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ES2624614T3 - Animales no humanos que tienen un gen humanizado de una proteína reguladora de señales - Google Patents

Animales no humanos que tienen un gen humanizado de una proteína reguladora de señales Download PDF

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Publication number
ES2624614T3
ES2624614T3 ES14781783.7T ES14781783T ES2624614T3 ES 2624614 T3 ES2624614 T3 ES 2624614T3 ES 14781783 T ES14781783 T ES 14781783T ES 2624614 T3 ES2624614 T3 ES 2624614T3
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ES
Spain
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sirpa
mouse
human
gene
cells
Prior art date
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Active
Application number
ES14781783.7T
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English (en)
Inventor
Andrew J. Murphy
O. Gavin Thurston
Bindu Varghese
Cagan Gurer
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Regeneron Pharmaceuticals Inc
Original Assignee
Regeneron Pharmaceuticals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Regeneron Pharmaceuticals Inc filed Critical Regeneron Pharmaceuticals Inc
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Active legal-status Critical Current
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Abstract

Un ratón cuyo genoma comprende un reemplazo de los exones 2, 3 y 4 de un gen de SIRPα de ratón en un locus endógeno de SIRPα de ratón con los exones 2, 3 y 4 de un gen de SIRPα humano para formar un gen de SIRPα humanizado, en donde dicho gen de SIRPα humanizado se une operativamente a un promotor de SIRPα de ratón en dicho locus endógeno de SIRPα de ratón, y expresa en dicho ratón una proteína SIRPα humanizada que comprende una porción extracelular de la proteína SIRPα humana codificada por dicho gen de SIRPα humano y una porción intracelular de la proteína SIRPα de ratón codificada por dicho gen de SIRPα de ratón.

Description

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DESCRIPCION
Animales no humanos que tienen un gen humanizado de una protefna reguladora de senales Descripcion
Referencia cruzada con solicitud relacionada
Esta solicitud reivindica el beneficio de prioridad de la solicitud provisional de los Estados Unidos num. 61/881,261, presentada el 23 de septiembre de 2013.
Antecedentes de la invencion
El sistema inmunitario se compone de varios tipos de celulas diferentes que estan implicadas en multiples procesos altamente regulados, y juntas generan respuestas inmunitarias que son eficaces en la eliminacion de protefnas extranas. Ademas, se ha encontrado que estas mismas celulas inmunitarias poseen una propiedad de autotolerancia, entre otras, para las protefnas reguladoras de membrana que regulan las interacciones de celula a celula. Este tipo de comunicacion es fundamental para la supervivencia de tales organismos, ya que se sugiere que estas mismas protefnas son un determinante importante en el trasplante de injertos. Sin embargo, no existe un sistema in vivo para determinar los aspectos moleculares de las interacciones de celula a celula del sistema inmunitario humano y su regulacion. Un sistema de este tipo proporciona una fuente para ensayos en las funciones relacionadas con el sistema inmunitario y hematopoyetico humano in vivo, asf como la identificacion de nuevas terapias y vacunas.
Breve descripcion de la invencion
La presente invencion se basa en el reconocimiento de que es conveniente disenar animales no humanos que permitan un mejor injerto de celulas madre hematopoyeticas humanas. La presente invencion se basa ademas en el reconocimiento de que los animales no humanos que tienen un gen de SIRPa humanizado y/o que expresan, contienen, o producen de cualquier otra manera una protefna SIRPa humana o humanizada son convenientes, por ejemplo para usar en el injerto de celulas madre hematopoyeticas humanas.
La invencion proporciona un raton cuyo genoma comprende un reemplazo de los exones 2, 3 y 4 de un gen de SIRPa de raton en un locus endogeno de SIRPa de raton con los exones 2, 3 y 4 de un gen de SIRPa humano para formar un gen de SIRPa humanizado, en donde dicho gen de SIRPa humanizado se une operativamente a un promotor de SIRPa de raton en dicho locus endogeno de SIRPa de raton, y expresa en dicho raton una protefna SIRPa humanizada que comprende una porcion extracelular de la protefna SIRPa humana codificada por dicho gen de SIRPa humano y una porcion intracelular de la protefna SIRPa de raton codificada por dicho gen de SIRPa de raton.
La invencion proporciona ademas una celula o tejido aislados de raton cuyo genoma comprende un reemplazo de los exones 2, 3 y 4 de un gen de SIRPa de raton en un locus endogeno de SIRPa de raton con los exones 2, 3 y 4 de un gen de SIRPa humano para formar un gen de SIRPa humanizado, en donde dicho gen de SIRPa humanizado se une operativamente a un promotor de SIRPa de raton en dicho locus endogeno de SIRPa de raton, y codifica una protefna SIRPa humanizada que comprende una porcion extracelular de la protefna SIRPa humana codificada por dicho gen de SIRPa humano y una porcion intracelular de la protefna SIRPa de raton codificada por dicho gen de SIRPa de raton.
La invencion proporciona adicionalmente un metodo para obtener un raton, que comprende: (a) reemplazar los exones 2, 3 y 4 de un gen de SIRPa de raton en un locus endogeno de SIRPa de raton en una celula ES de raton con los exones 2, 3 y 4 de un gen de SIRPa humano para formar un gen de SIRPa humanizado, en donde dicho gen de SIRPa humanizado se une operativamente a un promotor de SIRPa de raton en dicho locus endogeno de SIRPa de raton, y codifica una protefna SIRPa humanizada que comprende una porcion extracelular de la protefna SIRPa humana codificada por dicho gen de SIRPa humano y una porcion intracelular de la protefna SIRPa de raton codificada por dicho gen de SIRPa de raton, para obtener de esta manera una celula ES modificada de raton que comprende dicho gen de SIRPa humanizado; y (b) crear un raton con el uso de la celula ES modificada obtenida en (a).
La invencion proporciona ademas un metodo para proporcionar un raton transgenico, en donde una o mas celulas humanas se trasplantan a un raton de acuerdo con la invencion.
La invencion proporciona ademas un metodo para medir la fagocitosis de un sustrato marcado por una o mas celulas de raton que comprende, (a) proporcionar una o mas celulas de raton cuyo genoma comprende un reemplazo de los exones 2, 3 y 4 de un gen de SIRPa de raton en un locus endogeno de SIRPa de raton con los exones 2, 3 y 4 de un gen de SIRPa humano para formar un gen de SIRPa humanizado, en donde dicho gen de SIRPa humanizado se une operativamente a un promotor de SIRPa de raton en dicho locus endogeno de SIRPa de
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raton, y codifica una protefna SIRPa humanizada que comprende una porcion extracelular de la protefna SIRPa humana codificada por dicho gen de SIRPa humano y una porcion intracelular de la protefna SIRPa de raton codificada por dicho gen de SIRPa de raton; (b) incubar una o mas celulas de la etapa (a) con el sustrato marcado; y (c) medir la fagocitosis del sustrato marcado por una o mas celulas de la etapa (b).
La invencion proporciona ademas un metodo para medir la fagocitosis de un antfgeno por una o mas celulas de un raton, que comprende (a) proporcionar un raton de acuerdo con la invencion; (b) exponer el raton al antfgeno; y (c) medir la fagocitosis del antfgeno por una o mas celulas del raton.
La invencion proporciona adicionalmente un metodo para evaluar la eficacia terapeutica de un farmaco para dirigirse a celulas humanas, que comprende: (a) proporcionar un raton de acuerdo con la invencion en el que se han trasplantado una o mas celulas humanas; (b) administrar un candidato a farmaco a dicho raton; y (c) controlar las celulas humanas en el raton para determinar la eficacia terapeutica del candidato a farmaco.
En la presente descripcion se describe un animal no humano que expresa un polipeptido de SIRPa que comprende una porcion extracelular de una protefna SIRPa humana y una porcion intracelular de una protefna SIRPa de raton.
Una porcion extracelular de una protefna SIRPa humana puede comprender aminoacidos correspondientes a los residuos 28-362 de una protefna SIRPa humana que aparece en la sec. con num. de ident.: 4.
Una porcion extracelular de una protefna SIRPa humana puede compartir un por ciento de identidad de al menos 50 %, al menos 55 %, al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, o al menos 98 % con una porcion extracelular correspondiente de una protefna SIRPa humana que aparece en la Tabla 3. Una porcion extracelular de una protefna SIRPa humana puede compartir el 100 % de identidad (o ser identica) con una porcion extracelular correspondiente de una protefna SIRPa humana que aparece en la Tabla 3.
En la presente descripcion se describe ademas un animal no humano que tampoco expresa una protefna SIRPa endogena no humana. El animal no humano puede ser un roedor que tampoco expresa una protefna SIRPa endogena de roedor. El animal no humano puede ser un raton que tampoco expresa una protefna SIRPa endogena de raton que tiene una secuencia que aparece en la Tabla 3.
En la presente descripcion se describe ademas un animal no humano que comprende un gen de SIRPa que comprende los exones 2, 3 y 4 de un gen de SIRPa humano unido operativamente a un promotor de SIRPa no humano.
Un gen de SIRPa de un animal no humano descrito en el presente documento puede comprender los exones 1, 5, 6, 7 y 8 de un gen endogeno de SIRPa no humano.
Un animal no humano descrito en el presente documento puede ser un roedor. El roedor puede seleccionarse de un raton o una rata.
En la presente descripcion se describe ademas un polipeptido de SIRPa codificado por el gen de un animal no humano como se describe en el presente documento.
En la presente descripcion se describe ademas una celula o tejido aislados a partir de un animal no humano como se describe en el presente documento. Una celula puede seleccionarse a partir de un linfocito (por ejemplo, una celula B o T), una celula mieloide (por ejemplo, un macrofago, un neutrofilo, un granulocito, una celula dendrftica mieloide, y un mastocito), y una neurona. Un tejido puede seleccionarse de tejido adiposo, vejiga, cerebro, mama, medula osea, ojo, corazon, intestino, rinon, hfgado, pulmon, ganglio linfatico, musculo, pancreas, plasma, suero, piel, bazo, estomago, timo, testfculo, ovulo, y/o una combinacion de estos.
En la presente descripcion se describe adicionalmente una celula o tejido aislados de raton cuyo genoma incluye un gen de SIRPa que codifica la porcion extracelular de una protefna SIRPa humana unida a la porcion intracelular de una protefna SIRPa de raton. El gen de SIRPa descrito en el presente documento puede unirse operativamente a un promotor de SIRPa de raton. Un gen de SIRPa descrito en el presente documento puede comprender los exones 2, 3, y 4 de un gen de SIRPa humano.
En la presente descripcion se describe ademas una celula madre embrionaria (ES) no humana cuyo genoma comprende un gen de SIRPa como se describe en el presente documento. La celula ES puede comprender los exones 2, 3 y 4 de un gen de SIRPa humano unidos operativamente a un promotor de SIRPa no humano. La celula ES puede ser una celula ES de roedor. Una celula madre embrionaria no humana descrita en el presente documento puede ser una celula madre embrionaria de raton o rata.
En la presente descripcion se describe ademas un embrion no humano que comprende, se produce, se obtiene, o se genera a partir de una celula madre embrionaria no humana que comprende un gen de SIRPa como se describe en
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el presente documento. El embrion no humano puede ser un embrion de roedor. El embrion de roedor como se describe en el presente documento puede ser un embrion de raton o rata.
En la presente descripcion se describe ademas un metodo para obtener un animal no humano que expresa una protefna SIRPa a partir de un locus endogeno de SIRPa, en donde la protefna SIRPa comprende una secuencia humana, el metodo comprende transformar un locus endogeno de SIRPa en una celula ES no humana con un fragmento genomico que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una protefna SIRPa humana en su totalidad o en parte; obtener una celula ES no humana modificada que comprende un locus endogeno de SIRPa que comprende dicha secuencia humana; y, crear un animal no humano mediante el uso de dicha celula ES modificada.
Como se describe en el presente documento, dicha secuencia de nucleotidos puede comprender los exones 2, 3 y 4 de un gen de SIRPa humano. Dicha secuencia de nucleotidos puede comprender los exones 2, 3 y 4 de un gen de SIRPa humano que tiene una secuencia al menos 50 %, al menos 55 %, al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, o al menos 98 % identica a un gen de SIRPa humano que aparece en la Tabla 3.
Dicha secuencia de nucleotidos puede codificar los residuos de aminoacidos 28-362 de una protefna SIRPa humana. Dicha secuencia de nucleotidos puede codificar los residuos de aminoacidos 28-362 de una protefna SIRPa humana que tiene una secuencia al menos 50 %, al menos 55 %, al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, o al menos 98 % identica a una protefna SIRPa humana que aparece en la Tabla 3.
En la presente descripcion se describe adicionalmente un metodo para proporcionar un raton cuyo genoma incluye un gen de SIRPa que codifica la porcion extracelular de una protefna SIRPa humana unida a la porcion intracelular de una protefna SIRPa de raton, el metodo comprende modificar el genoma de un raton de manera que este comprenda un gen de SIRPa que codifique la porcion extracelular de una protefna SIRPa humana unida a la porcion intracelular de una protefna SIRPa de raton para proporcionar de esta manera dicho raton. El gen de SIRPa puede ser un gen de SIRPa como se describe en el presente documento. El gen de SIRPa puede comprender los exones 2, 3, y 4 de un gen de SIRPa humano.
En la presente descripcion se describe ademas un metodo para injertar celulas humanas a un raton, el metodo comprende etapas para proporcionar un raton cuyo genoma comprende un gen de SIRPa que codifica la porcion extracelular de una protefna SIRPa humana unida a la porcion intracelular de una protefna SIRPa de raton, y trasplantar una o mas celulas humanas al raton. El metodo puede comprender, ademas, como una etapa, ensayar el injerto de una o mas celulas humanas en el raton. La etapa de ensayar puede comprender comparar el injerto de una o mas celulas humanas con el injerto en uno o mas ratones de tipo silvestre. La etapa de ensayar puede comprender comparar el injerto de una o mas celulas humanas con el injerto en uno o mas ratones cuyo genoma no comprende un gen de SIRPa que codifica la porcion extracelular de una protefna SIRPa humana unida a la porcion intracelular de una protefna SIRPa de raton.
Las celulas humanas pueden ser celulas madre hematopoyeticas. Las celulas humanas pueden trasplantarse por via intravenosa. Las celulas humanas pueden trasplantarse por via intraperitoneal. Las celulas humanas pueden trasplantarse por via subcutanea.
En la presente descripcion se describe ademas un metodo que comprende las etapas de proporcionar una o mas celulas cuyo genoma incluye un gen de SIRPa que codifica la porcion extracelular de una protefna SIRPa humana unida a la porcion intracelular de una protefna SIRPa de raton, incubar una o mas celulas con un sustrato marcado, y medir la fagocitosis del sustrato marcado por una o mas celulas. Las celulas pueden ser celulas de raton.
El sustrato puede estar marcado fluorescentemente. El sustrato puede estar marcado con un anticuerpo. El sustrato puede ser uno o mas globulos rojos. El sustrato puede ser una o mas celulas bacterianas.
En la presente descripcion se describe adicionalmente un metodo que comprende las etapas de proporcionar un raton cuyo genoma incluye un gen de SIRPa que codifica la porcion extracelular de una protefna SIRPa humana unida a la porcion intracelular de una protefna SIRPa de raton, exponer el raton a un antfgeno, y medir la fagocitosis del antfgeno por una o mas celulas del raton. La etapa de exponer puede comprender exponer el raton a un antfgeno que esta marcado fluorescentemente. La etapa de exponer puede comprender exponer el raton a una o mas celulas que comprenden el antfgeno. La etapa de exponer puede comprender exponer el raton a una o mas celulas humanas que comprenden el antfgeno. La etapa de exponer puede comprender exponer el raton a una o mas celulas bacterianas que comprenden el antfgeno.
Un gen de SIRPa descrito en el presente documento comprende los exones 2, 3, y 4 de un gen de SIRPa humano. Una porcion extracelular de una protefna SIRPa humana descrita en el presente documento puede comprender los aminoacidos correspondientes a los residuos 28-362 de una protefna SIRPa humana que aparece en la Tabla 3. Un gen de SIRPa descrito en el presente documento puede unirse operativamente a un promotor de SIRPa de raton.
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En la presente descripcion se describe ademas un animal no humano que puede obtenerse por los metodos segun se describen en el presente documento. Los animales no humanos descritos en el presente documento pueden no expresar de manera detectable una porcion extracelular de una protefna SIRPa endogena.
En la presente descripcion se describen ademas metodos para la identificacion o validacion de un farmaco o vacuna, el metodo comprende las etapas de suministrar un farmaco o vacuna a un animal no humano como se describe en el presente documento, y controlar una o mas de las respuestas inmunitarias al farmaco o vacuna, el perfil de seguridad del farmaco o vacuna, o el efecto sobre una enfermedad o afeccion. El control del perfil de seguridad puede incluir la determinacion de si el animal no humano exhibe un efecto secundario o reaccion adversa como resultado del suministro del farmaco o vacuna. Un efecto secundario o reaccion adversa puede seleccionarse de morbilidad, mortalidad, alteracion del peso corporal, alteracion del nivel de una o mas enzimas (por ejemplo, hepaticas), alteracion en el peso de uno o mas organos, perdida de funcion (por ejemplo, sensorial, motora, de organos, etcetera), aumento de la susceptibilidad a una o mas enfermedades, alteraciones al genoma del animal no humano, aumento o disminucion del consumo de alimentos y complicaciones de una o mas enfermedades.
En la presente descripcion se describe adicionalmente el uso de un animal no humano de la presente invencion en el desarrollo de un farmaco o vacuna para su uso en medicina, tal como su uso como un medicamento.
En la presente descripcion se describe ademas el uso de un animal no humano descrito en el presente documento para evaluar la eficacia de un farmaco terapeutico que se dirige a celulas humanas. Un animal no humano descrito en el presente documento puede trasplantarse con celulas humanas, y puede administrarse al animal un candidato a farmaco que se dirige a tales celulas humanas. La eficacia del farmaco se determina mediante el control de las celulas humanas en el animal no humano despues de la administracion del farmaco.
Los animales no humanos descritos en el presente documento pueden ser roedores, preferentemente un raton o una rata.
Como se usa en esta solicitud, los terminos “alrededor de” y “aproximadamente” se usan como equivalentes. Cualquier numero usado en esta solicitud con o sin alrededor de/aproximadamente pretende abarcar cualquiera de las fluctuaciones normales apreciadas por un experto en la tecnica en cuestion.
Otras caracterfsticas, objetivos, y ventajas de la presente invencion son evidentes en la descripcion detallada a continuacion. Debe entenderse, sin embargo, que la descripcion detallada, si bien indica modalidades de la presente invencion, se proporciona solamente a modo de ilustracion, no de limitacion. Diversos cambios y modificaciones dentro del alcance de la invencion resultaran evidentes para los expertos en la tecnica a partir de la descripcion detallada.
Breve descripcion de las figuras
Las figuras incluidas en la presente descripcion solamente tienen propositos ilustrativos y no de limitacion.
La Figura 1 muestra un diagrama, no a escala, de un gen murino endogeno de SIRPa (superior) con cada exon numerado. Se muestra un gen endogeno de SIRPa humanizado (inferior) que contiene los exones 2-4 de un gen de SIRPa humano y un casete de seleccion de neomicina (Ub-Neo) flanqueado por sitios de reconocimiento de recombinasas sitio especfficas (por ejemplo, loxP). La insercion dirigida de los exones 2-4 de un gen de SIRPa humano da como resultado un gen endogeno que expresa un gen de SIRPa humanizado que tiene una region extracelular correspondiente a una protefna SIRPa humana.
La Figura 2 muestra una superposicion de la expresion de SIRPa de ratones de tipo silvestre y heterocigotos para un gen de SIRPa humanizado.
La Figura 3 muestra el por ciento de celulas CD45+ en diferentes cepas de ratones injertados con celulas CD34+ humanas.
La Figura 4 muestra el por ciento de celulas CD45+CD3+ en diferentes cepas de ratones injertados con celulas CD34+ humanas.
La Figura 5 muestra el por ciento de celulas CD45+CD19+ en diferentes cepas de ratones injertados con celulas CD34+ humanas.
La Figura 6 muestra que Ac 1 suprimio el crecimiento de tumores Raji de manera dependiente de la dosis en ratones BRG SIRPa injertados con hCD34+. El volumen de los tumores Raji se midio en los dfas 3, 6, 9, 13, 16, 20, 23, 27, 30 y 34 despues de la implantacion del tumor. Se presentan los datos de los animales individuales (Paneles A-D). Los ratones BRG SIRPa injertados con hCD34+ recibieron la administracion de 2 x 106 celulas tumorales Raji por via subcutanea en el Dfa 0. Los grupos control no recibieron anticuerpo (control de vehfculo) (Panel A). Para los grupos experimentales, en el Dfa 0 los ratones se trataron con una dosis IP de un Ac control de no union (control Ac
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La Figura 7 muestra que el Ac 1 suprimio significativamente el crecimiento de tumores Raji en comparacion con los controles en ratones BRG SIRPa injertados con hCD34+. Los datos representan los datos compuestos de n=4-5 ratones por grupo como se muestra en la Figura 6. Los datos se expresan como media (SEM) y se analizaron mediante el uso de analisis de varianza (ANOVA) y pruebas post hoc para determinar los efectos significativos (prueba de Tukey para el ANOVA de dos vfas). Un raton en el grupo control de vehfculo, el grupo Control de Ac 5, y el grupo de Ac 1 a 0,4 mg/kg se excluyeron de este grafico compuesto debido a una muerte temprana, para analizar los datos mediante ANOVA de dos vfas.
La Figura 8 muestra que el Ac 1 no afecto el peso corporal en ratones BRG SIRPa injertados con hCD34+. Los pesos corporales se midieron en los dfas 3, 6, 9, 13, 16, 20, 23, 27, 30 y 34 despues de la implantacion del tumor. Se midieron los datos para los animales individuales (Paneles A-D). Los ratones BRG SIRPa injertados con hCD34+ recibieron la administracion de 2 x 106 celulas tumorales Raji por via subcutanea en el Dfa 0. Los grupos control no recibieron anticuerpo (control de vehfculo) (Panel A). Para los grupos experimentales, en el Dfa 0 los ratones se trataron con un dosis IP del Control de no union de IgG1 Ac 5 a 0,4 mg/kg (Panel B) o Ac 1 a 0,4 mg/kg (Panel C) o 0,04 mg/kg (Panel D), seguido por dosis dos veces a la semana durante todo el estudio.
Definiciones
Esta invencion no se limita a los metodos particulares y condiciones experimentales descritos, ya que tales metodos y condiciones pueden variar. Ademas, debe entenderse que la terminologfa usada en la presente descripcion es solamente para el proposito de describir modalidades particulares, y no pretende ser limitante, dado que el alcance de la presente invencion se define en las reivindicaciones.
A menos que se defina de cualquier otra manera, todos los terminos y frases usados en la presente descripcion incluyen los significados que se atribuyen a los terminos y frases en la tecnica, a menos que se indique claramente lo contrario o resulte claramente evidente a partir del contexto en el cual se usa el termino o frase. Aunque cualquiera de los metodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento puede usarse en la practica o prueba de la presente invencion, a continuacion se describiran metodos y materiales particulares.
El termino “aproximadamente”, como se aplica en la presente descripcion a uno o mas valores de interes, se refiere a un valor que es similar a un valor de referencia indicado. En modalidades determinadas, el termino “aproximadamente” o “alrededor de” se refiere a un intervalo de valores que caen dentro de 25 %, 20 %, 19 %, 18 %, 17 %, 16 %, 15 %, 14 %, 13 %, 12 %, 11 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, o menos en cualquier direccion (mayor o menor) del valor de referencia indicado a menos que se indique de cualquier otra manera o resulte evidente de cualquier otra manera a partir del contexto (excepto cuando tal numero exceda el 100 % de un valor posible).
El termino “biologicamente activo” como se usa en la presente descripcion se refiere a una caracterfstica de cualquier agente que tenga actividad en un sistema biologico, in vitro o in vivo (por ejemplo, en un organismo). Por ejemplo, un agente que, cuando esta presente en un organismo, tiene un efecto biologico dentro de ese organismo, se considera biologicamente activo. En modalidades particulares, cuando una protefna o polipeptido es biologicamente activo, una porcion de esa protefna o polipeptido que comparte al menos una actividad biologica de la protefna o polipeptido se refiere tfpicamente como una porcion “biologicamente activa”.
El termino “comparable”, como se usa en la presente descripcion, se refiere a dos o mas agentes, entidades, situaciones, conjuntos de condiciones, etcetera, que pueden no ser identicos entre sf pero que son suficientemente similares para permitir la comparacion entre ellos de manera que puedan obtenerse conclusiones razonablemente en base a las diferencias o las similitudes observadas. Los expertos en la tecnica entenderan, en el contexto, cual es el grado de identidad requerido en cualquier circunstancia determinada para que dos o mas de tales agentes, entidades, situaciones, conjuntos de condiciones, etcetera, se consideren comparables.
El termino "conservador" como se usa en la presente descripcion para describir una sustitucion de aminoacidos conservadora, se refiere a la sustitucion de un residuo de aminoacido por otro residuo de aminoacido que tiene un grupo R de cadena lateral con propiedades qufmicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad). En general, una sustitucion de aminoacido conservadora no cambiara sustancialmente las propiedades funcionales de interes de una protefna, por ejemplo, la capacidad de un receptor de unirse a un ligando. Los ejemplos de grupos de aminoacidos que tienen cadenas laterales con propiedades qufmicas similares incluyen cadenas laterales alifaticas tales como glicina, alanina, valina, leucina, e isoleucina; cadenas laterales hidroxialifaticas tales como serina y treonina; cadenas laterales que contienen grupo amida tales como asparagina y glutamina; cadenas laterales aromaticas tales como fenilalanina, tirosina, y triptofano; cadenas laterales basicas tales como lisina, arginina e histidina; cadenas laterales acidas tales como acido aspartico y acido glutamico; y, cadenas laterales que contienen azufre tales como
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cistefna y metionina. Los grupos de sustituciones conservadoras de aminoacidos incluyen, por ejemplo, valina/leucina/isoleucina, fenilalanina/tirosina, lisina/arginina, alanina/valina, glutamato/aspartato, y asparagina/glutamina. En algunas modalidades, una sustitucion de aminoacido conservadora puede ser una sustitucion de cualquier residuo nativo en una protefna con alanina, como se usa, por ejemplo, en la mutagenesis por barrido de alanina. En algunas modalidades, se produce una sustitucion conservadora que tiene un valor positivo en la matriz de probabilidad logarftmica PAM250 descrita en Gonnet y otros (1992) Exhaustive Matching of the Entire Protein Sequence Database, Science 256:1443-45. En algunas modalidades, la sustitucion es una sustitucion moderadamente conservadora en donde la sustitucion tiene un valor no negativo en la matriz de probabilidad logarftmica PAM250.
El termino "interrupcion” como se usa en la presente descripcion se refiere al resultado de un evento de recombinacion homologa con una molecula de aDn (por ejemplo, con una secuencia homologa endogena tal como un gen o locus genico). En algunas modalidades, una interrupcion puede lograr o representar una insercion, una delecion, una sustitucion, un reemplazo, una mutacion con perdida de sentido, o un desplazamiento del marco de una(s) secuencia(s) de ADN, o cualquier combinacion de estos. Las inserciones pueden incluir la insercion de genes completos o fragmentos de genes, por ejemplo, exones, que pueden ser de un origen distinto al de la secuencia endogena. En algunas modalidades, una interrupcion puede aumentar la expresion y/o actividad de un gen o producto genico (por ejemplo, de una protefna codificada por un gen). En algunas modalidades, una interrupcion puede disminuir la expresion y/o actividad de un gen o producto genico. En algunas modalidades, una interrupcion puede alterar la secuencia de un gen o un producto genico codificado (por ejemplo, una protefna codificada). En algunas modalidades, una interrupcion puede truncar o fragmentar un gen o un producto genico codificado (por ejemplo, una protefna codificada). En algunas modalidades, una interrupcion puede extender un gen o un producto genico codificado; en algunas de tales modalidades, una interrupcion puede lograr el ensamblaje de una protefna de fusion. En algunas modalidades, una interrupcion puede afectar el nivel pero no la actividad de un gen o producto genico. En algunas modalidades, una interrupcion puede afectar la actividad pero no el nivel de un gen o producto genico. En algunas modalidades, una interrupcion puede no tener un efecto significativo sobre el nivel de un gen o producto genico. En algunas modalidades, una interrupcion puede no tener un efecto significativo sobre la actividad de un gen o producto genico. En algunas modalidades, una interrupcion puede no tener un efecto significativo sobre el nivel o la actividad de un gen o producto genico.
La frase "locus endogeno" o "gen endogeno" como se usa en la presente descripcion se refiere a un locus genetico encontrado en un organismo parental o de referencia antes de la introduccion de una interrupcion, delecion, reemplazo, alteracion, o modificacion como se describe en el presente documento. En algunas modalidades, el locus endogeno tiene una secuencia que se encuentra en la naturaleza. En algunas modalidades, el locus endogeno es un locus de tipo silvestre. En algunas modalidades, el organismo de referencia es un organismo de tipo silvestre. En algunas modalidades, el organismo de referencia es un organismo disenado. En algunas modalidades, el organismo de referencia es un organismo criado en un laboratorio (ya sea de tipo silvestre o disenado).
La frase "promotor endogeno" se refiere a un promotor que se asocia naturalmente, por ejemplo, en un organismo de tipo silvestre, con un gen endogeno.
El termino "heterologo” como se usa en la presente descripcion se refiere a un agente o entidad de una fuente diferente. Por ejemplo, cuando se usa en referencia a un polipeptido, gen, o producto genico o presente en una celula u organismo particulares, el termino aclara que el polipeptido, gen, o producto genico relevantes 1) se diseno por el hombre; 2) se introdujo en la celula u organismo (o un precursor de este) por accion del hombre (por ejemplo, por medio de ingenierfa genetica); y/o 3) no se produce o no esta presente de manera natural en la celula u organismo relevantes (por ejemplo, el tipo de celula o el tipo de organismo relevantes).
El termino "celula huesped” como se usa en la presente descripcion se refiere a una celula en la cual se ha introducido un acido nucleico o una protefna heterologos (por ejemplo, exogenos). Despues de leer esta descripcion los expertos entenderan que dicho termino no se refiere solamente a la celula particular en cuestion, sino que se usa, ademas, para referirse a la progenie de una celula de este tipo. Debido a que pueden producirse determinadas modificaciones en las generaciones posteriores ya sea debido a una mutacion o a influencias del ambiente, tal progenie puede no ser, de hecho, identica a la celula parental, pero aun asf se incluye dentro del alcance del termino "celula huesped" como se usa en la presente descripcion. En algunas modalidades, una celula huesped es, o comprende, una celula procariota o eucariota. En general, una celula huesped es cualquier celula que sea adecuada para recibir y/o producir un acido nucleico o una protefna heterologos, independientemente del reino de la vida al que pertenece la celula. Las celulas ilustrativas incluyen las de organismos procariotas y eucariotas (unicelulares o pluricelulares), celulas bacterianas (por ejemplo, cepas de E. coli, Bacillus spp., Streptomyces spp., etcetera), celulas de micobacterias, celulas fungicas, celulas de levaduras (por ejemplo, S. cerevisiae, S. pombe, P. pastoris, P. methanolica, etcetera), celulas vegetales, celulas de insectos (por ejemplo, SF-9, SF-21, celulas de insectos infectadas con baculovirus, Trichoplusia ni, etcetera), celulas de animales no humanos, celulas humanas, o fusiones de celulas tales como, por ejemplo, hibridomas o cuadromas. En algunas modalidades, la celula es una celula humana, de mono, simio, hamster, rata, o raton. En algunas modalidades, la celula es eucariota y se selecciona de las siguientes celulas: CHO (por ejemplo, CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS (por ejemplo, COS-7), celula de retina, Vero, CV1, renal (por ejemplo, HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK), HeLa, HepG2, WI38,
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MRC 5, Colo205, HB 8065, HL-60, (por ejemplo, BHK21), Jurkat, Daudi, A431 (epidermica), CV-1, U937, 3T3, celula L, celula C127, SP2/0, NS-0, MMT 060562, celula de Sertoli, celula BRL 3A, celula HT1080, celula de mieloma, celula tumoral, y una lfnea celular derivada de una celula mencionada anteriormente. En algunas modalidades, la celula comprende uno o mas genes virales, por ejemplo, una celula de retina que expresa un gen viral (por ejemplo, una celula PER.C6™). En algunas modalidades, una celula huesped es, o comprende, una celula aislada. En algunas modalidades, una celula huesped es parte de un tejido. En algunas modalidades, una celula huesped es parte de un organismo.
El termino "humanizado" se usa en la presente descripcion de acuerdo con el significado que se entiende en la tecnica para referirse a acidos nucleicos o protefnas cuyas estructuras (es decir, secuencias de nucleotidos o aminoacidos) incluyen porciones que se corresponden sustancial o identicamente con estructuras de un gen o protefna particulares que se encuentran en la naturaleza en un animal no humano, e incluyen, ademas, porciones que se diferencian de la encontrada en el gen o protefna no humanos particulares en cuestion y en lugar de eso se corresponden de manera mas cercana con estructuras comparables que se encuentran en un gen o protefna humanos correspondientes. Un gen “humanizado” puede ser uno que codifica un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos sustancialmente igual a la de un polipeptido humano (por ejemplo, una protefna humana o porcion de esta - por ejemplo, una porcion caracterfstica de esta). Para dar un ejemplo, en el caso de un receptor de membrana, un gen “humanizado” puede codificar un polipeptido que tiene una porcion extracelular que tiene una secuencia de aminoacidos igual a la de una porcion extracelular humana y la secuencia restante igual a la de un polipeptido no humano (por ejemplo, de raton). Un gen humanizado puede comprender al menos una porcion de una secuencia de ADN de un gen humano. Un gen humanizado puede comprender una secuencia de ADN completa de un gen humano. Una protefna humanizada puede comprender una secuencia que tiene una porcion que aparece en una protefna humana. Una protefna humanizada puede comprender una secuencia completa de una protefna humana y se expresa a partir de un locus endogeno de un animal no humano que corresponde al homologo o al ortologo del gen humano.
El termino "identidad" como se usa en la presente descripcion en relacion con una comparacion de secuencias, se refiere a la identidad determinada mediante una serie de algoritmos diferentes conocidos en la tecnica que pueden usarse para medir la identidad de secuencias de nucleotidos y/o aminoacidos. En algunas modalidades, las identidades como se describen en el presente documento se determinan con el uso de un alineamiento ClustalW v. 1,83 (lento) que emplea una penalizacion por apertura de interrupcion de 10,0, una penalizacion por extension de interrupcion de 0,1, y el uso de una matriz de similitud de Gonnet (MACVECTOR™ 10.0.2, MacVector Inc., 2008).
El termino "aislado” como se usa en la presente descripcion, se refiere a una sustancia y/o entidad que (1) se ha separado de al menos algunos de los componentes con los que se asociaba cuando se produjo inicialmente (ya sea naturalmente y/o en un entorno experimental), y/o (2) se ha disenado, producido, preparado, y/o fabricado por la
obra del hombre.
Las sustancias y/o entidades aisladas pueden separarse de aproximadamente 10 %,
aproximadamente
20 %, aproximadamente 30 %, aproximadamente 40 %, aproximadamente 50 %,
aproximadamente
60 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 90 %,
aproximadamente
91 %, aproximadamente 92 %, aproximadamente 93 %, aproximadamente 94 %,
aproximadamente
95 %, aproximadamente 96 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 98 %,
aproximadamente 99 %, o mas de aproximadamente 99 % de los otros componentes con los que se asociaban inicialmente. En algunas modalidades, los agentes aislados son aproximadamente 80 %, aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 91 %, aproximadamente 92 %, aproximadamente 93 %,
aproximadamente 94 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 96 %, aproximadamente 97 %,
aproximadamente 98 %, aproximadamente 99 %, o mas de aproximadamente 99 % puros. Como se usa en la presente descripcion, una sustancia es “pura” si esta sustancialmente libre de otros componentes. En algunas modalidades, como entenderan los expertos en la tecnica, una sustancia aun puede considerarse “aislada” o incluso “pura”, despues de combinarse con otros componentes determinados tales como, por ejemplo, uno o mas portadores o excipientes (por ejemplo, tampon, disolvente, agua, etcetera); en tales modalidades, el porcentaje de aislamiento o pureza de la sustancia se calcula sin incluir tales portadores o excipientes. Solo para dar un ejemplo, en algunas modalidades, un polfmero biologico tal como un polipeptido o un polinucleotido que se produce en la naturaleza se considera “aislado” cuando: a) en virtud de su origen o fuente de obtencion no se asocia con algunos o todos los componentes que lo acompanan en su estado nativo en la naturaleza; b) esta sustancialmente libre de otros polipeptidos o acidos nucleicos de la misma especie de la especie que lo produce en la naturaleza; o c) se expresa por, o se encuentra de cualquier otra manera en asociacion con componentes de una celula u otro sistema de expresion que no es de la especie que lo produce en la naturaleza. Asf, por ejemplo, en algunas modalidades, un polipeptido que se sintetiza qufmicamente o se sintetiza en un sistema celular diferente al que lo produce en la naturaleza se considera un polipeptido "aislado". Alternativamente o adicionalmente, en algunas modalidades, un polipeptido que se ha sometido a una o mas tecnicas de purificacion puede considerarse un polipeptido “aislado” en la medida que se ha separado de otros componentes a) con los que se asocia en la naturaleza; y/o b) con los que se asociaba cuando se produjo inicialmente.
La frase “animal no humano” como se usa en la presente descripcion se refiere a cualquier organismo vertebrado que no es un ser humano. En algunas modalidades, un animal no humano es un ciclostomo, un pez oseo, un pez cartilaginoso (por ejemplo, un tiburon o una raya), un anfibio, un reptil, un mamffero, y un ave. En algunas
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modalidades, un mamffero no humano es un primate, una cabra, una oveja, un cerdo, un perro, una vaca, o un roedor. En algunas modalidades, el animal no humano es un roedor tal como una rata o un raton.
La frase "acido nucleico”, como se usa en la presente descripcion, en su sentido mas amplio, se refiere a cualquier compuesto y/o sustancia que sea una cadena oligonucleotfdica, o que puede incorporarse a esta. En algunas modalidades, un acido nucleico es un compuesto y/o sustancia que sea una cadena oligonucleotfdica, o pueda incorporarse a esta, por medio de un enlace fosfodiester. Como resultara evidente a partir del contexto, en algunas modalidades, “acido nucleico” se refiere a residuos de acidos nucleicos individuales (por ejemplo, nucleotidos y/o nucleosidos); en algunas modalidades, “acido nucleico” se refiere a una cadena oligonucleotfdica que comprende residuos de acidos nucleicos individuales. En algunas modalidades, un “acido nucleico” es o comprende ARN; en algunas modalidades, un “acido nucleico” es o comprende ADN. En algunas modalidades, un acido nucleico es, comprende, o consiste en uno o mas residuos de acidos nucleicos naturales. En algunas modalidades, un acido nucleico es, comprende, o consiste en uno o mas analogos de acidos nucleicos. En algunas modalidades, un analogo de acido nucleico se diferencia de un acido nucleico en que no utiliza una cadena principal con enlaces fosfodiester. Por ejemplo, en algunas modalidades, un acido nucleico es, comprende, o consiste en uno o mas “acidos nucleicos peptfdicos”, que se conocen en la tecnica y tienen enlaces peptfdicos en lugar de enlaces fosfodiester en la cadena principal, y se consideran dentro del alcance de la presente invencion. Alternativamente o adicionalmente, en algunas modalidades, un acido nucleico tiene uno o mas enlaces fosforotioato y/o 5'-N- fosforamidita en lugar de enlaces fosfodiester. En algunas modalidades, un acido nucleico es, comprende, o consiste en uno o mas nucleosidos naturales (por ejemplo, adenosina, timidina, guanosina, citidina, uridina, desoxiadenosina, desoxitimidina, desoxiguanosina, y desoxicitidina). En algunas modalidades, un acido nucleico es, comprende, o consiste en uno o mas analogos de nucleosidos (por ejemplo, 2-aminoadenosina, 2-tiotimidina, inosina, pirrolopirimidina, 3-metiladenosina, 5-metilcitidina, C-5 propinilcitidina, C-5 propiniluridina, 2-aminoadenosina, C5- bromouridina, C5-fluorouridina, C5-yodouridina, C5-propiniluridina, C5-propinilcitidina, C5-metilcitidina, 2- aminoadenosina, 7-deazaadenosina, 7-deazaguanosina, 8-oxoadenosina, 8-oxoguanosina, 0(6)-metilguanina, 2- tiocitidina, bases metiladas, bases intercaladas, y combinaciones de estos). En algunas modalidades, un acido nucleico comprende uno o mas azucares modificados (por ejemplo, 2'-fluororribosa, ribosa, 2'-desoxirribosa, arabinosa, y hexosa) en comparacion con los que se encuentran en los acidos nucleicos naturales. En algunas modalidades, un acido nucleico tiene una secuencia de nucleotidos que codifica un producto genico funcional tal como un ARN o una protefna. En algunas modalidades, un acido nucleico incluye uno o mas intrones. En algunas modalidades, los acidos nucleicos se preparan mediante uno o mas de lo siguiente: aislamiento a partir de una fuente natural, sfntesis enzimatica por polimerizacion basada en un molde complementario (in vivo o in vitro), reproduccion en una celula o sistema recombinantes, y sfntesis qufmica. En algunas modalidades, un acido nucleico es de al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 20, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000 o mas residuos de longitud. En algunas modalidades, un acido nucleico es monocatenario; en algunas modalidades, un acido nucleico es bicatenario. En algunas modalidades, un acido nucleico tiene una secuencia de nucleotidos que comprende al menos un elemento que codifica un polipeptido, o es el complemento de una secuencia que codifica un polipeptido. En algunas modalidades, un acido nucleico tiene actividad enzimatica.
La frase "unido operativamente”, como se usa en la presente descripcion, se refiere a una yuxtaposicion en donde los componentes descritos se encuentran en una relacion que les permite funcionar en su manera prevista. Una secuencia de control "unida operativamente" a una secuencia codificante se une de manera tal que la expresion de la secuencia codificante se logra en condiciones compatibles con las secuencias de control. Las secuencias "unidas operativamente" incluyen las secuencias de control de la expresion contiguas al gen de interes y las secuencias de control de la expresion que actuan en trans o a una distancia para controlar el gen de interes. El termino "secuencia de control de la expresion” como se usa en la presente descripcion se refiere a secuencias de polinucleotidos, que son necesarias para efectuar la expresion y el procesamiento de las secuencias codificantes a las que se unen. Las secuencias de control de la expresion incluyen secuencias adecuadas de iniciacion, de terminacion, promotoras y potenciadoras de la transcripcion; senales para el procesamiento eficiente del ARN tales como senales de corte y empalme y de poliadenilacion; secuencias que estabilizan el ARNm citoplasmatico; secuencias que mejoran la eficiencia de la traduccion (es decir, la secuencia consenso Kozak); secuencias que mejoran la estabilidad de las protefnas; y cuando convenga, secuencias que mejoran la secrecion de protefnas. La naturaleza de tales secuencias de control se diferencia en dependencia del organismo huesped. Por ejemplo, en procariotas, tales secuencias de control generalmente incluyen promotor, sitio de union al ribosoma, y secuencia de terminacion de la transcripcion, mientras que en eucariotas, tfpicamente, tales secuencias de control incluyen promotores y secuencia de terminacion de la transcripcion. El termino "secuencias de control" se destina a incluir componentes cuya presencia es esencial para la expresion y el procesamiento, y puede incluir, ademas, componentes adicionales cuya presencia es ventajosa, por ejemplo, secuencias lfder y secuencias de pareja de fusion.
El termino "polipeptido", como se usa en la presente descripcion, se refiere a cualquier cadena polimerica de aminoacidos. En algunas modalidades, un polipeptido tiene una secuencia de aminoacidos que se produce en la naturaleza. En algunas modalidades, un polipeptido tiene una secuencia de aminoacidos que no se produce en la naturaleza. En algunas modalidades, un polipeptido tiene una secuencia de aminoacidos disenada por ingenierfa genetica debido a que se disena y/o se produce a traves de la accion del hombre.
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El termino "recombinante", como se usa en la presente descripcion, esta destinado a referirse a polipeptidos (por ejemplo, protefnas reguladoras de senales como se describe en el presente documento) que se disenan, modifican por ingenierfa genetica, se preparan, expresan, crean o afslan por medios recombinantes, tales como polipeptidos expresados mediante el uso de un vector de expresion recombinante transfectado en una celula huesped, polipeptidos aislados a partir de una librerfa combinatoria de polipeptidos humanos recombinantes (Hoogenboom H. R., (1997) TIB Tech. 15:62-70; Azzazy H., e Highsmith W. E., (2002) Clin. Biochem. 35:425-445; Gavilondo J. V., y Larrick J. W. (2002) BioTechniques 29:128-145; Hoogenboom H., y Chames P. (2000) Immunology Today 21:371378), anticuerpos aislados a partir de un animal (por ejemplo, un raton) que es transgenico para genes de inmunoglobulina humana (ver por ejemplo, Taylor, L. D., y otros (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295; Kellermann S-A., y Green L. L. (2002) Current Opinion in Biotechnology 13:593-597; Little M. y otros (2000) Immunology Today 21:364-370) o polipeptidos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que implique el corte y empalme de elementos de secuencia seleccionados entre si. En algunas modalidades, uno o mas de tales elementos de secuencia seleccionados se encuentran en la naturaleza. En algunas modalidades, uno o mas de tales elementos de secuencia seleccionados se disenan in silico. En algunas modalidades, uno o mas de tales elementos de secuencia seleccionados son el resultado de la mutagenesis (por ejemplo, in vivo o in vitro) de un elemento de secuencia conocido, por ejemplo, a partir de una fuente natural o sintetica. Por ejemplo, en algunas modalidades, un polipeptido recombinante se compone de secuencias que se encuentran en el genoma de un organismo fuente de interes (por ejemplo, ser humano, raton, etcetera). En algunas modalidades, un polipeptido recombinante tiene una secuencia de aminoacidos que es el resultado de la mutagenesis (por ejemplo, in vitro o in vivo, por ejemplo, en un animal no humano), de manera que las secuencias de aminoacidos de los polipeptidos recombinantes son secuencias que, aunque se originan de secuencias de polipeptidos y se relacionan con estas, pueden no existir naturalmente dentro del genoma de un animal no humano in vivo.
El termino "reemplazo" se usa en la presente descripcion para referirse a un proceso a traves del cual una secuencia de acido nucleico “reemplazada” (por ejemplo, un gen) que se encuentra en un locus huesped (por ejemplo, en un genoma) se elimina de ese locus, y un acido nucleico diferente, de “reemplazo” se coloca en su lugar. En algunas modalidades, la secuencia de acido nucleico reemplazada y las secuencias de acidos nucleicos de reemplazo son comparables entre si porque, por ejemplo, son homologas entre si y/o contienen elementos correspondientes (por ejemplo, elementos que codifican protefnas, elementos reguladores, etcetera). En algunas modalidades, una secuencia de acido nucleico reemplazada incluye uno o mas de un promotor, un potenciador, un sitio donante de corte y empalme, un sitio receptor de corte y empalme, un intron, un exon, una region no traducida (UTR); en algunas modalidades, una secuencia de acido nucleico de reemplazo incluye una o mas secuencias codificantes. En algunas modalidades, una secuencia de acido nucleico de reemplazo es un homologo de la secuencia de acido nucleico reemplazada. En algunas modalidades, una secuencia de acido nucleico de reemplazo es un ortologo de la secuencia reemplazada. En algunas modalidades, una secuencia de acido nucleico de reemplazo es, o comprende, una secuencia de acido nucleico humana. En algunas modalidades, que incluyen cuando la secuencia de acido nucleico de reemplazo es, o comprende, una secuencia de acido nucleico humana, la secuencia de acido nucleico reemplazada es, o comprende, una secuencia de roedor (por ejemplo, una secuencia de raton). La secuencia de acido nucleico asf colocada puede incluir una o mas secuencias reguladoras que son parte de la secuencia de acido nucleico fuente usada para obtener la secuencia asf colocada (por ejemplo, promotores, potenciadores, regiones 5' o 3' no traducidas, etcetera). Por ejemplo, en diversas modalidades, el reemplazo es una sustitucion de una secuencia endogena con una secuencia heterologa que da como resultado la produccion de un producto genico a partir de la secuencia de acido nucleico asf colocada (que comprende la secuencia heterologa), pero no la expresion de la secuencia endogena; el reemplazo es de una secuencia genomica endogena con una secuencia de acido nucleico que codifica una protefna que tiene una funcion similar a la de la protefna codificada por la secuencia endogena (por ejemplo, la secuencia genomica endogena codifica una protefna SIRPa, y el fragmento de ADN codifica una o mas protefnas SIRPa humanas). En diversas modalidades, un gen endogeno o un fragmento de este se reemplaza con un gen humano correspondiente o un fragmento de este. Un gen humano correspondiente o un fragmento de este es un gen humano o un fragmento que es un ortologo, o es sustancialmente similar o igual en estructura y/o funcion, con el gen endogeno o fragmento de este que se reemplaza.
La frase "protefna reguladora de senales" o "SIRP" como se usa en la presente descripcion se refiere a un receptor proteico regulador de senales, por ejemplo, un receptor de SIRPa. Los genes de SIRP incluyen un receptor de la membrana plasmatica que se expresa en la superficie de una celula y sirve como una protefna reguladora implicada en las interacciones entre las protefnas de la superficie de la membrana en los leucocitos. Dentro de los genes de SIRP, se han descrito variantes polimorficas en sujetos humanos. A modo de ilustracion, las secuencias de nucleotidos y de aminoacidos de los genes de SIRP de raton y humano se proporcionan en la Tabla 1. Despues de leer esta descripcion los expertos reconoceran que uno o mas genes de receptores SIRP endogenos en un genoma (o todos) pueden reemplazarse con uno o mas genes de SIRP heterologos (por ejemplo, variantes polimorficas, subtipos o mutantes, genes de otras especies, formas humanizadas, etcetera).
Una "celula que expresa SIRP" como se usa en la presente descripcion se refiere a una celula que expresa un receptor proteico regulador de senales. En algunas modalidades, una celula que expresa SIRP expresa un receptor proteico regulador de senales en su superficie. En algunas modalidades, una protefna SIRP se expresa en la superficie de la celula en una cantidad suficiente para mediar las interacciones celula a celula por medio de la
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protefna SIRP expresada en la superficie de la celula. Las celulas que expresan SIRP ilustrativas incluyen neuronas, linfocitos, celulas mieloides, macrofagos, neutrofilos, y celulas asesinas naturales (NK). Las celulas que expresan SIRP regulan la interaccion de las celulas inmunitarias para regular la respuesta inmunitaria a diversos antfgenos o patogenos extranos. Los animales no humanos descritos en el presente documento pueden demostrar una regulacion de las celulas inmunitarias por medio de receptores SIRP humanizados expresados en la superficie de una o mas celulas del animal no humano.
El termino “sustancialmente” como se usa en la presente descripcion se refiere a la condicion cualitativa de exhibir una medida o grado total o casi total de una caracterfstica o propiedad de interes. Un experto en las tecnicas biologicas entendera que los fenomenos biologicos y qufmicos pocas veces, si alguna vez lo hacen, llegan a su terminacion y/o proceden hasta la totalidad o logran o evitan un resultado absoluto. Por lo tanto, el termino “sustancialmente” se usa en la presente descripcion para capturar la carencia potencial de totalidad inherente en muchos fenomenos biologicos y qufmicos.
La frase “homologfa sustancial” como se usa en la presente descripcion se refiere a una comparacion entre secuencias de aminoacidos o acidos nucleicos. Como apreciaran los expertos en la tecnica, generalmente dos secuencias se consideran “sustancialmente homologas” si contienen residuos homologos en las posiciones correspondientes. Los residuos homologos pueden ser residuos identicos. Alternativamente, los residuos homologos pueden ser residuos no identicos pero con caracterfsticas estructurales y/o funcionales adecuadamente similares. Por ejemplo, como bien conocen los expertos en la tecnica, determinados aminoacidos se clasifican tfpicamente como aminoacidos “hidrofobicos” o “hidrofflicos”, y/o con cadenas laterales “polares” o “no polares”. La sustitucion de un aminoacido por otro del mismo tipo puede considerarse frecuentemente una sustitucion “homologa”. Las clasificaciones de aminoacidos tfpicas se resumen en la Tabla 1 y 2.
Tabla 1
Alanina
Ala A no polar neutro 1,8
Arginina
Arg R polar positivo -4,5
Asparagina
Asn N polar neutro -3,5
Acido aspartico
Asp D polar negativo -3,5
Cistefna
Cys C no polar neutro 2,5
Acido glutamico
Glu E polar negativo -3,5
Glutamina
Gln Q polar neutro -3,5
Glicina
Gly G no polar neutro -0,4
Histidina
His H polar positivo -3,2
Isoleucina
Ile I no polar neutro 4,5
Leucina
Leu L no polar neutro 3,8
Lisina
Lys K polar positivo -3,9
Metionina
Met M no polar neutro 1,9
Fenilalanina
Phe F no polar neutro 2,8
Prolina
Pro P no polar neutro -1,6
Serina
Ser S polar neutro -0,8
Treonina
Thr T polar neutro -0,7
Triptofano
Trp W no polar neutro -0,9
Tirosina
Tyr Y polar neutro -1,3
Valina
Val V no polar neutro 4,2
Tabla 2
Aminoacidos ambiguos
3 Letras 1 Letra
Asparagina o acido aspartico
Asx B
Glutamina o acido glutamico
Glx Z
Leucina o Isoleucina
Xle J
Aminoacido no especificado o desconocido
Xaa X
Como bien se conoce en esta tecnica, las secuencias de aminoacidos o de acidos nucleicos pueden compararse con el uso de cualquiera de una variedad de algoritmos, que incluyen los disponibles en programas informaticos comerciales tales como BLASTN para secuencias de nucleotidos y BLASTP, Gapped BLAST, y PSI-BLAST para secuencias de aminoacidos. Programas ilustrativos de este tipo se describen en Altschul, y otros, Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol., 215(3): 403-410, 1990; Altschul, y otros, Methods in Enzymology; Altschul, y otros, "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997; Baxevanis, y otros, Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998; y Misener, y otros, (eds.), Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press, 1999. Ademas de identificar secuencias homologas, los programas mencionados anteriormente proporcionan tfpicamente una indicacion del grado de homologfa. En algunas modalidades, dos secuencias se consideran sustancialmente homologas si al menos 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85
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%, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o mas de sus residuos correspondientes son homologos en un tramo de residuos en cuestion. En algunas modalidades, el tramo en cuestion es una secuencia completa. En algunas modalidades, el tramo en cuestion es de al menos 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 o mas
residuos. En algunas modalidades, el tramo en cuestion incluye residuos contiguos a lo largo de una secuencia
completa. En algunas modalidades, el tramo en cuestion incluye residuos discontinuos a lo largo de una secuencia
completa. En algunas modalidades, el tramo en cuestion es de al menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, o mas
residuos.
La frase “identidad sustancial” como se usa en la presente descripcion se refiere a una comparacion entre secuencias de aminoacidos o de acidos nucleicos. Como apreciaran los expertos en la tecnica, generalmente, dos secuencias se consideran “sustancialmente identicas” si contienen residuos identicos en las posiciones correspondientes. Como bien se conoce en esta tecnica, las secuencias de aminoacidos o de acidos nucleicos pueden compararse con el uso de cualquiera de una variedad de algoritmos, que incluyen los disponibles en programas informaticos comerciales tales como BLASTN para secuencias de nucleotidos y BLASTP, Gapped BLAST, y PSI-BLAST para secuencias de aminoacidos. Programas ilustrativos de este tipo se describen en Altschul, y otros, Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol., 215(3): 403-410, 1990; Altschul, y otros, Methods in Enzymology; Altschul y otros, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997; Baxevanis y otros, Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998; y Misener, y otros, (eds.), Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press, 1999. Ademas de identificar secuencias identicas, los programas mencionados anteriormente proporcionan tfpicamente una indicacion del grado de identidad. En algunas modalidades, dos secuencias se consideran sustancialmente identicas si al menos 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o mas de sus residuos correspondientes son identicos en un tramo de residuos en cuestion. En algunas modalidades, el tramo en cuestion es una secuencia completa. En algunas modalidades, el tramo en cuestion es de al menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, o mas residuos.
La frase "vector de transformacion" o "construccion de transformacion” como se usa en la presente descripcion se refiere a una molecula polinucleotfdica que comprende una region de transformacion. Una region de transformacion comprende una secuencia que es identica o sustancialmente identica a una secuencia en una celula, tejido o animal objetivo y proporciona la integracion de la construccion de transformacion en una posicion dentro del genoma de la celula, tejido o animal por medio de recombinacion homologa. Se incluyen, ademas, las regiones de transformacion que se dirigen hacia el objetivo con el uso de sitios de reconocimiento de recombinasas sitio especfficas (por ejemplo, sitios loxP o Frt). En algunas modalidades, una construccion de transformacion de la presente invencion comprende, ademas, una secuencia de acido nucleico o gen de interes particular, un marcador de seleccion, secuencias de control y/o reguladoras, y otras secuencias de acidos nucleicos que permiten la recombinacion mediada por la adicion exogena de protefnas que ayudan o facilitan la recombinacion que involucra a dichas secuencias. En algunas modalidades, una construccion de transformacion de la presente invencion comprende, ademas, un gen de interes en su totalidad o en parte, en donde el gen de interes es un gen heterologo que codifica una protefna, en su totalidad o en parte, que tiene una funcion similar a la de una protefna codificada por una secuencia endogena.
El termino “variante” como se usa en la presente descripcion se refiere a una entidad que muestra una identidad estructural significativa con una entidad de referencia, pero se diferencia estructuralmente de la entidad de referencia en la presencia o el nivel de una o mas porciones qufmicas en comparacion con la entidad de referencia. En muchas modalidades, una variante se diferencia, ademas, funcionalmente de su entidad de referencia. En general, el hecho de que una entidad particular se considere adecuadamente como una “variante” de una entidad de referencia se basa en su grado de identidad estructural con la entidad de referencia. Como apreciaran los expertos en la tecnica, cualquier entidad de referencia biologica o qufmica tiene determinados elementos estructurales caracterfsticos. Una variante, por definicion, es una entidad qufmica definida que comparte uno o mas de tales elementos estructurales caracterfsticos. Para proporcionar solo algunos ejemplos, una molecula pequena puede tener un elemento estructural central caracterfstico (por ejemplo, un macrociclo central) y/o una o mas porciones colgantes caracterfsticas de manera que una variante de la molecula pequena es una que comparte el elemento estructural central y las porciones colgantes caracterfsticas pero se diferencia en otras porciones colgantes y/o en los tipos de enlaces presentes (simples vs. dobles, E vs. Z, etcetera) dentro del nucleo central, un polipeptido puede tener un elemento de secuencia caracterfstico que se compone de una pluralidad de aminoacidos que tienen posiciones designadas unas con respecto a las otras en el espacio lineal o tridimensional y/o que contribuyen a una funcion biologica particular, un acido nucleico puede tener un elemento de secuencia caracterfstico que se compone de una pluralidad de residuos de nucleotidos que tienen posiciones designadas unos con respecto a otros en el espacio lineal o tridimensional. Por ejemplo, una variante de polipeptido puede diferenciarse de un polipeptido de referencia como resultado de una o mas diferencias en la secuencia de aminoacidos y/o una o mas diferencias en las porciones qufmicas (por ejemplo, carbohidratos, lfpidos, etcetera) unidas covalentemente a la cadena principal del polipeptido. En algunas modalidades, una variante de polipeptido muestra una identidad de secuencia general con un polipeptido de referencia que es al menos de 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, o 99 %. Alternativamente o adicionalmente, en algunas modalidades, una variante de polipeptido no comparte al menos un elemento de secuencia caracterfstico con un polipeptido de referencia. En algunas modalidades, el polipeptido de referencia tiene una o mas actividades biologicas. En algunas modalidades, una
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variante de polipeptido comparte una o mas de las actividades biologicas del polipeptido de referencia. En algunas modalidades, una variante de polipeptido carece de una o mas de las actividades biologicas del polipeptido de referencia. En algunas modalidades, una variante de polipeptido muestra un nivel reducido de una o mas actividades biologicas en comparacion con el polipeptido de referencia. En muchas modalidades, un polipeptido de interes se considera una “variante” de un polipeptido original o de referencia si el polipeptido de interes tiene una secuencia de aminoacidos que es identica a la del original excepto por un pequeno numero de alteraciones de la secuencia en posiciones particulares. Tfpicamente, menos de 20 %, 15 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 % de los residuos en la variante se sustituyen en comparacion con el parental. En algunas modalidades, una variante tiene 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, o 1 residuo sustituido en comparacion con un original. Frecuentemente, una variante tiene un numero muy pequeno (por ejemplo, menos de 5, 4, 3, 2 o 1) de residuos funcionales sustituidos (es decir, residuos que participan en una actividad biologica particular). Ademas, tfpicamente, una variante no tiene mas de 5, 4, 3, 2 o 1 adiciones o deleciones, y frecuentemente no tiene adiciones o deleciones, en comparacion con el original. Por otra parte, cualquiera de las adiciones o deleciones son tfpicamente menores que aproximadamente 25, aproximadamente 20, aproximadamente 19, aproximadamente 18, aproximadamente 17, aproximadamente 16, aproximadamente 15, aproximadamente 14, aproximadamente 13, aproximadamente 10, aproximadamente 9, aproximadamente 8, aproximadamente 7, aproximadamente 6, y comunmente son menores que aproximadamente 5, aproximadamente 4, aproximadamente 3, o aproximadamente 2 residuos. En algunas modalidades, el polipeptido parental o de referencia es uno que se encuentra en la naturaleza. Como entenderan los expertos en la tecnica, una pluralidad de variantes de un polipeptido de interes particular puede encontrarse comunmente en la naturaleza, particularmente cuando el polipeptido de interes es un polipeptido de un agente infeccioso.
El termino “vector” como se usa en la presente descripcion se refiere a una molecula de acido nucleico capaz de transportar otro acido nucleico al cual se asocia. En algunas modalidades, los vectores son capaces de replicar de manera extracromosomica y/o expresar los acidos nucleicos a los que se encuentran unidos en una celula huesped tal como una celula eucariota y/o procariota. Los vectores capaces de dirigir la expresion de genes unidos operativamente se refieren en la presente descripcion como “vectores de expresion.”
El termino “de tipo silvestre” como se usa en la presente descripcion, tiene el significado que se entiende en la tecnica que se refiere a una entidad que tiene una estructura y/o actividad como la que se encuentra en la naturaleza en un estado o contexto “normal” (a diferencia del mutante, enfermo, alterado, etcetera). Los expertos en la tecnica apreciaran que los genes y polipeptidos de tipo silvestre existen frecuentemente en multiples formas diferentes (por ejemplo, alelos).
Descripcion detallada de la invencion
En la presente descripcion se describen, entre otras cosas, animales no humanos mejorados y/o modificados geneticamente que tienen material genetico humanizado que codifica una protefna reguladora de senales (por ejemplo, SIRP) para ensayos de trasplante de injertos, activacion de la fagocitosis y transduccion de senales. Se contempla que tales animales no humanos proporcionan un mejoramiento en el trasplante de injertos de celulas humanas. Por lo tanto, la presente descripcion es particularmente util para mantener celulas hematopoyeticas humanas en animales no humanos. Particularmente, la presente descripcion abarca la humanizacion de un gen de SIRPa de roedor que da lugar a la expresion de una protefna humanizada en la superficie de la membrana plasmatica de celulas del animal no humano. Tales protefnas humanizadas tienen la capacidad de reconocer celulas humanas injertadas por medio de la participacion de las protefnas SIRPa humanizadas y los ligandos presentes en la superficie de las celulas humanas injertadas. En la presente descripcion se describe que los animales no humanos son capaces de recibir celulas hematopoyeticas humanas trasplantadas; tales mamfferos no humanos pueden desarrollar y/o tener un sistema inmunitario que comprende celulas humanas. Las protefnas SIRPa humanizadas pueden tener una secuencia correspondiente a los residuos de aminoacidos 28 - 362 de una protefna SIRPa humana. Los animales no humanos descritos en el presente documento pueden comprender un gen de SIRPa endogeno que contiene material genetico del animal no humano y una especie heterologa (por ejemplo, un ser humano). Los animales no humanos descritos en el presente documento pueden comprender un gen de SIRPa humanizado, en donde el gen de SIRPa humanizado comprende los exones 2, 3 y 4 de un gen de SIRPa humano.
Diversos aspectos de la invencion se describen en detalle en las siguientes secciones. El uso de secciones no significa que limite la invencion. Cada seccion puede aplicarse a cualquier aspecto de la invencion. En esta solicitud, el uso de “o” significa “y/o” a menos que se indique de cualquier otra manera.
Familia de genes de la protefna reguladora de senales (SIRP)
Las protefnas reguladoras de senales (SIRP) constituyen una familia de glicoprotefnas de la superficie celular que se expresan en linfocitos, celulas mieloides (que incluyen macrofagos, neutrofilos, granulocitos, celulas dendrfticas mieloides, y mastocitos) y neuronas (por ejemplo, ver Barclay y Brown, 2006, Nat Rev Immunol 6, 457-464). Se ha informado de numerosos genes de SIRP y estos pueden categorizarse por sus ligandos respectivos y los tipos de senalizacion donde estan implicados. SIRPa (referido ademas como CD172A, SHPS1, P84, MYD-1, BIT y PTPNS1) se expresa en celulas inmunitarias del linaje mieloide y funciona como un receptor inhibitorio por medio de un motivo inhibidor basado en tirosina del inmunorreceptor (ITIM). La expresion de SIRPa se ha observado ademas en
neuronas. Los ligandos informados para SIRPa incluyen, mas notablemente, CD47, pero ademas incluyen las protefnas tensoactivas A y D. SIRPp (referido ademas como CD172b) se expresa en macrofagos y neutrofilos, sin embargo, no se han informado ligandos conocidos. SIRPp contiene una region citoplasmatica corta en comparacion con SIRPa y se conoce que se asocia con un componente de senalizacion conocido como protefna 12 de activacion 5 de DNAX (DAP12). Asf, SIRPp parece ser un receptor de activacion. SIRPy (referido ademas como CD172g y SIRPp2) se expresa en linfocitos y celulas asesinas naturales y ademas se une a CD47, sin embargo, no se ha informado una funcion de senalizacion ya que la cola citoplasmatica solo contiene cuatro aminoacidos y carece de una secuencia que pudiera facilitar la asociacion con DAP12. Otro miembro, SIRP6, se ha descrito y existe como un receptor soluble.
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El papel de SIRPa, en particular, se ha investigado con respecto a su papel inhibidor en la fagocitosis de celulas huesped por macrofagos. Por ejemplo, la union de CD47 a SIRPa en los macrofagos, activa senales inhibidoras que regulan negativamente la fagocitosis. Alternativamente, se han informado efectos de senalizacion positiva mediados a traves de la union a SIRPa (Shultz y otros, 1995, J Immunol 154, 180-91).
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Secuencias de SIRPa
En la Tabla 3 se exponen secuencias ilustrativas de SIRPa para humano y raton. Para las secuencias de ADNc, los exones consecutivos estan separados por texto subrayado alternante. Para las secuencias de protefnas, los 20 peptidos senal estan subrayados y las secuencias transmembrana y citoplasmatica estan en letras cursivas.
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Tabla 3
ADNc de SIRPa de raton NM 007547.3
GCGCTCGGCCGGGCCGCCCTCGCGCTGGCCTCGCGACGGCTC C GCACAGCCCGC ACTC'GCTCTGCGAGCTGT CCCCGCTCGCGC’T TGCTCTCCGATCTCCGTCCCCGCTCCCTCTCCCTCTTCCTCTCC CCCTCTTTCCTTCTCCCTCGCTATCCGCTCCCCCGCCCCCGTGC
CTCTGGCTCTGCGCCTGGCTCCCTCGGGTCCGCTCCCCTTTCCC
GCCGGC CTGGCCCGGCGTCACGCTC CCGG AGTCTCCCCGCTCG
GCGGCGTCTCATTGTGGGAGGGGGTCAGATCACCCCGCCGGG
C GGT GGCGCT GGGGGGC AGCG G AGGGGG AGGGGCCTTAGT C
GTTCGCCCGCGCCGCCCGCCCGCCTGCCGAGCGCGCTCACCGC
CGCTCTCCCTCCTTGCTCTGCAGCCGCGGCCCATGGAGCCCGC
CGGCCCGGCCCCTGGC CGCCTAGGGCC GCTGC'TGCTCTGCCTG
CTGCTCTCCGCGTCCTGTTTCTGTACAGGAGCCACGGGGAAGG
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CTGGGGATTCGACCGTTCTGAACTGCACTTTGACCTCCTTGTT
GCCGGTGGGACCCATTAGGTGGTACAGAGGAGTAGGGCCAAG
CCGGC'TGTTGATCT ACAGTTTCGC AGGAGA AT AC'GTTCCTCGA
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TTTTCCATCCGTATCAGTAATGTCACCCCAGCAGATGCTGGCA
TCTACTACTGTGTGAAGTTCC ACiAAAC.C.ATCATCAGAGCCTG
ACACAGAAATACAATCTGGAGGGGGAACAGAGGTCTATGTAC
ICGCCAAACCrrCICC ACCGGAGGIATCCGGCCCAGCAGACA
GGGGCATACCTGACCAGAAAGTGAACTTCACCTGCAAGTCTC
AT GGC’TT CTCT CCCC GG AAT ATC ACCCT G AAGT GGTTC AAAG A
TGGGCAAGAAC’TCCACCCCTTGGAGACCACCGTGAACCCTAG
TGGAAAGAATGTCTCCTACAACATCTCCAGCACAGTCAGGGT
GGTACTAAACTCCATGGATGTTAATTCTAAGGTCATCTGCGAG
GTAGCCCACATCACCTTGGATAGAAGCCCTCTTCGTGGGATTG
CTAACCTGTCTAACTTCATCCGAGTTTCACCCACCGTGAAGGT
CACCCAACAGTCCCCGACGTCAATGAArrAGGTGAACrTCAC
CTGCCGGGCTGAGAGGTTCTACCCCGAGGATCTCCAGCTGATC
TGGCTGGAGAATGGAAACGTATCACGGAA TGACAC'GC’CCAAG
AAT CT C AC AAAGAACACGGAT GGG ACCT AT AATTAC AC.AAGC
TTGTTCCTGGTGAACTCATCTGCTCATAGAGAGGACGTGGTGT
TCACGTGCCAGGTGAAGCACGACCAACAGCCAGCGATCACCC
GAAACCATACCGTGCTGGGATTTGCCCACTCGAGTGATCAAG
GGAGC AIGCAAACCX ICC C 1GAI AA I AATGC1ACCCAC AACT
GGAATGTCTTCATCGGTGTGGGCGTGGCGTGTGCTTTGCTCGT
AGTCCTGCTGATGGCTGCTCTCTACCTCCTCCGGATCAAACAG
AAGAAAGCCAAGGGGTCAACATCTTCCAC AC GGTTGCACGAG
CCCGAGAAGAACGCCAGGGAAATAACCCAGATCCAGGACAC
AAAIGACArCAACGACATCACATACGCAGACCrGAArCTGCC
CAAAGAGAAGAAGCCCGCACCCCGGGCCCCTGAGCCT.AACAA
CCACACAGAATATGCAAGCATTGAGACAGGCAAAGTGCCTAG
GC C AGAGG AT ACC CTC AC CT ATGC'TG ACCT GG AC AT GGTC C A
CCTC AGCCGGGC AC AGCC AGCCCCC AAGCCTGAGCC ATCTTTC
I CAGAGIAI GC I AGI GI CCAGG I CCAGAGGAAGI GAA I GGGG
CTGTGGTCTGTACTAGGC CCCATCCCCAC AAGTTTTC TTGTCC T
ACATGGAGTGGCCATGACGAGGACATCCAGCCAGCCAATCCT
GrCCCCAGAAGGCCAGGTGGCACGGGTCCTAGGACCAGGGGT
AAGGGTGGCCTTTGTCTTCCCTCCGTGGCTCTTCAACACCTCTT
GGGCACCCACGTCCCCTTCTTCCGGAGGCTGGGTGTTGCAGAA
CCAGAGGGCGAACTGGAGAAAGCTGCCTGGAATCCAAGAAGT
GTT GT GCCTCGGCCCATC ACTCGTGGGTCTGGATCCTGGTCTT
GGCAACCCCAGGTTGCGTCCTTGATGTTCCAGAGCTTGGTCTT
CTGTGTGGAGAAGAGCTCACCATCTCTACCCAACTTGAGCTTT
GGGAC'CAGAC'ICCCTI TAGA ICAAACCGC'CCCATCrGrGGAA
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Protefna SIRP a de raton NP_031573.2
(continuacion) G AACTAC ACC A G A AGTC AG C A AGTTTTCAGCCAACAG TGCTG GCCTCOCC ACCTCCC AGGCTG ACTAGCCCTGG GGA G AAGGA A C CCTCTCCTCCT AG ACC ACC A G AG ACTCCCTG GG C ATG TTC AG TGrGGCCCCACCTCCCTrCCAGTCCCAGCTTGCTTCCTCCAGCT AG G AC T A ACTC AG C AGC ATCGCTCTG TGG AC G CCTGT A A ATT A TTG AGAAATGTGAACTGTGC AGTCTTAAAGCTAAGGTGTTAG A A AATTTG AlTT ATGCTGTTTA GTTGTTGTTGGGTTTC1 "IT ['CT TTTTAATTTCTTTTT CTTTTTTG ATTTTTTTT CTTT CCCTTAAAA CAACAGCAGCAGCATCTTGGCTCTTTGTCATGTGTTGAATGGT TGGGTCTTGTGA AGTCTGAGGTCT AACAGTTT ATTGTCCTQG A AG G ATTTTCTT AC A GC AG A A A CAGATTTTTTTCAAATTCCC AG AATCCTGAGGACCAAG AAGGATCCCTC AGCTGCTACTT CCAG C ACCCAG CGTCACTGG G AC G A ACC AG GC CCTGTTC TTACA AG GCC AC A TGG CTGGC CC'TTTG CCTCC ATG GCT ACTG TGGT A ACT GC AGCCTTGTCTGAC. CCA ATGC TGACCTAATG1 rG GC CATTCC AC ATTGAGGG G AC A AG GTC AGTG ATGCCCCCCTTCACTCACA AGCACTTCAGAGGCATGCAGAGAGAAGGGACACTCGGCCAGC TC.TCTG AG GT A ATC A GTGC A AGG AGG A GTCCGTTTTTTG CCAG C A A A CCTC A GC AG G ATG AC ACT GGA A C A GAACCT GGTC AT AC CTGIGAC A AC ACA GC: 1G I’G A GCC A GG GCA A A CC ACCC A C FGT C A CT G GC T CG AG A GT CT G GG C’ AG A GG CT CTG ACC CT CC ACCC T fTA AA CTG GATGCCGG GGCCTGGCTGGGCCCA A TGCC A AGTG G TT AT GG CAAC CC TGACTATCTGGT CTTAACATGTA G CTCA G G A A GTGG AGGCGCT A ATGTCCCC A A TCCCTG GGG ATTCCTG ATT C C AGCT ATTC ATGT A AG C A G A GC C A AC C TG C C T ATTTCI GT A G GTGCGACTGGGATGTT AGGAGCACAGC AAGGACCC AGCTCTG 1A GGGC' FGGTG ACCTG A 1 AC 1 1 Cl CAT A A rGGCATC 1 AG A AG 1 T AGG CTG AGTTG G C CTC ACTG GCC C A GCA A ACC A GAACTTGT CTTTGTC C GGG CC ATGTTCTTGGG CTGTCTTCT A A TTCC A A AG GGTTG GTTGGTA A A GCTCC ACCCC CTTCTCCTCTGCCTA A A G A C ATC AC ATGTGT ATAC AC ACACGGG TGT AT AG AT G AGTT A A A ACi A A [‘GTCCTCGC 1 GGC A TC C1A AT J 1 TG TCTT A AGTTTTTTTG G A G G GAG A A AGG A AG A AG G C A A G GG A A G ATGTGT AGCTTTG G CTTT A ACCAGGC AGCCTGGGGGCTCCCAAGCCTATGG AACC CTGGT AC A AAGA AGAGA AC AG A AGCGCCCTGTGAGGAGTGG GATTT GTTTTTCTGTA G ACC AG ATG AG AAGGAAACAGG CC CT Grrr r re tacat ag ' rre caactfa a a attttt ggct-rGC a a aat ATTTTTGTAATAAAGATTTCTGGGTAACAATAAAAAAAAAAA ■■ ■, (sec. con num. de ident.: 1) M E P AG P APG R L G P L L LC L L LS ASCFCTG ATG KE L K VTO PE KS VS V AAGUS I VLNCTL I SUTVGPIRWVKGVGPSRLLIYSFAGEYVPRI RNVSDTTKRNNMDFSIR3SNVTPADAGIYY CVKPQKGSSEPDTEI Q S GG GTEVY VLAKP SPPEVSGPADRGlPD QK.VNTTC KSH GFSPRN IT LK WPKDGQELHPLETTVNPSGKNVSYNISSTVRWLNSMDVN SKVIC EVAHTT LDRSPLRGIAN LSNF1RVS PTVKVTQQ S PTS MNQV NLTCRAERF YPEDLQLIWLENGM VSRNDTPKN LTKMTlXiTTO YT slflvnssahredwftcqvkhdqqpaitrnhtvlgfahssdqg SMQTF PDNNA THNWN VFIG VG VA CALL VVLLMAA L YLL RIKQKKAK GS TSSTRLHEPEKNA RFJTQlQD TNDIND1TYA DLNLPKEKKPA PR A P EPNNHTEYA SIE TGKVPRPEDTL TYA DLDM VHLSRA QPA FKPEPSFS EYASFQVQRK (sec. con num. de ident.: 2)
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ADN de SIRPa humana
NM 001040022.1
(continuacion)
TCCGGCCCGCAOCCACCCCCAAGAGGGGOCTTCAGCTTTGGG GCTCA GAG GCA CG ACCTC CTG GGG AG G GTT A A A AGG C A G ACG CCCCCCCG CCCCCCGCGOCOC CGCGCCCCG ACTCCTT CGCCGC CTCCAGCCTCTCGCC AGfTGGG AAGCGGGG AGC AGOCGCGCGG CCGGAGTCCGGAGGCGAGGGGAGGTCGGCCGCAACTTCCCCG GTCCACCTTAAGAGGACGATGTAGCCAGCTCGCAGCGCTGAC GTT A G A A A A AC A AGTTTGCG C A A A GT GG AG CG GGG ACCCG GC CTCTGGGCAGCCCCGGGGGCGCTTCCAGTGCCrTCCAGCCCTC
gcgggcggcgcagccgcggcccatggagcccgccggcccggc
C CC CC GC C G G CTC G GC G CGCTGCTCTG GCTG C TGCTCGCC GGG rcc roc GC CJGQJ C A GGAGTGGCGGGTG A GG AG G AGCTGC AG GTGATTCA GCCTG AC A AG TCCGTGTTG G TTGC AG CTGG AG AG AC AGCC ACTCTGCG CTG CACTGCG ACCTC TCTGA TCCCTGTGG GGCCCATCCAGTG GTTCAG A G GAG CTGGACCAGGCCGG GAAT T A ATCT AC AATCA AAA AG A AC GCC ACITCCCCCG GGT A AC A A CTGTTTCAG A C CTC: AC: A A A G A G A A AC A ACATGG ACTTTTCCAT CCGCATCGGT A AC ATC ACCCC AG CAGATGOCG GCACCTACTA CTGTGTG A A GTTCCG G A A AGGG AGCCCCG A TG A CGTGG A GTT [ AAGICIGGAGC AGGCACIGAGCIG1 Cl GI GCGC’GCCAAACC CTCTGCCCCCGTGGT AT CGGGCCCTGCGG CG AG GGCC AC ACCT C AGC AC ACAG I GAGCTTC AC C TGC’GAG rCCCACGGC TTC I C’AC C C A G AG AC ATC ACT T 'TG A A ATG G TTC A A A A ATG GG A ATG AGC TCTC AG A CTTCC AG A CC A AC G TG G A C CC CG T AG G AG AG A G CG [ G I C C I ACAGC A IT CACAGC AC AGCCAAGGTGG l CiC L GACCT GCGAGGACGTTCACTCTCAAGTCATCTGCGAGGTGGCCCACCj rCACC'ITCfC'AGGGGGACC'CTq rCGTGGGAC rGC'CAAClTG'rC TGAGACCATCCGAGTTCCACCC AC CTTGG AG GTT ACTC A AC AG CCCGTG A GGGC AG AG A ACC A GGTG A ATGTC ACCTGCC AGGTG AGCAAGTTCTACCCCCAGAGAOTACAGCTGACCTGGTTGCiAG A ATG G A A ACGTG TCCCG G A C AG A A ACG GCCTC A ACCGTT AC A G A G A AC A AG GATGGTA CCT AC A A CI GG AIG A GCTGG CI CC IG GTG A ATGTATCTGCCC AC A GG G ATG ATGTG A AG CTC ACCTG C CAGGTGGAGCATGACGGGCAGCCAGCGGTCAGCAAAAGCCAT G ACCTG A AGO r CTC AGCC C A C CCG A A GG AG C A GG GCTCA AAT ACCGCCGCT G AG AAC ACTGG ATCT AATG AACGG A AC ATCT AT AIIGIGGIUGGIGIGGIGIGCACC1IGC1GGIGGCCC1ACIGA TGGCGG C CCTCT ACCTCGTCCG A ATC AG A C AG A AG A A AG CC C AG GG CTC C ACTTCTTCT AC A A G GTTGC ATG A GCCC G AG A A G A ATG CC AG AG A A AT A AC AC AG GACAC A A ATG AT ATC AC AT ATG C AG A CCTGA AC CTG C CC A AG G GG A A G A AGCC TG CTCCCC AG G CTGCGG AGCCCA AC A ACC AC AC GG AGIA ] GCCAGC ATI'C AGA C C AGCCCGC AG CCC GCGTCG G AGG AC ACCCTC ACCT ATGCTG ACCTGGACATGGTCCACCT CAAC CGGA CC CCCAA GC AGCC GG CCCCCA A GCCTG A G CC GTC CTTCTC AG AGT A C GC C A GC GTC C A GGTCCCG AG G A AGTG A ATG GG ACCGTGGTTTGCTCT A GC ACC CATCT CTACG CGCTTT CTTGTCCCACAGGGAGCCGCCGTGATG AG C AC A GCC A ACCC A GTTCCC GG AGG GCTG GG G CGGTG C AGG CTCTGGG ACCC AGG GGCC AGG GT GGCTCTTCTCTCCCC ACC CC roc n GGCTCTCCAGCACTTCCTGGGCAGCCACGGCCCCCTCC C CCC AC ATTG C C AC AT ACCTGG AGG CTG ACGTTGCC A A AC C A GCC A GG GA AC C A A C CIGGGAAGIGGCC AGA AC I GCC T GGGG T
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Protefna SIRPa humanizada
Animales no humanos con SIRPa humanizado
Se describen animales no humanos que expresan protefnas SIRPa humanizadas en la superficie de celulas inmunitarias (por ejemplo, celulas mieloides) de los animales no humanos como resultado de una modificacion genetica de un locus endogeno del animal no humano que codifica una protefna SIRPa. Los ejemplos adecuados descritos en el presente documento incluyen roedores, particularmente, ratones.
Un gen de SIRPa humanizado, descrito en el presente documento puede comprender material genetico de una especie heterologa (por ejemplo, seres humanos), en donde el gen de SIRPa humanizado codifica una protefna SIRPa que comprende la porcion codificada del material genetico de la especie heterologa. Un gen de SIRPa humanizado descrito en el presente documento puede comprender ADN genomico de una especie heterologa que corresponde a la porcion extracelular de una protefna SIRPa que se expresa en la membrana plasmatica de una celula. Se proporcionan, ademas, animales no humanos, embriones, celulas y construcciones de transformacion para producir animales no humanos, embriones no humanos, y celulas que contienen dicho gen de SIRPa humanizado.
Puede eliminarse un gen endogeno de SIRPa. Un gen endogeno de SIRPa puede alterarse, en donde una porcion del gen endogeno de SIRPa se reemplaza con una secuencia heterologa (por ejemplo, una secuencia de SIRPa humana en su totalidad o en parte). La totalidad o sustancialmente la totalidad de un gen de SIRPa endogeno se reemplaza con un gen heterologo (por ejemplo, un gen de SIRPa humano). Una porcion de un gen heterologo de SIRPa puede insertarse en un gen endogeno de SIRPa no humano en un locus endogeno de SIRPa. El gen heterologo puede ser un gen humano. La modificacion o humanizacion puede realizarse a una de las dos copias del gen endogeno de SIRPa, lo que da lugar a un animal no humano que es heterocigoto con respecto al gen de SIRPa humanizado. Se describe un animal no humano que es homocigoto para un gen de SIRPa humanizado.
Un animal no humano descrito en el presente documento contiene un gen de SIRPa humano en su totalidad o en parte en un locus endogeno de SIRPa no humano. Asf, tales animales no humanos pueden describirse como que tienen un gen de SIRPa heterologo. El gen de SIRPa reemplazado, insertado o modificado en el locus de SIRPa endogeno puede detectarse con el uso de una variedad de metodos que incluyen, por ejemplo, PCR, transferencia de Western, transferencia de Southern, polimorfismo de longitud de fragmentos de restriccion (RFLP), o un ensayo de ganancia o perdida de alelos. El animal no humano puede ser heterocigoto con respecto al gen de SIRPa humanizado
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Un gen de SIRPa humanizado descrito en el presente documento incluye un gen de SIRPa que tiene un segundo, tercero y cuarto exones donde cada uno tiene una secuencia al menos 50 % (por ejemplo, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o mas) identica a un segundo, tercero y cuarto exones que aparecen en un gen de SIRPa humano de la Tabla 3.
Un gen de SIRPa humanizado descrito en el presente documento incluye un gen de SIRPa que tiene una secuencia nucleotfdica codificante (por ejemplo, una secuencia de ADNc) al menos 50 % (por ejemplo, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o mas) identica a los nucleotidos 352 - 1114 que aparecen en un ADNc humano de una secuencia de SIRPa de la Tabla 3.
Una protefna SIRPa humanizada producida por un animal no humano descrito en el presente documento puede tener una porcion extracelular con una secuencia que es al menos 50 % (por ejemplo, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o mas) identica a una porcion extracelular de una protefna SIRPa humana que aparece en la Tabla 3.
Una protefna SIRPa humanizada producida por un animal no humano descrito en el presente documento puede tener una porcion extracelular que tiene una secuencia que es al menos 50 % (por ejemplo, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o mas) identica a los residuos de aminoacidos 28 - 362 que aparecen en una protefna SIRPa humana de la Tabla 3.
Una protefna SIRPa humanizada producida por un animal no humano descrito en el presente documento puede tener una secuencia de aminoacidos que es al menos 50 % (por ejemplo, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o mas) identica a una secuencia de aminoacidos de una protefna SIRPa humanizada que aparece en la Tabla 3.
Se describen composiciones y metodos para producir animales no humanos que expresan una protefna SIRPa humanizada, que incluye formas polimorficas especfficas o variantes alelicas (por ejemplo, diferencias en un solo aminoacido) que incluyen composiciones y metodos para producir animales no humanos que expresan tales protefnas a partir de un promotor humano y una secuencia reguladora humana. Se proporcionan, ademas, composiciones y metodos para producir animales no humanos que expresan tales protefnas a partir de un promotor endogeno y una secuencia reguladora endogena. Los metodos incluyen insertar el material genetico que codifica una protefna SIRPa humana en su totalidad o en parte en una ubicacion precisa en el genoma de un animal no humano que corresponde a un gen endogeno de SIRPa para crear de esta manera un gen de SIRPa humanizado que expresa una protefna SIRPa que es humana en su totalidad o en parte. Los metodos pueden incluir insertar ADN genomico correspondiente a los exones 2 - 4 de un gen de SIRPa humano en un gen endogeno de SIRPa del animal no humano para crear de esta manera un gen humanizado que codifica una protefna SIRPa que contiene una porcion humana que contiene los aminoacidos codificados por los exones insertados.
Un enfoque de un gen de SIRPa humanizado emplea una modificacion relativamente minima del gen endogeno y puede dar como resultado una transduccion natural de senales mediadas por SIRPa en el animal no humano, porque la secuencia genomica de las secuencias de SIRPa se modifican en un solo fragmento y por lo tanto retienen la funcionalidad normal al incluir las secuencias reguladoras necesarias. Asf, la modificacion del gen de SIRPa puede no afectar otros genes cercanos u otros genes endogenos de SIRP. Ademas, la modificacion puede no afectar el ensamblaje de un receptor funcional en la membrana celular y mantiene sus funciones efectoras normales por medio de la union y posterior transduccion de senales a traves de la porcion citoplasmatica del receptor que no se afecta por la modificacion.
Una ilustracion esquematica (no a escala) de un gen de SIRPa endogeno murino y un gen de SIRPa humanizado se proporciona en la Figura 1. Como se ilustra, el ADN genomico que contiene los exones 2 - 4 de un gen de SIRPa humano se inserta en un locus de un gen de SIRPa endogeno murino mediante una construccion de transformacion. Este ADN genomico incluye la porcion del gen que codifica una porcion extracelular (por ejemplo, los residuos de aminoacidos 28 - 362) de una protefna SIRPa humana responsable de la union a ligandos.
Un animal no humano (por ejemplo, un raton) que tiene un gen de SIRPa humanizado en el locus de SIRPa endogeno puede producirse mediante cualquier metodo conocido en la tecnica. Por ejemplo, puede producirse un vector de transformacion que introduce un gen de SIRPa humano en su totalidad o en parte con un gen marcador de seleccion. La Figura 1 ilustra un genoma de raton que comprende una insercion de los exones 2 - 4 de un SIRPa humano. Como se ilustra, la construccion de transformacion contiene un brazo de homologfa en 5' que contiene una secuencia corriente arriba del exon 2 de un gen de SIRPa endogeno murino, seguido por un fragmento de ADN genomico que contiene los exones 2 - 4 de un gen de SIRPa humano, un casete de seleccion por farmacos (por ejemplo, un gen de resistencia a la neomicina flanqueado en ambos extremos por secuencias loxP), y un brazo de homologfa en 3' que contiene una secuencia corriente abajo del exon 4 de un gen de SIRPa endogeno murino. Despues de la recombinacion homologa, los exones 2 - 4 de un gen de SIRPa endogeno murino se reemplaza por la secuencia contenida en el vector de transformacion. Se crea un gen de SIRPa humanizado que da como resultado una celula o animal no humano que expresa una protefna SIRPa humanizada que contiene los aminoacidos
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codificados por los exones 2 - 4 de un gen de SIRPa humano. El casete de seleccion por farmacos puede eliminarse opcionalmente mediante la adicion posterior de una recombinasa (por ejemplo, mediante tratamiento con Cre).
Ademas de ratones que tienen genes de SIRPa humanizados como se describe en el presente documento, en el presente documento se describen ademas otros animales no humanos modificados geneticamente que comprenden genes de SIRPa humanizados. Tales animales no humanos pueden comprender un gen de SIRPa humanizado unido operativamente a un promotor endogeno de SIRPa. Tales animales no humanos pueden expresar una protefna SIRPa humanizada a partir de un locus endogeno, en donde la protefna SIRPa humanizada comprende los residuos de aminoacidos 28 - 362 de una protefna SIRPa humana.
Tales animales no humanos pueden seleccionarse del grupo que consiste en un raton, rata, conejo, cerdo, bovino (por ejemplo, vaca, toro, bufalo), ciervo, oveja, cabra, pollo, gato, perro, huron, primates (por ejemplo, titf, mono rhesus). Para los animales no humanos donde las celulas ES modificables geneticamente no estan disponibles facilmente, se emplean otros metodos para producir un animal no humano que comprende las modificaciones geneticas descritas en el presente documento. Tales metodos incluyen, por ejemplo, la modificacion de un genoma de celulas que no son ES (por ejemplo, un fibroblasto o una celula pluripotente inducida) y el empleo de la transferencia nuclear para transferir el genoma modificado a una celula adecuada, por ejemplo, un ovocito, y la gestacion de la celula modificada (por ejemplo, el ovocito modificado) en un animal no humano en condiciones adecuadas para formar un embrion.
Un animal no humano descrito en el presente documento puede ser un mamffero. Un animal no humano descrito en el presente documento puede ser un mamffero pequeno, por ejemplo, de la superfamilia Dipodoidea o Muroidea. Un animal modificado geneticamente descrito en el presente documento puede ser un roedor. Un roedor descrito en la presente descripcion puede seleccionarse de un raton, una rata, y un hamster. Un roedor puede seleccionarse de la superfamilia Muroidea. Un animal modificado geneticamente descrito en el presente documento puede ser de una familia seleccionada de Calomyscidae (por ejemplo, hamsteres similares a raton), Cricetidae (por ejemplo, hamster, ratas y ratones del Nuevo Mundo, ratones campestres), Muridae (ratones y ratas verdaderos, jerbos, ratones espinosos, ratas crestadas), Nesomyidae (ratones trepadores, ratones de roca, ratas coliblancas, ratas y ratones de Madagascar), Platacanthomyidae (por ejemplo, lirones espinosos), y Spalacidae (por ejemplo, ratas topo, ratas de bambu, y zokor). Un roedor modificado geneticamente descrito en el presente documento puede seleccionarse de un raton o una rata verdaderos (familia Muridae), un jerbo, un raton espinoso, y una rata crestada. Un raton modificado geneticamente descrito en el presente documento puede ser un miembro de la familia Muridae. Un animal no humano descrito en el presente documento puede ser un roedor. Un roedor descrito en el presente documento puede seleccionarse de un raton y una rata. En algunas modalidades, un animal no humano descrito en el presente documento puede ser un raton.
En algunas modalidades, un raton de la presente invencion es de una cepa C57BL seleccionada de C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr y C57BL/Ola. En algunas modalidades determinadas, un raton de la presente invencion es de una cepa 129 seleccionada del grupo que consiste en una cepa que es 129P1, 129P2, 129P3,129X1, 129S1 (por ejemplo, 129S1/SV, 129S1/SvIm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129/SvJae, 129S6 (129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, 129T2 (ver, por ejemplo, Festing y otros, 1999, Mammalian Genome 10:836; Auerbach y otros, 2000, Biotechniques 29(5):1024-1028, 1030, 1032). En algunas modalidades determinadas, un raton modificado geneticamente de la presente invencion es una mezcla de una cepa 129 mencionada anteriormente y una cepa C57BL/6 mencionada anteriormente. En algunas modalidades determinadas, un raton de la presente invencion es una mezcla de las cepas 129 mencionadas anteriormente, o una mezcla de las cepas BL/6 mencionadas anteriormente. En algunas modalidades determinadas, una cepa 129 de la mezcla como se describe en el presente documento es una cepa 129S6 (129/SvEvTac). En algunas modalidades, un raton de la presente invencion es de una cepa BALB, por ejemplo, la cepa BALB/c. En algunas modalidades, un raton de la presente invencion es una mezcla de una cepa BALB y otra cepa mencionada anteriormente.
Un animal no humano descrito en el presente documento puede ser una rata. En algunas modalidades determinadas, una rata de la presente invencion se selecciona de una rata Wistar, una cepa LEA, una cepa Sprague Dawley, una cepa Fischer, f344, F6, y Dark Agouti. En algunas modalidades determinadas, una cepa de rata como se describe en el presente documento es una mezcla de dos o mas cepas seleccionadas del grupo que consiste en Wistar, LEA, Sprague Dawley, Fischer, F344, F6, y Dark Agouti.
Metodos que emplean animales no humanos que tienen genes de SIRPa humanizados
Se han informado animales no humanos mutantes y transgenicos para SIRPa (por ejemplo, ratones) (Inagaki y otros, 2000, EMBO Journal 19(24):6721-6731; Strowig y otros, 2011, Proc. Nat. Acad. Sci. 108(32):13218-13223). Tales animales se han empleado en una variedad de ensayos para determinar los aspectos moleculares de la expresion, funcion y regulacion de SIRPa. Sin embargo, no lo han sido sin limitacion. Por ejemplo, el uso de ratones mutantes para SIRPa se ha limitado debido a las condiciones perjudiciales para la salud que resultan de la incapacidad de las celulas que contienen la forma mutante de SIRPa frente a la senal. Ademas, dado que CD47, un ligando de SIRPa, pudiera estar presente en la misma celula que la forma mutante de SIRPa y ambas protefnas son
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capaces de proporcionar senales intracelulares, no es posible distinguir si tales resultados provienen de la ausencia de senalizacion de SIRPa o la ausencia de union a CD47. En el caso de los ratones transgenicos para SIRPa humano, el SIRPa de raton esta intacto y funcional. Asf, las funciones dependientes de SIRPa en diversos procesos biologicos (por ejemplo, injertos) no pueden atribuirse claramente a la funcion de SIRPa humano o SIRPa de raton solas en estos ratones ya que ambos receptores SIRPa humano y de raton estan presentes y funcionales.
Los animales no humanos descritos en el presente documento proporcionan un sistema in vivo mejorado y una fuente de materiales biologicos (por ejemplo, celulas) que expresan SIRPa humano, los cuales son utiles para una variedad de ensayos. Los animales no humanos descritos en el presente documento pueden usarse para desarrollar agentes terapeuticos que se dirijan a SIRPa y/o modulen la senalizacion SIRPa-CD47. En diversas modalidades, los ratones de la presente invencion se usan para tamizar y desarrollar agentes terapeuticos candidatos (por ejemplo, anticuerpos) que se unen al SIRPa humano. Los animales no humanos descritos en el presente documento pueden usarse para determinar el perfil de union de antagonistas y/o agonistas al SIRPa humanizado en la superficie de una celula de un animal no humano como se describe en el presente documento.
Los animales no humanos descritos en el presente documento pueden usarse para medir el efecto terapeutico de bloquear o modular la transduccion de senales de SIRPa (por ejemplo, fosforilacion) y el efecto sobre la expresion genica como resultado de cambios celulares. Un animal no humano descrito en el presente documento o celulas aisladas a partir de el pueden exponerse a un agente terapeutico candidato que se une a un SIRPa humano en la superficie de una celula del animal no humano y, despues de un perfodo de tiempo posterior, analizarse para determinar los efectos sobre los procesos dependientes de SIRPa, por ejemplo, proliferacion de celulas B y/o T, aclaramiento de plaquetas, e induccion de la expresion de citocinas.
Los animales no humanos descritos en el presente documento expresan una protefna SIRPa humanizada, por lo tanto pueden generarse celulas, lfneas celulares, y cultivos celulares para servir como una fuente de SIRPa humanizado para usar en ensayos de union y funcionalidad, por ejemplo, para ensayar la union o funcion de un antagonista o agonista de SIRPa, particularmente cuando el antagonista o agonista es especffico para una secuencia o epftopo de SIRPa humano. Una protefna SIRPa humanizada expresada por un animal no humano como se describe en el presente documento puede comprender una variante de la secuencia de aminoacidos. Se han informado variantes de protefnas SIRPa humanas que tienen variaciones asociadas con los residuos de union al ligando. Los animales no humanos descritos en el presente documento pueden expresar una variante de una protefna SIRPa humanizada. La variante puede ser polimorfica en una posicion de un aminoacido asociado con la union al ligando. Los animales no humanos descritos en el presente documento pueden usarse para determinar el efecto de union al ligando a traves de la interaccion con una variante polimorfica de SIRPa humana.
Las celulas de los animales no humanos descritos en el presente documento pueden aislarse y usarse sobre una base ad hoc, o pueden mantenerse en cultivo por muchas generaciones. Las celulas de un animal no humano descrito en el presente documento pueden inmortalizarse y mantenerse en cultivo indefinidamente (por ejemplo, en cultivos en serie).
Las celulas de animales no humanos descritos en el presente documento pueden usarse en un ensayo de dispersion o migracion celular para tamizar y desarrollar agentes terapeuticos candidatos que modulen el SIRPa humano. Tales procesos son necesarios para muchos procesos celulares que incluyen la cicatrizacion de heridas, la diferenciacion, la proliferacion y la supervivencia.
Las celulas de animales no humanos descritos en el presente documento pueden usarse en ensayos de clonacion para celulas megacariocfticas formadoras de colonias para analizar los aspectos farmacotoxicologicos de agentes terapeuticos candidatos que se dirigen a SIRPa humano.
Las celulas de animales no humanos descritos en el presente documento pueden usarse en ensayos de fagocitosis para determinar el potencial terapeutico de compuestos o agentes biologicos que modulen la regulacion de la fagocitosis dependiente de SIRPa.
Los animales no humanos descritos en el presente documento proporcionan un sistema in vivo para el analisis y prueba de un farmaco o vacuna. Un farmaco o vacuna candidato puede suministrarse a uno o mas animales no humanos descritos en el presente documento, seguido del control de los animales no humanos para determinar una o mas respuestas inmunitarias frente al farmaco o vacuna, el perfil de seguridad del farmaco o vacuna, o el efecto sobre una enfermedad o afeccion. Tales farmacos o vacunas pueden mejorarse y/o desarrollarse en tales animales no humanos.
Los animales no humanos descritos en el presente documento proporcionan un sistema in vivo mejorado para elucidar los mecanismos de la interaccion de celula a celula humana a traves de transferencia adoptiva. Los animales no humanos descritos en el presente documento pueden implantarse con un xenoinjerto de tumor, seguido de un segundo implante de linfocitos infiltrantes de tumores que pueden implantarse en los animales no humanos mediante transferencia adoptiva para determinar la eficacia en la erradicacion de tumores solidos u otras enfermedades malignas. Tales experimentos pueden realizarse con celulas humanas debido a la presencia
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exclusiva de SIRPa humano sin competencia con SIRPa endogeno del animal no humano. Ademas, las terapias y los agentes farmaceuticos para usar en el xenotrasplante pueden mejorarse y/o desarrollarse en tales animales no humanos.
Los animales no humanos descritos en el presente documento proporcionan un sistema in vivo mejorado para el mantenimiento y desarrollo de celulas madre hematopoyeticas humanas a traves del injerto. Los animales no humanos descritos en el presente documento pueden proporcionar un mejor desarrollo y mantenimiento de las celulas madre humanas dentro del animal no humano. Puede observarse un aumento de poblaciones de celulas B y T humanas diferenciadas en la sangre, medula osea, bazo y timo del animal no humano. Los animales no humanos descritos en el presente documento pueden proporcionar un aumento en el nivel del injerto de celulas humanas en comparacion con animales no humanos que expresan SIRPa de raton y humana.
Los animales no humanos descritos en el presente documento pueden emplearse para evaluar la eficacia de un farmaco terapeutico dirigido a celulas humanas. Un animal no humano descrito en el presente documento puede recibir un trasplante de celulas humanas, y un candidato a farmaco dirigido a dichas celulas humanas se administra a dicho animal no humano. Despues se determina la eficacia terapeutica del farmaco mediante el control de las celulas humanas en el animal no humano despues de la administracion del farmaco. Los farmacos que pueden someterse a prueba en los animales no humanos incluyen compuestos moleculares pequenos, es decir, compuestos de pesos moleculares menores que 1500 kD, 1200 kD, 1000 kD, u 800 dalton, y compuestos moleculares grandes (tales como protefnas, por ejemplo, anticuerpos), que tienen efectos terapeuticos previstos para el tratamiento de enfermedades y afecciones humanas al dirigirse a celulas humanas (por ejemplo, union a ellas y/o accion sobre ellas).
El farmaco puede ser un farmaco anticancerfgeno, y las celulas humanas pueden ser celulas cancerosas, que pueden ser celulas de un cancer primario o celulas de lfneas celulares establecidas a partir de un cancer primario. En estos aspectos, un animal no humano descrito en el presente documento recibe un trasplante de celulas cancerosas humanas, y se le suministra un farmaco anticancerfgeno al animal no humano. La eficacia del farmaco puede determinarse al evaluar si el crecimiento o la metastasis de las celulas cancerosas humanas en el animal no humano se inhibe como resultado de la administracion del farmaco.
El farmaco anticancerfgeno puede ser una molecula de anticuerpo, que se une a un antfgeno en las celulas cancerosas humanas. El farmaco anticancerfgeno puede ser un anticuerpo biespecffico que se une a un antfgeno en las celulas cancerosas humanas, y a un antfgeno en otras celulas humanas, por ejemplo, celulas del sistema inmunitario humano (o "celulas inmunitarias humanas") tales como celulas B y celulas T.
Un animal no humano descrito en el presente documento puede recibir un injerto de celulas inmunitarias humanas o celulas que se diferencian en celulas inmunitarias humanas. Dicho animal no humano con las celulas inmunitarias humanas injertadas recibe un trasplante de celulas cancerosas humanas, y recibe una administracion de un farmaco anticancerfgeno, tal como un anticuerpo biespecffico que se une a un antfgeno sobre las celulas cancerosas humanas y a un antfgeno sobre las celulas inmunitarias humanas (por ejemplo, celulas T). La eficacia terapeutica del anticuerpo biespecffico puede evaluarse en base a su capacidad para inhibir el crecimiento o las metastasis de las celulas cancerosas humanas en el animal no humano. El animal no humano descrito en el presente documento puede recibir un injerto de celulas progenitoras hematopoyeticas humanas CD34+ que producen celulas inmunitarias humanas (que incluyen celulas T, celulas B, celulas NK, entre otras). Las celulas de linfoma de celulas B humanas (por ejemplo, celulas Raji) se trasplantan en dicho animal no humano con celulas inmunitarias humanas injertadas, el cual se administra despues con un anticuerpo biespecffico que se une a CD20 (un antfgeno en las celulas B normales y determinados tumores malignos de celulas B) y a la subunidad CD3 del receptor de celulas T, para probar la capacidad del anticuerpo biespecffico para inhibir el crecimiento del tumor en el animal no humano.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos se proporcionan para describir a los expertos en la tecnica como realizar y usar los metodos y composiciones descritos en el presente documento, y no estan destinados a limitar el alcance de lo que los inventores consideran como su invencion. A menos que se indique de cualquier otra manera, la temperatura se indica en Celsius, y la presion es la atmosferica o esta cercana a esta.
Ejemplo 1. Humanizacion de un gen endogeno de protefna reguladora de senales (SIRP).
Este ejemplo muestra metodos ilustrativos para la humanizacion de un gen endogeno que codifica la protefna reguladora de senales alfa (SIRPa) en un mamffero no humano tal como un roedor (por ejemplo, un raton). Se conoce que SIRPa humano existe en al menos 10 formas alelicas. Los metodos descritos en este ejemplo pueden emplearse para humanizar un gen de SIRPa endogeno de un animal no humano con el uso de cualquier alelo humano, o combinacion de alelos humanos (o fragmentos de alelos) segun convenga. En este ejemplo, la variante 1 de SIRPa humano se emplea para humanizar un gen endogeno de SIRPa de un raton.
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Un vector de transformacion para la humanizacion de una region extracelular de un gen de SIRP (por ejemplo, SIRPa) se construyo mediante el uso de la tecnologfa VELOCIGENE® (ver, por ejemplo, patente de los Estados Unidos num. 6,586,251 y Valenzuela y otros (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech. 21(6):652-659).
Brevemente, el clon de cromosoma artificial bacteriano (BAC) de raton bMQ-261H14 se modifico para eliminar la secuencia que contiene los exones 2 a 4 de un gen de SIRPa endogeno e insertar los exones 2 a 4 de un gen de SIRPa humano mediante el uso del clon de BAC humano CTD-3035H21. El ADN genomico correspondiente a los exones 2 a 4 de un gen endogeno de SIRPa (-8555 pb) se reemplazo en el clon de BAC bMQ-261H14 con un fragmento de ADN de -8581 pb que contiene los exones 2 a 4 de un gen de SIRPa humano del clon de BAC CTD- 3035H21. El analisis de secuencia del alelo de SIRPa humano contenido en el clon CTD-3035H21 de BAC revelo que el alelo corresponde a la variante humana 1. Un casete de neomicina flanqueado por sitios loxP se anadio al extremo del fragmento de ADN humano de -8581 pb que contiene los exones 2 a 4 del gen de SIRPa humano (Figura 1).
Los brazos de homologfa corriente arriba y corriente abajo se obtuvieron a partir del ADN de BAC en raton en las posiciones 5' y 3' de los exones 2 y 4, respectivamente, y se anadieron al casete de resistencia a neomicina- fragmento humano de 8581 pb para crear el vector de transformacion final para la humanizacion de un gen endogeno de SIRPa, que contiene de 5' a 3' un brazo de homologfa en 5' que contiene 19 kb del ADN de raton en 5' del exon 2 del gen endogeno de SIRPa, un fragmento de ADN de 8581 pb que contiene los exones 2 a 4 de un gen de SIRPa humano, un casete de resistencia a neomicina flanqueado por sitios loxP, y un brazo de homologfa en 3' que contiene 21 kb de ADN de raton en 3' del exon 4 de un gen endogeno de SIRPa. La insercion dirigida del vector de transformacion ubico el casete de resistencia a neomicina en el quinto intron de un gen de SIRPa de raton entre los exones 4 y 5. El vector de transformacion se linealizo mediante digestion con Swal y despues se uso en la recombinacion homologa en celulas bacterianas para lograr un reemplazo dirigido de los exones 2 a 4 en un gen de SIRPa de raton con los exones 2 a 4 de un gen de SIRPa humano (Figura 1).
El ADN de BAC transformado (descrito anteriormente) se uso para someter a electroporacion las celulas ES de raton para crear celulas ES modificadas que comprenden un reemplazo de los exones 2 a 4 en un gen endogeno de SIRPa de raton con un fragmento genomico que comprende los exones 2 a 4 de un gen de SIRPa humano. Las celulas ES positivas que contienen un fragmento genomico que comprende los exones 2 a 4 de un gen de SIRPa humano se identificaron mediante PCR cuantitativa con el uso de sondas TAQMAN™ (Lie y Petropoulos, 1998. Curr. Opin. Biotechnology 9:43-48). La secuencia de nucleotidos a traves del punto de insercion corriente arriba incluyo lo siguiente, que indica la secuencia endogena de raton corriente arriba del punto de insercion (contenida dentro del parentesis mas abajo) unida de manera contigua a una secuencia genomica de SIRPa humana presente en el punto de insercion: (AGCTCTCCTA CCACTAGACT GCTGAGACCC GCTGCTCTGC TCAGGACTCG ATTTCCAGTA CACAATCTCC CTCTTTGAAA AGTACCACAC ATCCTGGGGT) GCTCTTGCAT TTGTGTGACA CTTTGCTAGC CAGGCTCAGT CCTGGGTTCC AGGTGGGGAC TCAAACACAC TGGCACGAGT CTACATTGGA TATTCTTGGT (sec. con num. de ident.: 6). La secuencia de nucleotidos a traves del punto de insercion corriente abajo en el extremo 5' del casete de resistencia a neomicina incluyo lo siguiente, que indica una secuencia genomica de SIRPa humana contigua con la secuencia del casete corriente abajo del punto de insercion (contenida dentro del parentesis mas abajo con la secuencia loxP en letras cursivas): GCTCCCCATT cCtCACTGGC CCaGcCCCTC TTCCCTACTC TTTCTAGCCC CTGCCTCATC TCCCTGGCTG CCATTGGGAG CCTGCCCCAC TGGAAGCCAG (TCGAG ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT ATGCATGGCC TCCGCGCCGG GTTTTGGCGC CTCCCGCGGG CGCCCCCCTC CTCACGGCGA) (sec. con num. de ident.: 7). La secuencia de nucleotidos a traves del punto de insercion corriente abajo en el extremo 3' del casete de resistencia a neomicina incluyo lo siguiente, que indica la secuencia del casete contigua con la secuencia genomica de raton en 3' del exon 4 de un gen endogeno de SIRPa (contenida dentro del parentesis mas abajo): CATTCTCAGT ATTGTTTTGC CAAGTTCTAA TTCCATCAGA CCTCGACCTG CAGCCCCTAG ATAACTTCGT ATAATGTATG CTATACGAAG TTATGCTAGC (TGTCTCATAG AGGCTGGCGA TCTGGCTCAG GGACAGCCAG TACTGCAAAG AGTATCCTTG TTCATACCTT CTCCTAGTGG CCATCTCCCT GGGACAGTCA) (sec. con num. de ident.: 8). Los clones de celulas ES positivas se usaron despues para implantar en ratones hembras mediante el uso del metodo VELOCIMOUSE® (ver, por ejemplo, patente de los Estados Unidos num. 7,294,754 y Poueymirou y otros 2007, F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses Nature Biotech. 25(1):91-99) para generar una camada de cnas que contienen una insercion de los exones 2 a 4 de un gen de SIRPa humano en un gen endogeno de SIRPa de un raton.
Las celulas ES transformadas descritas anteriormente se usaron como celulas ES donantes y se introdujeron en un embrion de raton en etapa de 8 celulas mediante el metodo VELOCIMOUSE® (mas arriba). Los ratones que portan la humanizacion de los exones 2 a 4 de un gen endogeno de SIRPa se identificaron mediante genotipado con el uso de una modificacion de un ensayo de alelos (Valenzuela y otros, mas arriba) que detecta la presencia de las secuencias genicas de SIRPa humano.
Los ratones que portan la construccion del gen de SIRPa humanizado (es decir, que contienen los exones 2 a 4 de SIRPa humana en un gen de SIRPa de raton) pueden cruzarse con una cepa de raton Cre deletor (ver, por ejemplo, la publicacion de la solicitud de patente Internacional num. WO 2009/114400) para eliminar cualquier casete de
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resistencia a neomicina con sitios lox introducidos por el vector de transformacion que no se elimina, por ejemplo, en la etapa de celula ES o en el embrion. Opcionalmente, el casete de resistencia a neomicina se mantiene en los ratones.
Las crfas se genotipifican y una crfa heterocigota para la construccion del gen de SIRPa humanizado se selecciona para su caracterizacion.
Ejemplo 2. Expresion de SIRPa humanizado en animales no humanos.
Este ejemplo ilustra la expresion caracterfstica de la protefna SIRPa en la superficie de celulas de animales no humanos disenados geneticamente para contener una construccion del gen de SIRPa humanizado como se describe en el Ejemplo 1 en un locus endogeno de SIRPa.
Brevemente, los bazos se aislaron a partir de ratones de tipo silvestre (WT) y heterocigotos para un gen de SIRPa humanizado. Los bazos se perfundieron despues con Colagenasa D (Roche Bioscience) y los eritrocitos se lisaron con tampon de lisis ACK de acuerdo con las especificaciones del fabricante. La expresion en la superficie celular de SIRPa humano y de raton se analizo mediante FACS con el uso de anticuerpos anti-CD3 (17A2), anti-CD19 (1D3), anti-CD11b (M1/70), anti-SIRPa humana (SE5A5), y anti-SIRPa de raton (P84) conjugados con fluorocromo. La citometrfa de flujo se realizo mediante el uso de BD LSRFORTESSA™. La expresion ilustrativa de SIRPa humano y de raton segun se detecto en la superficie de monocitos CD11b+ se muestra en la Figura 2.
Como se muestra en la Figura 2, la expresion de SIRPa de raton y humanizado pudo detectarse claramente en la superficie de monocitos CD11b+ de ratones heterocigotos.
Ejemplo 3. Injerto de celulas humanas en animales no humanos humanizados para SIRP.
Este ejemplo ilustra un injerto mejorado de celulas madre hematopoyeticas humanas en animales no humanos que tienen un gen de SIRPa humanizado.
Brevemente, los ratones Rag2 KO IL2Ry nulos con o sin un gen de SIRPa humanizado se llevaron a condiciones libres de patogenos. Los ratones recien nacidos (2 a 5 dfas de edad) se irradiaron con 240 cGy y se inyectaron de manera intrahepatica con 1x105 celulas madre hematopoyeticas humanas CD34+. Se tomaron muestras de sangre de los ratones 10 a 12 semanas despues del injerto y la sangre se analizo mediante FACS con el uso de anticuerpos anti-CD45 humano (HI30), anti-CD3 humano (SK7), anti-CD19 humano (HIB19) y anti-CD45 de raton (30-F11) conjugados con fluorocromo para verificar la reconstitucion del sistema inmunitario humano. El fondo genetico de los ratones es BALB/cTa x 129/SvJae.
Los porcentajes ilustrativos de celulas CD34+ humanas en ratones de tipo silvestre, heterocigotos para SIRPa humanizado, ratones homocigotos para SIRPa humanizado y ratones BALB-Rag2-/-IL2RYc-/- (DKO) se muestran en las Figuras 3 - 5.
Como se muestra en este ejemplo, los ratones homocigotos para un gen de SIRPa humanizado demuestran un injerto mejorado de celulas CD34+ humanas al proporcionar el mayor porcentaje de celulas CD34+ humanas en la periferia (por ejemplo, en sangre) en comparacion con otras cepas analizadas.
En conjunto, estos datos demuestran que SIRPa humanizado es funcional en los ratones como se describe en la presente descripcion a traves de la expresion en la superficie de celulas en el raton y ser capaz de sustentar el injerto de celulas madre hematopoyeticas CD34+ humanas.
Ejemplo 4. Evaluacion de la eficacia del Ac 1 sobre el crecimiento tumoral de linfoma en celulas Raji en ratones BRG.
Sumario
El Ac 1 es un anticuerpo biespecffico (bsAc) que se une a CD3, un antfgeno de celulas T asociado con el complejo del receptor de celulas T (TCR), y a CD20, un antfgeno de la superficie de celulas B presente en celulas B normales y varios tumores malignos del linaje de celulas B. El Ac 1 esta disenado para unir las celulas que expresan CD20 con las celulas T citotoxicas mediante la union a la subunidad CD3 del TCR, lo que resulta en la muerte de celulas T policlonales dirigida por CD20. CD20 es una diana validada clfnicamente para la inmunoterapia; el anticuerpo quimerico rituximab esta aprobado para el tratamiento de los linfomas no Hodgkin (NHL) y la leucemia linfocftica cronica (CLL). Aunque los pacientes pueden llegar a ser refractarios al rituximab, tfpicamente no se observa perdida de la expresion de CD20. Por lo tanto, un anticuerpo biespecffico que una las celulas tumorales CD20 positivas con las celulas T citotoxicas representa una estrategia antitumoral potencial.
En este estudio, el efecto de tratamiento con el bsAc CD20xCD3 Ac 1 sobre el crecimiento tumoral de linfoma de celulas B humanas (Raji) se examino en un modelo tumoral en raton. El modelo utilizo ratones BALB/c-Rag2nulo
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IL2rYnulo (BRG) injertados con hCD34+ que se humanizaron para SIRPa. Estos ratones, con celulas T, B, y NK humanas, asf como granulocitos, monocitos, y celulas dendrfticas (DC), se trataron con Ac 1 dos veces a la semana, lo que dio como resultado una supresion significativa del crecimiento de tumores Raji en comparacion con el control de vehfculo y el AcM control de no union, Ac 5 Control. El tratamiento con el Ac 1 suprimio el crecimiento
tumoral a 0,4 mg/kg y 0,04 mg/kg con un mayor nivel de significacion que el grupo control de vehfculo a todo lo largo del perfodo de tratamiento (p<0,0001). No se observo una perdida del peso significativa en ningun grupo de tratamiento. Estos resultados muestran que el Ac 1 se dirige a tumores Raji en ratones con celulas inmunitarias humanas, lo que da lugar a una supresion tumoral significativa.
Materiales y metodos
Materiales
Compuesto de prueba y anticuerpo control Compuesto de prueba: Ac 1.
Anticuerpo control: Ac 5 Control.
Reactivos
Tabla 4: Lista de reactivos
Reactivo
Fuente Identificacion
Celulas Raji
Instalacion central de Regeneron Raji P 1-4-10 Pase num. 4
Celulas madre hematopoyeticas (HSC) CD34+ humanas aisladas de hfgados fetales humanos
Advanced Biosciences Resource, Inc.
hPBMC
Reachbio Catalogo num. 0500-300, Lote num. 130322
L-Histidina
Amresco Catalogo num. 181164-100G, Lote num. 3363E344
Sacarosa
Biosolutions Catalogo num. BIO640-07, Lote num. 0816012
RPMI
Irvine Scientific Catalogo num. 9160, Lote num. 9160100803
FBS
Tissue Culture Biologicals Catalogo num. 101, Lote num. 107062
Penicilina/Estreptomicina/L-Glutamina
Gibco Catalogo num. 10376-016, Lote num. 1411480
2-Mercaptoetanol
Gibco Catalogo num. 21985-023, Lote num. 762405
Anti-CD45 humano
Invitrogen Catalogo num. MHCD4518, Clon H130
Anti-NKp46 humano
BD Biosciences Catalogo num. 558051, Clon 9E2
Anti-CD 19 humano
BD Biosciences Catalogo num. 555412, Clon HIB19
Anti-CD3 humano
Invitrogen Catalogo num. MHCD0328, Clon S4.1
Anti-CD14 humano
BD Biosciences Catalogo num. 557742, Clon M5E2
Anti-CD45 humano
BD Biosciences Catalogo num. 557659, Clon 30-F11
BD Fortessa
BD Biosciences Instrumento de orden especial
Sistemas de prueba
Los estudios en tumores presentados en este informe emplearon ratones inmunodeficientes BALB/c-Rag2nulos IL2rYnulos (BRG) de 24-32 semanas de edad, machos y hembras, humanizados para el gen de la protefna reguladora de senales alfa (SIRPa). Estos se generaron en Regeneron mediante transformacion de celulas madre embrionarias (ES) (Strowig y otros, Proc Natl Acad Sci USA, 108(32): 13218-13223 (2011)). Despues del reconocimiento de CD47, SIRPa inhibe el aclaramiento de celulas CD47 positivas por los macrofagos. Estudios
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anteriores han demostrado que los ratones BRG que expresan el transgen SIRPa humano tienen un injerto mejorado de HSC humanas (Strowig y otros, Proc Natl Acad Sci USA, 108(32): 13218-13223 (2011)).
Las crfas BRG SIRPa recien nacidas se irradiaron e injertaron con celulas progenitoras hematopoyeticas hCD34+ derivadas de hfgado fetal (Traggiai, y otros, Science, 304(5667): 104-107 (2004)). Estas HSC humanas dan lugar a celulas T, B, y NK humanas, asf como a granulocitos, monocitos, y celulas dendrfticas (DC). Debido a los bajos niveles de celulas B humanas circulantes, hay bajos niveles de IgG humana circulante. Ademas, estos ratones no desarrollan centros germinales, carecen de ganglios linfaticos y tienen una reposicion limitada de celulas T y B si se agotan estas celulas. Los monocitos murinos, las DC, y los granulocitos continuan presentes tambien. La composicion de celulas inmunitarias se confirmo mediante citometrfa de flujo de sangre, y los ratones se asignaron al azar por el % de injerto CD45 humano antes de su uso en los estudios de tumores. Los ratones se implantaron con celulas tumorales Raji en el Dfa 0, y se analizo la capacidad del Ac 1 para bloquear el crecimiento tumoral en 4 semanas. Los pesos corporales y los volumenes tumorales se registraron en los dfas 3, 6, 9, 13, 16, 20, 23, 27, 30 y 34 despues de la implantacion.
Diseno experimental
Reconstitucion del sistema inmunitario humano en ratones BRG SIRPa
Los ratones BALB/c Rag2 /-yc-/- (BRG) con SIRP alfa humano (BRG SIRPa) inmunodeficientes se criaron en los aisladores libres de germenes en las instalaciones de animales de Regeneron. Los ratones neonatos se irradiaron con una dosis de 300 cGrey, 8-24 horas antes de la inyeccion de celulas madre hematopoyeticas (HSC) CD34+ humanas aisladas a partir de hfgados fetales humanos. El injerto se dejo desarrollar durante 12-16 semanas y la cantidad de celulas injertadas se evaluo periodicamente mediante citometrfa de flujo. Durante toda la duracion del experimento, los animales se alojaron en las instalaciones de animales de Regeneron en condiciones estandar en un ciclo dfa/noche de 12 horas con acceso a la comida y al agua ad libitum. La cantidad de animales por caja se limito a un maximo de 5 ratones.
Se analizo la sangre de los ratones para determinar el por ciento de los niveles de injerto antes de iniciar el estudio. Se tomaron muestras de sangre completa en dos tubos capilares que contenfan 150 ul de EDTA al 2 % (acido etilendiaminotetraacetico; 15 mg/ml). Los globulos rojos se lisaron mediante el uso del tampon de lisis ACK durante 3 minutos y el tampon se neutralizo con PBS (sin calcio ni magnesio). Las celulas se bloquearon con Bloqueo de Fc durante 5 minutos a 4 °C y despues se tineron con CD45 humano, NKp46, CD19, CD3 y CD14 durante 30 minutos a 4 °C. Las muestras se analizaron mediante citometrfa de flujo con 5 laseres (BD Fortessa). El por ciento de injerto se determino como el % de celulas CD45+ humanas de las celulas totales.
Procedimiento de estudio de tumores Raji en ratones BRG SIRPa
En el dfa 0, los grupos de 5 ratones BRG SIRPa recibieron la administracion de 2x106 celulas tumorales Raji por via subcutanea. El mismo dfa, los ratones se trataron con una dosis intraperitoneal (IP) de Ac 1 (0,4 o 0,04 mg/kg), Control de AcM control de no union Ac 5 (que se une un antfgeno felino sin reactividad cruzada con CD20 o CD3 humanos) a una dosis de 0,4 mg/kg o vehfculo solo. Posteriormente los ratones recibieron dos dosis de anticuerpo/semana durante 4 semanas. El crecimiento tumoral se midio con calibres en los dfas 3, 6, 9, 13, 16, 20, 23, 27, 30 y 34. Los grupos de estudio se resumen en la Tabla 5.
Tabla 5: Resumen de los grupos de tratamiento en ratones BRG SIRPa
Grupos
Tumor Anticuerpo Dosis (mg/kg) Via Programa Cant. de ratones
Grupos control
Raji Sin anticuerpo (Solo vehfculo) 0 IP 2x/sem 5
Raji
Ac 5 Control 0,4 IP 2x/sem 5
Grupos experimentales
Raji Ac 1 0,4 IP 2x/sem 5
Raji
Ac 1 0,04 IP 2x/sem 5
Procedimientos especfficos Preparacion de reactivos
Cada uno del Ac 1 y el Ac 5 Control se diluyeron hasta la concentracion deseada en vehfculo (histidina 10 mM, 5 % de sacarosa, pH 5,8). Las celulas Raji se obtuvieron de la instalacion central de Regeneron (pase 4) y se mantuvieron en medio de cultivo: RPMI 1640 +10 % FBS + Pen Strep-L-Glu + Mercaptoetanol. Las celulas Raji se diluyeron hasta la concentracion deseada en medio.
Analisis estadfstico
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Los analisis estadfsticos se realizaron mediante la utilizacion del programa GraphPad Prism 5.0 (Version Macintosh). El nivel de significacion estadfstica se determino mediante ANOVA de dos vfas y posteriormente la prueba de comparaciones multiples de Tukey. Los datos de cada una de las lecturas se compararon entre los grupos de tratamiento. Un umbral de p<0,05 se considero estadfsticamente significativo, como se indica por *. Los ratones que murieron antes del final del estudio se eliminaron de los graficos de las curvas de crecimiento tumoral combinadas (pero no de la curva de crecimiento de los ratones individuales) como se indica y el analisis estadfstico para analizar mediante ANOVA de dos vfas.
Resultados
El Ac 1 suprime el crecimiento de celulas tumorales Raji en ratones BRG SIRPa injertados con hCD34+
El Ac 1 suprimio el crecimiento de tumores Raji en comparacion con el control de vehfculo y el control de no union en ratones BRG SIRPa injertados con hCD34+ (Figura 6). Las crfas BRG SIRPa recien nacidas se irradiaron y se injertaron con celulas hepaticas fetales hCD34+ como celulas progenitoras hematopoyeticas (Traggiai, y otros, Science, 304(5667): 104-107 (2004)), lo que dio lugar a celulas T, B, y NK humanas, asf como a granulocitos, monocitos, y DC. En el dfa 0, los ratones BRG SIRPa injertados con hCD34+ recibieron la administracion de 2x106 celulas tumorales Raji por via subcutanea. El mismo dfa, los ratones se trataron con una dosis intraperitoneal (IP) de Ac 1 (0,4 o 0,04 mg/kg) o el Control de AcM control de no union Ac 5, o control de vehfculo, seguido de dos dosis semanales a todo lo largo del estudio.
En comparacion con los grupos control de vehfculo y los grupos control de no union, el Ac 1 suprimio significativamente el crecimiento de tumores Raji, administrado en dosis de 0,04 mg/kg (p<0,0001) o 0,4 mg/kg (p<0,0001) en el dfa 34 despues de la implantacion del tumor (Figura 7). Ademas, los efectos del tratamiento con el Ac 1 fueron dependientes de la dosis, donde el Ac 1 a 0,4 mg/kg suprimio el crecimiento completamente a todo lo largo del estudio, en comparacion con el Ac 1 a 0,04 mg/kg, que suprimio el crecimiento tumoral completamente hacia el Dfa 30. Ni el Ac 1 ni el AcM control de no union tuvieron un efecto significativo sobre el peso corporal de los ratones a todo lo largo del estudio (Figura 8).
Conclusion
El efecto del tratamiento con Ac1, un bsAc CD20xCD3, sobre el crecimiento de tumores Raji se examino en un modelo de raton. El Ac 1 fue eficaz en la supresion del crecimiento tumoral en ratones BRG SIRPa injertados con hCD34+ con celulas T, B, y NK humanas, asf como granulocitos, monocitos, y DC. El tratamiento dos veces a la semana con Ac 1 dio como resultado una supresion significativa y dependiente de la dosis del crecimiento tumoral de linfoma de celulas B humanas Raji en comparacion con el control de vehfculo y el control de no union. No se observo una perdida del peso significativa en ningun grupo de tratamiento. Estos resultados muestran que el Ac 1 se dirige a tumores Raji en ratones con celulas inmunitarias humanas, lo que da lugar a una supresion significativa del crecimiento tumoral.
Equivalentes
Habiendo descrito asf diversos aspectos de al menos una modalidad de esta invencion, los expertos en la tecnica apreciaran que pueden idear facilmente diversas alteraciones, modificaciones, y mejoras. Tales alteraciones, modificaciones, y mejoras estan destinadas a ser parte de esta descripcion. En consecuencia, la descripcion anterior y los dibujos son solo a manera de ejemplo.
El uso de terminos ordinales tales como “primero”, “segundo”, “tercero”, etcetera, en las reivindicaciones para modificar un elemento de reivindicacion no connota en sf mismo ninguna prioridad, precedencia, u orden de un elemento de reivindicacion sobre otro o el orden temporal en que se realizan las acciones de un metodo, sino que se usan simplemente como etiquetas para distinguir un elemento de reivindicacion que tiene un determinado nombre de otro elemento que tiene el mismo nombre (excepto por el uso del termino ordinal) para distinguir los elementos de reivindicacion.
Debe entenderse que los artfculos “un” y “una” como se usan en la presente descripcion en la especificacion y en las reivindicaciones, a menos que se indique claramente de cualquier otra manera, incluyen los referentes plurales. Las reivindicaciones o descripciones que incluyen “o” entre uno o mas miembros de un grupo se consideran satisfechas si uno, mas de uno, o todos los miembros del grupo estan presentes, se emplean, o son relevantes de cualquier otra manera en un producto o proceso determinado a menos que se indique lo contrario o resulte evidente de cualquier otra manera a partir del contexto. La invencion incluye modalidades en las que exactamente un miembro del grupo esta presente, se emplea, o es relevante de cualquier otra manera en un producto o proceso determinado. La invencion incluye, ademas, modalidades en las que mas de uno, o todos los miembros del grupo estan presentes, se emplean, o son relevantes de cualquier otra manera en un producto o proceso determinado. Ademas, debe entenderse que la invencion abarca todas las variaciones, combinaciones, y permutaciones en las que una o mas limitaciones, elementos, clausulas, terminos descriptivos, etcetera, de una o mas de las reivindicaciones
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enumeradas se introducen en otra reivindicacion dependiente de la misma reivindicacion de base (o, segun sea relevante, cualquier otra reivindicacion) a menos que se indique de cualquier otra manera o a menos que resulte evidente a un experto en la tecnica que podrfa surgir una contradiccion o inconsistencia. Cuando los elementos se presentan en forma de listas (por ejemplo, en grupo Markush o un formato similar) debe entenderse que cada subgrupo de los elementos tambien se describe, y cualquier elemento(s) puede(n) eliminarse del grupo. Debe entenderse que, en general, cuando la invencion, o aspectos de la invencion, se refiere(n) como que comprende(n) elementos, caracterfsticas particulares, etcetera, determinadas modalidades de la invencion o aspectos de la invencion consisten, o consisten esencialmente en tales elementos, caracterfsticas, etcetera. Con propositos de simplicidad esas modalidades no se han expuesto especfficamente en cada caso de manera explfcita en la presente descripcion. Debe entenderse que cualquier modalidad o aspecto de la invencion puede excluirse explfcitamente de las reivindicaciones, independientemente de si la exclusion especffica se menciona en la especificacion.
Los expertos en la tecnica apreciaran estandares de desviacion o error tfpicos atribuibles a valores obtenidos en ensayos u otros procesos descritos en el presente documento. Las publicaciones, sitios web y otros materiales de referencia referidos en la presente descripcion describen los antecedentes de la invencion y proporcionan detalles adicionales relacionados con su practica.
Listado de secuencias
[0145]
<110> Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Murphy, Andrew J.
<120> Animales no humanos que tienen un gen humanizado de una protefna reguladora de senales
<130> 31014 (3400P1)
<150> 61881261 <151> 2013-09-23
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1 <211> 4007 <212> ADN <213> Mus musculus

Claims (15)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    65
    REIVINDICACIONES
    1. Un raton cuyo genoma comprende un reemplazo de los exones 2, 3 y 4 de un gen de SIRPa de raton en un locus endogeno de SIRPa de raton con los exones 2, 3 y 4 de un gen de SIRPa humano para formar un gen de SIRPa humanizado, en donde dicho gen de SIRPa humanizado se une operativamente a un promotor de SIRPa de raton en dicho locus endogeno de SIRPa de raton, y expresa en dicho raton una protefna SIRPa humanizada que comprende una porcion extracelular de la protefna SIRPa humana codificada por dicho gen de SIRPa humano y una porcion intracelular de la protefna SIRPa de raton codificada por dicho gen de SIRPa de raton.
  2. 2. El raton de conformidad con la reivindicacion 1, en donde el gen de SIRPa humanizado comprende los exones 1, 5, 6, 7 y 8 de dicho gen de SIRPa de raton.
  3. 3. El raton de conformidad con la reivindicacion 1 o 2, en donde dicha protefna SIRPa humana comprende la secuencia de aminoacidos como se expone en la sec. con num. de ident.: 4.
  4. 4. El raton de conformidad con la reivindicacion 3, en donde dicha protefna SIRPa humanizada comprende la secuencia de aminoacidos como se expone en la sec. con num. de ident.: 5.
  5. 5. El raton de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el raton no expresa una protefna SIRPa de raton.
  6. 6. El raton de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde dicha protefna SIRPa humanizada se expresa en la superficie de las celulas en dicho raton y apoya el injerto de celulas madre hematopoyeticas CD34+ humanas.
  7. 7. Una celula o tejido aislados de raton cuyo genoma comprende un reemplazo de los exones 2, 3 y 4 de un gen de SIRPa de raton en un locus endogeno de SIRPa de raton con los exones 2, 3 y 4 de un gen de SIRPa humano para formar un gen de SIRPa humanizado, en donde dicho gen de SIRPa humanizado se une operativamente a un promotor de SIRPa de raton en dicho locus endogeno de SIRPa de raton, y codifica una protefna SIRPa humanizada que comprende una porcion extracelular de la protefna SIRPa humana codificada por dicho gen de SIRPa humano y una porcion intracelular de la protefna SIRPa de raton codificada por dicho gen de SIRPa de raton.
  8. 8. La celula o tejido aislados de conformidad con la reivindicacion 7, en donde el gen de SIRPa humanizado comprende los exones 1, 5, 6, 7 y 8 de dicho gen de SIRPa de raton.
  9. 9. La celula o tejido aislados de conformidad con la reivindicacion 7 u 8, en donde la celula o tejido no expresa una protefna SIRPa de raton.
  10. 10. Un metodo para obtener un raton, que comprende:
    a) reemplazar los exones 2, 3 y 4 de un gen de SIRPa de raton en un locus endogeno de SIRPa de raton en una celula ES de raton con los exones 2, 3 y 4 de un gen de SIRPa humano para formar un gen de SIRPa humanizado, en donde dicho gen de SIRPa humanizado se une operativamente a un promotor de SIRPa de raton en dicho locus endogeno de SIRPa de raton, y codifica una protefna SIRPa humanizada que comprende una porcion extracelular de la protefna SIRPa humana codificada por dicho gen de SIRPa humano y una porcion intracelular de la protefna SIRPa de raton codificada por dicho gen de SIRPa de raton, para obtener de esta manera una celula ES modificada de raton que comprende dicho gen de SIRPa humanizado; y
    b) crear un raton mediante el uso de la celula ES modificada obtenida en (a).
  11. 11. Un metodo para proporcionar un raton transgenico, en donde una o mas celulas humanas se trasplantan a un raton de conformidad con las reivindicaciones 1-6.
  12. 12. El metodo de conformidad con la reivindicacion 11, en donde las celulas humanas son celulas madre hematopoyeticas humanas.
  13. 13. Un metodo para medir la fagocitosis de un sustrato marcado por una o mas celulas de raton; el metodo comprende;
    a) proporcionar una o mas celulas de raton cuyo genoma comprende un reemplazo de los exones 2, 3 y 4 de un gen de SIRPa de raton en un locus endogeno de SIRPa de raton con los exones 2, 3 y 4 de un gen de SIRPa humano para formar un gen de SIRPa humanizado, en donde dicho gen de SIRPa humanizado se une operativamente a un promotor de SIRPa de raton en dicho locus endogeno de SIRPa de raton, y codifica una protefna SIRPa humanizada que comprende una porcion extracelular
    de la protefna SIRPa humana codificada por dicho gen de SIRPa humano y una porcion intracelular de la protefna SIRPa de raton codificada por dicho gen de SIRPa de raton;
    b) incubar una o mas celulas de la etapa (a) con el sustrato marcado; y
    c) medir la fagocitosis del sustrato marcado por una o mas celulas de la etapa (b).
    5
    10
  14. 14. Un metodo para medir la fagocitosis de un antfgeno por una o mas celulas de un raton, que comprende;
    a) proporcionar un raton de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6;
    b) exponer el raton al antfgeno; y
    c) medir la fagocitosis del antfgeno por una o mas celulas del raton.
    15
  15. 15. Un metodo para evaluar la eficacia terapeutica de un farmaco para dirigirse a celulas humanas, que comprende:
    a) proporcionar un raton de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6 en el cual se han trasplantado una o mas celulas humanas;
    b) administrar un candidato a farmaco a dicho raton; y
    c) controlar las celulas humanas en el raton para determinar la eficacia terapeutica del candidato a farmaco.
    .1.5 kb
    imagen1
    n....-...............; ■■■
    1—1 Region no traducida
    Region codificante de raton
    m
    Region codificante humana
    Figura 1
    imagen2
    Figura 2
    imagen3
    Figura 3
    imagen4
    Figura 4
    imagen5
    imagen6
    Volumen del tumor (mm3) Volumen del tumor (mm3)
    Control:
    imagen7
    Dias despues de la implantacion del tumor
    Ac 1
    imagen8
    Dias despues de la implantacion del tumor
    imagen9
    Ac 1:
    imagen10
    Pl&u-fr Drttf! I Ti iir>JM*iura lir'irtr'il^ rt+?3rfi.rtrt
    Dias despues de la implantacion del tumor
    Figura 6
    o rn
    imagen11
    1^ ;*i nr-i 4-p> A I \ ■ aJ.iK
    Control - Vehfculo Control Ac 5 - 0,4 mg/kg Ac 1 - 0,4 mg/kg Ac 1 - 0,04 mg/kg
    Dias desoues de la imolantacion del tumor
    I I j i «*i _i , , ■ ■ i lmji r* ii «i ii i"
    ' p<0,01 en comparacion con el Ac 5 Control P<0,001 en comparacion con el Ac 5 Control ^><0,0001 en comparacion con el Control de vehfculo p<0,0001 en comparacion con el Ac 5 Control
    Figura 7
    cn
    NJ
    A ^----* —i-
    Control:
    imagen12
    C. Ac1:
    0,4 mg/kg
    imagen13
    Plaice Prtet Tnirtrtf Imnlan+^atirtn
    Dias despues de la implantacion del tumor
    Control Ac 5:
    0,4 mg/kg
    imagen14
    Dias despues de la implantacion del tumor Ac 1:
    imagen15
    Dias despues de la implantacion del tumor
    Figura 8
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Families Citing this family (44)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK3056082T3 (en) 2009-10-06 2018-12-17 Regeneron Pharma RE-MODIFIED MICE AND INPUT
SG10202008003VA (en) 2011-02-15 2020-10-29 Regeneron Pharma Humanized m-csf mice
FI2892330T3 (fi) 2012-09-07 2023-03-25 Univ Yale Geneettisesti muokattuja hiiriä ja menetelmiä niiden käyttämiseksi
KR102275412B1 (ko) 2012-11-05 2021-07-12 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 유전자 변형된 비-인간 동물 및 그것의 사용 방법
PL3434101T3 (pl) 2013-09-23 2024-02-19 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Zwierzęta inne niż ludzie posiadające humanizowany gen białka regulacji sygnału
US9155290B2 (en) 2013-10-15 2015-10-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Humanized IL-15 animals
MX356809B (es) 2013-11-19 2018-06-13 Regeneron Pharma Animales no humanos que tienen un gen del factor activador de celulas b.
EP3693383A1 (en) 2014-04-08 2020-08-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mouse-human fc-gamma-ri proteins and encoding dna
NO2785538T3 (es) 2014-05-07 2018-08-04
PT3482629T (pt) 2014-05-19 2021-02-18 Univ Yale Animais não humanos geneticamente modificados que expressam epo humana
ES2783424T3 (es) 2014-06-19 2020-09-17 Regeneron Pharma Animales no humanos que tienen un gen de muerte celular programada 1 humanizado
RS61080B1 (sr) 2014-11-24 2020-12-31 Regeneron Pharma Ne-humane životinje koje eksprimiraju humanizovani cd3 kompleks
PT3850946T (pt) 2014-12-05 2024-01-02 Regeneron Pharma An:imais não romanos com tjm gene do grupo de diferenciação 47 romanizado
HRP20240855T1 (hr) 2014-12-09 2024-10-11 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Neljudske životinje koje imaju humanizirani gen cd274 iz diferencijacijske skupine
AU2016247892B2 (en) * 2015-04-13 2022-05-26 Institute For Research In Biomedicine (Irb) Humanized SIRPA-IL15 knockin mice and methods of use thereof
CN104904661B (zh) * 2015-06-05 2018-07-24 杭州正因生物技术有限公司 一种人源化小鼠
MX2018001428A (es) 2015-08-07 2018-09-05 Alx Oncology Inc Construcciones con un dominio sirp-alfa o sus variantes.
JP6997708B2 (ja) 2015-11-20 2022-02-04 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド ヒト化されたｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ－ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｇｅｎｅ ３遺伝子を有する非ヒト動物
CN108779159B (zh) 2016-02-04 2022-12-30 瑞泽恩制药公司 具有经改造的angptl8基因的非人动物
RU2749715C2 (ru) 2016-02-29 2021-06-16 Регенерон Фармасьютикалз, Инк. Грызуны, характеризующиеся гуманизированным геном tmprss
CN108588126B (zh) 2017-03-31 2020-04-10 北京百奥赛图基因生物技术有限公司 Cd47基因人源化改造动物模型的制备方法及应用
WO2018177441A1 (en) 2017-03-31 2018-10-04 Beijing Biocytogen Co., Ltd GENETICALLY MODIFIED NON-HUMAN ANIMAL WITH HUMAN OR CHIMERIC SIRPα
WO2018233608A1 (en) * 2017-06-19 2018-12-27 Beijing Biocytogen Co., Ltd NON-HUMAN ANIMAL GENETICALLY MODIFIED TO CD28 HUMAN OR CHIMERIC
CN109136261B (zh) 2017-06-19 2021-03-16 百奥赛图(北京)医药科技股份有限公司 人源化cd28基因改造动物模型的制备方法及应用
CA3068072A1 (en) 2017-07-31 2019-02-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for assessing crispr/cas-mediated disruption or excision and crispr/cas-induced recombination with an exogenous donor nucleic acid in vivo
EP3585159A1 (en) 2017-07-31 2020-01-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Cas-transgenic mouse embryonic stem cells and mice and uses thereof
KR102544051B1 (ko) * 2017-09-29 2023-06-16 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 인간화된 ttr 유전자좌를 포함하는 비인간 동물 및 사용 방법
IL274740B2 (en) 2017-11-30 2024-06-01 Regeneron Pharma Non-human animals containing a human TRKB locus
AU2019239880B2 (en) 2018-03-19 2023-11-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Transcription modulation in animals using CRISPR/Cas systems
TW202431987A (zh) 2018-03-26 2024-08-16 美商再生元醫藥公司 用於測試治療藥劑之人類化囓齒動物
CN117024593A (zh) 2018-07-10 2023-11-10 国立大学法人神户大学 抗SIRPα抗体
HRP20240999T1 (hr) 2018-07-16 2024-10-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Glodavački modeli bolesti ditra i njihova upotreba
WO2020160285A1 (en) * 2019-02-01 2020-08-06 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University SIRPα EXPRESSION ON T CELLS IS A BIOMARKER FOR FUNCTIONAL T CELLS DURING EXHAUSTION
ES2966625T3 (es) 2019-04-04 2024-04-23 Regeneron Pharma Roedores que comprenden un locus del factor de coagulación 12 humanizado
CN114126648A (zh) 2019-05-31 2022-03-01 Alx肿瘤生物技术公司 用SIRPα Fc融合体组合免疫检查点抑制剂治疗癌症的方法
CN113874510A (zh) 2019-06-04 2021-12-31 瑞泽恩制药公司 包括具有β滑移突变的人源化TTR基因座的非人动物和使用方法
JP2022534560A (ja) 2019-06-07 2022-08-02 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド ヒト化アルブミン遺伝子座を含む非ヒト動物
WO2021136537A1 (en) * 2019-12-31 2021-07-08 Biocytogen Pharmaceuticals (Beijing) Co., Ltd. GENETICALLY MODIFIED IMMUNODEFICIENT NON-HUMAN ANIMAL WITH HUMAN OR CHIMERIC SIRPα/CD47
US20230172170A1 (en) 2020-04-21 2023-06-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals having a humanized cxcl13 gene
US20220192165A1 (en) 2020-12-21 2022-06-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals having a humanized tslp gene, a humanized tslp receptor gene, and/or a humanized il7ra gene
US12098214B2 (en) 2021-05-13 2024-09-24 ALX Oncology Inc. Combination therapies for treating cancer
WO2023143341A1 (en) * 2022-01-25 2023-08-03 Biocytogen Pharmaceuticals (Beijing) Co., Ltd. Genetically modified non-human animal with human or chimeric nkp46
US20240102045A1 (en) 2022-07-19 2024-03-28 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Vectors, genetically modified cells, and genetically modified non-human animals comprising the same
WO2024073679A1 (en) 2022-09-29 2024-04-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Correction of hepatosteatosis in humanized liver animals through restoration of il6/il6r/gp130 signaling in human hepatocytes

Family Cites Families (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5149635A (en) * 1986-09-12 1992-09-22 Abbott Biotech, Inc. Messenger RNA stabilization in animal cells
JP2001515712A (ja) * 1997-09-12 2001-09-25 バイオジェン インコーポレイテッド 増殖効果を有する新規タンパク質−ａｐｒｉｌ
US6586251B2 (en) 2000-10-31 2003-07-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
ES2587344T3 (es) * 2003-12-24 2016-10-24 Novo Nordisk A/S Ratón transgénico que comprende un polinucleótido que codifica C5aR humano o humanizado
EP2767161B1 (en) 2004-10-19 2018-02-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Method for generating an non-human animal homozygous for a genetic modification
US20060272038A1 (en) * 2005-05-27 2006-11-30 Michael De Vivo Transgenic Alzheimer's mouse model vectors and uses thereof
US20070028316A1 (en) * 2005-06-02 2007-02-01 Xiaoxia Li Transgenic non-human Act1-deficient mammals and uses thereof
EP2388270A3 (en) * 2007-10-11 2012-04-25 The Hospital For Sick Children Modulation of SIRPa - CD47 interaction for increasing human hematopoietic stem cell engraftment and compounds therefor
WO2009114400A1 (en) 2008-03-07 2009-09-17 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Es cell-derived mice from diploid host embryo injection
RU2425880C2 (ru) * 2009-07-30 2011-08-10 Учреждение Российской академии наук Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН Способ получения трансгенных мышей
DK3056082T3 (en) 2009-10-06 2018-12-17 Regeneron Pharma RE-MODIFIED MICE AND INPUT
US9402377B2 (en) * 2010-09-20 2016-08-02 Yale University Human SIRPAalpha transgenic animals and their methods of use
AU2012217792A1 (en) * 2011-02-14 2013-08-29 Revivicor, Inc. Genetically modified pigs for xenotransplantation of vascularized xenografts and derivatives thereof
SG10202008003VA (en) * 2011-02-15 2020-10-29 Regeneron Pharma Humanized m-csf mice
RS59082B1 (sr) 2011-10-28 2019-09-30 Regeneron Pharma Miševi sa genetski modifikovanim glavnim kompleksom gena tkivne podudarnosti
EP4052572A1 (en) 2011-10-28 2022-09-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Genetically modified mice expressing chimeric major histocompatibility complex (mhc) ii molecules
RS55949B1 (sr) 2011-10-28 2017-09-29 Regeneron Pharmaeuticals Inc Humanizovani il-6 i il-6 receptor
US8962913B2 (en) 2012-06-18 2015-02-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Humanized IL-7 rodents
FI2892330T3 (fi) 2012-09-07 2023-03-25 Univ Yale Geneettisesti muokattuja hiiriä ja menetelmiä niiden käyttämiseksi
KR102275412B1 (ko) 2012-11-05 2021-07-12 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 유전자 변형된 비-인간 동물 및 그것의 사용 방법
US9848587B2 (en) 2013-02-20 2017-12-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Humanized T cell co-receptor mice
WO2014130667A1 (en) 2013-02-22 2014-08-28 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mice expressing humanized major histocompatibility complex
PL3434101T3 (pl) 2013-09-23 2024-02-19 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Zwierzęta inne niż ludzie posiadające humanizowany gen białka regulacji sygnału
CA2984413A1 (en) * 2015-04-30 2016-11-03 Institute Of Immunology Co., Ltd. Transgenic non-human animal expressing human specific molecule and human fc.gamma. receptor family

Also Published As

Publication number Publication date
EP3434101A1 (en) 2019-01-30
IL244187B (en) 2018-11-29
SI3175706T1 (sl) 2019-03-29
RU2018136614A (ru) 2018-11-27
US10206379B2 (en) 2019-02-19
CN108441497B (zh) 2021-10-29
CY1121410T1 (el) 2020-05-29
US9193977B2 (en) 2015-11-24
NZ717817A (en) 2022-07-01
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