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ES2638342T3 - Viriones de virus adenoasociado con cápside variante y métodos para su uso - Google Patents

Viriones de virus adenoasociado con cápside variante y métodos para su uso Download PDF

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Publication number
ES2638342T3
ES2638342T3 ES12774323.5T ES12774323T ES2638342T3 ES 2638342 T3 ES2638342 T3 ES 2638342T3 ES 12774323 T ES12774323 T ES 12774323T ES 2638342 T3 ES2638342 T3 ES 2638342T3
Authority
ES
Spain
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seq
vaa
cell
amino acids
virion
Prior art date
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Active
Application number
ES12774323.5T
Other languages
English (en)
Inventor
David V. Schaffer
Ryan R. Klimczak
James T. Koerber
John G. Flannery
Deniz DALKARA MOUROT
Meike VISEL
Leah C.T. BYRNE
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of California
Original Assignee
University of California
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by University of California filed Critical University of California
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Abstract

Un virión de virus adenoasociado recombinante (VAAr), o una composición farmacéutica que comprende dicho virión, para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad ocular en un individuo que lo necesite, en donde la composición comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable y en donde el virión del virus adenoasociado recombinante (VAAr) comprende: a) una proteína de la cápside de VAA variante, en donde la proteína de la cápside de VAA variante comprende una inserción de un péptido en el bucle GH de la proteína de la cápside en relación con una correspondiente proteína de la cápside de VAA parental, en donde la inserción comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de LGETTRP (SEQ ID NO:13), NETITRP (SEQ ID NO:14), KAGQANN (SEQ ID NO:15), KDPKTTN (SEQ ID NO:16), KDTDTTR (SEQ ID NO:57), RAGGSVG (SEQ ID NO:58), AVDTTKF (SEQ ID NO:59) y STGKVPN (SEQ ID NO:60); y b) un ácido nucleico heterólogo que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un producto génico; en donde la proteína de la cápside variante infecta una célula retiniana.

Description

imagen1
DESCRIPCIÓN
Viriones de virus adenoasociado con cápside variante y métodos para su uso
5 Declaración según la investigación federalmente financiada
Esta invención se realizó con apoyo del gobierno bajo las subvenciones Nº EY016994-02 y EY1018241 otorgadas por el “National Eye Institute of the National Institutes of Health”. El gobierno tiene ciertos derechos en la invención.
Antecedentes
Los fotorreceptores son las primeras neuronas en la retina para recibir y procesar la información visual, convirtiendo la radiación electromagnética visible en respuestas hiperpolarizadas a través de fototransducción. La mayoría aplastante de enfermedades de la retina hereditarias dan como resultado la pérdida de estas células, o bien
15 directamente, tal como en mutaciones dominantes que afectan al plegamiento de la proteína rodopsina, o indirectamente, tal como en mutaciones recesivas que afectan a las rutas de reciclado de la retina en el epitelio pigmentario de la retina (EPR).
VAA pertenece a la familia Parvoviridae y al género Dependovirus, cuyos miembros requieren infección conjunta con un virus auxiliar tal como adenovirus para fomentar la replicación, VAA establece una infección latente en ausencia de un auxiliar. Los viriones están compuestos de una cápside icosaédrica de 25 nm que rodea un genoma de ADN de cadena sencilla de 4,9 kb con dos marcos de lectura abiertos; rep y cap. El gen rep no estructural codifica cuatro proteínas reguladoras esenciales para la replicación vírica, mientras que cap codifica tres proteínas estructurales (VP1-3) que se ensamblan en una cubierta de la cápside 60-mer. Esta cápside viral media la capacidad de los
25 vectores de VAA de superar muchas de las barreras biológicas de la transducción viral incluyendo unión a receptor superficial celular, endocitosis, tráfico intracelular, y desempaquetamiento en el núcleo.
Bibliografía
Publicación de Patente americana Nº 2005/0053922; Publicación de Patente americana Nº 2009/0202490; Allocca y col. (2007) J. Virol. 81:11.372; Boucas y col. (2009) J. Gene Med. 11:1.103. Los viriones de VAA se describieron en el documento WO 2010/093784; Petrs-Silva y col., Molecular Therapy, vol. 17, nº 3, marzo 2009 páginas 463-471; Park y col., Gene Therapy, vol. 16 nº 7, julio 2009, páginas 916-926; y Watanabe y col., PLoS ONE, 8 (1), e54146 (2013).
35
Compendio de la invención
La presente invención proporciona un virión de virus adenoasociado recombinante (VAAr), o una composición farmacéutica que comprende dicho virión, para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad ocular en un individuo que lo necesite, en donde la composición comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable, y en el que el virión de virus adenoasociado recombinante comprende: a) una proteína de la cápside de VAA variante, en el que la proteína de la cápside de VAA variante comprende una inserción de un péptido en el bucle GH de la proteína de la cápside en relación con una correspondiente proteína de la cápside de VAA parental, en el que la inserción comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de LGETTRP (SEQ ID NO:13), NETITRP (SEQ ID NO:14),
45 KAGQANN (SEQ ID NO:15), KDPKTTN (SEQ ID NO: 16), KDTDTTR (SEQ ID NO:57), RAGGSVG (SEQ ID NO:58), AVDTTKF (SEQ ID NO:59), y STGKVPN (SEQ ID NO:60); y b) un ácido nucleico heterólogo que comprende una secuencia de nucleótidos codificante de un producto génico; en el que la proteína de la cápside variante infecta una célula retiniana.
La presente descripción también presenta un número de otras realizaciones tratadas más adelante en el presente documento. Estas realizaciones de la descripción se proporcionan a modo de referencia a la presente invención, cuyo alcance se define en las reivindicaciones adjuntas.
Breve descripción de los dibujos
55 La Figura 1 proporciona un modelo tridimensional representativo de VAA2 que contiene un heptámero aleatorio después del aminoácido 587. La Figura 2 representa niveles mayores de transducción intravítrea por la variante 7M8 de VAA2 (derecha), en relación con VAA2 (izquierda). La Figura 3 proporciona imágenes de fluorescencia representativas de criocortes de la retina que muestran la expresión de la proteína verde fluorescente (GFP) que resulta de 7M8 que lleva el gen GFP bajo el control del promotor CAG ubicuo (izquierda) o un promotor de Rho específico a fotorreceptor (derecha). La Figura 4 representa células fotorreceptoras GFP+ por millón de células retinianas contadas por citometría de flujo, después de transducción por 7M8 o por 7M8 que porta 4 mutaciones de tirosina (7m8.4YF).
65 La Figura 5 proporciona una secuencia de aminoácidos de VP1 de VAA2 (SEQ ID NO:1). La Figura 6 proporciona secuencias de aminoácidos que corresponden a los aminoácidos 570 a 610 de VAA2
imagen2
(Figura 5) de la proteína VP1 de la cápside de VAA de diversos serotipos de VAA. Las Figuras 7A-I representan mejoras estructurales en la retina de ratón Rslh-/-después de la transferencia génica. Las Figuras 8A-D representan rescate funcional de las ondas A y B de electroretinograma después de la
5 administración del gen de RS1. Las Figuras 9A-E representan mejoras constantes en el grosor de la retina medido a los 10 meses después del tratamiento con 7m8-rho-RS1. La Figura 10 proporciona una secuencia de aminoácidos de retinosquisina. La Figura 11 proporciona una secuencia de aminoácidos del factor neurotrófico derivado del cerebro.
10 La Figura 12 proporciona una secuencia de aminoácidos de EPR65. Las Figuras 13A-C proporcionan la secuencia de nucleótidos de la construcción 7m8-rho-RS1. La Figura 14 proporciona una secuencia de aminoácidos de periferina-2. La Figura 15 proporciona una secuencia de aminoácidos de periferina. La Figura 16 proporciona una secuencia de aminoácidos de la proteína 1 que interactúa con el regulador de la
15 GTPasa de la retinitis pigmentosa. Las Figuras 17A-C proporcionan un alineamiento de secuencias de aminoácidos de regiones de bucle IV (bucle GH) de la proteína de la cápside de VAA. Los sitios de inserción se muestran en negrita y subrayados. Las Figuras 18A-C proporcionan un alineamiento de secuencias de aminoácidos de regiones de bucle GH de la proteína de la cápside de VAA, con inserciones peptídicas heterólogas.
20 La Figura 19 proporciona una imagen de fluorescencia del fondo que muestra la expresión de GFP en retina central de primate 9 semanas después de la administración de 7m8 que lleva GFP bajo el control de un promotor de conexina 36.
Definiciones
25 En el presente documento el término “célula retiniana” puede referirse a cualquiera de los tipos celulares que comprenden la retina, tales como células ganglionares de la retina, células amacrinas, células horizontales, células bipolares y células fotorreceptoras incluyendo los bastones y conos, células gliales de Müller, y epitelio pigmentario de la retina.
30 “VAA” es una abreviación para virus adenoasociado, y se puede usar para referirse al propio virus o a sus derivados. El término cubre todos los subtipos y tanto formas de origen natural como recombinantes, excepto cuando se requiere otra cosa. La abreviación “VAAr” se refiere a virus adenoasociado recombinante, también se refiere a un vector de VAA recombinante (o “vector de VAAr”). El término “VAA” incluye VAA tipo 1 (VAA-1), VAA tipo 2 (VAA-2),
35 VAA tipo 3 (VAA-3), VAA tipo 4 (VAA-4), VAA tipo 5 (VAA-5), VAA tipo 6 (VAA-6), VAA tipo 7 (VAA-7), VAA tipo 8 (VAA-8), VAA aviar, VAA bovino, VAA canino, VAA equino, VAA primate, VAA no primate y VAA ovino. “VAA primate” se refiere a VAA que infecta primates, “VAA no primate” se refiere a VAA que infecta mamíferos no primates, “VAA bovino” se refiere a VAA que infecta animales bovinos, etc.
40 Las secuencias genómicas de diversos serotipos de VAA, así como las secuencias de las repeticiones terminales (RT) nativas, proteínas Rep, y subunidades de la cápside son conocidas en la técnica. Tales secuencias se pueden encontrar en la bibliografía o en bases de datos públicas tales como GenBank. Véase, por ejemplo, Números de acceso GenBank NC_002077 (VAA-1), AF063497 (VAA-1), NC_001401 (VAA-2), AF043303 (VAA-2), NC_001729 (VAA-3), NC_001829 (VAA-4), U89790 (VAA-4), NC_006152 (VAA-5), AF513851 (VAA-7), AF513852 (VAA-8), y
45 NC_006261 (VAA-8); cuyas descripciones enseñan secuencias de ácidos nucleicos de VAA y de aminoácidos. Véase también, por ejemplo, Srivistava y col. (1983) J. Virology 45:555; Chiorini y col. (1998) J. Virology 71:6.823; Chiorini y col. (1999) J. Virology 73:1.309; Bantel-Schaal y col. (1999) J. Virology 73:939; Xiao y col. (1999) J. Virology 73:3.994; Muramatsu y col. (1996) Virology 221:208; Shade y col., (1986) J. Virol. 58:921; Gao y col. (2002) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 99:1.1854; Moris y col. (2004) Virology 33:375-383; publicaciones de patente internacional
50 WO 00/28061, WO 99/61601, WO 98/11244; y documento de Patente americana Nº 6.156.303.
El “vector de VAAr” usado en el presente documento se refiere a un vector de VAA que comprende una secuencia de polinucléotidos no de origen VAA (es decir, un polinucleótido heterólogo a VAA), generalmente una secuencia de interés para la transformación genética de una célula. En general, el polinucleótido heterólogo está flanqueado por al
55 menos una, y generalmente por dos, secuencias de repetición terminal invertida (RT) de VAA. El término vector de VAAr abarca tanto partículas de vector de VAAr como plásmidos de vector de VAAr. Un vector de VAAr puede ser o bien de cadena sencilla (VAAcs) o autocomplementario (VAAac).
Un “virus VAA” o “partícula vírica VAA” o “partícula vector de VAAr” se refiere a una partícula viral compuesta de al
60 menos una proteína de la cápside de VAA (generalmente por todas las proteínas de la cápside de un VAA tipo natural) y un vector de VAAr de polinucleótido sometido a encapsidación. Si la partícula comprende un polinucleótido heterólogo (es decir, un polinucleótido distinto de un genoma de VAA de tipo natural tal como un transgen a administrar a una célula mamífera), generalmente se refiere a una “partícula vector de VAAr” o simplemente un “vector de VAAr”. Por tanto, la producción de partícula de VAAr necesariamente incluye la producción del vector de
65 VAAr, ya que tal vector está contenido dentro de una partícula de VAAr.
imagen3
“Empaquetamiento” se refiere a una serie de sucesos intracelulares que dan como resultado el ensamblaje y la encapsidación de una partícula de VAA.
Los genes “rep”y“cap” de VAA se refieren a secuencias de polinucleótidos codificantes de proteínas de replicación 5 y encapsidación de virus adenoasocidados. En el presente documento rep y cap de VAA se refieren como “genes de empaquetamiento” de VAA.
Un “virus auxiliar” para VAA se refiere a un virus que permite que VAA (por ejemplo, VAA de tipo natural) sea replicado y empaquetado por una célula mamífera. En la técnica se conocen una gran diversidad de tales virus auxiliares para VAA, incluyendo adenovirus, herpesvirus y poxvirus tales como vaccinia. El adenovirus abarca un número de diferentes subgrupos, aunque se usa más comúnmente el Adenovirus tipo 5 del subgrupo C. Se conocen numerosos adenovirus de origen humano, mamífero no humano y aviar y están disponibles en depósitos tales como ATCC. Los virus de la familia herpes incluyen, por ejemplo, virus del herpes simple (VHS) y virus de Epstein-Barr (VEB), así como citomegalovirus (CMV) y virus de la pseudorrabia (VPR); los cuales están también disponibles en
15 depósitos tales como ATCC.
“Función(es) del virus auxiliar” se refiere a la(s) función(es) codificada(s) en un genoma de virus auxiliar que permite la replicación y empaquetamiento de VAA (junto con otros requerimientos para la replicación y empaquetamiento descritos en el presente documento). Tal como se describe en el presente documento, “función del virus auxiliar” se puede proporcionar en un número de modos, incluyendo proporcionando virus auxiliar o proporcionando, por ejemplo, secuencias de polinucleótidos codificantes de la(s) función(es) requisito(s) para una célula productora en trans. Por ejemplo, un plásmido u otro vector de expresión que comprende secuencias de nucleótidos codificantes de una o más proteínas adenovíricas se somete a transfección en una célula productora junto con un vector de VAAr.
25 Un virus o partícula viral “infecciosa” es uno que comprende una cápside viral competentemente ensamblada y es capaz de administrar un componente de polinucléotido en una célula para la cual la especie viral es trópica. El término no necesariamente implica cualquier capacidad de replicación del virus. Los ensayos para recuento de partículas virales infecciosas se describen en otra parte en esta descripción y en la técnica. La infección viral se puede expresar como la relación de partículas virales infecciosas y partículas virales totales. En la técnica se conocen métodos de determinación de la relación de partícula viral infecciosa y partícula viral total. Véase, por ejemplo, Grainger y col. (2005) Mol. Ther. 11:S337 (que describe un ensayo de titulación infecciosa de TCID50); y Zolotukhin y col. (1999) Gene Ther. 6:973. Véanse también los Ejemplos.
35 Un virus “competente para replicación” (por ejemplo, VAA competente para replicación) se refiere a un virus fenotípicamente de tipo natural que es infeccioso, y también es capaz de ser replicado en una célula infectada (es decir, en presencia de un virus auxiliar o funciones de virus auxiliar). En el caso de VAA, la competencia de replicación generalmente requiere la presencia de genes funcionales de empaquetamiento de VAA. En general, los vectores de VAAr descritos en el presente documento son incompetentes para replicación en células mamíferas (especialmente en células humanas) debido a la falta de uno o más genes de empaquetamiento de VAA. Generalmente, tales vectores de VAAr carecen de alguna secuencia de gen de empaquetamiento de VAA para minimizar la posibilidad de que el VAA competente para replicación se genere por recombinación entre genes de empaquetamiento de VAA y un vector de VAAr entrante. En muchas realizaciones, las preparaciones del vector de VAAr descritas en el presente documento son aquellas que contienen pocos si algún VAA competente para
45 replicación (VAAcr, también se refiere como RCA) (por ejemplo, menos de aproximadamente 1 VAAcr por 102 partículas de VAAr, menos de aproximadamente 1 VAAcr por 104 partículas de VAAr, menos de aproximadamente 1 VAAcr por 108 partículas de VAAr, menos de aproximadamente 1 VAAcr por 1012 partículas de VAAr, o no VAAcr).
El término “polinucleótido” se refiere a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, incluyendo desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, o análogos de los mismos. Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados, tales como nucleótidos metilados y análogos de nucleótido, y se pueden interrumpir por componentes no nucleótidos. Si está presente, se pueden impartir modificaciones a la estructura de nucleótidos antes o después del ensamblaje del polímero. El término polinucléotido, como se usa en el presente documento, se refiere intercambiablemente a moléculas de cadena doble y sencilla. A menos que se especifique o requiera lo
55 contrario, cualquier realización de la invención descrita en el presente documento que es un polinucleótido abarca tanto la forma de doble cadena como cada una de las dos formas complementarias de cadena sencilla conocidas o previstas para componer la forma de doble cadena.
Las reacciones de hibridación del ácido nucleico se pueden realizar bajo condiciones de diferente “rigor”. Condiciones que incrementan el rigor de una reacción de hibridación se conocen ampliamente y están publicadas en la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook y col. “Molecular Clowning, A Laboratory Manual”, 2º Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989. Por ejemplo, véase la página 7.52 de Sambrook y col. Ejemplos de condiciones relevantes incluyen (en orden de rigor creciente): temperaturas de incubación de 25 ºC, 37 ºC, 50 ºC y 68 ºC; concentraciones tampón de 10xSCC, 6xSSC, 1xSSC, 0,1xSSC (donde 1xSCC es NaCl 0,15 M y 65 tampón citrato 15 mM) y sus equivalentes usando otro sistemas tampón; concentraciones de formamida de 0 %, 25 %, 50 %, y 75 %; tiempos de incubación desde 5 minutos a 24 horas; 1, 2 o más etapas de lavado; tiempos de incubación de lavado de 1, 2 o 15 minutos; y soluciones de lavado de 6xSSC, 1xSSC, 0.1xSSC, o agua desionizada. Un ejemplo de condiciones de hibridación rigurosa es la hibridación a 50 ºC o más y 0,1xSSC (cloruro de sodio 15 mM/citrato de sodio 1,5 mM). Otro ejemplo de condiciones de hibridación rigurosa es incubación durante la noche a 42 ºC en una solución: formamida al 50 %; 1xSSC (NaCl 150 mM, citrato de sodio 15 mM), fosfato de sodio 50 mM 5 (pH 7,6), 5x solución de Denhardt, sulfato de dextrano al 10 %, y 20 µg/ml de ADN de esperma de salmón partido desnaturalizado, seguido de lavado de los filtros en 0,1xSSC a aproximadamente 65 ºC. Como otro ejemplo, las condiciones de hibridación rigurosa comprenden: hibridación previa durante 8 horas durante la noche a 65 ºC en una solución que comprende 6x citrato de potencia sencilla (SSC) (1xSSC es NaCl 0,15 M, citrato de Na 0,015 M; pH 7,0), 5x solución de Denhardt, pirofosfato de sodio al 0,05 % y 100 µg/ml de ADN de esperma de arenque;
imagen4
10 hibridación durante 18 a 20 horas a 65 ºC en una solución que contiene 6xSSC, 1x solución de Denhardt, 100 µg/ml de ARNt de levadura y pirofosfato de sodio al 0,05 %; y lavado de los filtros a 65 ºC durante 1 h en una solución que contiene 0,2xSSC y SDS al 0,1 % (dodecil sulfato de sodio).
Condiciones de hibridación rigurosa son condiciones de hibridación que son al menos tan rigurosa como las 15 anteriores condiciones representativas. En la técnica se conocen otras condiciones de hibridación rigurosa y también se pueden emplear para identificar ácidos nucleicos de esta realización particular de la invención.
“Tm” es la temperatura en grados Celsius a la cual el 50 % de un polinucleótido bicatenario hecho de hidrógeno de cadenas complementarias unido en dirección antiparalela por emparejamiento de bases Watson-Crick se disocia en 20 cadenas sencillas bajo condiciones del experimento. Tm se puede predecir según una fórmula estándar, tal como:
Tm = 81,5 + 16,6 log[X+] + 0,41 (%G/C) -0,61 (%F) – 600/L
donde [X+] es la concentración catiónica (normalmente ion de sodio, Na+) en mol/l (%G/C) es el número de restos G 25 y C como porcentaje de restos totales en la doble cadena; (%F) es el porcentaje de formamida en solución (p/vol); y L es el número de nucleótidos en cada cadena de la doble cadena.
Un polinucléotido o polipéptido tiene un cierto porcentaje de “identidad de secuencia” a otro polinucleótido o polipéptido, significando que, cuando se alinean, ese porcentaje de bases o aminoácidos es el mismo cuando se 30 comparan las dos secuencias. La similitud de secuencia se puede determinar en un número de diferentes maneras. Para determinar la identidad de secuencia, las secuencias se pueden alinear usando los métodos y programas informáticos, incluyendo BLAST, disponibles en internet en ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/. Otro algoritmo de alineamiento es FASTA, disponible en los paquetes del “Genetics Computing Group” (GCG), de Madison, Wisconsin, USA, una sucursal completamente admitida del “Oxford Molecular Group”, Inc. Otras técnicas para alineamiento están 35 descritas en Methods in Enzymology, vol. 266: “Computer Methods for Macromolecular Sequence Analysis” (1996), ed. Doolittle, Academic Press, Inc., una división de Harcourt Brace & Co., San Diego, California, USA. Un interés particular son los programas de alineamiento que permiten huecos (gaps) en la secuencia. El Simth-Waterman es un tipo de algoritmo que permite huecos en alineamientos de secuencia. Véase Meth. Mol. Biol. 70:173-187 (1997). También, el programa GAP que usa el método de alineamiento de Needleman y Wunsch se puede utilizar para
40 alinear secuencias. Véase J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970).
De interés es el programa BestFit que usa el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981)) para determinar la identidad de secuencia. La penalización de la generación de hueco generalmente oscilará desde 1 a 5, normalmente 2 a 4 y en muchas realizaciones será 3. La penalización
45 de extensión de hueco generalmente oscilará desde aproximadamente 0,01 a 0,20 y en muchos ejemplos será de 0,10. El programa tiene parámetros por defecto determinados por las secuencias introducidas a comparar. Preferentemente, la identidad de secuencia se determina usando los parámetros por defecto determinados por el programa. Este programa está disponible también en el paquete de Genetics Computing Group (GCG), de Madison, Wisconsin, USA.
50 Otro programa de interés es el algoritmo FastDB, FastDB está descrito en “Current Methods in Sequence Comparison and Analysis, Macromolecule Sequencing and Synthesis, Selected Methods and Applications”, pp. 127149, 1988, Alan R. Liss, Inc. La identidad de porcentaje de secuencia se calcula por FastDB basándose en los siguientes parámetros:
55 Penalización de desparejamiento: 1,00; Penalización de hueco: 1,00;
Penalización de tamaño de hueco: 0,33; y Penalización de unión: 30,0.
60 Un “gen” se refiere a un polinucleótido que contiene al menos un marco de lectura abierto que es capaz de codificar una proteína particular después de ser sometido a transcripción y traducción.
Un “producto génico” es una molécula que resulta de la expresión de un gen particular. Los productos génicos 65 incluyen, por ejemplo, un polipéptido, un aptámero, un ARN interferente, un ARNm y similares.
imagen5
Un “ARN interferente corto” o “interferente pequeño” o ARNic es un ARN bicatenario de nucleótidos que se dirige a un gen de interés (un “gen diana”). Un “ARN bicatenario” se refiere a la estructura formada por el emparejamiento complementario entre dos regiones de una molécula de ARN. ARNic está “dirigido” a un gen en el que la secuencia de nucleótidos de la parte bicatenaria del ARNic es complementaria a una secuencia de nucleótidos del gen dirigido.
5 En algunas realizaciones, la longitud de la doble cadena de ARNic es menor de 30 nucleótidos. En algunas realizaciones, la doble cadena puede ser de 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11 o 10 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, la longitud de la doble cadena es de 19 a 25 nucleótidos de longitud. La parte de ARN bicatenario del ARNic puede ser parte de una estructura horquilla. Además de la parte bicatenaria, la estructura horquilla puede contener una parte bucle colocada entre las dos secuencias que forman la doble cadena. El bucle puede variar en longitud. En algunas realizaciones el bucle es de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13 nucleótidos de longitud. La estructura horquilla también puede contener partes salientes 3’ o 5’. En algunas realizaciones, el saliente es un saliente 3’ o 5’ de 0, 1, 2, 3, 4 o 5 nucleótidos de longitud.
Un “ARN de horquilla corta” o ARNhc, es una construcción de polinucleótido que se puede hacer para expresar un 15 ARN interferente tal como ARNic.
“Recombinante”, cuando se aplica a un polinucléotido significa que el polinucleótido es el producto de diversas combinaciones de etapas de clonación, restricción o ligación, y otros procedimientos que dan como resultado una construcción que es distinta de un polinucleótido encontrado en la naturaleza. Un virus recombinante es una partícula viral que comprende un polinucleótido recombinante. Los términos incluyen respectivamente réplicas de la construcción de polinucleótido original y progenie de la construcción de virus original.
Un “elemento control” o “secuencia control” es una secuencia de nucleótidos implicada en una interacción de moléculas que contribuyen a la regulación funcional de un polinucleótido, incluyendo replicación, duplicación,
25 transcripción, ayuste (splicing), traducción o degradación del polinucleótido. La regulación puede afectar a la frecuencia, velocidad o especificidad del proceso, y puede ser favorecedora o inhibidora en la naturaleza. Los elementos control conocidos en la técnica incluyen, por ejemplo, secuencias reguladoras transcripcionales tales como promotores o potenciadores. Un promotor es una región de ADN capaz bajo ciertas condiciones de unirse a ARN polimerasa e iniciar la transcripción de una región codificante normalmente localizada corriente abajo (en la dirección 3’) desde el promotor.
“Operativamente ligado” o “operablemente ligado” se refiere a una yuxtaposición de elementos genéticos, en la que los elementos están en una relación que los permite funcionar de la manera esperada. Por ejemplo, un promotor está operativamente ligado a una región codificante se el promotor ayuda a iniciar la transcripción de la secuencia
35 codificante. Puede haber restos intermedios entre el promotor y la región codificante siempre que se mantenga esta relación funcional.
Un “vector de expresión” es un vector que comprende una región que codifica un polipéptido de interés, y se usa para efectuar la expresión de la proteína en una célula diana prevista. Un vector de expresión también puede comprender elementos control operativamente ligados a la región codificante para facilitar la expresión de la proteína en la diana. La combinación de elementos control y un gen o genes a los cuales están operativamente ligados para la expresión a veces se refiere como un “casete de expresión”, un gran número de los cuales se conocen y están disponibles en la técnica o se pueden construir fácilmente a partir de los componentes que están disponibles en la técnica.
45 “Heterólogo” significa derivado de una entidad genotípicamente distinta del resto de la entidad con la cual se compara. Por ejemplo, un polinucléotido introducido por técnicas de ingeniería genética en un plásmido o vector derivado de una especie diferente es un polinucleótidos heterólogo. Un promotor separado de su secuencia codificante nativa y operativamente ligado a una secuencia codificante con la cual no se encuentra ligado de manera natural es un promotor heterólogo. Por tanto, por ejemplo, un VAAr que incluye un ácido nucleico heterólogo codificante de un producto génico heterólogo es un VAAr que incluye un ácido nucleico no incluido normalmente en un VAA de origen natural, de tipo natural, y el producto génico heterólogo codificado es un producto génico no codificado normalmente por un VAA de tipo natural, de origen natural.
55 Los términos “alteración genética” y “modificación genética” (y variantes gramaticales de los mismos), se usan intercambiablemente en el presente documento para referirse a un proceso en el que un elemento genético (por ejemplo, un polinucleótido) se introduce en una célula distinta por mitosis o meiosis. El elemento puede ser heterólogo a la célula, o puede ser una copia adicional o versión mejorada de un elemento ya presente en la célula. La alteración genética se puede efectuar, por ejemplo, sometiendo a transfección una célula con un plásmido recombinante u otro polinucleótido a través de cualquier proceso conocido en la técnica, tal como electroporación, precipitación de fosfato de calcio, o poniendo en contacto con un complejo de polinucleótido-liposoma. La alteración genética también se puede efectuar, por ejemplo, por transducción o infección con un virus de ADN o ARN o vector viral. Generalmente, el elemento genético se introduce en un cromosoma o minicromosoma en la célula; pero cualquier alteración que cambia el fenotipo y/o genotipo de la célula y su progenie está incluido en este término.
65 Se dice que una célula se altera, somete a transducción, modifica genéticamente o transforma con una secuencia genética “de manera estable” si la secuencia puede realizar su función durante el cultivo prolongado de la célula in vitro. Generalmente, dicha célula está “hereditariamente” alterada (genéticamente modificada) en el sentido de que se introduce una alteración genética que es también heredable por la progenie de la célula alterada.
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5 Los términos “polipéptido”, “péptido” y “proteína” se usan intercambiablemente en el presente documento para referirse a polímeros de aminoácidos de cualquier longitud. Los términos también incluyen un polímero de aminoácidos que se ha modificado; por ejemplo, formación de enlace disulfuro, glicosilación, lipidación, fosforilación
o conjugación con un componente de marcación. Los polipéptidos tales como polipéptidos antiangiogénicos, polipéptidos neuroprotectores y similares, cuando se tratan en el contexto de administración de un producto génico a un sujeto mamífero, y composiciones de los mismos, se refieren al respectivo polipéptido intacto, o cualquier fragmento o derivado genéticamente modificado del mismo, que conserva la función bioquímica deseada de la proteína intacta. Igualmente, las referencias a ácidos nucleicos codificantes de polipéptidos antiangiogénicos, ácidos nucleicos codificantes de polipéptidos neuroprotectores, y otros ácidos nucleicos para su uso en la administración de un producto génico a un sujeto mamífero (que pueden referir como “transgenes” a administrar a una célula
15 receptora), incluyen polinucleótidos codificantes del polipéptido intacto o cualquier fragmento o derivado genéticamente modificado que procesa la función bioquímica deseada.
Un plásmido, ácido nucleico, vector, virus, virión, célula hospedadora u otra sustancia “aislada” se refiere a una preparación de sustancia desprovista de al menos alguno de los otros componentes que también pueden estar presentes donde la sustancia o una sustancia similar se da de manera natural o está inicialmente preparada de la misma. Por tanto, por ejemplo, una sustancia aislada se puede preparar usando una técnica de purificación para enriquecerla a partir de una mezcla fuente. El enriquecimiento se puede medir sobre una base absoluta, tal como peso por volumen de solución, o se puede medir en relación con una segunda sustancia potencialmente interferente presente en la mezcla fuente. Los enriquecimientos crecientes de las realizaciones de esta descripción son cada vez 25 más aislados. Un plásmido, ácido nucleico, vector, virus, célula hospedadora u otra sustancia aislada está en algunas realizaciones purificadas, por ejemplo, desde aproximadamente 80 % a aproximadamente 90 % puro, al menos aproximadamente 90 % puro, al menos 95 % puro, al menos 98 % puro, o al menos aproximadamente 99 %
o más, puro.
Tal como se usa en el presente documento, los términos “tratamiento”, “tratar” y similares, se refieren a obtener un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado. El efecto puede ser profiláctico en términos de prevenir completamente o parcialmente una enfermedad o síntoma de la misma y/o puede ser terapéutico en términos de una cura parcial o completa de una enfermedad y/o efecto adverso atribuible a la enfermedad. “Tratamiento”, como se usa en el presente documento, cubre cualquier tratamiento de una enfermedad en un mamífero, particularmente en un
35 humano, e incluye: (a) prevenir la enfermedad de que se de en un sujeto el cual puede estar predispuesto a la enfermedad o en riesgo de adquirir la enfermedad, pero aún no se ha diagnosticado que la tiene; (b) inhibir la enfermedad, es decir, frenar su desarrollo; y (c) aliviar la enfermedad, es decir, causar regresión de la enfermedad.
Los términos “individual”, “hospedadora”, “sujeto” y “paciente” se usan intercambiablemente en el presente documento, y se refieren a un mamífero, incluyendo, pero no limitándose a, primates humanos y no humanos, incluido simios y humanos; animales mamíferos de deporte (por ejemplo, caballos), animales mamíferos de granja (por ejemplo, ovejas, cabras, etc.); mamíferos mascotas (perros, gatos, etc.); y roedores (por ejemplo, ratones, ratas, etc.).
45 Antes de que se describa más la presente invención, hay que entender que esta invención no se limita a las realizaciones particulares descritas, ya que tales, por supuesto, pueden variar. También hay que entender que la terminología usada en el presente documento es con el fin de describir solamente realizaciones particulares, y no se pretende que sea limitante, puesto que el alcance de la presente invención estará limitado solamente por las reivindicaciones adjuntas.
Cuando se proporciona un intervalo, se entiende que cada valor intermedio, al decimal de la unidad del límite inferior a menos que el contexto dicte claramente lo contrario, entre el límite superior e inferior de ese intervalo y cualquier otro valor señalado o intermedio en ese intervalo señalado, está incluido dentro de la invención. Los límites superiores e inferiores de estos intervalos más pequeños pueden estar incluidos independientemente en los
55 intervalos más pequeños, y también están incluidos dentro de la invención, sujeto a cualquier límite específicamente excluido en el intervalo señalado. Cuando el intervalo señalado incluye uno o ambos de los límites, los intervalos que excluyen uno o ambos de aquellos límites incluidos también están incluidos en la invención.
A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el comúnmente entendido por los expertos en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque también se puede usar cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en el presente documento en la práctica o el ensayo de la presente invención, los métodos y materiales preferidos se describen más adelante. Todas las publicaciones mencionadas en el presente documento revelan y describen los métodos y/o materiales con respecto a las publicaciones en las que se citan.
65 Se debe indicar que tal como se usa en el presente documento y en las reivindicaciones anexas, las formas del singular “un”, “una” y “el”, “la” incluyen referentes del plural a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. Por tanto, por ejemplo, la referencia a “un virión de VAA recombinante” incluye una pluralidad de tales viriones y la referencia a “la célula fotorreceptora” incluye referencia a una o más células fotorreceptoras y equivalentes de la misma conocidos por los expertos en la técnica, etc. Además, se indica que las reivindicaciones se pueden redactar
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5 para excluir cualquier elemento opcional. De por sí, esta declaración pretende servir como base antecedente para el uso de tal terminología exclusiva como “solo” “solamente” y similares en relación con la relación de los elementos de la reivindicación, o el uso de una limitación “negativa”.
Se aprecia que ciertas características de la invención, las cuales, para mayor claridad, se describen en el contexto de realizaciones separadas, también se pueden proporcionar en combinación en una realización única. A la inversa, diversas características de la invención, las cuales, para mayor brevedad, se describen en el contexto de una realización única, también se pueden proporcionar por separado en cualquier subcombinación adecuada. Todas las combinaciones de las realizaciones que conciernen a la invención son abarcadas específicamente por la presente invención y se describen en el presente documento justo como si cada una y todas las combinaciones estuvieran
15 descritas individualmente y explícitamente. Además, todas las subcombinaciones de las diversas realizaciones y elementos de las mismas también están abarcados por la presente invención y están descritos en el presente documento justo como si cada una y todas tales subcombinaciones estuvieran individualmente y explícitamente descritas en el presente documento.
Las publicaciones tratadas en el presente documento se proporcionan solamente para su descripción antes de la fecha de presentación de la presente aplicación. Nada en el presente documento es ser interpretado como una admisión de que la presente invención no tiene derecho a preceder tal publicación debido a la invención anterior. Además, las fechas de publicación proporcionadas pueden ser diferentes de las fechas de publicación reales que pueden necesitar ser confirmadas independientemente.
25
Descripción detallada
La presente descripción proporciona viriones de virus adenoasociados (VAA) con proteína de cápside alterada, donde los viriones de VAA presentan mayor infectividad de una célula retiniana, cuando se administran por inyección intravítrea, en comparación con VAA de tipo natural cuando se administra por inyección intravítrea. La presente descripción proporciona además métodos de administración de un producto génico a una célula retiniana en un individuo, y métodos de tratamiento de enfermedad ocular.
La célula retiniana puede ser un fotorreceptor (por ejemplo, bastones; conos), una célula ganglionar de la retina
35 (CGR), una célula de Müller (una célula glial de Müller), una célula bipolar, una célula amacrina, una célula horizontal, o una célula de epitelio pigmentario de la retina (EPR).
POLIPÉPTIDOS DE PROTEÍNA DE LA CÁPSIDE DE VAA VARIANTE
La presente descripción proporciona una proteína de la cápside de VAA variante, donde la proteína de la cápside de VAA variante comprende una inserción de desde aproximadamente 5 aminoácidos a aproximadamente 11 aminoácidos en un sitio de inserción en el bucle GH o bucle IV de la proteína de la cápside, en relación con una correspondiente proteína de la cápside de VAA parental, y donde la proteína de la cápside variante, cuando está presente en un virión de VAA, confiere infectividad incrementada de una célula retiniana en comparación con la
45 infectividad de la célula retiniana por un virión de VAA que comprende la correspondiente proteína de la cápside de VAA parental. En algunos casos, la célula retiniana es una célula fotorreceptora (por ejemplo, bastones; conos). En otros casos, la célula retiniana es una CGR. En otros casos, la célula retiniana es una célula de EPR. En otros casos, la célula retiniana es una célula de Müller. Otras células retinianas incluyen células amacrinas, células bipolares y células horizontales. En el presente documento, una “inserción de desde aproximadamente 5 aminoácidos a aproximadamente 11 aminoácidos” también se refiere como una “inserción peptídica” (por ejemplo, una inserción peptídica heteróloga). Una “correspondiente proteína de la cápside de VAA parental” se refiere a una proteína de la cápside de VAA del mismo serotipo de VAA, sin la inserción peptídica.
El sitio de inserción está en el bucle GH, o bucle IV, de la proteína de la cápside de VAA, por ejemplo, en una parte
55 accesible por disolvente del bucle GH, o bucle IV, de la proteína de la cápside de VAA. Para el bucle GH/bucle IV de la cápside de VAA, véase, por ejemplo, Vliet y col. (2006) Mol. Ther. 14:809; Padron y col. (2005) J. Virol. 79:5.047; y Shen y col. (2007) Mol. Ther. 15:1.955. Por ejemplo, el sitio de inserción puede estar dentro de los aminoácidos 411 a 650 de una proteína de la cápside de VAA, como se representa en las Figuras 17A y 17B. Por ejemplo, el sitio de inserción puede estar dentro de los aminoácidos 570 a 611 de VAA2, dentro de los aminoácidos 571 a 612 de VAA1, dentro de los aminoácidos 560 a 601 de VAA5, dentro de los aminoácidos 571 a 612 de VAA6, dentro de los aminoácidos 572 a 613 de VAA7, dentro de los aminoácidos 573 a 614 de VAA8, dentro de los aminoácidos 571 a 612 de VAA9, o dentro de los aminoácidos 573 a 614 de VAA10, como se representa en la Figura 6.
En algunos casos, desde aproximadamente 5 aminoácidos a aproximadamente 11 aminoácidos están insertados en
65 un sitio de inserción en el bucle GH o bucle IV de la proteína de la cápside en relación con una correspondiente proteína de la cápside de VAA parental. Por ejemplo, el sitio de inserción puede estar entre los aminoácidos 587 a 588 de VAA2, o las correspondientes posiciones de la subunidad de la cápside de otro serotipo de VAA. Se debería indicar que el sitio de inserción 587/588 se basa en una proteína de la cápside de VAA2. Desde aproximadamente 5 aminoácidos a aproximadamente 11 aminoácidos pueden estar insertados en un sitio correspondiente en un serotipo de VAA distinto de VAA2 (por ejemplo, VAA8, VAA9, etc.). Los expertos en la técnica sabrán, basándose en una
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5 comparación de las secuencias de aminoácidos de proteínas de la cápside de diversos serotipos de VAA, donde un sitio de inserción “correspondiente a los aminoácidos 587 a 588 de VAA2” sería una proteína de la cápside de cualquier serotipo de VAA dado. Las secuencias que corresponden a los aminoácidos 570 a 611 de la proteína de la cápside VP1 de VAA2 (véase Figura 5) en diversos serotipos de VAA se muestran en la Figura 6. Véase, por ejemplo, Nº de Acceso de GenBank NP_049542 para VAA1; Nº de Acceso de GenBank AAD13756 para VAA5; Nº de Acceso de GenBank AAB95459 para VAA6; Nº de Acceso de GenBank YP_077178 para VAA7; Nº de Acceso de GenBank YP_077180 para VAA8; Nº de Acceso de GenBank AAS99264 para VAA9 y Nº de Acceso de GenBank AAT46337 para VAA10.
En algunas realizaciones, el sitio de inserción es un sitio de inserción único entre dos aminoácidos adyacentes
15 localizados entre los aminoácidos 570 a 614 de VP1 de cualquier serotipo de VAA , por ejemplo, el sitio de inserción está entre dos aminoácidos adyacentes localizados en los aminoácidos 570 a 610, aminoácidos 580 a 600, aminoácidos 570 a 575, aminoácidos 575 a 580, aminoácidos 580 a 585, aminoácidos 585 a 590, aminoácidos 590 a 600, o aminoácidos 600 a 614, de VP1 de cualquier serotipo de VAA o variante. Por ejemplo, el sitio de inserción puede estar entre los aminoácidos 580 y 581, aminoácidos 581 y 582, aminoácidos 583 y 584, aminoácidos 584 y 585, aminoácidos 585 y 586, aminoácidos 586 y 587, aminoácidos 587 y 588, aminoácidos 588 y 589, o aminoácidos 589 y 590. El sitio de inserción puede estar entre los aminoácidos 575 y 576, aminoácidos 576 y 577, aminoácidos 577 y 578, aminoácidos 578 y 579, o aminoácidos 579 y 580. El sitio de inserción puede estar entre los aminoácidos 590 y 591, aminoácidos 591 y 592, aminoácidos 592 y 593, aminoácidos 593 y 594, aminoácidos 594 y 595, aminoácidos 595 y 596, aminoácidos 596 y 597, aminoácidos 597 y 598, aminoácidos 598 y 599, o
25 aminoácidos 599 y 600.
Por ejemplo, el sitio de inserción puede estar entre los aminoácidos 587 y 588 de VAA2, entre los aminoácidos 590 y 591 de VAA1, entre los aminoácidos 575 y 576 de VAA5, entre los aminoácidos 590 y 591 de VAA6, entre los aminoácidos 589 y 590 de VAA7, entre los aminoácidos 590 y 591 de VAA8, entre los aminoácidos 588 y 589 de VAA9, o entre los aminoácidos 588 y 589 de VAA10.
Como otro ejemplo, el sitio de inserción puede estar entre los aminoácidos 450 y 460 de una proteína de la cápside de VAA, como se muestra en la Figura 17A. Por ejemplo, el sitio de inserción puede estar en (por ejemplo, inmediatamente N-terminal a) el aminoácido 453 de VAA 2, en el aminoácido 454 de VAA1, en el aminoácido 454 de
35 VAA6, en el aminoácido 456 de VAA7, en el aminoácido 456 de VAA8, en el aminoácido 454 de VAA9, o en el aminoácido 456 de VAA10, como se muestra en la Figura 17A.
En algunas realizaciones, una proteína de la cápside objeto incluye un bucle GH que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99%, o 100%, de identidad de secuencia de aminoácidos con una secuencia de aminoácidos expuesta en la Figura 18A-C.
Péptidos de inserción
45 Como se indicó anteriormente, un péptido de desde aproximadamente 5 aminoácidos a aproximadamente 11 aminoácidos de longitud está insertado en el bucle GH de una cápside de VAA. El péptido de inserción tiene una longitud de 5 aminoácidos, 6 aminoácidos, 7 aminoácidos, 8 aminoácidos, 9 aminoácidos, 10 aminoácidos o 11 aminoácidos.
El péptido de inserción puede comprender una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las fórmulas expuestas a continuación.
Por ejemplo, un péptido de inserción puede ser un péptido de desde 5 a 11 aminoácidos de longitud, donde el sitio de inserción es de Fórmula I:
55
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donde:
cada uno de Y1-Y4, si está presente, se selecciona independientemente de Ala, Leu, Gly, Ser, y Thr; X1, si está presente, se selecciona de Leu, Asn, y Lys; X2 se selecciona de Gly, Glu, Ala, y Asp; X3 se selecciona de Glu, Thr, Gly, y Pro; X4 se selecciona de Thr, Ile, Gln, y Lys; X5 se selecciona de Thr y Ala;
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X6 se selecciona de Arg, Asn, y Thr; X7, si está presente, se selecciona de Pro y Asn.
Como otro ejemplo, un péptido de inserción puede ser un péptido de desde 5 a 11 aminoácidos de longitud, donde el péptido de inserción es de Fórmula IIa:
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donde:
10 cada uno de Y1-Y4, si está presente, se selecciona independientemente de Ala, Leu, Gly, Ser y Thr; cada uno de X1-X4 es cualquier aminoácido; X5 es Thr; X6 es Arg; y
15 X7 es Pro.
Como otro ejemplo, un péptido de inserción puede ser un péptido de desde 5 a 11 aminoácidos de longitud, donde el péptido de inserción es de Fórmula Ilb:
20
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donde:
cada uno de Y1-Y4, si está presente, se selecciona independientemente de Ala, Leu, Gly, Ser y Thr;
25 X1, si está presente, se selecciona de Leu y Asn; X2, si está presente, se selecciona de Gly y Glu; X3 se selecciona de Glu y Thr; X4 se selecciona de Thr y Ile; X5 es Thr;
30 X6esArg;y X7 es Pro.
Como otro ejemplo, un péptido de inserción puede ser un péptido de desde 5 a 11 aminoácidos de longitud, donde el péptido de inserción es de Fórmula IlI: 35
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donde:
40 cada uno de Y1-Y4, si está presente, se selecciona independientemente de Ala, Leu, Gly, Ser y Thr; X1, si está presente, es Lys; X2 se selecciona de Ala y Asp; X3 se selecciona de Gly y Pro; X4 se selecciona de GIn y Lys;
45 X5 se selecciona de Thr y Ala; X6 se selecciona de Asn y Thr; X7, si está presente, es Asn.
Como otro ejemplo, un péptido de inserción puede ser un péptido de desde 5 a 11 aminoácidos de longitud, donde el 50 péptido de inserción es de Fórmula IV:
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donde:
55 cada uno de Y1-Y4, si está presente, se selecciona independientemente de Ala, Leu, Gly, Ser y Thr; X1, si está presente, es un aminoácido positivamente cargado o un aminoácido no cargado; o se selecciona de Leu, Asn, Arg, Ala, Ser y Lys; X2 es un aminoácido negativamente cargado o un aminoácido no cargado; o se selecciona de Gly, Glu, Ala, Val,
60 Thr y Asp; X3 es un aminoácido negativamente cargado o un aminoácido no cargado; o se selecciona de Glu, Thr, Gly, Asp
o Pro;
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X4 se selecciona de Thr, IIe, Gly, Lys, Asp y Gln; X5 es un aminoácido polar, un alcohol (un aminoácido que tiene un grupo hidroxilo libre), o un aminoácido hidrófobo; o se selecciona de Thr, Ser, Val y Ala; X6 es un aminoácido positivamente cargado o un aminoácido no cargado; o se selecciona de Arg, Val, Lys, Pro,
5 Thr y Asn; y X7, si está presente, es un aminoácido positivamente cargado o un aminoácido no cargado; o se selecciona de Pro, Gly, Phe, Asn y Arg.
Como ejemplos no limitantes, el péptido de inserción puede comprender una secuencia de aminoácidos
10 seleccionada de LGETTRP (SEQ ID NO:13), NETITRP (SEQ ID NO:14), KAGQANN (SEQ ID NO:15), KDPKTTN (SEQ ID NO:16), KDTDTTR (SEQ ID NO:57), RAGGSVG (SEQ ID NO:58), AVDTTKF (SEQ ID NO:59), y STGKVPN (SEQ ID NO:60).
En algunos casos, el péptido de inserción tiene desde 1 a 4 aminoácidos espaciadores (Y1-Y4) en el terminal amino
15 y/o en el terminal carboxilo de una cualquiera de LGETTRP (SEQ ID NO:13), NETITRP (SEQ ID NO:14), KAGQANN (SEQ ID NO:15), KDPKTTN (SEQ ID NO:16), KDTDTTR (SEQ ID NO:57), RAGGSVG (SEQ ID NO:58), AVDTTKF (SEQ ID NO:59), y STGKVPN (SEQ ID NO:60). Los aminoácidos espaciadores adecuados incluyen, pero no se limitan a, leucina, alanina, glicina y serina.
20 Por ejemplo, en algunos casos, un péptido de inserción tiene una de las siguientes secuencias de aminoácidos: LALGETTRPA (SEQ ID NO:45); LANETITRPA (SEQ ID NO:46), LAKAGQANNA (SEQ ID NO:47), LAKDPKTTNA (SEQ ID NO:48), LAKDTDTTRA (SEQ ID NO:61), LARAGGSVGA (SEQ ID NO:62), LVAADTTKFA (SEQ ID NO:63), y LASTGKVPNA (SEQ ID NO:64). Como otro ejemplo, en algunos casos, un péptido de inserción tiene una de las siguientes secuencias de aminoácidos: AALGETTRPA (SEQ ID NO:49); AANETITRPA (SEQ ID NO:50),
25 AAKAGQANNA (SEQ ID NO:51), y AAKDPKTTNA (SEQ ID NO:52). Como otro ejemplo más, en algunos casos, el péptido de inserción tiene una de las siguientes secuencias de aminoácidos: GLGETTRPA (SEQ ID NO:53); GNETITRPA (SEQ ID NO:54), GKAGQANNA (SEQ ID NO:55), y GKDPKTTNA (SEQ ID NO:56). Como otro ejemplo, en algunos casos, un péptido de inserción comprende una de KDTDTTR (SEQ ID NO:57), RAGGSVG (SEQ ID NO:58), AVDTTKF (SEQ ID NO:59), y STGKVPN (SEQ ID NO:60), flanqueada en el terminal C por AA y en el
30 terminal N por A; o comprende una de KDTDTTR (SEQ ID NO:57), RAGGSVG (SEQ ID NO:58), AVDTTKF (SEQ ID NO:59), y STGKVPN (SEQ ID NO:60) flanqueada en el terminal C por G y en el terminal N por A.
En algunas realizaciones, una cápside de VAA variante objeto no incluye ninguna otra sustitución, inserción o deleción de aminoácido, aparte de una inserción de desde aproximadamente 5 aminoácidos a aproximadamente 11 35 aminoácidos en el bucle GH o bucle IV en relación con una correspondiente proteína de la cápside de VAA parental. En otras realizaciones, una cápside de VAA variante objeto incluye inserciones, deleciones o sustituciones de desde 1 a aproximadamente 25 aminoácidos, en comparación con la proteína de la cápside de VAA parental, además de una inserción de desde aproximadamente 5 aminoácidos a aproximadamente 11 aminoácidos en el bucle GH o bucle IV en relación con una correspondiente proteína de la cápside de VAA parental. Por ejemplo, en algunas 40 realizaciones, un cápside de VAA variante objeto incluye inserciones, deleciones o sustituciones de desde 1 a aproximadamente 5, desde aproximadamente 5 a aproximadamente 10, desde aproximadamente 10 a aproximadamente 15, desde aproximadamente 15 a aproximadamente 20, o desde aproximadamente 20 a aproximadamente 25 aminoácidos, en comparación con la proteína de la cápside de VAA parental, además de una inserción de desde 5 aminoácidos a aproximadamente 11 aminoácidos en el bucle GH o bucle IV en relación con
45 una correspondiente proteína de la cápside de VAA parental.
En algunas realizaciones, un polipéptido de la cápside variante objeto no incluye una, dos, tres o cuatro, de las siguientes sustituciones de aminoácidos: Y273F, Y444F, Y500F y Y730F.
50 En algunas realizaciones, un polipéptido de la cápside variante objeto comprende, además de un péptido de inserción anteriormente descrito, uno, dos, tres o cuatro de las siguientes sustituciones de aminoácidos: Y273F, Y444F, Y500F y Y730F.
En algunas realizaciones, un polipéptido de la cápside de VAA variante es una cápside quimérica, por ejemplo, la
55 cápside comprende una parte de una cápside de VAA de un primer serotipo de VAA y una parte de una cápside de VAA de un segundo serotipo; y comprende una inserción de desde aproximadamente 5 aminoácidos a aproximadamente 11 aminoácidos en el bucle GH o bucle IV en relación con una correspondiente proteína de la cápside de VAA parental.
60 En algunas realizaciones, una proteína de cápside variante objeto comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 98%, o al menos aproximadamente 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos proporcionada en la Figura 5; y una inserción de desde aproximadamente 5 aminoácidos a aproximadamente 11 aminoácidos en el bucle GH o bucle IV en relación con una correspondiente proteína de la
65 cápside de VAA parental.
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En algunas realizaciones, se aísla una proteína de la cápside variante objeto, por ejemplo, se purifica. En algunos casos, una proteína de la cápside variante objeto está incluida en un vector de VAA, que también se proporciona. Tal como se describe a continuación en detalle, una proteína de la cápside variante objeto puede estar incluida en un virión de VAA recombinante.
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VIRIÓN DE VAA RECOMBINANTE
La presente descripción proporciona un virión de virus adenoasociado recombinante (VAAr) que comprende: a) una proteína de la cápside de VAA variante, donde la proteína de la cápside de VAA variante comprende una inserción de desde aproximadamente 5 aminoácidos a aproximadamente 11 aminoácidos en un sitio de inserción en el bucle GH o bucle IV de la proteína de la cápside, en relación con una correspondiente proteína de la cápside de VAA parental, y donde la proteína de la cápside variante confiere infectividad incrementada de una célula retiniana en comparación con la infectividad de la célula retiniana por un virión de VAA que comprende la correspondiente proteína de la cápside de VAA parental; y b) un ácido nucleico heterólogo que comprende una secuencia de
15 nucleótidos codificante de un producto génico. En algunos casos, la célula retiniana es una célula fotorreceptora (por ejemplo, bastones y/o conos). En otros casos, la célula retiniana es una célula CGR. En otros casos, la célula retiniana es una célula de EPR. En otros casos, la célula retiniana es una célula de Müller. En otros casos, las células retinianas pueden incluir células amacrinas, células bipolares y células horizontales. Una “inserción de desde aproximadamente 5 aminoácidos a aproximadamente 11 aminoácidos” también se refiere en el presente documento a una “inserción peptídica” (por ejemplo, una inserción peptídica heteróloga). Una “correspondiente proteína de la cápside de VAA parental” se refiere a una proteína de la cápside de VAA del mismo serotipo de VAA, sin la inserción peptídica.
El sitio de inserción está en el bucle GH, o bucle IV, de la proteína de la cápside de VAA, por ejemplo, en una parte
25 accesible por disolvente del bucle GH, o bucle IV, de la proteína de la cápside de VAA. Para el bucle GH, véase, por ejemplo, van Vliet y col. (2006) Mol. Ther. 14:809; Padron y col. (2005) J. Virol. 79:5.047; y Shen y col. (2007) Mol. Ther. 15:1.955. Por ejemplo, el sitio de inserción está dentro de los aminoácidos 570 a 611 de VAA2, dentro de los aminoácidos 571 a 612 de VAA1, dentro de los aminoácidos 560 a 601 de VAA5, dentro de los aminoácidos 571 a 612 de VAA6, dentro de los aminoácidos 572 a 613 de VAA7, dentro de los aminoácidos 573 a 614 de VAA8, dentro de los aminoácidos 571 a 612 de VAA9, o dentro de los aminoácidos 573 a 614 de VAA10
Desde aproximadamente 5 aminoácidos a aproximadamente 11 aminoácidos están insertados en un sitio de inserción en el bucle GH o bucle IV de la proteína de la cápside en relación con una correspondiente proteína de la cápside de VAA parental. Por ejemplo, el sitio de inserción puede estar entre los aminoácidos 587 y 588 de VAA2, o
35 las correspondientes posiciones de la subunidad de la cápside de otro serotipo de VAA. Se debería indicar que el sitio de inserción 587/588 se basa en una proteína de la cápside de VAA2. Desde aproximadamente 5 aminoácidos a aproximadamente 11 aminoácidos pueden estar insertados en un sitio correspondiente en un serotipo de VAA distinto del VAA2 (por ejemplo, VAA8, VAA9, etc.). Los expertos en la técnica sabrán, basándose en una comparación de las secuencias de aminoácidos de proteínas de la cápside de diversos serotipos de VAA, dónde un sitio de inserción “correspondiente a los aminoácidos 587 a 588 de VAA2” estará en una proteína de la cápside de cualquier serotipo de VAA dado. Las secuencias correspondientes a los aminoácidos 570 a 611 de proteína de la cápside VP1 de VAA2 (véase la Figura 5) en diversos serotipos de VAA se muestran en la Figura 6.
En algunas realizaciones, el sitio de inserción está en una sitio de inserción único entre dos aminoácidos adyacentes
45 localizados entre los aminoácidos 570 y 614 de VP1 de cualquier serotipo de VAA, por ejemplo, el sitio de inserción está entre dos aminoácidos adyacentes localizados en los aminoácidos 570 a 614, aminoácidos 580 a 600, aminoácidos 570 a 575, aminoácidos 575 a 580 aminoácidos 580 a 585, aminoácidos 585 a 590, aminoácidos 590 a 600, o aminoácidos 600 a 610, de VP1 de cualquier serotipo o variante de VAA. Por ejemplo, el sitio de inserción puede estar entre los aminoácidos 580 y 581; aminoácidos 581 y 582, aminoácidos 583 y 584, aminoácidos 584 y 585, aminoácidos 585 y 586, aminoácidos 586 y 587, aminoácidos 587 y 588, aminoácidos 588 y 589, o aminoácidos 589 y 590. El sitio de inserción puede estar entre los aminoácidos 575 y 576, aminoácidos 576 y 577, aminoácidos 577 y 578, aminoácidos 578 y 579, o aminoácidos 579 y 580. El sitio de inserción puede estar entre los aminoácidos 590 y 591, aminoácidos 591 y 592, aminoácidos 592 y 593, aminoácidos 593 y 594, aminoácidos 594 y 595, aminoácidos 595 y 596, aminoácidos 596 y 597, aminoácidos 597 y 598, aminoácidos 598 y 599, o
55 aminoácidos 599 y 600.
Por ejemplo, el sitio de inserción puede estar entre los aminoácidos 587 y 588 de VAA2, entre los aminoácidos 590 y 591 de VAA1 entre los aminoácidos 575 y 576 de VAA5, entre los aminoácidos 590 y 591 de VAA6, entre los aminoácidos 589 y 590 de VAA7, entre los aminoácidos 590 y 591 de VAA8, entre los aminoácidos 588 y 589 de VAA9, o entre los aminoácidos 589 y 590 de VAA10.
Péptidos de inserción
Como se indicó anteriormente, un virión de VAAr objeto comprende un péptido de desde aproximadamente 5
65 aminoácidos a aproximadamente 11 aminoácidos de longitud insertado en el bucle GH de la cápside de VAA. El péptido de inserción tiene una longitud de 5 aminoácidos, 6 aminoácidos, 7 aminoácidos, 8 aminoácidos, 9
aminoácidos, 10 aminoácidos o 11 aminoácidos.
El péptido de inserción puede comprender una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las fórmulas expuestas a continuación.
Por ejemplo, un péptido de inserción puede ser un péptido de desde 5 a 11 aminoácidos de longitud, donde el péptido de inserción es de Fórmula I:
imagen17
10 donde:
cada uno de Y1-Y4, si está presente, se selecciona independientemente de Ala, Leu, Gly, Ser, y Thr; X1, si está presente, se selecciona de Leu, Asn, y Lys;
15 X2 se selecciona de Gly, Glu, Ala, y Asp; X3 se selecciona de Glu, Thr, Gly, y Pro; X4 se selecciona de Thr, IIe, GIn, y Lys; X5 se selecciona de Thr y Ala; X6 se selecciona de Arg, Asn, y Thr;
20 X7, si está presente, se selecciona de Pro y Asn.
Como otro ejemplo, un péptido de inserción puede ser un péptido de desde 5 a 11 aminoácidos de longitud, donde el péptido de inserción es de Fórmula IIa:
25
imagen18
donde:
cada uno de Y1-Y4, si está presente, se selecciona independientemente de Ala, Leu, Gly, Ser y Thr;
30 cada uno de X1-X4 es cualquier aminoácido; X5 es Thr; X6 es Arg; y X7 es Pro.
35 Como otro ejemplo, un péptido de inserción puede ser un péptido de desde 5 a 11 aminoácidos de longitud, donde el péptido de inserción es de Fórmula Ilb:
imagen19
40 donde:
cada uno de Y1-Y4, si está presente, se selecciona independientemente de Ala, Leu, Gly, Ser y Thr; X1, si está presente, se selecciona de Leu y Asn; X2, si está presente, se selecciona de Gly y Glu;
45 X3 se selecciona de Glu y Thr; X4 se selecciona de Thr y Ile; X5 es Thr; X6 es Arg; y X7 es Pro.
50 Como otro ejemplo, un péptido de inserción puede ser un péptido de desde 5 a 11 aminoácidos de longitud, donde el péptido de inserción es de Fórmula IlI:
imagen20
55 donde:
cada uno de Y1-Y4, si está presente, se selecciona independientemente de Ala, Leu, Gly, Ser y Thr; X1, si está presente, es Lys;
60 X2 se selecciona de Ala y Asp; X3 se selecciona de Gly y Pro; X4 se selecciona de Gln y Lys; X5 se selecciona de Thr y Ala; X6 se selecciona de Asn y Thr;
imagen21
X7, si está presente, es Asn.
Como otro ejemplo, un péptido de inserción puede ser un péptido de desde 5 a 11 aminoácidos de longitud, donde el péptido de inserción es de Fórmula IV:
imagen22
donde:
10 cada uno de Y1-Y4, si está presente, se selecciona independientemente de Ala, Leu, Gly, Ser y Thr; X1, si está presente, es un aminoácido positivamente cargado o un aminoácido no cargado; o se selecciona de Leu, Asn, Arg, Ala, Ser y Lys; X2 es un aminoácido negativamente cargado o un aminoácido no cargado; o se selecciona de Gly, Glu, Ala, Val,
15 Thr y Asp; X3 es un aminoácido negativamente cargado o un aminoácido no cargado; o se selecciona de Glu, Thr, Gly, Asp
o Pro; X4 se selecciona de Thr, IIe, Gly, Lys, Asp y Gln; X5 es un aminoácido polar, un alcohol (un aminoácido que tiene un grupo hidroxilo libre), o un aminoácido
20 hidrófobo; o se selecciona de Thr, Ser, Val y Ala; X6 es un aminoácido positivamente cargado o un aminoácido no cargado; o se selecciona de Arg, Val, Lys, Pro, Thr y Asn; y X7, si está presente, es un aminoácido positivamente cargado o un aminoácido no cargado; o se selecciona de Pro, Gly, Phe, Asn y Arg.
25 Como ejemplos no limitantes, el péptido de inserción puede comprender una secuencia de aminoácidos seleccionada de LGETTRP (SEQ ID NO:13), NETITRP (SEQ ID NO:14), KAGQANN (SEQ ID NO:15), KDPKTTN (SEQ ID NO:16), KDTDTTR (SEQ ID NO:57), RAGGSVG (SEQ ID NO:58), AVDTTKF (SEQ ID NO:59), y STGKVPN (SEQ ID NO:60).
30 En algunos casos, el péptido de inserción tiene desde 1 a 4 aminoácidos espaciadores (Y1-Y4) en el terminal amino y/o en el terminal carboxilo de una cualquiera de LGETTRP (SEQ ID NO:13), NETITRP (SEQ ID NO:14), KAGQANN (SEQ ID NO:15), KDPKTTN (SEQ ID NO:16), KDTDTTR (SEQ ID NO:57), RAGGSVG (SEQ ID NO:58), AVDTTKF (SEQ ID NO:59), y STGKVPN (SEQ ID NO:60). Aminoácidos espaciadores adecuados incluyen, pero no se limitan
35 a, leucina, alanina, glicina y serina.
Por ejemplo, en algunos casos, un péptido de inserción tiene una de las siguientes secuencias de aminoácidos: LALGETTRPA (SEQ ID NO:45); LANETITRPA (SEQ ID NO:46), LAKAGQANNA (SEQ ID NO:47), LAKDPKTTNA (SEQ ID NO:48), LAKDTDTTRA (SEQ ID NO:61), LARAGGSVGA (SEQ ID NO:62), LVAADTTKFA (SEQ ID NO:63), 40 y LASTGKVPNA (SEQ ID NO:64). Como otro ejemplo, en algunos casos, un péptido de inserción tiene una de las siguientes secuencias de aminoácidos: AALGETTRPA (SEQ ID NO:49); AANETITRPA (SEQ ID NO:50), AAKAGQANNA (SEQ ID NO:51), y AAKDPKTTNA (SEQ ID NO:52). Como otro ejemplo más, en algunos casos, un péptido de inserción tiene una de las siguientes secuencias de aminoácidos: GLGETTRPA (SEQ ID NO:53); GNETITRPA (SEQ ID NO:54), GKAGQANNA (SEQ ID NO:55), y GKDPKTTNA (SEQ ID NO:56). Como otro ejemplo,
45 en algunos casos, un péptido de inserción comprende una de KDTDTTR (SEQ ID NO:57), RAGGSVG (SEQ ID NO:58), AVDTTKF (SEQ ID NO:59), y STGKVPN (SEQ ID NO:60), flaqueadas en el terminal C por AA y en el terminal N por A; o comprende una de KDTDTTR (SEQ ID NO:57), RAGGSVG (SEQ ID NO:58), AVDTTKF (SEQ ID NO:59), y STGKVPN (SEQ ID NO:60) flanqueada en el terminal C por G y en el terminal N por A.
50 En algunas realizaciones, una cápside de virión de VAAr objeto no incluye cualquier otra sustitución, inserción o deleción de aminoácidos, aparte de una inserción de desde aproximadamente 7 aminoácidos a aproximadamente 10 aminoácidos en el bucle GH o bucle IV en relación con una correspondiente proteína de la cápside de VAA parental. En otras realizaciones, una cápside de virión de VAAr objeto incluye inserciones, deleciones o sustituciones de desde 1 a aproximadamente 25 aminoácidos, en comparación con la proteína de la cápside de VAA parental,
55 además de una inserción de desde aproximadamente 7 aminoácidos a aproximadamente 10 aminoácidos en el bucle GH o bucle IV en relación con una correspondiente proteína de la cápside de VAA parental. Por ejemplo, en algunas realizaciones, una cápside de virión de VAAr objeto incluye inserciones, deleciones o sustituciones de desde 1 a aproximadamente 5, desde aproximadamente 5 a aproximadamente 10, desde aproximadamente 10 a aproximadamente 15, desde aproximadamente 15 a aproximadamente 20, o desde aproximadamente 20 a
60 aproximadamente 25 aminoácidos, en comparación con la proteína de la cápside de VAA parental, además de una inserción de desde aproximadamente 7 aminoácidos a aproximadamente 10 aminoácidos en el bucle GH o bucle IV en relación con una correspondiente proteína de la cápside de VAA parental.
En algunas realizaciones, una cápside de virión de VAAr objeto no incluye una, dos, tres o cuatro, de las siguientes 65 sustituciones de aminoácidos: Y273F, Y444F, Y500F y Y730F.
imagen23
En algunas realizaciones, un polipéptido de cápside variante objeto comprende, además de un péptido de inserción como se describió anteriormente, una, dos, tres o cuatro, de las siguientes sustituciones de aminoácidos: Y273F, Y444F, Y500F y Y730F.
5 En algunas realizaciones, una cápside de virión de VAAr objeto es una cápside quimérica, por ejemplo, la cápside comprende una parte de una cápside de VAA de un primer serotipo de VAA y una parte de una cápside de VAA de un segundo serotipo; y comprende una inserción de desde aproximadamente 5 aminoácidos a aproximadamente 11 aminoácidos en el bucle GH o bucle IV en relación con una correspondiente proteína de la cápside de VAA parental.
10 En algunas realizaciones, un virión de VAAr objeto comprende una proteína de la cápside que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 98%, o al menos aproximadamente 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos proporcionada en la Figura 5; y una inserción de desde aproximadamente 5 aminoácidos a aproximadamente 11 aminoácidos en el bucle GH o bucle IV en relación con una
15 correspondiente proteína de la cápside de VAA parental.
En algunas realizaciones, un virión de VAAr objeto comprende una proteína de la cápside que incluye un bucle GH que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 %, al menos aproximadamente 98 %, al menos
20 aproximadamente 99 %, o 100 %, de identidad de secuencia de aminoácidos con una secuencia de aminoácidos expuesta en la Figura 18A-C.
Un virión de VAAr objeto presenta infectividad incrementada al menos 10 veces, al menos 15 veces, al menos 20 veces, al menos 25 veces, al menos 50 veces, o más de 50 veces, de una célula retiniana, en comparación con la
25 infectividad de la célula retiniana por un virión de VAA que comprende la correspondiente proteína de la cápside de VAA parental.
En algunos casos, un virión de VAAr objeto presenta infectividad incrementada al menos 10 veces, al menos 15 veces, al menos 20 veces, al menos 25 veces, al menos 50 veces, o más de 50 veces, de una célula retiniana,
30 cuando se administra por inyección intravítrea, en comparación con la infectividad de la célula retiniana por un virión de VAA que comprende la correspondiente proteína de la cápside de VAA parental, cuando se administra por inyección intravítrea.
En algunas realizaciones, un virión de VAAr objeto presenta infectividad incrementada al menos 10 veces, al menos
35 15 veces, al menos 20 veces, al menos 25 veces, al menos 50 veces, o más de 50 veces, de una célula fotorreceptora (bastón o cono), en comparación con la infectividad de la célula fotorreceptora por un virión de VAA que comprende la correspondiente proteína de la cápside de VAA parental.
En algunas realizaciones, un virión de VAAr objeto presenta infectividad incrementada al menos 10 veces, al menos
40 15 veces, al menos 20 veces, al menos 25 veces, al menos 50 veces, o más de 50 veces, de una célula fotorreceptora (bastón o cono), cuando se administra por inyección intravítrea, en comparación con la infectividad de la célula fotorreceptora por un virión de VAA que comprende la correspondiente proteína de la cápside de VAA parental, cuando se administra por inyección intravítrea.
45 En algunas realizaciones, un virión de VAAr objeto presenta infectividad incrementada al menos 10 veces, al menos 15 veces, al menos 20 veces, al menos 25 veces, al menos 50 veces, o más de 50 veces, de una CGR, en comparación con la infectividad de la CGR por un virión de VAA que comprende la correspondiente proteína de la cápside de VAA parental.
50 En algunas realizaciones, un virión de VAAr objeto presenta infectividad incrementada al menos 10 veces, al menos 15 veces, al menos 20 veces, al menos 25 veces, al menos 50 veces, o más de 50 veces, de una CGR, cuando se administra por inyección intravítrea, en comparación con la infectividad de la CGR por un virión de VAA que comprende la correspondiente proteína de la cápside de VAA parental, cuando se administra por inyección intravítrea.
55 En algunas realizaciones, un virión de VAAr objeto presenta infectividad incrementada al menos 10 veces, al menos 15 veces, al menos 20 veces, al menos 25 veces, al menos 50 veces, o más de 50 veces, de una célula de EPR, en comparación con la infectividad de la célula de EPR por un virión de VAA que comprende la correspondiente proteína de la cápside de VAA parental.
60 En algunas realizaciones, un virión de VAAr objeto presenta infectividad incrementada al menos 10 veces, al menos 15 veces, al menos 20 veces, al menos 25 veces, al menos 50 veces, o más de 50 veces, de una célula de EPR, cuando se administra por inyección intravítrea, en comparación con la infectividad de la célula de EPR por un virión de VAA que comprende la correspondiente proteína de la cápside de VAA parental, cuando se administra por
65 inyección intravítrea.
En algunas realizaciones, un virión de VAAr objeto presenta infectividad incrementada al menos 10 veces, al menos 15 veces, al menos 20 veces, al menos 25 veces, al menos 50 veces, o más de 50 veces, de una célula de Müller, en comparación con la infectividad de la célula de Müller por un virión de VAA que comprende la correspondiente proteína de la cápside de VAA parental.
5 En algunas realizaciones, un virión de VAAr objeto presenta infectividad incrementada al menos 10 veces, al menos 15 veces, al menos 20 veces, al menos 25 veces, al menos 50 veces, o más de 50 veces, de una célula de Müller, cuando se administra por inyección intravítrea, en comparación con la infectividad de la célula de Müller por un virión de VAA que comprende la correspondiente proteína de la cápside de VAA parental, cuando se administra por inyección intravítrea.
En algunas realizaciones, un virión de VAAr objeto presenta infectividad incrementada al menos 10 veces, al menos 15 veces, al menos 20 veces, al menos 25 veces, al menos 50 veces, o más de 50 veces, de una célula bipolar, en comparación con la infectividad de la célula bipolar por un virión de VAA que comprende la correspondiente proteína
15 de la cápside de VAA parental.
En algunas realizaciones, un virión de VAAr objeto presenta infectividad incrementada al menos 10 veces, al menos 15 veces, al menos 20 veces, al menos 25 veces, al menos 50 veces, o más de 50 veces, de una célula bipolar, cuando se administra por inyección intravítrea, en comparación con la infectividad de la célula bipolar por un virión de VAA que comprende la correspondiente proteína de la cápside de VAA parental, cuando se administra por inyección intravítrea.
En algunas realizaciones, un virión de VAAr objeto presenta infectividad incrementada al menos 10 veces, al menos 15 veces, al menos 20 veces, al menos 25 veces, al menos 50 veces, o más de 50 veces, de una célula amacrina,
25 en comparación con la infectividad de la célula amacrina por un virión de VAA que comprende la correspondiente proteína de la cápside de VAA parental.
En algunas realizaciones, un virión de VAAr objeto presenta infectividad incrementada al menos 10 veces, al menos 15 veces, al menos 20 veces, al menos 25 veces, al menos 50 veces, o más de 50 veces, de una célula amacrina, cuando se administra por inyección intravítrea, en comparación con la infectividad de la célula amacrina por un virión de VAA que comprende la correspondiente proteína de la cápside de VAA parental, cuando se administra por inyección intravítrea.
En algunas realizaciones, un virión de VAAr objeto presenta infectividad incrementada al menos 10 veces, al menos
35 15 veces, al menos 20 veces, al menos 25 veces, al menos 50 veces, o más de 50 veces, de una célula horizontal, en comparación con la infectividad de la célula horizontal por un virión de VAA que comprende la correspondiente proteína de la cápside de VAA parental.
En algunas realizaciones, un virión de VAAr objeto presenta infectividad incrementada al menos 10 veces, al menos 15 veces, al menos 20 veces, al menos 25 veces, al menos 50 veces, o más de 50 veces, de una célula horizontal, cuando se administra por inyección intravítrea, en comparación con la infectividad de la célula horizontal por un virión de VAA que comprende la correspondiente proteína de la cápside de VAA parental, cuando se administra por inyección intravítrea.
45 En algunos casos, un virión de VAAr objeto presenta capacidad incrementada al menos 10 veces, al menos 15 veces, al menos 20 veces, al menos 25 veces, al menos 50 veces, o más de 50 veces, de atravesar la membrana limitante interna (MLI), en comparación con la capacidad de un virión de VAA que comprende la correspondiente proteína de la cápside de VAA parental de atravesar la MLI.
En algunos casos, un virión de VAAr objeto presenta capacidad incrementada al menos 10 veces, al menos 15 veces, al menos 20 veces, al menos 25 veces, al menos 50 veces, o más de 50 veces, cuando se administra por inyección intravítrea, de atravesar la membrana limitante interna (MLI), en comparación con la capacidad de un virión de VAA que comprende la correspondiente proteína de la cápside de VAA parental de atravesar la MLI cuando se administra por inyección intravítrea.
55 Un virión de VAAr objeto puede cruzar la MLI, y también puede atravesar capas celulares, incluyendo células de Müller, células amacrinas, etc., para alcanzar las células fotorreceptoras y/o células de EPR. Por ejemplo, un virión de VAAr objeto, cuando se administra por inyección intravítrea, puede atravesar la MLI, y también puede atravesar capas celulares, incluyendo las células de Müller, células amacrinas, etc., para alcanzar las células fotorreceptoras o células de EPR.
En algunas realizaciones, un virión de VAAr objeto infecta selectivamente una célula retiniana, por ejemplo, un virión de VAAr objeto infecta una célula retiniana con 10 veces, 15 veces, 20 veces, 25 veces, 50 veces, o más de 50 veces más de especificidad que una célula no retiniana, por ejemplo, una célula fuera del ojo. Por ejemplo, en
65 algunas realizaciones, un virión de VAAr objeto infecta selectivamente una célula retiniana, por ejemplo, un virión de VAAr infecta una célula fotorreceptora con 10 veces, 15 veces, 20 veces, 25 veces, 50 veces, o más de 50 veces
imagen24
más de especificidad que una célula no retiniana, por ejemplo, una célula fuera del ojo.
En algunas realizaciones, un virión de VAAr objeto infecta selectivamente una célula fotorreceptora, por ejemplo, un virión de VAAr objeto infecta una célula fotorreceptora con 10 veces, 15 veces, 20 veces, 25 veces, 50 veces, o más 5 de 50 veces más de especificidad que una célula no fotorreceptora presente en el ojo, por ejemplo, una célula ganglionar de la retina, una célula de Müller, etc.
En algunas realizaciones, un virión de VAAr objeto presenta infectividad incrementada al menos 10 veces, 15 veces, 20 veces, 25 veces, 50 veces, o más de 50 veces, de una célula fotorreceptora, cuando se administra por inyección intravítrea, en comparación con la infectividad de la célula fotorreceptora por un virión de VAA que comprende la correspondiente proteína de la cápside de VAA parental, cuando se administra por inyección intravítrea.
Productos génicos
15 Un virión de VAAr objeto comprende un ácido nucleico heterólogo que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un producto génico. En algunas realizaciones, el producto génico es un ARN interferente. En algunas realizaciones, el producto génico es un aptámero. En algunas realizaciones, el producto génico es un polipéptido. En algunas realizaciones, el producto génico es una nucleasa específica a sitio que proporciona el silenciamiento (knock-down) específico a sitio de la función del gen.
ARN interferente
Cuando el producto génico es un ARN interferente (ARNi), el ARNi adecuado incluye ARNi que disminuye el nivel de un factor apoptótico o angiogénico en una célula. Por ejemplo, un ARNi puede ser un ARNhc o ARNic que reduce el
25 nivel de un producto génico que induce o fomenta la apoptosis en una célula. Los genes cuyos productos génicos inducen o fomentan la apoptosis se refieren, en el presente documento, como “genes pro-apoptóticos” y los productos de esos genes (ARNm; proteína) se refieren como “productos génicos pro-apoptóticos”. Los productos génicos pro-apoptóticos incluyen, por ejemplo, productos del gen Bax, Bid, Bak, y Bad. Véase, por ejemplo, el documento de patente americana Nº 7.846.730.
Los ARN interferentes también podrían ser frente a un producto angiogénico, por ejemplo, VEGF (por ejemplo, Cand5; véase, por ejemplo, la publicación de Patente americana Nº 2011/0143400; Publicación de Patente americana Nº. 2008/0188437; y Reich y col. (2003) Mol. Vis. 9:210), VEGFR1 (por ejemplo, Sirna-027; véase, por ejemplo, Kaiser y col. (2010) Am. J. Ophthalmol. 150:33; y Shen y col. (2006) Gene Ther. 13:225), o VEGFR2 (Kou y
35 col. (2005) Biochem. 44:15.064). Véase también, los documentos de Patente Americana Nº 6.649.596, 6.399.586, 5.661.135, 5.639.872, y 5.639.736; y los documentos de Patente americana Nº 7.947.659 y 7.919.473.
Aptámeros
Cuando el producto génico es un aptámero, aptámeros ilustrativos de interés incluyen un aptámero frente a factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF). Véase, por ejemplo, Ng y col. (2006) Nat. Rev. Drug Discovery 5:123; y Lee y col. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102:18.902. Por ejemplo, un aptámero de VEGF puede comprender la secuencia de nucleótidos 5’-cgcaaucagugaaugcuuauacauccg-3’ (SEQ ID NO:17). También adecuado para su uso es un aptámero específico a PDGF, por ejemplo, E10030; véase, por ejemplo, Ni y Hui (2009) Ophthalmologica
45 223:401; y Akiyama y col. (2006) J. Cell Physiol. 207:407).
Polipéptidos
Cuando el producto génico es un polipéptido, el polipéptido generalmente es un polipéptido que aumenta la función de una célula retiniana, por ejemplo, la función de una célula fotorreceptora bastón o cono, una célula ganglionar de la retina, una célula de Müller, una célula bipolar, una célula amacrina, una célula horizontal o una célula del epitelio pigmentario de la retina. Polipéptidos ilustrativos incluyen polipéptidos neuroprotectores (por ejemplo, GDNF, CNTF, NT4, NGF, y NTN); polipéptidos anti-angiogénicos (por ejemplo, un receptor del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) soluble; un anticuerpo de unión a VEGF; un fragmento del anticuerpo de unión a VEGF (por 55 ejemplo, un anticuerpo anti-VEGF de cadena sencilla); endostatina, tumstatina, angiostatina; un polipéptido Flt soluble (Lai y col. (2005) Mol. Ther. 12:659); una proteína de fusión Fc que comprende un polipéptido Flt soluble (véase, por ejemplo, Pechan y col. (2009) Gene Ther. 16:10); factor derivado de epitelio pigmentario (PEDF); un receptor Tie-2 soluble; etc.); tejido inhibidor de metaloproteinasa-3 (TIMP-3); una opsina sensible a la luz, por ejemplo, una rodopsina; polipéptidos anti-apoptóticos (por ejemplo, Bcl-2, Bcl-X1); y similares. Polipéptidos adecuados incluyen, pero no se limitan a, factor neurotrófico derivado de la glía (GDNF); factor 2 de crecimiento de fibroblastos; neurturina (NTN); factor neurotrófico ciliar (CNTF); factor de crecimiento de nervio (NGF); neurotrofina-4 (NT4); factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF; por ejemplo, un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 %, al menos aproximadamente 98 %, al menos aproximadamente 99 %, o 100 %, de identidad de secuencia de aminoácidos a 65 una tramo contiguo de desde aproximadamente 200 aminoácidos a 247 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos representada en la Figura 11 (SEQ ID NO:11)); factor de crecimiento epidérmico; rodopsina; inhibidor
imagen25
de apoptosis ligado a X; y gen erizo Sonic.
Opsinas sensibles a la luz adecuadas incluyen, por ejemplo, una opsina sensible a la luz como se describe en la Publicación de Patente americana Nº 2007/0261127 (por ejemplo, ChR2; Chop2); Publicación de Patente americana 5 Nº 2001/0086421; Publicación de Patente americana Nº 2010/0015095; y Diester y col. (2011) Nat. Neurosci.
14:387.
Polipéptidos adecuados también incluyen retinosquisina (por ejemplo, un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 %, al menos aproximadamente 98 %, al menos aproximadamente 99 %, o 100 %, de identidad de secuencia de aminoácidos con un tramo contiguo de desde aproximadamente 200 aminoácidos a 224 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos representada en la Figura 10 (SEQ ID NO:10). Polipéptidos adecuados incluyen, por ejemplo, proteína 1 que interactúa con el regulador de GTPasa de retinitis pigmentosa (RGPR) (véase, por ejemplo, los Nº de acceso de GenBank Q96KN7, Q9EPQ2, y Q9GLM3) (por ejemplo, un polipéptido que comprende una secuencia de 15 aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 %, al menos aproximadamente 98 %, al menos aproximadamente 99 %, o 100 %, de identidad de secuencia de aminoácidos con un tramo contiguo de desde aproximadamente 1.150 aminoácidos a aproximadamente 1.200 aminoácidos, o desde aproximadamente 1.200 aminoácidos a 1.286 aminoácidos, de la secuencia de aminoácidos representada en la Figura 16 (SEQ ID NO:21); periferina-2 (Prph2) (véase, por ejemplo, Nº de acceso de GenBank NP_000313 (por ejemplo, un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 %, al menos aproximadamente 98 %, al menos aproximadamente 99 %, o 100 %, de identidad de secuencia de aminoácidos con un tramo contiguo de desde aproximadamente 300 aminoácidos a 346 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos representada en la Figura 14 (SEQ ID NO:19); y Travis y col. (1991) Genomics 10:733); periferina (por ejemplo, un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene
25 al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 %, al menos aproximadamente 98 %, al menos aproximadamente 99 %, o 100 %, de identidad de secuencia de aminoácidos a un tramo contiguo de desde aproximadamente 400 aminoácidos a aproximadamente 470 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos representada en la Figura 15 (SEQ ID NO:20); una proteína específica a epitelio pigmentario de la retina (EPR65), (por ejemplo, un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 %, al menos aproximadamente 98 %, al menos aproximadamente 99 %, o 100 %, de identidad de secuencia de aminoácidos a un tramo contiguo de desde aproximadamente 200 aminoácidos a 247 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos representada en la Figura 12 (SEQ ID NO:12)) (véase, por ejemplo, GenBank AAC39660; y Morimura y col. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:3.088); y similares.
35 Polipéptidos adecuados también incluyen: CHM (coroideremia (proteína 1 acompañante Rab)), un polipéptido que, cuando es defectuoso o está perdido, causa coroideremia (véase, por ejemplo, Donnelly y col. (1994) Hum. Mol. Genet. 3:1.017; y van Bokhoven y col. (1994) Hum. Mol. Genet. 3:1.041); y homólogo de Crumbs 1 (CRB1), un polipéptido que, cuando es defectuoso o está perdido, causa amaurosis congénita de Leber y retinitis pigmentosa (véase, por ejemplo, den Hollander y col. (1999) Nat. Genet. 23:217; y Nº de Acceso de GenBank CAM23328).
Polipéptidos adecuados también incluyen polipéptidos que, cuando son defectuosos o están perdidos, conducen a acromatopsia, donde tales polipéptidos incluyen, por ejemplo, subunidad alfa del canal regulado de GMPc del cono fotorreceptor (CNGA3) (véase, por ejemplo, Nº de acceso de GenBank NP_001289; y Booij y col. (2011) Ophthalmology 118:160-167); subunidad beta del canal catiónico regulado de GMPc del cono fotorreceptor (CNGB3)
45 (véase, por ejemplo, Kohl y col. (2005) Eur. J. Hum. Genet. 13(3):302); proteína de unión a nucleótido de guanina (G proteína), polipéptido 2 de actividad de transducción alfa (GNAT2) (ACHM4); y ACHM5; y polipéptidos que, cuando son defectuosos o deficientes, conducen a diversas formas de daltonismo (por ejemplo, L-opsina, M-opsina y Sopsina). Véase, Mancuso y col. (2009) Nature 461(7.265):784-787.
Endonucleasas específicas a sitio
En algunos casos, un producto génico de interés es una endonucleasa específica a sitio que proporciona silenciamiento específico a sitio de la función del gen, por ejemplo, cuando la endonucleasa desactiva un alelo asociado con una enfermedad de la retina. Por ejemplo, cuando un alelo dominante codifica una copia defectuosa
55 de un gen que, cuando es de tipo natural, es una proteína estructural de la retina y/o proporciona función de la retina normal, una endonucleasa específica a sitio se puede dirigir al alelo defectuoso y e desactivar el alelo defectuoso.
Además de la desactivación de un alelo defectuoso, también se puede usar una endonucleasa específica a sitio para estimular la recombinación homóloga con un ADN donante que codifica una copia funcional de la proteína codificada por el alelo defectuoso. Por tanto, por ejemplo, un virión de VAAr objeto tanto se puede usar para administrar una endonucleasa específica a sitio que desactiva un alelo defectuoso, como se puede usar para administrar una copia funcional del alelo defectuoso, dando como resultado la reparación del alelo defectuoso, proporcionando de ese modo la producción de una proteína retiniana funcional (por ejemplo, retinosquisina funcional, EPR65 funcional, periferina funcional, etc.). Véase, por ejemplo, Li y col. (2011) Nature 475:217. En algunas realizaciones, un virión de 65 VAAr objeto comprende una secuencia de nucleótidos heteróloga que codifica una endonucleasa específica a sitio; y una secuencia de nucleótidos heteróloga que codifica una copia funcional de un alelo defectuoso, donde la copia
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funcional codifica una proteína retiniana funcional. Las proteínas retinianas funcionales incluyen, por ejemplo, retinosquisina, EPR65, proteína 1 que interactúa con el regulador de GTPasa de retinitis pigmentosa (RGPR), periferina, periferina-2 y similares.
5 Endonucleasas específicas a sitios que son adecuadas para su uso incluyen, por ejemplo, nucleasas de dedo de zinc (ZFN); y nucleasas efectoras similares a activador de transcripción (TALEN), donde tales endonucleasas específicas a sitio no son de origen natural y están modificadas para dirigir un gen específico. Tales nucleasas específicas a sitios se pueden modificar por ingeniería para cortar localizaciones específicas dentro de un genoma, y, a continuación, uniéndose a extremo no homólogo puede reparar la rotura mientras inserta o deleciona diversos nucleótidos. Tales endonucleasas específicas a sitio (también referidas como “INDEL”) a continuación echan la proteína fuera del marco e desactivan eficazmente el gen. Véase, por ejemplo, la Publicación de Patente americana Nº 2011/0301073.
Secuencias reguladoras
15 En algunas realizaciones, una secuencia de nucleótidos codificante de un producto genético de interés está operativamente ligada a un promotor constitutivo. En otras realizaciones, una secuencia de nucleótidos codificante de un producto génico de interés está operativamente ligada a un promotor inducible. En algunos ejemplos, una secuencia de nucleótidos codificante de un producto génico de interés está operativamente ligada a un elemento regulador específico a tejido o específico a tipo celular. Por ejemplo, en algunos ejemplos, una secuencia de nucleótidos codificante de un producto génico de interés está operativamente ligada a un elemento regulador específico a fotorreceptor (por ejemplo, un promotor específico a fotorreceptor), por ejemplo, un elemento regulador que confiere expresión selectiva del gen operativamente ligado en una célula fotorreceptora. Los elementos reguladores específicos a fotorreceptor adecuados incluyen, por ejemplo, un promotor de rodopsina, un promotor de
25 rodopsina quinasa (Young y col. (2003) Ophthalmol. Vis. Sci. 44:4.076); un promotor del gen de beta fosfodiesterasa (Nicoud y col. (2007) J. Gene Med. 9:1.015); un promotor del gen de retinitis pigmentosa (Nicoud y col. (2007) supra); un potenciador del gen de la proteína interfotorreceptora de unión a retinoide (IRBP) (Nicoud y col. (2007) supra); un promotor del gen de IRBP (Yokoyama y col. (1992) Exp. Eye Res. 55:225).
COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS
La presente descripción proporciona una composición farmacéutica que comprende: a) un virión de VAAr objeto, como se describió anteriormente; y b) un vehículo, diluyente, excipiente o tampón farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, el vehículo, diluyente, excipiente o tampón farmacéuticamente aceptable es adecuado para
35 su uso en un ser humano.
Tales excipientes, vehículos, diluyentes y tampones incluyen cualquier agente farmacéutico que se pueda administrar sin toxicidad indebida. Excipientes farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, líquidos tales como agua, solución salina, glicerol y etanol. Sales farmacéuticamente aceptables pueden incluir en las mismas, por ejemplo, sales de ácido mineral tales como clorhidratos, bromohidratos, fosfatos, sulfatos y similares; y las sales de los ácidos orgánicos tales como acetatos, propionatos, malonatos, benzoatos y similares. Además, sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes y emulsionantes, sustancias de tamponamiento de pH y similares pueden estar presentes en tales vehículos. En la técnica se conocen una amplia diversidad de excipientes farmacéuticamente aceptables y no necesitan ser tratados en detalle en el presente documento. Excipientes 45 farmacéuticamente aceptables han sido ampliamente descritos en diversas publicaciones, incluyendo, por ejemplo,
A. Gennaro (2000) "Remington: The Science and Practice of Pharmacy," 20ª edición, Lippincott, Williams, & Wilkins; “Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems” (1999) H.C. Ansel y col., eds., 7ª ed., Lippincott, Williams, & Wilkins; y “Handbook of Pharmaceutical Excipients” (2000) A.H. Kibbe y col., eds., 3ª ed. Amer. Pharmaceutical Assoc.
MÉTODOS DE ADMINISTRACIÓN DE UN PRODUCTO GÉNICO A UNA CÉLULA RETINIANA Y TRATAMIENTO
MÉTODOS
55 La presente descripción proporciona un método de administración de un producto génico a una célula retiniana en un individuo, comprendiendo el método la administración al individuo de un virión de VAAr objeto como se describió anteriormente. El producto génico puede ser un polipéptido o un ARN interferente (por ejemplo, un ARNhc, un ARNic y similares), un aptámero, o una endonucleasa específica a sitio como se describió anteriormente. La administración de un producto génico a una célula retiniana puede proporcionar tratamiento de una enfermedad de la retina. La célula retiniana puede ser un fotorreceptor, una célula ganglionar de la retina, una célula de Müller, una célula bipolar, una célula amacrina, una célula horizontal o una célula de epitelio pigmentario de la retina. En algunos casos, la célula retiniana es una célula fotorreceptora, por ejemplo, una célula bastón o cono.
La presente descripción proporciona un método de tratamiento de una enfermedad de la retina, comprendiendo el
65 método la administración a un individuo que lo necesite de una cantidad eficaz de un virión de VAAr objeto como se describió anteriormente. Un virión de VAAr objeto se puede administrar por inyección intraocular, por inyección intravítrea, o por cualquier otro modo conveniente o vía de administración. Otros modos convenientes o vías de administración incluyen, por ejemplo, intravenoso, intranasal, etc.
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Una “cantidad terapéuticamente eficaz” caerá en un intervalo relativamente amplio que se puede determinar a través
5 de la experimentación y/o los ensayos clínicos. Por ejemplo, por inyección in vivo, es decir, inyección directamente en el ojo, una dosis terapéuticamente eficaz estará en el orden de desde aproximadamente 106 a aproximadamente 1015 de los viriones de VAAr, por ejemplo, desde aproximadamente 108 a 1012 viriones de VAAr. Para la transducción in vitro, una cantidad eficaz de viriones de VAAr a administrar a células estará en el orden de desde aproximadamente 108 a aproximadamente 1013 de los viriones de VAAr. Otras dosis eficaces fácilmente pueden ser establecidas por un experto en la técnica a través de pruebas rutinarias que establecen curvas de respuesta de dosis.
En algunas realizaciones, más de una administración (por ejemplo, dos, tres, cuatro o más administraciones) se pueden emplear para alcanzar el nivel deseado de la expresión génica durante un periodo de diversos intervalos,
15 por ejemplo, diario, semanal, mensual, anual, etc.
Enfermedades oculares que se pueden tratar usando un método objeto incluyen, pero no se limitan a, neuroretinopatía macular aguda; enfermedad de Behcet; neovascularización coroidea, uveitis diabética; histoplasmosis; degeneración macular, tal como degeneración macular aguda, degeneración macular relacionada con la edad no exudativa y degeneración macular relacionada con la edad exudativa; edema, tal como edema macular, edema macular cistoide y edema macular diabético; coroiditis multifocal; trauma ocular que afecta a un sitio
o localización ocular posterior; tumores oculares; trastornos de la retina, tales como oclusión de la vena central de la retina, retinopatía diabética (incluyendo retinopatía diabética proliferativa), vitreorretinopatía proliferativa (VRP), enfermedad oclusiva de la arteria de la retina, desprendimiento de retina, enfermedad de retina uveítica; oftalmia
25 simpatética; síndrome de Vogt Koyanagi-Harada (VKH); difusión de la úvea; una afección ocular posterior causada por o influida por un tratamiento con láser ocular; afecciones oculares posteriores causadas por o influidas por una terapia fotodinámica; fotocoagulación, retinopatía por radiación; trastornos de la membrana epirretiniana; oclusión de la vena ramificada de la retina ; neuropatía óptica isquémica anterior; disfunción diabética de la retina no retinopatía; retinosquisis; retinitis pigmentosa; glaucoma; síndrome de Usher; distrofia cono-bastón; enfermedad de Stargardt (fundus flavimaculatus); degeneración macular hereditaria; degeneración coriorretiniana; amaurosis congénita de Leber; ceguera nocturna estacionaria congénita; coroideremia; síndrome de Bardet-Biedl; telangiectasia macular; neuropatía óptica hereditaria de Leber; retinopatía de prematuridad; y trastornos de visión de color; incluyendo acromatopsia, protanopia, deuteranopia y tritanopia.
35 ÁCIDOS NUCLEICOS Y CÉLULAS HOSPEDADORAS
La presente descripción proporciona un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de la cápside de virus adenoasociado (VAA) variante objeto como se describió anteriormente, donde la proteína de la cápside de VAA variante comprende una inserción de desde aproximadamente 5 aminoácidos a aproximadamente 11 aminoácidos en el bucle GH o bucle IV en relación con una correspondiente proteína de la cápside de VAA parental, y donde la proteína de la cápside variante, cuando está presente en un virión de VAA, proporciona infectividad incrementada de una célula retiniana en comparación con la infectividad de la célula retiniana por un virión de VAA que comprende la correspondiente proteína de la cápside de VAA parental. Un ácido nucleico aislado objeto puede ser un vector de VAA, por ejemplo, un vector de VAA recombinante.
45
Péptidos de inserción
Una proteína de la cápside de VAA variante codificada por un ácido nucleico objeto tiene un péptido de inserción de desde aproximadamente 5 aminoácidos a aproximadamente 11 aminoácidos de longitud insertado en el bucle GH de una cápside de VAA. El péptido de inserción tiene una longitud de 5 aminoácidos, 6 aminoácidos, 7 aminoácidos, 8 aminoácidos, 9 aminoácidos, 10 aminoácidos o 11 aminoácidos.
El péptido de inserción puede comprender una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las fórmulas expuestas a continuación.
55 Por ejemplo, un péptido de inserción puede ser un péptido de desde 5 a 11 aminoácidos de longitud, donde el péptido de inserción es de Fórmula I:
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donde:
cada uno de Y1-Y4, si está presente, se selecciona independientemente de Ala, Leu, Gly, Ser, y Thr; X1, si está presente, se selecciona de Leu, Asn, y Lys; X2 se selecciona de Gly, Glu, Ala, y Asp;
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X3 se selecciona de Glu, Thr, Gly, y Pro;
X4 se selecciona de Thr, IIe, Gln, y Lys;
X5 se selecciona de Thr y Ala;
X6 se selecciona de Arg, Asn, y Thr;
X7, si está presente, se selecciona de Pro y Asn.
Como otro ejemplo, un péptido de inserción puede ser un péptido de desde 5 a 11 aminoácidos de longitud, donde el péptido de inserción es de Fórmula IIa:
10
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donde:
cada uno de Y1-Y4, si está presente, se selecciona independientemente de Ala, Leu, Gly, Ser y Thr;
15 cada uno de X1-X4 es cualquier aminoácido; X5 es Thr; X6 es Arg; y X7 es Pro.
20 Como otro ejemplo, un péptido de inserción puede ser un péptido de desde 5 a 11 aminoácidos de longitud, donde el péptido de inserción es de Fórmula Ilb:
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25 donde:
cada uno de Y1-Y4, si está presente, se selecciona independientemente de Ala, Leu, Gly, Ser y Thr; X1, si está presente, se selecciona de Leu y Asn; X2, si está presente, se selecciona de Gly y Glu;
30 X3 se selecciona de Glu y Thr; X4 se selecciona de Thr y Ile; X5 es Thr; X6 es Arg; y X7 es Pro.
35 Como otro ejemplo, un péptido de inserción puede ser un péptido de desde 5 a 11 aminoácidos de longitud, donde el péptido de inserción es de Fórmula IlI:
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40 donde:
cada uno de Y1-Y4, si está presente, se selecciona independientemente de Ala, Leu, Gly, Ser y Thr;
X1, si está presente, es Lys;
45 X2 se selecciona de Ala y Asp; X3 se selecciona de Gly y Pro; X4 se selecciona de Gln y Lys; X5 se selecciona de Thr y Ala; X6 se selecciona de Asn y Thr;
50 X7, si está presente, es Asn.
Como otro ejemplo, un péptido de inserción puede ser un péptido de desde 5 a 11 aminoácidos de longitud, donde el péptido de inserción es de Fórmula IV:
55
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donde:
cada uno de Y1-Y4, si está presente, se selecciona independientemente de Ala, Leu, Gly, Ser y Thr;
60 X1, si está presente, es un aminoácido positivamente cargado o un aminoácido no cargado; o se selecciona de Leu, Asn, Arg, Ala, Ser y Lys; X2 es un aminoácido negativamente cargado o un aminoácido no cargado; o se selecciona de Gly, Glu, Ala, Val, Thr y Asp; X3 es un aminoácido negativamente cargado o un aminoácido no cargado; o se selecciona de Glu, Thr, Gly, Asp
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o Pro; X4 se selecciona de Thr, IIe, Gly, Lys, Asp y Gln; X5 es un aminoácido polar, un alcohol (un aminoácido que tiene un grupo hidroxilo libre), o un aminoácido
5 hidrófobo; o se selecciona de Thr, Ser, Val y Ala; X6 es un aminoácido positivamente cargado o un aminoácido no cargado; o se selecciona de Arg, Val, Lys, Pro, Thr y Asn; y X7, si está presente, es un aminoácido positivamente cargado o un aminoácido no cargado; o se selecciona de Pro, Gly, Phe, Asn y Arg.
Como ejemplos no limitantes, el péptido de inserción puede comprender una secuencia de aminoácidos seleccionada de LGETTRP (SEQ ID NO:13), NETITRP (SEQ ID NO:14), KAGQANN (SEQ ID NO:15), KDPKTTN (SEQ ID NO:16), KDTDTTR (SEQ ID NO:57), RAGGSVG (SEQ ID NO:58), AVDTTKF (SEQ ID NO:59), y STGKVPN (SEQ ID NO:60).
15 En algunos casos, el péptido de inserción tiene desde 1 a 4 aminoácidos espaciadores (Y1-Y4) en el terminal amino y/o en el terminal carboxilo de una cualquiera de LGETTRP (SEQ ID NO:13), NETITRP (SEQ ID NO:14), KAGQANN (SEQ ID NO:15), KDPKTTN (SEQ ID NO:16), KDTDTTR (SEQ ID NO:57), RAGGSVG (SEQ ID NO:58), AVDTTKF (SEQ ID NO:59), y STGKVPN (SEQ ID NO:60). Aminoácidos espaciadores adecuados incluyen, pero no se limitan a, leucina, alanina, glicina y serina.
Por ejemplo, en algunos casos, un péptido de inserción tiene una de las siguientes secuencias de aminoácidos: LALGETTRPA (SEQ ID NO:45); LANETITRPA (SEQ ID NO:46), LAKAGQANNA (SEQ ID NO:47), LAKDPKTTNA (SEQ ID NO:48), LAKDTDTTRA (SEQ ID NO:61), LARAGGSVGA (SEQ ID NO:62), LVAADTTKFA (SEQ ID NO:63),
25 y LASTGKVPNA (SEQ ID NO:64). Como otro ejemplo, en algunos casos, un péptido de inserción tiene una de las siguientes secuencias de aminoácidos: AALGETTRPA (SEQ ID NO:49); AANETITRPA (SEQ ID NO:50), AAKAGQANNA (SEQ ID NO:51), y AAKDPKTTNA (SEQ ID NO:52). Como otro ejemplo más, en algunos casos, un péptido de inserción tiene una de las siguientes secuencias de aminoácidos: GLGETTRPA (SEQ ID NO:53); GNETITRPA (SEQ ID NO:54), GKAGQANNA (SEQ ID NO:55), y GKDPKTTNA (SEQ ID NO:56). Como otro ejemplo, en algunos casos, un péptido de inserción comprende una de KDTDTTR (SEQ ID NO:57), RAGGSVG (SEQ ID NO:58), AVDTTKF (SEQ ID NO:59), y STGKVPN (SEQ ID NO:60), flanqueada en el terminal C por AA y en el terminal N por A; o comprende una de KDTDTTR (SEQ ID NO:57), RAGGSVG (SEQ ID NO:58), AVDTTKF (SEQ ID NO:59), y STGKVPN (SEQ ID NO:60) flanqueada en el terminal C por G y en el terminal N por A.
35 Un vector de VAA recombinante objeto se puede usar para generar un virión de VAA recombinante objeto, como se describió anteriormente. Por tanto, la presente descripción proporciona un vector de VAA recombinante que, cuando se introduce en una célula adecuada, puede proporcionar la producción de un virión de VAA recombinante objeto.
La presente invención proporciona además células hospedadoras, por ejemplo, células hospedadoras aisladas (genéticamente modificadas), que comprenden un ácido nucleico objeto. Una célula hospedadora objeto puede ser una célula aislada, por ejemplo, una célula en cultivo in vitro. Una célula hospedadora objeto es útil para producir un virión de VAAr objeto, como se describe más adelante. Cuando una célula hospedadora objeto se usa para producir un virión de VAAr objeto, se refiere como “célula empaquetadora”. En algunas realizaciones, una célula hospedadora objeto está genéticamente modificada de manera estable con un ácido nucleico objeto. En otras
45 realizaciones, una célula hospedadora objeto están genéticamente modificada de manera transitoria con un ácido nucleico objeto.
Un ácido nucleico objeto se introduce de manera estable o transitoria en una célula hospedadora, usando técnicas establecidas, que incluyen, pero no se limitan a, electroporación, precipitación de fosfato de calcio, transfección mediada por liposoma y similares. Para transformación estable, un ácido nucleico objeto generalmente incluirá además un marcador seleccionable, por ejemplo, cualquiera de los diversos marcadores seleccionables bien conocidos tales como resistencia a neomicina, y similares.
Una célula hospedadora se genera introduciendo un ácido nucleico objeto dentro de alguna de diversas células, por
55 ejemplo, células mamíferas, incluyendo, por ejemplo, células murinas y células primates (por ejemplo, células humanas). Células mamíferas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, células primarias y líneas celulares, donde las líneas celulares adecuadas incluyen, pero no se limitan a, células 293, células COS, células HeLa, células Vero, fibroblastos de ratón 3T3, fibroblastos C3H10T1/2, células CHO y similares. Ejemplos no limitantes de células hospedadoras adecuadas incluyen, por ejemplo, células HeLa (por ejemplo, “American Type Culture Collection” (ATCC) Nº CCL-2), células CHO (por ejemplo, ATCC Nº CRL9618, CCL61, CRL9096), células 293 (por ejemplo, ATCC Nº CRL-1573), células Vero, células NIH 3T3 (por ejemplo, ATCC Nº CRL-1658), células Huh-7, células BHK (por ejemplo, ATCC Nº CCL10), células PC12 (ATCC No. CRL1721), células COS, células COS-7 (ATCC Nº CRL1651), células RAT1, células L de ratón (ATCC Nº CCLI.3), células de riñón embrionario humano (HEK) (ATCC Nº CRL1573), células HLHepG2, y similares. Una célula hospedadora objeto también se puede producir usando un
65 baculovirus para infectar células de insecto tales como células Sf9, que producen VAA (véase, por ejemplo, el documento de Patente Nº 7.271.002; Publicación de Patente americana 12/297.958).
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En algunas realizaciones, una célula hospedadora genéticamente modificada objeto incluye, además de un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos codificante de una proteína de la cápside de VAA variante, como se describió anteriormente, un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos codificante de una
o más proteínas rep de VAA. En otras realizaciones, una célula hospedadora objeto comprende además un vector
5 de VAAr. Un virión de VAAr se puede generar usando una célula hospedadora objeto. Métodos de generación de un virión de VAAr están descritos en, por ejemplo, la Publicación de Patente americana Nº 2005/0053922 y Publicación de Patente americana 2009/0202490.
Ejemplos
10 Los siguientes ejemplos se proponen para proporcionar a los expertos en la técnica una descripción completa y una descripción de cómo producir y usar la presente invención, y no pretenden limitar el alcance de lo que los inventores consideran su invención ni pretenden representar que los experimentos de más adelante son todos o los únicos experimentos realizados. Se han realizado esfuerzos para asegurar la exactitud con respecto a los números usados
15 (por ejemplo, cantidades, temperaturas, etc.) pero algunos errores experimentales y desviaciones se deberían tener en cuenta. A menos que se indique lo contrario, partes son partes en peso, peso molecular es el peso molecular promedio, temperatura es en grados Celsius, y la presión está en o cerca de la atmosférica. Se pueden usar abreviaciones estándar, por ejemplo, pb, par(es) de bases; kb, kilobase(s), pl, picolitro(s); s o seg, segundo(s), min, minuto(s); h o hr, hora(s); aa, aminoácido(s); kb, kilobase(s); pb, par(es) de bases; nt, nucleótido(s); i.m.,
20 intramuscular(mente); i.p., intraperitoneal(mente); s.c., subcutánea(mente); y similares.
Ejemplo 1: variante de VAA con transducción aumentada de células retinianas
El planteamiento usado era crear una genoteca de demostración de péptido introduciendo un sitio AvrII único en el
25 genoma de VAA2 de tipo natural entre los aminoácidos 587 y 588 por mutagénesis por reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Un inserto de 21 nucleótido aleatorio, 7mer For, se usó para sintetizar los insertos de ADNdc, junto con el cebador antisentido 7mer Rev. Los insertos resultantes de ADNdc se clonaron en el sitio AvrII del genoma después de la digestión con NheI, produciendo una genoteca de demostración de 7mer diversa que, a continuación, se empaquetó (Perabo y col., 2003; Müller y col., 2003). El virus se generó de modo que cada genoma
30 viral se empaquetó o se sometió a encapsidación dentro de la proteína de la cápside variante que ese genoma codificaba. A este respecto, las mejoras funcionales identificadas a través de la selección pueden estar ligadas a la secuencia de genoma codificante de esta función mejorada contenida dentro de la cápside del virus.
Esta genoteca se sometió a selección positiva dentro de ratones rho-GFP (Wensel y col. (2005) Vision Res.
35 45:3.445). Brevemente, en una ronda de selección, se inyectaron inravitreamente ratones rho-GFP adultos con 2 µl de genoteca purificada por iodixanol, dializada con solución salina tamponada con fosfato (PBS) con una titulación genómica de aproximadamente 1x1012 genomas virales (gv)/ml. Se pasó una aguja desechable 30 1/2 gauge ultrafina a través de la esclerótica del ojo del animal, en el ecuador y próximo a los limbos, dentro de la cavidad vítrea. La inyección de 2 µl de virus se realizó con observación directa de la aguja en el centro de la cavidad vítrea.
40 Una semana después de la inyección, los ojos se sometieron a enucleación y las retinas se disociaron usando un tratamiento con luz, papaína proteasa, seguido por aislamiento por clasificador de célula activada por fluorescencia (FACS) de poblaciones fotorreceptoras. A continuación, lo viriones favorables se amplificaron por PCR a partir de extracciones genómicas posteriores y se clonaron más y se reempaquetaron para inyección.
45 Iteraciones adicionales de esta selección se realizaron, reduciendo el conjunto de variantes a un subconjunto con las mutaciones más permisivas. Después de tres iteraciones, se realizó una ronda de PCR propensa a error para crear una generación adicional de variantes para la selección. En total, este proceso se repitió para dos generaciones. A este respecto, este proceso de evolución dirigida creó variantes de VAA permisivas a fotorreceptor por la aplicación de selección positiva y mutagénesis inducida, similar al proceso de la evolución natural.
50 Posteriormente, los genes cap de cincuenta variantes se secuenciaron para determinar las variantes más prominentes y eficaces para tener mutaciones permisivas para la transducción intravítrea de fotorreceptor. De los 50 clones, 46 dieron secuencias legibles de un inserto 7mer. Notablemente, casi dos tercios de los clones contenían el mismo motivo de 7mer distinto (∼588LGETTRP∼; SEQ ID NO:13). Interesantemente, la próxima variante más
55 prominente (∼588NETITRP∼; SEQ ID NO:14) también contenía un motivo flanqueador similar que consistía en un resto de arginina positivamente cargado en entre una treonina polar y un resto de prolina no polar (TRP).
Tabla 1
Clon
Frecuencia aproximada (%) Frecuencia
∼588LGETTRP∼ (SEQ ID NO:13)
64 31
∼588NETITRP∼ (SEQ ID NO:14)
12 5
∼588KAGQANN∼ (SEQ ID NO:15)
6 3
∼588KDPKTTN∼ (SEQ ID NO:16)
4 2
∼588KDTDTTR∼ (SEQ ID NO:57)
2
imagen36
∼588RAGGSVG (SEQ ID NO:58)
1
∼588AVDTTKF (SEQ ID NO:59)
1
∼588STGKVPN (SEQ ID NO:60)
1
Tabla 1. La secuenciación de variantes aisladas a partir de evolución dirigida revela un alto grado de convergencia en las genotecas virales. Todas las variantes derivadas de la genoteca 7mer de VAA2, con aproximadamente 64 % de variantes que contienen el mismo motivo 7mer (∼588LGETTRP∼ (SEQ ID NO:13).
5 Entre las secuencias del inserto 7mer, había preferencias moderadas en posiciones particulares, por ejemplo, un aminoácido positivamente cargas en la posición 1; un aminoácido negativamente cargado en la posición 2; un alcohol (por ejemplo, un aminoácido que tiene un grupo alcohol (un grupo hidroxilo libre), tal como Thr o Ser) en la posición 5.
10 Los insertos 7mer estaban flanqueados por espaciadores, como se muestran en la Tabla 2:
Clon
Frecuencia
∼588LALGETTRPA∼ (SEQ ID NO:45)
31
∼588LANETITRPA∼ (SEQ ID NO:46)
5
∼588LAKAGQANNA∼ (SEQ ID NO:47)
3
∼588LAKDPKTTNA∼ (SEQ ID NO:48)
2
∼588LAKDTDTTRA∼ (SEQ ID NO:61)
2
∼588LARAGGSVGA∼ (SEQ ID NO:62)
1
∼588LVAADTTKFA∼ (SEQ ID NO:63)
1
∼588LASTGKVPNA∼ (SEQ ID NO:64)
1
Figura 1. Modelo proteína de la cápside tridimensional representativo de VAA2 que contiene un heptámero aleatorio
15 (mostrado en naranja) después del aminoácido 587. Esta área de la cápside de VAA2 probablemente participa en la unión a receptor de superficie celular.
Teniendo en cuenta el alto grado de convergencia de genoteca a partir de la selección anteriormente descrita, una forma recombinante de ∼588LGETTRP∼ de VAA2 (SEQ ID NO:13; nombrada 7M8) se clonó y empaquetó el vector 20 con un transgen scCAG-GFP para visualizar su perfil de transducción. Tres semanas después de la inyección intravítrea en ratones adultos, se observó expresión fuerte en numerosos tipos celulares, incluyendo células ganglionares de la retina (CGR) y células de Müller. Importantemente, se observó transducción de fotorreceptores en retinas inyectadas con 7M8, visto por la expresión de GFP en núcleos de la capa nuclear externa (CNE) (flechas rojas) y en segmentos externos (Figura 2, flecha azul), mientras que VAA2 no mostró expresión discernible de
25 fotorreceptor.
Figura 2. La variante 7M8 de VAA2 (derecha) demuestra mayores niveles de transducción de fotorreceptor intravítrea en relación con VAA2 (izquierda). El microscopio confocal de secciones de retina transversales tres semanas después de la inyección intravítrea de 2 µl de 1x1012 gv/ml de 7M8 de VAA2 y scCAG GFP de VAA2 en
30 ratones adultos. Las flechas rojas (arriba) indican el núcleo fotorreceptor y la flecha azul (arriba) indica segmentos exteriores de fotorreceptor.
Teniendo en cuenta estas ganancias en la transducción de la célula de la retina, se hizo un intento de incrementar la especificidad en la expresión a través del uso de un transgen ssRho-eGFP que contenía un promotor de rodopsina 35 específico a fotorreceptor para resolver mejor las eficacias de transducción específicamente en fotorreceptores (Figura 3). De hecho, el uso de un promotor Rho específico a fotorreceptor limitó la expresión de GFP a los fotorreceptores. Se hizo un intento de mejorar la eficacia de transducción de 7M8 combinando un planteamiento de diseño racional con el planteamiento anterior de evolución dirigida. Por lo tanto, cuatro restos de tirosina expuestos de superficie se mutaron a fenilalaninas en la cápside de 7M8 (Y273F, Y444F, Y500F y Y730F) que previamente se
40 ha mostrado que incrementan la infectividad del fotorreceptor (Petrs-Silva y col., 2009). Interesantemente, la adición de mutaciones disminuyó el número de fotorreceptores sometidos a transducción en comparación con el virus original mostrado por clasificación FAC de los fotorreceptores GFP(+) de retinas infectadas con 7m8 o 7m8-4YF (Figura 4).
45 Figura 3. Imágenes de fluorescencia representativas de criocortes de retina que muestran expresión de GFP resultante de 7m8 que lleva el gen de GFP bajo el control del promotor CAG ubicuo (izquierda) o un promotor de Rho específico a fotorreceptor (derecha).
Figura 4. Las células fotorreceptoras GFP(+) por millón de células de retina contadas por citometría de flujo. 7m8
50 transduce más de dos veces la cantidad de fotorreceptores en comparación con 7m8 que lleva 4 mutaciones de tirosina (arriba).
imagen37
Ejemplo 2: Tratamiento de retinosquisis
Usando la construcción de expresión 7m8-rho-RS1, se administró una proteína retinosquisina funcional (RS1) a ratones deficientes en retinosquisina (ratones deficientes en Rslh; Rslh es el homólogo de ratón de la RS1 humana).
5 El vector comprende una secuencia de nucleótidos codificante de una proteína retinosquisina funcional bajo control transcripcional de un promotor de rodopsina. Véase las Figuras 13A-C, donde la secuencia de nucleótidos en negrita y subrayada (nucleótidos 4.013-4.851) son el promotor de rodopsina; y los nucleótidos 4.866-5.540 (con las secuencias de inicio atg y de parada tga mostradas en negrita) codifican una proteína RS1 humana.
10 La construcción 7m8-rho-RS1 se administró de manera intravítrea a ratones Rslh-/-en P15. Los ratones Rslh-/-se generaron a través de alteración dirigida de exón 3 del gen Rslh, como se describe (Weber y col. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:6222). Los ratones Rslh-/-son deficientes en el producto proteico Rslh, tienen un ERG electronegativo (por ejemplo, una onda b reducida con conservación relativa de la onda a) y división de las capas de la retina, similar a lo visto en pacientes de retinosquisis humana. La inyección del vector 7m8-rho-RS1 en los Rslh-/
15 conduce a altos niveles de expresión de RS1 panretiniana de fotorreceptores en la retina. La expresión de RS1 conduce a morfología mejorada de la retina con un descenso en el número y tamaño de cavidades en la retina como se ve en la imagen por tomografía de coherencia óptica de dominio espectral (SD-OCT) (Figuras 7A-I), un rescate de la onda b de ERG (Figuras 8A-D), y conservación estructural a largo plazo de la retina (Figuras 9A-E).
20 Figuras 7A-I. Imágenes de SD-OCT de alta resolución representativas de retinas inyectadas con 7m8-rho-GFP (columna izquierda), 7mo8-rho-RS1 (columna del medio), o animales de tipo natural no inyectados (columna derecha). Se tomaron imágenes del fondo a través de la capa nuclear interna de la retina superior y excluyen otras capas (a-c). Las imágenes transversales de la retina superior (d-f) e inferior (g-i) se tomaron usando la cabeza del nervio óptico como punto de referencia.
25 La retina RS1 no tratada incrementa en general el espesor cuando se mide desde la membrana limitante interna (MLI) a los fotorreceptores, como los progresos patológicos debido a la división por esquisis de la retina interna. Este proceso es distinto del observado en la mayoría de las enfermedades degenerativas de la retina (EDR) que no forman esquisis, pero presentan muerte progresiva de célula fotorreceptora en la CNI y estrechamiento
30 concomitante de retina y pérdida de amplitud de ERG. En RS1, la CNE se estrecha ya que los fotorreceptores mueren de la enfermedad, pero esto es distinto del cambio del espesor general de la retina. Generalmente se piensa que una terapia con éxito para RS1 volverá el espesor general de la retina al tipo natural y aliviará la pérdida de fotorreceptor en la CNE. En la mayoría de EDR aparte de RS1, la pérdida de fotorreceptores, marcados por el estrechamiento de la CNE, se iguala por un descenso en la producción fisiológica de retina medida por la amplitud
35 de ERG. RS1 es uno de los muy pocos ejemplos de una enfermedad de la retina en la que la patología incrementa el espesor de la retina con concomitante pérdida de amplitud de ERG. En resumen, restaurar el producto génico de RS1, un “pegamento” de retina extracelular; -estrecha la parte de atrás de la retina al espesor de tipo natural y la amplitud de ERG vuelve a niveles normales cercanos ya que soluciona la esquisis.
40 La Figura 8a muestra una comparación de rescate funcional de ojos de Rs1-/-no tratados con ojos inyectados con VAA2-rho-RS1, 7m8-rho-GFP y 7m8-rho-RS1 tanto un mes (izquierda) como 4 meses (derecha) después de la inyección. Un mes después de la inyección, 7m8-rho-RS1 condujo a rescate considerable de la amplitud de onda b de ERG, mientras que VAA2-rho.RS1 era estadísticamente indistinguible de los ojos no tratados.
45 Después de 4 meses, la amplitud de 7m8-rho-RS1 se incrementa más hacia la amplitud de tipo natural (derecha). La Figura 8b muestra que rastros de ERG representativos de ojos inyectados con 7m8-rho-RS1 muestran amplitud mejorada de la onda a y onda b y una forma de onda más cercana a los ojos de tipo natural, en comparación con los ojos inyectados con 7m8-rho-GFP. La Figura 8c muestra la amplitud de la onda b escotópica de campo completo resultante de un estímulo de alta intensidad (1 log cd x s/m2) registrada sobre una base mensual comenzando un
50 mes después de la inyección en P15 para cada condición. Se registraron tres respuestas y se calculó la media para cada ojo en cada momento.
Las amplitudes medias de la onda b de ERG se trazaron como una función del momento después de la inyección. n=7 se usó para ambas condiciones. La Figura 8d muestra un análisis de las respuestas de ERG bajo condiciones
55 escotópicas (rastros superiores, intervalo del estímulo desde -3 a 1 log cd x s/m2) y fotópicas (rastros inferiores, intervalo desde -0,9 a 1,4 log cd x s/m2) indica función mejorada de bastón y cono durante un intervalo de intensidades de estímulos.
Figuras 9A-E. Mejoras constantes en el espesor de la retina medido a los 10 meses después del tratamiento con
60 7m8-rho-RS1. Imágenes de SD-OCT transversales representativas de retinas tratadas con a) 7m8-rho-RS1 o b) o 7m8-rho-GFP 10 meses después de la inyección centradas en la cabeza del nervio óptico. Medidas de c) espesor de la retina, d) espesor de CNE, y e) espesor del segmento interior y exterior se trazan como una función de la distancia desde la cabeza del nervio óptico.

Claims (14)

  1. imagen1
    REIVINDICACIONES
    1. Un virión de virus adenoasociado recombinante (VAAr), o una composición farmacéutica que comprende dicho virión, para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad ocular en un individuo que lo necesite, en donde la composición comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable y en donde el virión del virus adenoasociado recombinante (VAAr) comprende:
    a) una proteína de la cápside de VAA variante, en donde la proteína de la cápside de VAA variante comprende una inserción de un péptido en el bucle GH de la proteína de la cápside en relación con una correspondiente proteína de la cápside de VAA parental, en donde la inserción comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de LGETTRP (SEQ ID NO:13), NETITRP (SEQ ID NO:14), KAGQANN (SEQ ID NO:15), KDPKTTN (SEQ ID NO:16), KDTDTTR (SEQ ID NO:57), RAGGSVG (SEQ ID NO:58), AVDTTKF (SEQ ID NO:59) y STGKVPN (SEQ ID NO:60); y
    b) un ácido nucleico heterólogo que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un producto génico;
    en donde la proteína de la cápside variante infecta una célula retiniana.
  2. 2. El virión de VAAr o la composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 1, en donde el sitio de inserción está dentro de los aminoácidos 570 a 611 de la proteína de la cápside de VAA2 expuesta en SEQ ID NO:1,
    o la correspondiente posición en la proteína de la cápside de otro serotipo de VAA.
  3. 3.
    El virión de VAAr o la composición farmacéutica para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en donde la célula retiniana es un fotorreceptor, una célula ganglionar de la retina, una célula de Müller, una célula bipolar, una célula amacrina, una célula horizontal o una célula de epitelio pigmentario de la retina
  4. 4.
    El virión de VAAr o la composición farmacéutica para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicho tratamiento es por inyección intraocular.
  5. 5.
    El virión de VAAr o la composición farmacéutica para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicho tratamiento es por inyección intravítrea.
  6. 6.
    El virión de VAAr o la composición farmacéutica para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la enfermedad ocular es glaucoma, retinitis pigmentosa, degeneración macular, retinosquisis, amaurosis congénita de Leber, retinopatía diabética, acromatopsia o daltonismo.
  7. 7.
    Un virión de virus adenoasociado recombinante (VAAr) que comprende:
    a) una proteína de la cápside de VAA variante, en donde la proteína de la cápside de VAA variante comprende una inserción de un péptido en el bucle GH de la proteína de la cápside en relación con una correspondiente proteína de la cápside de VAA parental, en donde la inserción comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de LGETTRP (SEQ ID NO:13), NETITRP (SEQ ID NO:14), KAGQANN (SEQ ID NO:15), KDPKTTN (SEQ ID NO:16), KDTDTTR (SEQ ID NO:57), RAGGSVG (SEQ ID NO:58), AVDTTKF (SEQ ID NO:59) y STGKVPN (SEQ ID NO:60), y en donde la proteína de la cápside variante confiere infectividad de una célula retiniana; y
    b) un ácido nucleico heterólogo que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un producto génico.
  8. 8.
    El virión de VAAr de la reivindicación 7, en el que el sitio de inserción está dentro de los aminoácidos 570 a 611 del conjunto de proteína de la cápside de VAA2 expuesto en SEQ ID NO:1, o la correspondiente posición en la proteína de la cápside de otro serotipo de VAA.
  9. 9.
    El virión de VAAr de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 8, en donde la célula retiniana es un fotorreceptor, una célula ganglionar de la retina, una célula de Müller, una célula bipolar, una célula amacrina, una célula horizontal
    o una célula del epitelio pigmentario de la retina.
  10. 10.
    El virión de VAAr de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en donde el producto génico es un ARN interferente, un aptámero o un polipéptido.
  11. 11.
    El virión de VAAr de la reivindicación 10, en el que el polipéptido se selecciona del grupo que consiste en: factor neurotrófico derivado de la glía, factor 2 de crecimiento de fibroblastos, neurturina, factor neurotrófico ciliar, factor de crecimiento del nervio, factor neurotrófico derivado del cerebro, factor de crecimiento epidérmico, rodopsina, inhibidor ligado a X de apoptosis, retinosquisina, EPR65, proteína 1 que interactúa con GTPasa de retinitis pigmentosa, periferina, periferina 2, una rodopsina y Sonic hedgehog.
  12. 12.
    Una composición farmacéutica que comprende:
    85
    imagen2
    a) un virión de virus adenoasociado recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11; y b) un excipiente farmacéuticamente aceptable. 5
  13. 13. Un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de la cápside de virus adenoasociado (VAA) variante, en donde la proteína de la cápside de VAA variante es como se define en cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11.
    10 14. Una célula hospedadora genéticamente modificada aislada que comprende el ácido nucleico de la reivindicación
  14. 13.
    86
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