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ES2625548T3 - Isoformas de glicosilación de la calicreína-1 tisular humana - Google Patents

Isoformas de glicosilación de la calicreína-1 tisular humana Download PDF

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Publication number
ES2625548T3
ES2625548T3 ES13801165.5T ES13801165T ES2625548T3 ES 2625548 T3 ES2625548 T3 ES 2625548T3 ES 13801165 T ES13801165 T ES 13801165T ES 2625548 T3 ES2625548 T3 ES 2625548T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
klk1
polypeptide
composition
amino acid
seq
Prior art date
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Active
Application number
ES13801165.5T
Other languages
English (en)
Inventor
Matthew Charles
Tadeusz Kolodka
Mark Williams
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Diamedica Therapeutics Inc
Original Assignee
Diamedica Therapeutics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Diamedica Therapeutics Inc filed Critical Diamedica Therapeutics Inc
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Publication of ES2625548T3 publication Critical patent/ES2625548T3/es
Active legal-status Critical Current
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Abstract

Una composición que comprende una primera forma madura y activa de un polipéptido de calicreína-1 tisular humana (KLK1) y una segunda forma madura y activa de un polipéptido de calicreína-1 tisular humana (KLK1), en la que el primer polipéptido de KLK1 tiene tres glicanos ligados a N unidos a los residuos 78, 84 y 141 como se define por SEQ ID NO: 1 y el segundo polipéptido de KLK1 tiene dos glicanos ligados a N unidos a los residuos 78 y 84 pero no a 141 como se define por SEQ ID NO:2; y en la que el primer polipéptido de KLK1 y el segundo polipéptido de KLK1 están presentes en la composición en una proporción que varía de 45:55 a 55:45.

Description

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DESCRIPCION
Isoformas de glicosilacion de la calicrema-1 tisular humana Antecedentes
En individuos sanos, la liberacion de insulina por el pancreas se asocia estrictamente a la glucemia. Una glucemia elevada como la que se produce despues de las comidas se compensa rapidamente por un aumento correspondiente en la secrecion de insulina. La diabetes mellitus, o simplemente diabetes, es un grupo de enfermedades metabolicas en las que una persona tiene hiperglucemia, debido a que el pancreas no produce suficiente insulina, o bien debido a que las celulas no responden a la insulina que se produce. Alrededor de 366 millones de personas en todo el mundo padecen diabetes mellitus. La diabetes sin tratar puede provocar muchas complicaciones. Las complicaciones agudas incluyen cetoacidosis diabetica y coma hiperosmolar no cetosico. Las complicaciones a largo plazo graves incluyen enfermedad cardiovascular, insuficiencia renal cronica, retinopatfa diabetica, y neuropatfa diabetica. El tratamiento adecuado de la diabetes es, por tanto, importante y existe una necesidad de obtener tratamientos mejorados para el tratamiento de la diabetes.
Breve sumario de la invencion
La presente invencion incluye una composicion, que comprende una primera forma madura y activa de un polipeptido de calicrema-1 tisular humana (KLK1) y una segunda forma madura y activa de un polipeptido de calicrema-1 tisular humana (KLK1):
en la que el primer polipeptido de KLK1 tiene tres glicanos ligados a N unidos a tres posiciones diferentes por polipeptido y el segundo polipeptido de KLK1 tiene dos glicanos unidos a dos posiciones diferentes por polipeptido; y
en la que el primer polipeptido de KLK1 y el segundo polipeptido de KLK1 estan presentes en la composicion en una proporcion que vana de 45:55 a 55:45.
Los tres glicanos del primer polipeptido de KLK1 son glicanos ligados a N en los residuos 78, 84, y 141. Los dos glicanos del segundo polipeptido de KLK1 son glicanos ligados a N en los residuos 78 y 84 pero no en 141. En algunos aspectos, la proporcion del primer polipeptido de KLK1 y el segundo polipeptido de KLK1 en la composicion es de 50:50.
La presente invencion incluye una composicion que incluye una isoforma triplemente glicosilada de un polipeptido de calicrema-1 tisular (KLK1) y una isoforma doblemente glicosilada de un polipeptido de calicrema-1 tisular (KLK1), en la que la isoforma triplemente glicosilada del polipeptido de KLK1 y la isoforma doblemente glicosilada del polipeptido de KLK1 estan presentes en la composicion en una proporcion que vana de 45:55 a 55:45.
La isoforma triplemente glicosilada incluye glicanos ligados a N en los residuos aminoaddicos 78, 84, y 141 de KLK1, como se define por SEQ ID NO:1. La isoforma doblemente glicosilada incluye glicanos ligados a N en los residuos aminoaddicos 78 y 84, pero no en el residuo aminoaddico 141 de KLK1, como se define por SEQ ID NO:1. En algunos aspectos, la isoforma triplemente glicosilada y la isoforma doblemente glicosilada de KLK1 estan presentes en la composicion en una proporcion de 50:50. En algunos aspectos de una composicion de la presente invencion, uno o mas polipeptido(s) de KLK1 son un polipeptido de calicrema-1 tisular humana (hKLK1).
En algunos aspectos de una composicion de la presente invencion, uno o mas polipeptido(s) de KLK1 incluyen los residuos aminoaddicos 78-141 de SEQ ID NO:1 o los residuos aminoaddicos 78-141 de SEQ ID NO:2.
En algunos aspectos de una composicion de la presente invencion, uno o mas polipeptido(s) de KLK1 incluyen los residuos aminoaddicos 25-262 de SEQ ID NO:1 o los residuos aminoaddicos 25-262 de SEQ ID NO:2.
En algunos aspectos de una composicion de la presente invencion, uno o mas polipeptido(s) de KLK1 incluyen una secuencia de aminoacidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 95 % con SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:2.
En algunos aspectos de una composicion de la presente invencion, uno o mas polipeptido(s) de KLK1 incluyen una secuencia de aminoacidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 95 % con los residuos aminoaddicos 25-262 de SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:2.
En algunos aspectos de una composicion de la presente invencion, uno o mas polipeptido(s) de KLK1 incluyen una secuencia de aminoacidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 95 % con los residuos aminoaddicos 25-262 de SEQ ID NO:2, y en la que dicho(s) polipeptido(s) de KLK1 comprende(n) E145 y/o A188.
En algunos aspectos de una composicion de la presente invencion, uno o mas polipeptido(s) de KLK1 incluyen una secuencia de aminoacidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 95 % con los residuos aminoaddicos 25-262 de SEQ ID NO:2, y dicho(s) polipeptido(s) de KLK1 comprende(n) Q145 y/o V188.
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En algunos aspectos de una composicion de la presente invencion, el/los polipeptido(s) de KLK1 tiene(n) SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:2.
En algunos aspectos de una composicion de la presente invencion, el/los polipeptido(s) de KLK1 tiene(n) los residuos 25-262 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO:2.
En algunos aspectos de una composicion de la presente invencion, una composicion incluye ademas un diluyente, adyuvante o vehmulo farmaceuticamente aceptable.
En algunos aspectos de una composicion de la presente invencion, la composicion esta sustancialmente libre de otras isoformas glicosiladas (glicoformas) de KLK1.
En algunos aspectos de una composicion de la presente invencion, la composicion tiene niveles de endotoxina de menos de 1 UE/mg de protema, protema de celula huesped de menos de 100ng/mg de protema total, ADN de celula huesped de menos de 10 pg/mg de protema total, y/o esta sustancialmente libre de agregados (apareciendo mas de aproximadamente un 95 % como un pico unico por SEC HPLC).
La presente invencion tambien incluye un dispositivo que incluye una composicion como se describe en el presente documento, en la que el dispositivo es adecuado para administrar la composicion por via subcutanea. En algunos aspectos, el dispositivo es una jeringuilla. En algunos aspectos, la jeringuilla incluye ademas un montaje con aguja hipodermica unido a la jeringuilla. En algunos aspectos, la jeringuilla incluye ademas un recubrimiento protector alrededor del montaje con aguja. En algunos aspectos, la jeringuilla tiene una aguja que tiene una longitud de 1,27 cm (^ pulgadas) a 1,59 cm (5/8 pulgadas) y tiene un calibre de 25 a aproximadamente 31.
Se divulgan procedimientos de tratamiento de un sujeto que necesita el mismo, incluyendo administrar al sujeto una composicion como se describe en el presente documento.
En algunos aspectos de los procedimientos, la administracion es administracion subcutanea.
En algunos aspectos de los procedimientos en los que el sujeto tiene diabetes de tipo 1 (DT1) o diabetes de tipo 2 (DT2) confirmada. En algunos aspectos, el sujeto tiene diabetes de tipo 2 (DT2), resistencia a la insulina, prediabetes, diabetes, intolerancia a la glucosa, trastorno metabolico de la glucosa, hiperglucemia, hiperinsulinemia, o smdrome metabolico. En algunos aspectos, el sujeto tiene diabetes autoinmunitaria latente de adultos (LADA).
En algunos aspectos de los procedimientos, el sujeto tambien se trata con un antidiabetico. En algunos aspectos, el antidiabetico es insulina o un mimetico de incretina.
A menos que se defina de otro modo, todos los terminos tecnicos y cientificos usados en el presente documento tienen el mismo significado que se entiende comunmente por los expertos en la tecnica a la que pertenece la invencion. Aunque se puede usar cualquier procedimiento y material similar o equivalente a los descritos en el presente documento en la practica o la prueba de la presente invencion, se describen los procedimientos y materiales preferentes. Para los propositos de la presente invencion, se definen los siguientes terminos a continuacion.
Los artmulos “un/uno” y “una” se usan en el presente documento para referirse a uno o a mas de uno (es decir, a al menos uno) del objeto gramatical del artfculo. A modo de ejemplo, “un elemento” quiere decir un elemento o mas de un elemento.
Por “aproximadamente” se quiere decir una cantidad, nivel, valor, numero, frecuencia, porcentaje, dimension, tamano, cantidad, peso o longitud que vana tanto como un 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 % respecto de una cantidad, nivel, valor, numero, frecuencia, porcentaje, dimension, tamano, cantidad, peso o longitud de referencia.
En toda esta memoria descriptiva, a menos que el contexto requiera lo contrario, las palabras “comprender”, “comprende” y “que comprende” se entendera que implican la inclusion de una etapa, elemento o grupo de etapas o elementos establecido pero no la exclusion de ninguna otra etapa, elemento o grupo de etapas o elementos. Por “que consiste en” se quiere decir que incluye, y se limita a, cualquiera que sea la expresion que sigue a “que consiste en”. Por tanto, la expresion “que consiste en” indica que los elementos enumerados se requieren o son obligatorios, y que no puede estar presente ningun otro elemento. Por “que consiste esencialmente en” se quiere decir que incluye cualquier elemento enumerado despues de la expresion, y se limita a otros elementos que no interfieren con o contribuyen a la actividad o accion especificada en la divulgacion para los elementos enumerados. Por tanto, la expresion “que consiste esencialmente en” indica que los elementos enumerados se requieren o son obligatorios, pero que otros elementos son opcionales y pueden o no estar presentes dependiendo de si afectan o no materialmente a la actividad o accion de los elementos enumerados.
Breve descripcion de las figuras
La figura 1 es un gel de SDS-PAGE tenido con tincion Coomassie Blue de varias cantidades de KLK1 humana recombinante purificada a partir de lmeas celulares CHO o 293 despues de transfeccion transitoria. El carril 1 es una
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escalera de protema pretenida, los pesos moleculares de los patrones estan escritos a un lado (en kDa). Los carriles 2-5 tienen KLK1 purificada a partir de celulas CHO (carril 2 - 14 |jg de protema; carril 3 - 7 |jg de protema; carril 4 -
3.5 jg de protema; carril 5 - 1,35 jg de protema). El carril 6 tiene 14 jl de protema KLKl purificada a partir de transfeccion transitoria de celulas 293.
La figura 2 es una inmunoelectrotransferencia tenida con anticuerpos policlonales anti-KLK1 humana murinos de varias cantidades de KLK1 humana recombinante purificada a partir de lmeas celulares CHO o 293 despues de transfeccion transitoria. Los carriles 1 y 6 estan cargados con una escalera de protema pretenida, los pesos moleculares de los patrones estan escritos a un lado (en kDa). Los carriles 2-5 tienen KLK1 purificada a partir de celulas CHO (carril 2 - 5 jl de protema; carril 3 - 2,5 jl de protema; carril 4 - 1,25 jl de protema). El carril 5 tiene
2.5 jl de protema KLK1 purificada a partir de transfeccion transitoria de celulas 293.
La figura 3 son resultados de cromatograma. La figura 3A es un cromatograma que representa la absorbancia A280 de varias fracciones de elucion de la resina de interaccion hidrofoba Octyl Sepharose usada para separar las glicoformas de KLK1 humana recombinante de bajo y alto peso molecular. La figura 3B en una ampliacion del pico mostrado en la figura 3A. ■ representa la concentracion de protema (medida a A280); • representa el % de tampon de elucion; o representa el % de tampon de carga/tampon de lavado; y □ representa el pH de la solucion que sale de la columna.
La figura 4 es una SDS-PAGE de muestras de las fracciones de elucion de la resina de interaccion hidrofoba Octyl Sepharose usada para separar los isomeros de KLK1 humana recombinante de bajo y alto peso molecular.
La figura 5 son resultados de cromatograma. La figura 5A es un cromatograma del analisis RP-HPLC de KLK1 humana aislada a partir de celulas CHO que representa la mezcla glicoformas de bajo y alto peso molecular (proporcion aproximada de 45:55) de hKLK1. La figura 5B es un cromatograma del analisis RP-HPLC de la fraccion B11 (glucoforma de KLK1 humana de alto peso molecular). La figura 5C es un cromatograma del analisis RP-HPLC de la fraccion B5 (glicoforma de KLK1 humana de bajo peso molecular).
La figura 6 es un cromatograma del analisis RP-HPLC de KLK1 humana aislada a partir de celulas CHO que representa una mezcla 50:50 aproximada de glicoformas de bajo y alto peso molecular de hKLK1.
La figura 7 es un grafico de la tasa de infusion de glucosa en rata Sprague-Dawley durante un pinzamiento hiperinsulinemico-normoglucemico, despues de la administracion de HU KLK1, rhKLK1, glicoformas de KLK1 de bajo peso molecular o alto peso molecular.
La figura 8 es un grafico del area bajo la curva (ABC) de la tasa de infusion de glucosa en la figura 7.
Descripcion detallada de la invencion
La presente invencion proporciona composiciones de glicoformas de polipeptidos de calicrema-1 tisular (KLK1) de proporciones definidas de polipeptidos doble y triplemente glucosilados de KLK1 como se define en las reivindicaciones, que son utiles en el tratamiento de la diabetes. Sorprendentemente, estas composiciones son mas eficaces en el tratamiento y control de la diabetes que las composiciones naturales de KLK1.
Las calicremas son miembros de una superfamilia genica de serina proteasas que comprenden al menos 15 protemas separadas y distintas (denominadas calicrema tisular 1 a 15) (Yousef et al., 2001, Endocrine Rev; 22:184204). La calicrema-1 tisular se produce predominantemente en el pancreas, de aim el origen del nombre a partir del termino griego 'kallikrein'. Tambien se produce en las glandulas salivales y en los rinones y se encuentra en el aparato genitourinario y en el musculo esqueletico. La calicrema-1 tisular tambien es conocida como KLK1, calicrema pancreatica/renal, calicrema-1 glandular, serina proteasa calicrema 1, calicrema-1, calicrema renal, calicrema renal/pancreas/salival, calicrema del rinon/pancreas/glandula salival. Como se usa en el presente documento, el termino “calicrema-1 tisular” y “KLK1” son sinonimos.
La calicrema-1 tisular es una serina proteasa de tipo tripsina. En tejidos humanos y animales, la calicrema-1 tisular escinde el cininogeno en lisil-bradicinina (tambien conocida como calidina), una cinina decapeptfdica que tiene efectos fisiologicos similares a los de bradicinina. La bradicinina es un peptido que hace que los vasos sangumeos se dilaten y, por lo tanto, hace que la presion sangumea disminuya. La calidina es identica a bradicinina con un residuo lisina adicional anadido en el extremo N terminal y senaliza a traves del receptor de bradicinina.
El gen de KLK1 codifica una pre-pro-enzima individual que tiene una longitud de 262 residuos aminoaddicos y que incluye la "pre-" secuencia (residuos 1-18) y la "pro-" secuencia (residuos 19-24), que se activa por enzimas de tipo tripsina. La KLK1 humana de forma madura y activa es una glucoprotema de 238 residuos aminoaddicos (residuos 25-262) con un peso molecular de 26 kDa y un pl teorico de 4,6. La KLK1 tiene cinco enlaces disulfuro en su estructura terciaria que se cree que son responsables de la alta estabilidad de la protema, tanto frente a la digestion con tripsina como de la inactivacion termica.
La secuencia de aminoacidos de la calicrema-1 tisular esta disponible para una amplia variedad de especies, incluyendo, peros in limitarse a, ser humano (SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:2), raton (vease, por ejemplo, GenBank:
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AAA39349,1, 1 de febrero de 1994); gato domestico (vease, por ejemplo, secuencia de referencia NCBI: XP_003997527,1, 6 de noviembre de 2012); gorila (vease, por ejemplo, secuencia de referencia NCBI: XP_004061305,1, 3 de diciembre de 2012); ganado bovino (vease, por ejemplo, GenBank: AAI51559,1, 2 de agosto de 2007); perro (vease, por ejemplo, secuencia de referencia CBI: NP_001003262,1, 22 de febrero de 2013); rata (vease, por ejemplo, GenBank: cAE51906,1, 25 de abril de 2006); y Papio anubis (vease, por ejemplo, secuencia de referencia nCbI: XP_003916022,1, 4 de septiembre de 2012). La KlK1 se conserva funcionalmente en todas las especies en su capacidad para liberar el peptido natriuretico auricular, lis-bradicinina, del cininogeno de bajo peso molecular. Un polipeptido de calicrema-1 tisular de la presente invencion puede tener cualquiera de las secuencias de aminoacidos conocidas para KLK1, o un fragmento o variante de las mismas.
En algunos aspectos, un polipeptido de calicrema-1 tisular es una calicrema-1 tisular humana (hKLK1), incluyendo, pero sin limitarse a, un polipeptido de hKLK1 representado por SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:2.
Por ejemplo, la hKLK1 se puede representar por la secuencia de aminoacidos de GenBank Ref. NP_002248,1, que tiene la secuencia de aminoacidos preprotemica de KLK1 completa mostrada a continuacion:

MWFLVLCLALSLGGTGAAPPIQSRIVGGWECEQHSQPWQAALYHFSTFQC 50

GGILVHRQWVLTAAHCISDN YQLWLGRHN LFDDENTAQ FVHVS ES FP HP G 100

FNMSLLENHTRQADEDYSHDLMLLRLTEPADTITDAVKVVELPTEEPEVG 150

STCLASGWGSIZPEN FS FPDDLQCVDLKILPNDECKKAHVQKVTDFMLCV 200

GHLEGGKDTCVGDSGGPLMCDGVLQGVTSWGYVPCGTPNKPSVAVRVLSY 250
VKWIEDTIAENS (SEQ ID NO:l)
Los aminoacidos 1 a 18 de SEQ ID NO:1 representan el peptido senal, los aminoacidos 19 a 24 representan secuencias propeptfdicas, y los aminoacidos 25 a 262 representan el peptido maduro. Por tanto, la preproprotema incluye un presunto peptido senal de 17 aminoacidos, un fragmento proenzimatico de 7 aminoacidos y una protema KLK1 madura de 238 aminoacidos.
Como se describe en el ejemplo 1, una segunda secuencia de aminoacidos para KLK1 humana se representa por SEQ ID NO:2, mostrada a continuacion:

XWFLVLCLALSLGGTGAAPPIQSRIVGGWECEQHSQPWQAALYHFSTFQC 50

GGILVHRQWVLTAAHCISDNYQLWIiGRHNLFDDENTAQFVHVSESFPHPG 100

FNMSLLENHTRQADEDYSHDLMLLRLTEPADTTTDAVKVVELPTQFjPEVG 150

STCLASGWGSIE PEN FS FPDDLQCVDLKIL PNDECKKVHVQKVTDFMLCV 200

GHLEGGKDTCVGDSGGPI.MCDGVLQGVTSWGYVPCGTPNKPSVAVRVLSY 250
VKWIEDTIAENS (SEQ ID NO:2)
De nuevo, los aminoacidos 1 a 18 de SEQ ID NO:1 representan el peptido senal, los aminoacidos 19 a 24 representan secuencias propeptfdicas, y los aminoacidos 25 a 262 representan el peptido maduro. Por tanto, la preproprotema incluye un presunto peptido senal de 17 aminoacidos, un fragmento proenzimatico de 7 aminoacidos y una protema KLK1 madura de 238 aminoacidos.
Una comparacion entre SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:2 muestra diferencias en dos aminoacidos entre las dos secuencias de aminoacidos de hKLK1. Los polimorfismos mononucleotfdicos (SNP) entre los dos individuos dentro de una especie representan una sustitucion de E por Q en el residuo aminoaddico 145 de 262 y una sustitucion de A por V en la posicion 188 de 262. La SEQ ID NO:1 tiene un E (acido glutamico) en la posicion 145 y una A (alanina) en la posicion 188, mientras que la SEQ ID NO:2 tiene una Q (glutamina) en la posicion 145 y una V (valina) en la posicion 188.
Un polipeptido de KLK1 de la presente invencion puede tener un E en la posicion 145; puede tener una Q en la posicion 145; puede tener una A en la posicion 188; puede tener una A en la posicion 188; puede tener un E en la posicion 145 y una A en la posicion 188; puede tener una Q en la posicion 145 y una V en la posicion 188; puede
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tener una Q en la posicion 145 y una A en la posicion 188; o puede tener un E en la posicion 145 y una V en la posicion 188.
En determinados modos de realizacion, un polipeptido de calicrema-1 tisular puede incluir los residuos 1-262, residuos 19-262, o residuos 25-262 de una secuencia preproprotemica de calicrema, incluyendo, pero sin limitarse a KLK1 humana que tiene SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:2, y fragmentos y variantes de la misma. Los fragmentos y variantes de un polipeptido de KLK1 mantienen la capacidad enzimatica para liberar el peptido natriuretico auricular, lis-bradicinina, del cininogeno de bajo peso molecular. En algunos modos de realizacion, una variante o fragmento activo mantiene la actividad de serina proteasa de un polipeptido de KLK1 que libera la calidina de un precursor de mayor peso molecular tal como cininogeno, o que escinde un sustrato similar a cininogeno tal como D-val-leu-arg-7- amido-4-trifluorometilcumarina para liberar un fragmento colorimetrico o fluorometrico.
Una “variante” de un polipeptido de partida o de referencia es un polipeptido que tiene una secuencia de aminoacidos diferente de la del polipeptido de partida o de referencia. Dichas variantes incluyen, por ejemplo, deleciones de, inserciones en y/o sustituciones de residuos dentro de la secuencia de aminoacidos del polipeptido de interes. Un aminoacido variante, en este contexto, se refiere a un aminoacido diferente del aminoacido en la posicion correspondiente en una secuencia polipeptfdica de partida o de referencia. Se puede realizar cualquier combinacion de delecion, insercion y sustitucion para llegar a la construccion de variante o mutante final, siempre que la construccion final posea las caractensticas funcionales deseadas. Los cambios de aminoacidos tambien pueden alterar los procesos postraduccionales del polipeptido, tales como cambiar el numero o posicion de sitios de glicosilacion.

Una variante de polipeptido puede tener una identidad de aminoacidos de al menos aproximadamente un 80 %, al

menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 91 %, al

menos aproximadamente un 92 %, al menos aproximadamente un 93 %, al menos aproximadamente un 94 %, al

menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al
menos aproximadamente un 98 %, al menos aproximadamente un 98,5 %, al menos aproximadamente un 99 %, o al menos aproximadamente un 99,5% con una secuencia de referencia, tal como, por ejemplo, una secuencia de aminoacidos descrita en el presente documento.
En algunos aspectos, un polipeptido de KLK1 tiene una identidad de aminoacidos de al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un
91 %, al menos aproximadamente un 92 %, al menos aproximadamente un 93 %, al menos aproximadamente un
94 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un
97 %, al menos aproximadamente un 98 %, al menos aproximadamente un 98,5 %, al menos aproximadamente un
99 %, o al menos aproximadamente un 99,5 % con respecto a SEQ ID NO:1, o con respecto a un fragmento de SEQ ID NO:1, tal como, por ejemplo, los residuos 25-262 o los residuos 78-141 de SEQ ID No:1. Un polipeptido de KLK1 de este tipo puede tener un E o una Q en el residuo aminoaddico 145, y/o una A o una V en la posicion 188.
En algunos aspectos, un polipeptido de KLK1 tiene una identidad de aminoacidos de al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un
91 %, al menos aproximadamente un 92 %, al menos aproximadamente un 93 %, al menos aproximadamente un
94 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un
97 %, al menos aproximadamente un 98 %, al menos aproximadamente un 98,5 %, al menos aproximadamente un
99 %, o al menos aproximadamente un 99,5 % con respecto a SEQ ID NO:2, o con respecto a un fragmento de SEQ ID NO:2, tal como, por ejemplo, los residuos 25-262 o los residuos 78-141 de SEQ ID No:2. Un polipeptido de KLK1 de este tipo puede tener un E o una Q en el residuo aminoaddico 145, y/o una A o una V en la posicion 188.
“Porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoacidos” con respecto a un polipeptido se define como el porcentaje de residuos aminoaddicos en una secuencia candidata que son identicos a los residuos aminoaddicos en la secuencia de referencia, despues de alinear las secuencias e introducir huecos, en caso necesario, para lograr el porcentaje de identidad de secuencia maximo, y sin considerar ninguna sustitucion conservadora como parte de la identidad de secuencia. Se puede lograr la alineacion con el proposito de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoacidos de diversas formas que estan dentro de la habilidad en la tecnica, por ejemplo, usando un programa informatico publicamente disponible, tal como el programa informatico BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la tecnica pueden determinar los parametros apropiados para medir la alineacion, incluyendo cualquier algoritmo necesario para lograr la alineacion maxima en toda la longitud de las secuencias que se comparan. El programa ALIGN-2 esta publicamente disponible de Genentech, Inc., South San Francisco, California.
Para los propositos en el presente documento, el % de identidad de secuencia de aminoacidos de una secuencia de aminoacidos A dada con respecto a, con, o frente a una secuencia de aminoacidos B dada (que se puede expresar alternativamente como una secuencia de aminoacidos A dada que tiene o comprende un determinado % de identidad de secuencia de aminoacidos con respecto a, con, o frente a una secuencia de aminoacidos B dada) se puede calcular como sigue:
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100 veces la fraccion X/Y, en la que X es el numero de residuos aminoaddicos puntuados como coincidencias identicas por el programa de alineacion de secuencias en esa alineacion de A y B del programa, y en la que Y es el numero total de residuos aminoaddicos en B. Se apreciara que cuando la longitud de la secuencia de aminoacidos A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoacidos B, el % de identidad de secuencia de aminoacidos de A con respecto a B no equivaldra al % de identidad de secuencia de aminoacidos de B con respecto a A.
Las variantes tambien pueden incluir secuencias anadidas al polipeptido de referencia para facilitar la purificacion, para mejorar la semivida metabolica o para hacer que el polipeptido sea mas facil de identificar, por ejemplo, una region Fc, una marca His y/o una secuencia de PEGilacion.
El termino "fragmento" incluye porciones mas pequenas de un polipeptido de KLK1 que mantiene la actividad de un polipeptido de KLK1. Los fragmentos incluyen, por ejemplo, un fragmento de polipeptido de KLK1 que vana de tamano de aproximadamente 20 a aproximadamente 50, de aproximadamente 20 a aproximadamente 100, de aproximadamente 20 a aproximadamente 150, de aproximadamente 20 a aproximadamente 200, o de aproximadamente 20 a aproximadamente 250 aminoacidos de longitud. En otros modos de realizacion, un fragmento de polipeptido de KLK1 vana de tamano de aproximadamente 50 a aproximadamente 100, de aproximadamente 50 a aproximadamente 150, de aproximadamente 50 a aproximadamente 200, o de aproximadamente 50 a aproximadamente 250 aminoacidos de longitud. En otros modos de realizacion, un fragmento de polipeptido de KLK1 vana de tamano de aproximadamente 100 a aproximadamente 150, de aproximadamente 100 a aproximadamente 200, de aproximadamente 100 a aproximadamente 250, de aproximadamente 150 a aproximadamente 175, de aproximadamente 150 a aproximadamente 200, o de aproximadamente 150 a aproximadamente 250 aminoacidos de longitud. En otros modos de realizacion ilustrativos, un fragmento de polipeptido de KLK1 vana de tamano de aproximadamente 200 a aproximadamente 250 aminoacidos de longitud. Determinados modos de realizacion comprenden un fragmento de polipeptido de una KLK1 de longitud completa de aproximadamente, hasta aproximadamente, o al menos aproximadamente 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140,150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250 o mas residuos aminoaddicos (por ejemplo, contiguos). En algunos modos de realizacion, un fragmento puede tener los residuos 25-262 o los residuos 78-141 de una secuencia preproprotemica. En algunos modos de realizacion, un fragmento puede ser de cualquiera de dichos tamanos de fragmento, como se describe anteriormente, de SEQ D NO:1 o SEQ lDNO:2.
Una secuencia "natural" o "de referencia" o la secuencia de una protema/polipeptido "natural" o "de referencia" puede ser la secuencia de referencia de la que se derivan las variantes de polipeptidos a traves de la introduccion de cambios. En general, la secuencia de aminoacidos "natural" para una protema dada es la secuencia que es mas comun en la naturaleza. De forma similar, una secuencia genica "natural" es la secuencia polinucleotfdica para el gen que se encuentra de forma mas comun en la naturaleza. Se pueden introducir mutaciones en un gen "natural" (y por tanto la protema que lo codifica) a traves de procesos naturales o bien a traves de medios inducidos por el ser humano.
Expresion de KLK1 recombinante
Los polipeptidos de KLK1 y las mezclas descritas en el presente documento se pueden preparar por cualquier procedimiento adecuado conocido por los expertos en la tecnica, incluyendo tecnicas recombinantes. Como ejemplo general, se puede preparar KLK1 por un procedimiento que incluye una o mas de las etapas de: preparar una construccion que comprende una secuencia polinucleotfdica que codifica una rhKLK1 y que esta ligada funcionalmente a un elemento regulador; introducir la construccion en una celula huesped; cultivar la celula huesped para expresar la rhKLK1; y aislar la rhKLK1 de la celula huesped. La construccion y el sistema de expresion pueden ser tales que la rhKLK1 madura o activa se exprese a partir de la celula huesped. De forma alternativa, la rhKLK1 se puede expresar en una forma inactiva, tal como un propeptido, y la actividad de serina proteasa rhKLK1 se puede activar (por ejemplo, retirando la secuencia "pro") despues de que la rhKLK1 se aisle de la celula huesped.
Para expresar un polipeptido deseado, se puede insertar una secuencia de nucleotidos que codifica el polipeptido, o un equivalente funcional, en un vector de expresion apropiado, es decir, un vector que contiene los elementos necesarios para la transcripcion y traduccion de la secuencia codificante insertada. Se pueden usar procedimientos que son bien conocidos para los expertos en la tecnica para construir vectores de expresion que contienen secuencias que codifican un polipeptido de interes y elementos de control transcripcionales y traduccionales apropiados. Estos procedimientos incluyen tecnicas de ADN recombinante in vitro, tecnicas sinteticas y recombinacion genetica in vivo. Dichas tecnicas se describen en Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2001), y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (2003).
Es conocida una variedad de sistemas de vector de expresion/huesped y se pueden utilizar para contener y expresar secuencias polinucleotfdicas. Estos incluyen, pero no se limitan a, microorganismos tales como bacterias transformadas con vectores de expresion de ADN de bacteriofago, plasmido o cosmido recombinantes; levadura transformada con vectores de expresion de levadura; sistemas de celulas de insecto infectados con vectores de expresion de virus (por ejemplo, baculovirus); sistemas de celulas vegetales transformados con vectores de expresion de virus (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o con vectores de expresion bacterianos (por ejemplo, plasmidos Ti o pBR322); o sistemas de celulas animales, incluyendo sistemas de celulas de mairnfero. Si se usa un sistema de expresion de celulas distintas de mairnfero (tal
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como bacterias) entonces se necesitana usar un proceso para anadir grupos glucano a la rhKLKI, tales como celulas genomanipuladas que expresen las enzimas requeridas para la glicosilacion de tipo mai^ero.
En celulas huesped de mai^ero, en general estan disponibles varios sistemas de expresion basados en virus. Por ejemplo, en casos en los que se usa un adenovirus como vector de expresion, las secuencias que codifican un polipeptido de interes se pueden unir a un complejo de transcripcion/traduccion de adenovirus que consiste en el promotor tardm y la secuencias lfder tripartita. Se puede usar la insercion en una region E1 o E3 no esencial del genoma vmico para obtener un virus viable que pueda expresar el polipeptido en celulas huesped infectadas (Logan y Shenk, 1984, PNAS USA; 81:3655-3659). Ademas, se pueden usar potenciadores de transcripcion, tales como el potenciador del virus de sarcoma de Rous (RSV), para incrementar la expresion en celulas huesped de mairnfero.
Los ejemplos de lmeas de celulas huesped de marnffero incluyen lmeas CV1 de rinon de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); lmea de rinon embrionario humano (293 o celulas 293 subclonadas para el crecimiento en cultivo de suspension, Graham et al., 1977, J Gen Virol; 36:59); celulas de rinon de cna de hamster (BHK, ATCC CCL 10); celulas de Sertoli de raton (TM4, Mather, 1980, Biol Reprod; 23:243-251); celulas de rinon de mono (CV1 ATCC CCL 70); celulas de rinon de mono verde africano (VeRo-76, ATCC cRl-1587); celulas de carcinoma de cuello uterino humano (HELA, ATCC CCL 2); celulas de rinon canino (MDCK, ATCC CCL 34); celulas de hngado de rata Buffalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); celulas de pulmon humano (W138, ATCC CCL 75); celulas de hngado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de raton (mMt 060562, ATcC CCL51); celulas Tr1 (Mather et al., 1982, Annals NY Acad Sci; 383:44-68); celulas MRC 5; celulas FS4; y una lmea de hepatoma humano (Hep G2). Otras lmeas de celulas huesped de marnffero incluyen celulas de ovario de hamster chino (CHO), incluyendo celulas DHFR-CHO (Urlaub et al., 1980, PNAS USA; 77:4216)); y lmeas celulares de mieloma tales como NSO y Sp2/0.
El ADN exogeno de la presente invencion obtenido por clonacion genomica o de ADNc o por smtesis genica proporciona polipeptidos de KLK1 recombinante (rKLK1). Los productos de polipeptidos de KLK1 de expresion de cultivo celular en celulas de vertebrados (por ejemplo, de mai^ero y aviar) se pueden caracterizar ademas por la libertad de asociacion con protemas humanas u otros contaminantes, que se pueden asociar con KLK1 en su entorno natural de celulas de marnffero o en lfquidos extracelulares tales como plasma u orina. Los polipeptidos de la invencion tambien pueden incluir un residuo aminoaddico de metionina inicial (en la posicion 1). Determinados modos de realizacion, por lo tanto, incluyen celulas huesped (por ejemplo, celulas huesped eucariotas tales como celulas CHO, celulas 293) que comprenden un polinucleotido recombinante o introducido que codifica un polipeptido de KLK1 descrito en el presente documento, tal como el polipeptido de SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:2. Tambien se incluyen celulas huesped que comprenden un polinucleotido que codifica un polinucleotido de KLK1 recombinante (por ejemplo, no natural) descrito en el presente documento, tal como el polipeptido de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO:2.
Los polipeptidos de KLK1 expresados en cultivo celular de la presente invencion se pueden aislar o purificar usando, por ejemplo, separaciones cromatograficas o separaciones inmunologicas que implican preparaciones de anticuerpos monoclonales y/o policlonales, o usando inhibidores o sustratos de serina proteasas para cromatograffa de afinidad. Como sera evidente para los expertos en la tecnica, las secuencias de aminoacidos de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO:2 enumeran la secuencia para pre-pro KLK1. Si el gen que codifica cualquiera de estas secuencias se expresa en celulas de mamffero, el peptido senal de 17 aminoacidos (residuos 1-18) debena dar como resultado el polipeptido de KLK1 que se va a secretar por la celula, y el peptido senal retirado por la celula. Si no se desea tener el polipeptido secretado, o si se usan celulas distintas de mamffero para la expresion, se puede generar un gen que codifica KLK1 en el que la secuencia senal se omite o se reemplaza por otra secuencia. La pro-secuencia de 7 aminoacidos (residuos 19-24) inhibira la actividad serina proteasa de la KLK1 y se puede retirar para permitir la actividad del polipeptido de KLK1 maduro. La pro-secuencia se puede retirar despues de que el polipeptido de KLK1 se aisle, por ejemplo, exponiendo la pro-KLK1 a tripsina en condiciones que permitan la escision de la pro- secuencia, o generando un gen que codifica la KLK1 en la que la pro-secuencia se omite o se reemplaza por otra secuencia.
En determinados aspectos, los polipeptidos de KLK1 descritos en el presente documento se pueden "etiquetar" por asociacion covalente con una sustancia marcadora detectable (tal como, por ejemplo, radiomarcadores tales como I125 o P32 y marcadores no isotopicos tales como biotina) para proporcionar reactivos utiles en la deteccion y cuantificacion de KLK1 en tejido solido y muestras de fluido tales como sangre u orina.
Ademas de los procedimientos de produccion recombinante, se pueden producir polipeptidos de rhKLK1 por smtesis peptfdica directa usando tecnicas de fase solida (vease, por ejemplo, Merrifield, 1963, J Am Chem Soc; 85:21492154). Se puede realizar la smtesis de protemas usando tecnicas manuales o por automatizacion. Se puede lograr una smtesis automatizada, por ejemplo, usando el sintetizador peptfdico Applied Biosystems 431A (Perkin Elmer). De forma alternativa, varios fragmentos se pueden sintetizar qmmicamente por separado y combinar usando procedimientos qmmicos para producir el polipeptido deseado. Tambien se incluye la expresion sin celulas de protemas. Estos modos de realizacion y modos de realizacion relacionados utilizan tfpicamente ARN polimerasa purificada, ribosomas, ARNt y ribonucleotidos; estos reactivos se pueden producir por extraccion de celulas o a partir de un sistema de expresion basado en celulas.
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Para los procesos de smtesis que no dan como resultado polipeptidos de KLK1 glicosilados, tambien se puede emplear un proceso para anadir grupos glucano ligados a N, de tipo mairnfero, en la posicion 78 y 84 para generar las glicoformas de bajo peso molecular (doblemente glicosilada ) y en la posicion 78, 84 y 141 para generar las glicoformas de alto peso molecular (triplemente glicosilada ) del polipeptido de rhKLKI.
Glicoformas
La presente invencion se refiere a composiciones de varias glicoformas de polipeptidos de calicrema-1 tisular (KLK1), incluyendo composiciones que comprenden proporciones definidas de polipeptidos doble y triplemente glicosilados de KLK1 como se define en las reivindicaciones.
La secuencia de aminoacidos de calicrema-1 tisular indica que existen tres sitios de glicosilacion ligados a Asn (ligados a N) potenciales en el polipeptido, en las posiciones de aminoacidos 78, 84, y 141 (con relacion a la secuencia preproprotemica intacta en la secuencia de aminoacidos mostrada, por ejemplo, en SEQ ID NO:1), asf como supuestos sitios de glicosilacion ligados a O.
KLK1 esta presente en circulacion solo en cantidades pequenas, se encuentra en el suero a 3,5+/-0,4 ng/ml (Chao y Chao, 1996, Hypertension; 27:491-494). Una via de eliminacion principal de KLK1 del cuerpo humano es a traves de los rinones. La calicrema-1 tisular aislada de orina humana aparece en un gel de SDS PAGE en dos bandas, una glicoforma de bajo peso molecular y una glicoforma de alto peso molecular. La calicrema humana urinaria (HU KLK) contiene aproximadamente un contenido de carbohidrato de un 30 % en base al peso molecular estimado por electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS). La calicrema humana tiene tres sitios de glicosilacion ligados a Asn (ligados a N) potenciales en la posicion 78, 84 y 141. En un analisis mas riguroso, se ha determinado que la KLK1 humana urinaria esta completamente glicosilada en las posiciones 78 y 84, pero solo esta parcialmente glicosilada en la posicion 144, con glicosilacion solo de un 60% en la posicion 141 (vease el documento WO/1989/000192). La glicosilacion ligada a O no se detecta en la KLK1 natural.
El analisis de KLK1 humana recombinante (rhKLK1) expresada a partir de celulas CHO, detecta un patron de glicosilacion similar como en la KLK1 humana procedente de orina, esto es, un 40 % de los polipeptidos demostraron glicosilacion ligada a N solo en dos posiciones, las posiciones 78 y 84, y un 60 % de los polipeptidos demostraron glicosilacion ligada a N en las tres posiciones, las posiciones 78, 84 y 141 (Lu et al., 1996, Protein Expression and Purification; 8:227-237).
Antes de la presente invencion, la unica proporcion conocida para la glicoforma de bajo peso molecular de KLK1 con respecto a las glicoformas de alto peso molecular de rhKLK1 es de 40:60 (bajo:alto). Como se usa en el presente documento, el termino "glicoforma" se refiere a varias isoformas de KLK1 que difieren con respecto al numero o tipo de grupos glucano unidos (es decir, carbohidratos, polisacaridos, oligosacaridos o grupos de glicosilacion).
Por analisis SDS-PAGE, los polipeptidos de KLK1 glucosilados solo en dos de las tres posiciones disponibles (posiciones 78 y 84) se detectan como una banda de bajo peso molecular y se denominan en el presente documento como la glicoforma de KLK1 doblemente glicosilada de bajo peso molecular (o como KLK1 “baja” o “doble”). Por analisis SDS-PAGE, los polipeptidos de KLK1 glicosilados en las tres posiciones (posiciones 78, 84, y 141) se detectan como la banda de alto peso molecular y se denominan en el presente documento como la glicoforma de KLK1 triplemente glicosilada de alto peso molecular (o KLK1 “alta” o “triple”).
La presente invencion incluye composiciones de un primer polipeptido de calicrema-1 tisular y un segundo polipeptido de calicrema-1 tisular, en las que el primer polipeptido de calicrema-1 tisular tiene tres glicanos unidos a las tres posiciones diferentes disponibles para glicosilacion en el polipeptido y el segundo polipeptido de calicrema-1 tisular tiene dos glicanos unidos a solo dos de las tres posiciones diferentes disponibles para glicosilacion en el polipeptido, como se define en las reivindicaciones y en las que el primer y segundo polipeptidos de rhKLK1 estan presentes en una proporcion que vana de 45:55 a 55:45 (alto:bajo).
En algunos modos de realizacion, una proporcion de glicoformas de alto peso molecular con respecto a glicoformas de bajo peso molecular es de 50:50. En algunos modos de realizacion, la proporcion no es 60:40 (alto:bajo). En algunos modos de realizacion, la proporcion no es 40:60 (alto:bajo).
Aislamiento de KLK1 de bajo y alto peso molecular
Las proporciones de las isoformas doble y triplemente glicosilada glicosiladas glicosiladas de KLK1 se pueden detectar y cuantificar por una variedad de procedimientos, incluyendo cromatograffa de lfquidos de alto rendimiento (HPLC), que puede incluir fase inversa (RP-HPLC), cromatograffa de afinidad con lectina y electroforesis de afinidad con lectina.
En determinados modos de realizacion de la presente invencion, la proporcion de las glicoformas de bajo (doblemente glicosilada ) y alto (triplemente glicosilada ) peso molecular de KLK1 es de 50:50 (bajo:alto).
En otros modos de realizacion, la proporcion esta entre 45:55 y 55:45 incluyendo, por ejemplo, aproximadamente 46:54, aproximadamente 47:53, aproximadamente 48:52, aproximadamente 49:51, aproximadamente 51:49,
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aproximadamente 52:48, aproximadamente 53:47, y aproximadamente 54:46, incluyendo todos los numeros enteros y decimales entre st
Los modos de realizacion de la presente invencion incluyen composiciones que comprenden un polipeptido de KLK1 recombinante (rKLKI), y las que comprenden un acido nucleico que codifica un polipeptido de rKLKl, y mezclas de dichas glicoformas de polipeptidos de rKLKI. En modos de realizacion particulares, el polipeptido de KLK1 es un polipeptido humano recombinante. La KLK1 humana recombinante (rhKLKI) puede proporcionar determinadas ventajas sobre otras fuentes de KLK1, tales como KLK1 urinaria (por ejemplo, KLK1 humana aislada de orina humana), incluyendo una preparacion homogenea de rhKLKI, via reguladora de licencia mas sencilla, y opciones para alterar la secuencia de aminoacidos o patron de glicosilacion en base a condiciones de cultivo celular.
Como se describe anteriormente, la KLK1 humana recombinante se puede expresar como una KLK1 en la que la KLK1 esta unida al pro-peptido. El pro-peptido se puede retirar antes de la separacion de las glicoformas de bajo y alto peso molecular, o las glicoformas de bajo y alto peso molecular de KLK1 se pueden separar, y a continuacion digerir para liberar el pro-peptido y generar asf la KLK1 activa. La pro-KLK1 se puede activar por digestion con tripsina u otras enzimas. De forma alternativa, se puede expresar una variante de KLK1 que no codifique la pro- secuencia, o que codifique una pro-secuencia que se escinde por enzimas en la celula, generando asf una KLK1 activa.
Se puede emplear una variedad de otros procedimientos para generar mezclas de glicoformas de bajo y alto peso molecular de KLK1. En un modo de realizacion, se puede introducir un vector que codifica la KLK1 en una lmea celular, y se puede cribar una variedad de clones que expresan la KLK1 recombinante para determinar la proporcion de glicoformas de bajo y alto peso molecular de KLK1 que se expresan. A continuacion, se puede elegir una lmea celular que exprese la proporcion deseada de glicoformas de bajo y alto peso molecular de KLK1.
En otro modo de realizacion, una lmea celular puede no expresar la proporcion deseada de glicoformas de bajo y alto peso molecular de KLK1, pero las condiciones del cultivo celular se pueden manipular hasta que la lmea celular exprese las glicoformas de bajo y alto peso molecular de KLK1 en la proporcion deseada. En la tecnica son conocidas varias tecnicas para manipular las condiciones del cultivo celular de modo que se altere la glicosilacion de protemas, tales como la adicion de determinados azucares u otros nutrientes, niveles de oxfgeno disuelto, etc. Un arffculo ejemplar para manipular las condiciones del cultivo celular para influir en los cambios en la glicosilacion se describe por Devasahayam, 2007, Indian J Med Res; 126:22-27.
En determinados aspectos, la preparacion de calicrema purificada o procalicrema se puede separar en dos glicoformas diferentes por cromatograffa de Sepharose - benzamidina. La columna de afinidad acoplada a benzamidina presenta una afinidad de union diferencial para las dos glicoformas. La calicrema de alto peso molecular se une debilmente a la columna de afinidad y se puede eluir con una elucion isocratica usando NaCl 50 mM en el tampon de elucion, mientras que la calicrema de bajo peso molecular se une mas fuertemente a la columna de benzamidina y se puede eluir por GdnHCl 2 M en tampon Tris-HCl 10 mM a pH 7,6. En otro modo de realizacion, la separacion con benzamidina - Sepharose de las calicremas de alto y bajo peso molecular se puede realizar usando una preparacion de calicrema parcialmente purificada. Se pueden seguir las etapas descritas anteriormente para la purificacion de calicrema recombinante para aislar una proporcion espedfica de glicoformas de KLK1. Por ejemplo, si se desea una mezcla 50:50 (u otra) de glicoformas de bajo y alto peso molecular de KLK1, pero una lmea celular esta produciendo una mezcla 60:40 (alto:bajo), se pueden alterar las condiciones de lavado de la columna de modo que se eluya parte de la KLK1 de alto peso molecular y no quede retenida antes de la elucion de la KLK1 restante, dando como resultado una mezcla 50:50 de glicoformas despues de la purificacion en columna. De forma alternativa, se pueden manipular las condiciones de elucion de modo que quede retenida en la columna una fraccion de la KLK1 de alto peso molecular, dando como resultado una mezcla 50:50 de glicoformas despues de la purificacion en columna.
Tambien se puede usar una cromatograffa de interaccion hidrofoba usando una columna de Octyl Sepharose para aislar las procalicremas de alto y bajo peso molecular. A una concentracion de sulfato de amonio 1,0 M, Octyl Sepharose se puede unir selectivamente a la procalicrema obtenida a partir de la preparacion de procalicrema parcialmente purificada. En dichas condiciones, la calicrema residual no unida en la preparacion se eluye en la fraccion de flujo continuo de la columna. La procalicrema de alto peso molecular en la preparacion presenta una union mas debil a la columna de interaccion hidrofoba y se eluye por una elucion isocratica usando sulfato de amonio 1 M. La procalicrema de bajo peso molecular que presenta una union mas fuerte a la columna se puede eluir posteriormente por un gradiente lineal inverso de sulfato de amonio de 1,0 a 0 M. Como se describe anteriormente, si se desea una mezcla 50:50 o similar de glicoformas de bajo y alto peso molecular de KLK1, pero una lmea celular esta produciendo una mezcla 60:40 (alto:bajo), se pueden alterar las condiciones de lavado de columna de modo que se eluya parte de la KLK1 de alto peso molecular y no quede retenida antes de la elucion de la KLK1 restante, dando como resultado una mezcla de 45:55 a 55:45 de glicoformas despues de la purificacion en columna. De forma alternativa, se pueden manipular las condiciones de elucion de modo que quede retenida en la columna una fraccion de la KLK1 de alto peso molecular, dando como resultado una mezcla de 45:55 a 55:45 de glicoformas despues de la purificacion en columna.
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En determinados modos de realizacion, se pueden aislar las glicoformas por HPLC de fase inversa. En otro modo de realizacion, se pueden aislar las glicoformas por cromatograffa de exclusion por tamano se puede emplear, y preferentemente se puede emplear esta separacion en soluciones en las que la KLK1 se purifica parcial o sustancialmente a partir del medio celular. Adicionalmente, las glicoformas se separan en condiciones no reductoras o sin desnaturalizacion para permitir que la KLK1 mantenga los enlaces disulfuro internos. Otra tecnica que se puede emplear es la separacion basada en carga o hidrofobicidad. El tercer grupo glucosilado que distingma las glicoformas de bajo y alto peso molecular de KLK1 dana como resultado que la glucoforma de mas alto peso molecular fuera hidrofila. Ademas, las dos glicoformas diferinan en el punto isoelectrico debido al acido sialico adicional en el resto carbohidrato. Una vez separadas, las glicoformas se pueden recombinar para generar la proporcion deseada. De forma alternativa, se puede anadir cualquier glucoforma de bajo o alto peso molecular de KLK1 a una mezcla preexistente de glicoformas de KLK1 hasta que se logre la proporcion deseada.
Por ejemplo, para generar una proporcion 55:45 a partir de una mezcla inicial de 70:30 (glicoformas de alto a bajo peso molecular), se puede anadir una cantidad de glucoforma de KLK1 de bajo peso molecular hasta que la mezcla alcance 55:45. De forma similar, para generar una proporcion 45:55 a partir de una mezcla inicial de 25:75 (glicoformas de alto a bajo peso molecular), se puede anadir KLK1 de alto peso molecular adicional para lograr una proporcion 45:55.
Pureza. Las determinaciones de la pureza de una composicion de la presente invencion pueden incluir, pero no se limitan a, determinacion de endotoxina, protema de celula huesped, ADN de celula huesped, y/o porcentaje de pureza de pico unico por SEC HPLC.
Determinacion de prote^na de celula huesped. Se puede caracterizar la pureza con relacion a los niveles de protemas de celula huesped. Las celulas huesped usadas para expresion recombinante pueden variar de lmeas celulares de bacterias y de levaduras derivada de especies de mairnferos o de insectos. Las celulas contienen de cientos a miles de protemas de celula huesped (HCP) y otras biomoleculas que pueden contaminar el producto final. La HCP se puede secretar junto con la protema de interes, o liberarse por lisado accidental de las celulas, y puede contaminar la protema de interes. Se pueden aplicar dos tipos de procedimientos inmunologicos al analisis de HCP: inmunoelectrotransferencia (WB, de Western blotting) e inmunoensayo (IA), que incluye tecnicas tales como ELISA y inmunoensayo tipo sandwich o procedimientos similares usando marcadores de informacion radioactivos, luminiscentes o fluorescentes. Las composiciones de la presente invencion pueden incluir una protema de celula huesped de menos de aproximadamente 500, menos de aproximadamente 400, menos de aproximadamente 300, menos de aproximadamente 200, menos de aproximadamente 100 o menos de aproximadamente 50 ng/mg de protema total.
Determinacion de ADN de celula huesped. Se puede caracterizar la pureza con relacion a los niveles de ADN de celula huesped. La deteccion de ADN de celula huesped residual se puede realizar por la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) con una variedad de cebadores para las secuencias en el genoma de la celula huesped. En general, se informa de que el ADN de celula huesped residual esta por debajo de un determinado nivel umbral, pero tambien se puede cuantificar con un procedimiento de rPCR. Las composiciones de la presente invencion pueden incluir acido desoxirribonucleico (ADN) de celula huesped de menos de aproximadamente 100, menos de aproximadamente 90, menos de aproximadamente 80, menos de aproximadamente 70, menos de aproximadamente 60, menos de aproximadamente 50, menos de aproximadamente 40, menos de aproximadamente 30, menos de aproximadamente 20, o menos de aproximadamente 10 pg/mg de protema total.
Pruebas de endotoxina. La endotoxina es sumamente potente, es termoestable, atraviesa los filtros de membrana de esterilizacion y esta presente dondequiera que las bacterias esten o hayan estado presentes. Una unidad de endotoxina (UE) es una unidad de actividad biologica del patron de referencia de endotoxina de la USP.
La prueba de endotoxinas bacterianas (BET) es una prueba para detectar o cuantificar endotoxinas de bacterias gramnegativas usando un lisado de amebocitos (leucocitos) a partir del cangrejo herradura (Limulus poliphemus o Tachypleus tridentatus). Se usa el reactivo de lisado de amebocitos de Limulus (LAL), aprobado por la FDA, para todas las pruebas de endotoxina de la USP. Existen tres procedimientos para esta prueba: procedimiento A, la tecnica del coagulo de gel, que se basa en la formacion de gel; procedimiento B, la tecnica turbidimetrica, basada en el desarrollo de turbidez despues de escision de un sustrato endogeno; y procedimiento C, la tecnica cromogenica, basada en el desarrollo de color despues de escision de un complejo peptido-cromogeno sintetico.
Se describen dos tipos de pruebas de endotoxina en la USP <85> BET. Las pruebas fotometricas requieren un espectrofotometro, programa informatico espedfico para endotoxina y capacidad de impresion. El sistema fotometrico mas sencillo es una unidad portatil que emplea un cartucho de LAL de un solo uso que contiene reactivos precalibrados secos; no existe la necesidad de patrones o reactivos lfquidos. La unidad aprobada por la FDA se comercializa con el nombre Endosafe®-PTSTM. El dispositivo requiere aproximadamente de 15 minutos para analizar cantidades pequenas de muestra, una almuota de 25 pl de CSP diluida en un tubo esteril, y para imprimir los resultados. Por el contrario, los procedimientos de coagulo de gel requieren un termobloque, pipetas aforadas y termometro, agitadora vorticial, reactivos de LAL liofilizados, agua para reactivo de LAL (LRW) para hidratar los reactivos y material de vidrio despirogenado. En esta prueba de coagulo, la muestra diluida y los reactivos lfquidos requieren aproximadamente de una hora para la preparacion de la muestra y del control positivo y una incubacion de
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una hora en el termobloque; los resultados se registran manualmente. Por tanto, la simplicidad y la velocidad del sistema automatizado lo hacen idealmente adecuado para el contexto farmaceutico.
Pureza por SEC HPLC. Se puede determinar el grado de agregacion de rhKLKI (glicoforma o mezcla de glicoformas aislada) por cromatograffa de exclusion por tamano (SEC), que separa las parffculas en base a su tamano. Es un procedimiento generalmente aceptado para determinar la estructura terciaria y la estructura cuaternaria de las protemas purificadas. La SEC se usa principalmente para el analisis de moleculas grandes tales como protemas o poffmeros. La SEC funciona atrapando estas moleculas mas pequenas en los poros de una parffcula. Las moleculas mas grandes simplemente no atraviesan los poros ya que son demasiado grandes para entrar en los poros. Por lo tanto, las moleculas mas grandes fluyen a traves de la columna mas rapido que las moleculas mas pequenas, esto es, cuanto mas pequena sea la molecula, mayor sera el tiempo de retencion. En determinados modos de realizacion, se puede definir espedficamente la “pureza” de un polipeptido de KLK1 en una composicion. Por ejemplo, determinadas composiciones pueden incluir un polipeptido de hKLKI que sea puro en al menos aproximadamente un 80, al menos aproximadamente un 85, al menos aproximadamente un 90, al menos
aproximadamente un 91, al menos aproximadamente un 92, al menos aproximadamente un 93, al menos
aproximadamente un 94, al menos aproximadamente un 95, al menos aproximadamente un 96, al menos
aproximadamente un 97, al menos aproximadamente un 98, al menos aproximadamente un 99, o un 100%,
incluyendo todos los decimales intermedios, como se mide, por ejemplo y sin limitar de ningun modo, por cromatograffa de ffquidos de alta presion (HPLC), una forma bien conocida de cromatograffa en columna usada con frecuencia en bioqmmica y qrnmica anafftica para separar, identificar y cuantificar compuestos. Determinadas composiciones tambien estan sustancialmente libres de agregados (apareciendo mas de aproximadamente un 95 % como un pico unico por SEC HPLC). Determinados modos de realizacion estan libres de agregados apareciendo mas de aproximadamente un 96 %, aproximadamente un 97 %, aproximadamente un 98 %, o aproximadamente un 99 %, como un pico unico por SEC HPLC.
En determinados modos de realizacion, la glicoforma o mezcla de glicoformas de bajo o alto peso molecular de rhKLKI, puede tener uno o mas de las siguientes determinaciones de pureza: pureza de pico unico de menos de aproximadamente 1 UE endotoxina/mg de protema, menos de aproximadamente 100 ng protema de celula huesped/mg de protema, menos de aproximadamente 10 pg ADN de celula huesped/mg de protema, y/o mas de aproximadamente un 95 % por SEC HPLC.
Actividad de glicoformas de rhKLKI. La KLK1 es una serina proteasa que escinde el cininogeno de bajo peso molecular dando como resultado la liberacion de calidina (lis-bradicinina). Esta actividad proteasa de las glicoformas de KLK1 aisladas se puede medir en un ensayo de actividad enzimatica midiendo la escision de cininogeno de bajo peso molecular o bien la generacion de lis-bradicinina. En un formato de ensayo, se hace reaccionar un sustrato marcado con la glicoforma de KLK1, y se detecta la liberacion de un fragmento marcado. Un ejemplo de un sustrato fluorogenico de este tipo adecuado para la medida de la actividad de KLK1 es D-val-leu-arg-7-amido-4- trifluorometilcumarina (D-VLR-AFC, FW 597,6) (Sigma, Cat n.° V2888 o Ana Spec Inc Cat n.° 24137). Cuando se hidroliza la D-VLR-AFC, se puede cuantificar la AFC producida en la reaccion por deteccion fluorometrica (excitacion 400 nm, emision 505 nm) o por deteccion espectrofotometrica a 380 nm (coeficiente de extincion = 12.600 a pH 7,2). Tambien se pueden usar otros procedimientos y sustratos para medir la actividad proteofftica de la glicoforma de KLK1.
Se puede determinar la actividad de KLK1, medida en unidades o unidades/ml, comparando la actividad relativa de una muestra de KLK1 con el patron de cininogenasa porcina adquirido del National Institute for Biological Standards and Control (producto NIBSC n.° 78/543). Para este patron, la potencia asignada es de 22,5 unidades internacionales (UI) por 20 pg de ampolla de cininogenasa pancreatica porcina. Tfpicamente, se realizan diluciones en serie del patron, y se compara la actividad en una muestra desconocida de KLK1 con el patron. Para los experimentos descritos en el presente documento, las glicoformas o mezclas de rhKLK1 teman actividades espedficas de aproximadamente 200 a 450 UI/mg, aunque las actividades espedficas de determinados lotes pueden estar fuera de este intervalo. Sin embargo, la actividad espedfica de rhKLK1 puede variar de lote a lote, y, por tanto, sena necesario que se comprobara para determinar la dosificacion en mg/kg o mg totales de rhKLK1 para administrar a un animal o paciente.
Tambien se pueden usar ensayos basados en animales para determinar la actividad de glicoformas de hKLK1, incluyendo estimular la captacion de glucosa de la circulacion en un animal. Por ejemplo, la glicoforma de KLK1 se puede administrar a un animal que sea sensible a la KLK1, tal como rata Sprague-Dawley, y la captacion de glucosa por los tejidos se puede determinar por un pinzamiento hiperinsulinemico-normoglucemico. Los resultados de dichos ensayos basados en animales pueden ser diffciles de cuantificar. Como tales, se pueden usar los resultados de pruebas con animales de manera cuantitativa tal como comparando glicoformas para determinar si determinadas glicoformas o mezclas tienen mas o menos actividad en comparacion con otras glicoformas/mezclas.
La presente invencion tambien incluye composiciones farmaceuticas que incluyen una cantidad terapeuticamente eficaz de mezcla de formas glicosilada glicosiladas glicosiladas de KLK1 descritas en el presente documento, y un diluyente, adyuvante o vehmulo farmaceuticamente aceptable. Dichas composiciones farmaceuticas se pueden formular con veldculos o excipientes farmaceuticamente aceptables, por ejemplo, para optimizar la estabilidad y lograr isotonicidad. En determinados aspectos, el pH de la formulacion puede ser cercano al pH fisiologico o de
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aproximadamente pH 7,4, incluyendo aproximadamente pH 6,5, aproximadamente 7,0, aproximadamente 7,1, aproximadamente 7,2, aproximadamente 7,3, aproximadamente 7,4, aproximadamente 7,5, aproximadamente 7,6, aproximadamente 7,7, aproximadamente 7,8, aproximadamente 7,9, aproximadamente 8,0, aproximadamente 8,5, o cualquier intervalo de los mismos. En algunos modos de realizacion, una composicion (por ejemplo, composicion farmaceutica) comprende un polipeptido de KLK1 en combinacion con un vehmulo farmaceuticamente aceptable. Dichos vehmulos incluyen vehmulos, excipientes o estabilizantes farmaceuticamente aceptables que son no toxicos para la celula o mairnfero que esta expuesto a los mismos en las dosificaciones y concentraciones empleadas. Los procedimientos de formulacion son bien conocidos y se divulgan, por ejemplo, en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Company, Easton, Pa., edicion 21 (2005).
La expresion “fisiologicamente aceptable” o “farmaceuticamente aceptable” se refiere a entidades moleculares y composiciones que no producen una reaccion adversa alergica o similar significativa cuando se administran a un ser humano. Tfpicamente, dichas composiciones se preparan como inyectables, como soluciones o bien suspensiones lfquidas; tambien se pueden preparar formas solidas adecuadas para su solucion en, o su suspension en, lfquido antes de la inyeccion. Las preparaciones tambien se pueden emulsionar.
Como se usa en el presente documento, “vehmulo” incluye cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersion, excipientes, recubrimientos, diluyentes, agentes de retardo de absorcion e isotonicos, tampones, soluciones de vehmulo, suspensiones, coloides, y similares. Excepto en la medida en que cualquier agente o medio convencional sea incompatible con el principio activo, se contempla su uso en las composiciones terapeuticas.
Las composiciones de KLK1 descritas en el presente documento se pueden formular para administrarse por una variedad de tecnicas, incluyendo, por ejemplo, administracion subcutanea, intravenosa, oral, rectal, transmucosa, transdermica, intestinal, parenteral, intramuscular, intramedular, intratecal, intraventricular directa, intraperitoneal, intranasal e intraocular, entre otras.
Algunos modos de realizacion incluyen la administracion por inyeccion subcutanea. Se puede administrar una inyeccion subcutanea (abreviada como s.c., sbc, sub-Q, sub-cu o subcut, siendo s.c. la abreviatura preferente) como una inyeccion intravenosa rapida en la hipodermis, la capa de la piel directamente por debajo de la dermis y la epidermis, conjuntamente denominadas cutis. Los sitios ejemplares en el cuerpo en los que las personas se pueden inyectar s.c. mas facilmente incluyen, sin limitacion, el area externa del brazo, justo por encima y por debajo de la cintura, exceptuando en determinados aspectos el area justo alrededor del ombligo (un drculo de ~ 5 cm (~ 2 pulgadas)), el area superior de las nalgas, justo detras del hueso ilfaco, y la parte frontal del muslo, a la mitad del lado externo, aproximadamente 10 cm (4 pulgadas) por debajo de la parte superior del muslo a aproximadamente 10 cm (4 pulgadas) por encima de la rodilla. Estas areas pueden variar con el tamano de la persona. Ademas, cambiar el sitio de inyeccion puede evitar que se formen bultos o pequenas marcas denominadas lipodistrofias en la piel.
Las inyecciones subcutaneas normalmente entran en el tejido adiposo por debajo de la piel y en determinados casos se puede utilizar una aguja mas corta y mas pequena. En ejemplos espedficos, una aguja que sea de aproximadamente 1,27 cm (^ pulgada) a aproximadamente 0,63 cm (5/8 pulgada) de longitud con un calibre de aproximadamente 25 a aproximadamente 31 es suficiente para administrar por via subcutanea el medicamento. Como se apreciara por un experto en la tecnica, estas son recomendaciones generales y las inyecciones s.c. se pueden administrar con agujas de otros tamanos. En algunos modos de realizacion, la administracion s.c. se realiza apretando el tejido para evitar la inyeccion en el musculo, y/o la insercion de la aguja en un angulo de ~ 45° en la piel.
La inyeccion intramuscular es la inyeccion dentro de la sustancia de un musculo, normalmente el musculo del brazo, muslo o nalgas. Las inyecciones intramusculares se administran cuando la sustancia se va a absorber rapidamente. Se deben administrar con sumo cuidado, en especial en las nalgas, ya que el nervio ciatico se puede danar o se puede entrar en un vaso sangumeo grande si la inyeccion no se realiza correctamente en el cuadrante superior externo de la nalga. Tambien se usa el musculo deltoides en el hombro, pero menos comunmente que el musculo gluteo de las nalgas; se debe tener cuidado al insertar la aguja en el centro, 2 cm por debajo del acromion. Las inyecciones en la cara anterolateral del muslo se consideran las mas seguras debido a que existe menos riesgo de dano en un nervio o vaso sangumeo principal. La aguja debe ser lo suficientemente larga para garantizar que el medicamento se inyecte hondo en el tejido muscular. Como norma general, no se administra mas de 5 ml en una inyeccion intramuscular para un adulto. La aguja se inserta en un angulo de 90 grados en la piel.
Las inyecciones intraperitoneales no se realizan comunmente en pacientes humanos debido a las molestias, y se administran para obtener concentraciones sangumeas sistemicas del agente; mas rapido que una inyeccion subcutanea o intramuscular y se usan cuando las venas no son accesibles. La aguja se introduce en el flanco superior y el embolo de la jeringuilla se extrae para garantizar que no se ha penetrado el intestino. La solucion inyectada debe fluir libremente.
Las inyecciones intravftreas (intraoculares) son inyecciones en el ojo y un volumen pequeno de inyeccion es esencial para estos tipos de inyecciones para evitar la hipertension en el ojo. El sitio de inyeccion normalmente es inferotemporal para facilitar el acceso. Algunos retinologos realizaran la inyeccion en el cuadrante superotemporal,
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ya que consideran si se produce una complicacion tal como una forma de desprendimiento de retina, se puede tratar mas facilmente con una retinopexia neumatica.
La inyeccion intracerebral es una inyeccion en el cerebelo o cerebro. Dichas inyecciones requeriran un volumen de inyeccion pequeno para evitar la hipertension localizada que puede dar como resultado un dano en el tejido neuronal.
La inyeccion intrarraqmdea (intratecal) es la inyeccion de una sustancia a traves de la duramadre de la medula espinal en el espacio subaracnoideo.
La dosificacion de mezclas de glicoformas de rhKLKI dependera de diversos factores, incluyendo la enfermedad que se va a tratar, otros medicamentos que el paciente este tomando, etc. La dosificacion de KLK1 tambien depende de la actividad espedfica de la protema KLK1. Las dosificaciones de KLK1 se administran en base al numero de unidades, que se convierten en mg de protema. La KLK1 es una serina proteasa que escinde el cininogeno de bajo peso molecular dando como resultado la liberacion de calidina (lis-bradicinina). Esta actividad de KLK1 se puede medir en un ensayo de actividad enzimatica descrito anteriormente, o tambien se pueden usar otros procedimientos y sustratos para medir la actividad proteolttica de KLK1.
De acuerdo con la FDA Guidance for Industry; Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trial for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers (July 2005), Appendix D: Converting animal doses to human equivalent doses. Una dosis equivalente humana es 1/7 la dosis para rata y una dosis equivalente humana es 1/12 una dosis para raton.
Como ejemplo no limitante, en algunos aspectos, una mezcla de glicoformas de KLK1 se administra por via subcutanea a una dosis de al menos aproximadamente 200 pg/kg (0,20 mg/kg), o en el intervalo de aproximadamente 20 pg/kg a aproximadamente 5000 pg/kg (de 0,02 a 5,0 mg/kg). Como ejemplo ilustrativo, si se administra rhKLKI a una dosis de aproximadamente 200 pg/kg en un paciente de 90 kg, entonces se requerina un total de aproximadamente 18,0 mg de KLK1. Si la KLK1 se formula a 5 mg/ml, entonces se inyectana un total de aproximadamente 3,6 ml, que es un volumen grande y podna provocar molestias si se inyecta por via subcutanea. Sin embargo, si la KLK1 se formula a 25 mg/ml, el volumen de inyeccion total es de 0,72 ml, que esta dentro del volumen de inyeccion recomendado para administracion subcutanea de 1,0 a 1,5 ml.
De forma alternativa, para administrar una dosis de 500 pg/kg a una persona de 90 kg equivale a aproximadamente 45 mg de KLK1. Si la KLK1 se formula a 25 mg/ml, el volumen de inyeccion es de aproximadamente 1,8 ml, lo que esta por encima del volumen recomendado para inyeccion subcutanea. Si la KLK1 se formula a 50 mg/ml, el volumen de inyeccion es de aproximadamente 0,9 ml o esta dentro del lfmite tolerable para inyeccion subcutanea en un ser humano.
Una composicion de la presente invencion puede incluir una o mas modalidades terapeuticas adicionales. En algunos aspectos, la administracion de una composicion de la presente divulgacion puede permitir la eficacia de una dosificacion menor de otras modalidades terapeuticas en comparacion con la administracion de las otras modalidades terapeuticas solas, proporcionando un remedio para la toxicidad observada con la administracion de dosis mayores de las otras modalidades. Se pueden administrar uno o mas agentes terapeuticos adicionales antes, despues y/o coincidentes con la administracion de agentes de la presente divulgacion. Los agentes de la presente divulgacion y agentes terapeuticos adicionales se pueden administrar por separado o como parte de una mezcla de medicamentos. Como se usa en el presente documento, un agente terapeutico adicional puede incluir, por ejemplo, un agente con un uso para el tratamiento de diabetes que es conocido por el experto en la tecnica.
Una composicion de KLK1 como se describe en el presente documento tambien se puede administrar en combinacion con otros farmacos. Una composicion de KLK1 descrita en el presente documento se puede usar para tratar a un paciente con diabetes tal como diabetes de tipo 1 o diabetes de tipo 2 y al sujeto se le puede administrar una composicion de KLK y un antidiabetico conocido, conocido en la tecnica porque es util en el tratamiento o prevencion de resistencia a la insulina y diabetes. Los ejemplos de antidiabeticos, incluyen, por ejemplo, un antioxidante (tal como vitamina E, vitamina C, una isoflavona, cinc, selenio, Ebselen, o un carotenoide); una insulina o analogo de insulina (tal como insulina corriente, insulina lenta, insulina semilenta, insulina ultralenta, detemir, glargina, degludec, NPH o Humalog); un antagonista del receptor a-adrenergico (tal como prazosina, doxazocina, fenoxibenzamina, terazosina, fentolamina, rauwolscina, yohimbina, tolazolina, tamsulosina, o terazosina); un antagonista del receptor p-adrenergico (tal como acebutolol, atenolol, betaxolol, bisoprolol, carteolol, esmolol, metoprolol, nadolol, penbutolol, pindolol, propanolol, timolol, dobutamina clorhidrato, alprenolol, bunolol, bupranolol, carazolol, epanolol, moloprolol, oxprenolol, pamatolol, talinolol, tiprenolol, tolamolol, o toliprolol); un antagonista del receptor adrenergico no selectivo (tal como carvedilol o labetolol); una sulfonilurea de primera generacion (tal como tolazamida, tolubtuamida, clorpropamida, acetohexamida); una sulfonilurea de segunda generacion (tal como gliburida, glipizida, y glimepirida); un agente biguanida (tal como metformina); un derivado de acido benzoico (tal como replaglinida); un inhibidor de la a-glucosidasa (tal como acarbosa y miglitol); una tiazolidinediona (tal como rosiglitazona, pioglitazona, o troglitazona); un inhibidor de la fosfodiesterasa (tal como anagrelida, tadalfilo, dipiridamol, difilina, vardenafilo, cilostazol, milrinona, teofilina, o cafema); un antagonista de la colineresterasa (tal como donepezilo, tacrina, edrofonio, demecario, piridoestigmina, zanapezil, fosfolina, metrifonato, neostigmina, o
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galatamina); un compuesto de incremento de glutation (tal como N-acetilcistema, un ester de cistema, L-2- oxotiazolidin-4-carboxolato (OTC), gamma glutamilcistema y su ester etilico, ester etilico de glutation, ester propflico de glutation, acido lipoico, cistema, metionina, o S-adenosilmetionina); o incretina o mimeticos de incretina (tales como GLP-1, GLP-2, analogos peptidicos de tipo glucagon, tales como DAC:GLP-1(CJC-1131), liraglutida, ZP10, BIM51077, LY315902, LY307161 (Sr), y exenatida). En algunos modos de realizacion, las composiciones de hKLKI se administran a un sujeto con insulina o un mimetico de incretina.
Se divulgan procedimientos de tratamiento de un sujeto que necesita el mismo, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de una composicion como se describe en el presente documento. En algunos modos de realizacion, el sujeto tiene diabetes de tipo 1 (DT1) o diabetes de tipo 2 (DT2) confirmada. En algunos modos de realizacion, el sujeto esta en la fase de luna de miel, con el inicio reciente o diagnostico de diabetes de tipo 1 DT1. La luna de miel, o fase de remision, se refiere al periodo que sigue al diagnostico inicial cuando las restantes celulas beta que producen insulina funcionan bien. Durante esta luna de miel, es mas facil controlar la glucemia, con menores oscilaciones, menos riesgo de hipoglucemia, y un menor promedio total de glucemia. El periodo de luna de miel en los pacientes con diabetes de tipo 1 se caracteriza por la funcion de las celulas B conservada. En algunos modos de realizacion, el sujeto en la fase de luna de miel o inicio reciente de DT1 tiene aproximadamente un 1020 % de sus celulas beta pancreaticas con relacion a un control sano y produce insulina. En algunos casos, el sujeto no tiene diabetes de tipo 1 (DT1) pero esta en riesgo de desarrollar DT1. En algunos modos de realizacion, el sujeto tiene diabetes autoinmunitaria latente de adultos (LADA). La diabetes de tipo 2 (DT2) como se usa en el presente documento es una enfermedad caracterizada por concentraciones de glucemia por encima de las normales. La DT2 puede estar provocada por una produccion insuficiente de insulina en el sujeto o el sujeto es resistente a la accion de la insulina (resistente a la insulina). La administracion de las composiciones descritas en el presente documento a un sujeto con DT2 puede ayudar a moderar la glucemia.
En algunos modos de realizacion, una cantidad terapeuticamente eficaz de una composicion de KLK1 incluye una cantidad que disminuye la glucosa en ayuno, incrementa la tolerancia a la glucosa, u otro indicador en un sujeto con diabetes. En algunos modos de realizacion, una dosis terapeuticamente eficaz es la cantidad de composicion de glicoforma de KLK1 que trata o retrasa el inicio de la diabetes de tipo I sin efectos secundarios adversos sobre la presion sangumea y la frecuencia cardfaca.
En algunos modos de realizacion, el sujeto tiene una afeccion isquemica. Los ejemplos no limitantes incluyen isquemia cardfaca (isquemia miocardica), colitis isquemica, isquemia cerebral (apoplejfa isquemica), isquemia de extremidades e isquemia cutanea. Estas afecciones y afecciones medicas relacionadas se pueden diagnosticar de acuerdo con tecnicas rutinarias en la tecnica.
Las composiciones de la presente divulgacion se pueden administrar por cualquier medio adecuado incluyendo, pero sin limitarse a, por ejemplo, oral, rectal, nasal, topico (incluyendo, por ejemplo, transdermico, aerosol, oral y sublingual), vaginal, parenteral (incluyendo, por ejemplo, subcutaneo, intramuscular, intravenoso, intradermico, intravesical, intraperitoneal, intravttreo, intraocular, o intracerebral, intrarraqmdeo). Necesariamente se producira alguna variacion en la dosificacion dependiendo de la afeccion del sujeto que se esta tratando. La persona responsable de la administracion determinara, en cualquier caso, la dosis apropiada para el sujeto individual. Ademas, para administracion humana, las preparaciones deben cumplir las normas exigidas de esterilidad, pirogenicidad, y seguridad general y pureza como se requiere por la FDA. Dicha preparacion puede estar libre de pirogenos.
Dispositivos. La presente invencion tambien incluye dispositivos que contienen una composicion descrita en el presente documento, incluyendo dispositivos adecuados para administracion subcutanea. En algunos modos de realizacion, el dispositivo es una jeringuilla. En algunos modos de realizacion, la jeringuilla esta unida a un montaje con aguja hipodermica, que comprende opcionalmente un recubrimiento protector alrededor del montaje con aguja. En algunos modos de realizacion, la aguja puede ser de aproximadamente 1,27 cm (^ pulgada) a aproximadamente 0,63 cm (5/8 pulgada) de longitud y tiene un calibre de aproximadamente 25 a aproximadamente 31. Determinados modos de realizacion incluyen, por tanto, dispositivos que se unen o que se pueden unir a un montaje con aguja que es adecuado para administracion subcutanea, que comprenden una composicion a base de mezcla de glicoformas de KLK1 descrita en el presente documento. Por ejemplo, determinados dispositivos incluyen un vial o jeringuilla, opcionalmente en los que el vial o jeringuilla se puede unir a o se une a un montaje con aguja hipodermica. Tambien se incluyen viales que tienen una tapa de caucho, en los que se puede insertar una aguja/jeringuilla en el vial por medio de la tapa de caucho para extraer la composicion a base de KLK1 para administracion subcutanea.
En aspectos particulares, el dispositivo es una jeringuilla que se puede unir o que se une a una aguja hipodermica, y se envasa con uno o mas recubrimientos protectores extrafoles y/o permanentes alrededor de la aguja o montaje con aguja. Por ejemplo, un primer recubrimiento protector extrafble (que se retira durante la administracion) puede proteger a un usuario u otra persona de la aguja antes de la administracion, y se puede colocar un segundo recubrimiento protector (es decir, encajar) para una eliminacion segura del dispositivo despues de la administracion.
En determinados aspectos, un dispositivo, opcionalmente un dispositivo desechable, comprende una dosis individual de una KLK1 de al menos aproximadamente 25 mg, o en el intervalo de aproximadamente 2 a aproximadamente 500 mg. En algunos modos de realizacion, el dispositivo comprende una dosis de al menos aproximadamente 0,02 a
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aproximadamente 0,9, aproximadamente 1,0, aproximadamente 1,1, aproximadamente 1,2, aproximadamente 1,3,
aproximadamente 1,4, aproximadamente 1,5, aproximadamente 1,6, aproximadamente 1,7, aproximadamente 1,8,
aproximadamente 1,9, aproximadamente 2,0, aproximadamente 2,1,aproximadamente 2,2, aproximadamente 2,3, aproximadamente 2,4,aproximadamente 2,5, aproximadamente 2,6, aproximadamente 2,7, aproximadamente 2,8, aproximadamente 2,9, aproximadamente 3,0, aproximadamente 3,1, aproximadamente 3,2, aproximadamente 3,3, aproximadamente 3,4, aproximadamente 3,5, aproximadamente 3,6,aproximadamente 3,7, aproximadamente 3,8, aproximadamente 3,9, aproximadamente 4,0, aproximadamente 4,1, aproximadamente 4,2, aproximadamente 4,3,
aproximadamente 4,4, aproximadamente 4,5, aproximadamente 4,6, aproximadamente 4,7, aproximadamente 4,8,
aproximadamente 4,9, o aproximadamente 5,0 mg/kg.
En determinados aspectos, la composicion de KLK1 se puede envasar para permitir la administracion por el paciente o al paciente en un ambito domestico cada dfa, varias veces a la semana, cada semana, o con menos frecuencia. Una composicion de KLK1 se puede formular en un vial multidosis o una jeringuilla multidosis/multiusos, similar a las formulaciones de insulina u hormona del crecimiento humano. En un vial multidosis, una cantidad suficiente para al menos 2 administraciones puede estar en un vial (por ejemplo, 50 mg, o en el intervalo de aproximadamente 5 a 1000 mg), y se usan una aguja y una jeringuilla para extraer la cantidad requerida de KLK1 del vial e inyectarla en un paciente. Una jeringuilla multidosis o multiusos contiene una cantidad de KLK1 suficiente para al menos 2 administraciones (por ejemplo, 50 mg, o en el intervalo de aproximadamente 5 a 1000 mg), y el volumen que se puede inyectar se puede determinar por el paciente. La jeringuilla multidosis tambien puede tener un cartucho reemplazable que se puede cargar en la jeringuilla que contiene cantidades adicionales de la composicion de KLK1.
Para determinar si una dosis de una mezcla de glicoformas de KLK1 de una proporcion definida es eficaz en el tratamiento de un paciente, en terminos de la cantidad (numero de unidades administradas a un paciente) de glicoforma de KLK1 administrada o bien de la frecuencia de administracion, se pueden medir varios marcadores. Los siguientes marcadores se describen como ejemplos en el tratamiento de pacientes con DT1, y no pretenden ser una lista exhaustiva. Una dosis eficaz de glicoforma de KLK1 puede incrementar la cifra de linfocitos T reguladores en el bazo, espedficamente linfocitos CD4+/CD25+/FoxP3+ en el bazo del sujeto con DT1. Otro criterio de valoracion para determinar la dosis eficaz en una mejora en el pinzamiento hiperinsulinemico-normoglucemico, como se observa y se describe en el presente documento a continuacion. Otro criterio de valoracion para determinar la dosis eficaz es una disminucion en la insulitis, que se mide por biopsias pancreaticas, u otros procedimientos no invasivos en seres humanos. Como puede ser evidente, en el tratamiento de enfermedades distintas de DT1, se pueden medir otros marcadores para determinar si una dosis de glicoforma de KLK1 o mezcla de la misma es eficaz en el tratamiento de la enfermedad.
Para el tratamiento de sujetos con DT2, la composicion de mezcla de glicoformas de KLK1 se administra al sujeto, se miden parametros tales como una disminucion en la disminucion de la glucohemoglobina (HbA1c) en la glucemia en ayuno. Tambien se pueden medir otros parametros para determinar si la dosis de las mezclas de glicoformas de rhKLK1 es eficaz en el tratamiento de DT2.
En base a los resultados de los marcadores que se miden, la cantidad de dosificacion de glicoforma de KLK1 o mezclas se puede incrementar o disminuir, simplemente a modo de ejemplo, en aproximadamente 1,1x, 1,2x, 1,3x, 1,4x, 1,5x, 1,6x, 1,7x, 1,8x, 1,9x, 2x, 2,5x, 3x, 3,5x, 4x, 4,5x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x, 10x, 15x, 20x o mas, con relacion a la dosificacion previa. La frecuencia de dosificacion se puede incrementar o disminuir, simplemente a modo de ilustracion, en aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5 o mas dosificaciones por dfa, y/o 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o mas dosificaciones por semana, con relacion a la pauta de dosificacion previa. Como se incida anteriormente, la cantidad de dosificacion se puede incrementar o disminuir por separado o en combinacion con la frecuencia de dosificacion, y viceversa, opcionalmente hasta que se logre un nivel o intervalo deseado de uno o mas biomarcadores u otros indicadores del tratamiento.
Una composicion de la presente invencion puede estar libre de endotoxinas o sustancialmente libre de endotoxinas. Como se usa en el presente documento, el termino “libre de endotoxinas” o “sustancialmente libre de endotoxinas” se refiere, en general, a composiciones, disolventes, dispositivos y/o recipientes que contienen como mucho cantidades mmimas (por ejemplo, cantidades que no tienen efectos fisiologicos adversos en un sujeto) de endotoxina, y preferentemente cantidades indetectables de endotoxina. Las endotoxinas son toxinas asociadas con determinadas bacterias, tfpicamente bacterias gramnegativas, aunque las endotoxinas se pueden encontrar en bacterias grampositivas, tales como Listeria monocytogenes. Las endotoxinas mas predominantes son los lipopolisacaridos (LPS) o lipooligosacaridos (LOS) hallados en la membrana externa de varias bacterias gramnegativas, y que representan un rasgo patogeno fundamental en la capacidad de estas bacterias para provocar enfermedad. Cantidades pequenas de endotoxina en seres humanos pueden producir fiebre, una disminucion de la presion sangumea, y la activacion de inflamacion y coagulacion, entre otros efectos fisiologicos adversos.
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Por lo tanto, en la produccion farmaceutica, a menudo es deseable retirar la mayona de o todas las trazas de endotoxina de los productos farmaceuticos y/o recipientes de farmacos, debido a que pequenas cantidades pueden provocar efectos adversos en los seres humanos. Se puede usar un horno despirogenacion para este proposito, ya que tipicamente se requieren temperaturas en exceso de 300 °C para destruir la mayona de las endotoxinas. Por ejemplo, en base al material de envasado principal tal como jeringuillas o viales, la combinacion de una temperatura vttrea de 250 °C y un tiempo de retencion de 30 minutos a menudo es suficiente para lograr una reduccion de 3 en escala logantmica en el nivel de endotoxinas. Se contemplan otros procedimientos de retirada de endotoxinas, incluyendo, por ejemplo, procedimientos de cromatograffa y filtracion, como se describe en el presente documento y como es conocido en la tecnica. Tambien se incluyen procedimientos de produccion de polipeptidos de KLK1 en y su aislamiento de celulas eucariotas tales como celulas de mairnfero para reducir, por no decir eliminar, el riesgo de que las endotoxinas esten presentes en una composicion de la invencion. Son preferentes los procedimientos de produccion de polipeptidos de KLK1 en y su aislamiento de celulas recombinantes que crecen en medio sin suero qmmicamente definido.
Las endotoxinas se pueden detectar usando tecnicas rutinarias conocidas en la tecnica. Por ejemplo, en ensayo de lisados de amebocitos de Limulus, que utiliza sangre de cangrejo herradura, es un ensayo muy sensible para detectar la presencia de endotoxina. En esta prueba, niveles muy bajos de LPS pueden provocar una coagulacion detectable del lisado de Limulus debido a una poderosa cascada enzimatica que amplifica esta reaccion. Las endotoxinas tambien se pueden cuantificar por el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). Para estar sustancialmente libre de endotoxinas, los niveles de endotoxina pueden ser de menos de aproximadamente 0,001, 0,005, 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,08, 0,09, 0,1, 0,5, 1,0, 1,5, 2, 2,5, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 UE/ml, o UE/mg de protema. Tfpicamente, 1 ng de lipopolisacarido (LPS) corresponde a aproximadamente 1-10 UE.
Los terminos “modular” y “alterar” incluyen “incrementar”, “potenciar” o “estimular”, asf como “disminuir” o “reducir”, tfpicamente en un grado o cantidad esiadfsticamente significativa o fisiologicamente significativa con relacion a un control. Una cantidad “incrementada”, “estimulada” o “potenciada” es tfpicamente una cantidad “estadfsticamente significativa”, y puede incluir un incremento que es de 1,1, 1,2, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30 o mas veces (por ejemplo, 500, 1000 veces) (incluyendo toda la composicion de control, muestra o sujeto de prueba. Numeros enteros “disminuidos” o “reducidos” y decimales intermedios y por encima de 1, por ejemplo, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, etc.) la cantidad o nivel producido por una cantidad es tipicamente una cantidad “estadfsticamente significativa”, y puede incluir una disminucion de un 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, o 100 % en la cantidad o nivel producido por una composicion de control, muestra o sujeto de prueba.
Como ejemplo no limitante, la comparacion puede ser entre la cantidad o nivel de un parametro farmacocinetico o respuesta biologica/terapeutica producida por la administracion de una mezcla de isoformas triple:doblemente glicosilada glicosiladas glicosiladas (o glicoformas) de KLK1 (por ejemplo, aproximadamente 55:45, aproximadamente 50:50, o aproximadamente 45:55) con relacion a la administracion de una mezcla diferente de dichas glicoformas (por ejemplo, aproximadamente 60:40, aproximadamente 40:60, ~90:10, ~10:90, ~95:5, o ~5:95). Como otro ejemplo no limitante, la comparacion puede ser entre la cantidad o nivel de un parametro farmacocinetico o respuesta biologica/terapeutica producida por la administracion de una composicion sustancialmente pura de una isoforma triplemente glicosilada (o glicoforma) de rhKLK1 (por ejemplo, aproximadamente un 90 %, aproximadamente un 95 % triplemente glicosilada ) con relacion a la administracion de una glucoforma diferente (por ejemplo, aproximadamente un 90 %, aproximadamente un 95 % doblemente glicosilada ) o una mezcla de glicoformas (por ejemplo, aproximadamente 60:40 o aproximadamente, 40:60).
Otros ejemplos de comparaciones y cantidades “estadfsticamente significativas” se describen en el presente documento. Un resultado se denomina tfpicamente “estadfsticamente significativo” si es improbable que se haya producido por casualidad. El nivel de significacion de una prueba o resultado se refiere tradicionalmente a la cantidad de pruebas requeridas para aceptar que un acontecimiento es improbable que haya surgido por casualidad. En determinados casos, la significacion estadfstica se puede definir como la probabilidad de tomar la decision de rechazar la hipotesis nula cuando la hipotesis nula es realmente verdadera (una decision conocida como error de tipo I, o “determinacion de positivo falso”). Esta decision se toma a menudo usando el valor p: si el valor p es menor que el nivel de significacion, entonces la hipotesis nula se rechaza. Cuanto mas pequeno sea el valor p, mas significativo sera el resultado. Tambien se pueden utilizar los factores de Bayes para determinar la significacion estadfstica (vease Goodman, Ann Intern Med. 130:1005-13, 1999).
El termino “solubilidad” se refiere a la propiedad de un polipeptido rhKLK1 proporcionado en el presente documento para disolverse en un disolvente lfquido y formar una solucion homogenea. La solubilidad se expresa tipicamente como una concentracion, por masa de soluto por unidad de volumen de disolvente (g de soluto por kg de disolvente, g por dl (100 ml), mg/ml, etc.), molaridad, molalidad, fraccion molar u otras descripciones similares de concentracion. La cantidad maxima de equilibrio de soluto que se puede disolver por cantidad de disolvente es la solubilidad de ese soluto en ese disolvente en las condiciones especificadas, incluyendo temperatura, presion, pH y la naturaleza del disolvente. En determinados modos de realizacion, la solubilidad se mide a pH fisiologico, u otro pH, por ejemplo, a pH 6,0, pH 7,0, pH 7,4, pH 8,0 o pH 9,0. En determinados modos de realizacion, la solubilidad se mide en agua o un tampon fisiologico tal como PBS o NaCl (con o sin NaP). En modos de realizacion espedficos, la solubilidad se mide a un pH relativamente menor (por ejemplo, pH 6,0) y concentracion salina relativamente mayor (por ejemplo, NaCl
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500 mM y NaP 10 mM). En determinados modos de realizacion, la solubilidad se mide en un Ifquido biologico (disolvente) tal como sangre o suero. En determinados modos de realizacion, la temperatura puede ser aproximadamente la temperatura ambiente (por ejemplo, aproximadamente 20, aproximadamente 21, aproximadamente 22, aproximadamente 23, aproximadamente 24, o aproximadamente 25 °C) o aproximadamente la temperatura corporal (37 °C). En determinados modos de realizacion, un polipeptido de KLK1 tiene una solubilidad de al menos aproximadamente 1, al menos aproximadamente 2, al menos aproximadamente 3, al menos aproximadamente 4, al menos aproximadamente 5, al menos aproximadamente 6, al menos aproximadamente 7, al menos aproximadamente 8, al menos aproximadamente 9, al menos aproximadamente 10, al menos aproximadamente 11, al menos aproximadamente 12, al menos aproximadamente 13, al menos aproximadamente 14, al menos aproximadamente 15, al menos aproximadamente 16, al menos aproximadamente 17, al menos aproximadamente 18, al menos aproximadamente 19, al menos aproximadamente 20, al menos aproximadamente 25, al menos aproximadamente 30, al menos aproximadamente 35, al menos aproximadamente 40, al menos aproximadamente 45, al menos aproximadamente 50, o al menos aproximadamente 60 mg/ml a temperatura ambiente o a 37 °C.
“Sustancialmente” o “esencialmente” quiere decir casi totalmente o completamente, por ejemplo, un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o mas de alguna cantidad dada.
“Tratamiento” o “tratar”, como se usa en el presente documento, incluye cualquier efecto deseable sobre los smtomas o patologfa de una enfermedad o afeccion, y puede incluir incluso cambios o mejoras mmimas en uno o mas marcadores medibles de la enfermedad o afeccion que se esta tratando. “Tratamiento” o “tratar” no indica necesariamente una erradicacion o cura completa de la enfermedad o afeccion, o smtomas asociados de la misma. El sujeto que recibe este tratamiento es cualquier sujeto que necesita el mismo. Los marcadores ejemplares de mejora clmica seran evidentes para los expertos en la tecnica.
Un “sujeto”, como se usa en el presente documento, incluye cualquier animal que presente un smtoma, o que este en riesgo de presentar un smtoma, que se puede tratar con un polipeptido de KLK1 o composicion de la presente invencion. Los sujetos adecuados (pacientes) incluyen animales de laboratorio (tales como raton, rata, conejo o cobaya), animales de granja y animales domesticos o mascotas (tales como un gato o perro). Se incluyen primates no humanos y, preferentemente, pacientes humanos.
Por “aislado” se quiere decir un material que este sustancial o esencialmente libre de los componentes que normalmente lo acompanan en su estado natural. Por ejemplo, un “peptido aislado” o un “polipeptido aislado” y similares, como se usa en el presente documento, incluye el aislamiento y/o purificacion in vitro de una molecula peptfdica o polipeptfdica de su entorno celular natural, y de la asociacion con otros componentes de la celula; es decir, no esta significativamente asociado con sustancias in vivo tales como protemas o acidos nucleicos de la celula huesped.
La presente invencion se ilustra por los siguientes ejemplos. Se debe entender que los ejemplos, materiales, cantidades, y procedimientos particulares son para interpretarse ampliamente de acuerdo con el alcance de la invencion como se expone en el presente documento.
Ejemplos
Ejemplo 1
Se adquirio un ADNc que codificaba la pre-pro-KLK1 humana, la secuencia de 262 residuos aminoaddicos representada en SEQ ID NO:2, de OriGene™ (Rockville, MD, USA). El ADNc KLK1 (catalogo n.° SCI22623) es un clon con marco de lectura abierto de ADNc humano, clonado en el sitio de multiclonacion del vector pCMV6-XL5 de OriGene, entre un promotor de citomegalovirus (CMV) para controlar la transcripcion del ADNc que codifica la pre- pro-KLK1 humana y una senal de poliadenilacion. Este clon de KLK1 se secuencio y, usando el programa informatico de traduccion, tradujo para revelar la SEQ ID NO:2. Esta secuencia difirio en 2 residuos aminoaddicos de la secuencia de KLK1 humana en GenBank como Ref n°. NP_002248,1 (SEQ ID NO:1). Como se representa en SEQ ID NO:2, los polimorfismos mononucleotidicos (SNP) dieron como resultado un cambio de E a Q en el residuo aminoaddico 145 de 262, y un cambio de A a V en la posicion de aminoacido 188 de 262. Todos los experimentos posteriores se realizaron teniendo KLK1 la secuencia de aminoacidos en SEQ ID NO:2.
El ADNc de KLK1 humana en el pCMV6-XL5 se transfecto en una lmea celular de CHO usando el sistema de expresion de CHO MAX FreeStyle™ (Invitrogen, Carlsbad, CA catalogo n.° K9000 20). El kit permitio la transfeccion transitoria de vectores en celulas de ovario de hamster chino (CHO), el crecimiento de las celulas CHO transfectadas en un cultivo de 10 litros, y la expresion de protemas en medio sin suero definido. Las celulas CHO se hacen crecer en suspension y la transfeccion transitoria del vector de KLK1 se realizo con el reactivo liposomal suministrado en el kit segun las instrucciones.
La expresion y la purificacion de KLK1 humana recombinante se realizaron esencialmente como se describe por Hsieng S. Lu, et al, (Purification and Characterization of Human Tissue Prokallikrein and Kallikrein Isoforms Expressed in Chinese Hamster Ovary Cells, Protein Expression and Purification (1996), 8, 227-237). En resumen, despues de la transfeccion y permitiendo tiempo suficiente para la expresion de KLK1 humana recombinante, el
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sobrenadante de cultivo del cultivo de 10 litros de celulas CHO se recogio por centrifugacion seguido de filtracion de 0,2 micrometros. El sobrenadante clarificado se concentro a continuacion, se hizo reaccionar con tripsina para activar la KLK1 humana recombinante. Puesto que la transfeccion transitoria se realizo con el ADNc que codificaba la pre-pro-KLKI humana, la KLK1 humana recombinante secretada de las celulas CHO estaba en la forma de proprotema inactiva. Por lo tanto, el ensayo de actividad de la KLK1 del sobrenadante de cultivo celular implica una etapa de activacion con digestion con tripsina. La activacion se realiza con tripsina en una concentracion final 10 nM durante 2 horas a temperature ambiente, y la tripsina se inactiva con inhibidor de soja de tripsina.
Despues de la activacion de la KLK1 humana recombinante, el sulfato de amonio se anadio al sobrenadante, y se cargo sobre una columna de Octyl Sepharose®. La mezcla de elucion de la columna de Octyl de la KLK1 activa se purifico adicionalmente por cromatograffa de afinidad con benzamidina. Las fracciones activas mezcladas de la columna de benzamidina se intercambiaron de tampon a un tampon de equilibrado con DEAE y se limpiaron por columna DEAE. Las fracciones de KLK1 activa de DEAE se mezclaron y se intercambio de tampon a tampon 1 X PBS. El principio activo de KLK1 final se alicuoto y se almaceno a -20 °C.
Ejemplo 2
La KLK1 humana recombinante purificada conterna un contenido de carbohidratos de aproximadamente un 30 % en base al peso molecular estimado por electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS) (vease la figura 1). La KLK1 de las celulas CHO aparece como una banda que tiene un peso molecular aparente de ~40 a 49 kDa; una banda ancha de este tipo puede resultar de diferentes isoformas glicosilada glicosiladas glicosiladas de KLK1 secretada por celulas CHO. Para la KLK1 expresada en celulas 293, aparecieron dos bandas en el gel de SDS-PAGE a aproximadamente 40 kDa y 45 kDa. La identidad de las bandas como KLK1 humana se confirmo por analisis de inmunoelectrotransferencia usando anticuerpo policlonal de raton obtenido frente a una protema KLK1 humana de longitud completa (catalogo n.°: H00003816- B01P, anticuerpo policlonal murino MaxPab purificado de KLK1 (B01P), Abnova Corporation, Walnut, CA, USA) (vease la figura 2). La inmunoelectrotransferencia confirma los resultados del gel de SDS-PAGE, en los que la KLK1 humana recombinante de celulas CHO aparece como una banda que tiene un peso molecular aparente de ~40 a 49 kDa, y la KLK1 expresada en celulas 293 se resuelve como dos bandas a aproximadamente 40 kDa y 45 kDa.
La pureza de KLK1 de CHO se estimo visualmente a partir del gel de SDS-PAGE que era >90 % con una concentracion final de 1,19 mg de protema KLK1/ml. A partir del gel de SDS-PAGE, parece que la KLK1 producida en CHO tambien contiene impurezas de mayor peso molecular (~70-95 kDa) que no son visibles en la preparacion de 293.
Se uso un ensayo de actividad enzimatica para someter a prueba la actividad de KLK1 humana recombinante en sobrenadantes de cultivo celular, fracciones de cromatograffa durante la purificacion y en el producto purificado final. Un sustrato fluorogenico adecuado para la medida de actividad de la calicrema tisular es D-val-leu-arg-7-amido-4- trifluorometilcumarina (D-VLR-AFC, FW 597,6) (Sigma, Cat n.° V2888 o Ana Spec Inc Cat n.° 24137). Cuando se hidroliza la D-VLR-AFC, se puede cuantificar la AFC producida en la reaccion por deteccion fluorometrica (excitacion 400 nm, emision 505 nm) o por deteccion espectrofotometrica a 380 nm (coeficiente de extincion = 12.600 a pH 7,2).
La medida de la actividad de KLK1 humana recombinante (unidades/ml) producida en las celulas CHO se determino comparando la actividad relativa de KLK1 recombinante con el patron porcino de cininogenasa adquirido del National Institute for Biological Standards and Control (producto NIBSC n.° 78/543). Para este patron, la potencia asignada es de 22,5 unidades internacionales (UI) por 20 |jg de ampolla de cininogenasa pancreatica porcina.
Ejemplo 3
Se realizaron experimentos para determinar si la columna de Octyl Sepharose puede resolver las formas de alto y bajo peso molecular de KLK1 humana recombinante, y para cuantificar la actividad relativa de las dos formas aisladas.
Aproximadamente 45 mg (20 ml) de KLK1 humana recombinante se sometieron a la columna de Octyl Sepharose como se detalla a continuacion (vease la tabla 1):
Resina: resina de interaccion hidrofoba Octyl Sepharose (GE).
Columna: XK16 x 16, 1,6 cm x 16 cm (diametro x longitud), 32 ml de volumen de lecho de resina
Caudal: 3 ml/minuto de carga (~10 minuto de tiempo de contacto), 3 ml/minuto de gradiente (~90 cm/h).
Carga: 20 ml (~44,6 mg) de KLK1 humana recombinante purificada diluido hasta 150 ml con fosfato de
sodio 50 mM, sulfato de amonio 1,5 M, pH 7,0.
Tampones: Fosfato de sodio 50 mM, sulfato de amonio 1,5 M, pH 7,0. Fosfato de sodio 50 mM, pH 7,0.
Elucion: Gradiente del 0 % al 67 % B (fosfato de sodio 50 mM, pH 7,0) sobre 5 VC (160 ml), seguido de
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90 ml al 67 %.
Fracciones: recogidas cada 8 ml sobre la elucion del gradiente.
Tabla 1. Protocolo de columna de Octyl Sepharose
Etapa
Tampon VC Volumen (ml)
Desinfeccion
Hidroxido de sodio 0,1 M (almacenamiento) ND ND
Equilibrado
Sulfato de amonio 1,5 M en fosfato de sodio 50 mM, pH 7,0 >5 175
Carga
KLK1 humana recombinante purificada en (A) 150
Tampon de lavado
Sulfato de amonio 1,5 M en fosfato de sodio 50 mM, pH 7,0 5 160
Elucion
Gradiente del 0 % al 67 % B sobre 160 ml (53,3 minutos), mantenido al 67 % durante ~3 VC 5 160
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Tira
100 %B (fosfato de sodio 50 mM, pH 7,0) ~5 150
Limpieza y almacenamiento
NaOH 0,1 M 3 ~100
El cromatograma en la figura 3A (aumentado en la figura 3B) y el analisis SDS-PAGE en la figura 4 ilustran que la glicoforma de KLK1 de bajo peso molecular se aislo de la glucoforma de alto peso molecular usando la columna de Octyl Sepharose. Todas las fracciones se filtraron de forma esteril y se almacenaron a 2-8 °C en espera del analisis.
Se identificaron dos fracciones para analisis adicional, la fraccion B11 de la glicoforma de rhKLKI de alto peso molecular (triplemente glicosilada ) (figura 4, carril 6) y la fraccion B5 de la glicoforma de rhKLKI de bajo peso molecular (doblemente glicosilada ) (figura 4, carril 8). Estas dos fracciones se analizaron por absorbancia, actividad y cromatograffa de lfquidos de alto rendimiento con fase inversa (RP-HPLC). Las fracciones se alicuotaron a alfcuotas de 1 ml, se etiquetaron y se congelaron. Los resultados de las pruebas se muestran a continuacion. La cuantificacion de RP-HPLC se correlaciona muy bien con la absorbancia a A280 (usando un coeficiente de extincion de 1,76) y muestra las dos glicoformas de rhKLKI (vease la figura 5), como se observa con los resultados de la cromatograffa de Octyl. Espedficamente, el analisis con RP-HPLC de KLK1 humana recombinante antes de la separacion de las glicoformas aparece como dos picos (figura 5A). Despues de la separacion de las glicoformas, la fraccion B11 (glucoforma de KLK1 de alto peso molecular) del analisis RP-HPLC aparece como una unica banda (figura 5B), y fraccion B5 (glicoforma de KLKl de bajo peso molecular) aparece como una banda puntiaguda (figura 5C), aunque es evidente alguna contaminacion de la glicoforma de KLK1 de bajo peso molecular.
Se generaron cinco lmeas celulares que producen diferentes proporciones de las glicoformas de bajo y alto peso molecular de rhKLKI. La figura 5A representa una mezcla de rhKLKI purificada con las glicoformas de KLK1 de bajo y alto peso molecular en una proporcion aproximada de 55:45, respectivamente, y espedficamente un 52 % y un 47,5 % para las glicoformas de KLK1 de alto y bajo peso molecular, respectivamente, y un 0,5 % como agregados, tambien se purifico la rhKLKI de otra lmea celular de CHO recombinante que expresaba las glicoformas de rhKLKI aproximadamente en una proporcion de 50:50 (vease la figura 6).
Actividad espedfica de KLK1. La actividad espedfica (unidades/mg) de las glicoformas de rhKLKI de bajo peso molecular y de alto peso molecular, asf como la mezcla 50:50 de rhKLKI y KLK1 humana urinaria, se sometio a prueba por un ensayo de actividad enzimatica. Un sustrato fluorogenico adecuado para la medida de actividad de la calicrema-1 tisular es D-val-leu-arg-7-amido-4-trifluorometilcumarina (D-VLR-AFC, FW 597,6) (Sigma, Cat n.° V2888 o Ana Spec Inc Cat n.° 24137). Cuando se hidroliza la D-VLR-AFC, se puede cuantificar la AFC producida en la reaccion por deteccion fluorometrica (excitacion 400 nm, emision 505 nm de acuerdo con el catalogo, pero son posibles excitacion y emisiones alternativas, incluyendo excitacion 360 nm, emision 460 nm) o por deteccion espectrofotometrica a 380 nm (coeficiente de extincion = 12.600 a pH 7,2).
La medida de la actividad espedfica (unidades/mg) para las glicoformas de KLK1 y mezclas se determino comparando la actividad relativa de KLK1 con el patron porcino de cininogenasa adquirido del National Institute for Biological Standards and Control (producto NIBSC n.° 78/543). Para este patron, la potencia asignada es de 22,5 unidades internacionales (UI) por 20 |jg de ampolla de cininogenasa pancreatica porcina. Todas las dosificaciones de las ratas se basaron en unidades de KLK1.
La KLK1 humana urinaria (HU) se adquirio de Lee BioSciences (catalogo n.°: 314-15: CAS: 9001-01-8: Lote n.°: L23165). Se sabe que HU KLK1 comprende una proporcion de glicoformas de 60:40 (alto con respecto a bajo peso molecular). De acuerdo con la especificacion del producto del fabricante, la HU KLK1 es pura en un >99 % y tiene una actividad espedfica de 9,9 U/mg. Sin embargo, esta determinacion de la actividad espedfica fue con un ensayo diferente y en condiciones diferentes al ensayo de D-VLR-AFC descrito anteriormente. Por lo tanto, se sometio a prueba la HU en el ensayo de D-VLR-AFC junto con las glicoformas de rhKLK1 de bajo y alto peso molecular y mezcla de rhKLK1 50:50. Los resultados de los calculos de actividad espedfica y las concentraciones de protema como se determinaron por RP-HPLC o A280 nm se resumen en la tabla 2 a continuacion.
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Tabla 2. Actividad espedfica
Fraccion
A280 nm mg/ml RP-HPLC mg/ml Actividad espedfica U/mg (A280 nm)
Mezcla de rhKLK1 50:50
0,22 0,49 454
B11 (carril 6)
0,48 0,50 389
B5 (carril 8)
0,36 0,39 289
HU KLK1
1,0 ND 311
La pureza de rhKLKI (mezcla 50:50, fraccion B5 y B11) era relativamente baja en endotoxina con respecto a la protema total (< 1 UE/mg de protema), baja en protema de celula huesped con respecto a la protema total (<100 ng/mg de protema), baja en ADN de celula huesped con respecto a la protema total (<10 pg/mg de protema), y aparecio mayoritariamente como un monomero (>95 % como un pico unico por SEC HPLC). Para la HU KLK1 la endotoxina y el grado de agregacion no se cuantificaron. Sin embargo, las pruebas cualitativas sugirieron que la HU KLK1 tema niveles de endotoxina de > 1 UE/mg de protema, mayores que para la mezcla de rkKLKI 50:50, fraccion B5 y B11, y un mayor grado de agregacion (>5 %) que rhKLKI (mezcla 50:50, fraccion B5 y B11), teniendo la ultima niveles de agregacion de <5 %.
Pinzamiento hiperinsulinemico-normoglucemico. La actividad in vivo, y espedficamente la capacidad para estimular la captacion de glucosa por los tejidos, de las dos glicoformas aisladas de rhKLKI, la mezcla 50:50 de glicoformas y HU KLK1, se determinaron por un estudio de pinzamiento hiperinsulinemico-normoglucemico. El pinzamiento hiperinsulinemico-normoglucemico es el patron de referencia para investigar la utilizacion de la glucosa, incluyendo cuantificar la resistencia a la insulina debido a que mide la cantidad de glucosa necesaria para compensar un incremento en el nivel de insulina sin provocar hipoglucemia. En incremento en la tasa de infusion de glucosa detectada por el pinzamiento tambien puede indicar un incremento en la sensibilidad a la insulina, o incremento en la captacion de glucosa por los musculos, adipocitos, u otros tejidos en el cuerpo.
Se realizo un ensayo de pinzamiento hiperinsulinemico-normoglucemico de 120 minutos sobre ratas Sprague Dawley con 6 horas de ayuno con infusion continua de insulina humana (Humulina, Lilly) a una tasa constante de 4 mU/kg/minuto. Al mismo tiempo, se infundio una solucion de glucosa al 20 % a una tasa variable y se ajusto la tasa cada 10 minutos para mantener la glucemia objetivo. Tanto la insulina como la glucosa se infundieron a traves de cateterizacion de vena yugular derecha y se realizo el seguimiento de la glucemia a partir de la cateterizacion de la arteria carotida izquierda.
Se usaron doce grupos de tres ratas cada uno para este procedimiento de pinzamiento. A cada grupo de cuatro ratas se le inyecto por via subcutanea cualquier rhKLK1, fraccion 11 (glicoforma de KLK1 de alto peso molecular), fraccion 5 (glicoforma de KLK1 de bajo peso molecular) y KLK1 humana urinaria a 1,0 U, 0,33 U y 0,1 U/rata (vease la tabla 3 a continuacion). La KLK1 humana se disolvio en PBS y las ratas se dosificaron por via subcutanea, 30 minutos antes del procedimiento de pinzamiento. La tabla 3 resume la dosificacion de ratas con las diversas formas de KLK1 humana.
Tabla 3
Grupo
Compuesto Dosis
1. rhKLK1 mezcla 50:50
rhKLK1 1,0 U/rata
2. rhKLK1 mezcla 50:50
rhKLK1 0,33 U/rata
3. rhKLK1 mezcla 50:50
rhKLK1 0,1 U/rata
4. Glicoforma de alto PM
rhKLK1 fraccion B11 1,0 U/rata
5. Glicoforma de alto PM
rhKLK1 fraccion B11 0,33 U/rata
6. Glicoforma de alto PM
rhKLK1 fraccion B11 0,1 U/rata
7. Glicoforma de bajo PM
rhKLK1 fraccion B5 1,0 U/rata
8. Glicoforma de bajo PM
rhKLK1 fraccion B5 0,33 U/rata
9. Glicoforma de bajo PM
rhKLK1 fraccion B5 0,1 U/rata
10. KLK1 urinaria
huKLK1 1,0 U/rata
11. KLK1 urinaria
huKLK1 0,33 U/rata
12. KLK1 urinaria
huKLK1 0,1 U/rata
Se monitorizo la glucemia arterial antes de la dosificacion a t=-120, -90, -30, -15 y 0 minutos y a continuacion cada 10 minutos durante 120 minutos (t=120), usando un glucometro (Accu Check, Roche Diagnostics). Se siguio con los pinzamientos durante 120 minutos (t=120) momento en que finalizo el experimento. Se registro el efecto de la administracion de glicoforma de KLK1 sobre la tasa de infusion de glucosa requerida para mantener la misma glucemia. La figura 7 es un grafico de la tasa de infusion de glucosa (GIR) para ratas tratadas con 1 U/rata de rhKLK1 (mezcla 50:50), HU KLK1, o glicoforma de rhKLK1 de bajo o alto peso molecular. Este grafico es tfpico de los graficos de GIR ya que la GIR se incrementa desde el tiempo cero y presenta picos a aproximadamente de 40 a 60 minutos, y a continuacion hay una ligera disminucion en la GIR. Se realizo otro analisis sobre la tasa de infusion
de glucosa (GIR) para calcular el area bajo la curva (ABC), una medida de glucosa total glucosa infundida (mg/kg/minmin) durante el estudio de pinzamiento.
La tasa de infusion de glucosa requerida para mantener la misma glucemia era significativamente mayor con los grupos tratados con rhKLKI (glicoformas mezcladas 50:50) a 1 U/rata que en animales tratados con fraccion 11, 5 fraccion 5 o HU KLK1. Esta diferencia es evidente cuando con los datos se calcula una ABC total para la tasa de infusion de glucosa (vease la figura 8 y la tabla 4). Para ratas tratadas con fraccion B11, el ABC es de 3996 +/- 98 mg/kg/min min (media +/- EEM) y con fraccion B5, el ABC es de 3551 +/- 113 mg/kg/min min. Se esperaba que la mezcla 50:50 de rhKLK1 tuviera un ABC intermedio entre la glicoforma de bajo y alto peso molecular. Sorprendentemente, para la mezcla 50:50, el ABC fue de 4547 +/- 69 mg/kg/min min. Esta ABC sorprendentemente 10 alta indica que la combinacion de KLK1 de alto y bajo peso molecular tiene un efecto inesperadamente aditivo o mayor sobre la estimulacion de la captacion de glucosa. Para la KLK1 humana urinaria, puesto que se administro una cantidad igual de rhKLK1 y HU KLK1 a las ratas en base a la actividad in vitro (unidades calculadas en el ensayo de D-VLR-AFC), se esperaba que el efecto sobre GIR fuera el mismo. Sin embargo, el ABC de la GIR para KLK1 humana urinaria fue de 3444 +/- 227 mg/kg/min min, lo que era significativamente menor que el 4547 +/- 15 69 mg/kg/min min calculado para rhKLK1.
Tabla 4. Captacion de glucosa
Grupo / Dosis
Compuesto ABC de la GIR +/-EEM mg/kg/minmin
1. mezcla 50:50 1 U/rata
rhKLK1 4547 +/- 69
4. Glicoforma de alto PM 1 U/rata
rhKLK1 fraccion B11 3996 +/- 98
7. Glicoforma de bajo PM 1 U/rata
rhKLK1 fraccion B5 3551 +/- 113
10. KLK1 urinaria 1 U/rata
HU KLK1 3444 +/- 227
Como se muestra en la tabla 5 a continuacion, la mezcla 50:50 de rhKLK1 estimulo de forma consistente el incremento en la captacion de glucosa en ratas en comparacion con la HU KLK1 medida por un incremento en el ABC de la GIR. A una dosis de 0,33 U, el ABC de la mezcla 50:50 para rhKLK1 fue de 4127 +/- 78 mg/kg/min min 20 mientras que para HU KLK1 fue de 2969 +/- 144 mg/kg/min min, y a 0,1 U, para rhKLK1 fue de 3612 +/- 135 mg/kg/min min mientras que para HU KLK1 fue de 2503 +/- 266 mg/kg/min min.
Tabla 5. Captacion de glucosa
Dosis
ABC de la GIR +/- EEM mg/kg/min min
rhKLKI 50:50
KLK1 urinaria
1 U/rata
4547 +/- 69 3444 +/- 227
0,33 U/rata
4127 +/- 78 2964 +/- 144
0,1 U/rata
3612 +/-135 2503 +/- 266
En estos experimentos, se administraron cantidades iguales de KLK1 a las ratas, en base a la actividad in vitro de KLK1 medida en el ensayo de proteasa. Se administro una unica dosis de KLK1 (isoforma doblemente glicosilada , 25 isoforma triplemente glicosilada , mezcla 50:50 o HU KLK1) por via subcutanea 30 minutos antes del pinzamiento. Debido a que las diversas preparaciones de KLK1 se administraron por via subcutanea, la protema se debena absorber lentamente en la circulacion con relacion a la administracion i.v. Ademas, los animales se sometieron a prueba en los 30 minutos de administracion de los polipeptidos de KLK1. Como tal, cualquier diferencia en el pK o la semivida entre los polipeptidos de KLK1 en circulacion se debena minimizar y cualquier efecto sobre GIR debena 30 resultar de la actividad de la KLK1 administrada.
El tratamiento de ratas con la glicoforma de rhKLK1 de alto peso molecular dio como resultado un ligero incremento en la utilizacion de glucosa, como se detecta en una mayor ABC de la GIR, en comparacion con la glicoforma de rhKLK1 de bajo peso molecular. Esto se puede atribuir en parte a que la glicoforma de alto peso molecular tiene una semivida mayor en circulacion que la glicoforma de bajo peso molecular. La glicoforma de alto peso molecular puede 35 que no se elimine a traves de los rinones tan facilmente. Como se analiza anteriormente, dado el breve margen de tiempo para las pruebas (30 minutos despues de la administracion), el efecto no puede deberse solo a la semivida de la protema KLK1 en circulacion.
De forma alternativa, la glicosilacion adicional puede permitir que la glicoforma de KLK1 de mayor peso molecular se una a determinados receptores en el animal, lo que dana como resultado cambios en la utilizacion de glucosa. Por 40 ejemplo, la glicoforma de alto peso molecular puede ser mas eficaz que la glicoforma de bajo peso molecular al estimular un receptor directamente, o unirse a otra protema (por ejemplo, serpina) mas eficazmente y el complejo afecta a la utilizacion de glucosa. La glicoforma de alto peso molecular tambien se puede unir a un receptor mas
5
10
15
20
25
30
35
40
45
eficazmente que la glicoforma de bajo peso molecular, y secuestrar la glicoforma de KLK1 en un microentorno en el que la actividad enzimatica actua influenciando la utilizacion de glucosa. La glicosilacion adicional tambien puede permitir que la glicoforma de KLK1 de alto peso molecular sea mas activa en un entorno fisiologico tal como un animal, que no se refleja en los ensayos in vitro.
Sorprendentemente, la mezcla 50:50 de glicoformas de rhKLKI dio como resultado una mayor ABC de la GIR en comparacion con la glucoforma de alto peso molecular. El resultado esperado es que las glicoformas mezcladas 50:50 tendnan una actividad (medida por el ABC de la GIR) que es intermedia a las glicoformas de bajo y alto peso molecular. Este efecto sinergico en la mezcla 50:50 es inesperado. De hecho, el ABC de la GIR era significativamente mayor con las ratas tratadas con rhKLKI (mezcla 50:50) en comparacion con HU KLK1 (mezcla 60:40) en todas las dosis sometidas a prueba (vease la tabla 5).
Una posible explicacion no limitante para la sinergia de la mezcla de glicoformas 50:50 en las ratas es que las glicoformas de alto y bajo peso molecular actuan de formas ligeramente diferentes (actividades enzimaticas ligeramente diferentes, o union ligeramente diferente a los receptores) en un contexto fisiologico. Estas ligeras diferencias en las actividades son complementarias y, por tanto, sinergicas cuando las glicoformas estan en una mezcla 50:50.
De forma alternativa, la KLK1 puede actuar a traves de varios mecanismos diferentes para influir en la utilizacion de glucosa, tales como union a receptor y actividad enzimatica. Las glicoformas de alto y bajo peso molecular pueden actuar de manera complementaria en la que una glucoforma tiene mayor actividad enzimatica en un contexto fisiologico, mientras que la otra glicoforma tiene mayor afinidad de union. Conjuntamente, dichas diferencias dan como resultado un efecto sinergico en un animal. Esta sinergia o complementariedad no se detecto en la proporcion 60:40 de KLK1 de alto con respecto a bajo peso molecular.
Se llevo a cabo un estudio en un modelo animal de diabetes de tipo 2, espedficamente ratones db/db de 11 semanas de edad, administrados con la mezcla 52:57,5 de rhKLKI descrita previamente. Los ratones db/db hadan desarrollado diabetes de tipo 2 como se demostro por una glucemia en ayuno mayor de 250 mg/dl. Se separaron los ratones en cuatro grupos de diez ratones por grupo, y despues de ayuno durante la noche (8 horas), a los ratones se les administro tampon solo (control negativo) o bien 2 unidades, 0,8 unidades o 0,04 unidades por raton de mezcla de rhKLKI. 90 minutos despues de la administracion de rhKLKI, se sometio a prueba la glucemia en los ratones. En los animales con control negativo, la glucemia permanecio alta a 220 +/- 16 mg/dl. Los animales que recibieron 2 unidades de rhKLK1 tuvieron una disminucion significativa en la glucemia de hasta 141 +/- 9 mg/dl (p< 0,05) en comparacion con el control. Los animales que recibieron 0,8 unidades por raton tuvieron una disminucion menos drastica pero todavfa significativa en la glucemia de hasta 149 +/- 14 mg/dl (p< 0,05) en comparacion con el control. No existe ninguna diferencia estadfstica en la glucemia en ratones que recibieron la menor dosis de rhKLK1 de 0,04 unidades por raton (212 +/- 23 mg/dl) en comparacion con el control. Por lo tanto, el tratamiento de ratones db/db diabeticos con rhKLK1 en una proporcion de glicoformas de 52:47,5 da como resultado una disminucion significativa en la hiperglucemia.
Aunque se ha descrito la invencion anterior con algo de detalle a modo de ilustracion y ejemplo por fines de claridad de comprension, sera facilmente evidente para un experto en la tecnica a la vista de las ensenanzas de la presente invencion que se pueden realizar determinados cambios y modificaciones a la misma sin apartarse del alcance de las reivindicaciones adjuntas.
La anterior descripcion detallada y ejemplos se han dado unicamente por claridad de comprension. De las mismas no se debe entender ninguna limitacion innecesaria. La invencion no se limita a los detalles exactos mostrados y descritos, por lo que las variaciones obvias para un experto en la tecnica estaran incluidas dentro de la invencion definida por las reivindicaciones.
Listado de secuencias sin secuencias
SEQ ID NO: 1-2 secuencias de aminoacidos de la preproprotema calicrema-1 tisular humana

Claims (15)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    REIVINDICACIONES
    1. Una composicion que comprende una primera forma madura y activa de un polipeptido de calicrema-1 tisular humana (KLK1) y una segunda forma madura y activa de un polipeptido de calicrema-1 tisular humana (KLK1),
    en la que el primer polipeptido de KLK1 tiene tres glicanos ligados a N unidos a los residuos 78, 84 y 141 como se define por SEQ ID NO: 1 y el segundo polipeptido de KLK1 tiene dos glicanos ligados a N unidos a los residuos 78 y 84 pero no a 141 como se define por SEQ ID NO:2; y
    en la que el primer polipeptido de KLK1 y el segundo polipeptido de KLK1 estan presentes en la composicion en una proporcion que vana de 45:55 a 55:45.
  2. 2. La composicion de la reivindicacion 1, en la que la proporcion del primer polipeptido de KLK1 y el segundo polipeptido de KLK1 en la composicion es de 50:50.
  3. 3. La composicion de la reivindicacion 1 o 2, en la que dicho(s) polipeptido(s) de KLK1 comprende(n) los residuos aminoaddicos 78-141 de SEQ ID NO: 1 o los residuos aminoaddicos 78-141 de SEQ ID NO:2.
  4. 4. La composicion de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que dicho(s) polipeptido(s) de KLK1 comprende(n) los residuos aminoaddicos 25-262 de SEQ ID NO:1 o los residuos aminoaddicos 25-262 de SEQ ID NO:2.
  5. 5. La composicion de las reivindicaciones 1 o 2, en la que dicho(s) polipeptido(s) de KLK1 comprende(n) una secuencia de aminoacidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 95 % con los residuos aminoaddicos 25-262 de SeQ ID NO:1 o SEQ ID NO:2.
  6. 6. La composicion de la reivindicacion 5, en la que dicho(s) polipeptido(s) de KLK1 comprende(n) una secuencia de aminoacidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 95 % con los residuos aminoaddicos 25262 de SEQ ID NO:2, y en la que dicho(s) polipeptido(s) de KLK1 comprende(n) E145 y/o A188.
  7. 7. La composicion de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que dicho(s) polipeptido(s) de KLK1 comprende(n) una secuencia de aminoacidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 95 % con los residuos aminoaddicos 25-262 de SEQ ID NO:2, y en la que dicho(s) polipeptido(s) de KLK1 comprende(n) Q145 y/o V188.
  8. 8. La composicion de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en la que el/los polipeptido(s) de KLK1 consiste(n) en los residuos aminoaddicos 25-262 de SEQ ID NO:1 o los residuos aminoaddicos 25-262 de SEQ ID NO:2.
  9. 9. La composicion de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, que comprende ademas un diluyente, adyuvante o vehmulo farmaceuticamente aceptable.
  10. 10. La composicion de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en la que la composicion esta sustancialmente libre de otras isoformas glicosiladas (glicoformas) de KLK1.
  11. 11. La composicion de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en la que la composicion tiene niveles de endotoxina de menos de 1 UE/mg de protema, protema de celula huesped de menos de 100 ng/mg de protema total, ADN de celula huesped de menos de 10pg/mg de protema total, y/o esta sustancialmente libre de agregados (apareciendo mas de aproximadamente un 95 % como un pico unico por SEC HPLC).
  12. 12. Un dispositivo que comprende una composicion de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en el que el dispositivo es adecuado para administrar la composicion por via subcutanea.
  13. 13. El dispositivo de la reivindicacion 12, en el que el dispositivo es una jeringuilla.
  14. 14. La jeringuilla de la reivindicacion 13, que comprende ademas un montaje con aguja hipodermica unido a la jeringuilla.
  15. 15. La jeringuilla de la reivindicacion 14, en la que la aguja tiene una longitud de 1,27 cm (^ pulgadas) a 1,59 cm (5/8 pulgadas) y tiene un calibre de aproximadamente 25 a aproximadamente 31.
    imagen1
    1234 5 6789
    Figura 1
    180
    imagen2
    26 - 19 - 15 -
    1 2 3 4 5 6
    Figura 2
    mUA
    imagen3
    f
    Carga
    o
    o
    o
    o
    o
    o
    o
    CD
    o o o o
    in
    CO CM
    Figura 3A
    imagen4
    imagen5
    1
    2
    3
    4 5 6 7 8 9
    Carril
    Descripcio n de muestra Muestra (Ml) 4X LDS (pi) Cantidad cargada en gel (pi)
    1
    Patron es PM 7 0 7
    2
    Carga de 22,5 7,5 20
    3
    Fraccion A11 22,5 7,5 20
    4
    Fraccion A12 22,5 7,5 20
    5
    Fraccion B12 22,5 7,5 20
    6
    Fraccion B11 22,5 7,5 20
    7
    Fraccion B10 22,5 7,5 20
    8
    Fraccion B5 22,5 7,5 20
    9
    Fraccion B3 22,5 7,5 2D
    10
    Fraccion B1 22,5 7,5 20
    11
    Fraccion C2 22,5 7,5 20
    12
    Fraccion C12 22,5 7,5 20
    imagen6
    imagen7
    Figura 5A
    imagen8
    Figura 5B
    imagen9
    Figura 5C
    imagen10
    Tasa de infusion de glucosa (111/rata)
    CO
    ro
    imagen11
    DM-199_Frac_B11 DM-199_Frac_B5 -A- DM-199 (3417)
    FI U
    * (P<0,05)
    Tasa de infusion de glucosa, ABC
    (1 U/rata)
    CO
    GO
    500CH
    <D
    T3
    c o ^
    ‘Om c ■— “2
    »<£
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    (0 W (0
    O
    E
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    *
    4000-
    3000-
    2000-
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    m DM-199_Frac_B11 ES3 DM-199_Frac_B5 S DM-199 (3417)
    ™ huk
    * (P < 0,05) **(P < 0,001)
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