 % de pérdida de la cosecha.

Esta bacteria está clasificada entre las plagas de cuarentena en la Unión Europea, y se trata como tal en la ordenanza sobre protección de vegetales (OPV, Rs 916.20).

En el contexto de ausencia de medios de lucha contra esta enfermedad, es primordial desarrollar medidas capaces de limitar la propagación de la enfermedad, estimulando de forma significativa las defensas de los árboles.

Los tratamientos con PP1, capaces de luchar eficazmente contra esta bacteria, deberían poder limitar la contaminación a otros árboles.

Se realizó un ensayo con melocotoneros contaminados de forma natural, para conocer la reacción del árbol ante la enfermedad, después del tratamiento.

Utilizado de manera preventiva, PP1 debería ser capaz de limitar la propagación de la epidemia de bacteriosis (Xanthomonas arboricola pv. pruni) del melocotonero.

I/ Puesta en marcha del ensayo:

• Año: 2017

• Variedad de melocotonero: Summer Sweet

• Edad de los árboles: 4 años

• Lugar: Les Costiéres (Gard, Francia)

• Inoculación: Natural. El ensayo se realiza con plantas ya contaminadas por Xanthomonas arboricola desde hace 1 año.

• Número de modalidades: Se someten a prueba tres modalidades.

• Las modalidades son las siguientes:

1/ Referencia

2/ Pulverización de PP1 (t) a nivel foliar. PP1 (t) se extrae de los tallos de Eruca sativa

3/ Pulverización de PP1 (f) a nivel foliar. PP1 (f) se extrae de las hojas de Eruca sativa

Cada modalidad está constituida por 20 árboles (4 grupos de 5 árboles).

Los grupos de 5 árboles de todas las modalidades se asignan de forma aleatoria dentro de la parcela.

• Recomendaciones: Aplicación de PP1 cada 14 días, desde el estadio del desborre.

• 7 aplicaciones.

• Volumen: 500 l/ha (se tritura el equivalente a 10 g de planta/l, es decir 5 kg de plantas para cubrir una ha) II/ Observaciones realizadas:

A/ Daños en vástagos (follaje): Los resultados se expresan en % de vástagos infectados, sobre una base de 50 vástagos por modalidad, tomados al azar.

B/ Daños en frutas: La enfermedad en las frutas se valoró el día de la recolección (25/08). Para ello, se observaron 50 frutas por modalidad. Los resultados se expresan en % de fruta.

Los resultados se organizan según 3 categorías por modalidades: % frutas sanas, % frutas con pocos daños, % frutas con daños importantes.

C/ Número medio de nuevos brotes por ramas el 30/06, sobre una base de 50 vástagos por modalidad, tomados al azar.

III/ Resultados:

A/ Daños en vástagos (follaje) (Tabla 9)

B/ Daños en frutas: La enfermedad en la frutas se valoró el día de la recolección (25/08) (Tabla 10)

C/ Número medio de nuevos brotes por ramas en el 13/06 (Tabla 11)

VI / Conclusión:

El % de vástagos afectados se reduce significativamente cuando se aplica PP1 cada 14 días, desde el estadio del desborre (un 62 % vástagos afectados en las plantas de referencia, un 5 % y un 4 % de vástagos afectados en las modalidades PP1 (t) y PP1 (f))

En lo relativo a la fruta: En la modalidad de referencia, el 50 % de las frutas están sanas, mientras que el 85 % y el 82 % de las frutas sanas se contabilizan en las modalidades PP1 (t) y PP1 (f)

Es importante señalar que en las modalidades PP1 ningún fruto presenta daños importantes, mientras que el 32 % de la fruta en la modalidad de referencia muestra daños severos.

PP1 actúa asimismo en el vigor del huerto. En efecto, se observa un número de nuevos brotes significativamente superior en las modalidades PP1, en comparación con las modalidades de referencia (12 nuevos brotes de media por rama en las modalidades de referencia, 28 y 25 nuevos brotes de media por rama en las modalidades PP1 (t) y PP1 (f).

Los tratamientos con PP1 permiten una lucha eficaz contra la bacteria Xanthomonas arboricola pv pruni.

En un modo de realización, la presente invención se refiere a la utilización de triturados obtenidos por extracción acuosa de al menos una parte de plantas de rúcula para estimular las defensas de las plantas o árboles y reducir los efectos del fitoplasma bacteriano del decaimiento del peral o Candidatus Phytoplasma pyri en el peral o la bacteria Candidatus Phytoplasma solani en la vid, la lavanda, la patata, el tomate, la berenjena, el pimiento y el tabaco.

Ejemplo 10- Eficacia de PP1 contra la bacteria Candidatus phytoplasma pyri, de la pera (Pear decline).

Introducción

El fitoplasma Candidatus phytoplasma pyri, responsable del declive rápido del peral, está presente en la mayoría de los países de la Unión Europea donde existen cultivos de peral. Esta enfermedad también se detecta a lo largo de las costas norteamericanas. Afecta principalmente a las plantas del género Pyrus, frutales y ornamentales. También puede observarse en membrillos, Cydonia oblonga.

La degradación del floema de los árboles contaminados conduce a su marchitamiento. Sin embargo, en función de las prácticas de cultivo y de la sensibilidad de los portainjertos, pueden distinguirse dos tipos de síntomas: un decaimiento rápido que se traduce en la desecación de las hojas de julio y agosto, o un decaimiento lento que debilita progresivamente el árbol.

En la actualidad, no existe ninguna técnica ni ningún tratamiento que permita eliminar el fitoplasma del peral.

Es importante poner en marcha un nuevo tratamiento, capaz de estimular la planta para luchar contra la bacteria Candidatus phytoplasma pyri.

I/ Puesta en marcha del ensayo:

• Año: 2017

• Variedad de peral: Bartlett

• Huerto plantado en: 2008

• Lugar: Región de Provenza, Alpes y Costa Azul (Francia)

• Inoculación: Natural: Este huerto está gravemente infectado desde 2016.

• Número de modalidades: 2

Tres modalidades probadas: 3 filas de 10 árboles (30 árboles). Cada modalidad está constituida por una fila de 10 árboles.

Las modalidades son las siguientes:

1/ Referencia

2/ Pulverización de PP1 (f) a nivel foliar. PP1 (f) se extrae de las hojas de Eruca sativa

• Recomendación: Aplicación de PP1 cada 10 días, desde el estadio del desborre Ventaja de PP1: No presenta fitotoxicidad en la fase de floración.

• Volumen: 800 l/ha (se tritura el equivalente a 10 g de planta/l, es decir, 8 kg de plantas para cubrir una ha) II/ Observaciones realizadas:

A / Número de árboles que presentan síntomas de declive rápido, por modalidad

B/ Número medio de ramas por árbol que presentan los síntomas, en 2 fechas (5 de junio y 2 de agosto). Estos síntomas se dividen en 2 observaciones: 1/ Los síntomas en primavera (valoración de 5 de junio): vástagos con hojas de color verde pálido, de tamaño reducido y poco numerosas, y 2/ los síntomas de otoño (valoración del 2 de agosto): las hojas adoptan prematuramente un color rojo, los bordes se enrollan. III: Resultados:

A / Número de árboles que presentan los síntomas por modalidad (tabla 1)

B/ Número medio de ramas por árbol que presentan síntomas de declive (tabla 2)

IV: Opinión

Los árboles fueron severamente atacados en 2016. En este contexto de fuerte presión parasitaria, los síntomas se observaron en dos tiempos.

A partir de la primavera de 2017, y a pesar del tratamiento con PP1, se observa un 30 % de árboles en las 2 modalidades que presentan los síntomas de primavera (vástagos con hojas de color verde pálido, de tamaño reducido y hojas poco numerosas) (tabla 1). Estos vástagos se distinguen visualmente del resto del follaje en la parcela.

En cambio, en las plantas tratadas con PP1 se observa un menor número de árboles con síntomas de otoño (50 % de árboles respecto a los de referencia, 30 % respecto a la modalidad PP1 (f)), en las valoraciones de 02 de agosto de 2017 (tabla 1).

En lo que respecta al número medio de ramas por árbol que presentan los síntomas, los tratamientos con PP1 desde el desborre permiten estimular las defensas de los árboles y reducir significativamente el número de vástagos que presentan los síntomas por árbol (tabla 2).

En efecto, en la parcela de referencia se observa un 47 % de vástagos por árbol afectados por la enfermedad, mientras que en la parcela tratada con PP1 (f) solo resulta afectado un 26 % de vástagos por árbol.

En agosto, el 100 % de los brotes de los árboles se contaminan en la parcela de referencia, mientras que solo el 30% de los brotes resultó afectado en la parcela tratada con PP1 (f)

PP1 actúa estimulando las defensas del árbol, así como su metabolismo. En el caso del fitoplasma del peral, el agente patógeno se instala en los vasos conductores del floema, y se concentra en particular en los vasos más finos. Esta infección causa una degradación importante de los tejidos, y la acumulación de callosa en las paredes de las células vegetales que bloquea el paso de la savia. Como reacción a esta infección, el árbol sabe crear un floema de sustitución más o menos importante, lo que le permite vivir más o menos tiempo.

Se sugiere que PP1 actúe 1/ estimulando no solo los mecanismos de defensa del árbol, que lucharán activamente contra el parásito, 2/ estimulando el metabolismo de la planta para aumentar la creación de nuevos vasos, y 3/ estimulando la producción de enzima que alisará los tapones de callosa, tilosis que obstruyen los vasos.

Este mismo fenómeno se observa durante los tratamientos en el olivo para combatir la Xyllela fastidiosa.

Por tanto, se recomienda tratar con PP1 de forma preventiva los huertos de perales, y continuar con este tratamiento cada año, para permitir que la planta mantenga sus mecanismos de defensa en alerta cada año, y cuando se produzcan los síntomas.

Ejemplo 11 - Eficacia de PP1 contra la bacteria Candidatus phytoplasma solani (fitoplasma de Stolbur) de la Viña ( Vitis vinifera)

I/ Introducción:

El fitoplasma de Stolbur (Candidatus phytoplasma solani) está presente en el centro y el sur de Europa, y en algunos países de Oriente Medio.

Es una bacteria perteneciente a los micoplasmas. Estas bacterias tienen la particularidad de estar provistas de un pequeño genoma y carentes de pared celular. En una planta, estos organismos se localizan exclusivamente en los tubos cribosos del floema. Su patogenicidad podría explicarse por varios fenómenos: obstaculiza la correcta circulación de la savia dentro de la planta infectada; producción de moléculas que interactúan con las hormonas vegetales relacionadas con el crecimiento de la planta (por ejemplo, auxinas), etc.

El fitoplasma de Stolbur se transmite a las plantas a través de las cicadelas, insectos picadores-chupadores de la familia de los hemípteros. En la actualidad, la Hyalesthes obsoletus Signoret (Hemiptera, Cixiidae) se considera el vector principal de la enfermedad de la madera negra en Europa.

El fitoplasma de Stolbur infecta las plantas de la familia de las solanáceas, principalmente la patata, el tomate, la berenjena, el pimiento y el tabaco. Es también responsable de enfermedades en otras especies cultivadas como fresal (clorosis marginal), lavanda (decaimiento), vid (enfermedad de la madera negra) o remolacha (síndrome de baja riqueza). Las familias de las asteráceas, convolvuláceas y fabáceas también agrupan plantas sensibles al Stolbur.

Todos los viñedos europeos están afectados por la enfermedad de la madera negra, que consiste en un amarilleo de la vid, no contagiosa al viñedo, y que debe su nombre a la madera no leñosa que ennegrece cuando sufren los efectos de la helada. Su incidencia de un año a otro en la viña es variable.

Esta enfermedad ocasiona pérdidas de cosecha y afecta a la calidad de la vendimia. Puede provocar la muerte de las cepas y, por consiguiente, poner en peligro la sostenibilidad del viñedo.

El aumento desde los años 2000 del número de casos de madera negra en la vid, y el hecho de que no sea posible ningún tratamiento químico para luchar contra el vector, demuestran que es importante encontrar una solución nueva de lucha.

Teniendo en cuenta el mecanismo de acción de PP1, capaz de estimular eficazmente las defensas contra enfermedades bacterianas, el producto se ha utilizado con éxito en viñedos y campos de lavanda.

II/ Puesta en marcha del ensayo:

• Año: 2016

• Variedad de vid: Viñedo de Chardonnay, Viñedo de Pinot noir

• Para contar con una estimación estadística fiable teniendo en cuenta la enfermedad, se utilizan dos viñedos diferentes para valorar la enfermedad y la eficacia del producto PP1. En cada viñedo, cada modalidad está constituida por 100 pies de viña.

• Edad de los árboles: 12 años en el viñedo de Chardonnay y 14 años en el viñedo de Pinot noir

• Mantenimiento de la parcela: Con el fin de favorecer la enfermedad, estos viñedos se explotan en 2016, en suelo cubierto de hierba no controlado

• Lugar: Montpellier (Hérault, Francia) / Nimes (Gard, Francia)

• Inoculación: Natural.

• Número de modalidades: Se someten a prueba tres modalidades.

Las modalidades son las siguientes:

1/ Referencia

2/ Pulverización de PP1 (t) a nivel foliar. PP1 (t) se extrae de los tallos de Eruca sativa

3/ Pulverización de PP1 (f) a nivel foliar. PP1 (f) se extrae de las hojas de Eruca sativa

• Recomendaciones: Aplicación de PP1 cada 14 días, desde el estadio de 2-3 hojas, hasta la maduración de los frutos.

• Volumen: 800 l/ha (se tritura el equivalente a 10 g de planta/l, es decir, 8 kg de plantas para cubrir una ha). III/ Observaciones realizadas:

A/ Porcentaje de plantas atacadas por viñedos, el 31/08.

Los síntomas son visibles sobre todo en verano y pueden aparecer en una parte o en la totalidad de la cepa. Las plantas enfermas son reconocibles por sus hojas enrolladas hacia abajo que, según la variedad, presentan decoloraciones parciales a totales, amarillas o rojas, incluyendo las nervaduras. Sus racimos se marchitan prematuramente y sus vástagos presentan una maduración deficiente, parcial o ausente.

B/ Análisis cuantitativo del ácido jasmónico (AJ) endógeno libre

Dados los resultados de estimulación de las defensas observados en otros modelos, parece interesante realizar análisis cuantitativos del AJ.

En dos tiempos diferentes (6 horas y 24 horas) después del 5.° tratamiento, se extraen 5 hojas tomadas al azar de 10 vástagos sanos (50 hojas) y 10 contaminados (50 hojas).

Tras pesarse, las hojas se sumergen en el nitrógeno líquido N2. A continuación, el triturado se sumerge en etanol. Las diferentes extracciones se realizan de acuerdo con Gundlach et al., 1992. El AJ se analiza mediante cromatografía de gases y espectrómetro de masas.

Las separaciones se realizan en una columna DB-5 (30- X 0,25 mm).

IV/ Resultados:

A/ Porcentaje de plantas atacadas por viñedos el 31/08.

Las cepas con síntomas se aíslan en las parcelas, sin agrupación aparente.

B/ Análisis cuantitativo del ácido jasmónico (AJ) endógeno libre (ng de AJ/g materia fresca) en:

Plantas sanas:

Los resultados se expresan en ng de AJ/g de materia fresca.

Los resultados representan la media de los análisis cuantitativos realizados en 50 hojas por modalidad

Plantas contaminadas:

Los resultados se expresan en ng de AJ/g de materia fresca.

Los resultados representan la media de los análisis cuantitativos realizados en 50 hojas por modalidad.

V / Conclusión:

Se observa claramente que las parcelas tratadas con PP1 presentan un número significativamente reducido de cepas con síntomas relacionados con el fitoplasma de Stolbur (Candidatus phytoplasma solani), en comparación con las parcelas no tratadas.

En efecto, en las parcelas de referencia de los viñedos de Chardonnay y Pinot noir, el 17 % y el 24 % de las cepas presentan síntomas, respectivamente, mientras que solo el 3 % y el 4 % de las cepas presentan síntomas en las modalidades tratadas con PP1 (t), y solo el 2 % y el 1 % de las cepas presentan síntomas en las modalidades tratadas con PP1 (f).

Hay que señalar que los síntomas observados en las cepas tratadas con PP1 presentan síntomas menos «avanzados» en ambos viñedos en comparación con las cepas de referencia. En efecto, no se observa necrosis en las cepas de las modalidades tratadas, sino únicamente decoloraciones amarillas con hojas enrolladas...

Habida en cuenta los resultados obtenidos en este modelo y de los resultados observados en otros modelos (estimulación de las defensas de las plantas con PP1), ha sido interesante realizar uno de los compuestos relacionados con la defensa de las plantas contra los insectos: la AJ.

Los análisis cuantitativos se realizaron en 50 hojas tomadas al azar por modalidad, en plantas sanas y con síntomas.

En las plantas que no presentan síntomas, el tratamiento con PP1 desencadena una producción significativa de AJ en las hojas, 6 horas e incluso 24 horas después de la aplicación, en comparación con las hojas recogidas de las plantas de referencia. No obstante, los niveles de AJ no superarán los 705 ng de AJ/g de Materia Fresca (viñedo de Chardonnay), y los 788 ng de AJ/g de Materia Fresca (viñedo de Pinot noir) en las plantas tratadas con PP1,24 después de la aplicación.

Dado que el valor máximo observado de AJ en las plantas de referencia es de 81 ng de AJ/g de Materia fresca (es decir, 8-9 veces menos), los contenidos determinados cuantitativamente de AJ en las plantas tratadas podrían estar involucrados (en asociación con otros mecanismos de defensa que no permiten que el parásito se instale) en la repulsión eficaz de los insectos picadores-chupadores.

En las plantas contaminadas, se observa asimismo una importante producción significativa de AJ 6 horas y 24 horas después del tratamiento con PP1.

En esta ocasión, las cantidades de AJ observadas en las plantas tratadas con PP1 son mucho más elevadas (1352 ng de AS /g de Materia fresca en el viñedo de Chardonnay; 1489 ng de AS /g de Materia fresca en el viñedo de Pinot noir), mientras que las plantas de referencia contaminadas producen 102 ng de AS /g de Materia fresca en el viñedo de Chardonnay y 145 ng de AS /g de Materia fresca en el viñedo de Pinot noir.

Como en otros modelos vegetales tratados con PP1, parece que se pone en marcha un proceso de potenciación, con una elevada producción de moléculas activas implicadas en la defensa, desde la aparición del ante patógeno.

Los tratamientos con PP1 (extractos de hojas o tallo) muestran una eficacia significativa e interesante contra la enfermedad de la madera negra de la vid, y debe recomendarse como tratamiento preventivo, desde el estadio de 2 a 3 hojas.

Ejemplo 12- Eficacia de PP1 contra la Candidatus phytoplasma solani (fitoplasma de Stolbur) de la lavanda (Lavandula angustifolia)

I/ Introducción:

La lavanda y el lavandín son cultivos emblemáticos de la Alta Provenza (Francia), víctimas de un declive desde principios de los años 2000. Los productores de lavanda y lavandín se enfrentan a mortalidades precoces de sus producciones, cuya causa principal es el fitoplasma del Stolbur (Candidatus phytoplasma solani), que es transmitido a las plantas por un insecto vector, la cicadela (Hyalesthes obsoletus).

El fitoplasma del Stolbur es una bacteria sin pared celular que necesita un «anfitrión» para sobrevivir: planta o insecto. Una vez introducido en una planta de lavanda, obstruye los vasos por donde circula la savia, provocando así un debilitamiento de la planta. Se observa entonces una interrupción del crecimiento, un amarillamiento de las hojas y los tallos y, después, la muerte de la planta.

No existe ningún medio directo de lucha directa contra el fitoplasma y es imposible combatir al insecto.

El producto PP1 encuentra, por lo tanto, su lugar en una estrategia de lucha contra esta enfermedad.

II/ Puesta en marcha del ensayo

• Campos de lavanda:

La planta utilizada en este ensayo es la lavanda común (Lavandula angustifolia), denominada comúnmente lavanda verdadera. Este ensayo se realizó en plantaciones de lavanda de 6 años situadas en el sur de Francia (tabla 1).

Tabla 1. Ubicación de la parcela: Pézenas (Francia).

• Tratamientos

Durante este ensayo, 8 plantas de lavanda fueron tratadas con el producto PP1 en comparación con plantas de lavanda no tratadas. En esta parcela todas las plantas de lavanda estaban enfermas y presentaban síntomas de la infección por Candidatus Phytoplasma solani.

En cada tratamiento se aplicaron 100 ml de PP1 utilizando un dispositivo portátil BERTHOUD COSMOS 18 PRO. Entre marzo y julio de 2016, se realizaron 10 aplicaciones del producto PP1 con un intervalo de 12 a 15 días (Tabla 2: Calendario de aplicaciones del producto PP1)

* «XDAY» significa X días después de la aplicación Y

III/ Observaciones realizadas:

Durante este ensayo se realizaron las valoraciones en dos fechas. La primera tuvo lugar el mismo día de la sexta aplicación (F; 17/05/2016) y la segunda en la última aplicación (K; 25/07/2016).

Se valoraron los cinco parámetros siguientes:

• el porcentaje de pedúnculo secundario de nueva formación

• la altura del pedúnculo recién de nueva formación

• el porcentaje de verticilo (grupo del cáliz) por espiga

• el diámetro de las plantas

• la altura de las plantas

Respecto a los tres primeros parámetros, la evaluación se realizó en 50 pedúnculos elegidos al azar. Respecto a los dos últimos parámetros, la evaluación se realizó en la planta completa de lavanda. Con la finalidad de evaluar visualmente la progresión de la enfermedad, se tomó una foto de las plantas no tratadas y de las plantas enfermas tratadas con el producto PP1 en las dos fechas de evaluación (17/05/2016 y 25/07/2016).

IV/ Resultados

Figura 23: Desarrollo de los parámetros fisiológicos de crecimiento en las plantas de lavanda tratadas (barras negras), en comparación con las plantas de «control» no tratadas (barras blancas). Las partes de la figura 23 tienen los siguientes significados: A': porcentaje medio de pedúnculo secundario de nueva formación, B': altura media del pedúnculo de nueva formación, C': porcentaje medio de verticilo (grupo de cáliz) por espiga, D': diámetro medio de las plantas, E': Media de las alturas de las plantas.

A, B, C n=50. D, E n= 8. Las diferencias significativas entre las plantas tratadas y las plantas de «control» se indican con *** (P<0.001)

La figura 24 muestra, en forma de fotografías, la evolución de la enfermedad causada por el fitoplasma de Stolbur (Candidatus phytoplasma solani) en las plantas de referencia (A, C) y las plantas tratadas con PP1 (B, D).

V/ Conclusión:

En las dos fechas de valoración, 17 de mayo y 25 de julio, las plantas tratadas con PP1 muestran parámetros de crecimiento significativamente mejores que las plantas no tratadas, con relación a todas las valoraciones y parámetros. Las diferencias entre plantas tratadas y no tratadas son muy significativas (Figura 23).

Visualmente, los resultados son asimismo bastante expresivos (figura 24), ya que las plantas no tratadas están totalmente secas el 25 de julio, mientras que las plantas tratadas se mantienen verdes y presentan inflorescencias.

Estos resultados demuestran que PP1 debería utilizarse en la lucha contra la especie Candidatus phytoplasma solani, para preservar los cultivos de lavanda. PP1 debería integrarse en un programa de lucha preventiva, para limitar la epidemia y proteger los campos de lavanda y lavandín.

Ejemplo 13 - Efecto de PP1 contra el oídio (Podosphaera pannosa) del rosal

1/ Introducción

1.1 Objetivo del ensayo

Las pruebas experimentales de un nuevo producto natural (compuesto al 100 % por un extracto de planta), denominado PP1, han permitido demostrar resultados muy prometedores, en particular en lo que respecta a la activación de los mecanismos de defensa de la planta. Los resultados preliminares mostraron un efecto preventivo en los cultivos analizados atacados por hongos fitopatógenos.

El objetivo de este ensayo es, por lo tanto, probar este nuevo producto en un nuevo modelo, es decir, evaluar el efecto y la eficacia del producto PP1 para luchar contra el oídio del rosal.

1.2 Información sobre el agente patógeno que debe combatirse

El oídio del rosal es una enfermedad criptogámica, comúnmente conocida como «el mal blanco». Este hongo provoca la aparición de un fieltrado blanco en las hojas y los brotes jóvenes. Los primeros síntomas son poco visibles y se manifiestan con una ligera decoloración bajo las hojas. Cuando el ataque tiene lugar, las hojas pueden deformarse y los botones florales desecarse, limitando considerablemente el desarrollo de la planta y su floración.

El oídio produce esporas que proliferan sobre todo por efecto del calor y con un índice de humedad superior al 70 % (sobre todo en los invernaderos de cultivos de rosales ornamentales). El oídio se transmite rápidamente de planta a planta y requiere un tratamiento rápido y eficaz para limitar su proliferación y proteger la zona del cultivo.

Este ensayo se realizó con contaminación artificial de oídio.

1.3 Información sobre la planta anfitriona destinataria

El cultivo destinatario es el rosal.

Este ensayo se realizó en plantas de rosales ornamentales en maceta.

2/ Puesta en marcha del ensayo

2.1 Plan de acción

En abril de 2018, se introdujo una variedad ornamental de rosal sensible al oídio en uno de los invernaderos de la empresa Delphy en Boskoop (Países Bajos). Cuando el desarrollo de brotes jóvenes resultó suficiente, parte de los cultivos se trataron con el producto PP1.

Durante el ensayo se midió el desarrollo del oídio en comparación con un producto de referencia químico y con plantas no tratadas.

Si es necesario, para prevenir el desarrollo de otras enfermedades (como el mildiu), se aplicará otro producto de referencia a las plantas de rosales para evitar posibles interferencias.

2.3 Disposición y dimensiones

1 (cultivo) x 3 (tratamientos) x 5 (replicaciones)

Superficie: “ 48 m2 (6 x 8 m)

Superficie bruta: “ 1 m2 (30 plantas)

Superficie neta: “ 0,4 m2 (12 plantas)

Líneas de demarcación: al menos 2 (1 rodeando cada parcela)

2.4 Tratamientos y valoraciones

Número de tratamientos:

• PP1: 5

• Referencia: 3

Frecuencia de aplicación en relación con las instrucciones de uso:

• PP1: 10 días

• Referencia: 20 días

Número de valoraciones: 6

• Inmediatamente después de la primera aplicación

• Posteriormente, antes de cada tratamiento

Método (EPPO PP1/196(2) - evaluación biológica de los fungicidas - hongos de plantas leñosas ornamentales): En cada parcela, tomar al azar un mínimo de 50 hojas de edad comparable. Valorar el nivel de contaminación: número de hojas contaminadas y porcentaje de superficie foliar afectado. Puede utilizarse una escala, pero debe describirse.

Escala de puntuación:

Medidas adicionales: condiciones climáticas (temperatura, humedad, iluminación, etc.)

Soporte de las valoraciones: formato digital (fotos)

2.5 Análisis e informe

Fiabilidad: 95 % (P <0,05)

Fecha de emisión: Junio de 2018

2.6 Duración del ensayo

La duración de un ensayo en invernadero es de 12 semanas como máximo (debido al desarrollo de los cultivos y a la garantía de las condiciones óptimas).

* X DA-A: X días después del primer tratamiento (A)

Tabla: Valoración del porcentaje de la superficie foliar de los rosales afectada por el oídio (por replicación -escala de 0 a 5)

Tabla: Valoración del porcentaje de la superficie foliar de los rosales afectada por el oídio (media de las 5

3/ Conclusiones:

En todas las fechas de valoración, las plantas de rosales tratadas con el producto PP1 y las plantas de rosales tratadas con el producto químico de referencia muestran una superficie foliar afectada por el oídio estadísticamente inferior a las plantas de rosales no tratadas.

Cincuenta y nueve días (59 DA-A) después de la primera aplicación, los resultados demuestran que las plantas de rosales tratadas con el producto PP1 presentan menos del 5 % de su superficie foliar afectada por el oídio (escala 1: del 1 % al 5 % de la superficie foliar afectada).

Todas las calificaciones muestran un control de la enfermedad equivalente a la referencia, del 13 de abril al 11 de junio.

Estos resultados demuestran que el producto PP1 permite luchar eficazmente contra el oídio del rosal.

Ejemplo 14 - Eficacia de PP1 contra el mildiu (Plasmapora vitícola) de la vid (Vitis vinifera)

El mildiu, causado por el hongo Plasmapora viticola, está presente en la gran mayoría de los viñedos de todo el mundo. Si no existe protección fitosanitaria, los daños pueden ser dramáticos y llegar hasta la destrucción total de la cosecha. El mildiu de la vid se desarrolla en todos los órganos herbáceos de la vid, y especialmente en aquellos en vías de crecimiento (ricos en agua).

En lo que respecta a los tratamientos contra el mildiu, los agricultores suelen seguir la estrategia de los tratamientos con cobre, recomendada por los servicios técnicos. Además, es el único producto que permite el control de la Plasmopara viticola a lo largo del periodo vegetativo.

En un contexto de limitación de las cantidades de cobre por hectárea, es necesario encontrar alternativas para luchar contra el mildiu de la vid. PP1 es el candidato ideal para participar en la lucha natural contra las enfermedades de la vid, estimulando sus defensas naturales.

I/ Puesta en marcha del ensayo:

Año: 2014

Lugar: Sur de Francia

Variedad: Garnacha negra

Plan de ensayo: El ensayo se realizó siguiendo un plan en bloques de 4 repeticiones por modalidad.

Modalidades:

1/ Referencia

2/ PP1

3/ Especialidad de cobre Folpan 80WDG (marcas registradas) 1,9 kg/ha

Frecuencia de tratamientos: De 10 a 12 días

Observaciones:

Frecuencia de ataque: % medio de hojas contaminadas por modalidad

Intensidad de ataque: % medio de superficie contaminada.

Análisis estadístico: Test de Newman-Keuls (con un umbral del 5 %)

II / Resultados

Conclusiones: El producto PP1 se pulverizó sobre las plantas de vid con una frecuencia de 10 a 13 días, para combatir el mildiu.

Hay que señalar que el 24 de mayo, fecha de inicio del ensayo, la enfermedad no estaba aún presente. Por lo tanto, PP1 se utilizó como tratamiento curativo.

La enfermedad se declaró rápidamente y la presión parasitaria se hizo muy fuerte, tanto en las hojas como en los racimos.

PP1 logra controlar y limitar la enfermedad, tanto respecto a la frecuencia de ataque (% de hojas o racimos atacados por modalidad), como respecto a la intensidad (% de la superficie foliar o racimo atacado por la enfermedad).

En todas las fechas de valoración, la eficacia del producto PP1 no difiere significativamente de la eficacia del producto de referencia Folpan 80WDG (marcas registradas).

PP1 puede utilizarse en Agricultura Biológica en la lucha contra el mildiu de la vid.

Los ensayos con PP1 se realizaron mayoritariamente con Eruca sativa en diferentes modelos plantas/agentes patógenos (extraído a partir de hojas, tallo, flores, semilla o raíces).

En este ensayo, se probaron otras plantas de rúcula con la finalidad de conocer su capacidad para activar las defensas de las plantas. Esta lista de tipos de rúcula no es exhaustiva.

Ejemplo 15 - Ensayos relativos a los diferentes tipos de rúcula contra el oídio de la vid.

Las pruebas se realizaron en invernadero, en esquejes de viña de la variedad cariñena, de dos años, e infectada de forma natural por el oídio (Erysiphe necator).

Uno de los marcadores fáciles de utilizar es la actividad peroxidásica que, en este caso concreto y en estas condiciones experimentales, es un marcador de la activación de las defensas de la vid.

Las plantas son tratadas con PP1 extraído de diferentes plantas de la familia de la rúcula, y de diferentes partes de las plantas.

Cada modalidad consta de 10 plantas.

Cuando aparecen los síntomas del oídio en las hojas, las plantas de vid se pulverizan con PP1 cada 10 días. La actividad peroxidásica se mide entonces en 2 hojas por planta en todas las plantas de la modalidad, 24 horas después de la 4.a pulverización.

La siguiente tabla resume las modalidades sometidas a prueba, así como la actividad peroxidásica (nkat/mg de proteína):

Respecto a las hojas, los tallos y las flores, la concentración inicial por litro de filtrado obtenido varía de 5 g/l a 20 g/l.

Conclusión: Los resultados representan la media de la actividad peroxidásica, en nkat/mg de proteínas, en 20 hojas extraídas al azar (dos hojas por planta).

Estos resultados muestran la eficacia de los diferentes tipos de rúcula en la actividad peroxidásica en las hojas de vid.

Como segunda referencia, para comprobar la viabilidad del modelo, se sometió a ensayo otra especie vegetal carente en principio de efectos.

Las cuatro variedades de rúcula desencadenan la actividad peroxidásica, marcador del desencadenamiento de la estimulación de las defensas en estas condiciones experimentales.

Bibliografía

Aires, A., Mota, V. R., Saavedra, M. J., Rosa, E. A. & Bennett, R. N. (2009): “The antimicrobial effects of glucosinolates and their respective enzymatic hydrolysis products on bacteria isolated from the human intestinal tract”, J Appl Microbiol 106, 2086-2095.

Arora R., Sharma D., Kumar R., Singh B., Vig A.P., Arora S. (2014): “Evaluating extraction conditions of glucosinolate hydrolytic products from seeds of Eruca sativa (Mill.) Thell. using GC-MS”, Journal of Food Science, 79(10) C1964-9.

Beattie, G.A. (2011): “Water relations in the interaction of foliar bacterial pathogens with plants”, Annu. Rev. Phytopathol. 49, 533-555.

Berne, S. & Javornik, B. (2016): In Abiotic and Biotic Stress in Plants-Recent Advances and Future Perspectives (eds Shanker, A. K. & Shanker, C.) Ch. 18 (In Tech, Rijeka).

Bones A.M., Rossiter J.T. (1996): “The myrosinase-glucosinolate system, its organization and biochemistry”, Physiol. Plantarum 97, 194-208.

Bones A.M., Rossiter J.T. (2006): “The enzymic and chemically induced decomposition of glucosinolates”, Phytochemistry 67, 1053-1067.

Bones, A.M. and J.T. Rossiter (1996): “The myrosinase-glucosinolate system, its organisation and biochemistry”, Physiol. Plantarum 97, 194-208.

Bones, A.M. y J.T. Rossiter (2006): “The enzymic and chemically induced decomposition of glucosinolates”, Phytochemistry 67, 1053-1067.

Choat, B., Gambetta, G. A., Wada, H., Shackel, K. A. & Matthews, M. A. (2009): “The effects of Pierce's disease on leaf and petiole hydraulic conductance in Vitis vinifera cv. Chardonnay”, Physiol. Plant 136, 384-394.

Daugherty, M., Lopes, J.S., and Almeida, R.P. (2010): “Strain-specific alfalfa water stress induced by Xylella fastidiosa”, Eur. J. Plant Pathol. 127, 333-340.

Dufour V, Stahl M, Baysse C. (2015): “The antibacterial properties of isothiocyanates”, Microbiology 161, 229­ 243. (DOI:10.1099/mic.0.082362-0).

Dufour V., Stahl M., Baysse C.: “The antibacterial properties of isothiocyanates”, Microbiology 2015, 161, 229­ 243. DOI: 10.1099/mic.0.082362-0.

Fahey J.W., Zalcmann A.T., Talalay P. (2001): “The chemical diversity and distribution of glucosinolates and isothiocyanates among plants”, Phytochemistry 56, 5-51.

Fenwick, G.R., R.K. Heaney and W.J. Mullin (1983): “Glucosinolate and their breakdown products in food and plants”, Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 18, 123-201.

Fradin, E.F., and Thomma, B.P.H. J. (2006): “Physiology and molecular aspects of Verticillium wilt diseases caused by V.dahliae and V.alboatrum”, Mol. Plant Pathol. 7, 71-86.

Ganin, H., Rayo, J., Amara, N., Levy, N., Krief, P. & Meijler, M. M. (2013): “Sulforaphane and erucin, natural isothiocyanates from broccoli, inhibit bacterial quorum sensing”, MedChemComm 4, 175-179.

Halkier BA, Gershenzon J (2006): “Biology and biochemistry of glucosinolates”, Annu. Rev. Plant. Biol. 57, 303­ 333. DOI:10.1146/annurev.arplant.57.032905.105228.

Hilaire, E. et al. (2001): “Vascular defense responses in rice: peroxidase accumulation in xylem parenchyma cells and xylem wall thickening”, Mol. Plant. Microbe Interact. 14, 1411-1419.

J.W. Fahey, K.K. Stephenson, K.L. Wade, P. Talalay, (2013): “Urease from Helicobacter pylori is inactivated by sulforaphane and other isothiocyanates”, Biochem. Biophys. Res. Commun. 435, 1-7.

Klosterman, S.J., Atallah, Z.K., Vallad, G.E., and Subbarao, K.V. (2009): “Diversity, pathogenicity, and management of Verticillium species”, Annu. Rev. Phytopathol. 47, 39-61.

Koubaa M., Driss D., Bouazi F., Ghorbel R.E., Chaabouni S.E. (2015): “Antioxidant and antimicrobial activities of solvent extract obtained from rocket (Eruca sativa L.) flowers”, Free Radicals and Antioxydants 5, 29-34.

Lazzeri L., Tacconi R., Palmieri S., (1993): “ In vitro activity of some glucosinolates and their reaction products toward a population of the nematode Heterodera schachtii”, Journal of Agricultural and Food Chemistry 41, 825-9.

Lazzeri L., Leoni O., Manici L., Palmieri S., Patalano G. (2004): “Use of seed flour as soli pesticide”, Patent WO 2004017739 A1

Lord J.S., Lazzeri L., Atkinson H.J., Urwin P.E. (2011): “Biofumigation for control of pale potato cyst nematodes: activity of Brassica leaf extracts and green manures on Globodera pallida in vitro and in soil”, J. Agric. Food Chem. 59 (14), 7882-7890. DOI: 10.1021/jf200925k.

Manici L.M., Lazzeri L., Palmieri S. (1997): “ In vitro fungitoxic activity of some glucosinolates and their enzymederived products toward plant pathogenic fungi”, Agric. Food Chem. 45, 2768-2773.

Müller C., Sieling N. (2006): “Effects of glucosinolate and myrosinase levels in Brassica juncea on a glucosinolatesequestering herbivore and viceversa”, Chemoecology 16, 191-201.

Ngala B.M., Haydock P.P., Woods S., Back M.A. (2015): “Biofumigation with Brassica juncea, Raphanus sativus and Eruca sativa for the management of field populations of the potato cyst nematode Globodera pallida”. Pest. Manag. Sci. 71 (5), 759-769. DOI: 10.1002/ps.3849.

Pérez-Donoso A.G., Greve L.C., Walton J.H., Shackel K.A., Labavitch J.M. (2007): “Xylella fastidiosa infection and ethylene exposure result in xylem and water movement disruption in grapevine shoots”, Plant. Physiol. 143, 1024­ 1036.

Rapicavoli J.N., Blanco-Ulate B., Muszynski A., Figueroa-Balderas R., Morales-Cruz A., Azadi P., Dobruchowska J.M., Castro C., Cantu D., M. Caroline Roper M.C. (2018): “Lipopolysaccharide O-antigen delays plant innate immune recognition of Xylella fastidiosa", Nature Communications, vol. 9, Art. n.° 390, DOI:10.1038/s41467-018-02861-5.

Rask L., Andreasson E., Ekbom B., Eriksson S., Pontoppidan B., Meijer J. (2000): “Myrosinase: gene family evolution and herbivore defence in Brassicaceae”, Plant Mol. Biol. 42, 93-113.

Rep, M. et al. (2002): “Mass spectrometric identification of isoforms of PR proteins in xylem sap of fungus-infected tomato”, Plant Physiol. 130, 904-917.

Riga E., Pierce F., and Collins H.P. (2006): “Performance of arugula (Eruca sativa) as a green manure and trap crop for fungal pathogens and parasitic nematode suppression in potato”, American Phytopathological Society Abstracts, 96-97

Riga E. (2011): “The effects of Brassica green manures on plant parasitic and free living nematides used in combination with reduced rates of syhthetic nematicides”, Journal of Nematology 45 (2), 119-121.

Solana M., Boschiero I., Dall'Acqua S., Bertucco (2014): “Extraction of Bioactive enriched fractions from Eruca sativa leaves by supercritical CO² technology using different co-solvents”, The Journal of Supercritical Fluids 94, 245-251.

Sun, Q., Sun, Y., Walker, M. A. & Labavitch, J. M. (2013): “Vascular occlusions in grapevines with Pierce's disease make disease symptom development worse”, Plant Physiol. 161, 1529-1541.

Textor, S. and Gershenzon, J. (2009): “Herbivore induction of the glucosinolate-myrosinase defense system: major trends, biochemical bases and ecological significance”, Phytochem Rev. 8, 149-170.

Tong-Xian Liu, Le Kang, ed. (2011): Recent Advances in Entomological Research: From Molecular Biology to Pest Management. Springer, p. 38. ISBN 9783642178153.

Wittstock U., Agerbirk N., Stauber E.J., Olsen C.E., Hippler M., Mitchell-Olds T., Gershenzon J., Voge1H. (2004): “Successful herbivore attack due to metabolic diversion of a plant chemical defense”, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 101, 4859-4864.

Wittstock, U., Gershenzon, J., (2002): “Constitutive plant toxins and their role in defense against herbivores and pathogens”, Curr. Opin. Plant Biol. 5, 300-307.

Yadeta, K. A. & Bart, P. H. (2013): “The xylem as battleground for plant hosts and vascular wilt pathogens”, Front Plant Sci. 4, 97.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Utilización de un extracto obtenido mediante extracción acuosa de al menos una parte de plantas de Rúcula, preferentemente seleccionada entre el grupo de plantas de Rúcula del género Eruca (E. sativa, E. vesicaria...), Diplotaxis (D. erucoides, D. tenuifolia, D. muralis...), Bunias (B. erucago, B. orientalis...), Erucastrum (E. nasturtiifolium, E. incanum...) y Cakile, para estimular las defensas de las plantas o árboles y reducir los efectos de:

- la bacteria Xyllela fastidiosa sobre polígalas de hojas de mirto, vides, olivos, cítricos, adelfas, almendros, cafetos, melocotoneros y árboles frutales de hueso, robles, lavanda, romero o retama,

- la bacteria Pseudomonas syringae pv actinidiae en las plantas del género Actinidia,

- la bacteria Xantomonas arboricola pv juglandis sobre el nogal,

- la bacteria Xanthomonas arboricola pv. pruni en los Prunus spp., y preferentemente del grupo de los siguientes árboles frutales: albaricoquero, almendro, cerezo, melocotonero, ciruelo, P. salicina, laurel cerezo, así como otros Prunus exóticos u ornamentales, incluidos el P. davidiana y el P. laurocerasus,

- la bacteria fitoplasma del decaimiento del peral o Candidatus Phytoplasma pyri en el peral,

- la bacteria Candidatus Phytoplasma solani en la vid, la lavanda, la patata, el tomate, la berenjena, el pimiento y el tabaco, - el hongo Plasmapora viticola en la vid, o Phytophtora infestans en las patatas y tomates, Phytophtora citrophtora en los cítricos, Phytophtora cactorum en los perales y manzanos, Bremia lactucae en la alcachofa, o

- los hongos de tipo oídio como Podosphaera pannosa en el rosal, y Erysiphe necator, anteriormente Uncinula necator, en la vid, pero también los oídios en el tomate, la lechuga, el pepino, el fresal, el frambueso, el grosellero, el melocotonero, el peral, la alheña y el clavel.

2. Utilización según la reivindicación 1, para estimular las defensas de las plantas o árboles y reducir los efectos de la bacteria Xyllela fastidiosa sobre polígala de hojas de mirto, vides, olivos, cítricos, adelfas, almendros, cafetos, melocotoneros y árboles frutales de hueso, robles, lavanda, romero o retama.

3. Utilización según la reivindicación 1, para estimular las defensas de las plantas o árboles y reducir los efectos de la bacteria Pseudomonas syringae pv actinidiae en las plantas del género Actinidia.

4. Utilización según la reivindicación 1, para estimular las defensas de las plantas o árboles y reducir los efectos de la bacteria Xantomonas arboricola pv juglandis en el nogal.

5. Utilización según la reivindicación 1, para estimular las defensas de las plantas o árboles y reducir los efectos de la bacteria Xanthomonas arboricola pv. pruni, especialmente el Prunus spp., y en particular los árboles frutales como albaricoquero, almendro, cerezo, melocotonero, ciruelo, P. salicina, laurel cerezo así como otros Prunus exóticos u ornamentales, incluidos el P. davidiana y el P. laurocerasus,

6. Utilización según la reivindicación 1, para estimular las defensas de las plantas o árboles y reducir los efectos del fitoplasma bacteriano del decaimiento del peral o Candidatus Phytoplasma pyri en el peral.

7. Utilización según la reivindicación 1, para estimular las defensas de las plantas o árboles y reducir los efectos de la bacteria Candidatus Phytoplasma solani en la vid, la lavanda, la patata, el tomate, la berenjena, el pimiento y el tabaco,

8. Utilización según la reivindicación 1, para estimular las defensas de las plantas o árboles y reducir los efectos de los hongos Plasmapora viticola en la vid, Phytophtora infestans en las patatas y los tomates, Phytophtora citrophtora en los cítricos Phytophtora cactorum en los perales y manzanos o Bremia lactucae en la alcachofa.

9. Utilización según la reivindicación 1, para estimular las defensas de las plantas o árboles y reducir los efectos de los hongos de tipo oídio como Podosphaera pannosa en el rosal, y Erysiphe necator, anteriormente Uncinula necator, en la vid, pero también los oídios en el tomate, la lechuga, el pepino, el fresal, el frambueso, el grosellero, el melocotonero, el peral, la alheña y el clavel.

10. Utilización según alguna de las reivindicaciones de 1 a 9, en la que la aplicación sobre la planta o el árbol se realiza mediante pulverización foliar, riego en el suelo, goteo, utilización en cultivos hidropónicos, tratamiento de simientes y/o recubrimiento de semillas.

11. Utilización según alguna de las reivindicaciones de 1 y 10, en la que la aplicación sobre la planta o el árbol se realiza mediante dilución en el agua de la composición entre 2 g/l y 150 g/l, expresado en gramos de plantas de las que se ha realizado la extracción por litro de producto.

12. Utilización según alguna de las reivindicaciones de 1 a 11, en la que la aplicación en la planta o el árbol se realiza mediante dilución en el agua de la composición entre 5 g/l y 70 g/l, expresado en gramos de plantas de las que se ha realizado la extracción por litro de producto.

13. Utilización según alguna de las reivindicaciones de 1 a 12, en la que dicho extracto de al menos una parte de planta de Rúcula es un extracto líquido de Rúcula del género Eruca obtenido a partir de un triturado de dichas plantas de Rúcula, y:

- dicho extracto de al menos una parte de planta de Rúcula contiene al menos algunas hojas de Rúcula, de preferencia esencialmente hojas y

- el procedimiento que permite obtener dicho extracto líquido comprende las siguientes etapas:

a) una etapa de trituración en medio acuoso de dichas plantas de Rúcula del género Eruca;

b) la filtración del triturado obtenido; y

c) la recogida del extracto líquido de Rúcula del género Eruca obtenido tras la filtración.

14. Procedimiento para estimular las defensas de las plantas o árboles y reducir los efectos de:

- la bacteria Xyllela fastidiosa sobre polígalas de hojas de mirto, vides, olivos, cítricos, adelfas, almendros, cafetos, melocotoneros y árboles frutales de hueso, robles, lavanda, romero o retama,

- la bacteria Pseudomonas syringae pv actinidiae en las plantas del género Actinidia,

- la bacteria Xantomonas arboricola pv juglandis sobre el nogal,

- la bacteria Xanthomonas arboricola pv. pruni, especialmente el Prunus spp., y en particular los árboles frutales como albaricoquero, almendro, cerezo, melocotonero, ciruelo, P. salicina, laurel cerezo así como otros Prunus exóticos u ornamentales, incluidos el P. davidiana y el P. laurocerasus,

- el fitoplasma bacteriano del decaimiento del peral o Candidatus Phytoplasma pyri en el peral,

- la bacteria Candidatus Phytoplasma solani en la vid, la lavanda, la patata, el tomate, la berenjena, el pimiento y el tabaco, - el hongo Plasmapora viticola en la vid, o Phytophtora infestans en las patatas y tomates, Phytophtora citrophtora en los cítricos, Phytophtora cactorum en los perales y manzanos, Bremia lactucae en la alcachofa, o

- los hongos Podosphaera pannosa en el rosal, y Erysiphe necator, anteriormente Uncinula necator, en la vid, pero también los oídios en el tomate, la lechuga, el pepino, el fresal, el frambueso, el grosellero, el melocotonero, el peral, la alheña y el clavel;

procedimiento caracterizado porque incluye la aplicación sobre dicha planta o dicho árbol de un extracto obtenido por extracción acuosa de al menos una parte de planta de Rúcula, por ejemplo del género Eruca (E. vesicaria...), Diplotaxis (D. erucoides, D. tenuifolia, D. muralis...), Bunias (B. erucago, B. orientalis...), Erucastrum (E. nasturtiifolium, E. incanum...) o Cakile.

15. Procedimiento según la reivindicación 14, en el que la composición aplicada a dicha planta o dicho árbol es una composición que comprende un extracto líquido de Rúcula del género Eruca obtenido a partir de un triturado de dichas plantas de Rúcula, y:

- dicho extracto de al menos una parte de planta de Rúcula contiene al menos algunas hojas de Rúcula, de preferencia esencialmente hojas y

- el procedimiento que permite obtener dicho extracto líquido comprende las siguientes etapas:

a) una etapa de trituración en medio acuoso de dichas plantas de Rúcula del género Eruca;

b) la filtración del triturado obtenido; y

c) la recogida del extracto líquido de Rúcula del género Eruca obtenido tras la filtración.