ES2784866T3 - Composición agrícola y hortícola y procedimiento para cultivar plantas - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para acelerar la maduración después de la recolección de un fruto, que comprende la rociada de una disolución que comprende 0.5 a 75 mM de isoleucina sobre un fruto recolectado.
Description
DESCRIPCIÓN
Composición agrícola y hortícola y procedimiento para cultivar plantas
Campo técnico
La presente invención se refiere a un procedimiento para acelerar la maduración después de la recolección de un fruto.
Antecedentes de la técnica
Con el fin de mejorar el crecimiento de cultivos y la calidad de frutas o frutos secos, se utilizan fertilizantes químicos, fitohormonas y similares. Sin embargo, todavía adolecen de problemas no resueltos referidos a su influencia sobre el medio ambiente y el coste. Se espera que los aminoácidos sean ingredientes medioambientalmente respetuosos y económicos de composiciones para la aplicación agrícola u hortícola. Por ejemplo, se conoce un agente estimulante de la formación de yemas florales que utiliza prolina como principio activo (documento de patente n° 1), un agente vegetal que proporciona resistencia al estrés de temperatura elevada que contiene un aminoácido de cadena ramificada, tal como valina o leucina (documento de patente n° 2), un fertilizante líquido estimulador del crecimiento vegetal que contiene 18 tipos de aminoácido (documento de patente n° 3), un agente de efecto alelopático vegetal y/o potenciador de la producción de fitoalexina que contiene un subproducto de fermentación de aminoácidos o un subproducto de fermentación de ácidos nucleicos (documento de patente n° 4), etc. Se ha informado de que la hidroponía de tabaco en una disolución acuosa que contiene ácido glutámico, ácido aspártico y fenilalanina incrementa el contenido de aminoácidos, clorofilas y carotenoides en las hojas (documento no de patente n° 1).
El fertilizante líquido estimulador del crecimiento vegetal anteriormente mencionado (documento de patente n° 3) contiene 0,05% de isoleucina y la concentración del mismo en un líquido que debe pulverizarse es de 0.019 a 0,076 mM. Además, el documento de patente n° 4 describe que un tratamiento de semillas de arroz con isoleucina 0.2 a 20 mM estimuló la producción de las momilactonas A y B.
Es conocido que el ácido jasmónico, que es un tipo de fitohormona, presenta acciones fisiológicas, incluyendo aquellas para la topogénesis (formación de flor, formación de tubérculo) y acciones de activación de la transcripción de genes que responden a tensiones tales como los daños por insectos y enfermedades (“New Science of Phytohormones”). Asimismo se ha informado de que un tratamiento de los frutos o bayas, tales como las de los tomates y las fresas, con jasmonato de metilo, estimula la aparición del fruto o la coloración (documentos no de patente n° 2 y n° 3).
Es conocido que, en la transducción de señales del ácido jasmónico, (+)-7-iso-JA-Ile consistente en ácido jasmónico e isoleucina unidos entre sí, constituye el tipo activo (documentos no de patente n° 4 a n° 6).
Respecto a la relación con la isoleucina y el ácido jasmónico, se ha informado de que la infección por Phelipanche aegyptiaca, que es un parásito vegetal, en Arabidopsis thaliana cultivada sobre un medio de agar resultó suprimida por el tratamiento de la planta con una mezcla de isoleucina y jasmonato de metilo, mientras que un tratamiento con isoleucina sola resultó ineficaz (documento no de patente n° 7). Se ha demostrado además que el tratamiento de plántulas de alubias de Lima de inmersión en una disolución de un complejo de leucina o isoleucina y ácido 1-oxoindán-4-carboxílico o ácido 1-hidroxiindán-4-carboxílico induce la síntesis de sustancias volátiles implicadas en la resistencia a insectos, y un complejo de un aminoácido y ácido jasmónico es un producto intermedio de la ruta de transducción de señales de octadecanoides (documento no de patente n° 8).
Se ha informado además de que, mediante el tratamiento de las hojas de cebada mediante inmersión en una disolución de inducción de estrés de presión osmótica (D-sorbitol, D-manitol, polietilenglicol-6000 y cloruro sódico) se incrementa el ácido jasmónico y el complejo de ácido jasmónico y un aminoácido (documento no de patente n° 9).
Asimismo existe un informe referente a las influencias de los aminoácidos de cadena ramificada y similares sobre el crecimiento y estado nutricional del tomate, así como el crecimiento, supervivencia y proliferación de Bemisia tabaci (documento no de patente n° 10). La concentración de isoleucina utilizada para el tratamiento descrito en dicho informe es de 0.012 a 0.035 mM.
Se ha informado además de que fertilizantes mixtos que contienen diversos aminoácidos, ingredientes traza y fitohormonas incrementan la proporción de frutos y el rendimiento de cultivo de frutos de las plantas (documento de patente n° 5). La concentración de isoleucina utilizada para el tratamiento descrito en dicho informe es de 1.1 a 4.3 nM.
Se ha informado además de que los fertilizantes de pulverización foliar que contienen diversos aminoácidos, ingredientes traza, xantina, etc. presentan un efecto de incremento de los frutos de plantas, un efecto de incremento del contenido de sacáridos y similares (documento de patente n° 6), y de que los fertilizantes de pulverización foliar que contienen ingredientes traza y diversos aminoácidos incrementan el rendimiento de cultivo de la col china
(documento de patente n° 7). Se ha informado además de que el ácido glutámico incrementa las antocianinas de la manzana (documento no de patente n° 11) y de que la fenilalanina incrementa las antocianinas de la uva (documento no de patente n° 12). Se ha informado además de que la metionina estimula la coloración de los frutos (documento de patente n° 8).
Tal como se ha mencionado anteriormente, se ha informado de varios resultados referentes a efectos de la isoleucina y otros aminoácidos sobre plantas, aunque no se conoce que la aplicación de una disolución de alta concentración de isoleucina mediante rociado estimule la floración y la aparición de frutos en plantas, la coloración de frutos recolectados, y similares.
Además, se ha informado de que, al examinar las influencias de la sustitución de cada uno de los 20 tipos de aminoácido de 20% del nitrógeno de nitrato en una disolución de nutrientes sobre el crecimiento de acelgas chinas en hidroponía, la isoleucina incrementó el contenido de nitrógeno y fósforo de las partes terrestres (brotes) de la planta, aunque no resultó eficaz sobre el crecimiento (peso de masa radicular) (documento no de patente n° 13).
Referencias de la técnica anterior
Documentos de patente
Documento de patente n° 1 patente japonesa abierta al público (Kokai) n° 2003-48803.
Documento de patente n° 2 patente japonesa abierta al público (Kokai) n° 2012-197249.
Documento de patente n° 3 patente surcoreana abierta al público n° 2013-107406.
Documento de patente n° 4 patente japonesa abierta al público (Kokai) n° 2012-10694.
Documento de patente n° 5 patente china abierta al público n° 102627498.
Documento de patente n° 6 patente china abierta al público n° 102285823.
Documento de patente n° 7 patente china n° 101891520.
Documento de patente n° 8 patente japonesa abierta al público (Kokai) n° 2007-259714.
Documentos no de patente
Documento no de patente n° 1: Wu, X-P et al., Scientia Agricultura Sinica, 2004, 37(3):357-361 Documento no de patente n° 2: Liu, L., Journal of Experimental Botany, 2012, 63(16):5751-5761 Documento no de patente n° 3: Concha, C.M. et al., Plant Physiology and Biochemistry, 2013, 70:433-444 Documento no de patente n° 4: Fonseca, S. et al., Plant Biology, 2009, 12:539-547
Documento no de patente n° 5: Fonseca, S. et al., Nature Chemical Biogogy, 2009, 5:344:350 Documento no de patente n° 6: Wasternack, C., Annals of Botany, 2013, 111:1021-1058
Documento no de patente n° 7: Nun, N.B. et al., Phytoparasitica, 2009, 37 (5) : 485-488
Documento no de patente n° 8: Krumm, T et al., FEBS Letters, 1995, 377 (3) : 523-529
Documento no de patente n° 9: Kramell, R. et al., Journal of Plant Growth Regulation, 1995, 14(1):29-36 Documento no de patente n° 10: Pang, S-T. et al., Chinese Journal of Eco-Agriculture, Apr. 2013, 21(4):465-473 Documento no de patente n° 11: Wang, L.J., Journal of Fruit Science, 2006, 23(2):157-160
Documento no de patente n° 12: Qu, J.G. et al., Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao, 2006, 22(2):299-305 Documento no de patente n° 13: Wang, H-J. et al., Pedosphere, 2007, 17(5):595-600
El documento de Ana G. Pérez et al: “Biosynthesis of Strawberry Aroma Compounds through Amino Acid Metabolism”, JOURNAL OF AGRICULTURAL AND FOOD CHEMISTRY, vol. 50, n° 14, (1-7-2002), páginas 4037 4042, XP055394334, DOI:10.1021/jf011465r divulga la maduración in vitro de fresas que comprenden pedúnculos de inmersión en una disolución que contiene 0.1 M de L-isoleucina.
El documento n° JP S4991829 A da a conocer un procedimiento para mejorar el dulzor de los frutos cítricos, que comprende la pulverización de hojas o frutos con disolución que contiene 0.2% (15.2 mM) de isoleucina.
Wilchem: “Flower'n'Fruit Maker Brochure” (2013-05-15), páginas 1 a 4, XP055394344, http://www.wilchem.com.au/uploads/Brochures/Flower N Fruit Maker Brochure.pdf da a conocer un fertilizante de aminoácidos que contiene 0.9% de isoleucina que se aplica en las hojas en árboles frutales a una tasa de 3 a 5 l de fertilizante diluido en 400 a 1000 l de agua por ha (tasa de aplicación de isoleucina: 0.2 a 0.7 mM). Se da a conocer además que la isoleucina mejora la calidad del fruto e incrementa la producción.
El documento n° KR 2013 009524 A (I GIL ROK [KR]) da a conocer una composición antimarchitamiento que contiene 0.69% de isoleucina que se pulveriza sobre plantas diluido 100 a 1000 veces en agua (isoleucina 0.005 a 0.053 mM). Se da a conocer además que la isoleucina acelera la coloración de los frutos.
El documento US 2013/303377 A1 (QUAGHEBEUR KOEN [BE]) da a conocer un procedimiento para influir sobre los procesos vitales de plantas mediante la utilización de una composición que contiene L-aminoácidos individuales seleccionados de entre glutamina, asparagina, histidina y combinaciones de los mismos con glutamina, asparagina, histidina, arginina, ácido glutámico, ácido aspártico, en la que dichas influencias se refieren a, entre
otros, el incremento del número de frutos, la potenciación de la coloración de los frutos y el incremento del rendimiento de frutos coloreados en una primera recolección.
Divulgación de la invención
Objetivo que debe conseguir la invención
Un objetivo de la presente invención es proporcionar un procedimiento para acelerar la maduración de frutos recolectados.
Medios para conseguir el objetivo
Los inventores de la presente invención han llevado a cabo diversas investigaciones con el fin de conseguir el objetivo anteriormente indicado, como resultado, basándose en los hechos obtenidos hasta ahora de que, por ejemplo, la pulverización de una disolución de isoleucina sobre una planta fomenta la floración y la apariencia del fruto, así como la coloración de los frutos de la planta, de que la pulverización de una disolución de isoleucina sobre los frutos fomenta la coloración de los frutos, y de que la pulverización de una disolución de isoleucina eventualmente permite la producción de cultivos vegetales de alta calidad con un rendimiento mejorado del cultivo en un corto periodo de tiempo.
De esta manera, la presente invención proporciona lo siguiente.
[1] Un procedimiento para acelerar la maduración después de la recolección del fruto, que comprende pulverizar una disolución que comprende 0.5 a 75 mM de isoleucina sobre un fruto recolectado.
[2] El procedimiento según [1], en el que la isoleucina es L-isoleucina.
[3] El procedimiento según [1] o [2], en el que la disolución que comprende isoleucina es una disolución que comprende isoleucina purificada, un líquido de fermentación o un subproducto de fermentación de isoleucina, o un producto de fraccionamiento de ellos que comprende isoleucina.
[4] El procedimiento según cualquiera de [1] a [3], en el que el fruto es un fruto de una planta perteneciente a la familia Solanaceae, Vitaceae o Rosaceae.
[5] El procedimiento según cualquiera de [1] a [4], en el que el fruto es tomate, uva o manzana.
Breve descripción de los dibujos
Las figuras 1 a 10, 12 a 14 y 16 a 19 representan unos procedimientos adicionales fuera del alcance de la presente invención (ver ejemplos).
La figura 1 incluye fotografías que representan la floración y apariencia de los frutos en plantas tomateras pulverizadas con isoleucina (fotografías que muestran morfologías de las plantas). Las flechan señalan los frutos.
La figura 2 representa el cambio en el número de frutos coloreados de tomate 'cherry' (Micro-Tom). El eje vertical indica el número de frutos coloreados por planta.
La figura 3 representa el cambio en el número de tomates cherry aparecidos (Micro-Tom). El eje vertical indica el número medio de frutos por planta.
La figura 4 es un diagrama que representa el número de días requerido para la primera aparición de frutos en plantas de tomate (Momotaro) pulverizadas con diversos compuestos.
La figura 5 representa la coloración de tomate (Momotaro) pulverizado con diversos compuestos. La figura 5a representa el número de frutos coloreados, en la que el eje vertical indica el número de frutos coloreados por cada cuatro masas radiculares, y la figura 5b incluye fotografías de frutos producidos a partir de floración del mismo día (aparición de los frutos).
La figura 6 representa el número de frutos recolectados de plantas del tomate (Momotaro) pulverizadas con diversos compuestos. El eje vertical indica el número de frutos por cada cuatro masas radiculares.
La figura 7 representa el cambio en el número de frutos coloreados de plantas de tomate cherry (Suncherry Pure) pulverizadas con isoleucina o prolina. El eje vertical indica el número de frutos coloreados por planta.
La figura 8 representa el cambio en el número de plantas de tomate cherry aparecidas (Suncherry Pure) que han sido pulverizadas con isoleucina o prolina. El eje vertical indica el número de frutos por planta.
La figura 9 representa una comparación de las capacidades antioxidantes de plantas de tomate cherry (Suncherry Pure) pulverizadas con isoleucina o prolina. El eje horizontal indica la cantidad de antioxidante con una capacidad de eliminar radicales libres equivalente a la de catequina en 100 g de muestra (peso fresco).
La figura 10 incluye fotografías que representan un daño por insolación de plantas de tomate cherry (Suncherry Pure) pulverizadas con prolina (morfologías de plantas).
La figura 11 incluye fotografías (aparición de frutos) que representan una coloración de frutos de tomate (Suncherry Pure) pulverizados con isoleucina y un gráfico que muestra resultados del análisis de carotenoides de los mismos. El eje vertical del gráfico indica el contenido relativo de carotenoides.
La figura 12 incluye gráficos que representan la expresión de los genes LOX y JAR1 que participan en la síntesis del ácido jasmónico observada en tomates cherry (Suncherry Pure) pulverizados con isoleucina. El eje vertical indica la cantidad de expresión relativa.
La figura 13 incluye gráficos que representan la expresión de los genes de respuesta de ácido jasmónico PI y MYC2 observados en tomates cherry (Suncherry Pure) pulverizados con isoleucina. Los ejes verticales indican la cantidad de expresión relativa.
La figura 14 representa la expresión de genes que participan en la biosíntesis de carotenoides observada en tomates cherry (Suncherry Pure) pulverizados con isoleucina. Los ejes verticales indican la cantidad de expresión relativa.
La figura 15 incluye gráficos que representan la expresión de los genes LOX, JAR1, PI y MYC2 observados en tomates cherry (Suncherry Pure) pulverizados con isoleucina a diversas concentraciones. Los ejes verticales indican la cantidad de expresión relativa.
La figura 16 incluye gráficos que representan la expresión de los genes LOX, JAR1, PI y MYC2 observados en tomate cherry (Caddy) pulverizados con isoleucina a diversas concentraciones. Los ejes verticales indican la cantidad de expresión relativa.
La figura 17 incluye gráficos que representan la expresión de los genes LOX y Psy observados en pimiento (Anaheim) pulverizados con isoleucina. Los ejes verticales indican la cantidad de expresión relativa.
La figura 18 representa el número de racimos recolectados de frutos coloreados de tomate de tamaño intermedio (Tsukutshuku-shi) pulverizados con isoleucina.
La figura 19 representa la expresión del gen LOX observado en pimiento (pimiento morrón, Frupyred EX) pulverizado con líquido de producción secundaria de fermentación de isoleucina. El eje vertical indica la cantidad de expresión relativa.
La figura 20 representa el contenido de antocianina de callos de uva tratados con isoleucina. El eje vertical indica la cantidad de antocianina (pmoles/g de peso seco de callos).
La figura 21 representa el contenido de antocianina de frutos de uva pulverizados con isoleucina.
La figura 22 representa el contenido de antocianina de frutos de manzana pulverizados con isoleucina.
Formas de realización para poner en práctica la invención
A continuación en la presente memoria se explica la presente invención en detalle.
La composición utilizada en el procedimiento de la presente invención contiene isoleucina a modo de un principio activo. La isoleucina es preferentemente L-isoleucina. Los aminoácidos a los que se hace referencia a continuación en la presente descripción son L-aminoácidos, a menos que se indique lo contrario. La isoleucina puede ser isoleucina purificada o isoleucina de purificación gruesa, o la isoleucina puede ser un subproducto de cultivo (líquido de fermentación) o fermentación que contiene isoleucina, o un producto de fraccionamiento que contiene isoleucina de cualquiera de ellos.
La composición utilizada en el procedimiento de la presente invención puede contener un ingrediente arbitrario además de isoleucina, con la condición de que el efecto de la presente invención no se degrade. Entre los ejemplos de dicho ingrediente se incluyen portador, ajustador del pH, componente fertilizante para potenciar el efecto fertilizante, tal como minerales, ingrediente agroquímico, ligante, relleno y similares. A modo de estos ingredientes,
pueden utilizarse ingredientes utilizados habitualmente para productos químicos agrícolas, fertilizantes y similares, con la condición de que no se degrade el efecto de la presente invención.
La composición puede contener además un aminoácido diferente de la isoleucina.
La forma de administración de la composición no se encuentra particularmente limitada, con la condición de que pueda prepararse una disolución que pueda pulverizarse a partir de ella en el momento de la utilización, y pueda proporcionarse en forma de cualquiera de disolución, polvos, gránulos, emulsión y similares.
La composición utilizada en el procedimiento de la presente invención se pulveriza sobre un fruto recolectado tal como se indica a continuación. Puede añadirse un agente dispersante con el fin de potenciar la potencia dispersiva de la composición sobre una superficie o fruto, y puede añadirse dicho ingrediente a modo de tensioactivo con el fin de potenciar la permeabilidad de la isoleucina en la planta. Entre los ejemplos del agente dispersivo se incluyen, por ejemplo, Applauch BI TM (Kao), Mix Power TM (Syngenta Japan), Squash TM (MARUWA Biochemical) y similares. Como tensioactivo, puede utilizarse cualquiera de los tensioactivos no iónicos, tensioactivos aniónicos, tensioactivos catiónicos y tensioactivos anfolíticos. Entre los ejemplos se incluyen alquil éteres de polioxietileno, alquil aril éteres de polioxietileno, ésteres de polioxietileno de ácido graso, ésteres de sorbitano de ácido graso, ésteres de polioxietilén sorbitano de ácido graso, polímeros de oxietileno, polímeros de oxipropileno, ésteres de polioxietilén ácido alquilfosfórico, sales de ácido graso, sales de éster de ácido alquilsulfúrico, sales de ácido alquilsulfónico, sales de ácido alquilarilsulfónico, sales de ácido alquilfosfórico, sales de éster de ácido alquilfosfórico, ésteres de polioxietilén ácido alquilsulfúrico, sales de amonio cuaternario, oxialquilaminas, lecitina, saponina, y similares. Además, puede utilizarse como un agente auxiliar según se requiera, gelatina, caseína, almidón, agar, alcohol polivinílico, alginato sódico, y similares.
En el momento de utilización de la composición, la composición en forma de sólido o polvos puede disolverse o dispersarse en un disolvente, tal como agua y alcohol. La composición en forma de líquido puede diluirse con un disolvente, tal como agua y alcohol en el momento de utilización de la misma. Entre los ejemplos del alcohol se incluyen etanol, metanol, alcohol isopropílico, y similares. La solubilidad de la isoleucina en agua es de aproximadamente 0.3 M (40.2 g/l (20°C), 41.2 g/l (50°C)).
La concentración de isoleucina en el momento de la aplicación de la composición según el procedimiento de la presente invención es de 0.5 a 75 mM, preferentemente de 0.5 a 50.0 mM, más preferentemente de 1.0 a 20.0 mM, más preferentemente de 5.0 a 10.0 mM. Aunque el contenido de isoleucina de la composición no se encuentra particularmente limitado, es de 1% en peso o superior, preferentemente de 50% o superior, más preferentemente de 70% o superior, en términos de peso seco y resulta preferente un contenido de isoleucina dentro del intervalo ejemplificado anteriormente, en vista a evitar daños por impurezas, tales como los daños por sales, y la actualización del efecto de la isoleucina.
La composición utilizada en el procedimiento de la presente invención presenta la acción de acelerar la maduración después de la recolección del fruto. Puede presentar además por lo menos una acción de estimulación de la floración, una acción de estimulación de la aparición del fruto, una acción de mejora del número de frutos producidos, una acción de estimulación de la coloración del fruto, una acción de mejora del contenido de aminoácidos esenciales y/o de ácido Y-aminobutírico, una acción de estimulación de la síntesis de carotenoides y una acción de mejora de la capacidad antioxidante. Por lo tanto, se da a conocer que la composición puede utilizarse además para por lo menos cualquiera de estimulación de la floración, estimulación de la aparición del fruto, mejora del número de frutos aparecidos, estimulación de la coloración (el cambio de color, la aparición de color) de los frutos, mejora del contenido de aminoácidos esenciales y/o de ácido Y-aminobutírico, estimulación de la síntesis de carotenoides y mejora de la capacidad antioxidante, y puede, en consecuencia, mejorar el rendimiento de cultivo de una planta y/o la calidad de los cultivos en un periodo de tiempo corto.
El objetivo de la aplicación de la composición utilizada en el procedimiento de la presente invención es un fruto después de la recolección, que es un fruto tal como tomate (incluyendo el tomate cherry), ocra, berenjena, pimiento, pepino, melón, pepino amargo, calabaza japonesa, melón oriental, chayote, sandía, fresa, soja, judía adzuki, haba, guisante, cacahuete, caupí, altramuz, trébol, alfalfa, y similares.
Las variedades del fruto no se encuentran particularmente limitadas y entre los ejemplos del tomate (incluyendo el tomate cherry) se incluyen, por ejemplo, Momotaro, Roma, Ouju, First Tomato, Akairomarutama, Yellow Carol, Paruche, Mini Carol, Micro-Tom, Suncherry Pure, etc.
Entre los ejemplos de pimiento se incluyen Anaheim, pimiento morrón, pimiento verde, guindilla (Takano tsume), pimiento verde Manganji, pimentón, habanero, jolokir, jalapeño, etc.
Entre los ejemplos de manzana se incluyen Tsugaru, Fuji, Golden Delicious, Kougyku, Kokko, Mutsu, Ohrin, Johnna Gold, etc.
Los frutos preferidos utilizados en el procedimiento de la presente invención son frutos de plantas pertenecientes a la familia Solanaceae, Vitaceae o Rosaceae, y resultan especialmente preferidos el tomate, el pimiento, la uva y la manzana.
La composición utilizada en el procedimiento de la presente invención se pulveriza sobre el fruto recolectado. Mediante la pulverización de la composición sobre el fruto, puede fomentarse la maduración después de la recolección del mismo. La estimulación de la maduración después de la recolección incluye el fomento de la coloración, el incremento del contenido de licopeno, el incremento del contenido de azúcares y el incremento del contenido de aminoácidos, tal como el contenido de ácido glutámico.
La composición utilizada en el procedimiento de la presente invención se aplica en el fruto recolectado y su cantidad habitualmente es de 0.002 a 0.3 g/g (fruto), preferentemente de 0.002 a 0.2 g/g (fruto), más preferentemente de 0.004 a 0.08 g/g (fruto), todavía más preferentemente 0.02 a 0.04 g/g (fruto), en términos de cantidad de isoleucina.
Ejemplos
A continuación en la presente memoria, la presente invención se explica con mayor detalle haciendo referencia a los ejemplos.
Ejemplo 1 (únicamente de referencia): efecto de la isoleucina sobre el tomate cherry (Micro-Tom).
Se sembraron tres semillas de tomate cherry (Micro-Tom) en compost contenido en una maceta (diámetro superior de 10.5 cm x altura de 8.8 cm) y se cultivaron en un Biotrón a una temperatura de 23°C bajo un periodo de luz de 14 horas (6:00 a 20:00) y un periodo de oscuridad de 10 horas (20:00 a 6:00). Como compost, se utilizó una mezcla de Kumiai Nippi Engei Baido n° 1 (Nihon Hiryo) y vermiculita en una proporción de 3:1 (proporción en volumen).
Después de 3 semanas, se dejó una masa radicular y las otras se redujeron. Entre un mes después de la siembra y la recolección, se aplicó adicionalmente una disolución diluida 300 veces de fertilizante líquido Hyponex (N:P:K=6:10:5, Hyponex Japan) como fertilizante del suelo, mediante irrigación a una frecuencia de una vez a la semana en un volumen de 100 ml por cada masa radicular (maceta).
Después de crecer uniformemente las plantas de cinco masas radiculares y empezar a aparecer las yemas florales, se pulverizó agua (Con) o disolución acuosa de L-isoleucina 10 mM sobre las plantas completas una vez a la semana. El volumen pulverizado fue de 5 ml por cada masa radicular.
A continuación, se investigó, para cada masa radicular, la floración, la aparición de fruto, la coloración (cambio de color) del fruto y el número de frutos aparecidos.
i) Floración y aparición de fruto
Los estados de floración y aparición de fruto en las plantas se muestran en la figura 1. La floración y la aparición de fruto de las plantas de tomate pulverizadas con Ile se produjo antes y el número de flores y frutos en la misma asimismo fue superior en comparación con las plantas de Con.
ii) Coloración de los frutos
La investigación del número de frutos que cambiaban de color a naranja o rojo se llevó a cabo cada cinco días después de la aparición de frutos en las plantas de tomate y se muestran los resultados en la figura 2. La coloración de los frutos de las plantas de tomate pulverizadas con Ile se inició antes y el número de frutos en el mismo punto temporal era más elevado que en los observados para Con. Estos resultados demuestran que la pulverización de Ile presenta un efecto de estimulación de la coloración de los frutos de tomate y pudo fomentarse el crecimiento de las plantas de tomate.
iii) Número de frutos producidos
Los resultados de la investigación del cambio con el tiempo del número de frutos aparecidos en plantas de tomate se muestran en la figura 3. El día 82° después de la siembra, se recolectaron los frutos de tomate. El número de frutos recolectados de las plantas de tomate pulverizadas con Ile fue superior en 20% al de “Con”. Se considera que este resultado se debe al incremento de la proporción entre el número de flores y el número de frutos inducido por la pulverización con Ile; asimismo mejoró el rendimiento de cultivo del tomate.
Ejemplo 2 (únicamente de referencia): efecto de la isoleucina sobre el tomate (Momotaro).
Se sembraron tres semillas de tomate (Momotaro Fight) en compost contenido en una maceta y se cultivaron de la misma manera que en el ejemplo 1, con la condición de que el cultivo se lleve a cabo en un invernadero
(temperatura diurna de 25°C (6:00 a 20:00) y temperatura nocturna de 15°C (20:00 a 6:00)). El compost y la aplicación de fertilizante fueron los mismos o se llevaron a cabo de la misma manera que en el ejemplo 1.
Después de 3 semanas, quedaba una masa radicular y las demás se redujeron. Al aparecer un racimo de flores del primer nivel, se fijó un soporte y tras aparecer un racimo del segundo nivel, se llevó a cabo el pinzado (pinzado de la yema terminal).
Tras crecer uniformemente las plantas de cuatro masas radiculares y empezar a aparecer yemas florales, se pulverizaron las plantas completas cada dos semanas con agua (Con.), disolución acuosa de L-isoleucina 10 mM (Ile), disolución acuosa de glutamato monosódico 10 mM (GluNa), disolución acuosa de urea 5 mM (Urea) o disolución acuosa de fenilalanina (Phe). Se ajustó el volumen pulverizado según el crecimiento de las plantas, siendo de 15 a 30 ml por cada masa radicular. La concentración de urea era de 5 mM, por lo que la cantidad de nitrógeno proporcionada por la urea era la misma que la proporcionada por cada uno de los aminoácidos.
A continuación, el día de primera fructificación, se investigó la coloración de los frutos y el número de frutos producidos para cada masa radicular.
i) Día de primera aparición de fruto
Los días de primera aparición de fruto (días en los que cada planta daba fruto por primera vez) de las tomateras pulverizadas con cada disolución se muestran en la figura 4. Se observó la aparición de fruto en las tomateras pulverizadas con Ile, GluNa, urea, agua y Phe en el orden indicado. Mientras que la tomatera pulverizada con agua fructificó por primera vez el día 69° después de la siembra, la tomatera pulverizada con Ile fructificó por primera vez el día 55° después de la siembra. Las tomateras pulverizadas con GluNa y las tomateras pulverizadas con urea fructificaron por primera vez el día 56° y el día 63° después de la siembra, respectivamente; es decir, antes que las tomateras pulverizadas con agua (Con.). Además, la fructificación de la tomatera pulverizada con Phe fue la más tardía y se observó el día 83° después de la siembra. Tal como se ha indicado anteriormente, la pulverización con Ile fue la que más aceleró la fructificación de la tomatera.
ii) Coloración de los frutos
Los números de frutos que cambiaban de color a naranja o rojo el día 107° después de la siembra de las tomateras se muestran en la figura 5a. Los números fueron de 4 para la tomatera pulverizada con Ile, 1 para las pulverizadas con urea y GluNa y de 0 para las pulverizadas con agua (Con.) y Phe, y de esta manera, la tomatera pulverizada con Ile mostró el número más elevado de frutos coloreados. Además, el color de los frutos obtenido de flores que aparecieron el mismo día en comparación con tomateras pulverizadas con agua (Con.) e Ile. Como resultado, el fruto de la tomatera pulverizada con agua era verde, pero el fruto de la tomatera pulverizada con Ile ya había cambiado a rojo, es decir, cambió de color antes (figura 5b). Tal como se ha indicado anteriormente, el efecto de estimulación de la coloración del fruto del Ile asimismo se observó para el tomate Momotaro.
iii) Número de frutos
Tras el cultivo durante 3 meses después de la siembra, se recolectaron los frutos de tomate. Se muestra el número de los mismos en la figura 6. El número de frutos recolectados era de 8 para la tomatera pulverizada con agua (Con.), de 16 para la pulverizada con Ile, de 8 para la pulverizada con Phe, de 10 para la pulverizada con urea y de 14 para la pulverizada con GluNa. Tal como se ha indicado anteriormente, el efecto de incremento de la aparición de tomates de la pulverización de Ile asimismo se observó para el tomate Momotaro y asimismo mejoró el rendimiento de cultivo.
Ejemplo 3 (únicamente de referencia): efecto de la isoleucina sobre el tomate cherry (Suncherry Pure).
Se sembraron tres semillas de tomate cherry (Suncherry Pure, Tokita Seed) en compost contenido en una maceta y se cultivaron de la misma manera que la indicada en el ejemplo 1, con la condición de que el cultivo se llevase a cabo en un invernadero, tal como en el ejemplo 2. El compost y la aplicación de fertilizante fueron los mismos o se llevaron a cabo de la misma manera que la indicada en el ejemplo 1.
Un mes después de la siembra, cada plántula se plantó permanentemente en una maceta de 9.0 cm de longitud (diámetro superior de 9 cm, altura de 20 cm, diámetro inferior de 6.4 cm) y se cultivó hasta la recolección. Respecto a la aplicación de fertilizante, se aplicó adicionalmente una disolución diluida 200 veces de Vegetable Life A (Otsuka Chemical) como fertilizante mediante irrigación en un volumen de 100 ml por cada masa radicular (maceta) cada dos días desde un mes después de la siembra hasta la recolección.
Después de crecer uniformemente las plantas de cuatro masas radiculares y empezar a aparecer las yemas florales, se pulverizó agua (Con) o disolución acuosa de L-isoleucina 10 mM (Ile) o disolución acuosa de prolina 10 mM (Pro) sobre las plantas completas una vez a la semana. El volumen pulverizado se modificó según el crecimiento de las plantas, siendo de 15 a 30 ml por cada masa radicular.
A continuación, se investigó, para cada masa radicular, la coloración de los frutos, el número de frutos, el contenido de aminoácidos del zumo de los frutos, el contenido de azúcares y acidez del zumo de los frutos y la capacidad antioxidante del zumo de los frutos.
i) Coloración de los frutos
El número de frutos que había cambiado de color se muestra en la figura 7. El número de frutos que había cambiado de color fue, en orden de mayor a menor: tomateras pulverizadas con Ile, con Pro y con agua (Con.). El efecto de estimulación de la coloración de los frutos del tomate de la pulverización con Ile asimismo se confirmó en el presente ejemplo.
ii) Número de frutos
Los resultados de la investigación sobre el número de frutos de las tomateras llevada a cabo con el tiempo se muestran en la figura 8. En un estadio temprano, el número de frutos producidos fue más elevado, en orden decreciente, en plantas pulverizadas con Pro, con Ile, y con agua, aunque el número de frutos producidos de las tomateras pulverizadas con ile se incrementó en la parte intermedia del cultivo y superó el número de frutos producidos por la tomatera pulverizada con Pro. Respecto al rendimiento de cultivo final, el número de frutos producidos por tomateras pulverizadas con Ile y Pro fue superior en 16% y 9%, respectivamente, al de tomateras pulverizadas con agua (Con.).
iii) Análisis de aminoácidos de frutos
Se obtuvieron frutos maduros de cada una de las plantas de tomate cherry pulverizadas con agua, Ile o Pro y se analizó el contenido de aminoácidos de cada uno. Se obtuvieron dos piezas de fruta del racimo de flores de segundo nivel de una masa radicular, es decir, un total de 8 piezas de fruta de cada grupo de ensayo. Se obtuvo el zumo de los frutos exprimiendo cada pieza de fruta y el zumo de los frutos se diluyó 10 veces con HCl 0.02 N y se sometió a filtración con un filtro. Se midió el contenido de aminoácidos del filtrado obtenido. La medición de los aminoácidos se llevó a cabo con un analizador de aminoácidos de alta velocidad L-8800 (Hitachi) siguiendo el manual de este instrumento. Se calcularon las cantidades de los aminoácidos (pmoles/ml) en cada zumo de frutos y se utilizaron las medias para ocho piezas de fruta como las cantidades de aminoácidos del grupo de ensayo correspondiente.
Los resultados se muestran en la tabla 1. En los frutos de las tomateras pulverizadas con Ile, las cantidades de ácido glutámico (Glu), asparagina (Asn), glutamina (Gln), ácido aspártico (Asn), prolina (Pro) y metionina (Met) se redujeron, mientras que las cantidades de alanina (Ala), ácido Y-aminobutírico (y-ABA), isoleucina (Ile), leucina (Leu), valina (Val), serina (Ser), glicina (Gly), treonina (Thr), lisina (Lys), histidina (His), cisteína (Cys), arginina (Arg), tirosina (Tyr) y triptófano (Trp) se incrementaron en comparación “Con”. Mediante la pulverización con Ile, se incrementaron muchos tipos de aminoácido esencial, incluyendo aminoácidos de cadena ramificada y aminoácidos aromáticos.
Los aminoácidos de cadena ramificada y los aminoácidos aromáticos sirven de materiales de partida de la síntesis de muchos metabolitos secundarios vegetales, tales como fenilpropanoides, flavonoides y alcaloides. El aminoácido funcional, Y-ABA, asimismo se incrementó. Estos resultados sugieren que el metabolismo secundario de los frutos resultó activado por la pulverización con Ile. Puede esperarse que el valor nutricional del tomate se incremente mediante el incremento de los aminoácidos esenciales y el aminoácido funcional, y-ABA.
Tabla 1: análisis de los aminoácidos de los frutos de tomate obtenidos con la pulverización con Ile o Pro (pmoles/ml)
iv) Análisis del contenido de azúcares y de la acidez
Se obtuvieron frutos de tomate maduros de plantas de tomate cherry de cada grupo experimental de la manera indicada en iii), anteriormente, y se obtuvo el zumo de los frutos mediante exprimido de cada fruto. Se analizó el
contenido de glucosa, el contenido de fructosa y la acidez de cada zumo de frutos. El análisis de glucosa y fructosa se llevó a cabo para una disolución diluida 20 veces de zumo de frutos mediante la utilización de un kit de reactivos de análisis alimentario: F-Kit (kit sacarosa (sucrosa)/D-glucosa/D-fructosa (Roche)) y espectrofotómetro DU800 (Beckman Coulter) siguiendo los manuales del kit y del instrumento. Se llevó a cabo el análisis de la acidez mediante la utilización de un medidor de acidez de bolsillo (PAL-AC1, ATAGO).
Los resultados se muestran en la tabla 2. El contenido de glucosa y el contenido de fructosa de los frutos de las tomateras pulverizadas con Ile eran prácticamente iguales a los de “Con”. Los frutos de las tomateras pulverizadas con Pro mostraron el contenido de glucosa y el contenido de fructosa más bajos.
Respecto a la acidez, los frutos de las tomateras pulverizadas con Pro mostraron una acidez ligeramente incrementada.
Tabla 2: contenido de glucosa, contenido de fructosa y acidez de los frutos del tomate
v) Capacidad antioxidante
Se extrajeron los polifenoles del fruto del tomate y se investigaron las capacidades antioxidantes del mismo.
Se obtuvieron frutos del tomate maduros a partir de plantas de tomate cherry de cada grupo experimental de la manera indicada en iii), tal como se ha indicado anteriormente. Los frutos se congelaron en nitrógeno líquido y después se molieron y se introdujeron 0.5 g de los polvos en un tubo de 2 ml y se extrajeron dos veces con 1.0 ml de metanol al 70%. El líquido del extracto se evaporó por completo mediante la utilización de un evaporador centrífugo y el residuo se disolvió en 500 pl de metano al 70% a fin de preparar una muestra. Se midió la capacidad antioxidante de la muestra como capacidad de eliminación de radicales libres de la misma mediante la utilización del procedimiento del radical DPPH (2,2-difenil-1 -picrilhidrazilo), en referencia a Lamien-Meda A. et al., Molecules 13(3):581-594, 2008. A 50 pl de la muestra se añadieron 700 pl de metanol y 750 pl de DPPH 0.02 mg/ml (ALFA AESAR) y se mezclaron suficientemente. A continuación, la mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 15 minutos y se midió la absorbancia de la misma a 517 nm. Se preparó una curva de calibración mediante la utilización de soluciones 0, 0.2, 1, 2 y 4 pg/ml de catequina en lugar de la muestra. La capacidad medida de eliminación de radicales libres se convirtió en cantidad (mg) de catequinas con una capacidad de eliminación de radicales libres equivalente a la de 100 g (peso fresco) de muestra. Los resultados se muestran en la figura 9. Como resultado, se encontró que los frutos de las tomateras pulverizadas con Ile mostraban una capacidad antioxidante más elevada que los frutos de las tomateras pulverizadas con agua (Con.) o con Pro.
vi) Otros
Mientras que se observaron manchas negras de daño por insolación en las hojas de las tomateras pulverizadas con Pro, no se observó daño por insolación en las tomateras pulverizadas con Ile (figura 10).
A partir de los resultados indicados anteriormente, se encontró que la pulverización con Ile puede mejorar el rendimiento de cultivo y la calidad del tomate en un corto periodo de tiempo.
Ejemplo 4: efecto de la isoleucina sobre la coloración y síntesis de carotenoides del tomate
Se pulverizó una disolución acuosa de isoleucina 10 mM (Ile) sobre piezas de fruta inmadura de sustancialmente el mismo tamaño, obtenidas de racimos de flores del mismo nivel de tomateras cultivadas de la manera indicada en el ejemplo 3 y se investigó la coloración de los frutos.
Los frutos se introdujeron en dos vasos de vidrio de 100 ml, seis en cada uno. Se pulverizó 1 ml de agua (Con.) sobre los frutos en un vaso y se pulverizó 1 ml de una disolución de Ile sobre los frutos en el otro vaso. A continuación, se cerraron los vasos con envoltorio plástico y se dejaron durante 5 horas y después se retiró el envoltorio y se dejaron los frutos en reposo. El ensayo se llevó a cabo a temperatura ambiente y la pulverización con agua y disolución de Ile se llevó a cabo dos veces en total en un intervalo de una semana.
La apariencia de tres piezas de fruta de entre las seis de cada grupo se registró al inicio del ensayo, y 27, 32 y 34 días después del inicio del ensayo. En torno al día 27, los frutos pulverizados con Ile empezaron a cambiar de color, mientras que los frutos de “Con.”, pulverizados con agua, se mantenían verdes. En torno al día 34, los frutos pulverizados con Ile cambiaron de calor a un color rojo totalmente maduro, mientras que los frutos pulverizados con agua todavía presentan un color naranja semimaduro. Los resultados se muestran en la figura 11a.
Además, se midió el contenido de carotenoides de los tres frutos restantes mediante los procedimientos siguientes en torno al día 27 después del inicio del ensayo (figura 11b). Se extrajeron las semillas de los frutos del tomate, se congelaron con nitrógeno líquido y se molieron en un mortero. La muestra molida (0.5 mg) se introdujo en un tubo de 2 ml, se añadió 1 ml de cloroformo y se llevó a cabo la extracción en un agitador (Micro & Shaker, IUCHI) durante 10 minutos con vibración. La mezcla de extracción se centrifugó durante 5 minutos (8000 rpm) y la capa de cloroformo, como capa inferior, se transfirió a un tubo nuevo. Se añadió nuevamente cloroformo (0.5 ml) al primer tubo, se llevó a cabo la extracción de la misma manera y se extrajo por completo la capa de cloroformo y se transfirió al segundo tubo que contenía el extracto de cloroformo anteriormente mencionado. A continuación, se evaporó el cloroformo del extracto obtenido, mediante la utilización de un evaporador centrífugo. A continuación, se preparó una disolución de muestra mediante la adición de 0.5 ml de cloroformo al residuo para disolverlo y se analizaron los carotenoides contenidos en la disolución de muestra. Para la medición de los carotenoides, la muestra de extracción se diluyó 100 veces con cloroformo y se midió la absorbancia de la misma a la longitud de onda de extinción de los carotenoides (480 nm) mediante la utilización de un espectrofotómetro DU800 (Beckman Coulter). Se muestran los resultados en la figura 11b.
Tal como se muestra en la figura 11, se encontró que el contenido de carotenoides de los frutos del tomate pulverizados con Ile era superior al de los frutos tratados con agua, basándose en una evaluación visual (figura 11a) y una evaluación basada en la cuantificación de los carotenoides (figura 11b). Estos resultados revelan que la síntesis de carotenoides y la coloración de los frutos resultaban estimulados por la pulverización con Ile de los frutos.
Ejemplo 5 (únicamente de referencia): relación entre la pulverización con isoleucina y con ácido jasmónico
Se pulverizó una disolución acuosa de isoleucina 10 mM (Ile) o de agua (Con.) sobre hojas de plantas de tomate cherry (Suncherry Pure) cultivadas de la manera indicada en el ejemplo 3 y se analizó la expresión de genes relevantes al ácido jasmónico. Tres horas después de la aplicación foliar, se recogieron hojas de la misma parte y se aisló el ARN mediante la utilización del sistema SV Total RNA Isolation System™ (Promega) según el manual del kit. Mediante la utilización de la mezcla maestra de qPCR RT ReverTraAce™ (TOYOBO), se sintetizaron cadenas de ADNc primario a partir del ARN extraído.
i) Análisis de los genes implicados en la síntesis del ácido jasmónico
Se analizó la expresión del gen de 13-lipooxigenasa (LOX) situado cadena arriba de la ruta de biosíntesis del ácido jasmónico y el gen para la síntesis de JA-Ile de JA e Ile (JASMONATE RESISTANT 1 (JAR1)). Se llevó a cabo PCR en tiempo real mediante la utilización de los ADNc anteriormente indicados como molde y los cebadores mostrados en la tabla 3. Las cantidades de expresión de los genes se representan como cantidades de expresión relativa con respecto a la del gen actina. Se muestran los resultados en la figura 12.
La expresión del gen LOX y del gen JAR1 en las hojas de tomatera pulverizadas con Ile fue significativamente más elevada que en hojas de tomatera pulverizada con agua (Con.).
Tabla 3: cebadores para PCR en tiempo real
ii) Análisis de genes que responden al ácido jasmónico.
Los resultados del análisis de PCR en tiempo real de los genes que responden al ácido jasmónico y de los genes de inhibidor de proteasa (PI) y MYC2, realizado mediante la utilización de los ADNc anteriormente como moldes se muestran en la figura 13. Los cebadores utilizados se muestran en la tabla 3. Mediante la pulverización de Ile, se incrementó la expresión de los genes PI y MYC2.
iii) Análisis de los genes implicados en la síntesis de carotenoides.
Se pulverizó una disolución acuosa de isoleucina 10 mM (Ile) o agua (Con.) sobre las superficies de las hojas de plantas de tomate cherry y se aisló el ARN a partir de las hojas 24 horas después. Mediante la utilización del ARN aislado, se analizó la expresión de los genes que participan en la biosíntesis de carotenoides, los genes de fitoeno sintasa (Psy), fitoeno desaturasa (Pds) y Z-caroteno desaturada (Zds). Se llevó a cabo la extracción de ARN, la síntesis de ADNc y el análisis de PCR en tiempo real de la manera indicada anteriormente. Los cebadores utilizados se muestran en la tabla 3.
Se muestran los resultados en la figura 14. En la tomatera pulverizada con Ile, se incrementó la expresión de Psy, Pds y Zds.
Ejemplo 6: investigación de la concentración de isoleucina para la pulverización (I).
Se cultivaron plantas de tomate cherry de la manera indicada en el ejemplo 3 y se pulverizaron 20 ml de una disolución acuosa de isoleucina 1 mM, 4 mM, 7 mM o 10 mM (Ile) sobre las superficies de las aguas y frutos de cada planta. Una semana después, se pulverizó nuevamente Ile de la misma manera, se recogieron las hojas 3 horas después, y se analizó la expresión de los genes LOX, JAR1, PI y MYC2 de la manera indicada en el ejemplo 5. Los cebadores utilizados se muestran en la tabla 3.
Se muestran los resultados en la figura 15. La expresión de los genes se incrementó sustancialmente de una manera dependiente de la concentración de Ile.
Ejemplo 7 (únicamente de ejemplo): investigación de la concentración de isoleucina para la pulverización (II).
Se cultivaron tomateras (variedad: Caddy, Tokita Seed) en una sala Biotrón de la manera indicada en el ejemplo 1. Tres semanas después de la siembra, se pulverizaron 3 ml de agua o de una disolución acuosa de isoleucina 0.01 mM, 0.1 mM, 50 mM o 100 mM (Ile) sobre las superficies foliares de cada planta; se llevó a cabo el muestreo a partir de las hojas del segundo follaje y se analizó la expresión de los genes l Ox , JAR1, PI y MYC2 de la manera indicada en el ejemplo 5.
Se muestran los resultados en la figura 16. Se estimuló la expresión de los genes mediante pulverización de 50 mM de Ile.
Basándose en dicho resultado, junto con los resultados del ejemplo 6, se consideró que la concentración de Ile era preferentemente no inferior a 0.5 mM y no superior a 75 mM.
Ejemplo 8 (únicamente de ejemplo): efecto de la isoleucina sobre el pimiento.
Se pulverizó una disolución acuosa de isoleucina 10 mM (Ile) sobre plantas de pimiento (variedad, Anaheim), que asimismo pertenecen a la familia Solanaceae, como el tomate, y se llevó a cabo el análisis de la expresión génica. Las plantas del pimiento se cultivaron en un invernadero de la manera indicada en el ejemplo 2.
Se pulverizó Ile una vez a la semana y después de la segunda pulverización, se recogieron hojas de las plantas del pimiento. Se llevó a cabo la extracción del ARN, la síntesis de ADNc y PCR en tiempo real de la manera indicada en el ejemplo 5 para analizar la expresión génica. Se analizó la expresión del gen LOX mediante la utilización de hojas recogidas 3 horas después de la segunda pulverización y se analizó la expresión del gen Psy mediante la utilización de hojas recogidas 24 horas después de la segunda pulverización. Los cebadores utilizados se muestran en la tabla 3.
Se muestran los resultados en la figura 17. La expresión de los genes LOX y Psy de las plantas de pimiento pulverizadas con Ile era más elevada que la observada para Con.
Debido a que la ruta del ácido jasmónico y la ruta de los carotenoides resultaron activadas por la pulverización con Ile asimismo en plantas de pimiento, que pertenecen a la familia Solanaceae al igual que la planta del tomate, pueden esperarse de manera general efectos similares de la pulverización con Ile para las plantas solanáceas.
Ejemplo 9 (únicamente de referencia): efecto de estimulación de la coloración y efecto de incremento del número de racimos recolectables de la isoleucina en tomateras fructificantes de tamaño de fruto intermedio.
Para el ensayo, se utilizaron tomateras fructificantes de tamaño de fruto intermedio en la segunda mitad de su crecimiento (variedad, Tsukutsuku-shi) que se cultivaron en un invernadero y fructificación del nivel 12. Se seleccionaron 12 masas radiculares contiguas de las tomateras, 6 de ellas se utilizaron para el grupo de no tratamiento (control) y las 6 masas radiculares restantes se utilizaron para el grupo de tratamiento de Ile. Como fruto utilizado para el ensayo, se seleccionaron 10 racimos de cada uno de frutos sustancialmente no coloradas de entre los niveles 9 y 10 de plantas del grupo de no tratamiento y del grupo de tratamiento de isoleucina (Ile), y se etiquetaron. Para el grupo de tratamiento de Ile, se pulverizó una disolución acuosa de Ile que contenía Ile 3 mM y un agente de dispersión (Squash al 0.2%, MARUWA Biochemical) sobre los frutos y hojas objetivo de la planta completa, y las plantas del grupo de no tratamiento no se pulverizaron con ninguna sustancia. El volumen total de disolución pulverizada sobre las plantas de 6 masas radiculares fue de 600 ml. Tras el tratamiento, se confirmó la coloración de los frutos del tomate y se recolectaron de cada racimo los días 11, 8 y 27.
En el momento en que sustancialmente la totalidad de los frutos se habían coloreado (madurado), o muchos frutos estaban a punto de madurar en exceso (aunque la parte superior del fruto todavía no estuviese colorada), se recolectaban los frutos. El número de racimos recogido el día 11 después del tratamiento fue de 3 para el grupo de no tratamiento y de 7 para el grupo de tratamiento de Ile. El número de racimos recogido el día 18 después del tratamiento fue de 4 para el grupo de no tratamiento y de 3 para el grupo de tratamiento de Ile. El número de racimos recogido el día 27 después del tratamiento fue de 3 para el grupo de no tratamiento y de 1 para el grupo de tratamiento de Ile (figura 18). Tal como se observa a partir de dichos resultados, se aceleró la coloración del fruto del tomate en el grupo de tratamiento de Ile y se sugiere que Ile estimuló la coloración del fruto del tomate. Entre los frutos recogidos de 10 racimos, el total de 85 frutos del grupo de no tratamiento incluía 15 frutos no coloreados, mientras que el total de 86 frutos del grupo de tratamiento de Ile incluía sólo 8 frutos inmaduros, lo que significa que la pulverización con Ile redujo el número de frutos no coloreados.
Ejemplo 10 (únicamente de referencia): efecto de líquido de producción secundaria mediante fermentación de isoleucina sobre el pimiento (pimiento morrón).
La expresión del gen LOX en la ruta del ácido jasmónico se investigó en una planta del pimiento (pimiento morrón, variedad: Frupyred EX) pulverizada con un líquido de producción secundaria mediante fermentación de isoleucina (Ile). Se pulverizó una disolución diluida de líquido de producción secundaria mediante fermentación de Ile (concentración de Ile, 2.34% (p/v)) sobre hojas de la planta de pimiento morrón y se investigó la expresión del gen LOX de la manera indicada en el ejemplo 5. La concentración del líquido de producción secundaria de fermentación de Ile pulverizado era de 3.8 mM. Se muestran los resultados en la figura 19. Asimismo se observó una inducción de la expresión del gen LOX similar a la observada con una concentración similar de Ile, con el líquido de producción secundaria mediante fermentación de Ile.
Ejemplo 11: efecto de la isoleucina sobre la uva.
(1) Efectos de la isoleucina y diversos aminoácidos sobre la coloración de células en cultivo de uva.
Una estirpe celular (VR, número de gestión RPC00003) derivada de uva europea (Vitis vinífera L.) y almacenada en el Institute of Physical and Chemical Research, BioResource Center se subcultivó en medio agar-MS. Se transfirieron los callos de VR de subcultivo a medio agar-MS que contenía una disolución 5 mM de un aminoácido diferente y se cultivaron. Para el control positivo, se utilizó ácido abscísico (ABA), del que se conoce el efecto de estimulación de la coloración, a una concentración de 100 pM (Jeong et al., Plant Science 167:247-252, 2004). El 5° día después de la transferencia, se liofilizaron los callos y se molieron y se extrajo la antocianina de los mismos mediante la utilización de una disolución de HCl al 1%/MeOH. Se midió la absorbancia de los extractos a 530 nm y se midió el contenido de antocianina mediante la utilización de cianidín-3-glucósido como sustancia estándar. Se determinó el contenido relativo de antocianina que se había acumulado en los callos de cada grupo de tratamiento de aminoácido, respecto al contenido de antocianina de los callos del control positivo, que se consideró que era 100%.
Se muestran los resultados en la tabla 4. Los callos tratados con isoleucina (Ile) mostraron el contenido de antocianina más elevado.
Tabla 4: análisis del contenido de antocianina de callos de uva tratados con aminoácidos
Claims (5)
1. Procedimiento para acelerar la maduración después de la recolección de un fruto, que comprende la rociada de una disolución que comprende 0.5 a 75 mM de isoleucina sobre un fruto recolectado.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la isoleucina es L-isoleucina.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 o 2, en el que la disolución que comprende isoleucina es una disolución que comprende isoleucina purificada, un líquido de fermentación o un subproducto de fermentación de isoleucina, o un producto de fraccionamiento de estos que comprende isoleucina.
4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el fruto es un fruto de una planta perteneciente a la familia Solanaceae, Vitaceae o Rosaceae.
5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el fruto es tomate, uva o manzana.
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