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ES2755129T3 - Péptidos terapéuticos - Google Patents

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ES2755129T3
ES2755129T3 ES14824621T ES14824621T ES2755129T3 ES 2755129 T3 ES2755129 T3 ES 2755129T3 ES 14824621 T ES14824621 T ES 14824621T ES 14824621 T ES14824621 T ES 14824621T ES 2755129 T3 ES2755129 T3 ES 2755129T3
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mica
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antibodies
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Kai Wucherpfennig
Glenn Dranoff
F Hodi
Bettina Franz
Kenneth May
Christopher Harvey
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Original Assignee
Dana Farber Cancer Institute Inc
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Abstract

Un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo que se unen de manera inmunoespecífica a la secuencia A relacionada con polipéptido de clase I de MHC (MICA) que comprende una región variable de cadena pesada (VH) y una región variable de cadena ligera (VL), en donde la región VH comprende la CDR1 de VH, la CDR2 de VH y la CDR3 de VH como se muestran en la secuencia de aminoácidos de VH de la SEQ ID NO: 168; y en donde la región VL comprende la CDR1 de VL, la CDR2 de VL y la CDR3 de VL como se muestran en la secuencia de aminoácidos de VL de la SEQ ID NO: 170.

Description

DESCRIPCIÓN
Péptidos terapéuticos
Campo técnico
La presente invención se refiere a composiciones terapéuticas relacionadas con sujetos humanos.
Antecedentes
Los sujetos humanos expuestos a una enfermedad o una dolencia ofrecen una fuente de anticuerpos con potencial terapéutico y se conocen en la técnica métodos generales para obtener dichos anticuerpos. Sin embargo, los métodos para obtener de manera específica anticuerpos con potencial terapéutico normalmente se ven limitados por la baja frecuencia, la lenta velocidad de proliferación y los bajos niveles de secreción de anticuerpo de los linfocitos B que expresan dichos anticuerpos. Por ejemplo, los linfocitos B de memoria con especificidad definida normalmente representan una célula por cada millón de células mononucleares de sangre periférica o aproximadamente un mililitro de sangre (Lanzavecchia et al., Curr. Opin. Immunol., 21:298-304 (2009): Yoshida et al., Immunol. Rev., 237:117-139 (2010)). Es probable que la frecuencia de anticuerpos con potencial terapéutico sea incluso menor en pacientes con cáncer, lo que hace necesario el desarrollo de nuevas estrategias que permitan el aislamiento de dichas células con alta sensibilidad y eficacia.
Los métodos convencionales se basan generalmente en la conversión de linfocitos B de memoria en células secretoras de anticuerpos mediante cultivo in vitro y/o uso de modelos animales inmunizados (por ejemplo, ratones) (Crotty et al., J. Immunol., 171:4969-4973 (2003): Fecteau et al., Immunology, 128:e353-e365 (2009): Buisman et al., Vaccine, 28:179-186 (2009): Corti et al., PLoS One, 5:e8805 (2010)). Por ejemplo, después del cultivo in vitro durante hasta una semana, pueden medirse anticuerpos en los sobrenadantes de cultivo y evaluar la frecuencia de células secretoras de anticuerpos usando ensayo de puntos inmunosorbentes ligados a enzimas (ELISPOT). Se ha informado de limitaciones de dichos métodos (Henn et al., J. Immunol., 183:31777-3187 (2009): Cao et al., J. Immunol., Methods, 358:56-65 (2010)). Por ejemplo, el cultivo in vitro de linfocitos B de memoria altera el fenotipo de los linfocitos B de memoria para que se asemejen a células plasmáticas con distintas propiedades funcionales (Jiang et al., Eur. J. Immunol., 37:2205-2213 (2007): Huggins et al., Blood, 109:1611-1619 (2007): Jourdan et al., Blood, 114:5173-5181 (2009)). También se ha informado de limitaciones para los métodos fluorescentes basados en antígenos (Hofer et al., Immunol. Rev., 211:295-302 (2006): Odendahl et al., Blood, 105:1614-1621 (2005); Kunkel et al., Nat. Rev. Immunol., 3:822-829 (2003): Scheid et al., Nature, 458:636-640 (2009): Wu et al., Science, 329:856-861 (2010)).
Se necesitan métodos mejorados para obtener o dirigir de manera específica anticuerpos con potencial terapéutico.
MICA es un ligando para NKG2D, un receptor transmembrana de tipo II similar a lectina de tipo C expresado en la mayoría de células NK, linfocitos T y5 y linfocitos T CD8+ humanos. Tras el ligamiento, NKG2D señaliza a través de la proteína adaptadora DAP10 para evocar la citólisis dependiente de perforina y para proporcionar coestimulación. En los seres humanos, los ligandos de NKG2D incluyen la proteína A relacionada con la cadena de MHC de clase I (MICA), la MICB estrechamente relacionada, proteínas de unión a UL-16 (ULBP) 1-4 y RAE-1G. Aunque normalmente no se encuentran ligandos de NKG2D en tejidos sanos, varias formas de estrés celular, incluyendo daño en el ADN, pueden regular positivamente la expresión de ligando, dando como resultado su frecuente detección en múltiples neoplasias malignas sólidas y hematológicas, incluyendo melanoma. La activación de NKG2D mediante células transformadas positivas para ligando contribuye a la supresión tumoral extrínseca, ya que los ratones deficientes para NKG2D y de tipo silvestre tratados con anticuerpos anti-NKG2D manifiestan una susceptibilidad tumoral potenciada. Puede lograrse el escape inmunitario en los pacientes, sin embargo, por la secreción de ligandos de NKG2D por las células tumorales, lo que provoca la internalización de NKG2D superficial y la función deteriorada de los linfocitos citotóxicos. Los ligandos de NKG2D solubles también pueden estimular la expansión de linfocitos T reguladores NKG2D+CD4+Foxp3-, que pueden antagonizar la citotoxicidad antitumoral a través del ligando de Fas, IL-10 y TGF-p. MICA es un ligando de NKG2D dispersado por células tumorales, es decir, se libera de la superficie celular al medio circundante y el suero de pacientes con cáncer normalmente contiene niveles elevados de la forma soluble (sMICA). La dispersión de MICA se logra, en parte, mediante interacciones con la proteína disulfuro isomerasa ERp5, que forma un enlace disulfuro con una cisteína crítica que da como resultado el desplegamiento del dominio a3, haciendo que sea susceptible a la proteólisis por ADAM-10/17 y MMP14.
Se describen anticuerpos anti-MICA en el documento US 8.182.809 B1.
Existe la necesidad de identificar nuevos agentes que reconozcan específicamente y se unan a dianas de cáncer como terapia para el cáncer basada en inmunología. Dichos agentes serían útiles para la exploración de diagnóstico y la intervención terapéutica en patologías que están asociadas con el desarrollo tumoral.
Sumario
La presente invención se refiere a un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo que se unen de manera inmunoespecífica a la secuencia A relacionada con polipéptido de clase I de MHC (MICA) que comprende una región variable de cadena pesada (Vh) y una región variable de cadena ligera (Vl), en donde la región Vh comprende la CDR1 de VH, la CDR2 de VH y la CDR3 de VH como se muestran en la secuencia de aminoácidos de VH de la SEQ ID NO: 168; y en donde la región Vl comprende la CDR1 de Vl, la CDR2 de Vl y la CDR3 de Vl como se muestran en la secuencia de aminoácidos de Vl de la SEQ ID NO: 170.
En una realización, la región Vh del anticuerpo o el fragmento de anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 168 y/o la región Vl del anticuerpo o el fragmento de anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la s Eq ID NO: 170. En una realización particular de la invención, el anticuerpo comprende una región Vh que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 168; y una región Vl que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 170.
En una realización adicional, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la invención comprende:
(i) una CDR1 de VH que comprende la SEQ ID NO: 172;
una CDR2 de VH que comprende la SEQ ID NO: 174; y
una CDR3 de Vh que comprende la SEQ ID NO: 176; y
(ii) una CDR1 de Vl que comprende la SEQ ID NO: 179;
una CDR2 de Vl que comprende la SEQ ID NO: 181; y
una CDR3 de Vl que comprende la SEQ ID NO: 183.
De acuerdo con un aspecto de la invención, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo se une a un epítopo de la secuencia A relacionada con polipéptido de clase I de MHC (MICA) que comprende la secuencia de aminoácidos TCRASSFYPR (SEQ ID NO: 189).
De acuerdo con otro aspecto de la invención, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo,
(a) se une al dominio a3 de MICA;
(b) reduce los niveles de sMICA;
(c) inhibe la secreción de MICA por las células tumorales;
(d) inhibe la regulación negativa mediada por sMICA del receptor NKG2D en células NK;
(e) aumenta la lisis mediada por linfocitos NK de células tumorales; o
(f) una combinación de uno o más de (a)-(e).
La presente invención también se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpos o los fragmentos de anticuerpo de la invención y a las composiciones para su uso en el tratamiento del cáncer en un sujeto. De acuerdo con una realización particular, las composiciones comprenden además uno o más agentes adicionales seleccionados entre un inhibidor de histona desacetilasa (HDAC) seleccionado entre el grupo que consiste en ácido hidroxámico, vorinostat (ácido suberoilanilida hidroxámico, SAHA), tricostatina A (TSA), LAQ824, panobinostat (LBH589), belinostat (PXD101), ITF2357 italfarmaco SpA, tetrapéptido cíclico, depsipéptido (romidepsina, Fk228), benzamida; entinostat (SNDX-275/MS-275), MGCD0103, ácidos alifáticos de cadena corta (por ejemplo, ácido valproico, fenil butirato), AN-9, pivanex, CHR-3996, CHR-2845, inhibidor del proteasoma seleccionado entre el grupo que consiste en bortezomib, NPI-0052, carfilzomib (PR-171), CEP 18770 y MLN9708, un anticuerpo o péptido anti-CTLA-4, un anticuerpo o péptido anti-PD-1, un anticuerpo o péptido anti-PDL-1, un anticuerpo o péptido anti-OX40, un anticuerpo o péptido anti-GITR, un anticuerpo o péptido anti-LAG-3 y un anticuerpo o péptido anti-TIM-3.
Asimismo, la presente invención también se refiere a ácidos nucleicos aislados que codifican las regiones Vh y Vl del anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la invención.
A continuación, se divulgan diversos aspectos relacionados con los anticuerpos de la invención y anticuerpos adicionales con potencial terapéutico.
La divulgación proporciona además composiciones que comprenden péptidos que se unen de manera inmunoespecífica a la secuencia A relacionada con polipéptido de clase I del MHC (MICA) o un epítopo en la misma. En algunos aspectos, los péptidos de las composiciones incluyen la región determinante de la complementariedad (CDR) 3 de la VH del anticuerpo con la ID 11 o 12 mostrado en la tabla 1 que tiene 5 o menos sustituciones de aminoácidos conservativas y la CDR3 de la VL del anticuerpo con la ID 11 o 12 mostrado en la tabla 1 que tiene 5 o menos sustituciones de aminoácidos conservativas. En algunos aspectos, dichos péptidos incluyen la región determinante de la complementariedad (CDR) 3 de la VH del anticuerpo con la ID 11 o 12 mostrado en la tabla 1 y la CDR3 de la Vl del anticuerpo con la ID 11 o 12 mostrado en la tabla 1. En algunos aspectos, los péptidos incluyen demás la CDR2 de la Vh del anticuerpo con la ID 11 o 12 mostrado en la tabla 1 que tiene 5 o menos sustituciones de aminoácidos conservativas o la c DR2 de la Vl del anticuerpo con la ID 11 o 12 mostrado en la tabla 1 que tiene 5 o menos sustituciones de aminoácidos conservativas. En algunos aspectos, dichos péptidos incluyen la región determinante de la complementariedad CDR2 de la Vh del anticuerpo con la ID 11 o 12 mostrado en la tabla 1 o la CDR2 de la Vl del anticuerpo con la ID 11 o 12 mostrado en la tabla 1 o ambas. En algunos aspectos, los péptidos incluyen demás la CDR1 de la Vh del anticuerpo con la ID 11 o 12 mostrado en la tabla 1 que tiene 5 o menos sustituciones de aminoácidos conservativas o la CDR1 de la Vl del anticuerpo con la ID 11 o 12 mostrado en la tabla 1 que tiene 5 o menos sustituciones de aminoácidos conservativas. En algunos aspectos, dichos péptidos incluyen la región determinante de la complementariedad CDR1 de la Vh del anticuerpo con la ID 11 o 12 mostrado en la tabla 1 o la CDR1 de la Vl del anticuerpo con la ID 11 o 12 mostrado en la tabla 1 o ambas.
En algunos aspectos, los péptidos son un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que incluye: una cadena Vh con identidad respecto de la SEQ ID NO: 150 o 168, en donde las regiones correspondientes a la CDR1, la CDR2 y la CDR3 comprenden la CDR1, la CDR2 y la CDR3 de la Vh del anticuerpo con la ID 11 o 12 mostrado en la tabla 1 que tiene 5 o menos sustituciones de aminoácidos conservativas y las regiones en la SEQ ID NO: 150 o 168 que corresponden a la FR1, FR2, FR3, FR4, comprenden secuencias de aminoácidos con al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98, 99 % o 100 % de identidad respecto de la FR1, FR2, FR3, FR4 de la Vh del anticuerpo con la ID 11 o 12 mostrado en la tabla 1; y una cadena VL con identidad respecto de la SEQ ID NO: 152 o 170, en donde las regiones correspondientes a la CDR1, la CDR2 y la CDR3 comprenden la CDR1, la CDR2 y la CDR3 de la VL del anticuerpo con la ID 11 o 12 mostrado en la tabla 1 que tiene 5 o menos sustituciones de aminoácidos conservativas y las regiones en la SEQ ID NO: 152 o 170 que corresponden a la FR1, FR2, FR3, FR4, comprenden secuencias de aminoácidos con al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98, 99 % o 100 % de identidad respecto de la FR1, FR2, FR3, FR4 de la Vl del anticuerpo con la ID 11 o 12 mostrado en la tabla 1. En algunos aspectos, los péptidos incluyen un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que comprende una cadena Vh que comprende la SeQ ID NO: 150 o 168 y una cadena VL que comprende la SEQ ID NO: 152 o 170.
En algunos aspectos, la divulgación proporciona péptidos que son anticuerpos o fragmentos de anticuerpo que se unen a un epítopo en MICA que comprende la totalidad o una parte de un epítopo reconocido por los anticuerpos concretos descritos en el presente documento. En algunos aspectos, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno reconoce una región en el dominio a3 de MICA correspondiente a los aminoácidos 181 a 274 de la secuencia de referencia de MICA*009 (SEQ ID NO: 185). En algunos aspectos, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo se une al mismo epítopo que un anticuerpo que comprende una cadena Vh que comprende la SEQ ID NO: 131 y una cadena VL que comprende la SEQ ID NO: 133. En algunos aspectos, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo reconoce un epítopo que incluye al menos una porción de MICA de al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 aminoácidos que incluye o se solapa con la secuencia de aminoácidos GDVLPDGNGTYQTWVATRIC (SEQ ID NO: 186). En algunos aspectos, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo se une al mismo epítopo que un anticuerpo que comprende una cadena Vh que comprende la SEQ ID NO: 113 y una cadena VL que comprende la SEQ ID NO: 115. En algunos aspectos, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo reconoce un epítopo que incluye al menos una porción de MICA de al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 aminoácidos que incluye o se solapa con la secuencia de aminoácidos NVETEEWTVP (SEQ ID NO: 187). En algunos aspectos, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo se une al mismo epítopo que un anticuerpo que comprende una cadena Vh que comprende la SEQ ID NO: 150 y una cadena VL que comprende la SEQ ID nO: 152. En algunos aspectos, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo reconoce un epítopo que incluye al menos una porción de MICA de al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 aminoácidos que incluye o se solapa con la secuencia de aminoácidos TVPPMVNVTR (SEQ ID NO: 188). En algunos aspectos, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo se une al mismo epítopo que un anticuerpo que comprende una cadena Vh que comprende la SEQ ID NO: 168 y una cadena VL que comprende la SEQ ID NO: 170. En algunos aspectos, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo reconoce un epítopo que incluye al menos una porción de MICA de al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 aminoácidos que incluye o se solapa con la secuencia de aminoácidos TCRASSFYPR (SEQ ID NO: 189). En algunos aspectos, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo se une al mismo epítopo que un anticuerpo que comprende una cadena Vh que comprende la SEQ ID NO: 77 y una cadena VL que comprende la SEQ ID nO: 79. En algunos aspectos, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo se une al mismo epítopo que un anticuerpo que comprende una cadena Vh que comprende la SEQ ID NO: 2 y una cadena VL que comprende la SEQ ID NO: 11. En algunos aspectos, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo se une al mismo epítopo que un anticuerpo que comprende una cadena Vh que comprende la SEQ ID NO: 96 y una cadena VL que comprende la SEQ ID NO: 98.
En algunos aspectos, además de los péptidos, las composiciones incluyen además uno o más (por ejemplo, 12, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o menos de 20) agentes terapéuticos anticáncer. En algunos aspectos, las composiciones se formulan como composiciones farmacéuticas (por ejemplo, para su administración a un sujeto).
En algunos aspectos, la divulgación proporciona composiciones que comprenden un ácido nucleico que codifica un péptido que se une de manera inmunoespecífica a la secuencia A relacionada con el polipéptido de clase I del MHC (MICA) o un epítopo en el mismo. En algunos aspectos, los ácidos nucleicos de las composiciones codifican la Vh del anticuerpo con la ID 1, 6, 7, 8, 9, 11 o 12 mostrado en la tabla 1 que tiene 5 o menos sustituciones de aminoácidos conservativas. En algunos aspectos, los ácidos nucleicos de las composiciones codifican la Vl del anticuerpo con la ID 1, 6, 7, 8, 9, 11 o 12 mostrado en la tabla 1 que tiene 5 o menos sustituciones de aminoácidos conservativas.
En un aspecto, la divulgación proporciona ácidos nucleicos que comprenden una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente un 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o más de identidad de secuencia o completa (100 %) respecto de la SEQ ID NO: 1. En algunos aspectos, la secuencia de ácido nucleico codifica un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98, 99 % o 100 % de identidad respecto de la SEQ ID NO: 2. En otro aspecto, la divulgación proporciona ácidos nucleicos que comprenden una secuencia de nucleótidos con al menos aproximadamente un 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o más de identidad de secuencia o completa (100 %) respecto de la SEQ ID NO: 10. En algunos aspectos, la secuencia de ácido nucleico codifica un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98, 99 % o 100 % de identidad respecto de la SEQ ID NO: 11.
En un aspecto, la divulgación proporciona ácidos nucleicos que comprenden una secuencia de nucleótidos con al menos aproximadamente un 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o más de identidad de secuencia o completa (100 %) respecto de la SEQ ID NO: 76. En algunos aspectos, la secuencia de ácido nucleico codifica un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98, 99 % o 100 % de identidad respecto de la SEQ ID NO: 77. En otro aspecto, la divulgación proporciona ácidos nucleicos que comprenden una secuencia de nucleótidos con al menos aproximadamente un 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o más de identidad de secuencia o completa (100 %) respecto de la SEQ ID NO: 78. En algunos aspectos, la secuencia de ácido nucleico codifica un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98, 99 % o 100 % de identidad respecto de la SEQ ID NO: 79.
En un aspecto, la divulgación proporciona ácidos nucleicos que comprenden una secuencia de nucleótidos con al menos aproximadamente un 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o más de identidad de secuencia o completa (100 %) respecto de la SEQ ID NO: 95. En algunos aspectos, la secuencia de ácido nucleico codifica un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98, 99 % o 100 % de identidad respecto de la SEQ ID NO: 96. En otro aspecto, la divulgación proporciona ácidos nucleicos que comprenden una secuencia de nucleótidos con al menos aproximadamente un 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o más de identidad de secuencia o completa (100 %) respecto de la SEQ ID NO: 97. En algunos aspectos, la secuencia de ácido nucleico codifica un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98, 99 % o 100 % de identidad respecto de la SEQ ID NO: 98.
En un aspecto, la divulgación proporciona ácidos nucleicos que comprenden una secuencia de nucleótidos con al menos aproximadamente un 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o más de identidad de secuencia o completa (100 %) respecto de la SEQ ID NO: 112. En algunos aspectos, la secuencia de ácido nucleico codifica un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98, 99 % o 100 % de identidad respecto de la SEQ ID NO: 113. En otro aspecto, la divulgación proporciona ácidos nucleicos que comprenden una secuencia de nucleótidos con al menos aproximadamente un 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o más de identidad de secuencia o completa (100 %) respecto de la SEQ ID NO: 114. En algunos aspectos, la secuencia de ácido nucleico codifica un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98, 99 % o 100 % de identidad respecto de la SEQ ID NO: 115.
En un aspecto, la divulgación proporciona ácidos nucleicos que comprenden una secuencia de nucleótidos con al menos aproximadamente un 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o más de identidad de secuencia o completa (100 %) respecto de la SEQ ID NO: 130. En algunos aspectos, la secuencia de ácido nucleico codifica un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98, 99 % o 100 % de identidad respecto de la SEQ ID NO: 131. En otro aspecto, la divulgación proporciona ácidos nucleicos que comprenden una secuencia de nucleótidos con al menos aproximadamente un 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o más de identidad de secuencia o completa (100 %) respecto de la SEQ ID NO: 132. En algunos aspectos, la secuencia de ácido nucleico codifica un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98, 99 % o 100 % de identidad respecto de la SEQ ID NO: 133.
En un aspecto, la divulgación proporciona ácidos nucleicos que comprenden una secuencia de nucleótidos con al menos aproximadamente un 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o más de identidad de secuencia o completa (100 %) respecto de la SEQ ID NO: 149. En algunos aspectos, la secuencia de ácido nucleico codifica un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98, 99 % o 100 % de identidad respecto de la SEQ ID NO: 150. En otro aspecto, la divulgación proporciona ácidos nucleicos que comprenden una secuencia de nucleótidos con al menos aproximadamente un 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o más de identidad de secuencia o completa (100 %) respecto de la SEQ ID NO: 151. En algunos aspectos, la secuencia de ácido nucleico codifica un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98, 99 % o 100 % de identidad respecto de la SEQ ID NO: 152.
En un aspecto, la divulgación proporciona ácidos nucleicos que comprenden una secuencia de nucleótidos con al menos aproximadamente un 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o más de identidad de secuencia o completa (100 %) respecto de la SEQ ID NO: 167. En algunos aspectos, la secuencia de ácido nucleico codifica un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98, 99 % o 100 % de identidad respecto de la SEQ ID NO: 168. En otro aspecto, la divulgación proporciona ácidos nucleicos que comprenden una secuencia de nucleótidos con al menos aproximadamente un 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o más de identidad de secuencia o completa (100 %) respecto de la SEQ ID NO: 169. En algunos aspectos, la secuencia de ácido nucleico codifica un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98, 99 % o 100 % de identidad respecto de la SEQ ID NO: 170.
En algunos aspectos, la divulgación proporciona receptores de antígeno quiméricos (CAR) que comprenden péptidos que se unen inmunoespecíficamente a MICA y un dominio de linfocito T intracelular. En un aspecto, los péptidos incluidos en el CAR son un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que incluyen: una cadena VH con identidad respecto de la SEQ ID NO: 2, en donde las regiones correspondientes a la c DR1, la CDR2 y la CDR3 comprenden la CDR1, la CDR2 y la CDR3 de la Vh del anticuerpo con la ID 1 mostrado en la tabla 1 que tiene 5 o menos sustituciones de aminoácidos conservativas y las regiones en la SEQ ID NO: 2 que corresponden a la FR1, FR2, FR3, FR4, comprenden secuencias de aminoácidos con al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98, 99 % o 100 % de identidad respecto de la FR1, FR2, FR3, FR4 de la Vh del anticuerpo con la ID 1 mostrado en la tabla 1; o un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que incluye una cadena Vl con identidad respecto de la SEQ ID NO: 11, en donde las regiones correspondientes a la CDR1, la CDR2 y la CDR3 comprenden la CDR1, la CDR2 y la CDR3 de la Vl del anticuerpo con la ID 1 mostrado en la tabla 1 que tiene 5 o menos sustituciones de aminoácidos conservativas y las regiones en la SEQ ID NO: 11 que corresponden a la FR1, FR2, FR3, FR4, comprenden secuencias de aminoácidos con al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98, 99 % o 100 % de identidad respecto de la FR1, FR2, FR3, FR4 de la VL del anticuerpo con la ID 1 mostrado en la tabla 1. En algunos aspectos, los péptidos incluyen un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que comprende una cadena VH que comprende la SeQ ID NO: 2 y una cadena Vl que comprende la SEQ ID NO: 11.
En un aspecto, los péptidos incluidos en los CAR son un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que incluyen: una cadena Vh con identidad respecto de la SEQ ID NO: 77, en donde las regiones correspondientes a la CDR1, la CDR2 y la CDR3 comprenden la CDR1, la CDR2 y la CDR3 de la Vh del anticuerpo con la ID 6 mostrado en la tabla 1 que tiene 5 o menos sustituciones de aminoácidos conservativas en las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 y las regiones en la SEQ ID NO: 77 correspondientes a la FR1, FR2, FR3, FR4, comprenden secuencias de aminoácidos con al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98, 99 % o 100 % de identidad respecto de la FR1, FR2, FR3, FR4 de la VH del anticuerpo con la ID 6 mostrado en la tabla 1; o un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que incluye una cadena VL con identidad respecto de la SEQ ID NO: 79, en donde las regiones correspondientes a la CDR1, la CDR2 y la CDR3 comprenden la CDR1, la CDR2 y la CDR3 de la Vl del anticuerpo con la ID 6 mostrado en la tabla 1 que tiene 5 o menos sustituciones de aminoácidos conservativas en las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 y las regiones en la SEQ ID NO: 79 correspondientes a la FR1, FR2, FR3, FR4, comprenden secuencias de aminoácidos con al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98, 99 % o 100 % de identidad respecto de la FR1, FR2, FR3, FR4 de la Vl del anticuerpo con la ID 6 mostrado en la tabla 1. En algunos aspectos, los péptidos incluyen un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que comprende una cadena VH que comprende la SEQ ID NO: 77 y una cadena Vl que comprende la SEQ ID NO: 79.
En un aspecto, los péptidos que se unen inmunoespecíficamente a MICA incluidos en los CAR son un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que incluye: una cadena Vh con identidad respecto de la SEQ ID NO: 96, en donde las regiones correspondientes a la CDR1, la CDR2 y la CDR3 comprenden la CDR1, la CDR2 y la CDR3 de la Vh del anticuerpo con la ID 7 mostrado en la tabla 1 que tiene 5 o menos sustituciones de aminoácidos conservativas en las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 y las regiones en la SEQ ID NO: 96 correspondientes a la FR1, FR2, FR3, FR4, comprenden secuencias de aminoácidos con al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98, 99 % o 100 % de identidad respecto de la FR1, FR2, FR3, FR4 de la Vh del anticuerpo con la ID 7 mostrado en la tabla 1; y un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que incluye una cadena VL con identidad respecto de la SEQ ID NO: 98, en donde las regiones correspondientes a la CDR1, la CDR2 y la CDR3 comprenden la CDR1, la CDR2 y la CDR3 de la Vl del anticuerpo con la ID 7 mostrado en la tabla 1 que tiene 5 o menos sustituciones de aminoácidos conservativas en las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 y las regiones en la SEQ ID NO: 98 correspondientes a la FR1, FR2, FR3, FR4, comprenden secuencias de aminoácidos con al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98, 99 % o 100 % de identidad respecto de la FR1, FR2, FR3, FR4 de la Vl del anticuerpo con la ID 7 mostrado en la tabla 1. En algunos aspectos, los péptidos incluyen un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que comprende una cadena VH que comprende la SEQ ID NO: 96 y una cadena VL que comprende la SEQ ID NO: 98.
En un aspecto, los péptidos que se unen inmunoespecíficamente a MICA incluidos en los CAR son un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que incluye: una cadena Vh con identidad respecto de la SEQ ID NO: 113, en donde las regiones correspondientes a la CDR1, la CDR2 y la CDR3 comprenden la CDR1, la CDR2 y la CDR3 de la Vh del anticuerpo con la ID 8 mostrado en la tabla 1 que tiene 5 o menos sustituciones de aminoácidos conservativas en las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 y las regiones en la SEQ ID NO: 113 correspondientes a la FR1, FR2, FR3, FR4, comprenden secuencias de aminoácidos con al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98, 99 % o 100 % de identidad respecto de la FR1, FR2, FR3, FR4 de la VH del anticuerpo con la ID 8 mostrado en la tabla 1; o un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que incluye una cadena VL con identidad respecto de la SEQ ID NO: 115, en donde las regiones correspondientes a la CDR1, la CDR2 y la CDR3 comprenden la CDR1, la CDR2 y la CDR3 de la VL del anticuerpo con la ID 8 mostrado en la tabla 1 que tiene 5 o menos sustituciones de aminoácidos conservativas en las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 y las regiones en la SEQ ID NO: 115 correspondientes a la FR1, FR2, FR3, FR4, comprenden secuencias de aminoácidos con al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98, 99 % o 100 % de identidad respecto de la FR1, FR2, FR3, FR4 de la Vl del anticuerpo con la ID 8 mostrado en la tabla 1. En algunos aspectos, los péptidos incluyen un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que comprende una cadena Vh que comprende la SEQ ID NO: 113 y una cadena VL que comprende la SEQ ID NO: 115.
En un aspecto, los péptidos que se unen inmunoespecíficamente a MICA incluidos en los CAR son un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que incluye: una cadena Vh con identidad respecto de la SEQ ID NO: 131, en donde las regiones correspondientes a la CDR1, la CDR2 y la CDR3 comprenden la CDR1, la CDR2 y la CDR3 de la Vh del anticuerpo con la ID 9 mostrado en la tabla 1 que tiene 5 o menos sustituciones de aminoácidos conservativas en las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 y las regiones en la SEQ ID NO: 131 correspondientes a la FR1, FR2, FR3, FR4, comprenden secuencias de aminoácidos con al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98, 99 % o 100 % de identidad respecto de la FR1, FR2, FR3, FR4 de la Vh del anticuerpo con la ID 9 mostrado en la tabla 1; o un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que incluye una cadena Vl con identidad respecto de la SEQ ID NO: 133, en donde las regiones correspondientes a la CDR1, la CDR2 y la CDR3 comprenden la CDR1, la CDR2 y la CDR3 de la Vl del anticuerpo con la ID 9 mostrado en la tabla 1 que tiene 5 o menos sustituciones de aminoácidos conservativas en las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 y las regiones en la SEQ ID NO: 133 correspondientes a la FR1, FR2, FR3, FR4, comprenden secuencias de aminoácidos con al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98, 99 % o 100 % de identidad respecto de la FR1, FR2, FR3, FR4 de la Vl del anticuerpo con la ID 9 mostrado en la tabla 1. En algunos aspectos, los péptidos incluyen un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que comprende una cadena Vh que comprende la SEQ ID NO: 131 y una cadena VL que comprende la SEQ ID NO: 133.
En un aspecto, los péptidos que se unen inmunoespecíficamente a MICA incluidos en los CAR son un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que incluye: una cadena Vh con identidad respecto de la SEQ ID NO: 150, en donde las regiones correspondientes a la CDR1, la CDR2 y la CDR3 comprenden la CDR1, la CDR2 y la CDR3 de la Vh del anticuerpo con la ID 11 mostrado en la tabla 1 que tiene 5 o menos sustituciones de aminoácidos conservativas en las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 y las regiones en la SEQ ID NO: 150 correspondientes a la FR1, FR2, FR3, FR4, comprenden secuencias de aminoácidos con al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98, 99 % o 100 % de identidad respecto de la FR1, FR2, FR3, FR4 de la Vh del anticuerpo con la ID 11 mostrado en la tabla 1; o un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que incluye una cadena Vl con identidad respecto de la SEQ ID NO: 152, en donde las regiones correspondientes a la CDR1, la CDR2 y la CDR3 comprenden la CDR1, la CDR2 y la CDR3 de la VL del anticuerpo con la ID 11 mostrado en la tabla 1 que tiene 5 o menos sustituciones de aminoácidos conservativas en las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 y las regiones en la SEQ ID NO: 152 correspondientes a la FR1, FR2, FR3, FR4, comprenden secuencias de aminoácidos con al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98, 99 % o 100 % de identidad respecto de la FR1, FR2, FR3, FR4 de la Vl del anticuerpo con la ID 11 mostrado en la tabla 1. En algunos aspectos, los péptidos incluyen un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que comprende una cadena Vh que comprende la SEQ ID NO: 150 y una cadena Vl que comprende la SEQ ID NO: 152. En un aspecto, los péptidos que se unen inmunoespecíficamente a MICA incluidos en los CAR son un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que incluye: una cadena Vh con identidad respecto de la SEQ ID NO: 168, en donde las regiones correspondientes a la CDR1, la CDR2 y la CDR3 comprenden la CDR1, la CDR2 y la CDR3 de la VH del anticuerpo con la ID 12 mostrado en la tabla 1 que tiene 5 o menos sustituciones de aminoácidos conservativas en las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 y las regiones en la SEQ ID NO: 168 correspondientes a la FR1, FR2, FR3, FR4, comprenden secuencias de aminoácidos con al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98, 99 % o 100 % de identidad respecto de la FR1, FR2, FR3, FR4 de la Vh del anticuerpo con la ID 12 mostrado en la tabla 1; o un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que incluye una cadena VL con identidad respecto de la SEQ ID NO: 170, en donde las regiones correspondientes a la CDR1, la CDR2 y la CDR3 comprenden la CDR1, la CDR2 y la CDR3 de la VL del anticuerpo con la ID 12 mostrado en la tabla 1 que tiene 5 o menos sustituciones de aminoácidos conservativas en las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 y las regiones en la SEQ ID NO: 170 correspondientes a la FR1, FR2, FR3, FR4, comprenden secuencias de aminoácidos con al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98, 99 % o 100 % de identidad respecto de la FR1, FR2, FR3, FR4 de la Vl del anticuerpo con la ID 12 mostrado en la tabla 1. En algunos aspectos, los péptidos incluyen un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que comprende una cadena Vh que comprende la SEQ ID NO: 168 y una cadena VL que comprende la SEQ ID NO: 170. En otros aspectos, la divulgación proporciona un vector (por ejemplo, un vector de expresión, un vector vírico, un vector retrovírico, un vector adenovírico, un vector vírico adenoasociado (AAV), vector de virus del herpes o un vector de poxvirus) que comprende un ácido nucleico que codifica un péptido que se une inmunoespecíficamente a MICA. En un aspecto, el vector comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente un 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o más de identidad de secuencia o completa (100 %) respecto de la SEQ ID NO: 10, 78, 97, 114, 132, 151 o 169. En algunos aspectos, la secuencia de ácido nucleico codifica un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98, 99 % o 100 % de identidad respecto de la SEQ ID NO: 11, 79, 98, 115, 133, 152 o 170.
En otro aspecto, el vector comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente un 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o más de identidad de secuencia o completa (100 %) respecto de la SEQ ID NO: 1, 76, 95, 112, 130, 149 o 167. En algunos aspectos, la secuencia de ácido nucleico codifica un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98, 99 % o 100 % de identidad respecto de la SEQ ID NO: 2, 77, 96, 113, 131, 150 o 168.
En otro aspecto, el vector comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente un 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o más de identidad de secuencia o completa (100 %) respecto de la SEQ ID NO: 1, 76, 112, 130 o 149. En algunos aspectos, la secuencia de ácido nucleico codifica un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98, 99 % o 100 % de identidad respecto de la SEQ ID NO: 2, 77, 96, 113, 131 o 150.
En un aspecto, el vector comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente un 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o más de identidad de secuencia o completa (100 %) respecto de la SEQ ID NO: 1. En algunos aspectos, la secuencia de ácido nucleico codifica un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98, 99 % o 100 % de identidad respecto de la SEQ ID NO: 2. En otro aspecto, la divulgación proporciona ácidos nucleicos que comprenden una secuencia de nucleótidos con al menos aproximadamente un 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o más de identidad de secuencia o completa (100 %) respecto de la SEQ ID NO: 10. En algunos aspectos, la secuencia de ácido nucleico codifica un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98, 99 % o 100 % de identidad respecto de la SEQ ID NO: 11.
En un aspecto, el vector comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente un 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o más de identidad de secuencia o completa (100 %) respecto de la SEQ ID NO: 76. En algunos aspectos, la secuencia de ácido nucleico codifica un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98, 99 % o 100 % de identidad respecto de la SEQ ID NO: 77. En otro aspecto, la divulgación proporciona ácidos nucleicos que comprenden una secuencia de nucleótidos con al menos aproximadamente un 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o más de identidad de secuencia o completa (100 %) respecto de la SEQ ID NO: 78. En algunos aspectos, la secuencia de ácido nucleico codifica un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98, 99 % o 100 % de identidad respecto de la SEQ ID NO: 79.
En un aspecto, el vector comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente un 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o más de identidad de secuencia o completa (100 %) respecto de la SEQ ID NO: 95. En algunos aspectos, la secuencia de ácido nucleico codifica un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98, 99 % o 100 % de identidad respecto de la SEQ ID NO: 96. En otro aspecto, la divulgación proporciona ácidos nucleicos que comprenden una secuencia de nucleótidos con al menos aproximadamente un 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o más de identidad de secuencia o completa (100 %) respecto de la SEQ ID NO: 97. En algunos aspectos, la secuencia de ácido nucleico codifica un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98, 99 % o 100 % de identidad respecto de la SEQ ID NO: 98.
En un aspecto, el vector comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente un 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o más de identidad de secuencia o completa (100 %) respecto de la SEQ ID NO: 112. En algunos aspectos, la secuencia de ácido nucleico codifica un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98, 99 % o 100 % de identidad respecto de la SEQ ID NO: 113. En otro aspecto, la divulgación proporciona ácidos nucleicos que comprenden una secuencia de nucleótidos con al menos aproximadamente un 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o más de identidad de secuencia o completa (100 %) respecto de la SEQ ID NO: 114. En algunos aspectos, la secuencia de ácido nucleico codifica un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98, 99 % o 100 % de identidad respecto de la SEQ ID NO: 115.
En un aspecto, el vector comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente un 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o más de identidad de secuencia o completa (100 %) respecto de la SEQ ID NO: 130. En algunos aspectos, la secuencia de ácido nucleico codifica un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98, 99 % o 100 % de identidad respecto de la SEQ ID NO: 131. En otro aspecto, la divulgación proporciona ácidos nucleicos que comprenden una secuencia de nucleótidos con al menos aproximadamente un 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o más de identidad de secuencia o completa (100 %) respecto de la SEQ ID NO: 132. En algunos aspectos, la secuencia de ácido nucleico codifica un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98, 99 % o 100 % de identidad respecto de la SEQ ID NO: 133.
En un aspecto, el vector comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente un 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o más de identidad de secuencia o completa (100 %) respecto de la SEQ ID NO: 149. En algunos aspectos, la secuencia de ácido nucleico codifica un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98, 99 % o 100 % de identidad respecto de la SEQ ID NO: 150. En otro aspecto, la divulgación proporciona ácidos nucleicos que comprenden una secuencia de nucleótidos con al menos aproximadamente un 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o más de identidad de secuencia o completa (100 %) respecto de la SEQ ID NO: 151. En algunos aspectos, la secuencia de ácido nucleico codifica un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98, 99 % o 100 % de identidad respecto de la SEQ ID NO: 152.
En un aspecto, el vector comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente un 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o más de identidad de secuencia o completa (100 %) respecto de la SEQ ID NO: 167. En algunos aspectos, la secuencia de ácido nucleico codifica un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98, 99 % o 100 % de identidad respecto de la SEQ ID NO: 168. En otro aspecto, la divulgación proporciona ácidos nucleicos que comprenden una secuencia de nucleótidos con al menos aproximadamente un 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o más de identidad de secuencia o completa (100 %) respecto de la SEQ ID NO: 169. En algunos aspectos, la secuencia de ácido nucleico codifica un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98, 99 % o 100 % de identidad respecto de la SEQ ID NO: 170.
En algunos aspectos, la divulgación se refiere a métodos para tratar el cáncer en un sujeto. En algunos aspectos, los métodos incluyen administrar a un sujeto una composición que comprende uno o más de los péptidos y/o ácidos nucleicos divulgados en el presente documento.
La presente divulgación también proporciona métodos para aislar anticuerpos humanos de pacientes con cáncer después de la inmunoterapia.
En algunas realizaciones, la divulgación incluye un método para obtener células inmunitarias dirigidas contra un autoantígeno de un sujeto, comprendiendo el método identificar a un sujeto que muestra una respuesta inmunitaria positiva contra el autoantígeno, proporcionar una forma multimérica del autoantígeno, poner en contacto la forma multimérica del autoantígeno con una muestra del sujeto que muestra una respuesta inmunitaria positiva contra el autoantígeno y obtener células inmunitarias unidas a la forma multimérica del autoantígeno.
En algunas realizaciones, la divulgación incluye un método para obtener células inmunitarias de un paciente con cáncer dirigido contra un autoantígeno, comprendiendo el método identificar a un sujeto que muestra una respuesta inmunitaria positiva contra el autoantígeno; proporcionar una forma multimérica del autoantígeno; poner en contacto la forma multimérica del autoantígeno con una muestra del sujeto que muestra una respuesta inmunitaria positiva contra el autoantígeno; y obtener células inmunitarias unidas a la forma multimérica del autoantígeno.
A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende comúnmente un experto familiarizado con la técnica a la cual pertenece la presente invención. En el presente documento se describen métodos y materiales para su uso en la presente invención; también pueden usarse otros métodos y materiales adecuados conocidos en la técnica. Los materiales, métodos y ejemplos son solamente ilustrativos y no pretenden ser limitantes.
Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y a partir de las figuras y de las reivindicaciones.
Descripción de los dibujos
FIG. 1 | Secuencia de ácido nucleico variable de la cadena pesada (Vh) del anticuerpo con la ID 1 (anticuerpo anti-secuencia A relacionada con polipéptido de clase I del m Hc (MICA)) (SEQ ID NO: 1).
FIG. 2 | Secuencia de aminoácidos de la cadena Vh del anticuerpo con la ID 1 (anticuerpo anti-MICA) (SEQ ID NO: 2).
FIG. 3 | Secuencia de ácido nucleico de la cadena ligera variable (VL) del anticuerpo con la ID 1 (anticuerpo anti­ MICA) (SEQ ID NO: 10).
FIG. 4 | Secuencia de aminoácidos de la cadena Vl del anticuerpo con la ID 1 (anticuerpo anti-MICA) (SEQ ID NO: 11).
FIG. 5A-5F | Ilustra métodos a modo de ejemplo para producir anticuerpos a partir de linfocitos B. (A) El antígeno se expresa con un marcador BirA para la biotinilación de sitio específico y la tetramerización con estreptavidina marcada fluorescentemente. (B) Los linfocitos B se tiñen con tetrámero y un panel de anticuerpos monoclonales. Los linfocitos B de memoria con la clase cambiada tetrámero+ se clasifican en células individuales en tiras de PCR. (C) la amplificación del ARNm se lleva a cabo con ARN polimerasa de T7. (D) La secuenciación de los productos de la PCR se lleva a cabo usando productos de la PCR de 300-400 pb. (E) Se usa PCR solapada para la construcción de las secuencias de cadena pesada y ligera kappa/lambda de IgG 1 de longitud completa que se clonan en vectores separados. Los vectores se transfectan transitoriamente en células CHO-S para la expresión de anticuerpos recombinantes completamente humanos. (F) Se evalúa la unión a antígeno de los anticuerpos y se determinan sus propiedades terapéuticas.
FIG. 6A-6B | Gráficas que muestran la comparación de antígeno monomérico y tetramérico para la identificación de linfocitos B de memoria. (A) Se marcaron directamente los antígenos TTCF o CD80 monobiotinilados con fluoróforo Alexa-488; los tetrámeros se generaron con estreptavidina no marcada. Los linfocitos B enriquecidos de cada donante se dividieron en tres fracciones y se tiñeron con tetrámero de CD80 de control, monómero de TTCF o tetrámero de TTCF a la misma concentración total de antígeno de 0,125 pg/ml. Las gráficas de FACS representan los linfocitos B de memoria con clase cambiada CD19+ CD27+ IgM-; los números adyacentes a la ventana representan el porcentaje de la ventana precursora. (B) Frecuencias de linfocitos B de memoria tetrámero+ detectados en tres donantes diferentes. Los números se calculan como células tetrámero+ por cada 1x106 linfocitos B de memoria CD19+.
FIG. 7A-7B | Gráficas de líneas que muestran la unión de alta afinidad de TTCF a anticuerpos generados a partir de plasmablastos y linfocitos B de memoria. Se llevaron a cabo experimentos de unión de saturación para determinar las afinidades de los anticuerpos recombinantes. El antígeno TTCF se marcó con europio, que emite una fuerte señal fluorescente a 615nm tras la incubación con un agente quelante. Los anticuerpos se inmovilizaron en una placa de 96 pocillos y se incubaron con TTCF-europio (100 nM a 4 pM) durante dos horas a 37 °C. Se registraron los recuentos de fluorescencia a 615 nm y se calculó la Kd usando análisis de regresión no lineal. En todos los experimentos se incluyó anticuerpo de control (clon 8.18.C5) que también se produjo en células CHO-S. (A) Los Ab 1 y 2 contra TTCf recombinante se generaron a partir de plasmablastos tetrámero de TTCF+ (donante 1). (B) Los anticuerpos contra TCCF 3, 4 y 5 se produjeron a partir de linfocitos B de memoria tetrámero de TTCF+ de tres donantes diferentes.
FIG. 8 | Diagrama de barras que muestra la unión de anticuerpos anti-MICA a perlas Luminex recubiertas con MICA.
FIG. 9A-9O | Gráficas de líneas que muestran la unión de anticuerpos anti-MICA a perlas recubiertas con MICA. FIG. 10 | Secuencia de ácido nucleico variable de la cadena pesada (Vh) del anticuerpo con la ID 6 (anticuerpo anti-secuencia A relacionada con polipéptido de clase I del MHC (MICA)) (SEQ ID NO: 76).
FIG. 11 | Secuencia de aminoácidos de la cadena Vh del anticuerpo 6 (anticuerpo anti-MICA) (SEQ ID NO: 77). FIG. 12 | Secuencia de ácido nucleico de la cadena ligera variable (VL) del anticuerpo con la ID 6 (anticuerpo anti-MICA) (SEQ ID NO: 78).
FIG. 13 | Secuencia de aminoácidos de la cadena Vl del anticuerpo con la ID 6 (anticuerpo anti-MICA) (SEQ ID NO: 79).
FIG. 14 | Secuencia de ácido nucleico variable de la cadena pesada (Vh) del anticuerpo con la ID 7 (anticuerpo anti-secuencia A relacionada con polipéptido de clase I del MHC (MICA)) (SEQ ID NO: 95).
FIG. 15 | Secuencia de aminoácidos de la cadena Vh del anticuerpo con la ID 7 (anticuerpo anti-MICA) (SEQ ID NO: 96).
FIG. 16 | Secuencia de ácido nucleico de la cadena ligera variable (Vl) del anticuerpo con la ID 7 (anticuerpo anti-MICA) (SEQ ID NO: 97).
FIG. 17 | Secuencia de aminoácidos de la cadena Vl del anticuerpo con la ID 7 (anticuerpo anti-MICA) (SEQ ID NO: 98).
FIG. 18 | Secuencia de ácido nucleico variable de la cadena pesada (Vh) del anticuerpo con la ID 8 (anticuerpo anti-secuencia A relacionada con polipéptido de clase I del MHC (MICA)) (SEQ ID NO: 112).
FIG. 19 | Secuencia de aminoácidos de la cadena Vh del anticuerpo con la ID 8 (anticuerpo anti-MICA) (SEQ ID NO: 113).
FIG. 20 | Secuencia de ácido nucleico de la cadena ligera variable (Vl) del anticuerpo con la ID 8 (anticuerpo anti-MICA) (SEQ ID NO: 114).
FIG. 21 | Secuencia de aminoácidos de la cadena Vl del anticuerpo con la ID 8 (anticuerpo anti-MICA) (SEQ ID NO: 115).
FIG. 22 | Secuencia de ácido nucleico variable de la cadena pesada (Vh) del anticuerpo con la ID 9 (anticuerpo anti-secuencia A relacionada con polipéptido de clase I del MHC (MICA)) (SEQ ID NO: 130).
FIG. 23 | Secuencia de aminoácidos de la cadena Vh del anticuerpo con la ID 9 (anticuerpo anti-MICA) (SEQ ID NO: 131).
FIG. 24 | Secuencia de ácido nucleico de la cadena ligera variable (Vl) del anticuerpo con la ID 9 (anticuerpo anti-MICA) (SEQ ID NO: 132).
FIG. 25 | Secuencia de aminoácidos de la cadena VL del anticuerpo con la ID 9 (anticuerpo anti-MICA) (SEQ ID NO: 133).
FIG. 26A-G | Gráficas de líneas que muestran la evaluación de unión específica de alelo de MICA mediante anticuerpos anti-MICA recombinantes.
FIG. 27 | Gráfica de líneas que muestra el marcaje de células tumorales autólogas mediante el anticuerpo Ab2 CM24002 anti-MICA.
FIG. 28 | Una serie de gráficas de FACS que muestra la regulación de NKG2D mediante MICA sérico. Se incubaron células NK humanas con suero de control del paciente CM24002 a una dilución 1:10 durante 48 horas. Se añadieron los anticuerpos indicados al inicio de la incubación a una concentración de 10 pg/ml. Se evaluó la expresión de NKG2D en células NK CD56+ mediante citometría de flujo.
FIG. 29 | Una serie de gráficas de FACS que muestra la regulación de NKG2D mediante MICA recombinante. Se incubaron células NK con MICA recombinante a una concentración de 2 ng/ml durante 48 horas. Se añadieron los anticuerpos indicados al inicio de la incubación a una concentración de 10 pg/ml. Después de 48 horas, se evaluó la expresión de NKG2D en células NK CD56+ mediante citometría de flujo.
FIG. 30 | Gráfica de líneas que demuestra la potenciación de la toxicidad mediada por células mediante el anticuerpo Ab2 CM24002 anti-MICA. Se incubaron células NK con MICA recombinante (2 ng/ml) durante 48 horas en presencia de los anticuerpos indicados a 10 pg/ml. Se evaluó la capacidad de las células NK (efectoras) para eliminar células diana K562 midiendo la liberación de LDH después de 4 horas de incubación a las proporciones indicadas.
FIG. 31 | Diagrama de barras que demuestra la toxicidad mediada por células por los anticuerpos Ab2 CM24002 y Ab29 CM33322 anti-MICA. Se incubaron células NK con MICA recombinante (2 ng/ml) durante 48 horas en presencia de los anticuerpos indicados a 10 pg/ml. Se evaluó la capacidad de las células NK (efectoras) para eliminar células diana k562 midiendo la liberación de LDH después de 4 horas de incubación. Se añadió anticuerpo bloqueante de NKG2D o anticuerpo bloqueante de Fc durante la incubación de 4 h de células efectoras y células diana para evaluar la contribución del receptor de Fc y de NKG2D a la toxicidad mediada por células.
FIG. 32 | Una serie de gráficas de líneas que muestran la unión del dominio alfa 3 de MICA mediante anticuerpos recombinantes anti-MICA. Se biotinilaron los dominios alfa 3 de MICA y se capturaron sobre la superficie de perlas recubiertas de estreptavidina. Se incubaron los anticuerpos indicados a 10 pg/ml con las perlas recubiertas con la proteína recombinante individual durante 1 h. Posteriormente, se lavaron las perlas y se incubaron con anticuerpo secundario anti-IgG humana conjugado con FITC. La fluorescencia de FITC se cuantificó mediante citometría de flujo.
FIG. 33 | Gráficas de líneas que demuestran el marcaje de células tumorales mediante los anticuerpos anti-MICA CM24002 Ab2 y CM33322 Ab29. La fluorescencia se determinó mediante citometría de flujo.
FIG. 34 | Diagrama de barras que demuestra la especificidad alélica de MICA del anticuerpo anti-MICA CM33322 Ab29 determinada mediante el ensayo Luminex.
FIG. 35 | Secuencia de ácido nucleico variable de la cadena pesada (Vh) del anticuerpo con la ID 11 (anticuerpo anti-secuencia A relacionada con polipéptido de clase I del m Hc (MICA)) (SEQ ID NO: 149).
FIG. 36 | Secuencia de aminoácidos de la cadena Vh del anticuerpo 11 (anticuerpo anti-MICA) (SEQ ID NO: 150).
FIG. 37 | Secuencia de ácido nucleico de la cadena ligera variable (Vl) del anticuerpo con la ID 11 (anticuerpo anti-MICA) (SEQ ID NO: 151).
FIG. 38 | Secuencia de aminoácidos de la cadena Vl del anticuerpo con la ID 11 (anticuerpo anti-MICA) (SEQ ID NO: 152).
FIG. 39 | Diagrama de barras que demuestra la concentración sérica de MICA en pacientes con melanoma avanzado. Se detectó MICA sérico usando un ELISA sándwich disponible comercialmente. Los sueros se evaluaron a una dilución 1:10.
FIG. 40 | Tabla que muestra que los anticuerpos anti-MICA bloquean la regulación negativa de NKG2D en células NK incubadas con suero de paciente de melanoma. Las PBMC se incubaron con muestras de suero de control o de paciente con melanoma que contenía solo MICA soluble o en presencia de los anticuerpos indicados a 100ug/ml durante 48 horas. A las 48 horas, se determinó la expresión de NKG2D en células NK (CD3-, CD8-, CD56+) mediante citometría de flujo. Los datos se representan como % de células NK que son positivas para NKG2D.
FIG. 41-43 | Una serie de gráficas que demuestran que los anticuerpos anti-MICA potencian la citotoxicidad mediada por NKG2D de células diana K562 por células NK incubadas con suero de paciente de melanoma. Las PBMC se incubaron con muestras de suero de control o de paciente con melanoma que contenía solo MICA soluble o en presencia de los anticuerpos indicados a 100ug/ml durante 48 horas. A las 48 horas, se lavaron las células y se incubaron con células diana K562 marcadas con 51Cr a una relación de efector a diana de 20:1. La lisis específica se evaluó mediante recuento de centelleo después de 4 horas.
FIG. 44 | Gráficas que muestran la unión del anticuerpo anti-MICA CM33322 Ab29 a células de melanoma B16 que se han transducido para expresar MICA humano. Los anticuerpos indicados se incubaron con células de melanoma B16 y células de melanoma B16 inducidas para expresar MICA humano a 10ug/ml y la tinción se analizó mediante citometría de flujo.
FIG. 45 | Una serie de gráficas que demuestra que los tumores de B16-MICA regulan negativamente la expresión de NKG2D en células NK de bazo y células NK infiltrantes en tumores. Se determinó la expresión de NKG2D mediante citometría de flujo en células NK (CD3-, CD8-, CD335+) aislado de bazos de ratones sin tumores o el bazo y tumor de animales portadores de tumores.
FIG. 46 | Una serie de gráficas que demuestran que el tratamiento con anticuerpo anti-MICA reduce los niveles séricos de MICA en ratones portadores de tumores B16-MICA. Se trató a ratones B6 portadores de tumores B16-MICA con 100ug o 200ug/dosis de CM33322 Ab29 mediante inyección en la vena caudal tres veces por semana. Transcurrida una semana después del tratamiento inicial, se extrajo sangre y se midió MICA en suero mediante ELISA.
FIG. 47 | Una gráfica que muestra que la administración de anticuerpos anti-MICA no interfiere con la detección de MICA mediante ELISA sándwich. Se inoculó MICA recombinante con un exceso de 1000 veces de anticuerpo con rotación durante 18 horas. La concentración de MICA se determinó mediante ELISA sándwich.
FIG. 48 | Una gráfica que demuestra que el tratamiento de ratones portadores de tumores B16-MICA con anticuerpo anti-MICA CM33322 Ab29 detiene el crecimiento tumoral. Se trató por vía intravenosa a ratones portadores de tumores B16-MICA con 200ug/dosis de control de isotipo IgG2a/ K o de anticuerpo anti-MICA CM33322 Ab29 comenzando cuando los tumores alcanzaron un diámetro de 5 mm. Las dosis se administraron tres veces a la semana y el volumen tumoral se registró a diario. Las flechas indican la administración de la dosis.
FIG. 49 | Una serie de gráficas que demuestran la capacidad de los anticuerpos anti-MICA para reducir la secreción de MICA por células tumorales. Se cultivaron células RPMI-8226 en presencia de 10ug/ml de anticuerpo de control de isotipo, CM33322 Ab29 o CM24002 Ab2. Después de 48 horas, se lavaron las células y se determinó la expresión superficial de MICA mediante citometría de flujo y se evaluó MICA secretado en el medio acondicionado mediante ELISA sándwich.
FIG. 50 | Secuencia de ácido nucleico de la cadena pesada variable (Vh) del anticuerpo con la ID 12 (CM33322 Ab28) (anticuerpo anti-MICA) (SEQ ID NO: 167).
FIG. 51 | Secuencia de aminoácidos de la cadena Vh del anticuerpo con la ID 12 (CM33322 Ab28) (anticuerpo anti-MICA) (SEQ ID NO: 168).
FIG. 52 | Secuencia de ácido nucleico de la cadena ligera variable (Vl) del anticuerpo con la ID 12 (CM33322 Ab28) (anticuerpo anti-MICA) (SEQ ID NO: 169).
FIG. 53 | Secuencia de aminoácidos de la cadena Vl del anticuerpo con la ID 12 (CM33322 Ab28) (anticuerpo anti-MICA) (SEQ ID NO: 170).
FIG. 54 | Diagrama de barras que demuestra la toxicidad mediada por células por los anticuerpos anti-MICA CM24002 Ab2, CM33322 Ab4, CM33322 Ab11 y CM33322 Ab28. Se incubaron células K562 marcadas con 51Cr en presencia del anticuerpo indicado durante 30 minutos. A los 30 minutos, se añadieron PBMC enteras a una relación de efector a diana de 20:1. La lisis específica se evaluó mediante recuento de centelleo después de 4 horas.
FIG. 55 | Una serie de gráficas que demuestran la capacidad de los anticuerpos anti-MICA para reducir la secreción de MICA por células tumorales. Se cultivaron células RPMI-8226 en presencia de anticuerpo de control de isotipo, CM24002 Ab2, CM33322 Ab4, CM33322 Ab11 o CM33322 Ab28. Después de 48 horas, se lavaron las células y se determinó la expresión superficial de MICA mediante citometría de flujo y se evaluó MICA secretado en el medio acondicionado mediante ELISA sándwich.
FIG. 56 | Una gráfica de líneas que demuestra que los anticuerpos anti-MICA potencian la citotoxicidad mediada por NKG2D de células diana K562 por células NK incubadas con suero de paciente de melanoma. Las PBMC se incubaron con muestras de suero de control o de paciente con melanoma que contenía solo MICA soluble o en presencia de los anticuerpos indicados durante 48 horas. A las 48 horas, se lavaron las células y se incubaron con células diana K562 marcadas con 51Cr a una relación de efector a diana de 20:1, 10:1 y 5:1. La lisis específica se evaluó mediante recuento de centelleo después de 4 horas.
FIG. 57 | Una serie de gráficas de FACS que muestra la regulación de NKG2D mediante MICA sérico. Se incubaron PBMC enteras con suero de control o suero de melanoma solo o en presencia de los anticuerpos indicados durante 48 horas. Después de 48 horas, se lavaron las células y se evaluó la expresión superficial de NKG2D mediante citometría de flujo.
FIG. 58 | Una gráfica de líneas que muestra la toxicidad mediada por células por los anticuerpos anti-MICA CM24002 Ab2, CM33322 Ab4, CM33322 Ab11, CM33322 Ab28. Se incubaron PBMC completas durante 48 horas con MICA recombinante (rMICA) en presencia de los anticuerpos indicados, un anticuerpo de control negativo (específico para TTCF) o un anticuerpo de control positivo (BioLegend). La lisis específica se evaluó mediante la liberación de 51Cr después de 4 horas.
FIG. 59 | Una serie de gráficas de FACS que muestra la regulación de NKG2D mediante MICA recombinante. Se incubaron PBMC enteras con suero de control o suero con rMICA añadido solo o en presencia de los anticuerpos indicados durante 48 horas. Después de 48 horas, se lavaron las células y se evaluó la expresión superficial de NKG2D mediante citometría de flujo.
FIG. 60A-60D | A. Se muestra el epítopo de CM33322 Ab29 en la secuencia de aminoácidos de MICA*009 (SEQ ID NO: 185); B. Se muestra el epítopo de CM33322 Ab4 en la secuencia de aminoácidos de MICA*009 (SEQ ID NO: 185); C. Se muestra el epítopo de CM33322 Ab11 en la secuencia de aminoácidos de MICA*009 (SEQ ID NO: 185); D. Se muestra el epítopo de CM33322 Ab23 en la secuencia de aminoácidos de MICA*009 (s EQ ID NO: 185).
FIG. 61 | Mapeo de epítopos para CM33322Ab29, CM33322Ab4 y CM33322Ab28 en la estructura de referencia de MICA*009. El mapeo de epítopos se llevó a cabo usando matrices de péptidos solapantes. Cada péptido fue una secuencia lineal de 20 aminoácidos con un desplazamiento de 10 aminoácidos para cada péptido.
FIG. 62a-62c | Una serie de diagramas de barras que muestran que los anticuerpos CM24002 Ab2, CM33322Ab29 y CM33322Ab28 previnieron la regulación negativa del receptor NKGD en (a) células NK y (b) linfocitos T CD8 humanos; y (c) los anticuerpos CM24002 Ab2 y CM33322Ab28 previnieron la inhibición de la citotoxicidad de linfocitos T CD8 mediante sMICA (clon específico para NY-ESO, células Mel375 marcadas con 51Cr, relación E:T de 20:1). Los datos son representativos de al menos tres experimentos independientes.
FIG. 63a-63c | Una serie de gráficas que muestran que (a) los anticuerpos para MICA se unen al dominio a3 de MICA, según se mide mediante ELISA; (b) los anticuerpos específicos para el dominio a3 de MICA aumentaron los niveles superficiales de MICA en células RPMI-8226 durante una incubación de 48 horas; y (c) inhibieron la secreción de MICA por células A375 durante una incubación de 48 horas (ELISA de sobrenadantes para sMICA). Los datos son representativos de al menos tres experimentos independientes.
FIG. 64a-64b | Una serie de gráficas que muestran que en ratones SCID a los que se implantan células tumorales U937 humanas, el tratamiento con anticuerpos para MICA durante una semana (3x 100 pg de Ab por semana) (a) se redujo sMICA en homogeneizado de tumor (normalizado a la masa tumoral); y (b) aumentó la expresión de MICA sobre la superficie de las células tumorales (citometría de flujo). Los datos representan una composición de tres experimentos independientes (n=10 ratones/grupo/experimento).
FIG. 65a-65f | Una serie de gráficas que muestran la evaluación de la función de células NK en ratones SCID portadores de tumores U937 tratados durante una semana con mAb para MICA (3x 100 pg). El tratamiento con anticuerpo aumentó los niveles superficiales de NKG2D (a) y NKp46 (b) por células NK CD45+ NK1.1 infiltrantes en tumores e indujeron la acumulación de células NK en tumores (c) (normalizado a 1x105 células CD45+). El tratamiento aumentó la expresión de IFNy (d) y perforina (e) de células NK CD45+ NK1.1+. (f) Los tres anticuerpos para MICA humano potenciaron la eliminación ex vivo de células YAC-1 marcadas con 51Cr por esplenocitos.
Descripción detallada
La presente divulgación está basada, en parte, en la observación de que pueden obtenerse anticuerpos dirigidos contra dianas terapéuticas importantes en una enfermedad de sujetos humanos expuestos a la enfermedad mediante marcaje de linfocitos B con una forma tetramérica del antígeno de interés. Como se ha descrito en la sección de antecedentes anterior, los métodos anteriores están limitados al menos en que son ineficaces para identificar linfocitos B adecuados en sujetos humanos y/o debido a que inducen a los linfocitos B capturados a sufrir cambios fenotípicos, reduciendo de este modo su valor. Por el contrario, en el presente documento se describen métodos que permiten la captura de linfocitos B de memoria escasos dirigidos contra antígenos específicos relacionados con enfermedades. Como se describe a continuación, los métodos requieren la tetramerización del antígeno relacionado con la enfermedad, potenciando dicho proceso, como se demuestra en los ejemplos más adelante, la identificación de linfocitos B de memoria adecuados. Específicamente, los métodos en el presente documento permiten una captura más eficaz de linfocitos B de memoria adecuados durante periodos de tiempo aumentados después de la exposición de un sujeto al antígeno. Los métodos en el presente documento también incluyen anticuerpos (y péptidos generados a partir de las secuencias de dichos anticuerpos) generados usando material genético obtenido de linfocitos B de memoria capturados usando los métodos divulgados en el presente documento.
En el presente documento se describen anticuerpos humanos contra la secuencia A relacionada con polipéptido de la clase I del MHC (MICA). Estos anticuerpos humanos contra MICA se identificaron de pacientes que habían recibido una vacuna contra el cáncer basada células (células tumorales autólogas transducidas con GM-CSF) mediante métodos que implican el uso de antígenos tetraméricos.
En algunos casos, la divulgación proporciona métodos para obtener o dirigir específicamente anticuerpos con potencial terapéutico de sujetos humanos seleccionados y composiciones terapéuticas resultantes de los mismos. Estos métodos pueden incluir: obtener o dirigir células inmunitarias en un sujeto humano, en donde las células inmunitarias incluyen, pero sin limitación, por ejemplo, linfocitos B y/o linfocitos B de memoria, aislar o purificar material genético (por ejemplo, ADN y/o ARNm) de las células inmunitaria obtenidas o dirigidas y usar el material genético aislado o purificado para producir composiciones terapéuticas, por ejemplo, composiciones terapéuticas divulgadas en el presente documento. Se proporciona una descripción adicional de los métodos en la sección bajo el encabezado "Métodos", a continuación.
En algunos casos, la divulgación proporciona composiciones terapéuticas (por ejemplo, incluyendo péptidos terapéuticos, incluyendo anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, derivados de anticuerpos y/o conjugados de anticuerpos) relacionadas con anticuerpos presentes en sujetos que tienen o han tenido una afección o enfermedad que mostró una respuesta inmunitaria positiva contra la afección o enfermedad.
Composiciones terapéuticas
En algunos casos, las composiciones terapéuticas del presente documento pueden interactuar con (por ejemplo, unirse, unirse específicamente y/o unirse inmunoespecíficamente) compañeros de unión (por ejemplo, inmunógenos, antígenos y/o epítopos) relacionados con una enfermedad o afección, en donde la interacción entre la composición terapéutica y los compañeros de unión da como resultado una respuesta inmunitaria positiva contra la afección o enfermedad (por ejemplo, una reducción en el grado de la enfermedad o los síntomas de la misma en un sujeto).
En algunos casos, las composiciones terapéuticas pueden incluir péptidos que incluyen (por ejemplo, comprenden, consisten esencialmente en o constan de) al menos una (por ejemplo, una, dos, tres, cuatro, cinco y/o seis) regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada variable (Vh) y/o la cadena ligera variable (Vl) del anticuerpo con la ID 1, 6, 7, 8, 911 o 12, mostrado en la tabla 1.
En algunos casos, las composiciones terapéuticas pueden incluir péptidos que incluyen (por ejemplo, comprenden, consisten esencialmente en o constan de) al menos una (por ejemplo, una, dos, tres, cuatro, cinco y/o seis) regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada variable (Vh) y/o la cadena ligera variable (Vl) del anticuerpo con la ID 1, 6, 7, 8, 911 o 12, mostrado en la tabla 1 y que interactúa con (por ejemplo, se une, se une específicamente y/o se une inmunoespecíficamente) a la secuencia A relacionada con el polipéptido de clase I del MHC (MICA (por ejemplo, UniGene Hs.130838)) (por ejemplo, MICA soluble (sMICA)), incluyendo epítopos de los mismos.
En algunos casos, las composiciones terapéuticas pueden incluir péptidos que incluyen al menos una CDR de la VH y/o Vl del anticuerpo con la ID 1,6, 7, 8, 9, 11 o 12 mostrado en la tabla 1, en donde el péptido se une (por ejemplo, se une específicamente y/o se une inmunoespecíficamente) a MICA (por ejemplo, MICA humano (por ejemplo, MICA soluble (sMICA))). En algunos casos, los péptidos pueden incluir al menos dos CDR, en donde al menos dos CDR son CDR mostradas en la tabla 1 para diferentes anticuerpos. En otras palabras, las CDR (y las FR y/o secuencias de AA) mostradas en la tabla 1 para los anticuerpos con las ID 1, 6, 7, 8, 9, 11 o 12 son intercambiables y pueden combinarse para generar péptidos, en tanto que los péptidos se unan (por ejemplo, se unan específicamente y/o se unan inmunoespecíficamente) a MICA (por ejemplo, MICA humano (por ejemplo, MICA soluble (sMICA))). En algunos casos, dichos péptidos incluyen la CDR3 de la Vh y/o Vl del anticuerpo con la ID 1, 6, 7, 8, 9, 11 o 12 mostrada en la tabla 1. En algunos casos, dichos péptidos incluyen la CDR3 de la Vh y Vl del anticuerpo con la ID 1,6, 7, 8, 9 y/u 11 y la CDR1 y/o CDR2 de la Vh y/o Vl del anticuerpo con la ID 1, 6, 7, 8, 9, 11 o 12 mostrado en la tabla 1. En algunos casos, dichos péptidos incluyen la CDR1, la CDR2 y la CDR3 de la Vh y/o Vl del anticuerpo con la ID 1, 6, 7, 8, 9, 11 o 12. En algunos casos, dichos péptidos incluyen la CDR1, la CDR2 y la CDR3 de la Vh y/o Vl del anticuerpo con la ID 1, 6, 7, 8, 9, 11 o 12 y al menos una de la FR1, FR2, FR3 y/o FR4 de la Vh y/o Vl del anticuerpo con la ID 1, 6, 7, 8, 9, 11 o 12, mostrado en la tabla 1. En algunos casos, dichos péptidos incluyen una de la SEQ ID NO: 2, 77, 96, 113, 131, 150 o 168 y/o una de la SEQ ID NO: 11, 79, 98, 115, 133, 152 o 170. En cada caso, el péptido puede unirse (por ejemplo, unirse específicamente y/o unirse inmunoespecíficamente) a MICA (por ejemplo, MICA humano (por ejemplo, MICA soluble (sMICA))). En algunos casos, la afinidad de unión entre los péptidos y MICA puede ser de entre aproximadamente 0,1 nM a 1 pM, por ejemplo, aproximadamente 10 nM.
En algunos casos, las composiciones terapéuticas pueden incluir péptidos que incluyen al menos una CDR de la Vh y/o Vl del anticuerpo con la ID 1 mostrado en la tabla 1, en donde el péptido se une (por ejemplo, se une específicamente y/o se une inmunoespecíficamente) a MICA (por ejemplo, MICA humano (por ejemplo, MICA soluble (sMICA))). En algunos casos, dichos péptidos incluyen la CDR3 de la Vh y/o Vl del anticuerpo con la ID 1 mostrado en la tabla 1. En algunos casos, dichos péptidos incluyen la CDR3 de la Vh y Vl del anticuerpo con la ID 1 y la CDR1 y/o la CDR2 de la Vh y/o Vl del anticuerpo con la ID 1 mostrado en la tabla 1. En algunos casos, dichos péptidos incluyen la CDR1, la CDR2 y la CDR3 de la Vh y/o Vl del anticuerpo con la ID 1. En algunos casos, dichos péptidos incluyen la CDR1, la CDR2 y la CDR3 de la Vh y/o Vl del anticuerpo con la ID 1 y al menos una de la FR1, FR2, FR3 y/o FR4 de la Vh y/o Vl del anticuerpo con la ID 1, mostrado en la tabla 1. En algunos casos, dichos péptidos incluyen la SEQ ID NO: 2 y/o la SEQ ID NO: 11. En cada caso, el péptido puede unirse (por ejemplo, unirse específicamente y/o unirse inmunoespecíficamente) a MICA (por ejemplo, MiCa humano (por ejemplo, MICA soluble (sMICA))). En algunos casos, la afinidad de unión entre los péptidos y MICA puede ser de entre aproximadamente 0,1 nM a 1 pM, por ejemplo, aproximadamente 10 nM.
En algunos casos, las composiciones terapéuticas pueden incluir péptidos que incluyen al menos una CDR de la Vh y/o Vl del anticuerpo con la ID 6 mostrado en la tabla 1, en donde el péptido se une (por ejemplo, se une específicamente y/o se une inmunoespecíficamente) a MICA (por ejemplo, MICA humano (por ejemplo, MICA soluble (sMICA))). En algunos casos, dichos péptidos incluyen la CDR3 de la Vh y/o Vl del anticuerpo con la ID 6 mostrado en la tabla 1. En algunos casos, dichos péptidos incluyen la CDR3 de la Vh and Vl del anticuerpo con la ID 6 y la CDR1 y/o la CDR2 de la Vh y/o Vl del anticuerpo con la iD 6 mostrado en la tabla 1. En algunos casos, dichos péptidos incluyen la CDR1, la CDR2 y la CDR3 de la Vh y/o Vl del anticuerpo con la ID 6. En algunos casos, dichos péptidos incluyen la CDR1, la CDR2 y la CDR3 de la Vh y/o Vl del anticuerpo con la ID 6 y al menos una de la FR1, FR2, FR3 y/o FR4 de la Vh y/o Vl del anticuerpo con la ID 6, mostrado en la tabla 1. En algunos casos, dichos péptidos incluyen la SEQ ID NO: 77 y/o la SEQ ID NO: 79. En cada caso, el péptido puede unirse (por ejemplo, unirse específicamente y/o unirse inmunoespecíficamente) a MICA (por ejemplo, MICA humano (por ejemplo, MICA soluble (sMICA))). En algunos casos, la afinidad de unión entre los péptidos y MICA puede ser de entre aproximadamente 0,1 nM a 1 pM, entre aproximadamente 50 nM y 200 nM o entre 1 nM y 20 nM, por ejemplo, 500 nM o menos, 400 nM o menos, 300 nM o menos, 200 nM o menos, 100 nM o menos, 50 nM o menos, 10 nM o menos, 5 nM o menos, 1 nM, 0,5 nM o menos, 0,4 nM o menos, 0,3 nM o menos, 0,2 nM o menos o 0,10 nM o menos.
En algunos casos, las composiciones terapéuticas pueden incluir péptidos que incluyen al menos una CDR de la Vh y/o Vl del anticuerpo con la ID 7 mostrado en la tabla 1, en donde el péptido se une (por ejemplo, se une específicamente y/o se une inmunoespecíficamente) a MICA (por ejemplo, MICA humano (por ejemplo, MICA soluble (sMICA))). En algunos casos, dichos péptidos incluyen la CDR3 de la Vh y/o Vl del anticuerpo con la ID 7 mostrado en la tabla 1. En algunos casos, dichos péptidos incluyen la CDR3 de la Vh and Vl del anticuerpo con la ID 7 y la CDR1 y/o la CDR2 de la Vh y/o Vl del anticuerpo con la iD 7 mostrado en la tabla 1. En algunos casos, dichos péptidos incluyen la CDR1, la CDR2 y la CDR3 de la Vh y/o Vl del anticuerpo con la ID 7. En algunos casos, dichos péptidos incluyen la CDR1, la CDR2 y la CDR3 de la Vh y/o Vl del anticuerpo con la ID 7 y al menos una de la FR1, FR2, FR3 y/o FR4 de la Vh y/o Vl del anticuerpo con la ID 7, mostrado en la tabla 1. En algunos casos, dichos péptidos incluyen la SEQ ID NO: 96 y/o la SEQ ID NO: 98. En cada caso, el péptido puede unirse (por ejemplo, unirse específicamente y/o unirse inmunoespecíficamente) a MICA (por ejemplo, MICA humano (por ejemplo, MICA soluble (sMICA))). En algunos casos, la afinidad de unión entre los péptidos y MICA puede ser de entre aproximadamente 0,1 nM a 1 pM, entre aproximadamente 50 nM y 200 nM o entre 1 nM y 20 nM, por ejemplo, 500 nM o menos, 400 nM o menos, 300 nM o menos, 200 nM o menos, 100 nM o menos, 50 nM o menos, 10 nM o menos, 5 nM o menos, 1 nM, 0,5 nM o menos, 0,4 nM o menos, 0,3 nM o menos, 0,2 nM o menos o 0,10 nM o menos.
En algunos casos, las composiciones terapéuticas pueden incluir péptidos que incluyen al menos una CDR de la Vh y/o Vl del anticuerpo con la ID 8 mostrado en la tabla 1, en donde el péptido se une (por ejemplo, se une específicamente y/o se une inmunoespecíficamente) a MICA (por ejemplo, MICA humano (por ejemplo, MICA soluble (sMICA))). En algunos casos, dichos péptidos incluyen la CDR3 de la Vh y/o Vl del anticuerpo con la ID 8 mostrado en la tabla 1. En algunos casos, dichos péptidos incluyen la CDR3 de la Vh and Vl del anticuerpo con la ID 8 y la CDR1 y/o la CDR2 de la Vh y/o Vl del anticuerpo con la iD 8 mostrado en la tabla 1. En algunos casos, dichos péptidos incluyen la CDR1, la CDR2 y la CDR3 de la Vh y/o Vl del anticuerpo con la ID 8. En algunos casos, dichos péptidos incluyen la CDR1, la CDR2 y la CDR3 de la Vh y/o Vl del anticuerpo con la ID 8 y al menos una de la FR1, FR2, FR3 y/o FR4 de la Vh y/o Vl del anticuerpo con la ID 8, mostrado en la tabla 1. En algunos casos, dichos péptidos incluyen la SEQ ID NO: 113 y/o la SEQ ID NO: 115. En cada caso, el péptido puede unirse (por ejemplo, unirse específicamente y/o unirse inmunoespecíficamente) a MICA (por ejemplo, MICA humano (por ejemplo, MICA soluble (sMICA))). En algunos casos, la afinidad de unión entre los péptidos y MICA puede ser de entre aproximadamente 0,1 nM a 1 pM, entre aproximadamente 50 nM y 200 nM o entre 1 nM y 20 nM, por ejemplo,
500 nM o menos, 400 nM o menos, 300 nM o menos, 200 nM o menos, 100 nM o menos, 50 nM o menos, 10 nM o menos, 5 nM o menos, 1 nM, 0,5 nM o menos, 0,4 nM o menos, 0,3 nM o menos, 0,2 nM o menos o 0,10 nM o menos.
En algunos casos, las composiciones terapéuticas pueden incluir péptidos que incluyen al menos una CDR de la Vh y/o Vl del anticuerpo con la ID 9 mostrado en la tabla 1, en donde el péptido se une (por ejemplo, se une específicamente y/o se une inmunoespecíficamente) a MICA (por ejemplo, MICA humano (por ejemplo, MICA soluble (sMICA))). En algunos casos, dichos péptidos incluyen la CDR3 de la Vh y/o Vl del anticuerpo con la ID 9 mostrado en la tabla 1. En algunos casos, dichos péptidos incluyen la CDR3 de la Vh and Vl del anticuerpo con la ID
9 y la CDR1 y/o la CDR2 de la Vh y/o Vl del anticuerpo con la ID 9 mostrado en la tabla 1. En algunos casos, dichos péptidos incluyen la CDR1, la CDR2 y la CDR3 de la Vh y/o Vl del anticuerpo con la ID 9. En algunos casos, dichos péptidos incluyen la CDR1, la CDR2 y la CDR3 de la Vh y/o Vl del anticuerpo con la ID 9 y al menos una de la FR1,
FR2, FR3 y/o FR4 de la Vh y/o Vl del anticuerpo con la ID 9, mostrado en la tabla 1. En algunos casos, dichos péptidos incluyen la SEQ ID NO: 131 y/o la SEQ ID NO: 133. En cada caso, el péptido puede unirse (por ejemplo, unirse específicamente y/o unirse inmunoespecíficamente) a MICA (por ejemplo, MICA humano (por ejemplo, MICA soluble (sMICA))). En algunos casos, la afinidad de unión entre los péptidos y MICA puede ser de entre aproximadamente 0,1 nM a 1 pM, entre aproximadamente 50 nM y 200 nM o entre 1 nM y 20 nM, por ejemplo,
500 nM o menos, 400 nM o menos, 300 nM o menos, 200 nM o menos, 100 nM o menos, 50 nM o menos, 10 nM o menos, 5 nM o menos, 1 nM, 0,5 nM o menos, 0,4 nM o menos, 0,3 nM o menos, 0,2 nM o menos o 0,10 nM o menos.
En algunos casos, las composiciones terapéuticas pueden incluir péptidos que incluyen al menos una CDR de la Vh y/o Vl del anticuerpo con la ID 11 mostrado en la tabla 1, en donde el péptido se une (por ejemplo, se une específicamente y/o se une inmunoespecíficamente) a MICA (por ejemplo, MICA humano (por ejemplo, MICA soluble (sMICA))). En algunos casos, dichos péptidos incluyen la CDR3 de la VH y/o Vl del anticuerpo con la ID 11 mostrado en la tabla 1. En algunos casos, dichos péptidos incluyen la CDR3 de la Vh and Vl del anticuerpo con la ID
11 y la CDR1 y/o la CDR2 de la Vh y/o Vl del anticuerpo con la ID 11 mostrado en la tabla 1. En algunos casos, dichos péptidos incluyen la CDR1, la CDR2 y la CDR3 de la Vh y/o Vl del anticuerpo con la ID 11. En algunos casos, dichos péptidos incluyen la CDR1, la CDR2 y la CDR3 de la Vh y/o Vl del anticuerpo con la ID 11 y al menos una de la FR1, FR2, FR3 y/o FR4 de la Vh y/o Vl del anticuerpo con la ID 11, mostrado en la tabla 1. En algunos casos, dichos péptidos incluyen la SEQ ID NO: 150 y/o la SEQ ID NO: 152. En cada caso, el péptido puede unirse (por ejemplo, unirse específicamente y/o unirse inmunoespecíficamente) a MICA (por ejemplo, MICA humano (por ejemplo, MICA soluble (sMICA))). En algunos casos, la afinidad de unión entre los péptidos y MICA puede ser de entre aproximadamente 0,1 nM a 1 pM, entre aproximadamente 50 nM y 200 nM o entre 1 nM y 20 nM, por ejemplo,
500 nM o menos, 400 nM o menos, 300 nM o menos, 200 nM o menos, 100 nM o menos, 50 nM o menos, 10 nM o menos, 5 nM o menos, 1 nM, 0,5 nM o menos, 0,4 nM o menos, 0,3 nM o menos, 0,2 nM o menos o 0,10 nM o menos.
En algunos casos, las composiciones terapéuticas pueden incluir péptidos que incluyen al menos una CDR de la Vh y/o Vl del anticuerpo con la ID 12 mostrado en la tabla 1, en donde el péptido se une (por ejemplo, se une específicamente y/o se une inmunoespecíficamente) a MICA (por ejemplo, MICA humano (por ejemplo, MICA soluble (sMICA))). En algunos casos, dichos péptidos incluyen la CDR3 de la Vh y/o Vl del anticuerpo con la ID 12 mostrado en la tabla 1. En algunos casos, dichos péptidos incluyen la CDR3 de la Vh and Vl del anticuerpo con la ID
12 y la CDR1 y/o la CDR2 de la Vh y/o Vl del anticuerpo con la ID 12 mostrado en la tabla 1. En algunos casos, dichos péptidos incluyen la CDR1, la CDR2 y la CDR3 de la Vh y/o Vl del anticuerpo con la ID 12. En algunos casos, dichos péptidos incluyen la CDR1, la CDR2 y la CDR3 de la Vh y/o Vl del anticuerpo con la ID 12 y al menos una de la FR1, FR2, FR3 y/o FR4 de la Vh y/o Vl del anticuerpo con la ID 12, mostrado en la tabla 1. En algunos casos, dichos péptidos incluyen la SEQ ID NO: 168 y/o la SEQ ID NO: 170. En cada caso, el péptido puede unirse (por ejemplo, unirse específicamente y/o unirse inmunoespecíficamente) a MICA (por ejemplo, MICA humano (por ejemplo, MICA soluble (sMICA))). En algunos casos, la afinidad de unión entre los péptidos y MICA puede ser de entre aproximadamente 0,1 nM a 1 pM, entre aproximadamente 50 nM y 200 nM o entre 1 nM y 20 nM, por ejemplo,
500 nM o menos, 400 nM o menos, 300 nM o menos, 200 nM o menos, 100 nM o menos, 50 nM o menos, 10 nM o menos, 5 nM o menos, 1 nM, 0,5 nM o menos, 0,4 nM o menos, 0,3 nM o menos, 0,2 nM o menos o 0,10 nM o menos.
En algunos casos, las composiciones terapéuticas pueden incluir péptidos que incluyen: la SEQ ID NO: 2 y/o la SEQ
ID NO: 11; la SEQ ID NO: 77 y/o la SEQ ID NO: 79; la SEQ ID NO: 96 y/o la SEQ ID NO: 98; la SEQ ID NO: 113 y/o la SEQ ID NO: 115; la SEQ ID NO: 131 y/o la SEQ ID NO: 133; la SEQ ID NO: 150 y/o la SEQ ID NO: 152; y la SEQ
ID NO: 168 y/o 170.
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Un "péptido" se refiere a una cadena que comprende al menos dos restos de aminoácido enlazados consecutivamente, sin un límite superior en la longitud de la cadena. Uno o más restos de aminoácido en la proteína pueden contener una modificación, tal como, pero sin limitación, glucosilación, fosforilación o formación de enlaces disulfuro. El término "péptido" se usa indistintamente en el presente documento con "polipéptido" y "proteína".
En algunos casos, las composiciones terapéuticas pueden incluir péptidos, incluyendo, por ejemplo, anticuerpos, incluyendo anticuerpos de longitud completa y/o intactos o fragmentos de anticuerpo. Un "anticuerpo" es una molécula de inmunoglobulina capaz de unirse específicamente a una diana, tal como un carbohidrato, polinucleótido, lípido, polipéptido, etc., a través de al menos un sitio de reconocimiento de antígeno, ubicado en la región variable de la molécula de inmunoglobulina. Como se usa en el presente documento, el término "anticuerpo" abarca no solo anticuerpos policlonales o monoclonales intactos, sino también cualquier fragmento de unión a antígeno (es decir, "porción de unión a antígeno") o cadena individual del mismo, proteínas de fusión que comprenden un anticuerpo y cualquier otra configuración modificada de la molécula de inmunoglobulina que comprenda un sitio de reconocimiento de antígeno. Un anticuerpo incluye un anticuerpo de cualquier clase, tal como IgG, IgA o IgM (o subclase del mismo) y no es necesario que el anticuerpo sea de cualquier clase particular. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos de la región constante de la cadena pesada del anticuerpo, las inmunoglobulinas se pueden asignar a diferentes clases. Hay cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM y varias de estas pueden además dividirse en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl e IgA2. Las regiones constante de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulina se denominan alfa, delta, épsilon, gamma y mu, respectivamente. Las estructuras de las subunidades y las configuraciones tridimensionales de las diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas.
Los anticuerpos y fragmentos de anticuerpo a modo de ejemplo incluyen, pero sin limitación, anticuerpos monoclonales (incluyendo anticuerpos monoclonales de longitud completa), anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos formados a partir de al menos dos fragmentos de unión a epítopo diferentes (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos), anticuerpos camelizados, anticuerpos quiméricos, Fv monocatenarios (scFv), anticuerpos monocatenarios, los anticuerpos de dominio único, anticuerpos de dominio, fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2, fragmentos de anticuerpo que muestran la actividad biológica deseada (por ejemplo, la porción de unión a antígeno), Fv unidos por disulfuro (dsFv) y anticuerpos antiidiotipo (anti-Id) (incluyendo, por ejemplo, anticuerpos anti-Id contra anticuerpos de la invención), intracuerpos y fragmentos de unión a epítopo de cualquiera de los anteriores. Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo pueden ser humanos o humanizados. En determinados aspectos, un anticuerpo es un anticuerpo de origen no natural, tal como un anticuerpo que comprende como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 diferencias de aminoácidos (por ejemplo, sustituciones, adiciones o eliminaciones) en relación con un anticuerpo de origen natural. Las una o más diferencias de aminoácidos pueden encontrarse en la cadena ligera y/o en la cadena pesada y pueden encontrarse en una o más de las CDR, en una región marco o en una región constante, por ejemplo, en la CL, CH1, bisagra, CH2 o CH3.
Los anticuerpos normalmente se unen específicamente a su antígeno afín con alta afinidad, reflejada por una constante de disociación (Kd) de 10"5 a 10"” M o menos. Se considera que cualquier Kd mayor de aproximadamente 10-4 M generalmente indica unión no específica. Como se usa en el presente documento, un anticuerpo que "se une específicamente" a un antígeno se refiere a un anticuerpo que se une al antígeno y a antígenos sustancialmente idénticos con alta afinidad, lo que significa que tiene una Kd de 10"7 M o menor, preferentemente de 10"8 M o menor, aún más preferentemente, de 5 x 10"9 M o menor y lo más preferentemente, de entre 10"8 M y 10"10 M o menor, pero no se une con alta afinidad a antígenos no relacionados. Un antígeno es "sustancialmente idéntico" a un antígeno dado en caso de que muestre un alto grado de identidad de secuencia con el antígeno dado, por ejemplo, en caso de que muestre al menos un 80 %, al menos un 90 %, preferentemente al menos un 95 %, más preferentemente al menos un 97 % o aún más preferentemente al menos un 99 % de identidad de secuencia respecto de la secuencia del antígeno dado. A modo de ejemplo, un anticuerpo que se une específicamente a MICA humano también puede tener reactividad cruzada con antígenos de MIDA de ciertas especies de primate (por ejemplo, MICA de cinomolgo), pero no pueden reaccionar de manera cruzada con antígenos de MICA de otra especie o con un antígeno distinto de MICA.
Los fragmentos de anticuerpo son adecuados para su uso en los métodos proporcionados, en tanto que contengan una porción de unión a antígeno y conserven la afinidad y especificidad deseada del anticuerpo de longitud completa. La expresión "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo (o simplemente "porción de anticuerpo"), como se usa en el presente documento, se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que conservan la capacidad de unirse específicamente a un antígeno (por ejemplo, MICA humano). Dichos "fragmentos" tienen, por ejemplo, entre aproximadamente 8 y aproximadamente 1500 aminoácidos de longitud, de manera adecuada, entre aproximadamente 8 y aproximadamente 745 aminoácidos de longitud, de manera adecuada, de aproximadamente 8 a aproximadamente 300, por ejemplo, de aproximadamente 8 a aproximadamente 200 aminoácidos o de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 o 100 aminoácidos de longitud. Por lo tanto, un fragmento de un anticuerpo anti-MICA conservará la capacidad de unirse a MICA, respectivamente, en la porción Fv y la capacidad de unirse al receptor de Fc en células dendríticas, macrófagos, neutrófilos, linfocitos B y células NK en la porción FC. Dichos fragmentos se caracterizan por propiedades similares al anticuerpo anti-MICA correspondiente de longitud completa, es decir, los fragmentos se unirán específicamente a un antígeno de MICA humano, respectivamente, expresado sobre la superficie de una célula humana o el antígeno de sMICA correspondiente que se ha secretado al medio.
Se ha demostrado que la función de unión a antígeno de un anticuerpo se puede realizar mediante fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Los ejemplos de los fragmentos de unión abarcados en la expresión "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios Vl, Vh, CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos mediante un puente disulfuro en la región de bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento Fv que consiste en los dominios Vl y Vh de un único brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento de dAb (Ward et al. (1989) Nature 341:544-546), que consiste en un dominio Vh; y (vi) una región determinante de la complementariedad (CDR) aislada o (vii) una combinación de dos o más CDR aisladas que opcionalmente pueden estar unidas mediante un enlazador sintético. Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, Vl y Vh, están codificados por genes separados, se pueden unir, utilizando métodos recombinantes, mediante un enlazador sintético que les permite formarse como una sola cadena de proteína en la que las regiones Vl y Vh se aparean para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena única (scFv); véase, por ejemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; y Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). También se pretende que los anticuerpos de cadena única estén abarcados dentro de la expresión "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo. Estos fragmentos de anticuerpo se obtienen usando técnicas convencionales conocidas por aquellos expertos en la materia y se seleccionan en función de su utilidad del mismo modo que los anticuerpos intactos. Las porciones de unión a antígeno se pueden producir mediante técnicas de ADN recombinante o mediante escisión enzimática o química de inmunoglobulinas intactas.
Un fragmento Fv es un fragmento de anticuerpo que contiene un sitio de reconocimiento y unión a antígeno completo. Esta región consiste en un dímero de un dominio variable de cadena pesada y uno de cadena ligera en asociación estrecha, que puede ser de naturaleza covalente, por ejemplo, en scFv. Es en esta configuración en las que las tres CDR de cada dominio variable interaccionan para definir un sitio de unión a antígeno en la superficie del dímero VH-VL. En conjunto, las seis CDR o un subconjunto de las mismas confieren especificidad de unión a antígeno al anticuerpo. Sin embargo, incluso un único dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende solo tres CDR específicas para un antígeno) puede tener la capacidad de reconocer y unirse al antígeno, aunque normalmente con una afinidad menor que el sitio de unión completo.
Los fragmentos de anticuerpos Fv monocatenarios o scFv comprenden los dominios Vh y Vl del anticuerpo, en donde estos dominios están presentes en una sola cadena de polipéptido. En general, el polipéptido de Fv comprende además un enlazador polipeptídico entre los dominios Vh y Vl, que permite al scFv formar la estructura deseada para la unión a antígeno.
El fragmento Fab contiene un dominio variable y constante de la cadena ligera y un dominio variable y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos de anticuerpo F(ab')2 comprenden un par de fragmentos Fab que en general están unidos entre sí covalentemente cerca de su extremo carboxilo mediante cisteínas de bisagra. También se conocen en la técnica otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpo.
Un "anticuerpo bifuncional" o "biespecífico" es un anticuerpo híbrido artificial que tiene dos pares de cadenas pesadas/ligeras diferentes y dos sitios de unión diferentes. Los anticuerpos biespecíficos se pueden producir mediante varios métodos que incluyen la fusión de hibridomas o la unión de fragmentos Fab'. Véase, por ejemplo, Songsivilai y Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992).
Los diacuerpos son pequeños fragmentos de anticuerpo con dos sitios de unión a antígeno, comprendiendo dichos fragmentos una Vh conectada a una Vl en la misma cadena de polipéptido (Vh y Vl). Usando un enlazador que sea demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios de la misma cadena, se fuerza a los dominios a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión a antígeno.
Los anticuerpos lineales comprenden un par de segmentos Fd en tándem (Vh-CH1-Vh-CH1) que, junto con polipéptidos de cadena ligera complementarios, forman un par de regiones de unión a antígeno. Los anticuerpos lineales pueden ser biespecíficos o monoespecíficos.
Los anticuerpos y fragmentos de anticuerpo de la presente divulgación pueden modificarse en la región Fc para proporcionar las funciones efectoras o la semivida en suero deseadas. En algunos casos, puede conjugarse la región Fc a PEG o albúmina para aumentar la semivida en suero o alguna otra conjugación que dé como resultado el efecto deseado. Como alternativa, en los casos en los que es deseable eliminar o reducir la función efectora, con el objetivo de minimizar los efectos secundarios o las complicaciones terapéuticas, pueden usarse otras regiones Fc concretas.
Los anticuerpos humanos y humanizados incluyen anticuerpos que tienen regiones variables y constantes procedentes de (o que tienen la misma secuencia de aminoácidos que los procedentes de) secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. Los anticuerpos humanos pueden incluir restos de aminoácidos no codificados por las secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o específica de sitio in vitro o por mutación somática in vivo), por ejemplo, en las CDR y en particular CDR3. La expresión "anticuerpo humano recombinante", como se usa en el presente documento, incluye todos los anticuerpos humanos que se preparan, expresan, crean o aíslan por medios recombinantes, tales como (a) anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico o transcromosómico para genes de inmunoglobulina humana o un hibridoma preparado a partir de los mismos, (b) anticuerpos aislados de una célula hospedadora transformada para expresar el anticuerpo, por ejemplo, a partir de un transfectoma, (c) anticuerpos aislados de una biblioteca combinatoria recombinante de anticuerpos humanos y (d) anticuerpos que se preparan, expresan, crean o aíslan por cualquier otro medio que implica el corte y empalme de secuencias génicas de inmunoglobulina humana a otras secuencias de ADN. Dichos anticuerpos humanos recombinantes comprenden regiones variables y constantes que utilizan secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana particulares que están codificadas por genes de línea germinal, pero incluyen reordenaciones y mutaciones posteriores que se producen, por ejemplo, durante la maduración del anticuerpo. Como se conoce en la técnica (véase, por ejemplo, Lonberg (2005) Nature Biotech. 23(9): 1117-1125), la región variable contiene el dominio de unión a antígeno, que está codificado por diversos genes que se reordenan para formar un anticuerpo específico para un antígeno exógeno. Además de por reordenamiento, la región variable puede modificarse adicionalmente mediante múltiples cambios de aminoácidos individuales (lo que se denomina mutación somática o hipermutación) para aumentar la afinidad del anticuerpo por el antígeno exógeno. La región constante cambiará además en respuesta a un antígeno (es decir, cambio de isotipo). Por lo tanto, las moléculas de ácido nucleico reorganizadas y mutadas somáticamente que codifican los polipéptidos de inmunoglobulina de cadena ligera y de cadena pesada en respuesta a un antígeno pueden no tener identidad de secuencia con las moléculas de ácido nucleico originales, pero en cambio serán sustancialmente idénticas o similares (es decir, tienen al menos un 80 % de identidad).
Un anticuerpo "humano" (HuMAb) se refiere a un anticuerpo que tiene regiones variables en las que las regiones tanto marco como CDR proceden de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. Además, en caso de que el anticuerpo contenga una región constante, la región constante también proviene de las secuencias de inmunoglobulinas de la línea germinal humana. Los anticuerpos humanos de la invención pueden incluir restos de aminoácidos no codificados por las secuencias de inmunoglobulinas de la línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria y de sitio específico in vitro o mediante mutación somática in vivo). Sin embargo, la expresión "anticuerpo humano", como se usa en el presente documento, no pretende incluir anticuerpos en los que las CDR procedentes de la línea germinal de otra especie de mamífero, tal como de un ratón, se han injertado en secuencias flanqueantes humanas. Las expresiones anticuerpos "humanos" y anticuerpos "totalmente humanos" se usan indistintamente.
Un anticuerpo "humanizado" se refiere a un anticuerpo en el que algunos, la mayoría o todos los aminoácidos fuera de los dominios CDR de un anticuerpo no humano se reemplazan por aminoácidos correspondientes procedentes de inmunoglobulinas humanas. En un aspecto de una forma humanizada de un anticuerpo, algunos, la mayoría o todos los aminoácidos fuera de los dominios CDR se han reemplazado por aminoácidos de inmunoglobulinas humanas, mientras que algunos, la mayoría o todos los aminoácidos dentro de una o más regiones CDR no cambian. Son admisibles pequeñas adiciones, eliminaciones, inserciones, sustituciones o modificaciones de aminoácidos en tanto que no supriman la capacidad del anticuerpo para unirse a un antígeno particular. Un anticuerpo "humanizado" conserva una especificidad antigénica similar a la del anticuerpo original.
Un "anticuerpo quimérico" se refiere a un anticuerpo en el que las regiones variables proceden de una especie y las regiones constantes proceden de otra especie, tal como un anticuerpo en el que las regiones variables proceden de un anticuerpo de ratón y las regiones constantes proceden de un anticuerpo humano.
El término "epítopo", como se usa en el presente documento, se refiere a un determinante de proteína capaz de unirse a un anticuerpo. Los epítopos normalmente consisten en agrupamientos de superficie químicamente activos de moléculas tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar y normalmente tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Los epítopos pueden formarse tanto a partir de aminoácidos no contiguos yuxtapuestos mediante el plegamiento terciario de una proteína (por ejemplo, epítopos conformacionales) o de aminoácidos contiguos (por ejemplo, epítopos no conformacionales). Los epítopos conformacionales y no conformacionales se distinguen en que se pierde la unión del primero pero no la del segundo en presencia de disolventes desnaturalizantes. Un epítopo normalmente incluye al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 aminoácidos en una conformación espacial única. Se conocen bien en la técnica métodos para determinar qué epítopos se unen a un anticuerpo dado (es decir, mapeo de epítopos) e incluyen, por ejemplo, ensayos de inmunotransferencia e inmunoprecipitación, en donde se evalúa la reactividad de péptidos solapantes o contiguos (por ejemplo, de MICA) con un anticuerpo dado (por ejemplo, anticuerpo anti-MICA). Los métodos para determinar la conformación espacial de un epítopo incluyen las técnicas en la especialidad y las descritas en el presente documento, por ejemplo, cristalografía de rayos X y resonancia magnética nuclear en 2 dimensiones (véase, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)).
La expresión "mapeo de epítopos" se refiere al proceso de identificación de los determinantes moleculares para el reconocimiento de anticuerpo-antígeno.
La expresión "se une a un epítopo" o "reconoce a un epítopo", con referencia a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, se refiere a segmentos continuos o discontinuos de aminoácidos en un antígeno. Los expertos en la materia entienden que los términos no significan necesariamente que el anticuerpo o fragmento de anticuerpo se encuentra en contacto directo con cada aminoácido en una secuencia de epítopo.
La expresión "se une al mismo epítopo", en referencia a dos o más anticuerpos, significa que los anticuerpos se unen a segmentos de aminoácidos iguales, solapantes o continuos o discontinuos inclusivos. Los expertos en la materia entienden que la frase "se une al mismo epítopo" no significa necesariamente que los anticuerpos se unan a o estén en contacto exactamente con los mismos aminoácidos. Los aminoácidos concretos con los que entran en contacto los anticuerpos pueden diferir. Por ejemplo, un primer anticuerpo puede unirse a un segmento de aminoácidos que está completamente abarcado por el segmento de aminoácidos al que se une un segundo anticuerpo. En otro ejemplo, un primer anticuerpo se une a uno o más segmentos de aminoácidos que se solapan significativamente con los uno o más segmentos a los que se une el segundo anticuerpo. Para los fines del presente documento, se considera que dichos anticuerpos "se unen al mismo epítopo".
Por consiguiente, asimismo, se encuentran abarcados por la presente invención anticuerpos que se unen a un epítopo en MICA que comprende la totalidad o una parte (por ejemplo, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos, contiguos o no contiguos) de un epítopo reconocido por los anticuerpos particulares descritos en el presente documento (por ejemplo, la misma o una región solapante o una región entre o que abarca la región).
Las técnicas para determinar anticuerpos que se unen al "mismo epítopo en MICA" que los anticuerpos descritos en el presente documento incluyen, por ejemplo, métodos de mapeo de epítopos, tales como, análisis de rayos X de cristales de complejos de antígeno:anticuerpo que proporciona resolución atómica del epítopo. Otros métodos controlan la unión del anticuerpo a fragmentos de antígeno o variaciones mutadas del antígeno en las que la pérdida de unión debida a una modificación de un residuo de aminoácido dentro de la secuencia de antígeno se considera a menudo una indicación de un componente de epítopo. Además, también se pueden utilizar métodos combinatorios computacionales para el mapeo de epítopos. Estos métodos se basan en la capacidad del anticuerpo de interés para aislar por afinidad péptidos cortos específicos de bibliotecas combinadas de péptidos de presentación de fagos. Por tanto, los péptidos se consideran conductores para la definición del epítopo correspondiente al anticuerpo usado para cribar la biblioteca de péptidos. Para el mapeo de epítopos, también se han desarrollado algoritmos computacionales que ha demostrado que mapean epítopos conformacionales discontinuos.
Asimismo, la presente invención abarca anticuerpos que compiten por la unión a MICA con los anticuerpos descritos en el presente documento. Los anticuerpos que reconocen el mismo epítopo o compiten por la unión se pueden identificar usando técnicas rutinarias. Dichas técnicas incluyen, por ejemplo, un inmunoensayo, que muestra la capacidad de un anticuerpo para bloquear la unión de otro anticuerpo a un antígeno diana, es decir, un ensayo de unión competitiva. La unión competitiva se determina en un ensayo en el que la inmunoglobulina que se está analizando inhibe la unión específica de un anticuerpo de referencia a un antígeno común, tal como MICA. Se conocen numerosos tipos de ensayos de unión competitiva, por ejemplo: radioinmunoensayo (RIA, del inglés radioimmunoassay) directo o indirecto en fase sólida, inmunoensayo enzimático (EIA, del inglés enzyme immunoassay) directo o indirecto en fase sólida, ensayo de competición de tipo sándwich (véase Stahli et al., Methods in Enzymology 9:242 (1983)); EIA en fase sólida directa de biotina-avidina (véase, Kirkland et al., J. Immuno. 137:3614 (1986)); ensayo de marcaje directo en fase sólida, ensayo de tipo sándwich de marcaje directo en fase sólida (véase Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, 1988)); RIA de marcaje directo de fase sólida usando un marcaje de-125 (véase Morel et al., Mol. Immunol. 25(1):7 (1988)); EIA en fase sólida directa de biotina-avidina (Cheung et al., Virology 176:546 (1990)); y RIA de marcaje directo. (Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32:77 (1990)). Normalmente, dicho ensayo implica el uso de antígeno purificado unido a una superficie sólida o a células que portan cualquiera de estos, una inmunoglobulina de ensayo sin marcar y una inmunoglobulina de referencia marcada. La inhibición competitiva se mide determinando la cantidad de marcador unido a la superficie sólida o a las células en presencia de la inmunoglobulina de ensayo. Normalmente, la inmunoglobulina de ensayo está presente en exceso. Normalmente, cuando un anticuerpo competitivo está presente en exceso, inhibirá la unión específica de un anticuerpo de referencia a un antígeno común en al menos un 50-55 %, 55-60 %, 60-65 %, 65-70 %, 70-75 % o más.
Como se usa en el presente documento, las expresiones "unión específica", "unión selectiva", "se une de manera selectiva" y "se une de manera específica" se refieren a la unión del anticuerpo a un epítopo en un antígeno predeterminado. Normalmente, el anticuerpo se une con una constante de disociación en equilibrio (Kd) de aproximadamente menos de 10-7 M, tal como de aproximadamente menos de 10-8 M, 10-9 M o 10-10 M o incluso menor cuando se determina mediante la tecnología de resonancia de plasmón superficial (RPS) en un instrumento BIACORE 2000 usando MICA recombinante como el analito y el anticuerpo como el ligando y se une al antígeno predeterminado con una afinidad que es al menos dos veces mayor que su afinidad para unirse a un antígeno no específico (por ejemplo, BSA, caseína) que no sea el antígeno predeterminado o un antígeno estrechamente relacionado. Por consiguiente, un anticuerpo que "se une específicamente a MICA humano" se refiere a un anticuerpo que se une a MICA humano con una Kd de 10-7 M o menor, tal como de aproximadamente menos de 10-8 M, 10-9 M o 10-10 M o incluso menor. Un anticuerpo que "reacciona de manera cruzada con MICA de cinomolgo" se refiere a un anticuerpo que se une a MICA de cinomolgo con una Kd de 10-7 M o menor, tal como de aproximadamente menos de 10-8 M, 10-9 M o 10-10 M o incluso menor. En determinados aspectos, dichos anticuerpos que no reaccionan de manera cruzada con MICA de una especie no humana muestran una unión esencialmente indetectable contra estas proteínas en ensayos de unión convencionales.
El término "kasoc" o "ka", como se usa en el presente documento, pretende hacer referencia a la velocidad de asociación de una interacción anticuerpo-antígeno particular, mientras que el término "kdis" o "kd," como se usa en el presente documento, pretende hacer referencia a la velocidad de disociación de una interacción de anticuerpoantígeno particular. El término "Kd", como se usa en el presente documento, pretende hacer referencia a la constante de disociación, que se obtiene a partir de la relación de kd a ka (es decir, kd/ka) y se expresa como una concentración molar (M). Pueden determinarse los valores de KD para anticuerpos usando métodos bien establecidos en la técnica. Un método preferido para determinar la KD de un anticuerpo es mediante el uso de resonancia de plasmón superficial, preferentemente usando un sistema de biosensor, tal como un sistema Biacore®. Como se usa en el presente documento, la expresión "alta afinidad" por un anticuerpo IgG se refiere a un anticuerpo que tiene una Kd de 10-8 M o menor, más preferentemente, de 10-9 M o menor e incluso más preferentemente, de 10­ 10 M o menor por un antígeno diana. Sin embargo, la unión de "alta afinidad" puede variar para otros isotipos de anticuerpo. Por ejemplo, la unión de "alta afinidad" para un isotipo IgM se refiere a un anticuerpo que tiene una KD de 10-7 M o menor, más preferentemente, de 10-8 M o menor.
El término "CE50", como se usa en el presente documento, se refiere a la concentración de un anticuerpo o una porción de unión a antígeno del mismo, que induce una respuesta, bien en un ensayo in vitro o en un ensayo in vivo, que es el 50 % de la respuesta máxima, es decir, a medio camino entre la respuesta máxima y la de partida.
La expresión "se une a MICA inmovilizado" se refiere a la capacidad de un anticuerpo de la invención para unirse a MICA, por ejemplo, expresado sobre la superficie de una célula o que está unido a un soporte sólido.
La expresión "reacciona de manera cruzada" como se usa en el presente documento, se refiere a la capacidad de un anticuerpo de la invención para unirse a MICA de una especie diferente. Por ejemplo, un anticuerpo de la presente invención que se une a MICA humano también puede unirse a MICA de otra especie (por ejemplo, MICA de cinomolgo). Como se usa en el presente documento, la reactividad cruzada se mide detectando una reactividad específica con antígeno purificado en ensayos de unión (por ejemplo, SPR, ELISA) o unión a o de otro modo interaccionar funcionalmente con, células que expresan MICA de manera fisiológica. Los métodos para determinar la reactividad cruzada incluyen ensayos de unión convencionales como se describen en el presente documento, por ejemplo, mediante análisis de resonancia de plasmón superficial de Biacore™ (SPR) usando un instrumento Biacore™ 2000 SPR (Biacore AB, Uppsala, Suecia) o técnicas de citometría de flujo.
Una "CDR" de un dominio variable se refiere a restos de aminoácidos en la región hipervariable que se identifican de acuerdo con las definiciones de Kabat, Chothia, la acumulación tanto de Kabat como de Chothia, AbM, contacto y/o conformacional o cualquier método para determinar las CDR bien conocido en la técnica. Las CDR de anticuerpo pueden identificarse como las regiones hipervariables definidas originalmente por Kabat et al. Véase, por ejemplo, Kabat et al., 1992, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed., Public Health Service, NIH, Washington D.C. También pueden identificarse las posiciones de las CDR como las estructuras de bucle estructural descritas originalmente por Chothia y otros. Véase, por ejemplo, Chothia et al., 1989, Nature 342:877-883. Otras estrategias para la identificación de CDR incluyen la "definición AbM", que es un compromiso entre Kabat y Chothia y se obtiene usando el programa de modelado de anticuerpos AbM de Oxford Molecular (en la actualidad Accelrys®), o la "definición de contacto" de las CDR basándose en los contactos observados con el antígeno, expuesta en MacCallum et al., 1996, J. Mol. Biol., 262:732-745. En otro enfoque, citado en el presente documento como la "definición conformacional" de las CDR, pueden identificarse las posiciones de las CDR como los restos que efectúan aportaciones entálpicas a la unión al antígeno. Véase, por ejemplo, Makabe et al., 2008, Journal of Biological Chemistry, 283:1156-1166. Otras definiciones de límites de CDR pueden no seguir estrictamente ninguna de las estrategias anteriores, pero independientemente, se solaparán con al menos una parte de las CDR de Kabat, aunque pueden estar acortadas o alargadas en vista de la predicción o de hallazgos experimentales de que restos o grupos de restos particulares o incluso CDR enteras no tienen un impacto significativo en la unión al antígeno. Como se usa en el presente documento, una CDR puede referirse a CDR definidas mediante una estrategia conocida en la técnica, incluyendo combinaciones de estrategias. Los métodos usados en el presente documento pueden utilizar CDR definidas de acuerdo con cualquiera de estas estrategias. Para cualquier aspecto dado que contiene más de una CDR, las CDR pueden definirse de acuerdo con cualquiera de las definiciones de Kabat, Chothia, extendida, AbM, contacto y/o conformacional.
En algunos casos, las secuencias de aminoácidos de los péptidos divulgados en el presente documento pueden modificarse y variarse para crear variantes peptídicas (por ejemplo, péptidos con una homología de secuencia definida con los péptidos divulgados en el presente documento), por ejemplo, en tanto que se mantenga o mejore la propiedad de unión a antígeno del péptido en relación con el péptido no modificado (pueden evaluarse las propiedades de unión a antígeno de cualquier péptido modificado usando los ensayos in vitro y/o in vivo descritos en el presente documento y/o técnicas conocidas en la especialidad).
Aunque las variantes peptídicas se observan y analizan generalmente a nivel de aminoácidos, las modificaciones reales se introducen o efectúan normalmente a nivel de ácido nucleico. Por ejemplo, las variantes con un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 o 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos respecto de los péptidos mostrados en la tabla 1 pueden generarse modificando los ácidos nucleicos que codifican las SEQ ID NO: 1, 10, 76, 78, 95, 97, 112, 114, 130, 132, 149, 151, 167 y/o 169 o porciones/fragmentos de los mismos, usando técnicas (por ejemplo, técnicas de clonación) conocidas en la técnica y/o que se divulgan en el presente documento.
Las modificaciones de la secuencia de aminoácidos se encuentran normalmente en una o más de tres clases: modificaciones de sustitución, de inserción o de eliminación. Las inserciones incluyen fusiones amino y/o terminales, así como inserciones intrasecuencia de uno solo o de múltiples restos de aminoácidos. Las inserciones normalmente serán inserciones más pequeñas que las de las fusiones amino o carboxilo terminales, por ejemplo, en el orden de uno a cuatro restos. Las eliminaciones se caracterizan por la eliminación de uno o más restos de aminoácidos de la secuencia de proteína. Normalmente, se eliminan no más de aproximadamente 2 a 6 restos en un sitio cualquiera en la molécula de proteína. Las sustituciones de aminoácidos normalmente son de restos individuales, pero pueden producirse en una serie de ubicaciones diferentes a la vez; las inserciones normalmente serán en el orden de aproximadamente 1 a 10 restos de aminoácidos; y las eliminaciones normalmente variarán de 1 a 30 restos. Las eliminaciones o inserciones pueden efectuarse en pares adyacentes, es decir, una eliminación de 2 restos o inserción de 2 restos. Pueden combinarse sustituciones, eliminaciones, inserciones o cualquier combinación de las mismas para obtener una construcción final. Las mutaciones no deben colocar la secuencia fuera del marco de lectura y preferentemente no crearán regiones complementarias que podrían producir una estructura de ARNm secundaria. Las modificaciones por sustitución son aquellas en las que se ha eliminado al menos un resto y se ha insertado un resto diferente en su lugar. En algunos casos, las sustituciones pueden ser sustituciones de aminoácidos conservativas. En algunos casos, los péptidos en el presente documento pueden incluir una o más sustituciones de aminoácidos conservativas en relación con un péptido mostrado en la tabla 1. Por ejemplo, las variantes pueden incluir 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 20-30, 30-40 o 40-50 sustituciones de aminoácidos conservativas en relación con un péptido mostrado en la tabla 1. Como alternativa, las variantes pueden incluir 50 o menos, 40 o menos, 30 o menos, 20 o menos, 10 o menos, 9 o menos, 8 o menos, 7 o menos, 6 o menos, 5 o menos, 4 o menos, 3 o menos o 2 o menos sustituciones de aminoácidos conservativas en relación con un péptido mostrado en la tabla 1. Dichas sustituciones se efectúan normalmente de acuerdo con la tabla 2 a continuación y se citan como sustituciones conservativas. Se conocen en la técnica métodos para predecir la tolerancia a la modificación de proteínas (véase, por ejemplo, Guo et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 101(25):9205-9210 (2004)).
Tabla 2: Sustituciones conservativas de aminoácidos
Aminoácido Sustituciones (se conocen otras en la técnica)
Ala Ser, Gly, Cys
Arg Lys, Gln, His
Asn Gln, His, Glu, Asp
Asp Glu, Asn, Gln
Cys Ser, Met, Thr
Gln Asn, Lys, Glu, Asp, Arg
Glu Asp, Asn, Gln
Gly Pro, Ala, Ser
His Asn, Gln, Lys
Ile Leu, Val, Met, Ala
Leu Ile, Val, Met, Ala
Lys Arg, Gln, His
Met Leu, Ile, Val, Ala, Phe
Phe Met, Leu, Tyr, Trp, His
Ser Thr, Cys, Ala
Thr Ser, Val, Ala
Trp Tyr, Phe
Tyr Trp, Phe, His
Val Ile, Leu, Met, Ala, Thr
En algunos casos, las sustituciones son no conservativas. Por ejemplo, puede reemplazarse un aminoácido en un péptido mostrado en la tabla 1 por un aminoácido que pueda alterar alguna propiedad o aspecto del péptido. En algunos casos, pueden efectuarse sustituciones de aminoácidos no conservativas, por ejemplo, para cambiar la estructura de un péptido, para cambiar las propiedades de unión de un péptido (por ejemplo, para aumentar o reducir la afinidad de unión del péptido a un antígeno y/o para alterar, aumentar o reducir la especificidad de unión del péptido al antígeno).
En algunos casos, los péptidos y/o variantes de péptido pueden incluir o pueden ser fragmentos de los péptidos mostrados en la tabla 1. Dichos fragmentos pueden incluir, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 50-100, 101-150, menos aminoácidos que las CDR, FR y/o AA mostrados en la tabla 1, por ejemplo, en tanto que los fragmentos conserven al menos una parte de las propiedades de unión del péptido de longitud completa (por ejemplo, al menos un 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 100 % de las propiedades de unión del péptido de longitud completa). Pueden efectuarse truncamientos en el extremo amino, el extremo carboxilo y/o en los péptidos en el presente documento.
En algunos casos, la superficie de interacción de una variante de péptido puede ser la misma (por ejemplo, sustancialmente la misma) que un péptido no modificado, por ejemplo, para alterar (por ejemplo, aumentar o reducir), conservar o mantener las propiedades de unión de la variante de péptido en relación con el péptido no modificado. Los métodos para identificar la superficie de interacción de un péptido se conocen en la técnica (Gong et al., BMC: Bioinformatics, 6:1471-2105 (2007); Andrade y Wei et al., Pure and Appl. Chem., 64(11):1777-1781 (1992); Choi et al., “Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics, 77(1): 14-25 (2009); Park et al., BMC: and Bioinformatics, 10:1471-2105 (2009).
Los expertos en la materia entienden fácilmente cómo determinar la identidad de dos polipéptidos (por ejemplo, un péptido no modificado y una variante de polipéptido). Por ejemplo, la identidad puede calcularse después de alinear las dos secuencias, de tal forma que la identidad se encuentra en su nivel más elevado. Puede llevarse a cabo otra forma para calcular la identidad mediante algoritmos publicados. Puede llevarse a cabo un alineamiento óptimo de secuencias para su comparación mediante el algoritmo de identidad local de Smith y Waterman, Adv. Appl. Math, 2:482 (1981), mediante el algoritmo de alineamiento de identidad de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), mediante el método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988), mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) o mediante inspección.
Pueden obtenerse los mismos tipos de identidad para ácidos nucleicos mediante, por ejemplo, los algoritmos divulgados en Zuker, Science 244:48-52 (1989); Jaeger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:7706-10 (1989); Jaeger et al., Methods Enzymol. 183:281-306 (1989). Se entiende que normalmente puede usarse cualquiera de los métodos y que en ciertos casos, los resultados de estos métodos diversos pueden diferir, pero el experto en la materia entenderá que si se encuentra identidad con al menos uno de estos métodos, puede decirse que las secuencias tienen la identidad indicada y pueden divulgarse en el presente documento.
El porcentaje de identidad entre dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartido por las secuencias (es decir, % de homología = n.° de posiciones idénticas/n.° total de posiciones x 100), teniendo en cuenta el número de huecos y la longitud de cada hueco, que es necesario introducir para un alineamiento óptimo de las dos secuencias. La comparación de secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias pueden lograrse usando un algoritmo matemático, como se describe en los ejemplos no limitantes a continuación.
Puede determinarse el porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos usando el programa GAP en el paquete informático GCG (disponible en http://www.gcg.com), usando una matriz NWSgapdna.CMP y una ponderación por hueco de 40, 50, 60, 70 u 80 y una ponderación por longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6. También puede determinarse el porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos usando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller (CABIOS, 4:11-17 (1989)) que se ha incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0), usando una tabla de ponderación de restos PAM120, una penalización por longitud de hueco de 12 y una penalización por hueco de 4. Además, puede determinarse el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos usando el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970)) que se ha incorporado en el programa GAP en el paquete informático g Cg (disponible en http://www.gcg.com), usando o bien una matriz Blossum 62 o una matriz PAM250 y una ponderación por hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6 o 4 y una ponderación por longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6.
Las secuencias de ácido nucleico y de proteína de la presente invención pueden usarse además como una "secuencia de consulta" para realizar una búsqueda frente a bases de datos públicas para, por ejemplo, identificar secuencias relacionadas. Dichas búsquedas pueden realizarse usando los programas NBLAST y XBLAST (versión 2.0) de Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. Pueden realizarse búsquedas de nucleótidos BLAsT con el programa NBLAST, puntuación = 100, longitud de palabra = 12 para obtener secuencias de nucleótidos homólogas a la molécula de ácido nucleico de la invención. Las búsquedas de proteínas BLAST pueden realizarse con el programa XBLAST, puntuación = 50, longitud de palabra = 3 para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a la molécula de proteína de la invención. Para obtener alineaciones con huecos con fines de comparación, puede utilizarse Gapped BLAST como se describe en Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402. Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, pueden usarse los parámetros por defecto de los programas respectivos (por ejemplo, XBLAST y NBLAST). Véase www.ncbi.nlm.nih.gov.
En algunos casos, como se describe en más detalle en la sección de métodos más adelante, pueden producirse composiciones terapéuticas divulgadas en el presente documento usando material genético (por ejemplo, ADN y/o ARNm) aislado y/o purificado de células inmunitarias (por ejemplo, linfocitos B, incluyendo linfocitos B de memoria) obtenidos usando los métodos descritos en el presente documento. Una vez que se ha obtenido dicho material genético, se conocen en la técnica y/o se resumen a continuación métodos para usarlo para producir las composiciones terapéuticas divulgadas en el presente documento.
En algunos casos, los péptidos pueden incluir un marcador detectable. Como se usa en el presente documento, un "marcador" se refiere a un resto que tiene al menos un elemento, isótopo o grupo funcional incorporado en el resto que permite la detección del péptido al que se une el marcador. Los marcadores pueden unirse directamente (es decir, a través de un enlace) o pueden unirse mediante un enlazador (por ejemplo, tales como, por ejemplo, un alquileno cíclico o acíclico, ramificado o no ramificado, sustituido o sin sustituir; alquenileno cíclico o acíclico, ramificado o no ramificado, sustituido o sin sustituir; alquinileno cíclico o acíclico, ramificado o no ramificado, sustituido o sin sustituir; heteroalquileno cíclico o acíclico, ramificado o no ramificado, sustituido o sin sustituir; heteroalquenileno cíclico o acíclico, ramificado o no ramificado, sustituido o sin sustituir; heteroalquinileno cíclico o acíclico, ramificado o no ramificado, sustituido o sin sustituir; arileno sustituido o sin sustituir; heteroarileno sustituido o sin sustituir; o acileno sustituido o sin sustituir o cualquier combinación de los mismos, que pueda formar un enlazador). Los marcadores pueden unirse a un péptido en cualquier posición que no interfiera con la actividad o características biológicas del polipéptido de la invención que se está detectando.
Los marcadores pueden incluir: marcadores que contiene restos isotópicos, que pueden ser isótopos radiactivos o pesados, incluyendo, pero sin limitación, 2H,~V 13C, 14C, 15N, 31P, 32P, 35S, 67Ga, 99mTc (Tc-99m), 111In, 123I, 125I, 69Yb y 186Re; marcadores que incluyen restos inmunitarios o inmunorreactivos, que pueden ser anticuerpos o antígenos, que pueden estar unidos a enzimas (por ejemplo, tales como peroxidasa de rábano picante); marcadores que son coloreados, luminiscentes, fosforescentes o incluyen restos fosforescentes (por ejemplo, tal como el marcador fluorescente FITC); marcadores que tienen uno o más restos de fotoafinidad; marcadores que tienen restos de ligando con uno o más compañeros de unión conocidos (tales como biotina-estreptavidina, FK506-FKBP, etc.).
En algunos casos, los marcadores pueden incluir uno o más restos de fotoafinidad para la dilucidación directa de interacciones intermoleculares en sistemas biológicos. Puede emplearse varios fotóforos conocidos, basándose la mayoría en la fotoconversión de compuestos diazo, azidas o diazirinas en nitrenos o carbenos (véase, por ejemplo, Bayley, H., Photogenerated Reagents in Biochemistry and Molecular Biology (1983), Elsevier, Ámsterdam). En determinados aspectos de la invención, los marcadores de fotoafinidad empleados son o-, m- y p-azidobenzoílos, sustituidos con uno o más restos de halógeno, incluyendo, pero sin limitación, ácido 4-azido-2,3,5,6-tetrafluorobenzoico.
Los marcadores también pueden ser o pueden servir como agentes para la obtención de imágenes. Los agentes para la obtención de imágenes incluyen, pero sin limitación, los empleados en tomografía de emisión de positrones (PET), tomografía asistida por computadora (TAC), tomografía computarizada de emisión de fotón único, rayos X, fluoroscopia y obtención de imágenes mediante resonancia magnética (IRM); antieméticos; y agentes de contraste. Los agentes de diagnóstico a modo de ejemplo incluyen, pero sin limitación, restos fluorescentes, restos luminiscentes, restos magnéticos; quelatos de gadolinio (por ejemplo, quelatos de gadolinio con DTPA, DTPA-BMA, DOTA y HP-DO3A), quelatos de hierro, quelatos de magnesio, quelatos de manganeso, quelatos de cobre, quelatos de cromo, materiales a base de yodo útiles para la obtención de imágenes por CAT y rayos X y radionúclidos. Los radionúclidos adecuados incluyen, pero sin limitación 123I, 125I, 130I, 31I, 13 I, 135I, 47Sc, 2As, 2Se, 90Y, 88Y, 97Ru, 100Pd, 101mRh, 119Sb, 128Ba, 197Hg, 211At, 212Bi, 212Pb, 109Pd, 111In, 67Ga, 68Ga, 67Cu, 75Br, 77Br, 99mTc, 14C, 13N, 15O, 32P, 33P y 18F.
Los restos fluorescentes y luminiscentes incluyen, pero sin limitación, varias moléculas pequeñas orgánicas o inorgánicas citadas comúnmente como "colorantes", "marcadores" o "indicadores". Los ejemplos incluyen, pero sin limitación, fluoresceína, rodamina, tintes de acridina, tintes Alexa, tintes de cianina, etc. Los restos fluorescentes y luminiscentes pueden incluir varias proteínas de origen natural y derivados de las mismas, por ejemplo, variantes modificadas por ingeniería genética. Por ejemplo, las proteínas fluorescentes incluyen proteína fluorescente verde (GFP), GFP mejorada, proteínas fluorescentes rojas, azules, amarillas, cian y zafiro, proteína fluorescente de arrecife de coral, etc. Las proteínas luminiscentes incluyen luciferasa, aecuorina y derivados de las mismas. Se conocen en la técnica numerosos tintes y proteínas fluorescentes y luminiscentes (véase, por ejemplo, la Publicación de Patente de los Estados Unidos 2004/0067503; Valeur, B., "Molecular Fluorescence: Principles and Applications," John Wiley and Sons, 2002; y Handbook of Fluorescent Probes and Research Products, Molecular Probes, 9.a edición, 2002).
El término "purificado" o "aislado", como se usa en el presente documento, se refiere a otras moléculas, por ejemplo, polipéptido, molécula de ácido nucleico que se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de su ambiente natural. Por lo tanto, en un aspecto, los anticuerpos de la invención son anticuerpos purificados en donde se han separado de uno o más componentes de su ambiente natural.
Composiciones de ácido nucleico
En algunos casos, la divulgación proporciona secuencias correspondientes a (por ejemplo, que codifican) los péptidos divulgados (por ejemplo, divulgados en la tabla 1). Estas secuencias incluyen todas las secuencias degeneradas relacionadas con los péptidos divulgados, es decir, todos los ácidos nucleicos que tienen una secuencia que codifica un péptido particular y variantes y derivados de los mismos. Por lo tanto, aunque puede no escribirse expresamente cada secuencia de ácido particular en el presente documento, se entiende que se divulgan y describen en el presente documento todas y cada una de las secuencias por medio de las secuencias de polipéptido divulgadas.
En algunos casos, los ácidos nucleicos de la divulgación pueden incluir vectores de expresión. Los ejemplos de vectores adecuados incluyen, pero sin limitación, plásmidos, cromosomas artificiales, tales como BAC, YAC o PAC y vectores víricos.
Los vectores proporcionados también pueden incluir, por ejemplo, orígenes de replicación y/o marcadores. Un gen marcador puede conferir un fenotipo de selección, por ejemplo, resistencia a antibióticos, en una célula. El producto marcador se usa para determinar si el vector se ha suministrado a la célula y una vez que se ha suministrado, si se está expresando. Los ejemplos de marcadores de selección para células de mamífero son dihidrofolato reductasa (DHFR), timidina cinasa, neomicina, análogo de neomicina G418, higromicina, puromicina y blasticidina. Cuando se transfieren con éxito dichos marcadores de selección a una célula hospedadora de mamífero, la célula hospedadora de mamífero transformada puede sobrevivir si se somete a presión selectiva. Los ejemplos de otros marcadores incluyen, por ejemplo, el gen lacZ de E. coli, proteína fluorescente verde (GFP) y luciferasa. Además, un vector de expresión puede incluir una secuencia marcadora diseñada para facilitar la manipulación o la detección (por ejemplo, purificación o localización) del polipéptido expresado. Las secuencias marcadoras, tales como GFP, glutatión S-transferasa (GST), polihistidina, c-myc, hemaglutinina o marcador FLAG™ (Kodak; New Haven, CT) se expresan normalmente en forma de una fusión con el polipéptido codificado. Dichos marcadores pueden insertarse en cualquier parte dentro del polipéptido, incluyendo en uno cualquiera de los extremos carboxilo o amino.
En algunos casos, la divulgación incluye células que comprenden los ácidos nucleicos (por ejemplo, vectores) y/o péptidos divulgados en el presente documento. Las células pueden incluir, por ejemplo, células eucariotas y/o procariotas. En general, las células que pueden usarse en el presente documento se encuentran disponibles comercialmente de, por ejemplo, la American Type Culture Collection (ATCC), P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108. Véase también F. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York, NY, (1998). Se describen métodos de transformación y transfección útiles en la generación de las células divulgadas en el presente documento, por ejemplo, en F. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York, NY, (1998).
Se ha demostrado la transferencia génica mediada por vectores para diseñar el suministro dirigido de anticuerpos. (Balazs et al., Nature. 30 de noviembre de 2011;481(7379):81-4). Por consiguiente, en un aspecto, la presente divulgación proporciona métodos y composiciones para suministrar un polinucleótido que codifica un péptido que se une inmunoespecíficamente a MICA de interés en una célula diana usando un virus. En el contexto de la terapia génica, las secuencias de ácido nucleico que codifican el péptido que se une inmnunoespecíficamente a MICA pueden suministrarse a las células mediante un vector (por ejemplo, un vector vírico, incluyendo, pero sin limitación, adenovirus, virus vaccinia o virus adenoasociado). Por ejemplo, puede unirse a la superficie del virus una proteína, tal como un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que tiene especificidad por una molécula particular de la superficie celular, permitiendo que el virus se dirija a células específicas. Además, el virus puede modificarse para que contenga secuencias de ácido nucleico, tales como promotores, que permiten al virus funcionar únicamente en células particulares, tales como células cancerosas.
En algunos casos, las composiciones terapéuticas divulgadas pueden incluir un vector (por ejemplo, vector de expresión, un vector vírico, un vector de vino adenoasociado) que comprende un ácido nucleico que codifica un péptido que se une inmunoespecíficamente a MICA. En un aspecto, el péptido que se une inmunoespecíficamente a MICA es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une inmunoespecíficamente a MICA. Como se describe en el presente documento, los anticuerpos y fragmentos de anticuerpo incluyen, pero sin limitación, anticuerpos monoclonales (incluyendo anticuerpos monoclonales de longitud completa), anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos formados a partir de al menos dos fragmentos de unión a epítopo diferentes (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos), anticuerpos camelizados, anticuerpos quiméricos, Fv monocatenarios (scFv), anticuerpos monocatenarios, los anticuerpos de dominio único, anticuerpos de dominio, fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2, fragmentos de anticuerpo que muestran la actividad biológica deseada (por ejemplo, la porción de unión a antígeno), Fv unidos por disulfuro (dsFv) y anticuerpos antiidiotipo (anti-Id) (incluyendo, por ejemplo, anticuerpos anti-Id contra anticuerpos de la invención), intracuerpos y fragmentos de unión a epítopo de cualquiera de los anteriores.
Por consiguiente, en un aspecto, la divulgación proporciona vectores y células que comprenden una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente un 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o más de identidad de secuencia o completa (100 %) respecto de la SEQ ID NO: 1, 76, 95, 112, 130, 149 o 167. En algunos aspectos, la secuencia de ácido nucleico codifica un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98, 99 % o 100 % de identidad respecto de la SEQ ID NO: 2, 77, 96, 113, 131, 150 o 167.
En un aspecto, el vector puede comprender una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente un 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o más de identidad de secuencia o completa (100 %) respecto de la SEQ ID NO: 10, 78, 97, 114, 132, 151 o 169. En algunos aspectos, la secuencia de ácido nucleico codifica un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98, 99 % o 100 % de identidad respecto de la SEQ ID NO: 11, 79, 98, 115, 133, 152 o 169.
En algunos aspectos, la divulgación proporciona composiciones que comprenden ácidos nucleicos que codifican péptidos que se unen inmunoespecíficamente a la secuencia A relacionada con polipéptido de clase I del MHC (MICA) o un epítopo en el mismo. En algunos aspectos, los ácidos nucleicos de las composiciones codifican la VH del anticuerpo con la ID 1, 6, 7, 8, 9, 11 o 12 mostrado en la tabla 1 que tiene 5 o menos sustituciones de aminoácidos conservativas. En algunos aspectos, los ácidos nucleicos de las composiciones codifican la Vl del anticuerpo con la ID 1, 6, 7, 8, 9, 11 o 12 mostrado en la tabla 1 que tiene 5 o menos sustituciones de aminoácidos conservativas.
En algunos aspectos, un ácido nucleico que codifica un péptido descrito en el presente documento, por ejemplo, una cadena pesada o ligera de un anticuerpo, no es un anticuerpo de origen natural. Un ácido nucleico de origen no natural puede comprender, por ejemplo, como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 diferencias de nucleótidos (por ejemplo, sustituciones, adiciones o eliminaciones) en relación con un ácido nucleico de origen natural.
En un aspecto, la divulgación proporciona ácidos nucleicos aislados que comprenden una secuencia de nucleótidos con al menos aproximadamente un 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o más de identidad de secuencia o completa (100 %) respecto de la SEQ ID NO: 1. En algunos aspectos, la secuencia de ácido nucleico aislada codifica un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98, 99 % o 100 % de identidad respecto de la SEQ ID NO: 2. En otro aspecto, la divulgación proporciona ácidos nucleicos aislados que comprenden una secuencia de nucleótidos con al menos aproximadamente un 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o más de identidad de secuencia o completa (100 %) respecto de la SEQ ID NO: 10. En algunos aspectos, la secuencia de ácido nucleico aislada codifica un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98, 99 % o 100 % de identidad respecto de la SEQ ID NO: 11.
En un aspecto, la divulgación proporciona ácidos nucleicos aislados que comprenden una secuencia de nucleótidos con al menos aproximadamente un 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o más de identidad de secuencia o completa (100 %) respecto de la SEQ ID NO: 76. En algunos aspectos, la secuencia de ácido nucleico aislada codifica un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98, 99 % o 100 % de identidad respecto de la SEQ ID NO: 77. En otro aspecto, la divulgación proporciona ácidos nucleicos aislados que comprenden una secuencia de nucleótidos con al menos aproximadamente un 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o más de identidad de secuencia o completa (100 %) respecto de la SEQ ID NO: 78. En algunos aspectos, la secuencia de ácido nucleico aislada codifica un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98, 99 % o 100 % de identidad respecto de la SEQ ID NO: 79.
En un aspecto, la divulgación proporciona ácidos nucleicos aislados que comprenden una secuencia de nucleótidos con al menos aproximadamente un 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o más de identidad de secuencia o completa (100 %) respecto de la SEQ ID NO: 95. En algunos aspectos, la secuencia de ácido nucleico aislada codifica un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98, 99 % o 100 % de identidad respecto de la SEQ ID NO: 96. En otro aspecto, la divulgación proporciona ácidos nucleicos aislados que comprenden una secuencia de nucleótidos con al menos aproximadamente un 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o más de identidad de secuencia o completa (100 %) respecto de la SEQ ID NO: 97. En algunos aspectos, la secuencia de ácido nucleico aislada codifica un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98, 99 % o 100 % de identidad respecto de la SEQ ID NO: 98.
En un aspecto, la divulgación proporciona ácidos nucleicos aislados que comprenden una secuencia de nucleótidos con al menos aproximadamente un 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o más de identidad de secuencia o completa (100 %) respecto de la SEQ ID NO: 112. En algunos aspectos, la secuencia de ácido nucleico aislada codifica un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98, 99 % o 100 % de identidad respecto de la SEQ ID NO: 113. En otro aspecto, la divulgación proporciona ácidos nucleicos aislados que comprenden una secuencia de nucleótidos con al menos aproximadamente un 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o más de identidad de secuencia o completa (100 %) respecto de la SEQ ID NO: 114. En algunos aspectos, la secuencia de ácido nucleico aislada codifica un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98, 99 % o 100 % de identidad respecto de la SEQ ID NO: 115.
En un aspecto, la divulgación proporciona ácidos nucleicos aislados que comprenden una secuencia de nucleótidos con al menos aproximadamente un 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o más de identidad de secuencia o completa (100 %) respecto de la SEQ ID NO: 130. En algunos aspectos, la secuencia de ácido nucleico aislada codifica un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98, 99 % o 100 % de identidad respecto de la SEQ ID NO: 131. En otro aspecto, la divulgación proporciona ácidos nucleicos aislados que comprenden una secuencia de nucleótidos con al menos aproximadamente un 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o más de identidad de secuencia o completa (100 %) respecto de la SEQ ID NO: 132. En algunos aspectos, la secuencia de ácido nucleico aislada codifica un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98, 99 % o 100 % de identidad respecto de la SEQ ID NO: 133.
En un aspecto, la divulgación proporciona ácidos nucleicos aislados que comprenden una secuencia de nucleótidos con al menos aproximadamente un 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o más de identidad de secuencia o completa (100 %) respecto de la SEQ ID NO: 149. En algunos aspectos, la secuencia de ácido nucleico aislada codifica un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98, 99 % o 100 % de identidad respecto de la SEQ ID NO: 150. En otro aspecto, la divulgación proporciona ácidos nucleicos aislados que comprenden una secuencia de nucleótidos con al menos aproximadamente un 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o más de identidad de secuencia o completa (100 %) respecto de la SEQ ID NO: 151. En algunos aspectos, la secuencia de ácido nucleico aislada codifica un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98, 99 % o 100 % de identidad respecto de la SEQ ID NO: 152.
En un aspecto, la divulgación proporciona ácidos nucleicos aislados que comprenden una secuencia de nucleótidos con al menos aproximadamente un 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o más de identidad de secuencia o completa (100 %) respecto de la SEQ ID NO: 167. En algunos aspectos, la secuencia de ácido nucleico aislada codifica un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98, 99 % o 100 % de identidad respecto de la SEQ ID NO: 168. En otro aspecto, la divulgación proporciona ácidos nucleicos aislados que comprenden una secuencia de nucleótidos con al menos aproximadamente un 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o más de identidad de secuencia o completa (100 %) respecto de la SEQ ID NO: 169. En algunos aspectos, la secuencia de ácido nucleico aislada codifica un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98, 99 % o 100 % de identidad respecto de la SEQ ID NO: 170.
La expresión "ácido nucleico" o "molécula de ácido nucleico", como se usa en el presente documento, pretende incluir moléculas de ADN y moléculas de ARN. Una molécula de ácido nucleico puede ser monocatenaria o bicatenaria, pero es, preferentemente, ADN bicatenario.
Un ácido nucleico aislado puede ser, por ejemplo, una molécula de ADN, siempre que esté ausente o se elimine una de las secuencias de ácido nucleico normalmente encontradas inmediatamente flanqueantes a dicha molécula de ADN en un genoma de origen natural. Por lo tanto, un ácido nucleico aislado incluye, sin limitación, una molécula de ADN que existe como una molécula separada (por ejemplo, un ácido nucleico sintetizado químicamente, ADNc o fragmento de ADN producido mediante la PCR o tratamiento con endonucleasa de restricción) independiente de otras secuencias, así como ADN que se incorpora en un vector, un plásmido de replicación autónoma, un virus (por ejemplo, un retrovirus, lentivirus, adenovirus o herpes virus) o en el ADN genómico de un procariota o eucariota. Además, un ácido nucleico aislado puede incluir un ácido nucleico modificado por ingeniería genética, tal como una molécula de ADN recombinante que forma parte de un ácido nucleico híbrido o de fusión. No debe considerarse como ácido nucleico aislado un ácido nucleico que existe entre de cientos a millones de ácidos nucleicos diferentes en, por ejemplo, bibliotecas de ADN o genotecas o secciones de gel que contienen una digestión de restricción de ADN genómico.
A la hora de calcular el porcentaje de identidad de secuencia, se alinean dos secuencias y se determina el número de coincidencias de restos de nucleótidos o aminoácidos idénticos entre las dos secuencias. El número de coincidencias idénticas se divide entre la longitud de la región alineada (es decir, el número de nucleótidos o restos de aminoácidos alineados) y se multiplica por 100 para obtener un valor de porcentaje de identidad de secuencia. Se apreciará que la longitud de la región alineada puede ser una parte de una o ambas secuencias, hasta la longitud completa de la secuencia más corta. También se apreciará que puede alinearse una sola secuencia con más de una secuencia distinta y de este modo, se pueden tener diferentes valores de porcentaje de identidad de secuencia a lo largo de cada región alineada. Obsérvese que el valor de porcentaje de identidad normalmente se redondea al número entero más próximo. Por ejemplo, 78,1 %, 78,2 %, 78,3 % y 78,4 % se redondean por defecto a 78 %, mientras que 78,5 %, 78,6 %, 78,7 %, 78,8 % y 78,9 % se redondean por exceso a 79 %. Obsérvese también que la longitud de la región alineada siempre es un número entero.
Como se usa en el presente documento, la expresión "porcentaje de identidad de secuencia" se refiere al grado de identidad entre cualquier secuencia de búsqueda dada y una secuencia en cuestión. Puede determinarse el porcentaje de identidad para una secuencia de ácido nucleico o de aminoácidos de consulta, por ejemplo, un factor de transcripción, en relación con otra secuencia de ácido nucleico o aminoácidos en cuestión como se expone a continuación.
Los ácidos nucleicos pueden estar presentes en células enteras, en un lisado celular o en una forma parcialmente purificada o sustancialmente pura. Un ácido nucleico está "aislado" o "sustancialmente purificado" cuando se extrae mediante purificación de otros componentes celulares u otros contaminantes, por ejemplo, otros ácidos nucleicos o proteínas celulares, mediante técnicas convencionales, incluyendo tratamiento alcalino/SDS, bandeo de CsCl, cromatografía en columna, electroforesis en gel de agarosa y otras bien conocidas en la técnica. Véase, F. Ausubel, et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing y Wiley Interscience, Nueva York (1987).
Las composiciones de ácido nucleico de la presente invención, aunque normalmente está en una secuencia nativa (excepto para sitios de restricción modificados) de ADNc, genómica o mezclas de las mismas, puede mutarse, de acuerdo con técnicas convencionales, para proporcionar secuencias génicas. Para las secuencias codificantes, estas mutaciones, pueden afectar a la secuencia de aminoácidos según se desee. En particular, se contemplan secuencias de ADN sustancialmente homólogas a o procedentes de secuencias V, D, J, constantes, interruptores y otras secuencias similares descritas en el presente documento (donde "derivado" indica que una secuencia es idéntica o se modifica a partir de otra secuencia).
Un ácido nucleico está "unido de manera operativa" cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor o potenciador está unido operativamente a una secuencia codificante si afecta a la transcripción de la secuencia. Con respecto a las secuencias reguladoras de la transcripción, unido operativamente significa que las secuencias de ADN que se están uniendo son contiguas y, cuando es necesario unir dos regiones codificantes de proteína, contiguas y en marco de lectura. Para las secuencias de intercambio, unido operativamente indica que las secuencias son capaces de efectuar una recombinación de intercambio.
El término "vector", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier molécula usada para transferir una secuencia de ácido nucleico a una célula hospedadora. En algunos aspectos, se utiliza un vector de expresión. Un vector de expresión es una molécula de ácido nucleico que es adecuada para la transformación de una célula hospedadora y contiene secuencias de ácido nucleico que dirigen y/o controlan la expresión de las secuencias de ácido nucleico transformadas. La expresión incluye, pero sin limitación, procesos tales como transcripción, traducción y corte y empalme, en caso de que haya presencia de intrones. En algunos aspectos, se utiliza un vector vírico (por ejemplo, un retrovirus, adenovirus, virus adenoasociado (AAV), herpes virus y poxvirus, entre otros). Se entiende en la técnica que se encuentran disponibles en la técnica muchos vectores víricos de este tipo. En otros aspectos más, también puede ser adecuado en la práctica de la presente invención un vector plasmídico no vírico. Los vectores de la presente invención pueden construirse usando técnicas de recombinación convencionales ampliamente disponibles para un experto en la materia. Dichas técnicas pueden encontrarse en referencias de biología molecular convencionales, tales como Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2.a edición, 1989).
La expresión "célula hospedadora recombinante" (o simplemente "célula hospedadora"), como se usa en el presente documento, se emplea para hacer referencia a una célula en la que se ha introducido un vector de expresión recombinante. Debe entenderse que dichos términos pretenden hacer referencia no solo a la célula concreta, sino también a la descendencia de dicha célula. Debido a que pueden producirse determinadas mutaciones en generaciones posteriores debido a una mutación o a influencias ambientales, dicha descendencia puede, de hecho, no ser idéntica a la célula precursora, pero aun así se incluyen dentro del alcance de la expresión "célula hospedadora", tal como se usa en el presente documento.
Receptores de antígeno quimérico
En algunos casos, la invención proporciona receptores de antígeno quimérico (CAR) que comprenden péptidos que se unen inmunoespecíficamente a MICA y a un dominio de señalización de receptor de linfocitos T intracelular. (Kalos M, et al., Sci Transl Med. 10 de agosto de 2011;3(95)). En algunos aspectos, los CAR comprenden péptidos que se unen inmunoespecíficamente a MICA, un dominio bisagra extracelular, un dominio transmembrana de receptor de linfocitos T y un dominio de señalización de receptor de linfocitos T intracelular. Los aspectos adicionales de la invención proporcionan ácidos nucleicos relacionados, vectores de expresión recombinantes, células hospedadoras, poblaciones de células, anticuerpos o porciones de unión a antígeno de los mismos y composiciones farmacéuticas relacionadas con los CAR de la invención.
Un receptor de antígeno quimérico (CAR) es una proteína o polipéptido híbrido construido artificialmente que contiene los dominios de unión a antígeno de un anticuerpo (scFv) unido a dominios de señalización de linfocitos T. (Kalos M, et al., Sci Transl Med. 10 de agosto de 2011;3(95)). Kalos et al. describe la generación de linfocitos CAR T que se dirigen a CD19 y demuestra el potente efecto antitumoral mediado por linfocitos T modificados mediante CAR en pacientes con leucemia linfocítica crónica. Las características de linfocitos T modificadas por ingeniería genética de los CAR incluyen su capacidad para redirigir la especificidad y reactividad de los linfocitos T hacia una diana seleccionada de un modo no restringido al MHC, aprovechando las propiedades de unión a antígeno de los anticuerpos monoclonales. Los linfocitos T modificados con CAR tienen el potenciar de replicarse in vivo y su persistencia a largo plazo permite el control sostenido del tumor y obvian la necesidad de infusiones repetidas del anticuerpo. (Kalos M, et al., Sci Transí Med. 10 de agosto de 2011;3(95)). El reconocimiento de antígenos no restringido al MHC proporciona a los linfocitos T que expresan CAR la capacidad para reconocer antígenos independientemente del procesado de antígenos, evitando de este modo un mecanismo importante de evasión tumoral. Además, cuando se expresan en linfocitos T, los CAR ventajosamente no se dimerizan con las cadenas alfa y beta del receptor de linfocitos T (TCR) endógeno. Se describen en detalle linfocitos T modificados con CAR en los documentos US2003/022450 y US2010/0261269 y en Milone et al. 2009 Mol. Ther. 17:1453.
Formulaciones farmacéuticas
En algunos casos, las composiciones terapéuticas divulgadas en el presente documento pueden incluir otros compuestos, fármacos y/o agentes usados para el tratamiento del cáncer. Dichos compuestos, fármacos y/o agentes pueden incluir, por ejemplo, fármacos para quimioterapia, fármacos de molécula pequeña o anticuerpos que estimulan la respuesta inmunitaria contra un cáncer dado. En algunos casos, las composiciones terapéuticas pueden incluir, por ejemplo, uno o más péptidos divulgados en el presente documento y uno o más anticuerpos o péptidos anti-CTLA-4, un anticuerpo o péptido anti-PD-1, un anticuerpo o péptido anti-PDL-1, un anticuerpo o péptido anti-OX40 (también conocido como CD134, TNFRSF4, ACT35 y/o TXGP1L), un anticuerpo o péptido anti-GITR (también conocido como TNFRSF18, AITR y/o CD357), un anticuerpo o péptido anti-LAG-3 y un anticuerpo y/o péptido anti-TIM-3. Por ejemplo, en algunos casos, pueden combinarse las composiciones terapéuticas divulgadas en el presente documento con uno o más (por ejemplo, uno, dos, tres, cuatro, cinco o menos de diez) compuestos.
En algunos casos, las composiciones terapéuticas divulgadas en el presente documento pueden incluir otros compuestos, incluyendo inhibidores de histona desacetilasa ("HDAC"). Los ejemplos de inhibidores de HDAC incluyen, por ejemplo, ácido hidroxámico, Vorinostat (Zolinza); ácido subreoilanilida hidroxámico (SAHA) (Merck), tricostatina A (TSA), LAQ824 (Novartis), Panobinostat (LBH589) (Novartis), Belinostat (PXD101) (CuraGen), ITF2357 Italfarmaco SpA (Cinisello), tetrapéptido cíclico; Depsipéptido (romidepsina, FK228) (Gloucester Pharmaceuticals), Benzamida; Entinostat (SNDX-275/MS-275) (Syndax Pharmaceuticals), MGCD0103 (Celgene), ácidos alifáticos de cadena corta, ácido valproico, butirato de fenilo, AN-9, pivanex (Titan Pharmaceutical), CHR-3996 (Chroma Therapeutics) y CHR-2845 (Chroma Therapeutics).
En algunos casos, las composiciones terapéuticas divulgadas en el presente documento pueden incluir otros compuestos, incluyendo inhibidores del proteasoma, incluyendo, por ejemplo, Bortezomib, (Millennium Pharmaceuticals), NPI-0052 (Nereus Pharmaceuticals), Carfilzomib (PR-171) (Onyx Pharmaceuticals), c Ep 18770 y MLN9708.
En algunos casos, las composiciones terapéuticas divulgadas en el presente documento pueden incluir agentes alquilantes, tales como melfalano y se ha demostrado que los inhibidores de topoisomerasa, tales como adriamicina (doxorrubicina) aumentan la expresión de MICA, lo que puede potenciar la eficacia de un anticuerpo monoclonal anti-MICA.
En algunos casos, las composiciones terapéuticas pueden incluir, por ejemplo, uno o más péptidos divulgados en el presente documento y uno o más agentes diferentes, tales como quimioterapia, radioterapia, citocinas, quimiocinas y otras moléculas de señalización biológica, vacunas específicas de tumores, vacunas celulares contra el cáncer (por ejemplo, células cancerosas transducidas con GM-CSF), anticuerpos monoclonales específicos para tumores, rescate con células madre autólogas y alogénicas (por ejemplo, para aumentar los efectos de injerto contra tumor), otros anticuerpos terapéuticos, terapias moleculares dirigidas, terapia antiangiogénica, agentes infecciosos con intención terapéutica (tal como bacterias que se localizan en tumores) y terapia génica.
En algunos casos, las composiciones terapéuticas pueden incluir uno o una combinación de anticuerpos anti-MICA o porciones de unión a antígeno de los mismos, como se describe en el presente documento, formulados junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Dichas composiciones pueden incluir uno o una combinación de péptidos (por ejemplo, dos o más diferentes), anticuerpos, porciones de unión a antígeno, inmunoconjugados o moléculas biespecíficas que se unen a MICA.
Por ejemplo, una composición farmacéutica puede comprender una combinación de anticuerpos (o inmunoconjugados o moléculas biespecíficas) que se unen a diferentes epítopos en el antígeno diana o que tienen actividades complementarias. En algunos casos, dichas composiciones pueden incluir uno o más anticuerpos o fragmentos de anticuerpo que interactúan con un epítopo que abarca o se solapa con los aminoácidos 229 a 248 en la secuencia de MICA*009 (SEQ ID NO: 185), un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que interactúa con un epítopo que abarca o se solapa con los aminoácidos 179 a 188 en la secuencia de aminoácidos de MICA*009 (SEQ ID nO: 185), un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que interactúa con un epítopo que abarca o se solapa con los aminoácidos 119 a 128 en la secuencia de aminoácidos de MICA*009 (s Eq Id NO: 185) y/o un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que interactúa con un epítopo que abarca o se solapa con los aminoácidos 199 a 208 en la secuencia de aminoácidos de MICA*009 (SEQ ID nO: 185).
En algunos casos, las composiciones terapéuticas pueden incluir un péptido, anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a MICA y que comprende la Cd R1, la CDR2 y la CDR3 de la Vh de CM33322 mAb4 y/o la CDR1, la CDR2 y la CDR3 de la Vl de CM33322 mAb4, en combinación con uno o más péptidos, anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno que comprenden la CDR1, la CDR2 y la CDR3 de una Vh del anticuerpo con la ID 1, 6, 7, 8, 9 o 12 y/o la CDR1, la CDR2 y la CDR3 de una Vl del anticuerpo con la ID 1, 6, 7, 8, 9 o 12. En algunos casos, las composiciones terapéuticas pueden incluir un péptido, anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a MICA y que comprende la Cd R1, la CDR2 y la CDR3 de la Vh de CM33322 mAb28 y/o la CDR1, la CDR2 y la CDR3 de la Vl de CM33322 mAb28, en combinación con uno o más péptidos, anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno que comprenden la CDR1, la CDR2 y la CDR3 de una Vh del anticuerpo con la ID 1, 6, 7, 8, 9, 11 o 12 y/o la CDR1, la CDR2 y la CDR3 de una Vl del anticuerpo con la ID 1, 6, 7, 8, 9, 11 o 12.
En algunos casos, las composiciones terapéuticas divulgadas en el presente documento pueden formularse para su uso como o en composiciones farmacéuticas. Dichas composiciones pueden formularse o adaptarse para su administración a un sujeto por cualquier vía, por ejemplo, cualquier vía aprobada por la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA). Se describen métodos a modo de ejemplo en el CDER Data Standards Manual de la FDA, versión número 004 (que se encuentra disponible en fda.give/cder/dsm/DRG/drg00301.htm).
La cantidad de principio activo que se puede combinar con un material de vehículo para producir una forma farmacéutica individual variará dependiendo del sujeto que se esté tratando y del modo particular de administración. La cantidad del principio activo que puede combinarse con un material de vehículo para producir una forma farmacéutica individual será generalmente aquella cantidad de la composición que produce un efecto terapéutico. En general, de un cien por ciento, esta cantidad variará desde aproximadamente el 0,01 por ciento a aproximadamente el noventa y nueve por ciento de principio activo, preferentemente, de aproximadamente un 0,1 por ciento a aproximadamente un 70 por ciento, más preferentemente, de aproximadamente un 1 por ciento a aproximadamente un 30 por ciento de principio activo en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
En algunos casos, las composiciones farmacéuticas pueden incluir una cantidad eficaz de uno o más péptidos. Las expresiones "cantidad eficaz" y "eficaz para tratar", como se usan en el presente documento, se refieren a una cantidad o a una concentración de uno o más péptidos divulgados en el presente documento (por ejemplo, anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a MICA) durante un periodo de tiempo (incluyendo administración aguda o crónica y administración periódica o continua) que es eficaz en el contexto de su administración para provocar un efecto o resultado fisiológico previsto.
En algunos casos, las composiciones farmacéuticas pueden incluir uno o más péptidos y cualquier vehículo, adyuvante y/o vehículo farmacéuticamente aceptable. En algunos casos, los agentes farmacéuticos pueden incluir uno o más agentes terapéuticos adicionales diferentes en cantidades eficaces para lograr la modulación de la enfermedad o los síntomas de la enfermedad.
La expresión "vehículo o adyuvante farmacéuticamente aceptable" se refiere a un vehículo o adyuvante que pueda administrarse a un paciente, junto con un péptido de la presente invención y que no destruye la actividad farmacológica del mismo y que no es tóxico cuando se administra en dosis suficientes para suministrar una cantidad terapéutica del compuesto.
Los portadores, adyuvantes y vehículos farmacéuticamente aceptables que pueden usarse en las composiciones farmacéuticas de la presente invención incluyen, pero sin limitación, intercambiadores de iones, alúmina, estearato de aluminio, lecitina, sistemas de administración de fármacos autoemulsionantes (SEDDS) tales como succinato de d-I-tocoferol polietilenglicol 1000, tensioactivos utilizados en formas de dosificación farmacéutica como Tweens u otras matrices de suministro poliméricas similares, proteínas séricas, tales como seroalbúmina humana, sustancias tamponantes tales como fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato de potasio, mezclas de glicéridos parciales de ácidos grasos vegetales saturados, agua, sales o electrolitos, tales como sulfato de protamina, hidrogenofosfato de disodio, hidrogenofosfato de potasio, cloruro de sodio, sales de cinc, sílice coloidal, trisilicato de magnesio, polivinilpirrolidona, sustancias a base de celulosa, polietilenglicol, carboximetilcelulosa de sodio, poliacrilatos, ceras, polímeros de bloques de polietileno-polioxipropileno, polietilenglicol y lanolina. También pueden usarse ventajosamente ciclodextrinas, tales como I-, 3- y K-ciclodextrina para potenciar el suministro de los compuestos de las fórmulas descritas en el presente documento.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden contener cualquier transportador, adyuvante o vehículo no tóxico convencional farmacéuticamente aceptable. En algunos casos, el pH de la formulación se puede ajustar con ácidos, bases o tampones farmacéuticamente aceptables para potenciar la estabilidad del compuesto formulado o su forma de administración. El término parenteral tal como se usa en el presente documento incluye inyección subcutánea, intracutánea, intravenosa, intramuscular, intraarticular, intraarterial, intrasinovial, intraesternal, intratecal, intralesional e intracraneal o técnicas de infusión.
Las composiciones farmacéuticas pueden encontrarse en forma de una solución o polvo para inhalación y/o administración nasal. Dichas composiciones pueden formularse de acuerdo con técnicas conocidas en la especialidad usando agentes dispersantes o humectantes adecuados (tales como, por ejemplo, Tween 80) y agentes de suspensión. La preparación inyectable estéril puede ser también una solución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o disolvente no tóxico parenteralmente aceptable, por ejemplo, como una solución en 1,3butanodiol. Entre los vehículos y disolventes aceptables que se pueden emplear se encuentran manitol, agua, solución de Ringer y solución de cloruro de sodio isotónica. Además, normalmente se emplean aceites no volátiles estériles como disolvente o medio de suspensión. Para este fin, puede emplearse cualquier aceite suave no volátil, incluyendo mono o diglicéridos sintéticos. Los ácidos grasos, tales como el ácido oleico y sus derivados de glicéridos, son útiles en la preparación de inyectables, así como los aceites naturales farmacéuticamente aceptables, tales como el aceite de oliva o aceite de ricino, especialmente en sus versiones polioxietiladas. Estas soluciones o suspensiones oleosas también pueden contener un diluyente o dispersante de alcohol de cadena larga, o carboximetilcelulosa o agentes dispersantes similares que se utilizan comúnmente en la formulación de formas farmacéuticas farmacéuticamente aceptables, tales como emulsiones y/o suspensiones. Otros tensioactivos comúnmente usados, tales como Tween o Span y/u otros agentes emulsionantes similares o potenciadores de la biodisponibilidad que se usan comúnmente en la fabricación de formas farmacéuticas sólidas, líquidas u otras farmacéuticamente aceptables también pueden usarse con fines de formulación.
Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse por vía oral en cualquier forma farmacéutica aceptable por vía oral, incluyendo, pero sin limitación, cápsulas, comprimidos, emulsiones y suspensiones, dispersiones y soluciones acuosas. En el caso de los comprimidos para uso oral, los vehículos comúnmente utilizados incluyen lactosa y almidón de maíz. Normalmente, también se añaden agentes lubricantes, tales como estearato de magnesio. Para la administración oral en forma de cápsula, los diluyentes útiles incluyen lactosa y almidón de maíz deshidratado. Cuando las suspensiones y/o emulsiones se administran por vía oral, el principio activo que puede suspenderse o disolverse en una fase oleosa se combina con agentes de emulsión y/o de suspensión. Si se desea, pueden añadirse algunos agentes endulzantes y/o aromatizantes y/o colorantes.
Como alternativa o además, las composiciones farmacéuticas pueden administrarse por aerosol nasal o por inhalación. Dichas composiciones se preparan de acuerdo con técnicas bien conocidas en la materia de la formulación farmacéutica y pueden prepararse como soluciones en solución salina, empleando alcohol bencílico u otros conservantes adecuados, promotores de la absorción para potenciar la biodisponibilidad, fluorocarburos y/u otros agentes solubilizantes o de dispersión conocidos en la materia.
En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona métodos para usar uno cualquiera o más de los péptidos o las composiciones farmacéuticas (indicadas más adelante como "X") divulgadas en el presente documento en los siguientes métodos:
Sustancia X para su uso como medicamento en el tratamiento de una o más enfermedades o afecciones divulgadas en el presente documento (por ejemplo, cáncer, citados en los siguientes ejemplos como "Y"). Uso de la sustancia X para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de Y; y la sustancia X para su uso en el tratamiento de Y.
En algunos casos, las composiciones terapéuticas divulgadas en el presente documento pueden formularse para su venta en los Estados Unidos, importarse en los Estados Unidos y/o exportarse de los Estados Unidos.
Métodos
En algunos casos, los métodos pueden incluir la selección de un sujeto humano que tiene o ha tenido una afección o enfermedad y que muestra o mostró una respuesta inmunitaria positiva contra la afección o enfermedad. En algunos casos, los métodos adecuados incluyen, por ejemplo, sujetos que tienen o han tenido una afección o enfermedad pero que han resuelto la enfermedad o un aspecto de la misma, presentan síntomas reducidos de la enfermedad (por ejemplo, en relación con otros sujetos (por ejemplo, la mayoría de sujetos) con la misma afección o enfermedad) y/o que sobreviven durante periodos de tiempo prolongados con la afección o enfermedad (por ejemplo, en relación con otros sujetos (por ejemplo, la mayoría de sujetos) con la misma afección o enfermedad), por ejemplo, en un estado asintomático (por ejemplo, en relación con otros sujetos (por ejemplo, la mayoría de sujetos) con la misma afección o enfermedad). En algunos casos, puede seleccionarse a los sujetos en caso de que se hayan vacunado (por ejemplo, vacunado anteriormente y/o vacunado y revacunado (por ejemplo, que hayan recibido una vacuna de refuerzo)) contra una afección o enfermedad.
El término "sujeto", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier animal. En algunos casos, el sujeto es un mamífero. En algunos casos, el término "sujeto", como se usa en el presente documento, se refiere a un ser humano (por ejemplo, un hombre, una mujer o un niño). Las muestras para su uso en los métodos pueden incluir muestras de suero, por ejemplo, obtenidas del sujeto seleccionado.
En algunos casos, la selección de sujetos puede incluir obtener una muestra de un sujeto (por ejemplo, un sujeto candidato) y efectuar pruebas en la muestra para una indicación de que el sujeto es adecuado para la selección. En algunos casos, se puede confirmar o identificar, por ejemplo, por un profesional del cuidado de la salud, que el sujeto tiene o ha tenido una afección o enfermedad. En algunos casos, la exhibición de una respuesta inmunitaria positiva frente a una afección o enfermedad puede efectuarse a partir del historial del paciente, el historial familiar y/o detectando una indicación de una respuesta inmunitaria positiva. En algunos casos, pueden incluirse varias partes en la selección del sujeto. Por ejemplo, una primera parte puede obtener una muestra de un sujeto candidato y una segunda parte puede ensayar la muestra. En algunos casos, los sujetos pueden seleccionarse y/o ser remitidos por un profesional médico (por ejemplo, médico de cabecera). En algunos casos, la selección de sujetos puede incluir obtener una muestra de un sujeto seleccionado y almacenar la muestra y/o usarla en los métodos divulgados en el presente documento. Las muestras pueden incluir, por ejemplo, células o poblaciones de células.
En algunos casos, la obtención o el direccionamiento de células inmunitarias puede incluir uno o más y/o combinaciones de, por ejemplo: obtener o proporcionar un inmunógeno tetramérico que puede unirse (por ejemplo, unirse específicamente) a una célula inmunitaria diana; poner en contacto el inmunógeno tetramérico con una muestra; detectar el inmunógeno tetramérico; determinar si el inmunógeno tetramérico está unido a una célula inmunitaria diana; y, en caso de que el inmunógeno tetramérico esté unido a una célula inmunitaria diana, obtener posteriormente la célula inmunitaria diana.
Los inmunógenos tetraméricos pueden incluir inmunógenos relacionados con una afección o enfermedad y/o que se unen (por ejemplo, se unen específicamente) a una célula inmunitaria diana, por ejemplo, en donde la célula inmunitaria diana está relacionada con una afección o enfermedad seleccionada. Los inmunógenos y células diana relacionados con una afección o enfermedad incluyen, por ejemplo, inmunógenos o células inmunitarias presentes en sujetos con una afección o enfermedad concreta, pero no en sujetos sin la afección o enfermedad; y/o inmunógenos o células inmunitarias presentes a niveles alterados (por ejemplo, aumentados) en sujetos con una cierta afección o enfermedad en relación con sujetos sin la afección o enfermedad. En algunos casos, los inmunógenos o células inmunitarias pueden ser específicos para el cáncer. Los inmunógenos pueden ser solubles. El inmunógeno tetramérico puede incluir inmunógeno tetramérico (incluyendo, por ejemplo, antígeno monomérico, dimérico y/o trimérico tetramerizado) (por ejemplo, antígeno y/o epítopo). En algunos casos, un inmunógeno tetramérico tiene unión aumentada a una célula en relación con el nivel de unión entre una forma no tetramérica del inmunógeno a la célula en condiciones similares. En algunos casos, un antígeno tetramérico incluye un resto detectable, por ejemplo, un resto de estreptavidina. Se conocen en la técnica y se divulgan en el presente documento métodos de tetramerización.
La detección de inmunógeno tetramérico y/o la determinación de si el inmunógeno tetramérico está unido a una célula diana puede llevarse a cabo usando métodos conocidos en la técnica y/o divulgados en el presente documento. Por ejemplo, los métodos pueden incluir citometría de flujo. Se conocen en la técnica y/o se divulgan en el presente documento métodos de optimización para citometría de flujo, incluyendo métodos de separación y clasificación. En algunos casos, los métodos pueden incluir análisis del nivel de unión, afinidad de unión y/o especificidad de unión entre un inmunógeno tetramérico unido a una célula inmunitaria. Por ejemplo, puede obtenerse una célula inmunitaria diana en caso de que (por ejemplo, solo si) se determina un nivel predeterminado de unión entre un inmunógeno tetramérico y una célula inmunitaria diana. Los niveles de unión predeterminados pueden ser niveles específicos y/o pueden ser niveles relativos. La obtención de células inmunitarias diana puede incluir obtener, proporcionar, identificar, seleccionar, purificar y/o aislar las células inmunitarias diana. Dichos métodos pueden incluir, por ejemplo, métodos de clasificación celular, enriquecimiento celular y/o reducción de fondo.
En algunos casos, la obtención de células inmunitarias dirigidas contra un autoantígeno puede incluir uno o más y/o combinaciones de, por ejemplo, identificar un sujeto que muestra una respuesta inmunitaria positiva contra el autoantígeno; obtener o proporcionar una forma multimérica del autoantígeno; poner en contacto la forma multimérica del autoantígeno con una muestra del sujeto que muestra una respuesta inmunitaria positiva contra el autoantígeno; obtener células inmunitarias unidas a la forma multimérica del autoantígeno.
En algunos casos, los métodos pueden incluir obtener células inmunitarias dirigidas contra un autoantígeno de un paciente con cáncer, pueden incluir uno o más y/o combinaciones de, por ejemplo, identificar un sujeto que muestra una respuesta inmunitaria positiva contra el autoantígeno; proporcionar una forma multimérica del autoantígeno; poner en contacto la forma multimérica del autoantígeno con una muestra del sujeto que muestra una respuesta inmunitaria positiva contra el autoantígeno; y obtener células inmunitarias unidas a la forma multimérica del autoantígeno.
Las formas multiméricas de un autoantígeno pueden incluir autoantígenos relacionados con una afección o enfermedad y/o que se unen (por ejemplo, se unen específicamente) a una célula inmunitaria diana, por ejemplo, en donde la célula inmunitaria diana está relacionada con una afección o enfermedad seleccionada. Los autoantígenos y células diana relacionados con una afección o enfermedad incluyen, por ejemplo, antígenos o células inmunitarias presentes en sujetos con una cierta afección o enfermedad, pero no en sujetos sin la afección o enfermedad; y/o inmunógenos o células inmunitarias presentes a niveles alterados (por ejemplo, aumentados) en sujetos con una cierta afección o enfermedad en relación con sujetos sin la afección o enfermedad. En algunos casos, la afección o enfermedad puede ser un cáncer. En algunos aspectos, el cáncer es melanoma, de pulmón, de mama, de riñón, de ovario, de próstata, pancreático, gástrico, glioblastoma, cáncer de hígado y carcinoma de colon, linfoma o leucemia. En algunos casos, los autoantígenos o células inmunitarias pueden ser específicos para el cáncer. Los autoantígenos pueden ser solubles. La forma multimérica del autoantígeno puede incluir una forma tetramérica (incluyendo, por ejemplo, antígeno monomérico, dimérico y/o trimérico tetramerizado) del autoantígeno (por ejemplo, antígeno y/o epítopo). En algunos casos, una forma multimérica del autoantígeno incluye un resto detectable, por ejemplo, un resto de estreptavidina. Se conocen en la técnica y se divulgan en el presente documento métodos de multimerización.
Se conocen en la técnica y se ilustran en el presente documento métodos para aislar o purificar material genético (por ejemplo, ADN y/o ARNm) a partir de la célula inmunitaria diana obtenida. Una vez que se ha obtenido dicho material genético, se conocen en la técnica y/o se resumen a continuación métodos para usarlo para producir las composiciones terapéuticas divulgadas en el presente documento. Como se analizó anteriormente, puede variarse el material genético, usando técnicas conocidas en la especialidad para crear variantes peptídicas divulgadas en el presente documento.
La generación de péptidos a partir de ácidos nucleicos (por ejemplo, ADNc) contenidos en u obtenidos de la célula diana puede incluir, por ejemplo, análisis, por ejemplo, secuenciación de dominios variables de cadena pesada y ligera de células inmunitarias diana (por ejemplo, células inmunitaria diana individuales o aisladas). En algunos casos, los métodos pueden incluir generar anticuerpos completamente humanos o fragmentos de los mismos (por ejemplo, como se ha divulgado anteriormente) y humanización de anticuerpos no humanos. El ADN puede aislarse y/o secuenciarse fácilmente a partir de las células inmunitarias obtenidas usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas olignucleotídicas que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera de anticuerpos murinos).
Una vez aislado, el ADN puede colocarse en vectores de expresión, que después se transfectan a células hospedadoras, tales como células de Escherichia coli, células c Os de simio, células de ovario de hámster chino (CHO) o células de mieloma que de otro modo no producen proteína de anticuerpo, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células hospedadoras recombinantes. Los artículos de revisión acerca de la expresión recombinante de ADN que codifica el anticuerpo en bacterias incluyen Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262 (1993) y Pluckthun, Immunol. Revs., 130:151-188 (1992).
La expresión recombinante de un anticuerpo o una variante del mismo requiere generalmente la construcción de un vector de expresión que contiene un polinucleótido que codifica el anticuerpo. La invención, por lo tanto, proporciona vectores replicables que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica una molécula de anticuerpo, una cadena pesada o ligera de un anticuerpo, un dominio variable de cadena pesada o ligera de un anticuerpo o una porción del mismo o una CDR de cadena pesada o ligera, unida operativamente a un promotor. Dichos vectores pueden incluir la secuencia de nucleótidos que codifica la región constante de la molécula de anticuerpo (véanse, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos n.° 5.981.216, 5.591.639, 5.658.759 y 5.122.464) y el dominio variable del anticuerpo puede clonarse en dicho vector para la expresión de la cadena pesada completa, la cadena ligera completa o ambas de las cadenas pesada y ligera completas. Una vez se ha transferido el vector de expresión a una célula hospedadora mediante técnicas convencionales, se cultivan las células transfectadas mediante técnicas convencionales para producir un anticuerpo. Por lo tanto, la invención incluye células hospedadoras que contienen un polinucleótido que codifica un anticuerpo de la invención o fragmentos del mismo o una cadena pesada o ligera del mismo o una porción del mismo o un anticuerpo monocatenario de la invención, unido operativamente a un promotor heterólogo. En ciertos aspectos para la expresión de anticuerpos bicatenarios, pueden coexpresarse vectores que codifican las cadenas tanto pesada como ligera en la célula hospedadora para la expresión de la molécula de inmunoglobulina completa, como se detalla más adelante.
Las líneas celulares de mamífero disponibles como hospedadores para la expresión de anticuerpos recombinantes se conocen bien en la técnica e incluyen diversas líneas celulares inmortalizadas disponibles de la American Type Culture Collection (ATCC), incluyendo, pero sin limitación, células de ovario de hámster chino (CHO), células HeLa, células de riñón de cría de hámster (BHK), células de riñón de mono (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo, Hep G2), células epiteliales de riñón humano 293 y una serie de líneas celulares diferentes. Diferentes células hospedadoras tienen características y mecanismos específicos para el procesamiento y la modificación posterior a la traducción de las proteínas y productos génicos. Se pueden seleccionar líneas de células adecuadas o sistemas hospedadores para asegurar la modificación y el procesamiento correctos del anticuerpo o una porción del mismo expresada. Con este fin, se pueden usar células hospedadoras eucariotas que posean la maquinaria celular para el procesamiento adecuado del transcrito primario, la glucosilación y la fosforilación del producto génico. Dichas células hospedadoras de mamífero incluyen, pero sin limitación, células CHO, VERY, BHK, Hela, COS, MDCK, 293, 3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT2O y T47D, NSO (una línea celular de mieloma murino que no produce de manera endógena ninguna cadena de inmunoglobulina funcional), SP20, CRL7O3O y HsS78Bst. En un aspecto, las líneas celulares humanas desarrolladas inmortalizando linfocitos humanos pueden usarse para producir de manera recombinante anticuerpos monoclonales. En un aspecto, la línea celular humana PER.C6. (Crucell, Países Bajos) puede usarse para producir anticuerpos monoclonales de manera recombinante.
En algunos casos, los péptidos divulgados en el presente documento pueden generarse sintéticamente. En la técnica se conocen transformaciones de química sintética y metodologías de grupo protector (protección y desprotección) útiles en la síntesis de los péptidos descritos en el presente documento e incluyen, por ejemplo, aquellas como las descritas en R. Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers (1989); T. W. Greene y P.G.M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3.a Ed., John Wiley and Sons (1999); L. Fieser y M. Fieser, Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1994); y L. Paquette, ed., Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1995), y ediciones posteriores de los mismos.
Los péptidos también pueden producirse mediante métodos de síntesis química, que se conocen bien por el experto habitual en la materia. Véase, por ejemplo, Fields et al., Capítulo 3 en Synthetic Peptides: A User's Guide, ed. Grant, W. H. Freeman & Co., Nueva York, N.Y., 1992, pág. 77. Por lo tanto, pueden sintetizarse péptidos usando las técnicas de Merrifield automatizadas de síntesis en fase sólida con el a-NH2 protegido mediante química de t-Boc o Fmoc usando aminoácidos con la cadena lateral protegida en, por ejemplo, un sintetizador de péptidos de Applied Biosystems, modelo 430A o 431.
Un modo para producir los péptidos descritos en el presente documento es el uso de síntesis de péptidos en fase sólida (SPPS). El aminoácido C-terminal se une a una resina de poliestireno reticulada mediante un enlace lábil a ácidos con una molécula de enlazador. Esta resina es insoluble en los disolventes usados para la síntesis, haciendo que sea relativamente sencillo y rápido eliminar por lavado los reactivos y subproductos en exceso. El extremo N-terminal se protege con el grupo Fmoc, que es estable en ácido, pero puede retirarse por una base. Cualquier grupo funcional de la cadena lateral se protege con grupos estables a bases y lábiles en ácidos.
Pueden producirse péptidos más largos conjugando péptidos sintéticos individuales usando ligamiento químico nativo. Como alternativa, pueden sintetizarse los péptidos sintéticos más largos mediante técnicas de ADN recombinante bien conocidas. Dichas técnicas se proporcionan en manuales convencionales bien conocidos con protocolos detallados. Para construir un gen que codifica un péptido de la presente invención, se traduce de manera inversa la secuencia de aminoácidos para obtener una secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos, preferentemente con codones que son óptimos para el organismo en el que se va a expresar el gen. A continuación, se produce un gen sintético, normalmente sintetizando oligonucleótidos que codifican el péptido y cualquier elemento regulador, en caso de que sea necesario. El gen sintético se inserta en un vector de clonación adecuado y se transfecta en una célula hospedadora. Después, se expresa el péptido en condiciones adecuadas apropiadas para el sistema de expresión y el hospedador seleccionado. El péptido se purifica y caracteriza mediante métodos convencionales.
Los péptidos pueden producirse de un modo combinatorio de alto rendimiento, por ejemplo, usando un sintetizador combinatorio multicanal de alto rendimiento disponible de Advanced ChemTech.
Pueden reemplazarse los enlaces peptídicos, por ejemplo, para aumentar la estabilidad fisiológica del péptido, por: enlaces retro-inverso (C(O)-NH); un enlace de amida reducido (NH-CH2); un enlace de tiometileno (S-CH2 o CH2-S); un enlace de oxometileno (O-CH2 o CH2-O); un enlace de etileno (CH2-CH2); un enlace de tioamida (C(S)-NH); un enlace de trans-olefina (CH=CH); un enlace de trans-olefina sustituido con flúor (CF=CH); un enlace de cetometileno (C(O)-CHR) o CHR-C(O) en donde R es H o CH3; y un enlace fluoro-cetometileno (C(O)-CFR o CFR-C(O) en donde R es H o F o CH3.
Los péptidos pueden modificarse además mediante: acetilación, amidación, biotinilación, cinamoilación, farnesilación, fluoresceinación, formilación, miristoilación, palmitoilación, fosforilación (Ser, Tyr o Thr), estearoilación, succinilación y sulfurilación. Como se ha indicado anteriormente, los péptidos pueden conjugarse a, por ejemplo, polietilenglicol (PEG); grupos alquilo (por ejemplo, grupos alquilo C1-C20 lineales o ramificados); radicales de ácido graso; y combinaciones de los mismos.
En algunos casos, los péptidos pueden purificarse mediante cualquier método conocido en la técnica para la purificación de una molécula de inmunoglobulina, por ejemplo, mediante cromatografía (por ejemplo, intercambio iónico, afinidad, en particular, mediante proteína A o proteína G de afinidad por los antígenos específicos y cromatografía de exclusión por tamaños), centrifugación, solubilidad diferencial o mediante cualquier otra técnica normalizada para la purificación de proteínas. Además, los anticuerpos de la presente invención o los fragmentos de los mismos pueden fusionarse a secuencias de polipéptidos heterólogas (citadas en el presente documento como "marcadores") descritos anteriormente o conocidos de otro modo para facilitar la purificación.
En las FIG. 5A-5F se muestra una revisión ilustrativa no limitante de los métodos. Esto no implica orden alguno. En algunos casos, la divulgación también proporciona anticuerpos o fragmentos de anticuerpo que tienen regiones variables de cadena pesada y/o de cadena ligera que comprenden secuencias de aminoácidos que son homólogas respecto de las secuencias de aminoácidos de los anticuerpos descritos en el presente documento que conservan las propiedades funcionales de unión a MICA deseadas. Por ejemplo, en algunos aspectos, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede contener secuencias de aminoácidos de Vh y/o Vl que son un 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idénticas a las secuencias expuestas anteriormente. Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que tiene regiones VH y VL que tienen alta homología (es decir, del 80 % o mayor) respecto de las regiones Vh y Vl de las SEQ ID NO: 2, 77, 96, 113, 131, 150 o 168 y 11, 79, 98, 115, 133, 152 o 170, respectivamente, puede obtenerse mediante mutagénesis (por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio o mediada por la PCR) de moléculas de ácido nucleico que codifican las SeQ ID NO: 77, 96, 113, 131, 150 o 168 y/o 79, 98, 115, 133 152 o 170, seguido de la evaluación de la conservación de la función del anticuerpo alterado codificado (es decir, una o más funciones, tales como unión al dominio alfa 3 de MICA; bloqueo de la secreción de MICA; no inhibir la unión de NGKD a MICA; bloqueo de la regulación negativa de NGKD inducida por MICA soluble y citotoxicidad reducida de células NK) usando los ensayos funcionales descritos en el presente documento.
También se proporcionan anticuerpos y fragmentos de anticuerpo que compiten (por ejemplo, compiten de manera cruzada) por la unión a MICA con los anticuerpos anti-MICA particulares descritos en el presente documento (por ejemplo, el anticuerpo con la ID 1, 6, 7, 8, 9, 11 y 12). Pueden identificarse dichos anticuerpos competitivos basándose en su capacidad para inhibir de manera competitiva la unión de MICA al anticuerpo en ensayos de unión a MICA convencionales. Por ejemplo, pueden usarse ensayos ELISA convencionales en los que se inmoviliza la proteína MICA humana recombinante sobre la placa, se marca fluorescentemente uno de los anticuerpos y se evalúa la capacidad de los anticuerpos no marcados para competir por la unión del anticuerpo marcado. Además o como alternativa, puede usarse análisis BIAcore para evaluar la capacidad de los anticuerpos para competir de manera cruzada. La capacidad de un anticuerpo de ensayo para inhibir la unión a MICA de un anticuerpo anti-MICA demuestra que el anticuerpo de ensayo puede competir con el anticuerpo por la unión a MICA.
Por consiguiente, en un aspecto, la divulgación proporciona anticuerpos anti-MICA que inhiben la unión de los anticuerpos anti-MICA descritos en el presente a MICA sobre linfocitos T activados en al menos un 50 %, por ejemplo, al menos un 55 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o un 100 %, como se mide mediante FACS. Por ejemplo, la inhibición de la unión de los anticuerpos anti-MICA por anticuerpos competitivos anti-MICA candidatos puede evaluarse en las condiciones descritas en los ejemplos.
En algunos casos, la divulgación proporciona anticuerpos anti-MICA que se unen al mismo epítopo que los anticuerpos anti-MICA descritos en el presente documento (por ejemplo, el anticuerpo con la ID 8, 9, 11 y 12). Como se analiza con más detalle en el ejemplo 14, el anticuerpo con la ID 8 (CM33322 mAb11) se une a un epítopo que implica los restos 119 a 128 en la secuencia de aminoácidos de MICA*009 (SEQ ID NO: 185); el anticuerpo con la ID 9 (CM33322 mAb29) se une a un epítopo que implica los restos 229 a 248 en la secuencia de aminoácidos de MICA*009 (SEQ ID NO: 185); el anticuerpo con la iD 11 (CM33322 mAb4) se une a un epítopo que implica los restos 179 a 188 en la secuencia de aminoácidos de MICA*009 (SEQ ID NO: 185); y el anticuerpo con la ID 12 (CM33322 mAb28) se une a un epítopo que implica los restos 199 a 208 en la secuencia de aminoácidos de MICA*009 (SEQ ID NO: 185). Por consiguiente, en algunos aspectos, la divulgación proporciona un anticuerpo o fragmento de anticuerpo anti-MICA que se une a los restos de aminoácido en la región a3 correspondientes a los aminoácidos 181 a 274 de MICA*009.
Las técnicas para determinar anticuerpos que se unen al "mismo epítopo en MICA" que los anticuerpos descritos en el presente documento incluyen, por ejemplo, métodos de mapeo de epítopos, tales como, análisis de rayos X de cristales de complejos antígeno: anticuerpo que proporcionan la resolución atómica del epítopo. Otros métodos controlan la unión del anticuerpo a fragmentos de antígeno o variaciones mutadas del antígeno en las que la pérdida de unión debida a una modificación de un residuo de aminoácido dentro de la secuencia de antígeno se considera a menudo una indicación de un componente de epítopo. Además, también se pueden utilizar métodos combinatorios computacionales para el mapeo de epítopos. Estos métodos se basan en la capacidad del anticuerpo de interés para aislar por afinidad péptidos cortos específicos de bibliotecas combinadas de péptidos de presentación de fagos. Por tanto, los péptidos se consideran conductores para la definición del epítopo correspondiente al anticuerpo usado para cribar la biblioteca de péptidos. Para el mapeo de epítopos, también se han desarrollado algoritmos computacionales que ha demostrado que mapean epítopos conformacionales discontinuos.
Por ejemplo, puede inmunizarse a ratones con MICA humano, como se describe en el presente documento, se producen hibridomas y se exploran los anticuerpos monoclonales resultantes respecto de su capacidad para competir con mAb4 o mAb28 por la unión a MICA. También puede inmunizarse a los ratones con un fragmento más pequeño de MICA que contiene el epítopo al que se une el anticuerpo monoclonal mAb4. Por ejemplo, puede usarse el método de Jespers et al., Biotechnology 12:899, 1994 para guiar la selección de anticuerpos monoclonales que tienen el mismo epítopo y por tanto, propiedades similares al anticuerpo monoclonal arquetípico. Usando presentación en fagos, en primer lugar se empareja la cadena pesada del anticuerpo arquetípico con un repertorio de cadenas ligeras (preferentemente humanas) para seleccionar un anticuerpo monoclonal de unión a MICA y después, se empareja la nueva cadena pesada con un repertorio de cadenas pesadas (preferentemente humanas) para seleccionar un anticuerpo monoclonal de unión a MlCA (preferentemente humano) que tiene el mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal arquetípico. Como alternativa, pueden obtenerse variantes del anticuerpo monoclonal arquetípico (por ejemplo, mAb4, ID 11 o mAb28, ID 12) mediante mutagénesis del ADNc que codifica las cadenas pesada y ligera del anticuerpo.
Puede llevarse a cabo mapeo de epítopos, por ejemplo, como se describe en Champe et al. (1995) J. Biol. Chem.
270:1388-1394, para determinar si el anticuerpo se une a un epítopo de interés. La "mutagénesis de barrido de alanina", como se describe por Cunningham y Wells (1989) Science 244: 1081-1085 o cualquier otra forma de mutagénesis puntual de restos de aminoácidos en MICA o MICB también puede usarse para determinar el epítopo funcional para un anticuerpo anti-MICA o MICB de la presente invención. Sin embargo, los estudios de mutagénesis también pueden revelar restos de aminoácido que son cruciales para la estructura tridimensional general de MICA o MICB pero que no están implicados directamente en los contactos de anticuerpo-antígeno y por lo tanto, pueden ser necesarios otros métodos para confirmar un epítopo funcional determinado usando este método.
También pueden usarse ensayos de competición de anticuerpos, como se describen en el presente documento, para determinar si un anticuerpo "se une al mismo epítopo" que otro anticuerpo. Normalmente, una competición de un 50 % o más, 60 % o más, 70 % o más, tal como un 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o más, de un anticuerpo que se sabe que interactúa con el epítopo por un segundo anticuerpo en condiciones en las que el segundo anticuerpo se encuentra en exceso y el primero satura todos los sitios, indica que los anticuerpos "se unen al mismo epítopo". Para evaluar el nivel de competición entre dos anticuerpos, por ejemplo, pueden usarse radioinmunoensayos o ensayos que usan otros marcadores para los anticuerpos. Por ejemplo,puede incubarse un antígeno de MICA o MICB con una cantidad saturante de un primer anticuerpo anti-MICA o un fragmento de unión a antígeno del mismo conjugado a un compuesto marcado (por ejemplo, 3H, 125I, biotina o rubidio) en presencia de la misma cantidad de un segundo anticuerpo anti-MICA no marcado. Después, se evalúa la cantidad de anticuerpo marcado que se une al antígeno en presencia del anticuerpo de bloqueo no marcado y se compara con la unión en ausencia del anticuerpo de bloqueo no marcado. La competición se determina por el porcentaje de cambio en las señales de unión en presencia del anticuerpo de bloqueo no marcado, en comparación con la ausencia del anticuerpo de bloqueo. Por lo tanto, en caso de que haya una inhibición del 50 % de la unión del anticuerpo marcado en presencia del anticuerpo de bloqueo en comparación con la unión en ausencia del anticuerpo de bloqueo, hay una competición entre los dos anticuerpos del 50 %. Por lo tanto, la referencia a una competición entre un primer y un segundo anticuerpo de un 50 % o más, 60 % o más, 70 % o más, tal como un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o más, significa que el primer anticuerpo inhibe la unión del segundo anticuerpo (o viceversa) al antígeno en un 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o más (en comparación con la unión del antígeno al segundo anticuerpo en ausencia del primer anticuerpo). Por lo tanto, una inhibición de la unión de un primer anticuerpo a un antígeno en por un segundo anticuerpo de un 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o más indica que los dos anticuerpos se unen al mismo epítopo.
También se proporcionan anticuerpos modificados por ingeniería genética y recombinantes que comprenden como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 diferencias de aminoácidos (por ejemplo, sustituciones, adiciones o eliminaciones) en relación con un anticuerpo de origen natural. Las una o más diferencias de aminoácidos pueden encontrarse en la cadena ligera y/o en la cadena pesada y pueden encontrarse en una o más de las CDR, en una región marco o en una región constante, por ejemplo, en la CL, CH1, bisagra, CH2 o CH3. Por ejemplo, se proporcionan anticuerpos modificados por ingeniería genética y recombinantes que comprenden (1) una secuencia de VH que comprende una o más de las regiones CDR de VH descritas en el presente documento y una secuencia de VL que comprende una o más de las regiones CDR de VL y (2) una región marco heteróloga. La región marco heteróloga puede proceder de un anticuerpo, célula o ser humano que no es la fuente nativa de las regiones CDR. Por ejemplo, en algunos aspectos, un anticuerpo puede comprender la CDR1, la CDR2 y la CDR3 de una Vh del anticuerpo con la ID 1, 6, 7, 8, 9, 11 o 12 y/o la CDR1, la CDR2 y la CDR3 de una Vl del anticuerpo con la ID 1, 6, 7, 8, 9, 11 o 12 mostrada en la tabla 1 y una región marco que no es del anticuerpo con la ID 1, 6, 7, 8, 9, 11 o 12 que comprende las mismas CDR. En algunos aspectos, un anticuerpo puede comprender la CDR1, la CDR2 y la CDR3 de la Vh del anticuerpo con la ID 1 y/o la CDR1, la CDR2 y la CDR3 de una Vl del anticuerpo con la ID 1 mostrado en la tabla 1 y una región marco que no es del anticuerpo con la ID 1. En algunos aspectos, un anticuerpo puede comprender la CDR1, la CDR2 y la CDR3 de la Vh del anticuerpo con la ID 6 y/o la CDR1, la CDR2 y la CDR3 de una VL del anticuerpo con la ID 6 mostrado en la tabla 1 y una región marco que no es del anticuerpo con la ID 6. En algunos aspectos, un anticuerpo puede comprender la CDR1, la CDR2 y la CDR3 de la VH del anticuerpo con la ID 7 y/o la CDR1, la CDR2 y la CDR3 de una VL del anticuerpo con la ID 7 mostrado en la tabla 1 y una región marco que no es del anticuerpo con la ID 7. En algunos aspectos, un anticuerpo puede comprender la CDR1, la CDR2 y la CDR3 de la Vh del anticuerpo con la ID 8 y/o la CDR1, la CDR2 y la Cd R3 de una Vl del anticuerpo con la ID 8 mostrado en la tabla 1 y una región marco que no es del anticuerpo con la ID 8. En algunos aspectos, un anticuerpo puede comprender la CDR1, la CDR2 y la CDR3 de la Vh del anticuerpo con la ID 9 y/o la CDr 1, la CDR2 y la Cd R3 de una Vl del anticuerpo con la ID 9 mostrado en la tabla 1 y una región marco que no es del anticuerpo con la ID 9. En algunos aspectos, un anticuerpo puede comprender la CDR1, la CDR2 y la CDR3 de la VH del anticuerpo con la ID 11 y/o la CDR1, la CDR2 y la CDR3 de una VL del anticuerpo con la ID 11 mostrado en la tabla 1 y una región marco que no es del anticuerpo con la ID 11. En algunos aspectos, un anticuerpo puede comprender la CDR1, la CDR2 y la CDR3 de la VH del anticuerpo con la ID 12 y/o la c Dr 1, la CDR2 y la Cd R3 de una VL del anticuerpo con la ID 12 mostrado en la tabla 1 y una región marco que no es del anticuerpo con la ID 12.
También se proporcionan anticuerpos modificados por ingeniería genética y recombinantes que comprenden (1) una secuencia de Vh que comprende una o más de las regiones CDR de Vh descritas en el presente documento y una secuencia de Vl que comprende una o más de las regiones CDR de Vl y (2) una región constante heteróloga. La región constante heteróloga puede proceder de un anticuerpo, célula o ser humano que no es la fuente nativa de las regiones CDR. Por ejemplo, en algunos aspectos, un anticuerpo puede comprender la CDR1, la CDR2 y la CDR3 de una VH del anticuerpo con la ID 1, 6, 7, 8, 9, 11 o 12 y/o la c Dr 1, la CDR2 y la CDR3 de una VL del anticuerpo con la ID 1, 6, 7, 8, 9, 11 o 12 mostrado en la tabla 1 y una región constante de un ser humano que no es el ser humano del que se obtuvieron las CDR. En algunos aspectos, un anticuerpo puede comprender la CDR1, la CDR2 y la CDR3 de la Vh del anticuerpo con la ID 1 y/o la CDR1, la CDR2 y la c Dr3 de una Vl del anticuerpo con la ID 1 mostrado en la tabla 1 y una región constante que no es del anticuerpo con la ID 1. En algunos aspectos, un anticuerpo puede comprender la CDR1, la CDR2 y la Cd R3 de la Vh del anticuerpo con la ID 6 y/o la c Dr 1, la CDR2 y la CDR3 de una Vl del anticuerpo con la ID 6 mostrado en la tabla 1 y una región constante que no es del anticuerpo con la ID 6. En algunos aspectos, un anticuerpo puede comprender la CDR1, la CDR2 y la CDR3 de la Vh del anticuerpo con la ID 7 y/o la CDR1, la CDR2 y la CDR3 de una Vl del anticuerpo con la ID 7 mostrado en la tabla 1 y una región constante que no es del anticuerpo con la ID 7. En algunos aspectos, un anticuerpo puede comprender la CDR1, la CDR2 y la CDR3 de la Vh del anticuerpo con la ID 8 y/o la CDR1, la CDR2 y la CDR3 de una Vl del anticuerpo con la ID 8 mostrado en la tabla 1 y una región constante que no es del anticuerpo con la ID 8. En algunos aspectos, un anticuerpo puede comprender la CDR1, la CDR2 y la CDR3 de la Vh del anticuerpo con la ID 9 y/o la CDR1, la CDR2 y la CDR3 de una Vl del anticuerpo con la ID 9 mostrado en la tabla 1 y una región constante que no es del anticuerpo con la ID 9. En algunos aspectos, un anticuerpo puede comprender la CDR1, la CDR2 y la CDR3 de la Vh del anticuerpo con la ID 11 y/o la CDR1, la CDR2 y la Cd R3 de una Vl del anticuerpo con la ID 11 mostrado en la tabla 1 y una región constante que no es del anticuerpo con la ID 11. En algunos aspectos, un anticuerpo puede comprender la CDR1, la CDR2 y la CDR3 de la Vh del anticuerpo con la ID 12 y/o la CDR1, la CDR2 y la CDR3 de una Vl del anticuerpo con la ID 12 mostrado en la tabla 1 y una región constante que no es del anticuerpo con la ID 12.
También se proporcionan anticuerpos modificados por ingeniería genética y recombinantes que comprenden (1) una secuencia de Vh que comprende una o más de las regiones CDR de Vh descritas en el presente documento y una secuencia de Vl que comprende una o más de las regiones CDR de Vl y (2) una región Fc heteróloga. La región Fc heteróloga puede proceder de un anticuerpo, célula o ser humano que no es la fuente nativa de las regiones CDR.
También se proporcionan anticuerpos diseñados por ingeniería genética y modificados que pueden prepararse usando un anticuerpo que tiene una o más de las secuencias de Vh y/o Vl divulgadas en el presente documento como material de partida para diseñar un anticuerpo modificado, pudiendo tener dicho anticuerpo propiedades alteradas respecto del anticuerpo de partida. Puede diseñarse un anticuerpo modificando uno o más restos en una o ambas regiones variables (es decir, Vh y/o Vl), por ejemplo, en una o más regiones CDR y/o en una o más regiones marco. Además o como alternativa, se puede diseñar genéticamente un anticuerpo modificando los restos en las regiones constantes, por ejemplo, para alterar las funciones efectoras del anticuerpo.
Un tipo de modificación por ingeniería genética que puede efectuarse es el injerto de CDR. Los anticuerpos interactúan con antígenos diana predominantemente a través de restos de aminoácido que están ubicados en las seis regiones determinantes de la complementariedad de cadena pesada y ligera (CDR). Por este motivo, las secuencias de aminoácidos en las CDR son más diversas entre anticuerpos individuales que las secuencias fuera de las CDR. Dado que las secuencias CDR son responsables de la mayoría de las interacciones anticuerpo-antígeno, es posible expresar anticuerpos recombinantes que imitan las propiedades de anticuerpos de origen natural construyendo vectores de expresión que incluyen secuencias CDR del anticuerpo específico de origen natural insertadas en las secuencias marco de un anticuerpo diferente con propiedades diferentes (véase, por ejemplo, Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332:323-327; Jones, P. et al. (1986) Nature 321:522-525; Queen, C. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. U.S.A. 86:10029-10033; patente de los Estados Unidos n.° 5.225.539 concedida a Winter y Patentes de los Estados Unidos n.° 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 y 6.180.370 concedida a Queen et al.)
Por consiguiente, otro aspecto de la invención se refiere a un anticuerpo monoclonal aislado o a una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena pesada que comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden una secuencia de aminoácido seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 4, 81, 100, 117, 135, 154 y 172, las SEQ ID NO: 84, 102, 119, 137, 156 y 174 y las SEQ ID NO: 8, 86, 103, 121, 139, 158 y 176, respectivamente y una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 13, 88, 106, 124, 142, 161 y 179, las SEQ ID NO: 90, 108, 126, 144, 163 y 181 y las SEQ ID NO: 17, 92, 110, 128, 146, 165 y 183, respectivamente. Por lo tanto, dichos anticuerpos contienen las secuencias de CDR de Vh y Vl de los anticuerpos monoclonales con la ID 1, 6, 7, 8, 9, 11 o 12 mostrados en la tabla 1, aunque pueden contener secuencias marco diferentes a las de estos anticuerpos.
Dichas secuencias marco pueden obtenerse de bases de datos de ADN públicas o de referencias publicadas que incluyen secuencias génicas de anticuerpo de línea germinal. Por ejemplo, las secuencias de ADN de la línea germinal para los genes de la región variable de la cadena pesada y ligera humana se pueden encontrar en la base de datos de secuencias de la línea germinal humana "VBase" (disponible en internet en www.mrccpe.cam.ac.uk/vbase), así como en Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta edición, Departamento de salud y servicios humanos de Estados Unidos, Publicación de NIH N.° 91-3242; Tomlinson, I. M., et al. (1992) "The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops" J. Mol. Biol. 227:776-798; y Cox, J. P. L. et al. (1994) "A Directory of Human Germ-line VH Segments Reveals a Strong Bias in their Usage" Eur. J. Immunol. 24:827-836.
Las secuencias marco ilustradas para su uso en los anticuerpos de la invención incluyen aquellas que son estructuralmente similares a las secuencias marco usadas por los anticuerpos descritos en el presente documento. Las secuencias de CDR1, 2 y 3 de Vh y las secuencias de CDR1, 2 y 3 de Vl, pueden injertarse en regiones marco que tienen una secuencia idéntica a la encontrada en el gen de inmunoglobulina de línea germinal del que procede la secuencia marco o pueden injertarse las secuencias de CDR en regiones marco que contienen una o más mutaciones, en comparación con las secuencias de línea germinal. Por ejemplo, se ha descubierto que en ciertos casos, es beneficioso mutar restos en las regiones marco para mantener o potenciar la capacidad de unión a antígeno del anticuerpo (véanse, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos n.° 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 y 6.180.370 concedidas a Queen et al).
Otro tipo de modificación de la región variable es mutar restos de aminoácidos en las regiones CDR1, CDR2 y/o CDR3 de Vh y/o Vl para mejorar de este modo una o más propiedades de unión (por ejemplo, afinidad) del anticuerpo de interés. Puede llevarse a cabo mutagénesis dirigida al sitio o mutagénesis mediada por la PCR para introducir las mutaciones y puede evaluarse el efecto en la unión del anticuerpo u otra propiedad funcional de interés en ensayos in vitro o in vivo como se describen en el presente documento y se proporcionan en los ejemplos. Preferentemente, se introducen modificaciones conservativas (como se han analizado anteriormente). Las mutaciones pueden ser sustituciones, adiciones o eliminaciones de aminoácidos, pero preferentemente son sustituciones. Además, normalmente no se alteran más de uno, dos, tres, cuatro o cinco restos en una región CDR.
Por consiguiente, en otro aspecto, la invención proporciona anticuerpos monoclonales anti-MICA o porciones de unión a antígeno de los mismos, que comprenden una región variable de cadena pesada que comprende: (a) una región CDR1 de Vh que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 4, 81, 100, 117, 135, 154 y 172 o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, eliminaciones o adiciones de aminoácidos en comparación con las SEQ ID NO: 4, 81, 100, 117, 135, 154 y 172; (b) una región CDR2 de Vh que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 6, 84, 102, 119, 137, 156 y 174 o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, eliminaciones o adiciones de aminoácidos en comparación con las SEQ ID NO: 6, 84, 102, 119, 137, 156 y 174; (c) una región CDR3 de Vh que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 8, 86, 103, 121, 139, 158 y 176 o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, eliminaciones o adiciones de aminoácidos en comparación con las SEQ ID NO: 8, 86, 103, 121, 139, 158 y 176; (d) una región CDR1 de Vl que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 13, 88, 106, 124, 142, 161 y 179 o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, eliminaciones o adiciones de aminoácidos en comparación con las SEQ ID NO: 13, 88, 106, 124, 142, 161 y 179; (e) una región CDR2 de Vl que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 15, 90, 108, 126, 144, 163 y 181 o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, eliminaciones o adiciones de aminoácidos en comparación con las SEQ ID NO: 15, 90, 108, 126, 144, 163 y 181; y (f) una región CDR3 de Vl que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 17, 92, 110, 128, 146, 165 y 183 o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, eliminaciones o adiciones de aminoácidos en comparación con las SEQ ID NO: 17, 92, 110, 128, 146, 165 y 183.
Los restos de metionina en las CDR de los anticuerpos pueden oxidarse, dando como resultado una potencial degradación química y la consiguiente reducción de la potencia del anticuerpo. Por consiguiente, la invención también proporciona anticuerpos anti-MICA que tienen uno o más restos de metionina en las CDR de cadena pesada y/o ligera que se reemplazan con restos de aminoácido que no sufren degradación oxidativa. En un aspecto, se reemplazan los restos de metionina en las CDR de los anticuerpos con la ID 1, 6, 7, 8, 9, 11 o 12 mostrados en la tabla 1 con restos de aminoácido que no sufren degradación oxidativa.
Los anticuerpos diseñados por ingeniería genética de la invención incluyen aquellos en los que se han efectuado modificaciones en los restos de la región marco en Vh y/o Vl, por ejemplo, para mejorar las propiedades del anticuerpo. Normalmente, dichas modificaciones en la región marco se hacen para reducir la inmunogenicidad del anticuerpo. Por ejemplo, una estrategia es "retromutar" uno o más restos de la región marco a la correspondiente secuencia de la línea germinal. Más específicamente, un anticuerpo que se ha sometido a mutación somática puede contener restos de la región marco que difieren de la secuencia de la línea germinal de la que procede el anticuerpo. Dichos restos se pueden identificar mediante la comparación de las secuencias marco del anticuerpo con las secuencias de la línea germinal de la que proviene el anticuerpo. Para reestablecer las secuencias de la región marco a su configuración de la línea germinal, las mutaciones somáticas se pueden "retromutar" a la secuencia de la línea germinal mediante, por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio o mutagénesis mediada por la PCR. También se pretende que dichos anticuerpos "retromutados" estén abarcados por la invención.
Otro tipo de modificación en la región marco implica mutar uno o más restos en la región marco o incluso en una o más regiones CDR, para eliminar los epítopos de linfocitos T para reducir de este modo la inmunogenicidad potencial del anticuerpo. Esta estrategia también se denomina "desinmunización" y se describe con más detalle en la Publicación de Patente de los Estados Unidos N.° 20030153043 concedida a Carr et al.
Además o como alternativa a las modificaciones efectuadas en la región marco o en las regiones CDR, los anticuerpos de la invención se pueden modificar por ingeniería genética para que incluyan modificaciones en la región Fc, normalmente, para alterar una o más propiedades funcionales del anticuerpo, tales como la semivida en suero, la fijación al complemento, la unión al receptor de Fc y/o la citotoxicidad celular dependiente de antígeno. Además, un anticuerpo de la invención se puede modificar químicamente (por ejemplo, se pueden unir uno o más grupos químicos al anticuerpo) se puede modificar para alterar su glucosilación, para alterar de nuevo una o más propiedades del anticuerpo. Se describe con más detalle a continuación cada uno de estos aspectos. La numeración de los restos en la región Fc es la del índice de EU de Kabat.
Un Fc abarca dominios procedentes de la región constante de una inmunoglobulina, preferentemente una inmunoglobulina humana, incluyendo un fragmento, un análogo, una variante, un mutante o derivado de la región constante. Las inmunoglobulinas incluyen IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 y otras clases tales como IgA, IgD, IgE e IgM. La región constante de una inmunoglobulina puede ser un polipéptido de origen natural o producido sintéticamente y puede incluir un dominio CH1, una bisagra, un dominio CH2, un dominio CH3 o un dominio CH4, por separado o en combinación.
La región constante de una inmunoglobulina es responsable de muchas funciones importante del anticuerpo, incluyendo la unión al receptor de Fc (FcR) y la fijación al complemento. Hay cinco clases principales de región constante de cadena pesada, clasificadas como IgA, IgG, IgD, IgE, IgM, cada una con funciones efectoras características denominadas según su isotipo. Por ejemplo, IgG se separa en cuatro subclases conocidas como IgG 1, IgG2, IgG3 e IgG4. Un Fc citado en el presente documento puede comprender cualquier clase o subclase de región constante de cadena pesada.
Las moléculas de Ig interactúan con múltiples clases de receptores celulares. Por ejemplo, las moléculas de IgG interactúan con tres clases de receptores de Fcy (FcyR) específicos para la clase de anticuerpo IgG, a saber, FcyRI, FcyRII y FcyRIII. Se ha informado que las secuencias importantes para la unión de la IgG a los receptores FcyR están ubicadas en los dominios c H2 y CH3. La semivida en suero de un anticuerpo está influenciada por la capacidad de dicho anticuerpo para unirse a un receptor de Fc (FcR). De manera similar, la semivida en suero de IgFc también está influenciada por su capacidad para unirse a dichos receptores (Gillies S D et al., (1999) Cancer Res. 59:2159-66). Un Fc citado en el presente documento puede unirse a uno o más de estos receptores.
Los anticuerpos divulgados en el presente documento pueden comprender un Fc que incluye al menos una parte del extremo carboxilo de una cadena pesada de inmunoglobulina. Por ejemplo, el Fc puede comprender: un dominio CH2, un dominio CH3, un dominio CH4, un dominio CH2-CH3, un dominio CH2-CH4, un dominio CH2-CH3-CH4, un dominio bisagra-CH2, un dominio bisagra-CH2-CH3, un dominio bisagra-CH2-CH4 o un dominio bisagra-CH2-CH3-CH4. El dominio Fc puede proceder de anticuerpos que pertenecen a cualquiera de las clases de inmunoglobulina, es decir, IgA, IgD, IgE, IgG o IgM o cualquiera de las subclases de anticuerpo IgG, es decir, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. El dominio Fc puede ser una secuencia Fc de origen natural, incluyendo variantes alélicas o de corte y empalme naturales. El dominio Fc puede ser un dominio híbrido que comprende una parte de un dominio Fc de dos o más isotipos Ig diferentes, por ejemplo, un dominio Fc híbrido de IgG2/IgG4. En aspectos ilustrativos, el dominio Fc procede de una molécula de inmunoglobulina humana. El dominio Fc puede ser una versión humanizada o desinmunizada de un dominio Fc de un animal no humano, incluyendo, pero sin limitación, ratón, rata, conejo, camello, llama, dromedario y mono.
En determinados aspectos, el dominio Fc es una secuencia de Fc variante, por ejemplo, una secuencia Fc que se ha modificado (por ejemplo, mediante sustitución, eliminación y/o inserción de aminoácidos) en relación con una secuencia de Fc precursora (por ejemplo, un polipéptido de Fc no modificado que posteriormente se modifica para generar una variante), para proporcionar características estructurales y/o actividad biológica deseables.
Por ejemplo, se pueden efectuar modificaciones en la región Fc para generar una variante de Fc que (a) tiene citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo (ADCC) aumentada o reducida, (b) citotoxicidad mediada por complemento (CDC) aumentada o reducida, (c) tiene afinidad aumentada o reducida por C1q y/o (d) tiene afinidad aumentada o reducida por un receptor de Fc en relación con el Fc precursor. Dichas variantes de la región Fc comprenderán normalmente al menos una modificación de aminoácidos en la región Fc. Se considera que la combinación de modificaciones de aminoácidos es particularmente deseable. Por ejemplo, la región Fc variante puede incluir dos, tres, cuatro, cinco, etc. sustituciones en la misma, por ejemplo, de las posiciones de la región Fc específicas identificadas en el presente documento (incluyendo las figuras).
Un dominio Fc variante puede comprender una alteración de secuencia, en donde se retiran los sitios implicados en la formación de enlaces disulfuro. Dicha eliminación puede evitar la reacción con otras proteínas que contienen cisteína presentes en la célula hospedadora usadas para producir las moléculas de la invención. Para este fin, el segmento que contiene cisteína en el extremo N-terminal puede truncarse o pueden eliminarse los restos de cisteína o sustituirse por otros aminoácidos (por ejemplo, alanilo, serilo). Incluso cuando se retiran los restos de cisteína, los dominios Fc monocatenarios pueden seguir formando un dominio Fc dimérico que se mantiene junto de manera no covalente. En otros aspectos, puede modificarse un dominio Fc nativo para hacer que sea más compatible con una célula hospedadora seleccionada. Por ejemplo, se puede retirar la secuencia de PA próxima al extremo N-terminal de un Fc nativo típico, que puede reconocerse por una enzima digestiva en E. coli, tal como prolina iminopeptidasa. En otros aspectos, pueden retirarse uno o más sitios de glucosilación en el dominio Fc. Los restos que normalmente se encuentran glucosilados (por ejemplo, asparagina) pueden conferir respuesta citolítica. Dichos restos pueden eliminarse o sustituirse por restos no glucosilados (por ejemplo, alanina). En otros aspectos, los sitios implicados en la interacción con el complemento, tal como el sitio de unión a C1q, pueden retirarse del dominio Fc. Por ejemplo, se puede eliminar o sustituir la secuencia EKK de IgG1 humana. En determinados aspectos, pueden retirarse sitios que afectan a la unión a los receptores de Fc, preferentemente, sitios distintos a sitios de unión al receptor de rescate. En otros aspectos, un dominio Fc puede modificarse para eliminar un sitio de ADCC. Se conocen en la técnica sitios de ADCC; véase, por ejemplo, Molec. Immunol. 29 (5): 633-9 (1992) con respecto a los sitios de ADCC en IgG1. Se divulgan ejemplos específicos de dominios variantes de Fc, por ejemplo, en los documentos WO 97/34631 y WO 96/32478.
En un aspecto, se modifica la región bisagra de CH1, de tal forma que se altera el número de restos de cisteína en la región bisagra, por ejemplo, se aumenta o reduce. Este enfoque se describe con más detalle en la Patente de los Estados Unidos n.° 5.677.425, concedida a Bodmer et al. Se altera el número de restos de cisteína en la región bisagra de CH1 para, por ejemplo, facilitar el ensamblaje de las cadenas ligeras y pesadas o para aumentar o disminuir la estabilidad del anticuerpo.
En otro aspecto, la región bisagra de Fc de un anticuerpo se muta para disminuir la semivida biológica del anticuerpo. Más específicamente, se introducen una o más mutaciones de aminoácidos en la región de la interfaz del dominio CH2-CH3 del fragmento bisagra-Fc de manera que el anticuerpo tiene una unión a la proteína A estafilocócica (SpA) deteriorada en relación con la unión a SpA de Fc-bisagra natural. Este enfoque se describe con más detalle en la Patente de los Estados Unidos n.° 6.165.745, concedida a Ward et al.
En otro aspecto, el anticuerpo se modifica para aumentar su semivida biológica. Son posibles diversas estrategias. Por ejemplo, pueden introducirse una o más de las mutaciones siguientes: T252L, T254S, T256F, como se describe en la Patente de los Estados Unidos n.° 6.277.375 concedida a Ward. Como alternativa, para aumentar la semivida biológica, se puede alterar el anticuerpo en la región CH1 o CL para que contenga un receptor de rescate de unión al epítopo tomado de dos bucles de un dominio CH2 de una región Fc de una IgG, como se describe en las Patentes de los Estados Unidos n.° 5.869.046 y 6.121.022 concedidas a Presta et al.
En determinados aspectos, un Fc comprende las regiones CH2 y CH3 de una IgG 1 humana como se muestra a continuación: VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQYNSTYRVVSVLTVLHQD- WLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQP REPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEN- NYKTTPP VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 171). Ha de entenderse que la glicina y la lisina en el extremo son opcionales. En determinados aspectos, un Fc comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 50 %, 60 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la (SEQ ID NO: 171). En determinados aspectos, un Fc comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 50, 100 o 150 aminoácidos contiguos de la (SEQ ID NO: 171). En determinados aspectos, un Fc comprende una secuencia de aminoácidos que tiene de 50-100, 50-150 o 100-150 aminoácidos contiguos de la (SEQ ID NO: 171). En determinados aspectos, un Fc comprende una secuencia de aminoácidos que comprende la (SEQ ID NO: 171) con de 1-5, 1-10, 1-15, 1-20 o 1-25 sustituciones o sustituciones conservativas. La región constante y1 de tipo silvestre humana se describió por primera vez por el grupo de Leroy Hood en Ellison et al., Nucl. Acids Res. 10:4071 (1982). Las posiciones 356, 358 y 431 del índice de EU definen el haplotipo G1m y1.
Se describen a continuación variantes de Fc adicionales. Se entiende que las regiones Fc de la divulgación comprenden el esquema de numeración de acuerdo con el índice de EU como en Kabat et al. (1991, Publicación del NIH 91-3242, National Technical Information Service, Springfield, Va.).
La presente divulgación abarca péptidos que tienen una región Fc que se altera reemplazando al menos un resto de aminoácido por un resto de aminoácido diferente para alterar las funciones efectoras del anticuerpo. Por ejemplo, pueden reemplazarse uno o más aminoácidos seleccionados entre los restos de aminoácido 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 y 322 por un resto de aminoácido diferente, de tal forma que el anticuerpo tiene una afinidad alterada por un ligando efector, pero conserva la capacidad de unión a antígeno del anticuerpo precursor. El ligando efector para el que se altera la afinidad puede ser, por ejemplo, un receptor Fc del componente C1 del complemento. Este enfoque se describe con más detalle en las Patentes de los Estados Unidos n.° 5.624.821 y 5.648.260, ambas concedidas a Winter et al.
En otro ejemplo, pueden reemplazarse uno o más aminoácidos seleccionados entre los restos de aminoácidos 329, 331 y 322 por un resto de aminoácido diferente, de tal forma que el anticuerpo tiene unión a C1q alterada y/o citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) reducida o suprimida. Esta estrategia se describe con más detalle en la Patente de los Estados Unidos n.° 6.194.551 concedida a Idusogie et al.
En otro ejemplo, se alteran uno o más restos de aminoácido en las posiciones de aminoácido 231 y 239 para alterar de este modo la capacidad del anticuerpo para fijarse al complemento. Este enfoque se describe con más detalle en la Publicación PCT WO 94/29351, concedida a Bodmer et al.
En otro ejemplo más, se modifica la región Fc para aumentar la capacidad del anticuerpo para mediar citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) y/o para aumentar la afinidad del anticuerpo por un receptor Fcy modificando uno o más aminoácidos en las siguientes posiciones: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301,303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331,333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 o 439. Esta estrategia se describe adicionalmente en la Publicación PCT WO 00/42072 concedida a Presta. Además, se han mapeado los sitios de unión en IgG 1 para FcyR1, FcyRII, FcyRIII y FcRn y se han descrito variantes con unión mejorada (véase Shields, R.L. et al. (2001) J. Biol. Chem.
276:6591-6604). Se ha demostrado que mutaciones específicas en las posiciones 256, 290, 298, 333, 334 y 339 mejoran la unión a FcyRIII. Además, se ha demostrado que los siguientes mutantes de combinación mejoran la unión a FcyRIII: T256A/S298A, S298A/E333A, S298A/K224A y S298A/E333A/K334A. Las sustituciones a modo de ejemplo incluyen 236A, 239D, 239E, 268D, 267E, 268E, 268F, 324T, 332D e 332E. Las variantes a modo de ejemplo incluyen 239D/332E, 236A/332E, 236A/239D/332E, 268F/324T, 267E/268F, 267E/324T y 267E/268F/324T. Otras modificaciones para potenciar las interacciones con FcyR y complemento incluyen, pero sin limitación, las sustituciones 298A, 333A, 334A, 326A, 2471, 339D, 339Q, 280H, 290S, 298D, 298V, 243L, 292P, 300L, 396L, 3051 y 396L. Se revisan estas y otras modificaciones en Strohl, 2009, Current Opinion in Biotechnology 20:685-691.
Las modificaciones de Fc que aumentan la unión a un receptor de Fc gamma incluyen modificaciones de aminoácidos en una cualquiera o más de las posiciones de aminoácidos 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 279, 280, 283, 285, 298, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 312, 315, 324, 327, 329, 330, 335, 337, 3338, 340, 360, 373, 376, 379, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 o 439 de la región Fc, en donde la numeración de los restos en la región Fc es la del índice de EU como en Kabat (documento WO00/42072).
Otras modificaciones de Fc que pueden efectuarse en los Fc son aquellas para reducir o suprimir la unión a los FcyR y/o las proteínas de complemento, reduciendo o anulando de este modo las funciones efectoras mediadas por Fc, tales como ADCC, ADCP y CDC. Las modificaciones a modo de ejemplo incluyen, pero sin limitación, sustituciones, inserciones y eliminaciones en las posiciones 234, 235, 236, 237, 267, 269, 325 y 328, en donde la numeración es de acuerdo con el índice de EU. Las sustituciones a modo de ejemplo incluyen, pero sin limitación, 234G, 235G, 236R, 237K, 267R, 269R, 325L y 328R, en donde la numeración es de acuerdo con el índice de EU. Una variante de Fc puede comprender 236R/328R. Otras modificaciones para reducir las interacciones de FcyR y de complemento incluyen las sustituciones 297A, 234A, 235A, 237A, 318A, 228P, 236E, 268Q, 309L, 330S, 331S, 220S, 226S, 229S, 238S, 233P y 234V, así como la eliminación de la glucosilación en la posición 297 por medios mutacionales o enzimáticos o mediante producción en organismos, tales como bacterias, que no glucosilan las proteínas. Se revisan estas y otras modificaciones en Strohl, 2009, Current Opinion in Biotechnology 20:685-691.
Opcionalmente, la región Fc puede comprender un resto de aminoácido de origen no natural en posiciones adicionales y/o alternativas conocidas por un experto en la materia (véase, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos n.° 5.624.821; 6.277.375; 6.737.056; 6.194.551; 7.317.091; 8.101.720; las Publicaciones de Patente PCT WO 00/42072; WO 01/58957; WO 02/06919; WO 04/016750; WO 04/029207; WO 04/035752; WO 04/074455; WO 04/099249; WO 04/063351; WO 05/070963; WO 05/040217, WO 05/092925 y WO 06/020114).
También pueden usarse variantes de Fc que potencian la afinidad por un receptor FcyRllb inhibidor. Dichas variantes pueden proporcionar un Fc con actividades inmunomoduladoras relacionadas con células FcyR11 b+, incluyendo, por ejemplo, linfocitos B y monocitos. En un aspecto, las variantes de Fc proporcionan una afinidad selectivamente potenciada para FcyRllb en relación con uno o más receptores activantes. Las modificaciones para alterar la unión a FcyR11b incluyen una o más modificaciones en una posición seleccionada entre el grupo que consiste en 234, 235, 236, 237, 239, 266, 267, 268, 325, 326, 327, 328 y 332, de acuerdo con el índice de EU. Las sustituciones a modo de ejemplo para potenciar la afinidad de FcyR11b incluyen, pero sin limitación 234D, 234E, 234W, 235D, 235F, 235R, 235Y, 236D, 236N, 237D, 237N, 239D, 239E, 266M, 267D, 267E, 268D, 268E, 327D, 327E, 328F, 328W, 328Y e 332E. Las sustituciones a modo de ejemplo incluyen 235Y, 236D, 239D, 266M, 267E, 268D, 268E, 328F, 328W y 328Y. Otras variantes de Fc para potenciar la unión a FcyR11b incluyen 235Y/267E, 236D/267E, 239D/268D, 239D/267E, 267E/268D, 267E/268E y 267E/328F.
Pueden determinarse las afinidades y las propiedades de unión de una región Fc por su ligando mediante diversos métodos de ensayo in vitro (ensayos bioquímicos o basados en inmunología) conocidos en la técnica, incluyendo, pero sin limitación, métodos en equilibrio (por ejemplo, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) o radioinmunoensayo (RIA)) o cinéticos (por ejemplo, análisis BIACORE) y otros métodos, tales como ensayos de unión indirectos, ensayos de inhibición competitivos, transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET), electroforesis y cromatografía en gel (por ejemplo, filtración en gel). Estos y otros métodos pueden utilizar un marcador o uno o más de los componentes que se están examinando y/o emplear varios métodos de detección que incluyen, pero sin limitación, marcadores cromogénicos, fluorescentes, luminiscentes o isotópicos. Puede encontrarse una descripción detallada de las afinidades y cinéticas de unión en Paul, W. E., ed., Fundamental Immunology, 4.a edición, Lippincott-Raven, Philadelphia (1999), que se centra en las interacciones de anticuerpoinmunógeno.
Un Fc también puede aumentar la semivida en suero de un anticuerpo. Por ejemplo, esto puede efectuarse aumentando la afinidad de unión de la región Fc por el FcRn. Por ejemplo, pueden mutarse uno o más de los siguientes restos: 252, 254, 256, 433, 435, 436, como se describe en la Patente de los Estados Unidos n.° 6.277.375.
Otras variantes de Fc a modo de ejemplo que aumentan la unión a FcRn y/o mejoran las propiedades farmacocinéticas incluyen sustituciones en las posiciones 259, 308, 428 y 434, incluyendo, por ejemplo, 2591, 308F, 428L, 428M, 434S, 434H, 434F, 434Y e 434M. Otras variantes que aumentan la unión de Fc a FcRn incluyen: 250E, 250Q, 428L, 428F, 250Q/428L (Hinton et al., 2004, J. Biol. Chem. 279(8): 6213-6216, Hinton et al. 2006 Journal of Immunology 176:346-356), 256A, 272A, 286A, 305A, 307A, 307Q, 31 1A, 312A, 376A, 378Q, 380A, 382A, 434A (Shields et al, Journal of Biological Chemistry, 2001, 276(9):6591-6604), 252F, 252T, 252Y, 252W, 254T, 256S, 256R, 256Q, 256E, 256D, 256T, 309P, 31 1 S, 433R, 433S, 4331, 433P, 433Q, 434H, 434F, 434Y, 252Y/254T/256E, 433K/434F/436H, 308T/309P/311S (Dall Acqua et al. Journal of Immunology, 2002, 169:5171 -5180, Dall'Acqua et al., 2006, Journal of Biological Chemistry 281:23514-23524). Otras modificaciones para modular la unión a FcRn se describen en Yeung et al., 2010, J Immunol, 182:7663-7671.
En determinados aspectos, pueden usarse isotipos IgG híbridos con características biológicas particulares. Por ejemplo, puede construirse una variante híbrida lgG1/lgG3 sustituyendo posiciones de lgG1 en la región CH2 y/o CH3 con los aminoácidos de lgG3 en las posiciones donde difieren los dos isotipos. Por lo tanto, puede construirse un anticuerpo IgG variante híbrido que comprende una o más sustituciones, por ejemplo, 274Q, 276K, 300F, 339T, 356E, 358M, 384S, 392N, 397M, 4221, 435R y 436F. En otros aspectos de la invención, puede construirse una variante híbrida lgG1/lgG2 sustituyendo posiciones de lgG2 en la región CH2 y/o CH3 con los aminoácidos de lgG1 en las posiciones donde difieren los dos isotipos. Por lo tanto, puede construirse un anticuerpo IgG variante híbrido que comprende una o más sustituciones, por ejemplo, una o más de las siguientes sustituciones de aminoácidos: 233E, 234L, 235L, -236G (que se refiere a una inserción de una glicina en la posición 236) y 327A.
En otro aspecto más, se modifica la glucosilación de un anticuerpo. Por ejemplo, puede producirse un anticuerpo aglucosilado (es decir, el anticuerpo carece de glucosilación). La glucosilación puede alterarse para, por ejemplo, aumentar la afinidad del anticuerpo por el antígeno. Dichas modificaciones de carbohidratos pueden llevarse a cabo, por ejemplo, alterando uno o más sitios de glucosilación en la secuencia de anticuerpo. Por ejemplo, pueden efectuarse una o más sustituciones de aminoácidos que dan como resultado la eliminación de uno o más sitios de glucosilación de la región marco para eliminar de este modo la glucosilación en este sitio. Dicha glucosilación puede aumentar la afinidad del anticuerpo por el antígeno. Dicho enfoque se describe con más detalle en las Patentes de los Estados Unidos n.° 5.714.350 y 6.350.861 concedidas a Co et al. Como alternativa, pueden cambiarse, modificarse o de otro modo alterarse los oligosacáridos que están unidos covalentemente a la región Fc, por ejemplo, expresando una IgG en diversos organismos o líneas celulares (por ejemplo, células Lec-13 CHO o células de hibridoma de rata YB2/0), mediante la regulación de enzimas implicadas en la vía de glucosilación (por ejemplo, FUT8 [a1,6-fucosiltransferasa] y/o p1-4-N-acetilglucosaminiltransferasa III [Gn-TIII]), modificando carbohidratos después de que se haya expresado la IgG o expresando una proteína de fusión de Fc en presencia de análogos de fucosa como inhibidores enzimáticos. Otros métodos para modificar las glucoformas de Fc incluyen el uso de cepas glucodiseñadas de levadura (Li et al., 2006, Nature Biotechnology 24(2):210-215), musgo (Nechansky et al., 2007, Mol Immunjol 44(7): 1826-8) y plantas (Cox et al., 2006, Nat Biotechnol 24(12): 1591 -7).
En un aspecto, se glucodiseñan fusiones de Fc para alterar el nivel de sialilación. Los mayores niveles de glucanos de Fc sialilados pueden tener un impacto negativo en la funcionalidad (Scallon et al., 2007, Mol Immunol. 44(7): 1524-34) y las diferencias en los niveles de sialilación de Fc pueden dar como resultado una actividad antiinflamatoria (Kaneko et al., 2006, Science 313:670-673).
También puede modificarse el nivel de glucosilación de una molécula de Fc mediante mutaciones específicas. Por ejemplo, una mutación en la posición de aminoácido 297 o 299 elimina la glucosilación en la posición 297. Otras modificaciones de Fc que pueden usarse incluyen las descritas en los documentos WO88/07054, WO88/07089, US 6.277.375, WO99/051642, WO01/058957, WO2003/074679, WO2004/029207, US 7.317.091 y WO2004/099249.
Además o como alternativa, se puede preparar un anticuerpo que tiene un tipo alterado de glucosilación, tal como un anticuerpo hipofucosilado que tiene cantidades reducidas de restos de fucosilo o un anticuerpo que tiene que tiene estructuras GlcNAc bisectadas aumentadas. Se ha demostrado que dichos patrones de glucosilación alterada aumentan la capacidad de ADCC de los anticuerpos. Dichas modificaciones de hidratos de carbono se pueden lograr mediante, por ejemplo, la expresión del anticuerpo en una célula hospedadora con maquinaria de glucosilación alterada. Las células con la maquinaria de glucosilación alterada se han descrito en la materia y se pueden usar como células hospedadoras en las que expresar anticuerpos recombinantes de la invención para producir de este modo un anticuerpo con glucosilación alterada. Por ejemplo, el documento EP 1.176.195 por Hanai et al. describe una línea celular con un gen FUT8 funcionalmente interrumpido, que codifica una fucosiltransferasa, de manera que los anticuerpos expresados en dicha línea celular presentan hipofucosilación. Publicación PCT WO 03/035835 concedida a Presta describe una variante de la línea celular CHO, células Lec13, con capacidad reducida para unir fucosa a los hidratos de carbono enlazados a Asn(297), que también da como resultado una hipofucosilación de anticuerpos expresados en esa célula hospedadora (véase también Shields, R.L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740). La Publicación PCT WO 99/54342 concedida a Umana et al. describe líneas celulares diseñadas por ingeniería genética para expresar glucosiltransferasas modificadoras de glucoproteínas (por ejemplo beta(1,4)-N acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII)), de manera que dichos anticuerpos expresados en las líneas celulares diseñadas por ingeniería genética presentan estructuras GIcNac bisectadas aumentadas que dan como resultado una actividad de ADCC aumentada de los anticuerpos (véase también Umana et al., 1999 Nat. Biotech. 17: 176-180).
Además, las variantes de Fc particulares incluyen la variante Fc4 que contiene una región bisagra de y1, pero se ha introducido Arg 218 en la región bisagra para incluir una secuencia de reconocimiento de enzima de restricción Bg1 II para facilitar la clonación e incluye una sustitución de Cys por Ser para prevenir los efectos perjudiciales debido a la presencia potencial de un grupo sulfhidrilo no emparejado. La región CH2 de Fc4 se gasa en y1 CH2 y contiene tres sustituciones de aminoácidos que reducen la unión al receptor Fc y receptor I (FcyRI). Estas son sustituciones en las posiciones del índice de EU 234, 235 y 237. Estas sustituciones se describieron por el grupo de Greg Winter en Duncan et al., Nature 332:563 (1988) y en ese artículo se demostró que reducen la unión al Fc y RI. Además, se introdujeron dos sustituciones de aminoácidos en el sitio de unión a C1q de complemento para reducir la fijación al complemento. Estas son las sustituciones en las posiciones del índice de EU 330 y 331. La importancia o relevancia, de las posiciones 330 y 331 en la unión a C1q de complemento (o la ausencia de fijación o activación de complemento) se describe por el grupo de Sherie Morrison en Tao et al., J. Exp. Med. 178:661 (1993) y Canfield y Morrison, J. Exp. Med. 173:1483 (1991). La región CH3 de la variante de Fc4 permanece idéntica a y1 Fc de tipo silvestre.
Fc5 es una variante de Fc4 en la que se retornó la sustitución de Arg 218 en la región bisagra al resto de Lys 218 de tipo silvestre. Fc5 también contiene la misma sustitución de Cys 220 a Ser que Fc4 así como las mismas sustituciones de CH2 con una región CH2 que es idéntica a y1 Fc de tipo silvestre. La variante Fc6 contiene las mismas sustituciones en la región bisagra que Fc5 y contiene las mismas sustituciones de CH2 que Fc4. La región CH3 de Fc6 no contiene un resto de lisina carboxilo terminal. Este resto de Lys particular no tiene un número asignado en el índice de EU. Esta lisina se elimina en diversos grados de las inmunoglobulinas maduras y por lo tanto, no se encuentra predominantemente en los anticuerpos circulantes. La ausencia de este resto en Fc recombinante puede dar como resultado un producto más homogéneo. La variante Fc7 es idéntica a y1 Fc de tipo silvestre en la región bisagra. Su región CH2 se está basada en CH2 de y1, pero el sitio de unión a carbohidratos unido a N en el resto Asn-297 se cambia a Gln para producir un Fc desglucosilado. (Véase, por ejemplo, Tao y Morrison (1989) J. Immunol. 143:2595-2601). La región CH3 es idéntica a y1 Fc. La variante Fc8 tiene una región bisagra que es idéntica a Fc4 y tanto la región CH2 como la región CH3 son idénticas a las regiones y1 Fc de tipo silvestre correspondientes. La variante de Fc9 contiene una bisagra de y1 acortada que comienza en el resto de Asp inmediatamente en carboxilo terminal al resto de Cys implicado en la unión disulfuro a la cadena ligera. El resto de la secuencia de bisagra es idéntico a la bisagra de y1 de tipo silvestre. Tanto la secuencia de la región CH2 como la secuencia de la región CH3 son idénticas a las regiones correspondientes para y1 Fc de tipo silvestre. La variante Fc10 contiene la misma sustitución de la región bisagra que Fc5. Tanto la secuencia de la región CH2 como la secuencia de la región CH3 son idénticas a las regiones correspondientes para y1 Fc de tipo silvestre. La variante Fc11 contiene las mismas sustituciones de la región bisagra que Fc5. Su dominio CH2 se está basado en CH2 de y1, pero contiene las sustituciones para reducir la unión al receptor de Fcy (sustituciones en las posiciones del índice de Eu 234, 235 y 237). Fc11 es de tipo silvestre para la unión a C1q y la fijación al complemento. El dominio CH3 de Fc11 es idéntico a y1 CH3 de tipo silvestre. La variante Fc12 contiene una bisagra de y1 con las sustituciones Cys 220 Ser, Cys 226 Ser y Cys 229 Ser, tiene un dominio CH2 que es idéntico al de Fc5 y tiene dominio y1 CH3 de tipo silvestre. La variante Fc13 contiene una bisagra de y1 con las sustituciones Cys 220 Ser, Cys 226 Ser y Cys 229 Ser, tiene el dominio CH2 que es idéntico al de Fc5 y tiene un y1 CH3 con la sustitución Tyr 407 Gly. La variante Fc14 contiene una bisagra de y1 con las sustituciones Cys 220 Ser, Cys 226 Ser y Cys 229 Ser, tiene un y1 CH2 de tipo silvestre y tiene un y1 CH3 de tipo silvestre con la sustitución Tyr 407 Gly. La variante Fc15 contiene una bisagra de y4 con una sustitución Ser 228 Pro para reducir el "intercambio de Fab" de IgG4 y tiene dominios y4 CH2 y CH3 de tipo silvestre. La variante Fc16 contiene una bisagra de y1 que contiene una sustitución Cys 220 Ser, tiene un dominio CH2 idéntico al y1 CH2 y tiene un dominio CH3 idéntico al y4 CH3 de tipo silvestre. La variante Fc17 contiene una bisagra de y1 con una sustitución Cys 220 Ser, tiene un dominio y1 CH2 con una sustitución Phe 243 Ala y tiene un dominio CH3 idéntico al y1 CH3 de tipo silvestre. La variante Fc18 contiene una bisagra de y1 con una sustitución Cys 220 Ser, tiene un dominio y1 CH2 idéntico al y1 CH2 de tipo silvestre y contiene un y1 CH3 con una sustitución His 435 Ala. La variante Fc19 contiene una bisagra idéntica a Fc5, tiene un dominio CH2 idéntico a Fc5, excepto por que se cambia el sitio de unión a carbohidrato unido a N en el resto Asn-297 a Gln para producir un Fc desglucosilado y tiene un dominio CH3 idéntico al y1 CH3 de tipo silvestre. La variante Fc21 contiene una bisagra de Y1 con las mutaciones Cys 220 Ser, Cys 226 Ser y Cys 229 Ser, tiene un dominio CH2 idéntico a Fc5 y tiene un y1 CH3 con las sustituciones Phe 405 Ala y Tir 407 Gly. La variante Fc22 contiene una bisagra de y1 con las mutaciones Cys 220 Ser, Cys 226 Ser y Cys 229 Ser, tiene un dominio CH2 idéntico a Fc1 y tiene un y1 CH3 con las sustituciones Phe 405 Ala y Tir 407 Gly. La variante Fc23 contiene una bisagra de y1 con la sustitución Cys 220 Ser, tiene un dominio y1 CH2 con las sustituciones Leu 234 Ala, Leu 235 Glu, Pro 331 y un dominio CH3 idéntico al y1 Fc de tipo silvestre.
Otra modificación de los anticuerpos en el presente documento que se contempla por la invención es la pegilación. Se puede pegilar un anticuerpo para, por ejemplo, aumentar la semivida biológica (por ejemplo, sérica) del anticuerpo. Para pegilar un anticuerpo, normalmente se hace reaccionar el anticuerpo o el fragmento del mismo con polietilenglicol (p Eg ), tal como un éster reactivo o un derivado de aldehído de PEG, en condiciones en las que uno o más grupos PEG se unen al anticuerpo o fragmento de anticuerpo. Preferentemente, la pegilación se lleva a cabo mediante una reacción de acilación o una reacción de alquilación con una molécula de PEG reactiva (o un polímero hidrosoluble reactivo análogo). Como se usa en el presente documento, el término "polietilenglicol" pretende abarcar cualquiera de las formas de PEG que se han usado para derivatizar otras proteínas, tales como monoalcoxi (C1-C10) o ariloxi-polietilenglicol o polietilenglicol-maleimida. En determinados aspectos, el anticuerpo que se va a pegilar es un anticuerpo aglucosilado. Los métodos para pegilar proteínas son conocidos en la materia y se pueden aplicar a los anticuerpos de la invención. Véase, por ejemplo, el documento EP 0154316 concedido a Nishimura et al. y el documento EP 0401 384 concedido a Ishikawa et al.
Métodos de uso
En algunos casos, la divulgación se refiere a métodos de tratamiento que incluyen la administración a un sujeto de una composición divulgada en el presente documento.
Estos incluyen métodos para tratar y/o prevenir un cáncer o los síntomas de cáncer en un sujeto que comprenden administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que comprende un péptido que se une inmunoespecíficamente a la secuencia A relacionada con polipéptido de la clase I del MHC (MICA), en donde el péptido comprende la región determinante de la complementariedad (CDR) 3 de la VH del anticuerpo con la ID 1, 6, 7, 8, 9, 11 o 12 mostrado en la tabla 1 que tiene 5 o menos sustituciones de aminoácidos conservativas y la CDR3 de la Vl del anticuerpo con la ID 1, 6, 7, 8, 9, 11 o 12 mostrado en la tabla 1 que tiene 5 o menos sustituciones de aminoácidos conservativas. En algunos aspectos, el cáncer es un cáncer asociado con la sobreexpresión de MICA. En algunos aspectos, el cáncer es melanoma, de pulmón, de mama, de riñón, de ovario, de próstata, pancreático, gástrico y carcinoma de colon, linfoma o leucemia. En algunos aspectos, el cáncer es melanoma. En algunos aspectos, el cáncer es una neoplasia maligna de células plasmáticas, por ejemplo, mieloma múltiple (MM) o una afección premaligna de células plasmáticas. En algunos aspectos, se ha diagnosticado que el sujeto tiene un cáncer o tiene una predisposición a padecer cáncer.
En algunos casos, la divulgación se refiere a métodos para tratar y/o prevenir el cáncer o los síntomas de cáncer en un sujeto que comprenden administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que comprende un anticuerpo aislado que se une específicamente a la secuencia A relacionada con péptido de clase I del MHC (MICA), en donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada región (Vh) que comprende la CDR1 de Vh, la CDR2 de Vh y la CDR3 de Vh como se muestra en la secuencia de Vh de SEQ ID NO: 2, 77, 96, 113, 131, 150 o 168 y una secuencia de región variable de cadena ligera (Vl) de SEQ ID NO: 11, 79, 98, 113, 133, 152 o 170.
Los síntomas del cáncer son bien conocidos por los expertos en la materia e incluyen, sin limitación, lunares con características infrecuentes, un cambio en la apariencia de un lunar, incluyendo asimetría, borde, color y/o diámetro, un área de la piel recién pigmentada, un lunar abdominal, área oscurecida bajo las uñas, bultos mamarios, cambios en el pezón, quistes mamarios, dolor mamario, muerte, pérdida de peso, debilidad, fatiga excesiva, dificultad para comer, pérdida de apetito, tos crónica, fatiga que empeora, tos con sangre, sangre en la orina, sangre en las heces, náuseas, vómitos, metástasis hepáticas, metástasis pulmonares, metástasis óseas, llenado abdominal, meteorismo, fluido en la cavidad peritoneal, sangrado vaginal, estreñimiento, distensión abdominal, perforación del colon, peritonitis aguda (infección, fiebre, dolor), dolor, vómitos con sangre, sudoración intensa, fiebre, tensión arterial alta, anemia, diarrea, ictericia, mareos, escalofríos, espasmos musculares, metástasis en el colon, metástasis pulmonares, metástasis en la vejiga, metástasis hepáticas, metástasis óseas, metástasis en el riñón y metástasis pancreáticas, dificultad para tragar.
Los métodos divulgados en el presente documento pueden aplicarse a una gran variedad de especies, por ejemplo, seres humanos, primates no humanos (por ejemplo, monos), caballos, ganado bovino, cerdos, ovejas, ciervo, alces europeos, cabras, perros, gatos, mustélidos, conejos, cobayas, hámsteres, ratas y ratones.
Los términos "tratar" o "tratando", como se usan en el presente documento, se refieren a aliviar, inhibir, mejorar y/o aliviar parcial o completamente el inicio, la progresión o la recurrencia de al menos un síntoma o indicios biológicos de la enfermedad o afección que padece el sujeto. En algunos casos, el tratamiento puede dar como resultado la ausencia continuada de la enfermedad o afección que padece el sujeto.
La expresión "dosis eficaz" o "dosis efectiva" se define como una cantidad suficiente para lograr o al menos lograr parcialmente el efecto deseado. La expresión "dosis terapéuticamente eficaz" se define en el presente documento como una cantidad suficiente para curar o al menos detener parcialmente la enfermedad y sus complicaciones en un paciente que ya padece la enfermedad. Las cantidades eficaces para este uso dependerán de la gravedad del trastorno que se esté tratando y el estado general del propio sistema inmunitario del paciente.
Una "cantidad terapéuticamente eficaz" o "dosis terapéuticamente eficaz" de un fármaco o agente terapéutico, tal como una proteína de fusión de Fc de la invención, es cualquier cantidad del fármaco que, cuando se usa sola o en combinación con otro agente terapéutico, promueve la regresión de la enfermedad, lo que se evidencia por una reducción en la gravedad de los síntomas de la enfermedad, un aumento en la frecuencia y la duración de los periodos libres de síntomas de la enfermedad o la prevención del deterioro o la incapacidad debido a estar afectado por la enfermedad. Una cantidad o dosis terapéuticamente eficaz incluye una "cantidad profilácticamente eficaz" o una "dosis profilácticamente eficaz", que es cualquier cantidad del fármaco que, cuando se administra sola o en combinación con otro agente terapéutico a un sujeto en riesgo de desarrollar una enfermedad o de padecer la recurrencia de una enfermedad, inhibe el desarrollo o la recurrencia de la enfermedad. Puede evaluarse la capacidad de un agente terapéutico para promover la regresión de la enfermedad o inhibir el desarrollo o la recurrencia de la enfermedad usando varios métodos conocidos para el experto en la materia, tal como en sujetos humanos durante ensayos clínicos, en sistemas de modelo animal que predicen la eficacia en seres humanos o ensayando la actividad del agente en ensayos in vitro.
A modo de ejemplo, un agente anticáncer promueve la regresión del cáncer en un sujeto. En aspectos preferidos, una cantidad terapéuticamente eficaz del fármaco promueve la regresión del cáncer hasta el punto de eliminar el cáncer. "Promover la regresión del cáncer" significa que la administración de una cantidad eficaz del fármaco, sola o en combinación con un agente antineoplásico, da como resultado una reducción en el crecimiento o el tamaño tumoral, necrosis del tumor, una reducción en la gravedad de al menos un síntoma de la enfermedad, un aumento en la frecuencia y la duración de los periodos libres de síntomas de la enfermedad, una prevención del deterioro o la discapacidad causada por la enfermedad o de otro modo, la mejora de los síntomas de la enfermedad en el paciente. Además, los términos "eficaz" y "eficacia", con respecto a un tratamiento, incluyen tanto eficacia farmacológica como seguridad fisiológica. La eficacia farmacológica se refiere a la capacidad del fármaco para promover la regresión del cáncer en el paciente. La seguridad fisiológica se refiere al nivel de toxicidad u otros efectos fisiológicos adversos a nivel celular, de órgano y/o de organismo (efectos adversos) que resultan de la administración del fármaco.
A modo de ejemplo para el tratamiento de tumores, una cantidad o dosis terapéuticamente eficaz del fármaco inhibe preferentemente el crecimiento celular o el crecimiento tumoral en al menos aproximadamente un 20 %, más preferentemente en al menos aproximadamente un 40 %, aún más preferentemente, en al menos aproximadamente un 60 % y aún más preferentemente, en al menos aproximadamente un 80 % en relación con sujetos no tratados. En los aspectos más preferidos, una cantidad o dosis terapéuticamente eficaz del fármaco inhibe completamente el crecimiento celular o el crecimiento tumoral, es decir, inhibe preferentemente el crecimiento celular o el crecimiento tumoral en un 100 %. Puede evaluarse la capacidad de un compuesto para inhibir el crecimiento tumoral usando los ensayos descritos más adelante. Como alternativa, puede evaluarse esta propiedad de una composición examinando la capacidad del compuesto para inhibir el crecimiento tumoral, pudiendo medirse dicha inhibición in vitro mediante ensayos conocidos por el experto en la materia. En otros aspectos preferidos de la invención, puede observarse regresión tumoral y continuar durante un periodo de al menos aproximadamente 20 días, más preferentemente, al menos aproximadamente 40 días o incluso más preferentemente, al menos aproximadamente 60 días.
En general, los métodos incluyen seleccionar a un sujeto en riesgo de o con una afección o enfermedad. En algunos casos, la afección o enfermedad del sujeto puede tratarse con una composición farmacéutica divulgada en el presente documento. Por ejemplo, en algunos casos, los métodos incluyen seleccionar a un sujeto con cáncer, por ejemplo, en donde el cáncer del sujeto puede tratarse usando como diana uno o ambos de MICA y/o angiopoyetina-2.
En algunos casos, los métodos de tratamiento pueden incluir una sola administración, múltiples administraciones y administraciones repetidas, según sea necesario para la profilaxis o el tratamiento de la enfermedad o afección que padece el sujeto. En algunos casos, los métodos de tratamiento pueden incluir evaluar un nivel de la enfermedad en el sujeto antes del tratamiento, durante el tratamiento y/o después del tratamiento. En algunos casos, puede continuarse el tratamiento hasta que se detecta un nivel de enfermedad en el sujeto.
Los términos "administrar", "administrando" o "administración", como se usan en el presente documento, se refieren a implantar, absorber, ingerir, inyectar o inhalar, el péptido de la invención, independientemente de su forma. En algunos casos, pueden administrarse por vía tópica (por ejemplo, nasal) y/o por vía oral uno o más de los péptidos divulgados en el presente documento. Por ejemplo, los métodos en el presente documento incluyen la administración de una cantidad eficaz de compuesto o composición de compuesto para lograr el efecto deseado o indicado. La dosificación y los regímenes de tratamiento específicos para cualquier paciente concreto dependerán de varios factores, que incluyen la actividad del compuesto específico empleado, la edad, el peso corporal, el estado de salud general, el sexo, la dieta, el tiempo de administración, la tasa de excreción, la combinación de fármacos, la gravedad y la evolución de la enfermedad, afección o síntomas, la disposición del paciente a la enfermedad, afección o síntomas y el juicio del médico tratante.
Por ejemplo, las pautas posológicas se ajustan para proporcionar la respuesta óptima deseada (por ejemplo, una respuesta terapéutica). Puede administrarse un solo bolo, se pueden administrar varias dosis divididas a lo largo del tiempo o se puede reducir o aumentar proporcionalmente la dosis según se indique por las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente ventajoso formular las composiciones parenterales en forma de dosis unitaria para facilitar la administración y la uniformidad de la dosis. "Forma farmacéutica unitaria", como se usa en el presente documento, se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para los sujetos que se vayan a tratar; conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el transportador farmacéutico necesario. La especificación para las formas farmacéuticas unitarias de la invención está dictada por y depende directamente de (a) las características únicas del compuesto activo y del efecto terapéutico concreto que se vaya a lograr y de (b) las limitaciones inherentes en la técnica de formar compuestos de dicho compuesto activo para el tratamiento de la sensibilidad en individuos.
Para la administración de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo anti-MICA, la dosis varía de aproximadamente 0,0001 a 100 mg/kg y más normalmente, de 0,01 a 5 mg/kg, de peso corporal del hospedador. Por ejemplo, las dosis pueden ser de 0,3 mg/kg de peso corporal, 1 mg/kg de peso corporal, 3 mg/kg de peso corporal, 5 mg/kg de peso corporal o de 10 mg/kg de peso corporal o estar en el intervalo de 1-10 mg/kg. Una pauta posológica a modo de ejemplo implica la administración una vez a la semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, una vez cada cuatro semanas, una vez al mes, una vez cada 3 meses o una vez cada tres a 6 meses. Las pautas posológicas preferidas para un anticuerpo anti-MICA de la invención incluyen 1 mg/kg de peso corporal o 3 mg/kg de peso corporal por administración intravenosa, usando una de las siguientes pautas posológicas para el anticuerpo que se está administrando: (i) cada cuatro semanas durante seis dosis, después cada tres meses; (ii) cada tres semanas; (iii) 3 mg/kg de peso corporal seguido de 1 mg/kg de peso corporal cada tres semanas.
En algunos métodos, se administran simultáneamente dos o más anticuerpos monoclonales con diferentes especificidades de unión, en cuyo caso, la dosis de cada anticuerpo administrado se encuentra en los intervalos indicados. El anticuerpo se administra normalmente en múltiples ocasiones. Los intervalos entre dosis individuales pueden ser, por ejemplo, semanales, mensuales, cada tres meses o anuales. Los intervalos también pueden ser irregulares, según se indique midiendo los niveles sanguíneos de anticuerpo para el antígeno diana en el paciente. En algunos métodos, se ajusta la dosis para lograr una concentración plasmática de anticuerpo de aproximadamente 1-1000 pg/ml y en algunos métodos, de aproximadamente 25-300 pg/ml.
Como alternativa, las composiciones farmacéuticas pueden administrarse como una formulación de liberación sostenida, en cuyo caso se requiere una administración menos frecuente. La dosis y la frecuencia varían dependiendo de la semivida del anticuerpo en el paciente. En general, los anticuerpos humanos muestran la semivida más prolongada, seguidos de los anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos y anticuerpos no humanos. La dosificación y la frecuencia de administración pueden variar dependiendo de si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. En aplicaciones profilácticas, se administra una dosificación relativamente baja a intervalos relativamente infrecuentes durante un periodo de tiempo prolongado. Algunos pacientes continúan recibiendo el tratamiento durante el resto de su vida. En aplicaciones terapéuticas, en ocasiones se re requiere una dosis relativamente elevada a intervalos relativamente cortos hasta que se reduce o detiene la progresión de la enfermedad y preferentemente, hasta que el paciente muestra una mejora parcial o completa de los síntomas de la enfermedad. Posteriormente, puede administrarse al paciente un régimen profiláctico.
Los niveles de dosis reales de los principios activos en las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden variarse de tal forma que se obtiene una cantidad del principio activo que es eficaz para lograr la respuesta terapéutica deseada para un paciente, composición y modo de administración particular, sin que sean tóxicos para el paciente. El nivel de dosis seleccionado dependerá de varios factores farmacocinéticos, incluyendo la actividad de las composiciones particulares de la presente invención empleadas o del éster, la sal o la amida del mismo, la vía de administración, el tiempo de administración, la tasa de excreción del compuesto particular que se está empleando, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales usados en combinación con las composiciones particulares empleadas, la edad, el sexo, el peso, la afección, el estado de salud general y el historial médico previo del paciente que se está tratando y factores similares bien conocidos en las técnicas médicas.
Tras la administración, puede evaluarse al sujeto para detectar, evaluar o determinar su nivel de enfermedad. En algunos casos, el tratamiento puede continuar hasta que se detecta un cambio (por ejemplo, reducción) en el nivel de enfermedad en el sujeto.
Tras la mejora del estado de un paciente (por ejemplo, un cambio (por ejemplo, reducción) en el nivel de enfermedad en el sujeto), puede administrarse una dosis de mantenimiento de un compuesto, composición o combinación de la presente invención, en caso de que sea necesario. Posteriormente, puede reducirse la dosis o la frecuencia de administración o ambas, en función de los síntomas, hasta un nivel en que se mantiene la mejora de la afección. Los pacientes pueden, sin embargo, requerir tratamiento intermitente a largo plazo tras cualquier recurrencia de los síntomas de la enfermedad.
En algunos casos, la divulgación proporciona métodos para detectar células inmunitarias, por ejemplo, linfocitos B y/o linfocitos B de memoria, de un sujeto humano. Dichos métodos pueden usarse, por ejemplo, para monitorizar los niveles de células inmunitarias, por ejemplo, linfocitos B y/o linfocitos B de memoria, en un sujeto humano, por ejemplo, después de un evento. Los eventos a modo de ejemplo pueden incluir, pero sin limitación, detección de enfermedades, infección; administración de una composición terapéutica divulgada en el presente documento, administración de un agente terapéutico o régimen de tratamiento, administración de una vacuna, inducción de una respuesta inmunitaria. Dichos métodos pueden usarse clínicamente y/o para investigación.
Ejemplos
La invención se describe con más detalle en los ejemplos siguientes, que no limitan el alcance de la invención descrita en las reivindicaciones.
En el presente documento se describen métodos que permiten la detección sensible, específica y fiable de linfocitos B de memoria escasos, con especificidad antigénica definida, a partir de cantidades limitadas de sangre periférica. Los métodos permitieron la visualización y el aislamiento de linfocitos B de memoria de meses a años después de que se haya eliminado el antígeno.
Se estableció una prueba de principio para los métodos divulgados en el presente documento usando tetrámeros del fragmento C del toxoide tetánico (TTCF), como se comunica en detalle en Franz et al. (Blood, 118(2):348-357 (2011)).
Se seleccionó TTCF (es decir, el fragmento C-terminal no tóxico de 52 kDa de TTCF) como antígeno modelo debido a que la mayoría de individuos han sido vacunados con toxoide tetánico y se inducen títulos de anticuerpo IgG persistentes por medio de la vacuna (Amanna et al., N. Engl. J. Med., 357:1903-1915, 2007). Por consiguiente, el uso de TTCF proporcionó un gran grupo de sujetos en los que se pudieron verificar los métodos divulgados en el presente documento. Un experto en la materia apreciará, sin embargo, que los presentes métodos pueden adaptarse para incluir cualquier antígeno relacionado con enfermedades usando habilidades rutinarias. Como se demuestra en los ejemplos a continuación, se ha demostrado dicha adaptación mediante la adquisición de anticuerpos dirigidos contra MICA y angiopoyetina-2, que son antígenos relacionados con el cáncer.
Ejemplo 1: Expresión de antígeno y formación de tetrámero
Como se describe en más detalle a continuación, se expresó TTCF en Escherichia coli y se unió un sitio de BirA al extremo N-terminal para la mono-biotinilación de sitio específico mediante la enzima BirA. Se colocó un enlazador flexible entre la proteína y el sitio de biotinilación para prevenir el impedimento estérico de la unión de anticuerpo. Se purificó TTCF mediante cromatografía de intercambio aniónico, se biotiniló con BirA y se separó de la biotina libre y BirA mediante cromatografía de filtración en gel. Los tetrámeros de TTCF se generaron incubando estreptavidina marcada fluorescentemente con antígeno TTCF biotinilado a una relación molar de 1:4. Después, se usaron estos tetrámeros junto con un panel de mAb para la identificación de linfocitos B de memoria específicos para toxoide tetánico.
Se clonó TTCF en pET-15b (Novagen). La expresión de proteína se indujo en Eschericia coli BL21(DE3) con p-D-1-tiogalactopiranósido de isopropilo 1 mM (IPTG) durante 4 horas a 28 °C. Las células se lavaron, se lisa ron y se recogió el sobrenadante resultante. Se purificó TTCF usando una columna de afinidad HIS-Select (Sigma). El marcador de His se retiró proteolíticamente. Se produjo el dominio proximal a membrana de CD80 usando métodos similares. Las proteínas se monobiotinilaron. Para ciertos experimentos, se ligaron moléculas de colorante Alexa-488 (Molecular probes) a aminas primarias sobre TTCF o CD80 biotinilados.
Se prepararon tetrámeros de antígeno incubando el antígeno biotinilado con estreptavidina marcada con PE de grado premium (Molecular Probes) durante al menos 20 minutos sobre hielo a una relación molar de 4:1. Antes de usarse, se centrifugaron las preparaciones de tetrámero para retirar los agregados. En algunos experimentos, se formaron tetrámeros con antígenos marcados con Alexa-fluor-488 y estreptavidina no fluorescente a una relación 4:1.
Ejemplo 2: Métodos de identificación
Se llevaron a cabo métodos como los descritos en Franz et al., Blood, 118(2):348-357 (2011). Las células se clasificaron en un clasificador celular BD FACS Aria II. Las células se clasificaron en células individuales. En primer lugar, se seleccionaron las células en células CD19+ que eran negativos para un panel de marcadores de exclusión (CD3, CD14, CD16, 7AAD) y después se clasificaron en plasmablastos, se identificaron por altos niveles de CD27 y un nivel inmediato de expresión de CD19 y finalmente en células tetrámero+ CD19+.
Debido a la baja frecuencia de los linfocitos B de memoria, fue necesario reducir cuidadosamente el fondo tanto como fuese posible. En primer lugar, se enriquecieron los linfocitos B mediante selección negativa (cóctel de anticuerpos para CD2, c D3, CD14, CD16, CD56 y glucoforina A) para eliminar la mayoría de células que podrían unirse inespecíficamente al tetrámero. Las células enriquecidas se dividieron uniformemente y se tiñeron con TTCF o un tetrámero de control, seguido de marcaje con CD19, CD27 e IgM para seleccionar específicamente linfocitos B de memoria con clase cambiada. La estrategia de clasificación tomó en consideración la expresión de CD19, la ausencia de marcaje con un panel de marcadores de exclusión (CD3, CD14, CD16, 7AAD), la expresión del marcador de memoria CD27 y la ausencia de expresión de IgM evidenciada por el cambio de clase. La tinción de tetrámero se representó frente a la tinción de CD27 para la visualización de los linfocitos B de memoria con la especificidad de antígeno de interés. Los linfocitos B positivos para el tetrámero se clasificaron directamente en tiras para la PCR que contenían 3 pl de tampón de extracción de ARNm.
Los tubos se mantuvieron fríos durante la clasificación y las células clasificadas se congelaron y almacenaron a -80 °C. Como controles positivos se usaron linfocitos B c D19+ CD27+ IgM-.
Se usó un protocolo de PCR anidada anteriormente publicado para amplificar los segmentos variables de cadena pesada y ligera (Wang et al., J. Immunol. Methods., 244:217-225, 2000). La amplificación del ARNm se llevó a cabo en condiciones adecuadas para minimizar la contaminación. Los cebadores usados incluyeron:
TAATACGACTCACTATAGGTTCGGGGAAGTAGTCCTTGACCAGG (SEQ ID NO: 19);
TAATACGACTCACTATAGGGATAGAAGTTATTCAGCAGGCACAC (SEQ ID NO: 20);
TAATACGACTCACTATAGGCGTCAGGCTCAGRTAGCTGCTGGCCGC (SEQ ID NO: 21).
La RT-PCR anidada se llevó a cabo como se describe en Franz et al., Blood, 118(2):348-357 (2011).
Se incluyeron controles negativos para monitorizar y proteger contra la contaminación. De un total de 35 células individuales marcadas con el tetrámero de TTCF, se amplificaron 32 segmentos de cadena pesada y 30 de cadena ligera y se secuenciaron directamente a partir de los productos de la PCR purificados en gel, lo que corresponde a una eficiencia general de la PCR del 89 %. El análisis de secuencia reveló que las células tetrámero de TTCF+ emplearon varios diferentes segmentos génicos VhD-Jh, sin dominancia de un segmento génico particular. Las secuencias observadas respaldaron que los clones representaron células diversificadas por hipermutación somática. La producción de anticuerpo y la purificación incluyeron la clonación de ADN del dominio variable de cadena pesada y ligera en vectores de expresión pcDNA3.3 separados que contenían la secuencia de péptido de señal de prolactina bovina, así como los dominios constantes de cadena pesada o kappa ligera de IgG1. Los anticuerpos se expresaron en medio de CHO-S (Invitrogen) complementado con Glutamax 8 mM (Gibco) en matraces rotatorios de 100 ml a 37 °C con un 8 % de CO2. Un día antes de la transfección, se separaron las células en 6x105 células/ml. En el día de la transfección, se ajustaron las células, en caso necesario, a 1x106 células/ml. Se cotransfectaron 25 |jg de ADN plasmídico de cadena pesada y ligera usando reactivo de transfección MAX (Invitrogen) y las células transfectadas se cultivaron durante 6-8 días. La proteína se obtuvo usando perlas de proteína G-sefarosa y el anticuerpo se eluyó usando glicina 100 mM a pH 2,5 y se separó de las perlas usando tubos para centrifugación Spin-X. Se intercambió el anticuerpo a suero salino tamponado con fosfato (PBS) usando columnas Micro Bio-Spin (BioRad). La concentración de proteína se determinó mediante la absorbancia a 280nm.
Para el ensayo de unión de saturación, se marcó con europio TTCF purificado en MonoQ no biotinilado y se retiró el europio libre. Se recubrieron placas de fondo plano de 96 pocillos durante una noche con 20ng de anticuerpo por pocillo en tampón de NaHCO3100 mM a pH 9,6. El bloqueo se llevó a cabo con tampón de ensayo complementado con seroalbúmina bovina (BSA) y gammaglobulinas bovinas. Se diluyó TTCF-europio en tampón de ensayo (100 nM a 4pM) y se añadieron 200 jl por pocillo por triplicado. Las placas se incubaron durante 2 horas a 37 °C y se lavaron tres veces con 200 j l de tampón de lavado (Tris 50 mM a pH 8, NaCl 150 mM, EDTA 20 jM , Tween al 0,05 %). Se añadieron 100 j l de solución potenciadora a cada pocillo y se midieron los recuentos de fluorescencia usando un lector de placas Victor3 a 615nm.
Se analizaron las secuencias de dominio variable de cadena pesada y ligera usando IMGT/V-Quest y el programa informático JIONSOLVER. Los datos de citometría de flujo se evaluaron usando el programa informático de análisis FlowJo. Se llevaron a cabo los análisis estadísticos usando el programa informático GraphPad Prism 5 usando la prueba de t no emparejada. Para determinar los valores de Kd del anticuerpo, se ajustaron los datos de unión de saturación usando el programa informático GraphPad Prism 5 usando análisis de regresión no lineal.
Ejemplo 3: La multimerización potencia la identificación de linfocitos B de memoria
Se comparó TTCF tetramérico y monomérico. Se marcó TTCF fluorescentemente con Alexa-488 y después se usó en forma monomérica o se convirtió en un tetrámero usando estreptavidina no marcada (véase lo anterior). Posteriormente, se incubaron los linfocitos B enriquecidos con TTCF-Alexa-488 tetramérico o monomérico a la misma concentración. La proteína de control (dominio proximal de membrana de CD80) se marcó del mismo modo y también se usó como tetrámero.
Tal como se muestra en las FIG. 6A y 6B, TTCF marcó a algunos linfocitos B de memoria, pero las frecuencias identificadas con tetrámero fueron sustancialmente mayores (1,6-7,3 veces) usando células de tres donantes. En uno de los tres donantes, fue posible detectar linfocitos B de memoria específicos para TTCF con el tetrámero pero no con el monómero.
Estos resultados demuestran que los tetrámeros de antígeno permiten la detección sensible de linfocitos B de memoria basándose en la especificidad antigénica de su BCR, a pesar de que dichas células sean muy escasas en la sangre periférica. Los linfocitos B de memoria con la clase cambiada específicos para TTCF se marcaron brillantemente con el antígeno de TTCF tetramérico adecuado, mientras que el marcaje de fondo con tetrámero de control fue consistentemente bajo.
Ejemplo 4: Validación de método/anticuerpo
Se generaron anticuerpos totalmente humanos uniendo regiones constantes de las cadenas pesadas y kappa de IgG a segmentos variables aislados mediante PCR solapante. Los anticuerpos se expresaron en un sistema de expresión de mamífero transitorio sin suero usando células CHO-S durante un periodo de 6-8 días. Los anticuerpos se purificaron usando proteína G y cromatografía de filtración en gel.
Tal como se muestra en las FIG. 7A-7B, los anticuerpos aislados de plasmablastos específicos para TTCF mostraron altas afinidades de unión al antígeno de TTCF, con una Kd de 2,2 nM (TTCF Ab 1) y 323 pM (TtCF Ab 2) (FIG. 7B). Los anticuerpos aislados de linfocitos B de memoria también mostraron altas afinidades de unión, con una Kd de 382 pM, 228 pM y 1,4 nM, para otros anticuerpos (Abs para TTCF 3, 4 y 5) (FIG. 7B).
Estos datos respaldan la especificidad de los métodos divulgados en el presente documento. Además, se demostró la especificidad de los métodos del presente documento mediante la construcción de los cinco anticuerpos anti-TTCF de tres donantes diferentes, todos los cuales se unieron a TTCF con alta afinidad.
Los datos en el presente documento también demuestran que los tetrámeros de antígeno permiten la detección sensible de linfocitos B de memoria tiempo después de la eliminación del antígeno en el hospedador.
Ejemplo 5: Obtención de anticuerpos anti-MICA
Se desarrollaron anticuerpos que se unen inmunoespecíficamente a MICA usando los métodos del presente documento.
En resumen, se expresó antígeno MICA (UniGene Hs.130838) con un marcador BirA C-terminal (GLNDIFEAQKIEWHE (SEQ ID NO: 148)), que permite la monobiotinilación del antígeno. El antígeno se tetramerizó con estreptavidina (SA) marcada con R-ficoeritrina (PE) a una relación molar de 4 MICA: 1 SA. Se obtuvieron células mononucleares de sangre periférica de pacientes con melanoma en estadio avanzado que habían sido vacunados con células tumorales autólogas transducidas con un vector de expresión de GM-CSF (GVAX) (PNAS 103: 9190, 2006) y posteriormente fueron tratadas con el anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 ipilimumab (YERVOY™ (disponible de Bristol Myers Squib)). Se descongelaron rápidamente células mononucleares de sangre periférica, se lavaron y se resuspendieron a 5x106 en suero salino tamponado con fosfato (pH 7,2) suplementado con suero fetal de ternero al 2 % y se tiñeron con aproximadamente 0,1ug/ml de tetrámero durante 30 minutos sobre hielo. Se añadieron anticuerpos para identificar linfocitos B de memoria con la clase cambiada (CD19+, CD27+ e IgM-). Se incluyó un panel de anticuerpos de exclusión que marcan linfocitos T, linfocitos citolíticos naturales, macrófagos y células muertas para reducir la tinción de fondo de tetrámero (CD3, CD14, CD16, 7-AAD). Los linfocitos B individuales que se unieron al tetrámero de MICA se clasificaron en tiras de PCR de 8 tubos usando el dispositivo BD FACS Aria II. Se amplificó el ARNm del receptor de linfocitos B (BCR) usando un kit comercial de Epicentre Biotechnologies (número de catálogo: MBCL90310) usando cebadores para genes específicos mostrados a continuación:
Amplificación de ARNm
IgG-T7: AATACGACTCACTATAGGTTCGGGGAAGTAGTCCTTGACCAGG (SEQ ID NO: 22)
Kappa-T7:
TAATACGACTCACTATAGGGATAGAAGTTATTCAGCAGGCACAC (SEQ ID NO: 23)
Lambda-T7:
TAATACGACTCACTATAGGCGTCAGGCTCAGRTAGCTGCTGGCCGC (SEQ ID NO: 24)
PCR Uno
VHL-1: TCACCATGGACTG(C/G)ACCTGGA (SEQ ID NO: 25)
VHL-2: CCATGGACACACTTTG(C/T)TCCAC (SEQ ID NO: 26)
VHL-3: TCACCATGGAGTTTGGGCTGAGC (SEQ ID NO: 27)
VHL-4: AGAACATGAAACA(C/T)CTGTGGTTCTT (SEQ ID NO: 28)
VHL-5: ATGGGGTCAACCGCCATCCT (SEQ ID NO: 29)
VHL-6: ACAATGTCTGTCTCCTTCCTCAT (SEQ ID NO: 30)
VkL-1: GCTCAGCTCCTGGGGCTCCTG (SEQ ID NO: 31)
VkL-2: CTGGGGCTGCTAATGCTCTGG (SEQ ID NO: 32)
VkL-3: TTCCTCCTGCTACTCTGGCTC (SEQ ID NO: 33)
VkL-4: CAGACCCAGGTCTTCATTTCT (SEQ ID NO: 34)
VlL-1: CCTCTCCTCCTCACCCTCCT (SEQ ID NO: 35)
VlL-2: CTCCTCACTCAGGGCACA (SEQ ID NO: 36)
VlL-3: ATGGCCTGGA(T/C)C(C/G)CTCTCC (SEQ ID NO: 37)
CgII: GCCAGGGGGAAGAC(C/G)GATG (SEQ ID NO: 38)
CkII: TTTCAACTGCTCATCAGATGGCGG (SEQ ID NO: 39)
ClII: AGCTCCTCAGAGGAGGG(C/T)GG (SEQ ID NO: 40)
PCR Dos
VH-1: CAGGT(G/C)CAGCTGGT(G/A)CAGTC (SEQ ID NO: 41)
VH-2: CAG(A/G)TCACCTTGAAGGAGTC (SEQ ID NO: 42)
VH-3: (G/C)AGGTGCAGCTGGTGGAGTC (SEQ ID NO: 43)
VH-4: CAGGTGCAGCTGCAGGAGTC (SEQ ID NO: 44)
VH-5: GA(G/A)GTGCAGCTGGTGCAGTC (SEQ ID NO: 45)
VH-6: CAGGTACAGCTGCAGCAGTC (SEQ ID NO: 46)
Vk-1: CG(A/C)CATCC(A/G)G(A/T)TGACCCAGT (SEQ ID NO: 47)
Vk-2: CGAT(A/G)TTGTGATGAC(C/T)CAG (SEQ ID NO: 48)
Vk-3: CGAAAT(T/A)GTG(T/A)TGAC(G/A)CAGTCT (SEQ ID NO: 49)
Vk-4: CGACATCGTGATGACCCAGT (SEQ ID NO: 50)
Vl-1: CCAGTCTGTGCTGACTCAGC (SEQ ID NO: 51)
Vl-2: CCAGTCTGCCCTGACTCAGC (SEQ ID NO: 52)
Vl-3: CTCCTATGAGCTGAC(T/A)CAGC (SEQ ID NO: 53)
CgIII: GAC(C/G)GATGGGCCCTTGGTGGA (SEQ ID NO: 53)
CkIII: AAGATGAAGACAGATGGTGC (SEQ ID NO: 55)
ClIII: GGGAACAGAGTGACCG (SEQ ID NO: 56)
Los cebadores y las condiciones de ciclado PCR usados en la PCR uno y la PCR dos se adaptaron de Wang y Stollar et al. (Journal of Immunological Methods, 2000).
Se desarrolló un conjunto alternativo de cebadores de región variable de cadena pesada para abarcar las secuencias de región variable de cadena pesada potencialmente no abarcadas adecuadamente por el conjunto de cebadores anterior. Se generaron los siguientes cebadores alternativos:
PCR Uno
VHL1-58: TCACTATGGACTGGATTTGGA (SEQ ID NO: 57)
VHL2-5: CCATGGACA(C/T)ACTTTG(C/T)TCCAC (SEQ ID NO: 58)
VHL3-7: GTAGGAGACATGCAAATAGGGCC (SEQ ID NO: 59)
VHL3-11: AACAAAGCTATGACATATAGATC (SEQ ID NO: 60)
VHL3-13.1: ATGGAGTTGGGGCTGAGCTGGGTT (SEQ ID NO: 61)
VHL3-13.2: AGTTGTTAAATGTTTATCGCAGA (SEQ ID NO: 62)
VHL3-23: AGGTAATTCATGGAGAAATAGAA (SEQ ID NO: 63)
VHL4-39: AGAACATGAAGCA(C/T)CTGTGGTTCTT (SEQ ID NO: 64)
VHL4-61: ATGGACTGGACCTGGAGCATC (SEQ ID NO: 65)
VHL-9: CCTCTGCTGATGAAAACCAGCCC (SEQ ID NO: 66)
PCR Dos
VH1-3/18: CAGGT(C/T)CAGCT(T/G)GTGCAGTC (SEQ ID NO: 67)
VH1-45/58: CA(A/G)ATGCAGCTGGTGCAGTC (SEQ ID NO: 68)
VH2-5: CAG(A/G)TCACCTTGA(A/G)GGAGTCTGGT (SEQ ID NO: 69)
VH3-9/23/43: GA(A/G)GTGCAGCTG(T/G)TGGAGTC (SEQ ID NO: 70)
VH3-16: GAGGTACAACTGGTGGAGTC (SEQ ID NO: 71)
VH3-47: GAGGATCAGCTGGTGGAGTC (SEQ ID NO: 72)
V4-34: CAGGTGCAGCTACAGCAGTG (SEQ ID NO: 72)
V4-30-2/ 39: CAGCTGCAGCTGCAGGAGTC (SEQ ID NO: 74)
VH7-4-1: CAGGTGCAGCTGGTGCAATC (SEQ ID NO: 75)
En resumen, Se usaron 2ul de ADNc generado mediante amplificación de ARNm como molde para la primera ronda de PCR, con las siguientes condiciones de ciclado: 3 ciclos de preamplificación (94 C/45 segundos, 45 °C/45 segundos, 72 °C/105 segundos); 30 ciclos de amplificación (94 °C/45 segundos, 50 °C/45 segundos, 72 °C /105 segundos); 10 minutos de extensión final a 72 °C.
3ul de producto de la primera ronda de PCR sirvieron como molde para la segunda ronda de PCR anidada. Se usaron las mismas condiciones de ciclado para la primera ronda de PCR, pero se omitieron los 3 ciclos de preamplificación. Ambas etapas PCR se llevaron a cabo mediante el uso de AD Pfu polimerasa clonada (Agilent Technologies). Los productos de la PCR se separaron en geles de agarosa al 1 % y se aislaron productos con un tamaño de 300-400 nucleótidos mediante el uso del kit de recuperación de ADN en gel Zymoclean (Zymo Research). Se llevó a cabo la secuenciación mediante el uso de cebadores directos e inversos usados para la segunda ronda de PCR anidada. Una PCR anidada en dos etapas amplifica los dominios variables de BCR de las cadenas pesada y ligera (véase lo anterior). Se obtuvieron células mononucleares de sangre periférica de pacientes con melanoma en estadio avanzado que habían sido vacunados con células tumorales autólogas transducidas con un vector de expresión de GM-c Sf (GVAX) (PNAS 103: 9190, 2006). Los anticuerpos se expresaron como anticuerpos IgG 1 de longitud completa en un sistema de expresión transitoria de CHO-S.
La validación de la unión del anticuerpo anti-MICA a MICA se llevó a cabo usando dos ensayos basados en perlas independientes. El primer ensayo usó un kit de ensayo en perlas basado la solución disponible comercialmente diseñado para la detección de anticuerpos anti-MICA reactivos con varios alelos de MICA (One Lambda, número de catálogo LSMICA001). Se incubaron diversas concentraciones del anticuerpo para MICA con perlas, posteriormente se lavaron y se incubaron con un anticuerpo IgG anti-humano conjugado con ficoeritrina. Después de una segunda etapa de lavado, las perlas se analizaron en una máquina Luminex. Un control negativo consistió en la incubación de perlas solo con anticuerpo anti-IgG humana conjugado con ficoeritrina (sin anticuerpo anti-MICA). Un control positivo consistió en la incubación de perlas con un anticuerpo monoclonal anti-MICA/MICB disponible comercialmente (clon 6D4) conjugado directamente a ficoeritrina (BioLegend, n.° de catálogo 320906). El segundo ensayo se desarrolló internamente usando perlas de poliestireno conjugadas con estreptavidina. Las perlas se recubrieron con proteína MICA monobiotinilada y se incubaron con diversas concentraciones de anticuerpo anti-MICA, anticuerpo anti-TTCF (control negativo de isotipo) o anticuerpo anti-MICA/MICB de BioLegend conjugado directamente a ficoeritrina (control positivo). Se lavaron las perlas incubadas con anticuerpo anti-MICA o anticuerpo anti-TTCF y después se incubaron con anticuerpo anti-IgG humana conjugado con Alexa488. Para determinar la unión de fondo a las perlas, se llevó a cabo la misma incubación usando perlas conjugadas con estreptavidina no recubiertas con proteína MICA por comparación. Se analizaron las perlas respecto de su unión a los anticuerpos en un citómetro de flujo FACS Caliber.
Tal como se muestra en las FIG. 8 y 9A-9O, los anticuerpos anti-MICA (MICA-Ab12 y MICA-Ab20) se unen con alta afinidad a MICA. MICA-Ab20 corresponde al anticuerpo anti-MICA ID-1 descrito en la tabla 1.
Ejemplo 6: Anticuerpos anti-MICA
Se desarrollaron anticuerpos anti-MICA adicionales con propiedades biológicas clínicamente relevantes usando los métodos del presente documento. Se identificaron anticuerpos específicos para MICA reactivos con alelos comunes en pacientes que habían recibido una vacuna celular contra el cáncer (células cancerosas transducidas con GM-CSF, citada como GVAX) y un anticuerpo que bloquea el receptor inhibidor de CTLA-4 en linfocitos T ipilimumab (YERVOY™ (disponible de Bristol Myers Squib)). Después se usaron los tetrámeros de MICA para aislar linfocitos B de células mononucleares de sangre periférica de pacientes con la mayor reactividad con MICA sérico. Se determinaron secuencias de cadena pesada y ligera a partir de estos linfocitos B mediante PCR de células individuales, como se indica en el ejemplo 5. Este esfuerzo condujo a la identificación de anticuerpos que reconocen alelos comunes en la población norteamericana.
CM24002 Ab2 (anticuerpo anti-MICA ID-6 descrito en la tabla 1) es un anticuerpo aislado de un paciente con leucemia mieloide aguda (AML) que demostró una respuesta clínica significativa a la terapia de combinación de GVAX Ipilimumab y cuyo plasma reaccionó fuertemente contra MICA. Se muestran las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la cadena ligera (FIG. 12 y 13) y la cadena pesada (FIG. 10 y 11) de CM24002 Ab2, con las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 subrayadas. Se obtuvo un anticuerpo adicional con fuerte unión del mismo paciente y se marcó como CM24002 Ab4 (anticuerpo anti-MICA ID-7 descrito en la tabla 1). Se muestran las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la cadena ligera (FIG. 16 y 17) y la cadena pesada (FIG. 15 y 14) de CM24002 Ab4, con las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 subrayadas.
CM33322 Ab11 (anticuerpo anti-MICA ID-8 descrito en la tabla 1), CM33322 Ab4 (anticuerpo anti-MICA ID-11 descrito en la tabla 1) y CM33322 Ab28 (anticuerpo anti-MICA ID-12 descrito en la tabla 1) son anticuerpos aislados de un paciente con melanoma metastásico que tiene respuesta a largo plazo a la terapia de combinación de GVAX Ipilimumab. Se muestran las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la cadena ligera (FIG. 20 y 21) y la cadena pesada (FIG. 18 y 19) de CM33322 Ab11, con las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 subrayadas. Se muestran las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la cadena ligera (FIG. 24 y 25) y la cadena pesada (FIG. 22 y 23) de CM33322 Ab29, con las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 subrayadas. Se muestran las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la cadena ligera (FIG. 37 y 38) y la cadena pesada (FIG. 35 y 36) de CM33322 Ab4, con las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 subrayadas. Se muestran las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la cadena ligera (FIG. 52 y 53) y la cadena pesada (FIG. 50 y 51) de CM33322 Ab28, con las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 subrayadas. Debido a la respuesta clínica a largo plazo de este paciente, estos anticuerpos son particularmente interesantes.
Después de la identificación, clonación y expresión inicial de los anticuerpos de interés, se determinó la especificidad de estos anticuerpos por diferentes alelos de MICA con un ensayo citométrico con perlas. En resumen, se expresaron, purificaron y capturaron sobre perlas de estreptavidina los alelos recombinantes de MICA 002, 008, 009 y MICB con un solo sitio de biotinilación de BirA. Después, se incubaron los anticuerpos anti-MICA indicados con las perlas recubiertas con MICA recombinante a diferentes concentraciones durante una hora, posteriormente se lavaron y se incubaron con un anticuerpo secundario anti-IgG humana marcado con FITC. Después de una segunda etapa de lavado, se llevó a cabo la cuantificación de fluorescencia de FITC unido a placa mediante citometría de flujo. Se seleccionaron los alelos de MICA 002, 008, 009, así como la proteína MICB relacionada basándose en su prevalencia en las poblaciones de Norteamérica (FIG. 26A-G). De manera importante, CM24002 Ab2 y CM33322 Ab29 se unieron fuertemente a todos los alelos de MICA, además de a MICB. Los otros dos anticuerpos se unieron a un subconjunto de alelos: CM24002 Ab4 tuvo una unión elevada a MICA*009 y MICB y CM33322 Ab11 tuvo una unión elevada a MICA*002, MICA*008 y MICB. (FIG. 26A-G) Se documentó especificidad mediante el uso de un anticuerpo de control negativo humano generado con la misma tecnología (específico para el fragmento C-terminal del toxoide tetánico, TTCF) y un anticuerpo de control positivo para MICA (un anticuerpo murino comercial de BioLegend dirigido contra MiCA). Estos estudios identificaron CM24002 Ab2 y CM33322 Ab29 como candidatos potenciales para aplicación clínica.
Se evaluó la unión de CM33322 Ab28 a dos concentraciones de anticuerpo (500ng/ml y 1 pg/ml) contra MICA recombinante codificado por los tres alelos comunes (MICA*002, MICA*008, MICA*009) mediante ELISA (lectura de HRP). Los resultados demostraron que CM33322 Ab28 se unió a los tres alelos, lo que indica que este anticuerpo también es un candidato para aplicación clínica.
Ejemplo 7: Unión de anticuerpo anti-MICA a células tumorales autólogas
Se determinó mediante citometría de flujo la capacidad del anticuerpo anti-MICA CM24002 Ab2 aislado para unirse a células tumorales autólogas (FIG. 27). Se obtuvo médula ósea del paciente CM24002 y se evaluó la unión a células tumorales de CM24002 Ab2. Después, se identificaron células tumorales de la muestra de médula ósea como células CD33+ CD34+. Después, se tiñeron las células tumorales con 10 pg/ml de anticuerpo anti-MICA CM24002 Ab2, anticuerpo anti-MICA comercial de control positivo (BioLegend) o un anticuerpo de control negativo (específico para TTCF). Como se muestra en la FIG. 27, CM24002 Ab2 se unió fuertemente a estas células. CM24002 Ab2 no mostró unión a células tumorales (células CD16+ y CD3+) y solo unión de fondo a células CD14+, demostrando especificidad antitumoral (datos no mostrados).
Ejemplo 8. Inhibición con anticuerpo anti-MICA del receptor NKG2D en células NK.
Se examinó la capacidad del anticuerpo anti-MICA aislado CM24002 Ab2 para prevenir la regulación negativa mediada por MICA de su receptor afín, NKG2D. Se usó suero del paciente CM24002 a una dilución 1:10 y se incubó con células NK humanas durante un periodo de 48 horas. Se añadieron a estos cultivos CM24002 Ab2 (concentración de 10 pg/ml), anti-MICA comercial de control positivo (BioLegend) o un anticuerpo de control negativo (específico para TTCF). Se evaluó la expresión de NKG2D mediante citometría de flujo a las 48 h (FIG. 28). El suero del paciente CM24002 reguló negativamente con fuerza la expresión de NKG2D (anulando de este modo la función de este receptor). CM24002 Ab2 y el anticuerpo anti-MICA de control positivo restauraron parcialmente la expresión superficial de NKG2D por las células NK. Para demostrar la especificidad, se repitió el experimento anterior incubando células con MICA recombinante a 2ng/ml en lugar de suero de paciente (FlG. 29). CM24002 Ab2 previno por completo la regulación negativa de la expresión de NKG2D mediada por MICA, mientras que el anticuerpo de control negativo (específico para TTCF) no tuvo efecto (FlG. 29). Estos datos demuestran que los anticuerpos anti­ MICA humano pueden prevenir la inhibición del receptor de NKG2D crítico en células NK humanas.
Para examinar adicionalmente la capacidad de los anticuerpos anti-MICA aislados para prevenir la regulación negativa mediada por MICA de NKG2D, se repitió el experimento anterior usando múltiples muestras de suero y anticuerpos anti-MICA aislados adicionales. Como se muestra en la FlG. 29, 15 de las 20 muestras de suero de pacientes con melanoma avanzado contienen niveles significativos de MICA dispersado. Las PBMC se incubaron con muestras de suero de control o de paciente con melanoma seleccionadas que contenían solo MICA soluble o en presencia de los anticuerpos indicados a 100ug/ml durante 48 horas. A las 48 horas, se determinó la expresión de NKG2D en células NK (CD3-, CD8-, CD56+) mediante citometría de flujo (FlG. 40; los datos se representan como % de células NK que son positivas para NKG2D). Estos datos demuestran además que los anticuerpos anti-MICA humanos bloquearon la regulación negativa de NKG2D en las muestras de suero, restauraron la toxicidad mediada por NKG2D en todas las muestras de suero ensayadas y pueden impedir la inhibición del receptor NKG2D crítico en células NK humanas.
Para examinar adicionalmente la capacidad de los anticuerpos anti-MICA aislados para prevenir la regulación negativa mediada por MICA de NKG2d , se repitió el experimento anterior usando anticuerpos anti-MICA aislados adicionales (por ejemplo, CM24002 Ab2, CM33322 Ab4, CM33322 Ab11 o CM33322 Ab28). Después de 48 horas, se lavaron las células y se evaluó la expresión superficial de NKG2D mediante citometría de flujo. Como se muestra en la FlG. 59, varios anticuerpos anti-MICA bloquean la regulación negativa de NKG2D inducida por rMICA.
Para examinar la capacidad de los anticuerpos anti-MICA aislados para prevenir la regulación negativa de NKG2D en suero de melanoma, se repitió el experimento anterior usando múltiples muestras de suero y anticuerpos anti­ MICA aislados adicionales. Se incubaron PBMC enteras con suero de control o suero de melanoma solo o en presencia de los anticuerpos indicados durante 48 horas. Después de 48 horas, se lavaron las células y se evaluó la expresión superficial de NKG2D mediante citometría de flujo. Como se muestra en la FlG. 57, varios anticuerpos anti-MICA bloquean la regulación negativa de NKG2D inducida por suero de melanoma.
Ejemplo 9: Citotoxicidad mediada por células de anticuerpos anti-MICA
Para determinar si CM24002 Ab2 permite la citotoxicidad mediada por células, se incubaron células NK humanas (células efectoras) durante 48 horas con MICA recombinante (2ng/ml) en presencia de CM24002 Ab2, un anticuerpo de control negativo (específico para TTCF) o un anticuerpo de control positivo (BioLegend), todos a 10 pg/ml. Después de 48 horas, se lavaron las células y se incubaron con células tumorales K562 a relaciones de efector:diana de 20:1, 10:1 y 5:1 durante 4 horas. Se determinó la lisis específica de células diana por células NK por la liberación de una proteína citosólica (LDH) de células tumorales K562. En ausencia de anticuerpos anti-MICA, no hubo eliminación de células tumorales K562 por células NK. Sin embargo, CM24002 Ab2 potenció en gran medida la lisis mediada por linfocitos T de células tumorales K562 y fue más eficaz que el anticuerpo anti-MICA murino de control positivo a todas las relaciones de efector:diana (FIG. 30). Además, se demostró que la eliminación de células tumorales K562 estaba de hecho mediada por la vía de NKG2D (en lugar de por receptores de Fc). Se repitió el experimento anterior, con la adición de dos grupos experimentales: un anticuerpo bloqueante para NKG2D y de bloqueo de Fc humano. Además, también se ensayó CM33322 Ab29. Los datos demuestran que la adición de CM24002 Ab2 y CM33322 Ab29 permitió la citotoxicidad mediada por células NK. La eliminación de células K562 no se produjo cuando se añadió un anticuerpo de bloqueo de NKG2D, mientras que el reactivo de bloqueo de Fc tuvo poco efecto (FIG. 31). Estos datos demuestran que CM24002 Ab2 y CM33322 Ab29 restauran la función antitumoral de la vía de NKG2D.
Para determinar si anti-MICA aislado adicional posibilita la citotoxicidad mediada por células, se incubaron PBMC completas durante 48 horas con MICA recombinante (rMICA) en presencia de CM24002 Ab2, CM33322 Ab4, CM33322 Ab11, CM33322 Ab28, un anticuerpo de control negativo (específico para TTCF) o un anticuerpo de control positivo (BioLegend). Después de 48 horas, se lavaron las células y se incubaron con células diana K562 marcadas con 51Cr a relaciones de efector:diana de 20:1, 10:1 y 5:1 durante 4 horas. La lisis específica se evaluó mediante la liberación de 51Cr después de 4 horas. Como se demuestra en la FIG. 58, La actividad de eliminación de células NK se ve potenciada por los anticuerpos anti-MICA en presencia de sMICA recombinante. Para determinar adicionalmente si los anticuerpos anti-MICA posibilitan la citotoxicidad mediada por células, se incubaron células NK (células efectoras) durante 48 horas con suero de paciente de melanoma. Las PBMC se incubaron con muestras de suero de control o de paciente con melanoma que contenía solo MICA soluble o en presencia de los anticuerpos indicados a 100ug/ml durante 48 horas (anticuerpo de control de isotipo negativo (específico para TTCF) o un anticuerpo de control positivo (BioLegend)). A las 48 horas, se lavaron las células y se incubaron con células diana K562 marcadas con 51Cr a una relación de efector a diana de 20:1. La lisis específica se evaluó mediante recuento de centelleo después de 4 horas. (FIG. 41-43 y 62) Estos datos demuestran además que CM24002 Ab2, CM33322 Ab29, CM33322 Ab4 y CM33322 Ab28 restauran la función antitumoral de la vía de NkG2D.
Se incubaron PBMC enteras con suero de control o suero de melanoma solo o en presencia de CM24002 Ab2, CM33322 Ab4, CM33322 Ab11 y CM33322 Ab28 durante 48 horas. (FIG. 56) Después de 48 horas, se lavaron las células y se incubaron con células diana K562 marcadas con 51Cr a las relaciones de efector a diana indicadas. La lisis específica se evaluó mediante la liberación de Cr después 4 horas. Como se demuestra en la FIG. 56, la actividad de eliminación de células NK se ve potenciada por los anticuerpos anti-MICA en presencia de suero de melanoma.
En un ejemplo adicional, CM24002 Ab2 y CM33322 Ab28 potenciaron en gran medida la lisis mediada por linfocitos T de células tumorales K562 y fueron más eficaces que el anticuerpo anti-MICA murino de control positivo a todas las relaciones de efector:diana (FIG. 54).
En un experimento adicional, CM24002 Ab2, CM33322 Ab28 y CM33322 Ab29 previnieron la regulación negativa del receptor de NKG2D en células NK y linfocitos T CD8 durante 48 h de incubación con sMICA+ suero de paciente (FIG. 62A-B). También se demostró que estos anticuerpos para MICA previenen la inhibición de la citotoxicidad de linfocitos T CD8 por sMICA (clon específico para NY-ESO, células Mel375 marcadas con 51Cr, relación E:T de 20:1) (FIG. 62C).
Ejemplo 10: Unión del anticuerpo anti-MICA al dominio alfa 3 de MICA
En receptor NKG2D se une a los dominios alfa 1 y alfa 2 superiores de MICA y los anticuerpos que se unen al mismo sitio pueden competir con el receptor de NKG2D y de este modo bloquear la eliminación de células tumorales por células NK. Los anticuerpos que se unen al dominio alfa 3 son particularmente interesantes ya que no pueden bloquear la unión al receptor de NKG2D. Al mismo tiempo, dichos anticuerpos pueden interferir con la escisión proteolítica de MICA de la superficie de células tumorales. Se evaluó la afinidad de los anticuerpos anti-MICA por el dominio alfa 3 de MICA usando el ensayo de perlas citométricas anteriormente descrito. Se capturó la proteína recombinante biotinilada sobre perlas de estreptavidina. Después, se incubaron las células con los anticuerpos CM24002 Ab2, CM24002 Ab4, CM33322 Ab11, CM33322 Ab29, un anticuerpo de control negativo (específico para TTCF) o un anticuerpo de control positivo (BioLegend), a 10 pg/ml seguido de un anticuerpo secundario anti-IgG humana marcado con FITC y cuantificación de la fluorescencia de FITC unido a las perlas mediante citometría de flujo (FIG. 32). Como se muestra en la FIG. 32, CM33322 Ab29 se unió al dominio alfa 3 de MICA y por tanto, es de gran interés para aplicaciones terapéuticas.
En otro experimento, CM24002 Ab2, CM24002 Ab4, CM33322 Ab11, CM33322 Ab29 y CM33322 Ab28 se unieron al dominio a3 de MICA, según se midió mediante ELISA (FIG 63a). CM24002 Ab2, CM33322 Ab29 y CM33322 Ab28 demostraron además aumentar los niveles superficiales de MICA en células RPMI-8226 durante una incubación de 48 horas.
Ejemplo 11: Unión de anticuerpo anti-MICA a células tumorales
Se evaluó el potencial de CM24002 Ab2 y de CM33322 Ab29 para su uso para dirigirse a una gran variedad de cánceres. Se evaluó el marcaje de un panel de células de mieloma múltiple (RPMI 8226 y Xg-1), de cáncer de ovario (OVCAR3), de leucemia mieloide aguda (U937), de melanoma (K028), de cáncer de pulmón (1792 and 827) y de cáncer de mama (MCF7) con CM24002 Ab2 y CM33322 Ab29. Las células tumorales se resuspendieron a una concentración de 1x106 células/ml en PBS con BSA al 1 % y se tiñeron con CM24002 Ab2 y CM33322 Ab29, así como controles positivos y negativos (anticuerpo anti-MICA murino y anticuerpo específico para TTCF, respectivamente) (conjugados directamente) a una concentración de 10 pg/ml durante 1 hora a 4 °C. El marcaje se llevó a cabo por citometría de flujo (FIG. 33). Tanto CM24002 Ab2 como CM33322 Ab29 se unieron a cada tipo celular tumoral ensayado, siendo el marcaje mayor que el control positivo comercial para la mayoría de líneas celulares evaluadas. Cuando se ensayó en líneas celulares tumorales Me1526, K029, RPMI-8226 y MCF-7, CM3332 Ab28 también demostró la capacidad de detectar MICA en las células tumorales.
Ejemplo 12: Especificidad por el alelo de MICA del anticuerpo anti-MICA
Se evaluó la especificidad alélica de CM33322 Ab29 usando un ensayo Luminex disponible comercialmente. El kit comercial contiene alelos de MICA recombinante (MICA*001, *002, *007, *012, *017, *018, *027, *004, *009 y *015) conjugados directamente a perlas Luminex, cada una con propiedades fluorescentes intrínseca que permiten evaluar la unión en una sola muestra. Las perlas Luminex con los alelos de MICA indicados se incubaron con CM33322 Ab29, control positivo de BioLegend y el control negativo (TTCF), a 10 pg/ml durante 1 h, con la posterior incubación con anticuerpo secundario anti-IgG humana conjugado a PE. La fluorescencia se determinó después de la incubación durante 60 minutos con los anticuerpos indicados y la posterior incubación con anticuerpo secundario anti-humano conjugado a PE usando un instrumento Luminex 200 (FIG. 34). CM33322 Ab29 fue capaz de unirse a todos los alelos presentes en el ensayo comercial, lo que indica que puede usarse en pacientes, independientemente del genotipo de MICA.
Estos datos demuestran la elevada actividad biológica de CM24002 Ab2 y CM33322 Ab29 y su capacidad para restaurar la lisis mediada por células NK de células tumorales. Estos datos demuestran que los pacientes con cáncer que respondieron a las inmunoterapias produjeron anticuerpos para MICA que restauraron la actividad antitumoral de células NK. Conjuntamente, estos resultados resaltan el potencial terapéutico de anticuerpos anti-MICA para superar la supresión inmunitaria y promover la destrucción tumoral en pacientes con cáncer.
Ejemplo 13. Actividad in v itro e in v iv o de anticuerpos anti-MICA
Para examinar directamente el impacto de los anticuerpos anti-MICA en el crecimiento tumoral, se evaluó la actividad biológica in vitro e in vivo de anticuerpos anti-MICA usando B16 murinas. Para este estudio, se transdujeron células de melanoma murino B16 para expresar MICA humano. Se usó citometría de flujo para detectar la expresión de MICA en la superficie de células B16 (FIG. 44).
La FIG. 45 proporciona una serie de gráficas que demuestra que los tumores de B16-MICA regulan negativamente la expresión de NKG2D en células NK de bazo y células NK infiltrantes en tumores. Se determinó la expresión de NKG2D mediante citometría de flujo en células Nk (CD3-, CD8-, CD335+) aislado de bazos de ratones sin tumores o el bazo y tumor de animales portadores de tumores.
La FIG. 46 muestra que el tratamiento con anticuerpo anti-MICA reduce los niveles séricos de MICA en ratones portadores de tumores de B16-MICA. Se trató a ratones B6 portadores de tumores B16-MICA con 100ug o 200ug/dosis de CM33322 Ab29 mediante inyección en la vena caudal tres veces por semana. Transcurrida una semana después del tratamiento inicial, se extrajo sangre y se midió MICA en suero mediante ELISA. La FIG. 47 muestra que la administración de anticuerpos anti-MICA no interfiere con la detección de MICA mediante ELISA sándwich. Se inoculó MICA recombinante con un exceso de 1000 veces de anticuerpo con rotación durante 18 horas. La concentración de MICA se determinó mediante ELISA sándwich.
Para examinar directamente el impacto de los anticuerpos anti-MICA en el crecimiento tumoral, el anticuerpo anti­ MICA CM33322 Ab29 se administró a ratones portadores de tumores de B16-MICA. Se trató por vía intravenosa a los ratones con 200ug/dosis de control de isotipo IgG2a/K o de anticuerpo anti-MICA CM33322 Ab29 comenzando cuando los tumores alcanzaron un diámetro de 5 mm. Las dosis se administraron tres veces a la semana y el volumen tumoral se registró a diario. Como se muestra en la FIG. 48, el tratamiento de ratones portadores de tumores de B16-MICA con anticuerpo anti-MICA CM33322 AB29 detiene el crecimiento tumoral. Estos datos demostraron la inhibición del crecimiento de células de melanoma, tanto in vitro como in vivo y demuestran que el tratamiento con anticuerpo anti-MICA puede ser una estrategia terapéutica potencial, como consecuencia de la modulación de la respuesta antitumoral del hospedador y la eliminación directa de células tumorales.
Ejemplo 14. Los anticuerpos anti-MICA reducen la secreción de MICA de células tumorales
Se examinó el potencial de CM24002 Ab2 y CM33322 Ab29 para reducir la secreción de MICA de células tumorales. Se cultivaron células RPMI-8226 en presencia de 10ug/ml de anticuerpo de control de isotipo (TTCF-S1C1), CM33322 Ab29 o CM24002 Ab2. Después de 48 horas, se lavaron las células y se determinó mediante citometría de flujo la expresión superficial de MICA. Como se demuestra en la FIG. 49, CM24002 Ab2 y CM33322 Ab29 reducen la secreción de MICA por células RPMI-8226.
En un ejemplo adicional, se examinó el potencial de CM24002 Ab2, CM33322 Ab4, CM33322 Ab11 y CM33322 Ab28 para reducir la secreción de MICA por células tumorales. Se cultivaron células RPMI-8226 en presencia de anticuerpo de control de isotipo (TTCF-S1C1) y CM24002 Ab2, CM33322 Ab4, CM33322 Ab11 o CM33322 Ab28. Después de 48 horas, se lavaron las células y se determinó mediante citometría de flujo la expresión superficial de MICA. Como se demuestra en la FIG. 55, CM24002 Ab2, CM33322 Ab4, CM33322 Ab11 y CM33322 Ab28 reducen la secreción de MICA por células RPMI-8226.
En un ejemplo adicional, CM24002 Ab2, CM33322 Ab28 y CM33322 Ab29 inhibieron la secreción de MICA por células A375 durante una incubación de 48 horas, como se midió por la presencia de sMICA en sobrenadantes de células tumorales mediante ELISA (FIG. 63c).
Ejemplo 15. Actividad terapéutica de los anticuerpos humanos anti-MICA
Se implantaron células tumorales U937 humanas en ratones SCID tratados con CM24002 Ab2, CM33322 Ab28 y CM33322 Ab29 (3x 100 |jg de Ab por semana). Después de una semana de tratamiento, los tres anticuerpos redujeron significativamente sMICA en homogeneizados de tumores (normalizado a la masa tumoral) según se midió mediante ELISA y aumentaron la expresión de MICA en la superficie de células tumorales en homogeneizados de tumor, según se midió mediante citometría de flujo (FIG. 64a-b).
También se evaluó la función de células NK en los ratones tratados. El tratamiento con CM24002 Ab2, CM33322 Ab28 o CM33322 Ab29 aumentó los niveles superficiales de NKG2D y NKp46 por células NK CD45+ NK1.1 infiltrantes en tumores e indujeron la acumulación de células NK en tumores (normalizado a 1x105 células CD45+). El tratamiento también aumentó la expresión de IFNy y perforina por células NK CD45+ NK1.1+ infiltrantes en tumores. Además, los tres anticuerpos para MICA humano potenciaron la eliminación ex vivo de células YAC-1 marcadas con 51Cr por esplenocitos. (FIG. 65 a-f).
Ejemplo 16. Mapeo de epítopos de anticuerpos anti-MICA
Se llevaron a cabo experimentos para determinar las secuencias de epítopos para CM33322 mAb 29, CM33322 11, CM33322 mAb4 y CM33322 mAb28. En resumen, se llevó a cabo mapeo de epítopos mediante matrices de péptidos que contenían una serie de péptidos solapantes que abarcan la longitud completa de dominios extracelulares de MICA*009. Cada péptido en las matrices tenía una longitud de secuencia lineal de 20 aminoácidos de la secuencia de referencia de MICA*009 (SEQ ID NO: 185), solapándose cada secuencia posterior en diez aminoácidos con la secuencia anterior (péptidos de 20 aa con un desplazamiento de 10 aa). Estos péptidos se unieron a portaobjetos de vidrio mediante el uso de enlazadores flexibles. Los anticuerpos se incubaron con los portaobjetos, detectándose el anticuerpo unido a los fragmentos de péptido con un anticuerpo anti-IgG humano conjugado a Cy5. La unión a puntos de la matriz se evaluó con un escáner de micromatrices GenePix. Los resultados indican que los mAb CM33322 mAb 29, CM3332211, CM33322 mAb4 y CM33322 mAb28 se unen a la región alfa-3 de MICA o MICB. Los resultados indican que los tres anticuerpos interactúan con epítopos en la región aF3 de MICA humano que incluyen secuencias de aminoácidos continuas distintivamente diferentes. La secuencia de aminoácidos de los epítopos para CM33322 mAb 29, CM3332211, CM33322 mAb4 y CM33322 mAb28 en el MICA*009 se muestran en la Fig. 60A-60D. La localización de los epítopos para CM33322 mAb 29, CM33322 mAb4 y CM33322 mAb28 en la estructura tridimensional de MICA también se muestra en la Fig. 61.
Los resultados indicaron que el epítopo reconocido por el anticuerpo CM33322 mAb29 incluye una secuencia de aminoácidos contigua: GDVLPdGnGtYQTWVATRIC (SEQ ID No : 186), que corresponde a los restos de aminoácido 229 a 248 de MICA humano SEQ ID NO: 185 (Fig. 60A). El epítopo reconocido por el anticuerpo CM33322 mAb11 incluye una secuencia de aminoácidos contigua: NVeTe EWTP (SEQ ID NO: 187), que corresponde a los restos de aminoácido 119 a 128 de MICA humano SEQ ID NO: 185 (Fig. 60B). El epítopo reconocido por el anticuerpo CM33322 mAb 4 incluye una secuencia de aminoácidos contigua: TVPPMVNVTR (s Eq ID NO: 188), que corresponde a los restos de aminoácido 179 a 188 de MICA humano SEQ ID NO: 185 (Fig. 60C). El epítopo reconocido por el anticuerpo CM33322 mAb28 incluye una secuencia de aminoácidos contigua: TCRASSFYPR (SEQ ID NO: 189), que corresponde a los restos de aminoácido 199 a 208 de MICA humano (SEQ ID NO: 185).
OTRAS REALIZACIONES
Debe entenderse que aunque la invención se ha descrito junto con la descripción detallada de la misma, se pretende que la anterior descripción ilustre, y no limite, el alcance de la invención, que se define por el alcance de las reivindicaciones adjuntas. Otros aspectos, ventajas, están comprendidos en el alcance de las siguientes reivindicaciones.

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo que se unen de manera inmunoespecífica a la secuencia A relacionada con polipéptido de clase I de MHC (MICA) que comprende una región variable de cadena pesada (VH) y una región variable de cadena ligera (VL), en donde la región VH comprende la CDR1 de VH, la CDR2 de VH y la CDR3 de Vh como se muestran en la secuencia de aminoácidos de Vh de la SEQ ID NO: 168; y en donde la región Vl comprende la CDR1 de Vl, la CDR2 de Vl y la CDR3 de Vl como se muestran en la secuencia de aminoácidos de Vl de la SEQ ID NO: 170.
2. El anticuerpo o el fragmento de la reivindicación 1, en donde la región Vh del anticuerpo o del fragmento de anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 168.
3. El anticuerpo o el fragmento de las reivindicaciones 1 o 2, en donde la región VL del anticuerpo o del fragmento de anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 170.
4. El anticuerpo o el fragmento de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprenden: (i) una CDR1 de Vh que comprende la SEQ ID NO: 172;
una CDR2 de Vh que comprende la SEQ ID NO: 174; y
una CDR3 de Vh que comprende la SEQ ID NO: 176; y
(ii) una CDR1 de Vl que comprende la SEQ ID NO: 179;
una CDR2 de Vl que comprende la SEQ ID NO: 181; y
una CDR3 de Vl que comprende la SEQ ID NO: 183.
5. El anticuerpo o el fragmento de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo se unen a un epítopo de la secuencia A relacionada con polipéptido de clase I de m Hc (MICA) que comprende la secuencia de aminoácidos TCRASSFYPR (SEQ ID NO: 189).
6. El anticuerpo o el fragmento de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo,
(a) se une al dominio a3 de MICA;
(b) reduce los niveles de sMICA;
(c) inhibe la secreción de MICA por las células tumorales;
(d) inhibe la regulación negativa mediada por sMICA del receptor NKG2D en células NK;
(e) aumenta la lisis mediada por linfocitos NK de células tumorales; o
(f) una combinación de uno o más de (a)-(e).
7. El anticuerpo o el fragmento de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el anticuerpo comprende una región VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 168; y una región VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 170.
8. El anticuerpo o el fragmento de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el anticuerpo es humano, humanizado o quimérico.
9. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
10. La composición farmacéutica de la reivindicación 9,
en donde la composición comprende además uno o más agentes adicionales seleccionados entre un inhibidor de histona desacetilasa (HDAC) seleccionado entre el grupo que consiste en ácido hidroxámico, vorinostat (ácido suberoilanilida hidroxámico, SAHA), tricostatina A (TSA), lAq 824, panobinostat (LBH589), belinostat (PXD101), ITF2357 italfarmaco SpA, tetrapéptido cíclico, depsipéptido (romidepsina, FK228), benzamida; entinostat (SNDX-275/MS-275), MGCD0103, ácidos alifáticos de cadena corta (por ejemplo, ácido valproico, fenil butirato), AN-9, pivanex, CHR-3996, CHR-2845, inhibidor del proteasoma seleccionado entre el grupo que consiste en bortezomib, NPI-0052, carfilzomib (PR-171), CEP 18770 y MLN9708, un anticuerpo o péptido anti-CTLA-4, un anticuerpo o péptido anti-PD-1, un anticuerpo o péptido anti-PDL-1, un anticuerpo o péptido anti-OX40, un anticuerpo o péptido anti-GITR, un anticuerpo o péptido anti-LAG-3 y un anticuerpo o péptido anti-TIM-3; o
en donde la composición está formulada para su administración con uno o más agentes adicionales usados para el tratamiento del cáncer, seleccionados entre el grupo que consiste en quimioterapia, radioterapia, citocinas, quimiocinas y otras moléculas de señalización biológica, vacunas específicas de tumores, vacunas celulares contra el cáncer (por ejemplo, células cancerosas transducidas con GM-CSF), anticuerpos monoclonales específicos para tumores, rescate con células madre autólogas y alogénicas (por ejemplo, para aumentar los efectos de injerto contra tumor), terapias moleculares dirigidas, terapia antiangiogénica y terapia génica.
11. Un ácido nucleico aislado que codifica la región Vh del anticuerpo o del fragmento de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende preferentemente una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 75 %, 80 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad respecto de la SEQ ID NO: 167.
12. Un ácido nucleico aislado que codifica la región Vl del anticuerpo o del fragmento de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende preferentemente una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 75 %, 80 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad respecto de la SEQ ID NO: 169.
13. Un vector que comprende el ácido nucleico de las reivindicaciones 11 o 12, en donde el vector es preferentemente un plásmido o un vector vírico y más preferentemente, es un vector vírico seleccionado entre el grupo que consiste en poxvirus, adenovirus, retrovirus, herpesvirus y virus adenoasociado.
14. La composición farmacéutica de las reivindicaciones 9 o 10 para su uso en el tratamiento del cáncer en un sujeto.
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Families Citing this family (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
LT2760471T (lt) 2011-09-30 2017-04-25 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Terapiniai peptidai
BR112015021576A2 (pt) 2013-03-15 2017-10-10 Dana Farber Cancer Inst Inc peptídeos terapêuticos
US9803017B2 (en) 2013-07-05 2017-10-31 University Of Washington Through Its Center For Commercialization Soluble MIC neutralizing monoclonal antibody for treating cancer
US9394365B1 (en) 2014-03-12 2016-07-19 Yeda Research And Development Co., Ltd Reducing systemic regulatory T cell levels or activity for treatment of alzheimer's disease
NZ747418A (en) 2014-03-12 2023-05-26 Yeda Res & Dev Reducing systemic regulatory t cell levels or activity for treatment of disease and injury of the cns
US10519237B2 (en) 2014-03-12 2019-12-31 Yeda Research And Development Co. Ltd Reducing systemic regulatory T cell levels or activity for treatment of disease and injury of the CNS
US10618963B2 (en) 2014-03-12 2020-04-14 Yeda Research And Development Co. Ltd Reducing systemic regulatory T cell levels or activity for treatment of disease and injury of the CNS
CA2939006A1 (en) 2014-03-14 2015-09-17 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Vaccine compositions and methods for restoring nkg2d pathway function against cancers
JO3663B1 (ar) 2014-08-19 2020-08-27 Merck Sharp & Dohme الأجسام المضادة لمضاد lag3 وأجزاء ربط الأنتيجين
MX2018007406A (es) 2015-12-16 2018-08-15 Merck Sharp & Dohme Anticuerpos anti-lag3 y fragmentos de enlace al antigeno.
TWI808055B (zh) 2016-05-11 2023-07-11 美商滬亞生物國際有限公司 Hdac 抑制劑與 pd-1 抑制劑之組合治療
TWI794171B (zh) 2016-05-11 2023-03-01 美商滬亞生物國際有限公司 Ｈｄａｃ抑制劑與ｐｄ-ｌ１抑制劑之組合治療
EP3529280A4 (en) * 2016-10-19 2020-04-22 Novelogics Biotechnology, Inc. ANTIBODIES AGAINST MICA AND MICB PROTEINS
EP3532091A2 (en) * 2016-10-29 2019-09-04 H. Hoffnabb-La Roche Ag Anti-mic antibidies and methods of use
US10300089B2 (en) * 2016-11-08 2019-05-28 University Of Central Florida Research Foundation, Inc. Methods for high scale therapeutic production of memory NK cells
CN108299557A (zh) * 2017-01-13 2018-07-20 杭州翰思生物医药有限公司 提高IgG类抗体对FcRn的结合亲和力并延长其血清半衰期的方法
WO2018141959A1 (en) 2017-02-06 2018-08-09 Innate Pharma Immunomodulatory antibody drug conjugates binding to a human mica polypeptide
KR102236259B1 (ko) * 2017-02-22 2021-04-06 아이-맵 바이오파마 유에스 리미티드 항-lag-3 항체 및 그것의 사용
IL313939A (en) 2017-03-31 2024-08-01 Bristol Myers Squibb Co Anti-PD-1 antibodies for the treatment of tumors in patients with a high tumor mutational burden (TMB)
CN109232738B (zh) * 2017-07-11 2021-11-09 南京金斯瑞生物科技有限公司 一种抗人ox40单克隆抗体及其应用
CN111247169A (zh) 2017-10-15 2020-06-05 百时美施贵宝公司 治疗肿瘤的方法
BR112020018539A2 (pt) * 2018-03-23 2020-12-29 Bristol-Myers Squibb Company Anticorpos contra mica e/ou micb e usos dos mesmos
KR20200139724A (ko) 2018-03-30 2020-12-14 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 종양을 치료하는 방법
WO2020035345A1 (en) 2018-08-14 2020-02-20 Innate Pharma Treatment of colorectal cancer by a combination of an anti-mica antibody and an anti-nkg2a antibody
EP3725370A1 (en) 2019-04-19 2020-10-21 ImmunoBrain Checkpoint, Inc. Modified anti-pd-l1 antibodies and methods and uses for treating a neurodegenerative disease
JP2023540452A (ja) 2020-08-10 2023-09-25 イナート・ファルマ・ソシエテ・アノニム 抗体を使用した細胞表面ｍｉｃａ及びｍｉｃｂの検出
JP2024523039A (ja) * 2021-06-17 2024-06-25 ファポン バイオテック インコーポレイテッド キメラ免疫グロブリン
CN113637077B (zh) * 2021-10-14 2021-12-24 尚健单抗（北京）生物技术有限公司 一种抗mica的抗体及其应用

Family Cites Families (97)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
EP0154316B1 (en) 1984-03-06 1989-09-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified lymphokine and production thereof
US5981216A (en) 1985-04-01 1999-11-09 Alusuisse Holdings A.G. Transformed myeloma cell-line and a process for the expression of a gene coding for a eukaryotic polypeptide employing same
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
JP3101690B2 (ja) 1987-03-18 2000-10-23 エス・ビィ・２・インコーポレイテッド 変性抗体の、または変性抗体に関する改良
EP0351410A1 (en) 1987-03-18 1990-01-24 3i RESEARCH EXPLOITATION LIMITED Complement-binding peptide
GB8709290D0 (en) 1987-04-16 1987-05-20 Secretary Trade Ind Brit Precision motion slideways
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
US5677425A (en) 1987-09-04 1997-10-14 Celltech Therapeutics Limited Recombinant antibody
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
JP2989002B2 (ja) 1988-12-22 1999-12-13 キリン―アムジエン・インコーポレーテツド 化学修飾顆粒球コロニー刺激因子
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
CA2050918A1 (en) 1990-01-12 1991-07-13 Raju Kucherlapati Generation of xenogeneic antibodies
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
JP2938569B2 (ja) 1990-08-29 1999-08-23 ジェンファーム インターナショナル，インコーポレイティド 異種免疫グロブリンを作る方法及びトランスジェニックマウス
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
GB9022543D0 (en) 1990-10-17 1990-11-28 Wellcome Found Antibody production
DK0661985T3 (da) * 1991-11-08 2000-01-31 Univ Leland Stanford Junior Peptider, der er i stand til at binde til CTL-prækursere
EP0571613B1 (en) 1991-12-13 2003-09-17 Xoma Corporation Methods and materials for preparation of modified antibody variable domains and therapeutic uses thereof
US5714350A (en) 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
WO1993022332A2 (en) 1992-04-24 1993-11-11 Board Of Regents, The University Of Texas System Recombinant production of immunoglobulin-like domains in prokaryotic cells
EP0652950B1 (en) 1992-07-24 2007-12-19 Amgen Fremont Inc. Generation of xenogeneic antibodies
WO1994029351A2 (en) 1993-06-16 1994-12-22 Celltech Limited Antibodies
US6091001A (en) 1995-03-29 2000-07-18 Abgenix, Inc. Production of antibodies using Cre-mediated site-specific recombination
US6096871A (en) 1995-04-14 2000-08-01 Genentech, Inc. Polypeptides altered to contain an epitope from the Fc region of an IgG molecule for increased half-life
US6121022A (en) 1995-04-14 2000-09-19 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
KR20050085971A (ko) 1995-04-27 2005-08-29 아브게닉스, 인크. 면역화된 제노마우스 유래의 인간 항체
AUPN568095A0 (en) 1995-09-27 1995-10-26 Austin Research Institute, The Anti-Galalpha(1,3)Gal antibody binding peptides
JP4046354B2 (ja) 1996-03-18 2008-02-13 ボード オブ リージェンツ，ザ ユニバーシティ オブ テキサス システム 増大した半減期を有する免疫グロブリン様ドメイン
CA2275141A1 (en) 1996-10-29 1998-05-07 Thomas Spies Cell stress regulated human mhc class i gene
PT942968E (pt) 1996-12-03 2008-03-27 Amgen Fremont Inc Anticorpos totalmente humanos que se ligam ao egfr
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
US5830698A (en) 1997-03-14 1998-11-03 Idec Pharmaceuticals Corporation Method for integrating genes at specific sites in mammalian cells via homologous recombination and vectors for accomplishing the same
ATE319745T1 (de) 1997-05-21 2006-03-15 Biovation Ltd Verfahren zur herstellung von nicht-immunogenen proteinen
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
DK1068241T3 (da) 1998-04-02 2008-02-04 Genentech Inc Antistofvarianter og fragmenter deraf
EP2180007B2 (en) 1998-04-20 2017-08-30 Roche Glycart AG Glycosylation engineering of antibodies for improving antibody-dependent cellular cytotoxicity
KR100940380B1 (ko) 1999-01-15 2010-02-02 제넨테크, 인크. 효과기 기능이 변화된 폴리펩티드 변이체
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
ES2571230T3 (es) 1999-04-09 2016-05-24 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Procedimiento para controlar la actividad de una molécula inmunofuncional
US20090175821A1 (en) 1999-05-17 2009-07-09 Bridon Dominique P Modified therapeutic peptides with extended half-lives in vivo
US6475220B1 (en) 1999-10-15 2002-11-05 Whiteside Biomechanics, Inc. Spinal cable system
PT1252192E (pt) 2000-02-11 2007-01-31 Merck Patent Gmbh Melhoramento da semivida de circulação de proteínas de fusão à base de anticorpos
US6725230B2 (en) 2000-07-18 2004-04-20 Aegis Analytical Corporation System, method and computer program for assembling process data of multi-database origins using a hierarchical display
US20030133939A1 (en) 2001-01-17 2003-07-17 Genecraft, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
US7754208B2 (en) 2001-01-17 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
US20040115198A1 (en) 2001-02-28 2004-06-17 Fred Hutchinson Cancer Research Center Activation of lymphocyte populations expressing NKG2D using anti-NKG2D antibodies and ligand derivatives
WO2002068615A2 (en) 2001-02-28 2002-09-06 Fred Hutchinson Cancer Research Center, Inc. Activation of lymphocyte populations expressing nkg2d using anti-nkg2d antibodies and ligand derivatives
US6566208B2 (en) 2001-07-25 2003-05-20 Chartered Semiconductor Manufacturing Ltd. Method to form elevated source/drain using poly spacer
US7084257B2 (en) 2001-10-05 2006-08-01 Amgen Inc. Fully human antibody Fab fragments with human interferon-gamma neutralizing activity
MXPA04003798A (es) 2001-10-25 2004-07-30 Genentech Inc Composiciones de glicoproteina.
US7745140B2 (en) 2002-01-03 2010-06-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Activation and expansion of T-cells using an engineered multivalent signaling platform as a research tool
US20040002587A1 (en) 2002-02-20 2004-01-01 Watkins Jeffry D. Fc region variants
US7317091B2 (en) 2002-03-01 2008-01-08 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
US20040132101A1 (en) 2002-09-27 2004-07-08 Xencor Optimized Fc variants and methods for their generation
AU2003217912A1 (en) 2002-03-01 2003-09-16 Xencor Antibody optimization
AU2003225093A1 (en) 2002-04-22 2003-11-03 Fred Hutchinson Cancer Research Center Soluble mic polypeptides as markers for diagnosis, prognosis and treatment of cancer and autoimmune diseases or conditions
ATE394674T1 (de) 2002-04-22 2008-05-15 Univ Florida Funktionalisierte nanopartikel und verwendungsverfahren
US7425619B2 (en) 2002-08-14 2008-09-16 Macrogenics, Inc. FcγRIIB specific antibodies and methods of use thereof
ATE541857T1 (de) 2002-09-27 2012-02-15 Xencor Inc Optimierte fc-varianten und herstellungsverfahren dafür
WO2004035752A2 (en) 2002-10-15 2004-04-29 Protein Design Labs, Inc. ALTERATION OF FcRn BINDING AFFINITIES OR SERUM HALF-LIVES OF ANTIBODIES BY MUTAGENESIS
EP2368578A1 (en) 2003-01-09 2011-09-28 Macrogenics, Inc. Identification and engineering of antibodies with variant Fc regions and methods of using same
US7666417B2 (en) 2003-04-22 2010-02-23 Fred Hutchinson Cancer Research Center Methods and compositions for treating autoimmune diseases or conditions
US7628986B2 (en) 2003-06-27 2009-12-08 Amgen Fremont Inc. Antibodies directed to the deletion mutants of epidermal growth factor receptor and uses thereof
US7871610B2 (en) 2003-08-12 2011-01-18 Dyax Corp. Antibodies to Tie1 ectodomain
US8101720B2 (en) 2004-10-21 2012-01-24 Xencor, Inc. Immunoglobulin insertions, deletions and substitutions
GB0324368D0 (en) 2003-10-17 2003-11-19 Univ Cambridge Tech Polypeptides including modified constant regions
JP4762156B2 (ja) 2004-01-12 2011-08-31 アプライド モレキュラー エボリューション，インコーポレイテッド Ｆｃ領域変異体
CA2561264A1 (en) 2004-03-24 2005-10-06 Xencor, Inc. Immunoglobulin variants outside the fc region
ES2426817T3 (es) 2004-08-04 2013-10-25 Mentrik Biotech, Llc Regiones Fc variantes
US20080148432A1 (en) 2005-12-21 2008-06-19 Mark Scott Abad Transgenic plants with enhanced agronomic traits
KR101017301B1 (ko) 2004-12-21 2011-02-28 메드임뮨 리미티드 앤지오포이에틴-2에 대한 항체 및 그의 용도
EP4242655A3 (en) * 2005-06-08 2024-02-21 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods and compositions for the treatment of persistent infections and cancer by inhibiting the programmed cell death 1 (pd-1)pathway
JP2009514528A (ja) 2005-11-03 2009-04-09 フレッド ハッチンソン キャンサー リサーチ センター Ｎｋｇ２ｄ陽性ｃｄ４＋細胞による免疫応答の負の免疫調節法
DE102006009847A1 (de) 2006-03-01 2007-09-06 Sweredjuk, Robert, Dr. Verfahren von Absorbieren von Schadstoffen und Gerüchen
WO2008036981A1 (en) 2006-09-22 2008-03-27 Dana-Farber Cancer Research, Inc. Methods for treating mica-related disorders
WO2008043018A1 (en) 2006-10-04 2008-04-10 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Tumor immunity
EP2150565A2 (en) 2007-04-23 2010-02-10 Fred Hutchinson Cancer Research Center NEGATIVE IMMUNOMODULATION OF IMMUNE RESPONSES BY ERp5
CA2687117A1 (en) 2007-05-14 2008-11-27 Biogen Idec Ma Inc. Single-chain fc (scfc) regions, binding polypeptides comprising same, and methods related thereto
WO2011063336A2 (en) 2009-11-20 2011-05-26 President And Fellows Of Harvard College Secondary site of antigen stimulation for therapeutic vaccination
WO2009102465A2 (en) 2008-02-13 2009-08-20 President And Fellows Of Harvard College Continuous cell programming devices
US9370558B2 (en) 2008-02-13 2016-06-21 President And Fellows Of Harvard College Controlled delivery of TLR agonists in structural polymeric devices
JO2913B1 (en) 2008-02-20 2015-09-15 امجين إنك, Antibodies directed towards angiopoietin-1 and angiopoietin-2 proteins and their uses
US8182809B1 (en) * 2008-09-08 2012-05-22 University Of Washington Methods for treating cancer by inhibiting MIC shedding
US8207497B2 (en) 2009-05-08 2012-06-26 Ionsense, Inc. Sampling of confined spaces
KR101688522B1 (ko) 2009-12-15 2016-12-21 삼성전자주식회사 안지오포이에틴-2에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 용도
US8796420B2 (en) 2009-12-31 2014-08-05 Avidbiotics Corp. Non-natural MIC proteins
JP6177137B2 (ja) * 2010-12-27 2017-08-09 エーピーオー‐ティー ビー．ヴイ． アポトーシスを誘導する架橋ポリペプチド
US8753640B2 (en) 2011-05-31 2014-06-17 University Of Washington Through Its Center For Commercialization MIC-binding antibodies and methods of use thereof
LT2760471T (lt) 2011-09-30 2017-04-25 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Terapiniai peptidai
CA2862101A1 (en) 2012-02-07 2013-08-15 Innate Pharma Mica binding agents
BR112015021576A2 (pt) 2013-03-15 2017-10-10 Dana Farber Cancer Inst Inc peptídeos terapêuticos

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