ES2779303T3

ES2779303T3 - Endófitos fúngicos para mejorar el rendimiento de los cultivos y la protección contra plagas

Info

Publication number: ES2779303T3
Application number: ES14860187T
Authority: ES
Inventors: Gregory Sword
Original assignee: Texas A&M University System; Texas A&M University
Current assignee: Texas A&M University System; Texas A&M University
Priority date: 2013-11-06
Filing date: 2014-11-06
Publication date: 2020-08-14
Anticipated expiration: 2034-11-06
Also published as: EP3068212B1; CA3105900A1; HUE048814T2; US20160192662A1; US9545111B2; US10375966B2; US10813359B2; IL245385A0; US20200163344A1; AU2014346664A1; CA3105900C; AU2018204758A1; CA3195750A1; IL245385B; MX2016005921A; CA2929487A1; AU2014346664B2; BR112016010082A2; MX368885B; US20160286821A1

Abstract

Un método para mejorar un rasgo en una planta de algodón, comprendiendo el método: poner en contacto una semilla agrícola de dicha planta de algodón con una formulación que comprende endófitos fúngicos filamentosos facultativos, purificados y formadores de esporas, de al menos un Dothideomycetes no de Alternaria seleccionado de Cladosporium cladosporioides, Cladosporium uredinicola y Epicoccum nigrum y en donde los endófitos capaces de producir sustancias que son beneficiosas para las plantas o perjudiciales para las plagas o ambas, y en donde los endófitos están presentes en la formulación en una cantidad eficaz para modular las frecuencias de colonización de los endófitos del género Alternaria que son naturales de la planta de algodón, y para proporcionar un beneficio a la planta de algodón en comparación con una planta de algodón cultivada a partir de una semilla no tratada con los endófitos fúngicos facultativos de Dothidoemycetes no de Alternaria, en donde el beneficio es una mayor resistencia al estrés por sequía.

Description

DESCRIPCIÓN

Endófitos fúngicos para mejorar el rendimiento de los cultivos y la protección contra plagas

Campo de la invención

La presente invención se refiere a endófitos fúngicos de cultivos agrícolas para mejorar el rendimiento y/o para la protección contra plagas.

Descripción de la técnica relacionada

Los endófitos fúngicos son hongos que colonizan internamente los tejidos vegetales sin causar daños o enfermedades evidentes. Los endófitos fúngicos particulares, tales como las micorrizas, sobreviven dentro de varios tejidos de la planta hospedadora, colonizando a menudo los espacios intercelulares de las hojas, los tallos, las flores o las raíces del hospedador. Las relaciones simbióticas endófito-hospedador pueden proporcionar varios beneficios al estado físico de la planta hospedadora, tales como la mejora de la nutrición y/o el aumento de la tolerancia a la sequía. Las micorrizas colonizadoras de la raíz sobreviven de los carbohidratos fotosintéticos de la planta y, a cambio, ayudan en la solubilización y absorción de agua y minerales al hospedador, lo que puede llevar a la promoción de la germinación de semillas y el crecimiento de las plantas. Adicionalmente, la asociación de un endófito fúngico con una planta hospedadora puede proporcionar tolerancia a varios estreses bióticos y abióticos. Se cree que el crecimiento, la promoción y la protección del estado físico se logran a través de múltiples propiedades beneficiosas de la asociación endófito-hospedador. Por ejemplo, los organismos endofíticos pueden producir sustancias reguladoras del crecimiento para inducir la producción de biomasa y alcaloides u otros metabolitos. Adicionalmente, los endófitos fúngicos pueden suprimir o competir directamente con los microbios causantes de enfermedades, protegiendo a la planta de posibles patógenos.

Ek-Ramos et al. (2013) Spatial and Temporal Variation in Fungal Endophyte Communities Isolated from Cultivated Cotton (Gossypium hirsutum) (Plos one, volumen 8, número 6) publicó un estudio de los diversos endófitos detectados en las hojas de las plantas de algodón. Los autores tomaron muestras de múltiples variedades de algodón en Texas, e E. UU. y probado la variación temporal y espacial en la diversidad de hongos endófitos y la composición de la comunidad, así como las diferencias asociadas con las prácticas agrícolas orgánicas y convencionales. Los autores documentaron que no se detectaron diferencias en la riqueza o diversidad de especies endófitas entre las diferentes variedades de algodón, pero detectaron diferencias con el tiempo y en diferentes tejidos vegetales. No se observaron patrones consistentes de similitud comunitaria asociados con la variedad, la región, práctica agrícola, el tiempo de la temporada o el tipo de tejido independientemente de las medidas de similitud de la comunidad ecológica utilizada. Los autores especulan que sus resultados indicaron que las comunidades endófitas fúngicas locales pueden verse afectadas por la época del año y el tejido vegetal, pero la composición específica de la comunidad varía de un sitio a otro.

Compendio de la invención

En un aspecto, la invención proporciona un método para mejorar un rasgo en una planta de algodón, comprendiendo el método: poner en contacto una semilla agrícola de dicha planta de algodón con una formulación que comprende endófitos fúngicos filamentosos facultativos purificados, formadores de esporas, de al menos un Dothideomycetes no de Alternaria seleccionado de Cladosporium cladosporioides, Cladosporium uredinicola y Epicoccum nigrum y en donde los endófitos capaces de producir sustancias que son beneficiosas para las plantas o perjudiciales para las plagas o ambas, y en donde los endófitos están presentes en la formulación en una cantidad eficaz para modular las frecuencias de colonización de los endófitos del género Alternaria que son naturales de la planta de algodón, y para proporcionar un beneficio a la planta de algodón en comparación con una planta de algodón cultivada a partir de una semilla no tratada con los endófitos fúngicos facultativos de Dothidoemycetes no de Alternaria, en donde el beneficio es una mayor resistencia al estrés por sequía.

En un aspecto adicional, el beneficio para las plantas de algodón derivadas de la semilla puede ser un aumento del rendimiento en una población de dichas plantas en un 5 %, en un 10 %, en un 15 %, en un 20 %, en un 30 %, en un 40 %, o en un 45 % en relación con una población de referencia de plantas de algodón cultivadas a partir de semillas no tratadas con los endófitos facultativos fúngicos de Dothidoemycetes o una reducción de la pérdida de rendimiento en una población de dichas plantas en más del 40 %, en un 30 %, en un 20 %, en un 10 %, 5 % o 1 % en relación con una población de referencia de plantas de algodón cultivadas a partir de semillas no tratadas con endófitos fúngicos facultativos de Dothidoemycetes.

En un aspecto adicional, el endófito puede estar presente en la formulación en una cantidad eficaz para obtener al menos un 50 % de colonización de las hojas, tallos o raíces de una planta de algodón cultivada a partir de la semilla. En un aspecto adicional, la formulación puede comprender al menos 1, 2 o 3 especies de endófitos fúngicos facultativos.

En un aspecto adicional, el método puede comprender además envasar las semillas en contacto en un recipiente. En un aspecto adicional, el método comprende además el crecimiento de una población de dichas plantas de algodón, en donde el beneficio se mide a nivel de la población, en comparación con una población de plantas de referencia.

La presente invención también proporciona una combinación sintética de semilla de algodón y una composición que comprende endófitos fúngicos filamentosos facultativos purificados, formadores de esporas, de al menos una especie, en donde los endófitos son Dothideomycetes no de A/ternar/aseleccionado de Cladosporium cladosporioides, C/adosporium uredinico/a y Epicoccum nigrum capaces de producir sustancias que son beneficiosas para las plantas o perjudiciales para las plagas o ambas, y en donde los endófitos fúngicos facultativos están presentes en la formulación en una cantidad eficaz para modular las frecuencias de colonización de los endófitos del género A/ternaria que son naturales de la planta de algodón, y para proporcionar un beneficio a la planta de algodón en comparación con una planta de algodón cultivada a partir de una semilla no tratada con los endófitos fúngicos facultativos de Dothidoemycetes no de A/ternaria, en donde el beneficio es una mayor resistencia al estrés por sequía.

En otro aspecto de la combinación sintética, el endófito está presente en la combinación sintética en una cantidad eficaz para obtener al menos un 50 % de colonización de las hojas, tallos o raíces de una planta de algodón cultivada a partir de la semilla.

En otro aspecto, la combinación sintética puede comprender al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 cepas de endófitos.

En otro aspecto adicional de la combinación sintética, el beneficio para las plantas de algodón derivadas de la semilla puede ser un aumento del rendimiento en una población de dichas plantas en un 5 %, en un 10 %, en un 15 %, en un 20 %, en un 30 %, en un 40 %, o en un 45 % en relación con una población de referencia de plantas de algodón cultivadas a partir de semillas no tratadas con los endófitos facultativos fúngicos de Dothidoemycetes o una reducción de la pérdida de rendimiento en una población de dichas plantas en más del 40 %, 30 %, 20 %, 10 %, 5 % o 1 % en relación con una población de referencia de plantas de algodón cultivadas a partir de semillas no tratadas con endófitos fúngicos facultativos de Dothidoemycetes.

Breve descripción de los dibujos

FIG. 1: Las eficacias de colonización demuestran que los endófitos pueden manipularse en el campo. Se muestran las medias /- EE de las frecuencias de colonización endofítica de plántulas de algodón en condiciones de campo inoculadas por tratamientos con diferentes concentraciones de esporas de Paeci/omyces /i/acinus (izquierda) o de Beauveria bassiana (derecha). FIG. 2: El hongo endofítico Paeci/omyces /i/acinus afecta negativamente a la reproducción del nemátodo del nudo radicular (Me/oidogyne incognita) cuando está presente como un endófito en algodón.

A altos niveles de inóculo de nemátodos (10.000 huevos), el endófito redujo la producción de huevos en las plantas después del tratamiento de semillas con soluciones que contienen 106 o 107 esporas/ml en comparación con las semillas control no tratadas. A niveles de inóculo de campo (2000 huevos), la presencia del endófito redujo significativamente la producción de agallas y huevos a ambas concentraciones de tratamiento de semillas.

FIG. 3: El endófito Chaetomium g/obosum afecta negativamente a la reproducción de nemátodos del nudo radicular. Efectos negativos del endófito Chaetomium g/obosum sobre la formación de agallas por el nemátodo del nudo radicular y la producción de huevos después de los tratamientos de remojo de semillas de algodón en soluciones de 0 (controles no tratados), 106 y 108 esporas/ml. Las plántulas se inocularon con 1000 huevos de nemátodos y se cultivaron en el invernadero. La producción de huevos al incubar nemátodos que infectaron con éxito las plántulas se cuantificó 60 días después.

FIG. 4A, 4B: El efecto de los hongos endófitos sobre la reproducción de los áfidos del algodón. (Aphis gossypii). La Fig. 4A demuestra que la presencia de Beauveria bassiana en el algodón afecta negativamente a la reproducción de los áfidos del algodón. La Fig. 4B demuestra que la presencia de Paeci/omyces /i/acinus en el algodón afecta negativamente a la reproducción de los áfidos del algodón.

FIG. 5: Efectos de Chaetomium g/obosum sobre los áfidos del algodón. El endófito Chaetomium g/obosum en el algodón afecta negativamente a la tasa de crecimiento de la población de áfidos del algodón, como lo demuestra la reproducción reducida después de 14 días en plantas colonizadas con endófito frente a las plantas de control. Las plantas de algodón se cultivaron a partir de semillas tratadas mediante remojo en soluciones de esporas de 0 (control), 106 (bajo) y 108 (alto) esporas/ml.

FIG. 6A, 6B: El efecto de los hongos endófitos Beauveria bassiana y Paeci/omyces /i/acinus sobre la chinche opaca de las plantas occidentales Lygus hesperus (Miridae). La Fig. 6A demuestra que Beauveria bassiana y Paeci/omyces /i/acinus afectan negativamente la selección de plantas hospedadoras de la chinche opaca de las plantas occidentales cuando están presentes como endófitos en el algodón. La Fig. 6B demuestra que Beauveria bassiana y Paeci/omyces /i/acinus afectan negativamente al comportamiento de selección de la planta hospedadora de las chinches opacas de las plantas occidentales cuando están presentes como endófitos en el algodón.

FIG. 7A, 7B: El efecto de los hongos endófitos. Beauveria bassiana y Paecilomyces lilacinus en chinches verdes apestosas del sur (Nezara viridula (Pentatomidae). La Fig. 7A demuestra que Beauveria bassiana y Paecilomyces lilacinus afectan negativamente a la selección de plantas hospedadoras de chinches verdes apestosas del sur cuando están presentes como endófitos en el algodón. La figura 7B demuestra que Beauveria bassiana y Paecilomyces lilacinus afectan negativamente el comportamiento de selección de la planta hospedadora de las chinches apestosas del sur cuando están presente como endófitos en el algodón.

FIG. 8: Se observó una reducción en el daño de las cápsulas de algodón durante los ensayos de campo. En relación con las plantas de control, los niveles de daño de las cápsulas asociado a los insectos fueron más bajos entre las plantas que fueron tratadas remojando semillas en soluciones de esporas de Beauveria bassiana y Paecilomyces lilacinus a concentraciones de 106 y 108 esporas/ml.

FIG. 9: La aplicación foliar de algodón en el campo con esporas de hongos entomopatógenos endofíticos mejora el rendimiento de la planta. Las semillas de algodón (variedad FM1740B2F) tratadas con varios fungicidas típicos (Metalaxil, Triadimenol, Trifloxiestrobina, 2-(Tiocianometiltio)benzotioazol) e insecticidas (Tiodicarb, limidacloprid, Cloropirifós) se plantaron y cultivaron en condiciones de campo. Las plantas se rociaron en la 5a etapa de hoja verdadera con soluciones acuosas de Beauveria bassiana y Paecilomyces fumosoroseus. La sacarosa se incluyó (1 % en peso/vol) como un recurso nutricional adicional para los hongos. Se observó una retención significativamente mayor de cápsula de primera posición (desarrolladoras de fruto) en plantas rociadas con Beauveria bassiana sin sacarosa y Paecilomyces fumosoroseus más sacarosa.

FIG. 10A, 10B: Efectos positivos de los hongos endófitos en el rendimiento de la planta de algodón en condiciones de campo. La Fig. 10A demuestra una tendencia de temporada temprana para una mayor retención de cuadrados en las plantas tratadas frente a las no tratadas. La figura 10B demuestra que se retuvieron significativamente más cápsulas en los grupos de tratamiento con endófitos más adelante en la temporada, en relación con el control. Esto se demuestra con ambas especies de endófito utilizadas y con ambas concentraciones de tratamiento de semillas empleadas (ANOVA de mediciones repetidas: Tiempo, P < 0,001; Tiempo*Endófito, P = 0,045, Endófito, P = 0,003).

FIG. 11: Efectos positivos de los hongos endófitos sobre los rendimientos de la planta de algodón en condiciones de campo. Los datos demuestran que los tratamientos endófitos lograron rendimientos del 25 % más en plantas de algodón tratadas.

FIG. 12: Efectos positivos de los hongos endófitos en el sorgo (a) altura de la planta y (b) biomasa fresca total bajo ensayos de plántulas en la cámara de crecimiento. Los datos mostrados son la altura promedio de la planta (cm) y la biomasa fresca total (g) de n = 10 réplicas independientes. Las barras de error representan ± 1 de error estándar. Los tres endófitos fúngicos mejoran ambos rasgos en relación con el control no tratado.

FIG. 13: La modulación en el campo de la colonización endógena de endófitos de algodón endógenos en (a, b) tallos y (c, d) raíces cuando se trata con hongos endófitos Paecilomyces lilacinus (a, c) y Beauveria bassiana (b, d). Los datos mostrados son un cambio porcentual en la colonización en relación con el control no tratado correspondiente y el tejido vegetal.

FIG. 14: Diferencia porcentual promedio en el rendimiento entre las plantas de algodón tratadas con endófitos y de control (n = 6 parcelas replicadas en un campo de tierras secas, College Station, TX) para 15 endófitos fúngicos facultativos y dos variedades de cultivo de algodón; Delta Pine (DP 0912B2RF) y Phytogen (PHY 499WRF). En Delta Pine, 11 de 15 y en Phytogen 14 de 15 endófitos fúngicos facultativos probados mostraron un aumento en el rendimiento en relación con las plantas de algodón no tratadas.

FIG. 15: Diferencia porcentual promedio agregada en el rendimiento entre las plantas de algodón tratadas con endófitos y de control (n = 6 parcelas replicadas en un campo de tierras secas, College Station, TX) para 15 endófitos fúngicos facultativos y dos variedades de cultivo de algodón; Delta Pine (DP 0912B2RF) y Phytogen (PHY 499WRF). Las barras representan un intervalo de confianza del 95 % alrededor de la media.

FIG. 16: Diferencia porcentual promedio en el daño por trips (A) y el daño por pulguillas (B) entre las plantas de algodón tratadas con endófitos y de control. El daño por trips se evaluó en la variedad de cultivo Delta Pine (DP 0912B2RF) (n = 6 parcelas replicadas en un campo de tierras secas, College Station, TX) para 15 endófitos fúngicos facultativos. 12 de los 15 endófitos fúngicos facultativos probados mostraron una disminución en el daño por trips en relación con las plantas de algodón no tratadas. Se evaluó el daño de la pulguilla en plantas de algodón de la variedad de cultivo Phytogen (PHY 499WRF) (n = 6 parcelas replicadas en un campo de tierras secas, College Station, TX) para 15 endófitos fúngicos facultativos. 6 de los 15 endófitos fúngicos facultativos probados mostraron una disminución promedio en el daño por pulguillas en comparación con las plantas de algodón no tratadas.

FIG. 17: Rasgo de campo de mitad de temporada medido en junio en el ensayo de tierras secas de (A) longitud de raíz y (B) peso subterráneo. Los datos presentados son el promedio de n = 10 réplicas independientes y las barras de error representan ± uno de error estándar.

FIG. 18: Rasgo de campo de mitad de temporada medido en julio en la prueba de temperatura de la copa (Celsius) en secano para las variedades de cultivo Delta Pine (barras azules) y Phyton (barras verdes). Los datos presentados son el promedio controlado por bloques de n = 10 réplicas independientes, en relación con el gráfico de control y las barras de error representan ± uno de error estándar.

FIG. 19: Rasgo de campo de mitad de temporada medido en agosto en el ensayo del NDVI en secano para las variedades de cultivo Delta Pine (barras azules) y Phyton (barras verdes). Los datos presentados son el promedio controlado por bloques de n = 10 réplicas independientes, en relación con el gráfico de control y las barras de error representan ± uno de error estándar.

FIG. 20: Rasgo de campo de mitad de temporada medido en agosto en la retención de cuadrados en primera posición en secano para las variedades de cultivo Delta Pine (barras azules) y Phyton (barras verdes). Los datos presentados son el promedio controlado por bloques de n = 10 réplicas independientes, en relación con el gráfico de control y las barras de error representan ± uno de error estándar.

FIG. 21: Rasgo de campo de mitad de temporada medido en agosto en el ensayo de la altura de la planta (cm) en secano para las variedades de cultivo Delta Pine (barras azules) y Phyton (barras verdes). Los datos presentados son el promedio controlado por bloques de n = 10 réplicas independientes, en relación con el gráfico de control y las barras de error representan ± uno de error estándar.

FIG. 22: Rasgo de campo de mitad de temporada medido en julio en la prueba de altura de la planta (cm) en secano para las variedades de cultivo Delta Pine (barras azules) y Phyton (barras verdes). Los datos presentados son el promedio controlado por bloques de n = 10 réplicas independientes, en relación con el gráfico de control y las barras de error representan ± uno de error estándar.

FIG. 23: Imagen que muestra un aumento de la biomasa en las plantas tratadas con endófitos (mitad derecha de la imagen) en comparación con el control no tratado (mitad izquierda de la imagen).

FIG. 24: Tabla que muestra el tiempo para marchitarse después del estrés por sequía en días para plantas cultivadas a partir de semillas tratadas con endófitos fúngicos y de control.

FIG. 25: Tabla que muestra el tiempo para la muerte después del estrés por sequía en días para plantas cultivadas a partir de semillas tratadas con endófitos fúngicos y de control.

Descripción detallada de la invención

Los hongos endófitos son ubicuos en la naturaleza, infectando prácticamente a todas las plantas tanto en ecosistemas naturales como agronómicos. Las plantas comúnmente albergan diversos hongos que viven dentro de sus tejidos como endófitos asintomáticos que pueden proporcionar protección contra varios factores de estrés bióticos y abióticos. La presente divulgación describe ciertos endófitos fúngicos que pueden ser patógenos, parásitos o antagonistas de patógenos, insectos y plagas de nemátodos en plantas, proporcionando beneficios de salud y rendimiento a las plantas de cultivo. Las relaciones simbióticas endófito-hospedador pueden proporcionar varios beneficios a la salud general y al estado físico de la planta hospedadora, tales como la mejora de la nutrición, una mayor tolerancia a la sequía y/o la defensa química de posibles herbívoros y, a menudo, una mayor producción de biomasa. Las micorrizas colonizadoras de la raíz sobreviven de los carbohidratos fotosintéticos de la planta y, a cambio, ayudan en la solubilización y absorción de agua y minerales al hospedador, lo que puede llevar a la promoción de la germinación de semillas y el crecimiento de las plantas. Adicionalmente, la asociación de un endófito fúngico con una planta hospedadora a menudo proporciona protección frente a patógenos o tolerancia para varios estreses bióticos y abióticos, tales como la infestación de insectos, el pasto, deficiencias de agua o de nutrientes, estrés por calor, toxicidad por sal o aluminio y temperaturas de congelación. Se cree que el crecimiento, la promoción del estado físico y la protección se logran a través de múltiples propiedades beneficiosas de la asociación endófito-hospedador.

Estos endófitos fúngicos proporcionados en la Tabla 1 se recolectaron originalmente como endófitos fúngicos del algodón. Estos hongos endófitos pueden inocularse para vivir dentro del algodón utilizando la demanda de semillas, hojas o suelo y presentan efectos sorprendentemente beneficiosos al proporcionar protección contra la infestación de plagas. Las plagas pueden ser plagas de nemátodos y/o plagas de insectos. Además, estos hongos endófitos tienen un efecto beneficioso inesperado sobre el rendimiento del algodón.

Se describe la aplicación de hongos beneficiosos para establecerlos endofíticamente dentro de las plantas de cultivo para mejorar el rendimiento y la productividad de la planta al tiempo que confiere protección contra las plagas de insectos y nemátodos. En este sentido, la presente divulgación supera las limitaciones de la técnica anterior, tales como la susceptibilidad de los hongos a la degradación por la luz UV, la desecación o el calor después de la exposición al medio ambiente tras la aplicación como suelo inundante o biopesticida foliar. La inoculación y el establecimiento endofítico de los hongos dentro de la planta los protege de la luz ultravioleta, la desecación y temperaturas desfavorables, mientras albergan los hongos en los tejidos de las plantas que están destinados a proteger. La introducción de hongos para vivir endofíticamente dentro de las plantas no requiere modificación genética de la planta o de los microorganismos, y los hongos en sí pueden ser una fuente de productos naturales. En diversas realizaciones, el inoculante fúngico puede formularse y aplicarse, por ejemplo, como tratamiento de semillas, en aplicaciones de surcos, antes o durante la siembra, o como aplicación foliar después de la germinación de la planta, y después de la inoculación, los endófitos fúngicos proporcionan efectos protectores durante toda la temporada y mayores rendimientos de los cultivos (aproximadamente un 25 % más). En determinadas realizaciones, el aumento del rendimiento es de aproximadamente el 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 30 %, 40 %, 45 %, 50 %, o más del 50 % en relación con un cultivo al que no se le ha aplicado una composición endófita. En realizaciones adicionales, el aumento del rendimiento es el resultado de la reducción de la pérdida que comprende la reducción de la pérdida debido a la infestación de insectos o la sequía y la pérdida es inferior al 50 %, 40 %, 30 %, 20 %, 10 %, 5 % o 5 % en relación con un cultivo al que no se le ha aplicado composición endófita. En determinadas realizaciones, el cultivo es algodón y la reducción de la pérdida comprende un daño reducido en las cápsulas de algodón.

Por lo tanto, en un aspecto, la divulgación proporciona una combinación (también denominada "simbionte") de una planta hospedadora y un endófito que permite mejorar las propiedades agronómicas de las plantas hospedadoras. La combinación se puede lograr por inoculación artificial, aplicación u otra infección de una planta hospedadora o semillas de la misma, tal como una planta de algodón o semilla de la misma, o tejidos de plantas hospedadoras, con una cepa de endófitos fúngicos. Por lo tanto, una combinación lograda por tal inoculación se denomina combinación "sintética", composición sintética, revestimiento sintético de semillas, composición de semillas sintética resistente a plagas. El endófito fúngico puede estar presente en espacios intercelulares dentro del tejido vegetal, tal como la raíz. Su presencia también puede ocurrir o también puede mantenerse dentro de una planta o población de plantas mediante injerto u otros métodos de inoculación como el tratamiento de semillas, plantas o partes de las mismas con micelios endófitos o esporas endófitas. En determinadas realizaciones, la planta, parte de la planta, las raíces, las semillas o las hojas se esterilizan para eliminar microorganismos antes de aplicar el endófito. En realizaciones particulares, las semillas se esterilizan para eliminar endófitos naturales antes de añadir las composiciones endófitas descritas en el presente documento. En determinados aspectos, la capacidad de la semilla para germinar no se ve afectada por la esterilización.

La divulgación también proporciona métodos para detectar la presencia del endófito fúngico dentro de una planta hospedadora. Esto puede lograrse, por ejemplo, mediante el aislamiento del ADN total de los tejidos de una posible combinación planta-endófito, seguido por PCR, o como alternativa, análisis por transferencia de Southern, análisis por transferencia de Western u otros métodos conocidos en la materia, para detectar la presencia de secuencias de ácidos nucleicos o de aminoácidos específicos asociados con la presencia de una cepa de endófito fúngico de la presente divulgación. Como alternativa, los métodos bioquímicos tales como ELISA, HPLC, TLC o ensayos de metabolitos fúngicos se pueden utilizar para determinar la presencia de una cepa endófita de la presente divulgación en una muestra dada de tejido de cultivo. Adicionalmente, los métodos de identificación pueden incluir análisis microscópico, tal como tinción de raíces o métodos de cultivo, tales como pruebas de crecimiento u otros métodos conocidos en la materia (Deshmukh et al. 2006 Proc Natl Acad Sci EE.UU. 103 (49). En realizaciones particulares, las raíces de una posible combinación de planta de hierba y endófito se pueden teñir con cepas específicas de hongos, tales como WGA-Alexa 488, y se analizan microscópicamente para determinar los asociados de raíces fúngicas.

En determinadas realizaciones, las cualidades agronómicas pueden seleccionarse del grupo que consiste en: aumento de biomasa, aumento de macollaje, aumento de la masa de la raíz, aumento de la floración, aumento del rendimiento de la semilla y mayor resistencia a estreses bióticos y/o abióticos, cada una de estas cualidades se clasifica en comparación con plantas de otro modo idénticas cultivadas en las mismas condiciones, y que difieren solo con respecto a la presencia o ausencia de un endófito fúngico. Las combinaciones y métodos sintéticos de la presente divulgación pueden aplicarse para responder a estreses reales o anticipados. Tales estreses pueden incluir, por ejemplo, sequía (déficit de agua), frío, estrés por calor, deficiencia de nutrientes, toxicidad de sal, toxicidad de aluminio, pastoreo por herbívoros, infestación de insectos, infección por nemátodos e infección fúngica, bacteriana o vírica, entre otros.

La presente divulgación proporciona, en una realización, endófitos fúngicos seleccionados de los de la Tabla 1 que afectan negativamente a la reproducción de los herbívoros e insectos que se alimentan de hojas sobre el suelo (áfidos de algodón, Aphis gossypii) y de nemátodos parásitos de plantas que atacan las raíces bajo tierra (nemátodos de nudos radiculares, Meloidogyne incógnita). Además, se puede observar un mejor rendimiento y productividad de la planta en plantas de control colonizadas frente a las no colonizadas en ensayos de campo que emplean el tratamiento de semillas con dichos endófitos. La mejora del crecimiento de las plantas y el aumento de la resistencia a los nemátodos del nudo radicular se demostró en el algodón, por ejemplo, empleando Chaetomium globosum como endófito en ensayos de invernadero. Además y como otro ejemplo ilustrativo no limitante, utilizando Beauveria bassiana como endófito en algodón, se demostraron reducciones en la reproducción de insectos (áfido de algodón) se demostró en ensayos de invernadero y de campo. La presencia endofítica de Paecilomyces lilacinus y Beauveria bassiana también tuvo efectos negativos en el comportamiento de selección del hospedador de las principales plagas de chinches chupadoras (Lygus hesperus y Nezara viridula) que atacan el desarrollo de flores y frutos en la planta de algodón. Además, en ensayos de campo utilizando Beauveria bassiana como endófito en el algodón, se demostraron efectos positivos sobre el rendimiento de la planta y mayores productividades en plantas por endófitos frente a las plantas de control no colonizadas.

Las diferencias metabolómicas entre las plantas se pueden detectar utilizando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, una muestra biológica (tejido entero, exudado, savia del floema, savia de xilema, exudado de raíz, etc.) de las plantas asociadas a endófitos y de las plantas agrícolas de referencia se puede analizar esencialmente tal como se describe en Fiehn et al., (2000) Nature Biotechnol., 18, 1157-1161, o en Roessner et al., (2001) Plant Cell, 13, 11 29. Tales métodos metabolómicos se pueden usar para detectar diferencias en los niveles de hormonas, nutrientes, metabolitos secundarios, exudados de raíz, contenido de savia del floema, contenido de savia de xilema, contenido de metales pesados y similares.

En otra realización, la presente divulgación contempla métodos para recubrir la semilla de una planta con una pluralidad de endófitos, así como composiciones de semillas que comprenden una pluralidad de endófitos sobre y/o en la semilla. Estos métodos se pueden realizar de manera similar a los descritos en el presente documento para un único recubrimiento de los endófitos. En un ejemplo, se pueden preparar múltiples endófitos en una sola preparación que se recubre sobre la semilla. Los endófitos pueden ser de un origen común (es decir, una misma planta). Como alternativa, los endófitos pueden ser de diferentes plantas.

Cuando múltiples endófitos están recubiertos sobre la semilla, cualquiera o todos los endófitos pueden ser capaces de conferir un rasgo beneficioso a la planta hospedadora. En algunos casos, todos los endófitos son capaces de conferir un rasgo beneficioso a la planta hospedadora. El rasgo conferido por cada uno de los endófitos puede ser el mismo (por ejemplo, ambos mejoran la tolerancia de la planta hospedadora a un estrés biótico particular), o pueden ser distintos (por ejemplo, uno mejora la tolerancia de la planta hospedadora a la sequía, mientras que otro mejora la utilización de fosfato). En otros casos, el rasgo conferido puede ser el resultado de interacciones entre los endófitos.

Definiciones

En la descripción y las tablas del presente documento, se utiliza una serie de términos. Para proporcionar una comprensión clara y coherente de la memoria descriptiva y de las reivindicaciones, se proporcionan las siguientes definiciones. A menos que se indique otra cosa, los términos deben entenderse de acuerdo con el uso convencional por los expertos en la técnica relevante.

Cuando se proporciona un término en singular, los autores de la invención también contemplan aspectos de la invención descritos por el plural de ese término. La forma singular "un", "una", y "el" o "la" incluyen referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por ejemplo, el término "una célula" incluye una o más células, incluyendo mezclas de las mismas.

El término "que comprende" pretende significar que las composiciones y los métodos incluyen los elementos citados, pero no excluyen otros. "Que consiste esencialmente en" cuando se usa para definir las composiciones y los métodos, significará excluir otros elementos de cualquier significado esencial para la combinación. Por lo tanto, una composición que consista esencialmente en los elementos tal como se definen en el presente documento no excluiría los contaminantes traza del método de aislamiento y purificación y los vehículos aceptables para la agricultura. "Que consiste en" significará excluir más elementos traza de otros ingredientes y etapas sustanciales del método para aplicar las composiciones de la presente invención. Las realizaciones definidas por cada uno de estos términos de transición están dentro del alcance de la presente invención.

Control biológico: la expresión "control biológico" y su forma abreviada "biocontrol", tal como se usa en el presente documento, se define como el control de una plaga, patógeno, insecto o cualquier otro organismo indeseable mediante el uso de al menos un endófito.

Se pretende que una "composición" signifique una combinación de agente activo y al menos otro compuesto, vehículo o composición, inerte (por ejemplo, un agente o marcador detectable o vehículo líquido) o activo, tal como un pesticida.

Tal como se usa en el presente documento, una "semilla agrícola" es una semilla utilizada para cultivar plantas en la agricultura (una "planta agrícola"). La semilla puede ser de una planta monocotiledónea o dicotiledónea, y se planta para la producción de un producto agrícola, por ejemplo granos, un alimento, fibra, etc. Tal como se usa en el presente documento, una semilla agrícola es una semilla que está preparada para plantar, por ejemplo, en granjas para el cultivo. Las semillas agrícolas se distinguen de las semillas de productos básicos en que las primeras no se utilizan para generar productos, por ejemplo, productos vegetales básicos.

Tal como se usa en el presente documento, un "producto vegetal básico" se refiere a cualquier composición o producto que se compone de material derivado de una planta, semilla, célula vegetal, o parte de la planta. Los productos vegetales básicos pueden venderse a los consumidores y pueden ser viables o no viables. Los productos básicos no viables incluyen, entre otros, semillas y granos no viables; semillas procesadas, partes de semillas y partes de plantas; tejido vegetal deshidratado, tejido vegetal congelado y tejido vegetal procesado; semillas y partes de plantas procesadas para alimentación animal para consumo de animales terrestres y/o acuáticos, aceite, comida, harina, copos, salvado, fibra y cualquier otro alimento para consumo humano o animal; y biomasas y productos combustibles. Cualquiera de estos productos vegetales básicos de la presente invención puede contener al menos una cantidad detectable del ADN específico y único correspondiente a los endófitos descritos en el presente documento. Se puede usar cualquier método convencional de detección de moléculas de polinucleótidos, incluidos los métodos de detección desvelados en el presente documento.

Tal como se usa en el presente documento, la frase "plantas agronómicamente de élite" se refiere a un genotipo o a una variedad de cultivo con un fenotipo adaptado para cultivo comercial. Los rasgos compuestos por una planta agronómicamente de élite pueden incluir el rendimiento de biomasa, carbohidratos y/o de semillas; resistencia al estrés biótico o abiótico, incluyendo resistencia a la sequía, resistencia a insectos, resistencia a hongos, resistencia a virus, resistencia a bacterias, tolerancia al frío y tolerancia a la sal; estabilidad mejorada, mayor eficiencia en el uso de nutrientes y menor contenido de lignina.

En determinadas realizaciones, las plantas de algodón agronómicamente de élite incluyen, por ejemplo, las variedades de algodón conocidas AM 1550 B2RF, NG 1511 B2RF, NG 1511 B2RF, FM 1845LLB2, FM 1944GLB2, FM 1740B2F, PHY 499 WRF, PHY 375 WRF, PHY 367 WRF, PHY 339 WRF, PHY 575 WRF, DP 1252 B2RF, DP 1050 B2RF, DP 1137 B2RF, DP 1048 B2RF, y/o DP 1137 B2RF.

Tal como se usa en el presente documento, la frase "filtrado de cultivo" se refiere a caldo o medio obtenido de cultivos inoculados con una cepa de hongos y que se dejan crecer. Los medios generalmente se filtran para eliminar las células suspendidas, dejando los nutrientes, hormonas u otras sustancias químicas.

Tal como se usa en el presente documento, el término "endófito" se refiere a un organismo capaz de vivir dentro de una planta o tejido vegetal. Un endófito puede comprender un organismo fúngico que puede conferir un aumento en el rendimiento, biomasa, resistencia o aspecto físico en su planta hospedadora. Los endófitos fúngicos pueden ocupar los espacios intracelulares o extracelulares del tejido vegetal, incluyendo las hojas, los tallos, las flores o las raíces.

La frase "resistencia a las plagas" se refiere a inhibir o reducir el ataque de las plagas. La resistencia a las plagas proporciona al menos un cierto aumento en la resistencia a las plagas sobre lo que ya posee la planta.

Tal como se usa en el presente documento, el término "genotipos" se refiere a la constitución genética de una célula u organismo.

Tal como se usa en el presente documento, el término "fenotipo" se refiere a las características detectables de una célula u organismo, cuyas características son la manifestación directa o indirecta de la expresión génica.

Tal como se usa en el presente documento, la frase "planta hospedadora" se refiere a cualquier planta que coloniza un hongo endófito. En determinadas realizaciones, la planta hospedador comprende la progenie de la planta colonizada.

Tal como se usa en el presente documento, la frase "rendimiento aumentado" se refiere a un aumento en la biomasa o el peso de la semilla, el tamaño de semilla o fruto, el número de semillas por planta, el número de semillas por unidad de área, bushels por acre, toneladas por acre, kilo por hectárea, rendimiento de carbohidratos o rendimiento de algodón. Tal rendimiento aumentado es relativo a una planta o cultivo que no ha sido inoculado con el endófito. En determinadas realizaciones, el aumento del rendimiento es relativo a otros tratamientos de plagas comúnmente utilizados u otros métodos para abordar el estrés biótico o abiótico.

Tal como se usa en el presente documento, la frase "biomasa" significa la masa o peso total (fresco o seco), en un momento dado, de un tejido vegetal, tejidos de plantas, una planta completa, o población de plantas, generalmente se da como peso por unidad de área. El término también puede referirse a todas las plantas o especies en la comunidad (biomasa comunitaria).

Tal como se usa en el presente documento, "adhesivo" se refiere a compuestos para mejorar la unión de esporas a la superficie de la semilla. Los ejemplos no limitantes de tales compuestos son el ácido algínico, carragenano, dextrina, dextrano, pelgel, polietilenglicol, polivinilpirrolidona, metilcelulosa, alcohol polivinílico o gelatina.

Tal como se usa en el presente documento, un excipiente o vehículo "agrícolamente aceptable" es aquel que es adecuado para su uso en agricultura sin efectos secundarios adversos indebidos para las plantas, para el medio ambiente, o para los humanos o los animales que consumen los productos agrícolas resultantes derivados de los mismos en proporción razonable con una relación beneficio/riesgo.

Tal como se usa en el presente documento, el término "sintético" o la frase "combinación sintética" se refiere a una combinación artificial que incluye micelios y/o esporas de un endófito que es o que lleva a una relación endofítica hongo-hospedador (también llamado "simbionte") de una planta hospedadora y un endófito. La combinación sintética se puede lograr, por ejemplo, por inoculación artificial, aplicación u otra infección de una planta hospedadora, semillas de la planta hospedadora o tejidos de la planta hospedadora con el endófito. Además, la combinación de la planta hospedadora y un endófito se puede lograr inoculando el suelo o los medios de cultivo de la planta.

Tal como se usa en el presente documento, un microbio aislado es un microbio que está aislado de su entorno natural, y lleva consigo la inferencia de que el aislamiento fue realizado por la mano del hombre. Un microbio aislado es uno que se ha separado de al menos algunos de los componentes con los que estaba asociado anteriormente (ya sea en la naturaleza o en un entorno experimental).

Tal como se usa en el presente documento, se considera que un microbio es "natural" de una planta o una porción de la planta, y se dice que está "naturalmente" presente en la planta o en una porción de la planta, si esa planta o porción de la planta contiene el microbio, por ejemplo, en ausencia de cualquier contacto con la preparación de microbios.

Algunos de los métodos descritos en el presente documento permiten la colonización de semillas de plantas por microbios. Tal como se usa en el presente documento, se dice que un microbio "coloniza" una planta o semilla cuando puede existir en una relación simbiótica o no perjudicial con la planta en el entorno de la planta, por ejemplo sobre y/o dentro de una planta, incluyendo la semilla.

Una "población" de plantas, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una pluralidad de plantas que crecieron a partir de las semillas recubiertas con los endófitos tal como se describe en el presente documento, o son descendientes de una planta o grupo de plantas que se sometieron a los métodos de inoculación. Las plantas dentro de una población normalmente serán de la misma especie, y también generalmente compartirán una derivación genética común

Ejemplos

Ejemplo 1: Creación de suspensiones de esporas y tratamiento de semillas

Cultivo de plantas y cepas de hongos endófitos: La variedad de semilla de algodón utilizada en realizaciones particulares fue la variedad LA122 (disponible de All-Tex Seed, Inc., Levelland, TX 79336). Paecilomyces lilacinus y Chaetomium globosum se obtuvieron de plantas de algodón tal como se describe (Ek-Ramos et al. 2013, PLoS ONE 8(6): e66049. doi:10.1371/journal.pone.0066049). Los expertos en la materia pueden obtener endófitos adecuados para realizar las diversas realizaciones de la presente invención realizando los procedimientos descritos en la misma. En resumen, las muestras de plantas se enjuagaron con agua corriente y se esterilizaron en superficie por inmersión en etanol al 70 % durante 5 minutos, con solución de lejía al 10 % durante 3 minutos, y se enjuagar dos veces con agua destilada en autoclave. Las muestras se secaron mediante transferencia utilizando toallas de papel esterilizadas en autoclave. Cinco hojas, cuadrados y cápsulas individuales esterilizados en superficie (N = 15 muestras totales) se seleccionaron al azar y se imprimieron en agar fresco de dextrosa de patata (PDA) y medios V8 como una forma de controlar la eficacia de la esterilización de la superficie. Para el aislamiento de endófitos, las hojas se cortaron en pequeños fragmentos de aproximadamente 1 cm2 Los cuadrados y las cápsulas se cortaron en seis piezas. Se eliminó cualquier fibra presente y se cortó en seis piezas más pequeñas. Los fragmentos de hojas se colocaron boca abajo en placas medianas con PDA y V8 por triplicado. Cada placa contenía 3 fragmentos de hojas para un total de 9 fragmentos analizados por planta. Para los cuadrados recolectados a principios de la temporada, se colocaron 3 cortes por cuadrado en medio de PDA y V8 como con los fragmentos de hoja. Debido a la similitud en tamaño y ubicación dentro de una planta, cuando se recoge más tarde en la temporada, los cuadrados y las cápsulas de una planta dada se colocaron en placas de Petri que contenían dos cortes de cuadrados, dos cortes de cápsulas y dos pedazos de fibra. Los antibióticos Penicilina G (100 unidades/ml) y Estreptomicina (100 pg/ml) (Sigma, St Louis, MO, EE.UU.) se añadieron a los medios para suprimir el crecimiento bacteriano. Todas las placas se incubaron en la oscuridad a temperatura ambiente durante, en promedio, dos semanas hasta que se detectó el crecimiento de hifas del endófito fúngico a partir de tejidos vegetales.

Para la identificación se empleó una combinación inclusiva de identificación morfológica y molecular de endófitos fúngicos. Una vez que se detectaron hifas fúngicas que crecían a partir del material vegetal, se tomaron muestras para obtener aislados puros de hongos. Para la identificación por PCR, se extrajo el ADN genómico del micelio de cada cepa fúngica aislada, siguiendo un protocolo de cloroformo:alcohol isoamílico a 24:1 y se usaron cebadores específicos de hongos para amplificar la región ITS (espaciador de tránscrito interno) del ADN ribosómico nuclear. Esta región es el marcador de código de barras principal para hongos e incluye las regiones ITS 1 e ITS2, separadas por el gen ribosómico 5,8S. Para evitar la introducción de sesgos durante la PCR (sesgo de taxonomía e introducción de desajustes), se ha sugerido amplificar solo la región ITS1, por lo tanto, se usaron los cebadores ITS1 (5 'TCC GTA GGT GAA CCT GCG G 3') (SEQ ID NO: 5) e ITS2 (5 'GCT GCG TTC TTC ATC GAT GC 3') (SEQ ID NO: 6) para amplificar y secuenciar la región ITS1 de aproximadamente 240 pb de cada una de las cepas fúngicas aisladas. Las secuencias resultantes se alinearon como secuencias de consulta con las bases de datos disponibles públicamente de los nucleótidos de GenBank, UNITE y PlutoF. Las dos últimas se compilan específicamente y se utilizan para la identificación de hongos. La Tabla 1 proporciona un listado de endófitos. Todos estos endófitos pertenecen al filo Ascomycota, subfilo Pezizomycotina, salvo Phanerochaete crassa, que pertenece al filo Basidiomycota, subfilo Agaricomycotina, y Pseudozyma sp, que pertenece al filo Basidiomycota, subfilo Ustilaginomycotina. La Tabla 1 muestra la especie/género, familia, orden, subclase, clase, y la SEQ ID NO se corresponde con la región ITS1 de aproximadamente 240 pb para cada una de las cepas fúngicas aisladas, salvo Beauveria bassiana, Aspergillus parasiticus, Lecanicillium lecanii, y Paecilomyces lilacinus, en donde las secuencias mostradas incluyen las secuencias de ITS1, ITS2, 5,8S, 18S y 28S y se obtuvieron de la base de datos UNITE para los números de GenBank JF837090, JX857815, FJ643076 y EU553283, respectivamente.

Tabla 1: endófitos

continuación

TABLA 1 Listado de endófitos:

Acremonium alternatum, Alternaría alternata, Alternaría brassicae, Alternaría compacta, Alternaría dianthi, Alternaría longipes, Alternaría malí, Alternaría sesamí, Alternaría solaní, Alternaría sp., Alternaría tenuíssíma, Ascomycota sp., Bipolaris spicifera, Cercospora canescens, Cercospora capsici, Cercospora kikuchii, Cercospora zinnia, Chaetomium globosum, Chaetomium piluliferum, Chaetomium sp., Cladosporium cladosporioides, Cladosporium sp., Cladosporium uredinicola, Cochliobolus sp, Phanerochaete crassa, Phoma americana, Phoma subherbarum, Phomopsis liquidambari, Phomopsis sp., Pleospora sp., Pleosporaceae sp., Polyporales sp., Preussia africana, Preussia sp., Pseudozyma sp., Pyrenophora teres, Colletotrichumcapsici, Coniolariella gamsii, Coniothyrium aleuritis, Coniothyrium sp., Corynespora cassiicola, Diaporthe sp., Diatrype sp., Drechslerella dactyloides, Embellisia indefessa, Epicoccum nigrum, Epicoccum sp., Exserohilum rostratum, Fusarium chlamydosporum, Fusarium sp., Gibellulopsis nigrescens, Gnomoniopsis sp., Lewia infectoria, Mycosphaerella coffeicola, Mycosphaerellaceae sp., Nigrospora oryzae, Nigrospora sp., Nigrospora sphaerica, Paecilomyces sp., Penicillium citrinum, Retroconis sp., Rhizopycnis sp., Schizothecium inaequale, Stagonospora sp., Stemphylium lancipes, Thielavia hyrcaniae, Thielavia sp., Ulocladium chartarum, Verticillium sp., Beauveria bassiana, Aspergillus parasiticus, Lecanicillium lecanii, Paecilomyces lilacinus.

Beauveria bassiana se cultivó a partir de una cepa obtenida comercialmente (disponible de Botanigard). Beauveria bassiana, Paecilomyces lilacinus, y Chaetomium globosum se cultivaron en medio agar de dextrosa de patata (PDA). Las soluciones madre de concentración de esporas de cada hongo se prepararon añadiendo 10 ml de agua estéril a las placas de hongos y raspándolas del agar con un bisturí estéril. El micelio resultante y las esporas obtenidas se filtraron luego en un vaso de precipitados estéril utilizando una estopilla para filtrar el micelio, creando así soluciones madre. Se usó un hemocitómetro para medir y calcular las concentraciones de esporas de las soluciones madre. Las concentraciones deseadas se crearon por dilución, y las semillas se colocaron en suspensiones de esporas con las concentraciones de esporas deseadas. En diversas realizaciones, las concentraciones finales de tratamiento pueden ser aproximadamente 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108o 109 esporas/ml que pueden alcanzarse mediante diluciones seriadas en agua estéril o en una solución o tampón apropiado.

Para la inoculación de semillas, las semillas se esterilizaron en superficie antes de sumergirlas en suspensiones de esporas con la concentración deseada por inmersión de las semillas en etanol al 70 % durante 3 minutos con agitación constante seguida de incubación en NaOCl al 2 % durante 3 minutos; seguido de tres lavados en agua estéril. El tercer lavado con agua estéril se colocó en placa sobre medio de agar de dextrosa de patata (PDA) para confirmar que la esterilización de la superficie era eficaz. Luego se remojaron las semillas durante 24 horas en vasos de precipitados que contenían suspensiones de esporas con dos concentraciones diferentes de hongos. Las semillas del grupo de control se trataron solo con agua estéril. Las concentraciones de esporas para Beauveria bassiana eran cero (control), 1x106 (tratamiento 1) y 1x109 (tratamiento 2) y para Paecilomyces lilacinus o Chaetomium globosum eran cero (control), 1x106 (tratamiento 1) y 1x107 (tratamiento 2). Estos vasos de precipitados se incubaron durante 24 horas a 32 °C en una cámara de cultivo hasta el día siguiente para la plantación (24 horas).

Las semillas remojadas se plantaron en suelo mixto L22 (Instituto Borlaug, Texas A&M). Todas las plantas se cultivaron en un invernadero de laboratorio a ~ 28 °C con un fotoperíodo de luz natural. No hubo fertilización de las plantas, y el riego se realizó de manera consistente en todos los tratamientos según era necesario.

Inoculación directa de semillas: En realizaciones particulares, las semillas individuales y el suelo circundante pueden inocularse directamente con la solución de esporas (102-103, 103-104, 104-105, 106-107 o 107-108 esporas/ml) en la plantación antes de cubrir la semilla con tierra.

En diversas realizaciones, puede emplearse cualquier tratamiento de semillas o plantas que sea adecuado para la aplicación de agentes biológicos a semillas o plantas y conocido por expertos en la materia.

Ejemplo 2: Aplicación de esporas de endófitos como una composición de polvo seco.

Además de la aplicación de una solución de esporas para el tratamiento de semillas, los endófitos o esporas de endófitos también se pueden aplicar como polvo seco o usando un agente adhesivo como la metilcelulosa para el tratamiento de semillas. En determinadas realizaciones, la concentración puede ser de al menos 105, 106, 107, 108, 109, o de más unidades formadoras de colonias o esporas/g de peso seco.

En determinadas realizaciones, los endófitos se pueden cultivar en medios de cultivo de hongos en un fermentador. Los fragmentos de micelios o esporas de endófitos se pueden recoger, secar y moler. También se puede añadir un adhesivo tal como caboximetilcelulosa al material endofítico molido.

En ciertas realizaciones, la relación en peso entre el material endofítico y el adhesivo puede estar entre 1:10-50, 1:50-100, 1: 100-500, o 1:500-1000 para obtener el recubrimiento de semillas o el material de inoculación de semillas. Este material de inoculación de semillas se puede aplicar a las semillas. En diversas realizaciones, la relación en peso entre el material de inoculación de semilla y la semilla puede ser 1:10-50, 1:50-100, 1:100-500, 1:500-1000 o 1:1000-5000.

Ejemplo 3: Tratamientos de endófitos en el suelo (en surcos)

La aplicación de drenaje en el suelo (en surcos) puede realizarse aplicando una composición endófita a la superficie del suelo y/o semilla durante la plantación. En realizaciones particulares, la composición de endófito puede comprender una suspensión de endófito o una formulación de polvo seco de endófito. En diversas realizaciones, el endófito puede comprender micelios y/o esporas. En realizaciones particulares, la aplicación de drenaje en el suelo puede comprender aplicar la composición de endófito a la superficie del suelo directamente encima de cada semilla. En determinadas realizaciones, la composición de endófito puede comprender 0,01-0,1, 0,1-1, o 1-10 ml de suspensión de endófito, que puede ser una suspensión de esporas de endófitos.

Inoculación del suelo: En determinadas realizaciones, las semillas se pueden plantar en suelo inoculado. El inóculo se puede obtener multiplicando el endófito en los medios de crecimiento fúngico. Los medios de crecimiento fúngico pueden ser medios de agar de dextrosa de patata (PDA). En otras realizaciones, los medios de crecimiento fúngico pueden ser como los granos de trigo. En un ejemplo no limitante, se pueden lavar y remojar 100 g de grano de trigo durante la noche en agua estéril. El exceso de agua se puede drenar, las semillas se pueden secar sobre papel de cocina, envasarlas en un matraz cónico de 500 ml y esterilizarlas en autoclave a 15 psi durante 1 hora. Se puede inocular un mililitro de la suspensión de esporas de hongos endófitos (107 esporas/ml) en el matraz y los cultivos se pueden incubar a 25 °C durante 2 semanas. Para evitar aglomeraciones, los matraces se pueden agitar vigorosamente para separar el grano y romper el tapete micelial. Se pueden colocar aproximadamente 5 g de inóculo en el suelo en la plantación. En determinadas realizaciones, el inóculo se puede colocar en el suelo al mismo tiempo o dentro de 1 mes de plantar las semillas. En determinadas realizaciones, las semillas pueden comprender semillas esterilizadas.

Ejemplo 4: Tratamientos foliares con endófitos

Las plantas se inocularon mediante aplicación foliar en la tercera etapa de hojas verdaderas rociando la superficie de las hojas completamente expandidas para escurrirlas con una suspensión de esporas (108 esporas/ml) usando un pulverizador de mano de plástico (1 litro). En determinadas realizaciones, se realizaron suspensiones de esporas de endófitos en agua. En determinadas realizaciones, el agua se suplementó con un detergente. En un ejemplo particular no limitante, la suspensión de esporas contenía Triton X 100 al 0,02 % como detergente.

El tratamiento foliar con endófitos se puede realizar utilizando cualquier método adecuado conocido por un experto en la materia. En particular, el tratamiento foliar con endófitos se puede realizar usando un pulverizador que rocía directamente las hojas con una suspensión de endófitos, que puede ser una suspensión de esporas de endófitos. La Fig. 9 demuestra que la aplicación foliar de algodón en el campo con esporas de hongos entomopatógenos endofíticos mejoró el rendimiento de la planta. Las semillas de algodón (variedad FM1740B2F) se trataron con varios fungicidas típicos (Metalaxil, Triadimenol, Trifloxiestrobina, 2-(Tiocianometiltio)benzotioazol) e insecticidas (Tiodicarb, Iimidacloprid, Cloropirifós) y las semillas tratadas se plantaron y cultivaron en condiciones de campo. Las plantas se rociaron en la 5a etapa de hoja verdadera con soluciones acuosas de Beauveria bassiana y Paecilomyces fumosoroseus. La sacarosa se incluyó (1 % en peso/vol) como un recurso nutricional adicional para los hongos. Se observó una retención significativamente mayor de cápsula de primera posición (desarrolladoras de fruto) en plantas rociadas con Beauveria bassiana sin sacarosa y P. fumosoroseus más sacarosa.

Ejemplo 5: Confirmación de colonización de plantas por hongos endófitos

Las plantas se colocaron individualmente en bolsas de plástico, que se marcaron con el número de planta, el tratamiento y número final de áfidos, y se almacenaron a 4 °C hasta el día siguiente para confirmación del endófito. La mitad de cada planta se utilizó para colocar en placas en agar PDA y la otra mitad se liofilizó para realizar ensayos de diagnóstico de PCR para la confirmación de los endófitos. El protocolo de esterilización de la superficie y el cultivo en placa del tercer lavado con agua estéril en PDA para probar la contaminación de la superficie se realizó como se describió anteriormente. Para ensayos de diagnóstico de PCR, el tejido vegetal se liofilizó y se extrajo el ADN utilizando el protocolo CTAB (Doyle y Doyle, 1987, Phytochemistry Bulletin 19:11-15). Las secuencias de cebadores de oligonucleótidos sintetizadas se basaron en una búsqueda BLAST del NCBI correspondiente a los resultados de la secuencia de cultivo de laboratorio aislados (Ek-Ramos et al. 2013). Secuencias de oligonucleótidos de sentido y antisentido para Beauveria bassiana fueron: 5'-CGGCGGACTCGC^cC^cAGCCCG-3' (SEQ ID NO:1) y 5'-CCGCGTCGGGGTTCCGGTGCG-3' (SEQ ID NO:2) respectivamente. Los oligonucleótidos utilizados para amplificar Paecelomyces lilacinus fueron: 5' CTCAGTTGCCTCGGCGGGAA 3' (SEQ ID NO:3) y 5' GTGCAACTCAGAGAAGAAATTCCG 3' (SEQ ID NO:4).

El protocolo de PCR consistió en una etapa de desnaturalización a 95 °C durante 5 minutos, seguido de la alineación de oligonucleótidos a 56 °C durante 2 minutos y una etapa de extensión de 7 minutos a 72 °C con un total de 35 ciclos. Los productos de PCR se visualizaron en un gel de agarosa al 2 % que contenía bromuro de etidio al 1 %. La electroforesis se realizó a 70 voltios durante 30 minutos.

Ejemplo 6: Los hongos endófitos se pueden manipular en el campo

Durante el verano se realizó un ensayo de campo utilizando aislados de Paecilomyces lilacinus y Beauveria bassiana. Un diseño en bloques aleatorizado con cinco parcelas replicadas que fueron plantadas con semillas que fueron inoculadas remojándolas durante 9 horas en tres concentraciones diferentes de esporas acuosas (0, 106 o 108 esporas/ml) del endófito candidato (como Paecilomyces lilacinus o Beauveria bassiana). Cada parcela constaba de cuatro hileras de 15,24 m (40 pies), cada uno separado por 101,6 cm (40 in).

Eficiencia de colonización: En la primera etapa de hojas verdaderas, se muestrearon al azar cuatro plantas de cada parcela para un total de 20 plantas por tratamiento y se analizó la colonización por cada uno de los endófitos candidatos. Las frecuencias de colonización se determinaron incubando los fragmentos de raíz, tallo y hojas esterilizados en superficie en medios PDA y observando el crecimiento de los hongos. Las frecuencias de colonización se documentaron como el número de plantas por grupo de tratamiento con al menos un fragmento de planta colonizado positivamente.

La alta frecuencia de colonización endofítica de plántulas por Paecilomyces lilacinus o Beauveria bassiana demuestra que la presencia de endófitos específicos puede manipularse en condiciones de plantación en campo (Fig. 1).

Ejemplo 7: Ensayo de reproducción de áfidos de algodón

Una colonia de A. gossypii se crió en algodón en cestas en un invernadero mantenido a aproximadamente 28 °C con fotoperíodo de luz natural. Las ninfas del segundo estadio se colocaron directamente sobre plantas de algodón tratadas con endófitos y sobre plantas de control. Se utilizaron diez plantas por grupo de tratamiento y se colocaron diez áfidos por planta. Después de que se inoculasen las plantas con los áfidos, las plantas se colocaron en macetas de plástico individuales de 45 x 20 cm y se sellaron con una malla no-see-um (Eastex products, NJ) para evitar el movimiento de áfidos de una planta a otra. En una realización, las plantas utilizadas tenían 13 días de edad, aproximadamente en la primera etapa de hojas verdaderas, y se dejó que los áfidos se reprodujesen durante siete días en condiciones de invernadero. En otra realización, se dejó que los áfidos se reprodujesen durante 14 días en plantas que inicialmente tenían 20 días de edad al comienzo del experimento, aproximadamente en la tercera etapa de hojas verdaderas. Al final de cada realización, se contó y se registró el número de áfidos por planta individual. La presencia de Beauveria bassiana o Paecilomyces lilacinus como un endófito en algodón redujo significativamente la reproducción de los áfidos del algodón en plantas tratadas con endófito frente a plantas de control no tratadas (Fig. 4A, 4B, y Fig. 5)

Ejemplo 8: Los endófitos fúngicos reducen la reproducción de los nemátodos

Las plantas germinaron de semillas tratadas y de control no tratadas en una cámara ambiental y luego se trasplantaron al suelo en macetas 11 días después de la plantación. Se tomaron muestras de dos plántulas replicadas por tratamiento para examinar la eficacia de colonización de endófitos mediante esterilización superficial y se colocaron en placas de agar PDA. Las plántulas del grupo de tratamiento con nemátodos se trataron con 2.000 o 10.000 huevos/planta el día seis después del trasplante. Las plantas fueron cosechadas y procesadas 6 semanas después de la inoculación con nemátodos. Se cuantificó el número de agallas por gramo de tejido radicular y el número total de huevos en la población para cada planta para comparar el rendimiento de nemátodos entre las plantas tratadas con endófito y sin tratar (control).

Las Fig. 2 y 3 demuestran que los hongos endófitos Paecilomyces lilacinus y Chaetomium globosum afectaron negativamente a la reproducción del nemátodo del nudo radicular (Meloidogyne incognita) cuando está presente como endófito en el algodón. A altos niveles de inóculo de nemátodos (10.000 huevos), Paecilomyces lilacinus redujo la producción de huevos en plantas después del tratamiento de semillas con soluciones que contienen 106 o 107 esporas/ml en comparación con las semillas de control no tratadas. A niveles de inóculo de campo (2000 huevos), la presencia de Paecilomyces lilacinus redujo significativamente la producción de agallas y huevos a ambas concentraciones de tratamiento de semillas. El endófito Chaetomium globosum afecta negativamente a la reproducción de nemátodos del nudo radicular. Los efectos negativos del endófito Chaetomium globosum en la formación de agallas de nemátodos del nudo radicular y la producción de huevos se demostraron después de tratamientos de remojo de semillas de algodón en soluciones de 0 (controles no tratados), 106 y 108 esporas/ml. Ejemplo 9: Efecto de los endófitos fúngicos sobre los insectos

Las plantas tratadas con endófitos y de control se cultivaron a partir de semillas de algodón no transgénicas (Gossypium hirsutum)(variedad LA122, AllTex Seed Co.). Las semillas se remojaron durante 24 horas en vasos de precipitados que contenían soluciones de 108 esporas/ml de los hongos utilizados más agua estéril solo como control. Los vasos de precipitados se colocaron en una cámara de cultivo a 32 °C durante la noche (aprox. 9 h) hasta la plantación al día siguiente. Las plantas se cultivaron tanto en condiciones de invernadero como en condiciones de campo. Las plantas de invernadero germinaron primero en bandejas de plántulas y luego se transfirieron a macetas de 30 cm. Las plantas cultivadas en el campo se plantaron y crecieron simultáneamente.

Ensayos de comportamiento: Se realizaron ensayos de comportamiento de sin selección y con selección para comparar la respuesta de las chinches opacas de las plantas occidentales (L. hesperus) y de las chinches verdes apestosas (N. viridula) a cuadrados y cápsulas de plantas tratadas y no tratadas con endófitos. Los ensayos se realizaron a 30 °C en placas de Petri de 10 cm de diámetro con una capa delgada de agar al 2 % en el fondo para proporcionar humedad a los cuadrados (ensayos con L. hesperus) y a las cápsulas (ensayos con N. viridula) de plantas experimentales ofrecidas a los insectos durante las observaciones. Para ensayos sin selección, se insertó un solo cuadrado o cápsula por la base en el agar en el centro del plato. Se colocó un solo insecto adulto joven (1-7 días después de la muda) en cada plato y se cubrió con la parte superior. Se observó un total de 30 insectos en cada ensayo con N=10 insectos cada uno en los grupos de tratamiento con Beauveria bassiana, Paecilomyces lilacinus y control. Los ensayos sin selección de L. hesperus se repitieron cuatro veces (N = 40 por tratamiento) con cuadrados de plantas cultivadas en invernadero utilizados en todos los ensayos menos uno. Los ensayos sin selección de N. viridula se repitieron tres veces (N = 20 por tratamiento) con cápsulas de plantas cultivadas en invernadero utilizadas en un ensayo.

Los ensayos de selección se realizaron en condiciones similares utilizando los mismos escenarios, pero con dos cuadrados de igual tamaño (L. hesperus) o cápsulas (N. viridula) colocados a 4 cm de distancia en el centro de la placa de Petri. Los dos cuadrados o cápsulas por escenario eran de una planta de control no tratada y de una planta tratada con Beauveria bassiana o con Paecilomyces lilacinus. Se observó un total de 20 insectos en cada ensayo, con N = 10 cada uno en el grupo de tratamiento de Beauveria bassiana frente al de control y en el de Paecilomyces lilacinus frente al de control. Los ensayos de selección con L. hesperus y N. viridula se replicaron dos veces (N = 20 por tratamiento) con cuadrados de plantas cultivadas en campo en todos los ensayos.

Los insectos se observaron durante 6 horas por ensayo utilizando un procedimiento de muestreo puntual para los ensayos con selección y sin selección. Las observaciones preliminares indicaron que los insectos de ambas especies eran más activos al comienzo del ensayo, por lo tanto, se adoptó un programa de muestreo por etapas con observaciones registradas a intervalos de 5 minutos al principio del ensayo (0-60 min), intervalos de 15 minutos en el medio (61-180 min) e intervalos de 30 minutos al final (181-360 min) en el ensayo. En cada intervalo de muestreo, los insectos fueron registrados ya sea fuera del cuadrado/cápsula o alimentándose o descansando sobre el cuadrado/cápsula.

Análisis de datos: En los ensayos sin selección, la proporción de insectos observados alimentándose o descansando sobre cuadrados de algodón (L. hesperus) o cápsulas (N. viridula) se comparó entre los grupos de tratamiento en cada punto de observación a lo largo de la duración del ensayo usando la prueba de los rangos con signo de Wilcoxon. Para probar la variación en las respuestas a lo largo del tiempo, para cada individuo, se calculó la proporción de observaciones, ya sea de alimentación o sobre la muestra de la planta, para los períodos temprano (0 60 min), medio (61-180 min) y tardío (181-360 min) del ensayo y se comparó entre los grupos de tratamiento utilizando un análisis de varianza (ANOVA) de medidas repetidas con el grupo de tratamiento con endófitos como factor principal y el tiempo como efecto repetido. La frecuencia observada de los individuos que no logran hacer contacto con los cuadrados o las cápsulas de las plantas tratadas con endófitos se comparó con la frecuencia esperada de los individuos que no lo hicieron en función del grupo de control utilizando una prueba X2. Entre los insectos que hicieron contacto con un cuadrado o una cápsula, se comparó el tiempo hasta el primer contacto (latencia) entre los grupos de tratamiento utilizando una ANOVA de una vía. Todos los análisis, incluidas las pruebas de normalidad y homogeneidad de las variaciones, se realizaron en SPSS 21 (SPSS Inc.).

Resultados de los ensayos sin selección de L. hesperus: Durante la duración del ensayo, se observó una proporción significativamente mayor de individuos de L. hesperus a lo largo del tiempo en contacto y alimentándose de los cuadrados de plantas de control no tratadas en relación con los de cualquiera de los grupos tratados con los endófitos Beauveria bassiana o Paecilomyces lilacinus (prueba de rangos con signo de Wilcoxon, P <0,0001 para ambas comparaciones) (Figura 6A). El ANOVA de mediciones repetidas indicó un efecto significativo del tiempo (F¹¹¹⁶= 86,175; P <0,001) con una mayor proporción de insectos en contacto con el cuadrado a medida que avanzaba el ensayo (Figura 6B). También hubo un efecto significativo del tratamiento con endófitos (F^2,116= 4,929; P = 0,009) sin interacción significativa de tratamiento con endófito X tiempo (F^2,116= 1,015; P = 0,366). De los 40 insectos en cada grupo de tratamiento, el 12,5% del grupo de control no pudo hacer contacto con el cuadrado durante el transcurso del ensayo, mientras que un 35 % y un 32,5 % significativamente más altos de los insectos de grupos de tratamiento con Beauveria bassiana y Paecilomyces lilacinus, respectivamente, no pudo hacer contacto (prueba X2, P <0,0001). Entre los insectos que hicieron contacto con un cuadrado, hubo una diferencia significativa en la latencia al primer contacto entre los grupos de tratamiento (F^2,85= 7,225; P <0,0001) con el grupo de control presentando una latencia de contacto más corta que cualquiera de los grupos de tratamiento con los endófitos Beauveria bassiana (prueba posthoc LSD; P = 0,001) o Paecilomyces lilacinus (prueba LSD posthoc; P = 0,006 (Fig. 6A).

Resultados de los ensayos con selección de L. hesperus: En ensayos con selección simultánea, los individuos de L. hesperus seleccionaron cuadrados de plantas de control no tratadas con mayor frecuencia que los de plantas tratadas con endófitos. Las relaciones de respuesta fueron significativamente mayores que 0,5 durante la duración de los ensayos, lo que indica que los insectos seleccionaron de manera no aleatoria las cápsulas de las plantas de control sobre las cápsulas de las plantas colonizadas endofíticamente por cualquiera de (A) Beauveria bassiana (P <0,0001; Prueba de rangos con signo de Wilcoxon) o (B) Paecilomyces lilacinus (P <0,0001; prueba de rangos con signo de Wilcoxon) (Fig. 6B).

Resultados de los ensayos sin selección de N. viridula: Durante la duración del ensayo, una proporción significativamente mayor de individuos de N. viridula a lo largo del tiempo en contacto con y alimentándose de cápsulas de plantas de control no tratadas en relación con las de cualquiera de los grupos de tratamiento con los endófitos Beauveria bassiana o Paecilomyces lilacinus (prueba de rangos con signo de Wilcoxon, P <0,0001 para ambas comparaciones) (Fig. 7A). El ANOVA de mediciones repetidas indicó un efecto significativo del tiempo (F¹¹¹⁶= 86,175; P <0.001) con una mayor proporción de insectos en contacto con el cuadrado a medida que avanzaba el ensayo (Figura 1), También hubo un efecto significativo del tratamiento con endófitos (F²,na = 4,929; P = 0,009) sin interacción significativa de tratamiento con endófito X tiempo (F²,na = 1,015; P = 0,366). De los 40 insectos en cada grupo de tratamiento, el 12,5% del grupo de control no pudo hacer contacto con el cuadrado durante el transcurso del ensayo, mientras que un 35 % y un 32,5 % significativamente más altos de los insectos de grupos de tratamiento con Beauveria bassiana y Paecilomyces lilacinus, respectivamente, no pudo hacer contacto (prueba X2, P <0,0001). Entre los insectos que hicieron contacto con un cuadrado, hubo una diferencia significativa en la latencia al primer contacto entre los grupos de tratamiento (F^2,85= 7,225; P <0,0001) con el grupo de control presentando una latencia de contacto más corta que cualquiera de los grupos de tratamiento con los endófitos Beauveria bassiana (prueba posthoc LSD; P = 0,001) o Paecilomyces lilacinus (prueba LSD posthoc; P = 0,006 (Fig. 7B).

Ejemplo 10: Se conservan más cápsulas después del tratamiento con endófitos

Durante el ensayo de campo, la fenología y el desarrollo del algodón se cuantificaron utilizando un sistema de mapeo e información de la planta desarrollado específicamente para que el algodón rastree el desarrollo y la retención de la fruta por la planta como un medio para controlar el desarrollo y el estrés de la planta (COTMAN ™, Cotton Inc.). Una medida del estrés del algodón es la retención de flores en desarrollo (cuadrados) y frutos (cápsulas) en la primera posición de fructificación en las ramas. Los cuadrados y cápsulas de primera posición se midieron en 5 plantas por fila en dos filas en cada una de las cinco parcelas replicadas (N = 10 plantas por parcela) para cada grupo de tratamiento.

La Fig.10 demuestra que a principios de la temporada de cultivo, cuando las flores comienzan a desarrollarse, se observó una tendencia a una mayor retención de cuadrados en las plantas tratadas con endófito en relación con los controles. Esta tendencia continuó más adelante en la temporada como lo demuestra la retención de cápsulas significativamente mayor entre los grupos de tratamiento con endófitos en relación con las plantas de control no tratadas.

La Fig. 8 demuestra la reducción en el daño de las cápsulas de algodón durante los ensayos de campo. En relación con las plantas de control, los niveles de daño de las cápsulas asociado a los insectos fueron más bajos entre las plantas que fueron tratadas remojando semillas en soluciones de esporas de Beauveria bassiana y Paecilomyces lilacinus a concentraciones de 106 y 108 esporas/ml. Efectos positivos de los hongos endófitos en el rendimiento de la planta de algodón en condiciones de campo.

Ejemplo 11: El tratamiento con endófitos aumenta el rendimiento

Al final del ensayo de campo que emplea tratamiento de endófitos y plantas de tratamiento, las parcelas se cosecharon a máquina con un recogedor de 1 hilera. Sorprendentemente, los rendimientos finales en la cosecha fueron significativamente más altos de lo esperado (25 % más que los controles no tratados). Inesperadamente, el tratamiento con Paecilomyces lilacinus o Beauveria bassiana dio como resultado rendimientos más altos que las plantas de control sin tratar, independientemente de la concentración inicial de tratamiento de semillas. (Fig. 11) Ejemplo 12: El tratamiento con endófitos del sorgo aumentó el crecimiento en la GH

El efecto de las composiciones microbianas descritas sobre el sorgo se probó en un ensayo de plántulas. Las semillas de sorgo bicolor se esterilizaron en superficie usando etanol y lejía como se describe en el Ejemplo 1 para el algodón. Se prepararon tres cepas (B. bassiana, P. fumosoroseus, y P. lilacinus) como suspensiones de conidios a 107 conidios/ml, y se recubrieron con las semillas de sorgo como se describe en el Ejemplo 1. Las semillas de control se remojaron en agua estéril en lugar de una suspensión de conidios. Las semillas plantadas se mantuvieron en condiciones de cámara de crecimiento constante durante dos semanas a una replicación de 10. Al final de las dos semanas, las plantas se retiraron de la cámara de crecimiento y se midió la altura de la planta y la biomasa. La Fig. 12A muestra el aumento en la altura de la planta cuando se aplica con la composición microbiana descrita en relación con el control (p <0,05). La Fig. 12B muestra el aumento de la biomasa vegetal en plantas cultivadas a partir de semillas que se trataron con la composición microbiana descrita en relación con el control (p <0,05).

Ejemplo 13: El tratamiento con endófitos fúngicos modula las frecuencias de colonización de endófitos naturales

Para determinar si los tratamientos de semillas con endófitos podrían alterar el microbioma de la planta cultivada a partir de la semilla, se trataron las semillas de algodón con suspensiones de esporas de Paecilomyces lilacinus o Beauveria bassiana. Las plantas se cultivaron en el campo como parte de un ensayo de campo y se mantuvieron bajo prácticas agrícolas convencionales. Los hongos endofíticos se aislaron en medios PDA por separado del tallo/hoja sobre el suelo esterilizado en la superficie y del tejido de la raíz debajo del suelo para evaluar los cambios en la comunidad microbiana. La comparación que se muestra en la Fig. 13 es relativa a las comunidades de hongos endófitos en plantas de control no tratadas. Los resultados muestran que estos tratamientos pueden alterar las tasas de colonización de endófitos fúngicos naturales.

Los tratamientos con endófitos fúngicos pueden alterar las frecuencias de colonización de cualquiera de los endófitos fúngicos presentes de forma natural en las plantas. Para determinar qué otros endófitos naturales pueden verse afectados por los tratamientos de semillas con hongos endófitos, se evaluó la identidad de los endófitos fúngicos del algodón aislados de plantas de dos variedades comerciales de algodón. CG3787B2RF y PHY499WRF. Las muestras se obtuvieron durante un ensayo de variedades cerca de Lubbock, Texas, Estados Unidos identificado como Lubbock-RACE. Se recolectó una sola hoja sana de cada una de las nueve plantas individuales muestreadas por variedad en múltiples parcelas replicadas dispuestas en un diseño de bloques aleatorizados para controlar la variación espacial en el campo. Para identificar las especies de hongos endófitos, se extrajo el ADN genómico completo y la región del espaciador interno transcrito (ITS) del ADN ribosómico se amplificó como un código de barras para 454 pirosecuenciación utilizando los cebadores de fusión universal ITS1F directo e ITS2 inverso. Los hongos endófitos identificados en este experimento, junto con los que se muestran en la Fig. 13, se enumeran en la Tabla 2.

Tabla 2: Endófitos fúngicos naturales que pueden ser alterados por tratamientos de semillas con otros endófitos fún icos

continuación

Ejemplo 14: El tratamiento de semillas con endófitos fúngicos lleva a la modulación de los niveles de fitohormonas en plantas cultivadas a partir de la semilla.

Para determinar si el tratamiento de semillas con endófitos fúngicos afecta a los niveles de fitohormonas en plantas cultivadas a partir de la semilla, se recolectó tejido de la raíz o de la tercera hoja verdadera de plantas de algodón inoculadas con los endófitos Beauveria bassiana o Paecilomyces lilacinus. El experimento se realizó con tres tratamientos endófitos (control no colonizado, B. bassiana o P. lilacinus) y, para Beauveria bassiana, dos tratamientos de herbívoros (sin áfidos o con áfidos herbívoros durante 1, 4, 8, 24 o 48 horas). Se evaluaron mediante LC-MS en tejidos de hoja y raíz por separado los niveles de fitohormonas para el ácido abscísico (ABA), ácido tuberónico (12-OH-JA, un producto de oxidación de JA-Ile) (TA), ácido ascórbico (AA), ácido 12-oxofitodienoico (un precursor de JA) (OPDA), JA-isoleucina (JA-Ile) y ácido salicílico (SA). Todas las comparaciones de los niveles de fitohormonas se hicieron frente a las plantas en el grupo de control no colonizado con significación de P <0,05. Los niveles de fitohormonas en plantas cultivadas a partir de semillas tratadas con Beauveria bassiana se muestran en la Tabla 3, y los niveles de fitohormonas en plantas cultivadas a partir de semillas tratadas con Paecilomyces lilacinus se muestran en la Tabla 4.

T l : Niv l fi h rm n n l n liv rir mill r n B v ri i n

T l 4: Niv l fi h rm n n l n liv rir mill r n P il m lil in

Ejemplo 15: Los tratamientos de semillas con endófitos fúngicos alteran los rasgos de ciertas variedades de cultivo de algodón en ensayos de campo

Los ensayos de campo de 2014 se ejecutaron de manera similar a la descrita en el Ejemplo 6. Durante el verano se realizó un ensayo de campo con los aislamientos que se enumeran a continuación. Cada parcela constaba de cuatro hileras de 15,24 m (40 pies), cada uno separado por 101,6 cm (40 pulgadas), y hubo 6 parcelas replicadas por tratamiento. El rendimiento de las parcelas tratadas con las composiciones microbianas descritas se comparó con respecto a las parcelas de control no tratadas. Para los trips, esta evaluación de daños se realizó en una escala de 0 a 5; 0 = sin daños, 1 = cicatrices de alimentación notables, pero sin retraso en el crecimiento, 2 = alimentación notable y retraso del crecimiento del 25 %, 3 = alimentación con terminales de hojas ennegrecidas y retraso en el crecimiento del 50 %, 4 = alimentación severa y retraso del crecimiento del 75 %, y 5 = alimentación severa y retraso del crecimiento del 90 %. Para las pulguillas, el número de insectos por planta se cuantificó y se documentó como un promedio para cada parcela. La Fig. 14 muestra la mejora del rendimiento de los cultivos cuando se tratan con las composiciones microbianas descritas, para las variedades de Delta Pine y Phytogen, respectivamente. La Fig. 15 muestra la mejora del rendimiento agregado de los microbios a través de las dos variedades de cultivo. Las barras representan intervalos de confianza del 95 %. La Fig. 16A muestra el efecto beneficioso de 12 de 15 composiciones microbianas probadas en daños por trips en la variedad de cultivo Delta Pine. En la variedad de cultivo Phytogen, solo 2 de las 15 composiciones microbianas probadas mostraron un beneficio al reducir el daño por trips. La Fig. 16B muestra el efecto beneficioso de reducir el daño de las pulguillas en la variedad de cultivo Phytogen, en donde 6 de los 15 endófitos fúngicos facultativos probados mostraron una disminución promedio en el daño por pulguillas en comparación con las plantas de algodón no tratadas. En la variedad de cultivo Delta Pine, solo una composición microbiana mostró un efecto beneficioso sobre el daño de la pulguilla.

También se evaluaron una serie de otros rasgos de plantas de mitad de temporada en el campo para determinar el efecto de las composiciones de endófitos fúngicos descritas. La Fig. 17A muestra el aumento beneficioso de las composiciones microbianas descritas sobre la longitud media de la raíz a mitad de temporada. La Fig. 17B muestra el aumento beneficioso de las composiciones de endófitos fúngicos descritas sobre el peso subterráneo a mitad de temporada. La Fig. 18 muestra el aumento beneficioso de las composiciones de endófitos fúngicos descritas sobre la temperatura de la copa a mitad de temporada para las variedades de cultivo Delta Pine y Phyton. La Fig. 19 muestra el aumento beneficioso de las composiciones de endófitos fúngicos descritas sobre el n Dv I (Índice de Vegetación de Diferencia Normalizada) de mitad de temporada para las variedades de cultivo Delta Pine y Phytogen. El NDVI es una medida del contenido de clorofila. La Fig. 20 muestra el aumento beneficioso de las composiciones de endófitos fúngicos descritas sobre la retención de cuadrados de primera posición a mitad de temporada tanto para las variedades de cultivo Delta Pine y Phytogen. La Fig. 21 y la Fig. 22 muestran la modulación (hacia arriba en julio y hacia abajo en agosto) de la altura de la planta a mitad de temporada cuando se trata con las composiciones de endófitos fúngicos descritas para las variedades de cultivo Delta Pine y Phytogen. La Fig. 23 muestra un aumento de la biomasa en las plantas tratadas con endófitos (mitad derecha de la imagen) en comparación con el control no tratado (mitad izquierda de la imagen).

En las figuras 15 a la 22, TAM505 es Acremonium sp., TAM32 es Epicoccum nigrum, TAM534 es Cladosporium urdinicola, TAM244 es Cladosporium sp., TAM514 es Cladosporium urdinicola, TAM474 es Cladosporium cladosporoides, TAM554 es Chaetomium globosum, TAM15 es Exserohilum sp., TAM488 es Epicoccum nigrum, TAM452 es Cladosporium urdinicola, TAM490 es Paecilomyces lilacinus, TAMBB es Beauveria bassiana, TAM105 es Cochliobolus sp., TAM189 es Bipolaris sp., y TAM47 es Epicoccum nigrum.

Ejemplo 16: Los tratamientos de semillas con endófitos fúngicos proporcionan tolerancia a la sequía en variedades de cultivo de algodón en ensayos de invernadero

Las plantas de algodón germinaron a partir de semillas de control tratadas con endófitos y sin tratar en el invernadero. Todas las semillas se regaron durante 7 días o hasta la etapa de cotiledón utilizando un volumen de agua de saturación de suelo predeterminado por planta. A los 7 DDP, el agua se retuvo de las plantas con estrés hídrico mientras que los controles continuaron siendo regados. El tiempo hasta el marchitamiento y el tiempo hasta la muerte se midieron a un máximo de 21 DDP. Los datos en la Figura 24 muestran el tiempo medio para marchitarse, y los datos en la Figura 25 muestran el tiempo medio hasta la muerte. El tratamiento con endófitos aumentó la supervivencia de las plantas sometidas a estrés por sequía tanto en las variedades de cultivo Delta Pine (DTP) como Phytogen (PHY). En las Figuras 24 y 25, el endófito número 194 es Epicoccum nigrum, 249 es Cladosporium cladosporioides, 355 es Chaetomium globusum, 46 es Epicoccum sp., 463 es Cladosporium sp., 534 es Cladosporium uredinicola, 554 es Chaetomium globosum, 58 es Epicoccum nigrum, y el control es sin tratamiento con endófitos.

Ejemplo 17: Identificación de endófitos fúngicos con al menos un 97 % de identidad con los de la Tabla 1

Todos los endófitos fúngicos conocidos con un 97 % de identidad con la SEQ ID NO: 7 hasta la SEQ ID NO: 77 se identificaron y se enumeran aquí por número de registro: FJ425672, AY526296, JQ760047, UDB014465, KC662098, HQ649874, JQ764783, EU881906, KF251285, JQ862870, AB019364, AB594796, JF773666, JN034678, KC343142, EU707899, AB627855, GU138704, JN695549, DQ279491, HM776417, AB361643, DQ782839, AF222826, EU682199, DQ782833, EU054429, FJ025275, AY354239, AF222828, GU721921, GU721920, DQ093715, AJ309335, FR774125, JQ747741, EF042603, KC968942, HE584924, AY740158, FJ645268, HQ692590, GQ203786, AY233867, HE579398, AB777497, KF435523, DQ420778, JQ649365, AJ271430, GQ996183, EF070423, FJ172277, AF483612, JX675127, EF070420, EF070421, AB741597, JN 225408, DQ019364, KF251279, EF194151, EU977196, JX981477, EU686115, JX021531, FJ527863, AJ302451, AJ302455, JN975370, EU754952, AF284388, KF296855, AF502785, JX317207, AF502781, DQ278915, EU686867, KC179120, HM991270, AF284384, DQ632670, JQ759806, JQ747685, EU885302, GU721781, EF434047, EF505854, JQ666587, JQ619887, GQ919270, KF531831, AB627854, DQ914679, DQ914681, HQ599592, DQ279490, DQ660336, JX069862, AB607957, HE820869, FJ859345, JX966567, GU910230, AB627850, JX144030, DQ914723, HM595556, KC771473, DQ849310, EU179868, KF312152, JN890447, JX042854, EU554174, JN198518, HM992813, JQ845947, KF251310, JQ758707, AM930536, KF296912, JN865204, JN943512, GQ921743, EU245000, EU977304, EU144787, HE579322, HE579402, GU910171, HE792919, KC960885, DQ485941, JN604449, HQ607913, AF502620, DQ468027, JX944132, JN207338, JQ922240, JN207336, JX559559, JN207330, JN207333, HE820882, JX969625, HQ339994, JF744950, HE584937, JN120351, JX298885, DQ872671, AJ877102, JQ081564, DQ019391, AF071342, EF104180, JQ759755, GU827492, JN418769, GU324757, JX984750, JX256420, KF436271, JX205162, JN712450, KF435911, GU367905, JX416919, KC315933, JQ736648, AY904051, A F404126, FJ466722, HE584965, JN890282, HE584966, HQ166312, KC305124, HE977536, KC305128, AY907040, 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KF193449, AF178544, AM262354, AB540567, AY627787, HE792907 HE579333, EU445372, AF362069, GU973687, HM053663, AB374284, DQ062977, GU237797, JQ760783 EF029240, HM751829, FM200445, AY953383, AY233922, JF742784, HM626650, FN610871, JX155902, JX006065 AB566289, AF163078, AY344976, AB566287, AF282089, AY251441, AF395693, JQ761899, AJ315835, HQ187633 KC287233, AJ315831, HE820745, JN418779, M13906, JQ761896, AJ315838, AY536373, HQ328035, JX838793 JQ758986, HQ166357, JN163855, KC965595, JN545789, JN545788, GU944558, HE579247, KF296900, EF377335 KC965954, GU269703, AB095511, EF419913, DQ993641, AB325678, HQ223035, AY513945, FJ197013 FR799277, HM071900, JN207293, FJ025268, JQ758966, GU138733, GU138730, DQ267595, GQ919269 JF770450, GU138734, DQ279488, DQ279486, DQ242472, EU164804, EF104177, GU366726, KF212243 DQ923534, GU079598, JX987761, JX984765, AY585343, JQ769260, GU721919, DQ923538, EU686756 EU040222, U75626, GU004264, EU686753, JQ765651, JX270629, JN943408, EF042604, AJ271588, HE579386 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AB540550, EF394866, AY853245 EU680532, HQ450006, AM292674, KF435452, AF502638, JN890354, JX256427, JF773646, KC916704, FJ347031 JN572154, AF443850, AY273300, JQ247392, JQ247393, HQ316569, GU324760, AB120858, JF440978, HQ115719 JF440976, DQ124120, HQ022342, AF333138, AB255293, GQ999456, DQ286209, HE820785, AF451751 JN038479, JQ044421, JQ044422, KC968911, KC492447, FM172902, AF437754, HM030631, HM595545 AY510424, JX414184, HQ184179, AB588822, JQ813816, JQ813817, FJ025255, AY745019, EU668292, HM216214 AF427105, EU479799, JQ769257, HM484866, EU301059, EU564808, AY265329, HQ701737, KC677889 AY907030, GU721349, AY304513, GU062277, AY907037, HM484859, AB576865, JX090109, UDB004179 JN692542, JQ327868, AY756490, JN890185, JX042994, FJ613832, AF009815, HQ332534, AF009816, EU686781 DQ520639, KC247154, HE820841, HE820847, JN717228, JX944174, GU721348, AB444657, KF435560 JQ585546, JQ775577, UDB004443, JF744968, KF192823, JN102440, AM504058, JX164074, GU907781 HQ889707, FJ612980, KF251355, AF502854, AF350291, HQ649989, GU966521, FJ481149, AY916491, AB444663 FR799197, KC691458, HE820786, JN802324, AF149926, AY372686, AY233908, HQ631033, UDB004677 KF251596, EU479757, GU079602, KC691456, DQ420883, DQ914680, DQ914683, KC305134, JN207313 AB512307, JN807326, GQ395365, JN207256, FJ425678, AB000932, JN207252, KF293814, GU138728, AY160210 UDB015006, KC565735, FJ524302, AF404127, EU272486, JF796251, JF439458, AY304511, KC592278 JX143583, JF440977, EU686925, JX982370, EU687082, JX966607, GU222370, JN687988, JN006771, JX436806 JQ936201, KF481950, AF178551, KC181937, JX144778, DQ790541, JF796076, JX898576, JX418352, AF097902 FJ411320, AF309617, FR863589, HM469970, AF163069, KF582795, AB566293, HE820790, GQ267191, JX130356 JN049828, HM060596, KF436001, GQ919283, HQ832834, JN049822, EU041786, AB594789, HE579259 HE584944, GU004268, GU237770, GQ921765, HE579253, KC305158, AF043599, GQ267190, AY344968 JN601031, JN969420, GU328624, AB540507, AM691002, JN102384, EU480019, JN545815, DQ993651, JX130360 JX398990, AY969704, KF251559, AF395695, HQ449993, U94714, KF435968, JX966550, AB859762, JF749808 U94713, GU981750, AF177152, FJ430599, JQ647433, GU981756, GU981757, EF104164, JN802311, GQ266146 HQ445083, JX155909, KF436256, DQ318204, GU078649, JN890115, DQ386141, GQ999487, EU686744 FJ426983, UDB013022, FN435799, EF600976, HM596012, JF825143, AM711381, EU816668, AJ972833 JQ905735, AF004686, EU266103, EU266107, HQ166334, EF679384, UDB004580, AM691001, JX399012 KC460880, JX982437, AB482221, AM292048, KF251253, AF350308, JF502446, JQ905803, KC179320, KF251393 GU053815, DQ323686, DQ323681, KC343119, HE820747, KF251529, DQ676536, U17215, DQ278919, EU489950 FR668016, GU903287, AJ302439, AJ302438, AJ302435, AJ302434, JN807325, AB741584, KC790941, DQ394387 FJ403513, GQ461566, KF193491, KC305164, AF502895, GU237707, EU977520, AB247177, AB482220 AY929321, GU004278, AB247171, GU461294, GU461295, JX123570, AY684241, EU686968, JX944143 JN871718, JQ796813, HQ829122, KF435590, KC806231, JX414183, GU944858, AF502733, JN662314, HQ022970 AY510418, KC623569, KC216145, KF129059, DQ279515, KF251526, JN192379, JN192376, HM140630 DQ006928, AF011289, EU089663, FJ825373, DQ307292, JN890424, KF155521, AB670714, GQ927271 AB670717, AB670711, AB670713, KF435279, GU053814, KF435375, JX414188, AF033422, GU225946 EU520610, JF773645, KC595884, KC965570, DQ812921, EU885299, DQ078757, FJ612618, KF018920, JX077035 EU686911, JX270567, HE579352, EU885297, FJ418185, DQ914724, HQ608112, HQ450016, GU174399 JN890327, HM999913, GU079580, HE584936, JQ765675, GU726947, JQ765670, HM588120, AY969986 JN120335, JQ247384, HQ891112, JQ769297, JN207242, EU002888, EU479803, AY365468, AF163083 DQ534482, KC146356, KF436052, AF416460, JX537970, JX156018, AY907035, GQ241278, AF409972, JQ388941

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para mejorar un rasgo en una planta de algodón, comprendiendo el método: poner en contacto una semilla agrícola de dicha planta de algodón con una formulación que comprende endófitos fúngicos filamentosos facultativos, purificados y formadores de esporas, de al menos un Dothideomycetes no de Alternaría seleccionado de Cladosporium cladosporioides, Cladosporium uredinicola y Epicoccum nigrum y en donde los endófitos capaces de producir sustancias que son beneficiosas para las plantas o perjudiciales para las plagas o ambas, y en donde los endófitos están presentes en la formulación en una cantidad eficaz para modular las frecuencias de colonización de los endófitos del género Alternaria que son naturales de la planta de algodón, y para proporcionar un beneficio a la planta de algodón en comparación con una planta de algodón cultivada a partir de una semilla no tratada con los endófitos fúngicos facultativos de Dothidoemycetes no de Alternaría, en donde el beneficio es una mayor resistencia al estrés por sequía.

2. El método de la reivindicación 1, en donde el beneficio para las plantas de algodón derivadas de la semilla es un aumento del rendimiento en una población de dichas plantas en un 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 30 %, 40 % o 45 % en relación con una población de referencia de plantas de algodón cultivadas a partir de semillas no tratadas con endófitos fúngicos facultativos de Dothidoemycetes.

3. El método de la reivindicación 1, en donde el beneficio para las plantas de algodón derivadas de la semilla es una reducción de la pérdida de rendimiento en una población de dichas plantas en más del 40 %, 30 %, 20 %, 10 %, 5 % o 1 % en relación con una población de referencia de plantas de algodón cultivadas a partir de semillas no tratadas con endófitos fúngicos facultativos de Dothidoemycetes.

4. El método de la reivindicación 1, en donde el endófito está presente en la formulación en una cantidad eficaz para obtener al menos un 50 % de colonización de las hojas, tallos o raíces de una planta de algodón cultivada a partir de la semilla.

5. El método de la reivindicación 1, en donde la formulación comprende al menos 1, 2 o 3, especies de endófitos fúngicos facultativos.

6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende además envasar las semillas puestas en contacto en un recipiente.

7. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende además cultivar una población de dichas plantas de algodón, en donde el beneficio se mide a nivel de la población, en comparación con una población de plantas de referencia.

8. Una combinación sintética de semilla de algodón y una composición que comprende endófitos fúngicos filamentosos facultativos, purificados y formadores de esporas, de al menos una especie, en donde los endófitos son Dothideomycetes no de Alternariaseleccionado de Cladosporium cladosporioides, Cladosporium uredinicola y Epicoccum nigrum capaces de producir sustancias que son beneficiosas para las plantas o perjudiciales para las plagas o ambas, y en donde los endófitos fúngicos facultativos están presentes en la formulación en una cantidad eficaz para modular las frecuencias de colonización de los endófitos del género Alternaria que son naturales de la planta de algodón, y para proporcionar un beneficio a la planta de algodón en comparación con una planta de algodón cultivada a partir de una semilla no tratada con los endófitos fúngicos facultativos de Dothidoemycetes no de Alternaría, en donde el beneficio es una mayor resistencia al estrés por sequía.

9. La combinación sintética de la reivindicación 8, en donde el endófito está presente en la combinación sintética en una cantidad eficaz para obtener al menos un 50 % de colonización de las hojas, tallos o raíces de una planta de algodón cultivada a partir de la semilla.

10. La combinación sintética de la reivindicación 8, que comprende al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 cepas de endófitos.

11. La combinación sintética de la reivindicación 8, en donde el beneficio para las plantas de algodón derivadas de la semilla es un aumento del rendimiento en una población de dichas plantas en un 5 %, 10%, 15%, 20%, 30%, 40 % o 45 % en relación con una población de referencia de plantas de algodón cultivadas a partir de semillas no tratadas con endófitos fúngicos facultativos de Dothidoemycetes.

12. La combinación sintética de la reivindicación 8, en donde el beneficio para las plantas de algodón derivadas de la semilla es una reducción de la pérdida de rendimiento en una población de dichas plantas en más del 40 %, 30 %, 20 %, 10 %, 5 % o 1 % en relación con una población de referencia de plantas de algodón cultivadas a partir de semillas no tratadas con endófitos fúngicos facultativos de Dothidoemycetes.