ES2623459T3 - Composiciones y procedimientos para el diagnóstico prematuro de la preñez - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo producido por un hibridoma depositado con el número de acceso de la ATCC PTA-8566, o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

Description

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sustitución o mutantes de inserción. Los mutantes de inserción típicamente implican la adición de material en un punto no terminal en el péptido. Esto puede incluir la inserción de unos pocos restos; un epítopo inmunorreactivo; o simplemente un único resto. El material añadido puede modificarse, tal como por metilación y acetilación. Como alternativa, pueden añadirse restos adicionales a los extremos N-terminal o C-terminal del péptido.

Las sustituciones de aminoácidos generalmente se basan en la similitud relativa de los sustituyentes de cadena lateral de aminoácidos, por ejemplo, su hidrofobicidad, hidrofilicidad, carga y tamaño. Un análisis del tamaño, forma y tipo de los sustituyentes de cadena lateral de aminoácidos revela que la arginina, lisina e histidina son todos restos cargados positivamente; que la alanina, glicina y serina son todos de un tamaño similar; y que la fenilalanina, triptófano y tirosina todos tienen una forma generalmente similar. Por lo tanto, basándose en estas consideraciones, la arginina, lisina e histidina; la alanina, glicina y serina; y la fenilalanina, triptófano y tirosina se definen en el presente documento como equivalentes biológicamente funcionales.

Al hacer cambios, puede considerarse el índice hidropático de los aminoácidos. Cada aminoácido tiene un índice hidropático asignado basado en su hidrofobicidad y características de carga. Estas son: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína/cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptófano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9); y arginina (-4,5). La importancia del índice hidropático del aminoácido al conferir una función biológica interactiva a la proteína generalmente está entendida en la técnica (Kyte y Doolittle, 1982). Se sabe que ciertos aminoácidos pueden sustituirse por otros aminoácidos que tienen un índice o valor hidropático similar y aún retienen una actividad biológica similar. Al hacer cambios basados en el indicio hidropático, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos índices hidropáticos están en +2, aquellos que están en +1 son particularmente preferidos y aquellos en +0,5 son incluso más particularmente preferidos.

Se entiende que un aminoácido puede sustituirse por otro que tiene un valor de hidrofilicidad similar y aún obtener una proteína biológicamente equivalente. Como se detalla en la patente de Estados Unidos 4.554.101, se han asignado los siguientes valores de hidrofilicidad a los restos de aminoácido: arginina (+3,0); lisina (+3,0); aspartato (+3,0 + 1); glutamato (+3,0 + 1); serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); treonina (-0,4); prolina (-0,5 + 1); alanina (-0,5); histidina (-0,5); cisteína (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5); triptófano (-3,4).

Al hacer cambios basados en valores de hidrofilicidad similares, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos valores de hidrofilicidad están en +2, aquellos que están en +1 son particularmente preferidos y aquellos en +0,5 son incluso más particularmente preferidos.

II. Polinucleótidos

Diversos aspectos de la presente invención se refieren a polinucleótidos que codifican un polipéptido que incluye un dominio de cadena ligera con al menos un 97 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1 y un dominio de cadena pesada con al menos un 92 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2. También se divulgan polinucleótidos que comprenden una secuencia de ácido nucleico que tiene más del 98 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 5 o más del 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 6. La SEQ ID NO: 5 se refiere a la secuencia de ácido nucleico del ADNc que codifica la cadena ligera de 2D9 y la SEQ ID NO: 6 se refiere a la secuencia de ácido nucleico del ADNc que codifica la cadena pesada de 2D9.

Los polinucleótido pueden obtenerse de fuentes naturales o sintetizarse químicamente usando cualquier procedimiento conocido para los expertos en la materia. La presente invención también abarca mutantes sintetizados químicamente de estas secuencias.

En ciertas realizaciones, se puede desear emplear construcciones que incluyen otros elementos, por ejemplo, aquellos que incluyen C-5 propina pirimidinas. Los oligonucleótidos que contienen análogos C-5 propina de uridina y citidina han demostrado unirse a ARN con alta afinidad (Wagner y col., 1993). En algunas realizaciones, el polinucleótido codifica uno o más segmentos adicionales de aminoácidos que pueden unirse a una PAG.

III. Anticuerpos y fragmentos de anticuerpo

Realizaciones particulares de la presente invención implican anticuerpos o fragmento de anticuerpo. El término "anticuerpo" se usa para hacer referencia a cualquier molécula de tipo anticuerpo que tenga una región de unión a antígeno, e incluye fragmentos de anticuerpo tales como Fab', Fab, F(ab')2, anticuerpos de un único dominio (DAB), Fv y scFv (Fv de cadena sencilla). Las técnicas para preparar y usar diversas construcciones y fragmentos basados en anticuerpo son bien conocidas en la técnica. Los medios para preparar y caracterizar anticuerpos también son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988).

También se contemplan "minianticuerpos" o "minicuerpos" para su uso con la presente invención. Los minicuerpos son cadenas polipeptídicas sFv que incluyen dominios de oligomerización en sus extremos C-terminales, separados del sFv por una región de bisagra. Pack y col. (1992). El dominio de oligomerización comprende hélices alfa de autoasociación, por ejemplo, cremalleras de leucina que pueden estabilizarse adicionalmente por enlaces disulfuro

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adicionales. El dominio de oligomerización se diseña para que sea compatible con el plegamiento vectorial a través de una membrana, un procedimiento que se cree que facilita el plegamiento in vivo del polipéptido en una proteína de unión funcional. Generalmente, los minicuerpos se producen usando procedimientos recombinantes bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Pack y col. (1992); Cumber y col. (1992).

Los peptidomiméticos de unión de tipo anticuerpo (ABiPS) como se describe por Liu y col., 2003, son péptidos que actúan como anticuerpos recortados y tienen ciertas ventajas de semivida en suero más larga, así como procedimientos de síntesis menos problemáticos.

Se reconoce que los anticuerpos monoclonales (MAb) tienen ciertas ventajas, por ejemplo, reproducibilidad y producción a gran escala, y su uso generalmente es preferido. Los anticuerpos monoclonales pueden ser de origen humano, murino, de mono, de rata, de hámster, de conejo e incluso de pollo. Debido a la facilidad de preparación y fácil disponibilidad de los reactivos, a menudo se preferirán los anticuerpos monoclonales murinos.

Sin embargo, también se contempla los anticuerpos "humanizados", que son anticuerpos quiméricos de ratón, rata u otra especie que albergan dominios de región constante y/o variable humanos, anticuerpos biespecíficos, anticuerpos recombinantes y modificados por ingeniería y fragmentos de los mismos. Como se usa en el presente documento, la expresión inmunoglobulina "humanizada" se refiere a una inmunoglobulina que comprende una región flanqueante humana y una o más regiones determinantes de complementariedad (CDR) de una inmunoglobulina no humana (habitualmente de ratón o rata). La inmunoglobulina no humana que proporciona las CDR se llama "donante" y la inmunoglobulina humana que proporciona la región flanqueante se llama "aceptora". Un "anticuerpo humanizado" es un anticuerpo que comprende una inmunoglobulina de cadena ligera humanizada y de cadena pesada humanizada.

El término "anticuerpo" incluye anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales (mAb), anticuerpos quiméricos, anticuerpos antiidiotípicos (anti-Id) contra anticuerpos que pueden marcarse en forma soluble o unida, así como fragmentos, regiones o derivados de los mismos, proporcionados por cualquier técnica conocida, tal como escisión enzimática, síntesis peptídica o técnicas recombinantes. Los anticuerpos expuestos en el presente documento son capaces de unirse a una PAG.

Los "anticuerpos policlonales" se definen en el presente documento para hacer referencia a poblaciones heterogéneas de moléculas de anticuerpo derivadas de los sueros de animales inmunizados con el antígeno. Estos diferentes anticuerpos pueden reconocer varios epítopos en el mismo antígeno. Un "anticuerpo monoclonal" contiene una población sustancialmente homogénea de anticuerpos específicos para los antígenos, conteniendo dicha población sitios de unión a epítopo sustancialmente similares. Los mAb pueden obtenerse por procedimientos conocidos para los expertos en la materia. Véase, por ejemplo, Kohler y Milstein, 1975; patente de Estados Unidos n.º 4.376.110; Ausubel y col., 1992); Harlow y Lane 1988; Colligan y col., 1993. Dichos anticuerpos pueden ser de cualquier clase de inmunoglobulina incluyendo IgG, IgM, IgE, IgA, IgD y cualquier subclase de las mismas. Puede cultivarse un hibridoma que produce un mAb de la presente invención in vitro, in situ, o in vivo. La producción de altos títulos de mAb in vivo o in situ hace que este sea el procedimiento de producción actualmente preferido.

Los "anticuerpos quiméricos" son moléculas, diferentes partes de las cuales se obtienen de diferentes especies animales, tales como aquellos que tienen una región variable derivada de un mAb murino y una región constante de inmunoglobulina humana, que se usan principalmente para reducir la inmunogenicidad en su aplicación y para aumentar los rendimientos en la producción. Los anticuerpos quiméricos y procedimientos para su producción son conocidos en la técnica. Se describen procedimientos ejemplares de producción en Cabilly y col., 1984; Boulianne y col., 1984; y Neuberger y col., 1985.

Un "anticuerpo antiidiotípico" (anti-Id) es un anticuerpo que reconoce determinantes únicos generalmente asociados con el sitio de unión a antígeno de un anticuerpo. Un anticuerpo anti-Id puede prepararse inmunizando un animal de la misma especie y tipo genético (por ejemplo, cepa de ratón) como fuente de mAb con el mAb para el que se está preparando un anti-Id. El animal inmunizado reconocerá y responderá a los determinantes idiotípicos del anticuerpo inmunizante produciendo un anticuerpo contra estos determinantes idiotípicos (el anticuerpo anti-Id). Un procedimiento ejemplar de producción de dichos anticuerpos se encuentra en la patente de Estados Unidos n.º

4.699.880.

Los anticuerpos de la presente invención pueden incluir al menos una cadena pesada y al menos una ligera que se unen específicamente a los antígenos asociados a preñez (PAG): PAG4, PAG6, PAG9, PAG16, PAG 17, PAG 19, PAG20 y PAG21.

IV. Procedimientos de detección y formatos de ensayo

Ciertas realizaciones de la presente invención se refieren a procedimientos de detección de preñez en un animal bovino que implica poner en contacto una muestra obtenida del animal bovino con el anticuerpo proporcionado en el presente documento y detectar al menos un antígeno asociado a preñez en la muestra, en el que la detección de la PAG indica que el animal está preñado. Puede usarse cualquier procedimiento conocido para los expertos en la materia para detectar el anticuerpo o fragmentos de anticuerpo unidos a una PAG en la muestra.

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En la presente invención, por lo tanto, proporciona el uso de anticuerpos en la detección inmunológica de PAG. Se han descrito diversos procedimientos útiles de inmunodetección en la bibliografía científica, tales como, por ejemplo, Nakamura y col. (1987). Los inmunoensayos, en su sentido más simple y directo son ensayos de unión. Ciertos inmunoensayos son ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA) y radioinmunoensayos (RIA). La detección inmunohistoquímica usando secciones tisulares también es particularmente útil. Sin embargo, se apreciará fácilmente que la detección no está limitada a dichas técnicas, y también puede usarse transferencia de Western, transferencia puntual y análisis FACS en relación con la presente invención.

En general, los procedimientos de inmunounión incluyen obtener una muestra sospechosa de contener una proteína, péptido o anticuerpo, y poner en contacto la muestra con un anticuerpo o proteína o péptido de acuerdo con la presente invención, según pueda ser el caso, en condiciones eficaces para permitir la formación de inmunocomplejos. Las muestras preferidas, de acuerdo con la presente invención, son fluidos, tales como leche, orina, sangre, suero o saliva.

En realizaciones particulares, el anticuerpo se une a un soporte sólido, tal como la pared interna de un tubo o pocillo y la muestra sospechosa de contener la PAG se aplicará al anticuerpo inmovilizado.

Se describen sistemas de tubo recubiertos con anticuerpo en la patente de Estados Unidos n.º 3.646.346 y el documento WO 98/16832. Entonces puede detectarse la presencia de complejos de PAG-anticuerpo en condiciones específicas. Opcionalmente, dichos complejos inmunitarios pueden cuantificare.

El contacto de la muestra biológica elegida con el anticuerpo en condiciones eficaces y durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la formación de complejos inmunitarios (complejos inmunitarios primarios) es generalmente una cuestión de añadir simplemente la composición de anticuerpo a la muestra e incubar la mezcla durante un periodo de tiempo suficientemente largo para que los anticuerpos formen complejos inmunitarios con, es decir, se unan a, cualquier PAG presente en la muestra. Después de este tiempo, la muestra-composición de anticuerpo generalmente se lava para retirar cualquier especie de anticuerpo unido de forma no específica, permitiendo que solamente aquellos anticuerpos unidos específicamente dentro de los complejos inmunitarios primarios se detecten.

En general, la detección de la formación de inmunocomplejos es bien conocida en la técnica y puede conseguirse a través de la aplicación de numerosos enfoques. Estos procedimientos generalmente se basan en detección de un marcador o señal, tal como cualquiera de las marcas radiactivas, fluorescentes, biológicas y enzimáticas. Las patentes de Estados Unidos que se refieren al uso de dichos marcadores incluyen 3.817.837; 3.850.752; 3.939.350; 3.996.345; 4.277.437; 4.275.149 y 4.366.241. Pueden encontrarse procedimientos para la determinación inmunológica de proteínas y kits para realizar el procedimiento en la patente de Estados Unidos 5.721.105.

El procedimiento puede implicar el uso de un ligando de unión secundario tal como un anticuerpo secundario y/o una disposición de unión a ligando de biotina/avidina, como se sabe en la técnica. El anticuerpo secundario empleado en la detección puede estar por sí mismo unido a un marcador detectable, en el que simplemente tendría entonces que detectarse este marcador, permitiendo de ese modo determinar la cantidad de los complejos inmunitarios primarios en la composición. Los procedimientos para la detección de una biomolécula en una muestra de ensayo usando inmunocaptura, amplificación de biotina/avidina y producción de color con peroxidasa de rábano rusticano pueden encontrarse en la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos n.º 2003/508381.

Habitualmente, los complejos inmunitarios primarios pueden detectarse mediante un segundo ligando de unión que tiene afinidad de unión por la PAG o el primer anticuerpo específico de PAG. En estos casos, el segundo ligando de unión puede unirse a un marcador detectable. El segundo ligando de unión a menudo es en sí mismo un anticuerpo, que puede llamarse, por tanto, anticuerpo "secundario". Los complejos inmunitarios primarios se ponen en contacto con el ligando de unión o anticuerpo secundario marcado, en condiciones eficaces y durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la formación de complejos inmunitarios secundarios. Los complejos inmunitarios secundarios después generalmente se lavan para retirar cualquier anticuerpo o ligando secundario marcado unido de forma no específica, y entonces se detecta el marcador restante en los complejos inmunitarios secundarios.

Procedimientos adicionales incluyen la detección de complejos inmunitarios primarios por un enfoque de dos etapas. Un segundo ligando de unión, tal como un anticuerpo, que tiene afinidad de unión por la PAG o anticuerpo anti-PAG se usa para formar complejos inmunitarios secundarios, como se describe anteriormente. El segundo ligando de unión contiene una enzima capaz de procesar un sustrato en un producto detectable y, por tanto, amplificar la señal en el tiempo. Después del lavado, los complejos inmunitarios secundarios se ponen en contacto con el sustrato, permitiendo la detección.

En una realización de la invención, puede usarse inmunoensayo ligado a enzimas (ELISA). Véase, por ejemplo, Engvall, 1980; Engvall, 1976; Engvall, 1977; Gripenberg y col., 1978; Makler y col., 1981; Sarangadharan y col., 1984. El ELISA permite que las sustancias se adsorban de forma pasiva en soporte sólidos tales como plástico para posibilitar una fácil manipulación en condiciones de laboratorio. Para un tratado exhaustivo sobre ELISA se remite al experto en la materia a "Theory and Practise" (Crowther, 1995).

La sensibilidad de los procedimientos ELISA depende del recambio de la enzima usada y la facilidad de detección del producto de la reacción enzimática. La potenciación de la sensibilidad de estos sistemas de ensayo puede

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conseguirse por el uso de sustratos fluorescentes o radiactivos para las enzimas. Los inmunoensayos incluidos por la presente invención incluyen, los descritos en la patente de Estados Unidos 4.367.110 (ensayo de tipo sándwich de doble anticuerpo monoclonal) y la patente de Estados Unidos 4.452.901 (transferencia de Western). Otros ensayos incluyen inmunoprecipitación de ligandos marcados e inmunocitoquímica, ambos in vitro e in vivo.

En una realización, la invención comprende un ELISA "de tipo sándwich", donde los anticuerpos anti-PAG de la presente invención se inmovilizan en una superficie seleccionada, tal como un pocillo en una placa de microtitulación de poliestireno, un tubo o una varilla graduada. Después, una composición de ensayo sospechosa de contener PAG, por ejemplo, una muestra clínica, se pone en contacto con la superficie. Después de la unión y el lavado para retirar los inmunocomplejos unidos de forma no específica, el antígeno unido puede detectarse por un segundo anticuerpo contra la PAG.

En otro ELISA ejemplar, se inmovilizan polipéptidos de la muestra en una superficie y después se ponen en contacto con los anticuerpos anti-PAG. Después de la unión y el lavado para retirar los complejos inmunitarios unidos de forma no específica, se detecta el anticuerpo unido. Cuando los anticuerpos iniciales se unen a un marcador detectable, los complejos inmunitarios primarios pueden detectarse directamente. Como alternativa, los complejos inmunitarios pueden detectarse usando un segundo anticuerpo que tiene afinidad de unión por el primer anticuerpo, estando unido el segundo anticuerpo a un marcador detectable.

Otro ELISA en que las PAG se inmovilizan, implica el uso de competición de anticuerpos en la detección. En este ELISA, se añaden anticuerpos marcados a los pocillos, que se deja que se unan a las PAG, y se detectan mediante su marcador. La cantidad de PAG en una muestra se determina mezclando la muestra con los anticuerpos marcados antes o durante la incubación con pocillos recubiertos. La presencia de PAG en la muestra actúa reduciendo la cantidad de anticuerpo disponible para la unión al pocillo, y por tanto reduce la señal final.

Independientemente del formato empleado, los ELISA tienen ciertas características en común, tales como recubrimiento, incubación o unión, lavado para retirar las especies unidas de forma no específica y detección de los complejos inmunitarios unidos. Al recubrir una placa con antígeno o anticuerpo, generalmente se incubarán los pocillos de la placa con una solución del antígeno o anticuerpo, durante una noche o durante un periodo especificado de horas. Los pocillos de la placa después se lavarán para retirar el material adsorbido de forma incompleta. Cualquier superficie disponible restante de los pocillos después se "recubre" con una proteína no específica que es antigénicamente neutra con respecto al antisuero de ensayo. Esta puede incluir albumina sérica bovina (BSA), caseína, soluciones de leche en polvo u otras proteínas antigénicamente neutras. El recubrimiento permite el bloqueo de los sitios de adsorción no específicos en la superficie de inmovilización y, por tanto, reduce el fondo causado por la unión no específica de los antisueros en la superficie.

"En condiciones eficaces para permitir la formación de complejos inmunitarios (antígeno/anticuerpo)" significa que las condiciones incluyen preferentemente diluir los antígenos y anticuerpos con soluciones tales como BSA, gammaglobulina bovina (BGG), leche evaporada o en polvo, y solución salina tamponada con fosfato (PBS)/TWEEN. Estos agentes añadidos también tienden a ayudar a la reducción del fondo no específico.

Las condiciones "adecuadas" también indican que la incubación es a una temperatura y durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la unión eficaz. Las etapas de incubación típicamente son de aproximadamente 1 h a 2 h a 4 h, a temperaturas preferentemente del orden de 25 ºC a 27 ºC, o pueden ser durante una noche a 4 ºC.

Para proporcionar un medio de detección, el segundo o tercer anticuerpo tendrá un marcador asociado para permitir la detección. A menudo, este será una enzima que generará desarrollo de color tras la incubación con un sustrato cromogénico apropiado. Por tanto, por ejemplo, se deseará poner en contacto e incubar el primero o segundo complejo inmunitario con un anticuerpo conjugado con ureasa, glucosa oxidasa, fosfatasa alcalina o peroxidasa de hidrógeno durante un periodo de tiempo y en condiciones que favorecen el desarrollo de la formación de inmunocomplejos adicionales (por ejemplo, incubación durante 2 h a temperatura ambiente en una solución que contiene PBS tal como PBS-TWEEN). Después de la incubación con el anticuerpo marcado, y después del lavado para retirar el material no unido, se cuantifica la cantidad de marcador, por ejemplo, por incubación con un sustrato cromogénico tal como urea y púrpura de bromocresol o ácido 2,2'-acido-di-(3-etil-benciazolina-6-sulfónico [ABTS] y H2O2, en el caso de peroxidasa como marcador enzimático. La cuantificación entonces se consigue midiendo el grado de generación de color, por ejemplo, usando un espectrofotómetro en el espectro visible. Una variante de ELISA es el ensayo de coagulación ligado a enzimas, o ELCA (patente de Estados Unidos 4.668.621), que usa la cascada de coagulación combinada con la enzima de marcaje RVV-XA como sistema de detección universal. La ventaja de este sistema para la presente invención es que las reacciones de coagulación pueden realizarse a pH fisiológico en presencia de una amplia diversidad de tampones. Es posible, por lo tanto, retener la integridad de los analitos complejos.

También puede usarse inmunohistoquímica (IHC) de acuerdo con la presente invención en la identificación de PAG. Esto implica ensayar bloques tisulares incrustados en parafina, tanto congelados en fresco como fijados en formalina preparados a partir del estudio por IHC. Por ejemplo, cada bloque tisular consiste en 50 mg de tejido placentario "pulverizado" residual. El procedimiento de preparación de bloques tisulares a partir de estas muestras particuladas se ha usado satisfactoriamente en estudios de IHC previos de diversos factores de pronóstico, por ejemplo, en

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mama, y es bien conocido para los expertos en la materia (Brown y col., 1990; Abbondanzo y col., 1990; Allred y col., 1990).

En resumen, pueden prepararse secciones congeladas rehidratando 50 mg de tejido placentario "pulverizado" congelado a temperatura ambiente en solución salina tamponada con fosfato (PBS) en pequeñas cápsulas de plástico; sedimentando las partículas por centrifugación; resuspendiéndolas en un medio de incrustación viscoso (OCT); invirtiendo la cápsula y sedimentando de nuevo por centrifugación; congelando inmediatamente en isopentano a -70 ºC; cortando la cápsula de plástico y retirando el cilindro congelado de tejido; fijando el cilindro de tejido en un mandril de micrótomo de criostato; y cortando 25-50 secciones en serie que contienen un promedio de 500 células placentarias notablemente intactas.

Las secciones permanentes pueden prepararse por un procedimiento similar que implica la rehidratación de los 50 mg de muestra en un tubo de microfuga de plástico; sedimentación; resuspensión en formalina al 10 % durante 4 h de fijación; lavado/sedimentación; resuspensión en agar caliente al 2,5 %; sedimentación; refrigeración en agua enfriada con hielo para endurecer el agar; retirada del bloque de tejido/agar del tubo; infiltración e incrustación del bloque en parafina; y corte de hasta 50 secciones permanentes en serie.

V. Purificación de proteínas

Las técnicas de purificación de proteínas son bien conocidas para los expertos en la materia. Estas técnicas implican, a un nivel, el fraccionamiento en bruto del medio celular en fracciones polipeptídicas y no polipeptídicas. Habiendo separado el polipéptido de otras proteínas, el polipéptido de interés puede purificarse adicionalmente usando técnicas cromatográficas y electroforéticas para conseguir una purificación parcial o completa (o purificación hasta homogeneidad). Los procedimientos analíticos particularmente adecuados para la preparación de un péptido puro son cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de exclusión; electroforesis en gel de poliacrilamida; enfoque isoeléctrico. Un procedimiento particularmente eficaz de purificación de péptidos es cromatografía líquida rápida de proteínas o incluso HPLC.

La expresión "polipéptido, proteína o péptido purificado", como se usa en el presente documento, pretende hacer referencia a una composición, que se puede aislar de otros componentes, en la que la proteína o péptido se purifica a cualquier grado respecto a su estado obtenible de forma natural. Una proteína o péptido purificado, por lo tanto, también se refiere a una proteína o péptido, libre del entorno en el que puede producirse de forma natural. Generalmente, "purificada" se referirá a una composición de proteína o péptido que se ha sometido a fraccionamiento para retirar otros diversos componentes, y reteniendo sustancialmente dicha composición su actividad biológica expresada. Cuando se usa la expresión "sustancialmente purificada", esta denominación se referirá a una composición en la que la proteína o péptido forma el componente principal de la composición, tal como constituyendo el 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o más de las proteínas en la composición.

Diversas técnicas adecuadas para su uso en la purificación de proteínas serán bien conocidas para los expertos en la materia. Estas incluyen, por ejemplo, precipitación con sulfato amónico, PEG y anticuerpos o por desnaturalización por calor o pH ácido de las proteínas contaminantes, seguido por centrifugación; etapas de cromatografía tales como intercambio iónico, filtración en gel, fase inversa, cromatografía en hidroxilapatita y de afinidad; enfoque isoeléctrico; electroforesis en gel; y combinaciones de estas y otras técnicas. Como se sabe generalmente en la técnica, se cree que el orden de realización de las diversas etapas de purificación puede cambiarse, o que ciertas etapas pueden omitirse y aún producir un procedimiento adecuado para la preparación de una proteína o péptido sustancialmente purificado.

No existen requisitos generales de que el polipéptido siempre tenga que proporcionarse en su estado más purificado. De hecho, se contempla que tendrán utilidad productos sustancialmente menos purificados en ciertas realizaciones. La purificación parcial puede conseguirse usando menos etapas de purificación en combinación, o utilizando diferentes formas del mismo esquema de purificación general. Por ejemplo, se aprecia que una cromatografía en columna de intercambio catiónico realizada utilizando un aparato de HPLC generalmente producirá una purificación de mayor "factor" que la misma técnica utilizando un sistema de cromatografía de baja presión. Los procedimientos que muestran un grado menor de purificación relativa pueden tener ventajas en la recuperación total del producto proteico, o en el mantenimiento de la actividad de una proteína expresada.

VI. Kits

En más realizaciones adicionales, la presente invención proporciona kits para su uso con los procedimientos de inmunodetección descritos anteriormente para la detección de PAG, tal como un kit de inmunodetección para diagnosticar la preñez en un bovino. En realizaciones específicas, se incluye un anticuerpo que comprende un dominio de cadena ligera con al menos un 97 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1 y un dominio de cadena pesada con al menos un 92 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2 en el kit. El kit puede incluir uno o más recipientes. El recipiente, por ejemplo, puede ser un vial, un tubo, un matraz o una jeringa.

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Resultados

Inmunoprecipitación de PAG con perlas magnéticas acopladas a 2D9. El análisis de SDS-PAGE y transferencia de Western del material eluido de las perlas magnéticas mostró una única banda de proteína a 67 kDa. La huella peptídica y el análisis CL-EM-EM identificó esta banda de proteína como boPAG6 (FIG. 3). Sin embargo, este

5 análisis no reveló todas las PAG que se unen a 2D9 ya que el análisis usó 100 microgramos de preparación enriquecida con PAG para el experimento de inmunoprecipitación. Este material se aisló por cromatografía de afinidad por pepstatina de extracto de tejido placentario a pH 5,0, seguido por elución a pH 9,5. Esta preparación también se llamó "PAG ácidas", una preparación enriquecida de antígenos PAG prematuros. Para identificar todas PAG que se unen a 2D9, se realizó cromatografía de inmunoafinidad con extractos tisulares (véase a continuación).

10 Análisis de PAG purificadas de extractos tisulares con cromatografía de inmunoafinidad por 2D9. La tinción con azul de Coomassie del material eluido de la columna de inmunoafinidad mostró 3 bandas de proteína con pesos moleculares de 67 kDa, 55 kDa y 50 kDa. Se descubrió que las tres bandas de proteína también eran inmunorreactivas en análisis de transferencia de Western con anticuerpos de conejo anti-PAG. Basándose en estos resultados, todas las bandas de proteínas se cortaron después de SDS-PAGE (FIG.4) y se sometieron a huella

15 peptídica y CL-EM-EM. Las identidades de las secuencias peptídicas resultantes se determinaron por análisis BLAST. La tabla 1 muestra un resumen de los resultados de secuencia peptídica y su identificación como PAG correspondientes a secuencias de boPAG-4, boPAG-6, boPAG-9, boPAG-20 y boPAG21 por análisis BLAST. Para los significados de los parámetros de la Tabla 1, véase la descripción de la FIG.3.

Tabla 1. Resumen de los resultados de secuencia peptídica

N.º de banda de proteína: Presente en las bandas 3, 5, 6 y 7

Glucoproteína 4 asociada a preñez de Bos taurus (gi28603710)

Mz

Carga Mr (calculado) Inicio Final Valor Secuencia peptídica

494,7897

2 969,5647 323 331 97,72 % VPGQAYILK (SEQ ID NO: 19)

523,7799

2 1027,5127 362 369 99,00 % LYFSVFDR (SEQ ID NO: 20)

544,7657

2 1069,5193 127 136 98,95 % TFSITYGSGR (SEQ ID NO: 21)

608,8262

2 1197,6216 232 241 94,10 % GELNWIPLMK (SEQ ID NO: 22)

671,695

3 1994,0513 195 212 99,00 % LKNEGAISEPVFAFYLSK (SEQ ID NO: 23)

820,4574

3 2440,2678 172 194 87,95 % FDGVLGLSYTNISPSGAIPIFYK (SEQ ID NO: 24)

N.º de banda de proteína: Presente en las bandas 1, 2, 4 y 5

Glucoproteína 6 asociada a preñez de Bos taurus (gi28603714)

Mz

Carga Mr (calculado) Inicio Final Valor Secuencia peptídica

886,4235

2 1752,8722 196 211 88,08 % NEGAISEPVFAFYLSK (SEQ ID NO: 25)

881,9394

2 1743,8865 147 162 95,46 % IGDLVSTDQPFGLCLK (SEQ ID NO: 26)

809,7131

3 2408,1736 231 250 91,77 % GELNWVPLIQVGDWFVHMDR (SEQ ID NO: 27)

671,6718

3 1994,0513 194 211 97,94 % LKNEGAISEPVFAFYLSK (SEQ ID NO: 28)

615,3026

2 1210,6022 183 193 98,74 % TFSGAFPIFDK (SEQ ID NO: 29)

592,9321

3 1757,8154 212 227 99,00 % DKQEGSVVMFGGVDHR (SEQ ID NO: 30)

511,9066

3 1514,6936 214 227 90,49 % QEGSVVMFGGVDHR (SEQ ID NO: 31)

467,2242

2 914,4286 362 368 91,26 % YFSVFDR (SEQ ID NO: 32)

(continuación)

N.º de banda de proteína: Presente en las bandas 2 y 5

Glucoproteína 9 asociada a preñez de Bos taurus (gi28603720)

Mz

Carga Mr (calculado) Inicio Final Valor Secuencia peptídica

467,2146

2 914,4286 362 368 99,00 % YFSVFDR (SEQ ID NO: 33)

521,2636

2 1022,5185 138 146 99,00 % GFLAYDTVR (SEQ ID NO: 34)

653,9534

3 1940,8727 214 230 96,15 % QEGSVVMFGGVDHQYYK (SEQ ID NO: 35)

654,80054

2 1289,5962 126 137 97,70 % TFTITYGSGSMK (SEQ ID NO: 36)

660,8375

2 1301,6768 350 360 94,72 % ETWILGDAFLR (SEQ ID NO: 37)

734,6413

3 2183,0105 212 230 87,19 % NKQEGSVVMFGGVDHQYYK (SEQ ID NO: 38)

739,9147

2 1459,8439 307 319 99,00 % YLPSITFIINGIK (SEQ ID NO: 39)

817,7423

3 2432,2222 147 169 99,00 % IGDLVSTDQPFGLSVVEYGLEGR (SEQ ID NO: 40)

875,3999

3 2605,2012 256 280 83,62 % TVIACSDGCEALVHTGTSHIEGPGR (SEQ ID NO: 41)

N.º de banda de proteína: Presente en las bandas 1 y 4

Glucoproteína 20 asociada a preñez de Bos taurus (gi28603736)

Mz

Carga Mr (calculado) Inicio Final Valor Secuencia peptídica

671,6718

3 1994,0513 195 212 97,94 % LKNEGAISEPVFAFYLSK (SEQ ID NO: 42)

758,8157

2 1497,7511 215 228 80,98 % QKGSVVMFGGVDHR (SEQ ID NO: 43)

886,4235

2 1752,8722 197 212 88,08 % NEGAISEPVFAFYLSK (SEQ ID NO: 44)

N.º de banda de proteína: Presente en las bandas 3, 5 y 7

Glucoproteína 21 asociada a preñez de Bos taurus (gi28603738)

Mz

Carga Mr (calculado) Inicio Final Valor Secuencia peptídica

516,7575

2 1013,497 362 369 99,00 % VYFSVFDR (SEQ ID NO: 45)

544,7657

2 1069,5193 127 136 98,95 % TFSITYGSGR (SEQ ID NO: 46)

694,3238

3 2061,9712 258 277 98,47 % VVACSDGCEAVVDTGTSLIK (SEQ ID NO: 47)

753,6964

3 2240,1 148 168 99,00 % IGDLVSTDQPFGLSVSEYGFK (SEQ ID NO: 48)

892,1082

3 2655,2744 171 194 99,00 % AYDGILGLNYPDESFSEAIPIFDK (SEQ ID NO: 49)

915,4483

2 1810,8889 346 361 81,37 % FSSSTETWLLGDAFLR (SEQ ID NO: 50)

Este análisis mostró que cada una de las 3 bandas de proteína, tienen más de una PAG. (Tabla 1). La banda de 67 kDa contenía péptidos correspondientes a boPAG6 y boPAG20. La banda de proteína de 55 kDa contenía péptidos 5 que pertenecen a boPAG6 y boPAG9. La banda de proteína de 50 kDa correspondía a boPAG4 y boPAG21 con boPAG9 como componente minoritario. Estos resultados muestran que el anticuerpo monoclonal 2D9 se une a boPAG4, boPAG6, boPAG9, boPAG20 y boPAG21. Este anticuerpo monoclonal se une epítopos comunes a las 5 PAG. La comparación de secuencia mostró un alto grado de identidad de secuencia entre estas PAG.

Los resultados de ELISA de PAG (FIG. 5) obtenidos usando PAG de unión a 2D9 como patrones se usaron para

10 calcular el valor Kd usando SoftMax™. El valor Kd de 2D9 se determinó en 0,9 nM (FIG. 5). Por tanto, 2D9 es un anticuerpo monoclonal de alta afinidad para PAG. Estos resultados muestran que 2D9, un anticuerpo monoclonal contra PAG, se une a boPAG4, boPAG6, boPAG9, boPAG20 y boPAG21 de extractos tisulares de placenta del día

55. Las identidades de las secuencias peptídicas obtenidas por CL-EM-EM correspondían a secuencias previamente caracterizadas de estas 5 PAG (boPAG4, boPAG6, boPAG9, boPAG20 y boPAG21).

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diferentes de reproducción. Los resultados muestran claramente que hay una reducción significativa en los días receptivos en 10 a 15 días en el grupo de resincronización prematura en comparación con los controles. Además, se observó una reducción en los días entre las inseminaciones en ambos sitios.

Estos resultados muestran que el ensayo prematuro de la preñez con ELISA de PAG después de 27-30 días desde la inseminación permitía una reproducción prematura en comparación con la palpación. El ensayo prematuro de la preñez reducía significativamente los "días receptivos" en la reproducción repetida de las vacas. Además, el ensayo prematuro de la preñez reducía significativamente los días entre inseminaciones. La estrategia de reproducción estral con el ensayo prematuro de la preñez mostró que reducía la cantidad de inseminaciones por concepción.

Ejemplo 4

Conceptos de ensayo en granja: prueba de preñez bovina (tiras)

Se realizó un estudio adicional para evaluar la viabilidad de usar 2D9 en el desarrollo de una prueba de preñez "en granja" con tiras de ensayo. Las tiras de ensayo usaron tecnología de flujo lateral, que es la misma tecnología usada en las pruebas de preñez para el hogar. Las tiras de ensayo de flujo lateral tienen anticuerpo conjugado a oro coloidal en el extremo de aplicación de la muestra y un anticuerpo de captura colocado como línea de ensayo en el centro de la tira. Si hay antígeno de ensayo (PAG) presente en la muestra, entonces el anticuerpo conjugado con oro de unirá al antígeno y el complejo resultante migrará hacia la línea de ensayo. En la línea de ensayo, el anticuerpo de captura (también creado contra PAG) se unirá a este complejo y se concentrará en la línea. Cuando se retienen complejos suficientes en la línea de ensayo como un sándwich de anticuerpos, aparecerá una línea purpura visible debido al anticuerpo marcado con oro coloidal unido al antígeno de ensayo. Se produjeron y ensayaron tiras de flujo lateral con más de 40 combinaciones de anticuerpos (incluyendo 2D9 como anticuerpo de captura). Ninguna de las combinaciones de tira de flujo lateral produjo sensibilidad y especificidad aceptables. Como resultado, se evaluaron otros formatos de ensayo de diagnóstico rápidos para desarrollar un ensayo "en granja". Entre los formatos evaluados, los tubos de plástico con aletas internas mostraron resultados prometedores. A causa de esto, el formato de tubo se seleccionó para optimización adicional como ensayo de color.

Ejemplo 5

Conceptos de ensayos en granja: prueba de preñez bovina (placas de múltiples pocillos)

En un estudio adicional, se usaron muestras de plasma recogidas de vacas preñadas confirmadas en el día 28 para determinar la sensibilidad y especificidad del ensayo de color. Se determinó la intensidad de color transfiriendo la solución de muestra a una placa de múltiples pocillos recubierta con 2D9. La placa se leyó en un lector de placas (SpectraMax, Molecular Devices, Inc., CA). El panel de plasma consistía en 20 muestras de vacas preñadas y 20 muestras de vacas receptivas (no preñadas). Cada muestra se ensayó por duplicado. Basándose en la densidad óptica de las intensidades de color obtenidas de las 40 muestras, usando un punto de corte de 0,2 unidades DO como color de fondo, el ensayo mostró una sensibilidad del 100 % y una especificidad del 100 % (FIG. 9).

Ejemplo 6

Conceptos de ensayo en granja: prueba de preñez bovina de color (tubos de plástico)

Materiales y procedimientos. El siguiente protocolo describe el procedimiento optimizado para ensayar la preñez con tubos de plástico recubiertos con 2D9. El ensayo puede realizarse con muestras de sangre completa recogidas con tubos de recogida de sangre K3EDTA o con muestras de plasma.

Materiales. Se adquirieron tubos con nervaduras internas (n.º 214-2131-010) de Evergreen Scientific Company, Los Ángeles, California. El anticuerpo monoclonal contra PAG 2D9 y los anticuerpos policlonales de conejos se purificaron por cromatografía de afinidad por proteína G. El marcaje con biotina de los anticuerpos policlonales de conejo de consiguió usando el kit de marcaje con biotina de Roche (n.º 1-418-165, Roche Applied Science, Indianápolis, Indiana) de acuerdo con las directrices del fabricante. Se adquirió estreptavidina-PoliHRP20® n.º RDI-PHRP20-SA) que se adquirió de Research Diagnostics, Inc, Concord, MA. El Sure Blue Reserve@ (n.º 53-00-03) se adquirió de KPL, Inc, Gaithersburg, MD. SuperBlock con TWEEN20® (n.º 37516) se adquirió de Pierce Biotech, Rockford, IL. El anticuerpo monoclonal 2D9 purificado en solución salina tamponada con fosfato (pH 7,4) con concentración conocida; tampón de recubrimiento: Na2CO3 0,1 M, pH 9,3; tampón de lavado: PBS 1x con Tween20 al 0,05 %; tampón de dilución: SuperBlock™ al 10 % en tampón de lavado.

Marcaje con biotina de anticuerpos policlonales. El anticuerpo policlonal de conejo purificado (1 mg) se usó para el marcaje con biotina de acuerdo con el procedimiento recomendado por el fabricante del kit (Roche). En resumen, se añadieron 7,6 µl de reactivo de biotina activado en DMSO a 1 ml de anticuerpo en 1,0 ml de solución de PBS en un tubo de 1,5 ml. El tubo se colocó en un agitador giratorio con un ajuste de 45 r.p.m. durante 2 horas a temperatura ambiente. Después de esta etapa, los contenidos se transfirieron a un Slide-A-lyzer™ de diálisis (Pierce Biotech, n.º 63380) y se dializaron frente a PBS 1x a 4 ºC durante 16 horas con 2 cambios de tampón. La IgG marcada con biotina se recuperó del Slide-A-lyzer y se almacenó como una solución madre diluida 1:100 con BSA al 1 % en PBS. Esta solución se diluyó hasta 1:2000 con tampón de dilución para el ensayo de la preñez antes de su uso.

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siguiente estudio:

1. Inmunoprecipitación de PAG (obtenidas de placenta del día 55) con perlas magnéticas recubiertas con 2D9. Se acopla 2D9 purificado a perlas magnéticas Dynal activadas con tosilo de acuerdo con las directrices del fabricante (Dynal). Las perlas magnéticas recubiertas con anticuerpo se incubaron con 100 microgramos de preparación enriquecida con PAG durante 30 minutos en PBS 1x y se lavaron ampliamente con el mismo tampón. Las proteínas unidas se eluyeron usando ácido acético pH 3,0 y se sometieron a análisis en gel y de transferencia de Western. El análisis de Western se reveló con anticuerpos policlonales de conejo anti-PAG. Las bandas de proteínas inmunorreactivas se cortaron del SDS-PAGE y se sometieron a análisis CL-EM-EM después de digestión con tripsina.

El siguiente procedimiento es un procedimiento de inmunoprecipitación alternativo que puede realizarse:

2. Inmunoprecipitación de PAG (obtenidas de placenta del día 61 a 250) con perlas magnéticas recubiertas con 2D9. Puede acoplarse 2D9 purificado a perlas magnéticas Dynal activadas con tosilo de acuerdo con las directrices del fabricante (Dynal). Las perlas magnéticas recubiertas con anticuerpo pueden incubarse con 100 µg de preparación de PAG durante 30 min en PBS 1x y pueden lavarse ampliamente con el mismo tampón. Las proteínas unidas pueden eluirse usando ácido acético pH 3,0 y pueden someterse a análisis en gel o de transferencia de Western. La transferencia de Western puede revelarse con anticuerpos policlonales de conejo anti-PAG. Las bandas de proteínas inmunorreactivas después pueden cortarse de SDS-PAGE y someterse a análisis CL-EM-EM después de digestión con tripsina. Puede purificarse una preparación altamente purificada del subgrupo de proteínas PAG prematuras (específicamente PAG 4, 6, 9, 20 y 21) usando este procedimiento.

Se realizó el siguiente estudio:

3. Cromatografía de inmunoafinidad de extractos tisulares preparados a partir de tejidos de carúncula (endometrio) y cotiledón (placenta) del día 55 de preñez bovina. En resumen, se acopló 2D9 purificado (10 mg) a 1 g de sepharose activado con CNBr de acuerdo con las directrices del fabricante (Sigma, St. Louis). La resina de afinidad por 2D9 (aproximadamente 5,0 ml) se incubó con 25 ml de extracto tisular a pH 7,0 durante una noche para la unión. El siguiente, la resina se compactó en una columna y se lavó con PBS 1x para retirar los materiales no unidos y se eluyó con ácido acético pH 3,0. El pH del material eluido se neutralizó con Tris 1 M inmediatamente después de la elución hasta pH 7,0. El material eluido se sometió a análisis en gel o de transferencia de Western. La transferencia de Western se reveló con anticuerpos policlonales de conejo anti-PAG. Las bandas de proteínas 1 a 7 se cortaron del SDS-PAGE y se sometieron a análisis CL-EM-EM después de digestión con tripsina. Las identidades de las secuencias peptídicas se determinaron usando análisis BLAST.

Lo siguiente es un procedimiento cromatográfico alternativo que puede realizarse:

4. Cromatografía de inmunoafinidad de extractos tisulares preparados a partir de tejido de carúncula (endometrio) y cotiledón (placenta) del día 61 a 250 de preñez bovina. En resumen, puede acoplarse 2D9 purificado (10 mg) a 1 gramo de sepharose activado con CNBr de acuerdo con las directrices del fabricante (Sigma, St. Louis). La resina de afinidad por 2D9 (aproximadamente 5,0 ml) puede incubarse con 25 ml de extracto tisular a pH 7,0 durante una noche para la unión. El siguiente día, la resina puede compactarse en una columna y lavarse con PBS 1x para retirar los materiales no unidos y puede eluirse con ácido acético pH 3,0. El pH del material eluido puede neutralizarse son Tris 1 M inmediatamente después de la elución hasta pH 7,0. El material eluido puede someterse a análisis en gel o de transferencia de Western. La transferencia de Western puede revelarse con anticuerpos policlonales de conejo anti-PAG. Las bandas de proteínas 1 a 7 pueden cortarse del SDS-PAGE y someterse a análisis CL-EM-EM después de digestión con tripsina. Las identidades de las secuencias peptídicas entonces pueden determinarse usando análisis BLAST. Puede purificarse una preparación altamente purificada del subgrupo de proteínas PAG prematuras (específicamente PAG 4, 6, 9, 20 y 21) usando este procedimiento.

Ejemplo 10

Identificación de PAG adicionales de unión a 2D9

Se descubrió que el MAb 2D9 reconoce cinco isoformas de PAG (4, 6, 9, 20 y 21) como se resumen en el Ejemplo 1. Estas isoformas se identificaron por secuenciación de péptidos por CL/EM/EM de muestras de PAG purificadas obtenidas de tejidos placentarios recogidos 55 días después de la reproducción. El MAb 2D9 se utilizó adicionalmente para la purificación e identificación de PAG por acoplamiento del anticuerpo a una resina activada con CNBr para crear una columna de inmunoafinidad. Las PAG presentes en una muestra purificada pueden unirse (reconocerse) por 2D9. De una manera similar, las PAG presentes en muestras de sangre completa o plasma bovino en el ELISA de PAG pueden unirse por 2D9 y provocar una respuesta ELISA positiva, indicando preñez. La elución de las PAG purificadas durante el procedimiento de inmunopurificación se modificó ajustando el pH de 3,0 a 2,5 con neutralización inmediata hasta pH 7,0 durante la recogida del eluyente. La visualización de las PAG purificadas por SDS-PAGE con muestras purificadas se realizó esencialmente como se describe anteriormente (por ejemplo, Ejemplo 1). Se observaron patrones de bandas similares, con tres bandas principales entre 50 y 75 kDa.

Además de los tejidos placentarios recogidos de vacas 55 días después de la reproducción, las PAG también se

purificaron de tejidos placentarios recogidos de vacas 215 días después de la reproducción. Ciertos miembros de la

familia de proteínas PAG (isoformas) se expresan de forma más prematura en la gestación que otros. El conjunto de

PAG expresadas de forma prematura en la gestación se menciona comúnmente como PAG prematuras y el

5 conjunto de PAG expresadas posteriormente en la gestación, se menciona comúnmente como PAG tardías. Los

tejidos placentarios de 55 días después de la reproducción son representativos de una fase de gestación que

expresa PAG prematuras, mientras que los tejidos placentarios de 215 días después de la reproducción son

representativos de una fase de gestación que incluye la expresión de PAG tardías. La visualización de las PAG

purificadas por SDS-PAGE de tejidos placentarios del día 55 y el día 215 muestra las mismas tres bandas entre 50 y 10 75 kDa para ambos, sin embargo, la proporción (intensidad) de la banda de peso molecular mayor es mayor de

tejidos placentarios del día 215.

Los péptidos de muestras de PAG para tejidos placentarios tanto del día 55 como del día 215 se purificaron con una

columna de inmunoafinidad por 2D9 y se analizaron por secuenciación de péptidos por CL/EM/EM para identificar la

isoforma o isoformas de PAG presentes en las muestras. Las secuencias peptídicas se compararon con las 15 secuencias de la isoforma de PAG obtenidas de la base de datos UniProt (www.uniprot.org) enumeradas en la Tabla

4. La Tabla 5 muestra un resumen de los resultados de secuencia peptídica y su identificación como PAG correspondientes a secuencias de boPAG-16, boPAG-17 y boPAG-19 por análisis BLAST. "Carriles" y "bandas" (parte inferior, centro) mencionadas en la Tabla 5 se muestran en la FIG. 17. Se muestra un resumen de las isoformas de PAG caracterizadas en las muestras de PAG purificadas en la Tabla 6.

20 Tabla 4. Isoformas de PAG con los números de acceso a UniProt (SEQ ID NO: 51-62)

Isoforma de PAG

Número de acceso

1

Q29432

4

046492

6

046494, A5PJW4

9

046497, A4FV16

16

Q9TTV8

17

Q9TTV7, A7MBA4

19

Q9TTV5

20

Q9TTV4

21

Q9TTV3

Tabla 5. Resumen de los resultados de secuencia peptídica (incluyendo las SEQ ID NO: 63-74). "MH+" = masa a carga del péptido más agua; "Carga" = estado de carga iónica; "P(pep)" = probabilidad de secuencia peptídica; "Inicio" = aminoácido de inicio de la proteína con la que se alinea el péptido; "Final" = aminoácido de parada de la proteína con la que se alinea el péptido. 5

N.º de banda de proteína: Presente en las bandas del Carril 2 (parte inferior), Carril 3 (centro), Carril 6 (centro), Carril 7 (centro y parte inferior)

Glucoproteína 16 asociada a preñez de Bos taurus (gi75074836)

MH+

Carga Inicio Final P(pep) Secuencia peptídica

1389,65796

2 215 229 2,54E-05 REGSVVMFGGVDHRY (SEQ ID NO: 63)

1046,53052

2 361 370 6,28E-04 RLYFSVFDRG (SEQ ID NO: 64)

1770,90613

2 197 212 7,51E-06 NQGAISDPIFAFYLSK (SEQ ID NO: 65)

N.º de banda de proteína: Presente en las bandas del Carril 2 (parte inferior), Carril 3 (parte inferior), Carril 4 (parte inferior), Carril 5 (parte inferior, Carril 6 (parte inferior), Carril 7 (parte inferior)

Glucoproteína 17 asociada a preñez de Bos taurus (gi75074835)

MH+

Carga Inicio Final P(pep) Secuencia peptídica

1389,65796

2 215 229 2,54E-05 REGSWMFGGVDHRY (SEQ ID NO: 66)

1035,58337

2 138 148 1,69E-05 KGLLVYDTVRI (SEQ ID NO: 67)

1046,53052

2 361 370 6,28E-04 RLYFSVFDRG (SEQ ID NO: 68)

1771,89014

2 196 213 7,53E-07 KNEGAISEPVFAFYLSKD (SEQ ID NO: 69)

10

15

20

25

30

35

40

(continuación)

N.º de banda de proteína: Presente en las bandas del Carril 3 (centro), Carril 4 (centro), Carril 5 (centro), Carril 6 (centro)

Glucoproteína 19 asociada a preñez de Bos taurus (gi75051662)

MH+

Carga Inicio Final P(pep) Secuencia peptídica

1760,83850

3 212 229 1,00E-06 KDKQEGSVVMFGGVDHRY (SEQ ID NO: 70)

1088,53711

2 126 137 4,36E-06 KTFSITYGSGRI (SEQ ID NO: 71)

2243,06616

3 213 231 1,32E-03 DKQEGSVVMFGGVDHRYYR (SEQ ID NO: 72)

1046,53052

2 361 370 9,55E-04 RLYFSVFDRG (SEQ ID NO: 73)

1770,90613

2 196 213 6,03E-09 KNQGAISEPVFAFYLSKD (SEQ ID NO: 74)

Tabla 6. Isoformas de PAG caracterizadas en tejidos placentarios del día 55 y el día 215

Tipo de tejido del día55

Isoformas de PAG Tipo de tejido del día 215 Isoformas de PAG

carúncula

4, 6, 9, 16, 17, 21 carúncula 4, 6, 9, 17, 19, 21

cotiledón

4, 6, 9, 16, 17, 19, 21 cotiledón 4, 6, 9, 16, 17, 19, 21

carúncula/cotiledón

4, 6, 9, 17, 19 carúncula/cotiledón 4, 6, 9, 16, 17, 21

Las secuencias polipeptídicas mostradas en la Tabla 4 se alinearon usando PROTDIST v. 3.5c, por ejemplo, del paquete PHYLIP (Felsenstein, 1989). Se usó el paquete de análisis Neighbor Phylogenetic Tree de PROTDIST sobre las secuencias alineadas para generar el árbol mostrado en la FIG. 15. Las alineaciones de las PAG se muestran en la FIG. 16. Este análisis de las isoformas 1, 4, 6, 9, 16, 17, 19, 20 y 21 de PAG se realizó para visualizar la relación de las isoformas basándose en sus regiones de similitud y diferencia. De acuerdo con el análisis, las PAG 4, 6, 9, 16, 17, 19, 20 y 21 se agrupan juntas, dejando aparte PAG1.

Referencias

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Claims (1)

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