ES2711115T3

ES2711115T3 - Formulaciones de adenovirus mejoradas

Info

Publication number: ES2711115T3
Application number: ES14766474T
Authority: ES
Inventors: Janik Adriaansen
Original assignee: Janssen Vaccines and Prevention BV
Current assignee: Janssen Vaccines and Prevention BV
Priority date: 2013-09-19
Filing date: 2014-09-16
Publication date: 2019-04-30
Anticipated expiration: 2034-09-16
Also published as: US20180235871A1; JP6013654B2; IL244572A; US11484494B2; CN111514314A; JP2016530220A; MX369156B; ME03324B; EP3046536B1; US20190240146A1; LT3046536T; KR20160055180A; US9974737B2; HRP20182159T1; DK3046536T3; PH12016500316A1; BR112016005761B1; CL2016000621A1; PT3046536T; HUE041791T2

Abstract

Formulación líquida para adenovirus, que comprende: a) un adenovirus recombinante; b) un tampón citrato; c) hidroxipropil-beta-ciclodextrina (HBCD); d) una sal; e) un detergente no iónico; en la que dicha formulación tiene un pH que oscila entre 5.5 y 6.5.

Description

DESCRIPCION

Formulaciones de adenovirus mejoradas

CAMPO DE LA INVENCION

La presente invencion se refiere a formulaciones de adenovirus y a productos farmaceuticos relacionados para su uso, por ejemplo, en aplicaciones de terapia genica y/o de vacuna. En particular, se dan a conocer formulaciones ffquidas para adenovirus en el presente documento, que mejoran la estabilidad adenoviral conservando la cantidad, potencia (infectividad) y calidad del adenovirus contenido cuando se almacenan en aproximadamente el intervalo de 2-8°C o mayor mientras que tambien es compatible con la administracion parenteral.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

Los vectores de adenovirus se consideran los vetffculos mas eficaces y ampliamente usados para insercion genica. Un desaffo permanente en el campo de la terapia genica y la investigacion de vacunas es generar formulaciones ffquidas de adenovirus que pueden estabilizar estos virus durante periodos de tiempo mas prolongados dentro de un intervalo realista de temperatura de almacenamiento para productos farmaceuticos, tal como desde aproximadamente 2°C hasta aproximadamente 8°C.

La actividad biologica de un adenovirus depende de la integridad conformacional de al menos una secuencia de nucleotidos central rodeada por una estructura de capside icosaedrica que consiste en las protemas de la capside. A diferencia de los farmacos organicos e inorganicos tradicionales, estos son estructuras biologicas altamente complejas y agentes de estres qmmico o ffsico menores pueden contribuir a la degradacion de la parffcula adenoviral. Una buena formulacion de preparaciones de adenovirus es por tanto de crucial importancia para garantizar un termino de caducidad razonable, pero estabilizar estos vectores plantea retos particulares. Los adenovirus pueden perder potencia como resultado de inestabilidades ffsicas, incluyendo desnaturalizacion, agregacion (formacion de agregados tanto solubles como insolubles), precipitacion y adsorcion, asf como inestabilidades qmmicas, incluyendo hidrolisis, desamidacion y oxidacion. Cualquiera de estas rutas de degradacion puede conducir a una disminucion de la actividad biologica, pero tambien puede dar como resultado potencialmente la formacion de subproductos o derivados que tienen toxicidad aumentada y/o inmunogenicidad alterada.

Por tanto, es necesario un enfoque adaptado para encontrar una formulacion robusta para adenovirus que garantice la estabilidad a lo largo de un amplio intervalo de condiciones. Tendran que optimizarse meticulosamente el tipo de tampon, el pH y excipientes especializados para mantener un adenovirus qrnmica, ffsica y biologicamente estable. En vista de todos los factores que pueden variarse, esta cargado de desaffo el encontrar condiciones optimas para formular adenovirus, y la composicion de una buena formulacion es impredecible a priori.

Existen formulaciones liofilizadas y son estables. Sin embargo tienden a ser relativamente caras, requieren una manipulacion que lleva mucho tiempo antes de la administracion, y podna perderse potencia en cierta medida en el proceso de liofilizacion. Existen formulaciones ffquidas que son estables en condiciones congeladas (-80°C), pero estas requieren instalaciones de envfo especializadas y de almacenamiento caras, haciendo que sea casi imposible una cadena de fno fiable, especialmente en la periferia de la red de distribucion. Una formulacion preferida para adenovirus es por tanto una formulacion ffquida que ofrece estabilidad adenoviral en un intervalo de temperatura de entre 2-8°C o mayor. Tal formulacion puede almacenarse en una nevera normal y puede administrarse rapida y facilmente.

Se han descrito previamente formulaciones ffquidas para adenovirus, por ejemplo en Evans et al. 2004. Las mejores formulaciones ejemplificadas en dicha solicitud son formulaciones tamponadas con Tris que tienen un pH que oscila entre 7.5 y 8.5. Se ha encontrado en el presente documento que dichas formulaciones son suboptimas para adenovirus. Tambien se dan a conocer formulaciones para adenovirus en el documento WO 00/29024, que se refiere principalmente a tecnicas de liofilizacion. Otras formulaciones para adenovirus que comprenden un poliol se mencionan en el documento WO 00/29024.

El documento US2005085427 se refiere a composiciones de SYN3, que contienen un vector adenoviral para interferon alfa 2b. Roberts-K-Evans. Journal of Pharmaceutical Sciences, American Pharmaceutical Association. 93, 10.

01.10.2004. 2458-2475 (XP007914498) trata sobre la estabilidad mejorada del adenovirus. El documento CN1852918 se refiere a formulaciones liofilizadas que comprenden un agente potenciador del suministro de SYN3 y un adenovirus recombinante que codifica un gen de interferon (por ejemplo, hidroxipropil-beta-ciclodextrina o detergentes).

Por consiguiente, existe la necesidad en la tecnica de encontrar formulaciones que mejoren la estabilidad adenoviral conservando la cantidad y potencia del adenovirus contenido durante el almacenamiento a lo largo de un periodo de tiempo prolongado. La estabilidad adenoviral tambien debe retenerse en el caso de estres de agitacion durante el transporte o fuerzas de cizallamiento durante la produccion o el uso cffnico, y en condiciones climaticas que oscilan ampliamente, en particular a temperatura elevada o tras ciclos repetidos de congelacion/descongelacion. Ademas, la formulacion debe ser adecuada para la via de administracion pretendida, debe tolerarse bien y debe tener preferiblemente una composicion con tan pocos componentes como sea posible. Es un objeto de la invencion proporcionar tales formulaciones para adenovirus.

SUMARIO DE LA INVENCION

Se ha encontrado y descrito en el presente documento, formulaciones para adenovirus que mejoran la estabilidad adenoviral conservando la cantidad y potencia (infectividad) y calidad del adenovirus en comparacion con formulaciones dadas a conocer previamente. De manera notable, la combinacion de un tampon citrato que tiene un pH que oscila entre 5.5 y 6.5 junto con hidroxipropil-beta-ciclodextrina (HBCD) dio como resultado una formulacion extraordinaria segun la reivindicacion 1 para la conservacion de cantidad, potencia (infectividad) y calidad de adenovirus, mejorando con la misma la estabilidad adenoviral global en comparacion con otras formulaciones conocidas en la tecnica.

Como con todos los excipientes usados para el desarrollo de formulaciones, algunos de los componentes presentes en la formulacion segun la presente invencion se citan por separado en la tecnica anterior. Sin embargo, es la combinacion muy espedfica de varios componentes lo que proporciona a la presente formulacion sus propiedades y potencial de estabilizacion extraordinarios. La formulacion exacta segun la reivindicacion 1 no se dio a conocer en la tecnica anterior. Ademas, no podna haberse previsto, basandose en la tecnica anterior en este campo inherentemente impredecible, que dicha formulacion proporcionana tal estabilidad mejorada a los adenovirus.

La presente invencion se refiere por tanto a formulaciones de adenovirus estabilizadas y a productos farmaceuticos relacionados que pueden usarse, por ejemplo, en aplicaciones de terapia genica y/o de vacuna segun la reivindicacion 1.

Las formulaciones segun la presente invencion comprenden un tampon citrato a un pH que oscila entre 5.5 y 6.5, y comprenden ademas hidroxipropil-beta-ciclodextrina (HBCD). Las formulaciones comprenden adicionalmente una sal y un detergente no ionico. Opcionalmente, las formulaciones segun la presente invencion comprenden ademas un alcohol de 2 o 4 carbonos. Las formulaciones adenovirales de la presente invencion son propicias para el almacenamiento prolongado a de 2°C a 8°C o <-65°C, durante mas de 6 meses, 1 ano, 1.5 anos, 2 anos, o mas.

Las formulaciones de adenovirus de la presente invencion comprenden a) un adenovirus recombinante en b) una disolucion tamponada con citrato, que comprende ademas c) hidroxipropil-beta-ciclodextrina (HBCD); d) una sal; y e) un detergente no ionico, en la que dicha formulacion tiene un pH que oscila entre 5.5 y 6.5. Para conservar la estabilidad del adenovirus, es esencial que el pH de esta formulacion oscile entre 5.5 y 6.5.

Preferiblemente la formulacion segun la presente invencion comprende adenovirus a un tttulo que oscila entre aproximadamente 1x107 vp/ml y 1x1013 vp/ml.

En una realizacion preferida segun la presente invencion, la concentracion de citrato en la formulacion oscila entre aproximadamente 5 mM y 30 mM.

La hidroxipropil-beta-ciclodextrina (HBCD) es el crioprotector preferido. HBCD esta presente preferiblemente en una concentracion que oscila entre aproximadamente el 1% (p/p) y el 10% (p/p).

El cloruro de sodio (NaCl) es la sal preferida, que esta presente preferiblemente a una concentracion que oscila entre aproximadamente 20 mM y 200 mM.

El polisorbato 80 es el detergente no ionico preferido que tiene preferiblemente una concentracion que oscila entre aproximadamente el 0.005% (p/p) y el 0.5% (p/p).

En una realizacion mas preferida segun la presente invencion, la formulacion tiene un pH que oscila entre aproximadamente 5.7 y 6.3, y comprende citrato a una concentracion que oscila entre aproximadamente 5 y 30 mM; HBCD a una concentracion que oscila entre el 1% (p/p) y el 10% (p/p); NaCl a una concentracion que oscila entre 20 mM y 200 mM; polisorbato 80 a una concentracion que oscila entre aproximadamente el 0.01% (p/p) y el 0.05% (p/p). En otra realizacion preferida segun la presente invencion, la formulacion tiene un pH que oscila entre aproximadamente 5.8 y 6.2, y comprende citrato a una concentracion que oscila entre aproximadamente 15 y 25 mM; HBCD a una concentracion que oscila entre el 3% (p/p) y el 8% (p/p); NaCl a una concentracion que oscila entre 50 mM y 100 mM; polisorbato 80 a una concentracion que oscila entre aproximadamente el 0.01% (p/p) y el 0.03% (p/p).

En una realizacion incluso mas preferida, la formulacion segun la invencion tiene un pH de aproximadamente 6 y comprende citrato a una concentracion de aproximadamente 20 mM; HBCD a una concentracion de aproximadamente el 5% (p/p); NaCl a una concentracion de aproximadamente 75 mM; polisorbato 80 a una concentracion de aproximadamente el 0.02% (p/p).

Se demostro en el presente documento que la adicion de un alcohol de 2 o 4 carbonos, en particular etanol, en la formulacion de la presente invencion, protegio de manera inesperadamente fuerte los adenovirus frente al dano por congelacion/descongelacion y, por consiguiente, actuo como crioprotector.

Por tanto en una realizacion preferida, la formulacion segun la presente invencion comprende ademas un alcohol de 2 o 4 carbonos. En una realizacion incluso mas preferida, la formulacion segun la invencion comprende etanol. La concentracion de etanol oscila preferiblemente entre aproximadamente el 0.1% (p/p) y el 1% (p/p).

En una realizacion preferida segun la presente invencion, la formulacion tiene un pH que oscila entre aproximadamente 5.7 y 6.3, y comprende citrato a una concentracion que oscila entre aproximadamente 5 y 30 mM; HBCD a una concentracion que oscila entre el 1% (p/p) y el 10% (p/p); NaCl a una concentracion que oscila entre 20 mM y 200 mM; polisorbato 80 a una concentracion que oscila entre aproximadamente el 0.01% (p/p) y el 0.05% (p/p); y etanol a una concentracion que oscila entre aproximadamente el 0.2% (p/p) y el 0.6% (p/p).

En otra realizacion preferida segun la presente invencion, la formulacion tiene un pH que oscila entre aproximadamente 5.8 y 6.2, y comprende citrato a una concentracion que oscila entre aproximadamente 15 y 25 mM; HBCD a una concentracion que oscila entre el 3% (p/p) y el 8% (p/p); NaCl a una concentracion que oscila entre 50 mM y 100 mM; polisorbato 80 a una concentracion que oscila entre aproximadamente el 0.01% (p/p) y el 0.03% (p/p); y etanol a una concentracion que oscila entre aproximadamente el 0.2% (p/p) y el 0.6% (p/p).

En una realizacion incluso mas preferida, la formulacion segun la invencion tiene un pH de aproximadamente 6 y comprende citrato a una concentracion de aproximadamente 20 mM; HBCD a una concentracion de aproximadamente el 5% (p/p); NaCl a una concentracion de aproximadamente 75 mM; polisorbato 80 a una concentracion de aproximadamente el 0.02% (p/p) y etanol a una concentracion de aproximadamente el 0.4% (p/p).

En otra realizacion preferida, la formulacion segun la invencion tiene un pH de aproximadamente 6 y comprende citrato a una concentracion de aproximadamente 20 mM; HBCD a una concentracion de aproximadamente el 5% (p/p); NaCl a una concentracion de aproximadamente 80 mM; polisorbato 80 a una concentracion de aproximadamente el 0.025% (p/p) y etanol a una concentracion de aproximadamente el 0.4% (p/p).

En una realizacion incluso mas preferida, la formulacion segun la invencion tiene un pH de aproximadamente 6 y comprende citrato a una concentracion de aproximadamente 20 mM; HBCD a una concentracion de aproximadamente el 5% (p/p); NaCl a una concentracion de aproximadamente 80 mM; polisorbato 80 a una concentracion de aproximadamente el 0.025% (p/p) y etanol a una concentracion de aproximadamente el 0.4% (p/p).

En otra realizacion preferida de la presente invencion las formulaciones son formulaciones lfquidas (congeladas). En aun otra realizacion, las formulaciones de la presente invencion son adecuadas para uso parenteral.

En una realizacion, las formulaciones segun la presente invencion estan contenidas en un vial. En otra realizacion, las formulaciones estan contenidas en una bolsa o una botella. En aun otra realizacion, las formulaciones estan contenidas en una jeringa o un cartucho.

La presente invencion tambien se refiere a un metodo de conservacion de un adenovirus que comprende preparar una formulacion segun la presente invencion.

En aun otra realizacion, la presente invencion se refiere a un metodo de conservacion de un adenovirus que comprende preparar una formulacion tal como se describe en el presente documento y almacenar dicha formulacion a una temperatura que oscila entre 2°C y 8°C.

La estabilidad a largo plazo potenciada a lo largo de un amplio intervalo de temperatura da como resultado un termino de caducidad prolongado de las formulaciones de virus dadas a conocer en el presente documento, permitiendo un almacenamiento y una eventual administracion al huesped de estas formulaciones a lo largo de un periodo preferiblemente de aproximadamente 1-2 anos, o mas con perdidas aceptables en la potencia del virus(es decir de no mas de 0.3 log en dos anos a 2-8°C). Ademas, las formulaciones de la presente invencion muestran estabilidad durante la exposicion a temperaturas elevadas, ciclos prolongados de congelacion/descongelacion y agitacion.

DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

Figura 1. Perdida de potencia (en log Ul/ml) (A) de Ad26 durante condiciones aceleradas de temperatura a 25°C en la formulacion B (rombos en blanco) y formulacion de control (drculos rellenos). Se muestra la Apotencia media (n=4), que refleja la potenciamuestra sometida a estres-potenciamuestra de control. Se ha medido la potencia mediante QPA.

Figura 2. Perdida de potencia (en log Ul/ml) (A) de Ad35 durante condiciones aceleradas de temperatura a 25°C en la formulacion B (rombos en blanco) y formulacion de control (drculos rellenos). Se muestra la Apotencia media (n=4), que refleja la potenciamuestra sometida a estres-potenciamuestra de control. Se ha medido la potencia mediante QPA.

Figura 3. Punto de fusion termica de Ad26 en la formulacion B y la formulacion de control. Se realizo un analisis de TMA (ensayo de fusion termica) (n=3) para Ad26 con muestras de t=0.

Figura 4. Punto de fusion termica de Ad35 en la formulacion B y la formulacion de control. Se realizo un analisis de TMA (ensayo de fusion termica) (n=3) para Ad26 con muestras de t=0.

Figura 5. Valores de delta de Ct (ACt) de Ad26 en la formulacion B con y sin NaCl, EDTA, etanol y combinaciones de los mismos despues de 69 dfas a 25°C. Los valores de ACt se correlacionan directamente con una perdida de potencia, en los que un numero mayor significa mas perdida de potencia.

Figura 6. Valores de delta de Ct (ACt) de Ad26 en la formulacion B con y sin NaCI, EDTA, etanol y combinaciones de los mismos despues de 16 d^as a 35°C. Los valores de ACt se correlacionan directamente con una perdida de potencia, en los que un numero mayor significa mas perdida de potencia.

Figura 7. Valores de delta de Ct (ACt) de Ad26 en la formulacion B con y sin NaCl, EDTA, etanol y combinaciones de los mismos despues de 30 ciclos de congelacion/descongelacion seguido por 1 dfa de agitacion. Los valores de ACt se correlacionan directamente con una perdida de potencia, en los que un numero mayor significa mas perdida de potencia.

Figura 8. Turbidimetna medida mediante la absorbancia a 350 nm de Ad26 en la formulacion B con y sin NaCl, EDTA, etanol y combinaciones de los mismos de t=0 (drculos rellenos), 25°C durante 69 dfas (rombos en blanco), 35°C durante 16 dfas (triangulos rellenos) y 30 ciclos de congelacion/descongelacion seguido por agitacion (rectangulos en blanco).

Figura 9. Fluorescencia intrmseca de Ad26 en la formulacion B con y sin NaCl, EDTA, etanol y combinaciones de los mismos de t=0 (drculos rellenos), 25°C durante 69 dfas (rombos en blanco), 35°C durante 16 dfas (triangulos rellenos) y 30 ciclos de congelacion/descongelacion seguido por agitacion (rectangulos en blanco).

Figura 10. Punto de fusion termica de Ad26 en la formulacion F y la formulacion de control. Se realizo un analisis de TMA (ensayo de fusion termica) (n=3) para Ad26 con muestras de t=0.

Figura 11. Representacion grafica por parejas para la probabilidad de exito para la potencia de CQA (ALfmite de potencia > -0.30 log Ul/ml) con condicion de estres de congelacion/descongelacion (FT, freeze/thaw) + agitacion (AG) almacenamiento a 35°C. La escala para la probabilidad de exito es de desde 0.4 (gris claro) hasta 1 (negro). Se explota el dominio experimental completo. En el cuadrado blanco esta el espacio de diseno propuesto basandose en la representacion grafica.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION

Tal como se menciono previamente, existe la necesidad en la tecnica de encontrar formulaciones que mejoren la estabilidad adenoviral conservando la cantidad y potencia del adenovirus contenido durante el almacenamiento a lo largo de un periodo de tiempo prolongado.

Varias referencias dan a conocer el uso de componentes espedficos para la formulacion de adenovirus. Altaras et al. dan a conocer citrato como parte de una gran lista de posibles inhibidores de la oxidacion por radicales libres. Dicha lista tambien contiene la combinacion de EDTA y etanol (EDTA/etanol), que se identifica como un inhibidor adicional de la oxidacion por radicales libres. La formulacion de la presente invencion usa citrato como tampon y no como antioxidante.

Renteria et al. identifican la hidroxipropil-beta-ciclodextrina (HBCD) como uno de los aditivos usados para fomentar la estabilidad de determinadas protemas y evitar la agregacion durante la administracion nasal. Renteria et al. dan a conocer el uso de hidroxipropil-beta-ciclodextrina en el contexto de una formulacion apropiada para la administracion nasal que potencia la captacion mucosa. Todas las protemas son muy diferentes en comparacion con los virus vivos tales como adenovirus, en cuanto a estructura, carga y tamano. Por consiguiente, el mecanismo de estabilizacion para adenovirus es completamente diferente e impredecible en vista del mecanismo de estabilizacion para protemas.

El documento WO029024 da a conocer hidroxipropil-beta-ciclodextrina como parte de una gran lista de posibles lioprotectores usados para preparar una formulacion secada por congelacion. El documento WO029024 se refiere a una composicion secada por congelacion en oposicion a una composicion lfquida tal como se da a conocer en la presente invencion. La ventaja de una formulacion lfquida es que es menos cara, y la manipulacion antes de la administracion lleva menos tiempo y es menos propensa a errores de reconstitucion o dosificacion clmica. Ademas, la ampliacion a escala de los procesos de liofilizacion puede ser un empeno muy complicado.

Se ha encontrado y descrito en el presente documento, formulaciones para adenovirus que mejoran la estabilidad adenoviral conservando la cantidad y potencia (infectividad) y calidad del adenovirus en comparacion con formulaciones dadas a conocer previamente.

Las formulaciones de la invencion comprenden al menos un adenovirus recombinante. La construccion de vectores adenovirales se entiende bien en la tecnica e implica el uso de tecnicas convencionales de la biologfa molecular, tales como las descritas, por ejemplo, en Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2a ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), Watson et al., Recombinant DNA, 2a ed., Scientific American Books (1992), y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, NY (1995), y otras referencias mencionadas en el presente documento. Brevemente, el vector adenoviral puede ser deficiente en al menos una funcion genica esencial en la region E1, por ejemplo, la region E1a y/o la region E1b, del genoma adenoviral que se requiere para la replicacion viral. Tal como conoce el experto para producir adenovirus, en caso de deleciones de regiones esenciales del genoma del adenovirus, las funciones codificadas por estas regiones han de proporcionarse en trans, preferiblemente por la celula productora, por ejemplo integradas en el genoma, o en forma de los denominados plasmidos auxiliares o de adenovirus, cuando se produce el adenovirus recombinante.

La propagacion de un adenovirus recombinante se ha descrito en detalle en: la patente estadounidense 6,492,169 o en el documento WO 03/104467 las patentes estadounidenses n.os 5,559,099, 5,837,511, 5,846,782, 5,851,806, 5,994,106, 5,994,128, 5,965,541, 5,981,225, 6,040,174, 6,020,191 y 6,113,913, y Thomas Shenk, “Adenoviridae and their Replication”, M. S. Horwitz, “Adenoviruses”, capftulos 67 y 68, respectivamente, en Virology, B. N. Fields et al., eds., 3a ed., Raven Press, Ltd., Nueva York (1996), que se incorpora al presente documento como referencia. El vector adenoviral deficiente en la replicacion puede generarse usando cualquier especie, cepa, subtipo, o mezcla de especies, cepas o subtipos, de un adenovirus o un adenovirus quimerico como fuente de ADN de vector (veanse por ejemplo los documentos W^o96/26281, WO 00/03029). En determinadas realizaciones de la presente invencion, los serotipos de adenovirus humanos incluyen uno cualquiera de los serotipos 2, 4, 5, 7, 11, 26, 34, 35, 36, 48, 49 o 50 o cualquier serotipo de adenovirus hnbrido o mutado. En una realizacion preferida de la presente invencion, el adenovirus recombinante es de serotipo 5, 26 o 35 de adenovirus humano.

En realizaciones adicionales, el adenovirus de la invencion es un adenovirus de simio, preferiblemente un adenovirus de chimpance o gorila. Estos adenovirus tienen generalmente una baja seroprevalencia y/o bajos tttulos de anticuerpos neutralizantes preexistentes en la poblacion humana.

En realizaciones adicionales, el adenovirus de la invencion comprende ademas acido nucleico heterologo. El experto conoce bien acido nucleico heterologo adecuado, y por ejemplo puede incluir marcos de lectura abiertos de transgen, por ejemplo marcos de lectura abiertos que codifican para polipeptidos frente a los que se desea una respuesta inmunitaria cuando se usa el vector para fines de vacunacion, por ejemplo transgenes adecuados para generar una respuesta inmunitaria frente a la malaria (vease por ejemplo el documento WO 2004/055187), VIH, tuberculosis (vease por ejemplo el documento WO 2006/053871), determinados virus, etc., todo lo cual conoce bien el experto. De hecho, la naturaleza del transgen no es cntica para la presente invencion, puede ser cualquier secuencia heterologa de acido nucleico, y asf no requiere una explicacion adicional en este caso.

El termino “estabilidad” tal como se usa en el presente documento se refiere a la resistencia relativa a la degradacion de partfculas de adenovirus en una formulacion que retiene su potencia en la escala temporal de su utilidad esperada. Preferiblemente, la potencia muestra una disminucion de no mas de 0.3 log en dos anos a 2-8°C.

El termino “potencia” tal como se usa en el presente documento se refiere a una medida de la actividad de adenovirus expresada en cuanto a las unidades infecciosas medidas en un ensayo de potencia basado en celulas, que se describe a continuacion en el presente documento.

Una composicion segun la invencion muestra una disminucion de la potencia de no mas de 0.4 log en 60 dfas y una disminucion del tttulo de no mas de 0.3 log en 60 dfas en un estudio de estabilidad en condiciones aceleradas, estudio que se realiza mediante incubacion de las formulaciones a 25°C ± 2°C durante de 1 a 3 meses.

Una composicion segun la invencion tambien muestra una disminucion de la potencia de no mas de 0.2 log en 10 ciclos en un estudio en el que se someten viales a ciclos repetidos de congelacion/descongelacion seguido por 24 horas de agitacion a temperatura ambiente en una orientacion horizontal a 200 rpm.

Como “excipiente farmaceuticamente aceptable” se designa a cualquier sustancia inerte que se combina con una molecula activa, tal como un virus, para preparar una forma de dosificacion agradable o conveniente. El “excipiente farmaceuticamente aceptable” es un excipiente que es no toxico para los receptores con las dosificaciones y concentraciones usadas, y es compatible con otros ingredientes de la formulacion que comprenden la preparacion viral. Ejemplos de excipientes son crioprotectores, detergentes no ionicos, tampones, sales e inhibidores de la oxidacion por radicales libres.

El termino “subproducto” incluye productos no deseados, que restan valor o disminuyen la proporcion de adenovirus terapeutico/profilactico en una formulacion dada. Los subproductos tfpicos incluyen agregados del adenovirus y fragmentos del adenovirus, que resultan de por ejemplo desnaturalizacion de protemas, desamidacion, hidrolisis o combinaciones de las mismas. Normalmente, los agregados son complejos que tienen un peso molecular mayor que la partfcula de virus aislada.

Una formulacion que mejora la estabilidad adenoviral, tambien denominada una “formulacion estable” tal como se usa en el presente documento es una formulacion en la que el adenovirus en la misma retiene esencialmente su integridad ffsica y/o qrnmica y/o actividad biologica con el almacenamiento. Puede evaluarse la estabilidad determinando diferentes caractensticas tales como la cantidad (de adenovirus en una formulacion), la potencia, y/u otros aspectos de calidad del adenovirus en la formulacion a lo largo de un periodo de tiempo en determinadas condiciones de almacenamiento. Pueden medirse estas caractensticas de una formulacion de adenovirus a temperaturas elevadas (predictivas de temperaturas en tiempo real) o en otras condiciones de estres, por ejemplo pueden someterse formulaciones a incubacion a 25°C o someterse a ciclos de congelacion/descongelacion y agitacion con el fin de estudiar los efectos de diferentes formulaciones que maximizan el termino de caducidad. Dichas caractensticas que determinan la estabilidad pueden determinarse mediante al menos uno de los metodos seleccionados del grupo que consiste en inspeccion visual, reaccion en cadena de la polimerasa cuantitativa de partfculas de virus (vp-QPCR), ensayo de potencia basado en QPCR (QPA), cromatograffa de lfquidos de alta resolucion de fase inversa (RP-HPLC) y sedimentacion centnfuga diferencial (DCS), ensayo de fusion termica (TMA), turbidimetna y fluorescencia intnnseca.

Reaccion en cadena de la polimerasa cuantitativa de particulas de virus (vp-QPCR)

La vp-QPCR se desarrollo para la cuantificacion de particulas de adenovirus usando cebadores que seleccionan como diana una region de 100 pb del promotor de CMV del casete de transgen dentro del vector de adenovirus. Brevemente, este metodo de QPCR se basa en la actividad exonucleasa de Taq polimerasa, que da como resultado la degradacion de una sonda fluorescente espedfica hibridada en la parte central del amplicon de 100 pb. La sonda se une covalentemente a un emisor de luz y un extintor, y su degradacion libera el emisor del extintor con una emision de fluorescencia consiguiente proporcionar a la cantidad de molde. Se obtiene valores cuantitativos a partir del ciclo umbral (Ct), el ciclo en el que el aumento de la senal de fluorescencia supera un valor umbral. El umbral para la deteccion de fluorescencia basada en ADN se fija ligeramente por encima del fondo. El numero de ciclos en el que la fluorescencia supera el umbral se denomina el ciclo umbral (Ct) o, segun las directrices de MIQE, el ciclo de cuantificacion (Cq) (Bustin et al, 2009). Durante la fase de amplificacion exponencial, la secuencia de ADN diana se duplica cada ciclo. Por ejemplo, una muestra de ADN de la que el Ct antecede al de otra muestra en 3 ciclos contema 23 = 8 veces mas molde. Por consiguiente, un mayor valor de Ct representa una menor cantidad de ADN diana y un menor valor de Ct representa una alta disponibilidad de ADN diana. Puede realizarse la cuantificacion absoluta comparando una curva patron generada mediante una dilucion en serie de un adenovirus en disolucion madre del que se ha determinado la concentracion mediante la densidad optica a 260 nm (DO²⁶⁰). Se representan graficamente los valores de Ct del material de prueba frente a los valores de Ct de la curva patron, lo que genera un numero exacto y preciso de particulas de vector.

Cuando se usa como lectura despues de incubacion con celulas competentes E1 (QPA, vease a continuacion), muestras mas degradadas conduciran a mayores valores de delta de Ct (t=0 restado) y formulaciones mas estabilizantes conduciran a menores valores de Ct.

Ensayo de potencia basado en QPCR (QPA)

Para cuantificar la potencia del adenovirus, la QPA combina QPCR con un ensayo de infectividad basado en cultivo tisular. El ensayo se basa en la observacion experimental de que la aparicion de ADN viral recien sintetizado es muy rapida despues de la inoculacion de una monocapa celular, y es proporcional a la concentracion de introduccion de virus a lo largo de un gran intervalo de multiplicidad de infeccion (MOl). Se inoculan diluciones de muestras (no diluidas hasta el punto final) sobre monocapas de celulas HEK293 en una placa de 96 pocillos. Se permite que avance la infeccion durante 3 horas a 35°C. Se aspiran los pocillos y se reponen con medio que no contiene adenovirus. Se incuban las placas durante 42 horas mas antes de la lisis celular por medio de una disolucion de Triton X-100 y una unica etapa de congelacion/descongelacion para liberar el ADN de adenovirus. Se realiza una QPCR con lisados celulares diluidos segun el metodo descrito anteriormente. Se calcula el titulo de infectividad mediante comparacion con una curva patron generada mediante los valores de Ct de una muestra de infectividad conocida, que se determina mediante valoracion hasta el punto final. Alternativamente, puede expresarse la delta de potencia directamente como valores de Ct puesto que el titulo de infectividad, o potencia, se correlaciona directamente con los valores de Ct. Especialmente al comparar diferencias relativas en la potencia entre formulaciones, esto es un metodo rapido y fiable.

Cromatografia de lfquidos de alta resolucion de fase inversa (RP-HPLC)

Para determinar ciertos aspectos de calidad de un adenovirus, pueden analizarse los perfiles de protemas adenovirales mediante cromatograffa de lfquidos de alta resolucion de fase inversa (RP-HPLC). La HPLC separa los componentes de una mezcla usando una variedad de interacciones qmmicas entre la muestra, la fase movil (un tampon o disolvente) y la fase estacionaria (un material de relleno cromatografico en una columna). Una bomba de alta presion mueve la fase movil a traves de la columna y un detector muestra el tiempo de retencion (tR; tiempo entre la inyeccion de muestra y la aparicion del maximo de pico) de las moleculas usando deteccion de absorbancia UV a 280 nm. La separacion de RP-HPLC se basa en diferencias en la hidrofobicidad. La fase estacionaria apolar se compone de cadenas de alquilo hidrofobas (longitudes de cadena: C4, C8 y C18). La fase movil polar es agua con el 0.1% de trifluoroacetico (TFA). Los compuestos que se unen a las columnas se eluyen usando una concentracion creciente de acetonitrilo con el 0.1% de TFA. En general, un analito con una mayor area superficial hidrofoba tiene un mayor tiempo de retencion , mientras que la presencia de grupos polares reduce el tiempo de retencion. Un perfil de RP-HPLc de adenovirus tipico consiste en 10 o 14 protemas, incluyendo protema central (Vll), base de penton (Ill) y hexon (II).

Sedimentacion centrffuga diferencial (DCS)

La DCS es un metodo para medir distribuciones de tamano de particula (agregacion) mediante sedimentacion. En una centrffuga de disco, las particulas sedimentan en un gradiente de sacarosa (de viscosidad y densidad conocidas) bajo altas fuerzas gravitatorias segun la ley de Stokes. La velocidad de sedimentacion aumenta con el cuadrado del diametro de particula, de modo que las particulas que difieren en tamano solo en un pequeno porcentaje sedimentan a velocidades significativamente diferentes. El tiempo necesario para alcanzar el detector se usa para calcular el tamano de las particulas. El intervalo de medicion para este metodo es de aproximadamente 0.02 a 30 micrometros.

Ensayo de fusion termica (TMA)

El ensayo de fusion termica (TMA) puede usarse para determinar la temperatura de fusion (Tf) de adenovirus en formulaciones experimentales, que es la temperatura a la que se desnaturaliza la capside viral. Esta disgregacion viral puede medirse en tiempo real usando un colorante fluorescente de intercalacion de ADNbc. Este colorante fluorescente solo proporciona una senal de fluorescencia cuando se une a ADN, que se libera cuando se disgrega la partrnula viral. El aumento de fluorescencia exponencial con la fusion de la capside puede medirse usando una maquina de QPCR comun durante un aumento gradual de temperature. Se diluyen muestras hasta la misma concentracion (el intervalo es de 4x109 a 1x1012 vp/ml) en las formulaciones espedficas y se mezclan con colorante SYBRGreen (concentracion final 1X) en un volumen de 50 pl. Se aumento la temperatura 0.5°C cada 30 segundos partiendo de 30°C hasta 79°C. A partir de los datos sin procesar de fluorescencia, se calcular las derivadas primera y segunda y se lee la temperatura de fusion en la ordenada en el origen de la segunda derivada con el eje x. Mayores temperaturas de fusion (Tf) pueden ser indicativas de una formulacion mas estabilizante .

Ensayo de turbidez

La turbidimetna mide la perdida de intensidad de luz transmitida debido a la dispersion de partmulas en muestras (absorbancia aparente), detectada a una longitud de onda a la que las moleculas en la muestra no absorben luz (por ejemplo 350 nm para muestras en las que protemas son el principal cromoforo). Cuando se agregan moleculas o forman complejos supramoleculares, la dispersion de luz, que era aleatoria cuando procedfa de las partrnulas individuales, se vuelve ahora coherente, y de ese modo aumenta la intensidad medida. Esto hace que la dispersion de luz y la turbidimetna sean tecnicas utiles para detectar agregacion y formacion o disociacion de complejos.

En el ensayo de turbidez, se transfieren muestras por triplicado a una microplaca de fondo plano, transparente al UV. Se cubre la placa con un sello transparente al UV. Se registran espectros de absorbancia mediante un lector de microplacas a entre 230 y 500 nm, y se mide la absorbancia a 975 nm para determinar y posiblemente corregir diferencias en el camino optico. Se incluyen en el ensayo muestras de control que consisten en las formulaciones sin el adenovirus para corregir la dispersion o absorcion de componentes de la matriz, si se requiere. Se usa la absorbancia aparente a 350 nm como medida cuantitativa para la turbidez.

El ensayo de turbidez es indicativo de estabilidad para muestras de adenovirus. La agregacion de virus conduce a un aumento de la turbidez y la disociacion de la capside a una disminucion. La precision del ensayo es < 5% (% de CV) a valores de turbidez > 1 UNT.

La turbidez obtenida para muestras sometidas a estres siempre debe compararse con las muestras de control. Puesto que un aumento o una disminucion despues de estres aplicado depende de la ruta de degradacion y es espedfico para cada principio activo farmaceutico (API), no puede predecirse. Un cambio (mayor o menor) en comparacion con las muestras de t=0 es indicativo de una formulacion menos estable. Se espera que muestras sometidas a estres comparables a las muestras de t=0 muestras sean mas estables.

Ensayo de fluorescencia intnnseca

Las protemas de la capside adenoviral contienen aminoacidos aromaticos que reemiten luz despues de la excitacion, en particular triptofano y en menor grado tirosina y fenilalanina. El maximo de emision y el rendimiento cuantico del triptofano dependen fuertemente de la polaridad de su entorno. En un entorno acuoso, polar (por ejemplo, la superficie de una protema globular) el rendimiento cuantico es relativamente bajo, mientras que en un entorno apolar (por ejemplo, el interior de un agregado) el rendimiento cuantico aumenta. Esta caractenstica hace que la fluorescencia del triptofano sea una herramienta util para estudiar un cambio conformacional de protemas, agregacion e interacciones moleculares. En el ensayo de fluorescencia intnnseca, se transfieren muestras por triplicado a una microplaca de fondo plano, transparente al UV. Se cubre la placa con un sello transparente al UV. Se mide la fluorescencia del triptofano mediante un lector de microplacas usando un filtro de excitacion con una longitud de onda central de 280 nm y un ancho de banda de 10 nm, y un filtro de emision con una longitud de onda central de 340 nm y un ancho de banda de 10 nm. Se usa optica de fondo para minimizar la influencia del sello y la forma del menisco.

En la tecnica, se sabe que la intensidad de fluorescencia es una medida sensible de la estabilidad de adenovirus. Puede observarse o bien un aumento o bien una disminucion tras estres, dependiendo de la naturaleza de los cambios que se producen en la muestra. Se espera que el desplegamiento de protemas y la disociacion de la capside conduzcan a una disminucion de la fluorescencia intnnseca, y se espera que la agregacion conduzca a un aumento. La precision del ensayo es < 5% (% de CV) en el intervalo usado.

La fluorescencia obtenida para muestras sometidas a estres siempre debe compararse con las muestras de control. Puesto que un aumento o una disminucion despues de estres aplicado depende de la ruta de degradacion y es espedfico para cada principio activo farmaceutico (API), no puede predecirse. Un cambio (mayor o menor) en comparacion con las muestras de t=0 es indicativo de una formulacion menos estable. Las muestras sometidas a estres que permanecen mas proximas a los valores de muestra de t=0 muestra son mas estables.

Un adenovirus “retiene su estabilidad ffsica” en una formulacion farmaceutica, si muestra, entre otras cosas, una perdida minima (es decir 0.3 log/2 anos) en cuanto a cantidad y potencia, y no presenta modificaciones proteicas principales. Adicionalmente, no deben observarse signos de agregacion, precipitacion, cambio de color y/o claridad tras examen visual.

“Aproximadamente” tal como se usa en la presente solicitud significa ±10%, a menos que se establezca de otro modo. La presente invencion se refiere a formulaciones que estabilizan un adenovirus y a productos farmaceuticos relacionados, preferiblemente para su uso en aplicaciones de terapia genica y/o de vacuna. Una formulacion que contiene virus estabilizada preferida dada a conocer en el presente documento es una formulacion lfquida de adenovirus, que muestra estabilidad adenoviral mejorada cuando se almacena en el intervalo de aproximadamente 2-8°C a la vez que tambien es compatible con la administracion parenteral. Sin embargo, estas formulaciones tambien pueden almacenarse a menores temperaturas, por ejemplo de -2o°C o menor, -40°C o menor, -65°C o menor, -80°C o menor. Tambien puede ser mas estables a temperaturas superiores a 8°C, por ejemplo de 25°C o incluso mayor.

Estas formulaciones que pueden estabilizar un adenovirus comprenden un tampon citrato, hidroxipropil-betaciclodextrina (HBCD), una sal y un detergente no ionico, asf como componentes adicionales que potencian la estabilidad con respecto al virus anadido. El pH de dicho tampon se encuentra entre 5.5 y 6.5.

Las formulaciones de la presente invencion proporcionan estabilidad a adenovirus a concentraciones de virus variables, mono- o multivalentes, y pueden administrarse a una variedad de organismos vertebrados, preferiblemente mairnferos y especialmente seres humanos. Las formulaciones virales estabilizadas de la presente invencion son composiciones basadas en adenovirus, que pueden administrarse, por ejemplo, como vacuna que puede ofrecer una ventaja profilactica a individuos previamente no infectados y/o proporcionar un efecto terapeutico.

Un aspecto preferido de la invencion es una formulacion para adenovirus recombinante (es decir, un adenovirus que contiene la totalidad o una parte de un transgen que se expresa dentro del huesped diana de manera posterior a la administracion al huesped, tal como en cualquier metodologfa basada en vacunacion genica o terapia genica para seres humanos/mam^feros disponible para el experto en la tecnica) que muestra caractensticas de estabilidad potenciadas descritas en el presente documento con una concentracion de virus en el intervalo de desde aproximadamente 1x107 vp/ml (partfculas de virus/ml) a aproximadamente 1x1013 vp/ml. Un intervalo mas preferido es de desde aproximadamente 1x109 hasta lxl0l3 vp/ml, prefiriendose especialmente una concentracion de virus que es de desde aproximadamente 1x1010 hasta 5xl0l2 vp/ml. Las composiciones terapeuticas o profilacticas de las formulaciones de la presente invencion pueden administrarse a un individuo en cantidades suficientes para tratar o prevenir el trastorno respectivo. La cantidad eficaz para administracion a seres humanos puede variar, por supuesto, segun una variedad de factores tales como el estado, el peso, el sexo y la edad del individuo. Otros factores incluyen el modo de administracion. En una realizacion preferida, las formulaciones de la presente invencion son adecuadas para uso parenteral.

Las formulaciones de la presente invencion son disoluciones tamponadas con citrato que tienen un pH que oscila entre 5.5 y 6.5, comprenden ademas hidroxipropil-beta-ciclodextrina (HBCD) y que comprenden opcionalmente un alcohol de dos o cuatro carbonos. Inesperadamente, se ha probado que dicha combinacion es una formulacion extraordinaria para la conservacion de la cantidad, potencia (infectividad) y calidad de adenovirus, tal como se demuestra en el presente documento.

En una realizacion preferida, la concentracion de citrato oscila entre aproximadamente 5 mM y 30 mM, por ejemplo entre aproximadamente 5 mM y 25 mM, por ejemplo entre aproximadamente 10 mM y 25 mM, por ejemplo de aproximadamente 20 mM.

Otro componente esencial en estas formulaciones que contribuye a la estabilizacion de virus a lo largo de grandes intervalos de temperatura y durante periodos de almacenamiento prolongados es HBCD, que se usa como crioprotector. En una realizacion preferida, la concentracion de HBCD oscila entre aproximadamente el 1% (p/p) y el 10% (p/p), por ejemplo entre aproximadamente el 3% (p/p) y el 8% (p/p), por ejemplo entre aproximadamente el 4% (p/p) y el 6% (p/p), por ejemplo aproximadamente 5% (p/p).

Un componente adicional de las formulaciones de la presente invencion es sal. La sal potencia la estabilidad viral. Un proposito de la inclusion de una sal en la formulacion es lograr la fuerza ionica u osmolalidad deseadas y optimizar adicionalmente las interacciones electrostaticas. La sal esta presente a una osmolalidad que es fisiologicamente aceptable para el huesped. Las contribuciones a la fuerza ionica pueden proceder de iones producidos por el compuesto tamponante asf como de los iones de las sales no tamponantes. Las sales que son apropiadas para las formulaciones de la presente invencion incluyen pero no se limitan a cloruro de sodio (NaCl), cloruro de calcio (CaCb) o cloruro de manganeso (MnCb). A diferencia de la tecnica anterior, se mostro que el cloruro de magnesio (MgCb) era perjudicial para la estabilidad adenoviral. Por tanto, en una realizacion preferida la formulacion segun la presente invencion esta libre de cloruro de magnesio.

En una realizacion preferida, la formulacion de virus segun la presente invencion comprende cloruro de sodio (NaCl). En una realizacion preferida, la concentracion de cloruro de sodio oscila entre aproximadamente 10 mM y 250 mM, por ejemplo entre approximadamente 20 mM y 200 mM, por ejemplo entre aproximadamente 30 mM y 150 mM, por ejemplo entre aproximadamente 50 mM y 100 mM, por ejemplo de aproximadamente 80 mM.

Las formulaciones de la presente invencion comprenden al menos un detergente no ionico (tambien denominado tensioactivo no ionico) anadido para reducir la adsorcion a las superficies del recipiente asf como para proporcionar posiblemente un aumento de la estabilizacion del virus (por ejemplo reduciendo la agregacion). Los detergentes no ionicos para su uso en las formulaciones de la presente invencion incluyen pero no se limitan a esteres de acidos grados de polioxietileno-sorbitano, incluyendo pero sin limitarse a polisorbato 80 (Tween 80®), polisorbato 60 (Tween 60®), polisorbato 40 (Tween 40®) y polisorbato 20 (Tween 20®), y la serie Pluronic de tensioactivos no ionicos (por ejemplo Pluronic 121).

En una realizacion preferida, la concentracion de detergente no ionico oscila entre aproximadamente el 0.001% (p/p) y el 1% (p/p), por ejemplo entre aproximadamente el 0.005% (p/p) y el 0.5% (p/p), por ejemplo entre aproximadamente el 0.01% (p/p) y el 0.1% (p/p), por ejemplo entre aproximadamente el 0.01% (p/p) y el 0.05% (p/p), por ejemplo ente aproximadamente el 0.015% (p/p) y el 0.03% (p/p), por ejemplo de aproximadamente el 0.025% (p/p).

En una realizacion preferida, la formulacion de virus segun la presente invencion comprende polisorbato 80. La concentracion de polisorbato 80 oscila entre aproximadamente el 0.001% (p/p) y el 1% (p/p), por ejemplo entre aproximadamente el 0.005% (p/p) y el 0.5% (p/p), por ejemplo entre aproximadamente el 0.01% (p/p) y el 0.1% (p/p), por ejemplo entre aproximadamente el 0.01% (p/p) y el 0.05% (p/p), por ejemplo ente aproximadamente el 0.015% (p/p) y el 0.03% (p/p), por ejemplo de aproximadamente el 0.025% (p/p).

En una realizacion preferida, la formulacion de virus segun la presente invencion comprende ademas EDTA. En una mas realizacion preferida, la concentracion de EDTA oscila entre aproximadamente 0.05 mM y 0.2 mM, por ejemplo entre aproximadamente 0.05 mM y 0.15 mM, por ejemplo entre aproximadamente 0.08 mM y 0.12 mM, por ejemplo de aproximadamente 0.1 mM.

En otra realizacion preferida, la formulacion de virus segun la presente invencion comprende ademas etanol. En una realizacion mas preferida, la concentracion de etanol oscila entre aproximadamente el 0.1% (p/p) y el 1% (p/p), por ejemplo entre aproximadamente el 0.2% (p/p) y el 0.8% (p/p), por ejemplo entre aproximadamente el 0.2% (p/p) y el 0.6% (p/p), por ejemplo de aproximadamente el 0.4% (p/p).

En una realizacion preferida, cuando la formulacion de virus segun la presente invencion comprende etanol no debe comprender necesariamente EDTA al mismo tiempo.

En vista de lo comentado anteriormente, la presente invencion se refiere a una formulacion que contiene un adenovirus, tal como un Ad5, Ad26 o Ad35 recombinante, que puede usarse por ejemplo en aplicaciones de terapia genica y/o de vacunacion genica, que muestran propiedades de estabilidad mejoradas en comparacion con la formulacion de mejor rendimiento conocida en la tecnica (dada a conocer en Evans et al. 2004) y que contiene al menos un tampon citrato, HBCD como crioprotector, una sal y un tensioactivo.

Una realizacion particular de la presente invencion se refiere a tal formulacion de adenovirus recombinante que esta tamponada con citrato a un pH que oscila entre 5.5 y 6.5, y comprende ademas hidroxipropil-beta-ciclodextrina (HBCD), una sal, un detergente no ionico y un alcohol de 2 o 4 carbonos.

En una realizacion preferida segun la presente invencion, la formulacion comprende un tampon citrato con un pH que oscila entre aproximadamente pH 5.5 y pH 6.5, comprende HBCD como crioprotector, NaCl como sal, polisorbato 80 como tensioactivo y un alcohol de 2 o 4 carbonos como crioprotector sin precedentes adicional.

En otra realizacion preferida segun la presente invencion, la formulacion comprende un tampon citrato con un pH que oscila entre aproximadamente pH 5.5 y pH 6.5, comprende HBCD como crioprotector, NaCl como sal, polisorbato 80 como tensioactivo y EDTA.

En otra realizacion preferida segun la presente invencion, la formulacion comprende un tampon citrato con un pH que oscila entre aproximadamente pH 5.5 y pH 6.5, comprende HBCD como crioprotector, NaCl como sal, polisorbato 80 como tensioactivo y etanol como crioprotector sin precedentes adicional.

En otra realizacion preferida segun la presente invencion, la formulacion comprende un tampon citrato con un pH que oscila entre aproximadamente pH 5.5 y pH 6.5, comprende HBCD como crioprotector, NaCl como sal, polisorbato 80 como tensioactivo. Esta formulacion comprende ademas etanol y esta libre de EDTA.

tiene un pH que oscila entre aproximadamente 5.9 y 6.2, y comprende citrato a una concentracion que oscila entre aproximadamente 10 y 25 mM; HBCD a una concentracion que oscila entre el 4% (p/p) y el 6% (p/p); NaCl a una concentracion que oscila entre 70 mM y 100 mM; polisorbato 80 a una concentracion que oscila entre aproximadamente el 0.018% (p/p) y el 0.035% (p/p); y etanol a una concentracion que oscila entre aproximadamente el 0.3% (p/p) y el 0.45% (p/p).

En otra realizacion preferida segun la presente invencion, la formulacion tiene un pH que oscila entre aproximadamente 5.8 y 6.2, y comprende citrato a una concentracion que oscila entre aproximadamente 15 y 25 mM; HBCD a una concentracion que oscila entre el 3% (p/p) y el 8% (p/p); NaCl a una concentracion que oscila entre 50 mM y 100 mM; polisorbato 80 a una concentracion que oscila entre aproximadamente el 0.01% (p/p) y el 0.03% (p/p); y EDTA a una concentracion que oscila entre aproximadamente 0.05 mM y 0.15 mM.

En otra realizacion preferida segun la presente invencion, la formulacion tiene un pH que oscila entre aproximadamente 5.9 y 6.2, y comprende citrato a una concentracion que oscila entre aproximadamente 10 y 25 mM; HBCD a una concentracion que oscila entre el 4% (p/p) y el 6% (p/p); NaCl a una concentracion que oscila entre 70 mM y 100 mM; polisorbato 80 a una concentracion que oscila entre aproximadamente el 0.018% (p/p) y el 0.035% (p/p); y EDTA a una concentracion que oscila entre aproximadamente 0.05 mM y 0.15 mM.

En una realizacion incluso mas preferida de la presente invencion la formulacion esta tamponada con citrato aproximadamente 20 mM a un pH de aproximadamente 6; HBCD esta presente a una concentracion de aproximadamente el 5% (p/p); NaCl esta presente a una concentracion de aproximadamente 80 mM; el tensioactivo es polisorbato 80 a una concentracion de aproximadamente el 0.025% (p/p); y EDTA esta presente a una concentracion de aproximadamente 0.1 mM.

En una realizacion incluso mas preferida de la presente invencion, la formulacion esta tamponada con citrato aproximadamente 20 mM a un pH de aproximadamente 6; HBCD esta presente a una concentracion de aproximadamente el 5% (p/p); NaCl esta presente a una concentracion de aproximadamente 80 mM; el tensioactivo es polisorbato 80 a una concentracion de aproximadamente el 0.025% (p/p); y etanol esta presente a una concentracion de aproximadamente el 0.4% (p/p). Adicionalmente, pueden usarse combinaciones de los factores mencionados anteriormente.

En una realizacion, las formulaciones segun la presente invencion estan contenidas en un vial tal como por ejemplo vial de vidrio de borosilicato tipo I DIN 2R. En otra realizacion, las formulaciones estan contenidas en una bolsa. Las bolsas que contienen las formulaciones de la presente invencion pueden comprender capas compuestas, por ejemplo, de copolfmero de etileno-acetato de vinilo (EVA) o alcohol etilvimlico (EVOH). En aun otra realizacion de la presente invencion, las formulaciones estan contenidas en una jeringa.

Las formulaciones de virus recombinante descritas en el presente documento pueden administrarse al huesped vertebrado (preferiblemente un huesped mairnfero y especialmente un receptor humano) mediante cualquier medio conocido en la tecnica. Estas rutas de administracion incluyen pero no se limitan a inyeccion intramuscular, inyeccion intraperitoneal, inyeccion intravenosa, administracion por inhalacion o intranasal, administracion oral, administracion sublingual, administracion subcutanea, administracion transdermica, administracion intradermica, administracion en las glandulas salivares intraductales, administracion transcutanea o administracion percutanea. En una realizacion preferida, la formulacion de la presente invencion es compatible con la administracion parenteral.

Segun las formulaciones dadas a conocer en el presente documento, la presente invencion tambien se refiere a metodos de conservacion de un adenovirus que comprenden preparar formulaciones que contienen virus tal como se da a conocer en el presente documento, dando como resultado tales formulaciones una estabilidad viral mejorada cuando se almacenan por debajo de -65°C y en el intervalo de aproximadamente 2-8°C y posiblemente mayor mientras son tambien compatibles con la administracion parenteral, especialmente la administracion parenteral a seres humanos. Por tanto, otro aspecto de la presente invencion se refiere a metodos de conservacion de un adenovirus que comprenden preparar una formulacion tal como se da a conocer en el presente documento y almacenar dicha formulacion a una temperatura que oscila entre 2°C y 8°C.

Se proporcionan los siguientes ejemplos para ilustrar la presente invencion sin limitarse, sin embargo, la misma a ellos. Ejemplos

Ejemplo 1.

Diseno experimental y metodologfa

Despues de haberse sometido a prueba varias formulaciones diferentes, una formulacion supero a las demas. Esta nueva formulacion se denomino “formulacion B” y comprende el 5% (p/p) de HBCD, citrato 20 mM, el 0.02% (p/p) de PS-80 y NaCl 75 mM a un pH de 6.0.

Dos preparaciones adenovirales (Ad35.TB-S y Ad26.Mos1.Gag-Pol) (una que comprende un adenovirus de serotipo 35 (Ad35) y una que comprende un adenovirus de serotipo 26 (Ad26)) se han sometido a cambio de tampon usando columnas PD-10 (GE Healthcare) en la formulacion B.

Ambas preparaciones adenovirales se han formulado tambien en una “formulacion de control” que se describio en Evans et al. 2004 y que era la mejor formulacion disponible hasta entonces. Dicha “formulacion de control” comprende Tris 10 mM, histidina 10 mM, MgCh 1 mM, NaCl 75 mM, el 5% (p/p) de sacarosa, el 0.02% (p/p) de PS-80, EDTA 0.1 mM, el 0.4% (p/p) de EtOH, a un pH de 7.4.

Se usaron 12 columnas por formulacion; se reunieron los eluatos, se esterilizaron por filtracion y se almacenaron a 2-8°C en una botella de vidrio. Se tomaron muestras para la determinacion del tftulo viral mediante vp-QPCR y se ajustaron todos los tftulos con la formulacion de tampon apropiada a 1.7x1011 vp/ml. Posteriormente, se llenaron con las formulaciones viales de vidrio (0.7 ml por vial), se taponaron y se taparon.

Se almacenaron las muestras de t=0 (control, 6 viales por grupo) directamente a <-65°C. Posteriormente, se incubaron seis viales por grupo (n=6) a 25°C y se congelaron a <-65°C a t=10, 20, 30, 40, 50, 60, 65, 70, 75, 80 y 90 dfas hasta que se realizo el analisis de muestras mediante QPA por triplicado, por muestra.

Ademas, se analizaron muestras de t=0 para detectar vectores en ambas formulaciones mediante TMA (ensayo de fusion termica) para determinar la temperatura de fusion de la capside. Una mayor temperatura de fusion se correlaciona con una mayor estabilidad termica de la capside viral. Tambien se analizaron muestras de punto final (t=90 dfas) mediante cromatograffa de lfquidos de alta resolucion de fase inversa (RP-HPLC) y sedimentacion centnfuga diferencial (DCS) y se compararon con controles de t=0.

Resultados y conclusion

Despues de completarse el estudio, se analizaron todas las muestras mediante QPA y se expreso la perdida de potencia como deltas restando los valores de t=0. La formulacion B, segun la presente invencion (rombos en blanco) supero significativamente (p=1.44E-05) a la formulacion de control (drculos rellenos) conduciendo a menos degradacion a lo largo del tiempo y a un termino de caducidad predicho mas largo (tabla 1) para ambos adenovirus (figuras 1 y 2). Con Statistical Analysis System (software SAS), se ajustaron modelos lineal (Ad26) y cuadratico (Ad35) con los datos de potencia usando el tiempo y el cuadrado del tiempo como efectos fijos. Aunque el efecto de “tiempo” fijo representa la disminucion lineal de la potencia, el efecto de “tiempo*tiempo” fijo representa la curvatura de esta disminucion. Se usaron ambos efectos en el modelo para evaluar su significacion. El criterio de informacion de Akaike (AIC) es una medida para la calidad relativa del modelo estadfstico, que tiene en cuenta la complejidad del modelo y su exactitud de ajuste. Cuanto menor es AIC, mejor se ajusta el modelo. En el modelo lineal, la pendiente representa la tasa de degradacion de la potencia. Comparando las pendientes, puede identificarse el mejor tampon (menor pendiente).

Los terminos de caducidad corresponden a los puntos de tiempo para los que el lfmite inferior de este intervalo pasa bajo una especificacion dada (es decir, disminucion de la potencia). Para el modelo cuadratico, para calcular el termino de caducidad, se tomaron los intervalos de confianza del 95% bilaterales alrededor de la media. Mantener solo el lfmite inferior para la evaluacion del termino de caducidad conduce a un intervalo de confianza del 97.5% para el intervalo de confianza inferior univariante. Se promediaron las ordenadas en el origen (que reflejan la potencia a t=0) y se retiraron de los datos sin procesar y del modelo. Se calcularon los terminos de caducidad para ambas formulaciones.

Tabla 1: Terminos de caducidad a 25°C derivados del analisis estadistico de las curvas de degradacion (figuras 1 y ²).

La RP-HPLC no mostro ningun signo de modificaciones de protema de adenovirus ni oxidacion. La DCS no revelo ningun signo de agregacion. Ademas, la formulacion segun la presente invencion condujo a una temperatura de fusion aumentada significativamente tanto para Ad26 (figura 3) como para Ad35 (figura 4) en comparacion con la formulacion de control, lo que indica la estabilidad aumentada del adenovirus en la formulacion B.

Ejemplo 2

Diseno experimental y metodologfa

Despues de los experimentos descritos en el ejemplo 1, se modifico la formulacion B anadiendo u omitiendo uno o varios componentes (NaCl, etanol, EDTA o combinaciones de los mismos) produciendo 8 formulaciones experimentales (A a H, vease la tabla 2) que se comparacion con la formulacion de control (descrita en Evans et al. y especificada anteriormente en el presente documento). Todas las formulaciones contienen el 5% de HBCD, citrato 20 mM y el 0.02% de PS-80. Tal como se indica en la tabla 2, las formulaciones comprenden ademas NaCl 75 mM, EDTA 0.1 mM y/o el 0.5% de etanol (EtOH). Se incubaron los adenovirus (Ad26) en estas 9 formulaciones durante 69 dfas a 25°C o 16 dfas a 35°C o se expusieron a 30 ciclos de congelacion/descongelacion seguido por agitacion (1 dfa a temperatura ambiente). Se evaluo la perdida de potencia mediante QPA y se expreso como valores de delta (t=0 restado) de Ct (ciclo umbral). Adicionalmente, se leyo la absorbancia a 350 nm como medida para la turbidez y se midio la fluorescencia intrmseca para detectar cambios proteicos conformacionales y agregacion. Finalmente, se realizaron un TMA y vp-QPCR para determinar la temperatura de fusion y la razon vp/UI.

Tabla 2: Composicion de la formulacion. Todas las formulaciones contienen el 5% de HBCD, citrato 20 mM y el 0.02% de PS-80, algunas complementadas con NaCl: 75 mM, EDTA: 0.1 mM y/o etanol (EtOH): 0.5%(p/p).

Resultados y conclusion

Basandose en los resultados de estabilidad a 25°C mostrados en la figura 5, puede concluirse que la adicion de NaCl en combinacion con EDTA (C y D) o etanol (E y F) es claramente beneficioso para la estabilidad viral, en la que el etanol supera claramente al EDTA. Inesperadamente, la combinacion tanto de EDTA como de etanol con o sin NaCl no conduce a una formulacion mas estable (G y H). Esto va en contra de lo que se habna esperado a partir de la tecnica anterior, por ejemplo Altaras et al, 2005, y Evans et al. 2004 en los que la combinacion espedfica de EDTA/EtOH a la que se hace referencia comunmente como un inhibidor de la oxidacion por radicales libres y con el mismo un gran potenciador de la estabilidad adenoviral.

Pasando a un modelo mas riguroso, 35°C durante 16 dfas, el poder de discriminacion se volvio mas pronunciado, tal como puede observarse en la figura 6. Claramente, la adicion de NaCl mejora la estabilidad y el efecto beneficioso del etanol se confirma en la figura 6. Sorprendentemente, la combinacion de EDTA junto con etanol, con o sin NaCl, tiene un claro efecto negativo sobre la estabilidad viral. Esto va en contra de la percepcion comun de que la combinacion de EDTA/EtOH rinde bien como inhibidor de la oxidacion por radicales libres (por ejemplo Altaras et al. 2005, y Evans et al.

2004). Tomados en conjunto, ambos agentes de estres termico muestran el efecto beneficioso de NaCl en combinacion con o bien EDTA o bien etanol en esta formulacion particular.

Para investigar el rendimiento de las formulaciones con una ruta de degradacion diferente, se expusieron dichas formulaciones (A a H) a un ciclo de congelacion/descongelacion y estres de agitacion (figura 7). Los efectos observados son tanto pronunciados como inesperados. Claramente, el EDTA (C y D) no tuvo ningun efecto. Por otro lado, el etanol protegio fuertemente frente al dano por congelacion/descongelacion y, por consiguiente, actuo como crioprotector (E a H).

Se han confirmado estos resultados impredecibles mediante lecturas de absorbancia a 350 nm en un ensayo de turbidimetna (figura 8). La congelacion/descongelacion (cuadrados en blando en la figura 8) condujeron a una disminucion de la turbidez en comparacion con t=0, en las formulaciones sin etanol. Lo mas probable es que esta disminucion se deba a la disgregacion de partfculas virales. En lmea con estas observaciones, la tension por temperatura en condiciones aceleradas (triangulos rellenos en la figura 8) tambien dio como resultado una disminucion de la turbidez en formulaciones libres de etanol, mientras que la formulacion con etanol, espedficamente la formulacion F, no presenta cambios significativos en comparacion con las muestras de t=0 (drculos negros en la figura 8).

Ademas, la fluorescencia intrmseca (Figura 9) confirma ademas las observaciones anteriores. La formulacion sin etanol condujo a una disminucion sustancial de la fluorescencia del triptofano despues del estres de congelacion/descongelacion en comparacion con t=0 (cuadrados en blanco en la figura 9) lo que indica graves cambios conformacionales en la capside viral. En marcado contraste, las formulaciones con etanol protegen al virus frente a este agente de estres. El estres termino solo tuvo un impacto menor sobre las formulaciones que contienen etanol.

Los datos de TMA revelaron una temperatura de fusion aumentada significativamente de la formulacion F en comparacion con la formulacion de control (figura 10), lo que es indicativo de una capside viral mas estable en la formulacion F.

De manera importante, la razon vp/UI, que refleja la proporcion infecciosa de la preparacion viral (indicativa de la calidad de las partfculas de virus), revelo mayores valores (menos partfculas infecciosas por cantidad total de partfculas) en la formulacion de control en comparacion con la formulacion F despues de la exposicion a condiciones de temperatura aceleradas (25°C), vease la tabla 3. Esto muestra que la formulacion F puede conservar la infectividad de adenovirus en una medida mucho mayor en comparacion con la formulacion de control.

Tabla 3: razones vp/UI para la formulacion F y la formulacion de control de t=0 y t=61 a 25°C

Ejemplo 3.

Diseno experimental y metodologfa

Para definir el espacio de diseno de tampon de formulacion, se evaluo el intervalo de robustez para cada excipiente. Despues de haberse seleccionado los factores, se definio un intervalo experimental para cada componente tal como se notifica en la tabla 4.

Se siguio el enfoque de diseno de experimento (DOE) para mapear el espacio experimental. Usando un diseno con un nivel bajo y uno alto para cada uno de seis factores (tabla 4), se prepararon 15 formulaciones (incluyendo 3 puntos centrales) para estudiar el efecto de cada factor y posibles interacciones entre los factores (tabla 5) con alto poder estadfstico.

Tabla 4: Factores y niveles usados para recopilar el espacio experimental para el estudio

Tabla 5: Diseno del experimento. Se prepararon independientemente quince formulaciones, incluyendo tres puntos centrales (filas en gris), tras los factores y niveles usados para recopilar el espacio experimental para el estudio.

Para evaluar los niveles apropiados para cada excipiente y pH (la robustez de la formulacion), se lleno cada grupo en viales de vidrio y se sometieron a 10 ciclos de congelacion/descongelacion (F/T), seguido por 1 d^ a agitacion a 200 rpm a temperature ambiente (RT) y almacenamiento durante 7 d^as a 35°C (modelo de degradacion en condiciones aceleradas). Se uso entonces la potencia mediante QPA (n=3) como lectura.

Se sometio a cambio de tampon una preparacion de Ad26 usando columnas PD-10 (GE Healthcare) en cada una de las formulaciones enumeradas en la tabla 5. Se reunieron los eluatos de cada formulacion, se esterilizaron por filtracion y se almacenaron a 2-8°C en una botella de vidrio. Se tomaron muestras para la determinacion del tftulo viral mediante vp-QPCR y se ajustaron todos los tttulos con la formulacion apropiada a 1x1011 vp/ml. Posteriormente, se llenaron con las formulaciones viales de vidrio (0.75 ml por vial), se taponaron y se taparon. Se almacenaron las muestras de t=0 (control, 6 viales por grupo) directamente a <-65°C. Posteriormente, se incubaron cuatro viales por grupo (n=4) con congelacion/descongelacion y se almacenaron 35°C durante 7 dfas (tabla 6) hasta que se realizo el analisis de muestras mediante QPA por triplicado, por muestra.

Resultados y conclusion

Despues de completarse el estudio, se analizaron todas las muestras mediante QPA y se expreso la perdida de potencia se expreso como deltas restando los valores de t=0. Se usaron estos datos para el analisis estadfstico.

El resultado del analisis estadfstico fue la probabilidad de exito, en el que el exito se define como una formulacion estable, que satisface las especificaciones fijadas para el atributo de calidad critico seleccionado (CQA): la potencia. Se llevaron a cabo pruebas de equivalencia entre ^t0 y despues del estres: para comparar la equivalencia, se definieron criterios de aceptacion sobre la maxima perdida de potencia (Ul/ml) que puede tolerarse: en este experimento se definio la perdida de potencia tolerada como ALfmite de potencia > -0.30 log Ul/ml.

Los datos experimentales obtenidos se muestran en la tabla 6 y se usaron para reducir el dominio experimental y calcular un espacio de diseno, basandose en la potencia.

Los datos contienen 45 observaciones. Hay 12 tampones diferentes que se han sometido a prueba en triplicados y uno adicional que se ha preparado tres veces por separado y se ha sometido a prueba cada preparacion independiente por triplicado (puntos centrales).

Tabla 6: Valores experimentales para cada formulacion expresados como APotencia (log_IU/ml)

Se ha ajustado el siguiente modelo a los datos: delta_log_potency[i] ~ normal(mu[i], sigma);

for(i in 1:Nobs){

mu[i] <- alpha_0

alpha_pH * pH[i]

alpha_Citrate * Citrate[i]

alpha_HBCD * HBCD[i]

alpha_EtOH * EtOH[i]

alpha_PS_80 * PS_80[i]

alpha_NaCl * NaCl[i]

alpha_HBCD2 * HBCD[i] * HBCD[i]

alpha_PS_802 * PS_80[i] * PS_80[i]

alpha_pH_HBCD * pH[i] * HBCD[i]

alpha_pH_NaCl * pH[i] * NaCl[i]

alpha_r_Batch[batch[i]];

donde alpha-r-batch representa el lote aleatorio y sigma el error residual.

Para obtener predicciones a partir del modelo para obtener un enfoque de espacio de diseno basado en riesgos, se ha adoptado el marco bayesiano porque puede derivarse facilmente la distribucion conjunta predictiva del CQA dados los parametros de formulacion (veanse Peterson et al. y Lebrun et al.). El espacio de diseno basado en riesgos se define usando la siguiente declaracion de probabilidad:

En otras palabras, el espacio de diseno es una region del dominio experimental % (a menudo denominado espacio de conocimiento) donde la probabilidad posterior de que los CQA esten dentro de las especificaciones (A), es mayor que un nivel de calidad especificado n, dados los datos observados. Esta notacion lleva implfcita la inclusion de la incertidumbre incluida en el modelo estadfstico. La probabilidad es una medida directa de las garantias para satisfacer conjuntamente las especificaciones. Para calcular esta probabilidad, los modelos estadfsticos pueden escribirse como la siguiente ecuacion lineal generica. Para el CQA de orden j, se ajusta un modelo:

donde yi es cualquier transformacion aplicada al CQA de orden i para obtener buenas propiedades estadisticas (por ejemplo, identidad, transformaciones log o logit), i = 1....,7. Los parametros del modelo bi y o f han de estimarse (veanse los articulos anteriores).

Se calcula la probabilidad posterior de la ecuacion (1) a partir de la distribucion predictiva de nuevas respuestas, identificadas como la siguiente distribucion de Student (se retiran los indices i para mayor simplicidad):

Esta distribucion de Student de tres parametros tiene a — p grados de libertad (para n observaciones y p parametros

del modelo), esta centrada en la recta de regresion media itp, calculada a partir de la estimacion de minimos cuadrados

habitual de

donde el parametro a es la suma residual de cuadrados, es decir,

Por tanto, S define la escala de la distribucion de Student Se calcular el estimador de

varianza como

Para explorar el dominio experimental, no se recomienda crear una red con 5 factores (debido a un problema de dimensionalidad: si se evaluasen 2 niveles por factor, dana como resultado una red de tamano 25; si se evaluasen 10 niveles por factor, conducina a una red de tamano 105, etc.). En su lugar, se crearon varias muestras aleatorias y se exploraron de la siguiente manera:

a) Se eligieron condiciones operativas (ajustes de factor) (distribuidas uniformemente a lo largo de y) x L de alto numero dentro del dominio experimental

b) Para cada condicion operativa: llevar a cabo un alto numero de simulaciones:

Extraer n “ muestras y jj | Xj , d a tos (1 = 1, n * ) de las distribuciones predictivas como en la ecuacion (3), para cada CQA

c) A partir de las diferentes simulaciones de prediccion de CQA, calcular la proporcion de muestras dentro de las especificaciones

Esta proporcion es la estimacion de probabilidad posterior para obtener resultados de calidad dados los atributos de calidad cnticos y sus especificaciones. Finalmente, se propone evaluar visualmente la distribucion operativa aleatoria con representaciones graficas por parejas de la proyeccion de los resultados en espacios bidimensionales, para identificar un espacio de diseno (figura 11).

Entonces se adaptaron los calculos y se redujeron los intervalos de factor para maximizar la probabilidad de exito para la potencia de c Qa en estos intervalos (tabla 7), que reflejan los denominados intervalos operativos normales (NOR) y el espacio de diseno. Los intervalos mostrados en la tabla 7 garantizan la mayor probabilidad de exito para tener una formulacion estable. Estos intervalos garantizan por tanto una estabilidad de producto optima.

Tabla 7: Espacio de diseno con intervalos de factor (NOR) seleccionados

Bibliografia

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Formulacion Ifquida para adenovirus, que comprende:

a) un adenovirus recombinante;

b) un tampon citrato;

c) hidroxipropil-beta-ciclodextrina (HBCD);

d) una sal;

e) un detergente no ionico;

en la que dicha formulacion tiene un pH que oscila entre 5.5 y 6.5.

2. Formulacion segun la reivindicacion 1, en la que la concentracion de citrato oscila entre 5 mM y 30 mM.

3. Formulacion segun la reivindicacion 1 o 2, en la que la concentracion de HBCD oscila entre el 1% (p/p) y el 10% (p/p).

4. Formulacion segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que la sal es cloruro de sodio.

5. Formulacion segun la reivindicacion 4, en la que la concentracion de cloruro de sodio oscila entre 20 mM y aproximadamente 200 mM.

6. Formulacion segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en la que el detergente no ionico es polisorbato 80.

7. Formulacion segun la reivindicacion 6, en la que la concentracion de polisorbato 80 oscila entre el 0.005% (p/p) y el 0.5% (p/p).

8. Formulacion segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en la que dicha formulacion tiene un pH que oscila entre 5.7 y 6.3, y comprende citrato a una concentracion que oscila entre 5 y 30 mM; HBCD a una concentracion que oscila entre el 1% (p/p) y el 10% (p/p); NaCl a una concentracion que oscila entre 20 mM y 200 mM; polisorbato 80 a una concentracion que oscila entre el 0.01% (p/p) y el 0.05% (p/p).

9. Formulacion segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en la que dicha formulacion comprende ademas un alcohol de 2 o 4 carbonos.

10. Formulacion segun la reivindicacion 9, en la que el alcohol de 2 o 4 carbonos es etanol.

11. Formulacion segun la reivindicacion 10, en la que la concentracion de etanol oscila entre el 0.1% (p/p) y el 1% (p/p).

12. Formulacion segun una cualquiera de las reivindicaciones 9-11, en la que dicha formulacion tiene un pH que oscila entre 5.7 y 6.3, y comprende citrato a una concentracion que oscila entre 5 y 30 mM; HBCD a una concentracion que oscila entre el 1% (p/p) y el 10% (p/p); NaCl a una concentracion que oscila entre 20 mM y 200 mM; polisorbato 80 a una concentracion que oscila entre el 0.01% (p/p) y el 0.05% (p/p) y etanol a una concentracion que oscila entre el 0.2% (p/p) y el 0.6% (p/p).

13. Formulacion segun la reivindicacion 12, en la que dicha formulacion tiene un pH que oscila de 6, y comprende citrato a una concentracion de 20 mM; HBCD a una concentracion del 5% (p/p); NaCl a una concentracion de 80 mM; polisorbato 80 a una concentracion que oscila del 0.025% (p/p) y etanol a una concentracion del 0.4% (p/p).

14. Formulacion segun una cualquiera de las reivindicaciones 10-12, en la que dicha formulacion tiene un pH que oscila entre 5.9 y 6.2, y comprende citrato a una concentracion que oscila entre 10 y 25 mM; HBCD a una concentracion que oscila entre el 4% (p/p) y el 6% (p/p); NaCl a una concentracion que oscila entre 70 mM y 100 mM; polisorbato 80 a una concentracion que oscila entre el 0.018% (p/p) y el 0.035% (p/p) y etanol a una concentracion que oscila entre el 0.3% (p/p) y el 0.45% (p/p).

15. Formulacion segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en la que dicha formulacion es adecuada para uso parenteral.

16. Metodo de conservacion de un adenovirus que comprende preparar una formulacion segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-15.

17. Metodo de conservacion de un adenovirus que comprende preparar una formulacion segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-15 y almacenar dicha formulacion a una temperatura que oscila entre 2°C y 8°C.