ES2704878T3 - Composición para estimulación ovárica controlada - Google Patents
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Abstract
Un producto que comprende hormona estimulante del folículo (FSH) recombinante derivada de línea celular humana para su uso en el tratamiento de la esterilidad en una paciente que tiene un nivel de AMH en suero de >= 15 pmol/l, en el que el producto va a administrarse con una dosis diaria de 0,09 a 0,19 μg de FSH recombinante derivada de línea celular humana por kilogramo de peso corporal de la paciente; en el que el tratamiento de la esterilidad comprende una etapa de determinación del nivel de AMH en suero de la paciente, y una etapa de administración de la dosis a una paciente que tiene el nivel de AMH en suero definido.
Description
DESCRIPCIÓN
Composición para estimulación ovárica controlada
La presente invención se refiere a composiciones y a productos farmacéuticos para el tratamiento de la esterilidad.
Se conocen ampliamente técnicas de tecnología de reproducción asistida (ART, por sus siglas en inglés) tales como la fecundación in vitro (IVF, por sus siglas en inglés). Estas técnicas de ART requieren generalmente una etapa de estimulación ovárica controlada (COS, por sus siglas en inglés), en la que se estimula una cohorte de folículos hasta su completa madurez. Los regímenes de COS convencionales incluyen la administración de gonadotropinas, tales como la hormona estimulante del folículo (FSH, por sus siglas en inglés) sola o en combinación con actividad de la hormona luteinizante (LH, por sus siglas en inglés) para estimular el desarrollo folicular, normalmente con la administración de un análogo de GnRH antes de y/o durante la estimulación para prevenir un aumento de LH prematuro. Las composiciones farmacéuticas generalmente usadas para la COS incluyen la hormona estimulante del folículo recombinante (rFSH, por sus siglas en inglés), FSH derivada de orina, preparaciones de LH FSH recombinante, menotropina derivada de orina [gonadotropina menopáusica humana (hMG, por sus siglas en inglés)] y gonadotropina menopáusica humana altamente purificada (HP-hMG, por sus siglas en inglés). La IVF puede asociarse a un riesgo de desarrollar el síndrome de hiperestimulación ovárica (OHSS, por sus siglas en inglés), que puede ser potencialmente mortal en casos graves.
La capacidad para predecir el potencial de respuesta de las mujeres a la estimulación ovárica controlada (COS) puede permitir el desarrollo de protocolos de COS individualizados. Esto podría, por ejemplo, reducir el riesgo de desarrollar OHSS en mujeres a las que se predijo que tendrían una respuesta excesiva a la estimulación, y/o mejorar los desenlaces de embarazo en mujeres que se clasificaron como de escaso potencial de respuesta. La concentración en suero de la hormona antimülleriana (AMH, por sus siglas en inglés) se establece ahora como marcador fiable de la reserva ovárica. Los niveles decrecientes de AMH se correlacionan con una respuesta ovárica reducida a gonadotropinas durante COS. Además, altos niveles de AMH son un buen factor pronóstico de una respuesta ovárica excesiva, y un indicador de riesgo de desarrollar OHSS.
En un estudio preliminar de mujeres con menos de 35 años de edad que se sometían a ART, se usó el algoritmo de dosificación CONSORT (que incorpora FSH basal, IMC, edad y AFC) para predecir la dosis inicial óptima de FSH para COS en mujeres que corren el riesgo de desarrollar OHSS (Olivennes et al., 2009). La individualización de la dosis condujo a un rendimiento de ovocitos adecuado y una buena tasa de embarazos. Sin embargo, hubo altas tasas de cancelaciones en el grupo de dosis baja (75 UI de FSH) debido a una respuesta inadecuada, y se produjo OHSS en una proporción significativa de las pacientes.
Por tanto, existe la necesidad de una composición para su uso en protocolos de COS individualizados que proporcione una respuesta adecuada a la estimulación, y/o una disminución del riesgo de desarrollar OHSS.
Tal como se indicó anteriormente, los protocolos de COS convencionales pueden incluir la administración de FSH. La FSH se secreta de manera natural por la hipófisis anterior y funciona soportando el desarrollo folicular y la ovulación. La FSH comprende una subunidad alfa de 92 aminoácidos, también común para las demás hormonas de glicoproteína LH y CG, y una subunidad beta de 111 aminoácidos única para la FSH que confiere la especificidad biológica de la hormona (Pierce y Parsons, 1981). Cada subunidad se modifica de manera postraduccional mediante la adición de restos de carbohidratos complejos. Ambas subunidades portan 2 sitios para la unión a glicano unido a N, la subunidad alfa en los aminoácidos 52 y 78 y la subunidad beta en los restos de aminoácido 7 y 24 (Rathnam y Saxena, 1975, Saxena y Rathnam, 1976). Por tanto, la FSH se glicosila hasta aproximadamente el 30 % en masa (Dias y Van Roey.
2001. Fox et al. 2001).
Se ha usado FSH purificada a partir de orina humana posmenopáusica durante muchos años en el tratamiento de la esterilidad; tanto para fomentar la ovulación en la reproducción natural como para proporcionar ovocitos para tecnologías de reproducción asistida. Los productos de FSH recombinante (rFSH) aprobados actualmente para estimulación ovárica, tales como folitropina alfa (GONAL-F, Merck Serono / EMD Serono) y folitropina beta (PUREGON / FOLLISTIM, MSD / Schering-Plough), derivan de una línea celular de ovario de hámster chino (CHO). Actualmente, no está disponible en el mercado ningún producto de rFSH procedente de una línea celular humana.
Existe una heterogeneidad considerable asociada a las preparaciones FSH que se refiere a diferencias en las cantidades de las diversas isoformas presentes. Las isoformas de FSH individuales presentan secuencias de aminoácidos idénticas pero difieren en el grado en que se modifican de manera postraduccional; las isoformas particulares se caracterizan por heterogeneidad de las estructuras de ramificación de hidrato de carbono y las distintas cantidades de incorporación de ácido siálico (un azúcar terminal), que parecen influir ambas en la actividad biológica de la isoforma específica.
La glicosilación de FSH natural es sumamente compleja. Los glicanos en FSH hipofisaria derivada de manera natural pueden contener una amplia diversidad de estructuras que pueden incluir combinaciones de glicanos mono-, bi-, tri- y tetra-antenarios (Pierce y Parsons, 1981. Ryan et al., 1987. Baenziger y Green, 1988). Los glicanos pueden llevar
modificaciones adicionales: fucosilación central, glucosamina bisectriz, cadenas extendidas con acetil-lactosamina, sialilación parcial o completa, sialilación con enlaces a2,3 y a2,6, y galactosamina sulfatada sustituida por galactosa (Dalpathado et al., 2006). Además, existen diferencias entre las distribuciones de estructuras de glicano en los sitios de glicosilación individuales. Se ha encontrado un nivel comparable de complejidad de glicanos en FSH derivada del suero de individuos y de la orina de las mujeres posmenopáusicas (Wide et al., 2007).
La glicosilación de productos de FSH recombinante refleja la gama de glicosil-transferasas presentes en la línea celular del hospedador. Los productos de rFSH disponibles comercialmente derivan de células de ovario de hámster chino (células CHO) modificadas por ingeniería genética. La variedad de modificaciones de glicano en rFSH derivada de células CHO son más limitadas que las encontradas en los productos naturales. Los ejemplos de la heterogeneidad de glicano reducida en rFSH derivada de células CHO incluyen una ausencia de glucosamina bisectriz y un contenido reducido de fucosilación central y extensiones de acetil-lactosamina (Hard et al., 1990). Además, las células CHO solo pueden añadir ácido siálico usando el enlace a2,3 (Kagawa et al, 1988, Takeuchi et al, 1988, Svensson et al., 1990); la rFSH derivada de células CHO solo incluye ácido siálico con enlaces a2,3 y no incluye ácido siálico con enlaces a2,6.
Por tanto, FSH derivada de células CHO es diferente de la FSH producida de manera natural (por ejemplo, FSH hipofisaria / de suero / de orina humana) que contiene glicanos con una mezcla de ácido siálico con enlaces a2,3 y a2,6, con una predominancia del primero.
Además, se ha demostrado que la preparación de FSH recombinante disponible en el mercado difiere en las cantidades de FSH con un punto isoeléctrico (pl) inferior a 4 (consideradas las isoformas ácidas) en comparación con FSH hipofisaria, de suero o de orina posmenopáusica (Ulloa-Aguirre et al. 1995). La cantidad de isoformas ácidas en las preparaciones de orina fue mucho mayor en comparación con los productos recombinantes derivados de células CHO, Gonal-f (Merck Serono) y Puregon (Schering Plough) (Andersen et al. 2004). Esto debe reflejar un menor contenido molar de ácido siálico en la FSH recombinante puesto que el contenido de glicano cargado negativamente modificado con sulfato es bajo en FSH recombinante. El menor contenido de ácido siálico, en comparación con FSH natural, es una característica de ambos productos de FSH recombinante disponibles comercialmente y puede reflejar una limitación en el proceso de fabricación.
Se ha documentado la semivida circulatoria de FSH para materiales procedentes de una diversidad de fuentes. Algunos de estos materiales se han fraccionado basándose en la carga molecular global, tal como se caracteriza por su pl, en el que más ácido es igual a una mayor carga negativa. Tal como se estableció previamente, el principal factor contribuyente a la carga molecular global es el contenido de ácido siálico total de cada molécula de FSH. Por ejemplo, rFSH (Organon) tiene un contenido de ácido siálico de aproximadamente 8 mol/mol, mientras que la FSH derivada de orina tiene un mayor contenido de ácido siálico (de Leeuw et al. 1996). Las tasas de aclaramiento plasmático correspondientes en la rata son de 0,34 y 0,14 ml/min (Ulloa-Aguirre et al. 2003). En otro ejemplo en el que se dividió una muestra de FSH recombinante en fracciones de alto y bajo pl, disminuyó la potencia in vivo de la fracción de alto pl (menor contenido de ácido siálico) y tuvo una semivida plasmática más corta (D'Antonio et al. 1999). También se ha notificado que la FSH más básica circulante durante las etapas posteriores del ciclo de ovulación se debe a la regulación por disminución de a2,3 sialil-transferasa en la hipófisis anterior que está provocada por niveles crecientes de estradiol (Damian-Matsumara et al. 1999. Ulloa-Aguirre et al. 2001). No se han notificado resultados para la a2,6 sialil-transferasa.
Por tanto, tal como se expuso anteriormente, las proteínas recombinantes expresadas usando el sistema CHO diferirán de sus homólogos naturales en su tipo de enlaces de ácido siálico terminales. Esto es una consideración importante en la producción de productos biológicos para uso farmacéutico puesto que los restos de hidrato de carbono pueden contribuir a los atributos farmacológicos de la molécula. Los presentes solicitantes han desarrollado una FSH recombinante derivada de ser humano que es el objeto de la solicitud de patente internacional n.° PCT/GB2009/000978, publicada como documento WO2009/127826A. Se preparó FSH recombinante con una mezcla de ácido siálico con enlaces tanto a2,3 como a2,6 mediante modificación por ingeniería genética de una línea celular humana para expresar tanto rFSH como a2,3-sialiltransferasa. El producto expresado es altamente ácido y porta una mezcla de ácidos siálicos con enlaces tanto a2,3 como a2,6; este último proporcionado mediante la actividad sialil transferasa endógena. Se encontró que el tipo de enlace del ácido siálico, a2,3- o a2,6-, puede tener una influencia drástica sobre el aclaramiento biológico de FSH. La FSH recombinante con una mezcla de ácido siálico con enlaces tanto a2,3 como a2,6 tiene dos ventajas con respecto a rFSH expresada en células CHO convencionales: en primer lugar, el material está más altamente sialilado debido a las actividades combinadas de las dos sialiltransferasas; y en segundo lugar, el material se asemeja más estrechamente a la FSH natural. Probablemente, esto es más apropiado a nivel biológico en comparación con productos recombinantes derivados de células CHO que han producido solo ácido siálico con enlaces a2,3 (Kagawa et al, 1988, Takeuchi et al, 1988, Svensson et al., 1990) y tienen un contenido de ácido siálico disminuido (Ulloa-Aguirre et al. 1995., Andersen et al. 2004).
El producto de rFSH desvelado en la solicitud de patente internacional n.° PCT/GB2009/000978 contiene restos de glicano ramificado. La FSH comprende glicanos (unidos a las glicoproteínas de FSH) y estos glicanos pueden contener una amplia diversidad de estructuras. Tal como se conoce bien en la técnica, la ramificación (de un glicano) puede producirse con el resultado de que el glicano puede tener 1, 2, 3, 4 o más restos de azúcar terminales o “antenas”; los
glicanos con 1, 2, 3 o 4 residuos de azúcar terminales o “antenas” se denominan respectivamente estructuras monoantenarias, di-antenarias, tri-antenarias o tetra-antenarias. Los glicanos pueden tener la presencia de sialilación en estructuras mono-antenarias y/o di-antenarias y/o tri-antenarias y/o tetra-antenarias. Una rFSH a modo de ejemplo dada a conocer en la solicitud de patente internacional n.° PCT/GB2009/000978 incluía estructuras de glicano monosialiladas, di-sialiladas, tri-sialiladas y tetra-sialiladas con las siguientes cantidades relativas: el 9-15 % de monosialiladas; el 27 - 30 % de di-sialiladas; el 30 - 36 % de tri-sialiladas y el 25 - 29 % de tetrasialiladas. Como es bien sabido, una estructura de glicano mono-sialilada porta un residuo de ácido siálico; una estructura de glicano di-sialilada porta dos residuos de ácido siálico; una estructura de glicano tri-sialilada porta tres residuos de ácido siálico; y una estructura de glicano tetra-sialilada porta cuatro residuos de ácido siálico. En el presente documento, terminología tal como “X % de mono-sialiladas”, “X % de di-sialiladas”, “X % de tri-sialiladas” o “X % de tetra-sialiladas” se refiere al número de estructuras de glicano en FSH que están mono-, di, tri o tetra-sialiladas (respectivamente), expresadas como porcentaje (X %) del número total de estructuras de glicano en la FSH que están sialiladas de algún modo (portan ácido siálico). Por tanto, la expresión “el 30 - 36 % de estructuras de glicano tri-sialiladas” significa que, del número total de estructuras de glicano en la FSH que portan residuos de ácido siálico (es decir, están sialiladas), del 30 al 36 % de estas estructuras de glicano están tri-sialiladas (portan tres residuos de ácido siálico). Los solicitantes han descubierto sorprendentemente que la FSH que tiene una cantidad específica de estructuras de glicano tetrasialiladas (que es diferente a la del producto de rFSH a modo de ejemplo dado a conocer en el documento PCT/GB2009/000978 mencionado anteriormente) es notablemente más potente que productos de FSH recombinante que están actualmente en el mercado. La secuencia de aminoácidos de los productos del solicitante es la secuencia nativa y es idéntica a FSH humana natural y productos de rFSH derivados de células CHO existentes. Sin embargo, los presentes solicitantes han encontrado que productos de FSH recombinante derivada de ser humano (es decir, FSH recombinante producida o expresada en una línea celular humana por ejemplo preparada mediante modificación por ingeniería genética de una línea celular humana) que tienen una mezcla de ácido siálico con enlaces tanto a2,3 como a2,6 y/o una cantidad específica de estructuras de glicano tetra-sialiladas pueden ser particularmente eficaces cuando se usan en protocolos de COS (por ejemplo, individualizados).
Los solicitantes han descubierto que generalmente es necesario recuperar aproximadamente nueve ovocitos para permitir la selección de dos ovocitos de alta calidad para la transferencia.
Los solicitantes han descubierto que para sujetos que tienen bajo nivel de AMH (AMH < 15 pmol/l por litro) se requiere una dosis razonablemente alta de FSH recombinante (por ejemplo, de 12 |ig) para lograr esto. A esta dosis, se recuperarán de 8 a 14 ovocitos del 60 % de los sujetos con bajo nivel de AMH. Esto es una mejora inesperada y significativa con respecto al tratamiento de sujetos con bajo nivel de AMH tratados con 150 UI de Gonal-f, en el que se recuperan de 8 a 14 ovocitos solo del 33 % de los sujetos. Los solicitantes han descubierto que no hay necesidad de ajustar esta dosis según el peso corporal de la paciente.
Sin embargo, el 60 % de la población (y el 80 % de las mujeres con menos de 30 años tratadas para esterilidad) tienen un alto nivel de AMH (es decir, AMH de > 15 pmol/l). Para estos sujetos, generalmente resulta bastante sencillo recuperar una media de 9 a 11 ovocitos; el problema con los protocolos de estimulación es el riesgo de desarrollar OHSS. Los solicitantes han descubierto que en pacientes a las que se les dosificó dosis bajas de FSH recombinante humana existe una relación entre ovocitos recuperados y peso corporal del sujeto. Esto significa que puede haber un riesgo asociado con el tratamiento con una dosis fija de FSH (lo que es habitual en la técnica). Los presentes solicitantes han establecido una relación entre dosis de FSH y nivel de AMH y peso del sujeto que proporciona un perfil de seguridad mejorado (riesgo reducido de desarrollar OHSS) con una recuperación de ovocitos aceptable o mejorada en comparación con los protocolos de tratamiento conocidos (véase el ejemplo 10).
Según la invención, en un aspecto adicional, se proporciona un producto (por ejemplo, una composición farmacéutica) que comprende hormona estimulante del folículo (FSH) recombinante derivada de una línea celular humana para su uso en el tratamiento de la esterilidad en una paciente que tiene un nivel de AMH en suero de > 15 pmol/l, en el que el producto va a administrarse a una dosis diaria de 0,09 a 0,19 |ig (por ejemplo de 0,09 a 0,19 |ig) de FSH recombinante derivada de línea celular humana por kilogramo de peso corporal de la paciente; en el que el tratamiento de la esterilidad comprende una etapa de determinación del nivel de AMH en suero de la paciente, y una etapa de administración de la dosis a una paciente que tiene el nivel de AMH en suero definido.
En una realización, el producto es para su uso en el tratamiento de esterilidad en una paciente que tiene un nivel de AMH en suero de 15 a 24,9 pmol/l, y el producto va a administrarse a una dosis diaria de 0,14 a 0,19 |ig de FSH recombinante derivada de ser humano (preferentemente de 0,15 a 0,16 |ig de FSH recombinante derivada de ser humano) por kg de peso corporal de la paciente. En esta realización, el tratamiento de la esterilidad comprende una etapa de determinación (por ejemplo, medición) del nivel de AMH en suero de la paciente, y administración de la dosis a una paciente que tiene un nivel de AMH en suero de 15 a 24,9 pmol/l. En otra realización, el producto es para su uso en el tratamiento de esterilidad en una paciente que tiene un nivel de AMH en suero de 25 a 34,9 pmol/l, y el producto va a administrarse a una dosis diaria de 0,11 a 0,14 |ig de FSH recombinante derivada de ser humano (preferentemente de 0,12 a 0,13 |ig de FSH recombinante derivada de ser humano) por kg de peso corporal de la paciente. En esta realización, el tratamiento de la esterilidad comprende una etapa de determinación (por ejemplo, medición) del nivel de AMH en suero de la paciente, y administración de la dosis a una paciente que tiene un nivel de
AMH en suero de 25 a 34,9 pmol/l. En una realización aún adicional, el producto es para su uso en el tratamiento de esterilidad en una paciente que tiene un nivel de AMH en suero de > 35 pmol/l, y el producto va a administrarse a una dosis diaria de 0,10 a 0,11 |ig de FSH recombinante derivada de ser humano por kg de peso corporal de la paciente. En esta realización, el tratamiento de la esterilidad comprende una etapa de determinación (por ejemplo, medición) del nivel de AMH en suero de la paciente, y administración de la dosis a una paciente que tiene un nivel de AMH en suero de > 35 pmol/l. Las dosis proporcionan una respuesta eficaz a la vez que se minimiza el riesgo de desarrollar OHSS.
Las dosis anteriores pueden ser para el tratamiento de la esterilidad en el primer protocolo de estimulación de la paciente (del sujeto). Se apreciará que para ciclos de estimulación adicionales, las dosis pueden ajustarse según la respuesta ovárica real en el primer ciclo.
Preferentemente, la rFSH (por ejemplo, FSH recombinante derivada de línea celular humana) incluye a2,3- y a2,6-sialilación. La FSH (rFSH) para su uso según la invención puede tener del 1 % al 99 % de la sialilación total que es a2,3-sialilación. La FSH (rFSH) según la invención puede tener del 1 % al 99 % de la sialilación total que es a2,6-sialilación. Preferentemente, del 50 al 70 %, por ejemplo del 60 al 69 %, por ejemplo aproximadamente el 65 %, de la sialilación total es a2,3-sialilación. Preferentemente, del 25 al 50 %, por ejemplo del 30 al 50 %, por ejemplo del 31 al 38 %, por ejemplo aproximadamente el 35 %, de la sialilación total es a2,6-sialilación.
Preferentemente, la rFSH (por ejemplo, FSH recombinante derivada de línea celular humana) incluye estructuras de glicano mono-, di-, tri- y tetra-sialiladas, en las que el 15-24 %, por ejemplo el 17-23 % de las estructuras de glicano sialiladas son estructuras de glicano tetrasialiladas (por ejemplo, tal como se muestra mediante análisis por WAX de glicanos cargados, tal como se expone en los ejemplos a continuación). La FSH comprende glicanos (unidos a las glicoproteínas de FSH). Se conoce bien que los glicanos en FSH pueden contener una amplia diversidad de estructuras. Estas pueden incluir combinaciones de glicanos mono, bi, tri y tetra-antenarios. En el presente documento, terminología tal como “X% de las estructuras de glicano sialiladas son estructuras de glicano tetrasialiladas” se refiere al número de estructuras de glicano en la FSH que están tetra-sialiladas, es decir portan cuatro residuos de ácido siálico, expresadas como porcentaje (X %) del número total de estructuras de glicano en la FSH que están sialiladas de algún modo (portan ácido siálico). Por tanto, la expresión “el 15-24 % de las estructuras de glicano sialiladas son estructuras de glicano tetrasialiladas” significa que, del número total de estructuras de glicano en FSH que portan residuos de ácido siálico (es decir, están sialiladas), del 15 al 24 % de estas estructuras de glicano están tetra-sialiladas (portan cuatro residuos de ácido siálico).
La rFSH puede estar presente como una única isoforma o como una mezcla de isoformas.
Los solicitantes han concebido protocolos de COS “individualizados” en los que se usan dosis específicas de FSH recombinante que tienen características específicas para tratar pacientes basándose en sus niveles de AMH específicos, aumentando de ese modo la probabilidad de una respuesta adecuada a la estimulación (por ejemplo, en pacientes que tienen un bajo potencial de respuesta), y/o un riesgo disminuido de desarrollar OHSS (por ejemplo, en pacientes que se clasificaron como de potencial de respuesta alto o excesivo).
El nivel de AMH en suero puede determinarse (por ejemplo, medirse) mediante cualquier método conocido en la técnica. Preferentemente, el nivel de AMH en suero se mide usando el kit del ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas AMH Gen-II (Beckman Coulter, Inc., Webster, Tejas). Este ensayo puede detectar concentraciones de AMH mayores de 0,57 pmol/l con un límite de cuantificación mínimo de 1,1 pmol/l. Pueden usarse otros ensayos.
En el presente documento, los valores de AMH en suero se citan generalmente en términos de pmol/l. Esto puede convertirse a ng/ml usando la ecuación de conversión: 1 ng/ml de AMH = 7,1 pmol/l de AMH.
En el presente documento, los términos “paciente” y “sujeto” se usan indistintamente.
El producto (por ejemplo, la composición farmacéutica) comprende preferentemente una dosis diaria de, o una dosis diaria equivalente a, las cantidades de rFSH derivada de ser humano definidas anteriormente, en el presente documento, y en las reivindicaciones. La dosis (diaria) puede ser una dosis inicial (es decir, puede reducirse, aumentarse o mantenerse durante el tratamiento).
El producto (por ejemplo, la composición farmacéutica) puede ser para la administración (diaria) de FSH empezando en el día uno de tratamiento y continuando durante de siete a trece días, por ejemplo de nueve a trece días, por ejemplo de 10 a 13 días, por ejemplo de 10 a 11 días. El producto (por ejemplo, la composición farmacéutica) puede ser para la administración de 12 a 16, por ejemplo de 13 a 15, por ejemplo 14 días tras la administración de (por ejemplo, tras el inicio de la administración de, por ejemplo tras el inicio de la administración diaria de) un agonista de GnRH (por ejemplo, Synarel, Lupron, Decapeptyl). El producto (por ejemplo, la composición farmacéutica) puede ser para la administración con un agonista de GnRH. El producto (por ejemplo, la composición farmacéutica) puede ser para la administración antes de la administración de un antagonista de GnRH (por ejemplo, ganirelix, cetrorelix), por ejemplo para la administración cinco o seis días antes de la administración de un antagonista de GnRH. El producto (por ejemplo, la composición farmacéutica) puede ser para la administración con un antagonista de GnRH.
Preferentemente, el producto (por ejemplo, la composición farmacéutica) es para la administración antes de la administración de una dosis alta (ovulatoria) de hCG (por ejemplo, de 4.000 a 11.000 UI de hCG, por ejemplo 5.000 UI de hCG, 10.000 UI de hCG etc.; o de 150 a 350 microgramos de hCG recombinante, por ejemplo 250 microgramos de hCG recombinante) para inducir la maduración folicular final.
Se apreciará que el producto puede ser para una dosificación a frecuencias más frecuentes (o menos) que diaria, en cuyo caso las dosis relevantes serán equivalentes a las dosis (diarias) especificadas en el presente documento.
En el presente documento, el término “tratamiento de la esterilidad” incluye tratamiento de la esterilidad mediante estimulación ovárica controlada (COS) o métodos que incluyen una etapa o fase de estimulación ovárica controlada (COS), por ejemplo inseminación intrauterina (IUI), fecundación in vitro (IVF) o inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI). La frase “tratamiento de la esterilidad” incluye tratamiento de la esterilidad mediante inducción de la ovulación (OI) o mediante métodos que incluyen una etapa o fase de inducción de la ovulación (OI). La frase “tratamiento de la esterilidad” incluye el tratamiento de la esterilidad en un sujeto que tiene esterilidad tubárica o idiopática, incluyendo tratamiento de la esterilidad en un sujeto que tiene endometriosis, por ejemplo endometriosis de estadio I o estadio II, y/o en un sujeto que tiene esterilidad anovulatoria, por ejemplo esterilidad anovulatoria de tipo II de la OMS, y/o en un sujeto con una pareja con esterilidad por factor masculino. El producto (o la composición) puede ser para (su uso en) el tratamiento de la esterilidad (y/o para la estimulación ovárica controlada) en un sujeto que tiene endometriosis, por ejemplo en un sujeto que tiene endometriosis de estadio I o estadio II, tal como se define por el sistema de clasificación de The American Society for Reproductive Medicine (ASRM) para los diversos estadios de endometriosis, (estadio IV el más intenso; estadio I el menos intenso) [American Society for Reproductive Medicine. Revised American Society for Reproductive Medicine classification of endometriosis: 1996. Fertil Steril 1997; 67.817 821].
El producto (la composición) puede ser para (su uso en) el tratamiento de la esterilidad (y/o para la estimulación ovárica controlada) en un sujeto que tiene un nivel de FSH en suero normal de 1 a 16 UI/l, por ejemplo de 1 a 12 UI/l en la fase folicular temprana.
El producto (la composición) puede ser para (su uso en) el tratamiento de la esterilidad (y/o para la estimulación ovárica controlada) en un sujeto de 18 a 42 años de edad, por ejemplo de 25 a 37 años de edad. El producto puede ser para (su uso en) el tratamiento de la esterilidad (y/o para la estimulación ovárica controlada) en un sujeto que tiene un IMC >1 e IMC < 35 kg/m2, por ejemplo un sujeto que tiene un IMC >18 e IMC < 25 kg/m2, por ejemplo un sujeto que tiene un IMC >20 e IMC < 25 kg/m2.
La rFSH puede incluir preferentemente el 27 - 33 %, por ejemplo el 30 - 32 %, de estructuras de glicano tri-sialiladas. La rFSH puede incluir preferentemente el 24 - 33 %, por ejemplo el 26 - 30 %, de estructuras de glicano di-sialiladas. La rFSH puede incluir preferentemente el 12 - 21 %, por ejemplo el 15 - 17 %, de estructuras de glicano monosialiladas. La rFSH incluye preferentemente estructuras de glicano mono-sialiladas, di-sialiladas, tri-sialiladas y tetrasialiladas con las siguientes cantidades relativas: del 15 al 17 % de mono-sialiladas; el 26 - 30 % de di-sialiladas; el 27 - 33 % (por ejemplo, del 29 al 32 %, por ejemplo el 30-32 %, por ejemplo del 30 al 31 %) de tri-sialiladas y el 17 -23 % de tetra-sialiladas (por ejemplo, tal como se muestra mediante análisis por WAX de glicanos cargados, tal como se expone en los ejemplos). La rFSH puede incluir desde el 0 hasta el 7 %, por ejemplo del 0,1 al 7 %, por ejemplo del 3 al 6 %, por ejemplo del 5 al 6 %, de estructuras sialiladas neutras. La FSH comprende glicanos (unidos a las glicoproteínas de la fSh). En el presente documento, terminología tal como “X % de mono-sialiladas”, “X % de di-sialiladas”, “X % de tri-sialiladas” o “X % de tetra-sialiladas” se refiere al número de estructuras de glicano en FSH que están mono-, di, tri o tetra-sialiladas (respectivamente), expresadas como porcentaje (X %) del número total de estructuras de glicano en la FSH que están sialiladas de algún modo (portan ácido siálico). Por tanto, la expresión “el 27 - 33 % de estructuras de glicano tri-sialiladas” significa que, del número total de estructuras de glicano en FSH que portan residuos de ácido siálico (es decir, están sialiladas), del 27 al 33 % de estas estructuras de glicano están trisialiladas (portan tres residuos de ácido siálico).
La rFSH puede tener un contenido de ácido siálico [expresado en cuanto a la razón de moles de ácido siálico con respecto a moles de proteína] de 6 mol/mol o mayor, por ejemplo entre 6 mol/mol y 15 mol/mol, por ejemplo entre 8 mol/mol y 14 mol/mol, por ejemplo entre 10 mol/mol y 14 mol/mol, por ejemplo entre 11 mol/mol y 14 mol/mol, por ejemplo entre 12 mol/mol y 14 mol/mol, por ejemplo entre 12 mol/mol y 13 mol/mol. La rFSH puede producirse o expresarse en una línea celular humana.
La FSH (rFSH) para su uso según la invención puede tener del 1 % al 99 % de la sialilación total que es a2,3-sialilación. La rFSH puede tener el 10 % o más de la sialilación total que es a2,3-sialilación. Por ejemplo, el 20, el 30, el 40, el 50, el 60, el 70, el 80 o el 90 % o más de la sialilación total puede ser a2,3-sialilación. La rFSH puede incluir preferentemente a2,3-sialilación en una cantidad que es de desde el 50 hasta el 70 % de la sialilación total, por ejemplo desde el 60 hasta el 69 % de la sialilación total, por ejemplo desde el 63 hasta el 67 %, por ejemplo aproximadamente el 65 % de la sialilación total. La FSH (rFSH) para su uso según la invención puede tener del 1 % al 99 % de la sialilación total que es a2,6-sialilación. La rFSH (o preparación de rFSH) de la invención puede tener el 5 % o más, por ejemplo del 5 % al 99 %, de la sialilación total que es a2,6-sialilación. La rFSH puede tener el 50 % o menos de la sialilación total que es a2,6-sialilación. La rFSH puede incluir preferentemente a2,6-sialilación en una cantidad que es
de desde el 25 hasta el 50 % de la sialilación total, por ejemplo desde el 30 hasta el 50 % de la sialilación total, por ejemplo desde el 31 hasta el 38 %, por ejemplo aproximadamente el 35 % de la sialilación total. Por sialilación, quiere decirse la cantidad de residuos de ácido siálico presentes en las estructuras de hidrato de carbono de la FSH. a2,3-Sialilación significa sialilación en la posición 2,3 (tal como se conoce bien en la técnica) y a2,6-sialilación en la posición 2,6 (también se conoce bien en la técnica). Por tanto “% de la sialilación total puede ser a2,3 sialilación” se refiere al % del número total de restos de ácido siálico presentes en la FSH que están sialilados en la posición 2,3. El término “% de la sialilación total que es a2,6-sialilación” se refiere al % del número total de residuos de ácido siálico presentes en la FSH que están sialilados en la posición 2,6.
La rFSH puede tener un contenido de ácido siálico (cantidad de sialilación por molécula de FSH) de (basándose en la masa de proteína, en vez de la masa de proteína más hidrato de carbono) del 6 % o mayor (por ejemplo, entre el 6 % y el 15 %, por ejemplo entre el 7 % y el 13 %, por ejemplo entre el 8 % y el 12 %, por ejemplo entre el 11 % y el 15 %, por ejemplo entre el 12 % y el 14 %) en masa.
La rFSH puede ser rFSH o una preparación de rFSH en la que el 16 % o menos (por ejemplo, del 0,1 al 16 %) de los glicanos comprenden (por ejemplo, portan) N-acetilglucosamina bisectriz (GlcNAc bisectriz o bisGlcNAc). Preferentemente, la rFSH (o preparación de rFSH) es una rFSH o preparación de rFSH en la que del 8 al 14,5 % de los glicanos comprenden (por ejemplo, portan) una N-acetilglucosamina bisectriz (GlcNAc bisectriz o bisGlcNAc).
Se entenderá que la FSH comprende glicanos unidos a las glicoproteínas de la FSH. También se entenderá que el 100 % de los glicanos se refiere a o significa todos los glicanos unidos a las glicoproteínas de la FSH. Por tanto, en el presente documento, la terminología “del 8 al 14,5 % de los glicanos comprenden (portan) N-acetilglucosamina bisectriz” significa que del 8 al 14,5 % del número total de glicanos unidos a las glicoproteínas de la FSH incluyen/portan N-acetilglucosamina bisectriz; “el 16 % o menos de los glicanos comprenden (portan) N-acetilglucosamina bisectriz” significa que el 16 % o menos del número total de glicanos unidos a las glicoproteínas de la FSH incluyen/portan N-acetilglucosamina bisectriz, etcétera.
Los solicitantes han descubierto que la FSH recombinante (preparaciones de rFSH; composiciones de rFSH) en la que el 16 % o menos (por ejemplo, del 8 al 14,5 %) de los glicanos comprendidos en las glicoproteínas de la FSH portan GlcNAc bisectriz puede tener propiedades farmacocinéticas ventajosas. Se cree que las propiedades ventajosas pueden surgir debido a que la cantidad de glicanos que portan GlcNAc bisectriz es similar a la que existe en el producto derivado de orina humana Bravelle, que es bastante menor que la de otras preparaciones de FSH recombinante tales como las dadas a conocer en el documento WO2012/017058.
La rFSH (o preparación de rFSH) puede ser una rFSH o preparación de rFSH en la que el 20 % o más de los glicanos comprenden (por ejemplo, portan) N-acetilgalactosamina (GalNAc), por ejemplo en la que el 20 % o más de los glicanos comprenden (por ejemplo, portan) una GalNAc terminal. Preferentemente, la rFSH (o preparación de rFSH) es una FSH o preparación de FSH en la que del 40 al 55 %, por ejemplo del 42 al 52 %, de los glicanos comprenden (por ejemplo, portan) GalNAc. Preferentemente, la rFSH (o preparación de rFSH) es una FSH o preparación de FSH en la que del 40 al 55 %, por ejemplo del 42 al 52 %, de los glicanos comprenden (por ejemplo, portan) GalNAc terminal.
Se entenderá que FSH comprende glicanos unidos a las glicoproteínas de la FSH. También se entenderá que el 100 % de los glicanos se refiere a o significa todos los glicanos unidos a las glicoproteínas de la FSH. Por tanto, en el presente documento, la terminología “en la que el 20 % o más de los glicanos comprenden (por ejemplo, portan) GalNAc” significa que el 20 % o más del número total de glicanos unidos a las glicoproteínas de la FSH incluyen/portan N-acetilgalactosamina (GalNAc); “del 40 al 55 %, por ejemplo del 42 al 52 %, de los glicanos comprenden (por ejemplo, portan) GalNAc terminal” significa que del 40 al 55 %, por ejemplo del 42 al 52 %, del número total de glicanos unidos a las glicoproteínas de la FSH incluyen/portan GalNAc terminal, etcétera.
Parece que la disponibilidad del enlace a2,6 aumenta el número de estructuras tetra-sialiladas, en comparación con productos derivados de células CHO que tienen solo el enlace a2,3 disponible. Los solicitantes también han descubierto que su rFSH se distingue con respecto a otros productos aprobados debido a la composición de azúcares: incluye, o puede incluir, una cantidad específica de GalNac. Esto puede vincularse con la tetrasialilación y potencia porque la 2,6-sialilación está asociada a GalNac. En otras palabras, los presentes solicitantes han desarrollado un producto de rFSH que incluye características específicas (sitios de grupo de enlace 2,6, GalNac) que proporcionan rFSH con un alto grado de sialilación, lo que parece conducir a una potencia mejorada in vivo.
La rFSH (o preparación de rFSH) puede tener del 16 al 24 % de los glicanos que comprenden 1-fucosa-Lewis (por ejemplo, terminal), por ejemplo del 16,5 al 18 % de los glicanos que comprenden 1-fucosa-Lewis (por ejemplo, terminal). La rFSH (o preparación de rFSH) puede tener del 1,5 al 4,5 %, por ejemplo del 2 al 4 %, por ejemplo el 3,7 %, de los glicanos que comprenden 2-fucosa-Lewis (por ejemplo, terminal). El contenido de fucosa-Lewis puede tener un efecto sobre la potencia.
La rFSH puede producirse o expresarse en una línea celular humana, por ejemplo una línea celular Per.C6, una línea celular HT1080, etc. Esto puede simplificar (y hacer más eficaz) el método de producción porque la manipulación y el
control de, por ejemplo, el medio de crecimiento celular para conservar la sialilación pueden ser menos críticos que con procedimientos conocidos. El método también puede ser más eficaz porque se produce poca cantidad de rFSH básica en comparación con la producción de productos de rFSH conocidos; se produce más rFSH ácida y la separación/retirada de FSH básica es menos problemática. La rFSH puede producirse o expresarse en una línea celular PER.C6®, una línea celular derivada de PER.C6® o una línea celular PER.C6® modificada. rFSH que se produce o se expresa en una línea celular humana (por ejemplo, línea celular PER.C6®, línea celular HT1080, etc.) incluirá cierta cantidad de ácidos siálicos con enlaces a2,6 (a2,6-sialilación) proporcionados por actividad sialil transferasa endógena [de la línea celular] e incluirá cierta cantidad de ácidos siálicos con enlaces a2,3 (a2,3-sialilación) proporcionados por actividad sialil transferasa endógena. La línea celular puede modificarse usando a2,3-sialiltransferasa. La línea celular puede modificarse usando a2,6-sialiltransferasa. Alternativa o adicionalmente, la rFSH puede incluir ácidos siálicos con enlaces a2,6 (a2,6-sialilación) proporcionados por actividad sialil transferasa endógena [de la línea celular]. En el presente documento, el término “FSH recombinante derivada de ser humano” significa FSH recombinante que se produce o se expresa en una línea celular humana (por ejemplo, FSH recombinante preparada mediante modificación por ingeniería genética de una línea celular humana).
La rFSH puede producirse usando a2,3- y/o a2,6-sialiltransferasa. En un ejemplo, rFSH se produce usando a2,3-sialiltransferasa. La rFSH puede incluir ácidos siálicos con enlaces a2,6 (a2,6-sialilación) proporcionados por actividad sialil transferasa endógena.
El producto puede ser una composición farmacéutica. La composición farmacéutica es para el tratamiento de la esterilidad. El tratamiento de la esterilidad puede comprender tecnologías de reproducción asistida (ART), inducción de la ovulación o inseminación intrauterina (IUI). La composición farmacéutica puede usarse, por ejemplo, en indicaciones médicas en las que se usan las preparaciones de FSH conocidas.
El producto o la composición puede formularse en composiciones bien conocidas por cualquier vía de administración de fármacos, por ejemplo oral, rectal, parenteral, transdérmica (por ejemplo, tecnología de parche), intravenosa, intramuscular, subcutánea, intracisternal, intravaginal, intraperitoneal, local (polvos, pomadas o gotas) o como pulverización bucal o nasal. Una composición típica comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable, tales como disolución acuosa, excipientes no tóxicos, incluyendo sales y conservantes, tampones y similares, tal como se describe en Remington's Pharmaceutical Sciences, decimoquinta edición (Matt Publishing Company, 1975), en las páginas 1405 a 1412 y 1461 - 87, y el Formulario Nacional XIV decimocuarta edición (American Pharmaceutical Association, 1975), entre otros.
Los ejemplos de vehículos farmacéuticos, diluyentes, disolventes o vehículos acuosos y no acuosos adecuados incluyen agua, etanol, polioles (tales como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol, y similares), carboximetilcelulosa y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales (tales como aceite de oliva), y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Las composiciones de la presente invención también pueden contener aditivos tales como pero sin limitarse a conservantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes, tensioactivos y agentes dispersantes. Pueden incluirse agentes antibacterianos y antifúngicos para impedir el crecimiento de microbios e incluyen, por ejemplo, m-cresol, alcohol bencílico, parabeno, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, y similares. Si se incluye un conservante, se prefieren alcohol bencílico, fenol y/o m-cresol; sin embargo, el conservante no se limita en absoluto a estos ejemplos. Además, puede ser deseable incluir agentes isotónicos tales como azúcares, cloruro de sodio, y similares. El producto o la composición puede comprender además una sal que comprende un catión de metal alcalino farmacéuticamente aceptable seleccionada del grupo que consiste en sales de Na+ o K+, o una combinación de las mismas. Preferentemente, la sal es una sal de Na+, por ejemplo NaCl o Na2SO4.
Preferentemente, el producto o la composición comprenden FSH recombinante y uno o más de polisorbato 20, L-metionina, fenol, sulfato de disodio y tampón fosfato de sodio.
En algunos casos, para realizar una acción prolongada, es deseable ralentizar la absorción de FSH (y otros principios activos, si están presentes) a partir de la inyección subcutánea o intramuscular. Esto puede lograrse mediante el uso de una suspensión líquida de material cristalino o amorfo con escasa solubilidad en agua. La velocidad de absorción de FSH depende entonces de su velocidad de disolución que, a su vez, puede depender del tamaño de cristal y la forma cristalina. Alternativamente, la absorción retardada de una forma de combinación de FSH administrada por vía parenteral se logra disolviendo o suspendiendo la combinación de FSH en un vehículo aceitoso. Pueden prepararse formas de depósito inyectables formando matrices de microencapsulación de la FSH (y otros agentes, si están presentes) en polímeros biodegradables tales como polilactida-poliglicolida. Dependiendo de la razón de FSH con respecto a polímero y de la naturaleza del polímero particular empleado, puede controlarse la velocidad de liberación de FSH. Los ejemplos de otros polímeros biodegradables incluyen polivinilpirrolidona, poliortoésteres, polianhídridos, etc. También se preparan formulaciones inyectables de depósito atrapando la FSH en liposomas o microemulsiones que son compatibles con los tejidos corporales.
Las formulaciones inyectables pueden esterilizarse, por ejemplo, mediante filtración a través de un filtro que retiene bacterias, o mediante la incorporación de agentes esterilizantes en forma de composiciones sólidas estériles que pueden disolverse o dispersarse en agua estéril u otro medio inyectable estéril justo antes de su uso. Pueden suministrarse formulaciones inyectables en cualquier recipiente adecuado, por ejemplo vial, jeringa precargada,
cartuchos para inyección, y similares.
El producto o la composición puede formularse para un único uso o para múltiples usos (múltiples dosis). Si el producto o la composición se formula para múltiples usos, se prefiere que se incluya un conservante. Si se incluye un conservante, se prefieren alcohol bencílico, fenol y/o m-cresol; sin embargo, el conservante no se limita en absoluto a estos ejemplos. El producto o la composición formulado para un único uso o múltiples usos puede comprender además una sal que comprende un catión de metal alcalino farmacéuticamente aceptable seleccionada del grupo que consiste en sales de Na+ o K+, o una combinación de las mismas. Preferentemente, la sal es una sal de Na+, por ejemplo NaCl o Na2SO4.
El producto o la composición puede incluirse en un recipiente tales como un vial, un cartucho precargado (por ejemplo, para una única administración o múltiples usos) o un dispositivo de inyección tales como un “bolígrafo” por ejemplo para la administración de múltiples dosis.
El producto o la composición puede ser una formulación (por ejemplo, formulación inyectable) que incluye FSH (opcionalmente con hCG, LH, actividad LH etc.) La actividad LH, si está presente, puede originarse a partir de LH o gonadotropina coriónica humana, hCG. Si hay más de un principio activo (es decir, FSH y por ejemplo hCG o LH) estos pueden ser adecuados para la administración por separado o conjuntamente. Si se administran por separado, la administración puede ser secuencial. El producto puede suministrarse en cualquier envase apropiado. Por ejemplo, un producto puede incluir varios recipientes (por ejemplo, jeringas precargadas o viales) que contienen o bien FSH o bien hCG, o una combinación (o combinación) tanto de f Sh como de hCG. La hCG puede ser hCG recombinante o hCG de orina. Si el producto incluye varios recipientes (por ejemplo, jeringas precargadas o viales) que contienen FSH, por ejemplo FSH recombinante, cada recipiente puede incluir la misma cantidad de FSH. Uno o más recipientes pueden incluir diferentes cantidades de FSH. Las jeringas o los viales pueden envasarse en un envase de tipo blíster u otros medios para mantener la esterilidad. Cualquier producto puede contener opcionalmente instrucciones para el uso de las formulaciones de FSH (y por ejemplo hCG si está presente). El pH y la concentración exacta de los diversos componentes de la composición farmacéutica se ajustan según la práctica de rutina en este campo. Véase GOODMAN and GILMAN's THE PHARMACOLOGICAL BASIS FOR THERAPEUTICES, 7a ed. En una realización preferida, las composiciones de la invención se suministran como composiciones para su administración parenteral. En la técnica se conocen métodos generales para la preparación de las formulaciones parenterales y se describen en REMINGTON; THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY, citado anteriormente, en las páginas 780-820. Las composiciones parenterales pueden suministrarse en formulación líquida o como sólido que se mezclará con un medio inyectable estéril justo antes de la administración. En una realización especialmente preferida, las composiciones parenterales se suministran en forma de dosificación unitaria por su facilidad de administración y uniformidad de dosificación.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se describirá ahora con más detalle con referencia a los dibujos adjuntos en los que:
La Figura 1 muestra un mapa de plásmido del vector de expresión pFSHalpha/beta;
La Figura 2 muestra el vector de expresión de a2,3-sialiltransferasa (ST3GAL4);
La Figura 3 muestra el vector de expresión de a2,6-sialiltransferasa (ST6GAL1);
La Figura 4 muestra el % de abundancia de la distribución de ácido siálico de ejemplos de FSH recombinante producida por células PER.C6® que expresan de manera estable FSH tras la modificación por ingeniería genética con a2,3-sialiltransferasa;
La Figura 5 muestra el % de abundancia de la distribución de carga de glicanos de ejemplos de FSH recombinante producida por células PER.C6® que expresan de manera estable FSH tras la modificación por ingeniería genética con a2,3-sialiltransferasa;
La Figura 6 muestra una comparación de la concentración de inhibina-B tras la administración de 225 UI de Gonal f (línea inferior, línea discontinua) y 225 UI del ejemplo (línea superior, línea continua) de la invención;
La Figura 7 muestra el efecto del peso corporal sobre los ovocitos recuperados en el grupo de tratamiento con bajo nivel de AMH (ejemplos 10, 10A); y
La Figura 8 muestra el efecto del peso corporal sobre los ovocitos recuperados en el grupo de tratamiento con alto nivel de AMH.
Selección de secuencias
FSH humana
Se usó la región codificante del gen para el polipéptido de FSH alfa según Fiddes y Goodman. (1981). La secuencia se registra en el banco como AH007338 y en el momento de la construcción no había otras variantes de esta secuencia de proteína. La secuencia se denomina en el presente documento SEQ ID NO: 1.
Se usó la región codificante del gen para el polipéptido de FSH beta según Keene et al (1989). La secuencia se registra en el banco como NM_000510 y en el momento de la construcción no había otras variantes de esta secuencia de proteína. La secuencia se denomina en el presente documento SEQ ID NO: 2
Sialiltransferasa
a2,3-Sialiltransferasa - Se usó la región codificante del gen para beta-galactósido alfa-2,3-sialiltransferasa 4 (a2,3-sialiltransferasa, ST3GAL4) según Kitagawa y Paulson (1994). La secuencia se registra en el banco como L23767 y se denomina en el presente documento SEQ ID NO: 3.
a2,6-Sialiltransferasa - Se usó la región codificante del gen para beta-galactosamida alfa-2,6-sialiltransferasa 1 (a2,6-sialiltransferasa, ST6GAL1) según Grundmann et al. (1990). La secuencia se registra en el banco como NM_003032 y se denomina en el presente documento SEQ ID NO: 4.
EJEMPLOS
Ejemplo 1 Construcción del vector de expresión de FSH
Se amplificaron la secuencia codificante del polipéptido de FSH alfa (AH007338, SEQ ID NO: 1) y el polipéptido de FSH beta (NM_003032, SEQ ID NO: 2) mediante PCR usando las combinaciones de cebadores FSHa-fw y FSHa-rev y FSHb-fw y FSHb-rec respectivamente.
Se digirió el ADN de FSH beta amplificado resultante con las enzimas de restricción AscI y HpaI y se insertó en los sitios AscI y HpaI en el vector de expresión de mamíferos dirigido por CMV que porta un marcador de selección de neomicina. De manera similar, se digirió el ADN de FSH alfa con BamHI y NheI y se insertó en los sitios BamHI y NheI en el vector de expresión que ya contiene el ADN del polipéptido de FSH beta.
Se usó el ADN de vector para transformar la cepa DH5a de E. coli. Se escogieron colonias para amplificación. Se seleccionaron las colonias que contenían el vector que contenía tanto FSH alfa como beta para la secuenciación y todas contenían las secuencias correctas según SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2. Se seleccionó el plásmido pFSH A+B#17 para la transfección (Figura 1).
Ejemplo 2 Construcción del vector de expresión de ST3
Se amplificó la secuencia codificante de beta-galactósido alfa-2,3-sialiltransferasa 4 (ST3, L23767, SEQ ID NO: 3) mediante PCR usando la combinación de cebadores 2,3STfw y 2,3STrev.
Se digirió el ADN de ST3 amplificado resultante con las enzimas de restricción BamHI y AflII y se insertó en los sitios BamHI y AflII en el vector de expresión de mamíferos dirigido por CMV que porta un marcador de resistencia a higromicina. Se amplificó el vector tal como se describió anteriormente y se secuenció. El clon pST3#1 (Figura 2) contenía la secuencia correcta según SEQ ID NO: 3 y se seleccionó para la transfección.
Ejemplo 3 Construcción del vector de expresión de ST6
Se amplificó la secuencia codificante de beta-galactosamida alfa-2,6-sialiltransferasa 1 (ST6, NM_003032, SEQ ID NO: 4) mediante PCR usando la combinación de cebadores 2,6STfw y 2,6STrev.
Se digirió el ADN de ST6 amplificado resultante con las enzimas de restricción BamHI y AflII y se insertó en los sitios BamHI y AflII en el vector de expresión de mamíferos dirigido por CMV que porta un marcador de resistencia a higromicina. Se amplificó el vector tal como se describió anteriormente y se secuenció. El clon pST6#11 (Figura 3)
contenía la secuencia correcta según SEQ ID NO: 4 y se seleccionó para la transfección.
Ejemplo 4 Expresión estable de pFSH a+p en células PER.C6®. Transfección, aislamiento y examen de clones.
Se generaron clones de PER.C6® que producían FSH expresando ambas cadenas de polipéptido de FSH a partir de un único plásmido (véase el ejemplo 1).
Para obtener clones estables, un agente de transfección basado en liposomas con el constructo pFSH a+p. Se seleccionaron clones estables en VPRO complementado con FCS al 10 % y que contenía G418. Tres semanas tras la transfección, crecieron clones resistentes a G418. Se seleccionaron clones para aislamiento. Se cultivaron los clones aislados en medio de selección hasta que fueron confluentes al 70-80 %. Se sometieron a ensayo los sobrenadantes para determinar el contenido de proteína FSH usando un ELISA selectivo para FSH y la actividad farmacológica en el receptor de FSH en la línea celular clonada, usando un ensayo de acumulación de AMPc. Se avanzó con clones que expresaban la proteína funcional para la expansión del cultivo en placas de 24 pocillos, 6 pocillos y frascos T80.
Se iniciaron estudios para determinar la productividad y calidad del material de siete clones en frascos T80 para generar suficiente material. Se cultivaron las células en medios complementados tal como se describió anteriormente durante 7 días y se recogió el sobrenadante. Se determinó la productividad usando el ELISA selectivo para FSH. Se determinó el perfil isoeléctrico del material mediante isoelectroenfoque (IEF), mediante métodos conocidos en la técnica. Se seleccionaron clones con suficiente productividad y calidad para la modificación por ingeniería genética de sialiltransferasa.
Ejemplo 5 El nivel de sialilación aumenta en células que sobreexpresan a2,3-sialiltransferasa. Expresión estable de pST3 en células PER.C6® que expresan FSH; transfección, aislamiento y examen de clones.
Se generaron clones de PER.C6® que producían FSH altamente sialilada expresando a2,3-sialiltransferasa a partir de plásmidos independientes (ejemplo 2) en células PER.C6® que ya expresan ambas cadenas de polipéptido de FSH (del ejemplo 4). Se seleccionaron clones producidos a partir de las células PER.C6® tal como se expone en el ejemplo 4 por sus características incluyendo productividad, buen perfil de crecimiento, producción de proteína funcional, y produjeron FSH que incluía cierta sialilación. Se generaron clones estables tal como se describió anteriormente en el ejemplo 4. Se aislaron los clones, se expandieron y se sometieron a ensayo. Se adaptaron los clones de a2,3-sialiltransferasa a medios libres de suero y las condiciones de suspensión.
Igual que antes, se sometieron a ensayo los clones usando un ELISA selectivo para FSH, la respuesta funcional en una línea celular de receptor de FSH, IEF, tasa de aclaramiento metabólico y análisis de Steelman Pohley. Se compararon los resultados con una FSH recombinante disponible en el mercado (Gonal-f, Serono) y las líneas celulares PER.C6® de FSH parentales. La FSH producida por la mayor parte de los clones tiene una sialilación significativamente mejorada (es decir, en promedio más isoformas de FSH con altos números de ácidos siálicos) en comparación con f Sh expresada sin a2,3-sialiltransferasa. En conclusión, la expresión de FSH junto con sialiltransferasa en células PER.C6® dio como resultado un aumento de los niveles de FSH sialilada en comparación con células que expresan FSH únicamente.
Ejemplo 6 Visión general de la producción y purificación
Se desarrolló un procedimiento para producir FSH en células PER.C6® que se cultivaron en suspensión en medio libre de suero. El procedimiento se describe a continuación y se aplicó a varias líneas celulares PER.C6® que producen FSH.
Se preparó FSH a partir del clon a2,3 (ejemplo 5) usando una modificación del método descrito por Lowry et al. (1976). Para la producción de PER.C6®FSH, se adaptaron las líneas celulares a un medio libre de suero, es decir, Excell 525 (JRH Biosciences). En primer lugar, se cultivaron las células para formar una monocapa confluente al 70 %-90 % en un frasco de cultivo T80. En el pase, se resuspendieron las células en el medio libre de suero, Excell 525 L-glutamina 4 mM, hasta una densidad celular de 0,3x106 células/ml. Se puso una suspensión celular de 25 ml en un frasco con agitación de 250 ml y se agitó a 100 rpm a 37°C al 5 % de CO2. Tras alcanzar una densidad celular de > 1x106 células/ml, se subcultivaron las células hasta una densidad celular de 0,2 o 0,3x106 células/ml y se cultivaron adicionalmente en frascos con agitación a 37°C, el 5 % de CO2 y 100 rpm.
Para la producción de FSH, se transfirieron las células a un medio de producción libre de suero, es decir, VPRO (JRH Biosciences), que soporta el crecimiento de células PER.C6® hasta densidades celulares muy altas (habitualmente > 107 células/ml en un cultivo discontinuo). En primer lugar, se cultivaron las células hasta > 1x106 células/ml en Excell 525, luego se centrifugaron durante 5 min a 1000 rpm y posteriormente se suspendieron en medio VPRO L-glutamina 6 mM hasta una densidad de 1x106 células/ml. Entonces se cultivaron las células en un frasco con agitación durante 7-10 días a 37 °C, el 5 % de CO2 y 100 rpm. Durante este periodo, las células crecieron hasta una densidad de > 107 células/ml. Se recogió el medio de cultivo tras empezar a disminuir la viabilidad celular. Se centrifugaron las células durante 5 min a 1000 rpm y se usó el sobrenadante para la cuantificación y purificación de FSH. Se determinó la
concentración de FSH usando ELISA (DRG EIA 1288).
Después de eso, se llevó a cabo la purificación de FSH usando una modificación del método descrito por Lowry et al. (1976). Se llevó a cabo la purificación usando cromatografía de carga selectiva para enriquecer las formas altamente sialiladas mediante métodos bien conocidos en la técnica.
Durante todos los procedimientos cromatográficos, se confirmó el enriquecimiento de las formas sialiladas de FSH, según se reivindica en el presente documento, mediante RIA (DRG EIA 1288) y/o IEF.
Ejemplo 7 Cuantificación de cantidades relativas de ácido a2,3 y a2,6-siálico
Se midieron las cantidades en porcentaje relativas de ácido a2,3 y a2,6-siálico en rFSH purificada (Ejemplo 6) usando técnicas conocidas.
Se liberaron N-glicanos de las muestras usando PNGasa F en condiciones desnaturalizantes y luego se marcaron con 2-aminobenzamida. Entonces se separaron las formas de glicano liberadas y se analizaron mediante una columna de intercambio aniónico débil (WAX) para la determinación de la distribución de carga. Se analizaron adicionalmente mediante una columna para WAX los glicanos marcados tratados con 2,3,6,8-sialidasa para la determinación del ácido siálico total y 2,3-sialidasa para la determinación de ácido 2,3-siálico.
Se calcularon los porcentajes relativos de los glicanos cargados a partir de las estructuras presentes en las reservas de glicanos no digeridos y digeridos y se muestran en la Figura 4 (para 8 muestras). Se encontró que estos estaban en los intervalos del 50 % - 70 % (por ejemplo, aproximadamente el 60 % o el 65 %) para a2,3-sialilación y del 28 al 50 %, generalmente del 30 al 35 % (por ejemplo, aproximadamente el 31 % o el 35 %), para a2,6-sialilación.
Ejemplo 8 Cuantificación de cantidades relativas de estructuras de glicano mono, di, tri y tetra-sialiladas
Se midieron las cantidades en porcentaje relativas de estructuras mono, di, tri y tetra-sialiladas en glicanos extraídos de rFSH purificada (ejemplo 6) usando técnicas conocidas.
Se liberaron N-glicanos de las muestras usando PNGasa F en condiciones desnaturalizantes y luego se marcaron con 2-aminobenzamida. Se liberaron glicanos de las muestras usando PNGasa F en condiciones desnaturalizantes y luego se marcaron con 2-aminobenzamida. Entonces se separaron las formas de glicano liberadas y se analizaron mediante una columna de intercambio aniónico débil (WAX) para la determinación de la distribución de sialilación. Las cantidades relativas de estructuras neutras, mono-sialiladas, di-sialiladas, tri-sialiladas y tetra-sialiladas se muestran en la Figura 5 (para las 8 muestras mostradas en la Figura 4).
La rFSH incluye estructuras de glicano neutras, mono-sialiladas, di-sialiladas, tri-sialiladas y tetra-sialiladas con las siguientes cantidades relativas: el 5-6 % de neutras; el 15-17 % de mono-sialiladas; el 26-30 % de di-sialiladas; el 30 32 % de tri-sialiladas y el 17-23 % de tetra-sialiladas.
Ejemplo 8a
Se midieron las cantidades en porcentaje relativas de ácido a2,6-siálico en rFSH purificada extraída de nueve muestras de rFSH purificada (producida mediante los métodos del ejemplo 6) usando técnicas conocidas.
Se liberaron N-glicanos de las muestras usando PNGasa F en condiciones desnaturalizantes y entonces se marcaron con 2-aminobenzamida. Entonces se separaron las formas de glicano liberadas y se analizaron mediante una columna de intercambio aniónico débil (WAX) para la determinación de la distribución de carga. Se analizaron adicionalmente mediante una columna para WAX glicanos marcados tratados con 2,3,6,8-sialidasa para la determinación de ácido siálico total y 2,3-sialidasa para la determinación de ácido 2,3-siálico (véase el ejemplo 8). El análisis permite el cálculo de ácido a2,6-siálico.
Se calcularon los porcentajes relativos de los glicanos cargados a partir de las estructuras presentes en las reservas de glicanos no digeridos y digeridos y se muestran en la siguiente tabla. Se encontró que estos estaban en los intervalos del 25 al 50 %, generalmente del 30 al 35 % para a2,6-sialilación.
Se midieron las cantidades en porcentaje relativas de GlcNAc bisectriz, GalNac y 1-fucosa-Lewis en glicanos extraídos de las nueve muestras de rFSH purificada (producida mediante los métodos del ejemplo 6) usando técnicas conocidas. Se liberaron N-glicanos de la glicoproteína usando PNGasa F y se marcaron con 2-aminobenzamida (2AB). Se realizó el análisis mediante análisis de HPLC bidimensional (2D) en combinación con degradación enzimática de los glicanos. Para la verificación, se analizaron los glicanos mediante MALDI-EM. Las cantidades relativas de ácido alfa 2,6-siálico y los residuos terminales se muestran en la siguiente tabla, junto con los mismos para Gonal F (FSH recombinante derivada de células CHO) y Bravelle (FSH de orina humana).
1 El valor de 3,1 es el total de A de fucosa-Lewis. 2 No determinado
Puede observarse que la cantidad de GalNac en la FSH de la invención varía entre aproximadamente el 44,9 y el 51 %, promediando aproximadamente el 47,1 %.
Puede observarse que la cantidad de GlcNAc bisectriz en la FSH de la invención varía entre el 8,7 y el 13,9 %, promediando aproximadamente el 10,9 %.
Puede observarse que la cantidad de 1-fucosa-Lewis en la FSH de la invención varía entre el 16,1 y el 23,3 %, promediando aproximadamente el 19 %.
Puede observarse que la cantidad de 2-fucosa-Lewis en la FSH de la invención varía entre el 1,9 y el 4,4 %, promediando aproximadamente el 3,7 %.
Ejemplo 9 - Un estudio de múltiples dosis que investiga la seguridad, tolerancia, farmacocinética, farmacodinamia e inmunogenicidad de FE 999049 en comparación con GONAL-F.
Población de estudio
Un total de 48 (24 en cada fármaco) mujeres sanas recibieron dosis diarias de 14,6 |ig de FE 999049 (una composición según la invención, producida según el ejemplo 6) o 16,5 |ig de Gonal-F durante siete días.
Resultados de seguridad
La administración de múltiples dosis de FE 999049 y GONAL-F fue segura y generalmente se toleró bien tal como se evaluó mediante los acontecimientos adversos (AA), signos vitales, e Cg , mediciones de laboratorio clínico y exploración física. No se produjo ningún acontecimiento adverso grave o muerte durante el estudio.
Resultados farmacocinéticos
Tras la administración de FE 999049 y GONAL-F a lo largo de 7 días, los valores de concentración de FSH tal como se evaluaron inmediatamente antes de la siguiente inyección aumentaron y parecieron alcanzar un nivel de estado estacionario tras 6-7 días. Sin embargo, la exposición (AUC y Cmax) de FE 999049 fue un 60 % mayor en comparación con Gonal-F.
Resultados farmacodinámicos
Todas las concentraciones de inhibina-B (véase la Figura 6), estradiol y progesterona aumentaron después de la administración de FE 999049 y GONAL-F, sin embargo en mayor grado tras la administración de FE 999049 en comparación con GONAL-F. Tanto el número como la distribución de tamaño de los folículos mostraron una mayor respuesta a FE 999049 en comparación con GONAL-F.
El ejemplo 9 demuestra que FSH que tiene una cantidad específica (el 17-23 %) de estructuras de glicano tetrasialiladas y, por ejemplo, cantidades específicas de a2,3-sialilación y a2,6-sialilación es notablemente más potente que los productos de FSH recombinante que están actualmente en el mercado.
Ejemplo 10 - Un estudio de múltiples dosis que investiga FE 999049 en comparación con GONAL-F.
Lo siguiente describe un ensayo aleatorizado, controlado, ciego para el evaluador, de grupos paralelos, multinacional y multicéntrico que evalúa la relación dosis-respuesta de FE 999049 en pacientes que se someten a estimulación ovárica controlada para fecundación in vitro (IVF) / inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI). La población de pacientes eran 265 pacientes sometidas a IVF con edades comprendidas entre 18 y 37 años, con IMC de 18,5 a 32,0 kg/m2
Se diseñó el ensayo como un ensayo de dosis-respuesta con el número de ovocitos recuperados como criterio de valoración principal. Los criterios de valoración secundarios explorarán el impacto cualitativo y cuantitativo de diferentes dosis de FE 999049 con respecto al perfil endocrino, el desarrollo folicular, la fecundación de ovocitos, la calidad de los embriones y la eficacia del tratamiento (es decir, consumo de gonadotropina total y duración de la estimulación). Se diseña el ensayo para evaluar la eficacia de FE 999049 para establecer un embarazo cuando se usa en estimulación ovárica controlada para ciclos de IVF/ICSI.
Se evaluaron los sujetos en el plazo de 3 meses antes de la aleatorización para determinar el cumplimiento de los criterios de inclusión y exclusión, incluyendo una evaluación del nivel de hormona antimülleriana (AMH) para aumentar la homogeneidad de la población de ensayo en relación con la respuesta ovárica y minimizar el número de posibles pacientes con potencial de respuesta escaso y superalto frente a las dosis de f E 999049 y la dosis de GONAL-F usadas en el ensayo. Se midió la valoración del nivel de AMH usando el kit de ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas AMH Gen-II (Beckman Coulter, Inc., Webster, Tejas). Este ensayo puede detectar concentraciones de AMH mayores de 0,57 pmol/l con un límite de cuantificación mínimo de 1,1 pmol/l.
En el día 2-3 de su ciclo menstrual, se aleatorizaron los sujetos en un modo 1:1:1:1:1:1 con respecto al tratamiento con o bien 90 UI, 120 UI, 150 UI, 180 UI o 210 UI de FE 999049 o bien 150 UI de GONAL-F, y se inició la estimulación ovárica. Se estratificó la aleatorización según el nivel de AMH en la selección [5,0-14,9 pmol/l (bajo nivel de AMH) y de 15,0 a 44,9 pmol/l (alto nivel de AMH)).
Gonal-F es del tipo llenado en masa (FbM) a petición de la FDA; por tanto, es apropiada la referencia a una dosis en ug. La etiqueta de Gonal-F indica 600 UI/44 ug, lo que indica que 150 UI son 11 ug. Sin embargo, existe cierta variación y el certificado de lote para este ensayo indicó que 11,3 ug de Gonal-F eran equivalentes a 150 UI. Las dosis de FE999049 se presentan mediante el contenido de proteína (ug) en vez de por la actividad biológica. Por tanto, las dosis de FE999049 fueron de 5,2 ug (90 UI), 6,9 ug (120 UI), 8,6 ug (150 UI), 10,3 ug (180 UI) o 12,1 ug (210 UI).
La distribución de sujetos y dosis se expone de la siguiente manera (los datos son número de sujetos):
Tabla 1
FE 999049 GONAL-F
5,2 ug 6,9 ug 8,6 ug 10,3 ug 12,1 ug 11,3 ug Total
Seleccionados 334
Aleatorizados y
expuestos 42 45 44 45 46 43 265
Estratos con alto
nivel de AMH
(15,0 - 44,9 23 26 24 24 26 25 148 (56 %) pmol/l)
Estratos con
bajo nivel de
AMH (5,0 - 19 19 20 20 21 18 117 (44 %) 14,9 pmol/l)
Por protocolo 40 42 42 44 44 43 255
Se fija el nivel de dosis diaria de FE 999049 o GONAL-F en la totalidad del periodo de estimulación. Durante la estimulación, se monitorizan los sujetos en el día de estimulación 1, 4 y 6 y de aquí en adelante al menos cada dos días. Cuando se observan 3 folículos de > 15 mm, se realizan visitas diariamente. Se tratan los sujetos con FE 999049 o GONAL-F durante un máximo de 16 días.
Para prevenir un aumento de LH prematuro, puede iniciarse el tratamiento con un antagonista de GnRH (acetato de ganirelix, ORGALUTRAN, MSD / Schering-Plough) en el día de estimulación 6 a una dosis diaria de 0,25 mg y continuarse en la totalidad del periodo de estimulación. Se realiza la inducción de la maduración folicular final en el
día en el que se observan > 3 folículos con un diámetro >17 mm. Si hay < 25 folículos con un diámetro > 12 mm, se administran 250 |ig de hCG recombinante (coriogonadotropina alfa, OVITRELLE, Merck Serono / EMD Serono). Si hay 25-35 folículos con un diámetro > 12 mm, se administran 0,2 mg de agonista de GnRH (acetato de triptorelina, DECAPEPTYL / GONAPEPTYL, Ferring Pharmaceuticals). En caso de respuesta ovárica excesiva, definida como > 35 folículos con un diámetro > 12 mm, se cancela el tratamiento. En caso de escasa respuesta ovárica, definida como < 3 folículos con un diámetro > 10 mm observados en el día de estimulación 10, podría cancelarse el ciclo.
La recuperación de ovocitos tiene lugar 36 h (+ 2 h) tras la inducción de la maduración folicular final y se inseminan los ovocitos mediante IVF y/o ICSI. Se evalúan la fecundación y el desarrollo de embriones desde la recuperación de ovocitos hasta el día de la transferencia. Para sujetos que se sometieron a inducción de la maduración folicular final con hCG, se transfirió un blastocisto de la mejor calidad disponible en el día 5 tras la recuperación de ovocitos mientras que se congelan los blastocistos restantes. Para sujetos que se someten a inducción de la maduración folicular final con agonista de GnRH, no tuvo lugar una transferencia de embriones en el nuevo ciclo y en su lugar se congelan los blastocistos en el día 5. Se proporcionan óvulos vaginales de progesterona (LUTINUS, Ferring Pharmaceuticals) 100 mg 3 veces al día para el soporte de la fase lútea desde el día tras la recuperación de ovocitos hasta el día de la visita de embarazo clínico. Se realiza una prueba de phCG 13-15 días tras la transferencia de embriones y se confirmará el embarazo clínico mediante ecografía transvaginal (TVU) 5-6 semanas tras la transferencia de embriones.
Resultados
En la siguiente tabla, se muestra el número de ovocitos recuperados (criterio de valoración principal).
Tabla 2
FE 999049 GONAL-F
5,2 |ig 6,9 |ig 8,6 |ig 10,3 |ig 12,1 |ig 11,3 (11) |ig
Ovocitos
recuperados
Todos 5,2 (3,3) 7,9 (5,9) 9,2 (4,6) 10,6 (7,0) 12,2 (5,9) 10,4 (5,2)
Alto nivel de AMH 5,9 (3,9) 9,1 (6,4) 10,6 (4,8) 13,6 (7,8) 14,4 (5,8) 12,4 (5,4)
Bajo nivel de AMH 4,5 (2,2) 6,3 (4,9) 7,4 (3,8) 6,9 (3,6) 9,4 (4,9) 7,8 (3,4) Los datos son la media (D.E.)
Se cumplió el objeto primario: se estableció una relación dosis-respuesta significativa para FE 999049 con respecto al número de ovocitos recuperados. Se observó este hallazgo no solo para la población de ensayo global, sino también para cada uno de los dos estratos de AMH usados en la aleatorización.
Se demostró una relación dosis-respuesta significativa para FE 999049 para todos los parámetros farmacodinámicos objetivo clave, por ejemplo estradiol, inhibina B e inhibina A. A un nivel de dosis de microgramos similar, las respuestas farmacodinámicas con FE 999049 fueron mayores que con GONAL-F (no se muestran estos resultados).
Las concentraciones de FSH en suero tras la exposición a FE 999049 fueron significativamente mayores que para GONAL-F. Los resultados confirman que el perfil PK de FE 999049 difiere del de GONAL-F. Las tasas de fecundación, el desarrollo de blastocistos y las tasas de embarazos en pacientes sometidas a IVF/ICSI tratadas con FE 999049 estuvieron dentro de las expectativas.
No hubo problemas de seguridad con el uso de FE 999049. Se documentó una buena tolerancia local.
Análisis adicional
Los solicitantes han analizado además los datos para identificar la o las dosis de FE 999049 que cumplen con los siguientes criterios con respecto al número de ovocitos recuperados:
• Ovocitos recuperados en el intervalo de 8-14
• Minimizan la proporción de pacientes con < 8 ovocitos
• Minimizan la proporción de pacientes con > 20 ovocitos
Los solicitantes también investigaron el impacto del peso corporal. Si es relevante, se convierte la dosis en |ig/kg para un sujeto medio. Se evalúan este valor de |ig/kg y 0,01 |ig/kg en un modelo con respecto a la distribución de ovocitos recuperados así como al perfil de seguridad, y se identifica la dosis óptima.
Estratos con bajo nivel de AMH
Tal como se observa en la tabla 2, la dosis de FE999049 que cumplió con el primer criterio (ovocitos recuperados en el intervalo de 8-14) fue de 12,1 |ig (media de 9,4 ovocitos recuperados). La distribución de ovocitos se muestra en la tabla 3 a continuación.
Tabla 3
Los datos son el % de sujetos
Tal como se muestra mediante el recuadro y la flecha, una dosis de 12,1 |ig de FE999049 proporciona la recuperación del número de ovocitos más deseable en el 60 % de los sujetos en el grupo con bajo nivel de AMH. Esto es una mejora notable con respecto a Gonal-F (el número de ovocitos más deseable solo en el 33 % de los sujetos).
La tabla 4 a continuación muestra el análisis de signos de respuesta excesiva en los estratos con bajo nivel de AMH (los datos son el número de sujetos). Puede observarse que no hubo indicaciones de OHSS temprano de naturaleza moderada o intensa y no hubo incidencias que requirieran acción preventiva; no hay problemas asociados con la dosis de 12,1 |ig de FE999049 en una paciente que tiene bajo nivel de AMH.
Tabla 4
La Figura 7 muestra el efecto del peso corporal sobre los ovocitos recuperados (para los estratos con bajo nivel de AMH), para las diversas dosis. Las flechas indican el número de ovocitos recuperados de sujetos de peso corporal entre 45 kg y 90 kg tratados a la dosis de 12,1 |ig. Tal como puede observarse (recuadro de texto) la variación entre pacientes de peso corporal de 45 kg y las de 90 kg es menor de aproximadamente 0,5 ovocitos; en otras palabras, no se requiere una dosificación según el peso corporal en pacientes con bajo nivel de AMH cuando la dosis de FE999049 es de al menos 12 |ig, porque no existe una variación significativa en los ovocitos recuperados con el peso corporal, a esta dosis.
Por tanto, los solicitantes han encontrado que una dosis, o dosis equivalente a, de 11 a 13 |ig, por ejemplo de 12 |ig,
de FSH recombinante derivada de ser humano es adecuada para su uso en el tratamiento de la esterilidad en una paciente que tiene un nivel de AMH en suero <15 pmol/l, por ejemplo de 0,05-14,9 pmol/l por ejemplo de 5,0 14,9 pmol/l. La dosis proporciona una respuesta eficaz a la vez que se minimiza el riesgo de desarrollar OHSS.
Estratos de alto AMH
Tal como se observa en la tabla 2, tres doses de FE999049 cumplieron con el primer criterio (ovocitos recuperados en el intervalo de 8-14): 6,9 ug (media de 9,1 ovocitos recuperados), 8,6 ug (media de 10,6 ovocitos recuperados) y 10,3 ug (media de 13,6 ovocitos recuperados).
La Figura 8 muestra el efecto del peso corporal sobre los ovocitos recuperados (para los estratos con alto nivel de AMH), para las diversas dosis. Las flechas indican el número de ovocitos recuperados de sujetos de peso corporal entre 45 kg y 90 kg tratados a las dosis de 6,9 ug, 8,6 ug y 10,3 ug. Tal como puede observarse (recuadros de texto) la variación es significativa: para la dosis de 6,9 ug, se recuperarán 6 ovocitos adicionales de una paciente de 45 kg en comparación con una paciente de 90 kg; para la dosis de 8,6 ug, se recuperarán 4 ovocitos adicionales de una paciente de 45 kg en comparación con una paciente de 90 kg; y para la dosis de 10,1 ug, se recuperarán 2,5 ovocitos adicionales de una paciente de 45 kg en comparación con una paciente de 90 kg. En otras palabras, una dosificación según el peso corporal tiene un impacto en pacientes con alto nivel de AMH cuando la dosis de FE999049 es menor de 12 ug, porque existe una variación significativa en los ovocitos recuperados con el peso corporal, a estas dosis.
La tabla 5a a continuación muestra un desglose adicional de los ovocitos recuperados (de la tabla 2) según el nivel de AMH. Esto muestra las dosis que cumplieron con el primer criterio (ovocitos recuperados en el intervalo de 8-14) para cada subestrato de nivel de a Mh (recuadros).
Tabla 5a
La tabla 5b a continuación muestra el análisis de pacientes en las que se canceló tratamiento debido a o bien respuesta excesiva o bien inducción con agonista, para estos subgrupos. Por ejemplo, se canceló el tratamiento a una paciente en el estrato de nivel de AMH de 25-34 pmol/l debido a respuesta excesiva tras la dosis de 10,3 ug y se canceló el tratamiento a una paciente en el estrato de nivel de AMH de 25-34 pmol/l debido a respuesta excesiva tras la dosis de 12,1 ug; se canceló el tratamiento a una paciente en el estrato de nivel de AMH de 35-45 pmol/l tras inducción con agonista tras la dosis de 10,3 ug; y se canceló el tratamiento a una paciente en el estrato de nivel de AMH de 35-45 pmol/l tras inducción con agonista tras la dosis de 6,9 ug.
Tabla 5b
Puede observarse por tanto que sería útil el ajuste a medida de la dosis según el peso corporal (Figura 8) y el nivel de
AMH en los estratos con alto nivel de AMH, para minimizar las cancelaciones y maximizar la recuperación de ovocitos.
Los solicitantes han descubierto que las siguientes dosis proporcionan una respuesta eficaz a la vez que se minimiza el riesgo de desarrollar OHSS (kg es kg de peso corporal de paciente).
Las siguientes son apropiadas si no se desea una dosificación según el peso corporal.
Las siguientes son apropiadas si se requieren menos categorías de nivel de AMH.
Las siguientes son apropiadas si no se desea una dosificación según el peso corporal.
Por tanto, los solicitantes han encontrado que una dosis, o dosis equivalente a, de 9 a 14 |ig, por ejemplo de 12 |ig, de FSH recombinante derivada de ser humano es adecuada para su uso en el tratamiento de la esterilidad en una paciente que tiene un nivel de AMH en suero <15 pmol/l, por ejemplo de 0,05-14,9 pmol/l por ejemplo de 5,0 14,9 pmol/l. La dosis proporciona una respuesta eficaz a la vez que se minimiza el riesgo de desarrollar OHSS.
Los solicitantes han descubierto que una dosis diaria de 0,09 a 0,19 |ig de FSH recombinante derivada de ser humano por kg de peso corporal de la paciente es adecuada para su uso en el tratamiento de la esterilidad en una paciente que tiene un nivel de AMH en suero de >15 pmol/l. Los solicitantes han descubierto que una dosis diaria de 0,14 a 0,19 |ig de FSH recombinante derivada de ser humano (preferentemente de 0,15 a 0,16 |ig de FSH recombinante derivada de ser humano) por kg de peso corporal de la paciente es adecuada para su uso en el tratamiento de la esterilidad en una paciente que tiene un nivel de AMH en suero de 15 a 24,9 pmol/l. Los solicitantes han descubierto
que una dosis diaria de 0,11 a 0,14 |ig de FSH recombinante derivada de ser humano (preferentemente de 0,12 a 0,13 |ig de FSH recombinante derivada de ser humano) por kg de peso corporal de la paciente es adecuada para su uso en el tratamiento de la esterilidad en una paciente que tiene un nivel de AMH en suero de 25 a 34,9 pmol/l. Los solicitantes han descubierto que una dosis diaria de 0,10 a 0,11 |ig de FSH recombinante derivada de ser humano por kg de peso corporal de la paciente es adecuada para su uso en el tratamiento de la esterilidad en una paciente que tiene un nivel de AMH en suero de > 35 pmol/l. Estas dosis proporcionan una respuesta eficaz a la vez que se minimiza el riesgo de desarrollar OHSS.
Ejemplo 10 A - Protocolo de COS individualizado (bajo nivel de AMH)
Las pacientes seleccionadas están a punto de someterse a COS para fecundación in vitro (IVF) / inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) mediante métodos conocidos en la técnica. El protocolo previo al tratamiento incluye evaluación/examen del nivel de AMH en suero de la paciente usando el kit de ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas AMH Gen-II (Beckman Coulter, Inc., Webster, Tejas). Este ensayo puede detectar concentraciones de AMH mayores de 0,57 pmol/l con un límite de cuantificación mínimo de 1,1 pmol/l. Puede medirse el nivel de AMH usando otros kits de ensayo (por ejemplo, disponibles de Roche).
El protocolo de COS avanza de la manera habitual aparte de la administración de la dosis inicial de FE 999049 según el nivel de AMH en la selección. A una paciente con un nivel de AMH de <14,9 pmol/l se le administraría una dosis diaria inicial de aproximadamente 12 |ig de FE 999049, un producto de FSH recombinante derivada de ser humano fabricado según el método del ejemplo 6. Una paciente con un nivel de AMH de 15 a 24,9 pmol/l recibiría una dosis diaria inicial de 0,15 a 0,19 |ig de la FSH recombinante derivada de ser humano por kg de peso corporal de la paciente. Una paciente con un nivel de AMH de 25 a 34,9 pmol/l recibiría una dosis diaria inicial de 0,11 a 0,13 |ig de la FSH recombinante derivada de ser humano por kg de peso corporal de la paciente. Una paciente con un nivel de AMH de > 35 pmol/l recibiría una dosis diaria inicial de 0,10 a 0,11 |ig de la FSH recombinante derivada de ser humano por kg de peso corporal de la paciente.
Ejemplo 11 - Protocolos de COS individualizados.
Las dosis en este protocolo se prefieren menos que las del ejemplo 10A.
Las pacientes seleccionadas están a punto de someterse a COS para fecundación in vitro (IVF) / inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) mediante métodos conocidos en la técnica. El protocolo previo al tratamiento incluye evaluación/examen del nivel de AMH en suero de la paciente usando el kit de ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas AMH Gen-II (Beckman Coulter, Inc., Webster, Tejas). Este ensayo puede detectar concentraciones de AMH mayores de 0,57 pmol/l con un límite de cuantificación mínimo de 1,1 pmol/l.
El protocolo de COS avanza de la manera habitual aparte de la administración de la dosis inicial de FE 999049 según el nivel de AMH en la selección en línea con la siguiente tabla. Por tanto, a una paciente con un nivel de AMH de 5 14,8 pmol/l se le administrarían 180 UI de FSH en forma de aproximadamente 8-11 |ig de FE 999049, un producto de FSH recombinante derivada de ser humano fabricado según el método del ejemplo 6. A una paciente con un nivel de AMH de 30-44,9 pmol/l se le administrarían 120 UI de FSH en forma de aproximadamente 4-7 |ig de FE 999049, un producto de FSH recombinante derivada de ser humano fabricado según el método del ejemplo 6. Si el nivel de AMH no está disponible, a la paciente recombinante se le administrarían 120-180 UI de FSH en forma de aproximadamente 6-11 |ig de FE 999049, un producto de FSH recombinante derivada de ser humano fabricado según el método del Ejemplo 6.
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SEQ ID NO: 1
Polipéptido de hormona estimulante del folículo alfa
Número de registro AH007338
Secuencia de nucleótidos de FSH alfa
Secuencia de proteína de FSH alfa (SEQ ID NO: 5)
SEQ ID NO: 2
Polipéptido de hormona estimulante del folículo beta
Número de registro NM_000510
Secuencia de nucleótidos de FSH beta
Secuencia de proteína de FSH beta (SEQ ID NO: 6)
1 MKTLQFFFLF CCWKAICCNS CELTNITIAI EKEECRFCIS INTTWCAGYC YTRDLVYKDP
61 ARPKIQKTCT FKELVYETVR VPGCAHHADS LYTYPVATQC HCGKCDSDST DCTVRGLGPS 121 YCSFGEMKE
SEQ ID NO: 3
Beta-galactósido alfa-2,3-sialiltransferasa 4
Número de registro L23767
Secuencia de nucleótidos de ST3GAL4
Secuencia de proteína de ST3GAL4 (SEQ ID NO: 7)
SEQ ID NO: 4
Beta-galactosamida alfa-2,6-sialiltransferasa 1
Número de registro NM_003032
Secuencia de nucleótidos de ST6GAL1
Claims (4)
1. Un producto que comprende hormona estimulante del folículo (FSH) recombinante derivada de línea celular humana para su uso en el tratamiento de la esterilidad en una paciente que tiene un nivel de AMH en suero de > 15 pmol/l, en el que el producto va a administrarse con una dosis diaria de 0,09 a 0,19 |ig de FSH recombinante derivada de línea celular humana por kilogramo de peso corporal de la paciente; en el que el tratamiento de la esterilidad comprende una etapa de determinación del nivel de AMH en suero de la paciente, y una etapa de administración de la dosis a una paciente que tiene el nivel de AMH en suero definido.
2. Un producto para su uso según la reivindicación 1 en el que la FSH recombinante derivada de la línea celular humana incluye a2,3- y a2,6-sialilación.
3. Un producto para su uso según cualquier reivindicación anterior en el que la FSH recombinante derivada de la línea celular humana incluye a2,3- y a2,6-sialilación, en el que del 1 % al 99 % de la sialilación total es a2,3-sialilación, y del 1 % al 99 % de la sialilación total es a2,6-sialilación.
4. Un producto que comprende hormona estimulante del folículo (FSH) recombinante derivada de la línea celular humana para su uso en el tratamiento de la esterilidad según cualquier reivindicación anterior, en el que el producto comprende además una sal que comprende un catión de metal alcalino farmacéuticamente aceptable seleccionada del grupo que consiste en sales de Na+ o K+, o una combinación de las mismas.
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