ES2639941T3 - Marcaje de glóbulos blancos con oligonucleótidos de fosforotioato - Google Patents
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Abstract
Un método para marcar indiscriminadamente leucocitos en una muestra fluida de sangre entera, que comprende la etapa de añadir un oligonucleótido de fosforotioato conjugado a dicha muestra bajo condiciones tales que el oligonucleótido de fosforotioato conjugado se una a los leucocitos.
Description
DESCRIPCION
Marcaje de globulos blancos con oligonucleotidos de fosforotioato Antecedentes de la invencion
La presente invencion se refiere al campo del analisis celular. Los oligonucleotidos de fosforotioato (PS-ODN) son 5 una variante de ADN normal en la que uno de los oxfgenos que no forman puentes se reemplaza por un atomo de azufre.
Descripcion de la tecnica relacionada
El marcaje de globulos blancos (WBC) o leucocitos usando un compuesto de union que se une a todos los globulos blancos es util tanto en el analisis de celulas mediante, por ejemplo, citometna de flujo y microscopfa, como en el 10 enriquecimiento o separacion de globulos blancos de, por ejemplo, sangre entera. Normalmente, se usa un anticuerpo que se une espedficamente a una protema de la superficie celular que es expresada por todos los WBC, tal como CD45. CD45 (tambien conocido como antfgeno comun leucocitario, GP180 o T200) se encuentra en todas las celulas hematopoyeticas excepto en las de origen de globulos rojos.
Para el analisis celular, un anticuerpo anti-CD45 se marca con un marcador detectable, p. ej., un colorante 15 fluorescente, para facilitar la deteccion de las celulas. Los anticuerpos se mezclan con la muestra que contiene globulos blancos, de modo que las celulas se marquen fluorescentemente a traves de la union del anticuerpo al marcador de la superficie celular. A continuacion, las celulas marcadas se pueden identificar y enumerar usando un instrumento, tal como un citometro de flujo o un microscopio. Los anticuerpos anti-CD45 marcados con colorante estan disponibles comercialmente de, por ejemplo, BD Biosciences (San Jose, CA). Para el enriquecimiento o la 20 separacion, el anticuerpo anti-CD45 normalmente se conjuga a una superficie solida, tal como la superficie de partfculas magneticas. Las partfculas magneticas conjugadas a anticuerpo se mezclan con la muestra que contiene globulos blancos, de modo que las celulas se marquen magneticamente a traves de union del anticuerpo al marcador de la superficie celular. Las celulas marcadas magneticamente se pueden concentrar al poner la muestra en un campo magnetico.
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Normalmente, las celulas marcadas magneticamente se lavan para separar las celulas de la muestra. Las nanopartfculas magneticas conjugadas a anticuerpos anti-CD45 estan disponibles comercialmente, por ejemplo, de BD Biosciences (San Jose, CA). B. Jahrsdorfer, y cols. 2005. J. Immun. Method. 297: 259-263 describen un estudio que demuestra que los oligodesoxinucleotidos de fosforotioato (PS-ODN) suprimen la union no espedfica de 30 conjugados de anticuerpos monoclonales basados en Cy5, incluyendo los que contienen PE-Cy5 y Cy5 solo, a monocitos y macrofagos. Esta supresion parece estar mediada por la union de PS-ODN a CD64, bloqueando de ese modo la union de Cy5 a su receptor. Concluyen que PS-ODN se puede usar como un reactivo para prevenir la union no espedfica de inmunoconjugados basados en Cy5 a monocitos en ensayos de citometna de flujo. E. R. Kandimalla y cols. 2001. Bioorg. Med. Chem. 9: 807-813, describen oligonucleotidos de CpG y sus srntesis. Los 35 oligonucleotidos de CpG se usan como moleculas estimulantes para la activacion de ciertas celulas del sistema inmunitario.
Breve sumario de la invencion
Se hace referencia a la invencion en las reivindicaciones.
Breve descripcion de las diversas vistas de los dibujos
40 La figura 1 muestra esquematicamente un metodo para la modificacion y el marcaje de bases de citosina en PS- ODN con FITC.
La figura 2 muestra esquematicamente una reaccion para la modificacion y el marcaje del extremo 5' de PSODN con FITC.
La figura 3 muestra datos que demuestran la union de PS-ODN#2 a globulos blancos totales. Las subpoblaciones 45 leucocitarias de granulocitos, monocitos y linfocitos se marcan como G, M y L, respectivamente.
La figura 4 muestra datos que demuestran la union de PS-ODN#5 a globulos blancos totales. Las subpoblaciones leucocitarias de granulocitos, monocitos y linfocitos se marcan como G, M y L, respectivamente.
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La figura 5 muestra datos procedentes de un analisis de celulas tenidas con FITC-PS-ODN#2 y CD19-PE-Cy7.
La figura 6 muestra datos procedentes de un analisis de celulas tenidas con FITC-PS-ODN#5 y CD19-PE-Cy7.
La figura 7 muestra datos que demuestran el enriquecimiento magnetico de globulos blancos procedentes de una muestra de sangre entera usando partfculas PS-ODN-IMag y separacion magnetica.
Descripcion detallada de la invencion
A fin de que la invencion descrita en la presente se pueda entender a fondo, un numero de terminos se definen explfcitamente, posteriormente. Los terminos no definidos explfcitamente estan destinados a tener su significado habitual en los campos de la microscopfa, la citometna, la inmunologfa y la biologfa, en general.
Los terminos globulos blancos y leucocitos se usan intercambiablemente en la presente. Por "sangre entera" se entiende una muestra fluida de sangre que se extrae en presencia de un anticoagulante de un mairnfero y posteriormente no se fracciona sustancialmente.
Un "reactivo de marcaje", segun se usa en la presente, se refiere a cualquier reactivo que comprenda un resto detectable y sea capaz de unirse a un analito de interes, p. ej., una celula, para obtener un analito marcado. Normalmente, una reaccion de deteccion de la presente invencion comprendera un PS-ODN conjugado a un marcador detectable, tal como un colorante fluorescente. La union de un PS-ODN unido a colorante a leucocitos da como resultado que los leucocitos se marquen con el colorante.
Un "reactivo de captura", segun se usa en la presente, se refiere a cualquier reactivo que sea capaz de unirse a un analito de interes, p. ej., una celula, y que bien se una a, o bien sea capaz de unirse a, una superficie solida. Normalmente, una reaccion de deteccion de la presente invencion comprendera un PS-ODN conjugado a una superficie solida. La union de un PS-ODN unido a colorante a leucocitos da como resultado que los leucocitos se inmovilicen sobre la superficie solida.
La presente invencion implica usar reactivos de marcaje y captura que comprenden oligonucleotidos de fosforotioato (PS-ODN). Los PS-ODN de esta invencion se pueden unir a todos los globulos blancos (leucocitos) de un modo indiscriminado, y permiten el marcaje, la captura o la concentracion de leucocitos de un modo que conserven la integridad antigenica de las celulas. Las partfculas o los colorantes se pueden conjugar directamente al PS-ODN o, preferiblemente, se conjugan al PS-ODN a traves de un conector. La presente invencion proporciona metodos para capturar, enriquecer o concentrar leucocitos, que comprenden las etapas de poner en contacto un fluido que contiene leucocitos con PS-ODN unido a una superficie solida bajo condiciones tales que los leucocitos se unan al PS-ODN y de ese modo sean capturados por la superficie solida. Preferiblemente, los leucocitos capturados en la superficie se separan del fluido para un analisis o uso adicional. Un analisis o uso adicional puede comprender poner en contacto los leucocitos capturados con inmunoconjugados monodticos. El uso de reactivos de captura unidos superficialmente, en general, para capturar, enriquecer o concentrar celulas es muy conocido en la tecnica. Los reactivos de captura son adecuados para el uso en cualquiera de estos metodos conocidos. La presente invencion tambien implica usar reactivos para el enriquecimiento o la separacion magnetica de leucocitos. Los reactivos pueden comprender una partfcula magneticamente sensible conjugada a oligonucleotidos de fosforotioato (PS- ODN).
La partfcula o el reactivo de captura magneticamente sensible se puede conjugar directamente al PS-ODN o, preferiblemente, se puede conjugar al PS-ODN a traves de un conector. La presente invencion proporciona metodos para enriquecer magneticamente leucocitos, que comprenden las etapas de anadir partfculas magneticas conjugadas a PS-ODN a un fluido que contiene leucocitos bajo condiciones tales que las partfculas magneticas conjugadas a PS-ODN se unan a los leucocitos, y aplicar un campo magnetico a leucocitos marcados magneticamente localizados.
Preferiblemente, los leucocitos magneticamente marcados o capturados se separan del fluido para un analisis o un uso adicional. En algunas realizaciones, el analisis o uso adicional de las celulas concentradas o capturadas puede comprender unir las celulas concentradas o separadas a cualesquiera inmunoconjugados leucocfticos conocidos tales como un granulocito, un monocito o un linfocito (p. ej. anti-CD 19, anti-CD56, anti-CD 19, anti-CD 20, anti-CD 8, anti-CD 4, anti-CD 33, anti-CD 45 etc.). Los metodos de esta invencion proporcionan beneficiosamente la concentracion o la separacion de leucocitos mientras que conservan la especificidad antigenica hacia marcadores de interes.
Oligonucleotidos de fosforotioato (PS-ODN)
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Los oligonucleotidos de fosforotioato (PS-ODN) y sus smtesis se han descrito en la bibliograffa. Por ejemplo, veanse las Patentes de EE. UU. N° 5.644.048 y 5.571.902, y Jahrsdorfer y cols., 2005, J. Immun. Method. 297: 259-263. Los metodos de smtesis descritos en estas referencias son adecuados para el uso en la generacion de los PS-ODN de la presente invencion.
Las moleculas de PS-ODN de cualquier longitud pueden ser adecuadas para el uso como reactivos de deteccion o captura en la presente invencion. Preferiblemente, la longitud puede estar entre 15 y 30, mas preferiblemente entre 15 y 25, nucleotidos de longitud. Estudios previos sobre diferentes secuencias de PS-ODN (Tabla 1) sugenan que la especificidad de la secuencia no es un factor determinante o requisito previo para la union a globulos blancos, asf, cualquier secuencia de PS-ODN de cualquier longitud se puede incorporar en los metodos y los reactivos. Los reactivos de PS-ODN pueden tener uno o mas enlaces fosforotioato en combinacion con uno o mas enlaces fosfato convencionales. En una realizacion preferida, el PS-ODN comprende una secuencia seleccionada de ODN#1, ODN#2, ODN#3, ODN#4 y ODN#5, mostrados en la Tabla 1, posteriormente. En realizaciones mas preferidas, el PS-ODN se selecciona de ODN#1, ODN#2, ODN#3, ODN#4 y ODN#5, mostrados en la Tabla 1, posteriormente. Mas preferiblemente, el PS-ODN es bien ODN#2 o bien ODN#5.
Tabla 1
El asterisco (*) indica la union de fosforotioato entre nucleotidos.
ODN#1 t*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T ODN#2 t*0*0*t*0*0*t*t*t*t*0*t*0*0*t*t*t*t*0*t*0*0*t*t ODN#3 G*G*G*G*G*A*C*G*A*T*C*G*T*C*G*G*G*G*G*G ODN#4 G*G*G*G*G*A*G*C*A*T*G*C*T*G*G*G*G*G*G*G ODN#5 t*C*G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C
Sin limitarse por una teona, los datos sugieren que los PS-ODN se unen a carbohidratos y protemas sobre la superficie celular de un modo no espedfico, y que la presencia de tiol en el esqueleto de fosfodiester del PS-ODN esta implicada en la union no espedfica a la superficie celular. Comparaciones de diferentes secuencias de PS-ODN (Tabla 1) sugieren que la especificidad de secuencia no es un factor determinante o un requisito previo para la union a globulos blancos. Segun se describe en los ejemplos, posteriormente, los PS-ODN marcados con fluorescema se unen a globulos blancos totales, incluyendo linfocitos, monocitos y granulocitos, indiscriminadamente. El uso de PS- ODN marcados en el extremo 5' o en las bases de citosina proporcionaba resultados equivalentes, lo que indica que ni el extremo 5' ni las bases de citosina son cnticos para la union de PS-ODN a la superficie celular de globulos blancos.
Reactivos de deteccion
Los reactivos de deteccion fluorescentes comprenden PS-ODN conjugado a un marcador detectable, tal como un colorante fluorescente (fluoroforo). Los colorantes fluorescentes (fluoroforos) adecuados para el uso en la presente invencion se pueden seleccionar de cualquiera de los muchos colorantes adecuados para el uso en ensayos biologicos, incluyendo citometna de flujo y aplicaciones de obtencion de imagenes. Sin embargo, la invencion no se limita al uso de colorantes fluorescentes, y se puede usar cualquiera de los reactivos de deteccion utiles en un metodo de analisis optico que se unan al analito de interes y permitan la deteccion optica, tales como nanopartmulas detectables mediante dispersion Raman mejorada superficialmente (SERS).
Los colorantes fluorescentes son conocidos por los expertos en la tecnica y estan disponibles comercialmente de un numero de fuentes. Colorantes fluorescentes adecuados incluyen, pero no se limitan a, ficoeritrina ("PE"), isotiocianato de fluorescema ("FITC"), aloficocianina ("APC"), Texas Red ("TR", Molecular Probes, Inc.), complejo de peridinina-clorofila ("PerCp"), CY5 (Biological Detection System) y conjugados de los mismos con PE (p. ej., PE/CY5, PE/APC y PE/TR); etc. Un gran numero de colorantes esta disponible comercialmente de una variedad de fuentes, tales como, por ejemplo, Molecular Probes (Eugene, OR) y Exciton (Dayton, OH). Los reactivos de deteccion se pueden conjugar a PS-ODN usando cualquiera de un numero de metodos muy conocidos para conjugar marcadores a oligonucleotidos. Dos reacciones de conjugacion preferidas se muestran en las figuras 1 y 2.
Reactivos de captura
Los reactivos de captura comprenden un oligonucleotido de fosforotioato (PSODN) conjugado a una superficie solida, o capaz de ser unido a una superficie solida. Se puede usar una amplia gama de superficies solidas en la presente invencion, incluyendo, por ejemplo, cuentas, placas, portaobjetos, columnas, canales microflmdicos, etc. La superficie solida se puede conjugar directamente al PS-ODN o, preferiblemente, se conjuga al PS-ODN a traves de un conector. Son muy conocidos en la tecnica metodos para conjugar acidos nucleicos a una superficie solida. Alternativamente, el PS-ODN se puede unir a un miembro de un par de union, y la superficie solida unirse al otro miembro del par de union, de modo que la union del PS-ODN a la superficie solida se pueda llevar a cabo despues de la union del PS-ODN a la celula. Ejemplos de pares de union que son adecuados para unir el PS-ODN a la
superficie solida son muy conocidos en la tecnica e incluyen, por ejemplo, un anticuerpo y sus pares de antigeno elegidos como diana, y estreptavidina y biotina.
Reactivo de captura magnetico 5
Los reactivos de captura magneticos son partfculas magneticas unidas a PSODN. Segun se usa en la presente, "partfculas magneticas" se refiere a cualquier partfcula que contenga un material magnetico o magneticamente sensible. Las partfculas magneticas pueden ser de cualquier conformacion, pero normalmente son aproximadamente esfericas ("microesferas"). Las partfculas magneticas adecuadas para el uso en la presente 10 invencion tienen preferiblemente un diametro en el intervalo de nanometros a micrometros, normalmente aproximadamente de 0,01 a 50 pm de diametro, preferiblemente de aproximadamente 0,1 a 10 pm, mas preferiblemente de aproximadamente 0,2 a 0,4 pm. Preferiblemente, las partfculas magneticas son paramagneticas o superparamagneticas. Las partfculas magneticas adecuadas para el uso en la presente invencion estan disponibles comercialmente de un numero de fuentes, incluyendo, pero no limitadas a, BD Biosciences (San Jose, 15 CA), Invitrogen (Carlsbad, CA), Miltenyi Biotech (Bergisch Gladbach, Alemania) y Polysciences (Warrington, PA). En general, las partfculas magneticas vendidas para el uso en ensayos de separacion celular son adecuadas para el uso en la presente invencion. La conjugacion de las partfculas magneticas a PS-ODN se puede llevar a cabo usando cualquiera de un numero de metodos muy conocidos para conjugar oligonucleotidos a partfculas magneticas. Las partfculas magneticas estan disponibles comercialmente con grupos superficiales reactivos adecuados para el uso 20 en la conjugacion a oligonucleotidos. Alternativamente, como con otras superficie solidas, el PS-ODN se puede unir a un miembro de un par de union, y la partfcula magnetica se puede unir al otro miembro del par de union, de modo que la union del PS-ODN a la partfcula magnetica se pueda llevar a cabo despues de la union del PS-ODN a la celula.
Ejemplos
25 Los siguientes ejemplos se indican a fin de proporcionar a los expertos normales en la tecnica una divulgacion y descripcion completas de como elaborar y usar la presente invencion, y no estan destinados a limitar el alcance de lo que los inventores consideran su invencion ni estan destinados a representar que los experimentos posteriores sean todos o cada uno de los experimentos realizados.
Ejemplo 1
30 Union de PS-ODN#2 a globulos blancos totales.
Se sintetizaron PS-ODN#2 marcados con FITC, conjugados a residuos de citosina, como se muestra en la figura 1. Se incubaron muestras de sangre de 50 pl con 5 pg bien de PS-ODN#5 no marcado o bien de FITC-PS-ODN#2 durante 30 minutos, seguido por tratamiento con solucion de lisis BD FACS™. Las celulas se centrifugaron, se lavaron y se analizaron en un citometro de flujo. Los datos se muestran en la figura 3.
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Los resultados muestran que los PS-ODN#2 marcados con FITC se unen a las tres poblaciones de globulos blancos (linfocitos, monocitos y granulocitos), es decir, todos los globulos blancos. Los resultados muestran ademas que los PS-ODN se pueden marcar con FITC en el extremo 5' o en las bases de citosina (figura 1 y 2). Estas modificaciones (marcaje con FITC) bien en el extremo 5' o bien en las bases de citosina no suprimen la capacidad de los PS-ODN 40 para unirse a la superficie celular (mostrado en la figura 3 y 4) donde los PS-ODN marcados se unen a las tres poblaciones de globulos blancos.
Ejemplo 2
Union de PS-ODN#5 a globulos blancos totales.
Se sintetizaron PS-ODN#5 marcados con FITC en el extremo 5', como se muestra en la figura 2. Se incubaron 45 muestras de sangre de 50 pl con 5 pg bien de PS-ODN#5 no marcado o bien de FITC-PS-ODN#5 durante 30 minutos, seguido por tratamiento con solucion de lisis BD FACS™. Las celulas se centrifugaron, se lavaron y se analizaron en un citometro de flujo. Los datos se muestran en la figura 4. Los resultados muestran que los PS- ODN#5 marcados con FITC se unen a las tres poblaciones de globulos blancos (linfocitos, monocitos y granulocitos), es decir, todos los globulos blancos. Los resultados muestran ademas que los PS-ODN se pueden marcar con FITC 50 en el extremo 5' o en las bases de citosina (figura 1 y 2). Estas modificaciones (marcaje con FITC) bien en el extremo 5' o bien en las bases de citosina no suprimen la capacidad de los PS-ODN para unirse a la superficie celular (mostrado en la figura 3 y 4) donde los PS-ODN marcados se unen a las tres poblaciones de globulos blancos.
Ejemplo 3
Tincion de celulas con FITC-PS-ODN#2 y CD19-PE-Cy7.
Una muestra de sangre de 50 |jl se incubo con 5 |jg de FITC-PS-ODN#2 y 150 ng de anti-CD19-PECy7 durante 30 minutes, seguido por tratamiento con solucion de lisis BD FACS™. Las celulas se centrifugaron, se lavaron y se 5 analizaron en un citometro de flujo. Los datos se muestran en la figura 5. Los dates indican que el PS-ODN marcado
se une a todos los globulos blancos. Por otra parte, la union del PS-ODN marcado no enmascara al antigeno espedfico sobre la superficie celular, segun se muestra por la tincion de las celulas usando un anticuerpo espedfico para CD 19 marcado. Asf, la union de PS-ODN a la superficie celular proporciona un metodo para tenir celulas que mantiene la integridad antigenica de las celulas.
10 Ejemplo 4
Tincion de celulas con FITC-PS-ODN#5 y CD19-PE-Cy7.
Una muestra de sangre de 50 jl se incubo con 5 jg de FITC-PS-ODN#5 y 150 ng de anti-CD19-PE5Cy7 durante 30 minutos, seguido por tratamiento con solucion de lisis BD FACS™. Las celulas se centrifugaron, se lavaron y se analizaron en un citometro de flujo. Los datos se muestran en la figura 6. Los datos indican que el PS-ODN marcado 15 se une a todos los globulos blancos. Por otra parte, la union del PS-ODN marcado no enmascara al antfgeno
espedfico sobre la superficie celular, segun se muestra por la tincion de las celulas usando un anticuerpo espedfico para CD 19 marcado.
Ejemplo 5
Separacion magnetica de globulos blancos totales con PS-ODN-IMag.
20 Se conjugaron partteulas magneticas (partteulas magneticas BD IMag, BD Biosciences, San Jose, CA) a PS-ODN#5. Una muestra de 50 jl de sangre entera se incubo con 32 jg de Fe de partteulas magneticas conjugadas a PS- ODN#5 durante 30 minutos, seguido por tratamiento con solucion de lisis BD FACS™. Las celulas se separaron magneticamente usando un iman de separacion de celulas BD IMagnet™ (BD Biosciences, San Jose, CA), se lavaron y se analizaron en un citometro de flujo. Como un control, una muestra de celulas no tratadas se analizo 25 mediante un citometro de flujo. Los datos se presentan en la figura 7.
Los resultados muestran que pueden usarse partteulas magneticas conjugadas a PS-ODN para enriquecer o separar globulos blancos mediante cualquier metodo de separacion (p. ej., separacion magnetica). Una ventaja de los presentes metodos es que los marcadores de la superficie celular se dejan intactos para el marcaje y el analisis 30 de anticuerpos.
Claims (8)
- 510152025REIVINDICACIONES1. Un metodo para marcar indiscriminadamente leucocitos en una muestra fluida de sangre entera, que comprende la etapa de anadir un oligonucleotido de fosforotioato conjugado a dicha muestra bajo condiciones tales que el oligonucleotido de fosforotioato conjugado se una a los leucocitos.
- 2. El metodo segun la reivindicacion 1, que comprende ademas anadir un inmunoconjugado a la muestra bajo condiciones tales que el inmunoconjugado se una a los leucocitos.
- 3. El metodo segun la reivindicacion 1 o 2, en el que el oligonucleotido de fosforotioato conjugado se conjuga a un colorante fluorescente, o en el que el oligonucleotido de fosforotioato conjugado se conjuga a un reactivo de captura, preferiblemente en donde el reactivo de captura es magnetico.
- 4. El metodo segun la reivindicacion 3, que comprende ademas colocar la muestra en un campo magnetico de modo que los leucocitos unidos a los reactivos de captura magneticos se concentren.
- 5. El metodo segun la reivindicacion 4, que comprende ademas anadir un inmunoconjugado a los leucocitos concentrados bajo condiciones tales que el inmunoconjugado se una a los leucocitos, preferiblemente en donde el inmunoconjugado es un anticuerpo anti-CD19.
- 6. El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el oligonucleotido de fosforotioato tiene entre 15 y 25 nucleotidos de longitud.
- 7. El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el oligonucleotido de fosforotioato (PS- ODN) comprende una secuencia seleccionada de los Ps-ODN que consisten en ODN#1, ODN#2, ODN#3, ODN#4, y ODN#5, mostrados en la Tabla 1.
- 8. Una muestra de sangre entera que contiene leucocitos marcados indiscriminadamente obtenibles segun cualquiera de las reivindicaciones 1-7.
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