ES2748381T3 - Polipéptido(s) llevado(s) por CYAA y uso para inducir respuestas inmunitarias terapéuticas y profilácticas - Google Patents
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Abstract
Polipéptido(s) llevado(s) por un vector, en donde dicho vector que lleva el (los) polipéptido(s) consiste en una proteína adenilciclasa de una proteína CyaA de la especie Bordetella o un fragmento de la misma adecuados para presentar dicho(s) polipéptido(s) al sistema inmunitario en un hospedador mamífero, para su uso: (i) en el tratamiento inmunoterapéutico de la(s) primera(s) afección(es) patológica(s) determinada(s) que es (a) consecutiva a la infección por una primera cepa de VPH seleccionada entre VPH16, VPH18, VPH31, VPH33, VPH35, VPH45, VPH52 o VPH58 o (b) relacionado con un tumor que expresa el antígeno MAGE-A3 diagnosticado en dicho hospedador mamífero en donde dicho tratamiento se realiza suscitando una respuesta inmunitaria de linfocitos T contra un primer grupo de epítopos contenidos en dicho(s) polipéptido(s) y en donde (a) los epítopos de dicho primer grupo provienen de los antígenos E6 o E7 de una cepa de VPH seleccionada entre VPH16, VPH18, VPH31, VPH33, VPH35, VPH45, VPH52 o VPH58 o respectivamente en (b) los epítopos de dicho primer grupo son de un antígeno tumoral MAGE-A3 y (ii) en la profilaxis contra la(s) segunda(s) afección(es) patológica(s) determinada(s) en donde cuando dicha primera afección patológica es consecutiva a la infección por VPH como en (a), dicha segunda afección patológica es consecutiva a la infección por una segunda cepa de VPH diferente de la primera y dicho VPH diferente se selecciona entre VPH16, VPH18, VPH31, VPH33, VPH35, VPH45, VPH52 o VPH58 o en donde dicha segunda afección determinada está relacionada con un tumor que expresa el antígeno MAGE-A3, en donde dicha segunda afección patológica se encuentra en el mismo hospedador mamífero y se genera una respuesta inmunitaria de memoria de linfocitos T contra un segundo grupo de epítopos contenidos en dicho(s) polipéptido(s) y en dicho segundo grupo los epítopos son de un antígeno del segundo VPH seleccionado entre VPH16, VPH18, VPH31, VPH33, VPH35, VPH45, VPH52 o VPH58 o respectivamente de un antígeno tumoral MAGE-A3, obteniéndose dichas respuestas inmunitarias después de la administración de dicho(s) polipéptido(s) llevado(s) por un vector en dicho hospedador, en donde dicha profilaxis contra la(s) segunda(s) afección(es) patológica(s) determinada(s) no se observa cuando dicho segundo grupo de epítopos no está contenido en dicho(s) polipéptido(s) llevado(s) por un vector administrado(s) y en donde la secuencia de aminoácidos de dicho primer grupo de epítopo es diferente del aminoácido de dicho segundo grupo de epítopos.
Description
DESCRIPCIÓN
Polipéptido(s) llevado(s) por CYAA y uso para inducir respuestas inmunitarias terapéuticas y profilácticas
Campo de la invención
La invención está dirigida a medios, basados en polipéptidos llevados por CyaA, para su uso en el tratamiento inmunoterapéutico de la(s) primera(s) afección(es) patológica(s) determinada(s) que es (a) consecutiva a la infección por una primera cepa de VPH seleccionada entre VPH16, VPH18, VPH31, VPH33, VPH35, VPH45, VPH52 o VPH58 o (b) relacionada(s) con un tumor que expresa el antígeno MAGE-A3 diagnosticado en un hospedador mamífero en donde dicho tratamiento se realiza suscitando una respuesta inmunitaria de linfocitos T contra un primer grupo de epítopos contenidos en dicho(s) polipéptido(s) y en donde (a) los epítopos de dicho primer grupo provienen del antígeno E6 o E7 de una cepa de VPH seleccionada entre VPH16, VPH18, VPH31, VPH33, VPH35, VPH45, VPH52 o VPH58 o respectivamente en (b) los epítopos de dicho primer grupo son de un antígeno tumoral MAGE-A3 y en la profilaxis contra la(s) segunda(s) afección(es) patológica(s) determinada(s) en donde cuando dicha primera afección patológica es consecutiva a la infección por VPH como en (a), dicha segunda afección patológica es consecutiva a la infección por una segunda cepa de VPH diferente de la primera y dicha cepa de VPH diferente se selecciona entre VPH16, VPH18, VPH31, VPH33, VPH35, VPH45, VPH52 o VPH58 o en donde dicha segunda afección determinada está relacionada con un tumor que expresa el antígeno MAGE-A3, en donde dicha segunda afección determinada está en el mismo hospedador mamífero y se suscita una respuesta inmunitaria de memoria de linfocitos T contra un segundo grupo de epítopos contenidos en dicho(s) polipéptido(s) y en donde en dicho segundo grupo los epítopos provienen de un antígeno del segundo VPH seleccionado entre VPH16, VPH18, VPH31, VPH33, VPH35, Vp H45, VPH52 o VPH58, o respectivamente de un antígeno tumoral MAGE-A3, obteniéndose dichas respuestas inmunitarias después de la administración de dicho(s) polipéptido(s) llevado(s) por un vector en dicho hospedador, en donde dicha profilaxis contra la(s) segunda(s) afección(es) patológica(s) determinada(s) no se observa cuando dicho segundo grupo de epítopos no está contenido en dicho(s) polipéptido(s) llevado(s) por un vector administrado(s) y en donde la secuencia de aminoácidos de dicho primer grupo de epítopos es diferente de la secuencia de aminoácidos de dicho segundo grupo de epítopos. En una realización particular, la invención está dirigida a dichos medios, basados en polipéptidos llevados por CyaA, para su uso (i) en el tratamiento inmunoterapéutico de la(s) primera(s) afección(es) patológica(s) determinada(s) diagnosticada(s) en un hospedador mamífero, suscitando una respuesta inmunitaria de linfocitos T contra un primer grupo de epítopos contenidos en dicho(s) polipéptido(s), (ii) en la profilaxis contra la(s) segunda(s) afección(es) patológica(s) determinada(s) en el mismo hospedador mamífero, suscitando una respuesta inmunitaria de memoria de linfocitos T contra un segundo grupo de epítopos contenidos en dicho(s) polipéptido(s) y (iii) en la prevención contra la reaparición de dicha(s) primera(s) afección(es) patológica(s) determinada(s), suscitando una respuesta inmunitaria de memoria de linfocitos T contra dicho primer grupo de epítopos contenidos en dicho(s) polipéptido(s), obteniéndose dichas respuestas inmunitarias después de la administración de dicho(s) polipéptido(s) llevado(s) por un vector en dicho hospedador, en donde dicha profilaxis contra la(s) segunda(s) afección(es) patológica(s) determinada(s) no se observa cuando dicho segundo grupo de epítopos no está contenido en dicho(s) polipéptido(s) llevado(s) por un vector administrado(s).
Antecedentes de la invención
Una de las toxinas clave producidas por Bordetella pertussis, el patógeno responsable de la tos ferina, es su adenilato ciclasa (CyaA). Se demostró mediante un modelo murino que la bacteria requiere CyaA durante la fase temprana de la colonización pulmonar (Goodwin y Weiss 1990). CyaA exhibe un mecanismo único de invasión de células eucariotas al entregar de manera dedicada su dominio catalítico en el citosol celular (Simsova, Sebo et al. 2004). La CyaA desintoxicada y recombinante utilizada como vector de vacuna muestra la capacidad exquisita de dirigirse a las células presentadoras de antígeno (CPA) que expresan CD11b/CD18, como por ejemplo células dendríticas o células de Langerhans (Guermonprez et al. 2001). Estas CPA residentes son células innatas clave en el inicio de respuestas de linfocitos T específicos de antígeno siguiendo enfoques de inmunización intradérmica (Merad, Ginhoux et al. 2008). Después de la unión específica a CD11b CPA, CyaA que lleva un antígeno vírico o tumoral puede entregar su carga antigénica de una manera dedicada (Preville, Ladant et al. 2005). Basándose en esta tecnología única, el solicitante ha desarrollado una vacuna bivalente en etapa clínica para curar pacientes infectados con VPH: ProCervix. ProCervix es una vacuna terapéutica bivalente preparada con una mezcla de dos vacunas de CyaA diferentes: una que incorpora la proteína E7 de VPH16 y la otra que lleva la proteína E7 de VPH18.
Las proteínas recombinantes que se construyen mediante la inserción de uno o más epítopos portadores de polipéptidos de antígenos de VPH en sitios permisivos de la proteína CyaA y su uso en composiciones farmacéuticas para el tratamiento o profilaxis de la infección por oncovirus se describen en el documento EP 1576967.
De hecho, las infecciones por el virus del papiloma humano (VPH) son generalmente duraderas y una respuesta inmunitaria comprometida del hospedador puede conducir al desarrollo de cáncer cervical, especialmente con VPH de alto riesgo como el VPH18 y el VPH16. Las oncoproteínas E7 del VPH se expresan a lo largo del ciclo replicativo del virus, convirtiéndolos así en objetivos elegidos para la inmunoterapia mediada por linfocitos T (Iwasaki 2010). Se ha demostrado que la inmunidad mediada por células B a las proteínas de la cápside viral es suficiente para una protección profiláctica contra la infección por VPH (Stanley 2010). Sin embargo, las inmunidades innatas y mediadas
por linfocitos T son críticas para curar a los pacientes que ya están infectados por el virus (Frazer 2009). Además, las vacunas profilácticas contra el VPH disponibles no son eficaces para tratar pacientes ya infectados con VPH y para curar la enfermedad, resaltando así la importancia de desarrollar vacunas terapéuticas que generen respuestas de linfocitos T específicos de antígeno contra antígenos de VPH (Trimble y Frazer 2009).
Las vacunas profilácticas se basan en el desarrollo de una inmunidad mediada por linfocitos B. Por el contrario, las vacunas terapéuticas tienen como objetivo desarrollar respuestas de los linfocitos T a CD4+ y CD8+ proinflamatorias fuertes y robustas para un tratamiento eficaz de la infección crónica (virus, bacterias, etc.) o de cáncer (Bachmann y Jennings 2010). Muchos estudios han descrito tanto en modelos de ratones como en pacientes humanos que la inducción de una inmunidad de linfocitos T específicos de antígeno puede correlacionarse con una protección contra las células enfermas, ya sea células infectadas o células tumorales (Pulendran, Li et al. 2010; Sallusto, Lanzavecchia et al. 2010). Midiendo los aspectos cualitativos y cuantitativos de la vacunación posterapéutica inducida por respuesta de linfocitos T a CD8+ en ratones portadores de tumores, es posible predecir el resultado terapéutico, es decir, la progresión o la regresión del tumor en animales individuales (Rosato, Zoso et al. 2006). Después de una vacunación terapéutica exitosa que conduce a una eliminación completa de las células enfermas, un aspecto clave de esta inmunoterapia sería su potencial para generar linfocitos T de memoria a largo plazo con el fin de proteger al paciente contra la infección secundaria por patógenos. Los linfocitos T de memoria se pueden clasificar en dos subconjuntos celulares principales: Tme (Memoria efectora) y Tmc (Memoria central). Tme son los primeros linfocitos T de memoria que se generan después de la fase de contracción clonal de la respuesta inmunitaria que se ajusta a la eliminación del patógeno. Tme son CD62L- CCR7- y preferentemente residen en tejidos periféricos, como la piel, intestino y pulmones, donde proporcionan una primera línea de defensa para el hospedador (Woodland y Kohlmeier 2009). Con el paso del tiempo, Tme se diferencia progresivamente hacia un fenotipo de Tmc: CD62L+ CCR7+. Estos linfocitos T se localizan preferentemente en órganos linfoides secundarios (Kaech, Hemby et al. 2002; Ahmed, Bevan et al. 2009). Sin embargo, ambos Tme y Tmc se encuentran en la circulación. Un aspecto crítico de la eficacia de la respuesta de memoria de CD8 es la velocidad a la que los linfocitos T CD8+ de memoria adquieren potencial lítico y, por lo tanto, eliminan las células infectadas tras una nueva infección por el mismo patógeno para evitar la propagación de la infección y, a su vez, el desarrollo de la enfermedad asociada. Se ha demostrado que los ratones, que han sido capaces de eliminar la infección aguda por el virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV) a través del desarrollo de las respuestas de linfocitos T CD8+ específicos de antígeno, también desarrolló linfocitos T CD8+ de memoria que pueden eliminar rápidamente las células infectadas (Barber et al., 2003).
Basándose en este conocimiento, los inventores han ampliado el enfoque de la vacunación terapéutica que implica la respuesta inmunitaria mediada por linfocitos T para idear un nuevo concepto de tratamiento terapéutico y profiláctico de afección(es) patológica(s) mediante la combinación de la administración de ingredientes activos en una composición inmunogénica multivalente diseñada que involucra epítopos vectorizados.
En particular, los inventores diseñaron vacunas terapéuticas multivalentes adecuadas para inducir, en un solo paciente, un tratamiento inmunoterapéutico contra una patología diagnosticada mientras se monta una respuesta profiláctica robusta contra antígenos o epítopos que no están relacionados con dicha patología tratada, y opcionalmente, se monta una respuesta protectora y preventiva contra la reaparición de dicha patología tratada.
De hecho, el uso de enfoques terapéuticos multivalentes basados en CyaA destaca el potencial de los polipéptidos llevados por CyaA para tratar y posiblemente erradicar una infección determinada o un cáncer a la vez que proporciona en el mismo paciente una fuerte respuesta inmunitaria, preferiblemente una respuesta de memoria de linfocitos T protectora, contra epítopos dirigidos contenidos en dicho(s) polipéptido(s) contra los cuales se busca una protección profiláctica, y opcionalmente, una respuesta protectora y preventiva contra la reaparición de dicha infección o cáncer determinados.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1. Secuencia de proteína de la adenilato ciclasa (CyaA) de B. pertussis, B. parapertussis y B. bronquiseptica (SEQ ID NO: 1 a 3), y secuencia de nucleótidos de CyaA de B. pertussis, B. parapertussis y B. Bronquiseptica (SEQ ID NO: 4 a 6).
Figura 2. Alineamiento de proteínas de las proteínas CyaA de B. pertussis, B. parapertussis y B. Bronchiseptica.
Figura 3. Mapa esquemático de pkTRACE5 en el que se indican sitios de restricción relevantes y secuencias insertadas para CyaA-VPH16E7D30-42 (A) y para CyaA-VPH18E7D32-42 (B).
Figura 4. (A) Mapa esquemático de pTRACE5 en el que se indican sitios de restricción relevantes y secuencias insertadas para CyaA-CysOVA; (B) Mapa esquemático de pkTRACE5 en el que se indican sitios de restricción relevantes y secuencias insertadas para CyaA-MAGEA3g7-178/190-295. *MAGE-A3190-295 representa los restos 190 a 221 fusionados a los restos 242 a 295 de MAGE A3. Los números 97, 178, 190, 221, 242 y 295 indican la posición de los restos de aminoácidos de toda la secuencia de MAGE-A3; (C) Secuencia de proteína del vector CyaA-MAGEA3 (SEQ ID NO: 7). La secuencia de MAGEA3 está subrayada. Los sitios de restricción están en negrita: Nhel (AS), Kpnl (GT), Agel (TG) y Spel (TS).
Figura 5. La vacunación terapéutica con ProCervix adyuvado en el día 11 erradica los tumores inducidos por TC-1 sólidos establecidos. Al final de la monitorización: el grupo de ratones vacunados con PBS Aldara™ muestra 3/10 ratones bajo regresión tumoral (A), El grupo de ratones vacunados con ProCervix 8 |jg solo muestra 0/10 ratones bajo regresión tumoral (B). Los ratones vacunados con ProCervix adyuvado con Aldara ™ (Imiquimod tópico) (C) o Poly-ICLC (D) muestran 7/10 ratones bajo regresión tumoral.
Figura 6. La vacunación terapéutica con ProCervix adyuvado induce una alta tasa de supervivencia y un alto porcentaje de ratones sin tumores en el día 50. En el día 50, los ratones vacunados con ProCervix Aldara™ o ProCervix Poly-ICLC no muestran tumor (A). Con respecto a la tasa de supervivencia en el día 50: el 100 % y el 70 % de los ratones que recibieron el día 11 respectivamente ProCervix Aldara™ y ProCervix Poly-ICLC están vivos (B).
Figura 7. Sesenta días después de la vacunación terapéutica por ProCervix adyuvado, los ratones sin tumor exhiben linfocitos T CD8+ de memoria específicos de VPH16 E749-57 funcional y VPH18 E7as43-49. En el día 60, se inyectaron iv ratones sin tumor en los diferentes grupos con células diana impulsadas por CFSEhi VPH16e749-57, células diana no impulsadas por CFSEin y células diana impulsadas por CFSElD v PH18E7as43-49 en una relación 1:1:1. Después de una noche, los ratones fueron sacrificados, se recogieron los bazos y la citotoxicidad específica de antígeno in vivo se midió mediante análisis FACS. Cada punto representa los resultados obtenidos de un ratón individual; los círculos abiertos representan el porcentaje de destrucción de las células diana impulsadas por VPH18 E7as43-49 y los círculos negros representan el porcentaje de destrucción de células diana impulsadas por VPH16 E749-57. Las barras representan el valor medio para un grupo de ratones.
Figura 8. Esquema general de vacunación (D significa día); la tabla resume la naturaleza y el sitio de las inoculaciones y vacunas celulares (/: sin inoculación).
Figura 9. La vacunación terapéutica mediante las vacunas bivalentes CyaA adyuvadas con Aldara™ que incorporan el antígeno VPH16 E7 conduce a la eliminación del tumor sólido inducido por TC-1. El volumen de las células tumorales TC1 (mm3) fue seguido desde el día 0 (Do) hasta el día 100 (D100), en el flanco derecho de 10 ratones por grupo. Los ratones del grupo 1 fueron vacunados con placebo, los ratones del grupo 2 fueron vacunados con Placebo Aldara™, los ratones del grupo 3 fueron vacunados con CyaA-MAGEA397-178/190-295/CyaA-VPH16 E7 adyuvado con Aldara™, los ratones del grupo 4 fueron vacunados con CyaA-cysOVA/CyaA-VPH16 e 7 adyuvado con Aldara™, y los ratones de los grupos 5 y 6 fueron vacunados con ProCervix adyuvado con Aldara™. El número a la derecha de cada gráfico corresponde al número asignado a cada ratón de cada grupo.
Figura 10. Los ratones que se han curado de un tumor inducido por TC1 con vacunación bivalente basada en CyaA están protegidos contra otra exposición tumoral no relacionada de una manera específica de antígeno. El volumen de las células tumorales B16 MAGE A3 (a y c) o de las células tumorales EG7-OVA (b y d) se siguió desde el día 60 (D60) hasta el día 100 (D100), en el flanco izquierdo de los ratones que han sobrevivido, en el día 60, a la exposición de TC1. El número a la derecha de cada gráfico corresponde al número previamente asignado a cada ratón en la exposición de TC1 (Figura 9).
Descripción detallada
La invención está dirigida a medios para su uso (i) en el tratamiento inmunoterapéutico de la(s) primera(s) afección(es) patológica(s) determinada(s) que es (a) consecutiva a la infección por una primera cepa de VPH seleccionada entre VPH16, VPH18, VPH31, VPH33, VPH35, VPH45, VPH52 o VPH58 o (b) relacionada(s) con un tumor que expresa el antígeno MAGE-A3 diagnosticado en un hospedador mamífero y (ii) en la profilaxis contra la(s) segunda(s) afección(es) patológica(s) determinada(s) en donde cuando dicha primera afección patológica es consecutiva a la infección por VPH como en (a), dicha segunda afección patológica es consecutiva a la infección por una segunda cepa de VPH diferente de la primera y dicha cepa de VPH diferente se selecciona entre VPH16, VPH18, VPH31, VPH33, VPH35, VPH45, VPH52 o VPH58 o en donde dicha segunda afección determinada está relacionada con un tumor que expresa el antígeno MAGE-A3, en donde dicha segunda afección determinada se encuentra en el mismo hospedador mamífero, y (iii) opcionalmente en la prevención de la reaparición de dicha(s) primera(s) afección(es) patológica(s) determinada(s). La respuesta inmunitaria se obtiene (i) suscitando una respuesta inmunitaria de linfocitos T contra un primer grupo de epítopos contenidos en el (los) polipéptido(s) y en donde en (a) los epítopos de dicho primer grupo provienen del antígeno E6 o E7 de una cepa de VPH seleccionada entre VPH16 , VPH18, VPH31, Vp H33, VPh 35, VPH45, VPH52 o VPH58 o respectivamente en (b) los epítopos de dicho primer grupo provienen de un antígeno tumoral MAGE-A3 diseñado como principio(s) activo(s) para tratar dicha(s) afección(es) patológica(s) diagnosticada(s) y (ii) suscitando una respuesta inmunitaria de memoria de linfocitos T contra un segundo grupo de epítopos contenidos en el (los) polipéptido(s) y en donde en dicho segundo grupo los epítopos provienen de un antígeno del segundo VPH seleccionado entre VPH16, VPH18, VPH31, VPH33, VPH35, VPH45, VPH52 o VPH58, o respectivamente de un antígeno tumoral MAGE-A3, diseñado como principio(s) activo(s) para prevenir la aparición o el desarrollo de dicha(s) segunda(s) afección(es) determinada(s) y (iii) opcionalmente suscitando una respuesta inmunitaria de memoria de linfocitos T contra dicho primer grupo de epítopos para prevenir la reaparición de dicha(s) primera(s) afección(es) patológica(s) determinada(s), obteniéndose dichas respuestas inmunitarias después de la administración de dicho(s) polipéptido(s) llevado(s) por un vector en dicho hospedador, en donde dicha profilaxis contra la(s) segunda(s)
afección(es) patológica(s) determinada(s) no se observa cuando dicho segundo grupo de epítopos no está contenido en dicho(s) polipéptido(s) llevado(s) por un vector administrado(s) y en donde la secuencia de aminoácidos de dicho primer grupo de epítopos es diferente de la secuencia de aminoácidos de dicho segundo grupo de epítopos. Estos medios incluyen:
(1) como principios activos, polipéptido(s) llevado(s) por un vector, en donde dicho vector que lleva el (los) polipéptido(s) consiste en una proteína CyaA o un fragmento de la misma adecuado para presentar dicho(s) polipéptido(s) al sistema inmunitario en un hospedador mamífero;
(2) una composición que comprende o que contiene dichos principios activos que incluyen una composición que comprende el (los) polipéptido(s) llevado(s) por un vector como se define en (1) en combinación con un excipiente o formulación farmacéuticamente aceptable; y
(3) una composición que comprende un(os) primer(os) polipéptido(s) llevado(s) por un vector que contiene(n) dicho primer grupo de epítopos y un(os) segundo(s) polipéptido(s) llevado(s) por un vector separado(s) que contiene(n) dicho segundo grupo de epítopos.
Por lo tanto, en una primera realización, la invención se refiere a polipéptido(s) llevado(s) por un vector, en donde dicho vector que lleva el (los) polipéptido(s) consiste en una proteína CyaA o un fragmento de la misma adecuado para presentar dicho(s) polipéptido(s) al sistema inmunitario en un hospedador mamífero, para su uso como se describe en las reivindicaciones (i) en el tratamiento inmunoterapéutico de la(s) primera(s) afección(es) patológica(s) diagnosticada(s) en dicho hospedador mamífero suscitando una respuesta inmunitaria de linfocitos T contra un primer grupo de epítopos contenidos en dicho(s) polipéptido(s) y (ii) en la profilaxis contra la(s) segunda(s) afección(es) patológica(s) determinada(s) en el mismo hospedador mamífero suscitando una respuesta inmunitaria de memoria de linfocitos T contra un segundo grupo de epítopos contenidos en dicho(s) polipéptido(s), y (iii) opcionalmente en la prevención contra la reaparición de dicha(s) primera(s) afección(es) patológica(s) determinada(s) suscitando una respuesta inmunitaria de memoria de linfocitos T contra dicho primer grupo de epítopos contenidos en dicho(s) polipéptido(s), obteniéndose dichas respuestas inmunitarias después de la administración de dicho(s) polipéptido(s) llevado(s) por un vector en dicho hospedador, en donde dicha profilaxis contra la(s) segunda(s) afección(es) patológica(s) determinada(s) no se observa cuando dicho segundo grupo de epítopos no está contenido en dicho(s) polipéptido(s) llevado(s) por un vector administrado(s).
La invención también proporciona una composición que comprende, en combinación con un excipiente farmacéuticamente aceptable, un(os) polipéptido(s) llevado(s) por un vector, en donde dicho vector que lleva el (los) polipéptido(s) consiste en una proteína CyaA o un fragmento de la misma adecuado para presentar dicho(s) polipéptido(s) al sistema inmunitario en un hospedador mamífero, para su uso como se describe en las reivindicaciones (i) en el tratamiento inmunoterapéutico de la(s) primera(s) afección(es) patológica(s) diagnosticada(s) en dicho hospedador mamífero suscitando una respuesta inmunitaria de linfocitos T contra un primer grupo de epítopos contenidos en dicho(s) polipéptido(s) y (ii) ) en la profilaxis contra la(s) segunda(s) afección(es) patológica(s) determinada(s) en el mismo hospedador mamífero suscitando una respuesta inmunitaria de memoria de linfocitos T contra un segundo grupo de epítopos contenidos en dicho(s) polipéptido(s), y (iii) opcionalmente en la prevención contra la reaparición de dicha(s) primera(s) afección(es) patológica(s) determinada(s) suscitando una respuesta inmunitaria de memoria de linfocitos T contra dicho primer grupo de epítopos contenidos en dicho(s) polipéptido(s) obteniéndose dichas respuestas inmunitarias después de la administración de dicha composición en dicho hospedador, en donde dicha profilaxis contra la(s) segunda(s) afección(es) patológica(s) determinada(s) no se observa cuando dicho segundo grupo de epítopos no está contenido en el (los) polipéptido(s) llevado(s) por un vector de dicha composición administrada.
La invención también se refiere a una composición que comprende, opcionalmente en combinación con un excipiente farmacéuticamente aceptable:
(a) un(os) primer(os) polipéptido(s) llevado(s) por un vector, en donde dicho primer vector que lleva el (los) polipéptido(s) consiste en una proteína CyaA o un fragmento de la misma adecuado para presentar dicho(s) polipéptido(s) al sistema inmunitario en un hospedador mamífero, y en donde dicho primer grupo de epítopos está contenido en dicho(s) polipéptido(s) de dicho primer vector;
(b) un(os) segundo(os) polipéptido(s) llevado(s) por un vector separado(s), en donde dicho segundo vector que lleva el (los) polipéptido(s) consiste en una proteína CyaA o un fragmento de la misma adecuado para presentar dicho(s) polipéptido(s) al sistema inmunitario en un hospedador mamífero, y en donde dicho segundo grupo de epítopos está contenido en dicho(s) polipéptido(s) en dicho segundo vector; y
(c) opcionalmente, uno o más polipéptido(s) llevado(s) por un vector adicional(es) distinto(s) de los de (a) y (b), para su uso como se divulga en las reivindicaciones en (i) el tratamiento inmunoterapéutico combinado contra patología asociada con dicho primer grupo de epítopos y (ii) el tratamiento de inmunoprofilaxis asociado con dicho segundo grupo de epítopos y (iii) opcionalmente la prevención contra la reaparición de dicha(s) primer(as) afección(es) patológica(s) determinada(s), en donde dicha profilaxis contra la(s) segunda(s) afección(es) patológica(s) determinada(s) no se observa cuando dicho segundo grupo de epítopos no está contenido en el (los) polipéptido(s) llevado(s) por un vector de dicha composición administrada.
En una realización específica, dicha composición con (a), (b) y (c) es para su uso como se divulga en las reivindicaciones (i) en el tratamiento inmunoterapéutico de la(s) primera(s) afección(es) patológica(s) diagnosticada(s) en dicho hospedador mamífero suscitando una respuesta inmunitaria de linfocitos T contra el primer grupo de epítopos y (ii) ) en la profilaxis contra la(s) segunda(s) afección(es) patológica(s) determinada(s) en el mismo hospedador mamífero suscitando una respuesta inmunitaria de memoria de linfocitos T contra el segundo grupo de epítopos contenidos en dicho(s) polipéptido(s), y (iii) opcionalmente en la prevención contra la reaparición de dicha(s) primera(s) afección(es) patológica(s) determinada(s) suscitando una respuesta inmunitaria de memoria de linfocitos T contra dicho primer grupo de epítopos contenidos en dicho(s) polipéptido(s), dichas respuestas inmunitarias se obtienen después de la administración de dicha composición en dicho hospedador.
El término "CyaA"significa una adenilato ciclasa (o adenilciclasa) de una especie de Bordetella, en particular una CyaA de Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis o Bordetella bronchiseptica. La proteína adenilato ciclasa de Bordetella pertussis es una toxina de 1706 restos (SEQ ID NO: 1), que comprende un dominio catalítico N-terminal de 400 restos de aminoácidos y una parte C-terminal de 1306 restos. La parte C-terminal es responsable de la unión de la toxina a la membrana de la célula diana y el posterior suministro del resto catalítico al citosol de la célula diana. La secuencia de CyaA de Bordetella pertussis se proporciona en la Figura 1. La proteína CyaA de B. parapertussis de B. bronquiseptica tiene 1740 aminoácidos, y su secuencia respectiva (SEQ ID NO: 2 y s Eq ID NO: 3) se divulga en la Figura 1.
La expresión "Fragmento de CyaA" significa una parte de la proteína CyaA, opcionalmente abarcando todo o parte de la parte C-terminal de la proteína CyaA de longitud completa, siempre que dicho fragmento sea capaz de presentar dicho(s) polipéptido(s) al sistema inmunitario en un hospedador mamífero, es decir, que sea capaz de conducir a la inducción de respuesta(s) inmunitaria(s) específica(s) contra epítopos contenidos en el (los) polipéptido(s) llevado(s) por un vector o favorecer dicha respuesta. En particular, dicho fragmento de CyaA es capaz de unirse específicamente a las células que expresan CD11b y, opcionalmente, entregar dicho(s) polipéptido(s) al citosol de la célula. Dicho fragmento abarca una proteína CyaA que se ha truncado (deleción de los extremos N-terminal y/o C-terminal) o una proteína de longitud completa con deleción interna de resto(s) de aminoácidos. Por lo tanto, un fragmento particular de proteína CyaA según la invención consiste en los restos de aminoácidos 372 a 1706 de proteína CyaA de B. pertussis (truncamiento de los primeros 371 restos). Otro fragmento particular es la proteína CyaA de B. pertussis en donde se han eliminado los restos de aminoácidos 225 a 234, proporcionando así un fragmento de CyaA que consiste en los restos 1 a 224 y 235 a 1706 (deleción interna). El término "específicamente significa dentro del contexto de la presente invención que la adenilato ciclasa o su fragmento, cuando se usa como molécula vector, se dirige preferentemente a células que expresan CD11b, ofreciendo así medios para dirigirse al(a los) polipéptido(s) en la superficie de dichas células o dentro de dichas células de manera selectiva con respecto a otras células (que no expresan CD11b).
El término "CyaA" también abarca una proteína CyaA o sus fragmentos que se modifican, preferiblemente por una o más sustitución(es) de aminoácidos, inserción interna de aminoácidos o deleción interna de aminoácidos, para dar lugar a un producto desintoxicado o no tóxico o un producto desprovisto de actividad enzimática (invasiva y citotóxica). Por lo tanto, dicha proteína CyaA (o sus fragmentos) no tiene actividad catalítica, pero la capacidad de presentar dicho(s) polipéptido(s) al sistema inmunitario en un hospedador mamífero, y opcionalmente la unión específica al receptor CD11b/CD18 y/o el proceso de translocación del dominio catalítico de la proteína CyaA original, no está(n) afectado(s). Un ejemplo de una proteína CyaA no tóxica bien conocida es una CyaA de Bordetella pertussis en la que el dipéptido Leu-Gln se ha insertado en fase entre los restos Asp188 e Ile189 (parte esencial del sitio catalítico). La ausencia de toxicidad o actividad enzimática de esta proteína CyaA (o sus fragmentos) se puede analizar como se describe en Ladant et al. (1992). La capacidad de la proteína CyaA (o sus fragmentos) para dirigirse a las células CD11b/CD18 se puede analizar especialmente de acuerdo con los métodos descritos en los documentos EP03291486 o WO02/22169. Además, la capacidad de la proteína CyaA (o sus fragmentos) para translocar el polipéptido antigénico en el citosol de la célula diana se puede analizar aplicando el método descrito en el documento WO02/22169.
En una realización particular adicional, el término "CyaA" también abarca, la proteína CyaA (o sus fragmentos) que ha sido modificada por modificaciones postraduccionales, por ejemplo, por palmitoilación postraduccional de al menos uno de sus restos, en particular los dos restos internos de lisina (lisinas 860 y 983). Esta(s) modificación(es) postraduccional(es) pueden obtenerse mediante la coexpresión de los genes cyaA y cyaC. Por lo tanto, la proteína CyaA o un fragmento de la misma, dentro del (los) polipéptido(s) llevado(s) por un vector, puede ser una proteína CyaA o un fragmento de la misma que es el resultado de la coexpresión en una célula, especialmente en una célula recombinante, de los genes cyaA y cyaC.
El término "vector" o "molécula vector" utilizados en la presente solicitud abarca la proteína CyaA de longitud completa, o fragmentos de la misma, modificada o no, como se detalla en el presente documento.
Por "células que expresan CD11b", se hace referencia a las células que expresan el receptor CD11b/CD18 en su superficie (CD11b+). En particular, estas células son granulocitos/neutrófilos, macrófagos, linfocitos NK, subconjuntos de T CD8+, subconjuntos de linfocitos B, células de Langerhans, células dendríticas y células dendríticas mieloides.
La expresión "polipéptido(s) llevado(s) por un vector" significa que la proteína CyaA (o sus fragmentos) lleva al menos un polipéptido que es heterólogo con respecto a CyaA, en particular, que no es un fragmento de CyaA como se define en el presente documento, y especialmente no reacciona inmunológicamente de forma cruzada con CyaA. La expresión "al menos uno" significa un polipéptido o más, en particular, cualquiera de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 polipéptido(s), preferiblemente 1, 2 o 3 polipéptido(s).
El término "lleva" abarca diversas estructuras que asocian la proteína CyaA o un fragmento de la misma de acuerdo con la presente invención y el (los) polipéptido(s). Dichas estructuras pueden obtenerse como resultado de:
- acoplamiento químico de al menos un(os) polipéptido(s) de acuerdo con la invención a CyaA o sus fragmentos. Los métodos para acoplar químicamente un polipéptido a CyaA o sus fragmentos son bien conocidos en la técnica y comprenden, por ejemplo, enlace(s) de disulfuro, preferiblemente usando sulfhidrilo activado con N-piridilsulfonilo. Dado que la proteína CyaA nativa no tiene restos de cisteína en su secuencia primaria, se introduce genéticamente un resto de cisteína en la proteína CyaA, en particular, en su dominio catalítico, preferiblemente en un sitio permisivo como se define a continuación (tal como la posición 235) o en uno de los extremos de CyaA; y
- enlace genético o fusión genética de al menos un(os) polipéptido(s) a CyaA o sus fragmentos. El enlace o fusión genético incluye la inserción genética del ácido nucleico que codifica al menos uno o más polipéptidos según la invención en fase en el ácido nucleico que codifica la proteína CyaA o fragmento de la misma (es decir, sin cambio del marco de la proteína CyaA), preferiblemente en la región del dominio catalítico de la proteína CyaA, dando como resultado una proteína recombinante. Por lo tanto, el o los polipéptidos al menos se pueden insertar en cualquier sitio permisivo de la proteína CyaA (véase el documento WO 93/21324). Como se usa en el presente documento, el término "sitio permisivo" se refiere a un sitio donde el (los) polipéptido(s) puede(n) insertarse sin afectar sustancialmente a las propiedades funcionales deseadas de la adenilato ciclasa, es decir, sin afectar a la capacidad de la proteína CyaA para presentar dichos polipéptidos al sistema inmunitario del hospedador mamífero, en particular, sin afectar a la unión específica al receptor CD11 b/CD18 y opcionalmente sin afectar al proceso de translocación del(de los) polipéptido(s) al citosol de la célula diana. Los sitios permisivos de la adenilato ciclasa de Bordetella pertussis incluyen, pero sin limitación, restos 107-108 (Gly-His), 132-133 (Met-Ala), 137-138 (Val-Ala), 224-225 (Arg-Ala), 228-229 (Glu-Ala), 232 233 (Gly-Leu), 235-236 (Arg-Glu), 317-318 (Ser-Ala) y 335-336 (Gly-Gln) (Sebo et al., 1985; Glaser et al., 1988). Para otras especies de Bordetella, los sitios permisivos correspondientes se pueden definir mediante la comparación de secuencias y la determinación de los restos correspondientes (Figura 2). De acuerdo con otra realización, el enlace genético también incluye la fusión del ácido nucleico que codifica al menos un(os) polipéptido(s) en uno y/u otros extremos de la proteína CyaA o sus fragmentos.
Cuando una proteína CyaA (o sus fragmentos) lleva más de un polipéptido, estos polipéptidos pueden ser llevados por acoplamiento químico, todos llevados por enlace genético (preferiblemente todos insertados genéticamente), o uno(s) de ellos es(son) llevado(s) por acoplamiento químico mientras que el (los) otro(s) es(son) llevado(s) por enlace genético. En una realización particular, cuando todos los polipéptidos se insertan genéticamente en CyaA, preferiblemente en sitios permisivos de CyaA, los polipéptidos se insertan en diferentes sitios, preferiblemente diferentes sitios permisivos. En otra realización, cuando todos los polipéptidos se insertan genéticamente en CyaA, preferiblemente en sitios permisivos de CyaA, los polipéptidos se insertan en el mismo sitio, preferiblemente en el mismo sitio permisivo.
El término "polipéptido" se refiere a una concatenación de aminoácidos, y tiene al menos 9 restos de aminoácidos y, en particular, tiene de 9 a 500 restos, de 9 a 200, de 9 a 100, de 9 a 50 restos, o de 30 o 50 a 500 o a 200 restos, o de 100 a 500 o de 100 a 200 restos de longitud. En la invención, el término "polipéptido" significa un polipéptido que es capaz, una vez llevado por la molécula vector, de inducir una respuesta inmunitaria, en particular, una respuesta inmunitaria de linfocitos T, contra el (los) epítopo(s) contenido(s) en este polipéptido. El (los) polipéptido(s) contenido(s) en la(s) molécula(s) vector pueden derivarse de un antígeno tumoral, es decir, un péptido expresado por tumor o células cancerosas, si el tumor es propio o inducido por un patógeno; el antígeno tumoral puede ser propio (en particular de origen humano) o del patógeno que induce el tumor.
El término "antígeno tumoral" abarca los siguientes grupos de antígenos tumorales, y el (los) polipéptido(s) contenido(s) en la(s) molécula(s) vector de la invención pueden elegirse en al menos uno de los siguientes grupos: (a) antígenos tumorales oncofetales, (b) antígenos tumorales oncovíricos, (c) antígenos tumorales sobreexpresados/acumulados, expresados en una amplia variedad de tejidos normales y sobreexpresados en tumores, (d) antígenos específicos de tumor compartidos o antígenos de cáncer testicular, expresados en muchos tumores pero no en tejidos normales (incluida la familia BAGE, familia GAGE, familia MAGE, familia SAGE y familia XAGE), (e) antígenos tumorales de linaje restringido, (f) antígenos tumorales mutados, resultantes de mutaciones puntuales en genes que se expresan de manera ubicua; y (g) antígenos tumorales de diferenciación, expresados en el tejido normal de origen de los tumores pero que no son específicos del tumor.
En un aspecto de la presente divulgación, cuando se usa más de un polipéptido en una molécula de un solo vector para provocar una respuesta inmunoterapéutica o una molécula de un solo vector para obtener una respuesta inmunoprofiláctica, todos los polipéptidos se derivan de antígenos tumorales.
En otro aspecto de la divulgación, el (los) polipéptido(s) contenido(s) en la(s) molécula(s) del vector también o alternativamente pueden derivarse de un antígeno de patógeno, es decir, un antígeno que es producido por el
patógeno en el hospedador mamífero infectado, y posiblemente procesado en las células de dicho hospedador mamífero infectado o un componente de dicho patógeno. Ejemplos de antígenos patógenos son un antígeno bacteriano, un antígeno vírico, un antígeno fúngico o un antígeno parásito. En estos ejemplos, como una realización particular, se pueden distinguir los patógenos implicados en la tumorigénesis (oncopatógenos) y los patógenos que no están implicados en la tumorigénesis. Ejemplos de patógenos son los patógenos intracelulares, en particular patógenos que inducen respuesta(s) inmunitaria(s) de linfocitos T en su hospedador. Por lo tanto, el (los) polipéptido(s) puede(n) derivarse de, pero sin limitación, Chlamydia, Plasmodium, Leishmania, Mycobacterium tuberculosis, HIV, VPH, VHB, VHC, adenovirus, VEB, herpesvirus, virus HTLV.1 y CMV. En una realización particular, el (los) polipéptido(s) contenido(s) en la(s) molécula(s) vector puede(n) derivarse de una proteína de superficie del patógeno (como la proteína de envoltura del VIH) o derivarse de un polipéptido que interactúa con la maquinaria de la célula infectada (como E6 o E7 de VPH).
En una realización particular, cuando se usa más de una proteasa, en una sola molécula vector o en una combinación de vectores, todos los polipéptidos se derivan de antígenos de patógenos, posiblemente de distintos patógenos, géneros o especies.
De acuerdo con la divulgación, los polipéptidos contenidos en la(s) molécula(s) vector son todos derivados de antígenos bacterianos, son todos derivados de antígenos víricos, son todos derivados de antígenos fúngicos o son todos derivados de antígenos parásitos. En otra realización, los distintos polipéptidos contenidos en la(s) molécula(s) vector descrita(s) en el presente documento son derivados independientemente de un antígeno bacteriano, un antígeno vírico, un antígeno fúngico o un antígeno parásito. En otra realización, los polipéptidos, en una sola molécula vector o en una combinación de vectores, son derivados de un tumor y son derivados de un patógeno.
La expresión "derivado de", con respecto a un polipéptido llevado por una molécula vector, significa la proteína antigénica de longitud completa, o un fragmento de esta proteína antigénica, o un polipéptido sintético, no natural, lleva el (los) epítopo(s) que consiste(n) en varias partes de la proteína antigénica fusionada o un polipéptido sintético, no natural, que consiste en una o varias partes de varias proteínas fusionadas, siempre que el fragmento o el polipéptido sintético, no natural, es capaz de inducir, una vez llevado por la(s) molécula(s) vector, una respuesta inmunitaria, en particular, una respuesta inmunitaria de linfocitos T, contra un determinante antigénico contenido en este fragmento o polipéptido. De acuerdo con esta definición, el (los) polipéptido(s) llevado(s) por la(s) molécula(s) vector es o comprende un epítopo único, o es o comprende un grupo de epítopos. La expresión "grupo de epítopos" abarca al menos un epítopo, es decir, un epítopo o más, en particular entre 10 y 500 epítopos, entre 50 y 200 epítopos y entre 80 y 150 epítopos. En una realización particular, la expresión "grupo de epítopos" significa 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9 o 10 epítopos. En una realización particular, el (los) polipéptido(s) llevado(s) por la(s) molécula(s) vector es o comprende un polipéptido, es decir, un polipéptido con al menos dos epítopos, en particular al menos dos epítopos de linfocitos T. Los epítopos de la presente invención son, ya sea lineales o conformacionales, preferiblemente lineales, y son cualquier secuencia de aminoácidos implicada en la inducción de una respuesta inmunitaria mediada por células, especialmente una respuesta inmunitaria de linfocitos T. En consecuencia, los epítopos en el (los) polipéptido(s) llevado(s) por un vector descritos en el presente documento incluyen aquellos que son procesados por CpA (células presentadoras de antígeno) en un hospedador, especialmente los epítopos T reconocidos en asociación con las moléculas CMH (complejo mayor de histocompatibilidad) de clase I, tales como epítopos cuyas células diana son los linfocitos T CD8+ o epítopos T reconocidos en asociación con moléculas de CMH de clase II, como aquellos cuyas células diana son linfocitos T CD4+. En una realización particular, el (los) polipéptido(s) también contienen epítopo(s) B implicado(s) en la respuesta humoral. En una realización particular, el (los) polipéptido(s) llevado(s) por la(s) molécula(s) vector consiste(n) o comprende(n) varios epítopos diferentes o varios idénticos.
De acuerdo con la invención, el (los) polipéptido(s) llevado(s) por un vector contienen al menos dos grupos diferentes de epítopos, es decir, un grupo de epítopos es capaz de provocar una respuesta inmunitaria de linfocitos T para permitir un tratamiento inmunoterapéutico de la(s) primera(s) afección(es) patológica(s) determinada(s) diagnosticada(s) en un hospedador mamífero, mientras que el segundo grupo de epítopos puede provocar una respuesta inmunitaria de memoria de linfocitos T para permitir la profilaxis contra la(s) segunda(s) afección(es) patológica(s) determinada(s) en el mismo hospedador mamífero. En una realización particular, el primer grupo de epítopos es opcionalmente capaz de provocar, además de una respuesta de linfocitos T que proporciona tratamiento inmunoterapéutico de la(s) primera(s) afección(es) patológica(s) determinada(s) diagnosticada(s) en un hospedador mamífero, una respuesta inmunitaria de memoria de linfocitos T contra dicho primer grupo de epítopos contenidos en dicho(s) polipéptido(s) para permitir la prevención contra la reaparición de dicha(s) primera(s) afección(es) patológica(s) determinada(s).
De acuerdo con la invención, en ausencia de dicho segundo grupo de epítopos en dicho(s) polipéptido(s) llevado(s) por un vector, no se observa la profilaxis contra la(s) segunda(s) afección(es) patológica(s) determinada(s). Esto significa que el segundo grupo de epítopos como se define en este documento es necesario para obtener la profilaxis contra la(s) segunda(s) afección(es) patológica(s) determinada(s).
En una realización particular, el segundo grupo de epítopos [en el (los) polipéptido(s) llevado(s) por un vector] es necesario y suficiente para obtener la profilaxis contra la(s) segunda(s) afección(es) patológica(s) determinada(s); en esta realización, la contribución del único segundo grupo de epítopos, en la respuesta inmunitaria suscitada, es
suficiente para obtener la profilaxis contra la(s) segunda(s) afección(es) patológica(s) determinada(s). En otras palabras, existe una relación causal entre la administración de dicho segundo grupo de epítopos y dicha respuesta profiláctica.
La divulgación también describe que, el segundo grupo de epítopos [en el (los) polipéptido(s) llevado(s) por un vector] es necesario para obtener la profilaxis contra la(s) segunda(s) afección(es) patológica(s) determinada(s), pero no es suficiente o se beneficia de la contribución del primer grupo, lo que significa que la profilaxis contra la(s) segunda(s) afección(es) patológica(s) determinada(s) se obtiene después de una sinergia entre la respuesta inmunitaria suscitada contra el segundo grupo de epítopos y la respuesta inmunitaria suscitada contra el primer grupo de epítopos. En este último caso, la contribución de ambos grupos de epítopos es necesaria para obtener la profilaxis contra la(s) segunda(s) afección(es) patológica(s) determinada(s).
La contribución necesaria del segundo grupo de epítopos en la profilaxis contra la(s) segunda(s) afección(es) patológica(s) determinada(s) puede manifestarse comparando el efecto de la administración del(de los) polipéptido(s) llevado(s) por un vector de la invención en dicha(s) segunda(s) afección(es) patológica(s) determinada(s) [el término profilaxis se define a continuación] en los dos siguientes grupos de mamíferos, en particular, en los siguientes dos grupos de ratones: (1) mamíferos administrados con polipéptido(s) llevado(s) por un vector de la invención que no tienen un segundo grupo de epítopos como se define en la solicitud y (2) mamíferos administrados con polipéptido(s) llevado(s) por un vector de la invención que tienen un segundo grupo de epítopos como se define en la solicitud.
Como se entiende por la expresión "en donde dicha profilaxis contra la(s) segunda(s) afección(es) patológica(s) determinada(s) no se observa cuando dicho segundo grupo de epítopos no está contenido en dicho(s) polipéptido(s) llevado(s) por un vector administrado(s)", se excluye que el primer grupo de epítopos como se define en el presente documento sea suficiente (es decir, solo) para obtener la profilaxis contra la(s) segunda(s) afección(es) patológica(s) determinada(s).
Por lo tanto, la secuencia de aminoácidos del primer grupo de epítopos (o polipéptido(s) que consiste(n) en este primer grupo de epítopos) es diferente de la secuencia de aminoácidos del segundo grupo de epítopos (o polipéptido(s) que consisten en este segundo grupo de epítopos). El término "diferente" significa que ambas secuencias difieren en al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 % o al menos el 95 %, calculado sobre la longitud completa de la secuencia de los polipéptidos (alineación global calculada, por ejemplo, por el algoritmo de Needleman y Wunsch). En una definición alternativa o en una realización particular de dichas "diferentes secuencias", al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90% de los epítopos del primer grupo tienen una secuencia que es diferente de la secuencia de los epítopos del segundo grupo. En una realización particular adicional, el primer y el segundo grupo de epítopos (o el (los) polipéptido(s) que consiste(n) en el primer grupo de epítopos y el (los) polipéptido(s) que consiste(n) en el segundo grupo de epítopos) no tienen una secuencia de epítopos en común. En una realización particular, la respuesta inmunitaria de linfocitos T obtenida contra el primer grupo de epítopos es eficaz contra la(s) afección(es) patológica(s) asociada(s) con dicho primer grupo de epítopos y no es eficaz o no específicamente eficaz contra una afección(es) patológica(s) asociada(s) con el segundo grupo de epítopos. Por lo tanto, en una realización particular, la respuesta inmunitaria de linfocitos T obtenida contra un grupo de epítopos es específica para este grupo, es decir, los linfocitos T involucrados en la respuesta inmunitaria contra este grupo de epítopos no reconoce el otro grupo de epítopos.
El (los) polipéptido(s) contiene(n) al menos un epítopo de cepas de VPH. Las cepas de VPH abarcan el género Alfapapilomavirus, Beta-papilomavirus, Gamma-papilomavirus, Delta-papilomavirus, Epsilon-papilomavirus, Zetapapilomavirus, Eta-papilomavirus, Theta-papilomavirus, lota-papilomavirus, Kappa-papilomavirus, Lambdapapilomavirus, Mu-papilomavirus, Nu-papilomavirus, Xi-papilomavirus, Omikron-papilomavirus y Pi-papilomavirus. En particular, los virus del papiloma tienen un tropismo humano, como las cepas del género Alfa-papilomavirus, Betapapilomavirus, Gamma-papilomavirus, Mu-papilomavirus o Nu-papilomavirus. El (los) polipéptido(s) más particular(es) contiene(n) al menos un epítopo de cepas de VPH del género Alfa-papilomavirus, especialmente la cepa de las especies de VPH 7 y 9 del género Alfa-papilomavirus (de Villiers et al. Virology 2004). Por lo tanto, en una realización de la presente invención, los polipéptidos contienen al menos un epítopo de especies de tipo altamente oncogénico de VPH seleccionadas entre VPH16, VPH18, VPH31, VPH33, VPH35, VPH45, VPH52 o VPH58. Entre estas especies tipo, el VPH 18 y el VPH 16 son de particular interés. Los polipéptidos llevados por la(s) molécula(s) vector descrita(s) en el presente documento son de diferentes cepas de v Ph o diferentes especies de tipo de VPH elegidas entre las descritas anteriormente. Según la invención, cualesquiera que sean las cepas de VPH o las especies de tipo VPH, los polipéptidos son derivados de las proteínas E6 o E7. En una realización particular, los polipéptidos llevados por la(s) molécula(s) descrita(s) en el presente documento son de la misma proteína de VPH pero de diferentes cepas de VPH o diferentes especies de tipo de VPH elegidas entre las descritas anteriormente. En una realización particular de la invención, la proteína E7 de VPH16 y la proteína E7 de VPH18 se usan para el diseño de polipéptidos. De acuerdo con una realización particular de la invención, una molécula vector lleva varios polipéptidos, preferiblemente por inserción genética, cada uno de ellos contiene o consiste en uno o varios epítopos de una o varias proteínas de VPH de al menos dos cepas de VPH distintas o dos especies de tipos de VPH distintos. Por lo tanto, una realización particular son polipéptidos llevados por un vector que consisten en una proteína CyaA o un fragmento de la misma que lleva un polipéptido o varios polipéptidos que abarcan epítopos derivados de la proteína E7 de las especies de tipo VPH, VPH16 y VPH18. En otra realización, la invención se refiere a una composición que comprende una primera
molécula vector que lleva un polipéptido o varios polipéptidos que abarcan epítopos derivados de la proteína E7 de VPH16 (los primeros polipéptidos llevados por un vector con un primer grupo de epítopos) y una molécula vector separada que lleva un polipéptido o varios polipéptidos que abarcan epítopos derivados de la proteína E7 de VPH18 (los polipéptidos llevados por un vector separados con un segundo grupo de epítopos). Cuando varios polipéptidos son llevados por una sola molécula vector, estos polipéptidos pueden consistir en diferentes fragmentos de la misma proteína, por ejemplo, de una proteína E7 o E6, que se insertan en diferentes sitios, en particular, sitios permisivos, de la molécula vector.
Por lo tanto, una composición utilizada dentro de la presente invención comprende un(os) polipéptido(s) llevado(s) por un vector cuyo(s) polipéptido(s) se deriva(n) de la proteína E7 de VPH16 y un(os) polipéptido(s) llevado(s) por un vector, polipéptido(s) que se deriva(n) de la proteína E7 de VPH18. Un ejemplo de dicha composición comprende: (a) una primera molécula vector que lleva un primer polipéptido que es un fragmento que comprende los restos 1 a 29 o un fragmento que consiste en los restos 1 a 29 de E7 de VPH16 y que lleva un segundo polipéptido que es un fragmento que comprende los restos 43 a 98 o un fragmento que consiste en los restos 43 a 98 de la proteína E7 de VPH16. En una realización preferida, el primer polipéptido son los primeros 29 restos de aminoácidos de VPH16-E7 y se inserta entre los codones 319 y 320 de CyaA, y el segundo polipéptido consta de los restos 43 a 98 de VPH16-E7 y se inserta entre los codones 224 y 235 de CyaA (ejemplificado en el vector pKTRACE5-VPH16E7¿30-42); y (b) una molécula vector separada que lleva un primer polipéptido que es un fragmento que comprende los restos 1 a 31 de E7 de VPH18 o un fragmento que consiste en los restos 1 a 31 de E7 de VPH18, y un segundo polipéptido que es un fragmento que comprende los restos 43 a 105 de E7 de VPH18 o un fragmento que consiste en los restos 43 a 105 de E7 de VPH18. En una realización preferida, el primer polipéptido son los primeros 31 restos de aminoácidos de VPH18-E7 y se inserta entre los codones 319 y 320 de CyaA, y el segundo polipéptido consta de los restos 43 a 105 de VPH18-E7 y se inserta entre los codones 224 y 235 de CyaA (ejemplificado en el vector pKTRACE5-VPH18E7ñ32-42).
En otra realización, el (los) polipéptido(s) contiene(n) al menos un epítopo derivado del antígeno tumoral MAGE A3, tal como un polipéptido que consiste en los restos 97 a 178 de MAGE A3 (SEQ ID NO: 8), o tal como un polipéptido que consiste en los restos 190 a 221 fusionados a los restos 242 a 295 de mAg E A3 (SEQ iD NO: 9). En una realización particular, un(os) polipéptido(s) llevado(s) por un vector de la invención (o una composición que lo(s) contiene) consiste en una proteína CyaA, preferiblemente CyaA de B. pertussis, en la que dos polipéptidos derivados de MAGE A3 se han insertado en dos sitios diferentes. Tal(es) polipéptido(s) llevado(s) por un vector consiste en la CyaA de B. pertussis, en donde (1) se ha insertado un primer polipéptido que consiste en los restos 97 a 178 de MAGE A3 entre los codones 224 y 235 de CyaA y (2) se ha fusionado un segundo polipéptido que consiste en los restos 190 a 221 fusionados a los restos 242 a 295 de MAGE A3 insertado entre los codones 319 a 320 de CyaA. Un ejemplo particular de un vector CyaA-MAGE A3 se proporciona en la Figura 4C (SEQ ID NO: 7).
El (los) polipéptido(s) llevado(s) por un vector tal como se define en el presente documento, como tal o en una composición, se usa(n) para obtener en un mismo hospedador mamífero, especialmente en un hospedador humano, (i) un tratamiento inmunoterapéutico de la(s) primera(s) afección(es) patológica(s) determinada(s) diagnosticada(s) en dicho hospedador mamífero suscitando una respuesta inmunitaria de linfocitos T contra un primer grupo de epítopos contenidos en dicho (s) polipéptido(s) y (ii) la profilaxis contra una(s) segunda(s) afección(es) patológica(s) determinada(s) suscitando una respuesta inmunitaria de memoria de linfocitos T contra un segundo grupo de epítopos contenidos en dicho(s) polipéptido(s), y (iii) opcionalmente la prevención contra la reaparición de dicha(s) primera(s) afección(es) patológica(s) determinada(s) suscitando una respuesta inmunitaria de memoria de linfocitos T contra dicho primer grupo de epítopos contenidos en dicho(s) polipéptido(s), obteniéndose dichas respuestas inmunitarias después de la administración de dicho(s) polipéptido(s) llevado(s) por un vector en dicho hospedador, en donde dicha profilaxis contra la(s) segunda(s) afección(es) patológica(s) determinada(s) no se observa cuando dicho segundo grupo de epítopos no está contenido en dicho(s) polipéptido(s) llevado(s) por un vector administrado(s). El (los) polipéptido(s), como se define en el presente documento, llevado(s) por la(s) molécula(s) vector, se elige(n) de acuerdo con los grupos de epítopos que se buscan y se pueden clasificar de acuerdo con dos grupos:
- el primer grupo de epítopos se refiere a polipéptido(s) que se deriva(n) de un antígeno que se sabe que se expresa o presenta al sistema inmunitario en un hospedador mamífero infectado por un patógeno particular, desarrollando un tumor particular o presentándose con una primera afección patológica determinada, habiendo sido diagnosticado dicho hospedador mamífero con dicha infección particular, dicho tumor particular o dicha(s) primera(s) afección(es) patológica(s) determinada(s) antes de la administración del(de los) polipéptido(s) llevado(s) por un vector o composición definidos en el presente documento; y
- el segundo grupo de epítopos se refiere a polipéptido(s) que se deriva(n) de un antígeno que se sabe que se expresa o presenta al sistema inmunitario en un hospedador mamífero infectado por otro patógeno particular, desarrollando otro tipo particular de tumor o presentando una segunda afección patológica determinada, dicho hospedador mamífero que no está o no ha sido infectado por dicho otro patógeno particular, que no ha desarrollado dicho otro tipo particular de tumor o que no ha presentado dicha(s) segunda(s) afección(es) patológica(s) determinada(s) antes de la administración del(de los) polipéptido(s) llevado(s) por un vector o composición definidos en el presente documento.
La invención se basa en las observaciones de que:
(i) puede obtenerse un tratamiento inmunoterapéutico de la(s) primera(s) afección(es) patológica(s) determinada(s) diagnosticada(s) en un hospedador mamífero suscitando una respuesta inmunitaria de linfocitos T contra un primer
grupo de epítopos contenidos en polipéptidos llevados por una molécula vector;
(ii) la profilaxis contra la(s) segunda(s) afección(es) patológica(s) determinada(s) en el mismo hospedador mamífero puede obtenerse suscitando una respuesta inmunitaria de memoria de linfocitos T contra un segundo grupo de epítopos contenidos en el (los) polipéptido(s); y
(iii) opcionalmente, la prevención contra la reaparición de dicha(s) primera(s) afección(es) patológica(s) determinada(s) puede(n) obtenerse suscitando una respuesta inmunitaria de memoria de linfocitos T contra dicho primer grupo de epítopos contenidos en dicho(s) polipéptido(s) llevado(s) por una molécula vector;
estando llevado dicho segundo grupo de epítopos por la misma molécula vector, o llevado por una molécula vector separada, y administrado en la misma composición y simultáneamente con la primera molécula vector.
Por tanto, la molécula vector tal como se define en el presente documento o en una composición, o las moléculas vector de una composición tal como se define en el presente documento lleva al menos un, preferiblemente uno, polipéptido que comprende un(os) epítopo(s) del primer grupo y al menos un polipéptido que comprende un(os) epítopo(s) del segundo grupo. La molécula vector tal como se define en el presente documento o en una composición o las moléculas vector de una composición como se define en el presente documento lleva(n) (a) un polipéptido que comprende un(os) epítopo(s) del primer grupo y al menos un polipéptido que comprende un(os) epítopo(s) del segundo grupo, (b) un polipéptido que comprende un(os) epítopo(s) del primer grupo y al menos un polipéptido que comprende epítopo(s) del segundo grupo seleccionado entre 1, 2, 3, 4, 5 o 6 polipéptidos, (c) al menos un polipéptido que comprende un(os) epítopo(s) del primer grupo seleccionado entre 2 o 3 polipéptidos y al menos un polipéptido que comprende un(os) epítopo(s) del segundo grupo y (d) al menos un polipéptido que comprende un(os) epítopo(s) del primer grupo seleccionado(s) entre 2 o 3 polipéptidos y al menos un polipéptido que comprende un(os) epítopo(s) del segundo grupo seleccionado entre 1, 2, 3, 4, 5 o 6 polipéptidos.
Cuando un(os) polipéptido(s) llevado(s) por un vector se usa como tal o en una composición, el vector puede llevar un polipéptido que comprende un(os) epítopo(s) del primer grupo y un(os) epítopo(s) del segundo grupo, es decir, que dicho segundo grupo de epítopos está contenido en el mismo polipéptido que el primer grupo de epítopos.
En otra realización, dicho primer y segundo grupo de epítopos están contenidos en diferentes polipéptidos. El polipéptido que comprende un(os) epítopo(s) del primer grupo y el polipéptido que comprende un(os) epítopo(s) del segundo grupo pueden ser llevados por la misma molécula vector. En otra realización, el polipéptido que comprende un(os) epítopo(s) del primer grupo y el polipéptido que comprende un(os) epítopo(s) del segundo grupo pueden ser llevados por diferentes moléculas de vector e incluirse en una misma composición. Cuando una composición, que contiene un primer y un segundo polipéptido(s) llevado(s) por un vector separado(s), se usa, la primera molécula vector lleva al menos un polipéptido que comprende un(os) epítopo(s) del primer grupo, lo que significa que un polipéptido que comprende un(os) epítopo(s) del primer grupo como mínimo es llevado por dicha primera molécula vector. En la misma composición, la segunda molécula vector lleva al menos un polipéptido que comprende un(os) epítopo(s) del segundo grupo, lo que significa que un polipéptido que comprende un(os) epítopo(s) del segundo grupo como mínimo es llevado por dicha segunda molécula vector separada. Finalmente, opcional uno o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5 o 6) polipéptido(s) llevado(s) por un vector también pueden incluirse en dicha composición, cualquiera que sea el grupo de epítopos contenidos en este/estos polipéptido(s) llevado(s) por un vector.
Por "respuesta inmunitaria", se entiende una respuesta inmunitaria mediada por células, especialmente una respuesta inmunitaria mediada por linfocitos T. En una realización particular, dicha respuesta inmunitaria mediada por linfocitos T es una respuesta inmunitaria citotóxica de CTL mediada por células, especialmente una respuesta inmunitaria CD8+. En el caso de polipéptidos derivados del antígeno tumoral, la respuesta inmunitaria es preferiblemente una respuesta inmunitaria citotóxica específica de tumor, que implica linfocitos citotóxicos específicos de tumor. En una realización particular, dicha respuesta inmunitaria mediada por linfocitos T es una respuesta inmunitaria CD4+, especialmente una respuesta inmunitaria de T-colaboradores. En una realización particular, la respuesta inmunitaria, en particular la(s) respuesta(s) inmunitaria(s) inducida(s) contra los epítopos del segundo grupo (como se define en el presente documento), después de la administración del(de los) polipéptido(s) llevado(s) por un vector o composición definidos en el presente documento, es una respuesta inmunitaria de linfocitos T de memoria. La expresión "respuesta inmunitaria" también puede abarcar, además de una respuesta inmunitaria mediada por células como se definió anteriormente, una respuesta inmunitaria humoral (producción de anticuerpos). Las respuestas inmunitarias descritas en la presente solicitud se obtienen después de la administración, en el hospedador, del(de los) polipéptido(s) llevado(s) por un vector de la invención, como tal o dentro de una composición.
La expresión "tratamiento inmunoterapéutico" se refiere al tratamiento de una(s) (primera(s)) afección(es) patológica(s) determinada(s) diagnosticada(s) en un hospedador mamífero, suscitando especialmente una respuesta inmunitaria de linfocitos T contra un primer grupo de epítopos contenidos en el (los) polipéptido(s) llevado(s) por la(s) molécula(s) vector administrada(s) como se define en el presente documento. El uso del(de los) polipéptido(s) llevado(s) por un vector o composición tal como se define en el presente documento tiene como objetivo mejorar las condiciones clínicas de un hospedador mamífero, que lo necesite, que ha sido diagnosticado como infectado por un patógeno o que padece un estado patológico, tal como un tumor, o tiene como objetivo la eliminación del agente u organismo causante de la enfermedad, o reducir dicho agente u organismo. En una situación de infección por patógenos, el tratamiento inmunoterapéutico da como resultado una disminución significativa en la carga de patógenos en el sitio de infección o en el sitio de replicación de este patógeno, en particular en el plasma o en la mucosa del hospedador, y posiblemente
da como resultado una carga de patógenos, como la carga de plasma, que es menos de lo que se puede detectar cuando se mide o, en la reducción del tamaño o el desarrollo del tumor, si lo hay.
La expresión "inmunoprofilaxis" o "profilaxis" se refiere a una respuesta que previene o protege contra la exposición, infección, aparición o el desarrollo de una(s) segunda(s) afección(es)patológicas determinada(s) o enfermedad o consecuencias clínicas de las mismas en el mismo hospedador mamífero suscitando especialmente una respuesta inmunitaria de memoria de linfocitos T contra un segundo grupo de epítopos contenidos en el (los) polipéptido(s) llevado(s) por la(s) molécula(s) vector administrada(s) como se define en el presente documento. El uso del(de los) polipéptido(s) llevado(s) por un vector o composición tal como se define en el presente documento da como resultado una respuesta inmunitaria profiláctica contra una futura infección, futuros eventos malignos o enfermedades y, en consecuencia, previene la aparición de un estado patológico en dicho hospedador mamífero.
La eficacia de la respuesta para conferir profilaxis puede analizarse mediante la detección del marcador del estado patológico. En una realización particular, los criterios de eficacia se seleccionan para alcanzar relevancia estadística.
La expresión "prevención contra la reaparición" se refiere a la obtención de una respuesta inmunitaria para prevenir una nueva exposición futura, una nueva infección futura, una nueva aparición futura o un nuevo desarrollo futuro de la(s) primera(s) afección(s) patológica(s) determinada(s), afecciones que se han diagnosticado previamente y se han tratado después de la administración del(de los) polipéptido(s) llevado(s) por un vector o composición como se define en el presente documento.
La expresión "hospedador mamífero" abarca todos los mamíferos, en particular, primates y humanos (por ejemplo, un paciente).
Se entiende que, después de la(s) administración(es) del(de los) polipéptido(s) llevado(s) por un vector o composición tal como se define en el presente documento, tanto la respuesta inmunitaria de los linfocitos T contra un primer grupo de epítopos como la respuesta inmunitaria de la memoria de los linfocitos T contra un segundo grupo de epítopos y, opcionalmente, la respuesta contra dicho primer grupo de epítopos, se inducen en el mismo hospedador mamífero, dentro de una ventana de tiempo particular. Por lo tanto, la al menos una administración del(de los) polipéptido(s) llevado(s) por un vector o composición tal como se define en el presente documento conduce a la inducción de una respuesta inmunitaria de linfocitos T contra un primer grupo de epítopos y una respuesta inmunitaria de memoria de linfocitos T contra un segundo grupo de epítopos y opcionalmente una respuesta inmunitaria de memoria de linfocitos T contra dicho primer grupo de epítopos, que puede manifestarse y/o medirse de 1 mes a 12 meses o más después de la administración (en particular a los 2, 3, 6, 9 o 12 meses), aunque los linfocitos T participan en una de estas o en ambas respuestas inmunitarias aún pueden manifestarse varios años después de la administración. La expresión "al menos una administración" o "administrando una vez" significa que el (los) polipéptido(s) llevado(s) por un vector o composición como se define en el presente documento se administra en el hospedador mamífero, especialmente el paciente, una o más, preferiblemente una o dos veces. Cada administración consiste en al menos un(os) polipéptido(s) llevado(s) por un vector, siempre que un primer grupo de epítopos y un segundo grupo de epítopos contenidos en al menos un(os) polipéptido(s) llevado(s) por al menos una(s) molécula(s) vector, con al menos un epítopo de dicho segundo grupo de epítopos, se administran al hospedador mamífero al mismo tiempo. Si es apropiado, la segunda y posibles administraciones posteriores (refuerzo principal) se llevan a cabo con el mismo polipéptido(s) llevado(s) por un vector o con la misma composición, con respecto al(a los) polipéptido(s), como la primera administración. Los experimentos informados a continuación muestran que un tratamiento y profilaxis inmunoterapéuticos, y opcionalmente, la prevención contra la reaparición, pueden obtenerse después de una única administración del(de los) polipéptido(s) llevado(s) por un vector o composición tal como se define en el presente documento.
La divulgación describe el (los) polipéptido(s) llevado(s) por un vector o composición tal como se define en el presente documento para su uso (i) en el tratamiento inmunoterapéutico de la(s) primera(s) afección(es) patológica(s) consecutiva(s) a una infección por patógeno, en particular consecutiva(s) a una infección bacteriana o vírica, diagnosticada en un hospedador mamífero y (ii) en la profilaxis contra una(s) segunda(s) afección(es) patológica(s) consecutiva(s) a una infección por un patógeno diferente, en particular consecutiva(s) a una infección por una bacteria diferente o un virus diferente (o una cepa diferente de los mismos) y (iii) opcionalmente, en la prevención contra la reaparición de dicha(s) primera(s) afección(es) patológica(s), en donde dicha profilaxis contra dicha(s) segunda(s) afección(es) patológica(s) determinada(s) no se observa cuando el segundo grupo de epítopos unidos a dicho patógeno diferente (por ejemplo, diferentes bacterias o virus diferentes) no está contenido en dicho(s) polipéptido(s) llevado(s) por un vector administrado(s). En el caso particular de afección(es) patológica(s) consecutiva(s) a diferentes cepas de virus, especialmente cepas de VPH diferentes o especies de tipos de VPH diferentes, la invención se refiere al(a los) polipéptido(s) llevado(s) por un vector o composición tal como se define en el presente documento para su uso de acuerdo con las reivindicaciones (i) en el tratamiento inmunoterapéutico de la(s) primera(s) afección(es) patológica(s) consecutiva(s) a la infección por un primer virus, primera cepa de VPH o primeras cepas de tipo de VPH, diagnosticados en un hospedador mamífero y (ii) en la profilaxis contra una(s) segunda(s) afección(es) patológica(s) consecutiva(s) a la infección por un segundo virus diferente, segunda cepa de VPH diferente o segunda cepa de tipo de VPH diferente, y (iii) opcionalmente en la prevención contra la reaparición de dicha(s) primera(s) afección(es) patológica(s), en donde dicha profilaxis contra la(s) segunda(s) afección(es) patológica(s) determinada(s) no se observa cuando el segundo grupo de epítopos se une a dicho segundo virus diferente, la segunda cepa diferente de
VPH o la segunda cepa diferente de tipo VPH no está contenida en dicho(s) polipéptido(s) llevado(s) por un vector administrado(s). En una realización preferida, la invención se refiere a polipéptido(s) llevado(s) por un vector o composición tal como se define en el presente documento, que comprende un polipéptido derivado de la proteína E7 de VPH16 y un polipéptido derivado de la proteína e 7 de VPH18, para su uso: (1) (i) en el tratamiento inmunoterapéutico de la(s) primera(s) afección(es) patológica(s) consecutiva(s) a la infección por VPH16, diagnosticada(s) en un hospedador mamífero y (ii) en la profilaxis contra la(s) segunda(s) afección(es) patológica(s) consecutiva(s) a la infección por VPH18 y (iii) opcionalmente en la prevención contra la reaparición de dicha(s) primera(s) afección(es) patológica(s), en donde dicha profilaxis contra la(s) segunda(s) afección(es) patológica(s) determinada(s) no se observa cuando el polipéptido derivado de la proteína E7 de VPH18 no está contenido en dicho(s) polipéptido(s) llevado(s) por un vector administrado(s); o (2) (i) en el tratamiento inmunoterapéutico de la(s) primera(s) afección(es) patológica(s) consecutiva(s) a la infección por VPH18, diagnosticada(s) en un hospedador mamífero y (ii) en la profilaxis contra la(s) segunda(s) afección(es) patológica(s) consecutiva(s) a la infección por VPH16 y (iii) opcionalmente, en la prevención contra la reaparición de dicha(s) primera(s) afección(es) patológica(s), en donde dicha profilaxis contra la(s) segunda(s) afección(es) patológica(s) determinada(s) no se observa cuando el polipéptido derivado de la proteína E7 de VPH16 no está contenido en dicho(s) polipéptido(s) llevado(s) por un vector administrado(s).
La divulgación describe el (los) polipéptido(s) llevado(s) por un vector o composición tal como se define en el presente documento para su uso (i) en el tratamiento inmunoterapéutico de la(s) primera(s) afección(es) patológica(s) consecutiva(s) a las primeras células tumorales, diagnosticada(s) en un hospedador mamífero y (ii) en la profilaxis contra una(s) segunda(s) afección(es) patológicas consecutivas a segundas células tumorales, cuyo origen y/o histología es diferente de las primeras células tumorales, y (iii) opcionalmente, en la prevención contra la reaparición de dichas primeras afecciones patológicas, en donde dicha profilaxis contra la(s) segunda(s) afección(es) patológica(s) determinada(s) no se observa cuando el segundo grupo de epítopos unidos a dichas segundas células tumorales no está contenido en dicho(s) polipéptido(s) llevado(s) por un vector administrado(s).
La divulgación describe el (los) polipéptido(s) llevado(s) por un vector o composición tal como se define en el presente documento para su uso (i) en el tratamiento inmunoterapéutico de la(s) primera(s) afección(es) patológica(s) consecutiva(s) a una infección por patógeno, en particular consecutiva(s) a una infección bacteriana o vírica, diagnosticada(s) en un hospedador mamífero y (ii) en la profilaxis contra la(s) segunda(s) afección(es) patológica(s) consecutiva(s) al desarrollo de células tumorales y (iii) opcionalmente en la prevención contra la reaparición de dicha(s) primera(s) afección(es) patológica(s), en donde dicha profilaxis contra la(s) segunda(s) afección(es) patológica(s) determinada(s) no se observa cuando el segundo grupo de epítopos unidos a dichas células tumorales no está contenido en dicho polipéptido(s) llevado(s) por un vector administrado(s).
La divulgación describe el (los) polipéptido(s) llevado(s) por un vector o composición tal como se define en el presente documento para su uso (i) en el tratamiento inmunoterapéutico de la(s) primera(s) afección(es) patológica(s) consecutiva(s) al desarrollo de células tumorales, diagnosticada(s) en un hospedador mamífero y (ii) en la profilaxis contra una(s) segunda(s) afección(es) patológica(s) consecutiva(s) a una infección por patógeno, en particular consecutiva(s) a una infección bacteriana o vírica, y (iii) opcionalmente en la prevención contra la recurrencia de dicha(s) primera(s) afección(es) patológica(s), en donde dicha profilaxis contra la(s) segunda(s) afección(es) patológica(s) determinada(s) no se observa cuando el segundo grupo de epítopos unidos a dicho patógeno diferente (por ejemplo, diferentes bacterias o virus diferentes) no está contenido en dicho(s) polipéptido(s) llevado(s) por un vector administrado(s).
La divulgación describe un método para obtener en un mismo hospedador mamífero, (i) un tratamiento inmunoterapéutico de la(s) primera(s) afección(es) patológica(s) determinada(s) diagnosticada(s) en un hospedador mamífero, especialmente suscitando una respuesta inmunitaria de linfocitos T contra un primer grupo de epítopos, y (ii) la profilaxis contra la(s) segunda(s) afección(es) patológica(s) determinada(s), especialmente suscitando una respuesta inmunitaria de memoria de linfocitos T contra un segundo grupo de epítopos, en donde dicha profilaxis contra la(s) segunda(s) afección(es) patológica(s) determinada(s) no se observa cuando dicho segundo grupo de epítopos no está contenido en dicho(s) polipéptido(s) llevado(s) por un vector, comprendiendo dicho método administrar, al menos una vez, a dicho hospedador mamífero ya sea:
(1) un(os) polipéptido(s) llevado(s) por un vector, en donde dicho vector que lleva el (los) polipéptido(s) consiste en una proteína CyaA o un fragmento de la misma adecuado para presentar dicho(s) polipéptido(s) al sistema inmunitario en un hospedador mamífero, dicho primer grupo de epítopos y el segundo grupo de epítopos están contenidos en al menos un(os) polipéptido(s) llevado(s) por dicho vector, y al menos un epítopo de dicho segundo grupo de epítopos es diferente de los epítopos del primer grupo de epítopos;
(2) una composición que comprende el (los) polipéptido(s) llevado(s) por un vector como se define en (1) en combinación con un excipiente farmacéuticamente aceptable; o
(3) una composición que comprende (a) un(os) primer(os) polipéptido(s) llevado(s) por un vector en donde dicho primer vector que lleva el (los) polipéptido(s) consiste en una proteína CyaA o un fragmento de la misma adecuados para presentar dicho(s) polipéptido(s) al sistema inmunitario en un hospedador mamífero, dicho primer grupo de epítopos está contenido en al menos un(os) polipéptido(s) llevado(s) por dicho primer vector y (b) un(os) segundo(s) polipéptido(s) llevado(s) por un vector separado(s) en donde dicha segunda molécula vector que lleva el (los)
polipéptido(s) consiste en una proteína CyaA o un fragmento de la misma adecuados para presentar dicho(s) polipéptido(s) al sistema inmunitario en un hospedador mamífero, dicho segundo grupo de epítopos está contenido en al menos un(os) polipéptido(s) llevado(s) por dicho segundo vector.
Según la divulgación, se describe un método para obtener en un mismo hospedador mamífero, (i) un tratamiento inmunoterapéutico de la(s) primera(s) afección(es) patológica(s) determinada(s) diagnosticada(s) en un hospedador mamífero, especialmente suscitando una respuesta inmunitaria de linfocitos T contra un primer grupo de epítopos, (ii) la profilaxis contra una(s) segunda(s) afección(es) patológica(s) determinada(s), especialmente suscitando una respuesta inmunitaria de memoria de linfocitos T contra un segundo grupo de epítopos y (iii) opcionalmente la prevención contra la reaparición de dicha(s) primera(s) afección(es) patológica(s) determinada(s), especialmente suscitando una respuesta inmunitaria de memoria de linfocitos T contra dicho primer grupo de epítopos, en donde dicha profilaxis contra la(s) segunda(s) afección(es) patológica(s) determinada(s) no se observa cuando dicho segundo grupo de epítopos no está contenido en dicho(s) polipéptido(s) llevado(s) por un vector, comprendiendo dicho método administrar al menos una vez a dicho paciente:
(1) un(os) polipéptido(s) llevado(s) por un vector, en donde dicho vector que lleva el (los) polipéptido(s) consiste en una proteína CyaA o un fragmento de la misma adecuado para presentar dicho(s) polipéptido(s) al sistema inmunitario en un hospedador mamífero, dicho primer grupo de epítopos y el segundo grupo de epítopos están contenidos en al menos un(os) polipéptido(s) llevado(s) por dicho vector, y al menos un epítopo de dicho segundo grupo de epítopos es diferente de los epítopos del primer grupo de epítopos;
(2) una composición que comprende el (los) polipéptido(s) llevado(s) por un vector como se define en (1) en combinación con un excipiente farmacéuticamente aceptable; o
(3) una composición que comprende (a) un(os) primer(os) polipéptido(s) llevado(s) por un vector en donde dicho primer vector que lleva el (los) polipéptido(s) consiste en una proteína CyaA o un fragmento de la misma adecuados para presentar dicho(s) polipéptido(s) al sistema inmunitario en un hospedador mamífero, dicho primer grupo de epítopos está contenido en al menos un(os) polipéptido(s) llevado(s) por dicho primer vector y (b) un(os) segundo(s) polipéptido(s) llevado(s) por un vector separado(s) en donde dicha segunda molécula vector que lleva el (los) polipéptido(s) consiste en una proteína CyaA o un fragmento de la misma adecuados para presentar dicho(s) polipéptido(s) al sistema inmunitario en un hospedador mamífero, dicho segundo grupo de epítopos está contenido en al menos un(os) polipéptido(s) llevado(s) por dicho segundo vector.
Las composiciones como se definen en el presente documento pueden, en una realización particular, comprender un excipiente o formulación farmacéuticamente aceptable, o un diluyente fisiológicamente aceptable, que se elige entre agentes tampón, solución salina, solución salina tamponada con fosfato, dextrosa, glicerol, agua, etanol o similares y combinaciones de los mismos.
Además, el (los) polipéptido(s) llevado(s) por un vector o la composición como se define en el presente documento como medio para obtener un tratamiento inmunoterapéutico y la profilaxis se puede combinar o mezclar con, o la composición como se define en el presente documento como medio para obtener un tratamiento inmunoterapéutico y la profilaxis puede comprender además, al menos un inmunopotenciador, como al menos un adyuvante, preferiblemente un adyuvante, y/o un tensioactivo y/o sustancias inmunomoduladoras (tales como citocinas o quimiocinas).
Se conocen varios adyuvantes en la técnica e incluyen el adyuvante completo de Freund (ACF), adyuvante incompleto de Freund (AIF), montanide ISA (adyuvante de Seppic incompleto), péptidos de muramilo tales como dipéptido de muramilo (MDP) MDP-Lys (L18) (Na-acetilomuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-Nmiesteoroil-L-lisina), sulfato de zinc, hidróxido de hierro coloidal, fosfato de calcio o cloruro de calcio, CpG oligodesoxinucleótidos (CPG ODN) como CPG ODN 1826 y CPG ODN 2007, MF59, que es una emulsión de aceite en agua estabilizada con detergente que contiene 5 % de escualeno (p/v), 0,5 % de Tween® 80 (p/v) y 0,5 % de Span (p/v) en agua, Ligandos TLR4 (como MPL, GLA), ligandos TLR3 (como Hiltonol®), polisacáridos (como la inulina) y liposomas (como los liposomas catiónicos, ISCOM).
El al menos un adyuvante se elige entre las moléculas que tienen la capacidad de activar la respuesta inmunitaria de los linfocitos T, en particular la respuesta de memoria de linfocitos T. Los adyuvantes preferidos son los que se unen o son agonistas de TLR (receptor similar a Toll) 3, 4, 7, 8 y/o 9 en células inmunes (como CPA). En una realización particular, el adyuvante es un ligando TLR (por sus siglas en inglés), en particular un ligando TLR seleccionado del grupo que consiste en ligandos TLR de clase 3, tal como poly-ICLC, ligandos TLR de clase 4, ligandos TLR de clase 9, tales como CpG y los ligandos TLR de la clase 7/8, como Imiquimod. Ejemplos de adyuvantes son Imiquimod vendido como una crema que contiene 5 % de Imiquimod (Aldara™) y Poly-ICLC vendido por Oncovir (Inc, WA, EE. UU.) Como Hiltonol®.
Mediante "combinado", se entiende que el (los) polipéptido(s) llevado(s) por un vector o la composición como se define en el presente documento y el inmunopotenciador se ponen en contacto con el hospedador, en diferentes momentos y/o por diferentes modos de administración, preferiblemente en el mismo sitio de contacto. En una realización particular, el (los) polipéptido(s) llevado(s) por un vector o la composición como se define en el presente documento se inyecta en el hospedador y el inmunopotenciador (tal como un adyuvante) se aplica tópicamente, por ejemplo, cutáneamente (sobre la piel), al hospedador. Por ejemplo, el (los) polipéptido(s) llevado(s) por un vector o la
composición como se define en el presente documento se inyecta en el hospedador y el inmunopotenciador (como un adyuvante) se aplica sobre la piel del hospedador después de la inyección, en el sitio de inyección. Por el contrario, "mezclado" significa que el (los) polipéptido(s) llevado(s) por un vector o la composición como se define en el presente documento y el inmunopotenciador están en la misma formulación cuando se administran.
Cabe destacar que en la presente solicitud, cuando un inmunopotenciador (como un adyuvante) se mezcla o combina con el (los) polipéptido(s) llevado(s) por un vector o la composición como se define en el presente documento, se usa el inmunopotenciador, al menos, cada vez que el (los) polipéptido(s) llevado(s) por un vector o la composición como se define para su uso de acuerdo con la invención se administra en el hospedador. En una realización particular, el (los) polipéptido(s) llevado(s) por un vector o la composición de la invención se administran dos veces, y se aplica el inmunopotenciador (mezclado o combinado, preferiblemente por vía cutánea), en el sitio de administración del (los) polipéptido(s) llevado(s) por un vector o la composición de la invención, en el día de cada administración. En otra realización particular, el (los) polipéptido(s) llevado(s) por un vector o la composición para su uso de acuerdo con la invención se administran dos veces, y se aplica el inmunopotenciador (mezclado o combinado, preferiblemente por vía cutánea), en el sitio de administración del (los) polipéptido(s) llevado(s) por un vector o la composición de la invención, en el día de cada administración y al día siguiente del día de cada administración. En una realización particular, el (los) polipéptido(s) llevado(s) por un vector o la composición de la invención se administra(n) dos veces, y el adyuvante (preferiblemente Imiquimod, tal como Aldara™) se aplica por vía cutánea en el sitio de administración del (los) polipéptido(s) llevado(s) por un vector o la composición de la invención, en el día de cada administración y al día siguiente del día de cada administración.
El (los) polipéptido(s) llevado(s) por un vector como se define(n) en el presente documento o la composición como se define en el presente documento como medio para obtener un tratamiento inmunoterapéutico y la profilaxis y, opcionalmente, la prevención contra la reaparición, adicionalmente se puede(n) combinar o mezclar, en regímenes de administración, con otros compuestos activos adecuados para tratar la infección por patógenos, células tumorales o afecciones patológicas asociadas con esta infección o tumor, tales como compuestos activos antitumorales o antivíricos.
El (los) polipéptido(s) llevado(s) por un vector o las composiciones definidos en el presente documento pueden inyectarse en un paciente a través de diferentes vías: subcutánea (s.c.), intradérmica (i.d.), intramuscular (i.m.) o intravenosa (i.v.), administración oral y administración en la mucosa, especialmente administración o inhalación intranasal. En una realización particular, el (los) polipéptido(s) llevado(s) por un vector o composiciones definidos en el presente documento se administran por vía intradérmica.
En particular, el (los) polipéptido(s) llevado(s) por un vector o composiciones definidas en el presente documento, ya sea mezclados o combinados con al menos un inmunopotenciador o no, cualesquiera que sean las vías de administración, se administran en un sitio, independiente de la(s) (primera(s)) afección(es) patológica(s) determinada(s) diagnosticada(s) en el hospedador mamífero, es decir, para un tumor, en un sitio que no sea el del desarrollo del tumor (por ejemplo, que no sea la mucosa) y para un patógeno, en un sitio que no sea el sitio de replicación del patógeno.
El (los) polipéptido(s) llevado(s) por un vector o las composiciones definidos en el presente documento pueden estar en forma sólida (oblea, polvo, gélula, píldora, supositorio, comprimido de liberación rápida, comprimido gastrorresistente, comprimido de liberación retardada), una forma en polvo, preferiblemente después de la liofilización (forma liofilizada o forma en polvo liofilizado) que necesita reconstruirse, por ejemplo, con diluyente(s) antes de la inyección, o en forma líquida, como una solución inyectable o suspensión inyectable.
La cantidad de polipéptido(s) llevado(s) por un vector que se debe administrar (dosis) depende del sujeto a tratar, incluyendo considerar la afección del paciente, el estado del sistema inmunitario del individuo, la vía de administración y el tamaño del hospedador. Las dosis convencionales varían de 1 a 1200 |jg, de 100 a 1000 |jg, de 200 a 1000 |jg, de 500 a 1000 jg . Se elige una dosis particular del grupo que consiste en 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 y 1000 jg . En otra realización, las dosis convencionales varían de 1 a 100 jg , de 1 a 50 jg y de 1 a 10 jg de polipéptido(s) llevado(s) por un vector. Estos ejemplos pueden ser modificados por un experto en la materia, dependiendo de las circunstancias.
Cada realización específica se puede combinar con cualquier realización particular.
Ejemplos
A. MATERIALES Y MÉTODOS
Ratones
Ratones hembra C57BL/6 de seis semanas de edad (H-2si) se compran en Charles River Laboratories. Los ratones se alojan en condiciones sin patógenos con agua y alimentos ad libitum. Los procedimientos que involucran animales y su cuidado se ajustan a las pautas de Genticel que cumplen con las leyes y políticas nacionales e internacionales y
que son revisadas por el comité de ética local.
Líneas celulares tumorales
Las células tumorales TC-1 (cultivo de tejidos número uno) (Lin, Guarnieri et al. 1996) se prepararon por transformación de células de pulmón de ratón primarias C57BL/6 con oncogenes E6 y E7 de VPH16 y oncogén c-Ha-Ras humano activado. Las células utilizadas en este estudio se obtuvieron del ATCC. Los linfocitos TC1 se descongelan antes de cada experimento y luego se cultivan y expanden in vitro durante al menos 10 días antes de la inyección.
EG7, la línea celular murina de linfoma EL4 transfectada con OVA (antecedentes genéticos C57BL/6), se usan para inducir un tumor sólido que expresa la proteína ovoalbúmina. Este modelo se describe ampliamente y se usa como un modelo de tumor murino de cáncer (Schreiber, Deyev et al. 2009). Los linfocitos EG7 se descongelan antes de cada experimento y luego se cultivan y expanden in vitro durante al menos 10 días antes de la inyección.
Inoculación de células tumorales
En el día 0, los ratones C57BL/6 son inyectados con linfocitos TC-1 (0,5x106 células por ratón para VPH _TUR008, 1x106 células por ratón para los otros estudios) diluidos en 100 pl de PBS 1X por vía subcutánea en el flanco. En algunos experimentos, los ratones se inyectan en el día 60 con células EG7 diluidas en 100 pl de PBS 1X a través de la vía subcutánea en el flanco.
Preparación del vector
- Construcción y purificación de CyaA-VPH16E7 ¿30-42 recombinante (C16-1) y CyaA-VPH18E7¿32-42 (C18-1) (Figuras 3A y 3B) ya se describen en el documento EP1576967B1. Las dos masas finales de CyaA-VPH16E7¿30-42 (C16-1) y CyaA-VPH18E7¿32-42 (C18-1) se mezclaron en Genticel en una relación 1:1 para producir el ProCervix que luego se almacena a -80 °C en partes alícuotas.
- CyaA-CysOVA incorpora el epítopo restringido OVA257-264 (SIINFEKL) H-2b de la proteína ovoalbúmina (OVA). Se codifica como BTpr_103, lote VPH043_Cova_ PB_8M purificado en Genticel. Este lote de CyaA-CysOVA se caracterizó por su inmunogenicidad en ratones en Genticel (resultados internos) (Figura 4).
- el vector CyaA-MAGEA397-178/190-295 (Figura 4C y SEQ ID NO: 7) abarca dos polipéptidos:
(1) el epítopo MAGE A397-178 insertado entre los restos 224 y 235 de CyaA de B. pertussis: LGDNQIMPKAGLLNVLANAREGDCAPEEKIPKKLLTQHFVQENY LEYRQVPGSDPACYEFLWGPRALVETSYVKVLHHMVKISG (SEQ ID NO: 8); y 2
(2) el epítopo MAGE-A3190-295 * correspondiente a los restos 190-221 fusionados a los restos 242-295 de la secuencia m Ag E A3, insertado entre los restos 319 a 320 de CyaA: TFPDLESEFQAALSRKVAELVHFLLLKYRAREPVTKAEMLGSVVGN WQYFFPVIFSKASSSLQLVFGIELMEVDPIGHLYIF (SEQ ID NO:9).
Administración de vacunas
En el día 11, después de la medición tumoral, los ratones con tumores sólidos detectables se vacunan mediante inyección intradérmica (id) en la dermis de los oídos (se inyectan ambos oídos). En algunos experimentos, los ratones reciben una vacuna de dos inyecciones el día 11 y el día 39 después de la inoculación de células tumorales TC-1. En cuanto a ProCervix, a los ratones se les administró 5 pg de CyaA-VPH16E7.¿30-42 y 5 pg de CyaA-VPH18E7¿32-42.
Moléculas adyuvantes
Aldara™ es una formulación farmacéutica de una molécula que activa la inmunidad innata a través de una unión preferencial en TLR7 a las células inmunes como, por ejemplo, CPA. Esta molécula activa es Imiquimod, un pequeño compuesto sintético. Aldara™ se comercializa como una crema que contiene 5 % de Imiquimod en paquetes de uso de dosis única de 250 mg (12,5 mg de Imiquimod activo). La dosis que induce un efecto adyuvante para la vacunación de ratones con ProCervix es de 25 mg de Aldara™ por sitio de inmunización, por lo que, respectivamente, 1,25 mg de Imiquimod activo por sitio de inyección (50 mg para un ratón). Una aplicación tópica (cutánea) de Aldara™ se realiza en el día de la inmunización y 24 h después de la inmunización. Se preparan tubos individuales, cada uno contiene 25 mg de Aldara™ para su aplicación en la piel del oído (2 tubos para un ratón). Para evaluar con precisión la cantidad real de crema Aldara™ aplicada en cada sitio de inyección de ProCervix (correspondiente a cada oreja para un ratón individual); cada tubo Eppendorf se pesa antes y después del depósito de la crema en el interior. Después de la aplicación de la crema Aldara™ en la piel del oído, el peso de los tubos Eppendorf se reevalúa para calcular aproximadamente la cantidad de crema restregada en la piel. Para cada tubo, todo el contenido de la crema se restriega durante al menos 15 segundos y hasta la penetración completa en la piel.
Poly-ICLC (agonista de TLR3) fue proporcionado por Oncovir (Inc, WA, EE. UU.) en frascos que contienen 1 ml de solución estéril opalescente de 2 mg/ml. El Poly-ICLC se deja en el recipiente original y se almacena a 4 °C. Poly-ICLC para inyección contiene 2 mg/ml de poly-IC estabilizado con 1,5 mg/ml de poli-L-lisina y 5 mg/ml de carboximetilcelulosa de sodio en solución de cloruro de sodio al 0,9 % y ajustado a pH 7,6-7,8 con hidróxido de sodio.
Medida tumoral
Se tienen en cuenta diferentes parámetros para evaluar el desarrollo tumoral en ratones:
- Tamaño tumoral: Los tumores se miden manualmente usando un calibrador dos veces por semana, comenzando 5 días después de la inoculación de las células tumorales y hasta el día 60. El volumen tumoral se calcula de la siguiente manera: volumen = (Largo x ancho2)/2;
-Supervivencia de ratones: Por razones éticas, los ratones que se desarrollan de manera anormalmente importante (tamaño límite: 2000 mm3) y/o tumores necróticos, o con movilidad alterada inducida por el tumor son sacrificados; y
- Número de ratones sin tumor: Esta información indica cuándo la vacunación terapéutica ha inducido una regresión tumoral completa (ausencia de tumor palpable).
Medición de respuestas citototóxicas de memoria de linfocitos T CD8
El método para medir la citotoxicidad de linfocitos T CD8+ in vivo ha sido ampliamente descrito (Barchet, Oehen et al.
2000; Ingulli 2007). En resumen, los esplenocitos singénicos de ratones sin tratamiento previo se marcan con diferentes concentraciones de CFSE (éster succinimidílico de carboxifluoresceína, Molecular Probes Invitrogen) y se impulsan in vitro con péptidos restringidos con H-2b relevantes o se dejan sin impulsar. Tanto las poblaciones de células diana impulsadas con péptidos como sin impulsar se transfieren de forma adoptiva por vía intravenosa a hospedadores vacunados singénicos y la pérdida de las dianas impulsadas por péptidos se mide por citometría de flujo (BD FACSCalibur) en el bazo. El porcentaje de destrucción se estima a partir de la reducción en la relación del porcentaje de células diana impulsadas a células no impulsadas, corregido por la relación inicial (ver más abajo). Las preparaciones celulares se analizan mediante citometría de flujo antes de la inyección para verificar la carga de CFSE de las diferentes células diana y obtener valores de referencia (porcentaje real de cada población celular) para el cálculo de la destrucción in vivo. Las tres poblaciones de células diana se inyectan por vía intravenosa en una proporción 1:1:1 a cada ratón vacunado. El porcentaje de destrucción in vivo se calcula como se describe en otra parte con la siguiente fórmula (Barber, Wherry et al. 2003)
Ensayo ELISpot (inmunopuntos ligados a enzimas) de IFN-y
Frecuencias de IFN-y de E749-57 de VPH16 y E7as43-49 de VPH18 que producen linfocitos T CD8+ específicos se evalúan en esplenocitos reestimulados ex vivo por un ensayo ELISpot de IFN-y:
- Se realizan ensayos ELISpot en ratones individuales, no en bazo agrupado.
- Los ratones recibieron el día anterior a la infusión intravenosa de esplenocitos diana cargados con CFSE singénicos (debido al ensayo de destrucción in vivo, véase más arriba).
En resumen, los esplenocitos totales obtenidos de ratones vacunados se dejan sin estimular o se reestimulan durante 20 h a 37 °C, 5 % de CO2 con 1 pg/ml de cada péptido como se describe a continuación:
- 1x106 células/pocillo con el péptido E749-57 de VPH16 (epítopo relevante restringido con H-2b)
- 1x106 células/pocillo con 0 VA257-264 (epítopo irrelevante restringido con H-2b).
- 0,25x106 células/pocillo con E7as43-49 de VPH18 (epítopo relevante restringido con H-2b).
La secreción de IFN-y se controla mediante un ELISpot con base de sándwich revelado por BCIP/NBT usando estreptavidina-AKP. Los datos se analizaron en un Bioreader 5000-Pro S (Biosys).
Vacunas terapéuticas/profilácticas
El esquema terapéutico, detallado a continuación, se resume en la Figura 8.
En el día 0, se inocularon dos grupos de ratones (grupos 1 y 2) en el flanco derecho con linfocitos TC-1 (1x106 células por ratón). Después, los ratones recibieron dos vacunas, la primera en el día 11 y la segunda en el día 39, con Placebo (PBS 1X urea) (grupo 1) o con Placebo Aldara™ (grupo 2). Los grupos 1 y 2 son un control negativo.
En el día 0, se inocularon cuatro grupos de ratones (grupos 3 a 6) en el flanco derecho, con linfocitos TC-1 (1x106 células por ratón) (grupos 3 a 6); entonces, los ratones recibieron dos vacunas, la primera en el día 11 y la segunda
en el día 39, con CyaA-MAGEA397-i78/i90-295/CyaA-VPH16 E7 (5 |jg de cada vector basado en CyaA) en presencia de Aldara™ (grupo 3), con CyaA-cysOVA/CyaA-VPH16 E7 (5 jg de cada vector basado en CyaA) en presencia de Aldara™ (grupo 4) o con ProCervix adyuvado con Aldara™ (grupos 5 y 6, como control positivo para la eliminación del tumor TC-1). El flanco derecho de estos ratones se controló hasta el día 100 (Figura 9). En el día 60, los ratones de supervivencia fueron inoculados con una segunda línea celular tumoral, ya sean las células tumorales B16 que expresan la proteína MAGE A3 (grupos 3 y 5) o las células tumorales EG7 (células singénicas malignas que expresan la proteína ovoalbúmina) (grupos 4 y 6). El flanco izquierdo de estos ratones se controló hasta el día 100.
Cuando se usa, se aplica tópicamente Aldara™ (cutáneamente), en el sitio de vacunación, en el día de la vacunación y al día siguiente a la vacunación (es decir, en los días 12 y 40).
B. RESULTADOS
Ratones portadores de tumores sólidos que expresan E7 de VPH16 vacunados por ProCervix muestran una alta tasa de regresión tumoral y una mejor supervivencia
Los ratones vacunados en el día 11 con PBS y que recibieron la aplicación de Aldara™ no mostraron inhibición del crecimiento tumoral con la excepción de 2 ratones de 10 que eliminaron completamente el tumor antes del día 50 (Figura 5A y 6A). Cuatro ratones estaban vivos en este grupo en el día 50 (Figura 6B; final de la monitorización del tamaño del tumor). No se incluyó ningún grupo tratado solo con PBS en este estudio y, por lo tanto, es difícil tener una idea clara del impacto de Aldara™ en comparación con la respuesta natural de los ratones contra el tumor. Sin embargo, es obvio que el efecto observado con Aldara™ solo es mucho más débil que los observados con ProCervix adyuvado con Aldara™ (véase más adelante). Esto indica que incluso si Aldara™ puede tener algún efecto por vecindad en la progresión del tumor, probablemente debido a la activación inmunitaria innata y los procesos inflamatorios resultantes (citocinas proinflamatorias, etc. (Schon y Schon 2008)), no es lo suficientemente potente como para usarse solo con este esquema terapéutico como tratamiento de tumores sólidos inducidos por VPH.
Los ratones vacunados en el día 11 con ProCervix sin adyuvante también mostraron crecimiento tumoral importante sin ratones sin tumor en el día 50 (Figura 5B y 6A). Solo dos ratones estaban vivos en el día 50 en este grupo (Figura 6B). La vacunación terapéutica con ProCervix adyuvado con Imiquimod tópico (Aldara™) indujo una regresión tumoral significativa (Figura 5D) que condujo a altas tasas de supervivencia (figura 6B) y una mayoría de ratones sin tumor al final del estudio (figura 6a ). Para el grupo de ProCervix adyuvado con Aldara™, observamos un escape tumoral después de un período de control aparente (el tamaño disminuyó a menos de 50 mm3) en 3 ratones de 10. El escape ocurrió entre el día 30 y el día 40 con un crecimiento importante hasta el día 50. Este fenómeno podría deberse a mecanismos de escape desarrollados por tumores y, en este caso, se deben tener en cuenta los refinamientos del esquema terapéutico, pero es más probable debido a la pérdida de moléculas de MHC de clase I en la superficie de las células tumorales como se describió anteriormente para células TC-1 (Zwaveling, Ferreira Mota et al. 2002). La vacunación terapéutica con ProCervix adyuvado con poly-ICLC dio resultados comparables de regresión tumoral y tasa de supervivencia (Figura 5C y 6). Estos resultados muestran que la vacunación terapéutica de ratones que tienen tumores sólidos que expresan e 7 de VPH16 con ProCervix, ya sea adyuvados con Poly-ICLC o Imiquimod tópico (Aldara™), produce un fuerte efecto terapéutico.
La vacuna terapéutica ProCervix promueve el desarrollo de CTL de memoria funcional específica para E7 de VPH16 y E7 de HVP18
Se describió por Rafi Ahmed y colaboradores en un modelo murino de infección vírica aguda con LCMV que los linfocitos T c D8+ de memoria pueden exhibir un potencial lítico rápido in vivo (Barber, Wherry et al. 2003). Basándose en estas observaciones, los inventores decidieron investigar si los ratones que eliminaron completamente los tumores sólidos inducidos por TC-1, después de la administración de ProCervix en el día 11, muestran linfocitos T CD8+ de memoria específicos de antígeno funcionales después de la erradicación del tumor.
Con este fin, en el día 60 después de la inoculación de linfocitos TC-1, los ratones sin tumor restantes en cada grupo se transfirieron de forma adoptiva con esplenocitos singénicos cargados con CFSE para medir en paralelo la citotoxicidad in vivo (como se describió anteriormente en la sección Materiales y métodos) de los linfocitos T CD8+ de memoria contra los dos siguientes epítopos restringidos con H-2si: E749-57 de VPH16 y E7as43-49 de VPH18. En los grupos de ratones vacunados con ProCervix adyuvados con Aldara™ o con Poly-ICLC, se tomaron 5 ratones sin tumor (seleccionados al azar en el grupo) para realizar el ensayo de destrucción in vivo. En todos los ratones probados, que han erradicado completamente el tumor, detectamos una fuerte citotoxicidad contra células diana impulsadas con e 749-57-de VPH16 (Figura 7). No se pueden observar diferencias entre los grupos. La detección de la respuesta citotóxica específica de VPH16E7 en placebo con el grupo vacunado con Aldara™ se debe al uso para esta prueba de los dos ratones sin tumor (todos los demás ratones estaban muertos debido a la excrecencia del tumor en el día 60). Estos datos indican que estos dos ratones han podido desarrollar una respuesta inmunitaria específica para E7 de VPH16 lo suficientemente fuerte como para eliminar los tumores sólidos inducidos por TC-1. Curiosamente, solo los ratones vacunados con ProCervix adyuvado también mostraron células diana impulsadas con VPH18E7. Estos datos son más informativos ya que los linfocitos TC-1 no expresan antígenos de VPH18, indicando así que la citotoxicidad específica de VPH18 informada solo se debió a los linfocitos T de memoria inducidos por la vacuna. De hecho, no se observó
citotoxicidad in vivo contra células diana impulsadas por VPH18E7 en ratones tratados únicamente con Aldara™ (Figura 7).
Tomados en conjunto, los datos de los inventores demuestran la exquisita eficacia de ProCervix para inducir, con una sola inyección, una respuesta de memoria dependiente de CD8 funcional contra los antígenos E7 de VPH16 y E7 de VPH18. Una vacuna ProCervix de una sola inyección puede inducir la diferenciación de un grupo de linfocitos T CD8+ de memoria específicos de antígeno que confieren a ratones vacunados, tanto una protección a largo plazo contra un exposición secundario con células injertadas singénicas que expresan E7 de VPH16 (antígeno expresado por tumores) y en paralelo una protección contra una nueva exposición con células injertadas singénicas que expresan E7 de VPH18 (antígeno que no se expresa por tumores y que solo se entrega por el vector CyaA-VPH18E7¿32-42).
La vacuna terapéutica bivalente de CyaA-VPH16E7ú30-42/CyaA-MAGE A3 proporciona la erradicación de los tumores sólidos que expresan E7 de VPH16 y protección contra el desarrollo de tumores inducidos por MAGE-A3
Los ratones vacunados con CyaA-VPH16E7¿30-42/CyaA-MAGE A3 Aldara como adyuvante transcutáneo (grupo 3) y los ratones vacunados con ProCervix adyuvado con Aldara (grupos 5 y 6) eliminaron los tumores sólidos inducidos por TC1 en 40 días: 9 de cada 10 ratones en el grupo 3 (Figura 9c); 8 de cada 10 ratones en el grupo 5 y 9 de cada 10 en el grupo 6 (Figura 9 e y f). La fuerte eliminación de los tumores se confirmó hasta el día 100. Por el contrario, los ratones que fueron vacunados con el placebo, con o sin adyuvante (grupo 1 y 2 respectivamente), ya que los controles negativos desarrollaron tumores sólidos inducidos por TC1: 9/10 ratones en el grupo 1 (Figura 9a) y 8/10 ratones en el grupo 2 (Figura 9b).
En el día 60, los ratones de supervivencia de los grupos 3 y 5 fueron inoculados, en su flanco izquierdo, con células tumorales B16 que expresan la proteína MAGE a 3. Ninguno de los ratones, que fueron vacunados con CyaA-VPH16E7á30-42/CyaA-MAGE A3 en presencia de Aldara™ y que han eliminado los tumores inducidos por TC1, mostró desarrollo de tumor B16-MAGEA3 después de la exposición (0 de 9 ratones desarrollaron tumores B16-MAGEA3; Figura 10a), que indica que estos ratones estaban protegidos contra la exposición con tumores sólidos inducidos por B16-MAGE A3.
Por el contrario, los ratones vacunados con ProCervix adyuvado con Aldara™ y que han eliminado los tumores inducidos por TC1 desarrollan tumores B16-MAGEA3 (6 de 8 ratones desarrollaron tumores B16-MAGEA3; Figura 10c), que indica que Procervix (VPH16E7/VPH18E7) no confirió inmunidad de linfocitos T de memoria protectora contra la exposición por las células tumorales B16-MAGEA3. Por lo tanto, la protección contra el desarrollo de tumores inducidos por MAGE A3 observados en ratones del grupo 3 se logró como resultado de la inducción de una respuesta de memoria mediada por linfocitos T específicos de MAGE A3 en ratones vacunados con CyaA-MAGEA3, mientras que la respuesta de memoria mediada por linfocitos T provocada en ratones del grupo 5 se generó contra un antígeno (E7 de VPH18) que es irrelevante con respecto a la naturaleza de las células tumorales B16-MAGEA3.
En conclusión, estos experimentos demuestran que se puede usar CyaA bivalente, después de una administración, tanto para erradicar los linfocitos TC-1 (respuesta inmunitaria específica de VPH18E7) como para prevenir el desarrollo de células tumorales B16-MAGEA3 (respuesta de memoria mediada por linfocitos T específicos de MAGE A3). Además, los resultados obtenidos después del día 60 mostraron que el efecto profiláctico obtenido contra las células tumorales B16-MAGEA3 no perjudicó el efecto terapéutico obtenido contra los linfocitos TC-1 (erradicación de linfocitos TC1 hasta el día 100; figura 9c).
La vacuna terapéutica bivalente CyaA-VPH16E7ñ30-42JCyaA-cysOVA proporciona la erradicación de los tumores sólidos que expresan E7 de VPH16 y protección contra el desarrollo de tumores inducidos por EG7-OVA
Ratones vacunados con CyaA-VPH1 6E7¿30-42/ CyaA-CysOVA en presencia de Aldara™ como adyuvante transcutáneo (grupo 4) y los ratones vacunados con ProCervix adyuvado con Aldara (grupo 5 y 6) eliminaron los tumores sólidos inducidos por TC1 en 40 días: 9 de cada 10 ratones en el grupo 4 (Figura 9d) y 8 de cada 10 ratones en el grupo 5 y 9 de cada 10 en el grupo 6 (Figura 9 e y f). La fuerte eliminación de los tumores se confirmó hasta el día 100. Por el contrario, los ratones que fueron vacunados con Placebo con o sin adyuvante (grupo 1 y 2 respectivamente), como controles negativos, desarrollaron tumores sólidos inducidos por TC1: 9/10 ratones en el grupo 1 (Figura 9a) y 8/10 ratones en el grupo 2 (Figura 9b).
En el día 60, los ratones de supervivencia de los grupos 4 y 6 fueron inoculados, en su flanco izquierdo, con células tumorales EG7-OVA (células singénicas malignas que expresan la proteína ovoalbúmina). En el grupo 6, el ratón 6004 desarrolló un tumor después del día 60 (Figura 9f), de modo que se inoculó con células tumorales EG7-OVA como los otros 9 ratones del grupo que no desarrollaron tumores. Ninguno de los ratones, que fueron vacunados con CyaA-VPH16E7á30-42/CyaA-CysOVA en presencia de Aldara™ y que han eliminado los tumores inducidos por TC1, mostraron desarrollo de tumor EG7-OVA después de la exposición (0 de 9 ratones desarrollaron tumores EG7-OVA; Figura 10b), demostrando que estos ratones estaban protegidos contra la exposición con células tumorales EG7-OVA. Por el contrario, los ratones que fueron vacunados con ProCervix adyuvado con Aldara™ y que han eliminado los tumores inducidos por TC1 desarrollaron tumores EG7-OVA (8 de cada 10 ratones desarrollaron tumores EG7-OVA; Figura 10d), que indica que Procervix (VPH16E7/VPH18E7) no confirió inmunidad de linfocitos T de memoria
protectora contra la exposición por las células tumorales EG7-OVA. Por lo tanto, la protección contra el desarrollo de tumores sólidos inducidos por EG7-OVA observados en el grupo 4 se logró como resultado de la inducción de una respuesta de memoria mediada por linfocitos T específicos de OVA en ratones vacunados con CyaA-VPH16E7¿30-42/CyaA-CysOVA, mientras que la respuesta de memoria mediada por linfocitos T suscitada en ratones del grupo 6 se generó contra un antígeno (VPH18 e 7) que es irrelevante con respecto a la naturaleza de los tumores EG7-OVA.
En conclusión, estos experimentos demuestran que se puede usar CyaA bivalente, después de una administración, tanto para erradicar los linfocitos TC-1 (respuesta inmunitaria específica de VPH18E7) como para prevenir el desarrollo de tumores sólidos inducidos por EG7-OVA. Además, los resultados obtenidos después del día 60 mostraron que el efecto profiláctico obtenido contra las células tumorales EG7-OVA no perjudicó el efecto terapéutico obtenido contra los linfocitos TC-1 (erradicación de linfocitos TC1 hasta el día 100; figura 9d).
C. CONCLUSIÓN
El concepto novedoso presentado en la presente solicitud, con la vacuna terapéutica bivalente ProCervix es, por una parte, tratar, por ejemplo, pacientes infectados por VPH16, erradicar la infección y, por otra parte, proporcionar respuestas de memoria mediadas por linfocitos T para los antígenos E7 de VPH16 y E7 de VPH18, estableciendo así para los pacientes vacunados con ProCervix una protección a largo plazo contra una posible reinfección por VPH16 y también contra una infección posterior por VPH18.
Esto se confirmó con otras dos vacunas bivalentes (CyaA-VPH16E7¿30-42/CyaA-MAGE A3 y CyaA-VPH16E7¿30-42/CyaA-CysOVA) que se han mostrado, por una parte, para tratar ratones infectados por VPH16 (erradicación de linfocitos TC1) y, por otra parte, para proporcionar protección contra el desarrollo de tumores B16-MAGE A3 o tumores EG7-OVA respectivamente.
Utilizando un modelo preclínico murino de carcinoma cervical [células tumorales TC-1 (Lin, Guarnieri et al. 1996; Zwaveling, Ferreira Mota et al. 2002)], se demostró que la vacunación terapéutica de ratones con tumores que expresan E7 de VPH16 sólido con ProCervix se combinó con una molécula adyuvante [agonistas de TLR como Aldara™ (Johnston y Bystryn 2006; Heib, Becker et al. 2007; Schon y Schon 2008) o Poly-ICLC (Longhi, Trumpfheller et al. 2009)] conducen a una regresión tumoral eficaz.
Además, se demostró que la eliminación del tumor inducida por la vacuna puede correlacionarse con la presencia de respuestas de memoria de CTL específicos de E7 de VPH16 de larga duración en ratones que han erradicado completamente el tumor. Inesperadamente, también se evidenció que en estos ratones sin tumores, la vacuna terapéutica ProCervix genera, en paralelo, respuestas funcionales de memoria de CTL específicos de E7de VPH18. Tanto CTL de memoria E7 de VPH16 como E7 de VPH18 mostraron un potencial lítico in vivo.
Las observaciones de que los polipéptidos llevados por CyaA pueden generar una(s) respuesta(s) preventiva(s) de memoria de linfocitos T contra un segundo grupo de epítopos en un hospedador mamífero (respuesta inmunitaria profiláctica) mientras permiten generar un tratamiento inmunoterapéutico de la(s) primera(s) afección(es) patológica(s) determinada(s) diagnosticada(s) en dicho hospedador mamífero suscitando una respuesta inmunitaria de linfocitos T contra un primer grupo de epítopos, es sorprendente. De hecho, es bien sabido que existe competencia entre diferentes epítopos, ya sea con respecto al acceso a CPA, procesamiento y presentación por CPA y disponibilidad de citocinas. Este fenómeno conduce a una jerarquía de epítopos dominantes y subdominantes, y permite activar la respuesta inmunitaria de los linfocitos T y suprimir otra(s) respuesta(s) inmunitaria(s) de los linfocitos T. Este fenómeno se esperaba en la situación actual donde los linfocitos T que reconocen el primer grupo de epítopos ya existen en el paciente antes de la administración de los polipéptidos llevados por un vector (ya que uno o algunos epítopos del primer grupo ya se han presentado al sistema inmunitario del hospedador), mientras que los linfocitos T nativos tienen que activarse con respecto al segundo grupo de epítopos. Curiosamente, la presente invención ha demostrado que, en contraste con lo que se espera, la respuesta inmunitaria preventiva contra el segundo grupo de epítopos contenidos en un polipéptido llevado por CyaA no parece estar desfavorecida con respecto a la respuesta inmunitaria terapéutica contra el primer grupo de epítopos. Estos resultados significan que no se observa competencia entre la respuesta inmunitaria inducida contra el primer grupo de epítopos y la respuesta inmunitaria inducida contra el segundo grupo de epítopos. En consecuencia, los inventores han demostrado que el (los) polipéptido(s) llevado(s) por CyaA es/son suficientemente eficaces para suscitar una respuesta inmunitaria de linfocitos T en un tratamiento inmunoterapéutico de la(s) primera(s) afección(es) patológica(s) determinada(s) diagnosticada(s) en un hospedador mamífero y para suscitar una respuesta inmunitaria de memoria de linfocitos T en la profilaxis contra una(s) segunda(s) afección(es) patológica(s) determinada(s) en el mismo hospedador mamífero.
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Claims (15)
1. Polipéptido(s) llevado(s) por un vector, en donde dicho vector que lleva el (los) polipéptido(s) consiste en una proteína adenilciclasa de una proteína CyaA de la especie Bordetella o un fragmento de la misma adecuados para presentar dicho(s) polipéptido(s) al sistema inmunitario en un hospedador mamífero, para su uso:
(i) en el tratamiento inmunoterapéutico de la(s) primera(s) afección(es) patológica(s) determinada(s) que es (a) consecutiva a la infección por una primera cepa de VPH seleccionada entre VPH16, VPH18, VPH31, VPH33, VPH35, VPH45, VPH52 o VPH58 o (b) relacionado con un tumor que expresa el antígeno MAGE-A3 diagnosticado en dicho hospedador mamífero en donde dicho tratamiento se realiza suscitando una respuesta inmunitaria de linfocitos T contra un primer grupo de epítopos contenidos en dicho(s) polipéptido(s) y en donde (a) los epítopos de dicho primer grupo provienen de los antígenos E6 o E7 de una cepa de v Ph seleccionada entre VPH16, VPH18, VPH31, VPH33, v Ph 35, VPH45, VPH52 o VPH58 o respectivamente en (b) los epítopos de dicho primer grupo son de un antígeno tumoral MAGE-A3 y
(ii) en la profilaxis contra la(s) segunda(s) afección(es) patológica(s) determinada(s) en donde cuando dicha primera afección patológica es consecutiva a la infección por VPH como en (a), dicha segunda afección patológica es consecutiva a la infección por una segunda cepa de VPH diferente de la primera y dicho VPH diferente se selecciona entre VPH16, VPH18, VPH31, VPH33, VPH35, VPH45, VPH52 o VPH58 o en donde dicha segunda afección determinada está relacionada con un tumor que expresa el antígeno MAGE-A3, en donde dicha segunda afección patológica se encuentra en el mismo hospedador mamífero y se genera una respuesta inmunitaria de memoria de linfocitos T contra un segundo grupo de epítopos contenidos en dicho(s) polipéptido(s) y en dicho segundo grupo los epítopos son de un antígeno del segundo VPH seleccionado entre VPH16, VPH18, VPH31, VPH33, VPH35, Vp H45, VPH52 o VPH58 o respectivamente de un antígeno tumoral MAGE-A3, obteniéndose dichas respuestas inmunitarias después de la administración de dicho(s) polipéptido(s) llevado(s) por un vector en dicho hospedador, en donde dicha profilaxis contra la(s) segunda(s) afección(es) patológica(s) determinada(s) no se observa cuando dicho segundo grupo de epítopos no está contenido en dicho(s) polipéptido(s) llevado(s) por un vector administrado(s) y en donde la secuencia de aminoácidos de dicho primer grupo de epítopo es diferente del aminoácido de dicho segundo grupo de epítopos.
2. El polipéptido llevado por un vector para su uso adicional de acuerdo con la reivindicación 1, (iii) en la prevención contra la reaparición de dicha(s) primera(s) afección(es) patológica(s) determinada(s), suscitando una respuesta inmunitaria de memoria de linfocitos T contra dicho primer grupo de epítopos contenidos en dicho(s) polipéptido(s).
3. El (los) polipéptido(s) llevado(s) por un vector para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde dicho segundo grupo de epítopos está contenido en el polipéptido que comprende el primer grupo de epítopos o en donde dicho primer y segundo grupos de epítopos están contenidos en diferentes polipéptidos.
4. El (los) polipéptido(s) llevado(s) por un vector para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, una molécula vector lleva todos los polipéptidos.
5. Una composición que comprende, en combinación con un excipiente o formulación farmacéuticamente aceptable, al menos un polipéptido(s) llevado por un vector como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para su uso:
(i) en el tratamiento inmunoterapéutico de la(s) primera(s) afección(es) patológica(s) determinada(s) que es (a) consecutiva a la infección por una primera cepa de VPH seleccionada entre VPH16, VPH18, VPH31, VPH33, VPH35, VPH45, VPH52 o VPH58 o (b) relacionado con un tumor que expresa el antígeno MAGE-A3 diagnosticado en dicho hospedador mamífero en donde dicho tratamiento se realiza suscitando una respuesta inmunitaria de linfocitos T contra un primer grupo de epítopos contenidos en dicho(s) polipéptido(s) y en donde (a) los epítopos de dicho primer grupo provienen de los antígenos E6 o E7 de una cepa de VPH seleccionada entre VPH16, VPH18, VPH31, VPH33, v Ph 35, VPH45, VPH52 o VPH58 o respectivamente en (b) los epítopos de dicho primer grupo son de un antígeno tumoral MAGE-A3 y
(ii) en la profilaxis contra la(s) segunda(s) afección(es) patológica(s) determinada(s) en donde cuando dicha primera afección patológica es consecutiva a la infección por VPH como en (a), dicha segunda afección patológica es consecutiva a la infección por una segunda cepa de VPH diferente de la primera y dicho VPH diferente se selecciona entre VPH16, VPH18, VPH31, VPH33, VPH35, VPH45, VPH52 o VPH58 o en donde dicha segunda afección determinada está relacionada o en donde dicha segunda afección determinada está relacionada con un tumor que expresa el antígeno MAGE-A3, en donde dicha segunda afección patológica se encuentra en el mismo hospedador mamífero y se genera una respuesta inmunitaria de memoria de linfocitos T contra un segundo grupo de epítopos contenidos en dicho(s) polipéptido(s) y en donde en dicho segundo grupo los epítopos son de un antígeno del segundo VPH seleccionado entre VPH16, VPH18, VPH31, VPH33, VPH35, VPH45, VPH52 o VPH58 o respectivamente de un antígeno tumoral MAGE-A3, obteniéndose dichas respuestas inmunitarias después de la administración de dicha composición en dicho hospedador, en donde dicha profilaxis contra la(s) segunda(s) afección(es) patológica(s) determinada(s) no se observa cuando dicho segundo grupo de epítopos no está contenido en el (los) polipéptido(s) llevado(s) por un vector de dicha composición administrada y en donde la secuencia de aminoácidos de dicho primer grupo de epítopos es diferente del aminoácido de dicho segundo grupo
de epítopos, dicha composición comprende opcionalmente al menos un adyuvante, y opcionalmente compuestos activos antitumorales o antivíricos.
6. Una composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 5, que comprende al menos dos polipéptidos llevados por un vector, en donde el primer grupo de epítopos está contenido en un primer polipéptido llevado por un vector y el segundo grupo de epítopos está contenido en un polipéptido llevado por un vector separado.
7. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 6, en donde dicho primer grupo de epítopos está contenido en polipéptidos separados llevados por dicho(s) primer(os) polipéptido(s) llevado(s) por un vector y/o el segundo grupo de epítopos está contenido en polipéptidos separados llevados por dicho(s) polipéptido(s) llevado(s) por un vector separado(s).
8. El (los) polipéptido(s) llevado(s) por un vector para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o la composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en donde dicha CyaA es una CyaA de la especie Bordetella que se origina de Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis o Bordetella bronchiseptica.
9. El (los) polipéptido(s) llevado(s) por un vector o la composición para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde
- dicho fragmento de CyaA es capaz de unirse específicamente a las células que expresan CD11b y, opcionalmente, entregar dicho(s) polipéptido(s) al citosol celular, como un fragmento de CyaA de B. pertussis que consiste en los restos 1 a 224 y 235 a 1706 y/o
- dicha proteína CyaA o fragmento de CyaA está desintoxicado, es no tóxico o carente de actividad enzimática, como una CyaA de B. pertussis en la que se inserta un dipéptido Leu-Gln en fase entre los restos 188 y 189.
10. El polipéptido(s) llevado(s) por un vector o la composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde dicho al menos uno, preferentemente todos, los polipéptidos son llevados por dicha proteína CyaA o fragmento de CyaA como resultado de la fusión genética.
11. El (los) polipéptido(s) llevado(s) por un vector o la composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 10, en donde dicho al menos uno, preferentemente todos, los polipéptidos se insertan genéticamente en CyaA, en particular en sitios permisivos de CyaA.
12. Los polipéptidos llevados por un vector o la composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 o 5, en donde dicho primer grupo de epítopos constituye un fragmento antigénico de la proteína E7 de VPH16, y el segundo grupo de epítopos constituye un fragmento antigénico de la proteína E7 de VPH18.
13. La composición para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, que comprende:
(a) un primer polipéptido llevado por un vector que consiste en los primeros 29 restos de aminoácidos de VPH16-E7 insertados entre los codones 319 y 320 de CyaA, y los restos 43 a 98 de VPH16-E7 insertados entre los codones 224 y 235 de CyaA; y
(b) un polipéptido llevado por un vector separado que consiste en los primeros 31 restos de aminoácidos de VPH18-E7 insertados entre los codones 319 y 320 de CyaA y los restos 43 a 105 de VPH18-E7 insertados entre los codones 224 y 235 de CyaA.
14. El (los) polipéptido(s) llevado(s) por un vector o la composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 11, en donde dicho polipéptido llevado por un vector consiste en CyaA de B. pertussis en donde:
(1) un primer polipéptido que consiste en los restos 97 a 178 de MAGE A3 se ha insertado entre los codones 224 y 235 de CyaA; y
(2) un segundo polipéptido que consiste en los restos 190 a 221 fusionados a los restos 242 a 295 de MAGE A3 se ha insertado entre los codones 319 a 320 de CyaA.
15. El (los) polipéptido(s) llevado(s) por un vector o la composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 12 o 13, para su uso:
(1) (i) en el tratamiento inmunoterapéutico de la(s) primera(s) afección(es) patológica(s) consecutiva(s) a la infección por VPH16, diagnosticada(s) en un hospedador mamífero y (ii) en la profilaxis contra la(s) segunda(s) afección(es) patológica(s) consecutiva(s) a la infección por VPH18 y (iii) opcionalmente en la prevención contra la reaparición de dicha(s) primera(s) afección(es) patológica(s), en donde dicha profilaxis contra la(s) segunda(s) afección(es) patológica(s) determinada(s) no se observa cuando el polipéptido derivado de la proteína E7 de VPH18 no está contenido en dicho(s) polipéptido(s) llevado(s) por un vector administrado(s); o
(2) (i) en el tratamiento inmunoterapéutico de la(s) primera(s) afección(es) patológica(s) consecutiva(s) a la infección por VPH18, diagnosticada(s) en un hospedador mamífero y (ii) en la profilaxis contra la(s) segunda(s) afección(es) patológica(s) consecutiva(s) a la infección por VPH16 y (iii) opcionalmente, en la prevención contra la reaparición de
dicha(s) primera(s) afección(es) patológica(s), en donde dicha profilaxis contra la(s) segunda(s) afección(es) patológica(s) determinada(s) no se observa cuando el polipéptido derivado de la proteína E7 de VPH16 no está contenido en dicho(s) polipéptido(s) llevado(s) por un vector administrado(s).
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