ES2704855T3

ES2704855T3 - Moléculas de oligonucleótido de doble cadena para p53 y métodos de uso de las mismas

Info

Publication number: ES2704855T3
Application number: ES13776599T
Authority: ES
Inventors: Elena Feinstein; Sharon Avkin-Nachum; Hagar Kalinski; Igor Mett
Original assignee: Quark Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Quark Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2012-09-12
Filing date: 2013-09-12
Publication date: 2019-03-20
Anticipated expiration: 2033-09-12
Also published as: US20190040385A1; EP2895608A1; AU2013315524B2; DK2895608T3; EP2895608B1; US10781449B2; AU2013315524A1; WO2014043292A1

Abstract

Una molécula de ácido nucleico de doble cadena que comprende una cadena sentido y una cadena antisentido, teniendo la molécula la estructura:**Fórmula** en la que cada uno de A, C, G, U es independientemente un ribonucleótido no modificado, un ribonucleótido modificado, un desoxirribonucleótido no modificado, un desoxirribonucleótido modificado, o un resto no convencional seleccionado del grupo que consiste en un nucleótido especular, un ácido nucleico de treosa (TNA), un análogo del nucleótido pirazolotriazina (PT) y un ribonucleótido unido a un ribonucleótido adyacente mediante un enlace de fosfato internucleótido 2'-5'; en la que cada "|" representa el emparejamiento de bases entre la cadena antisentido y la cadena sentido correspondiente; en la que cada uno de Z y Z' está independientemente presente o ausente, pero si está presente, es independientemente 1-5 nucleótidos consecutivos, 1-5 análogos de nucleótidos consecutivos o 1-5 restos no nucleotídicos consecutivos o una combinación de los mismos, o un resto conjugado, covalentemente unido en el terminal 3' de la cadena en la que está presente; en la que z" puede estar presente o ausente, pero si está presente es un resto de protección, o un resto conjugado unido covalentemente en el terminal 5' de la cadena sentido; y en la que la secuencia de la cadena sentido es complementaria a la secuencia de la cadena antisentido; con la condición de que cada nucleótido no sea un desoxirribonucleótido; o una sal farmacéuticamente aceptable de dicha molécula.

Description

DESCRIPCIÓN

Moléculas de oligonucleótido de doble cadena para p53 y métodos de uso de las mismas

Campo técnico de la invención

La presente divulgación se refiere a moléculas de ácido nucleico, composiciones farmacéuticas que comprenden las mismas y métodos de uso de las mismas para subregulación de un gen p53. Los compuestos y composiciones divulgados en el presente documento son útiles para tratar a un sujeto que padece o está en riesgo de desarrollar una enfermedad o un trastorno asociado con una expresión del gen p53. Ejemplos de tales enfermedades/trastornos incluyen, sin limitarse a, lesión por isquemia-reperfusión, una deficiencia auditiva, un trastorno auditivo, una alteración del equilibrio, una pérdida auditiva, alopecia inducida por quimioterapia (pérdida de cabello), alopecia inducida por radioterapia, insuficiencia renal aguda, una lesión renal aguda, una enfermedad renal crónica (CKD), un efecto secundario asociado con la terapia contra el cáncer, una función retardada del injerto (DGF) en un paciente de trasplante de riñón, una lesión de la médula espinal, una lesión cerebral, una convulsión, un accidente cerebrovascular, un trastorno neurodegenerativo, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, un tumor, una quemadura, una herida, hipertermia, hipoxia, isquemia, trasplante de órganos, infarto de miocardio/ataque cardíaco, cardiotoxicidad e insuficiencia hepática aguda.

Antecedentes de la invención

ARNpi y ARN de interferencia

El ARN de interferencia (ARNi) es un fenómeno que involucra el silenciamiento postranscripcional específico del gen dependiente de ARN de doble cadena (dc).

La solicitud de patente de Estados Unidos No. 13/508.493, las publicaciones de las solicitudes de patente de Estados Unidos Nos. 20060069056, 20100029746, 20100222409, 20110142917, 20120184597, 20120141378 y las patentes de Estados Unidos Nos. 7.825.099, 7.842.674, 7.910.566, 8.148.342, todas para el cesionario de la presente solicitud, relacionadas con compuestos de ARN de doble cadena y composiciones útiles en la subregulación de un gen p53 y con el uso de tales compuestos y composiciones para tratar a un paciente que padece o está en riesgo de desarrollar una enfermedad o un trastorno asociado con la expresión del gen p53.

Las patentes de Estados Unidos Nos. 6.982.277, 7.008.956, 7.012.087, asignadas a la Junta de Síndicos de la Universidad de Illinois, se refieren a un método para inhibir reversiblemente p53 durante un tiempo suficiente para permitir que las células normales en un huésped se recuperen de un evento inductor de estrés que afecta las células, a método para reducir la pérdida de cabello asociado con una terapia contra el cáncer que comprende administrar una dosis terapéuticamente eficaz de un inhibidor de p53 reversible a un mamífero que lo necesite junto con la terapia contra el cáncer; y a un método para reducir la muerte celular en un mamífero atribuible a un evento que induce estrés en un sistema nervioso central que afecta a la célula, comprendiendo dicho método administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor temporal de p53 para inhibir reversiblemente la actividad de p53.

Las publicaciones de las solicitudes de patente de los Estados Unidos Nos. 2010/0292301 y 2011/0112168, y las publicaciones de patente PCT Nos. WO 2011/066475, WO 2011/084193, WO 2011/085056 y WO 2012/078536 para el cesionario de la presente invención divulgan secuencias de ácido nucleico y modificaciones útiles en la generación de moléculas de ARNdc.

Las publicaciones de las solicitudes de patente de Estados Unidos Nos. 2011/0142917, 2011/0229557 y 2012/0141378 para el cesionario de la presente invención divulgan composiciones y métodos de uso de compuestos de ARN de doble cadena que se dirigen a un gen p53.

El documento WO 2010/080452 A2 se refiere a inhibidores de oligonucleótidos de doble cadena de genes objetivo, composiciones farmacéuticas que comprenden los mismos y el uso de tales moléculas para tratar, entre otros, trastornos neurodegenerativos que incluyen enfermedad de Alzheimer y esclerosis lateral amiotrófica, enfermedades oculares que incluyen glaucoma e ION, insuficiencia renal aguda, pérdida de audición, síndrome de dificultad respiratoria aguda y en la prevención o el tratamiento de la lesión por isquemia-reperfusión en pacientes con trasplante de órganos.

El documento WO 00/24885 A2 se refiere a oligonucleótidos antisentido útiles para tratar un estado de enfermedad caracterizado por la inducción de p53, tal como trastornos de células proliferativas, por ejemplo cáncer, o un estado hipóxico inducido por un ataque isquémico, tal como un derrame cerebral.

Moléculas, composiciones, métodos y kits útiles para tratar o atenuar una afección, una enfermedad o un trastorno asociado con la expresión de un gen p53 y que presentan al menos uno entre mayor biodisponibilidad, mejor biodistribución, mayor tiempo de circulación en suero, mayor estabilidad en suero, menor eliminación del suero, captación celular mejorada, actividad reducida fuera de la diana, inmunogenicidad reducida, liberación endosomal mejorada, suministro específico mejorado al tejido o célula objetivo y se requiere mayor actividad de desactivación en comparación con las contrapartes de ARNdc no modificadas.

Sumario de la invención

La materia objeto de la presente invención es una molécula de ácido nucleico de doble cadena o una sal farmacéuticamente aceptable de dicha molécula como se define en la reivindicación 1. Las reivindicaciones dependientes se refieren a realizaciones particulares de la misma.

La molécula de ácido nucleico de doble cadena según la presente invención comprende una cadena sentido y una cadena antisentido, teniendo la molécula la estructura:

<A) 5 r z"-GGGCCUGACUCAGACt)GAU - 2 ' 3 f|cadenasentido ; SEO ID NO: 19)

3 r Z-CCCGGACUGAGUCUGACUA 5'lcadena antisentido; SEQ ID NO: 32)

en la que cada uno de A, C, G, U es independientemente un ribonucleótido no modificado, un ribonucleótido modificado, un desoxirribonucleótido no modificado, un desoxirribonucleótido modificado, o un resto no convencional seleccionado del grupo que consiste en un nucleótido especular, un ácido nucleico de treosa (TNA), un análogo del nucleótido pirazolotriazina (PT) y un ribonucleótido unido a un ribonucleótido adyacente mediante un enlace de fosfato internucleótido 2'-5';

en la que cada "|" representa el emparejamiento de bases entre la cadena antisentido y la cadena sentido correspondiente;

en la que cada uno de Z y Z' está independientemente presente o ausente, pero si está presente, es independientemente 1-5 nucleótidos consecutivos, 1-5 análogos de nucleótidos consecutivos o 1-5 restos no nucleotídicos consecutivos o una combinación de los mismos, o un resto conjugado, covalentemente unido en el terminal 3' de la cadena en la que está presente;

en la que z” puede estar presente o ausente, pero si está presente es un resto de protección, o un resto conjugado unido covalentemente en el terminal 5' de la cadena sentido; y

en la que la secuencia de la cadena sentido es complementaria a la secuencia de la cadena antisentido; con la condición de que cada nucleótido no sea un desoxirribonucleótido.

Un objeto adicional de la presente invención es una composición como se define en la reivindicación 10.

Un objeto adicional de la presente invención es el uso de la molécula de ácido nucleico de doble cadena según la presente invención o sal farmacéuticamente aceptable de dicha molécula, o de la composición según la presente invención como se define en las reivindicaciones 11 a 15.

Las moléculas de ácido nucleico para subregular la expresión del gen p53, las composiciones y los kits que comprenden los mismos y los métodos de uso de los mismos se proporcionan en el presente documento. Las composiciones, métodos y kits pueden involucrar el uso de moléculas de ácido nucleico (por ejemplo, ácido nucleico de interferencia corta (ANic), a Rn corto de interferencia (ARNpi), ARN de doble cadena (ARNdc), micro ARN (miARN) o ARN de horquilla corta (ARNhc)) que se unen a una secuencia de nucleótidos (tal como una secuencia de ARNm) o una porción de la misma, que codifica p53, por ejemplo, la secuencia de codificación de ARNm (SEQ ID NO: 1-7 en las Figuras 1-7) para p53 humano, que codifica una o más proteínas o subunidades de proteínas. En ciertos ejemplos preferidos, las moléculas, composiciones, métodos y kits divulgados en el presente documento subregulan o inhiben la expresión del gen p53. En varios ejemplos, la molécula de ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste en un compuesto de ARNdc no modificado o modificado químicamente, tal como un ARNpi o ARNhc que subregula la expresión de un gen p53.

En algunos ejemplos, la molécula de ácido nucleico es un compuesto de ARN de doble cadena (ARNdc) no modificado sintético que subregula la expresión de p53.

En algunos ejemplos preferidos, la molécula de ácido nucleico es un compuesto de ARN de doble cadena (ARNdc) químicamente modificado, sintético que subregula la expresión de p53. En ciertas realizaciones preferidas, "p53" se refiere a un gen p53 humano. En ciertas realizaciones preferidas, "gen objetivo" se refiere a un gen p53 humano.

Las moléculas de ácido nucleico químicamente modificadas y las composiciones proporcionadas en el presente documento exhiben propiedades beneficiosas, que incluyen al menos una entre mayor estabilidad en suero, captación celular mejorada, actividad reducida fuera de la diana, inmunogenicidad reducida, liberación endosomal mejorada, suministro específico mejorado al tejido o célula objetivo y mayor actividad de desactivación/subregulación cuando se compara con las correspondientes moléculas de ácido nucleico no modificadas.

En el presente documento se divulgan adicionalmente métodos para tratar o prevenir la incidencia o gravedad de un trastorno, enfermedad, lesión o afección en un sujeto que lo necesite, en el que la enfermedad o afección y/o un síntoma o patología asociada con el mismo se asocia con la expresión del gen p53. En algunas realizaciones, tal trastorno, enfermedad, lesión, condición o patología, se selecciona de un grupo que comprende un trastorno, enfermedad, lesión, condición o patología del oído interno; un trastorno, enfermedad, lesión, condición o patología del riñón; un trastorno, enfermedad, lesión, afección o patología del sistema nervioso central (CNS); un trastorno, enfermedad, lesión, afección o patología del corazón; un trastorno, enfermedad, lesión, afección o patología del hígado; un trastorno, enfermedad, lesión, condición o patología del corazón; un trastorno, enfermedad, lesión, afección o patología que afecta a un paciente de trasplante de órganos; un trastorno, enfermedad, lesión, afección o patología que experimenta un paciente que se somete a un tratamiento anticanceroso. En algunas realizaciones, tal trastorno, enfermedad, lesión, afección o patología, se selecciona de un grupo que comprende lesión por isquemia-reperfusión, una deficiencia auditiva, un trastorno de la audición, una alteración del equilibrio, una pérdida auditiva, alopecia inducida por quimioterapia, alopecia inducida por radioterapia, insuficiencia renal aguda, una lesión renal aguda, una enfermedad renal crónica (CKD), un efecto secundario asociado con la terapia anticancerosa, una función retardada del injerto (DGF) en un paciente de trasplante de riñón, una lesión de la médula espinal, una lesión cerebral, una convulsión, un accidente cerebrovascular, un trastorno neurodegenerativo, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, un tumor, una quemadura, una herida, hipertermia, hipoxia, isquemia, trasplante de órganos, infarto de miocardio/ataque cardíaco, cardiotoxicidad e insuficiencia hepática aguda.

En ejemplos particulares, se proporcionan en el presente documento compuestos de ARNdc químicamente modificados que se dirigen a p53, composiciones y kits que comprenden los mismos y los métodos de uso de los mismos en el tratamiento de una afección o patología que implica apoptosis, que es la muerte apoptótica (programada) de células. Otras afecciones a tratar incluyen cualquier afección en la que la expresión de p53 sea perjudicial, y se traten con los compuestos y composiciones proporcionados en el presente documento.

En un aspecto, se proporcionan en este documento secuencias de oligonucleótidos (SEQ ID NO: 8-33) útiles para la generación de compuestos de ácido nucleico que se dirigen y subregulan al gen p53.

En otro aspecto, se proporcionan compuestos de ácido nucleico que se dirigen y subregulan el gen p53, o sales farmacéuticamente aceptables de tales compuestos. En algunos ejemplos preferidos, las moléculas de ácido nucleico divulgadas en el presente documento tienen una estructura de doble cadena. En algunos ejemplos, los compuestos de ácido nucleico tienen una estructura de doble cadena y cada una de las cadenas comprende una secuencia de oligonucleótidos seleccionada de las secuencias expuestas en la Tabla 1 a continuación (SEQ ID NO: 8-33). En algunos ejemplos, de los compuestos de ácido nucleico que tienen una estructura de doble cadena, la secuencia de oligonucleótidos de una de las cadenas se selecciona de una de las SEQ ID NOS: 8-20 y la secuencia de oligonucleótidos de la otra cadena se selecciona de una de las SEQ ID NOS: 21-33.

En algunos ejemplos, se proporcionan moléculas de ácido nucleico, o sales farmacéuticamente aceptables de dichas moléculas, que tienen una estructura de doble cadena en la que (a) la molécula de ácido nucleico es un dúplex que incluye una cadena sentido y una cadena antisentido complementaria; (b) cada cadena de la molécula de ácido nucleico tiene 19 nucleótidos de longitud; (c) una secuencia de 19 nucleótidos de la cadena antisentido es complementaria a una secuencia consecutiva de un ARNm que codifica p53 de mamífero (por ejemplo, SEQ ID NO: 1-7) o una porción de la misma; y (d) la cadena sentido y la cadena antisentido se seleccionan de las secuencias de oligonucleótidos expuestas en la Tabla 1 a continuación (SEQ ID NO: 8-33).

Tabla 1. Secuencias seleccionadas de oligonucleótidos de cadena sentido y cadena antisentido para compuestos de ácido nucleico dirigidos a p53

En otro ejemplo, se proporcionan compuestos de ácido nucleico (por ejemplo, moléculas de ARNdc), o sales farmacéuticamente aceptables de tales compuestos, en las que (a) la molécula de ácido nucleico es un dúplex que incluye una cadena sentido y una cadena antisentido complementaria; (b) cada cadena de la molécula de ácido nucleico tiene 19 nucleótidos de longitud; (c) una secuencia de 19 nucleótidos de la cadena antisentido es complementaria a una secuencia consecutiva de un ARNm que codifica p53 de mamífero (por ejemplo, SEQ ID NO: 1-7) o parte del mismo; y (d) la cadena sentido y la cadena antisentido comprenden pares de secuencias expuestas en la Tabla 2 a continuación.

Tabla 2. Pares seleccionados de cadenas sentido y antisentido para generar compuestos de ácido nucleico de doble cadena dirigidos a p53

En los ejemplos preferidos, de la molécula de ácido nucleico de doble cadena divulgada en el presente documento, la cadena sentido y la cadena antisentido se seleccionan del grupo que consiste en una cadena sentido SEQ ID NO: 16 y una cadena sentido SEQ ID NO: 29, y una cadena sentido SEQ ID NO: 19 y una cadena antisentido SEQ ID NO: 28.

Las moléculas de ácido nucleico proporcionadas en el presente documento son preferiblemente moléculas de ácido nucleico de cadena doble que poseen modificaciones, que pueden aumentar la actividad, aumentar la estabilidad y/o minimizar la toxicidad cuando se comparan con el correspondiente compuesto de ARNdc no modificado. Estas moléculas, cuando se mezclan con un vehículo farmacéutico que efectúa el suministro del ácido nucleico al órgano objetivo, proporcionan compuestos terapéuticos eficaces, seguros y compatibles con el paciente útiles en el tratamiento de una variedad de trastornos asociados con el gen p53. Los compuestos de ácido nucleico están diseñados para subregular la expresión del gen p53 y atenuar la función del gen p53. En diversas formas de realización, el gen p53 es un gen p53 humano transcrito en uno cualquiera de los polinucleótidos de ARNm expuestos en las SEQ ID NOS: 1-7.

La materia objeto de la presente invención es una molécula de ácido nucleico de doble cadena que comprende una cadena sentido y una cadena antisentido, teniendo la molécula la estructura:

(A) 5’ z"-GGGCCUGACUCAGACUGAU-Z’ 3'(cadena sentido; SEQ ID NO: 19)

3' Z-C iC mCG iG iA iC i iU mGAG i iU iC iU iG iA !CUA 5’(cadena antisentido; SEQ ID NO:32)

en la que cada uno de A, C, G, U es independientemente un ribonucleótido no modificado, un ribonucleótido modificado, un desoxirribonucleótido no modificado, un desoxirribonucleótido modificado, o un resto no convencional seleccionado del grupo que consiste en un nucleótido especular, un ácido nucleico especular (TNA), un análogo del nucleótido pirazolotriazina (PT) y un ribonucleótido unidos a un ribonucleótido adyacente por un enlace de fosfato internucleótido 2'-5';

en la que cada "|" representa el emparejamiento de bases entre la cadena antisentido y la correspondiente cadena sentido;

en la que cada uno de Z y Z' está independientemente presente o ausente, pero si está presente es independientemente de 1-5 nucleótidos consecutivos, 1-5 análogos de nucleótidos consecutivos o 1-5 restos no nucleotídicos consecutivos o una combinación de los mismos, o un resto conjugado, covalentemente unido en el terminal 3' de la cadena en la que está presente;

en la que z” puede estar presente o ausente, pero si está presente es un resto de protección, o un resto conjugado está unido de manera covalente en el terminal 5' de la cadena sentido; y

en la que la secuencia de la cadena sentido es complementaria a la secuencia de la cadena antisentido; con la condición de que ninguno de cada uno de N y N' es un resto no convencional.

En los ejemplos preferidos de compuestos divulgados, la cadena sentido y la cadena antisentido se seleccionan del grupo que consiste en una cadena sentido SEQ ID NO: 16 y una cadena antisentido SEQ ID NO: 29, una cadena sentido SEQ ID NO: 19 y una cadena antisentido SEQ ID NO: 32 y una cadena sentido SEQ ID NO: 19 y una cadena antisentido SEQ ID NO: 28.

En diversos ejemplos de compuestos divulgados, el ribonucleótido modificado comprende una modificación en la posición 2' del resto azúcar. En algunos ejemplos preferidos, el ribonucleótido modificado es un ribonucleótido modificado con azúcar 2'-O-metilo.

En varios ejemplos de compuestos divulgados, el resto no convencional se selecciona del grupo que consiste en un nucleótido especular, un desoxirribonucleótido no modificado, un desoxirribonucleótido modificado, un ácido nucleico de treosa (TNA), un análogo de nucleótido y un ribonucleótido unidos a un ribonucleótido adyacente por un enlace de fosfato internucleótido 2'-5' (5' > 3'). En algunos ejemplos preferidos, el análogo de nucleótido es un análogo de nucleótido de pirazolotriazina (PT). En algunos ejemplos preferidos, el resto no convencional de un ribonucleótido se unió a un ribonucleótido adyacente por un enlace de fosfato internucleótido 2'-5' (5' > 3').

En varios ejemplos de compuestos divulgados, tanto Z como Z' están ausentes. En algunos ejemplos, al menos uno de Z o Z' está presente. En algunos ejemplos, tanto Z como Z' están presentes. En algunos ejemplos, tanto Z como Z' están presentes y son 1-5 nucleótidos consecutivos. En algunos ejemplos, tanto Z como Z' están presentes y son 2 nucleótidos consecutivos. En algunos ejemplos, tanto Z como Z' están presentes, Z y Z' son 2 nucleótidos consecutivos, cada nucleótido es un dT, y cada uno de Z y Z' comprende dos nucleótidos consecutivos (dTdT). En algunos ejemplos, tanto Z como Z' están presentes y cada uno de Z y Z' es de 1 a 5 restos no nucleotídicos consecutivos. En algunos ejemplos, tanto Z como Z' están presentes y cada uno de Z y Z' es 1-2 restos no nucleotídicos consecutivos). En algunos ejemplos preferidos, cada resto no nucleotídica es un 1,3-propanodiol, mono(dihidrógeno fosfato) (C3) [CAS RN: 13507-42-1]. En algunos ejemplos preferidos, tanto Z como Z' están presentes, Z es un resto no nucleotídico C3 (C3) y Z' es dos restos no nucleotídicos C3 consecutivos (C3-C3).

En algunos ejemplos de compuestos divulgados, z” está ausente. En algunos ejemplos de compuestos divulgados, z” está presente. En varios ejemplos de compuestos divulgados, z” está presente y se selecciona del grupo que consiste en un resto de ribosa abásica, un resto de desoxirribosa abásica, un resto de ribosa abásica invertida, un resto de desoxirribosa invertida, un resto desoxiabásico invertido (idAb), un resto amino-C6 (AM-c6), C6-amino-Pi, un resto no nucleotídica, un nucleótido especular, un fosfodiéster 5,6,7,8-tetrahidro-2-naftaleno butírico (THNB), una vitamina y un resto farmacológico. En algunos ejemplos, z” está presente y es un resto no nucleotídico de 1,3-propanodiol, mono(dihidrógeno fosfato) (C3).

En algunos ejemplos de compuestos divulgados, el nucleótido en el terminal 3' y en el terminal 5' en cada una de las cadenas antisentido y en la cadena sentido está fosforilado. En algunos ejemplos, el nucleótido en el terminal 3' y en el terminal 5' en cada una de las cadenas antisentido y la cadena sentido está fosforilada. En algunos ejemplos, en cada una de las cadenas antisentido y en la cadena sentido, el ribonucleótido en el terminal 3' está fosforilado y el ribonucleótido en el terminal 5' no está fosforilado. En algunos ejemplos, la cadena sentido está fosforilada o no fosforilada tanto en el terminal 3' como en el terminal 5'. En algunos ejemplos, la cadena antisentido está fosforilada o no fosforilada tanto en el terminal 3' como en el terminal 5'.

De acuerdo con una realización, se proporciona un compuesto de ácido nucleico modificado (9) que tiene una cadena sentido y una cadena antisentido que se exponen a continuación:

5' cap-GGGCCUGACUCAGACUGAU-C3-pi 3' (cadena sentido; SEQ ID NO: 19)

5' AUCAGUcyGAGUCAGGCCC-C3-C33' (cadena antisentido; SEQ ID NO: 32)

en las que cada uno de A, U, G y C es un ribonucleótido no modificado;

en las que cada uno de U y C es un ribonucleótido modificado con azúcar 2'-O-metilo;

en las que c es un ribonucleótido unido a un ribonucleótido adyacente (5' > 3') por un enlace de fosfato internucleótido 2'-5';

en las que en la cadena antisentido y en la cadena sentido, cada ribonucleótido consecutivo se une al siguiente ribonucleótido mediante un enlace fosfodiéster;

en las que la cadena sentido comprende una saliente no nucleotídica 1,3-propanodiol, mono(dihidrogenofosfato) (C3) covalentemente unida en el terminal 3' de la cadena;

en las que la cadena sentido comprende un protector 5' unido covalentemente al terminal 5' de la cadena;

en las que la cadena antisentido comprende una saliente no nucleotídica C3-C3 unida covalentemente en el terminal 3' de la cadena; y

en las que el terminal 3' de la cadena sentido está fosforilado (pi); o

una sal farmacéuticamente aceptable de dicho compuesto.

De acuerdo con una realización de un compuesto de ácido nucleico modificado (9), el protector 5' unido covalentemente en el terminal 5' de la cadena sentido es 1,3-propanodiol, mono(dihidrógeno fosfato) (C3); el ribonucleótido en el terminal 5' de la cadena antisentido está fosforilado (fos) y la saliente en el terminal 3' de la cadena antisentido está fosforilado (-C3-C3-pi)

De acuerdo con una realización, se proporciona un compuesto de ácido nucleico modificado (10) que tiene una cadena sentido y una cadena antisentido que se exponen a continuación:

5' cap-GGGCCUGACUCAGAcugau-C3-pi 3' (cadena sentido; SEQ ID NO: 19)

5' AUCAGUCyGAGUCAGGCCC-C3-C33' (cadena antisentido; SEQ ID NO: 32)

en las que cada uno de A, U, G y C es un ribonucleótido no modificado;

en las que cada uno de a, u, c y g es un ribonucleótido unido a un ribonucleótido adyacente (5' > 3') por un enlace de fosfato internucleótido 2'-5';

en las que la cadena sentido comprende una saliente no nucleotídica de 1,3-propanodiol, mono(dihidrogenofosfato) (C3) unida covalentemente en el terminal 3' de la cadena;

en las que el terminal 3' de la cadena sentido está fosforilado (pi); o

una sal farmacéuticamente aceptable de dicho compuesto.

De acuerdo con una realización, se proporciona un compuesto de ácido nucleico modificado (11) que tiene una cadena sentido y una cadena antisentido que se exponen a continuación:

5' cap-GGGCCUGACUCAGACyGAU-C3-pi 3' (cadena sentido; SEQ ID NO: 19)

5' AUCAGuCyGAGUCAGGCCC-C3-C33' (cadena antisentido; SEQ ID NO: 32)

en las que cada uno de A, U, G y C es un ribonucleótido no modificado;

en las que u es un ribonucleótido unido a un ribonucleótido adyacente (5' > 3') por un enlace de fosfato internucleótido 2'-5';

en las que el terminal 3' de la cadena sentido está fosforilado (pi); o

una sal farmacéuticamente aceptable de dicho compuesto.

De acuerdo con una realización, se proporciona un compuesto de ácido nucleico modificado (12) que tiene una cadena sentido y una cadena antisentido que se exponen a continuación:

5' cap-GGGCCUGACUCAGACyGAU-C3-pi 3' (cadena sentido; SEQ ID NO: 19)

5' AUCAGUcUGAGUCAGGCCC-C3-C33' (cadena antisentido; SEQ ID NO: 32)

en las que cada uno de A, U, G y C es un ribonucleótido no modificado;

en las que la cadena sentido comprende una saliente no nucleotídica de 1,3-propanodiol, mono(dihidrogeno fosfato) (C3) unida covalentemente en el terminal 3' de la cadena;

en el que el terminal 3' de la cadena sentido está fosforilado (pi); o

una sal farmacéuticamente aceptable de dicho compuesto.

De acuerdo con una realización, se proporciona un compuesto de ácido nucleico modificado (13) que tiene una cadena sentido y una cadena antisentido que se exponen a continuación:

5' C3-GGGCCUGACUCAGAcugau-C3-pi 3' (cadena sentido; SEQ ID NO: 19)

5' fos-AUCAGUcUGAGUCAGGCCC-C3-C3-pi 3' (cadena antisentido; SEQ ID NO: 32)

en las que cada uno de A, U, G y C es un ribonucleótido no modificado;

en las que la cadena sentido comprende una saliente no nucleotídica de 1,3-propanodiol, mono(dihidrogenofosfato) (C3) unida covalentemente en el terminal 3' de la cadena y en donde la saliente está fosforilado (C3-pi);

en las que la cadena sentido comprende un protector 5' de C3 unido covalentemente en el terminal 5' de la cadena; en las que la cadena antisentido comprende una saliente no nucleotídica C3-C3 fosforilada (-C3-C3-pi) unida covalentemente en el terminal 3' de la cadena; y

en las que en la cadena antisentido el ribonucleótido en el terminal 5' está fosforilado (fos); o

una sal farmacéuticamente aceptable de dicho compuesto.

De acuerdo con una realización, se proporciona un compuesto de ácido nucleico modificado (14) que tiene una cadena sentido y una cadena antisentido que se exponen a continuación:

5' C3-GGGCCUGACUCAGAcugau-C3-pi 3' (cadena sentido; SEQ ID NO: 19)

5' fos-AU C AGUcUGAGUCAGGGCCC-C3-C3-pi 3' (cadena antisentido; SEQ ID NO: 32)

en las que cada uno de A, U, G y C es un ribonucleótido no modificado;

en las que C es un ribonucleótido modificado con azúcar 2'-O-metilo;

en las que la cadena sentido comprende una saliente no nucleotídica de 1,3-propanodiol, mono(dihidrogenofosfato) (C3) unida covalentemente en el terminal 3' de la cadena y en donde la saliente está fosforilada (C3-pi);

en las que la cadena sentido comprende un protector C35' unido covalentemente en el terminal 5' de la cadena; en las que la cadena antisentido comprende una saliente no nucleotídica C3-C3 fosforilada (-C3-C3-pi) unida covalentemente en el terminal 3' de la cadena; y

en las que en la cadena antisentido el ribonucleótido en el terminal 5'está fosforilado (fos); o

una sal farmacéuticamente aceptable de dicho compuesto.

De acuerdo con una realización, se proporciona un compuesto de ácido nucleico modificado (15) que tiene una cadena sentido y una cadena antisentido que se exponen a continuación:

5' C3-GGGCCUGACUCAGACUGAU-C3-pi 3' (cadena sentido; SEQ ID NO: 19)

5' fos-AUCAGUcUGAGUCAGGGCCC-C3-C3-pi 3' (cadena antisentido; SEQ ID NO: 32)

en las que cada uno de A, U, G y C es un ribonucleótido no modificado;

en las que la cadena sentido comprende una saliente no nucleotídica de 1,3-propanodiol, mono(dihidrogenofosfato) (C3) unida covalentemente en el terminal 3' de la cadena y en las que la saliente está fosforilada (C3-pi);

en las que la cadena sentido comprende un protector C35' unido covalentemente en el terminal 5' de la cadena;

en las que la cadena antisentido comprende una saliente no nucleotídica C3-C3 fosforilada (-C3-C3-pi) unida covalentemente en el terminal 3' de la cadena; y

una sal farmacéuticamente aceptable de dicho compuesto.

De acuerdo con diversas realizaciones del compuesto de ácido nucleico modificado (9), (10), (11) y (12), la saliente no nucleotídica C3-C3 unida covalentemente en el terminal 3' de la cadena antisentido está fosforilada (-C3-C3-pi).

De acuerdo con diversas realizaciones del compuesto de ácido nucleico modificado (9), (10), (11), (12), (13), (14) y (15), el protector 5' se selecciona del grupo que consiste en un resto ribosa abásica, un resto de desoxirribosa abásica, un resto de desoxirribosa invertida, un resto desoxiabásico invertido (idAb), un resto amino-C6 (AM-c6), C6-amino-pi, un resto no nucleotídico, un nucleótido especular, un fosfodiéster 5,6,7,8-tetrahidro-2-naftaleno butírico (THNB) y un resto conjugado. En diversas realizaciones del compuesto de ácido nucleico modificado (9), (10), (11), (12), (13), (14) y (15), el protector 5' es un resto no nucleotídico. En algunas realizaciones del compuesto de ácido nucleico modificado (9), (10), (11), (12), (13), (14) y (15), el resto no nucleotídico del protector 5' es un 1,3-propanodiol, mono(dihidrógeno fosfato) (C3).

De acuerdo con diversas realizaciones del compuesto de ácido nucleico modificado (9), (10), (11), (12), (13), (14) y (15), el ribonucleótido en el terminal 5' de la cadena antisentido está fosforilada (fos).

De acuerdo con diversas realizaciones del compuesto de ácido nucleico modificado (9), (10), (11), (12), (13), (14) y (15), el ribonucleótido en el terminal 5' en la cadena antisentido no es fosforilada ($).

En otro aspecto, se proporcionan composiciones farmacéuticas que incluyen una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, una molécula de ANic) como se describe en el presente documento, o una sal farmacéuticamente aceptable de dicha molécula, en un vehículo farmacéuticamente aceptable. En ciertos ejemplos, la formulación farmacéutica incluye, o involucra, un sistema de administración adecuado para administrar moléculas de ácido nucleico (por ejemplo, moléculas de ANic) a un individuo tal como un paciente; por ejemplo, sistemas de suministro descritos más detalladamente a continuación. En ciertos ejemplos, la molécula de ácido nucleico como se describe en el presente documento, o una sal farmacéuticamente aceptable de tal compuesto, o una composición que comprende dicho compuesto, o una composición que comprende la sal farmacéuticamente aceptable de dicho compuesto, son para uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad o trastorno asociado a la expresión de p53 en un sujeto.

En otro aspecto, se proporcionan métodos para tratar, incluida la prevención, la incidencia o gravedad de un trastorno, enfermedad, lesión, afección o patología en la que la expresión del gen p53 se asocia con la etiología o progresión del trastorno, enfermedad, lesión, afección, o patología. En otro ejemplo, el trastorno, enfermedad, lesión, afección o patología involucra muerte celular apoptótica (programada). En algunos ejemplos, se proporciona un método para el tratamiento de un sujeto que padece una enfermedad o trastorno seleccionado de, sin limitarse a, lesión por isquemiareperfusión, deficiencia auditiva, trastorno auditivo, alteración del equilibrio, pérdida auditiva, alopecia inducida por quimioterapia (pérdida del cabello), alopecia inducida por radioterapia, insuficiencia renal aguda, lesión renal aguda, enfermedad renal crónica (CKD), un efecto secundario asociado con la terapia contra el cáncer, función retardada del injerto (DGF) en un paciente de trasplante de riñón, lesión de la médula espinal, lesión cerebral, convulsión, accidente cerebrovascular, trastorno neurodegenerativo, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, tumor, quemadura, herida, hipertermia, hipoxia, isquemia, trasplante de órganos, infarto de miocardio/ataque cardiaco, cardiotoxicidad, cáncer positivo para p53 e insuficiencia hepática aguda. En diversos ejemplos, el método comprende administrar al sujeto un compuesto de ácido nucleico descrito en el presente documento o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en una cantidad suficiente para subregularla expresión de p53. En diversos ejemplos, el método comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de una molécula de ácido nucleico divulgada en el presente documento, o una sal farmacéuticamente aceptable de dicha molécula, para tratar así la enfermedad o el trastorno.

En algunos ejemplos, el sujeto padece un cáncer positivo para p53 en un sujeto y el compuesto de ácido nucleico, o la sal farmacéuticamente aceptable de dicho compuesto, o la composición que comprende dicho compuesto, o la composición que comprende la sal farmacéuticamente aceptable de dicho compuesto, se administra en una cantidad efectiva para subregular la expresión de un gen p53 y, por lo tanto, sensibilizar el cáncer positivo para p53 a la quimioterapia.

En algunos ejemplos, el compuesto de ácido nucleico divulgado en el presente documento, o una sal farmacéuticamente aceptable de dicho compuesto, o una composición que comprende dicho compuesto, o una composición que comprende la sal farmacéuticamente aceptable de dicho compuesto, es para uso en la expansión del progenitor hematopoyético o en la estimulación de hematopoyesis.

En algunos ejemplos, el compuesto de ácido nucleico divulgado en el presente documento, o una sal farmacéuticamente aceptable de dicho compuesto, o una composición que comprende dicho compuesto, o una composición que comprende la sal farmacéuticamente aceptable de dicho compuesto, es para uso en alojamiento de células madre hematopoyéticas sin p53 (HSC).

Los métodos, materiales y ejemplos preferidos que se describirán ahora son solo ilustrativos y no pretenden ser limitativos; los materiales y métodos similares o equivalentes a los descritos en este documento pueden usarse en la práctica o en el ensayo de la invención. Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de las siguientes figuras, descripción detallada y de las reivindicaciones.

Descripción detallada de la invención

En el presente documento se proporcionan moléculas y composiciones que subregulan la expresión de un gen p53 humano. Se demostró que la inhibición de la expresión de un gen p53 es beneficiosa en el tratamiento y/o prevención de diversas enfermedades y trastornos. La presente solicitud se refiere en particular a moléculas de ácido nucleico de doble cadena que subregulan la expresión del gen p53, y al uso de estas moléculas en el tratamiento y/o prevención de diversas enfermedades y trastornos. Una lista no limitante de tales enfermedades/trastornos se proporciona en el presente documento. Las cadenas sentido y las cadenas antisentido complementarias útiles para generar moléculas de ácido nucleico de doble cadena se exponen en la Tabla 1, más arriba. Ciertos compuestos de ácido nucleico de doble cadena se exponen en las Tablas A, B y E a continuación.

Los compuestos, composiciones y métodos para inhibir p53 se discuten en el presente documento en detalle, y cualquiera de dichos compuestos, o sales farmacéuticamente aceptables de dichos compuestos, o composiciones pueden emplearse beneficiosamente en el tratamiento de un paciente que padece una enfermedad/un trastorno. asociado con la expresión elevada del gen p53.

Por consiguiente, en un aspecto, la presente divulgación se refiere en general a compuestos de ácido nucleico que subregulan la expresión del gen p53, y al uso de estos nuevos compuestos en el tratamiento de un sujeto que padece una enfermedad, un trastorno o una lesión asociada con la expresión del gen p53, tal como, sin limitarse a, enfermedades y trastornos divulgados en el presente documento.

Los compuestos de ácido nucleico divulgados en el presente documento poseen estructuras y modificaciones que pueden, por ejemplo, aumentar la actividad, aumentar la estabilidad y/o minimizar la toxicidad del compuesto.

De acuerdo con un aspecto, la presente divulgación proporciona compuestos oligonucleotídicos inhibidores que comprenden nucleótidos modificados y no modificados y/o restos no convencionales.

En algunos ejemplos, un compuesto de ácido nucleico divulgado en el presente documento incluye al menos un nucleótido modificado seleccionado del grupo que consiste en una modificación de azúcar, una modificación de base y una modificación de enlace internucleótido y puede incluir además ADN, y nucleótidos modificados o restos no convencionales que incluyen LNA (ácido nucleico bloqueado), ENA (ácido nucleico con puente de etileno), PNA (ácido nucleico peptídico), arabinósido, PACE, nucleótido especular, un nucleótido unido a un nucleótido adyacente por un enlace internucleótido 2'-5' o un nucleótido con un azúcar de 6 carbonos.

En diversos ejemplos, de una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, una molécula de ARNdc) como se divulga en el presente documento, la cadena antisentido puede tener una longitud de 18-40 nucleótidos. En algunos ejemplos, de una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, una molécula de ARNdc) como se divulga en el presente documento, la cadena antisentido tiene una longitud de 19 nucleótidos. De manera similar, la cadena sentido de una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, una molécula de ARNdc) como se divulga en este documento puede tener una longitud de 18-40 nucleótidos. En algunos ejemplos preferidos, de una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, una molécula de ARNdc) como se divulga en el presente documento, la cadena sentido tiene 19 nucleótidos de longitud. En algunos ejemplos, de una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, una molécula de ARNdc) como se divulga en el presente documento, cada una de la cadena antisentido y la cadena sentido tienen 19 nucleótidos de longitud. En diversos ejemplos, de un compuesto de ácido nucleico (por ejemplo, una molécula de ARNdc) como se divulga en este documento, la región dúplex del compuesto tiene 19 nucleótidos de longitud.

En ciertos ejemplos, la cadena sentido y la cadena antisentido de un compuesto de ácido nucleico (por ejemplo, una molécula de ácido nucleico de ARNdc) como se proporciona en este documento son cadenas de oligonucleótidos separadas. En algunos ejemplos, la cadena sentido y la cadena antisentido separadas forman una estructura de doble cadena, también conocida como dúplex, a través de enlaces de hidrógeno, por ejemplo, el emparejamiento de bases de Watson-Crick. En algunos ejemplos, uno o más pares de nucleótidos forman un emparejamiento de bases no Watson-Crick. En algunos ejemplos, la cadena sentido y la cadena antisentido son dos cadenas separadas que están unidas covalentemente entre sí. En otros ejemplos, la cadena sentido y las cadenas antisentido son parte de un oligonucleótido único que tiene una región tanto sentido como antisentido; en algunos ejemplos preferidos, el oligonucleótido tiene una estructura de horquilla.

En ciertos ejemplos, la molécula de ácido nucleico es una molécula de ácido nucleico de doble cadena (ARNdc) que es simétrica con respecto a las salientes, y tiene un extremo romo en ambos extremos. En otros ejemplos, la molécula de ácido nucleico es una molécula de ARNdc que es simétrica con respecto a las salientes, y tiene una saliente de nucleótido o un no nucleotídico o una combinación de un nucleótido y un no nucleotídico en ambos extremos de la molécula de ARNdc. En algunos ejemplos, una molécula de ARNdc simétrica tiene una saliente 3' en un lado de un dúplex que se produce en la cadena sentido; y una saliente 3' en el otro lado de la molécula que aparece en el terminal 3' de la cadena antisentido. En ciertos ejemplos preferidos, la molécula de ácido nucleico es una molécula de ARNdc que es asimétrica con respecto a las salientes, y tiene un extremo romo en un extremo de la molécula de ARNdc y una saliente en el otro extremo de la molécula de ARNdc. En algunos ejemplos, una molécula de ARNdc asimétrica tiene una saliente 3' en un lado de un dúplex que se produce en la cadena sentido, un extremo romo que se produce en el terminal 5' de la cadena sentido antisentido y un extremo romo en el otro lado de la molécula que se presenta tanto en el terminal 5' de la cadena sentido como en el terminal 3' de la cadena antisentido. En algunos ejemplos, las salientes son salientes de nucleótidos, en otros ejemplos, las salientes son salientes no nucleotídicas.

En varios ejemplos, la molécula de ácido nucleico comprende además un resto de protección unido covalentemente en el terminal 5' de la cadena sentido. En algunos ejemplos, la molécula de ARNdc tiene una saliente 3' en un lado de un dúplex que se produce en la cadena sentido; una saliente 3' en el otro lado de la molécula que aparece en el terminal 3' de la cadena antisentido y un resto de protección unido covalentemente en el terminal 5' de la cadena sentido. En algunos ejemplos, la molécula de ARNdc tiene una saliente 3' que se presenta en la cadena sentido, un resto de protección unido covalentemente al terminal 5' de la cadena sentido, un extremo romo que se presenta en el terminal 5' de la cadena sentido antisentido y un extremo romo que se presenta en el terminal 3' de la cadena antisentido. En algunos ejemplos, las salientes son salientes de nucleótidos, en otros ejemplos, las salientes son salientes no nucleotídicas. En diversos ejemplos, el resto de protección se selecciona de un resto ribosa abásica; un resto de desoxirribosa abásica; un resto de ribosa abásica invertida; un resto de desoxirribosa abásica invertida; un C6-imino-Pi; un nucleótido especular que incluye L-ADN y L-ARN; un nucleótido 5'OMe; un análogo de nucleótido, tal como, sin estar limitado a, un nucleótido de 4',5'-metileno; un nucleótido l-(p-D-eritrofuranosil); un nucleótido 4'-tio, un nucleótido carbocíclico, un alfa-nucleótido; un nucleótido treo-pentofuranosilo; un nucleótido acíclico 3',4'-seco; un nucleótido 3,4-dihidroxibutilo, un nucleótido 3,5-dihidroxipentilo; fosfato de 5'-amino-alquilo; fosfato de 1,3-diamino-2-propilo, fosfato de 3-aminopropilo; fosfato de 6-aminohexilo; fosfato de 12-aminododecilo; fosfato de hidroxipropilo; Nucleótido de 1,5-anhidrohexitol; Resto abásico invertido 5'-5'; fosfato de 1,4 butanodiol; 5'-amino; metilfosfonato con puente o sin puente y restos 5'-mercapto. En algunos ejemplos preferidos, el resto de protección unido covalentemente al terminal 5' de la cadena sentido se selecciona de un resto de desoxirribosa abásica invertida, AM-c6, un resto no nucleotídico C3 y THNB.

En algunos ejemplos, la molécula de ácido nucleico tiene una estructura de horquilla (que tiene la cadena sentido y la cadena antisentido en un oligonucleótido), con una estructura de bucle en un extremo y un extremo romo en el otro. En algunos ejemplos, la molécula de ácido nucleico tiene una estructura de horquilla, con una estructura de bucle en un extremo y un extremo saliente en el otro extremo; en ciertos ejemplos, la saliente es una saliente 3'; en ciertos ejemplos, la saliente es una saliente 5'; en ciertos ejemplos, la saliente está en la cadena sentido; en ciertos ejemplos, la saliente está en la cadena antisentido.

En diversos ejemplos, la molécula de ácido nucleico (por ejemplo, la molécula de ARNdc) divulgada en el presente documento puede incluir una o más modificaciones o nucleótidos modificados, tal como se describe en el presente documento. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, una molécula de ARNdc) como se proporciona en este documento puede incluir un nucleótido modificado que tiene un azúcar modificado; un nucleótido modificado que tiene una nucleobase modificada; o un nucleótido modificado que tiene un grupo fosfato modificado. De manera similar, una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, una molécula de ARNdc) como se proporciona en este documento puede incluir una cadena principal de fosfodiéster modificado y/o puede incluir un grupo fosfato terminal modificado.

Una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, moléculas de ARNdc) tal como se proporciona en el presente documento puede tener uno o más nucleótidos que incluyen un resto de azúcar modificado, por ejemplo, como se describe en el presente documento. En algunos ejemplos, el resto de azúcar modificado se selecciona del grupo que consiste en 2'-O-metilo, 2'-metoxietoxi, 2'-dexoxi, 2'-flúor, 2'-alilo, 2'-O-[2-(metilamino)-2-oxoetilo], 4'-tio, 4'-(CH²)²-O-2'-puente, ácido nucleico bloqueado en 2' y 2'-O-(N-metilcarbamato). En algunos ejemplos preferidos, el ácido nucleico comprende al menos un ribonucleótido modificado con azúcar 2'-O-metilo.

Una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, una molécula de ARNdc) como se proporciona en este documento puede tener una o más nucleobases modificadas, por ejemplo, como se divulga en este documento.

Una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, una molécula de ARNdc) como se proporciona en este documento puede tener una o más modificaciones a la cadena principal de fosfodiéster, por ejemplo, como se describe en este documento.

Una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, una molécula de ARNdc) como se proporciona en este documento puede tener uno o más grupos de fosfato modificado, por ejemplo, como se describe en el presente documento.

Una molécula de ácido nucleico tal como se proporciona en el presente documento puede comprender nucleobases no modificadas, sin modificaciones en la cadena principal de fosfodiéster y grupos fosfato no modificados, por ejemplo, como se describe en el presente documento.

En diversos ejemplos, la molécula de ácido nucleico proporcionada (por ejemplo, una molécula de ARNdc) puede incluir una cadena antisentido no modificada y una cadena sentido que tiene una o más modificaciones. En algunos ejemplos, la molécula de ácido nucleico proporcionada (por ejemplo, una molécula de ARNdc) puede incluir una cadena sentido no modificada y una cadena antisentido que tiene una o más modificaciones. En los ejemplos preferidos, la molécula de ácido nucleico proporcionada (por ejemplo, una molécula de ARNdc) puede incluir uno o más nucleótidos modificados tanto en la cadena sentido como en la cadena antisentido.

Una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, moléculas de ARNdc) como se proporciona en el presente documento puede incluir un grupo fosfato en el terminal 5' de la cadena sentido y/o la antisentido (es decir, un grupo fosfato 5'-terminal). En algunos ejemplos, una molécula de ARNdc divulgada en el presente documento puede incluir un grupo fosfato en el terminal 5'de la cadena antisentido.

Una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, moléculas de ARNdc) como se proporciona en el presente documento puede incluir un grupo fosfato en el terminal 3' de la cadena sentido y/o la antisentido (es decir, un grupo fosfato 3'-terminal). En algunos ejemplos, una molécula de ARNdc divulgada en el presente documento puede incluir un grupo fosfato en el terminal 3' de la cadena antisentido.

En algunos ejemplos, una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, moléculas de ARNdc) divulgada en el presente documento puede incluir un grupo fosfato en el terminal 3' de la cadena antisentido y en el terminal 3' de la cadena sentido.

En algunos ejemplos, una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, moléculas de ARNdc) divulgada en este documento incluye un grupo fosfato en el terminal 3' de la cadena antisentido y en el terminal 3' de la cadena sentido y no está fosforilada en el terminal 5' de la cadena antisentido y en el terminal 5' de la cadena sentido.

En algunos ejemplos, una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, moléculas de ARNdc) divulgada en el presente documento incluye un grupo fosfato en el terminal 3' de la cadena antisentido, en el terminal 3' de la cadena sentido y en el terminal 5' de la cadena antisentido, y no está fosforilada en el terminal 5' de la cadena sentido.

En algunos ejemplos, una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, moléculas de ARNdc) divulgada en el presente documento incluye un grupo fosfato en el terminal o 3' de la cadena sentido y en el terminal 5' de la cadena antisentido, y no está fosforilado y el terminal 5' de la cadena sentido y en el terminal 3' de la cadena antisentido.

En algunos ejemplos, una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, moléculas de ARNdc) divulgada en el presente documento, la cadena antisentido y la cadena sentido de la molécula de ácido nucleico no están fosforiladas en el terminal 3' y en el terminal 5'.

Un objetivo de la presente invención es una molécula de ácido nucleico de doble cadena que comprende una cadena sentido y una cadena antisentido, teniendo la molécula la estructura:

(A) 5’ z"-GGGCCUGACUCAGACUGAU-Z’ 3’(cadena sentido; SEQ ID NO:19)

3’ Z-C ICICIG1G11A1C¡U1G1A1G1 [UíC1U1GiAl!CUA cadena antísentido; SEQ ID NO:32)

en la que cada uno de A, C, G, U es independientemente un ribonucleótido no modificado, un ribonucleótido modificado, un desoxirribonucleótido no modificado, un desoxirribonucleótido modificado, o un resto no convencional seleccionado del grupo que consiste de un nucleótido especular, un ácido nucleico de treosa (TNA), un análogo del nucleótido pirazolotriazina (PT) y un ribonucleótido unido a un ribonucleótido adyacente por un enlace de fosfato internucleótido 2'-5';

en la que cada "|" representa el emparejamiento de bases entre la cadena antisentido y la correspondiente sentido;

en la que cada uno de Z y Z' está independientemente presente o ausente, pero si está presente es independientemente 1-5 nucleótidos consecutivos, 1-5 análogos de nucleótidos consecutivos o 1-5 restos no nucleotídicos consecutivos o una combinación de los mismos, o un resto conjugado, covalentemente unido en el terminal 3' de la cadena en la que está presente;

en la que z” puede estar presente o ausente, pero si está presente es un resto de protección, o un resto conjugado unido de manera covalente en el terminal 5' de la cadena sentido; y

en la que la secuencia de la cadena sentido es complementaria a la secuencia de la cadena antisentido; con la condición de que no cada N y N' sea un resto no convencional.

En varios ejemplos de moléculas divulgadas en el presente documento, la cadena sentido y la cadena antisentido se seleccionan de las SEQ ID NOs: 8-33. En los ejemplos preferidos de moléculas divulgadas en el presente documento, la cadena sentido y la cadena antisentido se seleccionan del grupo que consiste en una cadena sentido SEQ ID NO: 16 y una cadena antisentido SEQ ID NO: 29,

y una cadena sentido SEQ ID NO: 19 y una cadena antisentido SEQ ID NO: 28.

En varios ejemplos, cada uno de Z y Z' está independientemente presente o ausente, pero si está presente comprende independientemente 1-5 nucleótidos consecutivos, 1-5 análogos de nucleótidos consecutivos o 1-5 restos no nucleotídicos consecutivos o una combinación de los mismos, o un resto conjugado, unido covalentemente en el terminal 3' de la cadena en la que está presente. En varios ejemplos, se incluyen independientemente uno o más nucleótidos modificados y no modificados unidos covalentemente, incluidos desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos, o uno o más (preferiblemente 1-5, más preferiblemente 1-2) restos no convencionales, por ejemplo, resto de desoxirribosa abásica invertida o resto de ribosa abásica o un nucleótido especular; uno o más (preferiblemente 1-5, más preferiblemente 1-2) resto C3 no nucleotídico o un derivado del mismo, un resto C4 no nucleotídico o un derivado del mismo o un resto C5 no nucleotídico o un derivado del mismo, un resto amino-C6 no nucleotídico o un derivado del mismo, como se define en el presente documento, y similares.

En algunos ejemplos, Z' está ausente y Z está presente e incluye uno o más (preferiblemente 1-5, más preferiblemente 1-2) restos C3 no nucleotídicos. En algunos ejemplos, Z está ausente y Z' está presente e incluye uno o más (preferiblemente 1-5, más preferiblemente 1-2) restos C3 no nucleotídicos. En algunos ejemplos, cada uno de Z y Z' comprende independientemente uno o más (preferiblemente 1-5, más preferiblemente 1-2) restos C3 no nucleotídicos o uno o más restos amino-C6 no nucleotídicos.

En algunos ejemplos, cada uno de Z y Z' incluye un resto abásico, por ejemplo, un resto desoxirribabásico (denominado en el presente documento como "dAb") o un resto riboabásico (denominado en el presente documento como "rAb"). En algunos ejemplos, cada uno de Z y/o Z' comprende dos restos abásicos unidos covalentemente y es, por ejemplo, dAb-dAb o rAb-rAb o dAb-rAb o rAb-dAb, en los que cada resto está unido covalentemente a un resto adyacente, preferiblemente a través de un enlace a base de fósforo. En algunos ejemplos, el enlace basado en fósforo incluye un fosforotioato, un fosfonoacetato o un enlace fosfodiéster. En ejemplos preferidos, el enlace a base de fósforo es un enlace fosfodiéster.

En algunos ejemplos, cada uno de Z y/o Z' incluye independientemente un resto alquilo, opcionalmente un resto propano [(CH²)³] (C3) o un derivado del mismo que incluye propanol (C3OH) y un derivado de fósforo de propanodiol ("C3Pi"). En algunos ejemplos, cada uno de Z y/o Z' incluye dos restos alquilo y en algunos ejemplos es C3Pi-C3OH. En el ejemplo de C3Pi-C3OH, el terminal 3' de la cadena antisentido y/o el terminal 3' de la cadena sentido se une covalentemente a un resto C3 a través de un enlace con base en fósforo y el resto C3 se une covalentemente al resto C3OH a través de un enlace a base de fósforo. En algunos ejemplos, los enlaces con base en fosforo incluyen un fosforotioato, un fosfonoacetato o un enlace fosfodiéster. En realizaciones preferidas, el enlace con base en fósforo es un enlace fosfodiéster.

En algunos ejemplos, Z comprende C3Pi-C3OH. En ejemplos específicos, Z' comprende C3Pi o C3OH. En algunos ejemplos, una molécula de ácido nucleico de doble cadena incluye un resto C3Pi-C3OH unido covalentemente al terminal 3' de la cadena antisentido y un resto C3Pi o C3OH unido covalentemente al terminal 3' de la cadena sentido.

En algunos ejemplos, z” está presente y se selecciona del grupo que consiste en un resto de ribosa abásica, un resto de desoxirribosa abásica, un resto de ribosa abásica invertida, un resto de desoxirribosa invertida, un resto desoxiabásico invertido (idAb), un resto amino C6 (AM-c6), un rsto C6-amino-Pi, un resto no nucleotídico, un nucleótido especular, un fosfodiéster 5,6,7,8-tetrahidro-2-naftaleno butírico (THNB), y un resto conjugado. En algunos ejemplos, el resto conjugado es una vitamina o un resto de fármaco. En algunos ejemplos, z” está presente y se selecciona de un nucleótido especular, un resto abásico y un resto abásico invertido.

En algunos ejemplos, cada N consiste en un ribonucleótido no modificado. En ejemplos preferidos, al menos uno de N y/o N' es un ribonucleótido modificado químicamente, un desoxirribonucleótido no modificado, un desoxirribonucleótido modificado químicamente o un resto no convencional, con la condición de que no cada N y N' sea un desoxirribonucleótido.

En algunos ejemplos, un compuesto de ácido nucleico incluye al menos un ribonucleótido modificado en su residuo de azúcar. En algunos ejemplos, el compuesto comprende una modificación en la posición 2' del residuo de azúcar. En algunos ejemplos, la modificación en la posición 2' comprende la presencia de un resto amino, uno flúor, uno alcoxi o uno alquilo. En ciertos ejemplos, la modificación 2' incluye un resto alcoxi. En ejemplos preferidos, el resto alcoxi es un resto metoxi (también denominado como 2'-O-metilo; 2'OMe; 2'OMe; 2'-OCH3). En algunos ejemplos, un compuesto de ácido nucleico incluye ribonucleótidos alternantes modificados con azúcar 2'Ometilo en una o ambas de la cadena antisentido y la cadena sentido. En otros ejemplos, un compuesto incluye ribonucleótidos modificados con azúcar 2'OMe en la cadena antisentido, (N)x o N1-(N)x, solo. En algunos ejemplos, los ribonucleótidos modificados con el azúcar 2'OMetilo alternan con nucleótidos no modificados. En ciertos ejemplos, el ribonucleótido medio de la cadena antisentido; por ejemplo, el ribonucleótido en la posición 10 en una cadena de 19 mer, no está modificado. En varios ejemplos, el compuesto de ácido nucleico incluye al menos 5 ribonucleótidos modificados con azúcar 2'OMe alternantes y ribonucleótidos no modificados.

En algunos ejemplos, ni la cadena sentido ni la cadena antisentido están fosforiladas en el terminal 3' y en el terminal 5'. En otros ejemplos, una o ambas entre la cadena sentido y/o la cadena antisentido están fosforiladas en el terminal 3'. En otras realizaciones, una o ambas de la cadena sentido y/o la cadena antisentido están fosforiladas en el terminal 5'.

En un ejemplo actualmente preferido, el inhibidor proporcionado en este documento es un compuesto de ácido nucleico de doble cadena sintético, modificado químicamente que subregula la expresión de p53 e incluye un par de oligonucleótidos seleccionado de la Tabla 1, SEQ ID NOs: 8-33.

En algunos ejemplos, el compuesto de ácido nucleico incluye una cadena antisentido 5' AGUAGUUUCCAUAGGUCUG 3' (SEQ ID NO: 21) y una cadena sentido 5' CAGACCUAUGGAAACUACU 3' (SEQ ID NO: 8), identificada en la Tabla 1 por nombre de par p53_13.

En algunos ejemplos, el compuesto de ácido nucleico incluye una cadena antisentido 5' UUACAUCUCCCAAACAUCC 3' (SEQ ID NO: 22) y una cadena sentido 5' GGAUGUUUGGGAGAUGUAA 3' (SEQ ID NO: 9), identificada en la Tabla 1 por nombre del par p53_34.

En algunos ejemplos, el compuesto de ácido nucleico incluye una cadena antisentido 5' UUACAUCUCCCAAACAUCC 3' (SEQ ID NO: 22) y una cadena sentido 5' GGAUGUUUGGGAGAUGUAU 3' (SEQ ID NO: 18).

En algunos ejemplos, el compuesto de ácido nucleico incluye una cadena antisentido 5' UAGAAUGUCAGUCUGUGAGAGUC 3' (SEQ ID NO: 23) y una cadena sentido 5' GACUCAGACUGACAUUCUA 3' (SEQ ID NO: 10), identificada en la Tabla 1 por nombre de par p53_35.

En algunos ejemplos, el compuesto de ácido nucleico incluye una cadena antisentido 5' UUGUAGAAACUACCAACCC 3' (SEQ ID NO: 24) y una cadena sentido 5' GGGUUGGUAGUUUCUACAA 3' (SEQ ID NO: 11), identificada en la Tabla 1 por nombre del par p53_36.

En algunos ejemplos, el compuesto de ácido nucleico incluye una cadena antisentido 5' UACAUCUCCCAAACAUCCC 3' (SEQ ID NO: 25) y una cadena sentido 5' GGGAUGUUUGGGAGAUGUA 3' (SEQ ID NO: 12), identificada en la Tabla 1 por el nombre de par p53_37.

En algunos ejemplos, el compuesto de ácido nucleico incluye una cadena antisentido 5' UACAAGUCUUGGUGGAUCC 3' (SEQ ID NO: 26) y una cadena sentido 5' GGAUCCACCAAGACUUGUA 3' (SEQ ID NO: 13), identificada en la Tabla 1 por el nombre de par p53_38.

En algunos ejemplos, el compuesto de ácido nucleico incluye una cadena antisentido 5' UAUCUCCCAAACAUCCCUC 3' (SEQ ID NO: 27) y una cadena sentido 5' GAGGGAUGUUUGGGAGAUA 3' (SEQ ID NO: 14), identificada en la Tabla 1 por el nombre del par p53_39.

En algunos ejemplos, el compuesto de ácido nucleico incluye una cadena antisentido 5' UUCAGUCUGAGAGAGUCAGGCCCCC 3' (SEQ ID NO: 28) y una cadena sentido 5' GGGUGUGACUCAGAGACUGAA 3' (SEQ ID NO: 15), identificada en la Tabla 1 por el nombre del par p53_40. En algunos ejemplos, el compues de ácido nucleico incluye una cadena antisentido 5' UUCAGUCUGAGAGAGUCAGGCCC 3' (SEQ ID NO: 28) y una cadena sentido 5 GGGCCUGACUCAGACACUGAUGA 3' (SE ID NO: 19).

En algunos ejemplos, el compues de ácido nucleico incluye una cadena antisentido 5' AAGAAUGUCAGUCUGUGAGAGUC 3' (SEQ ID NO: 29) y una cadena sentido 5' GACUCAGACUGACAAUCUCUUCUU 3' (SEQ ID NO: 16), identificada en la Tabla 1 por el nombre del par p53_41. En algunos ejemplos, el compuesto de ácido nucleico incluye una cadena antisentido 5' UUGAGGUAGGUGCAAAUGC 3' (SEQ ID NO: 30) y una cadena sentido 5' GCAUUUGCACCUACCUCAA 3' (SEQ ID NO: 17), identificada en la Tabla 1 por el nombre del par p53_42.

En algunos ejemplos, el compuesto de ácido nucleico incluye una cadena antisentido 5' AUACAUCUCCCAAACAUCC 3' (SEQ ID NO: 31) y una cadena sentido 5'GGAUGUUUGGGAGAUGUAU 3' (SEQ ID NO: 18), identificada en la Tabla 1 por nombre del par p53_43.

En algunos ejemplos, el compuesto de ácido nucleico incluye una cadena antisentido 5' AUACAUCUCCCAAACAUCC 3' (SEQ ID NO: 31) y una cadena sentido 5' GGAUGUUUGGGAGAUGUAA 3' (SEQ ID NO: 9).

En realizaciones de acuerdo con la presente invención, el compuesto de ácido nucleico incluye una cadena antisentido 5' AUCAGUCUGAGAGUCAGGAGCCC 3' (SEQ ID NO: 32) y una cadena sentido 5' GGGCCUGACUCAGACUGUGUGUU 3' (SEQ ID NO: 19), identificada en Tabla 1 por el nombre del par p53_44. En algunos ejemplos, el compuesto de ácido nucleico incluye una cadena antisentido 5' UGUAGUUUCCAUAGGUCUG 3' (SEQ ID NO: 33) y una cadena sentido 5' CAGACCUAUGGAAACUACA 3' (SEQ ID NO: 20), identificada en la Tabla 1 por el nombre del par p53_45.

En algunos ejemplos, el compuesto de ácido nucleico incluye una cadena antisentido 5' AGUAGUUUCCAUAGGUCUG 3' (SEQ ID NO: 21) y una cadena sentido 5' CAGACCUAUGGAAACUACA 3' (SEQ ID NO: 20).

En algunos ejemplos, cada A, C, G, U es un ribonucleótido no modificado o un ribonucleótido modificado con azúcar 2'-O-metilo que se alternan de acuerdo con el siguiente patrón:

en el que cada N es un ribonucleótido no modificado,

en el que cada N es un ribonucleótido modificado con azúcar 2'-O-metilo,

en el que cada "|" representa el emparejamiento de bases entre N y N;

en el que en la cadena antisentido, cada N o N consecutivo se une al N o N adyacente un enlace covalente;

en el que en la cadena sentido, cada N o N consecutivo se une al N o N adyacente un enlace covalente;

en el que la secuencia de la cadena sentido es complementaria a la secuencia de la cadena antisentido; y en el que la secuencia de la cadena antisentido y la secuencia de la cadena sentido se exponen en las SEQ ID NO: 8-33; o una sal farmacéuticamente aceptable de dicho compuesto.

Ciertos dúplex preferidos se exponen en el presente documento a continuación en la Tabla A.

Tabla A

En todas las tablas anteriores y siguientes, los nombres de los dúplex se identifican por los prefijos "p53" y "TP53" que se usan indistintamente.

Para todos los compuestos de ARNdc en la Tabla A:

A, U, G, C - designa un ribonucleótido no modificado;

A, U, G, C - designa un ribonucleótido modificado con azúcar 2-O-metilo;

En varios ejemplos de los compuestos de ácido nucleico en la Tabla A, el ribonucleótido en el terminal 3' y en el terminal 5' cada una de la cadena antisentido y la cadena sentido pueden estar fosforilada o no fosforilada. En algunos ejemplos de los compuestos de ácido nucleico en la Tabla A, en cada una de la cadena antisentido y la cadena sentido, el ribonucleótido en el terminal 3' está fosforilado y el ribonucleótido en el terminal 5' no está fosforilado. En algunos ejemplos, en cada uno de los compuestos de ácido nucleico en la Tabla A, la cadena antisentido y la cadena sentido no están fosforadas tanto en el terminal 3' como en el terminal 5'.

Ciertos dúplex preferidos para la generación de compuestos de ácido nucleico de doble cadena para la subregulación de un gen p53 se exponen en el presente documento a continuación en la Tabla B. Otros dúplex preferidos se proporcionan en la sección de Ejemplos a continuación.

Tabla B. Ciertos dúplex preferidos.

Para todos los compuestos de ácido nucleico de doble cadena en la Tabla B:

A, U, G, C - designa un ribonucleótido no modificado;

A, U, G, C - designa un ribonucleótido modificado con azúcar 2-O-metilo;

a, u, c, g - designa un nucleótido unido a un nucleótido adyacente por un enlace de fosfato internucleótido 2'-5'(5' > 3');

cap - designa un resto de protección. En algunos ejemplos preferidos, el resto de protección es el grupo que consiste en un resto ribosa abásico, un resto desoxirribosa abásico, un resto desoxirribosa invertido, un resto desoxiabático invertido (idAb), resto amino-C6 (AM-c6), C6-amino-pi, un resto no nucleotídico, un nucleótido especular, un fosfodiéster 5,6,7,8-tetrahidro-2-naftaleno butírico (THNB) y un resto conjugado.

pi - designa 3'-fosfato.

z- designa un resto de protección

$ - designa un fosfato no terminal

dT$ - designa timidina (sin fosfato)

C3 - designa 1,3-propanodiol, mono(dihidrogenofosfato) (C3) [CAS RN: 13507-42-1].

C3-C3 - designa dos moléculas C3 consecutivas.

En varios ejemplos de los compuestos de ácido nucleico descritos en la Tabla B, más arriba, la saliente no nucleotídica C3-C3 unida covalentemente al terminal 3' de la cadena antisentido está fosforilado (-C3-C3-pi).

En algunos ejemplos de los compuestos de ácido nucleico descritos en la Tabla B, más arriba, en cada uno de los compuestos de ácido nucleico, el ribonucleótido en el terminal 5' de la cadena antisentido está fosforilado. En algunos ejemplos de los compuestos de ácido nucleico descritos en la Tabla B, más arriba, en cada uno de los compuestos de ácido nucleico, el ribonucleótido en el terminal 5'en la cadena antisentido no está fosforilado.

De acuerdo con una realización, se proporciona un compuesto de ácido nucleico modificado que tiene una cadena sentido y una cadena antisentido que se exponen a continuación:

5' cap-GGGCCUGACUCAGAcugau-C3-pi 3' (cadena sentido; SEQ ID NO: 19)

5' AUCAGuCUGAGUCAGGCCC-C3-C33' (cadena antisentido; SEQ ID NO: 32)

en las que cada uno de A, U, G y C es un ribonucleótido no modificado;

en las que cada uno de a, u, c y g es un ribonucleótido unido a un ribonucleótido adyacente (5' > 3') por un enlace de fosfato internucleotídico 2'-5';

en el que el terminal 3' de la cadena sentido está fosforilado (pi); o

una sal farmacéuticamente aceptable de dicho compuesto.

5' cap-GGGCCUGACUCAGACUGAU-C3-pi 3' (cadena sentido; SEQ ID NO: 19)

5' AUCAGUcUGAGUCAGGCCC-C3-C33' (cadena antisentido; SEQ ID NO: 32)

en las que cada uno de A, U, G y C es un ribonucleótido no modificado;

en las que c es un ribonucleótido unido a un ribonucleótido adyacente (5' > 3') por un enlace de fosfato internucletídico 2'-5';

en las que la cadena antisentido comprende una saliente no nucleotídica C3-C3 unida covalentemente en al terminal emo 3' de la cadena; y

en las que el terminal 3' de la cadena sentido está fosforilado (pi); o

una sal farmacéuticamente aceptable de dicho compuesto.

5' cap-GGGCCUGACUCAGACUGAU-C3-pi 3' (cadena sentido; SEQ ID NO: 19)

5' AUCAGUcyGAGUCAGGCCC-C3-C33' (cadena antisentido; SEQ ID NO: 32)

en las que cada uno de A, U, G y C es un ribonucleótido no modificado;

en el que el terminal 3' de la cadena sentido está fosforilado (pi); o

una sal farmacéuticamente aceptable de dicho compuesto.

De acuerdo con una realización de dicho compuesto, el protector 5' unido covalentemente en el terminal 5' de la cadena sentido es 1,3-propanodiol, mono(dihidrógeno fosfato) (C3); y

en la cadena antisentido, el ribonucleótido en el terminal 5' está fosforilado (fos) y la saliente en el terminal 3' está fosforilado (-C3-C3-pi).

De acuerdo con una realización se proporciona, un compuesto de ácido nucleico modificado que tiene una cadena sentido y una cadena antisentido expuestas a continuación:

5' cap-GGGCCUGACUCAGAcugau-C3-pi 3' (cadena sentido; SEQ. ID. NO 19)

5' AUCAGuCUGAGUCAGGCCC-C3-C33' (cadena antisentido; SEQ ID NO: 32)

en las que cada uno de A, U, G y C es un ribonucleótido no modificado;

en el que el terminal 3' de la cadena sentido está fosforilado (pi); o

una sal farmacéuticamente aceptable de dicho compuesto.

De acuerdo con una realización se proporciona, un compuesto de ácido nucleico modificado que tiene una cadena sentido y una cadena antisentido que se exponen a continuación:

5' cap-GGGCCUGACUCAGACUGAU-C3-pi 3' (cadena sentido; SEQ ID NO: 19)

5' AUCAGuCUGAGUCAGGCCC-C3-C33' (cadena antisentido; SEQ ID NO: 32)

en las que cada uno de A, U, G y C es un ribonucleótido no modificado;

en donde u es un ribonucleótido unido a un ribonucleótido adyacente (5' > 3') por un enlace de fosfato internucleótido 2'-5';

en el que el terminal 3' de la cadena sentido está fosforilado (pi); o

una sal farmacéuticamente aceptable de dicho compuesto.

5' cap-GGGCCUGACUCAGACyGAU-C3-pi 3' (cadena sentido; SEQ ID NO: 19)

5' AUCAGUcUGAGUCAGGCCC-C3-C33' (cadena antisentido; SEQ ID NO: 32)

en las que cada uno de A, U, G y C es un ribonucleótido no modificado;

en las que cada uno de U y C_es un ribonucleótido modificado con azúcar 2'-O-metilo;

en el que el terminal 3' de la cadena sentido está fosforilado (pi); o

una sal farmacéuticamente aceptable de dicho compuesto.

5' C3-GGGCCUGACUCAGAcugau-C3-pi 3' (cadena sentido; SEQ ID NO: 19)

5' fos-AUCAGUcyGAGUCAGGCCC-C3-C3-pi 3' (cadena antisentido; SEQ ID NO: 32)

en las que cada uno de A, U, G y C es un ribonucleótido no modificado;

en las que la cadena sentido comprende una tapa C35' unida covalentemente en el terminal 5' de la cadena; en las que la cadena antisentido comprende una saliente no nucleotídica C3-C3 unida covalentemente en el terminal 3' de la cadena; y

en las que en la cadena antisentido el ribonucleótido en el terminal 5'está fosforilado (fos) y la saliente en el terminal 3' está fosforilado (-C3-C3-pi); o

una sal farmacéuticamente aceptable de dicho compuesto.

5' C3-GGGCCUGACUCAGAcugau-C3-pi 3' (cadena sentido; SEQ ID NO: 19)

5' fos-AUCAGUcUGAGUCAGGGCCC-C3-C3-pi 3' (cadena antisentido; SEQ ID NO: 32)

en las que cada uno de A, U, G y C es un ribonucleótido no modificado;

en las que C es un ribonucleótido modificado con azúcar 2'-O-metilo;

en las que c. es un ribonucleótido unido a un ribonucleótido adyacente (5' > 3') por un enlace de fosfato intemucleótido 2'-5';

en las que en la cadena antisentido el ribonucleótido en el terminal 5' está fosforilado (fos) y la saliente en el terminal 3' está fosforilado (C3-C3-pi); o

una sal farmacéuticamente aceptable de dicho compuesto.

5' C3-GGGCCUGACUCAGACUGAU-C3-pi 3' (cadena sentido; SEQ ID NO: 19)

5' fos-AUCAGUcUGAGUCAGGGCCC-C3-C3-pi 3' (cadena antisentido; SEQ ID NO: 32)

en las que cada uno de A, U, G y C es un ribonucleótido no modificado;

en las que en la cadena antisentido el ribonucleótido en el terminal 5' está fosforilado (fos) y la saliente en el terminal 3' está fosforilado (-C3-C3-pi); o

una sal farmacéuticamente aceptable de dicho compuesto.

En varios ejemplos de los compuestos de ácido nucleico descritos en el presente documento, más arriba, la cadena antisentido comprende una saliente no nucleotídica C3-C3 unida covalentemente al terminal 3' de la cadena. En algunos ejemplos preferidos de los compuestos de ácido nucleico descritos en el presente documento, más arriba, la saliente no nucleotídica C3-C3 unida covalentemente al terminal 3' de la cadena antisentido está fosforilada (-C3-C3-pi).

En varios ejemplos de los compuestos de ácido nucleico descritos en el presente documento, el protector 5' se selecciona del grupo que consiste en un resto ribosa abásico, un resto desoxirribosa abásico, un resto desoxirribosa invertido, un resto desoxibásicoa invertido (idAb), un resto amino-C6 (AM-c6), C6-amino-pi, un resto no nucleotídico, un nucleótido especular, un fosfodiéster 5,6,7,8-tetrahidro-2-naftaleno butírico (THNB), una vitamina y un resto farmacológico.

En varios ejemplos de los compuestos de ácido nucleico descritos en el presente documento, en la cadena antisentido, el ribonucleótido en el terminal 5' está fosforilado (fos). En diversos ejemplos de los compuestos de ácido nucleico descritos en el presente documento en la cadena antisentido, el ribonucleótido en el terminal 5' no está fosforilado ($). En otro aspecto, se proporcionan composiciones que comprenden uno o más de dichos compuestos de ácido nucleico divulgados en el presente documento; y un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable. En algunos ejemplos, la molécula de ARNdc se administra como ARNdc desnudo. En otros ejemplos, la molécula de ARNdc se mezcla con un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otros ejemplos más, el ARNdc está encapsulado en un portador de fármaco.

En otro aspecto, se proporciona el uso de las moléculas divulgadas en el presente documento para tratar a un sujeto que padece una enfermedad o trastorno seleccionado de, sin limitarse a, alopecia asociada con el tratamiento anticanceroso, lesión renal/insuficiencia renal, incluida la lesión renal aguda, en particular, insuficiencia renal aguda isquémica y lesión renal crónica; enfermedad o trastorno del oído interno o medio, tal como trastorno de la audición, trastorno del equilibrio; enfermedad o trastorno de los ojos, función retardada del injerto en pacientes con trasplante de órganos, en particular en la función retardada del injerto en pacientes con trasplante de riñón; accidente cerebrovascular, lesión cerebral, lesión de la médula espinal, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, cardiotoxicidad, infarto de miocardio/insuficiencia cardíaca. En el presente documento se proporcionan métodos para tratar o prevenir la incidencia o gravedad de tales enfermedades o trastornos en un sujeto que lo necesite, en el que las enfermedades o trastornos están asociados con la expresión de un gen p53. Tales métodos implican administrar a un mamífero que necesite tal tratamiento una cantidad profiláctica o terapéuticamente eficaz de uno o más compuestos proporcionados en el presente documento, que inhiben o reducen la expresión o actividad del gen p53.

En algunos ejemplos, al menos dos agentes de ARNdc se administran conjuntamente, por ejemplo, concomitantemente o en secuencia. En otros ejemplos, al menos dos agentes de ARNdc se administran en una composición farmacéutica que comprende una combinación de los mismos.

En el presente documento se proporcionan ácidos nucleicos funcionales que comprenden diversas modificaciones como se divulga en el presente documento, su uso para la fabricación de un medicamento, composiciones farmacéuticas que comprenden dichos ácidos nucleicos funcionales modificados y métodos para el tratamiento de un paciente que padece o es susceptible a una enfermedad o trastorno como el divulgado en el presente documento.

Definiciones

Por conveniencia, algunos términos empleados en la memoria descriptiva, ejemplos y reivindicaciones se describen en el presente documento.

Se debe tener en cuenta que, como se usa en este documento, las formas singulares "un", "uno, una" y "el, la" incluyen formas plurales a menos que el contenido indique claramente lo contrario.

Cuando los aspectos o ejemplos se describen en términos de grupos Markush u otro grupo de alternativas, los expertos en la materia reconocerán que la divulgación también se describe de este modo en términos de cualquier miembro individual o subgrupo de miembros del grupo.

Un "inhibidor" es un compuesto, que es capaz de reducir (parcial o totalmente) la expresión de un gen o la actividad del producto de dicho gen hasta un grado suficiente para lograr un efecto biológico o fisiológico deseado. El término "inhibidor" como se usa en el presente documento se refiere a uno o más de un inhibidor de oligonucleótidos, que incluyen, sin limitación, ARNpi, ARNhc, ARNhc sintético; miARN, ARN antisentido y ADN y ribozimas.

Un "compuesto de ácido nucleico de doble cadena" o "molécula de ARNdc" o "inhibidor de ARNdc" es un compuesto que es capaz de subregular o reducir la expresión de un gen o la actividad del producto de dicho gen a una grado suficiente para lograr un efecto biológico o fisiológico deseado e incluye uno o más de un ARNdc, ARNpi, ARNhc, ARNhc sintético; miARN. La inhibición también puede denominarse subregulación o, para ARNi, silenciamiento.

El término "inhibir" como se usa en el presente documento se refiere a subregular o reducir la expresión de un gen o la actividad del producto de dicho gen en un grado suficiente para lograr un efecto biológico o fisiológico deseado. La inhibición es completa o parcial.

Como se usa en el presente documento, el término "subregulación" o "inhibición" de un gen objetivo significa inhibición de la expresión del gen (transcripción o traducción) o actividad polipeptídica de un gen objetivo en el que el gen objetivo es p53 transcrito en un ARNm expeuesto en cualquiera de las SEQ ID NO: 1-7 o un SNP (polimorfismo de un solo nucleótido) u otras variantes del mismo. El número gi para el ARNm de cada una de las variantes de transcripción del gen p53 humano se expone en las SEQ ID NOS: 1-7. La secuencia de polinucleótidos de la secuencia de ARNm objetivo, o las variantes de transcripción se refieren a las secuencias de ARNm expuestas en las SEQ ID NOs: 1-7, o cualquiera de sus secuencias homólogas, preferiblemente con al menos un 70% de identidad, más preferiblemente un 80% de identidad, incluso más preferiblemente, el 90% o el 95% de identidad con cualquiera de los ARNm expuestos en las SEQ ID NOS: 1-7. Por lo tanto, las secuencias de polinucleótidos derivadas de cualquiera de las SEQ ID NOS: 1-7 que han sufrido mutaciones, alteraciones o modificaciones como se describen en el presente documento están incluidas en la presente descripción. Los términos "secuencia polinucleotídica de ARNm", "secuencia de ARNm" y "ARNm" se usan de manera intercambiable.

Como se usa en el presente documento, los términos "oligonucleótido" y "ácido nucleico" se pueden usar indistintamente y se refieren a secuencias de nucleótidos que comprenden ácido desoxirribonucleico (ADN) y ácido ribonucleico (ARN). Debe entenderse que los términos incluyen, como equivalentes, análogos de ARN o ADN hechos de análogos de nucleótidos.

"Oligonucleótido" u "oligómero" se refiere a una secuencia de desoxirribonucleótido o ribonucleótido de aproximadamente 2 a aproximadamente 50 nucleótidos. Cada nucleótido de ADN o ARN puede ser independientemente natural o sintético, y/o modificado o no modificado. Las modificaciones incluyen cambios en el resto de azúcar, el resto de base y/o los enlaces entre nucleótidos en el oligonucleótido. Los compuestos de ácido nucleico divulgados en el presente documento abarcan moléculas que comprenden desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos, desoxirribonucleótidos modificados, ribonucleótidos modificados, restos no convencionales y combinaciones de los mismos, con la condición de que no cada nucleótido sea un desoxirribonucleótido.

El término "resto no convencional", como se usa en este documento, incluye un resto ribosa abásica, un resto desoxirribosa abásica, un desoxirribonucleótido no modificado, un desoxirribonucleótido modificado, un nucleótido especular (L-ADN y L-ARN), un análogo de nucleótido sin apareamiento de base y un nucleótido unidos a un nucleótido adyacente por un enlace de fosfato internucleótido 2'-5'; Restos de C3, C4, C5 y C6; ácidos nucleicos de treosa (TNA), análogos de ácidos nucleicos de base pirazolotriazina (PT) modificad; morfolino; ácidos nucleicos puenteados que incluyen LNA y ácidos nucleicos puenteados con etileno (ENA).

"Substancialmente complementario" se refiere a la complementariedad mayor que aproximadamente 84%, con otra secuencia. Por ejemplo, en una región dúplex que consta de 19 pares de bases, una falta de coincidencia da como resultado una complementariedad del 94,7%, dos faltas de coincidencia dan como resultado una complementariedad de aproximadamente el 89,5% y 3 faltas de coincidencia dan como resultado una complementariedad de aproximadamente el 84,2%, haciendo que la región dúplex sea sustancialmente complementaria. Por consiguiente, "sustancialmente idéntico" se refiere a una identidad de más de aproximadamente del 84%, con otra secuencia.

"Nucleótido" se entiende abarcar desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos, que pueden ser naturales o sintéticos, y/o modificados o no modificados. Las modificaciones incluyen cambios en el resto de azúcar, el resto de base y/o los enlaces entre nucleótidos en el oligonucleótido.

Los nucleótidos pueden seleccionarse a partir de bases modificadas naturales o sintéticas. Las bases naturales incluyen adenina, guanina, citosina, timina y uracilo. Las bases modificadas de nucleótidos incluyen inosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metilo, 2-propilo y otras alquil adeninas, 5-halo uracilo, 5-halo citosina, 6-aza citosina y 6-aza timina, seudouracilo, 4-tiouracilo, 8-halo adenina, 8-aminoadenina, 8-tiol adenina, 8-tiolalquil adeninas, 8-hidroxil adenina y otras 8-adenina sustituidas, 8-halo guaninas, 8-amino guanina, 8-tiol guanina, 8-tioalquil guaninas, 8-hidroxil guaninas y otras guaninas sustituidas, otras aza y deaza adeninas, otras aza y deaza guaninas, 5-trifluorometil uracilo y 5-trifluoro citosina. En algunos ejemplos, uno o más nucleótidos en un oligonucleótido están sustituidos con inosina.

De acuerdo con algunos ejemplos, la presente divulgación proporciona compuestos oligonucleotídicos inhibidores que comprenden nucleótidos modificados y no modificados y o restos no convencionales. El compuesto comprende al menos un nucleótido modificado seleccionado del grupo que consiste en una modificación de azúcar, una modificación de una base y una modificación de enlace internucleótido y puede contener restos no convencionales tales como, sin limitarse a, un ADN, LNA (ácido nucleico bloqueado), ENA (ácido nucleico con puente de etileno), PNA (ácido nucleico peptídico), arabinósido, un nucleótido fosfonocarboxilato o fosfinocarboxilato (nucleótido PACE), nucleótido especular, o nucleótidos con un azúcar de 6 carbonos.

Todos los análogos de, o modificaciones para, un nucleótido/oligonucleótido se emplean con los compuestos de ácido nucleico divulgados en el presente documento, siempre que dicho análogo o modificación no afecte sustancialmente de manera adversa la función del compuesto de ácido nucleico

Una modificación de azúcar incluye una modificación en el resto 2' del residuo de azúcar y abarca amino, flúor, alcoxi, por ejemplo, metoxi, alquilo, amino, flúor, cloro, bromo, CN, CF, imidazol, carboxilato, tioato, alquilo inferior C1 a C10, alquilo inferior sustituido, alquilarilo o aralquilo, OCF3, OCN, O-, S- o N-alquilo; O-, S o N-alquenilo; SOCH3; SO2CH3; ONO2; NO2, N3; heterocicloalquilo; heterocicloalcarilo; aminoalquilamino; polialquilamino o sililo sustituido, tal como, entre otros, se describe en las patentes europeas EP 0586520 B1 o EP 0618925 B1.

En un ejemplo, las moléculas de ácido nucleico divulgadas en el presente documento comprenden al menos un ribonucleótido que comprende una modificación 2' en el resto de azúcar ("modificación de azúcar 2' "). En ciertos ejemplos, el compuesto comprende 2'-O-alquilo o 2'-flúor o 2'-O-alilo o cualquier otra modificación 2', opcionalmente en posiciones alternativas. También son posibles otras modificaciones de estabilización (por ejemplo, modificaciones terminales). En algunos ejemplos, un 2'-O-alquilo preferido es una modificación del azúcar 2'-O-metil (metoxi).

En algunos ejemplos, la cadena principal del oligonucleótido se modifica y comprende entidades fosfato D-ribosa, pero también puede contener entidades tiofosfato-D-ribosa, triéster, tioato, cadena principal con puentes 2'-5' (también se puede denominar 5'-2'), PACE y similares.

Como se usa en este documento, los términos "análogo de nucleótido sin emparejamiento" significa un análogo de nucleótido que comprende un resto sin emparejamiento de bases que incluye, pero no se limita a: 6 desamino adenosina (Nebularina), 4-Me-indol, 3-nitropirrol, 5-nitroindol, Ds, Pa, N3-Me ribo U, N3-Me riboT, N3-Me dC, N3-MedT, N1-Me-dG, N1-Me-dA, N3-etil-dC, N3-Me dC. En algunos ejemplos, el análogo de nucleótido sin apareamiento de bases es un ribonucleótido. En otros ejemplos, el nucleótido sin emparejamiento de bases es un desoxirribonucleótido. Un ejemplo de un análogo de nucleótido es un ácido nucleico peptídico (PNA) en el que la cadena principal del fosfato desoxirribosa (o ribosa) en el ADN (o ARN) se reemplaza por una cadena principal de poliamida que es similar a la encontrada en los péptidos. Se ha demostrado que los análogos de PNA son resistentes a la degradación enzimática y tienen estabilidad extendida in vivo e in vitro. Otras modificaciones que se pueden hacer a los oligonucleótidos incluyen cadena principales de polímeros, cadenas principales cíclicas, cadenas principales acíclicaas, cadenas principales de tiofosfato-D-ribosa, cadenas principales de triester, cadenas principales de tioato, una cadena principal con puente 2'-5', ácidos nucleicos artificiales, ácidos nucleicos morfolino, ácido nucleico de glicol (GNA), ácido nucleico de treosa (TNA), arabinosido y nucleósido especular (por ejemplo, beta-L-desoxirribonucleósido en lugar de beta-D-desoxirribonucleósido). Ejemplos de moléculas de ARNdc que comprenden nucleótidos de LNA se divulgan en Elmen et al., (NAR 2005, 33 (1): 439-447).

Los compuestos de la presente divulgación se pueden sintetizar usando uno o más nucleótidos invertidos, por ejemplo timidina invertida o adenina invertida (véase, por ejemplo, Takei, et al., 2002, JBC 277 (26): 23800-06) .

Un nucleótido "especular" es un nucleótido con quiralidad inversa al nucleótido natural o empleado comúnmente, es decir, una imagen especular (L-nucleótido) del de origen natural (D-nucleótido), también denominado como L-ARN. en el caso de un ribonucleótido especular, y "spiegelmer". El nucleótido puede ser un ribonucleótido o un desoxirribonucleótido y además comprende al menos una modificación de azúcar, base y cadena principal. Los ejemplos de nucleótidos especulares se describen en la patente de Estados Unidos N° 6.586.238. La Patente de Estados Unidos N° 6.602.858 divulga catalizadores de ácido nucleico que comprenden al menos una sustitución de L-nucleótido.

Otras modificaciones incluyen modificaciones terminales en la parte 5' y/o 3' de los oligonucleótidos y también se conocen como restos de protección. Dichas modificaciones terminales se seleccionan de un nucleótido, un nucleótido modificado, un lípido, un péptido, un azúcar y un resto abásico invertido.

En varios ejemplos de los compuestos de ácido nucleico divulgados en el presente documento, las modificaciones preferidas incluyen la incorporación de restos de TNA en la cadena sentido y/o la cadena antisentido. Ejemplos de ARNdc que comprenden restos de TNA se divulgan en el documento PCT/US11/063365, para el cesionario de la presente invención. En algunos ejemplos, 1-19 ribonucleótidos en la cadena sentido pueden estar sustituidos con TNA.

En varios ejemplos de los compuestos de ácido nucleico divulgados en el presente documento, las modificaciones preferidas incluyen la incorporación de restos de nucleótidos modificados en la base de pirazolotriazina en la cadena sentido y/o la cadena antisentido. Los ejemplos de restos de pirazolotriazina y ARNdc que comprenden restos de pirazolotriazina se divulgan en el documento PCT/IL2013/050465, asignado conjuntamente al cesionario de la presente invención. Los análogos de ADN o ARN de pirazolotriazina se incorporan preferiblemente en una cadena antisentido de 19 mer en las posiciones 1, 5, 6 o 7 (5' > 3'). En algunos ejemplos, se prefieren los análogos de ARN de pirazolotriazina. Los análogos de ADN o ARN de pirazolotriazina también se pueden unir covalentemente al terminal 3' de la cadena sentido o la cadena antisentido, como salientes del terminal 3' .

El término "resto conjugado", como se usa en el presente documento, se refiere a un resto que incluye un péptido, lípido, fármaco, vitamina, mineral, fluoróforo que puede unirse covalentemente a la molécula de ácido nucleico, preferiblemente en uno o más del terminal 5' o del terminal 3'. Sin desear estar ligados a la teoría, el resto conjugado altera la biodistribución, el escape endosómico, la captación celular, la retención de plasma, el direccionamiento de la molécula, sin afectar negativamente a la actividad de la molécula de ácido nucleico. Por ejemplo, una vitamina preferida es un resto de vitamina D, vitamina A o vitamina E; un lípido preferido es un esfingolípido o colesterol o un derivado de colesterol. Un "resto alquilo o derivado del mismo" se refiere a restos de carbono de cadena lineal o ramificada y restos en si mismos o que comprenden además un grupo funcional que incluye alcoholes, fosfodiéster, fosforotioato, fosfonoacetato y también incluye aminas, ácidos carboxílicos, ésteres, amidas, aldehídos. El "resto hidrocarburo" y el "resto alquilo" se usan de manera intercambiable.

"Grupo funcional terminal" incluye grupos halógeno, alcohol, amina, carboxílico, éster, amida, aldehído, cetona, éter.

En este documento se proporcionan secuencias de oligonucleótidos (SEQ ID NOS: 8-33) útiles para la generación de compuestos de ácido nucleico que se dirigen a un ARNm transcrito a partir del gen p53.

En este documento se proporcionan métodos y composiciones para inhibir la expresión del gen p53 in vitro e in vivo. En general, los métodos in vivo incluyen la administración de un compuesto oligonucleótido, en particular un compuesto de ácido nucleico de doble cadena divulgado ebn este documento que se dirige a un ARNm transcrito del gen p53, o una sal farmacéuticamente aceptable de dicho compuesto, o una composición farmacéutica que comprende dicho compuesto, o una composición farmacéutica que comprende una sal farmacéuticamente aceptable de dicho compuesto, en una cantidad eficaz para subregular la expresión del gen p53 in vivo. En particular, los métodos in vivo divulgados en el presente documento son útiles para el tratamiento de una enfermedad o un trastorno asociado con la expresión de un gen p53.

En particular, el método en cuestión puede usarse para inhibir la expresión de un gen p53 para el tratamiento de una enfermedad o un trastorno o una condición, tal como, sin limitarse a, una enfermedad o un trastorno o una condición divulgada en el presente documento.

En este documento se describen compuestos de ARNdc químicamente modificados, o sales farmacéuticamente aceptables de dichos compuestos, que subregulan la expresión de un gen p53 transcrito en ARNm que tiene una secuencia de polinucleótidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NOS: 1-7 y composiciones farmacéuticas que comprenden uno o más de tales compuestos o composiciones farmacéuticas que comprenden una sal farmacéuticamente aceptable de uno o más de dichos compuestos.

De acuerdo con algunos ejemplos de los compuestos de ácido nucleico divulgados en el presente documento, el compuesto de ácido nucleico es un oligorribonucleótido dúplex en el que la cadena sentido es sustancialmente complementaria a un segmento de nucleótido consecutivo 18-40 de la secuencia polinucleotídica del ARNm de un gen p53, y la cadena antisentido es sustancialmente complementaria a la cadena sentido. En general, se tolera cierta desviación de la secuencia del ARNm objetivo sin comprometer la actividad del ARNpi (como se describe en, por ejemplo, Czaudema et al., Nuc. Acids Res. 2003, 31 (11): 2705-2716). En algún ejemplo, el compuesto de ácido nucleico divulgado en el presente documento subregula la expresión del gen p53 en un nivel postranscripcional con o sin destruir el ARNm. Sin estar ligado a ninguna teoría, el compuesto de ácido nucleico divulgado en el presente documento puede dirigirse al ARNm para su escisión y degradación específicas y/o puede inhibir la traducción del mensaje dirigido.

En algunos ejemplos, el compuesto de ácido nucleico de doble cadena tiene un extremo romo, en uno o ambos extremos. Más específicamente, el compuesto de ácido nucleico de doble cadena puede tener un extremo romo en el extremo definido por el terminal 5' de la primera cadena y el terminal 3' de la segunda cadena, o el extremo definido por el terminal 3' de la primera cadena y el terminal 5' de la segunda cadena.

En otros ejemplos, al menos una de las dos cadenas puede tener una saliente unida covalentemente en el terminal 3' de la cadena en la que está presente. Cada saliente puede consistir independientemente en 1-5 nucleótidos consecutivos, 1-5 análogos de nucleótidos de pirazolotriazina (PT), 1-5 restos no nucleotídicos consecutivos o una combinación de los mismos, o un resto conjugado.

La longitud de un dúplex de compuesto de ácido nucleico de doble cadena es de aproximadamente 18 a aproximadamente 40 nucleótidos, preferiblemente de 19 a 23 nucleótidos. Además, cada cadena (oligómero) puede tener independientemente una longitud seleccionada del grupo que consiste en aproximadamente 18 a aproximadamente 40 bases, preferiblemente 18 a 23 bases y más preferiblemente 19, 20 o 21 nucleótidos.

Adicionalmente, en ciertos ejemplos preferidos, el compuesto de ácido nucleico tiene una estructura de doble cadena; en el que la secuencia de oligonucleótidos de una de las cadenas se selecciona de una de las SEQ ID NOS: 8-20 y en la que la secuencia de oligonucleótidos de la otra cadena se selecciona de una de las SEQ ID NOS: 21-33; o una sal farmacéuticamente aceptable de dicho compuesto. En algunos ejemplos, la complementariedad entre una de las cadenas del compuesto de ácido nucleico y el ARN objetivo (SEQ ID NOS: 1-7) es perfecta. En algunos ejemplos, una de las cadenas del compuesto de ácido nucleico es sustancialmente complementaria al ARN objetivo (SEQ ID NOS: 1-7), es decir, que tiene uno, dos o hasta tres faltas de coincidencia entre dicha cadena y el ARN objetivo. En algunos ejemplos, la complementariedad entre las cadenas del compuesto de ácido nucleico de doble cadena es perfecta. En algunos ejemplos, las cadenas del compuesto de ácido nucleico de doble cadena son sustancialmente complementarias, es decir, tienen uno, dos o hasta tres faltas de coincidencia entre las cadenas.

Además, el terminal 5' de la primera cadena del compuesto de ácido nucleico de doble cadena puede estar unido al términal 3' de la segunda cadena, o el términal 3' de la primera cadena puede estar unido a el terminal 5' de la segunda cadena, siendo dicho enlace a través de un enlazador de ácido nucleico que tiene típicamente una longitud de entre 3 y 100 nucleótidos, preferiblemente de aproximadamente 3 a aproximadamente 10 nucleótidos.

Los compuestos de ácido nucleico de doble cadena divulgados en el presente documento poseen estructuras y modificaciones que imparten uno o más de mayor actividad, mayor estabilidad, toxicidad reducida, efecto diana reducido y/o respuesta inmune reducida. En los ejemplos preferidos, los compuestos de ácido nucleico de doble cadena divulgados en el presente documento poseen estructuras y modificaciones que imparten una mayor actividad. Las estructuras de ácido nucleico de doble cadena divulgadas en este documento se aplican beneficiosamente a compuestos de ARN de doble cadena útiles para prevenir o atenuar la expresión del gen objetivo, en particular el gen p53.

En varios ejemplos, los compuestos de ácido nucleico divulgados en el presente documento comprenden al menos un nucleótido modificado seleccionado del grupo que consiste en una modificación de azúcar, una modificación de base y una modificación de enlace internucleótido. Por consiguiente, los compuestos de oligonucleótidos químicamente modificados divulgados en el presente documento pueden contener nucleótidos modificados tales como ADN, LNA (ácido nucleico bloqueado), e Na (ácido nucleico con puente de etileno), PNA (ácido nucleico peptídico), arabinosido, PACE, nucleósido especular o nucleótidos con un azúcar de 6 carbonos. Ejemplos de nucleótidos PACE y análogos se divulgan en las patentes de Estados Unidos Nos. 6.693.187 y 7.067.641.

El oligonucleótido puede comprender además 2'-O-metilo o 2'-flúor o 2'-O-alilo o cualquier otra modificación 2', opcionalmente en posiciones alternativas. También son posibles otras modificaciones de estabilización, que no reducen significativamente la actividad (por ejemplo, modificaciones terminales). La cadena principal de la parte activa del oligonucleótido puede comprender entidades fosfato-D-ribosa, pero también puede contener entidades tiofosfato-D-ribosa, triéster, tioato, cadena principal con puente 2'-5' (también puede denominarse 5'-2'), PACE o cualquier otro tipo de modificación. Las modificaciones terminales en la parte 5' y/o 3' de los oligonucleótidos pueden estar presentes o ausentes. Dichas modificaciones terminales pueden ser lípidos, péptidos, azúcares, restos abásicos invertidos u otras moléculas.

La presente divulgación se refiere a secuencias de oligonucleótidos (SEQ ID NOS: 8-33) útiles para la generación de compuestos de ácido nucleico que subregulan la expresión del gen p53, tales como nuevos compuestos modificados de ácido nucleico de doble cadena divulgados en el presente documento. Las secuencias de oligonucleótidos de la presente divulgación se aplican beneficiosamente a compuestos de ácido nucleico de doble cadena útiles para prevenir o atenuar la expresión del gen p53. Las secuencias de oligonucleótidos de 21 o 23 mer también pueden generarse mediante la extensión 5' y/o 3' de las secuencias de 19 mer divulgadas en el presente documento. Dicha extensión es preferiblemente complementaria a la secuencia correspondiente de ARNm de p53.

También se describe en el presente documento el uso de compuestos de ácido nucleico en el tratamiento de diversas enfermedades y afecciones médicas.

Los métodos, moléculas y composiciones que subregulan la expresión del gen p53 se describen en el presente documento y se analizan en este documento en detalle, y cualquiera de dichas moléculas y/o composiciones se emplean beneficiosamente en el tratamiento de un sujeto que sufre de una o más de dichas afecciones. Las enfermedades particulares y las condiciones médicas a tratar se describen en este documento.

ARNdc y ARN de iInterferencia

El ARN de interferencia (ARNi) es un fenómeno que implica el silenciamiento postranscripcional específico del gen dependiente de ARN de doble cadena (dc). Los intentos iniciales de estudiar este fenómeno y manipular las células de mamíferos de manera experimental se vieron frustrados por un mecanismo de defensa antiviral activo, no específico, que se activó en respuesta a las moléculas de ARNdc largo (Gil et al., Apoptosis, 2000. 5: 107-114). Más tarde, se descubrió que los dúplex sintéticos de 21 ARN de nucleótidos podían mediar ARNi específico del gen en células de mamíferos, sin estimular los mecanismos de defensa antivirales genéricos (Elbashir et al., Nature 2001, 411: 494-498 y Caplen et al., PNAS 2001, 98: 9742-9747). Como resultado, los ARN pequeños de interferencia (ARNpi), que son ARN cortos de doble cadena, se han utilizado ampliamente para inhibir la expresión de genes y comprender la función de los genes.

El ARN de interferencia (ARNi) está mediado por ARN pequeños de interferencia (ARNpi) (Fire et al., Nature 1998, 391: 806) o microARN (miARN) (Ambros V. Nature 2004, 431: 350-355); y Bartel DP. Cell. 2004 116 (2): 281-97). El proceso correspondiente se denomina comúnmente a un silenciamiento génico postranscripcional específico cuando se observa en plantas y a una represión cuando se observa en hongos.

Un compuesto de ARNpi es un ARN de doble cadena que subregula o silencia (es decir, inhibe total o parcialmente) la expresión de un gen endógeno o exógeno/ARNm. La interferencia de ARN se basa en la capacidad de ciertas especies de ARNdc para ingresar a un complejo de proteínas específico, donde luego se dirigen a los ARN celulares complementarios y los degradan específicamente. Por lo tanto, la respuesta del ARN de interferencia presenta un complejo de endonucleasa que contiene un ARNpi, comúnmente denominado complejo silenciador inducido por ARN (RISC), que media la escisión del ARN de cadena sencilla que tiene una secuencia complementaria a la cadena antisentido del dúplex de ARNpi. La escisión del ARN objetivo puede tener lugar en el centro de la región complementaria a la cadena antisentido del dúplex de ARNpi (Elbashir, et al., Genes Dev., 2001, 15: 188). Con más detalle, los ARNdc más largos se digieren en fragmentos de ARNdc cortos (17-29 pb) (también conocidos como ARN pequeños inhibidores o "ARNpi") por las ARNasas tipo III (DICER, DROSHA, etc., (véase Bernstein et al., Nature, 2001, 409: 363-6 y Lee et al., Nature, 2003, 425: 415-9). El complejo de proteínas RISC reconoce estos fragmentos y al ARNm complementario. Todo el proceso se completa con la escisión con endonucleasa del ARNm objetivo (McManus y Sharp, Nature Rev Genet, 2002, 3: 737-47; Paddison y Hannon, Curr Opin Mol Ther. 2003, 5 (3): 217-24) (Para obtener información adicional sobre estos términos y mecanismos propuestos, véase por ejemplo , Bernstein, et al., ARN. 2001, 7 (11): 1509-21; Nishikura, Cell. 2001, 107 (4): 415-8 y la publicación PCT No. WO 01/36646).

La selección y síntesis de compuestos de ARNdc correspondientes a genes conocidos se ha informado ampliamente; véase, por ejemplo, Ui-Tei et al., J Biomed Biotechnol. 2006; 65052; Chalk et al., BBRC. 2004, 319 (1): 264-74; Sioud y Leirdal, Met. Mol Biol.; 2004, 252: 457-69; Levenkova et al., Bioinform. 2004, 20 (3): 430-2; Ui-Tei et al., NAR 2004, 32 (3): 936-48. Para ejemplos del uso y producción de ARNpi modificado, véase Braasch et al., Biochem., 2003, 42 (26): 7967-75; Chiu et al., ARN, 2003, 9 (9): 1034-48; las publicaciones PCT WO 2004/015107 (atugen); WO 02/44321 (Tuschl et al.), y las patentes de Estados Unidos Nos. 5.898.031 y 6.107.094.

Varios grupos han descrito el desarrollo de vectores basados en ADN capaces de generar ARNpi dentro de las células. El método generalmente implica la transcripción de ARN de horquilla corta que se procesan de manera eficiente para formar ARNpi dentro de las células (Paddison et al., PNAS USA 2002, 99: 1443-1448; Paddison et al., Genes & Dev 2002, 16: 948-958; Sui et al., PNAS USA 2002, 8: 5515-5520 y Brummelkamp et al., Science 2002, 296: 550-553).

Estos informes describen métodos para generar ARNpi capaces de dirigirse específicamente a numerosos genes expresados de forma endógena y exógena.

Los estudios han revelado que ARNpi puede ser efectivo tanto en mamíferos como en humanos. Específicamente, Bitko et al., mostraron que los ARNpi específicos dirigidos contra el gen N de la nucleocápside del virus sincitial respiratorio (RSV) son efectivos en el tratamiento de ratones cuando se administran por vía intranasal (Nat. Med. 2005, 11 (1): 50-55). Para revisiones de aplicaciones terapéuticas de los ARNpI, consulte por ejemplo Barik (Mol. Med 2005, 83: 764-773) y Chakraborty (Current Drug Targets 2007 8 (3): 469-82). Además, se han realizado estudios clínicos con ARNpi cortos que se dirigen al receptor VEGFR1 para tratar la degeneración macular relacionada con la edad (AMD) en pacientes humanos (Kaiser, Am J. Ophthalmol. 2006 142 (4): 660-8). Se puede encontrar más información sobre el uso de ARNpi como agentes terapéuticos en Durcan, 2008. Mol. Farma 5 (4): 559-566; Kim y Rossi, 2008. BioTechniques 44: 613-616; Grimm y Kay, 2007, JCI, 117 (12): 3633-41.

Síntesis química

Los compuestos divulgados en el presente documento pueden sintetizarse mediante cualquiera de los métodos que son bien conocidos en la técnica para la síntesis de oligonucleótidos ribonucleicos (o desoxirribonucleicos). Dicha síntesis se describe, entre otras, en Beaucage e Iyer, Tetrahedron 1992; 48: 2223-2311; Beaucage e Iyer, Tetrahedron 1993; 49: 6123-6194 y Caruthers, et. al., Methods Enzymol. 1987; 154: 287-313; La síntesis de tioatos se describe, entre otros, en Eckstein, Annu. Rev. Biochem. 1985; 54: 367-402, la síntesis de moléculas de ARN se describe en Sproat, en Humana Press 2005 editada por Herdewijn P.; Kap. 2: 17-31 y los respectivos procesos posteriores se describen, entre otros, en Pingoud et. al., en IRL Press 1989 editado por Oliver R.W.A .; Kap. 7: 183-208.

Otros procedimientos sintéticos son conocidos en la técnica, por ejemplo, los procedimientos divulgados en Usman et al., 1987, J. Am. Chem. Soc., 109, 7845; Scaringe et al., 1990, NAR., 18, 5433; Wincott et al., 1995, NAR. 23, 2677 2684; y Wincott et al., 1997, Methods Mol. Bio., 74, 59, y estos procedimientos pueden hacer uso de grupos de protección y acoplamiento de ácidos nucleicos comunes, tales como dimetoxitritilo en el exremo 5', y fosforamiditas en el extremo 3'. Los nucleótidos modificados (por ejemplo, 2'-O-metilados) y los nucleótidos no modificados se incorporan según se desee.

Los oligonucleótidos divulgados en el presente documento pueden sintetizarse por separado y unirse de manera post sintética, por ejemplo, mediante ligación (Moore et al., 1992, Science 256, 9923; Draper et al., publicación internacional de patente No. w O 93/23569 Shabarova et al., 1991, NAR 19, 4247; Bellon et al., 1997, Nucleosides & Nucleotides, 16, 951; Bellon et al., 1997, Bioconjugate Chem. 8, 204), o por hibridación después de la síntesis y/o desprotección.

Se observa que se puede usar una máquina disponible comercialmente (disponible, entre otros, a través de Applied Biosystems); Los oligonucleótidos se preparan de acuerdo con las secuencias divulgadas en el presente documento. Se pueden ligar pares superpuestos de fragmentos sintetizados químicamente usando métodos bien conocidos en la técnica (por ejemplo, véase la patente de Estados Unidos No. 6.121.426). Las cadenas se sintetizan por separado y luego se hibridad entre sí en el tubo. Luego, los ARNpi de doble cadena se separan de los oligonucleótidos de cadena sencilla que no fueron hibridados (por ejemplo, debido al exceso de uno de ellos) por HPLC. En relación con los ARNpi o fragmentos de ARNpi de la presente divulgación, dos o más de tales secuencias se pueden sintetizar y unir entre sí para su uso en la presente divulgación.

Los compuestos divulgados en el presente documento también se pueden sintetizar a través de la metodología de síntesis en tándem, como se describe, por ejemplo, en la publicación de patente de Estados Unidos No. US 2004/0019001 (McSwiggem) en el que ambas cadenas de ARNpi se sintetizan como un único fragmento o cadena de oligonucleótidos contiguos separados por un enlazador escindible que posteriormente se escinde para proporcionar fragmentos o cadenas de ARNpi separados que hibridan y permiten la purificación del dúplex de ARNpi. El enlazador puede ser un enlazador polinucleotídico o un enlazador no nucleotídico.

Se divulga adicionalmente en este documento una composición farmacéutica que comprende dos o más moléculas de ácido nucleico para el tratamiento de cualquiera de las enfermedades y afecciones mencionadas en el presente documento, por lo que dichas dos moléculas pueden mezclarse físicamente juntas en la composición farmacéutica en cantidades que generan actividad igual o de otra manera beneficiosa, o pueden unirse covalentemente o no covalentemente, o unirse entre sí mediante un enlazador de ácido nucleico de una longitud que varía de 2 a 100, preferiblemente de 2 a 50 o de 2 a 30 nucleótidos. En un ejemplo, las moléculas de ácido nucleico comprenden una estructura de ácido nucleico de doble cadena como se describe en el presente documento, en la que las dos moléculas de ácido nucleico se seleccionan de los oligonucleótidos divulgados en el presente documento. Por lo tanto, las moléculas de ácido nucleico pueden estar unidas de forma covalente o no covalente o unidas mediante un enlazador para formar un compuesto de ARNpi en tándem. Tales moléculas de ARNdc en tándem que comprenden dos secuencias de ARNpi tienen típicamente una longitud de 38-150 nucleótidos, más preferiblemente una longitud de 38 o 40-60 nucleótidos, y por lo tanto más largas si se incluyen más de dos secuencias de ARNpi en la molécula en tándem. También se contempla un compuesto en tándem más largo que comprende dos o más secuencias más largas que codifican el ARNpi producido a través del procesamiento celular interno, por ejemplo, ARNdc largos, al igual que una molécula en tándem que codifica dos o más ARNhc. Tales moléculas en tándem también se consideran parte de la divulgación. Se contempla un compuesto que comprende dos secuencias de ARNdc (Tándem) o más (ARNi estrella) divulgadas en este documento. Ejemplos de tales moléculas "en tándem" o "estrella" se proporcionan en la publicación de patente PCT No. WO 2007/091269, asignada al cesionario de la presente solicitud.

Las moléculas de ácido nucleico que se dirigen a p53 pueden ser el principal componente activo en una composición farmacéutica, o pueden ser un componente activo de una composición farmacéutica que contiene dos o más ácidos nucleicos (o moléculas que codifican o producen de manera endógena dos o más ácidos nucleicos) , ya sea una mezcla de moléculas o una o más moléculas en tándem que codifican dos o más compuestos de ácido nucleico), dicha composición farmacéutica además comprende una o más moléculas de ácido nucleico adicionales que se dirigen a uno o más genes adicionales. La inhibición simultánea de dicho gen o genes adicionales tendrá probablemente un efecto aditivo o sinérgico para el tratamiento de las enfermedades divulgadas en este documento.

Adicionalmente, el ácido nucleico divulgado en el presente documento o cualquier molécula de ácido nucleico que comprende o codifica dicho ácido nucleico puede unirse o enlazarse (covalentemente o no covalentemente) a anticuerpos (incluidas las moléculas de aptámero) contra moléculas internalizables de la superficie celular expresadas en las células objetivo, con el fin de lograr un direccionamiento mejorado para el tratamiento de las enfermedades divulgadas en este documento. Por ejemplo, el anticuerpo anti-Fas (preferiblemente un anticuerpo neutralizante) puede combinarse (covalentemente o no covalentemente) con cualquier ARNdc. En otro ejemplo, un aptámero que puede actuar como un ligando/anticuerpo puede combinarse (covalentemente o no covalentemente) con cualquier compuesto de ácido nucleico.

Las moléculas de ácido nucleico divulgadas en el presente documento pueden administrarse directamente o con vectores virales o no virales. Cuando se administra directamente, las secuencias generalmente se hacen resistentes a las nucleasas. Alternativamente, las secuencias se pueden incorporar en casetes de expresión o construcciones de tal manera que la secuencia se exprese en la célula como se discute a continuación. En general, el constructo contiene la secuencia reguladora adecuada o el promotor para permitir que la secuencia se exprese en la célula seleccionada. Los vectores usados opcionalmente para el suministro de los compuestos de la presente divulgación están disponibles comercialmente, y pueden modificarse con el fin de suministrar los compuestos de la presente divulgación por métodos conocidos por los expertos en la técnica.

Modificaciones quimicas

Todos los análogos de, o modificaciones a, un nucleótido/oligonucleótido pueden emplearse con la presente descripción, siempre que dicho análogo o modificación no afecte sustancialmente la función del nucleótido/oligonucleótido. Los nucleótidos pueden seleccionarse a partir de bases modificadas naturales o sintéticas. Las bases naturales incluyen adenina, guanina, citosina, timina y uracilo. Las bases modificadas de nucleótidos se describen en el presente documento.

Además, pueden prepararse análogos de polinucleótidos en los que la estructura de uno o más nucleótidos está fundamentalmente alterada y se adapta mejor como reactivos terapéuticos o experimentales. Un ejemplo de un análogo de nucleótido es un ácido nucleico peptídico (PNA) en el que la cadena principal de fosfato de desoxirribosa (o ribosa) en el ADN (o ARN) se reemplaza con una cadena principal de poliamida que es similar a la que se encuentra en péptidos. Se ha demostrado que los análogos de PNA son resistentes a la degradación enzimática y que tienen una estabilidad extendida in vivo e in vitro. Otras modificaciones que se pueden hacer a los oligonucleótidos incluyen cadenas principales de polímeros, cadenas principales cíclicas, cadenas principales acíclicas, cadenas principales de tiofosfato-D-ribosa, cadenas principales de triéster, cadenas principales de tioato, cadena principal con puente 2'-5', ácidos nucleicos artificiales, ácidos nucleicos morfolinos, ácido nucleico bloqueado (LNA), ácido nucleico de glicol (GNA), ácido nucleico de treosa (TNA), arabinosido y nucleósido especular (por ejemplo, beta-L-desoxinucleósido en lugar de beta-D-desoxinucleósido). Los ejemplos de moléculas de ARNdc que comprenden nucleótidos de LNA se describen en Elmen et al., (NAR 2005, 33 (1): 439-447).

Los compuestos de ácido nucleico divulgados en el presente documento se pueden sintetizar utilizando uno o más nucleótidos invertidos, por ejemplo timidina invertida o adenina invertida (véase, por ejemplo, Takei, et al., 2002, JBC 277 (26): 23800-06) .

El término "resto no convencional", como se usa en el presente documento, se refiere a un resto de ribosa abásico, un resto de desoxirribosa abásico, un desoxirribonucleótido, un desoxirribonucleótido modificado, un nucleótido especular, un ácido nucleico de treosa (TNA), un análogo del nucleótido de pirazolotriazina (PT) un análogo de nucleótido sin emparejamiento de bases y un nucleótido unido a un nucleótido adyacente por un enlace fosfato internucleótido 2'-5'; restos de C3, C4, C5 y C6; ácidos nucleicos puenteados que incluyen LNA y ácidos nucleicos puenteados con etileno.

Los términos "cap" o "resto de protección" como se usan en este documento incluyen un resto de ribosa abásica, un resto de desoxirribosa abásica, modificaciones de ribosa abásica y restos de desoxirribosa abásica incluyendo modificaciones 2'-O- alquilo; ribosa abásica invertida, restos de desoxirribosa abásica invertida (idAb) y modificaciones de los mismos; resto de amino-C6 (AM-c6), C6-imino-Pi; un resto no nucleotídico, un nucleótido especular que incluye L-ADN y L-ARN; nucleótido 5'OMe; un fosfodiéster 5,6,7,8-tetrahidro-2-naftaleno butírico (THNB), una vitamina, un resto farmacológico y un análogo de nucleótido que incluye, sin limitación, un nucleótido de 4',5'-metileno; 1-(p-Deritrofuranosil)nucleótido; nucleótido4’-tio, nucleótido carbocíclico; fosfato de 5’-amino-alquilo; fosfato de 1,3-diamino-2- propilo, fosfato de 3-aminopropilo; fosfato de 6-aminohexilo; fosfato de 12-aminododecilo; fosfato de hidroxipropilo; nucleótido de 1,5-anhidrohexitol; alfa-nucleótido; nucleótido treo-pentofuranosilo; nucleótido acíclico 3’,4’-secoaddico; nucleótido 3,4-dihidroxibutilo; nucleótido 3,5-dihidroxipentil, resto abásico invertido en 5’-5’; fosfato de 1,4 butanodiol; 5’-amino; y metilfosfonato con puente o sin puente y restos 5’-mercapto.

El resto de desoxirribosa abásica incluye, por ejemplo, desoxirribosa-3’-fosfato abásica; 1,2-didesoxi-D-ribofuranosa-3- fosfato; 1,4-anhidro-2-desoxi-D-ribitol-3-fosfato. El resto de desoxirribosa abásica invertida incluye desoxiriboabásico invertida; 5’-fosfato deoxiriboabasio invertido en 3’,5’.

Un nucleótido "especular" es un nucleótido con quiralidad inversa al nucleótido natural o empleado comúnmente, es decir, una imagen especular (L-nucleótido) del de origen natural (D-nucleótido). El nucleótido puede ser un ribonucleótido o un desoxirribonucleótido y puede comprender además al menos una modificación de azúcar, base y/o cadena principal. La patente de Estados Unidos N° 6.602.858 describe catalizadores de ácido nucleico que comprenden al menos una sustitución de L-nucleótido. El nucleótido especular incluye, por ejemplo, L-ADN (L-desoxiriboadenosina-3’-fosfato (dA especular); L-desoxirribocitidina-3’-fosfato (dC especular); L-desoxirriboguanosina-3’-fosfato (dG especular); L-desoxirribotimidina-3’-fosfato (imagen especular de dT) y L-ARN (L-riboadenosina-3’-fosfato (rA especular); L-ribocitidina-3’-fosfato (rC especular); L-riboguanosina-3’-fosfato (rG especular); L-ribouracil-3’-fosfato (dU especular).

Los análogos de nucleótidos de pirazolotriazina (PT) útiles se describen mediante la fórmula general I:

(I)

en la que

R-i y R⁴se seleccionan cada uno independientemente de H, halógeno, -CN, -SCN, -NO², -O-hidrocarbilo, -S-hidrocarbilo, -CO-H, -CO-hidrocarbilo, -NR⁸R⁹, heteroarilo o hidrocarbilo opcionalmente sustituido por uno o más grupos, cada uno independientemente es halógeno, -CN, -SCN, o -NO2, en la que R⁸y R9 son cada uno independientemente H, hidrocarbilo, o un grupo protector de amina; o R⁸y R9 junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos forman un anillo heterocíclico saturado o insaturado que contiene opcionalmente 1-2 heteroátomos adicionales seleccionados de oxígeno, nitrógeno o azufre;

R2 es H o ausente;

R3 es O o -NR10R10’, en la que R10 y R10’ son cada uno independientemente H, hidrocarbilo, -CO-hidrocarbilo, o un grupo protector de amina; y

R5 es H, halógeno, -O, o -OR11;

R⁶es -O-, o -OR11;

R7 es -OR11, o un resto fosfato;

R-n cada uno independientemente es H, alquilo (C-i-C⁸), alquileno (C-i-C⁸)-OR¹², alquileno (C-i-C⁸)-SR¹², alquileno (Cr C8)-NR12R13, un grupo protector hidroxilo, o un resto de fosforamidita de la fórmula P(OR-i4)NR15R-i6, en la que R14 es H o cianoalquilo (C-i-C⁸), preferiblemente cianoetilo, y R¹⁵y R¹⁶son cada uno independientemente es H o alquilo (C-i-C⁸), preferiblemente isopropilo;

R¹²y R¹³son cada uno independientemente H o alquilo (C-i-C³); y

la línea de puntos representa un doble enlace potencial entre el átomo de carbono en la posición 4 y el átomo de nitrógeno en la posición 3 o el residuo R3, siempre que, cuando R2 es H, existe un doble enlace entre el átomo de carbono en la posición 4 y R3 , y cuando R2 está ausente, existe un doble enlace entre el átomo de carbono en la posición 4 y el átomo de nitrógeno en la posición 3, pero excluyendo los análogos en los que R⁵y R⁶son cada uno independientemente -OH o -O-, y los análogos en donde R5 es H y R1 es hidrocarbilo.

En varios ejemplos proporcionados en el presente documento es una molécula de ácido nucleico de doble cadena que comprende un análogo del nucleótido de PT de la fórmula general II:

(II)

en la que

R¹y R⁴se seleccionan cada uno independientemente de H, halógeno, -CN, -SCN, -NO², -O-hidrocarbilo, -S-hidrocarbilo, -CO-H, -CO-hidrocarbilo, -NR8R9, heteroarilo o hidrocarbilo opcionalmente sustituidos por uno o más grupos, cada uno independientemente un halógeno, -CN, -SCN, o -NO², en la que R8 y R⁹son cada uno independientemente H o hidrocarbilo, o R8 y R9 junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos forman un anillo heterocíclico saturado o insaturado que contiene opcionalmente 1-2 heteroátomos adicionales seleccionados de oxígeno, nitrógeno o azufre;

R²es H o ausente;

R3 es O o -NR10R1o', en la que R10 y R10 son cada uno independientemente H, hidrocarbilo o -CO-hidrocarbilo;

R⁵es H, halógeno, -O- o -OR¹¹;

R6 es -O- o -OR11,

R7 es OR11, un resto monofosfato o un resto de enlace fosfato; y

R11, cada uno independientemente, es H, alquilo (C1-C8), alquileno (C1-C8)-OR12, alquileno (C1-C8)-SR12, o alquileno (C1-C8) NR12R13, en la que R12 y R13 son cada uno independientemente H o alquilo (C1-C8); y

la línea de puntos representa un doble enlace potencial entre el átomo de carbono en la posición 4 y el átomo de nitrógeno en la posición 3 o el radical R3, siempre y cuando R2 es H, existe un doble enlace entre el átomo de carbono en la posición 4 y R3, y cuando R2 está ausente, existe un doble enlace entre el átomo de carbono en la posición 4 y el átomo de nitrógeno en la posición 3.

En algunos ejemplos, el análogo del nucleótido de PT comprende un análogo del nucleótido de PT de adenina de Fórmula IIa, o un análogo del nucleótido de PT de guanina de Fórmula IIb, como sigue en la Tabla I:

Tabla I: Análogos de nucleótidos PT de adenina y guanina de fórmulas IIa y IIb:

En algunos ejemplos preferidos, el análogo del nucleótido pirazolotriazina (PT) es un análogo del nucleótido de PTadenina de fórmula IIa (es decir, R2 está ausente y R3 es NHR10) en la que R1 es H, R10 es H; R4 es H; R5 es H, halógeno o -OR¹¹, en la que R¹¹es H, alquilo (C¹-C⁸), alquileno (Ci-C⁸)-ORi², alquileno (Ci-C⁸)-SRi²o alquileno (Ci-C8)-NR12R13, en la que R12 y R13 cada uno es independientemente H o alquilo (C1-C8); R6 es -O- o -OH; y R7 es OH o un resto de unión a fosfato. En algunos ejemplos, R11 es H, CH3 o (CH2)2-OCH3. En algunos ejemplos, R11 es H (es decir, R5 es hidroxi; 2'OH). En algunos ejemplos, R11 es CH3 (es decir, R5 es metoxi, 2'OMe). En algunos ejemplos, R11 es (CH2)2-OCH3 (es decir, R5 es metoxietoxi; 2'MOE).

En algunos ejemplos preferidos, el análogo del nucleótido de pirazolotriazina (PT) es un análogo del nucleótido de PT de desoxiadenosina de fórmula IIa en donde R1 es H, R10 es H; R4 es H; R5 es H o halógeno; R⁶es -O- o -OH; y R7 es OH o un resto fosfato. En algunos ejemplos, R5 es H. En algunos ejemplos, R5 es halógeno, preferiblemente flúor (F).

En algunos ejemplos preferidos, el análogo nucleótido pirazolotriazina (PT) es un análogo del nucleótido de PT de guanosina de fórmula IIb en el que cada uno de R4R8 y R9 es H, R5 es -OR11, en la que R11 es H, alquilo (C1-C8), ) alquileno(C1-C8)-OR12, alquileno (C1-C8)-SR12, o alquileno (C1-C8)-NR12R13, en la que R12 y R13 cada uno es independientemente H o alquilo (C1-C8); R⁶es -O‘ o -OH; y R7 es OH o un resto fosfato. En algunos ejemplos, R11 es H, CH3 o (CH2)2-OCH3. En algunos ejemplos, R11 es H (es decir, R3 es hidroxi; 2'OH). En algunos ejemplos, R11 es CH3 (es decir, R5 es metoxi, 2'-OMetilo). En algunos ejemplos, R11 es (CH2)2-OCH3 (es decir, R5 es metoxietoxi; 2'MOE).

En algunos ejemplos preferidos, el análogo de nucleótido de pirazolotriazina (PT) es un análogo del nucleótido de PT desoxiguanosina de fórmula IIb (es decir, R2 es H y R3 es O) en la que cada uno de R4, R⁸y R9 es H, R5 es H, halógeno o -OR11; R⁶es -O ‘ o -OH; y R7 es OH o un resto de unión a fosfato. En algunos ejemplos, R5 es H. En algunos ejemplos, R5 es halógeno, preferiblemente flúor (F).

En algunos ejemplos de los compuestos de ácido nucleico divulgados en el presente documento, la cadena principal de los oligonucleótidos se modifica y comprende entidades fosfato-D-ribosa, pero también puede contener entidades tiofosfato-D-ribosa, triéster, tioato, cadena principal con puente 2'-5' (también se puede denominar como nucleótido enlazado 2'-5' o 5'-2'), PACE y similares. Las modificaciones adicionales incluyen enlaces fosfotriéster reversibles o lábiles, tales como las divulgados en los documentos US20090093425 y US20110294869, respectivamente.

En algunos ejemplos de los compuestos de ácido nucleico divulgados en el presente documento,

la cadena sentido está fosforilada o no fosforilada tanto en el terminal 3' como en el terminal 5'. En algunos ejemplos de los compuestos de ácido nucleico divulgados en el presente documento,

la cadena antisentido está fosforilada o no fosforilada tanto en el terminal 3' como en el terminal 5'. En algunos ejemplos de los compuestos de ácido nucleico divulgados

en el presente documento, el ribonucleótido en el terminal 3' y en el terminal 5' en cada una de las cadenas antisentido y la cadena sentido está fosforilado. En algunos ejemplos de los compuestos de ácido nucleico divulgados en el presente documento, el ribonucleótido en el terminal 3' y en el terminal 5' en cada una de la cadena antisentido y la cadena sentido no está fosforilado. En algunos ejemplos de los compuestos de ácido nucleico divulgados en el presente documento,

en cada una de la cadena antisentido y la cadena sentido, el ribonucleótido en el terminal 3' está fosforilado y el ribonucleótido en el terminal 5' no está fosforilado.

el ribonucleótido modificado comprende una modificación en la posición 2' del resto de azúcar. En algunos ejemplos de los compuestos de ácido nucleico divulgados en le presente documento, el ribonucleótido modificado es un ribonucleótido modificado con azúcar 2'-O-metilo.

el resto no convencional se selecciona de un nucleótido especular, un ácido nucleico de treosa (TNA), un análogo del nucleótido de pirazolotriazina (PT) y un ribonucleótido unido a un ribonucleótido adyacente por un enlace de fosfato internucleótido 2'-5'.

el resto no convencional es un análogo de nucleótido. En algunos ejemplos de los compuestos de ácido nucleico divulgados en el presente documento, el resto no convencional es un análogo del nucleótido de pirazolotriazina (PT). En algunos ejemplos preferidos de los compuestos de ácido nucleico divulgados en el presente documento, está presente un análogo del nucleótido de pirazolotriazina (PT). En algunos ejemplos preferidos de los compuestos de ácido nucleico divulgados en el presente documento, el análogo del nucleótido de pirazolotriazina (PT) está presente solo en la cadena antisentido. En algunos ejemplos preferidos de los compuestos de ácido nucleico divulgados en el presente documento, el análogo del nucleótido de pirazolotriazina (PT) está presente en la cadena antisentido una vez en una de las posiciones 4-7 (5'> 3'). En algunos ejemplos preferidos de los compuestos de ácido nucleico divulgados en el presente documento, el análogo del nucleótido de pirazolotriazina (PT) está presente en la cadena antisentido dos veces: en la posición 1 (5'> 3') y en una de las posiciones 4, 5, 6 o 7 (5'> 3'). En varios ejemplos de los compuestos de ácido nucleico divulgados en el presente documento, el análogo del nucleótido de pirazolotriazina (PT) está presente en la cadena antisentido y en uno o en las dos salientes (Z y/o Z') que están unidas covalentemente en el terminal 3' de la cadena en la que está presente la saliente.

En varios ejemplos de los compuestos de ácido nucleico divulgados en el presente documento, la saliente (Z o Z') está presente o ausente independientemente, pero si está presente está unida covalentemente en el terminal 3' de la cadena en la que está presente. En varios ejemplos, la saliente (Z o Z') comprende independientemente de 1 a 5 nucleótidos consecutivos, análogos de nucleótidos de pirazolotriazina (PT) o restos no nucleotídicos consecutivos o una combinación de los mismos, o una vitamina, o un resto de fármaco, unido covalentemente al terminal 3' de la cadena en la que está presente. En algunos ejemplos de los compuestos de ácido nucleico divulgados en el presente documento, ambas salientes (Z y Z') están ausentes. En otros ejemplos, Z o Z' está presente.

En algunos ejemplos de los compuestos de ácido nucleico divulgados en el presente documento, Z y/o Z' son 1-5 nucleótidos consecutivos. En algunos ejemplos, cada nucleótido es un dT, y cada uno de Z y Z' son 2 nucleótidos consecutivos (dTdT).

En algunos ejemplos de los compuestos de ácido nucleico divulgados en el presente documento, Z y/o Z' son 1-5 restos consecutivos no nucleotídicos. En algunos ejemplos, cada uno de Z y/o Z' incluye independientemente un resto no nucleotídica, tal como un resto alquilo C2, C3, C4, C5 o C⁶, opcionalmente un 1,3-propanodiol, mono(dihidrógeno fosfato) (C3) [CAS RN: 13507-42-1] o un derivado del mismo que incluye propanol (C3-OH/C3OH), propanodiol y un derivado fosfodiéster de propanodiol ("C3Pi"). En algunos ejemplos, cada uno de Z y/o Z' incluye dos restos hidrocarbonados y en algunos ejemplos es C3Pi-C3OH o C3Pi-C3Pi. Cada C3 está conjugado covalentemente a un C3 adyacente a través de un enlace covalente, preferiblemente un enlace basado en fósforo. En algunos ejemplos, el enlace a base de fósforo es un fosforotioato, un fosfonoacetato o un enlace fosfodiéster.

En algunos ejemplos de los compuestos de ácido nucleico divulgados en el presente documento, cada uno de Z y Z' son 1-2 restos no nucleotídicos consecutivos. En algunos ejemplos preferidos, cada resto no nucleotídico es un 1,3-propanodiol, mono(dihidrógenofosfato) (C3). En algunos ejemplos preferidos de los compuestos de ácido nucleico divulgados en el presente documento, Z es un resto no nucleotídico C3 (C3) y Z' es dos restos no nucleotídicos C3 consecutivos (C3-C3).

el protector

está ausente.

el protector, donde está presente z”. En algunos ejemplos de los compuestos de ácido nucleico divulgados en el presente documento, el protector z” se selecciona del grupo que consiste en un resto de ribosa abásica, un resto de desoxirribosa abásica, un resto de ribosa abásica invertida, un resto desoxirribosa invertida, un resto desoxabasico invertido (idAb), amino-C⁶(AM-c⁶), C⁶-amino-Pi, un resto no nucleotídico, un nucleótido especular, un fosfodiéster 5,6,7,8-tetrahidro-2-naftaleno butírico (THNB), una vitamina y un resto farmacológico. En algunos ejemplos de los compuestos de ácido nucleico divulgados en el presente documento, el protector z” es un 1,3-propanodiol, mono(dihidrógeno fosfato) (C3). En algunos ejemplos de los compuestos de ácido nucleico divulgados en el presente documento, cada uno de N, N', N1 y N2 es un ribonucleótido no modificado, z” está ausente, Z y Z' están presentes y consisten en una saliente dTdT.

En algunos ejemplos, la saliente C3-C3 está unida covalentemente al terminal 3' de (N)x o (N')y a través de un enlace covalente, preferiblemente un enlace fosfodiéster. En algunos ejemplos, el enlace entre un primer C3 y un segundo C3 es un enlace fosfodiéster. En algunos ejemplos, la saliente no nucleotídica 3' es C3Pi-C3Pi. En algunos ejemplos, la saliente no nucleotídica 3' es C3Pi-C3P. En algunos ejemplos, la saliente no nucleotídica 3' es C3Pi-C3OH (OH es hidroxi). En algunos ejemplos, la saliente no nucleotídica 3' es C3Pi-C3OH.

En varios ejemplos, el resto alquilo comprende un derivado alquílico que incluye un resto alquilo C3, alquilo C4, alquilo C5 o alquilo c ⁶que comprende un grupo hidroxilo terminal, un grupo amino terminal o fosfato terminal. En algunos ejemplos, el resto alquilo es un resto de alquilo C3 o derivado de alquilo C3. En algunos ejemplos, el resto alquilo C3 comprende propanol, fosfato de propilo, fosforotioato de propilo o una combinación de los mismos. El resto alquilo C3 está unido covalentemente al terminal 3' de (N')y y/o al terminal 3' de (N)x a través de un enlace fosfodiéster. En algunos ejemplos, el resto alquilo comprende propanol, fosfato de propilo o fosforotioato de propilo. En algunos ejemplos, cada uno de Z y Z' se selecciona independientemente de propanol, fosfato de propilo, fosforatioato de propilo, combinaciones de los mismos o múltiplos de los mismos en particular 2 o 3 propanol, fosfato de propilo, fosforotioato de propilo, combinaciones de los mismos covalentemente unido. En algunos ejemplos, cada uno de Z y Z' se selecciona independientemente de fosfato de propilo, fosforotioato de propilo, propil fosfopropanol; fosforotioato de propilfosfo-propilo; fosfato de propilfosfo-propilo; (fosfato de propilo)3, (fosfato de propilo)2-propanol, (fosfato de propilo)2- fosforotioato de propilo. Cualquier porción conjugada de propano o propanol se puede incluir en Z o Z'.

Los ejemplos de estructuras de los restos no nucleotídicos del terminal 3' son las siguientes:

Conjugado de fenil hidrocarbilo

En algunos ejemplos, se proporcionan moléculas de ácido nucleico unidas covalentemente a un resto de fenil hidrocarbilo (PHM). En algunos ejemplos, se proporcionan moléculas de ácido nucleico que comprenden una cadena sentido y antisentido, en la que al menos una cadena está unida covalentemente a un resto de fenilo hidrocarbilo (PHM).

En algunos ejemplos, un ácido nucleico de doble cadena divulgado en el presente documento comprende una cadena sentido y una cadena antisentido, en las que la cadena sentido, la cadena antisentido o ambas se unen covalentemente directamente o mediante un enlazador a un resto que comprende un grupo fenilhidrocarbonilo, la fracción representada por la fórmula general III:

en la que

R1 y R2 cada uno se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, halógeno, grupo hidrocarbilo C1-C10, OR6, OCOR6, COOR6, CH2OR6 , CHO, COR6, NR6R7 y SR6; o R1 y R2 forman un anillo de hidrocarbilo C1-C7 cíclico saturado o insaturado opcionalmente interrumpido por hasta ²heteroátomos seleccionados de oxígeno, nitrógeno o azufre y está opcionalmente sustituido con hasta 3 grupos seleccionados independientemente del grupo que consiste de halógeno, grupo hidrocarbilo C1-C3, OR6, OCOR6, COOR6, CH2 OR6 , CHO, COR6, NR6R7, SR6 , =O, =S y = NH;

R3 es un grupo hidrocarbilo C1-C8 opcionalmente interrumpido por hasta 2 heteroátomos seleccionados de oxígeno, nitrógeno o azufre;

R4 es NH, O, S o CR6R7;

R6 y R7 se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en H y un grupo hidrocarbilo C1-C4; X es O o S;

L se selecciona del grupo que consiste en una cadena de peptidilo de hasta ¹²residuos de aminoácidos, -[CH2 -CH2-O]m-, un grupo hidrocarbilo C1-C12 opcionalmente interrumpido por hasta 2 heteroátomos seleccionados de O, N o S y R8O-;

R⁸es un grupo hidrocarbilo C 1-C 12 opcionalmente interrumpido por hasta 2 heteroátomos seleccionados de O, N o S;

n es un número entero de ⁰a ^{1 0};

m es un número entero de ¹a ^{1 0};

R⁵se selecciona del grupo que consiste en -P(O)(R⁹)-O", -C(O)NH-, -O-; -NH-, -S-, -C(O)-; -C(O)O-; -NHCS-; -NHCO-y un enlace sencillo;

R⁹se selecciona del grupo que consiste en O', S ‘, BH³-, NR⁶R⁷o CH³;

o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos;

en la que la cadena sentido tiene una identidad de secuencia con el segmento de un ARNm correspondiente a un gen p53 (SEQ ID NO:S 1-7).

Indicaciones

Se demostró que la inhibición de la expresión de un gen p53 es beneficiosa en el tratamiento y/o prevención de diversas enfermedades y trastornos. La presente solicitud se refiere en particular a moléculas de ácido nucleico de doble cadena que subregulan la expresión del gen p53, y al uso de estas moléculas en el tratamiento y/o prevención de diversas enfermedades y trastornos. Ejemplos de tales enfermedades/trastornos incluyen, sin limitarse a, lesión por isquemia-reperfusión, una deficiencia auditiva, un trastorno auditivo, una alteración del equilibrio, una pérdida auditiva, alopecia inducida por quimioterapia, alopecia inducida por radioterapia, una insuficiencia renal aguda, una lesión renal aguda, una enfermedad renal crónica (CKD), un efecto secundario asociado con la terapia anticancerosa, la función retardada del injerto (DGF) en un paciente con trasplante de riñón, una lesión de la médula espinal, una lesión cerebral, una convulsión, un derrame cerebral, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, tumor, quemadura, herida, hipertermia, hipoxia, isquemia, trasplante de órganos, trasplante de médula ósea (BMT), infarto de miocardio/ataque cardiaco, cardiotoxicidad e insuficiencia hepática aguda.

En una realización, el trastorno es un efecto secundario asociado con la terapia anticancerosa y el compuesto de ácido nucleico divulgado en el presente documento, o la sal farmacéuticamente aceptable de dicho compuesto, o la composición que comprende dicho compuesto, o la composición que comprende la sal farmacéuticamente aceptable de tal compuesto, se administra en una cantidad efectiva para tratar o mejorar el efecto secundario. Dicha terapia contra el cáncer puede comprender radioterapia, quimioterapia, terapia biológica contra el cáncer y dirigida molecularmente. En diversas realizaciones, un efecto secundario asociado con dicha terapia anticáncer se selecciona entre una o más de pérdida de cabello (alopecia), daño de células testiculares, daño de células del epitelio intestinal, daño del sistema linfoide o daño del sistema hematopoyético.

En una realización, las enfermedades son un cáncer positivo para p53 y el compuesto de ácido nucleico divulgado en el presente documento, o la sal farmacéuticamente aceptable de dicho compuesto, o la composición que comprende dicho compuesto, o la composición que comprende la sal farmacéuticamente aceptable de dicho compuesto, se administra en una cantidad eficaz para subregular la expresión de un gen p53 y, por lo tanto, sensibiliza el cáncer positivo para p53 a la quimioterapia en el sujeto.

En un ejemplo, el compuesto de ácido nucleico divulgado en el presente documento, o una sal farmacéuticamente aceptable de dicho compuesto, o una composición que comprende dicho compuesto, o una composición que comprende la sal farmacéuticamente aceptable de dicho compuesto, es para uso en la expansión progenitora hematopoyética o en la estimulación de la hematopoyesis.

En un ejemplo, el compuesto de ácido nucleico divulgado en el presente documento, o una sal farmacéuticamente aceptable de dicho compuesto, o una composición que comprende dicho compuesto, o una composición que comprende la sal farmacéuticamente aceptable de dicho compuesto, es para uso en el alojamiento de células madre hematopoyéticas sin p53 (HSC).

Composiciones farmacéuticas

Se proporcionan composiciones y métodos para la subregulación de la expresión de p53 mediante el uso de moléculas de ácido nucleico, tales como el ácido nucleico de interferencia corto (ANic), ARN de interferencia (ARNi), ARN de interferencia corto (ARNpi), ARN de doble cadena (ARNdc), micro-ARN (miARN) y moléculas de ARN de horquilla corta (ARNhc) capaces de mediar la subregulación de la expresión del gen p53 o que median el ARN de interferencia contra la expresión del gen p53.

Si bien puede ser posible que las moléculas divulgadas en el presente documento se administren como el producto químico bruto, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, es preferible presentarlas como una composición farmacéutica. Por consiguiente, se proporciona una composición farmacéutica que comprende una o más de las moléculas de ácido nucleico divulgadas en el presente documento; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y un portador farmacéuticamente aceptable. Dicha composición farmacéutica puede comprender una mezcla de dos o más compuestos de ácido nucleico diferentes.

Las composiciones, métodos y kits proporcionados en el presente documento pueden incluir una o más moléculas de ácido nucleico y métodos que independientemente o en combinación modulan (por ejemplo, subregulan) la expresión de la proteína p53 y/o el gen que codifica la proteína p53. La descripción de los diversos aspectos y realizaciones se proporciona con referencia al gen p53. Sin embargo, los diversos aspectos y realizaciones también se dirigen a otros genes relacionados, tales como genes homólogos y variantes de transcripción, y polimorfismos (por ejemplo, polimorfismo de un solo nucleótido, (SNP)) asociados con cierto gen p53. Como tales, los diversos aspectos y realizaciones también se dirigen a otros genes que están involucrados en las vías mediadas por p53 de la transducción de señales o la expresión génica que están involucradas, por ejemplo, en el mantenimiento o desarrollo de enfermedades, rasgos o afecciones descritas en este documento. Estos genes adicionales pueden analizarse para determinar los sitios objetivo utilizando los métodos descritos para el gen p53 en este documento. Por lo tanto, la subregulación de otros genes y los efectos de dicha modulación de los otros genes se pueden realizar, determinar y medir como se describe en el presente documento.

Se proporciona además una composición farmacéutica que comprende al menos un compuesto de ácido nucleico divulgado en el presente documento unido covalentemente o no covalentemente a uno o más compuestos de ácido nucleico divulgado en el presente documento en una cantidad eficaz para subregular la expresión de p53; y un portador farmacéuticamente aceptable. El compuesto puede procesarse intracelularmente por complejos celulares endógenos para producir uno o más oligorribonucleótidos divulgados en el presente documento.

Se proporciona además una composición farmacéutica que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y uno o más de los compuestos divulgados en el presente documento en una cantidad efectiva para subregular la expresión en una célula de p53 humana, el compuesto que comprende una secuencia expuesta en las SEQ ID NOS.: 8-33

En un ejemplo, los compuestos, composiciones y métodos de oligorribonucleótidos divulgados en este documento inhiben/subregulan el gen p53, por lo que la inhibición/subregulación se selecciona del grupo que comprende la inhibición/subregulación de la función génica, inhibición/subregulación del polipéptido y la inhibición/subregulación de la expresión del ARNm.

En un ejemplo, un ácido nucleico divulgado en el presente documento puede usarse para inhibir la expresión de la familia del gen p53 en la que los genes o las secuencias de la familia de genes comparten homología de secuencia. Dichas secuencias homólogas pueden identificarse como se conoce en la técnica, por ejemplo, usando alineamientos de secuencias. Las moléculas de ácido nucleico pueden diseñarse para dirigirse a tales secuencias homólogas, por ejemplo, utilizando secuencias perfectamente complementarias o incorporando pares de bases no canónicas, por ejemplo, faltas de coincidencia y/o pares de bases oscilantes, que pueden proporcionar secuencias objetivo adicionales. En los casos en que se identifican faltas de coincidencia, se pueden usar pares de bases no canónicas (por ejemplo, faltas de coincidencia y/o bases oscilantes) para generar moléculas de ácido nucleico que se dirigen a más de una secuencia de genes. En un ejemplo no limitativo, los pares de bases no canónicas, tales como los pares de bases UU y CC, se utilizan para generar moléculas de ácido nucleico que son capaces de dirigirse a secuencias para diferentes objetivos de p53 que comparten homología de secuencia. Como tal, una ventaja de usar compuestos de ácido nucleico divulgados en este documento es que se puede diseñar un único ácido nucleico para incluir una secuencia de ácido nucleico que sea complementaria a la secuencia de nucleótidos que se conserva entre los genes homólogos. En este enfoque, se puede usar un solo ácido nucleico para inhibir la expresión de más de un gen en lugar de usar más de una molécula de ácido nucleico para dirigirse a los diferentes genes.

Las moléculas de ácido nucleico pueden usarse para dirigirse a secuencias conservadas correspondientes a una familia de genes o familias de genes tales como genes de la familia p53. Como tales, las moléculas de ácido nucleico que se dirigen a múltiples objetivos de p53 pueden proporcionar un mayor efecto terapéutico. Además, el ácido nucleico se puede usar para caracterizar las vías de la función del gen en una variedad de aplicaciones. Por ejemplo, las moléculas de ácido nucleico pueden usarse para inhibir la actividad de uno o varios genes objetivo en una ruta para determinar la función de uno o más genes no caracterizados en el análisis de la función de los genes, el análisis de la función del ARNm o el análisis de la traducción. Las moléculas de ácido nucleico pueden usarse para determinar posibles vías de genes objetivo implicadas en diversas enfermedades y afecciones hacia el desarrollo farmacéutico. Las moléculas de ácido nucleico pueden usarse para comprender las vías de expresión génica implicadas en diversas enfermedades y afecciones.

En un ejemplo, los compuestos de ácido nucleico, composiciones y métodos proporcionados en el presente documento, inhiben al polipéptido p53, por lo que la inhibición se selecciona del grupo que comprende la inhibición de la función (que puede examinarse mediante un ensayo enzimático o un ensayo de unión con un interactor conocido del gen/polipéptido nativo, entre otros, subregulación de la proteína o inhibición de la proteína (que puede examinarse mediante transferencia de Western, ELISA o inmunoprecipitación, entre otros) e inhibición de la expresión del ARNm (que puede ser examinado por transferencia Northern, RT-PCR cuantitativa, hibridación in situ o hibridación de microarreglos, entre otros).

En un ejemplo, las composiciones y métodos proporcionados en el presente documento incluyen una molécula de ácido nucleico que tiene actividad de ARNi contra el ARN de p53, en la que la molécula de ácido nucleico incluye una secuencia complementaria a cualquier ARN que tenga una secuencia codificante de p53, tal como la secuencia expuesta en las SEQ. ID NOS: 1-7. En otro ejemplo, una molécula de ácido nucleico puede tener actividad de ARNi contra el ARN de p53, en la que la molécula de ácido nucleico incluye una secuencia complementaria a un ARN que tiene una variante que codifica la secuencia de p53, por ejemplo, otro gen p53 mutante no mostrado en las SEQ ID NOS: 1-7 pero se sabe en la técnica que está asociado con el inicio y/o mantenimiento y/o desarrollo de una enfermedad/trastorno/afección, tal como se describe en el presente documento. Las modificaciones químicas como se describen en este documento se pueden aplicar a cualquier constructo de ácido nucleico divulgada en este documento. En otro ejemplo, una molécula de ácido nucleico divulgada en el presente documento incluye una secuencia de nucleótidos que puede interactuar con la secuencia de nucleótidos de un gen p53 y, por lo tanto, mediar la subregulación o el silenciamiento de la expresión del gen p53, por ejemplo, en la que la molécula de ácido nucleico media la regulación de la expresión del gen p53 por procesos celulares que modulan la estructura de la cromatina o los patrones de metilación del gen y evitan la transcripción del gen.

Más particularmente, se proporcionan moléculas de ácido nucleico de cadena doble que tienen una cadena sentido y una secuencia de cadena antisentido expuestas en la Tabla 1 (SEQ ID NOS: 8-33) u homólogos de la mismas en las que se alteran uno o dos de los ribonucleótidos en cada región terminal.

Suministro y formulaciones

Las moléculas de ácido nucleico de la presente divulgación pueden suministrarse al tejido objetivo mediante la aplicación directa de las moléculas desnudas preparadas con un vehículo o un diluyente.

Los términos "ácido nucleico desnudo" o "ARNdc desnudo" o "ARNpi desnudo" se refieren a moléculas de ácido nucleico que están libres de cualquier vehículo de suministro que actúe para ayudar, promover o facilitar la entrada en la célula, incluidas las secuencias virales, partículas virales, formulaciones de liposomas, lipofectina o agentes precipitantes y similares. Por ejemplo, ARNdc en PBS es "ARNdc desnudo".

Las moléculas de ácido nucleico divulgadas en el presente documento, o sus sales farmacéuticamente aceptables, pueden suministrarse o administrarse directamente con un vehículo o diluyente que actúa para ayudar, promover o facilitar la entrada a la célula, incluidos vectores virales, partículas virales, formulaciones de liposomas, lipofectina o agentes precipitantes y similares.

Una molécula de ácido nucleico puede incluir un vehículo de administración, que incluye liposomas, para la administración a un sujeto, portadores y diluyentes y sus sales, y/o puede estar presente en formulaciones farmacéuticamente aceptables. En algunos ejemplos, las moléculas de ARNdc de la divulgación se suministran en formulaciones de liposomas y formulaciones de lipofectina y similares y pueden prepararse mediante métodos bien conocidos por los expertos en la técnica. Tales métodos se describen, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos Números 5.593.972, 5.589.466 y 5.580.859.

Se han desarrollado sistemas de administración dirigidos específicamente a la administración potenciada y mejorada de ARNpi en células de mamíferos (véase, por ejemplo, Shen et al., FEBS Let. 2003, 539: 111-114; Xia et al., Nat. Biotech. 2002, 20: 1006-1010; Reich et al., Mol. Vision 2003, 9: 210-216; Sorensen et al., J. Mol. Biol. 2003. 327: 761 766; Lewis et al. , Nat. Gen. 2002, 32: 107-108 y Simeoni et al., NAR 2003, 31,11: 2717-2724). El ARNpi recientemente se ha utilizado con éxito para la inhibición de la expresión génica en primates (véase, por ejemplo, Tolentino et al., Retina 24 (4): 660).

La administración de moléculas de ARN desnudas o formuladas al oído, opcionalmente al oído interno, se realiza, entre otras cosas, mediante inyección transtimpánica o mediante la administración del compuesto deseado formulado como una gota para el oído. Las composiciones óticas que comprenden ARNdc se describen en la publicación de Estados Unidos No. 20110142917, al cesionario de la presente solicitud.

Los polipéptidos que facilitan la introducción de ácido nucleico en un sujeto deseado son conocidos en la técnica, por ejemplo, tales como los descritos en la publicación de la solicitud de Estados Unidos. No. 20070155658 (por ejemplo, un derivado de melamina como el 2,4,6-triguanidino triazina y 2,4,6-tramidosarcocil melamina, un polipéptido de poliarginina y un polipéptido que incluye la alternancia de residuos de glutamina y de asparagina).

Los portadores, disolventes, diluyentes, excipientes, adyuvantes y vehículos farmacéuticamente aceptables, así como los portadores de implantes, se refieren generalmente a rellenos inertes, sólidos o líquidos no tóxicos, diluyentes o material de encapsulación que no reaccionan con los ingredientes activos de la divulgación e incluyen liposomas y microesferas. Los ejemplos de sistemas de administración útiles en la presente invención incluyen las patentes de Estados Unidos Nos 5.225.182; 5.169.383; 5.167.616; 4.959.217; 4.925.678; 4.487.603; 4.486.194; 4.447.233; 4.447.224; 4.439.196; y 4.475.196. Muchos otros implantes, sistemas de administración y módulos de este tipo son bien conocidos por los expertos en la técnica.

En un ejemplo particular, la administración comprende administración sistémica. En otro ejemplo, la administración comprende administración tópica o local. Los implantes de los compuestos también son útiles. Se preparan formas liquidas. Las composiciones líquidas incluyen soluciones acuosas, con y sin codisolventes orgánicos, suspensiones acuosas o oleosas, emulsiones con aceites comestibles, así como vehículos farmacéuticos similares. Las composiciones también se pueden inyectar de forma transtimpánica o intravítrea. Las composiciones también se pueden aplicar como gotas para los ojos de gotas para los oídos.

Los métodos para el suministro de moléculas de ácido nucleico se describen en Akhtar et al., Trends Cell Bio., 2: 139 (1992); Delivery Strategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics, ed. Akhtar, (1995), Maurer et al., Mol. Membr. Biol., 16: 129-140 (1999); Hofland y Huang, Handb. Exp. Pharmacol., 137: 165-192 (1999); y Lee et al., ACS Symp. Ser., 752: 184-192 (2000); Patentes de los Estados Unidos Nos. 6.395.713; 6.235.310; 5.225.182; 5.169.383; 5.167.616; 4.959.217; 4.925.678; 4.487.603; y 4.486.194 y Sullivan et al., PCT WO 94/02595; PCT WO 00/03683 y PCT WO 02/08754; y la Publicación de la solicitud de patente de Estados Unidos N° 2003077829. Estos protocolos pueden utilizarse para el suministro de prácticamente cualquier molécula de ácido nucleico. Las moléculas de ácido nucleico pueden administrarse a las células mediante una variedad de métodos conocidos por los expertos en la técnica, que incluyen, entre otros, la encapsulación en liposomas, por iontoforesis o por incorporación a otros vehículos, como polímeros biodegradables, hidrogeles, ciclodextrinas (véase, por ejemplo, Gonzalez et al., Bioconjugate Chem., 10: 1068-1074 (1999); Wang et al., publicaciones internacionales PCT números WO 03/47518 y WO 03/46185), ácido poli (lactico-co-glicólico) (PLGA) y microesferas de PLCA (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos número 6.447.796 y la publicación de solicitud de los Estados Unidos número 2002130430), nanocápsulas biodegradables y microesferas bioadhesivas, o por vectores proteicos (O'Hare and Normand, publicación internacional PCT No. WO 00/53722). Alternativamente, la combinación de ácido nucleico/vehículo se administra localmente mediante inyección directa o mediante el uso de una bomba de infusión. La inyección directa de las moléculas de ácido nucleico de la divulgación, ya sea en forma intravítrea, subcutánea, transtimpánica, intramuscular o intradérmica, puede realizarse mediante el uso de metodologías estándar de agujas y jeringas, o mediante tecnologías sin agujas como las divulgadas en Conry et al., Clin. Cancer Res., 5: 2330-2337 (1999) y Barry et al., Publicación internacional PCT No. WO 99/31262. Las moléculas de la presente divulgación pueden usarse como agentes farmacéuticos. Los agentes farmacéuticos previenen, modulan la aparición, o tratan o alivian un síntoma en cierta medida (preferiblemente todos los síntomas) de un estado de enfermedad en un sujeto. En un ejemplo específico, se pueden seleccionar formulaciones tópicas y transdérmicas.

El compuesto de ácido nucleico, o la sal farmacéuticamente aceptable de dicho compuesto, o una composición que comprende dicho compuesto, o una composición que comprende la sal farmacéuticamente aceptable de dicho compuesto, divulgada en el presente documento, se administra y dosifica de acuerdo con una buena práctica médica, teniendo en cuenta la condición clínica del sujeto particular, la enfermedad a tratar, el sitio y el método de administración, el programa de administración, la edad, el sexo, el peso corporal y otros factores conocidos del paciente por los médicos.

Las moléculas de ácido nucleico pueden formar complejos con lípidos catiónicos, envasarse dentro de liposomas, o administrarse de otro modo a células o tejidos objetivo. EL ácido nucleico o complejos de ácido nucleico pueden administrarse localmente a tejidos relevantes ex vivo o in vivo mediante aplicación dérmica directa, aplicación transdérmica o inyección, con o sin su incorporación en biopolímeros.

Los sistemas de administración pueden incluir liposomas modificados en la superficie que contienen lípidos de poli (etilenglicol) (liposomas modificados con PEG, o de larga circulación o liposomas sigilosos). Estas formulaciones ofrecen un método para aumentar la acumulación de fármacos en los tejidos objetivo. Esta clase de portadores de fármacos resiste la opsonización y la eliminación por el sistema fagocítico mononuclear (MPS o RES), lo que permite tiempos de circulación en sangre más prolongados y una mayor exposición del tejido para el fármaco encapsulado (Lasic et al., Chem. Rev. 1995, 95, 2601-2627). Ishiwata et al., Chem. Pharm. Bull. 1995, 43, 1005-1011).

Las moléculas de ácido nucleico pueden formularse o complejarse con polietilenimina (por ejemplo, PEI lineal o ramificado) y/o derivados de polietilenimina, que incluyen, por ejemplo, polietilenimina-polietilenglicol-N-acetilgalactosamina (PEI-PEG-GAL) o derivados de polietilenimina-polietilenglicol-tri-N-acetilgalactosamina (PEI-PEG-triGAL), PEI injertadas, tales como galactosa PEI, colesterol PEI, anticuerpos derivados de PEI, y derivados de polietilenglicol PEI (PEG-PEI) de los mismos (véase, por ejemplo, Ogris et al., 2001, AAPA PhannSci, 3, 1-11; Furgeson et al., 2003, Bioconjugate Chem., 14, 840-847; Kunath et al., 2002, Pharmaceutical Research, 19, 810-817; Choi et al., 2001, Bull. Korean Chem. Soc., 22, 46-52; Bettinger et al., 1999, Bioconjugate Chem., 10, 558-561; Peterson et al., 2002, Bioconjugate Chem., 13, 845-854; Erbacher et al., 1999, Journal of Gene Medicine Preprint, 1, 1-18; Godbey et al., 1999., PNAS USA, 96, 5177-5181; Godbey et al., 1999, Journal of Controlled Release, 60, 149 160; Diebold et al., 1999, Journal of Biological Chemistry, 274, 19087-19094; Thomas and Klibanov, 2002, PNAS USA, 99, 14640-14645; Sagara, patente de Estados Unidos No. 6,586,524 y publicación de la solicitud depatente de los Estados Unidos No. 20030077829).

Las moléculas de ácido nucleico se pueden complejarse con agentes que rompen la membrana, como los descritos en la publicación de solicitud de patente Estados Unidos número 20010007666. El agente o agentes de rompimiento de la membrana y la molécula de ácido nucleico también se pueden complejar con una molécula de lípido catiónico o lípido auxiliar, tal como los lípidos divulgados en la patente de Estados Unidos N° 6.235.310.

Las moléculas de ácido nucleico divulgadas en este documento se pueden administrar al sistema nervioso central (CNS) o al sistema nervioso periférico (PNS). Los experimentos han demostrado la absorción eficiente in vivo de ácidos nucleicos por parte de las neuronas. Véase, por ejemplo, Sommer et al., 1998, Antisense Nuc. Acid Drug Dev., ⁸, 75; Epa et al., 2000, Antisense Nuc. Acid Drug Dev., 10, 469; Broaddus et al., 1998, J. Neurosurg., ⁸⁸(4), 734; Karle et al., 1997, Eur. J. Pharmocol., 340 (2/3), 153; Bannai et al., 1998, Brain Research, 784 (1,2), 304; Rajakumar et al., 1997, Synapse, 26 (3), 199; Wu-pong et al., 1999, BioPharm, 12 (1), 32; Bannai et al., 1998, Brain Res. Protoc., 3 (1), 83; y Simantov et al., 1996, Neuroscience, 74 (1), 39. Las moléculas de ácido nucleico son, por lo tanto, susceptibles de ser administradas y absorbidas por las células en el CNS y/o PNS, por ejemplo, neuronas, macrófagos, axones de la sustancia blanca y células endoteliales.

Los sistemas de administración pueden incluir, por ejemplo, geles acuosos y no acuosos, cremas, emulsiones múltiples, microemulsiones, liposomas, pomadas, soluciones acuosas y no acuosas, lociones, aerosoles, bases y polvos de hidrocarburos, y pueden contener excipientes como solubilizantes, potenciadores de permeación (por ejemplo, ácidos grasos, ésteres de ácidos grasos, alcoholes grasos y aminoácidos) y polímeros hidrófilos (por ejemplo, policarbófilo y polivinilpirrolidona). En un ejemplo, el portador farmacéuticamente aceptable es un liposoma o un potenciador transdérmico. Los ejemplos no limitantes de liposomas que pueden usarse con los compuestos de esta descripción incluyen los siguientes: (1) CellFectin, formulación de liposomas 1:1,5 (M/M) del lípido catiónico N,NI,NN,NNI-tetrametil-N ,NI,NN,NNI-tetrapalmit-i-espermina y dioleoil fosfatidiletanolamina (DOPE) (GIBCO BRL); (2) Citofectina GSV, formulación de liposomas 2:1 (M/M) de un lípido catiónico y DOPE (Glen Research); (3) DOTa P (N-[1-(2,3-dioleoiloxi)-N,N,N-tri-metil-amonio-metilsulfato) (Boehringer Manheim); y (4) Lipofectamina, formulación de liposomas 3:1 (M/M) del lípido policatiónico DOSPA, el lípido neutro DOPE (GIBCO Br L) y el aminoácido dialquilado (DiLA2).

Los sistemas de suministro pueden incluir parches, tabletas, supositorios, pesarios, geles, soluciones acuosas y no acuosas, lociones y cremas, y pueden contener excipientes como solubilizantes y potenciadores (por ejemplo, propilenglicol, sales biliares y aminoácidos) y otros vehículos (por ejemplo, polietilenglicol, glicerol, ésteres y derivados de ácidos grasos y polímeros hidrófilos como la hidroxipropilmetilcelulosa y el ácido hialurónico).

Las moléculas de ácido nucleico pueden incluir un bioconjugado, por ejemplo un conjugado de ácido nucleico como se describe en Vargeese et al., U.S. Ser. N° 10/427.160; patente de Estados Unidos N° 6.528.631; patente de Estados Unidos N° 6.335.434; patente de Estados Unidos N° 6.235.886; patente de Estados Unidos N° 6.153.737; patente de Estados Unidos N° 5.214.136; patente de Estados Unidos N° 5.138.045.

Las composiciones, métodos y kits divulgados en el presente documento pueden incluir un vector de expresión que incluye una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos una molécula de ácido nucleico de la divulgación de una manera que permite la expresión de la molécula de ácido nucleico. Los métodos para introducir moléculas de ácido nucleico o uno o más vectores capaces de expresar las cadenas de un compuesto oligonucleotídico de doble cadena en el entorno de la célula dependerán del tipo de célula y de la composición de su entorno. La molécula de ácido nucleico o la construcción del vector pueden introducirse directamente en la célula (es decir, intracelularmente); o introducirse extracelularmente en una cavidad, espacio intersticial, en la circulación de un organismo, introducirse por vía oral, o puede introducirse bañando un organismo o una célula en una solución que contiene el compuesto de ácido nucleico. La célula es preferiblemente una célula de mamífero; más preferiblemente una célula humana. La molécula de ácido nucleico del vector de expresión puede incluir una región sentido y una región antisentido. La región antisentido puede incluir una secuencia complementaria a una secuencia de ARN o ADN que codifica al gen p53, y la región sentido puede incluir una secuencia complementaria a la región antisentido. La molécula de ácido nucleico puede incluir dos cadenas distintas que tienen regiones complementarias sentido y antisentido. La molécula de ácido nucleico puede incluir una sola cadena que tiene regiones complementarias sentido y antisentido.

Las moléculas de ácido nucleico que interactúan con las moléculas de ARN objetivo y subregulan un gen p53 que codifica las moléculas de ARN objetivo (por ejemplo, ARNm, SEQ ID NOS: 1-7) pueden expresarse a partir de unidades de transcripción insertadas en vectores de ADN o ARN. Los vectores recombinantes pueden ser plásmidos de ADN o vectores virales. Las moléculas de ácido nucleico que expresan vectores virales pueden construirse con base en, sin limitarse a, virus adenoasociados, retrovirus, adenovirus o alfavirus. Los vectores recombinantes capaces de expresar las moléculas de ácido nucleico pueden administrarse como se describe en el presente documento, y persistir en células objetivo. Alternativamente, pueden usarse vectores virales que proporcionan una expresión transitoria de moléculas de ácido nucleico. Tales vectores pueden administrarse repetidamente según sea necesario. Una vez expresadas, las moléculas de ácido nucleico se unen y subregulan la función o expresión génica, por ejemplo, a través de ARN de interferencia (ARNi). El suministro de vectores que expresan molécula de ácido nucleico puede ser sistémica, tal como por administración intravenosa o intramuscular, por administración local, por administración a células objetivo extraídas de un sujeto seguida de reintroducción en el sujeto, o por cualquier otro medio que permita la introducción en la célula objetivo deseada.

Los vectores de expresión pueden incluir una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos una molécula de ácido nucleico divulgada en el presente documento, de una manera que permite la expresión de la molécula de ácido nucleico. Por ejemplo, el vector puede contener una secuencia o secuencias que codifican ambas cadenas de una molécula de ácido nucleico que incluye un dúplex. El vector también puede contener una secuencia o secuencias que codifican una única molécula de ácido nucleico que es autocomplementaria y, por lo tanto, forma una molécula de ácido nucleico. Los ejemplos no limitantes de tales vectores de expresión se describen en Paul et al., 2002, Nature Biotechnology, 19, 505; Miyagishi y Taira, 2002, Nature Biotechnology, 19, 497; Lee et al., 2002, Nature Biotechnology, 19, 500; y Novina et al., 2002, Nature Medicine, publicación avanzada en línea doi: 10.1038/nm725. Los vectores de expresión también se pueden incluir en una célula de mamífero (por ejemplo, humana).

Un vector de expresión puede codificar una o ambas cadenas de un dúplex de ácido nucleico, o una única cadena auto-complementaria que se hibrida en un dúplex de ácido nucleico. Las secuencias de ácido nucleico que codifican moléculas de ácido nucleico pueden unirse operativamente de una manera que permita la expresión de la molécula de ácido nucleico (véase, por ejemplo, Paul et al., 2002, Nature Biotechnology, 19, 505; Miyagishi y Taira, 2002, Nature Biotechnology, 19, 497; Lee et al., 2002, Nature Biotechnology, 19, 500; y Novina et al., 2002, Nature Medicine, publicación avanzada en línea doi: 10.1038/nm725).

Un vector de expresión puede incluir uno o más de los siguientes: a) una región de iniciación de la transcripción (por ejemplo, región de iniciación de pol I, II o III eucariota); b) una región de terminación de la transcripción (por ejemplo, región de terminación de pol I, II o III eucariota); c) un intrón y d) una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos una de las moléculas de ácido nucleico, en la que dicha secuencia está operativamente unida a la región de iniciación y la región de terminación de una manera que permite la expresión y/o la administración de la molécula de ácido nucleico. El vector puede incluir opcionalmente un marco de lectura abierto (ORF) para una proteína unida operativamente en el lado 5' o el lado 3' de la secuencia que codifica la molécula de ácido nucleico; y/o un intrón (secuencias intermedias).

La transcripción de las secuencias de moléculas de ácido nucleico puede dirigirse desde un promotor para la ARN polimerasa I eucariota I (pol I), la ARN polimerasa II (pol II) o la a Rn polimerasa III (pol III). Los transcritos de los promotores pol II o pol III se expresan en niveles altos en todas las células; los niveles de un promotor pol II dado en un tipo de célula dado dependen de la naturaleza de las secuencias reguladoras de genes (potenciadores, silenciadores, etc.) presentes en las inmediaciones. También se utilizan promotores de ARN polimerasa procariota, siempre que la enzima ARN polimerasa procariota se exprese en las células apropiadas (Elroy-Stein y Moss, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, ^{8 7}, 6743-7; Gao y Huang 1993 , Nucleic Acids Res., 21, 2867-72; Lieber et al., 1993, Methods Enzymol., 217, 47-66; Zhou et al., 1990, Mol. Cell. Biol., 10, 4529-37). Varios investigadores han demostrado que las moléculas de ácido nucleico expresadas a partir de dichos promotores pueden funcionar en células de mamíferos (por ejemplo, Kashani-Sabet et al., 1992, Antisense Res. Dev., 2, 3-15; Ojwang et al.,, 1992, Proc. Natl). Acad. Sci. Us a , ^{8 9}, 10802-6; Chen et al., 1992, Nucleic Acids Res., 20, 4581-9; Yu et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 6340-4; L'Huillier et al., 1992, EMBO J., 11, 4411-8; Lisziewicz et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 8000-4; Thompson et al. , 1995, Nucleic Acids Res., 23, 2259; Sullenger & Cech, 1993, Science, 262, 1566). Más específicamente, las unidades de transcripción, como las derivadas de los genes que codifican U⁶nuclear pequeño (ARNnp), ARN de transferencia (ARNt) y ARN de adenovirus VA, son útiles para generar altas concentraciones de moléculas de ARN deseadas, tales como ANic en células (Thompson et al., citado más arriba; Couture y Stinchcomb, 1996, citado más arriba; Noonberg et al., 1994, Nucleic Acid Res., 22, 2830; Noonberg et al., patente de Estados Unidos N° 5.624.803; Good et al., 1997, Gene Ther., 4, 45; Beigelman et al., publicación internacional PCT No. WO 96/18736). Las unidades de transcripción de ácido nucleico anteriores pueden incorporarse en una variedad de vectores para la introducción en células de mamíferos, incluidos, entre otros, vectores de plásmidos de ADN, vectores de ADN viral (como adenovirus o vectores de virus adenoasociados) o vectores de ARN viral (tal como los vectores retrovirales o alfavirus) (véase Couture y Stinchcomb, 1996 citado más arriba).

La molécula de ácido nucleico puede expresarse dentro de las células a partir de promotores eucariotas (por ejemplo, Izant y Weintraub, 1985, Science, 229, 345; McGarry y Lindquist, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 83, 399; Scanlon etal., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, ^{8 8}, 10591-5; Kashani-Sabet et al., 1992, Antisense Res. Dev., 2, 3-15; Dropulic et al., 1992, J. Virol., ^{6 6}, 1432-41; Weerasinghe et al., 1991, J. Virol., 65, 5531-4; Ojwang et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 10802- ⁶; Chen et al., 1992, Nucleic Acids Res., 20, 4581-9; Sarver et al., 1990 Science, 247, 1222 1225; Thompson et al., 1995, Nucleic Acids Res., 23, 2259; Good et al., 1997, Gene Therapy, 4, 45. Los expertos en la materia se dan cuenta de que cualquier ácido nucleico puede expresarse en células eucariotas del vector de ADN/ARN apropiado. La actividad de dichos ácidos nucleicos puede aumentarse por su liberación a partir del transcrito primario por un ácido nucleico enzimático (Draper et al., PCT WO 93/23569, y Sullivan et al., p Ct WO 94/02595; Ohkawa et al., 1992, Nucleic Acids Symp. Ser., 27, 15-6; Taira et al., 1991, Nucleic Acids Res., 19, 5125-30; Ventura et al., 1993, Nucleic Acids Res., 21, 3249-55; Chowrira et al., 1994, J. Biol. Chem., 269, 25856.

Un constructo viral empacado en una partícula viral lograría tanto la introducción eficiente de un constructo de expresión en la célula como la transcripción del constructo de ARNdc codificada por el constructo de expresión.

Los métodos para la introducción oral incluyen la mezcla directa de ARN con el alimento del organismo, así como los enfoques modificados por ingeniería genética en los cuales una especie que se usa como alimento se modifica para expresar un ARN, y luego se alimenta al organismo que va a ser afectado. Se pueden emplear métodos físicos para introducir una solución de molécula de ácido nucleico en la célula. Los métodos físicos de introducción de ácidos nucleicos incluyen la inyección de una solución que contiene la molécula de ácido nucleico, el bombardeo por partículas cubiertas por la molécula de ácido nucleico, remojar la célula u organismo en una solución del ARN, o la electroporación de las membranas celulares en presencia de la molécula de ácido nucleico. En un ejemplo, se proporciona en el presente documento una célula que comprende una molécula de ácido nucleico divulgada en este documento.

Se pueden usar otros métodos conocidos en la técnica para introducir ácidos nucleicos en células, tales como el transporte mediado por productos químicos, como el fosfato de calcio, y similares. Por lo tanto, las moléculas de ácido nucleico pueden introducirse junto con componentes que realizan una o más de las siguientes actividades: mejorar la captación de ARN por la célula, promover la hibridación de las cadenas dúplex, estabilizar las cadenas hibridadas, o bien, aumentar la inhibición/subregulación del gen objetivo.

Las nanocápsulas o microcápsulas poliméricas facilitan el transporte y la liberación del ARNdc encapsulado o unido a la célula. Incluyen materiales poliméricos y monoméricos, especialmente el polibutilcianoacrilato. Se ha publicado un resumen de los materiales y métodos de fabricación (véase Kreuter, 1991). Los materiales poliméricos que se forman a partir de precursores monoméricos y/u oligoméricos en la etapa de polimerización/generación de nanopartículas, son ya conocidos a partir de la técnica anterior, al igual que los pesos moleculares y la distribución de pesos moleculares del material polimérico que una persona experta en el campo de fabricación de nanopartículas puede seleccionar adecuadamente de acuerdo con la habilidad habitual.

Las moléculas de ácido nucleico pueden formularse como una microemulsión. Una microemulsión es un sistema de agua, aceite y anfifilo que es una única solución líquida ópticamente isotrópica y termodinámicamente estable. Típicamente, las microemulsiones se preparan primero dispersando un aceite en una solución acuosa de surfactante y luego agregando una cantidad suficiente de un cuarto componente, generalmente un alcohol de longitud de cadena intermedia para formar un sistema transparente.

Los tensioactivos que pueden usarse en la preparación de microemulsiones incluyen, pero no se limitan a, tensioactivos iónicos, tensioactivos no iónicos, Brij 96, éteres de oleil polioxietileno, ésteres de ácidos grasos poliglicerol, tetraglicerol monolaurato (ML310), tetraglicerol monooleato (MO310), monooleato de hexaglicerol (PO310), pentaoleato de hexaglicerol (PO500), monocaprato de decaglicerol (MCA750), monooleato de decaglicerol (MO750) sesquioleato de decaglicerol (SO750), decaoleato de decaglicerol (DA0750) solos o en combinación con cosurfactantes. El cosurfactante, generalmente un alcohol de cadena corta como el etanol, el 1-propanol y el 1-butanol, sirve para aumentar la fluidez interfacial al penetrar en la película del agente tensioactivo y, en consecuencia, crear una película desordenada debido al espacio vacío generado entre las moléculas del agente tensioactivo.

Las formulaciones de administración pueden incluir polímeros entrelazados degradables solubles en agua que incluyen uno o más restos lipídicos de entrecruzamiento degradables, uno o más restos de PEI, y/o uno o más mPEG (derivado de metil éter de PEG (metoxipoli(etilenglicol)).

Dosis

La dosis útil que se administrará y el modo particular de administración variarán dependiendo de factores tales como el tipo de célula, o para uso in vivo, la edad, el peso y el animal particular y la región del mismo a tratar, el ácido nucleico particular y el método de administración utilizado, el uso terapéutico o diagnóstico contemplado, y la forma de la formulación, por ejemplo, suspensión, emulsión, micela o liposoma, tal como será fácilmente evidente para los expertos en la materia. Normalmente, la dosis se administra a niveles más bajos y se incrementa hasta que se logra el efecto deseado.

La "dosis terapéuticamente eficaz” para los fines del presente documento se determina por lo tanto, por las consideraciones que se conocen en la técnica. La dosis debe ser efectiva para lograr una mejoría que incluya pero no se limite a, una mejor tasa de supervivencia o una recuperación más rápida, o una mejoría o eliminación de los síntomas y otros indicadores que se seleccionen como medidas apropiadas por los expertos en la materia.

Se pueden introducir cantidades adecuadas de moléculas de ácido nucleico y estas cantidades se pueden determinar empíricamente usando métodos estándar. Las concentraciones efectivas de especies de moléculas de ácido nucleico individuales en el entorno de una célula pueden ser aproximadamente 1 femtomolar, aproximadamente 50 femtomolar, 100 femtomolar, 1 picomolar, 1,5 picomolar, 2,5 picomolar, 5 picomolar, 10 picomolar, 25 picomolar, 50 picomolar, 100 picomolar, 500 picomolar, 1 nanomolar, 2,5 nanomolar, 5 nanomolar, 10 nanomolar, 25 nanomolar, 50 nanomolar, 100 nanomolar, 500 nanomolar, 1 micromolar, 2,5 micromolar, 5 micromolar, 10 micromolar, 100 micromolar o más.

En general, la dosis activa de compuesto de ácido nucleico para humanos está en el rango de 1 ng/kg a aproximadamente ^{2 0 - 1 0 0}miligramos por kilogramo (mg/kg) de peso corporal del receptor por día, preferiblemente aproximadamente ^{0 , 01}mg a aproximadamente ^{2 - 1 0}mg/kg de peso corporal del receptor por día, en un régimen de una dosis única, una dosis por día o dos veces o tres o más veces por día durante un período de 1-4 semanas o más. Una unidad de dosificación adecuada de moléculas de ácido nucleico puede estar en el intervalo de 0,001 a 0,25 miligramos por kilogramo de peso corporal del receptor por día, o en el intervalo de ^{0 , 01}a ²⁰microgramos por kilogramo de peso corporal por día, o en el intervalo de ^{0 , 01}a ¹⁰microgramos por kilogramo de peso corporal por día, o en el intervalo de 0,10 a 5 microgramos por kilogramo de peso corporal por día, o en el intervalo de 0,1 a 2,5 microgramos por kilogramo de peso corporal por día. La dosis puede ser de 0,01 |jg a 1 g por kg de peso corporal (por ejemplo, 0,1 jg , 0,25 jg , 0,5 jg , 0,75 jg , 1 jg , 2,5 jg , 5 jg , 10 jg , 25 jg , 50 jg , 100 jg , 250 jg , 500 jg , 1 mg, 2,5 mg, 5 mg, ¹⁰mg, 25 mg, 50 mg, ^{10 0}mg, 250 mg o 500 mg por kg de peso corporal).

Los niveles de dosificación del orden de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 140 mg por kilogramo de peso corporal por día son útiles en el tratamiento de las condiciones indicadas anteriormente (aproximadamente 0,5 mg a aproximadamente 7 g por sujeto por día). La cantidad de ingrediente activo que puede combinarse con los materiales del vehículo para producir una forma de dosificación única varía según el huésped tratado y el modo particular de administración. Las formas de dosificación unitaria generalmente contienen entre aproximadamente 1 mg y aproximadamente 500 mg de un ingrediente activo.

Se entiende que el nivel de dosis específico para cualquier sujeto en particular depende de una variedad de factores que incluyen la actividad del compuesto específico empleado, la edad, el peso corporal, la salud general, el sexo, la dieta, el tiempo de administración, la vía de administración y la tasa de excreción, la combinación de fármacos y la gravedad de la enfermedad en particular que se está sometiendo a la terapia.

Las composiciones farmacéuticas que incluyen la molécula de ácido nucleico divulgada en este documento pueden administrarse una vez al día (QD), dos veces al día (bid), tres veces al día (tid), cuatro veces al día (qid), o en cualquier intervalo y para cualquier duración que sea médicamente apropiada. Sin embargo, el agente terapéutico también se puede dosificar en unidades de dosificación que contienen dos, tres, cuatro, cinco, seis o más subdosis administradas a intervalos apropiados a lo largo del día. En ese caso, las moléculas de ácido nucleico contenidas en cada subdosis pueden ser correspondientemente más pequeñas para lograr la unidad de dosificación diaria total. La unidad de dosificación también puede combinarse para una dosis única durante varios días, por ejemplo, usando una formulación de liberación sostenida convencional que proporciona una liberación sostenida y consistente del ARNdc durante un período de varios días. Las formulaciones de liberación sostenida son bien conocidas en la técnica. La unidad de dosificación puede contener un múltiplo correspondiente de la dosis diaria. La composición se puede componer de tal manera que la suma de las unidades múltiples de un ácido nucleico contenga una dosis suficiente.

Composiciones farmacéuticas, kits y envases.

También se proporcionan composiciones, kits, contenedores y formulaciones que incluyen una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, una molécula de ANic) como se proporciona en el presente documento para subregular la expresión del gen p53 para administrar o distribuir la molécula de ácido nucleico a un paciente. Un kit puede incluir al menos un contenedor y al menos una etiqueta. Los contenedores adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, viales, jeringas y tubos de ensayo. Los contenedores se pueden formar a partir de una variedad de materiales como vidrio, metal o plástico. El contenedor puede contener una secuencia o secuencias de ácido nucleico y/o cualquier otro componente requerido para fines relevantes de laboratorio, pronóstico, diagnóstico, profilácticos y terapéuticos. Las indicaciones y/o instrucciones para tales usos pueden incluirse en o con dicho contenedor, al igual que los reactivos y otras composiciones o herramientas utilizadas para estos fines.

El contenedor puede contener alternativamente una composición que es eficaz para el tratamiento, diagnóstico, pronóstico o profilaxis de una condición y puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el contenedor puede ser una bolsa de solución intravenosa o un frasco con un tapón perforable por un aguja de inyección hipodérmica). El agente activo en la composición comprende preferiblemente una molécula de ácido nucleico capaz de unirse específicamente al ARNm de p53 y/o subregular la función del gen p53.

Un kit puede incluir además un segundo contenedor que incluye un regulador farmacéuticamente aceptable, tal como solución salina regulada con fosfato, solución de Ringer y/o solución de dextrosa. Además, puede incluir otros materiales deseables desde el punto de vista comercial y del usuario, incluidos otros reguladores, diluyentes, filtros, agitadores, agujas, jeringas y/o prospectos con indicaciones y/o instrucciones de uso.

La ley federal requiere que el uso de composiciones farmacéuticas en la terapia de humanos sea aprobado por una agencia del gobierno federal. En los Estados Unidos, la aplicación de la ley es responsabilidad de la Administración de Alimentos y Medicamentos, que emite los reglamentos apropiados para garantizar dicha aprobación, detallados en la regla 21 del U.S.C. párrafos 301-392. La regulación del material biológico, incluidos los productos fabricados a partir de tejidos de animales, se proporciona bajo la regla 42 del U.S.C. párrafo 262. La mayoría de los países extranjeros requieren una aprobación similar. Las regulaciones varían de un país a otro, pero los procedimientos individuales son bien conocidos por los expertos en la técnica, y las composiciones y los métodos que se proporcionan en este documento cumplen preferiblemente en consecuencia.

Las moléculas de ácido nucleico divulgadas en el presente documento pueden usarse para tratar enfermedades, afecciones o trastornos asociados con p53, tales como enfermedades, lesiones, afecciones o patologías en el oído, el sistema sensorial vestibular y cualquier otra enfermedad o afección que esté relacionada con o que responda a los niveles de p53 en una célula o tejido, solo o en combinación con otras terapias. Como tales, las composiciones, kits y métodos divulgados en el presente documento pueden incluir el empaquetamiento de una molécula de ácido nucleico divulgada en el presente documento que incluye una etiqueta o un prospecto. La etiqueta puede incluir indicaciones para el uso de las moléculas de ácido nucleico tales como el uso para el tratamiento o la prevención de enfermedades, trastornos, lesiones y afecciones, que incluyen, sin limitación, cualquier enfermedad o afección divulgada en el presente documento. La etiqueta puede incluir indicaciones para el uso de las moléculas de ácido nucleico, como el uso para el tratamiento o la prevención de la atenuación de dicha enfermedad, lesión o afección. La etiqueta puede incluir indicaciones para el uso de las moléculas de ácido nucleico, como el uso para el tratamiento o la prevención de cualquier otra enfermedad o afección que esté relacionada o que responda a los niveles de p53 en una célula o tejido, solo o en combinación con otras terapias. Una etiqueta puede incluir una indicación para su uso en la reducción y/o subregulación de la expresión de p53. Un "prospecto" se usa para referirse a las instrucciones que habitualmente se incluyen en los empaques comerciales de productos terapéuticos, que contienen información sobre las indicaciones, el uso, la dosificación, la administración, las contraindicaciones, otros productos terapéuticos que se combinan con el producto envasado y/o advertencias sobre el uso de dichos productos terapéuticos, etc.

Los expertos en la técnica reconocerán que otros tratamientos, fármacos y terapias conocidos en la técnica pueden combinarse fácilmente con las moléculas de ácido nucleico del presente documento (por ejemplo, moléculas de ANdc) y, por lo tanto, se contemplan en el presente documento.

Metodos de tratamiento

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a un método para el tratamiento de un sujeto que necesita tratamiento para una enfermedad o trastorno asociado con la expresión anormal del gen p53, que comprende administrar al sujeto una cantidad de un inhibidor, que reduce o inhibe la expresión del gen p53.

En un ejemplo, las moléculas de ácido nucleico se pueden usar para subregular o inhibir la expresión del gen p53 y/o la proteína p53 y/o los polimorfismos de haplotipo que están asociados con una enfermedad o afección (por ejemplo, isquemia). El análisis del gen p53 y/o los niveles de proteína o ARN se pueden usar para identificar sujetos con tales polimorfismos o aquellos sujetos con riesgo de desarrollar rasgos, afecciones o enfermedades divulgadas en este documento. Estos sujetos son susceptibles de tratamiento, por ejemplo, el tratamiento con moléculas de ácido nucleico divulgado en el presente documento y cualquier otra composición útil en el tratamiento de enfermedades relacionadas con la expresión del gen p53. Como tal, el análisis del gen p53 y/o los niveles de proteína o ARN se pueden usar para determinar el tipo de tratamiento y el curso de la terapia en el tratamiento de un sujeto. El monitoreo de los niveles de proteína o ARN se puede usar para predecir el resultado del tratamiento y para determinar la eficacia de compuestos y composiciones que modulan el nivel y/o la actividad de ciertos genes y/o proteínas asociadas con un rasgo, condición o enfermedad.

En algunos ejemplos, los compuestos de ácido nucleico divulgados en el presente documento son para uso en un método para subregular la expresión de un gen p53 transcrito en el ARNm expuesto en cualquiera de las SEQ ID NOS: 1-7 en al menos un 40%, preferiblemente en un 50%, 60% o 70%, más preferiblemente en un 75%, 80% o 90% en comparación con un control, que comprende poner en contacto un transcrito de ARNm del gen p53 con uno o más de los compuestos.

En varios ejemplos, los compuestos de ácido nucleico divulgados en este documento inhiben el gen p53, por lo que la inhibición se selecciona del grupo que comprende la inhibición de la función del gen, la inhibición del polipéptido y la inhibición de la expresión del ARNm.

En un ejemplo, el compuesto de ácido nucleico divulgado en el presente documento inhibe el polipéptido p53, por lo que la inhibición se selecciona del grupo que comprende la inhibición de la función (que se examina, por ejemplo, mediante un ensayo enzimático o un ensayo de unión con un interactor conocido del gen/polipéptido nativo, entre otros), la inhibición de la proteína (que se examina mediante, por ejemplo, transferencia Western, ELISA o inmunoprecipitación, entre otros) y la inhibición de la expresión del ARNm (que se examina mediante, por ejemplo, transferencia Northern, RT-PCR cuantitativa, hibridación in situ o hibridación de microarreglos, entre otros).

En un ejemplo, el compuesto de ácido nucleico divulgado en el presente documento subregula un polipéptido p53 de mamífero, por lo que la subregulación se selecciona del grupo que comprende la subregulación de la función (que se examina, por ejemplo, mediante un ensayo enzimático o un ensayo de unión con un interactor conocido del gen/polipéptido nativo, entre otros), la subregulación de la proteína (que se examina, por ejemplo, mediante transferencia Western, ELISA o inmunodeposición, entre otras) y la subregulación de la expresión de ARNm (que se examina, por ejemplo, mediante transferencia Northern, RT-PCr cuantitativa, hibridación in situ o hibridación de microarreglos, entre otros).

Los métodos, moléculas y composiciones que inhiben un gen o polipéptido p53 se analizan en este documento en detalle, y cualquiera de dichas moléculas y/o composiciones se emplean de manera beneficiosa en el tratamiento de un paciente que padece cualquiera de dichas afecciones. Debe entenderse explícitamente que los compuestos conocidos están excluidos de la presente divulgación. Los nuevos métodos de tratamiento que utilizan compuestos y composiciones conocidos están dentro del alcance de la presente divulgación. Los métodos incluyen administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de uno o más compuestos de ácido nucleico divulgados en el presente documento que subregulan la expresión de un gen p53. En algunos ejemplos del método, un compuesto de ácido nucleico divulgado en el presente documento es para tratar una enfermedad, un trastorno o una condición asociada con una exposición a un agente tóxico. Por "exposición a un agente tóxico" se entiende que el agente tóxico está disponible para o entra en contacto con, un mamífero. Un agente tóxico puede ser tóxico para el sistema nervioso. La exposición a un agente tóxico puede ocurrir por administración directa, por ejemplo, por ingestión o administración de un alimento, medicamento o agente terapéutico, por ejemplo, un agente quimioterapéutico, por contaminación accidental, o por exposición ambiental, por ejemplo, exposición aérea o acuosa.

Además, se proporciona un proceso de preparación de una composición farmacéutica, que comprende:

proporcionar una o más moléculas de ácido nucleico divulgadas en el presente documento, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma; y

mezclar dicha molécula o dicha sal de la misma con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En un ejemplo preferido, la molécula usada en la preparación de una composición farmacéutica se mezcla con un vehículo en una dosis farmacéuticamente eficaz. En un ejemplo particular, el compuesto de ácido nucleico divulgado en el presente documento se conjuga con un esteroide o con un lípido o con otra molécula adecuada, por ejemplo, con colesterol.

Se proporcionan composiciones y métodos para la subregulación de la expresión de p53 mediante el uso de moléculas de ácido nucleico como se proporciona en el presente documento, tales como, sin limitarse a, un ácido nucleico de interferencia corto (ANic), ARN de interferencia (ARNi), ARN corto de interferencia (ARNpi), ARN de doble cadena (ARNdc), micro-ARN (miARN) y moléculas de ARN de horquilla corta (ARNhc) capaces de subregular la expresión del gen p53, o de mediar el ARN de interferencia contra la expresión del gen p53.

La composición y los métodos divulgados en el presente documento también son útiles para tratar diversas afecciones o enfermedades, tales como, por ejemplo, trastornos, enfermedades y lesiones divulgados en el presente documento.

Las moléculas de ácido nucleico divulgadas en el presente documento individualmente, o en combinación o junto con otros fármacos, pueden usarse para prevenir o tratar enfermedades, rasgos, afecciones y/o trastornos asociados con p53, tales como, sin limitarse a, enfermedades, trastornos y lesiones descritas en el presente documento.

Las moléculas de ácido nucleico divulgadas en el presente documento pueden subregular la expresión del gen p53 de una manera específica de la secuencia. Las moléculas de ácido nucleico pueden incluir una cadena sentido y una cadena antisentido que incluyen nucleótidos contiguos que son al menos parcialmente complementarios (antisentido) a una porción de ARNm de p53 (por ejemplo, las SEQ ID NOS: 1-7).

En algunos ejemplos, los compuestos de ácido nucleico específicos para p53 pueden usarse junto con otros agentes terapéuticos y/o compuestos de ácido nucleico específicos para otros objetivos moleculares, tales como, sin limitarse a, varios genes proapoptóticos.

Un método para tratar o prevenir una enfermedad o una afección que está asociada con la expresión de p53 en un sujeto o un organismo puede incluir poner en contacto al sujeto o al organismo con una molécula de ácido nucleico proporcionada en el presente documento bajo condiciones adecuadas para subregular la expresión del gen p53 en el sujeto u organismo.

En los ejemplos preferidos, el sujeto que se trata es un animal de sangre caliente y, en particular, mamíferos que incluyen seres humanos.

Los métodos divulgados en el presente documento comprenden administrar al sujeto uno o más compuestos inhibidores que subregulan la expresión del gen p53; y, en particular, los compuestos de ácido nucleico descritos en el presente documento, en una dosis terapéuticamente eficaz para tratar así al sujeto.

Las moléculas divulgadas en el presente documento, particularmente los compuestos de ácido nucleico de doble cadena novedosos, subregulan la expresión de p53 y son útiles en el tratamiento de enfermedades o afecciones en las que es beneficiosa la subregulación de la expresión de p53. Los métodos, las moléculas y las composiciones que subregulan la p53 se discuten en este documento en detalle, y cualquiera de dichas moléculas y/o composiciones pueden emplearse beneficiosamente en el tratamiento de un sujeto que padece cualquiera de dichas afecciones. Las secuencias de oligonucleótidos de cadena sentido y cadena antisentido útiles para generar compuestos de ácido nucleico se exponen en la Tabla 1 (SEQ ID NOS: 8-33). Los compuestos oligonucleotídicos específicos se exponen en las Tablas A, B y E. En ejemplos preferidos, el sujeto que se trata es un animal de sangre caliente y, en particular, un mamífero, incluido un humano.

El término "tratamiento" se refiere tanto al tratamiento terapéutico como a las medidas profilácticas o preventivas, en el que el objetivo es prevenir un trastorno o reducir los síntomas de un trastorno, tal como un trastorno o deterioro de la audición (o deterioro del equilibrio), o prevenir o reducir la muerte celular asociada con una enfermedad asociada con la pérdida de audición como se indica en el presente documento. Aquellos que necesitan tratamiento incluyen aquellos que ya experimentan la enfermedad o afección, aquellos propensos a tener la enfermedad o afección, y aquellos en los que se debe prevenir la enfermedad o afección. Los compuestos de ácido nucleico divulgados en este documento se administran antes, durante o después del inicio de la enfermedad o afección.

En algunos ejemplos, las moléculas y composiciones proporcionadas en el presente documento se administran conjuntamente con una ototoxina. Por ejemplo, se proporciona un método mejorado para el tratamiento de la infección de un mamífero mediante la administración de un antibiótico aminoglucósido, comprendiendo la mejora administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de uno o más compuestos (particularmente ARNpi nuevos) que subregulan la expresión de p53 al paciente que necesite dicho tratamiento para reducir o prevenir la deficiencia auditiva inducida por ototoxinas asociada con el antibiotico. Los compuestos que subregulan la expresión de p53, particularmente los nuevos ARNdc, se administran preferiblemente de manera local dentro del oído interno.

En otro ejemplo más, se proporciona un método mejorado para el tratamiento del cáncer en un mamífero mediante la 5 administración de un compuesto quimioterapéutico, en el que la mejora comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición al paciente que necesita dicho tratamiento para reducir o prevenir el deterioro auditivo inducido por ototoxinas asociado con el fármaco quimioterapéutico. Los compuestos que reducen o previenen la discapacidad auditiva inducida por ototoxinas, por ejemplo, las moléculas de ARNdc divulgadas en el presente documento, entre otras, se administran preferiblemente de manera directa, por ejemplo, a la cóclea, como 0 ARNdc desnudo en un vehículo tal como PBS u otras soluciones fisiológicas, pero puede administrarse alternativamente con un vehículo de administración como se describió anteriormente.

En algunos ejemplos, se prefiere la terapia de combinación. La terapia de combinación se logra administrando dos o más agentes (es decir, dos o más ARNdc o al menos un ARNdc y al menos otro agente terapéutico), cada uno de los cuales se formula y administra por separado, o administrando dos o más agentes en una única formulación. Otras 5 combinaciones también están abarcadas por la terapia de combinación. Por ejemplo, dos agentes pueden formularse juntos y administrarse junto con una formulación separada que contiene un tercer agente. Si bien los dos o más agentes en la terapia de combinación pueden administrarse simultáneamente, no es necesario que lo sean. Por ejemplo, la administración de un primer agente (o combinación de agentes) puede preceder a la administración de un segundo agente (o combinación de agentes) por minutos, horas, días o semanas. Por lo tanto, los dos o más agentes ⁰pueden administrarse en el lapso de minutos unos de otros o dentro de una o varias horas entre sí o dentro de uno o varios días entre sí o dentro de varias semanas entre sí. En algunos casos son posibles incluso intervalos más largos. Los dos o más agentes utilizados en la terapia de combinación pueden o no estar presentes en el cuerpo del paciente al mismo tiempo. La terapia de combinación incluye dos o más administraciones de uno o más de los agentes utilizados en la combinación. Por ejemplo, si se usa ARNdc1 y ARNdc2 en una combinación, se podrían administrar 5 secuencialmente en cualquier combinación una o más veces, por ejemplo, en el orden ARNdc1-ARNdc2, ARNdc2-ARNdc1, ARNdc1-ARNdc2-ARNdc1, ARNdc2-ARNdc1-ARNdc2, ARNdc1-ARNdc1-ARNdc2, ARNdc1-ARNdc2-ARNdc2 etc.

Los detalles de ciertas indicaciones en las que los compuestos divulgados en el presente documento son útiles como agentes terapéuticos se describen en el presente documento.

0 Los ejemplos se han descrito de manera ilustrativa, y debe entenderse que la terminología utilizada pretende estar en la naturaleza de las palabras de la descripción en lugar de la limitación.

A lo largo de esta solicitud, varias publicaciones, incluidas las patentes de los Estados Unidos, son referenciadas por el autor y el año y las patentes por el número.

Las composiciones y métodos proporcionados en el presente documento se describirán ahora con mayor detalle 5 haciendo referencia a los siguientes ejemplos no limitativos.

Ejemplos

Sin más elaboración, se cree que un experto en la técnica puede, utilizando la descripción precedente, utilizar la presente invención en toda su extensión. Por lo tanto, los siguientes ejemplos específicos preferidos deben interpretarse como meramente ilustrativos y no limitativos de la invención reivindicada de ninguna manera.

0 Los protocolos de biología molecular estándar conocidos en la técnica no divulgados específicamente en este documento generalmente se siguen esencialmente como en Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Springs Harbor Laboratory, New-York (1989, 1992), y en Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1988), y como en Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989) y como en Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John 5 Wiley & Sons, New York (1988), y como en Watson et al., Recombinant DNA, Scientific American Books, New York y en Birren et al., (eds) Genome Analysis: A Laboratory Manual Series, Vols. 1-4 Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998) y la metodología expuesta en las patentes de Estados Unidos Nos. 4.666.828; 4.683.202; 4.801.531; 5.192.659 y 5.272.057.

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se llevó a cabo como en los Protocolos estándar de PCR: A Guide To 0 Methods And Applications, Academic Press, San Diego, CA (1990). La PCR in situ en combinación con citometría de flujo (FACS) se puede usar para la detección de células que contienen secuencias específicas de ADN y ARNm (Testoni et al., Blood 1996, 87: 3822). Los métodos para realizar la RT-PCR son bien conocidos en la técnica.

Ejemplo 1: Generación de nuevas secuencias para compuestos de ARNdc activos

Utilizando algoritmos patentados y la secuencia conocida del ARNm del gen p53 (SEQ ID NOS: 1-7), se generaron 5 las secuencias de muchos ARNdc potenciales.

Las secuencias de oligonucleótidos se priorizaron basándose en su puntuación en el algoritmo patentado como las mejores secuencias predichas para dirigirse a la expresión génica humana.

Ejemplo 2: Identificación de nuevas secuencias preferidas para compuestos de ácido nucleico activos y generación de nuevos compuestos de ácido nucleico de doble cadena

Las secuencias de oligonucleótidos con mejor puntuación se priorizaron adicionalmente basándose en su actividad in vitro. Para este propósito, se sintetizaron compuestos de ARNdc que tenían los siguientes patrones de modificación:

compuesto de ARNdc identificado por la terminación "_S709" que tiene ribonucleótidos no modificados en la cadena antisentido y en la cadena sentido, y una saliente en el extremo 3' -dTdT$ tanto en la cadena antisentido como en la cadena sentido, con dT designando timidina y dT$ designando timidina sin fosfato terminal.

compuesto de ARNdc identificados por la terminación _S500 tienen el siguiente patrón de modificación: Los ribonucleótidos modificados con azúcar 2'-O-metil (Me) alternantes están presentes en las posiciones primera, tercera, quinta, séptima, novena, undécima, decimotercera, decimoquinta, decimoséptima y decimonovena de la cadena antisentido, por lo que la misma modificación, es decir, un ribonucleótido modificado con azúcar 2'-O-metilo están presentes en las posiciones segunda, cuarta, sexta, octava, décima, duodécima, decimocuarta, decimosexta y decimoctava de la cadena sentido.

compuestos de ARNdc identificados con los prefijos "p53_3", "p53_QMON1" y "p53_1" se utilizaron como control, las secuencias de la cadena antisentido y la cadena sentido de estos compuestos de control se proporcionan en la Tabla C.

Tabla C

En todas las tablas anteriores y siguientes, los nombres dúplex se identifican con los prefijos "p53" y "TP53" que se usan de manera intercambiable.

El siguiente ensayo se usó para los estudios de actividad in vitro.

Ensayo de actividad

Se cultivaron aproximadamente 1,5-2 x 10⁵células humanas o de rata probadas que expresan de forma endógena los genes p53 (células HCT116 humanas o células REF52 de rata) en una placa de ⁶pozos en 1,5 mL de medio de crecimiento durante aproximadamente 24 horas hasta una confluencia del 30-50%.

Las células se transfectaron a continuación con un compuesto de ARNdc analizado en una concentración final requerida de 0,001-100 nM por pozo utilizando el reactivo Liopofectamina 2000.

Para determinar la eficacia de la transfección del estudio, se trataron de forma independiente 5 pozos con el reactivo Lipofectamina 2000 y se definieron como "muestras de control negativo" y 5 pozos se transfectaron de forma independiente con ARNdc activo a una concentración final de 5 nM definida como "muestras activas de control" (control positivo). Se utilizaron células transfectadas con ARNpi marcadas con Cy3 como control positivo para la eficacia de la transfección.

Las células se incubaron luego en una incubadora a 37°C ± 1°C, 5% de CO²durante 48-72 horas. Se recogieron células transfectadas con ARNdc y se aisló el ARN utilizando el kit EZ-RNA [Biological Industries (# 20-410-100)]. La transcripción inversa se realizó de la siguiente manera: se sintetizó ADNc y se determinaron los niveles de ARNm de p53 humano y/o de rata, mediante qPCR en tiempo real y se normalizaron con aquellos del ARNm de Ciclofilina A (CYNA, PPIA) para cada muestra. La actividad del ARNdc se determinó en función de la proporción de la cantidad de ARNm en muestras tratadas con ARNpi frente a muestras de control no transfectadas.

Como resultado del estudio de actividad, se identificaron secuencias preferidas para nuevos compuestos de ARNdc para la subregulación del gen p53. Estas secuencias se exponen en la Tabla 1, más arriba (SEQ ID NOS: 8-33). Los resultados de la actividad obtenidos con los compuestos que tienen esta secuencia y que tienen un patrón de modificación identificado por la terminación "_S709" se presentan en la Tabla D. Los compuestos de ARNdc identificados por la terminación "_S709" tienen ribonucleótidos no modificados en la cadena antisentido y en la cadena sentido, y una saliente del extremo 3' -dTdT$ tanto en la cadena antisentido como en la cadena sentido, con dT que designa timidina y dT$ que designa timidina sin fosfato terminal.

Tabla D:

Como se muestra en la Tabla D, los compuestos de ácido nucleico de doble cadena p53_34_S709, p53_35_S709, p53_37_S709, p53_38_S709, p53_39_S709, p53_40_S709, p53_41_S709, p53_42_S709, fueron encontrados activos contra el ARNm de p53 humano objetivo, con p53_41_S709 siendo el compuesto más activo.

Ejemplo 3: Generación y prueba de nuevos compuestos modificados de ácido nucleico de doble cadena

Las secuencias preferidas (SEQ ID NOS: 8-33) se usaron para generar nuevos compuestos modificados de ácido nucleico de cadena doble. Los nuevos compuestos modificados de ácido nucleico de doble cadena que se generaron utilizando la cadena antisentido preferida y las secuencias de la cadena sentido se exponen en las Tablas A y B, más arriba. La Tabla E a continuación muestra algunos de los nuevos compuestos modificados de ácido nucleico de doble cadena preferidos que se generaron utilizando secuencias preferidas de cadena antisentido y cadena sentido (SEQ ID NOS: 8-33).

Tabla E

En todas las tablas anteriores y siguientes, los nombres del dúplex se identifican con los prefijos "p53" y "TP53" que se usan indistintamente. Así, por ejemplo, un compuesto identificado por el prefijo "p53_13" y "TP53_13" designa un compuesto de ácido nucleico de doble cadena que tiene una secuencia de la cadena sentido 5' CAGACCUAUGGAAACUACU 3' (SEQ ID NO: ⁸) y una secuencia de cadena antisentido 5' AGUAGUUUCCAUAGGUCUG 3' (SEQ ID NO: 21).

En todas las tablas anteriores y siguientes, los compuestos identificados por el prefijo "p53_44" están de acuerdo con la presente invención. Otros prefijos identifican compuestos de referencia. Para todos los compuestos de ARNdc en la Tabla E:

A, U, G, C - designa un ribonucleótido no modificado;

A, U, G, C - designa un ribonucleótido modificado con azúcar 2-O-metilo;

a, u, c, g - designa un nucleótido unido a un nucleótido adyacente (5' > 3') por un enlace de fosfato internucleótido 2'-5';

C3: designa 1,3-propanodiol, mono(dihidrogenofosfato) también identificado como un resto de protección 3-hidroxipropano-1-fosfato [CAS RN: 13507-42-1].

C3C3 - designa un resto de protección que consiste en dos moléculas C3 consecutivas

pi - designa 3'-fosfato

5'-fos - designa 5'-fosfato

La actividad de nuevos compuestos modificados de ácido nucleico de doble cadena fue estudiada en células HCT116 humanas y en células REF52 de rata.

La Tabla F1 resume los resultados de la actividad in vitro obtenidos para algunas de las nuevas moléculas de ácido nucleico de doble cadena en la línea celular HCT116 humana. Todos los nuevos compuestos de ARNdc se describen en la Tabla E, más arriba. p53_13_S500 es un compuesto conocido que se usó con fines comparativos. El compuesto p53_13_S500 tiene las secuencias de la cadena sentido y de la cadena antisentido descritas en la Tabla C, más arriba. El compuesto p53_13_S500 tiene el siguiente patrón de modificación: los ribonucleótidos modificados con azúcar 2'-O-metil (Me) alternantes están presentes en las posiciones primera, tercera, quinta, séptima, novena, undécima, decimotercera, decimoquinta, decimoséptima y decimocuarta de la cadena antisentido, mediante la cual la misma modificación, es decir, los ribonucleótidos modificados con azúcar 2'-O-metilo están presentes en la segunda, cuarta, sexta, octava, décima, duodécima, decimocuarta, decimosexta y decimoctava posición de la cadena sentido.

La actividad in vitro en la Tabla F1 se demuestra como el % de ARNm objetivo residual en relación con el control.

Tabla F1

Se encontró que los resultados de los estudios de actividad in vitro que se llevaron a cabo en células HCT116 humanas muestran que los compuestos identificados como p53_41_S709, p53_41_S2279, p53_41_S2298, p53_41_S2299, p53_44_S2301, p53_44_S2302, p53_44_S2303 y p53_44_S2304 (todos descritos en la Tabla E, más arriba) son más activos en la subregulación del ARNm de p53 humano.

La Tabla F2 resume los resultados de la actividad in vitro obtenidos para algunas de las nuevas moléculas de ácido nucleico de doble cadena en la línea celular REF52 de rata.

La actividad in vitro en la Tabla F2 se demuestra como el % de ARNm objetivo residual en relación con el control.

Tabla F2

Se encontró que los resultados de este estudio de actividad in vitro realizado en células REF52 de rata muestran que los compuestos identificados como p53_44_S2301, p53_44_S2302, p53_44_S2303 y p53_44_S2304 (todos descritos en la Tabla E, más arriba) fueron los más activos en la subregulación del ARNm de p53 de rata, entre los compuestos que se probaron en este estudio.

Ejemplo 4: Evaluación de la actividad potencial de nuevas moléculas de ARN de doble cadena utilizando el sistema psiCHECKMR-2

Se prepararon tres constructos basados en psiCHECKMR-2 (Promega) para la evaluación de la actividad potencial. Los constructos psiCHECK contenían copias individuales de la guía complementaria correspondiente (AS-CM). Se inocularon 1,3 - 1,5 x 10⁶células HeLa humanas en una placa de 10 cm. Las células se incubaron luego en una incubadora a 37 ± 1°C, 5% de CO²durante 24 horas. El medio de crecimiento se reemplazó un día después de la inoculación por ⁸mL de medio de crecimiento fresco y cada placa se transfectó con uno de los plásmidos mencionados anteriormente, utilizando el reactivo LipofectminaMR 2000 según el protocolo del fabricante y se incubó durante 5 horas a 37 ± 1°C y 5% de CO². Después de la incubación, las células se volvieron a colocar en una placa de 96 pozos a una concentración final de 5x10³células por pozo en 80 pL de medio de crecimiento. Después de 16 horas, las células se transfectaron con un compuesto de ARN de transfección utilizando el reactivo Lipofectamina 2000 a concentraciones finales que oscilan entre 0,01 nM y 100 nM en un volumen final de 100 pL. Las células se incubaron luego durante 48 horas a 37 ± 1°C después de la evaluación de las actividades de luciferasa de Renilla y Luciérnaga como se describe a continuación.

48 horas después de la transfección con compuesto de ARN de doble cadena, se midieron las actividades de luciferasa de Renilla y Luciernaga en cada una de las muestras transfectadas con ARNpi, utilizando el kit de ensayo Dual-Luciferase® (Promega, Cat # E1960) de acuerdo con el procedimiento del fabricante. El valor de actividad de la luciferasa de Renilla se dividió por el valor de actividad de luciferasa de Luciérnaga para cada muestra (normalización). La actividad de luciferasa de Renilla finalmente se expresa como el porcentaje del valor de actividad normalizada en la muestra analizada con relación al valor normalizado obtenido en células transfectadas con el correspondiente plásmido psiCHECKMR-2 solamente pero sin ARN de doble cadena.

Las tablas G, H e I resumen los resultados (% de ARNm residual) obtenidos para algunas de las nuevas moléculas de ácido nucleico de doble cadena que utilizan el sistema psiCHECK en la secuencia AS-CM. Todos los nuevos compuestos de ácido nucleico de doble cadena se describen en la Tabla E, más arriba.

Las tablas G, H e I resumen los resultados (% de ARNm residual) obtenidos para algunas de las nuevas moléculas de ácido nucleico de doble cadena que utilizan el sistema psiCHECK en la secuencia AS-CM. Todos los nuevos compuestos de ARNdc se describen en la Tabla E, más arriba.

Tabla G

Tabla H

Tabla I

Los resultados del estudio de actividad en el sistema psiCHECKMR-2 muestran que todos los compuestos de ácido nucleico de doble cadena basados en la secuencia TP53_41, la secuencia TP53_13 y la secuencia TP53_44 fueron altamente activos.

Ejemplo 5: modelos animales

La prueba de los ARNpi activos se puede hacer en modelos animales predictivos.

Sistemas modelo de insuficiencia renal aguda (ARF).

La prueba de los compuestos de ácido nucleico activo divulgados en el presente documento para tratar la insuficiencia renal aguda (ARF) se puede realizar utilizando ARF inducido por sepsis o ARF inducida por isquemia-reperfusión.

1. ARF inducida por sepsis

Se describen dos modelos animales predictivos de ARF inducida por sepsis por Miyaji T, Hu X, Yuen PS, Muramatsu Y, Iyer S, Hewitt SM, Star RA, 2003, Ethyl pyruvate decreases sepsis-induced acute renal failure and multiple organ damage in aged mice, Kidney Int. Nov;64(5):1620-31. Estos dos modelos son la administración de lipopolisacáridos y la punción de la ligadura cecal en ratones, preferiblemente en ratones de edad avanzada.

2. ARF inducida por isquemia-reperfusión

Este modelo animal predictivo está divulgado por Kelly KJ, Plotkin Z, Vulgamott SL, Dagher PC, enero de 2003. P53 mediates the apoptotic response to GTP depletion after renal ischemia-reperfusion: protective role of a p53 inhibitor, J Am Soc Nephrol.; 14(1): 128-38.

La lesión por isquemia-reperfusión se induce en ratas después de 45 minutos de pinzamiento arterial bilateral renal y posterior liberación de la pinza para permitir 24 horas de reperfusión. Se inyectan 250 |jg de un compuesto de ácido nucleico de prueba en la vena yugular 2 horas antes y 30 minutos después de la pinza. Se administran 250 jg adicionales de compuesto de ácido nucleico de prueba a través de la vena de la cola a las 4 y ⁸horas después de la pinza. El compuesto de ácido nucleico contra GFP sirve como control negativo. La progresión de la ARF se controla mediante la medición de los niveles de creatinina en suero antes y 24 horas después de la cirugía. Al final del experimento, las ratas se perfunden a través de una línea femoral permanente con PBS caliente seguido de paraformaldehído al 4%. Los riñones izquierdos se extraen y se almacenan en paraformaldehído al 4% para su posterior análisis histológico. La insuficiencia renal aguda se define frecuentemente como un aumento agudo del nivel de creatinina en suero a partir de la línea base. Un aumento de al menos 0,5 mg por dL o 44,2 jm ol por L de creatinina en suero se considera una indicación de insuficiencia renal aguda. La creatinina en suero se mide en el momento cero antes de la cirugía y 24 horas después de la cirugía de ARF.

Para estudiar la distribución del compuesto de ácido nucleico en el riñón de rata, las moléculas de compuesto de ácido nucleico marcadas con Cy3 (2 mg/kg) se administran por vía intravenosa durante 3 a 5 minutos, después de lo cual se realizan imágenes in vivo utilizando microscopia confocal de dos fotones.

El efecto del compuesto de ácido nucleico sobre la lesión por isquemia-reperfusión renal se determina adicionalmente analizando la extensión de la necrosis tubular en el tejido renal. La necrosis tubular se puede calificar como: sin daño (puntuación de daño ⁰), necrosis unicelular irregular aislada (puntuación de daño ¹), necrosis tubular en menos del 25% del tejido (puntuación de daño 2), necrosis tubular entre el 25 y el 50% del tejido (puntuación de daño 3) y necrosis tubular en más del 50% del tejido (puntuación de daño 4).

Los compuestos de ácido nucleico de las Tablas A, B y E se prueban en estos modelos de insuficiencia renal aguda (ARF), en los que se encuentra que son eficaces en el tratamiento de ARF.

Sistemas modelo de muerte de células pilosas del oído interno inducida por quimioterapia

1. Sistema modelo de pérdida de células pilosas internas inducida por carboplatino.

Las ocho chinchillas se tratan previamente mediante administración directa del compuesto de ácido nucleico de prueba en solución salina (1, 10 y 30 |jg) al oído izquierdo de cada animal. La solución salina se administra en el oído derecho de cada animal como placebo. Dos días después de la administración del compuesto de ácido nucleico, los animales se tratan con carboplatino (75 mg/kg ip). Después del sacrificio de las chinchillas (dos semanas después del tratamiento con carboplatino), el porcentaje de células muertas de las células pilosas internas (IHC) y las células pilosas externas (OHC) se calcula en el oído izquierdo (tratado con compuesto de ácido nucleico) y en el oído derecho (tratado con solución salina).

2. Sistema modelo de pérdida de células pilosas internas inducida por cisplatino.

En ratas Wistar macho se analizan los umbrales de respuesta auditiva basal del tronco cerebral (ABR) para detectar señales de clics, ⁸, 16 y 32 kHz antes del tratamiento con cisplatino. Tras la prueba de respuesta auditiva basal del tronco cerebral, se administra cisplatino como una infusión intraperitoneal de 13 mg/kg durante 30 minutos. Los oídos tratados reciben 15 jg /4 microlitros de un compuesto de ácido nucleico de prueba en PBS. Los oídos de control se tratan con compuesto de ácido nucleico de GFP no relacionado o PBS. Las moléculas del compuesto de ácido nucleico se administran entre 3-5 días antes de la administración de cisplatino para permitir un efecto protector sobre la cóclea.

La prueba de respuesta auditiva del tronco cerebral (ABR) se repite 3 días después de la administración de cisplatino. Los umbrales de la respuesta auditiva del tronco encefálico se comparan entre el tratamiento previo y el tratamiento posterior, y se registra el cambio en los umbrales. Un mayor cambio en los umbrales después del tratamiento con cisplatino es indicativo de una pérdida más severa de células pilosas en la cóclea. Después de repetir la prueba de respuesta auditiva del tronco cerebral, los animales se sacrifican y las cócleas se extraen y se procesan para microscopía electrónica de barrido (SEM) para cuantificar la pérdida de células pilosas externas (OHC) en la región de gancho (región de alta frecuencia). El % de pérdida de células pilosas externas se calcula dividiendo el número de células perdidas o severamente dañadas por la cantidad total de células pilosas externas en el campo de la fotografía.

Los compuestos de ácido nucleico de las Tablas A, B y E se prueban en este modelo de pérdida de células pilosas internas inducida por quimioterapia en la cóclea, en el que se encuentra que son efectivos para reducir significativamente la pérdida de células pilosas en la cóclea y en el tratamiento de la pérdida de audición inducida por la quimioterapia.

Sistema modelo de muerte de células pilosas inducida acústicamente en la cóclea.

La actividad del compuesto de ácido nucleico de prueba en un modelo de trauma acústico se estudia en chinchillas. Un grupo de 7 animales sufre el trauma acústico. Los animales están expuestos a una banda de una octava de ruido centrada a 4 kHz durante 2,5 h a 105 dB. El oído izquierdo de las chinchillas expuestas al ruido se trata previamente (48 h antes del trauma acústico) con 30 jg de compuesto de ácido nucleico en aproximadamente 10 jL de solución salina; el oído derecho se trata previamente con vehículo (solución salina). El potencial de acción del compuesto (CAP) es un método electrofisiológico conveniente y confiable para medir la actividad neuronal transmitida desde la cóclea. El CAP se registra colocando un electrodo cerca de la base de la cóclea para detectar el potencial de campo local que se genera cuando un estímulo sonoro, tal como el clic o la ráfaga de tono, se enciende abruptamente. El estado funcional de cada oído se evalúa 2,5 semanas después del trauma acústico. Específicamente, el umbral medio del potencial de acción compuesto registrado desde la ventana redonda se determina 2,5 semanas después del trauma acústico para determinar si los umbrales en el oído tratado con ácido nucleico son más bajos (mejores) que el oído no tratado (solución salina). Además, la cantidad de pérdida de células pilosas internas y externas se determina en el tratamiento con ácido nucleico y el oído de control. Estos resultados indican que el ARNpi de p53 administrado en la ventana redonda de la cóclea es capaz de reducir el daño causado por un trauma acústico.

Los compuestos de ácido nucleico de las Tablas A, B y E se prueban en este modelo de pérdida auditiva inducida por trauma acústico, en el que se encuentra que son efectivos para reducir el daño causado por el trauma acústico y en el tratamiento de pérdida de audición inducida por trauma acústico.

Modelos adicionales de pérdida auditiva

A) Modelo de regeneración auditiva (plasticidad) en conejillos de indias.

La inducción de ensordecimiento se realiza mediante el tratamiento sistémico de conejillos de indias albinos con una única inyección de kanamicina (450-500 mg/kg) seguida de una única inyección iv (yugular) de ácido etacrínico (EA). Este ensordecimiento farmacológico elimina bilateralmente todas las células pilosas aproximadamente después de 1 2 días y deja las células de soporte diferenciadas. Los ácidos nucleicos terapéuticos se aplican en el oído medio mediante inyección transtimpánica (TT) o en el conducto auditivo externo o el tímpano mediante gotas auditivas (ErD).

La eficacia de los compuestos de ácido nucleico de prueba se examina como sigue:

1) Las cócleas se analizan morfológicamente como monturas completas teñidas para miosina VIIa (marcador de células pilosas) y faloidina.

2) La incorporación de BrdU se mide como un indicador de la tasa de proliferación de las células pilosas.

B) Modelo de pérdida auditiva aguda inducida por ruido en conejillos de indias

El ruido puede causar daños a la audición con pérdida de audición neurosensorial (SNHL) temporal o permanente y tinnitus. La SNHL y el tinnitus pueden aparecer en forma singular o en combinación. En humanos, la pérdida de audición inducida por ruido (NIHL) se demuestra por un cambio de umbral en el audiograma de tono puro, en el reclutamiento, en los resultados patológicos de las pruebas de audición por el encima del umbral y en la disminución de la amplitud de las emisiones oto-acústicas. El daño auditivo es inducido por la exposición a ruido continuo o ruido impulsivo. Además, debe tenerse en cuenta la posibilidad de traumatismos por ruido impulsivo o traumas por explosión. La exposición al ruido de impulso puede provocar una lesión más grave del oído interno que la exposición al ruido continuo. Los criterios importantes para el desarrollo del daño por ruido son el nivel de presión acústica (SPL), la velocidad de aumento de nivel, el tiempo de exposición, así como la susceptibilidad individual ("el oído interno vulnerable"). La exposición al ruido generalmente conduce a una elevación del umbral que puede resolverse posteriormente en parte, de manera que el componente temporal se denomina "cambio de umbral temporal" (TTS). Si no hay una restitución completa en la fase de recuperación después del TTS, esto puede resultar en un daño permanente del oído interno (cambio de umbral permanente = PTS). Una intensidad de sonido muy alta puede provocar la muerte celular inmediata y la rotura mecánica de las estructuras en el oído interno y el PTS.

En este modelo, se induce una lesión bilateral con exposición al ruido; los conejillos de indias están expuestos a ruidos de banda ancha de SPL de 117 dB durante 6 horas.

Los compuestos de ácido nucleico de las Tablas A, B y E se prueban en este modelo, en el que se encuentra que son efectivos para prevenir o tratar la pérdida de audición.

Sistemas modelo de llagas por presión o úlceras por presión

Las llagas por presión o úlceras por presión, incluidas las úlceras diabéticas, son áreas de piel y tejido dañados que se desarrollan cuando la presión sostenida (generalmente de una cama o silla de ruedas) corta la circulación a las partes vulnerables del cuerpo, especialmente la piel de los glúteos, caderas y talones. La falta de flujo sanguíneo adecuado conduce a necrosis isquémica y ulceración del tejido afectado. Las úlceras por presión ocurren con más frecuencia en pacientes con sensación disminuida o ausente o que están debilitados, demacrados, paralizados o postrados en cama por largo tiempo. Los tejidos sobre el sacro, la isquia, los trocánteres mayores, los maléolos externos y los talones son especialmente susceptibles; otros sitios pueden estar involucrados dependiendo de la situación del paciente.

La prueba de los compuestos de ácido nucleico activo para tratar las llagas por presión, úlceras y heridas similares se realiza en el modelo de ratón descrito en Reid et al., (J Surgical Research. 116: 172-180, 2004).

Un modelo de conejo adicional (descrito por Mustoe et al., (JCI, 1991. 87 (2): 694-703; Ahn y Mustoe, Ann Pl Surg, 1991. 24 (1): 17-23) se usa para probar los compuestos de ácido nucleico, se prueban en modelos animales en los que se muestra que estos compuestos de ARNpi tratan y previenen las llagas y úlceras por presión.

Los compuestos de ácido nucleico de las Tablas A, B y E se prueban en estos modelos, en los que se encuentra que son efectivos en el tratamiento de llagas y úlceras por presión, y lesiones similares.

Sistema modelo de función retardada de injerto (DGF) en un paciente con trasplante de riñón

Isquemia por calor: se realiza una nefrectomía izquierda, seguida de un autotrasplante que da como resultado un período de preservación del injerto renal por calor de 45 minutos. Después del auto trasplante, se realiza una nefrectomía derecha en el mismo animal. Un compuesto de ácido nucleico de prueba se administra por vía intravenosa a través de la vena femoral, ya sea antes de la extracción del injerto renal (simulando el tratamiento del donante) ("pre"), o después del autotrasplante del riñón (simulando el tratamiento del receptor), o ambos antes de la recolección y después del trasplante (tratamiento combinado del donante y el receptor) ("pre-post").

Isquemia por frío: se realiza una nefrectomía izquierda en un animal donante, seguida de una preservación en frío (en hielo) del riñón recogido durante un período de 5 horas. Al final de este período, la rata receptora se somete a una nefrectomía bilateral, seguida de un trasplante del injerto de riñón preservado en frío. El tiempo total de isquemia por calor (incluido el procedimiento quirúrgico) es de 30 minutos. Un compuesto de ácido nucleico de prueba se administra por vía intravenosa a través de la vena femoral, ya sea al animal donante antes de la extracción del riñón ("pre"), o al animal receptor 15 minutos ("después de 15 min") o 4 horas (después de 4 h) después del trasplante.

Para evaluar la eficacia del compuesto de ácido nucleico en la mejora de la función renal posterior al trasplante, los niveles de creatinina en suero se miden en los días 1, 2 y 7 posteriores al trasplante en modelos de isquemia tanto por frío como por calor.

Los compuestos de ácido nucleico de las Tablas A, B y E se prueban en este modelo de DGF (función retardada del injerto), en el que se encuentra que son efectivos para proteger el riñón de DGF (función retardada del injerto) asociado con Isquemia por frio y calor y posterior reperfusión.

Sistemas modelo de enfermedad renal crónica (CKD)

La prueba de los compuestos de ácido nucleico activo divulgados en el presente documento para tratar la enfermedad renal crónica (CKD) se puede realizar utilizando los siguientes modelos:

Este modelo animal es útil en la evaluación de los compuestos de prueba para la prevención de la CKD o la atenuación de la progresión de la CKD que resulta de los ataques repetitivos de AKI/ARF.

Los ataques repetitivos de AKI/ARF a menudo dan como resultado la exacerbación de la enfermedad renal crónica (CKD), la progresión de la CKD o el desarrollo de la CKD. La ARF es un síndrome clínico caracterizado por un rápido deterioro de la función renal que se produce en unos días. Sin pretender estar atado a ninguna teoría, la lesión renal aguda puede ser el resultado de una lesión de isquemia-reperfusión renal tal como la lesión por isquemia-reperfusión renal en pacientes sometidos a cirugía mayor como la cirugía cardíaca mayor. La característica principal de ARF es una disminución abrupta en la tasa de filtración glomerular (GFR), que resulta en la retención de desechos nitrogenados (urea, creatinina) en sangre. Estudios recientes demuestran que la apoptosis en los tejidos renales es prominente en la mayoría de los casos humanos de ARF. El sitio principal de la muerte celular apoptótica es la nefrona distal. Durante la fase inicial de la lesión isquémica, la pérdida de integridad del citoesqueleto de actina conduce al aplanamiento del epitelio, con la pérdida del borde en cepillo, la pérdida de los contactos de las células focales y la posterior separación de las células del sustrato subyacente.

El modelo de rata para la CKD comprende ARF inducida por isquemia-reperfusión repetitiva (5 veces) de la siguiente manera: se induce lesión por isquemia-reperfusión en ratas después de 45 minutos de pinzado de arterial renal bilateral y la posterior liberación de la pinza para permitir 24 horas de reperfusión. Se inyectan i.v. PBS o el compuesto de ácido nucleico de prueba (12 mg/kg) en animales experimentales individuales 4 horas después del pinzado. La progresión de la ARF se controla mediante la medición de los niveles de creatinina en suero (SCr) antes (línea base) y 24 horas, 2 días y 7 días después de la cirugía. El tratamiento (lesión I/R, compuesto de ácido nucleico de prueba, medición de SCr) se repite durante cuatro ciclos más a intervalos de 30 días, para un total de cinco ciclos. A los 7 días posteriores al quinto ciclo, se miden la caja metabólica de eliminación de creatinina (SCr) en 24 horas y la proteína en la orina. Los riñones derechos se extirpan quirúrgicamente 2 días después de la caja metabólica (día 10 después del quinto ciclo) y el riñón se analiza histológicamente para la CKD. A las 3 semanas posteriores a la nefrectomía derecha, el riñón izquierdo se exterioriza y se estudia in vivo mediante microscopía intravital de dos fotones (para la captación y retención de Cy3-ARNpi).

Los compuestos de ácido nucleico de las Tablas A, B y E se prueban en este modelo de CKD, en el que se encuentra que son efectivos en el tratamiento de CKD.

Sistemas modelo de lesión de médula espinal (SCI)

Animales y lesión de la médula espinal: los experimentos se realizan con 125 ratas hembra Sprague-Dawley (10 -11 semanas de edad) (Taconic, Germantown, NY). Para la cirugía de SCI, las ratas se anestesian con isoflurano al 2% (IsoFlo, Abbott Lab, North Chicago, IL) y la médula espinal se expone mediante laminectomía en T9-10 y luego se produce una contusión dejando caer una barra de 10,0 g en médula T11 expuesta desde una altura de 12,5 o 25 mm, como se describe (Constantini y Young, 1994; Hasegawa et al., 2005). Después de la contusión y colocar las inyecciones, los músculos y la piel se cierran por separado. Se administra cefazolina (25 mg/kg) a todas las ratas.

Inyección de un compuesto de ácido nucleico de prueba: las inyecciones en el sitio de la lesión se realizan dentro de los 30 minutos previos a la lesión; se inyecta 1 |jg en 1 jL de compuesto de ácido nucleico en cada uno de los tres puntos, incluido el epicentro de la lesión, y 2 mm rostral y caudal del epicentro (3 jL en total) (Hasegawa et al., 2005). Cada inyección se realiza lentamente durante un período de aproximadamente 10 minutos a una profundidad de aproximadamente 1 mm utilizando una jeringa estéril Hamilton de 5 jL . Para la punción lumbar, las ratas anestesiadas se colocan en una superficie operativa que flexiona la espalda y eleva la región lumbar. Se realiza una incisión longitudinal de aproximadamente 1 cm sobre los procesos espinales L3-5 y se retrae la piel. Se introduce una aguja de calibre 30 en el canal espinal en L3-4 o L4-5 para administrar 40 jL en el espacio intratecal con una jeringa Hamilton de 100 jL . La ubicación correcta de la aguja en el espacio intratecal lumbar se indica mediante una sensación de "dar" en el momento de la entrada y un movimiento de la cola (Lepore et al., 2005). Para determinar si este método revierte el flujo del líquido cerebroespinal (CSF) hasta la región del lugar de la lesión, se inyectan 40 jL de colorante azul Evans en el agrandamiento lumbar y la aparición del colorante en ratas laminectomizadas expuestas espinalmente T9-10 en un lapso de segundos después de la inyección confirmó el flujo a través del sitio de la lesión.

Preparación de ARN celular total y Q-RT-PCR: para aislar los ARN, los animales se inyectan con 100 mg/kg de pentobarbital y luego se perfunden con PBS frío. Las columnas vertebrales se remueven rápidamente y se congelan en hielo seco en polvo. Se disecciona un segmento de la médula espinal de 5 mm centrado en el epicentro de la lesión (I) junto con segmentos adyacentes y distales de 5 mm adyacentes, así como un segmento a nivel torácico 1 (T1) (Chang et al., 2009). En algunos experimentos, los segmentos I se dividen en dos en la línea media, lo que da como resultado dos piezas de tejido que representan la misma región de la médula espinal y las extracciones separadas para el ARN y la proteína permitieron la comparación de los resultados de los tejidos pareados. Para el ARN, los tejidos se homogeneizan con un homogeneizador de politrones (Kinematica Inc.) y el ARN se prepara siguiendo el protocolo de Qiagen RNeasy Plus Mini (Qiagen, Valencia, CA). El ARN se cuantifica utilizando un espectrofotómetro Nanodrop (Thermo Scientific Inc.) y se utiliza 1 |jg de ARN total para el ADNc de la primera cadena con transcriptasa inversa SuperScript II (Invitrogen, Carlsbad, CA) cebado por hexámeros aleatorios. Las reacciones de PCR se realizan en 40 ng de ADNc utilizando 1 mM de cebadores y la mezcla maestra SYBR Green (Applied Biosystems, Foster City, CA) en reacciones de 20 jL utilizando la máquina de Applied Biosystems 7500 Fast. El valor de expresión de cada gen se normaliza a la cantidad de ADNc de GAPDH para calcular la cantidad relativa de ARN presente en cada muestra.

Procesamiento y tinción del tejido: los animales anestesiados se perfunden intracardialmente con solución salina seguido por paraformaldehído al 4%. Las médulas espinales se remueven con el epicentro de la lesión marcado y se fijan posteriormente 4-5 h en el mismo fijador, crioprotegido, embebido para el seccionamiento congelado y cortado a ^{2 0}jm en un criostato (Hacker-Bright). El compuesto de ácido nucleico marcado con Cy3.5 se detecta en la médula espinal recién aislada con un microscopio Zeiss Stemi SV11 para determinar las distribuciones generales. Las médulas espinales se fijan luego en paraformaldehído al 4% y se crioseccionan. La tinción de LFB y otros procedimientos se realizan como se describe (Hasegawa et al., 2005). Para la inmunotinción, las secciones se bloquean con 10% de suero normal de cabra/0,3% de Triton X-100 en PBS durante 2 horas y se incuban durante la noche a 4°C con anticuerpos primarios. La tinción con proteína quinasa de conejo C-y (PKCy) (1:200) y ED1 de ratón (1:300) (Serotec, Raleigh, NC) se realizó en las mismas secciones después de la recuperación del antígeno con proteinasa K (Dako) durante 4 min a 25°C. Las secciones se lavan con PBS y se incuban con anticuerpo Alexa 488 secundario anti-conejo o Alexa 568 anti-raton a 1:400 durante 1 hora a temperatura ambiente. Después del lavado, las secciones se montan con Aqua-Mount (Lerner Lab). Las imágenes se capturan utilizando un microscopio de barrido láser confocal Zeiss 510 (LSM) o un sistema de barrido celular automatizado Zeiss para Axiovert 200 M en grupos de secciones que se tiñen al mismo tiempo. La tinción con serotonina de conejo 5-HT (1:1000) (ImmunoStar) se realiza utilizando el mismo procedimiento sin recuperación de antígeno y con Alexa 568 anti-conejo (1:200) como anticuerpo secundario.

Cuantificación para histología: la cuantificación de la tinción con LFB se utiliza para analizar la conservación del tejido. Todas las secciones coronales para el análisis se tiñen para LFB al mismo tiempo para asegurar un desarrollo de color uniforme y luego se escanean con un escáner de película LS-8000 ED (Nikon, Japón) a una resolución de 4000 ppp. Las imágenes en color se convierten a escala de grises y se delinearon secciones individuales en Photoshop, y se utiliza NIH Image J para obtener los píxeles de área total para cada sección. Se utiliza un umbral constante para obtener píxeles de umbral superior de la tinción de LFB y se miden las áreas resultantes. El tejido preservado se define como el área de umbral superior dividida por el área total que se describe en cada sección. Las imágenes de cada médula espinal se miden a intervalos de ¹mm sobre ¹⁰mm de la médula espinal centrada en el epicentro de la lesión. En casi todos los casos, la posición con un tejido escaso mínimo corresponde al epicentro de lesión designado y cuando no lo hace, se redefine como la ubicación 0. Los promedios de tejido sobrante se calculan y se representan en función de la ubicación. Para la tinción con ED1, se seleccionan 11 secciones coronales a intervalos de 1 mm de cada animal para la cuantificación. Las imágenes en mosaico que abarcan secciones coronales completas en cada ubicación se toman con una lente objetivo 20x (N.A. = 0,75) en un microscopio de fluorescencia Axiovert 200M (Zeiss) y se analizan con el software de histograma Zeiss LSM. Se aplica un umbral constante a todas las secciones y el área de umbral superior para cada una se divide por el área total resumida para obtener el porcentaje de ED1+. El CST está ubicado en la línea media sobre el canal central y la tinción de PKCy en esta región se describe y extrae para la cuantificación. Las áreas de umbral superior de cada región extraída de CST se obtienen después de excluir las áreas de autofluorescencia debido a los macrófagos y luego normalizar. Todos los análisis cuantitativos son realizados por investigadores en forma ciega a los grupos de tratamiento.

Los compuestos de ácido nucleico de las Tablas A, B y E se prueban en este modelo de SCI, en el que se encuentra que son efectivos en el tratamiento de SCI.

Sistemas modelo de lesión por isquemia- reperfusión después del trasplante de pulmón en ratas

La lesión por isquemia/reperfusión pulmonar se logra en un modelo animal de rata como se describe en Mizobuchi et al., The Journal of Heart and Lung Transplantation, Vol. 23 No. 7 (2004) y en Kazuhiro Yasufuku et al., Am. J. Respir. Cell Mol Biol, vol. 25, pp 26-34 (2001).

Específicamente, después de inducir la anestesia con isofluorano, se canaliza la tráquea con un catéter de teflón de calibre 14 y la rata se ventila mecánicamente con un ventilador para roedores usando 100% de oxígeno, a una velocidad de 70 respiraciones por minuto y 2 cm de H²O de presión positiva de final de respiración. La arteria pulmonar izquierda, las venas y los bronquios principales del tallo se ocluyen con una pinza de Castaneda. Durante la operación, el pulmón se mantiene húmedo con solución salina y se cubre la incisión para minimizar las pérdidas por evaporación. El período de isquemia es de 60 minutos de duración. Al final del período isquémico, se retira la pinza y se permite que el pulmón se ventile y se reperfunda durante 4 h, 24 h y 5 días después de la inducción de isquemia pulmonar. Al final del experimento, los pulmones se recolectan suavemente y se congelan para la extracción de ARN o se fijan en un cóctel de glutaraldehído para su posterior análisis histológico.

Los compuestos de ácido nucleico de las Tablas A, B y E se prueban en este modelo, en el que se encuentra que son efectivos en el tratamiento de la lesión por reperfusión de isquemia después del trasplante de pulmón.

Sistema modelo de trasplante de médula ósea (BMT)

Se puede usar el siguiente sistema modelo de BMT descrito en Kelly RM et al. Blood. 4 de febrero de 2010; 115 (5): 1088-1097:

Animales: se utilizan ratones hembra C57BL/6 (H-2b; denominados B⁶), [C^{5 7}BL/⁶*Balb/c]F¹(H-2d/b; denominado CB6F1), BALB/c (H-2d) o ratones C57BL/6.Ly5.1 y ratones Bim7', cruzados más de 10 generaciones en ambiente de B⁶. Un compuesto de ácido nucleico de prueba se administra por vía intraperitoneal en solución salina regulada con fosfato (PBS) 30 a 45 minutos antes de la radiación. La dosis/sincronización seleccionada de la administración del compuesto de ácido nucleico de prueba proporciona una inhibición óptima de la función de p53 con una toxicidad mínima.

BMT: las suspensiones de células individuales de células BM de donantes B6.Ly5.1 (congénicas) o BALB/c (alogénicas) se eliminan de las células T hasta una pureza superior al 98%. Se administran las células BM sin CD4/8 (10⁷[alogénicas] o 5*10® [congénicas]) por vía intravenosa a los receptores que han recibido una TBI de 9 Gy (c 57Bl/6) o ¹⁰Gy (CB⁶F¹) de una fuente de rayos X, 24 horas antes.

Análisis de linfocitos mediante clasificación de células activadas por fluorescencia: se preparan suspensiones de células individuales de timocitos, esplenocitos y LN por disociación suave, lavado, filtración, y se resuspenden en suero de ternera fetal/PBS al 2% y se incuban con anticuerpos monoclonales conjugado con fluorocromo durante 30 minutos a 4°C. Los anticuerpos utilizados se dirigen contra células T CD4, CD⁸, CD3 (receptor p), CD11c, B220, CD45.1, CD62L y CD44 (eBioscience). Los eventos vivos (> 105) se adquieren en un BD FACsCanto y se analizan con el software FlowJo (TreeStar).

Análisis de células epiteliales tímicas (TEC) mediante clasificación de células activadas por fluorescencia: las TEC se aíslan. Las células tímicas individuales se incuban a 37°C dos veces en colagenasa-D/DNasa-I y dos veces en colagenasa/dispasa/DNasa-I (Roche). Las digestiones combinadas se tiñen con anti-CD45-PerCp-Cy5.5, anti-EpCAM-PE, anti-Ly51/CDR1-biotina más PE/Cy7 conjugada con estreptavidina, anti-MHC-II-Pacific Blue (eBioscience) y Ulex-europaeus-aglutinin-1 conjugada con FITC (UEA-1; Vector Laboratories). El mAb de rata específico de AlRE de ratón (5H12) se detecta con anti IgG2c-Cy5 de rata de ratón. Se adquire un total de 3*10® eventos vivos por muestra.

Detección de emigrantes tímicos recientes: los ratones anestesiados se inyectan en un lóbulo tímico con 50 |jg de sulfo-NHS-biotina (Pierce) en 10 jL de PBS. Después de 24 horas, el timo y el bazo se tiñen con PE/Cy7, CD4, CD⁸, CD3, CD45.1, CD44 y CD62L conjugados con estreptavidina y se analizaron mediante citometría de flujo.

Microscopía de inmunofluorescencia: los tejidos se incorporan en OCT y se congelan en forma instantanea en nitrógeno líquido. Se bloquean las secciones tímicas de ⁸jm fijadas con acetona con un 10% de suero de caballo normal/PBS y se tiñen con Ly51/CDR1-FITC y CK5 policlonal antiratón de conejo (Covance Research Products) más anti inmunoglobulina G de conejo de cabra conjugada con Cy5 (IgG; Invitrogen). Para análisis de LN/bazo, se fijan con acetona criosecciones de ⁶jm y se tiñen para glicoproteína-38 (gp38; clon 8.1.1 purificado; ATCC) o CCL21 (R&D Systems) junto con B220-FITC (clon RA3-6B2; BD) Durante 3 horas a temperatura ambiente. Las señales de CCL21 y gp38 se amplifican con el kit de amplificación de señal Tiramida de acuerdo con las instrucciones del fabricante (invitrogen). Las láminas se montan con VECTASHIELD (Vector Laboratories) y las imágenes se adquieren a través de una lente de aceite UPlanApo Olympus de 10X/0.40 o UplanApo Olympus de 40X/0.80 y una cámara Olympus FV500, compilada con el software Fluoview (v.4.3), luego analizadas y recortadas en Adobe Photoshop CS2.

Infección por Lm y determinación de CFU en órganos: se utilizan cepas Lm recombinantes Lm-OVA y AactA-Lm-OVA (atenuadas) que expresan ovoalbúmina (OVA) de pollo de longitud completa. Los ratones se inoculan con bacterias en fase logarítmica temprana cultivadas en caldo de infusión de cerebro y corazón (BHI) a 37°C. Los receptores de trasplantes de BM congénicos se infectaron con 10® unidades formadoras de colonias (CFU) de AactA-Lm-OVA y se expxonen nuevamente con 10⁵CFU de Lm-OVA. Para estudios de BMT alogénicos, los ratones se inmunizan por vía intravenosa con 5*10⁴CFU y se exponen nuevamente con 2*10® CFU de Lm2C. Tres días después de la infección secundaria, se homogeneizan hígados/bazos en Triton X-100/PBS al 0,05%, se colocan en placas de BHI y las colonias de Lm se enumeran después de 24 horas a 37°C.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una molécula de ácido nucleico de doble cadena que comprende una cadena sentido y una cadena antisentido, teniendo la molécula la estructura:

en la que la secuencia de la cadena sentido es complementaria a la secuencia de la cadena antisentido; con la condición de que cada nucleótido no sea un desoxirribonucleótido; o

una sal farmacéuticamente aceptable de dicha molécula.

2. La molécula de la reivindicación 1, o una sal farmacéuticamente aceptable de dicha molécula, en la que el ribonucleótido modificado comprende una modificación en la posición 2' del resto de azúcar, en particular en la que el ribonucleótido modificado es un ribonucleótido modificado con azúcar 2'-O-metilo.

3. La molécula de la reivindicación 1 o 2, o una sal farmacéuticamente aceptable de dicha molécula, en la que están presentes uno o ambos de Z y Z'.

4. La molécula de la reivindicación 3, o una sal farmacéuticamente aceptable de dicha molécula, en la que cada uno de Z y Z' es un resto no nucleotídico consecutivo 1-2.

5. La molécula de la reivindicación 4, o una sal farmacéuticamente aceptable de dicha molécula, en la que cada resto no nucleotídico es un 1,3-propanodiol, mono(dihidrógeno fosfato) (C3), que puede estar fosforilado o no fosforilado, en particular, en la que Z es un resto no nucleotídico C3 (C3), que puede estar fosforilado o no fosforilado; y en la que Z' es dos restos no nucleotídicos C3 consecutivos (C3-C3), que pueden estar fosforilados o no fosforilados.

6. La molécula de la reivindicación 1, que tiene una cadena sentido y una cadena antisentido:

5' cap-GGGCCUGACUCAGACUGAU-C3-pi 3' (cadena sentido; SEQ ID NO: 19)

5' AUCAGUcy GAGUCAGGCCC-C3-C3 3' (cadena antisentido; SEQ ID NO: 32)

en las que cada uno de A, U, G y C es un ribonucleótido no modificado;

en las que la cadena sentido comprende un protector z” 5' unido covalentemente al terminal 5' de la cadena;

en las que el terminal 3' de la cadena sentido está fosforilada (pi); o

una sal farmacéuticamente aceptable de dicha molécula.

7. La molécula de la reivindicación 6, en la que el protector 5' unido covalentemente al terminal 5' de la cadena sentido es 1,3-propanodiol, mono(dihidrogenofosfato) (C3); y

en las que en la cadena antisentido el ribonucleótido en el terminal 5' está fosforilado (fos) y la saliente en el terminal 3' está fosforilada (-C3-C3-pi); o

una sal farmacéuticamente aceptable de dicha molécula.

8. La molécula de la reivindicación 6, o una sal farmacéuticamente aceptable de dicha molécula, en la que en la cadena antisentido la saliente no nucleotídica C3-C3 unida covalentemente al terminal 3' de la cadena está fosforilada (-C3-C3-pi).

9. La molécula de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, 8, o una sal farmacéuticamente aceptable de dicha molécula, en la que el protector z” 5' está presente y se selecciona del grupo que consiste en un resto de ribosa abásico, un resto de desoxirribosa abásico , un resto de desoxirribosa invertido, un resto desoxiabásico invertido (idAb), un resto amino-C6 (AM-c6), C6-amino-pi, un resto no nucleotídico, en particular 1,3-propanodiol, mono(dihidrógeno fosfato) ( C3), un nucleótido especular, un fosfodiéster 5,6,7,8-tetrahidro-2-naftaleno butírico (THNB), y un resto conjugado, tal como un resto de vitamina o un resto de fármaco.

10. Una composición que comprende la molécula de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9 o una sal farmacéuticamente aceptable de dicha molécula; y un portador farmacéuticamente aceptable.

11. La molécula de cualquiera de las reivindicaciones 1-9, o una sal farmacéuticamente aceptable de dicha molécula, o la composición de la reivindicación 10 para uso en un método para tratar a un sujeto que padece una enfermedad o trastorno asociado con la expresión de p53, comprendiendo el método administrar al sujeto dicha molécula o composición en una cantidad suficiente para subregular la expresión de p53.

12. La molécula, o sal farmacéuticamente aceptable de dicha molécula, o composición para el uso de la reivindicación 11 , en la que la enfermedad o trastorno se selecciona del grupo que consiste en lesión por isquemia-reperfusión, una deficiencia auditiva, un trastorno de la audición, una alteración del equilibrio, una pérdida de audición, alopecia inducida por quimioterapia, alopecia inducida por radioterapia, insuficiencia renal aguda, lesión renal aguda, enfermedad renal crónica (CKD), un efecto secundario asociado con la terapia anticancerosa, función retardada del injerto (DGF) en un paciente de trasplante de riñón, una lesión de la médula espinal, una lesión cerebral, una convulsión, un derrame cerebral, un trastorno neurodegenerativo, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer, un tumor, una quemadura, una herida, hipertermia, hipoxia, isquemia, trasplante de órganos, trasplante de médula ósea (BMT), infarto de miocardio/ataque cardiaco, cardiotoxicidad, cáncer positivo para p53 e insuficiencia hepática aguda

13. La molécula de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, o una sal farmacéuticamente aceptable de dicha molécula, o una composición que comprende dicha molécula, o una composición que comprende la sal farmacéuticamente aceptable de dicha molécula, para usar en el tratamiento de un cáncer positivo para p53 en un sujeto, en el que la molécula, o la sal farmacéuticamente aceptable de dicha molécula, o la composición que comprende dicha molécula, o la composición que comprende la sal farmacéuticamente aceptable de dicha molécula, se administra en una cantidad para subregular la expresión de un gen p53 y de ese modo sensibilizar el cáncer positivo para p53 a la quimioterapia en el sujeto.

14. La molécula de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, o una sal farmacéuticamente aceptable de dicha molécula, o una composición que comprende dicha molécula, o una composición que comprende la sal farmacéuticamente aceptable de dicha molécula, para uso en la expansión del progenitor hematopoyético o en la estimulación de hematopoyesis.

15. La molécula de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, o una sal farmacéuticamente aceptable de dicha molécula, o una composición que comprende dicha molécula, o una composición que comprende la sal farmacéuticamente aceptable de dicha molécula, para uso en el alojamiento de células madre hematopoyéticas (HSC) sin p53.