ES2622107T3 - Antagonistas anti-FGF19 humanizados y métodos de uso de los mismos - Google Patents

Abstract

Una forma humanizada de un anticuerpo anti-FGF19 murino que comprende: (i) una cadena ligera que comprende (a) secuencias de región hipervariable (HVR)-L1 que comprende la secuencia A1-A11, en donde A1-A11 es KASQDINSFLA (SEQ ID NO: 11); (b) HVR-L2 que comprende la secuencia B1-B7, en donde B1-B7 es RANRLVD (SEQ ID NO: 2), RANRLVS (SEQ ID NO: 13) o RANRLVE (SEQ ID NO: 14); y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia C1-C9, en donde C1-C9 es LQYDEFPLT (SEQ ID NO: 3); y (ii) una cadena pesada que comprende (a) la HVR-H1 que comprende la secuencia D1-D10, en donde D1-D10 es GFSLTTYGVH (SEQ ID NO: 4); (b) la HVR-H2 que comprende la secuencia E1-E17, en donde E1-E17 es GVIWPGGGTDYNAAFES (SEQ ID NO: 7); y (c) la HVR-H3 que comprende la secuencia F1-F13, en donde F1- F13 es VRKEYANLYAMDY (SEQ ID NO: 8); y (iii) una secuencia marco conservada consenso del subgrupo 1 K humano de cadena ligera y (iv) una secuencia marco conservada consenso del subgrupo III humano de cadena pesada.

Description

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DESCRIPCION

Antagonistas anti-FGF19 humanizados y metodos de uso de los mismos Campo de la invencion

La presente invencion se refiere en general a los campos de la biologia molecular. Mas espedficamente, la invencion se refiere a antagonistas de las rutas FGF19/FGFR4, y a los usos de los mismos.

Antecedentes de la invencion

La familia del factor de crecimiento de fibroblastos (FGF, fibroblast growth factor) esta compuesta de 22 polipeptidos estructuralmente relacionados que se unen con 4 tirosina quinasas receptoras (FGFR1-4) y un receptor deficiente en quinasa (FGFR5) (Eswarakumar et al (2005) Cytokine Growth Factor Rev 16, 139-149; Ornitz et al (2001) Genome Biol 2, rEvIEWS3005; Sleeman et al (2001) Gene 271, 171-182). La interaccion de los FGF con FGFR1-4 da como resultado homodimerizacion y autofosforilacion de los receptores, reclutamiento de adaptadores citosolicos tales como FRS2 e inicio de multiples rutas de senalizacion (Powers et al (2000) Endocr Relat Cancer 7, 165-197; Schlessinger, J. (2004) Science 306, 1506-1507).

Los FGF y FGFR desempenan papeles importantes en el desarrollo y reparacion de tejidos regulando la proliferacion, migration, quimiotaxis, diferenciacion, morfogenesis y angiogenesis celular (Ornitz et al (2001) Genome Biol 2, REVIEWS3005; Auguste et al (2003) Cell Tissue Res 314, 157-166; Steiling et al (2003) Curr Opin Biotechnol 14, 533-537). Varios FGF y FGFR estan asociados a la patogenesis de canceres de mama, de prostata, de cuello uterino, de estomago y de colon (Jeffers et al (2002) Expert Opin Ther Targets 6, 469-482; Mattila et al. (2001) Oncogene 20, 2791-2804; Ruohola et al. (2001) Cancer Res 61, 4229-4237; Marsh et al (1999) Oncogene 18, 1053-1060; Shimokawa et al (2003) Cancer Res 63, 6116-6120; Jang (2001) Cancer Res 61, 3541-3543; Cappellen (1999) Nat Genet 23, 18-20; Gowardhan (2005) Br J Cancer 92, 320-327).

FGF19 es un miembro de la mas distante de las siete subfamilias de los FGF. FGF19 es un ligando de alta afinidad de FGFR4 (Xie et al (1999) Cytokine 11: 729-735). FGF19 normalmente se secreta por el epitelio biliar e intestinal. FGF19 desempena un papel en la homeostasis de colesterol reprimiendo la expresion hepatica de colesterol-7-a- hidroxilasa 1 (Cyp7a1), la enzima limitante de la velocidad para sintesis de colesterol y acido biliar (Gutierrez et al (2006) Arterioscler Thromb Vasc Biol 26, 301-306; Yu et al (2000) J Biol Chem 275, 15482-15489; Holt, JA, et al. (2003) Genes Dev 17(130): 158). La expresion ectopica de FGF19 en un modelo de raton transgenico aumenta la proliferacion de hepatocitos, promueve la displasia hepatocelular y da como resultado neoplasia a los 10 meses de edad (Nicholes et al. (2002). Am J Pathol 160, 2295-2307). Se cree que el mecanismo de carcinoma hepatocelular inducido por FGF19 implica interaccion de FGFR4. El tratamiento con FGF-19 aumenta la tasa metabolica e invierte la diabetes dietetica y deficiente en leptina. Fu et al (2004) Endocrinology 145: 2594-2603. FGF19 tambien se describe, por ejemplo, en Xie et al. (1999) Cytokine 11: 729-735; Harmer et al (2004) Biochemistry 43: 629-640; Desnoyer, LR et al, Oncogene (2007): 1-13; y Lin, BC et al. (2007) J Biol Chem 282(37): 27277-84; Pai, R et al. Cancer Res (2008) 68(13): 5086-95. El documento de Desnoyers L et al (2007), Oncogene, vol.27, pp.85- 97 describe que la direction de FGF19 inhibe el crecimiento tumoral en xenoinjerto de cancer de colon y modelos de carcinoma hepatocelular transgenicos para FGF19. La expresion de FGFR4 esta ampliamente distribuida y se ha indicado en musculos esqueleticos en desarrollo, higado, pulmon, pancreas, glandula adrenal, rinon y cerebro (Kan et al. (1999) J Biol Chem 274, 15947-15952; Nicholes et al. (2002) Am J Pathol 160, 2295-2307; Ozawa et al. (1996) Brain Res Mol Brain Res 41, 279-288; Stark et al (1991) Development 113, 641-651). Se ha indicado amplfiicacion de FGFR4 en adenocarcinomas mamarios y ovaricos (Jaakkola et al (1993) Int J Cancer 54, 378-382). La mutation y el truncamiento de FGFR4 se correlacionaron con el tumor maligno y en algunos casos el pronostico de adenocarcinomas de prostata y pulmon, carcinoma de celulas escamosas de cabeza y cuello, sarcoma de tejido blando, astrocitoma y adenomas de la hipofisis (Jaakkola et al (1993) Int J Cancer 54, 378-382; Morimoto (2003) Cancer 98, 2245-2250; Qian (2004) J Clin Endocrinol Metab 89, 1904-1911; Spinola et al. (2005) J Clin Oncol 23, 7307-7311; Streit et al (2004) Int J Cancer 111, 213-217; Wang (1994) Mol Cell Biol 14, 181-188; Yamada (2002) Neurol Res 24, 244-248).

Resulta evidente que continua existiendo una necesidad de agentes que tengan atributos clinicos que sean optimos para el desarrollo como agentes terapeuticos. La invencion descrita en el presente documento cumple esta necesidad y proporciona otros beneficios.

Sumario de la invencion

En su sentido mas amplio, la invencion es como se define en las reivindicaciones independientes.

La invencion se basa en parte en la identification de diversos antagonistas de la ruta de FGF19/FGFR4. FGF19 se presenta como una diana terapeutica importante y ventajosa, y la invencion proporciona composiciones y metodos basados en la interferencia con la activation de FGF19/FGFR4, incluyendo pero sin limitation interferencia con la union de FGF19 con el dominio extracelular de FGFR4. Los antagonistas de la invencion, como se describe en el

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presente documento, proporcionan agentes terapeuticos y de diagnostico importantes para su uso en la direction a afecciones patologicas asociadas a la expresion y/o actividad de la ruta de FGF19-FGFR4. En consecuencia, la invention se refiere a metodos, composiciones, kits y articulos de fabrication relacionados con la modulation de la ruta de FGF19/FGFR4, incluyendo modulacion de la union de receptor de FGF19, activation y otras actividades biologicas/fisiologicas asociadas a la senalizacion de FGF19/FGFR4.

Por ejemplo, en una realization, la invencion proporciona un anticuerpo anti-FGF19 humanizado en el que la afinidad monovalente del anticuerpo como FGF19 humano (por ejemplo, afinidad del anticuerpo como un fragmento Fab por FGF19 humano) es sustancialmente igual que la afinidad monovalente de un anticuerpo murino (por ejemplo, afinidad del anticuerpo murino como un fragmento Fab por FGF19 humano) o un anticuerpo quimerico (por ejemplo, afinidad del anticuerpo quimerico como un fragmento Fab por FGF19 humano) que comprende, consiste o consiste esencialmente en una secuencia de dominio variable de cadena ligera y cadena pesada como se representa en la Fig. 8 como se define en las reivindicaciones.

Como esta bien establecido en la tecnica, la afinidad de union de un ligando con su receptor puede determinarse usando cualquiera de diversos ensayos, y puede expresarse con respecto a diversos valores cuantitativos. En consecuencia, la afinidad de union puede expresarse como valores de Kd y refleja la afinidad de union intrinseca (por ejemplo, con efectos de avidez minimizados). En general y preferentemente, la afinidad de union se mide in vitro, bien en una situation sin celulas o asociada a celulas. Como se describe en mas detalle en el presente documento, el factor de diferencia en la afinidad de union puede cuantificarse con respecto a la relation del valor de afinidad de union monovalente de un anticuerpo humanizado (por ejemplo, en forma de Fab) y el valor de afinidad de union monovalente de un anticuerpo de referencia/comparador (por ejemplo, en forma de Fab) (por ejemplo, un anticuerpo murino que tiene secuencias de region hipervariable donadoras), en el que los valores de afinidad de union se determinan en condiciones de ensayo similares. Por lo tanto, en un ejemplo, el factor de diferencia en la afinidad de union se determina como la relacion de los valores de Kd del anticuerpo humanizado en forma de Fab y dicho anticuerpo de Fab de referencia/comparador. Por ejemplo, si un anticuerpo de la invencion (A) tiene una afinidad que es “3 veces menor” que la afinidad de un anticuerpo de referencia (M), entonces si el valor de Kd para A es 3x, el valor de Kd de M seria 1x y la relacion de Kd de A con respecto a Kd de M seria 3:1. Por el contrario, en un ejemplo, si un anticuerpo de la invencion (C) tiene una afinidad que es “3 veces mayor” que la afinidad de un anticuerpo de referencia (R), entonces si el valor Kd para C es 1x, el valor Kd de R seria 3x, y la relacion de Kd de C con respecto a Kd de R seria 1:3. Puede usarse cualquiera de varios ensayos conocidos en la tecnica, incluyendo los descritos en el presente documento, para obtener mediciones de afinidad de union, incluyendo por ejemplo, Biacore, radioinmunoensayo (RIA) y ELISA.

En una realizacion, HVR-L2 de un anticuerpo de la invencion comprende la secuencia de SEQ ID NO: 2. HVR-L3 de un anticuerpo de la invencion comprende la secuencia de SEQ ID NO: 3. HVR-H1 de un anticuerpo de la invencion comprende la secuencia de SEQ ID NO: 4. HVR-H2 comprende GVIWPGGGTDYNAAFIS (SEQ ID NO: 7). HVR-H3 comprende VRKLEYANLYAMDY (SEQ ID NO: 8). HVR-LI comprende KASQDINSFLA (SEQ ID NO: 11). En una realizacion, HVR-L2 comprende RANRLVS (SEQ ID NO: 13). En una realizacion, HVR-L2 comprende RaNRLVE (SEQ ID NO: 14). Un anticuerpo de la invencion que comprende estas secuencias (en combination como se describe en el presente documento) esta humanizado. Estos anticuerpos son distintos de (es decir no son) un anticuerpo descrito en el documento US2007248604.

En un aspecto, la invencion proporciona un anticuerpo que comprende seis HVR, en el que cada HVR comprende, consiste o consiste esencialmente en una secuencia en la que SEQ ID NO: 11 corresponde a un HVR-L1, SEQ ID NO: 2, 13, y 14 corresponden a un HVR-L2, SEQ ID NO: 3 corresponde a un HVR-L3, SEQ ID NO: 4 corresponde a un HVR-H1, SEQ ID NO: 7 corresponde a un HVR-H2 y SEQ ID NO: 8, corresponde a un HVR-H3.

Estos anticuerpos comprenden ademas una secuencia consenso de marco conservado de cadena pesada de subgrupo III humana y secuencia consenso de marco conservado de cadena ligera k1 humana.

Un agente terapeutico para su uso en un sujeto hospedador preferentemente induce de poca a ninguna respuesta inmunogenica contra el agente en dicho sujeto. En una realizacion, la invencion proporciona dicho agente. Por ejemplo, en una realizacion, la invencion proporciona un anticuerpo humanizado que induce y/o se espera que induzca una respuesta de anticuerpo humano anti-raton (HAMA) a un nivel sustancialmente reducido en comparacion con un anticuerpo que comprende las regiones variables de cadena pesada y ligera mostradas en la Fig. 8 en un sujeto hospedador. En otro ejemplo, la invencion proporciona un anticuerpo humanizado que induce y/o se espera que induzca una respuesta de anticuerpo humano anti-raton minima o ninguna respuesta de anticuerpo humano anti-raton (HAMA). En un ejemplo, un anticuerpo de la invencion induce respuesta de anticuerpo anti-raton que es igual o menor que un nivel clinicamente aceptable.

Como se conoce en la tecnica, y como se describe en mas detalle en el presente documento posteriormente, la position de aminoacido/limite que delinea una region hipervariable de un anticuerpo puede variar, dependiendo del contexto y las diversas definiciones conocidas en la tecnica (como se describe posteriormente). Algunas posiciones dentro de un dominio variable pueden verse como posicionales hipervariables hibridas porque puede considerarse que estas posiciones estan dentro de una region hipervariable segun un conjunto de criterios mientras que se

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considera que estan fuera de una region hipervariable segun un conjunto de criterios diferente. Tambien pueden encontrarse una o mas de estas posiciones en regiones hipervariables extendidas (como se define adicionalmente posteriormente). La divulgacion proporciona anticuerpos que comprenden modificaciones en estas posiciones hipervariables hibridas.

Un anticuerpo de la divulgacion puede comprender cualquier secuencia de marco conservado de cadena ligera consenso humana o humana adecuada, siempre que el anticuerpo muestre las caracteristicas biologicas deseadas (por ejemplo, una afinidad de union deseada). En algunas realizaciones, una o mas (tales como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o mas) modificaciones adicionales estan presentes dentro de las secuencias de region no hipervariable humanas y/o de consenso humanas. Un anticuerpo de la invencion comprende al menos una parte (o toda) de la secuencia de marco conservado de la cadena ligera k humana, en particular, secuencia consenso de marco conservado del subgrupo I k humana. Los anticuerpos de la invencion comprenden una secuencia consenso de marco conservado de cadena pesada de subgrupo III humana. En un ejemplo de estos anticuerpos, la secuencia consenso de marco conservado comprende sustitucion en la posicion 71, 73 y/o 78. En algunos ejemplos, de estos anticuerpos, la posicion 71 es A, 73 es T y/o 78 es A. En un ejemplo, un anticuerpo comprende un dominio variable de cadena pesada y/o ligera que comprende secuencia de marco conservado representada en la Figura 1 y/o Figura 2, siempre que la posicion 49 en la cadena pesada no sea G y/o la posicion 93 en la cadena pesada no sea V y/o la posicion 94 en la cadena pesada no sea R.

Algunas realizaciones de anticuerpos de la divulgacion comprenden un dominio variable de cadena ligera del anticuerpo 4D5 humanizado (huMAb4D5-8) (HERCEPTIN®, Genentech, Inc., South San Francisco, CA, Estados Unidos) (tambien referido en la Patente de Estados Unidos N.° 6.407.213 y Lee et al., J. Mol. Biol. (2004), 340(5): 1073-93) como se representa en SEQ ID NO: 14 a continuacion.

1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gin Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu He Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu He Lys 107 (sEq ID NO: 14) (los restos de HVR estan subrayados)

En una realization, la secuencia de dominio variable de cadena ligera de huMAb4D5-8 esta modificada en una o mas de las posiciones 30, 66 y 91 (Asn, Arg y His como se indica en negrita/cursiva anterior, respectivamente). En una realizacion, la secuencia de huMAb4D5-8 modificada comprende Ser en la posicion 30, Gly en la posicion 66 y/o Ser en la posicion 91. En consecuencia, en una realizacion, un anticuerpo de la invencion comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia representada en SEQ ID NO: 15 a continuacion:

1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gin Asp Val Ser Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 107 (SeQ ID NO: 15) (los restos de HVR estan subrayados)

Los restos sustituidos con respecto a huMAb4D5-8 estan indicados en negrita/cursiva anteriormente.

En un aspecto, un anticuerpo de la invencion es un anticuerpo anti-FGF19 humanizado que inhibe la union de FGF19 humano con FGFR4 sustancialmente igual que un anticuerpo de referencia (tal como un anticuerpo anti- FGF19 quimerico o un anticuerpo anti-FGF19 murino) que comprende una secuencia variable de cadena ligera y cadena pesada como se representa en la Fig. 8. Puede realizarse comparacion de las capacidades para inhibir la union de FGF19 con su receptor segun diversos metodos conocidos en la tecnica, incluyendo como se describe en los Ejemplos posteriores. En una realizacion, se determinan los valores de CI50 a traves de un intervalo de concentration de anticuerpos de aproximadamente 0,01 nM a aproximadamente 1000 nM.

En un aspecto, un anticuerpo de la invencion es un anticuerpo anti-FGF 19 humanizado que inhibe la activation del receptor FGFR4 humano sustancialmente igual que un anticuerpo de referencia (tal como un anticuerpo anti-FGF 19 quimerico o un anticuerpo anti-FGF19 murino) que comprende una secuencia variable de cadena ligera y cadena pesada como se representa en la Fig. 8. La comparacion de las capacidades para inhibir la activacion del receptor puede realizarse de acuerdo con diversos metodos conocidos en la tecnica, incluyendo como se describe en los Ejemplos posteriores. En una realizacion, los valores de CI50 se determinan a lo largo de un intervalo de concentraciones de anticuerpo de aproximadamente 0,1 nM a aproximadamente 100 nM.

En una realizacion, tanto el anticuerpo humanizado como el anticuerpo quimerico son monovalentes. En una realizacion, el anticuerpo quimerico de referencia comprende secuencias de dominio variable representadas en la Fig. 8 ligadas a una region Fc humana. En una realizacion, la region Fc humana es la de una IgG (por ejemplo, IgG1,2, 3 o 4).

Los anticuerpos de la invencion pueden modular uno o mas aspectos de efectos asociados a FGF 19 y FGFR4,

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incluyendo pero sin limitation union a FGF19, activation de FGFR4, senalizacion molecular corriente abajo de FGFR4, alteration de la union de FGFR4 con FGF19, multimerizacion de FGFR4, expresion de un gen de CYP7aI, fosforilacion de FGFR4, MAPK, FRS2 y/o ERK2, activacion de p-catenina, migration celular promovida por FGF18, y/o alteracion de cualquier ruta biologica de FGF19 y/o FGFR4 biologicamente relevante y/o tratamiento y/o prevention de un tumor, trastorno proliferativo celular o un cancer; y/o tratamiento o prevention de un trastorno asociado a la expresion y/o actividad de FGF19 (tal como expresion y/o actividad de FGF19 aumentada).

En algunas realizaciones, el anticuerpo de la invention se une especificamente con FGF19. En algunas realizaciones, el anticuerpo se une especificamente con FGF19 con una Kd de aproximadamente 120 pM o mas fuerte. En algunas realizaciones, el anticuerpo se une especificamente con FGF19 con una Kd de aproximadamente 140 pM o mas fuerte. En algunas realizaciones, el anticuerpo bloquea la union de FGF19 con FGFR4, con una CI50 de aproximadamente 4 nM.

En un aspecto, la invencion proporciona un anticuerpo aislado que se une con una region de union a FGFR4 de FGF19.

En un aspecto, la invencion proporciona un anticuerpo aislado anti-FGF19 que inhibe, reduce y/o bloquea la represion inducida por FGF19 de la expresion de un gen de CYP7a1 en una celula expuesta a FGF19.

En un aspecto, la invencion proporciona un anticuerpo anti-FGF19 que inhibe, reduce y/o bloquea la fosforilacion inducida por FGF19 de FGFR4, MaPK, FRS2 y/o ErK2 en una celula expuesta a FGF19.

En un aspecto, la invencion proporciona un anticuerpo anti-FGF19 aislado que inhibe, reduce y/o bloquea la migracion celular promovida por FGF19. En algunas realizaciones, la celula es una celula tumoral. En algunas realizaciones, la celula es una celula HCT116.

En un aspecto, la invencion proporciona un anticuerpo anti-FGF19 aislado que inhibe, reduce y/o bloquea la activacion de la ruta de Wnt en una celula. En algunas realizaciones, la activacion de la ruta de Wnt comprende uno o mas de inmunorreactividad de p-catenina, fosforilacion de tirosina de p-catenina, expresion de genes diana de Wnt, mutation de p-catenina y union de E-cadherina con p-catenina. Se conoce en la tecnica la detection de la activacion de la ruta de Wnt, y se describen y ejemplifican en el presunto documento algunos ejemplos.

En una realization, un anticuerpo de la divulgation se une especificamente con FGF19 de una primera especie animal y no se une especificamente con FGF9 de una segunda especie animal. En una realizacion, la primera especie animal es ser humano y/o primate (por ejemplo, mono cynomolgus), y la segunda especie animal es murina (por ejemplo, raton) y/o canina. En una realizacion, la primera especie animal es ser humano. En una realizacion, la primera especie animal es primate, por ejemplo, mono cynolmogus. En una realizacion, la segunda especie animal es murina, por ejemplo raton. En una realizacion, la segunda especie es canina.

El anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. El anticuerpo es un anticuerpo humanizado. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, o scFv.

En un aspecto, la divulgacion proporciona un anticuerpo que compite con cualquiera de los anticuerpos anteriormente mencionados por la union con FGF19 (es decir, bloquea la union con FGF19 de cualquiera de los anticuerpos anteriormente mencionados). En un aspecto, la divulgacion proporciona un anticuerpo que se une con el mismo epitopo en FGF19 que cualquiera de los anticuerpos anteriormente mencionados.

En otras realizaciones, los anticuerpos de la divulgacion comprenden ademas cambios en los restos de aminoacidos en la region de Fc que conducen a funcion efectora mejorada incluyendo funcion CDC y/o ADCC potenciada y destruction de linfocitos B. Otros anticuerpos de la divulgacion incluyen los que tienen cambios especificos que mejoran la estabilidad. En otras realizaciones, los anticuerpos de la invencion comprenden cambios en restos de aminoacidos en la region Fc que conducen a funcion efectora reducida, por ejemplo funcion CDC y/o ADCC reducida y/o destruccion de linfocitos B reducida. En algunas realizaciones, los anticuerpos de la divulgacion se caracterizan por union reducida (tal como ausencia de union) con factor de complemento humano C1q y/o receptor de Fe humano en linfocitos citoliticos naturales (NK). En algunas realizaciones, los anticuerpos de la divulgacion se caracterizan por union reducida (tal como la ausencia de union) con FcyRI, FcRI, FcRIlA y/o FcyRIIIA humano. En algunas realizaciones, los anticuerpos de la divulgacion son de la clase IgG (por ejemplo, IgG 1 o IgG4) y comprenden al menos una mutacion en E233, L234, L235, G236, D265, D270, n297, E3l8, K320, K322, A327, A330, P331 y/o P329 (numeration de acuerdo con el indice de EU). En algunas realizaciones, los anticuerpos comprenden la mutacion L234A/L235A o D265A/N297A.

En un aspecto, la divulgacion proporciona polipeptidos anti-FGF19 que comprenden cualquiera de las secuencias de union a antigeno proporcionadas en el presente documento, en los que los polipeptidos anti-FGF19 se unen especificamente con FGF19.

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En un aspecto, la divulgacion proporciona un inmunoconjugado (denominado indistintamente “conjugado farmacologico de anticuerpo” o “ADC") que comprende cualquiera de los anticuerpos anti-FGF19 desvelados en el presente documento conjugado con un agente, tal como un farmaco.

En un aspecto, la invencion proporciona composiciones que comprenden uno o mas anticuerpos de la invencion y un vehiculo. En una realizacion, el vehnculo es farmaceuticamente aceptable.

En otro aspecto, la invencion proporciona una composicion que comprende uno o mas anticuerpos anti-FGF19 descritos en el presente documento, y un vehiculo. Esta composicion puede comprender ademas un segundo medicamento, en el que el anticuerpo es un primer medicamento. Este segundo medicamento, para tratamiento del cancer, por ejemplo, puede ser otro anticuerpo, agente quimioterapeutico, agente citotoxico, agente anti- angiogenico, agente inmunosupresor, profarmaco, citocina, antagonista de citocina, radioterapia citotoxica, corticosteroide, vacuna de cancer anti-emetica, analgesico, agente anti-vascular o agente inhibidor del crecimiento. En otra realizacion, se administra un segundo medicamento a un sujeto en una cantidad eficaz, en el que el anticuerpo es un primer medicamento. Este segundo medicamento es mas de un medicamento, y es preferentemente otro anticuerpo, agente quimioterapeutico, agente citotoxico, agente anti-angiogenico, agente inmunosupresor, profarmaco, citocina, antagonista de citocina, radioterapia citotoxica, corticosteroide, anti-emetico, vacuna de cancer, analgesico, agente anti-vascular o agente inhibidor del crecimiento. Los agentes mas especificos incluyen, por ejemplo, irinotecan (CAMPTOSAR®), cetuximab (ERBITUX®), fulvestrant (FASLODEX®), vinorelbina (NAVELBINE®), antagonistas de receptor de EFG tales como erlotinib (TARCEVA®) antagonistas de VEGF tales como bevacizumab (AVASTIN®), vincristina (ONCOVIN®), inhibidores de mTor (una proteina serina/treonina quinasa) tal como rapamicina y CCI-779, y antagonistas anti-HER1, HER2, ErbB y/o EGFR tales como trastuzumab (HERCEPTIN®), pertuzumab (OMNITARG™) o lapatinib, y otros agentes citotoxicos incluyendo agentes quimioterapeuticos. En algunas realizaciones, el segundo medicamento es un farmaco anti-estrogeno tal como tamoxifeno, fulvestrant o un inhibidor de aromatasa, un antagonista del valor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) o de ErbB o el receptor de Efb, o Her-1 o Her-2. En algunas realizaciones, el segundo medicamento es tamoxifeno, letrozol, exemestano, anastrozol, irinotecan, cetuximab, fulvestrant, vinorelbina, erlotinib, bevacizumab, vincristina, imatinib, sorafenib, lapatinib o trastuzumab, y preferentemente, el segundo medicamento es erlotinib, bevacizumab o trastuzumab.

En un aspecto, la divulgacion proporciona un anticuerpo anti-idiotipico que se une especificamente con un anticuerpo anti-FGF19 de la invencion.

En un aspecto, la invencion proporciona acidos nucleicos que codifican un anticuerpo anti-FGF19 de la invencion.

En un aspecto, la invencion proporciona vectores que comprenden un acido nucleico de la invencion.

En un aspecto, la invencion proporciona composiciones que comprenden uno o mas acidos nucleicos de la invencion y un vehiculo. En una realizacion, el vehiculo es farmaceuticamente aceptable.

En un aspecto, la invencion proporciona celulas hospedadoras que comprenden un acido nucleico o un vector de la invencion. Un vector puede ser de cualquier tipo, por ejemplo, un vector recombinante tal como un vector de expresion. Puede usarse cualquiera de diversas celulas hospedadoras. En una realizacion, una celula hospedadora es una celula procariota, por ejemplo, E. coli. En una realizacion, una celula hospedadora es una celula eucariota, por ejemplo una celula de mamifero tal como celula de ovario de hamster chino (CHO).

En un aspecto, la invencion proporciona metodos para preparar un anticuerpo de la invencion. Por ejemplo, la invencion proporciona metodos para preparar un anticuerpo anti-FGF19 (que, como se define en el presente documento incluye longitud completa y fragmentos del mismo), comprendiendo dicho metodo expresar en una celula hospedadora adecuada un vector recombinante de la invencion que codifica dicho anticuerpo, y recuperar dicho anticuerpo.

En un aspecto, la divulgacion proporciona un articulo de fabricacion que comprende un recipiente; y una composicion contenida dentro del recipiente, en el que la composicion comprende uno o mas anticuerpos anti- FGF19 de la invencion. En una realizacion, la composicion comprende un acido nucleico de la invencion. En una realizacion, una composicion que comprende un anticuerpo comprende ademas un vehiculo, que en algunas realizaciones es farmaceuticamente aceptable. En una realizacion, un articulo de fabricacion comprende ademas instrucciones para administrar la composicion (por ejemplo, para el anticuerpo) a un individuo (tal como instrucciones para cualquiera de los metodos descritos en el presente documento).

En un aspecto, la divulgacion proporciona un kit que comprende un primer recipiente que comprende una composicion que comprende uno o mas anticuerpos anti-FGF19 de la invencion; y un segundo recipiente que comprende un tampon. En una realizacion, el tampon es farmaceuticamente aceptable. En una realizacion, una composicion que comprende un anticuerpo comprende ademas un vehiculo, que en algunas realizaciones es farmaceuticamente aceptable. En una realizacion, un kit comprende ademas instrucciones para administrar la composicion (por ejemplo, para el anticuerpo) a un individuo.

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En un aspecto, la invencion proporciona uso de un anticuerpo anti-FGF19 de la invencion en la preparation de un medicamento para el tratamiento terapeutico y/o profilactico de un trastorno, tal como un cancer, un tumor, y/o un trastorno proliferativo celular. En algunas realizaciones, el cancer, tumor y/o trastorno proliferativo celular es cancer colorrectal, carcinoma hepatocelular, cancer de pulmon, cancer de mama o cancer pancreatico. En algunas realizaciones, el trastorno es un trastorno de higado, tal como cirrosis. En algunas realizaciones, el trastorno es un trastorno debilitante.

En un aspecto, la divulgation proporciona uso de un acido nucleico de la invencion en la preparacion de un medicamento para el tratamiento terapeutico y/o profilactico de un trastorno, tal como un cancer, un tumor, y/o un trastorno proliferativo celular. En algunas realizaciones, el cancer, un tumor y/o un trastorno proliferativo celular es cancer colorrectal, carcinoma hepatocelular, cancer de pulmon, cancer de mama o cancer pancreatico. En algunas realizaciones, el trastorno es un trastorno de higado, tal como cirrosis. En algunas realizaciones, el trastorno es un trastorno debilitante.

En un aspecto, la divulgacion proporciona uso de un vector de expresion de la invencion en la preparacion de un medicamento para el tratamiento terapeutico y/o profilactico de un trastorno, tal como un cancer, un tumor, y/o un trastorno proliferativo celular. En algunas realizaciones, el cancer, un tumor y/o trastorno proliferativo celular es cancer colorrectal, carcinoma hepatocelular, cancer de pulmon, cancer de mama o cancer pancreatico. En algunas realizaciones, el trastorno es un trastorno de higado, tal como cirrosis. En algunas realizaciones, el trastorno es un trastorno debilitante.

En un aspecto, la divulgacion proporciona uso de una celula hospedadora de la invencion en la preparacion de un medicamento para el tratamiento terapeutico y/o profilactico de un trastorno, tal como un cancer, un tumor, y/o un trastorno proliferativo celular. En algunas realizaciones, el cancer, un tumor y/o trastorno proliferativo celular es cancer colorrectal, carcinoma hepatocelular, cancer de pulmon, cancer de mama o cancer pancreatico. En algunas realizaciones, el trastorno es un trastorno de higado, tal como cirrosis. En algunas realizaciones, el trastorno es un trastorno debilitante.

En un aspecto, la divulgacion proporciona uso de un articulo de fabrication de la invencion en la preparacion de un medicamento para el tratamiento terapeutico y/o profilactico de un trastorno, tal como un cancer, un tumor, y/o un trastorno proliferativo celular. En algunas realizaciones, el cancer, un tumor y/o trastorno proliferativo celular es cancer colorrectal, carcinoma hepatocelular, cancer de pulmon, cancer de mama o cancer pancreatico. En algunas realizaciones, el trastorno es un trastorno de higado, tal como cirrosis. En algunas realizaciones, el trastorno es un trastorno debilitante.

En un aspecto, la divulgacion proporciona uso de un kit de la invencion en la preparacion de un medicamento para el tratamiento terapeutico y/o profilactico de un trastorno, tal como un cancer, un tumor, y/o un trastorno proliferativo celular. En algunas realizaciones, el cancer, un tumor y/o trastorno proliferativo celular es cancer colorrectal, carcinoma hepatocelular, cancer de pulmon, cancer de mama o cancer pancreatico. En algunas realizaciones, el trastorno es un trastorno de higado, tal como cirrosis. En algunas realizaciones, el trastorno es un trastorno debilitante.

La invencion proporciona composiciones utiles para modular una enfermedad asociada a la desregulacion del eje de senalizacion de FGF19/FGFR4 (tal como modulation de patologias asociadas a la expresion y/o actividad de FGF19 y/o FGFR4), comprendiendo dichos metodos la administration de una dosis eficaz de un anticuerpo anti-FGF19 a un individuo que necesite dicho tratamiento.

En un aspecto, la divulgacion proporciona metodos para destruir una celula (tal como una celula cancerosa o tumoral), comprendiendo los metodos administrar una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-FGF19 a un individuo que necesite dicho tratamiento.

En un aspecto, la invencion proporciona anticuerpos de la invencion para su uso en metodos para reducir, inhibir, bloquear o prevenir el crecimiento de un tumor o cancer, comprendiendo los metodos administrar una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-FGF19 a un individuo que necesite dicho tratamiento.

Pueden usarse metodos para afectar a cualquier estado patologico adecuado. Se describen en el presente documento trastornos a modo de ejemplo, e incluyen un cancer seleccionado del grupo que consiste en cancer esofagico, cancer de vejiga, cancer de pulmon, cancer ovarico, cancer pancreatico, fibroadenoma mamario, cancer de prostata, carcinoma de celulas escamosas de cabeza y cuello, sarcoma de tejido blando, astrocitoma, cancer de la hipofisis, cancer de mama, neuroblastomas, melanoma, carcinoma de mama, cancer gastrico, cancer colorrectal (CRC), carcinomas epiteliales, cancer de cerebro, cancer endometrial, cancer de testiculo, colangiocarcinoma, carcinoma de la vesicula biliar y carcinoma hepatocelular.

En una realization, una celula que es diana en un metodo es una celula cancerosa. Por ejemplo, una celula cancerosa puede ser una seleccionada del grupo que consiste en una celula de cancer de mama, una celula de cancer colorrectal, una celula de cancer de pulmon, una celula de carcinoma papilar, una celula de cancer de colon,

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una celula de cancer pancreatico, una celula de cancer ovarico, una celula de cancer del cuello uterino, una celula de cancer del sistema nervioso central, una celula de cancer esofagico, una celula de cancer de sarcoma osteogenico, una celula de carcinoma renal, una celula de cancer de carcinoma hepatocelular, una celula de cancer de vejiga, una celula de carcinoma gastrico, una celula de carcinoma escamoso de cabeza y cuello, una celula de melanoma, una celula de leucemia, una celula de cancer de cerebro, una celula de cancer endometrial, una celula de cancer de testiculo, una celula de colangiocarcinoma, una celula de carcinoma de la vesicula biliar, una celula de cancer de pulmon y/o una celula de cancer de prostata. En una realizacion, una celula diana en un metodo es una celula hiperproliferativa y/o hiperplasica. En una realizacion, una celula diana en un metodo es una celula displasica. En una realizacion mas, una celula diana en un metodo es una celula metastatica.

En una realizacion de la invencion, la celula diana es una celula de higado cirrotico.

Los metodos de los usos medicos de la invencion pueden comprender ademas etapas de tratamiento adicionales. Por ejemplo, en una realizacion, un metodo comprende ademas una etapa en la que una celula y/o un tejido diana (por ejemplo, para una celula cancerosa) se exponen a tratamiento por radiacion o un agente quimioterapeutico.

Breve descripcion de las figuras

FIGURA 1: representa alineamiento de secuencias de la cadena ligera variable para lo siguiente: secuencia consenso kI humana de cadena ligera (SEQ ID NO: 261), anticuerpo 1A6 murino (SEQ ID NO: 17) y el anticuerpo con injerto 1A6 (SEQ ID NO: 262). Las posiciones se enumeran de acuerdo con Kabat.

FIGURA 2: representa alineamiento de secuencias de la cadena ligera variable para lo siguiente: secuencia consenso del subgrupo III pesado variable de cadena ligera (SEQ ID NO: 263), anticuerpo 1A6 murino (SEQ ID NO: 16) y el anticuerpo con injerto 1A6 (SEQ ID NO: 264). Las posiciones se enumeran de acuerdo con Kabat. FIGURA 3A-D: representa diversas secuencias de HVR de anticuerpos madurados por afinidad seleccionados de bibliotecas con hVr seleccionados aleatoriamente de forma individual HVR-L1: SEQ ID NO: 18 y 52-86; HVR-L2 SEQ ID NO: 87-127; HVR-L3: SEQ ID NO: 128-155; HVR-H1: SEQ ID NO: 156-176; HVR-H2: SEQ ID NO: 177229; y HVR=H3: SEQ ID NO: 230-260.

FIGURAS 4A, B y 5: representan secuencias de marco conservado consenso humanas aceptoras a modo de ejemplo para su uso en la practica de la presente invencion con los siguientes identificadores de secuencia:

Marcos conservados consenso pesados variables (VH) (FIG. 4A, B)

marco conservado consenso del subgrupo I VH humano sin CDR de Kabat (SEQ ID NO: 19)

marco conservado consenso del subgrupo I VH humano sin regiones hipervariables extendidas (SEQ ID

NO: 20-22)

marco conservado consenso del subgrupo II VH humano sin CDR de Kabat (SEQ ID NO: 23)

marco conservado consenso del subgrupo II VH humano sin regiones hipervariables extendidas (SEQ ID

NO: 24-26)

marco conservado consenso del subgrupo III de VH humano sin CDR de Kabat (SEQ ID NO: 27) marco conservado consenso del subgrupo III de VH humano sin regiones hipervariables extendidas (SEQ ID NO: 28-30)

marco conservado aceptor VH humano sin CDR de Kabat (SEQ ID NO: 31)

marco conservado aceptor VH humano sin regiones hipervariables extendidas (SEQ ID NO: 32-33)

marco conservado 2 aceptor VH humano sin CDR de Kabat (SEQ ID NO: 34)

marco conservado 2 aceptor VH humano sin regiones hipervariables extendidas (SEQ ID NO: 35-37)

Marcos conservados consenso ligeros variables (VH) (FIG. 5)

marco conservado consenso del subgrupo I kappa VL humano (SEQ ID NO: 38) marco conservado consenso del subgrupo II kappa VL humano (SEQ ID NO: 39) marco conservado consenso del subgrupo III kappa VL humano (SEQ ID NO: 40) marco conservado consenso del subgrupo IV kappa VL humano (SEQ ID NO: 41)

FIGURA 6: representa secuencias de region marco de cadenas ligeras y pesadas de huMAb4D5-8. Los numeros en superindice/negrita indican posiciones de aminoacidos de acuerdo con Kabat.

FIGURA 7: representa secuencias de region marco variantes/modificadas de cadenas ligeras y pesadas de huMAb4D5-8. Los numeros en superindice/negrita indican posiciones de aminoacidos de acuerdo con Kabat. FIGURA 8: representa secuencias de dominio variable de cadena ligera (LC) y cadena pesada (HC) donadoras (anticuerpo murino 1A6).

FiGURA 9: el anticuerpo anti-FGF18 humano 1A6.v1 (“h1A6”) y el anticuerpo anti-FGF19 quimerico 1A6 (“ch1A6”) demostraron actividad de bloqueo similar. En un ensayo de union a receptor de fase solida, hu1A6 y ch1A6 bloquearon la interaccion de FGF19 con FGFR4 con la misma eficacia (CI50 = 4,5 nM).

FIGURA 10: analisis de transferencia de Western de la expresion de FGF19 en higado humano y de cynomolgus. (A) Anticuerpo anti-FGF19 humanizado 1A6.v1 (“huIA6”) unido a FGF19 humano y de cynomolgus. (B) Anticuerpo anti-FGF19 humanizado 1A6.v1 reconocio proteinas huFGF19 recombinante, cynoFGF19

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recombinante y cynoFGF19 aisladas del higado.

FIGURA 11: tratamiento con anticuerpo anti-FGF19 humanizado 1A6.v1 inhibio la fosforilacion de FGFR4, FRS2 y ERK in vitro. La fosforilacion de FGFR4, FRS2 y ERK se inhibio en celulas de tumor de colon HCT116 tratadas con anticuerpo anti-FGF19 humanizado 1A6.v1.

FIGURA 12: el tratamiento con anticuerpo anti-FGF19 humanizado 1A6.v1 inhibio el crecimiento de la linea celular de tumor de colon in vivo. (A) El crecimiento de xenoinjertos de tumor de colon HCT116 se inhibio significativamente por el tratamiento con 30 mg/kg de 1A6.v1 en comparacion con el anticuerpo de control (p = 0,042). Se observo una inhibicion de 44 % de crecimiento tumoral cuando los animales se trataron con 30 mg/kg de 1A6.v1. (B) Se inhibio la fosforilacion de FGFR4, FRS2 y ERK en tumores de xenoinjertos HCT116 tratados con anticuerpo anti-FGF19 humanizado 1A6.v1.

Descripcion detallada de la invencion

La invencion en su sentido mas amplio es como se define en las reivindicaciones independientes.

La invencion se refiere a metodos, composiciones, kits y articulos de fabricacion para identificar y/o usar inhibidores de la ruta de senalizacion de FGF19/FGFR4.

Se proporciona en el presente documento detalles de estos metodos, composiciones, kits y articulos de fabricacion. Tecnicas generales

Las tecnicas y procedimientos descritos o a los que se hace referencia en el presente documento se entienden bien en general y se emplean habitualmente usando metodologia convencional por los expertos en la materia, tal como, por ejemplo, las metodologias ampliamente utilizadas descritas en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3a edicion (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel, et al. eds., (2003)); la serie METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.): PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M. J. MacPherson, B. D. Hames y G. R. Taylor eds. (1995)), Harlow y Lane, eds. (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, y ANIMAL CELL CULTURE (R. I. Freshney, ed. (1987)).

Definiciones

Un anticuerpo “aislado” es uno que se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de su ambiente natural. Son componentes contaminantes de su ambiente natural materiales que interferirian con los usos de diagnostico y terapeuticos para el anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteicos o no proteicos. En realizaciones preferidas, el anticuerpo se purificara (1) a mas del 95 % en peso del anticuerpo como se determina por el metodo de Lowry, y mas preferentemente mas del 99 % en peso, (2) en un grado suficiente para obtener al menos 15 restos de secuencias de aminoacidos internas o N terminales mediante el uso de un secuenciador de copa giratoria, o (3) hasta homogeneidad por SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras usando azul de Coomassie o, preferentemente, tincion de plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ dentro de celulas recombinantes ya que al menos un componente del ambiente natural del anticuerpo no estara presente. Habitualmente, sin embargo, se preparara anticuerpo aislado por al menos una etapa de purificacion.

Una molecula de acido nucleico “aislada” es una molecula de acido nucleico que se identifica y separa de al menos una molecula de acido nucleico contaminante con la que se asocia habitualmente en la fuente natural del acido nucleico del anticuerpo. Una molecula de acido nucleico aislada no esta en una forma o situation en la que se encuentra la naturaleza. Las moleculas de acido nucleico aisladas se distinguen por lo tanto de la molecula de acido nucleico como existe en celulas naturales. Sin embargo, una molecula de acido nucleico aislada incluye una molecula de acido nucleico contenida en celulas que expresan habitualmente el anticuerpo en el que, por ejemplo, la molecula de acido nucleico esta en una localization cromosomica diferente de la de celulas naturales.

La expresion “anticuerpo anti-FGF19” o “un anticuerpo que se une con FGF19” se refiere a un anticuerpo que es capaz de unirse con FGF19 con suficiente afinidad de modo que el anticuerpo sea util como un agente de diagnostico y/o terapeutico en la direction a FGF19. Preferentemente, el alcance de la union de un anticuerpo anti- FGF19 con una proteina no FGF19, no relacionada, es menos de aproximadamente el 10 % de la union del anticuerpo con FGF19 como se mide, por ejemplo, mediante un radioinmunoensayo (RIA). En ciertas realizaciones, un anticuerpo que se une con FGF19 tiene una constante de disociacion (Kd) de < 1 ^M, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM o < 0,1 nM. En ciertas realizaciones, un anticuerpo anti-FGF19 se une con un epitopo de FGF19 que esta conservado entre FGF19 de diferentes especies.

La “afinidad de union” se refiere en general a la fuerza de la suma total de interacciones no covalentes entre un unico sitio de union de una molecula (por ejemplo, un anticuerpo) y su companero de union (por ejemplo, un antigeno). A no ser que se indique de otro modo, como se usa en el presente documento, “afinidad de union” se refiere a afinidad de union intrinseca que refleja una interaction 1:1 entre miembros de un par de union (por ejemplo,

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anticuerpo y antigeno). La afinidad de una molecula X por su companero Y puede representarse en general por la constante de disociacion (Kd). La afinidad puede medirse por metodos habituales conocidos en la tecnica, incluyendo los descritos en el presente documento. Los anticuerpos de baja afinidad generalmente se unen con el antigeno lentamente y tienden a disociarse facilmente, mientras que los anticuerpos de alta afinidad generalmente se unen con el antigeno mas rapido y tienden a permanecer unidos mas tiempo. Se conocen en la tecnica diversos metodos para medir la afinidad de union, cualquiera de los cuales puede usarse para fines de la presente invention. Se describen a continuation realizaciones ilustrativas especificas.

En una realization, la “Kd" o el “valor Kd" de acuerdo con la presente invencion se mide por un ensayo de union a antigeno radiomarcado (RIS) realizado con la version Fab de un anticuerpo de interes y su antigeno como se describe por el siguiente ensayo que mide la afinidad de union en solution de Fab por antigeno mediante equilibrado de Fab con una concentration minima de antigeno marcado con (125I) en presencia de una serie de valoraciones de antigeno no marcado, capturando despues el antigeno unido con una placa recubierta con anticuerpo anti-Fab (Chen, et al., (1999) J. Mol Biol 293: 865-881). Para establecer condiciones para el ensayo, las placas de microtitulacion (Dynex) se recubren durante una noche con 5 ^g/ml de un anticuerpo anti-Fab de captura (Cappel Labs) en carbonato sodico 50 mM (pH 9,6), y posteriormente se bloquean con albumina de suero bovino 2 % (p/v) en PBS durante dos a cinco horas a temperatura ambiente (aproximadamente 23 °C). En una placa no adsorbente (Nunc n.° 269620), se mezcla [125I]-antigeno 100 pM o 26 pM con diluciones en serie de un Fab de interes (por ejemplo, coherente con la evaluation de un anticuerpo anti-VEGF, Fab-12, en Presta et al., (1997) Cancer Res. 57:4593-4599). El Fab de interes se incuba despues durante una noche; sin embargo, la incubation puede continuar durante un periodo mas largo (por ejemplo, 65 horas) para asegurar que se alcanza el equilibrio. A continuacion, las mezclas se transfieren a la placa de captura para incubacion a temperatura ambiente (por ejemplo, durante una hora). Despues la solucion se retira de la placa lavada ocho veces con Tween-20 0,1 % en PBS. Cuando las placas se han secado, se anaden 150 jal/pocillo de agente de centelleo (MicroScint-20; Packard), y las placas se recuentan en un contador gamma Topcount (Packard) durante diez minutos. Las concentraciones de cada Fab que proporcionan menos de o igual a 20 % de la union maxima se eligen para su uso en ensayos de union competitiva. De acuerdo con otra realizacion la Kd o el valor Kd se mide usando ensayos de resonancia de plasmon superficial usando un BIAcore™-2000 o un BIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) a 25 °C con microplacas CM5 con antigeno inmovilizado a ~10 unidades de respuesta (UR). Brevemente, se activan microplacas biosensoras de dextrano carboximetilado (CM5, BIAcore, Inc.) con clorhidrato de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. El antigeno se diluye con acetato sodico 10 mM, pH 4,8, en 5 ag/ml (~0,2 ^M) antes de la inyeccion a un caudal de 5 al/minuto para conseguir aproximadamente 10 unidades de respuesta (UR) de la proteina acoplada. Despues de la inyeccion del antigeno se inyecta etanolamina 1 M para bloquear grupos que no han reaccionado. Para mediciones de cinetica, se inyectan diluciones en serie dobles de Fab (de 0,78 nM a 500 nM) en PBS con Tween 20 0,05 % (PBST) a 25 °C a un caudal de aproximadamente 25 al/min. Se calculan las velocidades de asociacion (kon) y velocidades de disociacion (koff) usando un modelo de union de Langmuir uno a uno sencillo (Software BIAcore Evaluation version 3.2) mediante ajuste simultaneo del sensograma de asociacion y disociacion. La constante de disociacion en equilibrio (Kd) se calcula como la relation koff/kon. Vease, por ejemplo, Chen, Y., et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881. Si la velocidad de asociacion supera 106 M-1 S-1 por el ensayo de resonancia de plasmon superficial anterior, entonces la velocidad de asociacion puede determinarse usando una tecnica de interruption de fluorescencia que mide el aumento o la reduction de la intensidad de emision de fluorescencia (excitation = 295 nm; emision = 340 nm, paso de banda 16 nm) a 25 °C de un anticuerpo anti-antigeno 20 nM (forma Fab) en PBS, pH 7,2, en presencia de concentraciones crecientes del antigeno como se mide en un espectrometro, tal como un espectrofotometro equipado con detention de flujo (Aviv Instruments) o un espectrofotometro SLM-Aminco serie 8000 (ThermoSpectronic) con una cubeta agitada.

Una “velocidad de asociacion" o “kon" de acuerdo con la presente invencion tambien puede determinarse con la misma tecnica de resonancia de plasmon superficial descrita anteriormente usando un BIAcore™-2000 o un BIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) a 25 °C con microplacas CM5 con antigeno inmovilizado a ~10 unidades de respuesta (UR). Brevemente, se activan microplacas biosensoras de dextrano carboximetiladas (CM5, BIAcore, Inc.) con clorhidrato de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. El antigeno se diluye con acetato sodico 10 mM, pH 4,8, en 5 ag/ml (~0,2 aM) antes de la inyeccion a un caudal de 5 al/minuto para conseguir aproximadamente 10 unidades de respuesta (UR) de la proteina acoplada. Despues de la inyeccion del antigeno, se inyecta etanolamina 1 M para bloquear grupos que no han reaccionado. Para mediciones cineticas, se inyectan diluciones en serie dobles de Fab (de 0,78 nM a 500 nM) en PBS con Tween 20 0,05 % (PBST) a 25 °C a un caudal de aproximadamente 25 al/min. Se calculan las velocidades de asociacion (kon) y velocidades de disociacion (koff) usando un modelo de union de Langmuir uno a uno sencillo (Software BIAcore Evaluation version 3.2) por ajuste simultaneo del sensograma de asociacion y disociacion. La constante de disociacion en equilibrio (Kd) se calculo como la relacion koff/kon. Vease, por ejemplo, Chen, Y., et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881. Sin embargo, si la velocidad de asociacion supera 106 M-1 S-1 por el ensayo de resonancia de plasmon superficial anterior, entonces la velocidad de asociacion se determina preferentemente usando una tecnica de interrupcion de fluorescencia que mide el aumento o la reduccion de la intensidad de emision de fluorescencia (excitacion = 295 nm; emision = 340 nm, paso de banda 16 nm) a 25 °C de un anticuerpo anti-antigeno 20 nM (forma Fab) en PBS, pH 7,2, en presencia de concentraciones crecientes del

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antigeno como se mide en un espectrometro, tal como un espectrofotometro equipado con detencion de flujo (Aviv Instruments) o un espectrofotometro SLM-Aminco serie 8000 (ThermoSpectronic) con una cubeta agitada.

Se entiende que el termino “vector”, como se usa en el presente documento, se refiere a una molecula de acido nucleico capaz de transportar otro acido nucleico con el que se ha unido. Un tipo de vector es un “plasmido” que se refiere a un bucle de ADN bicatenario circular en el que pueden ligarse segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector de fago. Otro tipo de vector es un vector viral, en el que pueden ligarse segmentos de ADN adicionales en el genoma viral. Ciertos vectores tienen capacidad de replicacion autonoma en una celula hospedadora en la que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen bacteriano de replicacion y vectores de mamiferos episomicos). Otros vectores (por ejemplo, vectores de mamiferos no episomicos) pueden integrarse en el genoma de una celula hospedadora tras introduction en la celula hospedadora, y de este modo se replican junto con el genoma del hospedador. Ademas, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresion de genes con los que se unen operativamente. Dichos vectores se denominan en el presente documento “vectores de expresion recombinante” (o simplemente, “vectores recombinantes”). En general, los vectores de expresion utiles en tecnicas de ADN recombinante estan con frecuencia en forma de plasmidos. En la presente memoria descriptiva, “plasmido” y “vector” pueden usarse indistintamente ya que el plasmido es la forma mas habitualmente usada de vector.

“Polinucleotido” o “acido nucleico”, como se usa indistintamente en el presente documento, se refieren a polimeros de nucleotidos de cualquier longitud, e incluyen ADN y ARN. Los nucleotidos pueden ser desoxirribonucleotidos, ribonucleotidos, nucleotidos o bases modificados, y/o sus analogos, o cualquier sustrato que pueda incorporarse en un polimero mediante ADN o ARN polimerasa, o mediante una reaction sintetica. Un polinucleotido puede comprender nucleotidos modificados, tales como nucleotidos metilados y sus analogos. Si esta presente, la modification de la estructura de nucleotidos puede proporcionarse antes o despues del ensamblaje del polimero. La secuencia de nucleotidos puede interrumpirse por componentes no nucleotidicos. Un polinucleotido puede modificarse adicionalmente despues de la sintesis, tal como por conjugation con un marcador. Otros tipos de modificaciones incluyen, por ejemplo, “recubrimientos terminales”, sustitucion de uno o mas de los nucleotidos de origen natural con un analogo, modificaciones internucleotidicas tales como, por ejemplo, los que tienen enlaces sin cargas (por ejemplo, metil fosfonatos, fosfotriesteres, fosfoamidatos, carbamatos, etc.) y con enlaces con carga (por ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), los que contienen restos colorantes, tales como, por ejemplo, proteinas (por ejemplo, nucleasas, toxinas, anticuerpos, peptidos senal, ply-L-lisina, etc.), los que tienen intercaladores (por ejemplo, acridina, psoraleno, etc.), los que contienen quelantes (por ejemplo, metales, metales radiactivos, boro, metales oxidantes, etc.), los que contienen alquilantes, los que tienen enlaces modificados (por ejemplo, acidos nucleicos alfa anomericos, etc.), asi como formas no modificadas del polinucleotido o los polinucleotidos). Ademas, cualquiera de los grupos hidroxilo habitualmente presentes en los azucares puede reemplazarse, por ejemplo, por grupos fosfonato, grupos fosfato, protegerse por grupos protectores convencionales o activarse para preparar enlaces adicionales con nucleotidos adicionales, o pueden conjugarse con soportes solidos o semi-solidos. El OH 5' y 3' terminal puede fosforilarse o sustituirse con aminas o restos de grupos de recubrimiento terminal organicos de 1 a 20 atomos de carbono. Otros hidroxilos tambien pueden derivatizarse a grupos protectores convencionales. Los polinucleotidos tambien pueden contener formas analogas de azucares ribosa o desoxirribosa que se conocen en general en la tecnica, incluyendo, por ejemplo, 2'-O-metilo, 2'-O-alilo, 2'- fluoro- o 2'-azido-ribosa, analogos de azucares carbociclicos, azucares alfa anomericos, azucares epimericos tales como arabinosa, xilosas o lixosas, azucares de piranosa, azucares de furanosa, sedoheptulosas, analogos aciclicos y analogos de nucleosidos basicos tales como metil ribosido. Uno o mas enlaces fosfodiester pueden reemplazarse por grupos de enlace alternativos. Estos grupos de enlace alternativos incluyen, pero sin limitation, realizaciones en las que el fosfato se reemplaza por P(O)S (“tioato”), P(S)S (“ditioato”), “(O)NR2 (“amidato”), P(O)R, P(O)OR', CO o CH2 (“formacetal”), en los que cada R o R' es de forma independiente H o alquilo (1-20 C) sustituido o no sustituido que contiene opcionalmente un enlace eter (-O-), arilo, alquenilo, cicloalquilo, cicloalquenilo o araldilo. No es necesario que todos los enlaces en un polinucleotido sean identicos. La description precedente se aplica a todos los polinucleotidos indicados en el presente documento, incluyendo ARN y ADN.

“Oligonucleotido”, como se usa en el presente documento, se refiere en general a polinucleotidos cortos, generalmente monocatenarios, generalmente sinteticos que son, generalmente, pero no necesariamente, de menos de aproximadamente 200 nucleotidos de longitud. Los terminos “oligonucleotido” y “polinucleotido” no son mutualmente excluyentes. La descripcion anterior para polinucleotidos es igualmente y completamente aplicable a oligonucleotidos.

El termino “FGF19” (denominado indistintamente “factor de crecimiento de fibroblastos 19”), como se usa en el presente documento, se refiere, a no ser que se indique especifica o contextualmente de otro modo, a cualquier polipeptido de FGF19 nativo o variante (bien nativo o bien sintetico). La expresion “secuencia nativa” abarca especificamente formas secretadas o truncadas de origen natural (por ejemplo, una secuencia de dominio extracelular), formas variantes de origen natural (por ejemplo, formas de corte y empalme alternativo) y variantes alelicas de origen natural. La expresion “FGF19 de tipo de silvestre” se refiere en general a un polipeptido que comprende la secuencia de aminoacidos de una proteina FGF19 de origen natural. La expresion “secuencia de FGF19 de tipo silvestre” se refiere en general a una secuencia de aminoacidos hallada en un FGF19 de origen natural.

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El termino “FGFR4” (denominado indistintamente “receptor del factor de crecimiento de Fibroblastos 4"), como se usa en el presente documento, se refiere, a no ser que se indique espedficamente o contextualmente de otro modo, a cualquier polipeptido de FGFR4 nativo o variante (bien nativo o bien sintetico). La expresion “secuencia nativa” abarca espedficamente formas truncadas o secretadas de origen natural (por ejemplo, una secuencia de dominio extracelular), formas variantes de origen natural (por ejemplo, formas de corte y empalme alternativo) y variantes alelicas de origen natural. La expresion “FGFR4 de tipo silvestre” generalmente se refiere a un polipeptido que comprende la secuencia de aminoacidos de una proteina FGFR4 de origen natural. La expresion “secuencia de FGFR4 de tipo silvestre” se refiere en general a una secuencia de aminoacidos hallada en un FGFR4 de origen natural.

Los terminos “anticuerpo” e “inmunoglobulina” se usan indistintamente en el sentido mas amplio e incluyen anticuerpos monoclonales (por ejemplo, para anticuerpos monoclonales de longitud completa o intactos), anticuerpos policlonales, anticuerpos multivalentes, anticuerpos multiespedficos (por ejemplo anticuerpos biespedficos siempre que muestren la actividad biologica deseada) y tambien pueden incluir ciertos fragmentos de anticuerpo (como se describe en mas detalle en el presente documento). Un anticuerpo puede ser humano, humanizado y/o madurado por afinidad.

El termino “variable” se refiere al hecho de que ciertas partes de los dominios variables difieren extensivamente en su secuencia entre anticuerpos y se usan en la union y especificidad de cada anticuerpo particular por su antigeno particular. Sin embargo, la variabilidad no esta distribuida de forma uniforme a lo largo de los dominios variables de anticuerpos. Se concentra en tres segmentos denominados regiones determinantes de complementariedad (HVR) o regiones hipervariables en los dominios variables tanto de cadena ligera como de cadena pesada. Las partes mas altamente conservadas de dominios variables se denominan marco conservado (FR). Los dominios variables de cadenas pesadas y ligeras nativas comprenden cada uno cuatro regiones FR, que adoptan en su mayor parte una configuracion de lamina p, conectadas por tres HVR, que forman bucles que conectan, y en algunos casos forman parte de, la estructura de lamina p. Las HVR en cada cadena se mantienen juntas en proximidad estrecha por las regiones FR y, con las HVR de la otra cadena, contribuyen a la formacion del sitio de union a antigeno de anticuerpos (vease Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edicion, National Institute of Health, Bethesda, MD (1991)). Los dominios constantes no estan implicados directamente en la union de un anticuerpo con un antigeno, pero muestran diversas funciones efectoras, tales como participacion del anticuerpo en la toxicidad celular dependiente de anticuerpo.

La digestion con papaina de anticuerpos produce dos fragmentos de union a antigeno identicos, denominados fragmentos “Fab”, cada uno con un unico sitio de union a antigeno, y un fragmento “Fc” residual, cuyo nombre refleja su capacidad para cristalizar facilmente. El tratamiento con pepsina produce un fragmento F(ab')2 que tiene dos sitios de combinacion con antigeno y aun es capaz de reticularse con el antigeno.

“Fv” es el fragmento de anticuerpo minimo que contiene un sitio de reconocimiento y union a antigeno completo. En una especie de Fv bicatenaria, esta region consiste en un dimero de un dominio variable de cadena pesada y uno de cadena ligera en asociacion no covalente, estrecha. En una especie de Fv monocatenaria, un dominio variable de cadena pesada y uno de cadena ligera pueden unirse covalentemente por un enlazador peptidico flexible de modo que las cadenas ligera y pesada pueden asociarse en una estructura “dimerica” analoga a la de una especie de Fv bicatenaria. Es en esta configuracion en la que las tres HVR de cada dominio variable interaccionan para definir un sitio de union a antigeno en la superficie del dimero VH-VL. Colectivamente, las seis HVR confieren especificidad de union a antigeno al anticuerpo. Sin embargo, incluso un unico dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende solamente tres HVR espedficas para un antigeno) tiene la capacidad de reconocer y unirse con el antigeno, aunque a una afinidad menor que el sitio de union completo.

El fragmento Fab tambien contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de una cadena pesada. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab mediante la adicion de algunos restos en el extremo carboxilo terminal del dominio CH1 de cadena pesada incluyendo una o mas cisteinas de la region bisagra del anticuerpo. Fab'-SH es la designacion del presente documento para Fab' en el que el resto o los restos de cisteina de los dominios constantes portan un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo F(ab')2 se produjeron originalmente como partes de fragmentos Fab' que tienen cisteinas bisagra entre ellos. Se conocen tambien otros acoplamientos quimicos de fragmentos de anticuerpo.

Las “cadenas ligeras” de anticuerpos (inmunoglobulinas) de cualquier especie vertebrada pueden asignarse a uno de dos tipos claramente distintos, denominados kappa (k) y lambda (T), basandose en las secuencias de aminoacidos de sus dominios constantes.

Dependiendo de la secuencia de aminoacidos de dominio constante de sus cadenas pesadas, las inmunoglobulinas pueden asignarse a diferentes clases. Existen cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de estas pueden dividirse adicionalmente en subclases (isotipos), por ejemplo, IgGi, IgG2, IgG3, IgG4, IgAi e IgA2. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan a, 8, s, y y ^, respectivamente. Las estructuras subunitarias y configuraciones

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tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobulinas se conocen bien.

Los “fragmentos de anticuerpo” comprenden solamente una parte de un anticuerpo intacto, en el que la parte conserva preferentemente al menos una, preferentemente la mayoria o todas, de las funciones normalmente asociadas a esa parte cuando esta presente en un anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales; moleculas de anticuerpo monocatenarios; y anticuerpos multiespecificos formados a partir de fragmentos de anticuerpo. En una realization, un fragmento de anticuerpo comprende un sitio de union a antigeno del anticuerpo intacto y por lo tanto conserva la capacidad de unirse con antigeno. En otra realizacion, un fragmento de anticuerpo, por ejemplo, uno que comprende la region Fc, conserva al menos una de las funciones biologicas normalmente asociadas a la region Fc cuando esta presente en un anticuerpo intacto, tal como union con FcRn, modulation de semivida del anticuerpo, funcion ADCC y union a complemento. En una realizacion, un fragmento de anticuerpo es un anticuerpo monovalente que tiene una semivida in vivo sustancialmente similar a la de un anticuerpo intacto. Por ejemplo, dicho fragmento de anticuerpo puede comprender una rama de union al antigeno ligada a una secuencia de Fc capaz de conferir estabilidad in vivo al fragmento.

La expresion “region hipervariable”, “HVR” o “HV”, cuando se usan en el presente documento se refiere a las regiones de un dominio variable de anticuerpo que son de secuencia hipervariable y/o forman bucles estructuralmente definidos. En general, los anticuerpos comprenden seis HVR: tres en el VH (H1, H2, H3) y tres en el VL (L1, L2, L3). En anticuerpos nativos, H3 y L3 presenten la mayor diversidad de las seis HVR, y se cree que H3 en particular desempena un papel unico para conferir especificidad fina a los anticuerpos. Vease, por ejemplo, Xu et al., Immunity 13: 37-45 (2000); Johnson y Wu, en Methods in Molecular Biology 248: 1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003). De hecho, los anticuerpos de camelidos de origen natural que consisten en solamente una cadena pesada son funcionales y estables en ausencia de cadena ligera. Vease, por ejemplo, Hamers-Casterman et al., Nature 363: 446-448 (1993); Sheriff et al., Nature Struct. Biol. 3: 733-736 (1996).

Se usan varias delineaciones de HVR y estan abarcadas en el presente documento. Las Regiones Determinantes de Complementariedad (CDR) de Kabat se basan en la variabilidad de secuencia y son las mas habitualmente usadas (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Chothia se refiere en su lugar a la localization de los bucles estructurales (Chothia y Lesk J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)). Las HVR de AbM representan un compromiso entre las HVR de Kabat y los bucles estructurales de Chothia, y son usadas por el software de modelos de anticuerpos AbM de Oxford Molecular. Las HVR de “contacto” se basan en un analisis de las estructuras cristalinas complejas disponibles. Los restos de cada una de estas HVR se indican a continuation.

Bucle

Kabat AbM Chothia Contacto

L1

L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36

L2

L50-L56 L50-L56 L50-L52 L46-L55

L3

L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96

H1

H31-H35B H26-H35B H26-H32 H30-H35B

(Numeracion de Kabat)

H1

H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35

(Numeration de Chothia)

H2

H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58

H3

H95-H102 H95-H102 H96-H101 H93-H101

Las HVR pueden comprender “HVR extendidas” de la siguiente manera: 4-36 o 24-34 (L1), 46-56 o 50-56 (L2) y 8997 o 89-96 (L3) en el VL y 26-35 (H1), 50-65 o 49-65 (H2) y 93-102, 94-102, o 95-102 (H3) en la VH. Los restos de dominio variable se numeran de acuerdo con Kabat et al., mencionado anteriormente, para cada una de estas definiciones.

Los restos de “marco conservado” o “FR” son los restos de dominio variable distintos de los restos de region hipervariable como se definen en el presente documento.

Las formas “humanizadas” de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son anticuerpos quimericos que contienen secuencia minima derivada de inmunoglobulina no humana. En una realizacion, un anticuerpo humanizado es una inmunoglobulina humana (anticuerpo receptor) en la que restos de una HVR del receptor se reemplazan por restos de una HVR de una especie no humana (anticuerpo donador) tal como raton, rata, conejo, o primate no humano que tiene la especificidad, afinidad y/o capacidad deseadas. En algunos casos, los restos de FR de la inmunoglobulina humana se reemplazan por los restos no humanos correspondientes. Ademas, los anticuerpos humanizados pueden comprender restos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donador. Estas modificaciones pueden realizarse para refinar adicionalmente el rendimiento del anticuerpo. En general, un anticuerpo humanizado comprendera sustancialmente todos de al menos uno, y normalmente dos, dominios variables, en los que todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a los de una inmunoglobulina no humana, y todas o sustancialmente todas las FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado opcionalmente tambien comprendera al menos

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una parte de una region constante de inmunoglobulina (Fc), normalmente la de una inmunoglobulina humana. Para mas detalles, vease, por ejemplo, Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332: 323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992). Vease tambien, por ejemplo, Vaswani y Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1: 105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23: 1035-1038 (1995); Hurle y Gross, Curr. Op. Biotech. 5: 428-433 (1994); y Patentes de Estados Unidos N.° 6.982.321 y 7.087.409.

La expresion “anticuerpo monoclonal" como se usa en el presente documento se refiere a un anticuerpo obtenido de una poblacion de anticuerpos sustancialmente homogeneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la poblacion son identicos excepto por posibles mutaciones, por ejemplo, mutaciones de origen natural, que pueden estar presentes en cantidades menores. Por lo tanto, el modificador “monoclonal" indica como el caracter del anticuerpo que no es una mezcla de anticuerpos discretos. En ciertas realizaciones, dicho anticuerpo monoclonal normalmente incluye un anticuerpo que comprende una secuencia polipeptidica que se une con una diana, en el que la secuencia polipeptidica de union a diana se obtuvo por un proceso que incluye la selection de una unica secuencia polipeptidica de union a diana de una pluralidad de secuencias polipeptidicas. Por ejemplo, el proceso de seleccion puede ser la seleccion de un clon unico de una pluralidad de clones, tal como un grupo de clones de hibridoma, clones de fagos, o clones de ADN recombinante. Deberia entenderse que una secuencia de union a diana seleccionada puede alterarse adicionalmente, por ejemplo, para mejorar la afinidad por la diana, para humanizar la secuencia de union a diana, para mejorar su production en cultivo celular, para reducir su inmunogenicidad in vivo, para crear un anticuerpo multiespetifico, etc. y que un anticuerpo que comprende la secuencia de union a diana alterada tambien es un anticuerpo monoclonal de la presente invention. A diferencia de preparaciones de anticuerpos policlonales, que normalmente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epitopos), cada anticuerpo monoclonal de una preparation de anticuerpos monoclonales se dirige contra un unico determinante en un antigeno. Ademas de su especificidad, las preparaciones de anticuerpos monoclonales son ventajosas porque normalmente no estan contaminadas por otras inmunoglobulinas.

El modificador “monoclonal" indica como el caracter del anticuerpo que se obtiene de una poblacion sustancialmente homogenea de anticuerpos, y no debe interpretarse que requiera la produccion de anticuerpo por ningun metodo particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales para usar de acuerdo con la presente invencion pueden prepararse por diversas tecnicas, incluyendo, por ejemplo, el metodo de hibridoma (por ejemplo, Kohler y Milstein, Nature, 256: 495-97 (1975); Hongo et al., Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995), Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed. 1988); Hammerling et al., en: Monoclonal Antibodies and T- Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)), metodos de ADN recombinante (vease, por ejemplo, Patente de Estados Unidos N.° 4.816.567), tecnologias de presentation en fagos (vease, por ejemplo, Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); y Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004), y tecnologias para producir anticuerpos humanos o de tipo humano en animales que tienen partes de o todos los loci o genes de inmunoglobulina humana que codifican secuencias de inmunoglobulina humana (vease, por ejemplo, documentos WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362: 255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immunol. 7:33 (1993); Patentes de Estados Unidos N.° 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; y 5.661.016; Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368: 812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996); y Lonberg y Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995).

Los anticuerpos monoclonales en el presente documento incluyen especificamente anticuerpos “quimericos" en los que una parte de la cadena pesada y/o ligera es identica u homologa de secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de la cadena o las cadenas es identico a u homologo de secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o que pertenecen a otra clase u subclase de anticuerpo, asi como fragmentos de dichos anticuerpos, siempre que muestren la actividad biologica deseada (vease, por ejemplo, Patente de Estados Unidos N.° 4.816.567; y Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855 (1984)). Los anticuerpos quimericos incluyen anticuerpos PRIMATIZED® en los que la region de union a antigeno del anticuerpo deriva de un anticuerpo producido, por ejemplo, inmunizando macacos con el antigeno de interes.

Los fragmentos de anticuerpo “Fv monocatenario" o “scFv" comprenden los dominios VH y VL de anticuerpo, en los que estos dominios estan presentes en una unica cadena polipeptidica. En general, el polipeptido de scFv comprende ademas un enlazador polipeptidico entre los dominios Vh y VL que permite que el scFv forme la estructura deseada para union a antigeno. Para una revision de scFv vease Pluckthun, en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds., Springer-Verlag, Nueva York, pp. 269-315 (1994).

Un “antigeno" es un antigeno predeterminado con el que puede unirse selectivamente un anticuerpo. El antigeno diana puede ser polipeptido, carbohidrato, acido nucleico, lipido, hapteno u otro compuesto de origen natural o sintetico. Preferentemente, el antigeno diana es un polipeptido.

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El termino “diacuerpos” se refiere a fragmentos de anticuerpos pequenos con dos sitios de union a antigeno, comprendiendo dichos fragmentos un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado con un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena polipeptidica (VH - VL). Usando un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, se obliga a los dominios a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de union a antigeno. Los diacuerpos se describen mas completamente, por ejemplo en los documentos EP 404.097; WO 93/11161; y Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993). Tambien se describen triacuerpos y tetracuerpos en Hudson et al., Nat. Med. 9: 129-134 (2003).

Un “anticuerpo humano” es uno que posee una secuencia de aminoacidos que corresponde a la de un anticuerpo producido por un ser humano y/o se ha preparado usando cualquiera de las tecnicas para preparar anticuerpos humanos como se desvela en el presente documento. Esta definicion de un anticuerpo humano excluye especificamente un anticuerpo humanizado que comprenda restos de union a antigeno no humanos. Pueden producirse anticuerpos humanos usando diversas tecnicas conocidas en este campo, incluyendo bibliotecas de presentacion en fagos. Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227: 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581 (1991). Tambien estan disponibles para la preparacion de anticuerpos monoclonales humanos metodos descritos en Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol., 147(1): 86-95 (1991). Vease tambien van Dijk y van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol., 5: 368-74 (2001). Pueden prepararse anticuerpos humanos administrando el antigeno a un animal transgenico que se ha modificado para producir dichos anticuerpos en respuesta a exposicion antigenica, pero cuyos loci endogenos se han deshabilitado, por ejemplo, xenomice inmunizados (vease, por ejemplo, Patentes de Estados Unidos N.° 6.075.181 y 6.150.584 con respecto a tecnologia XENOMOUSE™). Vease tambien, por ejemplo, Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 103: 3557-3562(2006) con respecto a anticuerpos humanos generados mediante una tecnologia de hibridoma de linfocitos B humanos.

La expresion “numeracion de restos de dominio variable como en Kabat” o “numeracion de posiciones de aminoacidos como en Kabat”, y variaciones de las mismas, se refieren al sistema de numeracion usado para dominios variables de cadena pesada o dominios variables de cadena ligera de la compilation de anticuerpos en Kabat et al., mencionado anteriormente. Usando este sistema de numeracion, la secuencia de aminoacidos lineal real puede contener menos o mas aminoacidos correspondientes a un acortamiento de, o insertion en, una FR o HVR del dominio variable. Por ejemplo, un dominio variable de cadena pesada puede incluir un inserto de un unico aminoacido (resto 52a de acuerdo con Kabat) despues del resto 52 de H2 y restos insertados (por ejemplo restos 82a, 82b y 82c, etc. de acuerdo con Kabat) despues del resto 82 de FR de cadena pesada. La numeracion de Kabat de restos puede determinarse para un anticuerpo dado por alineamiento en regiones de homologia de la secuencia del anticuerpo con una secuencia de numeracion de Kabat “convencional”.

El sistema de numeracion de Kabat se usa en general cuando se hace referencia a un resto en el dominio variable (aproximadamente los restos 1-107 de la cadena ligera y los restos 1-113 de la cadena pesada) (por ejemplo, Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). El “sistema de numeracion de EU” o “indice EU” se usa en general cuando se hace referencia a un resto en una region constante de cadena pesada de inmunoglobulina (por ejemplo, el indice EU presentado en Kabat et al., mencionado anteriormente). El “indice EU como en Kabat” se refiere a la numeracion de restos del anticuerpo IgG1 humano EU. A no ser que se indique de otro modo en el presente documento, las referencias a numeros de restos en el dominio variable de anticuerpos significan numeracion de restos por el sistema de numeracion de Kabat. A no ser que se indique de otro modo en el presente documento, las referencias a numeros de restos en dominio constante de anticuerpos significa la numeracion de restos por el sistema de numeracion EU (por ejemplo, vease Solicitud Provisional de Estados Unidos N.° 60/640.323, Figuras para numeracion de EU).

Un anticuerpo “de afinidad madurada” es uno con una o mas alteraciones en una o mas HVR del mismo que dan como resultado una mejora de la afinidad del anticuerpo por el antigeno, en comparacion con un anticuerpo parental que no posee esa alteration o esas alteraciones. En una realization, un anticuerpo con afinidad madurada tiene afinidades nanomolares o incluso picomolares por el antigeno diana. Pueden producirse anticuerpos de afinidad madurada usando ciertos procedimientos conocidos en la tecnica. Por ejemplo, Marks et al. Bio/Technology 10: 779783 (1992) describe maduracion de afinidad por redistribution de dominios VH y VL. Se describe la mutagenesis aleatoria de HVR y/o restos de marco conservado, por ejemplo, en Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci. USA 91: 38093813 (1994); Schier et al. Gene 169: 147-155 (1995); Yelton et al. J. Immunol. 155: 1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154(7): 3310-9 (1995); y Hawkins et al, J. Mol. Biol. 226: 889-896 (1992).

Un anticuerpo “de bloqueo” o un anticuerpo “antagonista” es uno que inhibe o reduce la actividad biologica del antigeno con el que se une. Ciertos anticuerpos de bloqueo o anticuerpos antagonistas sustancialmente o completamente inhiben la actividad biologica del antigeno.

Un “anticuerpo agonista” como se usa en el presente documento, es un anticuerpo que imita parcial o completamente al menos una de las actividades funcionales de un polipeptido de interes.

La expresion “sustancialmente similar” o “sustancialmente igual”, como se usa en el presente documento, indica un

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grado de similitud suficientemente alto entre dos valores numericos (por ejemplo, uno asociado a un anticuerpo de la invention y el otro asociado a un anticuerpo de referencia/comparador), de modo que un experto en la materia consideraria que la diferencia entre los dos valores es de poca o ninguna signification biologica y/o estadistica dentro del contexto de la caracteristica biologica medida por dichos valores (por ejemplo, valores Kd). La diferencia entre dichos dos valores es, por ejemplo, menor de aproximadamente 50 %, menor de aproximadamente 40 %, menor de aproximadamente 30 %, menor de aproximadamente 20 % y/o menor de aproximadamente 10 % en funcion del valor de referencia/comparador.

La expresion “sustancialmente reducido” o “sustancialmente diferente”, como se usa en el presente documento, indica un grado suficientemente alto de diferencia entre dos valores numericos (generalmente uno asociado a una molecula y el otro asociado a una molecula de referencia/comparadora) de modo que un experto habitual en la materia consideraria que la diferencia entre los dos valores es estadisticamente significativa dentro del contexto de la caracteristica biologica medida por dichos valores (por ejemplo, valores Kd). La diferencia entre dichos dos valores es, por ejemplo, mayor de aproximadamente 10 %, mayor de aproximadamente 20 %, mayor de aproximadamente 30 %, mayor de aproximadamente 40 %, y/o mayor de aproximadamente 50 % en funcion del valor para la molecula de referencia/comparadora.

Las “funciones efectoras” del anticuerpo se refieren a las actividades biologicas atribuibles a la region Fc (una region Fc de secuencia nativa o una region Fc variante de secuencia de aminoacidos) de un anticuerpo, y varian con el isotipo del anticuerpo. Los ejemplos de funciones efectoras de anticuerpos incluyen: union con C1q y citotoxicidad dependiente de complemento (CDC); union a receptor de Fc; citotoxicidad mediada por celulas dependientes de anticuerpo (ADCC); fagocitosis; regulation negativa de receptores de superficie celular (por ejemplo receptores de linfocitos B); y activation de linfocitos B.

La expresion “region Fc” en el presente documento se usa para definir una region C terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina, incluyendo regiones Fc de secuencia nativa y regiones Fc variantes. Aunque los limites de la region Fc de una cadena pesada de inmunoglobulina podrian variar, habitualmente se define que la region Fc de cadena pesada de IgG humana abarca desde un resto de aminoacido en la position Cys226, o desde Pro230, al extremo carboxilo de la misma. La lisina C terminal (resto 447 de acuerdo con el sistema de numeration de EU) de la region Fc puede retirarse, por ejemplo, durante la production o purification del anticuerpo, o modificando tecnicamente de forma recombinante el acido nucleico que codifica una cadena pesada del anticuerpo. En consecuencia, una composition de anticuerpos intactos puede comprender poblaciones de anticuerpos con todos los restos K447 retirados, poblaciones de anticuerpos sin restos K447 retirados y poblaciones de anticuerpos que tienen una mezcla de anticuerpos con y sin el resto K447.

Una “region Fc funcional” posee una “funcion efectora” de una region Fc de secuencia nativa. Las “funciones efectoras” a modo de ejemplo incluyen union con C1q; CDC; union a receptor de Fc; ADCC; fagocitosis; regulacion negativa de receptores de superficie celular (por ejemplo, receptor de linfocitos B; BCR), etc. Dichas funciones efectoras generalmente requieren que la region Fc se combine con un dominio de union (por ejemplo, un dominio variable de anticuerpo) y pueden evaluarse usando diversos ensayos segun se desvela, por ejemplo, en las definiciones del presente documento.

Una “region Fc de secuencia nativa” comprende una secuencia de aminoacidos identica a la secuencia de aminoacidos de una region Fc hallada en la naturaleza. Las regiones Fc humanas de secuencia nativa incluyen una region Fc IgG1 humana de secuencia nativa (alotipos no A y A); region Fc IgG2 humana de secuencia nativa; region Fc IgG3 humana de secuencia nativa; y region Fc IgG4 humana de secuencia nativa asi como variantes de origen natural de las mismas.

Una “region Fc variante” comprende una secuencia de aminoacidos que difiere de la de una region Fc de secuencia nativa en virtud de al menos una modification de aminoacido, preferentemente una o mas sustituciones de aminoacidos. Preferentemente, la region Fc variante tiene al menos una sustitucion de aminoacido en comparacion con una region Fc de secuencia nativa o con la region Fc de un polipeptido parental, por ejemplo, de aproximadamente una a aproximadamente diez sustituciones de aminoacidos, y preferentemente de aproximadamente una a aproximadamente cinco sustituciones de aminoacidos en una region Fc de secuencia nativa o en la region Fc del polipeptido parental. La region Fc variante del presente documento poseera preferentemente al menos aproximadamente 80 % de homologia con una region Fc de secuencia nativa y/o con una region Fc de un polipeptido parental, y mas preferentemente al menos aproximadamente 90 % de homologia con la misma, mas preferentemente al menos aproximadamente 95 % de homologia con la misma.

“Receptor de Fc” o “FcR” describe un receptor que se une con una region Fc de un anticuerpo. En algunas realizaciones, un FcR es un FcR humano nativo. En algunas realizaciones, un FcR es uno que se une con un anticuerpo IgG (un receptor gamma) e incluye receptores de las subclases FcyRI, FcyRII y FcyRIII, incluyendo variantes alelicas y formas cortadas y empalmadas de forma alternativa de esos receptores. Los receptores FcyRII incluyen FcyRNA (un “receptor activador”) y FcyRIIB (un “receptor inhibidor”), que tiene secuencias de aminoacidos similares que difieren principalmente en los dominios citoplasmaticos de las mismas. El receptor activador FcyRNA contiene un motivo de activacion basado en tirosina inmunorreceptor (ITAM) en su dominio citoplasmatico. El

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receptor inhibidor FcyRIIB contiene un motivo de inhibicion basado en tirosina inmunorreceptor (ITIM) en su dominio citoplasmatico. (Vease, por ejemplo, Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15: 203-234 (1997)). Se revisan FcR, por ejemplo, en Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4: 25-34 (1994); y de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126: 330-41 (1995). Otros FcR, incluyendo los que se identifiquen en el futuro, estan abarcados por el termino “FcR" del presente documento.

La expresion “receptor de Fc” o “FcR" tambien incluye el receptor neonatal, FcRn, que es responsable de la transferencia de IgG maternos al feto (Guyer et al., J. Immunol. 117: 587 (1976) y Kim et al., J. Immunol. 24: 249 (1994)) y regulacion de la homeostasis de inmunoglobulinas. Se conocen metodos para medir la union con FcRn (vease, por ejemplo, Ghetie y Ward., Immunol. Today 18(12): 592-598 (1997); Ghetie et al., Nature Biotechnology, 15(7): 637-640 (1997); Hinton et al., J. Biol. Chem. 279(8): 6213-6216 (2004); documento WO 2004/92219 (Hinton et al.).

Puede ensayarse la union con FcRn humano in v/Vo y semivida en suero de polipeptidos de union de alta afinidad con FcRn humano, por ejemplo, en ratones transgenicos o lineas celulares humanas transfectadas que expresan FcRn humano, o en primates a los que se administran polipeptidos con una region Fc variante. El documento WO 2000/42072 (Presta) describe variantes de anticuerpos con union mejorada o reducida con FcR. Vease tambien, por ejemplo, Shields et al. J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001).

Las “celulas efectoras humanas” son leucocitos que expresan uno o mas FcR y realizan funciones efectoras. En ciertas realizaciones, las celulas expresan al menos FcyRIII y realizan una funcion o funciones efectoras de ADCC. Los ejemplos de leucocitos humanos que median en ADCC incluyen celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC), linfocitos citoliticos naturales (NK), monocitos, linfocitos T citotoxicos y neutrofilos. Las celulas efectoras pueden aislarse de una fuente nativa, por ejemplo, de sangre.

La “citotoxicidad mediada por celulas dependientes de anticuerpo” o “ADCC” se refiere a una forma de citotoxicidad en la que Ig secretada unida a receptores de Fc (FcR) presentes en ciertas celulas citotoxicas (por ejemplo, linfocitos NK, neutrofilos y macrofagos) permiten que estas celulas efectoras citotoxicas se unan especificamente con una celula diana portadora de antigenos y posteriormente destruyan la celula diana con citotoxinas. Las celulas primarias para mediar en ADCC, linfocitos NK, expresan solamente FcyRIII, mientras que los monocitos expresan FcyRI, FcyRII y FcyRIII. La expresion de FcR en celulas hematopoyeticas se resume en la Tabla 3 en la pagina 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-92 (1991). Para evaluar la actividad ADCC de una molecula de interes, puede realizarse un ensayo de ADCC in v/tro, tal como el descrito en la Patente de Estados Unidos N.° 5.500.362 o 5.821.337 o Patente de Estados Unidos N.° 6.737.056 (Presta). Las celulas efectoras utiles para dichos ensayos incluyen PBMC y linfocitos NK. Como alternativa, o adicionalmente, puede evaluarse la actividad ADCC de la molecula de interes in v/Vo, por ejemplo, en un modelo animal tal como el desvelado en Clynes et al. PNAS (USA) 95: 652-656 (1998).

La “citotoxicidad dependiente de complemento” o “CDC” se refiere a la lisis de una celula diana en presencia de complemento. La activacion de la ruta del complemento clasica se inicia por la union del primer componente del sistema de complemento (C1q) con anticuerpos (de la subclase apropiada), que se unen con su antigeno afin. Para evaluar la activacion de complemento, puede realizarse un ensayo de CDC, por ejemplo, como se describe en Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202: 163 (1996). Se describen variantes polipeptidicas con secuencias de aminoacidos de region Fc alteradas (polipeptidos con una region Fc variante) y capacidad de union a Cq1 aumentada o reducida, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos N.° 6.194.551 B1 y documento WO 1999/51642. Vease tambien, por ejemplo, Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000).

La expresion "anticuerpo que comprende la region Fc" se refiere a un anticuerpo que comprende una region Fc. La lisina C-terminal (resto 447 segun el sistema de numeracion EU) de la region Fc puede retirarse, por ejemplo, durante la purificacion del anticuerpo o mediante ingenieria recombinante de un acido nucleico que codifica el anticuerpo. En consecuencia, una composicion que comprende un anticuerpo que tiene una region Fc de acuerdo con la presente invencion puede comprender un anticuerpo con K447, con todo K447 retirado, o una mezcla de anticuerpos con y sin el resto K447.

Un "marco conservado humano aceptor" para los fines del presente documento es un marco conservado que comprende la secuencia de aminoacidos de un marco conservado VL o VH derivado de un marco conservado de inmunoglobulina humana, o de un marco conservado consenso humano. Un marco conservado humano aceptor "derivado de" un marco conservado de inmunoglobulina humana o marco conservado de consenso humano puede comprender la misma secuencia de aminoacidos del mismo, o puede contener cambios de secuencias de aminoacidos preexistentes. Cuando esten presentes cambios de aminoacidos preexistentes, preferentemente no estan presentes mas de 5 y preferentemente 4 o menos, o 3 o menos, cambios de aminoacidos preexistentes. Cuando estan presentes cambios de aminoacidos preexistentes en un VH, preferentemente esos cambios son solamente en tres, dos o una de las posiciones 71H, 73H y 78H; por ejemplo, los restos de aminoacidos en esas posiciones pueden ser 71A, 73T y/o 78A. En una realizacion, el marco conservado humano aceptor VL es identico en secuencia a la secuencia de marco conservado de inmunoglobulina humana VL o secuencia de marco conservado consenso humana.

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Un "marco conservado consenso humano" es un marco conservado que representa el resto de aminoacido de aparicion mas habitual en una seleccion de secuencias de marco conservado VL o VH de inmunoglobulina humana. En general, la seleccion de secuencias VL o VH de inmunoglobulina humana es de un subgrupo de secuencias de dominio variable. En general, el subgrupo de secuencias es un subgrupo como en Kabat et al. En una realizacion, para el VL, el subgrupo es subgrupo kappa I como en Kabat et al. En una realizacion, para el VH, el subgrupo es subgrupo III como en Kabat et al.

Un "marco conservado consenso de subgrupo III de VH" comprende la secuencia consenso obtenida de las secuencias de aminoacidos en el subgrupo III pesado variable de Kabat et al. En una realizacion, la secuencia de aminoacidos del marco conservado consenso del subgrupo III de VH comprende al menos una parte o todas de cada una de las siguientes secuencias:

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (SEQ ID NO: 46)-H1-WVRQAPGKGLEWV (SEQ ID NO: 47)-H2- RFTISRDN- SKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC (SEQ ID NO: 48)-H3-WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 49).

Un "marco conservado consenso de subgrupo I de VL" comprende la secuencia consenso obtenida de las secuencias de aminoacidos en el subgrupo I variable ligero kappa de Kabat et al. En una realizacion, la secuencia de aminoacidos del marco conservado consenso del subgrupo I de VH comprende al menos una parte o todas de cada una de las siguientes secuencias:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 42)-L1-WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 43)-L2-GVPSRF- SGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 44)-L3-FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 45).

Una "muestra biologica" (denominada indistintamente "muestra" o "muestra tisular o celular") abarca diversos tipos de muestra obtenidos de un individuo y pueden usarse en un ensayo de diagnostico o control. La definicion abarca sangre y otras muestras liquidas de origen biologico, muestras tisulares solidas tales como una muestra de ensayo de biopsia o cultivos tisulares o celulas derivadas de los mismos, y la descendencia de los mismos. La definicion tambien incluye muestras que se han manipulado de cualquier manera despues de su obtencion, tal como mediante tratamiento con reactivos, solubilizacion o enriquecimiento con respecto a ciertos componentes, tales como proteinas o polinucleotidos, o inclusion en una matriz semisolida o solida para fines de seccion. La expresion "muestra biologica" abarca una muestra clinica, y tambien incluye celulas en cultivo, sobrenadantes celulares, lisados celulares, suero, plasma, fluido biologico y muestras tisulares. La fuente de la muestra biologica puede ser tejido solido como de una muestra organica o tisular, o biopsia o aspirado, nuevo, congelado y/o conservado; sangre o cualquier constituyente sanguineo; fluidos corporales tales como liquido cefalorraquideo, liquido amniotico, liquido peritoneal o liquido intersticial; celulas de cualquier momento de la gestacion o el desarrollo del sujeto. En algunas realizaciones, la muestra biologica se obtiene de un tumor primario o metastasico. La muestra biologica puede contener compuestos que no estan entremezclados de forma natural con el tejido en la naturaleza tales como conservantes, anticoagulantes, tampones, fijadores, nutrientes, antibioticos o similares.

Para los fines del presente documento una "seccion" de una muestra tisular se entiende como una unica parte o trozo de una muestra tisular, por ejemplo, un corte fino de tejido o celulas cortadas de una muestra tisular. Se entiende que pueden tomarse multiples secciones de muestras tisulares y someterse a analisis de acuerdo con la presente invencion. En algunas realizaciones, la misma seccion de muestra tisular se analiza en los niveles tanto morfologico como molecular, o se analiza con respecto tanto a proteinas como a acido nucleico.

La palabra "marcador" cuando se usa en el presente documento se refiere a un compuesto o una composition que esta conjugada o fusionada directamente o indirectamente con un reactivo tal como una sonda de acido nucleico o un anticuerpo y facilita la detection del reactivo con el que se conjuga o fusiona . El marcador puede en si mismo ser detectable (por ejemplo, marcadores radioisotopicos o marcadores fluorescentes) o, en el caso de un marcador enzimatico, puede catalizar la alteration quimica de un compuesto o una composicion de sustrato que es detectable.

Un "medicamento" es un farmaco activo para tratar el trastorno en cuestion o sus sintomas, o efectos secundarios.

Un "trastorno" o una "enfermedad" es cualquier afeccion que se beneficie del tratamiento con una sustancia/molecula o metodo de la invencion. Esto incluye trastornos o enfermedades cronicos y agudos, incluyendo las afecciones patologicas que predisponen al mamifero al trastorno en cuestion. Como ejemplos no limitantes de trastornos para tratar en el presente documento se incluyen tumores malignos y benignos; carcinoma, blastoma y sarcoma.

Las expresiones "trastorno proliferativo celular" y "trastorno proliferativo" se refieren a trastornos que estan asociados a algun grado de proliferation celular anomala. En una realizacion, el trastorno proliferativo celular es cancer.

"Tumor", como se usa en el presente documento, se refiere a todo el crecimiento y proliferacion de celulas neoplasicas, bien malignas o bien benignas, y todas las celulas y tejidos precancerosos y cancerosos. Las expresiones “cancer”, “canceroso”, “trastorno proliferativo celular”, “trastorno proliferativo” y “tumor” no son

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mutuamente excluyentes como se indica en el presente documento.

Los terminos "cancer" y "canceroso" se refieren a o describen la condition fisiologica en mam^feros que se caracteriza normalmente por cretimiento/proliferacion celular desregulado. Los ejemplos de cancer incluyen, pero sin limitation, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia. Los ejemplos mas particulares de dichos canceres incluyen cancer de celulas escamosas, cancer de pulmon microcitico, cancer de la hipofisis, cancer esofagico, astrocitoma, sarcoma de tejido blando, cancer de pulmon no microcitico, adenocarcinoma del pulmon, carcinoma escamoso del pulmon, cancer del peritoneo, cancer hepatocelular, cancer gastrointestinal, cancer pancreatico, glioblastoma, cancer del cuello uterino, cancer ovarico, cancer de higado, cancer de vejiga, hepatoma, cancer de mama, cancer de colon, cancer colorrectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de glandulas salivales, cancer de rinon, cancer de higado, cancer de prostata, cancer vulvar, cancer de tiroides, carcinoma hepatico, cancer de cerebro, cancer endometrial, cancer de testiculo, colangiocarcinoma, carcinoma de la vesicula biliar, cancer gastrico, melanoma y diversos tipos de cancer de cabeza y cuello. La desregulacion de la angiogenesis puede conducir a muchos trastornos que pueden tratarse por composiciones y metodos de la invention. Estos trastornos incluyen afecciones tanto neoplasicas como no neoplasicas. Las neoplasicas incluyen pero sin limitacion las descritas anteriormente. Los trastornos no neoplasicos incluyen pero sin limitacion hipertrofia indeseada o aberrante, artritis, artritis reumatoide (AR), psoriasis, placas psoriasicas, sarcoidosis, aterosclerosis, placas ateroscleroticas, retinopatias diabeticas y otras proliferativas incluyendo retinopatia del prematuro, fibroplasia retrolental, glaucoma neovascular, degeneration macular relacionada con la edad, edema macular diabetico, neovascularization corneana, neovascularizacion de injerto corneano, rechazo de injerto corneano, neovascularizacion

retiniana/coroidal, neovascularizacion del angulo (rubeosis), enfermedad neovascular ocular, reestenosis vascular, malformaciones arteriovenosas, (MAV), meningioma, hemangioma, angiofibroma, hiperplasias tiroideas, (incluyendo enfermedad de Graves), trasplante de tejido corneano y otros, inflamacion cronica, inflamacion pulmonar, lesion pulmonar aguda/SDRA, septicemia, hipertension pulmonar primaria, efusiones pulmonares malignas, edema cerebral (por ejemplo, asociado a ictus agudo/lesion cerebral cerrada/traumatismo), inflamacion sinovial, formation de catarata en AR, miositis osificante, formacion de hueso hipertrofico, osteoartritis (OA), ascitis refractaria, enfermedad de ovario poliquistico, endometriosis, 3a division de enfermedades de fluidos (pancreatitis, sindrome del compartimento, quemaduras, enfermedad intestinal), fibroides uterinos, parto prematuro, inflamacion cronica tal como EII (enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa), rechazo de aloinjerto renal, enfermedad inflamatoria del intestino, sindrome nefrotico, crecimiento de masa tisular indeseada o aberrante (no canceroso), articulaciones hemofilas, cicatrices hipertroficas, inhibition del crecimiento del cabello, sindrome de Osler-Weber, granuloma piogeno, fibroplasias retrolentales, esclerodermia, tracoma, adhesiones vasculares, sinovitis, dermatitis, preeclampsia, ascitis, efusion pericardica (tal como la asociada a pericarditis) y efusion pleural.

La expresion trastornos "consuntivos" (por ejemplo, sindrome consuntivo, caquexia, sarcopenia) se refiere a un trastorno provocado por perdida de peso o perdida de masa celular corporal indeseable y/o poco saludable. En los ancianos asi como en pacientes con SIDA y cancer, la enfermedad consuntiva puede dar como resultado perdida indeseada de peso corporal, incluyendo los compartimentos tanto grasos y como libres de grasa. Las enfermedades consuntivas pueden ser el resultado de consumo inadecuado de alimentos y/o cambios metabolicos relacionados con la enfermedad y/o el proceso de envejecimiento. Los pacientes con cancer y pacientes con SIDA, asi como pacientes despues de cirugia extensiva o que tienen infecciones cronicas, enfermedades inmunologicas, hipertiroidismo, enfermedad de Crohn, enfermedad psicogenica, insuficiencia cardiaca cronica u otro traumatismo grave, padecen con frecuencia enfermedad consuntiva que tambien se denomina con frecuencia caquexia, un trastorno metabolico y, en ocasiones, alimentario. La caquexia se caracteriza adicionalmente por hipermetabolismo e hipercatabolismo. Aunque la caquexia y la enfermedad consuntiva se usan con frecuencia indistintamente para hacer referencia a afecciones consuntivas, existe al menos un conjunto de investigaciones que diferencia la caquexia del sindrome consuntivo como una perdida de masa sin grasas y, particularmente, masa celular corporal (Mayer, 1999, J Nutr. 129 (1S Supl.): 256S-259S). La sarcopenia, otro mas de dichos trastornos que puede afectar al individuo envejecido, se caracteriza normalmente por perdida de masa muscular. La enfermedad consuntiva de estadio final como se ha descrito anteriormente puede desarrollarse en individuos que padecen caquexia o sarcopenia.

Como se usa en el presente documento, "tratamiento" se refiere a la intervention clinica en un intento de alterar el ciclo natural del individuo o la celula que se trata y puede realizarse bien para profilaxis o bien durante el transcurso de la patologia clinica. Los efectos deseables del tratamiento incluyen prevenir la aparicion o reaparicion de enfermedad, alivio de los sintomas, disminucion de cualquier consecuencia patologica directa o indirecta de la enfermedad, reduction de la velocidad de progresion de la enfermedad, alivio o paliacion de la patologia y remision o pronostico mejorado. En algunas realizaciones, se usan anticuerpos de la invencion para retardar el desarrollo de una enfermedad o un trastorno.

Un "agente antiangiogenesis" o "inhibidor de angiogenesis" se refiere a una sustancia de bajo peso molecular, un polinucleotido, un polipeptido, una proteina aislada, una proteina recombinante, un anticuerpo, o conjugados o proteinas de fusion de los mismos, que inhibe la angiogenesis, vasculogenesis o permeabilidad vascular indeseable, bien directa o bien indirectamente. Por ejemplo, un agente antiangiogenesis es un anticuerpo u otro antagonista para un agente angiogenico como se ha definido anteriormente, por ejemplo, anticuerpos para VGEF, anticuerpos para receptores de VGEF, moleculas pequenas que bloquean la senalizacion del receptor de VEGF (por ejemplo,

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PTK787/ZK2284, SU6668, SUTENT/SU11248 (malato de sunitinib), AMG706). Los agentes anti-angiogenesis tambien incluyen inhibidores nativos de la angiogenesis, por ejemplo, angiostatina, endostatina, etc. Vease, por ejemplo, Klagsbrun y D'Amore, Annu. Rev. Physiol., 53: 217 - 39 (1991); Streit y Detmar, Oncogene, 22:3172-3179 (2003) (por ejemplo, Tabla 3, que enumera la terapia antiangiogenica en melanoma maligno); Ferrara y Alitalo, Nature Medicine 5(12):1359-1364 (1999); Tonini et al., Oncogene, 22:6549-6556 (2003) (por ejemplo, Tabla 2, que enumera factores antiangiogenicos); y Sato Int. J. Clin. Oncol., 8:200-206 (2003) (por ejemplo, la Tabla 1 enumera agentes antiangiogenicos usados en ensayos clinicos).

Un "individuo", "sujeto", o "paciente" es un vertebrado. En ciertas realizaciones, el vertebrado es un mam^fero. Los mamiferos incluyen, pero sin limitation, animales de granja (como vacas), animales deportivos, mascotas (como gatos, perros y caballos), primates, ratones y ratas. En ciertas realizaciones, un mamifero es un ser humano.

"Mamifero" para fines de tratamiento se refiere a cualquier animal clasificado como mamifero, incluyendo seres humanos, animales domesticos y de granja, y animales de zoologico, deportivos o mascotas, tales como perros, caballos, gatos, vacas, etc. Preferentemente, el mamifero es un ser humano.

Una "cantidad eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, a dosificaciones y durante periodos de tiempo necesarios, para conseguir el resultado terapeutico o profilactico deseado.

Una "cantidad terapeuticamente eficaz" de una sustancia/molecula de la invention, agonista o antagonista puede variar de acuerdo con factores tales como la patologia, la edad, el sexo y el peso del individuo, y la capacidad de la sustancia/molecula, agonista o antagonista para inducir una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapeuticamente eficaz tambien es una en la que cualquier efecto toxico o perjudicial de la sustancia/molecula, agonista o antagonista se compensa por los efectos beneficiosos terapeuticamente. Una "cantidad profilacticamente eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, a dosificaciones y durante periodos de tiempo necesarios, para conseguir el resultado profilactico deseado. normalmente pero no necesariamente, ya que se usa una dosis profilactica en sujetos antes de o en un estadio mas temprano de la enfermedad, la cantidad profilacticamente eficaz sera menor que la cantidad terapeuticamente eficaz.

La expresion "agente citotoxico" como se usa en el presente documento se refiere a una sustancia que inhibe o previene la funcion de celulas y/o provoca la destruction de celulas. Se entiende que la expresion incluye isotopos radiactivos (por ejemplo, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 e isotopos radiactivos de Lu), agentes quimioterapeuticos, por ejemplo metotrexato, adriamicina, alcaloides de la vinca, vincristina, vinblastina, etoposido), doxorrubicina, melfalan, mitomicina C, clorambucilo, daunorrubicina u otros agentes intercaladores, enzimas y fragmentos de los mismos tales como enzimas nucleoliticas, antibioticos y toxinas tales como moleculas pequenas toxicas o toxinas enzimaticamente activas de origen bacteriano, fungico, vegetal o animal, incluyendo fragmentos y/o variantes de los mismos y los diversos agentes antitumorales o anticancerosos desvelados posteriormente. Otros agentes citotoxicos se describen posteriormente. Un agente tumoricida provoca la destruccion de celulas tumorales.

Una "toxina" es cualquier sustancia capaz de tener un efecto perjudicial en el crecimiento o la proliferation de una celula.

Un "agente quimioterapeutico" es un compuesto quimico util en el tratamiento de cancer. Los ejemplos de agentes quimioterapeuticos incluyen agentes alquilantes tales como tiotepa y ciclofosfamida (CYTOXAN®); alquil sulfonatos tales como busulfan, improsulfan y piposulfan; aziridinas tales como benzodopa, carboquona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilamelaminas, incluyendo altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilomelamina; acetogeninas (especialmente bulatacina y bulatacinona); delta-9- tetrahidrocannabinol (dronabinol, MARINOL®); beta-lapachona; lapachol; colchicinas; acido betulinico; una camptotecina (incluyendo el analogo sintetico topotecan (HYCAMTIN®), CPT-11 (irinotecan, CAMPTOSAR®), acetilcamptotecina, escopolectina y 9-aminocamptotecina); briostatina; callistatina; CC-1065 (incluyendo sus analogos sinteticos de adozelesina, carzelesina y bizelesina); podofilotoxina; acido podofilinico; teniposido; criptoficinas (particularmente criptoficina 1 y criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluyendo los analogos sinteticos, KW-2189 y CB1-TM1); eleuterobina; pancratistatina; una sarcodictina; espongistatina; mostazas de nitrogeno tales como clorambucilo, clornafazina, clorofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de oxido de mecloretamina, melfalan, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosoureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina y ranimnustina; antibioticos tales como los antibioticos de enediina (por ejemplo, calicheamicina, especialmente calicheamicina gamma1I y calicheamicina omega I1 (vease, por ejemplo, Nicolaou et al., Angew. Chem. Int. Ed., 33:183-186, 1994) ), CDP323, un inhibidor de integrina alfa-4 oral; dinemicina, incluyendo dinemicina A; una esperamicina; asi como un cromoforo de neocarzinostatina y cromoforos de antibioticos de cromoprotema enediina relacionados), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina (incluyendo ADRIAMYCIN®, morfolino-doxorrubicina, cianomorfolino-doxorrubicina, 2-pirrolino-doxorrubicina, inyeccion de liposoma de doxorrubicina HCl (DOXIL®), doxorrubicina liposomica TLC D-99 (MYOCET®), doxorrubicina liposomica pegilada (CAELYX®) y desoxidoxorrubicina), epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas tales como mitomicina C, acido micofenolico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, porfiromicina,

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puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina; antimetabolitos tales como metotrexato, gemcitabina (GEMZAR®), tegafur (UFTORAL®), capecitabina (XELODA ®), una epotilona y 5-fluorouracilo (5-FU); analogos de acido folico tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; analogos de purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; analogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; androgenos tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; antiadrenales tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reforzador de acido folico tal como acido frolinico; aceglatona; glucosido de aldofosfamida; acido aminolevulinico; eniluracilo; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatrexato; desfofamina; demecolcina; diazicuona; elfornitina; acetato de eliptinio; una epotilona; etoglucido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinano; lonidainina; maitansinoides tales como maitansina y ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; losoxantrona; 2-etilhidrazida; procarbazina; complejo de polisacarido PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR); razoxano; rizoxina; sizofirano; espirogermanio; acido tenuazonico; triazicuona; 2,2’,2’- triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A y anguidina); uretano; vindesina (ELDISINE®, FILDESIN®); dacarbazina; mannomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinosido ("Ara-C"); tiotepa; taxoide, por ejemplo, paclitaxel (TAXOL®), formulacion de nanoparticulas modificadas tecnicamente con albumina de paclitaxel (ABRAXANE™) y docetaxel (TAXOTERE®); clorambucilo; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; agentes de platino tales como cisplatino, oxaliplatino (por ejemplo, ELOXATIN®) y carboplatino; vincas, que evitan que la polimerizacion de tubulina forme microtubulos, incluyendo vinblastina (VELBAN®), vincristina (ONCOVIN®), vindesina (ELDISINE®, FILDESIN®) y vinorelbina (NAVELBINE®); etoposido (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; leucovorina; novantrona; edatrexato; daunomicina; aminopterina; ibandronato; inhibidor de topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); retinoides tales como acido retinoico, incluyendo bexaroteno (TARGRETIN®); bisfosfonatos tales como clodronato (por ejemplo, BONEFOS® u OSTAC®), etidronato (DIDROCAL®), NE-58095, acido zoledronico/zoledronato (ZOMEtA®), alendronato (FOSAMAX®), pamidronato (AREDIA®), tiludronato (SKELID® ), o risedronato (ACTONEL®); troxacitabina (un analogo de 1,3- dioxolano nucleosido citosina); oligonucleotidos antisentido, particularmente los que inhiben la expresion de genes en rutas de senalizacion implicadas en la proliferacion celular aberrante, tales como, por ejemplo, PKC-alfa, Raf, H- Ras y receptor del factor de crecimiento epidermico (EGF-R); vacunas tales como vacuna THERATOPE® y vacunas de terapia genica, por ejemplo, vacuna ALLOVECTIN®, vacuna LEUVECTIN® y vacuna VAXID®; inhibidor de la topoisomerasa 1 (por ejemplo, LURTOTECAN®); rmRH (por ejemplo, ABARELIX®); BAY439006 (sorafenib, Bayer); SU-11248 (sunitinib, SUTENT®, Pfizer); perifosina, inhibidor de COX-2 (por ejemplo celecoxib o etoricoxib), inhibidor de proteasoma (por ejemplo PS341); bortezomib (VELCADE®); CCI-779; tipifarnib (R11577); orafenib, ABT510; inhibidor de Bcl-2 tal como oblimersen sodico (GENASENSE®); pixantrona; inhibidores de EGfR (vease la definicion posterior); inhibidores de la tirosina quinasa (vease la definicion posterior); inhibidores de serina-treonina quinasa tales como rapamicina (sirolimus, RAPAMUNE®); inhibidores de farnesiltransferasa tales como lonafarnib (SCH 6636, SARASAR™); y sales, acidos o derivados farmaceuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores; asi como combinaciones de dos o mas de los anteriores, tales como CHOP, una abreviatura para una terapia combinada de ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina y prednisolona; y FOLFOX, una abreviatura para un regimen de tratamiento con oxaliplatino (ELOXATIN™) combinado con 5-FU y leucovorina.

Los agentes quimioterapeuticos como se definen en el presente documento incluyen "agentes antihormonales" o "productos terapeuticos endocrinos" que actuan para regular, reducir, bloquear o inhibir los efectos de hormonas que pueden promover el crecimiento del cancer. Pueden ser hormonas en si mismas, incluyendo, pero sin limitation: anti estrogenos con perfil de agonista/antagonista mixto, incluyendo, tamoxifeno (NOLVADEX®), 4-hidroxitamoxifeno, toremifeno (FARESTON®), idoxifeno, droloxifeno, raloxifeno (EVISTA ®), trioxifeno, keoxifeno y moduladores de receptores de estrogenos selectivos (SERM) tales como SERM3; antiestrogenos puros sin propiedades agonistas, tales como fulvestrant (FASLODEX®) y EM800 (dichos agentes pueden bloquear la dimerization de receptores de estrogenos (RE), inhibir la union a ADN, aumentar la renovation de RE y/o suprimir los niveles de RE); inhibidores de aromatasa, incluyendo inhibidores de aromatasa esteroideos tales como formestano y exemestano (AROMASIN®), e inhibidores de aromatasa no esteroideos tales como anastrazol (ARIMIDEX®), letrozol (FEMARA®) y aminoglutetimida y otros inhibidores de aromatasa incluyendo vorozol (RIVISOR®) acetato de megestrol (MEGASE®), fadrozol y 4(5)-imidazoles; agonistas de la hormona liberadora de hormona luteinizante, incluyendo leuprolide (LUPRON® y ELIGARD®), goserelina, buserelina y tripterelina; esteroides sexuales, incluyendo progestinas tales como acetato de megestrol y acetato de medroxiprogesterona, estrogenos tales como dietilestilbestrol y premarina, y androgenos/retinoides tales como fluoximesterona, acido transretionico y fenretinida; onapristona; antiprogesteronas; reguladores negativos de receptor de estrogenos (ERD); antiandrogenos tales como flutamida, nilutamida y bicalutamida; y sales, acidos o derivados farmaceuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores; asi como combinaciones de dos o mas de los anteriores.

Un "agente inhibidor del crecimiento" cuando se usa en el presente documento se refiere a un compuesto o una composition que inhibe el crecimiento de una celula (tal como una celula que expresa FGF19) bien in vitro o bien in vivo. Por lo tanto, el agente inhibidor del crecimiento puede ser uno que reduzca significativamente el porcentaje de celulas (tal como una celula que expresa FGF19) en fase S. Los ejemplos de agentes inhibidores del crecimiento incluyen agentes que bloquean la progresion del ciclo celular (en un lugar distinto de la fase S), tales como agentes que inducen detention en G1 y detention en fase M. Los bloqueadores de fase M clasicos incluyen las vincas (vincristina y vinblastina), taxanos e inhibidores de topoisomerasa II tales como doxorrubicina, epirrubicina,

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daunorrubicina, etoposido y bleomicina. Los agentes que detienen en G1 tambien se expanden a detencion en fase S, por ejemplo, agentes alquilantes de ADN tales como tamoxifeno, prednisona, dacarbanzina, mecloretamina, cisplatino, metotrexato, 5-fluorouracilo y ara-C. Puede encontrarse informacion adicional en Mendelsohn e Israel, eds., The Molecular Basis of Cancer, Capitulo 1, titulado "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" de Murakami et al. (W.B. Saunders, Filadelfia, 1995), por ejemplo, p. 13. Los taxanos (paclitaxel y docetaxel) son farmacos anticancerosos derivados ambos del tejo. Docetaxel (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer), derivado del tejo europeo, es un analogo semisintetico de paclitaxel (TAXOl®, Bristol-Myers Squibb). Paclitaxel y docetaxel promueven el ensamblaje de microtubulos de dimeros de tubulina y estabilizan microtubulos evitando la despolimerizacion, lo que da como resultado la inhibicion de mitosis en celulas.

"Doxorrubicina" es un antibiotico de antraciclina. El nombre quimico completo de doxorrubicina es (8S-cis)-10-[(3-

amino-2,3,6-tridesoxi-a-L-lixo-hexapiranosil)oxi]-7,8,9,10-tetrahidro-6,8,11-trihidroxi-8-(hidroxiacetil)-1-metoxi-5,12-

naftacenodiona.

La expresion “polipeptido que comprende la region Fc” se refiere a un polipeptido, tal como un anticuerpo o una inmunoadhesina (vease definiciones posteriores), que comprende una region Fc. La lisina C-terminal (resto 447 de acuerdo con el sistema de numeracion de EU) de la region Fc puede retirarse, por ejemplo, durante la purificacion del polipeptido o mediante ingenieria recombinante del acido nucleico que codifica el polipeptido. En consecuencia, una composicion que comprende un polipeptido que tiene una region Fc de acuerdo con la presente invention puede comprender polipeptidos con K447, con todo K447 retirado, o una mezcla de polipeptidos con y sin el resto K447.

Generation de anticuerpos variantes que muestran respuesta HAMA reducida o ausencia de respuesta HAMA.

La reduction o elimination de una respuesta HAMA es un aspecto significativo del desarrollo clinico de agentes terapeuticos adecuados. Vease, por ejemplo Khaxzaeli et al., J. Natl. Cancer Inst. (1988), 80:937; Jaffers et al., Transplantation (1986), 41:572; Shawler et al., J. Immunol. (1985), 135:1530; Sears et al., J. Biol. Response Mod. (1984), 3:138; Miller et al., Blood (1983), 62:988; Hakimi et al., J. Immunol. (1991), 147:1352; Reichmann et al., Nature (1988), 332:323; Junghans et al., Cancer Res. (1990), 50:1495. Como se describe en el presente documento, la invencion proporciona anticuerpos que estan humanizados de modo que la respuesta HAMA se reduce o elimina. Pueden obtenerse adicionalmente variantes de estos anticuerpos usando metodos rutinarios conocidos en la tecnica, algunos de los cuales se describen adicionalmente posteriormente.

Por ejemplo, una secuencia de aminoacidos de un anticuerpo como se describe en el presente documento puede actuar como una secuencia de partida (parental) para diversification de la secuencia o las secuencias de marco conservado y/o hipervariables. Una secuencia de marco conservado seleccionada con la que se une una secuencia hipervariable de partida se indica en el presente documento como un marco conservado humano aceptor. Aunque los marcos conservados humanos aceptores pueden ser, o derivar, de una inmunoglobulina humana (las regiones VL y/o VH de la misma), preferentemente los marcos conservados humanos aceptores son de, o derivan de, una secuencia de marco conservado consenso humana ya que se han demostrado que dichos marcos conservados tienen inmunogenicidad minima o no tienen inmunogenicidad, en pacientes humanos.

Cuando el aceptor deriva de una inmunoglobulina humana, se puede seleccionar opcionalmente una secuencia de marco conservado humana que se selecciona basandose en su homologia con la secuencia de marco conservado donadora alineando la secuencia de marco conservado con diversas secuencias de marco conservado humanas en una coleccion de secuencias de marco conservado humanas y seleccionar la secuencia de marco conservado mas homologa como el aceptor.

En una realization, los marcos conservados consenso humanos del presente documento son de, o derivan de, secuencias de marco conservado consenso del subgrupo III de VH y/o subgrupo I de VL kappa.

Por lo tanto, el marco conservado humano aceptor VH puede comprender una, dos, tres o todas las secuencias de marco conservado siguientes:

FR1 que comprende EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (SEQ ID NO: 46),

FR2 que comprende WVRQAPGKGLEWV (SEQ ID NO: 47),

FR3 que comprende FR3 comprende RFTISX1DX2SKNTX3YLQMNSLRAEDTAVYYC (SEQ ID NO: 50), en la que X1 es A o R, X2 es T o N, y X3 es A o L,

FR4 que comprende WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 49)

Los ejemplos de marcos conservados consenso VH incluyen:

marco conservado consenso de subgrupo I de VH humano sin CDR de Kabat (SEQ ID NO: 19); marco conservado consenso de subgrupo I de VH humano sin regiones hipervariables extendidas (SEQ ID NO: 20-22);

marco conservado consenso de subgrupo II de VH humano sin CDR de Kabat (SEQ ID NO: 23);

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marco conservado consenso de subgrupo II de VH humano sin regiones hipervariables extendidas (SEQ ID NO: 24-26);

subgrupo de VH humano en marco conservado consenso sin las CDR de Kabat (SEQ ID NO: 27); marco conservado consenso de VH subgrupo III humano sin regiones hipervariables extendidas (SEQ ID NO: 2830);

marco conservado aceptor VH humano sin CDR de Kabat (SEQ ID NO: 31);

marco conservado aceptor VH humano sin regiones hipervariables extendidas (SEQ ID NO: 32-33);

marco conservado aceptor 2 VH humano sin CDR de Kabat (SEQ ID NO: 34); o

marco conservado aceptor 2 VH humano sin regiones hipervariables extendidas (SEQ ID NO: 35-37).

En una realization, el marco conservado humano aceptor de VH comprende una, dos, tres o todas las secuencias de marco conservado siguientes:

FR1 que comprende EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (SEQ ID NO: 46),

FR2 que comprende WVRQAPGKGLEWV (SEQ ID NO: 47),

FR3 que comprende RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYC (SEQ ID NO: 51), RFTISADTSKN- TAYLQMNSLRAEDTAVYYCA (SEQ ID NO: 265), RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 266), RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCS (SEQ ID NO: 267) o RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAED- TAVYYCSR (SEQ ID NO: 268)

FR4 que comprende WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 49).

El marco conservado humano aceptor de VL puede comprender una, dos, tres o todas de las secuencias de marco conservado siguientes:

FR1 que comprende DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 42),

FR2 que comprende WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 43),

FR3 que comprende GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 44),

FR4 que comprende FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 45).

Los ejemplos de marcos conservados consenso de VL incluyen:

marco conservado consenso de subgrupo I de VL kappa humano (SEQ ID NO: 38); marco conservado consenso de subgrupo II de VL kappa humano (SEQ ID NO: 39); marco conservado consenso de subgrupo III de VL kappa humano (SEQ ID NO: 40); o marco conservado consenso de subgrupo IV de VL kappa humano (SEQ ID NO: 41).

Aunque el aceptor puede tener una secuencia identica a la secuencia de marco conservado humana seleccionada, sea esta de una inmunoglobulina humana o un marco conservado consenso humano, la presente invention contempla que la secuencia aceptora puede comprender sustituciones de aminoacidos preexistentes en relation con la secuencia de inmunoglobulina humana o secuencia de marco conservado consenso humana. Estas sustituciones preexistentes son preferentemente minimas; habitualmente diferencias de cuatro, tres, dos o un aminoacidos solamente en relacion con la secuencia de inmunoglobulina humana o secuencia de marco conservado consenso.

Se incorporan restos de region hipervariable del anticuerpo no humano en los marcos conservados humanos aceptores VL y/o VH. Por ejemplo, se pueden incorporar restos correspondientes a los restos de CDR de Kabat, los restos de bucle hipervariable de Chothia, los restos de Abm y/o restos de contacto. Opcionalmente, se incorporan los restos de region hipervariable extendida siguientes: 24-34(L1), 50-56(L2) y 89-97(L3), 26-35 (H1), 50-65 o 49- 65(H2) y 93-102, 94-102 o 95-102(H3).

Aunque se analiza en el presente documento la "incorporation" de restos de region hipervariable, se apreciara que esto puede conseguirse de diversas maneras, por ejemplo, puede generarse acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos deseada mutando acido nucleico que codifica la secuencia de dominio variable de raton de modo que se cambien los restos de marco conservado de la misma a restos de marco conservado humano aceptor, o mutando acido nucleico que codifica la secuencia de dominio variable humana de modo que los restos de dominio hipervariable se cambien a restos no humanos, o sintetizando acido nucleico que codifica la secuencia deseada , etc.

En los ejemplos en el presente documento, se generaron variantes con injertos de region hipervariable por mutagenesis de Kunkel de acido nucleico que codifica las secuencias aceptoras humanas, usando un oligonucleotido separado para cada region hipervariable. Kunkel y col., Methods Enzymol. 154:367-382 (1987). Pueden introducirse cambios apropiados dentro de la region marco y/o hipervariable, usando tecnicas rutinarias, para corregir y restablecer interacciones de region hipervariable-antigeno apropiadas.

Puede usarse presentation en fagos (o fagemidos) (a veces tambien denominada en el presente documento presentation en fagos en algunos contextos) como un metodo conveniente y rapido para generar y explorar muchos anticuerpos variantes potenciales diferentes en una biblioteca generada por selection aleatoria de secuencia. Sin

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embargo, otros metodos para preparar y explorar anticuerpos alterados estan disponibles para los expertos en la materia.

La tecnologia de presentacion en fagos (o fagemidos) ha proporcionado una herramienta potente para generar y seleccionar nuevas proteinas que se unan con un ligando, tal como un antigeno. Usando las tecnicas de presentacion en fagos (o fagemidos) se permite la generacion de grandes bibliotecas de variantes proteicas que pueden clasificarse rapidamente con respecto a las secuencias que se unen con una molecula diana con alta afinidad. Los acidos nucleicos que codifican polipeptidos variantes se fusionan en general con una secuencia de acido nucleico que codifica una proteina de envoltura virica, tal como la proteina del gen III o la proteina del gen VIII. Se han desarrollado sistemas de presentacion en fagemidos monovalentes en los que la secuencia de acido nucleico que codifica la proteina o el polipeptido se fusiona con una secuencia de acido nucleico que codifica una parte de la proteina del gen III. (Bass, S., Proteins, 8:309 (1990), Lowman y Wells, Methods: A Companion to Methods in Enzymology, 3:205 (1991)). En un sistema de presentacion en fagemido monovalente, la fusion genica se expresa a bajos niveles y tambien se expresan proteinas de gen III tipo silvestre de modo que se conserve la capacidad de infeccion de las particulas. Se han desvelado en muchas patentes metodos para generar bibliotecas peptidicas y explorar esas bibliotecas (por ejemplo, Patente de Estados Unidos N.° 5.723.286, Patente de Estados Unidos N.° 5.442.018, Patente de Estados Unidos N.° 5.580.717, Patente de Estados Unidos N.° 5.427.908 y Patente de Estados Unidos N.° 5.498.530).

Se han preparado bibliotecas de anticuerpos o polipeptidos de union a antigeno de varias maneras incluyendo alterando un unico gen insertando secuencias de ADN aleatorias o clonando una familia de genes relacionados. Se han descrito metodos para presentar anticuerpos o fragmentos de union a antigeno usando presentacion en fagos (o fagemidos) en las Patentes de Estados Unidos N.° 5.750.373, 5.733.743, 5.837.242, 5.969.108, 6.172.197, 5.580.717 y 5.658.727. La biblioteca se explora despues para expresion de anticuerpos o proteinas de union a antigeno con las caracteristicas deseadas.

Estan bien establecidos en la tecnica metodos para sustituir un aminoacido elegido en un acido nucleico molde, algunos de los cuales se describen en el presente documento. Por ejemplo, los restos de region hipervariable pueden sustituirse usando el metodo de Kunkel. Vease, por ejemplo, Kunkel et al., Methods Enzymol. 154: 367-382 (1987)

La secuencia de oligonucleotidos incluye uno o mas de los conjuntos de codones disenados para alterar los restos de region hipervariable. Un conjunto de codones es un conjunto de secuencias de tripletes de nucleotidos diferentes usados para codificar aminoacidos variantes deseados. Los conjuntos de codones pueden representarse usando simbolos para designar nucleotidos particulares o mezclas equimolares de nucleotidos como se muestra a continuacion de acuerdo con el codigo IUB.

C6DIGOS IUB G Guanina A Adenina T Timina C Citosina R (A o G)

Y (C o T)

M (A o C)

K (G o T)

S (C o G)

W (A o T)

H (A o C o T)

B (C o G o T)

V (A o C o G)

D (A o G o T)

N (A o C o G o T)

Por ejemplo, en el conjunto de codones DVK, D puede ser los nucleotidos A o G o T; V puede ser A o G o C; y K puede ser G o T. Este conjunto de codones puede presentar 18 codones diferentes y puede codificar los aminoacidos Ala, T rp, Tyr, Lys, Thr, Asn, Lys, Ser, Arg, Asp, Glu, Gly y Cys.

Pueden sintetizarse conjuntos de cebadores u oligonucleotidos usando metodos convencionales. Puede sintetizarse un conjunto de oligonucleotidos, por ejemplo, mediante sintesis de fase solida, que contiene secuencias que representan todas las posibles combinaciones de tripletes de nucleotidos proporcionados por el conjunto de codones y que codificaran el grupo deseado de aminoacidos. La sintesis de oligonucleotidos con "degradation" de nucleotidos seleccionada en ciertas posiciones se conoce bien en la tecnica. Dichos conjuntos de nucleotidos que tienen ciertos conjuntos de codones pueden sintetizarse usando sintetizadores de acidos nucleicos comerciales (disponibles de, por ejemplo, Applied Biosystems, Foster City, CA), o pueden obtenerse comercialmente (por ejemplo, de Life Technologies, Rockville, MD). Por lo tanto, un conjunto de oligonucleotidos sintetizados que tienen

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un conjunto de codones particular incluira normalmente una pluralidad de oligonucleotidos con diferentes secuencias, las diferencias establecidas por el conjunto de codones dentro de la secuencia general. Los oligonucleotidos, como se usan de acuerdo con la invention, tienen secuencias que permiten la hibridacion con un molde de acido nucleico de dominio variable y tambien pueden incluir sitios de enzimas de restriction para fines de donation.

En un metodo, pueden crearse las secuencias de acido nucleico que codifican aminoacidos variantes por mutagenesis mediada por oligonucleotidos. Esta tecnica se conoce bien en este campo como se describe en Zoller et al. Nucleic Acids Res. 10:6487-6504 (1987). Brevemente, se crean las secuencias de acido nucleico que codifican aminoacidos variantes hibridando un conjunto de oligonucleotidos que codifica los conjuntos de codones deseados con un molde de ADN, en el que el molde es la forma monocatenaria del plasmido que contiene una secuencia molde de acido nucleico de region variable. Despues de la hibridacion, se usa ADN polimerasa para sintetizar una segunda cadena complementaria completa del molde que incorporara de este modo el cebador oligonucleotidico, y contendra los conjuntos de codones proporcionados por el conjunto de oligonucleotidos.

En general, se usan oligonucleotidos de al menos 25 nucleotidos de longitud. Un oligonucleotido optimo tendra de 12 a 15 nucleotidos que son completamente complementarios con el molde en uno de los lados del nucleotido o los nucleotidos que codifican la mutation o las mutaciones. Esto asegura que el oligonucleotido hibride apropiadamente con la molecula molde de ADN monocatenaria. Los oligonucleotidos se sintetizan facilmente usando tecnicas conocidas en este campo tales como la descrita en Crea et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 75:5765 (1978).

El molde de ADN se genera por los vectores que derivan de vectores de bacteriofago M13 (los vectores M13mp18 y M13mp19 disponibles en el mercado son adecuados), o los vectores que contienen un origen de replication de fago monocatenario como se describe en Viera et al., Meth. Enzymol., 153:3 (1987). Por tanto, el ADN que va a mutarse puede insertarse en uno de estos vectores para generar molde monocatenario. La production del molde monocatenario se describe en las secciones 4.21-4.41 de Sambrook et al., mencionada anteriormente.

Para alterar la secuencia de ADN nativa, el oligonucleotido se hibrida con el molde monocatenario en condiciones de hibridacion adecuadas. Despues se anade una enzima polimerizadora de ADN, habitualmente ADN polimerasa T7 o el fragmento de Klenow de ADN polimerasa I, para sintetizar la cadena complementaria del molde usando el oligonucleotido como un cebador para sintesis. Se forma de este modo una molecula heteroduplex de modo que una cadena de ADN codifique la forma mutada del gen 1, y la otra cadena (el molde original) codifique la secuencia nativa inalterada, del gen 1. Esta molecula heteroduplex se transforma despues en una celula hospedadora adecuada, habitualmente un procariota tal como E. coli JM101. Despues de cultivar las celulas, estas se siembran en placas de agarosa y se exploran usando el cebador oligonucleotidico radiomarcado con un fosfato-32 para identificar las colonias bacterianas que contienen el ADN mutado.

El metodo descrito inmediatamente antes puede modificarse de modo que se cree una molecula homoduplex en la que ambas cadenas del plasmido contienen la mutacion o las mutaciones. Las modificaciones son las siguientes: el oligonucleotido monocatenario se hibrida con el molde monocatenario como se ha descrito anteriormente. Se combina una mezcla de tres desoxirribonucleotidos, desoxirriboadenosina (dATP), desoxirriboguanosina (dGTP) y desoxirribotimidina (dTT), con una tiodesoxirribocitosina modificada denominada dCTP-(aS) (que puede obtenerse de Amersham). Esta mezcla se anade al complejo de molde-oligonucleotido. Tras la adicion de ADN polimerasa a esta mezcla, se genera una cadena de ADN identica al molde excepto para las bases mutadas. Ademas, esta nueva cadena de ADN contendra dCTP-(aS) en lugar de dCTP, que sirve para protegerlo de digestion por endonucleasa de restriccion. Despues de cortarse la cadena molde del heteroduplex bicatenario con una enzima de restriccion apropiada, la cadena molde puede digerirse con nucleasa ExoIII u otra nucleasa apropiada mas alla de la region que contiene el sitio o los sitios para mutar. La reaction se detiene despues para dejar una molecula que es solamente parcialmente monocatenaria. Despues se forma un homoduplex de ADN bicatenario completo usando ADN polimerasa en presencia de los cuatro desoxirribonucleotido trifosfatos, ATP y ADN-ligasa. Esta molecula homoduplex puede despues transformarse en una celula hospedadora adecuada.

Como se ha indicado anteriormente, la secuencia del conjunto de oligonucleotidos es de suficiente longitud para hibridar con el acido nucleico molde y tambien puede, aunque no es necesario, contener sitios de restriccion. El molde de ADN puede generarse por los vectores que derivan de vectores de bacteriofagos M13 o vectores que contienen un origen de replicacion de fago monocatenario como se describe en Viera et al. Meth. Enzymol., 153:3 (1987). Por lo tanto, el ADN que va a mutarse debe insertarse en uno de estos vectores para generar molde monocatenario. Se describe la produccion del molde monocatenario en las secciones 4.21-4.41 de Sambrook et al., mencionado anteriormente.

De acuerdo con otro metodo, puede generarse una biblioteca proporcionando conjuntos de oligonucleotidos cadena arriba y cadena abajo, teniendo cada conjunto una pluralidad de oligonucleotidos con diferentes secuencias, las diferentes secuencias establecidas por los conjuntos de codones proporcionados dentro de la secuencia de los oligonucleotidos. Los conjuntos de oligonucleotidos cadena arriba y cadena abajo, junto con una secuencia de acido nucleico molde de dominio variable, pueden usarse en una reaccion en cadena de la polimerasa para generar una "biblioteca" de productos de PCR. Los productos de PCR pueden denominarse "casetes de acido nucleico", ya que

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pueden fusionarse con otras secuencias de acido nucleico relacionadas o no relacionadas, por ejemplo, protemas de cubierta vmca y dominios de dimerizacion, usando tecnicas de biolog^a molecular establecidas.

La secuencia de los cebadores de PCR incluye uno o mas de los conjuntos de codones disenados para las posiciones accesibles al disolvente y altamente diversas en una region hipervariable. Como se ha descrito anteriormente, un conjunto de codones es un conjunto de diferentes secuencias de tripletes de nucleotidos usado para codificar aminoacidos variantes deseados.

Los selectores de anticuerpos que cumplen los criterios deseados, seleccionados mediante etapas de exploracion/seleccion apropiadas pueden aislarse y clonarse usando tecnicas recombinadas convencionales.

Fragmentos de anticuerpo

La presente invencion abarca fragmentos de anticuerpo. Los fragmentos de anticuerpo pueden generarse por medios tradicionales, tales como digestion enzimatica, o mediante tecnicas recombinantes. En ciertas circunstancias existen ventajas para el uso de fragmentos de anticuerpos, en lugar de anticuerpos completos. El tamano mas pequeno de los fragmentos permite una elimination rapida, y puede conducir a acceso mejorado a tumores solidos. Para una revision de ciertos fragmentos de anticuerpo, vease Hudson et al. (2003) Nat. Medicina. 9: 129-134

Se han desarrollado diversas tecnicas para la production de fragmentos de anticuerpos. Tradicionalmente, estos fragmentos se derivaron mediante digestion proteolitica de anticuerpos intactos (vease, por ejemplo, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) y Brennan et al., Science, 229:81 (1985)). Sin embargo, estos fragmentos pueden producirse ahora directamente por celulas hospedadoras recombinantes. Los fragmentos de anticuerpo Fab, Fv y ScFv pueden expresarse todos en y segregarse de E. coli, permitiendo de este modo la facil produccion de cantidades mayores de estos fragmentos. Pueden aislarse fragmentos de anticuerpo de las bibliotecas de fagos de anticuerpos analizadas anteriormente. Como alternativa, pueden recuperarse directamente fragmentos Fab'-SH de E. coli y acoplarse quimicamente para formar fragmentos F(ab')2 (Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). De acuerdo con otro enfoque, los fragmentos F(ab')2 pueden aislarse directamente de cultivo de celulas hospedadoras recombinante. Se describen fragmentos Fab y F(ab')2 con semivida in vivo aumentada que comprende restos de epitopos de union a receptor de recuperation en la Patente de Estados Unidos N.° 5.869.046. Otras tecnicas para la produccion de fragmentos de anticuerpo seran evidentes para el experto en la materia. En ciertas realizaciones, un anticuerpo es un fragmento Fv monocatenario (scFv). Vease documento WO 93/16185; Patente de Estados Unidos. N.° 5.571.894; y 5.587.458. Fv y scFv son las unicas especies con sitios de combination intactos que estan desprovistas de regiones constantes; por lo tanto, pueden ser adecuados para union inespecifica reducida durante el uso in vivo. Pueden construirse proteinas de fusion scFv para producir fusion de una proteina efectora en el extremo amino o el extremo carboxilo de un scFv. Vease Antibody Engineering, ed Borrebaeck, mencionado anteriormente. El fragmento de anticuerpo tambien puede ser un "anticuerpo lineal", por ejemplo, como se describe en la Patente de Estados Unidos N.° 5.641.870, por ejemplo. Dichos anticuerpos lineales pueden ser monoespecificos o biespecificos.

Anticuerpos Humanizados

La invencion abarca anticuerpos humanizados. Se conocen en la tecnica diversos metodos para humanizar anticuerpos no humanos. Por ejemplo, un anticuerpo humanizado puede tener uno o mas restos de aminoacidos introducidos en el desde una fuente que no es humana. Estos restos de aminoacidos no humanos se denominan con frecuencia restos "importados", que se toman normalmente de un dominio variable "importado". La humanization puede realizarse esencialmente siguiendo el metodo de Winter y colaboradores (Jones et al. (1986) Nature 321:522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327; Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534-1536), sustituyendo con secuencias de region hipervariable las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. En consecuencia, dichos anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quimericos (Patente de Estados Unidos N.° 4.816.567) en los que sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto se ha sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la practica, los anticuerpos humanizados son normalmente anticuerpos humanos en los que algunos restos de region hipervariable y posiblemente algunos restos FR se sustituyen por restos de sitios analogos en anticuerpos de roedor.

La election de los dominios variables humanos, tanto ligeros como pesados, para usar en la preparation de anticuerpos humanizados puede ser importante para reducir la antigenicidad. De acuerdo con el metodo denominado "de mejor ajuste", la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor se explora frente a la biblioteca completa de secuencias de dominio variable humanas conocidas. La secuencia humana que es mas cercana a la del roedor se acepta entonces como el marco conservado humano para el anticuerpo humanizado. Vease por ejemplo, Sims et al. (1993) J. Immunol. 151:2296; Chothia et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901. Otro metodo usa un marco conservado particular derivado de la secuencia consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenas ligeras o pesadas. El mismo marco conservado puede usarse para varios anticuerpos humanizados diferentes. Vease, por ejemplo, Carter et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4285; Presta et al. (1993) J. Immunol., 151: 2623.

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Es deseable en general ademas que los anticuerpos se humanicen con conservacion de alta afinidad por el antigeno y otras propiedades biologicas favorables. Para conseguir este objetivo, de acuerdo con un metodo, se preparan anticuerpos humanizados por un proceso de analisis de las secuencias parentales y diversos productos humanizados conceptuales usando modelos tridimensionales de las secuencias parentales y humanizadas. Estan disponibles habitualmente modelos de inmunoglobulina tridimensionales y los expertos en la materia estan familiarizados con ellos. Estan disponibles programas informaticos que ilustran y presentan estructuras conformacionales tridimensionales probables de secuencias de inmunoglobulina candidatas seleccionadas. La inspeccion de estas presentaciones permite el analisis de papel probable de los restos en la funcion de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el analisis de restos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina candidata para unirse con su antigeno. De este modo, pueden seleccionarse restos de FR y combinarse a partir de las secuencias receptoras e importadas de modo que se consiga la caracteristica de anticuerpo deseada, tal como afinidad aumentada por el antigeno o los antigenos diana. En general, los restos de region hipervariable estan directa y mas sustancialmente implicados en la influencia en la union a antigeno.

Anticuerpos Humanos

Pueden construirse anticuerpos humanos combinando una secuencia o secuencias de dominio variable de clon Fv seleccionadas de bibliotecas de presentacion en fagos derivadas de seres humanos con una secuencia o secuencias de dominio constante humanas conocidas como se ha descrito anteriormente. Como alternativa, pueden prepararse anticuerpos monoclonales humanos de la invencion mediante el metodo del hibridoma. Se han descrito iineas celulares de mieloma humano y heteromieloma de raton-ser humano para la produccion de anticuerpos monoclonales humanos, por ejemplo, en Kozbor J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Techniques y Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1987); y Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991).

Es ahora posible producir animales transgenicos (por ejemplo, ratones) que sean capaces, tras la inmunizacion, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de produccion de inmunoglobulina endogena. Por ejemplo, se ha descrito que la supresion homocigota del gen de region de union de cadena pesada de anticuerpo (JH) en ratones mutantes de linea germinal y quimericos da como resultado la inhibicion completa de la produccion de anticuerpos endogena. La transferencia de la matriz genica de inmunoglobulina de linea germinal humana en dichos ratones mutantes de linea germinal dara como resultado la produccion de anticuerpos humanos tras la exposicion a antigeno. Vease, por ejemplo, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255 (1992); Bruggermann et al., Year in Immunol., 7:33 (1993).

Tambien puede usarse la distribution genetica para derivar anticuerpos humanos de anticuerpos no humanos, por ejemplo, de roedores, en los que el anticuerpo humano tiene afinidades y especificidades similares al anticuerpo no humano de partida. De acuerdo con este metodo, que tambien se denomina "impronta epitopica”, la region variable de cadena pesada o ligera de un fragmento de anticuerpo no humano obtenido por tecnicas de presentacion en fagos como se describe en el presente documento se reemplaza con un repertorio de genes de dominio V humano, creando una poblacion de quimeras de scFv o Fab de cadena no humana/cadena humana. La selection con antigeno da como resultado aislamiento de un scFv o Fab quimerico de cadena no humana/cadena humana en el que la cadena humana restaura el sitio de union al antigeno destruida tras la retirada de la cadena no humana correspondiente en el clon de presentacion en fagos primario, es decir, el epitopo controla (imprime) la election del companero de cadena humana. Cuando el proceso se repite para reemplazar la cadena no humana restante, se obtiene un anticuerpo humano (vease documento PCT WO 93/06213 publicado el 1 de abril de 1993). A diferencia de la humanization tradicional de anticuerpos no humanos mediante injerto HVR, esta tecnica proporciona anticuerpos completamente humanos, que no tienen restos de FR o HVR de origen no humano.

Anticuerpos biespec^ficos

Los anticuerpos biespecificos son anticuerpos monoclonales que tienen especificidades de union por al menos dos antigenos diferentes. En ciertas realizaciones, los anticuerpos biespecificos son anticuerpos humanos o humanizados. En ciertas realizaciones, una de las especificidades de union es para FGF19 y la otra es para cualquier otro antigeno. En ciertas realizaciones, los anticuerpos biespecificos pueden unirse con dos epitopos diferentes de FGF19. Tambien pueden usarse anticuerpos biespecificos para localizar agentes citotoxicos en celulas que expresan FGF19. Estos anticuerpos poseen una rama de union a FGF19 y una rama que se une con un agente citotoxico, tal como, por ejemplo, saporina, anti-interferon-a, alcaloide de la vinca, cadena A de ricina, metotrexato o hapteno de isotopo radiactivo. Los anticuerpos biespecificos pueden prepararse como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpo (por ejemplo anticuerpos biespecificos F(ab')2).

Se conocen en la tecnica metodos para preparar anticuerpos biespecificos. Tradicionalmente, la produccion recombinante de anticuerpos biespecificos se basa en la coexpresion de dos partes de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina, en los que las dos cadenas pesadas tienen especificidades diferentes (Milstein y Cuello, Nature, 305: 537 (1983)). Debido a la mezcla aleatoria de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 moleculas de anticuerpos diferentes, de las cuales solamente una tiene la estructura biespecifica correcta. La purification de la molecula correcta, que se realiza habitualmente mediante etapas de cromatografia de afinidad, es algo incomoda, y los rendimientos de productos son

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bajos. Se desvelan procedimientos similares en el documento WO 93/08829 publicado el 13 de mayo de 1993 y en Traunecker et al., eMbO J., 10: 3655 (1991).

De acuerdo con un enfoque diferente, se fusionan dominios variables de anticuerpos con las especificidades de union deseadas (sitios de combinacion de anticuerpo-antigeno) con secuencias de dominio constante de inmunoglobulina. La fusion, por ejemplo, es con un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende al menos parte de las regiones bisagra, CH2 y CH3. En ciertas realizaciones, la primera region constante de cadena pesada (CH1), que contiene el sitio necesario para union a cadena ligera, esta presente en al menos una de las fusiones. Se insertan ADN que codifican las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, en vectores de expresion separados, y se co-transfectan en un organismo hospedador adecuado. Esto proporciona gran flexibilidad en el ajuste de las proporciones mutuas de los tres fragmentos polipeptidicos en realizaciones cuando relaciones desiguales de las tres cadenas polipeptidicas usadas en la construccion proporcionan los rendimientos optimos. Es posible, sin embargo, insertar las secuencias codificantes para dos o las tres cadenas polipeptidicas en un vector de expresion cuando la expresion de al menos dos cadenas polipeptidicas en relaciones iguales da como resultado altos rendimientos o cuando las relaciones no son particularmente significativas.

En una realizacion de este enfoque, los anticuerpos biespecificos estan compuestos de una cadena pesada de inmunoglobulina hibrida con una primera especificidad de union en una rama, y un par de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina hibrida (que proporciona una segunda especificidad de union) en la otra rama. Se descubrio que esta estructura asimetrica facilita la separacion del compuesto biespecifico deseado de combinaciones de cadenas de inmunoglobulina no deseadas, ya que la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina en solamente una mitad de la molecula biespecifica proporciona un modo facil de separacion. Este enfoque se desvela en el documento WO 94/04690. Para mas detalles de la generacion de anticuerpos biespecificos vease, por ejemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121: 210 (1986).

De acuerdo con otro enfoque, la interfaz entre un par de moleculas de anticuerpo puede modificarse tecnicamente para maximizar el porcentaje de heterodimeros que se recuperan del cultivo celular recombinante. La interfaz comprende al menos una parte del dominio Ch3 de un dominio constante de anticuerpo. En este metodo, una o mas cadenas laterales de aminoacidos pequenas de la interfaz de la primera molecula de anticuerpo se reemplazan con cadenas laterales mayores (por ejemplo tirosina o triptofano). Se crean “cavidades” compensatorias de tamano identico o similar a la cadena o a las cadenas laterales grandes en la interfaz de la segunda molecula de anticuerpo reemplazando cadenas laterales de aminoacidos grandes con mas pequenas (por ejemplo alanina o treonina). Esto proporciona un mecanismo para aumentar el rendimiento del heterodimero con respecto a otros productos finales no deseados tales como homodimeros.

Los anticuerpos biespecificos incluyen anticuerpos reticulados o “heteroconjugados”. Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heteroconjugado puede acoplarse con avidina, el otro con biotina. Se ha propuesto que dichos anticuerpos, por ejemplo, dirigen celulas del sistema inmunitario a celulas no deseadas (Patente de Estados Unidos N.° 4.676.980), y para el tratamiento de infeccion por VIH (documentos WO 91/00360, WO 92/00373 y EP 03089). Pueden prepararse anticuerpos heteroconjugados usando cualquier metodo de reticulacion conveniente. Se conocen bien en la tecnica agentes de reticulacion adecuados, y se desvelan en la Patente de Estados Unidos N.° 4.676.980, junto con varias tecnicas de reticulacion.

Tambien se han descrito tecnicas para generar anticuerpos biespecificos de fragmentos de anticuerpo en la bibliografia. Por ejemplo, pueden prepararse anticuerpos biespecificos usando enlace quimico. Brennan et al., Science, 229: 81 (1985) describen un procedimiento en el que se escinden proteoliticamente anticuerpos intactos para generar fragmentos F(ab')2. Estos fragmentos se reducen en presencia del agente formador de complejo con ditiol arsenita sodica para estabilizar ditioles adyacentes y evitar la formacion de disulfuro intermolecular. Los fragmentos Fab' generados se convierten despues a derivados de tionitrobenzoato (TNB). Uno de los derivados de Fab'-TNB se reconvierte despues al Fab'-tiol por reduction con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar del otro derivado de Fab'-TNB para formar el anticuerpo biespecifico. Los anticuerpos biespecificos producidos pueden usarse como agentes para la inmovilizacion selectiva de enzimas.

El progreso reciente ha facilitado la recuperation directa de fragmentos Fab'-SH de E. coli, que pueden acoplarse quimicamente para formar anticuerpos biespecificos. Shalaby et al., J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992) describen la production de una molecula de anticuerpo biespecifico completamente humanizada F(ab')2. Cada fragmento Fab' se secreto por separado de E. coli y se sometio a acoplamiento quimico dirigido in vitro para formar el anticuerpo biespecifico. El anticuerpo biespecifico formado de este modo fue capaz de unirse con celulas que sobreexpresaban el receptor HER2 y linfocitos T humanos normales, asi como desencadenar la actividad litica de linfocitos citotoxicos humanos contra dianas de tumor de mama humano.

Tambien se han descrito diversos tecnicas para preparar y aislar fragmentos de anticuerpos biespecificos directamente de cultivo celular recombinante. Por ejemplo, se han producido anticuerpos biespecificos usando cremalleras de leucina. Kostelny et al., J. Immunol., 148(5): 1547-1553 (1992). Los peptidos de cremallera de leucina de las proteinas Fos y Jun se ligaron a las partes Fab' de dos anticuerpos diferentes por fusion genica. Los

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homod^eros de anticuerpo se redujeron en la region bisagra para formar monomeros y despues se re-oxidaron para formar los heterodimeros de anticuerpos. Este metodo tambien puede utilizarse para la production de homodimeros de anticuerpos. La tecnolog^a de “diacuerpos” descrita en Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo alternativo para preparar fragmentos de anticuerpos biespecificos. Los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado con un dominio variable de cadena ligera (VL) por un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios de la misma cadena. En consecuencia, se obliga a los dominios VL y VH de un fragmento ha emparejarse con los dominios VL y VH complementarios de otro fragmento, formando de este modo dos sitios de union a antigeno. Otra estrategia para preparar fragmentos de anticuerpo biespecificos mediante el uso de dimeros de Fv monocatenario (sFv) tambien se ha indicado. Vease Gruber et al., J. Immunol., 152: 5368 (1994).

Se contemplan anticuerpos con mas de dos valencias. Por ejemplo, pueden prepararse anticuerpos triespecificos. Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991).

Anticuerpos multivalentes

Puede internalizarse un anticuerpo multivalente (y/o catabolizarse) mas rapido que un anticuerpo bivalente por una celula que expresa un antigeno con el que se unen los anticuerpos. Los anticuerpos de la presente invention pueden ser anticuerpos multivalentes (que son distintos de los de la clase IgM) con tres o mas sitios de union a antigeno (por ejemplo anticuerpos tetravalentes), que pueden producirse facilmente por expresion recombinante de acido nucleico que codifica las cadenas polipeptidicas del anticuerpo. El anticuerpo multivalente puede comprender un dominio de dimerization y tres o mas sitios de union a antigeno. En ciertas realizaciones, el dominio de dimerization comprende (o consiste en) una region Fc o una region bisagra. En este escenario, el anticuerpo comprendera una region Fc y tres o mas sitios de union a antigeno amino-terminales de la region Fc. En ciertas realizaciones, un anticuerpo multivalente comprende (o consiste en) de tres a aproximadamente ocho sitios de union a antigeno. En dicha realization, un anticuerpo multivalente comprende (o consiste en) cuatro sitios de union a antigeno. El anticuerpo multivalente comprende al menos una cadena polipeptidica (por ejemplo, dos cadenas polipeptidicas), en la que la cadena o las cadenas polipeptidicas comprenden dos o mas dominios variables. Por ejemplo, la cadena o las cadenas polipeptidicas pueden comprender VD1-(X1)n -VD2-(X2)n -Fc, en la que VD1 es un primer dominio variable, VD2 es un segundo dominio variable, Fc es una cadena polipeptidica de una region Fc, X1 y X2 representan un aminoacido o polipeptido, y n es 0 o 1. Por ejemplo, la cadena o las cadenas polipeptidicas pueden comprender: cadena de VH-CH1-enlazador flexible-VH-CH1-region Fc; o cadena de VH-CH1-VH-CH1- region Fc. El anticuerpo multivalente en el presente documento puede comprender ademas al menos dos (por ejemplo, cuatro) polipeptidos de dominio variable de cadena ligera. El anticuerpo multivalente en el presente documento puede, por ejemplo, comprender de aproximadamente dos a aproximadamente ocho polipeptidos de dominio variable de cadena ligera. Los polipeptidos de dominio variable de cadena ligera contemplados en el presente documento comprenden un dominio variable de cadena ligera y, opcionalmente, comprenden ademas un dominio CL.

Anticuerpos de un unico dominio

En algunas realizaciones, un anticuerpo de la invencion es un anticuerpo de un unico dominio. Un anticuerpo de un unico dominio es una unica cadena polipeptidica que comprende todo o una parte del dominio variable de cadena pesada o todo o una parte del dominio variable de cadena ligera de un anticuerpo. En ciertas realizaciones, un anticuerpo de un unico dominio es un anticuerpo de un unico dominio humano (Domantis, Inc., Waltham, MA; vease, por ejemplo, Patente de Estados Unidos N.° 6.248.516 B1). En una realizacion, un anticuerpo de un unico dominio consiste en todo o una parte del dominio variable de cadena pesada de un anticuerpo.

Variantes de anticuerpos

En algunas realizaciones, se contemplan una modification o modificaciones de secuencias de aminoacidos de los anticuerpos descritos en el presente documento. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de union y/u otras propiedades biologicas del anticuerpo. Pueden prepararse variantes de secuencias de aminoacidos del anticuerpo introduciendo cambios apropiados en la secuencia de nucleotidos que codifica el anticuerpo, o mediante sintesis peptidica. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, supresiones de, y/o inserciones en y/o sustituciones de, restos dentro de las secuencias de aminoacidos del anticuerpo. Puede realizarse cualquier combination de supresion, insertion y sustitucion para llegar a la construction final, siempre que la construction final posea las caracteristicas deseadas. Las alteraciones de aminoacidos pueden introducirse en la secuencia de aminoacidos de anticuerpo objeto en el momento que se realice esa secuencia.

Un metodo util para identification de ciertos restos o regiones del anticuerpo que son localizaciones preferidas para mutagenesis se denomina “mutagenesis de exploration de alanina” como se describe en Cunningham y Wells (1989) Science, 244: 1081-1085. Aqui, se identifican un resto o grupo de restos diana (por ejemplo, restos con carga tales como arg, asp, his, lys y glu) y se reemplaza por un aminoacido neutro o con carga negativa (por ejemplo, alanina y polialanina) para afectar a la interaction de los aminoacidos con antigeno. Las localizaciones de aminoacidos que demuestran sensibilidad funcional a las sustituciones se refinan despues introduciendo mas

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variantes u otras variantes en, o en lugar de, sitios de sustitucion. Por lo tanto, aunque el sitio para introducir una variacion de secuencia de aminoacidos esta predeterminado, no es necesario que la naturaleza de la mutacion en si misma este predeterminada. Por ejemplo, para analizar el rendimiento de una mutacion en un sitio dado, se realiza exploracion de alanina o mutagenesis aleatoria en el codon o la region diana y las inmunoglobulinas expresadas se exploran con respecto a la actividad deseada.

Las inserciones de secuencias de aminoacidos incluyen fusiones amino y/o carboxilo terminales que varian en longitud de un resto a polipeptidos que contienen cien o mas restos, asi como inserciones intrasecuencia de un unico resto o multiples restos de aminoacidos. Los ejemplos de dichas inserciones terminales incluyen un anticuerpo con un resto de metionilo N terminal. Otras variantes de insercion de la molecula de anticuerpo incluyen la fusion con el extremo N o C terminal del anticuerpo con una enzima (por ejemplo para ADEPT) o un polipeptido que aumenta la semivida en suero del anticuerpo.

En ciertas realizaciones, un anticuerpo de la invencion se altera para aumentar o reducir la medida en que el anticuerpo esta glucosilado. La glucosilacion de polipeptidos es normalmente ligada a N o ligada a O. Ligada a N se refiere a la union de un resto de carbohidrato con la cadena lateral de un resto de asparagina. Las secuencias tripeptidicas asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, en las que X es cualquier aminoacido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para union enzimatica del resto de carbohidrato con la cadena lateral de asparagina. Por lo tanto, la presencia de una de estas secuencias tripeptidicas en un polipeptido crea un sitio de glucosilacion potencial. La glucosilacion ligada a O se refiere a la union de uno de los azucares N- acetilgalactosamina, galactosa o xilosa con un hidroxiaminoacido, mas habitualmente serina o treonina, aunque tambien pueden usarse 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina.

La adicion o supresion de sitios de glucosilacion al anticuerpo se consigue convenientemente alterando la secuencia de aminoacidos de modo que se cree o retire uno o mas de las secuencias tripeptidicas anteriormente descritas (para sitios de glucosilacion ligados a N). La alteration tambien puede prepararse mediante la adicion, supresion o sustitucion de uno o mas restos de serina o treonina en la secuencia del anticuerpo original (para sitios de glucosilacion ligados a O).

Cuando el anticuerpo comprende una region Fc, el carbohidrato unido a la misma puede alterarse. Los anticuerpos nativos producidos por celulas de mamifero normalmente comprenden un oligosacarido ramificado, biantenario, que generalmente se une por un enlace N con Asn297 del dominio CH2 de la region Fc. Vease, por ejemplo, Wright et al. (1997) TIBTECH 15: 26-32. El oligosacarido puede incluir diversos carbohidratos, por ejemplo, manosa, N-acetil glucosamina (GlcNAc), galactosa y acido sialico, asi como una fucosa unida a un GlcNAc en el “tallo” de la estructura de oligosacarido biantenaria. En algunas realizaciones, pueden realizarse modificaciones del oligosacarido en un anticuerpo de la invencion para crear variantes de anticuerpos con ciertas propiedades mejoradas.

Por ejemplo, se proporcionan variantes de anticuerpos que tienen una estructura de carbohidrato que carece de fucosa unida (directa o indirectamente) con una region Fc. Dichas variantes pueden tener funcion ADCC mejorada. Vease, por ejemplo, Publicaciones de Patentes de Estados Unidos N.° US 2003/0157108 (Presta, L.); US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Los ejemplos de publicaciones relacionadas con variantes de anticuerpos “desfucosiladas” o “deficientes en fucosa” incluyen: documentos US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336: 1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004). Los ejemplos de lineas celulares capaces de producir anticuerpos desfucosilados incluyen celulas CHO Lec13 deficientes en fucosilacion de proteinas (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249: 533545 (1986); Solicitud de Patente de Estados Unidos N.° US 2003/0157108 A1, Presta, L; y documento WO 2004/056312 A1, Adams et al., especialmente en el Ejemplo 11), y lineas celular nuligenicas tales como gen de alfa- 1,6-fucosiltransferasa, FUT8, celulas CHO nuligenicas (vease, por ejemplo, Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4): 680-688 (2006); y documento WO2003/085107).

Se proporcionan adicionalmente variantes de anticuerpos con oligasacaridos biseccionados, por ejemplo, en los que un oligasacarido biantenario unido a la region Fc del anticuerpo se bisecciona por GlcNAc. Dichas variantes de anticuerpos pueden tener fucosilacion reducida y/o funcion de ADCC mejorada. Se describen ejemplos de dichas variantes de anticuerpos, por ejemplo, en el documento WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.); Patente de Estados Unidos N.° 6.602.684 (Umana et al.); y documento US 2005/0123546 (Umana et al.). Tambien se proporcionan variantes de anticuerpos con al menos un resto de galactosa en el oligasacarido unido a la region Fc. Dichas variantes de anticuerpo pueden tener funcion CDC mejorada. Dichas variantes de anticuerpo se describen, por ejemplo, en los documentos WO 1997/30087 (Patel et al.); WO 1998/58964 (Raju, S.); y WO 1999/22764 (Raju, S.).

En ciertas realizaciones, una variante de anticuerpo comprende una region Fc con una o mas sustituciones de aminoacidos que mejoran adicionalmente ADCC, por ejemplo, sustituciones en las posiciones 298, 333 y/o 334 de la region Fc (numeration Eu de restos). Dichas sustituciones pueden producirse en combination con cualquiera de las variaciones descritas anteriormente.

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En ciertas realizaciones, la invencion contempla una variante de anticuerpo que posee algunas pero no todas las funciones efectoras, lo que lo hace un candidato deseable para muchas aplicaciones en las que la semivida del anticuerpo in vivo es importante pero ciertas funciones efectoras (tales como complemento y ADCC) son innecesarias o deletereas. En ciertas realizaciones, las actividades de Fc del anticuerpo se miden para asegurar que solamente se mantengan las propiedades deseadas. Pueden realizarse ensayos de citotoxicidad in vitro y/o in vivo para confirmar la reduccion/agotamiento de actividades CDC y/o ADCC. Por ejemplo, pueden realizarse ensayos de union a receptor de Fc (FcR) para asegurar que el anticuerpo carece de union a FcyR (que por lo tanto probablemente carecen de actividad ADCC), pero conserva la capacidad de union a FcRn. Las celulas primarias para mediar en ADCC, linfocitos NK, expresan solamente FcyRIII, mientras que los monocitos expresan FcyRI, FcyRII y FcyRIII. La expresion de FcR en celulas hematopoyeticas se resume en la Tabla 3 en la pagina 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991). Se describen ejemplos no limitantes de ensayos in vitro para evaluar la actividad ADCC de una molecula de interes en la Patente de Estados Unidos N.° 5.500.362 (vease, por ejemplo, Hellstrom, I., et al. Pro. Nat'l Acad. Sci. USA 83: 7059-7063 (1986)) y Hellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985); 5.821.337 (vease Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166: 1351-1361 (1987)). Como alternativa, pueden emplearse metodos de ensayo no radiactivos (vease, por ejemplo, ensayo de citotoxicidad no radiactivo ACT™ para citometria de flujo (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA; y ensayo de citotoxicidad no radioactivo CytoTox 96® (Promega, Madison, WI). Las celulas efectoras utiles para dichos ensayos incluyen celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) y Linfocitos Citoliticos Naturales (NK). Como alternativa, o adicionalmente, la actividad ADCC de la molecula de interes puede evaluarse in vivo, por ejemplo, en un modelo animal tal como el desvelado en Clynes et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95: 652-656 (1998). Tambien pueden llevarse a cabo ensayos de union a C1q para confirmar que el anticuerpo es incapaz de unirse con C1q y por lo tanto carece de actividad CDC. Para evaluar la activacion de complemento, puede realizarse un ensayo de CDC (vease, por ejemplo, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202: 163 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101: 1045-1052 (2003); y Cragg, M.S. y M.J. Glennie, Blood 103: 2738-2743 (2004)). Tambien puede realizarse union de FcRn y determinaciones de eliminacion/semivida in vivo usando metodos conocidos en la tecnica (vease, por ejemplo, Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18(12): 1759-1769 (2006)).

Se proporcionan otras variantes de anticuerpos que tienen una o mas sustituciones de aminoacidos. Los sitios de interes para mutagenesis de sustitucion incluyen las regiones hipervariables, pero tambien se contemplan alteraciones de FR. Se muestran sustituciones conservativas en la Tabla 1 bajo el encabezamiento de “sustituciones preferidas”. Se proporcionan mas cambios sustanciales, denominados “sustituciones a modo de ejemplo" en la Tabla 1, o como se describe adicionalmente posteriormente en referencia a clases de aminoacidos. Pueden introducirse sustituciones de aminoacidos en un anticuerpo de interes y los productos explorarse, por ejemplo, con respecto a una actividad deseada, tal como union a antigeno mejorada, inmunogenicidad reducida, ADCC o CDC mejorada, etc.

TABLA 1

Resto Original

Sustituciones a modo de ejemplo Sustituciones Preferidas

Ala (A)

Val; Leu; He Val

Arg (R)

Lys; Gln; Asn Lys

Asn (N)

Gln; His; Asp, Gln

Asp (D)

Glu; Asn Glu

Cys (C)

Ser; Ala Ser

Gln (Q)

Asn; Glu Asn

Glu (E)

Asp; Gln Asp

Gly (G)

Ala Ala

His (H)

Asn; Gln; Lys; Arg Arg

He (I)

Leu; Val; Met; Ala; Phe; Norleucina Leu

Leu (L)

Norleucina; Ile; Val; Met; Ala; Phe He

Lys (K)

Arg; Gln; Asn Arg

Met (M)

Leu; Phe; He Leu

Phe (F)

Trp; Leu; Val; Ile; Ala; Tyr Tyr

Pro (P)

Ala Ala

Ser (S)

Thr Thr

Thr (T)

Val; Ser Ser

Trp (W)

Tyr; Phe Tyr

Tyr (Y)

Trp; Phe; Thr; Ser Phe

Val (V)

He; Leu; Met; Phe; Ala; Norleucina Leu

Pueden conseguirse modificaciones en las propiedades biologicas de un anticuerpo seleccionando sustituciones que afectan (a) a la estructura de la cadena principal polipeptidica en el area de la sustitucion, por ejemplo, como una conformacion en lamina o helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la molecula en el sitio diana, o (c) el volumen de la cadena lateral. Los aminoacidos pueden agruparse de acuerdo con similitudes en las propiedades de sus cadenas laterales (en A. L. Lehninger, en Biochemistry, segunda ed., pp. 73-75, Worth Publishers, Nueva York (1975)):

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(1) no polares: Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M)

(2) polares sin carga: Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q)

(3) acidos: Asp (D), Glu (E)

(4) basicos: Lys (K), Arg (R), His (H)

Como alternativa, los restos de origen natural pueden dividirse en grupos basandose en las propiedades de cadena lateral comunes:

(1) hidrofobo: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) hidrofilos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) acidos: Asp, Glu;

(4) basicos: His, Lys, Arg;

(5) restos que influyen en la orientacion de cadena: Gly, Pro;

(6) aromaticos: Trp, Tyr, Phe.

Las sustituciones no conservativas implicaran cambiar un miembro de una de estas clases por otra clase. Dichos restos sustituidos tambien pueden introducirse en los sitios de sustitucion conservativos o en los sitios restantes (no conservados).

Un tipo de variante de sustitucion implica sustituir uno o mas restos de region hipervariable de un anticuerpo parental (por ejemplo, un anticuerpo humanizado o humano). En general, la variante o las variantes resultantes seleccionadas para desarrollo adicional tendran propiedades biologicas modificadas (por ejemplo, mejoradas) en relacion con el anticuerpo parental del que se generaron. Una variante de sustitucion a modo de ejemplo es un anticuerpo de afinidad madurada, que puede generarse convenientemente usando tecnicas de maduracion de afinidad basadas en presentacion en fagos. Brevemente, se mutan varios sitios de region hipervariable (por ejemplo, 6-7 sitios) para generar todas las posibles sustituciones de aminoacidos en cada sitio. Los anticuerpos generados de este modo se presentan a partir de particulas de fagos filamentosos como fusiones con al menos parte de una proteina de cubierta de fago (por ejemplo, el producto del gen III de M13) empaquetadas dentro de cada particula. Las variantes presentadas en fagos se exploran despues con respecto a su actividad biologica (por ejemplo, afinidad de union). Para identificar sitios de region hipervariable candidatos para modificacion, puede realizarse mutagenesis de exploracion (por ejemplo, exploracion de alanina) para identificar restos de regiones hipervariables que contribuyen significativamente a la union a antigeno. Como alternativa, o adicionalmente, puede ser beneficioso analizar una estructura cristalina del complejo de antigeno-anticuerpo para identificar puntos de contacto entre el anticuerpo y el antigeno. Dichos restos de contacto y restos adyacentes son candidatos para la sustitucion de acuerdo con tecnicas conocidas en este campo, incluyendo las desarrolladas en el presente documento. Una vez que se generan dichas variantes, el panel de variantes se somete a exploracion usando tecnicas conocidas en este campo, incluyendo las descritas en el presente documento, y pueden seleccionarse para desarrollo adicional variantes con propiedades superiores en uno o mas ensayos relevantes.

Se preparan moleculas de acido nucleico que codifican variantes de secuencia de aminoacidos del anticuerpo por diversos metodos conocidos en la tecnica. Estos metodos incluyen pero sin limitacion, aislamiento de una fuente natural (en el caso de variantes de secuencias de aminoacidos de origen natural) o preparacion por mutagenesis mediada por oligonucleotidos (o dirigida), mutagenesis por PCR, y mutagenesis de casete de una version variante o no variante preparada anteriormente del anticuerpo.

Puede ser deseable introducir una o mas modificaciones de aminoacidos en una region Fc de anticuerpos de la invention, generando de este modo una variante de region Fc. La variante de region Fc puede comprender una secuencia de region Fc humana (por ejemplo, una region Fc IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humana) que comprenda una modificacion de aminoacidos (por ejemplo, una sustitucion) en una o mas posiciones de aminoacidos incluyendo la de una cisteina de bisagra.

De acuerdo con la presente description y las ensenanzas de la tecnica, se contempla que en algunas realizaciones, un anticuerpo de la invencion puede comprender una o mas alteraciones en comparacion con el anticuerpo homologo de tipo silvestre, por ejemplo, en la region Fc. Estos anticuerpos conservarian no obstante sustancialmente las mismas caracteristicas requeridas para utilidad terapeutica en comparacion con su homologo de tipo silvestre. Por ejemplo, se cree que ciertas alteraciones pueden realizarse en la region Fc que darian como resultado union a C1q alterada (es decir, bien mejorada o bien reducida) y/o Citotoxicidad Dependiente de Complemento (CDC), por ejemplo, como se describe en el documento WO99/51642. Vease tambien Duncan y Winter, Nature 322: 738-40 (1988); Patente de Estados Unidos N.° 5.648.260; Patente de Estados Unidos N.° 5.624.821; y documento WO94/29351 con respecto a otros ejemplos de variantes de region Fc. Los documentos WO00/42072 (Presta) y WO 2004/056312 (Lowman) describen variantes de anticuerpos con union mejorada o reducida con FcR. Vease, tambien Shields et al. J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001). Se describen anticuerpos con semividas aumentadas y union mejorada con el receptor de Fc neonatal (FcRn), que es responsable de la transferencia de IgG maternos al feto (Guyer et al., J. Immunol. 117: 587 (1976) y Kim et al., J. Immunol. 24: 249 (1994)), en el documento US2005/0014934A1 (Hinton et al.). Estos anticuerpos comprenden una region Fc con una o mas sustituciones en la misma que mejoran la union de region Fc con FcRn. Se describen variantes polipeptidicas

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con secuencias de aminoacidos de region Fc alteradas y capacidad de union a C1q aumentada o reducida en la Patente de Estados Unidos N.° 6.194.551B1, documento WO99/51642. Vease, tambien, Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000).

En otro aspecto, la invencion proporciona anticuerpos que comprenden modificaciones en la interfaz de polipeptidos de Fc que comprenden la region Fc, en los que las modificaciones facilitan y/o promueven la heterodimerizacion. Estas modificaciones comprenden introduction de una protuberancia en un primer polipeptido de Fc y una cavidad en un segundo polipeptido de Fc, en el que la protuberancia puede situarse en la cavidad para promover la formation de complejo de los primer y segundo polipeptidos de Fc. Se conocen en la tecnica metodos para generar anticuerpos con estas modificaciones, por ejemplo, como se describe en la Patente de Estados Unidos N.° 5.731.168.

En otro aspecto mas, puede ser deseable crear anticuerpos modificados con cisteina, por ejemplo, “tioMAb”, en los que uno o mas restos de un anticuerpo se sustituyen con restos de cisteina. En realizaciones particulares, los restos sustituidos aparecen en sitios accesibles del anticuerpo. Sustituyendo esos restos con cisteina, se situan de este modo grupos tiol reactivos en sitios accesibles del anticuerpo y pueden usarse para conjugar el anticuerpo con otros restos, tales como restos farmacologicos u otros restos de enlazador-farmaco, como se describe adicionalmente en el presente documento. En ciertas realizaciones, uno cualquiera o mas de los siguientes restos pueden sustituirse con cisteina: V205 (numeration de Kabat) de la cadena ligera; A118 (numeration de EU) de la cadena pesada; y S400 (numeracion de EU) de la region Fc de cadena pesada.

Derivados de anticuerpos

Los anticuerpos de la presente invencion pueden modificarse adicionalmente para contener restos no proteicos adicionales que se conocen en la tecnica y estan facilmente disponibles. Preferentemente, los restos adecuados para derivatizacion del anticuerpo son polimeros solubles en agua. Los ejemplos no limitantes de polimeros solubles en agua incluyen, pero sin limitation, polietilenglicol (PEG), copolimeros de etilenglicol/propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, alcohol polivinilico, polivinilpirrolidona, poli-1,3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolimero de etileno/anhidrido maleico, poliaminoacidos (bien homopolimeros o bien copolimeros aleatorios), y dextrano o poli(n-vinilpirrolidona)polietilenglicol, homopolimeros de propropilenglicol, co-polimeros de oxido de prolipropileno/oxido de etileno, polioles de polioxietilados (por ejemplo, glicerol), alcohol polivinilico y mezclas de los mismos. El propionaldehido de polietilenglicol puede tener ventajas en la fabrication debido a su estabilidad en agua. El polimero puede ser de cualquier peso molecular, y puede estar ramificado o no ramificado. El numero de polimeros unidos al anticuerpo puede variar, y si se unen mas de un polimero, estos pueden ser iguales o diferentes moleculas. En general, el numero y/o tipo de polimeros usados para derivatizacion pueden determinarse basandose en consideraciones que incluyen, pero sin limitacion, las propiedades o funciones particulares del anticuerpo para mejorar, si el derivado de anticuerpo se va a usar en una terapia en condiciones definidas, etc.

En otra realization, se proporcionan conjugados de un anticuerpo y resto no proteico que pueden calentarse selectivamente por exposition a radiation. En una realizacion, el resto no proteico es un nanotubo de carbono (Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)). La radiacion puede ser de cualquier longitud de onda, e incluye, pero sin limitacion, longitudes de onda que no danan celulas ordinarias, pero que calientan el resto no proteico hasta una temperatura a la que las celulas proximas al resto no proteico de anticuerpo se destruyen.

Ensayos de actividad

Los anticuerpos de la presente invencion pueden caracterizarse por sus propiedades fisicas/quimicas y funciones biologicas por diversos ensayos conocidos en la tecnica.

En un aspecto, se proporcionan ensayos para identificar anticuerpos anti-19 de los mismos que tienen actividad biologica. La actividad biologica puede incluir, por ejemplo, la modulation de uno o mas aspectos de efectos asociados a FGF19, incluyendo pero sin limitacion union a FGF19, activation de FGFR4, senalizacion molecular corriente abajo de FGFR4, alteration de la union de FGFR4 con FGF19, multimerizacion de FGFR4, expresion de un gen de CYP7a1, fosforilacion de FGFR4, MAPK, FRS2 y/o ERK2, activacion de p-catenina, migration celular promovida por FGF19 y/o alteracion de cualquier ruta biologica de FGF19 y/o de FGFR4 biologicamente relevante, y/o tratamiento y/o prevention de un tumor, trastorno proliferativo celular o un cancer; y/o tratamiento o prevention de un trastorno asociado a expresion y/o actividad de FGF19 (tal como expresion y/o actividad de FGF19 aumentada).

En ciertas realizaciones, un anticuerpo de la invencion se ensaya con respecto a su capacidad para inhibir, reducir y/o bloquear la represion inducida por FGF19 de la expresion de un gen de CYP7a1 en una celula expuesta a FGF19, usando metodos conocidos en la tecnica, por ejemplo, como se describe en la Solicitud de Patente de Estados Unidos del mismo propietario que la presente N.° 11/673.411, presentada el 9 de febrero de 2007. En ciertas realizaciones, un anticuerpo de la invencion se ensaya con respecto a su capacidad para inhibir, reducir y/o bloquear la fosforilacion inducida por FGF19 de FGFR4, MPAK, FRS2 y/o ERK2 en una celula expuesta a FGF19, usando metodos conocidos en la tecnica (por ejemplo, como se describe en la Solicitud de Patente de Estados

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Unidos del mismo propietario que la presente N.° 11/673.411, presentada el 9 de febrero de 2007) o ejemplificada en el presente documento. En ciertas realizaciones, un anticuerpo de la invencion se ensaya con respecto a su capacidad para inhibir, reducir y/o bloquear migracion celular promovida por FGF19 (por ejemplo, una celula tumoral, por ejemplo, una celula HCT116), usando metodos conocidos en la tecnica (por ejemplo, como se describe en la Solicitud de Patente de Estados Unidos del mismo propietario que la presente N.° 11/673.411, presentada el 9 de febrero de 2007). En ciertas realizaciones, un anticuerpo de la invencion se ensaya con respecto a su capacidad para inhibir, reducir y/o bloquear la actividad de la ruta de Wnt en una celula. En algunas realizaciones, la activacion de la ruta de Wnt comprende uno o mas de inmunorreactividad de p-catenina, fosforilacion de tirosina de p-catenina, expresion de genes diana de Wnt, mutacion de p-catenina y union de E-cadherina a p-catenina. La detection de la activacion de la ruta de Wnt se conoce en la tecnica, y se describen y ejemplifican algunos ejemplos, por ejemplo, en la Solicitud de Patente de Estados Unidos del mismo propietario que la presente N.° 11/673.411, presentada el 9 de febrero de 2007.

En un aspecto, un anticuerpo de la invencion se ensaya con respecto a su actividad de union a antigeno, por ejemplo, mediante metodos conocidos tales como ELISA, transferencia de Western, etc. En algunas realizaciones, un anticuerpo de la invencion se ensaya con respecto a su capacidad para bloquear la union de FGF19 con FGFR4, por ejemplo como se ejemplifica en el presente documento. En otro aspecto, pueden usarse ensayos de competition para identificar un anticuerpo monoclonal que compite con cualquiera de los anticuerpos anti-FGF19 descritos en el presente documento por la union con FGF19. En ciertas realizaciones, dicho anticuerpo de competicion se une con el mismo epitopo (por ejemplo, un epitopo lineal o conformacional) que se une con cualquiera de los anticuerpos anti-FGF19 descritos en el presente documento. Los ensayos de competicion a modo de ejemplo incluyen, pero sin limitation, ensayos rutinarios tales como los proporcionados en Harlow y Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual cp.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY). Se proporcionan metodos a modo de ejemplo detallados para mapear un epitopo al que se une un anticuerpo en Morris (1996) “Epitope Mapping Protocols", en Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ). Se dice que dos anticuerpos se unen el mismo epitopo si cada uno bloquea la union del otro en 50 % o mas.

En un ensayo de competicion a modo de ejemplo, se incuba FGF19 inmovilizado en una solution que comprende un primer anticuerpo marcado que se une con FGF19 y un segundo anticuerpo no marcado que se ensaya con respecto a su capacidad para competir con el primer anticuerpo por la union con FGF19. El segundo anticuerpo puede estar presente en un sobrenadante de hibridoma. Como control, se incuba FGF19 inmovilizado en una solucion que comprende el primer anticuerpo marcado pero no el segundo anticuerpo no marcado. Despues de la incubation en condiciones permisivas para la union del primer anticuerpo con FGF19, se retira el anticuerpo no unido en exceso y se mide la cantidad de marcador asociado a FGF19 inmovilizado. Si la cantidad de marcador asociado a FGF19 inmovilizado esta reducida sustancialmente en la muestra de ensayo en relation con la muestra de control, entonces eso indica que el segundo anticuerpo compite con el primer anticuerpo por la union con FGF19.

Las inmunoglobulinas purificadas pueden caracterizarse adicionalmente por una serie de ensayos incluyendo, pero sin limitacion, secuenciacion N terminal, analisis de aminoacidos, cromatografia liquida de alta presion de exclusion por tamano no desnaturalizante (HPLC), espectrometria de masas, cromatografia de intercambio ionico y digestion con papaina.

En ciertas realizaciones de la invencion, las inmunoglobulinas producidas en el presente documento se analizan con respecto a su actividad biologica. En algunas realizaciones, las inmunoglobulinas de la presente invencion se ensayan con respecto a su actividad de union a antigeno. Los ensayos de union a antigeno que se conocen en la tecnica y pueden usarse en el presente documento incluyen sin limitacion cualquier ensayo de union directo o competitivo usando tecnicas tales como transferencias de western, radioinmunoensayos, ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas), inmunoensayos de tipo “sandwich", ensayos de inmunoprecipitacion, inmunoensayos fluorescentes e inmunoensayos de proteina A. Se proporciona a continuation un ensayo de union a antigeno ilustrativo en la section de Ejemplos.

Los anticuerpos purificados pueden caracterizarse adicionalmente por una serie de ensayos incluyendo pero sin limitacion, secuenciacion N terminal, analisis de aminoacidos, cromatografia liquida de alta presion (HPLC) de exclusion por tamano no desnaturalizante, espectrometria de masas, cromatografia de intercambio ionico y digestion con papaina.

En ciertas realizaciones de la invencion, los anticuerpos producidos en el presente documento se analizan con respecto a su actividad biologica. En algunas realizaciones, los anticuerpos de la presente invencion se ensayan con respecto a su actividad de union a antigeno. Los ensayos de union a antigeno que se conocen en la tecnica y pueden usarse en el presente documento incluyen sin limitacion cualquier ensayo de union directo o competitivo usando tecnicas tales como transferencias de western, radioinmunoensayos, ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas), inmunoensayos de tipo “sandwich", ensayos de inmunoprecipitacion, inmunoensayos fluorescentes e inmunoensayos de proteina A. Se proporcionan posteriormente en la seccion de Ejemplos ensayos de union a antigeno ilustrativos.

En algunas realizaciones, la presente invencion contempla anticuerpos alterados que poseen algunas pero no todas

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las funciones efectoras, lo que lo hace un candidato deseado para muchas aplicaciones en las que la semivida del anticuerpo in vivo es importante pero ciertas funciones efectoras (tales como complemento y ADCC) son innecesarias o deletereas. En ciertas realizaciones, las actividades de Fc de la inmunoglobulina producida se miden para asegurar que solamente se mantengan las propiedades deseadas. Pueden realizarse ensayos de citotoxicidad in vitro y/o in vivo para confirmar la reduccion/el agotamiento de actividades CDC y/o ADCC. Por ejemplo, pueden realizarse ensayos de union a receptor de Fc (FcR) para asegurar que el anticuerpo carezca de union a FcyR (que carece por lo tanto probablemente de actividad ADCC), pero conserva la capacidad de union a FcRn. Las celulas primarias para mediar en ADCC, linfocitos NK, expresan FcyRIII solamente, mientras que los monocitos expresan FcyRI, FcyRII y FcyRIII. La expresion de FcR de celulas hematopoyeticas se resume en la Tabla 3 en la pagina 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-92 (1991). Un ejemplo de un ensayo in vitro para evaluar la actividad ADCC de una molecula de interes se describe en la Patente de Estados Unidos N.° 5.500.362 o 5.821.337. Las celulas efectoras utiles para dichos ensayos incluyen celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) y linfocitos Citoliticos Naturales (NK). Como alternativa, o adicionalmente, la actividad ADCC de la molecula de interes puede evaluarse in vivo, por ejemplo, en un modelo animal tal como el desvelado en Clynes et al. PNAS (USA) 95: 652-656 (1998). Tambien pueden llevarse a cabo ensayos de union a C1q para confirmar que el anticuerpo es incapaz de unirse con C1q y por lo tanto carece de actividad CDC. Para evaluar la activacion de complemento, puede realizarse un ensayo de CDC, por ejemplo, como se describe en Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202: 163 (1996). Tambien pueden realizarse determinaciones de union a FcRn y eliminacion/semivida in vivo usando metodos conocidos en la tecnica.

En algunas realizaciones, la invention proporciona anticuerpos alterados que poseen funciones efectoras aumentadas y/o semivida aumentada.

Vectores, celulas hospedadoras y metodos recombinantes

Para la production recombinante de un anticuerpo de la invencion, el acido nucleico que lo codifica se aisla e inserta en un vector replicable para donation posterior (amplification del ADN) o para expresion. El ADN que codifica el anticuerpo se aisla facilmente y se secuencia usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas oligonucleotidicas que son capaces de unirse especificamente con genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo). Estan disponibles muchos vectores. La election del vector depende en parte de la celula hospedadora para usar. En general, las celulas hospedadoras preferidas son de origen procariota o eucariota (generalmente de mamifero). Se apreciara que pueden usarse regiones constantes de cualquier isotipo para este fin, incluyendo regiones constantes IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, y que dichas regiones constantes pueden obtenerse de cualquier especie humana o animal.

a. Generation de anticuerpos usando celulas hospedadoras procariotas:

i. Construction de vectores

Pueden obtenerse secuencias polinucleotidicas que codifican componentes polipeptidicos del anticuerpo de la invencion usando tecnicas recombinantes convencionales. Pueden aislarse y secuenciarse secuencias polinucleotidicas deseadas de celulas productoras de anticuerpos tales como celulas de hibridoma. Como alternativa, pueden sintetizarse polinucleotidos usando sintetizador de nucleotidos o tecnicas de PCR. Una vez obtenidas, las secuencias que codifican los polipeptidos se insertan en un vector recombinante capaz de replicar y expresar polinucleotidos heterologos en hospedadores procariotas. Muchos vectores que estan disponibles y se conocen en la tecnica pueden usarse para el fin de la presente invencion. La selection de un vector apropiado dependera principalmente del tamano de los acidos nucleicos para insertar en el vector y la celula hospedadora particular para transformar con el vector. Cada vector contiene diversos componentes, dependiendo de su funcion (amplificacion o expresion de polinucleotido heterologo, o ambas) y su compatibilidad con la celula hospedadora particular en la que reside. Los componentes de vector generalmente incluyen, pero sin limitation: un origen de replication, un gen de marcador de seleccion, un promotor, un sitio de union a ribosoma (RBS), una secuencia senal, el inserto de acido nucleico heterologo y una secuencia de termination de la transcription.

En general, se usan vectores plasmidicos que contienen secuencias de control y replicon que derivan de especies compatibles con la celula hospedadora en relation con estos hospedadores. El vector porta habitualmente un sitio de replicacion, asi como secuencias marcadoras que son capaces de proporcionar seleccion fenotipica en celulas transformadas. Por ejemplo, E. coli se transforma normalmente usando pBR322, un plasmido derivado de una especie de E. coli. pBR322 contiene genes que codifican resistencia a ampicilina (Amp) y tetraciclina (Tet) y por lo tanto proporciona un medio facil para identificar celulas transformadas. pBR322, sus derivados u otros plasmidos microbianos o bacteriofagos tambien pueden contener, o modificarse para contener, promotores que pueden usarse por el organismo microbiano para expresion de proteinas endogenas. Se describen ejemplos de derivados de pBR322 usados para expresion de anticuerpos particulares en detalle en Carter et al., Patente de Estados Unidos N.° 5.648.237.

Ademas, pueden usarse vectores de fagos que contienen secuencias de replicon y de control que son compatibles con el microorganismo hospedador como vectores transformantes en relacion con estos hospedadores. Por ejemplo,

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pueden utilizarse bacteriofagos tales como T.GEM.TM.-11 en la preparacion de un vector recombinante que puede usarse para transformar celulas hospedadoras susceptibles tales como E. coli LE392.

El vector de expresion de la invencion puede comprender dos o mas pares de promotor-cistron, que codifican cada uno de los componentes polipeptidicos. Un promotor es una secuencia reguladora no traducida localizada cadena arriba (5') de un cistron que modula su expresion. Los promotores procariotas normalmente se clasifican en dos clases, inducibles y constitutivos. El promotor inducible es un promotor que inicia niveles aumentados de transcripcion del cistron bajo su control en respuesta a cambios en la condicion de cultivo, por ejemplo la presencia o ausencia de un nutriente o un cambio de la temperatura.

Se conoce un gran numero de promotores reconocidos por diversas celulas hospedadoras potenciales. El promotor seleccionado puede unirse operativamente con ADN cistronico que codifica la cadena ligera o pesada retirando el promotor del ADN fuente mediante digestion con enzimas de restriccion e insertando la secuencia promotora aislada en el vector de la invencion. Tanto la secuencia promotora nativa como muchos promotores heterologos pueden usarse para la amplificacion directa y/o expresion de los genes diana. En algunas realizaciones, se utilizan promotores heterologos, ya que generalmente permiten mayor transcripcion y mayores rendimientos de gen diana expresado en comparacion con el promotor polipeptidico diana nativo.

Los promotores adecuados para su uso con hospedadores procariotas incluyen el promotor de PhoA, los sistemas promotores p-galactamasa y lactosa, un sistema promotor de triptofano (trp) y promotores hibridos tales como el promotor de tac o el de trc. Sin embargo, otros promotores que son funcionales en bacterias (tales como otros promotores bacterianos o de fagos conocidos) tambien son adecuados. Sus secuencias de nucleotidos se han publicado, permitiendo de este modo que un trabajador experto los una operativamente a cistrones que codifiquen las cadenas ligera y pesada diana (Siebenlist et al. (1980) Cell 20: 269) usando enlazadores o adaptadores para aportar cualquier sitio de restriccion requerido.

En un aspecto de la invencion, cada cistron dentro del vector recombinante comprende un componente de secuencias senal de secrecion que dirige la translocacion de los polipeptidos expresados a traves de una membrana. En general, la secuencia senal puede ser un componente del vector, o puede ser una parte del ADN polipeptidico diana que se inserta en el vector. La secuencia senal seleccionada para el fin de la presente invencion deberia ser una que se reconozca y procese (es decir se escinda por una peptidasa senal) por la celula hospedadora. Para celulas hospedadoras procariotas que no reconocen y procesan las secuencias senal nativas de los polipeptidos heterologos, la secuencia senal se sustituye por una secuencia senal procariota seleccionada, por ejemplo, del grupo que consiste en la fosfatasa alcalina, penicilinasa, lpp, o lideres de enterotoxina termoestable II (STIl), LamB, PhoE, PelB, OmpA y MBP. En una realizacion de la invencion, las secuencias senal usadas en ambos cistrones del sistema de expresion son secuencias senal de STIl o variantes de las mismas.

En otro aspecto, la produccion de las inmunoglobulinas de acuerdo con la invencion puede producirse en el citoplasma de la celula hospedadora y por lo tanto no requiere la presencia de secuencias senal de secrecion dentro de cada cistron. A este respecto, se expresan cadenas ligeras y pesadas de inmunoglobulina, se pliegan y se ensamblan para formar inmunoglobulinas funcionales dentro del citoplasma. Ciertas cepas hospedadoras (por ejemplo, las cepas de E. coli trx-B) proporcionan condiciones del citoplasma que son favorables para la formacion de enlaces disulfuro, permitiendo de este modo el plegamiento y ensamblaje apropiados de subunidades proteicas expresadas. Proba y Pluckthun Gene, 159: 203 (1995).

Las celulas hospedadoras procariotas adecuadas para expresar anticuerpos de la invencion incluyen Arqueobacterias y Eubacterias, tales como organismos Gram negativos o Gram positivos. Los ejemplos de bacterias utiles incluyen Escherichia (por ejemplo, E. coli), Bacilos (por ejemplo, B. subtilis), Enterobacterias, especies de Pseudomonas (por ejemplo, P. aeruginosa), Salmonella typhimurium, Serratia marcescans, Klebsiella, Proteus, Shigella, Rhizobia, Vitreoscilla o Paracoccus. En una realizacion, se usan celulas gram negativas. En una realizacion se usan celulas E. coli como hospedadores para la invencion. Los ejemplos de cepas de E. coli incluyen cepa W3110 (Bachmann, Cellular and Molecular Biology, vol. 2 (Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1987), pp. 1190-1219; Deposito de ATCC N.° 27.325) y derivados de la misma, incluyendo la cepa 33D3 que tiene el genotipo W3110 AfhuA (AtonA) ptr3 lac Iq lacL8 AompTA(nmpc-fepE) degP41 kanR (Patente de Estados Unidos N.° 5.639.635). Tambien son adecuadas otras cepas y derivados de las mismas, tales como E. coli 294 (ATCC 31,446), E. coli B, E. coliX1776 (ATCC 31.537) y E. coli RV308 (ATCC 31.608), Estos ejemplos son ilustrativos mas que limitantes. Se conocen en la tecnica metodos para construir derivados de cualquiera de las bacterias anteriormente mencionadas que tienen genotipos definidos y se describen, por ejemplo, en Bass et al., Proteins, 8: 309-314 (1990). Es necesario en general seleccionar las bacterias apropiadas teniendo en consideracion la capacidad de replicacion del replicon en las celulas de una bacteria. Por ejemplo, pueden usarse convenientemente especies de E. coli, Serratia o Salmonella como el hospedador cuando se usen plasmidos bien conocidos tales como pBR322, pBR325, pACYC177 o pKN410 para aportar el replicon. normalmente la celula hospedadora deberia secretar cantidades minimas de enzimas proteoliticas, y pueden incorporarse convenientemente inhibidores de proteasa adicionales en el cultivo celular.

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ii. Produccion de anticuerpos

Las celulas hospedadoras se transforman con los vectores de expresion anteriormente descritos y se cultivan en medios nutrientes convencionales modificados segun sea apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes, o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas.

La transformacion significa introducir ADN en el hospedador procariota de modo que el ADN sea replicable, bien como un elemento extracromosomico o mediante integrante cromosomico. Dependiendo de la celula hospedadora usada, la transformacion se realiza usando tecnicas convencionales apropiadas para dichas celulas. El tratamiento con calcio que emplea cloruro calcico se usa en general para celulas bacterianas que contienen barreras de pared celular sustanciales. Otro metodo para transformacion emplea polietilenglicol/DMSO. Otra tecnica usada mas es la electroporacion.

Se cultivan celulas procariotas usadas para producir los polipeptidos de la invencion en medio conocido en la tecnica y adecuado para cultivo de las celulas hospedadoras seleccionadas. Los ejemplos de medios adecuados incluyen caldo de cultivo luria (LB) mas complementos nutrientes necesarios. En algunas realizaciones, el medio tambien contiene un agente de seleccion, elegido basandose en la construccion del vector de expresion, para permitir selectivamente el crecimiento de celulas procariotas que contienen el vector de expresion. Por ejemplo, se anade ampicilina al medio para el crecimiento de celulas que expresan gen resistente a ampicilina.

Tambien puede incluirse cualquier complemento necesario ademas de fuentes de carbono, nitrogeno y fosfato inorganico a concentraciones apropiadas introducidos solos o como una mezcla con otro complemento o medio tal como una fuente de nitrogeno compleja. Opcionalmente el medio de cultivo puede contener uno o mas agentes reductores seleccionados del grupo que consiste en glutation, cisteina, cistamina, tioglicolato, ditioeritritol y ditiotreitol.

Las celulas hospedadoras procariotas se cultivan a temperaturas adecuadas. Para el cultivo de E. coli, por ejemplo, la temperatura preferida varia de aproximadamente 20 °C a aproximadamente 39 °C, mas preferentemente de aproximadamente 25 °C a aproximadamente 37 °C, aun mas preferentemente a aproximadamente 30 °C. El pH del medio puede ser cualquier pH que varia de aproximadamente 5 a aproximadamente 9, dependiendo principalmente del organismo hospedador. Para E. coli, el pH es preferentemente de aproximadamente 6,8 a aproximadamente 7,4, y mas preferentemente aproximadamente 7,0.

Si se usa un promotor inducible en el vector de expresion de la invencion, se induce expresion de proteinas en condiciones adecuadas para la activacion del promotor. En un aspecto de la invencion, se usan promotores PhoA para controlar la transcripcion de los polipeptidos. En consecuencia, las celulas hospedadoras transformadas se cultivan en un medio con fosfato limitante para induccion. Preferentemente, el medio con fosfato limitante es el medio C.R.A.P. (vease, por ejemplo, Simmons et al., J. Immunol. Methods (2002), 263: 133-147). Pueden usarse diversos inductores adicionales, segun la construccion de vector empleada, como se conoce en la tecnica.

En una realizacion, los polipeptidos expresados de la presente invencion se secretan a y se recuperan del periplasma de las celulas hospedadoras. La recuperacion de proteinas normalmente implica romper el microorganismo, generalmente por medios tales como choque osmotico, ultrasonidos o lisis. Una vez que las celulas se han roto, se puede retirar el residuo celular o celulas completas por centrifugacion o filtracion. Las proteinas pueden purificarse adicionalmente, por ejemplo, mediante cromatografia en resina de afinidad. Como alternativa, las proteinas pueden transportarse al medio de cultivo y aislarse en el mismo. Las celulas pueden retirarse del cultivo y el sobrenadante de cultivo puede filtrarse y concentrarse para purificacion adicional de las proteinas producidas. Los polipeptidos expresados pueden aislarse e identificarse ademas usando metodos conocidos habitualmente tales como electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) y ensayo de transferencia de Western.

En un aspecto de la invencion, se realiza produccion de anticuerpos en gran cantidad por un proceso de fermentacion. Estan disponibles para produccion de proteinas recombinantes diversos procedimientos de fermentacion semicontinuos a gran escala. Las fermentaciones a gran escala tienen al menos 1000 litros de capacidad, preferentemente de aproximadamente 1000 a 100.000 litros de capacidad. Estos fermentadores usan propulsores agitadores para distribuir el oxigeno y los nutrientes, especialmente glucosa (la fuente de carbono/energia preferida). La fermentacion a pequena escala se refiere en general a fermentacion en un fermentador que no tiene mas de aproximadamente 100 litros de capacidad volumetrica, y puede variar de aproximadamente 1 litro a aproximadamente 100 litros.

En un proceso de fermentacion, la induccion de expresion de proteinas se inicia normalmente despues de haberse cultivado las celulas en condiciones adecuadas hasta una densidad deseada, por ejemplo, una DO550 de aproximadamente 180-220, en cuyo estadio las celulas estan en la fase estacionaria temprana. Puede usarse diversos inductores, de acuerdo con la construccion de vector empleada, como se conoce en la tecnica y se ha descrito anteriormente. Las celulas pueden cultivarse durante periodos mas cortos antes de la induccion. Las celulas se inducen habitualmente durante aproximadamente 12-50 horas, aunque pueden usarse tiempos de induccion mas largos o mas cortos.

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Para mejorar el rendimiento de produccion y la calidad de los polipeptidos de la invencion, pueden modificarse diversas condiciones de fermentacion. Por ejemplo, para mejorar el ensamblaje y plegamiento apropiado de los polipeptidos de anticuerpo secretados, pueden usarse vectores adicionales que sobreexpresan proteinas chaperonas, tales como proteinas Dsb (DsbA, DsbB, DsbC, DsbD y/o DsbG) o FkpA (una peptidilprolil cis, trans- isomerasa con actividad chaperona) para co-transformar las celulas procariotas hospedadoras. Se ha demostrado que las protemas chaperonas facilitan el plegamiento y la solubilidad apropiados de proteinas heterologas producidas en celulas hospedadoras bacterianas. Chen et al. (1999) J Bio Chem 274: 19601-19605; Georgiou et al., Patente de Estados Unidos N.° 6.083.715; Georgiou et al., Patente de Estados Unidos N.° 6.027.888; Bothmann y Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275: 17100-17105; Ramm y Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275: 17106-17113; Arie et al. (2001) Mol. Microbiol. 39: 199-210.

Para minimizar la proteolisis de proteinas heterologas expresadas (especialmente las que son proteoliticamente sensibles), pueden usarse ciertas cepas hospedadoras deficientes para enzimas proteoliticas para la presente invencion. Por ejemplo, pueden modificarse cepas de celulas hospedadoras para efectuar una mutacion o mutaciones geneticas en los genes que codifican proteasas bacterianas conocidas tales como Proteasa III, OmpT, DegP, Tsp, Proteasa I, Proteasa Mi, Proteasa V, Proteasa VI y combinaciones de las mismas. Algunas cepas deficientes en proteasa de E. coli estan disponibles y se describen, por ejemplo, en Joly et al. (1998), mencionado anteriormente; Georgiou et al., Patente de Estados Unidos N.° 5.264.365; Georgiou et al., Patente de Estados Unidos N.° 5.508.192; Hara et al., Microbial Drug Resistance, 2: 63-72 (1996).

En una realizacion, se usan cepas de E. coli deficientes para enzimas proteoliticas y transformadas con plasmidos que sobreexpresan una o mas proteinas chaperonas como celulas hospedadoras en el sistema de expresion de la invencion.

iii. Purificacion de anticuerpos

Pueden emplearse metodos de purificacion de proteinas convencionales conocidos en la tecnica. Los siguientes procedimientos son ejemplos de procedimientos de purificacion adecuados: fraccionamiento en columnas de inmunoafinidad o intercambio ionico, precipitacion con etanol, HPLC de fase inversa, cromatografia en silice o en una resina de intercambio cationico tal como DEAE, cromatoenfoque, SDS-PAGE, precipitacion con sulfato de amonio y filtracion en gel usando, por ejemplo, Sephadex G.75.

En un aspecto, se usa proteina A inmovilizada en una fase solida para purificacion por inmunoafinidad de los productos de anticuerpo de longitud completa de la invencion. La proteina A es una proteina de la pared celular de 41 kD de Staphylococcus aureus que se une con una alta afinidad con la region Fc de anticuerpos. Lindmark et al (1983) J. Immunol. Meth. 62: 1-13. La fase solida en la que se inmoviliza Proteina A es preferentemente una columna que comprende una superficie de vidrio o silice, mas preferentemente una columna de vidrio de poro controlado o una columna de acido silicico. En algunas aplicaciones, la columna se ha recubierto con un reactivo, tal como glicerol, en un intento de prevenir la adherencia no especifica de contaminantes.

Como la primera etapa de purificacion, la preparacion derivada del cultivo celular como se ha descrito anteriormente se aplica a la fase solida con Proteina A inmovilizada para permitir la union especifica del anticuerpo de interes con la Proteina A. La fase solida se lava despues para retirar contaminantes unidos de forma no especifica con la fase solida. Finalmente el anticuerpo de interes se recupera de la fase solida por elucion.

b. Generacion de anticuerpos usando celulas hospedadoras eucariotas:

Los componentes de vector generalmente incluyen, pero sin limitacion, uno o mas de los siguientes: una secuencia senal, un origen de replicacion, uno o mas genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor y una secuencia de terminacion de la transcripcion.

(i) Componente de secuencia senal

Un vector para su uso en una celula hospedadora eucariota, tambien puede contener una secuencia senal u otro polipeptido que tenga un sitio de escision especifico en el extremo N terminal de la proteina madura o el polipeptido de interes. La secuencia senal heterologa seleccionada preferentemente es una que se reconoce y procesa (es decir, se escinde por una peptidasa senal) por la celula hospedadora. En expresion de celulas de mamifero, estan disponibles secuencias senal de mamifero asi como lideres secretores viricos, por ejemplo, la senal de gD del herpes simple.

El ADN para dicha region precursora se liga en fase de lectura con ADN que codifica el anticuerpo.

(ii) Origen de replicacion

En general, un componente de origen de replicacion no es necesario para vectores de expresion de mamiferos. Por ejemplo, el origen de SV40 puede usarse normalmente solamente porque contiene el promotor temprano.

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(iii) Componente de gen de seleccion

Los vectores de expresion y clonacion pueden contener un gen de seleccion, tambien denominado un marcador seleccionable. Los genes de seleccion tipicos codifican protemas que (a) confieren resistencia a antibioticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, (b) complementan las deficiencias auxotroficas, cuando sea relevante, o (c) aportan nutrientes criticos no disponibles de medio complejo.

Un ejemplo de un esquema de seleccion utiliza un farmaco para detener el crecimiento de una celula hospedadora. Las celulas que se transforman con exito con un gen heterologo producen una proteina que confiere resistencia a farmacos y por lo tanto sobreviven al regimen de seleccion. Los ejemplos de dicha seleccion dominante usan los farmacos neomicina, acido micofenolico e higromicina.

Otro ejemplo de marcadores seleccionables adecuados para celulas de mamifero son los que permiten la identificacion de celulas competentes para captar el acido nucleico de anticuerpo, tal como DHFR, timidina quinasa, metalotioneina I y II, preferentemente genes de metalotioneina de primate, adenosina desaminasa, ornitina descarboxilasa, etc.

Por ejemplo, se identifican en primer lugar celulas transformadas con el gen de seleccion de DHFR cultivando todos los transformantes en un medio de cultivo que contiene metotrexato (Mtx), un antagonista competitivo de DHFR. Una celula hospedadora apropiada cuando se emplea DHFR de tipo silvestre es la linea celular de ovario de hamster chino (ChO) deficiente en actividad (por ejemplo, ATCC CRL-9096).

Como alternativa, pueden seleccionarse celulas hospedadoras (particularmente hospedadores de tipo silvestre que contienen DHFR endogeno) transformadas o co-transformadas con secuencias de ADN que codifican un anticuerpo, proteina de DHFR tipo silvestre y otro marcador seleccionable tal como aminoglucosido 3'-fosfotransferasa (APH) por crecimiento celular en medio que contiene un agente de seleccion para marcador seleccionable tal como un antibiotico aminoglucosidico, por ejemplo, kanamicina, neomicina, o G418. Vease Patente de Estados Unidos N.° 4.965.199.

(iv) Componente promotor

Los vectores de expresion y clonacion habitualmente contienen un promotor que reconoce el organismo hospedador y esta unido operativamente con el acido nucleico del polipeptido del anticuerpo. Se conocen secuencias promotoras para eucariotas. Practicamente todos los genes aleucarioticos tienen una region rica en AT localizada a aproximadamente 25 a 30 bases cadena arriba del sitio en el que se inicia la transcripcion. Otra secuencia hallada de 70 a 80 bases cadena arriba del inicio de la transcripcion de muchos genes es una region CNCAAT en la que N puede ser cualquier nucleotido. En el extremo 3' de la mayoria de genes eucariotas hay una secuencia AATAAA que puede ser la senal para adicion de la cola de poli A al extremo 3' de la secuencia codificante. Todas estas secuencias estan insertadas convenientemente en vectores de expresion eucariotas.

La transcripcion del polipeptido del anticuerpo de vectores en celulas hospedadoras de mamiferos esta controlada, por ejemplo, por promotores obtenidos de los genomas de virus tales como virus del polioma, virus de la viruela aviar, adenovirus (tal como Adenovirus 2), virus del papiloma bovino, virus de sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, virus de la hepatitis B y Virus de Simio 40 (SV40), de promotores mamiferos heterologos, por ejemplo, el promotor de actina o un promotor de inmunoglobulina, de promotores de choque termico, siempre que dichos promotores sean compatibles con los sistemas de celulas hospedadoras.

Los promotores temprano y tardio del virus SV40 se obtienen convenientemente como un fragmento de restriccion de SV40 que tambien contiene el origen de replication virico de SV40. El promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano se obtiene convenientemente como fragmento de restriccion de HindIII E. Se desvela un sistema para expresar ADN en hospedadores mamiferos usando el virus del papiloma bovino como un vector en la Patente de Estados Unidos N.° 4.419.446. Se describe una modification de este sistema en la Patente de Estados Unidos N.° 4.601.978. Como alternativa, puede usarse la repetition terminal larga del Virus de Sarcoma de Rous como el promotor.

(v) Componente de elemento potenciador

La transcripcion de ADN que codifica el polipeptido de anticuerpo de la presente invention por eucariotas superiores se aumenta con frecuencia insertando una secuencia potenciadora en el vector. Se conocen en la actualidad muchas secuencias potenciadoras de genes de mamifero (globina, elastasa, albumina, a-fetoproteina e insulina). normalmente, sin embargo, se usara un potenciador de un virus de celula eucariota. Los ejemplos incluyen el potenciador de SV40 en el lado tardio del origen de replicacion (pb 100-270), el potenciador de promotor temprano de citomegalovirus, el potenciador de polioma en el lado tardio del origen de replicacion y potenciadores de adenovirus. Vease tambien Yaniv, Nature 297: 17-18 (1982) sobre elementos potenciadores para activation de promotores eucariotas. El potenciador puede cortarse y empalmarse en el vector en una position 5' o 3' de la secuencia codificante de polipeptido de anticuerpo, pero esta preferentemente localizado en un sitio 5' del promotor.

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(iv) Componente de terminacion de la transcripcion

Los vectores de expresion usados en celulas hospedadoras eucariotas tambien contendran normalmente secuencias necesarias para la terminacion de la transcripcion y para estabilizar el ARNm. Dichas secuencias estan disponibles habitualmente de las regiones no traducidas 5' y, ocasionalmente, 3', de ADN o ADNc vmcos o eucariotas. Estas regiones contienen segmentos de nucleotidos transcritos como fragmentos poliadenilados en la parte no traducida del ARN que codifica un anticuerpo. Un componente de terminacion de la transcripcion util es la region de poliadenilacion de hormona del crecimiento bovina. Vease documento WO94/11026 y el vector de expresion desvelado en el mismo.

(vii) Seleccion y transformacion de celulas hospedadoras

Las celulas hospedadoras adecuadas para clonar o expresar el ADN de los vectores del presente documento incluyen celulas eucariotas superiores descritas en el presente documento, incluyendo celulas hospedadoras de vertebrados. La propagacion de celulas de vertebrados en cultivo (cultivo tisular) se ha convertido en un procedimiento rutinario. Son ejemplos de lineas celulares hospedadoras de mamifero utiles linea CV1 de rinon de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linea de rinon embrionario humano (293 o celulas 293 subclonadas para crecimiento en cultivo en suspension, Graham et al., J. Gen Virol. 36: 59 (1977)); celulas de rinon de cria de hamster (BHK, ATCC CCL 10); celulas de ovario de hamster chino/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216 (1980)); celulas de sertoli de raton (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980)); celulas de rinon de mono (CV1 ATCC CCL 70); celulas de rinon de mono verde africano (VERO-76, AtCc cRl-1587); celulas de carcinoma del cuello uterino humano (HELA, ATCC CCL 2); celulas de rinon canino (MDCK, ATCC CCL 34); celulas de higado de rata bufalo (BRL 3A, AtCC CRL 1442); celulas de pulmon humano (W138, ATCC CCL 75); celulas de higado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de raton (MmT 060562, AtCc CCL51); celulas TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383: 44-68 (1982)); celulas MRC 5; celulas FS4; y una linea de hepatoma humano (Hep G2).

Las celulas hospedadoras se transforman con los vectores de expresion o clonacion anteriormente descritos para produccion de anticuerpos y se cultivan en medio nutriente convencional modificado segun sea apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas.

(viii) Cultivo de las celulas hospedadoras

Las celulas hospedadoras usadas para producir un anticuerpo de la presente invencion pueden cultivarse en diversos medios. Medios disponibles en el mercado tales como F10 de Ham (Sigma), Medio Esencial Minimo ((MEM), (Sigma)), RPMI-1640 (Sigma) y Medio de Eagle Modificado por Dulbecco ((DMEM), Sigma) son adecuados para cultivar las celulas hospedadoras. Ademas, cualquiera de los medios descritos en Ham et al., Meth. Enz. 58: 44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem.102: 255 (1980), Patentes de Estados Unidos N.° 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762; 4.560.655; o 5.122.469; documentos WO 90/03430; WO 87/00195; o Patente de Estados Unidos Re. 30.985 pueden usarse como un medio de cultivo para las celulas hospedadoras. Cualquiera de estos medios puede complementarse segun sea necesario con hormonas y/u otros factores de crecimiento (tales como insulina, transferrina o factor de crecimiento epidermico), sales (tales como cloruro sodico, calcio, magnesio y fosfato), tampones (tales como HEPES), nucleotidos (tales como adenosina y timidina), antibioticos (tales como farmaco GENTAMYCIN™), oligoelementos (definidos como compuestos inorganicos habitualmente presentes a concentraciones finales en el intervalo micromolar) y glucosa o una fuente de energia equivalente. Puede incluirse tambien cualquier otro complemento necesario a concentraciones apropiadas que conocerian los expertos en la materia. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH y similares, son las previamente usadas con las celula hospedadora seleccionada para expresion, y resultaran evidentes para el experto habitual en la materia.

(ix) Purificacion de anticuerpo

Cuando se usan tecnicas recombinantes, el anticuerpo puede producirse de forma intracelular, o secretarse directamente al medio. Si el anticuerpo se produce de forma intracelular, como una primera etapa, los residuos en particulas, bien celulas hospedadoras o bien fragmentos lisados, se retiran, por ejemplo, por centrifugacion o ultrafiltracion. Cuando el anticuerpo se secreta al medio, los sobrenadantes de dichos sistemas de expresion se concentran primero en general usando un filtro de concentracion de proteinas disponible en el mercado, por ejemplo, una unidad de ultrafiltracion Amicon o Millipore Pellicon. Puede incluirse un inhibidor de proteasa tal como PMSF en cualquiera de las etapas anteriores para inhibir la proteolisis y pueden incluirse antibioticos para evitar el crecimiento o contaminantes adventicios.

La composicion de anticuerpos preparada a partir de las celulas puede purificarse usando, por ejemplo, cromatografia de hidroxilapatita, electroforesis en gel, dialisis y cromatografia de afinidad, siendo la cromatografia de afinidad la tecnica de purificacion preferida. La conveniencia de la proteina A como un ligando de afinidad depende de la especie y el isotipo de cualquier dominio Fc de inmunoglobulina que este presente en el anticuerpo. Puede usarse proteina A para purificar anticuerpos que esten basados en cadenas pesadas y1, y2 o y4 humanas (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62: 1-13 (1983)). La proteina G se recomienda para todos los isotipos de raton y para y3

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humano (Guss et al., EMBO J. 5: 15671575 (1986)). La matriz con la que se une el ligando de afinidad es con mas frecuencia agarosa, pero estan disponibles otras matrices. Matrices mecanicamente estables tales como vidrio de poro controlado o poli(estirendivinil)benceno permiten caudales mas rapidos y tiempos de procesamiento mas cortos que los que pueden conseguirse con agarosa. Cuando el anticuerpo comprende un dominio CH3, la resina Bakerbond ABX™ (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ) es util para purificacion. Otras tecnicas para purificacion de proteinas tales como fraccionamiento en una columna de intercambio ionico, precipitacion con etanol, HPLC de fase inversa, cromatografia en silice, cromatografia en heparina, cromatografia de SEPHAROSE™ en una resina de intercambio anionico o cationico (tal como columna de acido poliaspartico), cromatoenfoque, SDS-PAGE y precipitacion con sulfato de amonio tambien estan disponibles dependiendo del anticuerpo para recuperar.

Despues de cualquier etapa o etapas de purificacion preliminares, la mezcla que comprende el anticuerpo de interes y contaminantes puede someterse a cromatografia de interaccion hidrofoba de pH bajo usando un tampon de elucion a un pH entre aproximadamente 2,5-4,5, preferentemente realizada a bajas concentraciones salinas (por ejemplo, sal de aproximadamente 0-0,25 M).

Inmunoconjugados

La divulgacion tambien proporciona inmunoconjugados (denominados indistintamente “conjugados de anticuerpo- farmaco” o “ADC") que comprenden un anticuerpo conjugado con uno o mas agentes citotoxicos, tales como un agente quimioterapeutico, un farmaco, un agente inhibidor del crecimiento, una toxina (por ejemplo, una toxina proteica, una toxina enzimaticamente activa de origen bacteriano, fungico, vegetal o animal o fragmentos de las mismas), o un isotopo radiactivo (es decir, un radioconjugado).

Se han usado inmunoconjugados para el suministro local de agentes citotoxicos, es decir, farmacos que destruyen o inhiben el crecimiento o proliferacion de celulas, en el tratamiento del cancer (Lambert, J. (2005) Curr. Opinion in Pharmacology 5: 543-549; Wu et al (2005) Nature Biotechnology 23(9): 1137-1146; Payne, G. (2003) i 3: 207-212; Syrigos y Epenetos (1999) Anticancer Research 19: 605-614; Niculescu-Duvaz y Springer (1997) Adv. Drug Deliv. Rev. 26: 151-172; Patente de Estados Unidos N.° 4.975.278). Los inmunoconjugados permiten el suministro dirigido de un resto farmacologico a un tumor, y acumulacion intracelular en el mismo, donde la administracion sistemica de farmacos no conjugados puede dar como resultado niveles inaceptables de toxicidad a celulas normales asi como a las celulas tumorales que se busca eliminar (Baldwin et al., Lancet (Mar. 15, 1986) pp. 603-05; Thorpe (1985) “Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review,” en Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications (A. Pinchera et al., eds) pp. 475-506. Se ha indicado que tanto anticuerpos policlonales como anticuerpos monoclonales son utiles en estas estrategias (Rowland et al., (1986) Cancer Immunol. Immunother. 21: 183-87). Los farmacos usados en estos metodos incluyen daunomicina, doxorrubicina, metotrexato y vindesina (Rowland et al., (1986) mencionado anteriormente). Las toxinas usadas en conjugados de anticuerpo-toxina incluyen toxinas bacterianas tales como toxina difterica, toxinas vegetales tales como ricina, toxinas de moleculas pequenas tales como geldanamicina (Mandler et al (2000) J. Nat. Cancer Inst. 92(19): 1573-1581; Mandler et al (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10: 1025-1028; Mandler et al (2002) Bioconjugate Chem. 13: 786-791), maitansinoides (documento EP 1391213; Liu et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 8618-8623), y calicheamicina (Lode et al (1998) Cancer Res. 58: 2928; Hinman et al (1993) Cancer Res. 53: 3336-3342). Las toxinas pueden ejercer sus efectos citotoxicos por mecanismos que incluyen union a tubulina, union a ADN o inhibition de topoisomerasa. Algunos farmacos citotoxicos tienden a estar inactivos o menos activos cuando se conjugan con grandes anticuerpos o ligandos de receptores de proteinas.

ZEVALIN® (tiuxetano de ibritumomab, Biogen/Idec) es un conjugado de anticuerpo-radioisotopo compuesto de un anticuerpo monoclonal kappa IgG1 murino dirigido contra el antigeno CD20 hallado en la superficie de linfocitos B normales y malignos y radioisotopo 111In o 90Y unido con un quelante-enlazador de tiourea (Wiseman et al (2000) Eur. Jour. Nucl. Med. 27(7): 766-77; Wiseman et al (2002) Blood 99(12): 4336-42; Witzig et al (2002) J. Clin. Oncol. 20(10): 2453-63; Witzig et al (2002) J. Clin. Oncol. 20(15): 3262-69). Aunque ZEVALIN tiene actividad contra Linfoma no de Hodgkin de linfocitos B (NHL), su administracion da como resultado citopenias graves y prolongadas en la mayoria de los pacientes. MYLOTARG™ (ozogamicina de gemtuzumab, Wyeth Pharmaceuticals), un conjugado de anticuerpo-farmaco compuesto de un anticuerpo huCD33 unido a calicheamicina, se aprobo en el ano 2000 para el tratamiento de leucemia mieloide aguda por inyeccion (Drugs of the Future (2000) 25(7): 686; Patentes de Estados Unidos N.° 4970198; 5079233; 5585089; 5606040; 5693762; 5739116; 5767285; 5773001). Mertansina de cantuzumab (Immunogen, Inc.), un conjugado de anticuerpo-farmaco compuesto del anticuerpo huC232 unido mediante el enlazador disulfuro SPP con el resto farmacologico maitansinoide, DM1, esta avanzando a ensayos de Fase II para el tratamiento de canceres que expresan CanAg, tales como canceres de colon, pancreatico, gastrico y otros. MLN-2704 (Millennium Pharm., BZL Biologics, Immunogen Inc.), un conjugado de anticuerpo-farmaco compuesto del anticuerpo monoclonal anti-antigeno de membrana especifico de prostata (PSMA) unido al resto farmacologico maitansinoide, DM1, esta desarrollandose para el tratamiento potencial de tumores de prostata. Los peptidos de auristatina, auristatina E (AE) y monometilauristatina (MMAE), analogos sinteticos de dolastatina, se conjugaron con anticuerpos monoclonales quimericos cBR96 (especifico de Lewis Y en carcinomas) y cAC10 (especifico de CD30 en tumores malignos hematologicos) (Doronina et al (2003) Nature Biotechnol. 21(7): 778-784) y estan en desarrollo terapeutico.

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En ciertas realizaciones, un inmunoconjugado comprende un anticuerpo y un agente quimioterapeutico u otra toxina. Se describen en el presente documento (por ejemplo, anteriormente) agentes quimioterapeuticos utiles en la generacion de inmunoconjugados. Las toxinas enzimaticamente activas y fragmentos de las mismas que pueden usarse incluyen cadena A de la difteria, fragmentos activos que no se unen de toxina difterica, cadena A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadena A de ricina, cadena A de abrina, cadena A de modeccina, alfa- sarcina, proteinas de Aleurites fordii, proteinas diantina, proteinas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S), inhibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de Saponaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos. Vease, por ejemplo, documento WO 93/21232 publicado el 28 de octubre de 1993. Estan disponibles diversos radionuclidos para la produccion de anticuerpos radioconjugados. Los ejemplos incluyen 212Bi, 131I, 131In, 90Y y 186Re. Se preparan conjugados del anticuerpo y agente citotoxico usando diversos agentes de acoplamiento de proteinas bifuncionales tales como N-succinimidil-3-(2- piridiltiol)propionato (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoesteres (tales como dimetil adipimidato HCl), esteres activos (tales como disuccinimidil suberato), aldehidos (tales como glutaraldehido), compuestos de bis-azido (tales como bis(p-azibobenzoil)hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tales como bis- (p-diazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (tales como tolueno 2,6-diisocianato), y compuestos de fluor bis- activos (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, puede prepararse una inmunotoxina ricina como se describe en Vitetta et al., Science, 238: 1098 (1987). El acido 1-isotiocianatobenzil-3-metildietilen triaminopentaacetico marcado con carbono 14 (MX-DTPA) es un agente quelante a modo de ejemplo para conjugacion de radionucleotido con el anticuerpo. Vease documento WO94/11026.

Tambien se contemplan en el presente documento conjugados de un anticuerpo y una o mas toxinas de moleculas pequenas, tales como una calicheamicina, maitansinoides, dolastatinas, aurostatinas, un tricoteceno y CC106, y los derivados de estas toxinas que tienen actividad de toxina.

Maitansina y maitansinoides

En algunas realizaciones, el inmunoconjugado comprende un anticuerpo (de longitud completa o fragmentos) conjugado con una o mas moleculas maitansinoides.

Los maitansinoides son inhibidores mitoticos que actuan inhibiendo la polimerizacion de tubulina. La maintansina se aislo por primera vez del arbusto africano oriental Maytenus serrata (Patente de Estados Unidos N.° 3.896.111). Posteriormente, se descubrio que ciertos microbios tambien producen maitansinoides, tales como maitansinol y esteres de maitansinol C-3 (Patente de Estados Unidos N.° 4.151.042). Se desvelan maitansinol sintetico y derivados y analisis del mismo, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos N.° 4.137.230; 4.248.870; 4.256.746; 4.260.608; 4.265.814; 4.294.757; 4.307.016; 4.308.268; 4.308.269; 4.309.428; 4.313.946; 4.315.929; 4.317.821; 4.322.348; 4.331.598; 4.361.650; 4.364.866; 4.424.219; 4.450.254; 4.362.663; y 4.371.533.

Los restos farmacologicos maitansinoides son restos farmacologicos atractivos en conjugados farmacologicos de anticuerpos porque son: (i) relativamente accesibles para preparar por fermentacion o modificacion quimica, derivatizacion de productos de fermentacion, (ii) susceptibles de derivatizacion con grupos funcionales adecuados para conjugacion mediante los enlazadores distintos de disulfuro con anticuerpos, (iii) estables en plasma y (iv) eficaces contra diversas lineas celulares tumorales.

Se desvelan inmunoconjugados que contienen maitansinoides, metodos para prepararlos y su uso terapeutico, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos N.° 5.208.020, 5.416.064 y Patente Europea EP 0 425 235 B1. Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 8618-8623 (1996) describieron inmunoconjugados que comprendian un maitansinoide designado DM1 unido al anticuerpo monoclonal de C242 dirigido contra cancer colorrectal humano. Se descubrio que el conjugado era altamente citotoxico para celulas de cancer de colon cultivadas, y mostro actividad antitumoral en un ensayo de crecimiento tumoral in vivo. Chari et al., Cancer Research 52: 127-131 (1992) describen inmunoconjugados en los que un maitansinoide se conjugo mediante un enlazador disulfuro con el anticuerpo murino A7 que se unia con un antigeno en lineas celulares de cancer de colon humano, o con otro anticuerpo monoclonal murino TA.1 que se une con el oncogen HER-2/neu. La citotoxicidad del conjugado de TA.1- maitansinoide se ensayo in vitro en la linea celular de cancer de mama humano SK-BR-3, que expresa 3 x 105 antigenos de superficie HER-2 por celula. El conjugado farmacologico consiguio un grado de citotoxicidad similar al farmaco maitansinoide libre, que podria aumentarse aumentando el numero de moleculas maitansinoides por molecula de anticuerpo. El conjugado de A7-maitansinoide mostro baja citotoxicidad sistemica en ratones.

Se preparan conjugados de anticuerpo-maitansinoide uniendo quimicamente un anticuerpo con una molecula maitansinoide sin disminuir significativamente la actividad biologica del anticuerpo o la molecula maitansinoide. Vease, por ejemplo, Patente de Estados Unidos N.° 5.208.020. Un promedio de 3-4 moleculas maitansinoides por moleculas de anticuerpo han mostrado eficacia en la potenciacion de la citotoxicidad de celulas diana sin afectar negativamente a la funcion o solubilidad del anticuerpo, incluso aunque se esperaria que una molecula de toxina/anticuerpo potenciara la citotoxicidad sobre el uso de anticuerpo desnudo. Los maitansinoides se conocen bien en la tecnica y pueden sintetizarse por tecnicas conocidas o aislarse de fuentes naturales. Se desvelan maitansinoides adecuados, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos N.° 5.208.020 y en las otras patentes y publicaciones no de patente indicadas anteriormente en el presente documento. Son maitansinoide preferidos

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maitansinol y analogos de maitansinol modificados en el anillo aromatico o en otras posiciones de la molecula de maitansinol, tales como diversos esteres de maitansinol.

Existen muchos grupos de enlace conocidos en la tecnica para preparar conjugados de anticuerpo-maitansinoide, incluyendo, por ejemplo, los desvelados en la Patente de Estados Unidos N.° 5.208.020 o Patente EP 0 425 235 B1, Chari et al., Cancer Research 52: 127-131 (1992), y Solicitud de Patente de Estados Unidos N.° 10/960.602, presentada el 8 de octubre de 2004. Pueden prepararse conjugados de anticuerpo-maitansinoide que comprenden el componente enlazador SMCC como se desvela en la Solicitud de Patente de Estados Unidos N.° 10/960.602, presentada el 8 de octubre de 2004. Los grupos de enlace incluyen grupos disulfuro, grupos tioeter, grupos labiles por acidos, grupos fotolabiles, grupos labiles por peptidasa, o grupos labiles por esterasa, como desvela en las patentes anteriormente identificadas, prefiriendose grupos disulfuro y tioeter. Se describen y ejemplifican en el presente el documento grupos de enlace adicionales.

Pueden prepararse conjugados del anticuerpo y maitansinoide usando diversos agentes de acoplamiento de proteinas bifuncionales tales como N-succinimidil-3-(2-piridilditio) propionato (SPDP), succinimidil-4-(N- maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato (SMCC), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoesteres (tales como dimetil adipimidato HCl), esteres activos (tales como disuccinimidil suberato), aldehidos (tales como glutaraldehido), compuestos de bis-azido (tales como bis(p-azidobenzoil) hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tales como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (tales como tolueno 2,6-diisocianato), y compuestos de fluor bis-activos (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Los agentes de acoplamiento particularmente preferidos incluyen N-succinimidil-3-(2-piridilditio) propionato (SPDP) (Carlsson et al., Biochem. J. 173: 723-737 (1978)) y N-succinimidil-4-(2-piridiltio)pentanoato (SPP) para proporcionar un enlace disulfuro.

El enlazador puede unirse con la molecula maitansinoide en diversas posiciones, dependiendo del tipo del enlace. Por ejemplo, puede formarse un enlace ester por reaccion con un grupo hidroxilo usando tecnicas de acoplamiento convencionales. La reaccion puede producirse en la posicion C-3 que tiene un grupo hidroxilo, la posicion C-14 modificada con hidroximetilo, la posicion C-15 modificada con un grupo hidroxilo, y la posicion C-20 que tiene un grupo hidroxilo. En una realizacion preferida, el enlace se forma en la posicion C-3 de maitansinol o un analogo de maitansinol.

Auristatinas y dolastatinas

En algunas realizaciones, el inmunoconjugado comprende un anticuerpo conjugado con dolastatinas o analogos peptidicos de dolostatina y derivados, las auristatinas (Patentes de Estados Unidos N.° 5635483; 5780588). Se ha mostrado que las dolastatinas y auristatinas interfieren con dinamicas de microtubulos, hidrolisis de GTP, y division nuclear y celular (Woyke et a/ (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12): 3580-3584) y tienen actividad anticancerosa (documento US 5663149) y antifungica (Pettit et al (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42: 29612965). El resto farmacologico de dolastatina o auristatina puede unirse con el anticuerpo mediante el extremo N (amino) terminal o el extremo C (carboxilo) terminal del resto farmacologico peptidico (documento WO 02/088172).

Las realizaciones de auristatina a modo de ejemplo incluyen los restos farmacologicos de monometilauristatina ligados al extremo N DE y DF, desvelados en “Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands", N.° de Serie de Estados Unidos 10/983.340, presentada el 5 de noviembre de 2004.

Normalmente, pueden prepararse restos farmacologicos basados en peptidos formando un enlace peptidico entre dos o mas aminoacidos y/o fragmentos peptidicos. Dichos enlaces peptidicos pueden prepararse, por ejemplo, de acuerdo con el metodo de sintesis de fase liquida (vease E. Schroder y K. Lubke, “The Peptides", volumen 1, pp 76136, 1965, Academic Press) que se conocen bien en el campo de la quimica de peptidos. Los restos farmacologicos de auristatina/dolastatina pueden prepararse de acuerdo con los metodos de: documentos US 5635483; US 5780588; Pettit et al (1989) J. Am. Chem. Soc. 111: 5463-5465; Pettit et al (1998) Anti-Cancer Drug Design 13: 243277; Pettit, G.R., et al. Synthesis, 1996, 719-725; y Pettit et al (1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 5: 859-863. Vease tambien Doronina (2003) Nat Biotechnol 21(7): 778-784; “Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands", N.° de Serie de Estados 10/983.340, presentada el 5 de noviembre de 2004 (que desvela, por ejemplo, enlazadores y metodos para preparar compuestos de monometilvalina tales como MMAE y MMAF conjugado con enlazadores).

Calicheamicina

En otras realizaciones, el inmunoconjugado comprende un anticuerpo conjugado con una o mas moleculas de calicheamicina. La familia calicheamicina de antibioticos son capaces de producir roturas de ADN bicatenario a concentraciones subpicomolares. Para la preparacion de conjugados de la familia de la calicheamicina, vease Patentes de Estados Unidos 5.712.374, 5.714.586, 5.739.116, 5.767.285, 5.770.701, 5.770.710, 5.773.001, 5.877.296 (todas de American Cyanamid Company). Los analogos estructurales de calicheamicina que pueden usarse incluyen, pero sin limitacion a, y1I, a2I, a3I, N-acetil-Y1I, PSAG y 0I1 (Hinman et al., Cancer Research 53: 3336-3342 (1993), Lode et al., Cancer Research 58:2925-2928 (1998) y las patentes de Estados Unidos anteriormente mencionadas de American Cyanamid). Otro farmaco antitumoral con el que puede conjugarse el

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anticuerpo es QFA que es un antifolato. Tanto calicheamicina como QFA tienen sitios intracelulares de accion y no cruzan facilmente la membrana plasmatica. Por lo tanto, la captation celular de estos agentes mediante internalization mediada por anticuerpos potencia en gran medida sus efectos citotoxicos.

Otros agentes citotoxicos

Otros agentes antitumorales que pueden conjugarse con los anticuerpos incluyen BCNU, estreptozocina, vincristina y 5-fluororacilo, la familia de agentes conocida colectivamente como complejo LL-E33288 descrita en las patentes de Estados Unidos 5.053.394, 5.770.710, as^ esperamicinas (patente de Estados Unidos 5.877.296).

Las toxinas enzimaticamente activas y fragmentos de las mismas que pueden usarse incluyen cadena A de la difteria, fragmentos activos que no se unen de toxina difterica, cadena A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadena A de ricina, cadena A de abrina, cadena A de modecina, alfa sarcina, proteinas de Aleurites fordii, proteinas diantinas, proteinas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S), inhibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de Saponaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos. Vease, por ejemplo, el documento WO 93/21232, publicado el 28 de octubre de 1993.

La presente invention contempla ademas un inmunoconjugado formado entre un anticuerpo y un compuesto con actividad nucleolitica (por ejemplo, una ribonucleasa o una ADN endonucleasa tal como una desoxirribonucleasa, DNasa).

Para destruction selectiva del tumor, el anticuerpo puede comprender un atomo altamente radiactivo.

Estan disponibles diversos isotopos radiactivos/produccion de anticuerpos radioconjugados. Los ejemplos incluyen At211, |131, |125, y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isotopos radiactivos de Lu. Cuando el conjugado se usa para detection, este puede comprender un atomo radiactivo para estudios escintigraficos, por ejemplo, tc99m o 1123, o un marcador de espin para captura de imagenes por resonancia magnetica nuclear (RMN) (tambien conocida como captura de imagenes por resonancia magnetica, irm), tal como yodo-123 de nuevo, yodo-131, Indio- 111, fluor-19, carbono-13, nitrogeno-15, oxigeno-17, gadolinio, manganeso o hierro.

Los radiomarcadores u otros marcadores pueden incorporarse en el conjugado de maneras conocidas. Por ejemplo, el peptido puede biosintetizarse o puede sintetizarse por sintesis de aminoacidos quimica usando precursores de aminoacidos adecuados que implican, por ejemplo, fluor-19 en lugar de hidrogeno. Pueden unirse marcadores tales como tc99m o I123, Re186, Re188 e In111 mediante un resto de cisteina en el peptido. Puede unirse ltrio-90 mediante un resto de lisina. El metodo IODOGEN (Fraker et al. (1978) Biochem. Biophys Res. Commun. 80:49-57) puede usarse para incorporar yodo-123. “Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" (Chatal, CRC Press 1989) describe otros metodos en detalle.

Pueden prepararse conjugados del anticuerpo y agente citotoxico usando diversos agentes de acoplamiento bifuncionales tales como N-succinimidil-3-(2-piridilditio) propionato (SPDP), succinimidil-4-(N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato (SMCC), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoesteres (tales como dimetil adipimidato HCl), esteres activos (tales como disuccinimidil suberato), aldehidos (tales como glutaraldehido), compuestos de bis-azido (tales como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tales como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (tales como tolueno 2,6-diisocianato), y compuestos de fluor bis- activos (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, puede prepararse una inmunotoxina de ricina como se describe en Vitetta et al., Science 238:1098 (1987). El acido 1-isotiocianatobencil-3-metildietilen triaminopentaacetico marcado con carbono 14 (MX-DTPA) es un agente quelante a modo de ejemplo para conjugation de radionucleotidos con el anticuerpo. Vease documento WO94/11026. El enlazador puede ser un "enlazador escindible" que facilita la liberation del farmaco citotoxico en la celula. Por ejemplo, puede usarse un enlazador labil por acido, enlazador sensible a peptidasa, enlazador fotolabil, enlazador de dimetilo o enlazador que contiene disulfuro (Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992), Patente de Estados Unidos N.° 5.208.020).

Los compuestos contemplan expresamente, pero sin limitation, ADC preparado con reactivos de articulation: BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo- GMBS, Sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC y sulfo-SMPB y SVSB (succinimidil-(4-vinilsulfona) benzoato) que estan disponibles en el mercado, (por ejemplo, de Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL, Estados Unidos). Vease paginas 46-498, 2003-2004 Applications Handbook and Catalog.

Preparation de conjugados farmacologicos de anticuerpos

En los conjugados farmacologicos de anticuerpos (ADC), un anticuerpo (Ab) se conjuga con uno o mas restos farmacologicos (D), por ejemplo de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 restos farmacologicos por anticuerpo, mediante un enlazador (L). El ADC de Formula I puede prepararse por varias rutas empleando reacciones quimicas organicas, condiciones y reactivos conocidos por los expertos en la materia, incluyendo: (1) reaction de un grupo nucleofilo de un anticuerpo con un reactivo enlazador bivalente, para formar Ab-L, mediante un enlace covalente, seguido de reaccion con un resto farmacologico D; y (2) reaccion de un grupo nucleofilo de un

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resto farmacologico con un reactivo enlazador bivalente, para formar D-L, mediante un enlace covalente, seguido de reaccion con el grupo nucleofilo de un anticuerpo. Se describen en el presente documento metodos adicionales para preparar ADC.

Ab-(L-D)p I

El enlazador puede estar compuesto de uno o mas componentes enlazadores. Los componentes enlazadores a modo de ejemplo incluyen 6-maleimidocaproilo ("MC"), maleimidopropanoNo (MP), valina-citrulina ("val-cit"), alanina- fenilalanina (ala-phe), p-paminobenciloxicarbonilo ("PAB"), N-Succinimidilo 4-(2-piridiltio) pentanoato ("SPP"), N- succinimidil 4-(N-maleimidometil) ciclohexano-1 carboxilato ("SMCC”) y N-Succinimidil (4-yodo-acetil) aminobenzoato ("SIAB"). Se conocen en la tecnica componentes enlazadores adicionales y algunos se describen en el presente documento. Vease tambien "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands", N.° de serie de Estados Unidos 10/983.340, presentado el 5 de Noviembre de 2004.

En algunas realizaciones, el enlazador puede comprender restos de aminoacidos. Los componentes enlazadores de aminoacidos a modo de ejemplo incluyen un dipeptido, un tripeptido, un tetrapeptido o un pentapeptido. Los dipeptidos a modo de ejemplo incluyen: valina-citrulina (vc o val-cit), alanina-fenilalanina (af o ala-phe). Los tripeptidos a modo de ejemplo incluyen: glicina-valina-citrulina (glival-cit) y glicina-glicina-glicina (gly-gly-gly). Los restos de aminoacidos que comprenden un componente enlazador de aminoacidos incluyen los de origen natural, asi como aminoacidos menores y analogos de aminoacidos de origen no natural, tales como citrulina. Los componentes enlazadores de aminoacidos pueden disenarse y optimizarse en su selectividad para escision enzimatica por una enzima particular, por ejemplo, una proteasa asociada a tumor, catepsina B, C y D, o una plasmina proteasa.

Los grupos nucleofilos en anticuerpos incluyen, pero sin limitacion: (i) grupos amino N-terminales, (ii) grupos amino de cadena lateral, por ejemplo lisina, (iii) grupos tioles de cadena lateral, por ejemplo cisteina, y (iv) grupos hidroxilo o amino de azucares en los que el anticuerpo esta glucosilado. Los grupos amino, tiol e hidroxilo son nucleofilos y son capaces de reaccionar para formar enlaces covalentes con grupos electrofilos en restos enlazadores y reactivos enlazadores incluyendo: (i) esteres activos tales como esteres de NHS, esteres de HOBt, haloformatos y haluros acidos; (ii) alquil y bencil haluros tales como haloacetamidas; (iii) aldehidos, cetonas, carboxilo y grupos maleimida. Ciertos anticuerpos tienen disulfuros intercatenarios reducibles, es decir, enlaces de cisteina. Los anticuerpos pueden hacerse reactivos para conjugation con reactivos enlazadores por tratamiento con un agente reductor tal como DTT (ditiotreitol). Cada enlace de cisteina formara por lo tanto, teoricamente, dos nucleofilos tiol reactivos. Pueden introducirse grupos nucleofilos adicionales en anticuerpos mediante la reaccion de lisinas con 2-iminotiolano (reactivo de Traut) dando como resultado conversion de una amina en un tiol. Pueden introducirse grupos tiol reactivos en el anticuerpo (o fragmento del mismo) introduciendo uno, dos, tres, cuatro o mas restos de cisteina (por ejemplo, preparando anticuerpos mutantes que comprenden uno o mas restos de aminoacidos de cisteina no nativos).

Tambien pueden producirse conjugados farmacologicos de anticuerpos mediante modification del anticuerpo para introducir restos electrofilos, que pueden reaccionar con sustituyentes nucleofilos en el reactivo enlazador o farmaco. Los azucares de anticuerpos glucosilados pueden oxidarse, por ejemplo con reactivos oxidantes de peryodato, para formar grupos aldehido o cetona que pueden reaccionar con el grupo amino de reactivos enlazadores o restos farmacologicos. Los grupos de base de Schiff de imina resultantes pueden formar un enlace estable, o pueden reducirse, por ejemplo por reactivos de borohidruro para formar enlaces de amina estables. En una realization, la reaccion de la parte de carbohidrato de un anticuerpo glucosilado con galactosa oxidasa o metaperyodato sodico puede producir grupos carbonilo (aldehido y cetona) en la proteina que pueden reaccionar con grupos apropiados en el farmaco (Hermanson, Bioconjugate Techniques). En otra realizacion, las proteinas que contienen restos de serina o treonina N terminales pueden reaccionar con metaperyodato sodico, dando como resultado la production de un aldehido en lugar del primer aminoacido (Geoghegan y Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3:138-146; documento US 5362852). Dicho aldehido puede hacerse reaccionar con un resto farmacologico o nucleofilo enlazador.

De forma similar, los grupos nucleofilos en un resto farmacologico incluyen, pero sin limitacion: amino, tiol, hidroxilo, hidracida, oxima, hidracina, tiosemicarbazona, carboxilato de hidracina y grupos arilhidracida capaces de reaccionar para forma enlaces covalentes con grupos electrofilos en restos enlazadores y reactivos enlazadores incluyendo: (i) esteres activos tales como esteres de NHS, esteres de HOBt, haloformatos y haluros acidos; (ii) alquil y bencil haluros tales como haloacetamidas; (iii) aldehidos, cetonas, carboxilo y grupos maleimida

Como alternativa, una proteina de fusion que comprende el anticuerpo y agente citotoxico, puede prepararse, por ejemplo, mediante tecnicas recombinantes o sintesis peptidica. La longitud de ADN puede comprender regiones respectivas que codifican las dos partes del conjugado bien adyacentes entre si o bien separadas por una region que codifica un peptido enlazador que no destruye las propiedades deseadas del conjugado.

En otra realizacion mas, el anticuerpo puede conjugarse con un "receptor" (tal como estreptavidina) para utilization en predireccion tumoral en la que el conjugado anticuerpo-receptor se administra al paciente, seguido de retirada de conjugado no unido de la circulation usando un agente de clarification y despues administration de un “ligando” (por

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ejemplo, avidina) que se conjuga con un agente citotoxico (por ejemplo, radionucleotido).

Formulaciones farmaceuticas

Se preparan formulaciones terapeuticas que comprenden un anticuerpo de la invention para almacenamiento mezclando el anticuerpo que tiene el grado deseado de pureza con vehiculos, excipientes o estabilizadores fisiologicamente aceptables opcionales (Remington: The Science y Practice of Pharmacy 20a Edition (2.000)), en forma de soluciones acuosas, formulaciones liofilizadas u otras secas. Los vehiculos, excipientes o estabilizadores aceptables no son toxicos para receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas, e incluyen tampones tales como fosfato, citrato, histidina y otros acidos organicos; antioxidantes incluyendo acido ascorbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencilamonio, cloruro de hexametonio, cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butilico o bencilico; alquil parabenos tales como metil o propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipeptidos de bajo peso molecular (de menos de aproximadamente 10 restos); proteinas, tales como albumina de suero, gelatina, o inmunoglobulinas; polimeros hidrofilos tales como polivinilpirrolidona; aminoacidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, o lisina; monosacaridos, disacaridos y otros carbohidratos incluyendo glucosa, manosa, o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azucares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales tales como sodio; complejos metalicos (por ejemplo, complejos de Zn-proteina); y/o tensioactivos no ionicos tales como TWEEN™, PLURONICS™ o polietilenglicol (PEG).

La formulation del presente documento tambien puede contener mas de un compuesto activo segun sea necesario para tratar la indication particular, preferentemente los que tienen actividades complementarias que no se afectan de forma adversa entre si. Dichas moleculas estan presentes convenientemente en combination en cantidades que son eficaces para el fin pretendido.

Los principios activos tambien pueden inmovilizarse en una microcapsula preparada, por ejemplo, por tecnicas de coacervacion o mediante polimerizacion interfacial, por ejemplo, microcapsula de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcapsula de poli-(metil-metacilato), respectivamente, en sistemas de suministro de farmacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albumina, microemulsiones, nanoparticulas y nanocapsulas) o en macroemulsiones. Dichas tecnicas se desvelan en Remington: The Science y Practice of Pharmacy 20a edicion (2000).

Las formulaciones para usar para administration in vivo deben ser esteriles. Esto se consigue facilmente mediante filtration a traves de membranas de filtration esteriles.

Pueden prepararse preparaciones de liberation sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberation sostenida incluyen matrices semipermeables de polimeros hidrofobos solidos que contienen la inmunoglobulina de la invencion, estando dichas matrices en forma de articulos moldeados, por ejemplo, peliculas o microcapsulas. Los ejemplos de matrices de liberacion sostenida incluyen poliesteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(2- hidroxietilmetacrilato), o poli(vinilalcohol)), polilactidos (Patente de Estados Unidos N.° 3.773.919), copolimeros de acido L-glutamico y y etil-L-glutamato, etilen-vinil acetato no degradable, copolimeros de acido lactico-acido glicolico degradables tales como LUPRON DEPOT™ (microesferas inyectables compuestas de copolimero de acido lactico- acido glicolico y acetato de leuprolide) y acido poli-D-(-)-3- hidroxibutirico. Aunque polimeros tales como etilen-vinil acetato y acido lactico-acido glicolico permiten la liberacion de moleculas durante mas de 100 dias, ciertos hidrogeles liberan proteinas durante periodos de tiempo mas cortos. Cuando permanecen en el cuerpo durante un periodo largo inmunoglobulinas encapsuladas, estas pueden desnaturalizarse o agregarse como resultado de exposition a humedad a 37 °C, dando como resultado una perdida de actividad biologica y posibles cambios en la inmunogenicidad. Pueden idearse estrategias racionales para estabilizacion dependiendo del mecanismo implicado. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de agregacion es formation de enlaces S-S intermoleculares mediante intercambio de tio-disulfuro, puede conseguirse estabilizacion modificando restos de sulfhidrilo, liofilizando a partir de soluciones acidas, controlando el contenido de humedad, usando aditivos apropiados y desarrollando composiciones de matrices polimericas especificas.

Usos

Un anticuerpo del presente documento puede usarse, por ejemplo, en metodos terapeuticos in vitro, ex vivo e in vivo.

La invencion proporciona composiciones utiles para modular las patologias asociadas a la expresion y/o la actividad de FGF19 y/o FGFR4, tal como expresion y/o actividad aumentada o expresion y/o actividad indeseada, comprendiendo dichos metodos administracion de una dosis eficaz de un anticuerpo anti-FGF19 a un individuo que necesite dicho tratamiento. En algunas realizaciones, la patologia se asocia a expresion aumentada de FGF19, y la patologia comprende la colestasis o desregulacion del metabolismo de acido biliar.

En un aspecto, la invencion se refiere a metodos para tratar o prevenir un tumor, un cancer y/o un trastorno proliferativo celular, comprendiendo los metodos administrar una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-FGF19 a un

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individuo que necesite dicho tratamiento.

En un aspecto, la invencion se refiere a metodos para tratar o prevenir un tumor, un cancer y/o un trastorno proliferativo celular asociado a la expresion y/o actividad aumentada de FGF19, comprendiendo los metodos administrar una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-FGF19 a un individuo que necesite dicho tratamiento.

En un aspecto, la invencion se refiere a metodos para tratar o prevenir un tumor, un cancer y/o un trastorno proliferativo celular asociado a expresion y/o actividad aumentada de FGFR4, comprendiendo los metodos administrar una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-FGF19 a un individuo que necesite dicho tratamiento.

En un aspecto, la invencion se refiere a metodos para tratar y/o prevenir un trastorno hepatico, comprendiendo los metodos administrar una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-FGF19 a un individuo que necesite dicho tratamiento. En algunas realizaciones, el trastorno hepatico es cirrosis.

En un aspecto, la invencion se refiere a metodos para tratar y/o prevenir un trastorno de debilitamiento, comprendiendo los metodos administrar una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-FGF19 a un individuo que necesite dicho tratamiento. En algunas realizaciones, el individuo tiene un tumor, un cancer y/o un trastorno proliferativo celular.

Se entiende que cualquier anticuerpo anti-FGF19 adecuado puede usarse en metodos de tratamiento, incluyendo anticuerpos monoclonales y/o policlonales, un anticuerpo humano, un anticuerpo quimerico, un anticuerpo de afinidad madurada, un anticuerpo humanizado y/o un fragmento de anticuerpo. En algunas realizaciones, se usa cualquier anticuerpo anti-FGF19 descrito en el presente documento para tratamiento.

Ademas, al menos algunos de los anticuerpos de la invencion pueden unirse con antigeno de otra especie. En consecuencia, los anticuerpos de la invencion pueden usarse para unirse con actividad de antigeno especifica, por ejemplo, en un cultivo celular que contiene el antigeno, en sujetos humanos o en otros sujetos mamiferos que tienen el antigeno con el que reacciona de forma cruzada un anticuerpo de la invencion (por ejemplo chimpance, babuino, titi, cynomolgus y rhesus, cerdo o raton). En una realizacion, el anticuerpo de la invencion puede usarse para inhibir actividades del antigeno poniendo en contacto el anticuerpo con el antigeno de modo que se inhiba la actividad del antigeno. Preferentemente, el antigeno es una molecula proteica humana.

En una realizacion, puede usarse un anticuerpo de la invencion en un metodo para unir un antigeno en un individuo que padece un trastorno asociado a una expresion y/o actividad de antigeno aumentada, que comprende administrar al sujeto un anticuerpo de la invencion de modo que se una al antigeno en el sujeto. Preferentemente, el antigeno es una molecula proteica humana y el sujeto es un sujeto humano. Como alternativa, el sujeto puede ser un mamifero que expresa el antigeno con el que se une un anticuerpo de la invencion. Adicionalmente, el sujeto puede ser un mamifero en el que se ha introducido el antigeno (por ejemplo, mediante administration del antigeno o mediante expresion de un transgen antigenico). Un anticuerpo de la invencion puede administrarse a un sujeto humano para fines terapeuticos. Ademas, un anticuerpo de la invencion puede administrarse a un mamifero no humano que expresa un antigeno con el que reacciona de forma cruzada la inmunoglobulina (por ejemplo, un primate, cerdo o raton) para fines veterinarios o como un modelo animal de enfermedad humana. Con respecto a esto ultimo, dichos modelos animales pueden ser utiles para evaluar la eficacia terapeutica de anticuerpos de la invencion (por ejemplo, ensayo de dosificaciones y ciclos temporales de administracion).

Los anticuerpos de la invencion pueden usarse para tratar, inhibir, retardar la progresion de, retardar/prevenir la reaparicion de, aliviar, o prevenir enfermedades, trastornos o afecciones asociadas a expresion y/o actividad de una o mas moleculas antigenicas.

En ciertas realizaciones, un inmunoconjugado que comprende un anticuerpo conjugado con uno o mas agentes citotoxicos se administra al paciente. En algunas realizaciones, el inmunoconjugado y/o antigeno con el que se une se internaliza por la celula, dando como resultado eficacia terapeutica aumentada del inmunoconjugado en la destruction de la celula diana con la que se une. En una realizacion, el agente citotoxico se dirige a o interfiere con acido nucleico en la celula diana. En una realizacion, el agente citotoxico se dirige a o interfiere con la polimerizacion de microtubulos. Los ejemplos de dichos agentes citotoxicos incluyen cualquiera de los agentes quimioterapeuticos indicados en el presente documento (tales como un maitansinoide, auristatina, dolastatina o una calicheamicina), un isotopo radiactivo, una ribonucleasa o una ADN endonucleasa.

En cualquiera de los metodos del presente documento, se puede administrar al sujeto o paciente junto con el anticuerpo en el presente documento una cantidad eficaz de un segundo medicamento (en el que el anticuerpo del presente documento es un primer medicamento), que es otro agente activo que puede tratar la afeccion en el sujeto que requiere tratamiento. Por ejemplo, un anticuerpo de la invencion puede coadministrarse con otro anticuerpo, agente o agentes quimioterapeuticos (incluyendo cocteles de agentes quimioterapeuticos), agente o agentes antiangiogenicos, agente o agentes inmunosupresores, citocina o citocinas, antagonista o antagonistas de citocinas y/o agente o agentes inhibidores del crecimiento. El tipo de dicho segundo medicamento depende de diversos factores, incluyendo el tipo de trastorno, tal como cancer o un trastorno autoinmunitario, la gravedad de la

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enfermedad, la afeccion y edad del paciente, el tipo y dosis del primer medicamento empleado, etc.

Cuando un anticuerpo de la invencion inhibe el crecimiento tumoral, por ejemplo, puede ser particularmente deseable combinarlo con uno o mas agentes terapeuticos adicionales que tambien inhiban el crecimiento tumoral. Por ejemplo, un anticuerpo de la invencion puede combinarse con un agente antiangiogenico, tal como un anticuerpo anti-VEGF (por ejemplo, AVASTIN®) y/o anticuerpos anti-ErbB (por ejemplo anticuerpo anti-HER2 trastuzumab HERCEPTIN® o un anticuerpo anti-HER2 que se una el dominio II de hER2, tal como anticuerpo anti- HER2 pertuzumab OMNITARG™) en un esquema de tratamiento, por ejemplo en el tratamiento de cualquiera de las enfermedades descritas en el presente documento, incluyendo cancer colorrectal, cancer de pulmon, carcinoma hepatocelular, cancer de mama y/o cancer pancreatico. Como alternativa, o adicionalmente, el paciente puede recibir radioterapia combinada (por ejemplo, irradiacion de haz externo o terapia con un agente marcado con radiactividad, tal como un anticuerpo). Dichas terapias combinadas indicadas anteriormente incluyen administracion combinada (en la que los dos o mas agentes se incluyen en la misma formulacion o formulaciones separadas), y administracion separada, en cuyo caso, la administracion del anticuerpo de la invencion puede producirse antes de, y/o despues de, la administracion de la terapia o las terapias complementarias. Ademas, la combination de un anticuerpo de la presente invencion con un agente relativamente no citotoxico tal como otra molecula biologica, por ejemplo, se espera que otro anticuerpo reduzca la citotoxicidad frente a la combinacion del anticuerpo con un agente quimioterapeutico de otro agente que es altamente toxico para celulas.

El tratamiento con una combinacion del anticuerpo del presente documento con uno o mas segundos medicamentos preferentemente da como resultado una mejora de las senales o sintomas de cancer. Por ejemplo, dicha terapia puede dar como resultado una mejora de la supervivencia (supervivencia general y/o supervivencia sin progresion) en relation con un paciente tratado solamente con el segundo medicamento (por ejemplo, un agente quimioterapeutico solamente), y/o puede dar como resultado una respuesta objetiva *(parcial o completa, preferentemente completa). Ademas, el tratamiento con la combinacion de un anticuerpo en el presente documento y uno o mas segundos medicamentos preferentemente da como resultado un beneficio terapeutico aditivo, y mas preferentemente sinergico (o mayor que el aditivo), al paciente. Preferentemente, en este metodo de combinacion el tiempo entre al menos una administracion del segundo medicamento y al menos una administracion del anticuerpo del presente documento es de aproximadamente un mes o menos, mas preferentemente, de aproximadamente dos semanas o menos.

Para el tratamiento de canceres, el segundo medicamento es preferentemente otro anticuerpo, agente quimioterapeutico (incluyendo cocteles de agentes quimioterapeuticos), agente antiangiogenico, agente inmunosupresor, profarmaco, citocina, antagonista de citocinas, radioterapia citotoxica, corticosteroides, antiemetico, vacuna de cancer, analgesico, agente antivascular y/o agente inhibidor del crecimiento. El agente citotoxico incluye un agente que interactua con ADN, los antimetabolitos, los inhibidores de topoisomerasa I o II, o los agentes inhibidores o estabilizadores del huso (por ejemplo, preferentemente alcaloides de la vinca, mas preferentemente seleccionados de vinblastina, desoxivinblastina, vincristina, vindesina, vinorelbina, vinepidina, vinfosiltina, vinzolidina y vinfunina), o cualquier agente usado en quimioterapia tal como 5-FU, un taxano, doxorrubicina o dexametasona.

En otra realization, el segundo medicamento es otro anticuerpo usado para tratar canceres tales como los dirigidos contra el dominio extracelular del receptor HER2/neu, por ejemplo trastuzumab, o uno de sus fragmentos funcionales, inhibidor de pan-HER, un inhibidor de Src, un inhibidor de MEK o un inhibidor de EGFR (por ejemplo, un anticuerpo anti-EGFR (tal como uno que inhibe la actividad tirosina quinasa del EGFR), que es preferentemente el anticuerpo monoclonal de raton 225, su derivado quimerico de raton-hombre C225, o un anticuerpo humanizado derivado de este anticuerpo 225 o agentes naturales derivados, dianilinoftalimidas, pirazolo o pirrolopiridopirimidinas, quinazilinas, gefitinib, erlotinib, cetuximab, ABX-EFG, canertinib, EKB-569 y PKI-166), o inhibidor eGfR/HER-2 doble tal como lapatanib. Los segundos medicamentos adicionales incluyen alemtuzumab (CAMPATHTM), FavID (IDKLH), anticuerpos de CD20 con glucosilacion alterada, tales como GA-101/GlYcaRT™, oblimersen (GENASENSE™), talidomida y analogos de los mismos, tales como lenalidomida (REVLIMID™), imatinib, sorafenib, ofatumumab (HUMAX-CD20™), anticuerpo anti-CD40, por ejemplo, SGN-40, y anticuerpo anti-CD-80, por ejemplo galiximab.

El agente antiemetico es preferentemente clorhidrato de ondansetron, clorhidrato de granisetron, metroclopramida, domperidona, haloperidol, ciclizina, lorazepam, proclorperazina, dexametasona, levomepromazina o tropisetron. La vacuna es preferentemente ADN de GM-CSF y vacunas basadas en celulas, vacuna de celulas dendriticas, vacunas viricas recombinantes, vacunas de proteina de choque termico (HSP), vacunas de tumores alogenicos o autologos. El agente analgesico preferentemente es ibuprofeno, naproxeno, trisalicilato magnesico de colina o clorhidrato de oxicodona. El agente antivascular preferentemente es bevacizumab o rhuMAb-VGEF. Los segundos medicamentos adicionales incluyen agentes antiproliferativos tales como inhibidores de proteina farnesil transferasa, inhibidores anti-VEGF, inhibidores de p53, o inhibidores de PDGFR. El segundo medicamento en el presente documento incluye tambien terapia de diana biologica tal como tratamiento con anticuerpos asi como terapia dirigida a moleculas pequenas, por ejemplo, contra ciertos receptores.

Se han identificado muchos agentes anti-angiogenicos y se conocen en la tecnica, incluyendo los enumerados en el presente documento, por ejemplo, enumerados en definiciones, y en, por ejemplo Carmeliet y Jain, Nature 407:249-

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257 (2.000); Ferrara et al., Nature Reviews:Drug Discovery, 3:391-400 (2004); y Sato Int. J. Clin. Oncol., 8:200-206 (2003). Vease tambien solicitud de patente de Estados Unidos US20030055006. En una realizacion, se usa un anticuerpo anti-FGF19 en combinacion con un anticuerpo neutralizante anti-VEGF (o fragmento) y/u otro antagonista de VEGF o un antagonista de receptor de VEGF incluyendo, pero sin limitacion, por ejemplo, fragmentos de receptor de VEGF soluble (por ejemplo, VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, neuropilinas (por ejemplo, NRP1, NRP2)), aptameros capaces de bloquear VEGF o VEGFR, anticuerpos neutralizantes anti-VEGFR, inhibidores de bajo peso molecular VEGFR tirosina quinasas (RTK), estrategias antisentido para VGEF, ribozimas contra VEGF o receptores de VEGF, variantes antagonistas de VGEF; y cualquier combinacion de los mismos. Como alternativa, o adicionalmente, pueden coadministrarse opcionalmente dos o mas inhibidores de angiogenesis al paciente ademas de antagonista de VEGF y otro agente. En ciertas realizaciones, uno o mas agentes terapeuticos adicionales, por ejemplo, agentes antineoplasicos, pueden administrarse en combinacion con anticuerpo anti-FGF19, el antagonista de VEGF y un agente antiangiogenesis.

Se han descrito anteriormente agentes quimioterapeuticos utiles en el presente documento, por ejemplo, en la definition de "agente quimioterapeutico".

Los segundos medicamentos a modo de ejemplo incluyen un agente alquilante, un antagonista de folato, un antagonista de pirimidina, un antibiotico citotoxico, un compuesto de platino o compuesto basado en platino, un taxano, un alcaloide de la vinca, un inhibidor de c-Kit, un inhibidor de topoisomerasa, un inhibidor antiangiogenesis tal como un inhibidor anti-VEGF, un inhibidor de HER-2, un inhibidor de EGFR o un inhibidor doble de EGFR/HER-2 quinasa, un anti-estrogeno tal como fulvestrant, y un agente de terapia hormonal, tal como carboplatino, cisplatino, gemcitabina, capecitabina, epirrubicina, tamoxifeno, un inhibidor de aromatasa y prednisona. Mas preferentemente, el cancer es cancer colorrectal y el segundo medicamento es un inhibidor de EGFR tal como erlotinib, un inhibidor anti-VEGF tal como bevacizumab, o es cetuximab, arinotecan, irinotecan, o FOLFOX, o el cancer es cancer de mama y el segundo medicamento es un modulador antiestrogenos tal como fulvestrant, tamoxifeno o un inhibidor de aromatasa tal como letrozol, exemestano, o anastrozol, o es un inhibidor de VEGF tal como bevacizumab, o es un agente quimioterapeutico tal como doxorrubicina, y/o un taxano tal como paclitaxel, o es un inhibidor anti-HER-2 tal como trastuzumab, o un inhibidor doble de EGFR/HER-2 quinasa tal como lapatinib o un regulador negativo de HER-2 tal como 17AAG (derivado de geldanamicina que es veneno de proteina de choque termico [Hsp]90) (por ejemplo, para canceres de mama que han progresado en trastuzumab). En otras realizaciones, el cancer es cancer de pulmon, tal como cancer de pulmon microcitico y el segundo medicamento es un inhibidor de VEGF tal como bevacizumab, o un inhibidor de EGFR tal como, por ejemplo, erlotinib o un inhibidor de c-Kit tal como por ejemplo imatinib. En otras realizaciones, el cancer es cancer de higado, tal como carcinoma hepatocelular, y el segundo medicamento es un inhibidor de EGFR tal como erlotinib, un agente quimioterapeutico tal como doxorrubicina o irinotecan, un taxano tal como paclitaxel, talidomida y/o interferon. Ademas, un agente quimioterapeutico preferido para terapia de primera linea de cancer es taxotere, solo o en combinacion con otros segundos medicamentos. Mas preferentemente, si se administra quimioterapia, se proporciona primero, seguido de los anticuerpos del presente documento.

Dichos segundos medicamentos pueden administrarse en un periodo de 48 horas despues de administrarse los anticuerpos del presente documento, o en un periodo de 24 horas, o en un periodo de 12 horas, o en un periodo de 3-12 horas despues de dicho agente, o pueden administrarse durante un periodo de tiempo preseleccionado, que es preferentemente de aproximadamente 1 a 2 dias. Ademas, la dosis de dicho agente puede ser subterapeutica.

Los anticuerpos del presente documento pueden administrarse simultaneamente, secuencialmente, o alternando con el segundo medicamento o tras ausencia de sensibilidad con otra terapia. Por lo tanto, la administration combinada de un segundo medicamento incluye coadministracion (administraciones simultaneas), usando formulaciones separadas o una unica formulation farmaceutica, y administracion consecutiva en cualquier orden, en el que preferentemente hay un periodo de tiempo durante el que ambos (o todos) los medicamentos ejercen simultaneamente sus actividades biologicas. Todos estos segundos medicamentos pueden usarse en combinacion entre si o por si solos con el primer medicamento, de modo que el "segundo medicamento" expresado como se usa en el presente documento no significa que sea el unico medicamento ademas del primer medicamento, respectivamente. Por lo tanto, no es necesario que el segundo medicamento sea un medicamento, sino que puede constituir o comprende mas de uno de dichos farmacos.

Estos segundos medicamentos como se exponen en el presente documento se usan en general en las mismas dosificaciones y con vias de administracion como el primer medicamento, o aproximadamente de 1 a 99 % de las dosificaciones de los primeros medicamentos. Si dichos segundos medicamentos se usan, preferentemente, se usan en cantidades menores que si no estuviera presente el primer medicamento, especialmente en dosificaciones posteriores mas alla de la dosificacion inicial con el primer medicamento, para eliminar o reducir los efectos secundarios provocados por los mismos.

La invention tambien se refiere a metodos y composiciones para inhibir o prevenir el crecimiento tumoral recidivante o crecimiento de celulas cancerosas recidivante. El crecimiento tumoral recidivante o crecimiento de celulas cancerosas recidivante se usa para describir una afeccion en la que los pacientes que se han sometido a o se tratan con una o mas terapias disponibles en la actualidad (por ejemplo, terapias de cancer, tales como quimioterapia,

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radioterapia, cio^a, terapia hormonal y/o terapia biologica/inmunoterapia, terapia de anticuerpos anti-VEGF, particularmente un regimen terapeutico convencional para el cancer particular) no son clinicamente adecuadas para tratar a los pacientes o los pacientes ya no reciben ningun efecto beneficioso de la terapia de modo que estos pacientes necesitan terapia eficaz adicional. Como se usa en el presente documento, la frase tambien puede referirse a una afeccion del paciente "no sensible/refractario", por ejemplo, que describe pacientes que responden a la terapia pero padecen efectos secundarios, desarrollan resistencia, no responden a la terapia, no responden satisfactoriamente a la terapia, etc. En diversas realizaciones, un cancer es crecimiento tumoral recidivante o crecimiento de celulas cancerosas recidivante cuando el numero de celulas cancerosas no se ha reducido significativamente, o ha aumentado, o el tamano tumoral no se ha reducido significativamente, o ha aumentado, o no consigue ninguna reduccion adicional del tamano o del numero de celulas cancerosas. La determinacion de si las celulas cancerosas son crecimiento tumoral recidivante o crecimiento de celulas cancerosas recidivante puede realizarse bien in vivo o bien in vitro por cualquier metodo conocido en la tecnica para ensayar la eficacia del tratamiento en celulas cancerosas, usando los significados aceptados en la tecnica de "recidivante" o "refractario” o “no sensible" en dicho contexto. Un tumor resistente a tratamiento anti-VEGF es un ejemplo de un crecimiento tumoral recidivante.

La invencion se refiere a metodos para bloquear o reducir el crecimiento tumoral recidivante o el crecimiento de celulas cancerosas recidivante en un sujeto administrando uno o mas anticuerpos anti-FGF19 para bloquear o reducir el crecimiento tumoral recidivante o el crecimiento de celulas cancerosas recidivante en el sujeto. En ciertas realizaciones, el antagonista puede administrarse despues del producto terapeutico de cancer. En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-FGF19 se administra simultaneamente con terapia de cancer. Como alternativa, o adicionalmente, la terapia de anticuerpo anti-FGF19 se alterna con otra terapia de cancer, que puede realizarse en cualquier orden. La invencion tambien se refiere a metodos para administrar uno o mas anticuerpos inhibidores para evitar la aparicion o reaparicion de cancer en pacientes predispuestos a tener cancer. En general, el sujeto estaba o se esta sometiendo simultaneamente a terapia de cancer. En una realizacion, la terapia de cancer es tratamiento con un agente antiangiogenesis por ejemplo, un antagonista de VEGF. El agente antiangiogenesis incluye los conocidos en la tecnica y los hallados en las definiciones del presente documento. En una realizacion, el agente antiangiogenesis es un anticuerpo neutralizante anti-VEGF o fragmento (por ejemplo, A4.6.1 humanizado, AVASTIN® (Genentech, South San Francisco, CA), Y0317, M4, G6, B20, 2C3, etc.). Vease, por ejemplo, patentes de Estados Unidos 6.582.959, 6.884.879, 6.703.020; WO98/45332; WO 96/30046; WO94/10202; EP 0666868B1; solicitudes de patente de Estados Unidos 20030206899, 20030190317, 20030203409 y 20050112126; Popkov et al., Journal of Immunological Methods 288:149-164 (2004); y documento WO2005012359. Pueden administrarse agentes adicionales en combinacion con antagonista de VEGF y un anticuerpo anti-FGF19 para bloquear o reducir el crecimiento tumoral recidivante o crecimiento de celulas cancerosas recidivante.

Los anticuerpos de la invencion (y agente terapeutico adyuvante) se administran por cualquier medio adecuado, incluyendo administracion parenteral, subcutanea, intraperitoneal, intrapulmonar e intranasal y, si se desea para tratamiento local, intralesional. Las infusiones parenterales incluyen administracion intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal o subcutanea. Ademas, los anticuerpos se administran convenientemente por infusion por pulsos, particularmente con dosis decrecientes del anticuerpo. La dosificacion puede ser por cualquier via adecuada, por ejemplo mediante inyecciones, tales como inyecciones intravenosas o subcutaneas, dependiendo en parte de si la administracion es breve o cronica.

La localizacion de la diana de union de un anticuerpo de la invencion puede tomarse en consideration en la preparation y administracion del anticuerpo. Cuando la diana de union es una molecula intracelular, ciertas realizaciones de la invencion proporcionan que el anticuerpo o fragmento de union al antigeno del mismo para introducir en la celula en la que se localiza la diana de union. En una realizacion, un anticuerpo de la invencion puede expresarse intracelularmente como un intracuerpo. El termino "intracuerpo", como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo o parte de union al antigeno del mismo que se expresa intracelularmente y es capaz de unirse selectivamente con una molecula diana, como se describe, por ejemplo, en Marasco, Gene Therapy 4:11-15 (1997); Kontermann, Methods 34:163 -170 (2004); Patentes de Estados Unidos numeros 6.004.940 y 6.329.173; Publication de Solicitud de Patente de Estados Unidos N.° 2003/0104402 y Publication de PCT N.° WO2003/077945. Vease tambien, por ejemplo, documento WO96/07321 publicado el 14 de marzo de 1996, con respecto al uso de terapia genica para generar anticuerpos intracelulares.

Puede efectuarse expresion intracelular de un intracuerpo introduciendo un acido nucleico que codifica el anticuerpo deseado o parte de union a antigeno del mismo (que carece de la secuencia lider de tipo silvestre y senales secretoras normalmente asociadas al gen que codifica ese anticuerpo o fragmento de union a antigeno) en una celula diana. Pueden suministrarse uno o mas acidos nucleicos que codifican todo o una parte de un anticuerpo de la invencion a una celula diana, de modo que se expresen uno o mas intracuerpos que sean capaces de unirse con polipeptido diana intracelular y modular la actividad del polipeptido diana. Puede usarse cualquier metodo convencional para introducir acidos nucleicos en una celula, incluyendo, pero sin limitation, microinyeccion, inyeccion balistica, electroporation, precipitation con fosfato calcico, liposomas y transfection con vectores retrovirales, adenovirales, viricos adenoasociados y vaccinia que portan el acido nucleico de interes.

En ciertas realizaciones, puede introducirse acido nucleico (opcionalmente contenido en un vector) en las celulas de

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un paciente por metodos in vivo y ex vivo. En un ejemplo de suministro in vivo, se inyecta acido nucleico directamente en el paciente, por ejemplo, en el sitio donde se requiere intervencion terapeutica. En un ejemplo adicional de suministro in vivo, se introduce acido nucleico en una celula usando transfeccion con vectores virales (tales como adenovirus, virus del herpes simple I o virus adenoasociado) y sistemas basados en lipidos (son lipidos utiles para la transferencia mediada por lipidos DOTMA, DOPE y DC-Chol, por ejemplo). Para revision de ciertos protocolos de marcacion genica y terapia genica, vease Anderson et al., Science 256: 808-813 (1992) y documento WO 93/25673 y las referencias citadas en los mismos. En un ejemplo de tratamiento ex vivo, se retiran las celulas de un paciente, se introduce acido nucleico en esas celulas aisladas, y las celulas modificadas se administran al paciente bien directamente o bien, por ejemplo, encapsuladas dentro de membranas porosas que se implantan en el paciente (vease, por ejemplo, Patentes de Estados Unidos N.° 4.892.538 y 5.283.187). Un vector usado habitualmente para suministro ex vivo de un acido nucleico es un vector retroviral.

En otra realizacion, se proporcionan anticuerpos de internalizacion. Los anticuerpos pueden poseer ciertas caracteristicas que potencian el suministro de anticuerpos a celulas, o pueden modificarse para poseer dichas caracteristicas. Se conocen en este campo tecnicas para conseguir esto. Por ejemplo, se sabe que la cationizacion de un anticuerpo facilita su captacion en celulas (vease, por ejemplo, Patente de Estados Unidos N.° 6.703.019). Tambien pueden usarse lipofecciones o liposomas para suministrar el anticuerpo a celulas. Cuando se usan fragmentos de anticuerpo, el fragmento inhibidor mas pequeno que se une especificamente con la proteina diana puede ser ventajoso. Por ejemplo, basandose en las secuencias de region variables de un anticuerpo, pueden disenarse moleculas peptidicas que conservan la capacidad para unirse con la secuencia de proteina diana. Dichos peptidos pueden sintetizarse quimicamente y/o producirse por tecnologia de ADN recombinante. Vease, por ejemplo Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:7889-7893 (1993).

La entrada de anticuerpos en celulas diana puede potenciarse por otros metodos conocidos en la tecnica. Por ejemplo, ciertas secuencias, tales como las derivadas de Tat de HIV o la proteina de homeodominio de antennapedia son capaces de dirigir captacion eficaz de proteinas heterologas a traves de las membranas celulares. Vease, por ejemplo, Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. uSa (1999), 96:4325-4329.

Cuando la diana de union de un anticuerpo se localiza en el cerebro, ciertas realizaciones de la invencion posibilitan que el anticuerpo atraviese la barrera hematoencefalica. Existen varios enfoques conocidos en la tecnica para transportar moleculas a traves de la barrera hematoencefalica, incluyendo, pero sin limitacion, metodos fisicos, metodos basados en lipidos, metodos basados en celulas madre y metodos basados en receptores y canales.

Los metodos fisicos de transporte de un anticuerpo a traves de la barrera hematoencefalica incluyen, pero sin limitacion, evitar la barrera hematoencefalica completamente, o crear aperturas en la barrera hematoencefalica. Los metodos de elusion incluyen, pero sin limitacion, inyeccion directa en el cerebro (vease, por ejemplo, Papanastassiou et al., Gene Therapy 9: 398-406 (2002), suministro potenciado por conveccion/infusion instersticial (Bobo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 2076-2080 (1994)), e implantacion de un dispositivo de suministro en el cerebro (vease, por ejemplo, Gill et al., Nature Med. 9:589-595 (2003); y Gliadel Wafers™, Guildford Pharmaceutical). Los metodos para crear aperturas en la barrera incluyen, pero sin limitacion, ultrasonidos (vease, por ejemplo, publicacion de Patente de Estados Unidos N.° 2002/0038086), presion osmotica (por ejemplo, mediante administracion de manitol hipertonico (Neuwelt, E. A., Implication of the Blood-Brain Barrier and its Manipulation, Vols 1 y 2, Plenum Press, N.Y. (1989)), permeabilizacion mediante, por ejemplo, bradiquinina o permeabilizador A-7 (vease, por ejemplo, Patentes de Estados Unidos N.° 5.112.596, 5.268.164, 5.506.206 y 5.686.416), y transfeccion de neuronas que atraviesan la barrera hematoencefalica con vectores que contienen genes que codifican el anticuerpo (vease, por ejemplo, Publicacion Patente de Estados Unidos N.° 2003/0083299).

Los metodos basados en lipidos para transportar un anticuerpo a traves de la barrera hematoencefalica incluyen, pero sin limitacion, encapsular el anticuerpo en liposomas que se acoplan con fragmentos de union a anticuerpo que se unen a receptores en el endotelio vascular de la barrera hematoencefalica (vease, por ejemplo, Publicacion de Solicitud de Patente de Estados Unidos N.° 20020025313) y recubrir el anticuerpo con particulas lipoproteicas de baja densidad (vease, por ejemplo, Publicacion de Solicitud de Patente de Estados Unidos N.° 20040204354) o apolipoprotema E (vease, por ejemplo, Publicacion de Solicitud de Patente de Estados Unidos N.° 20040131692).

Los metodos basados en celulas madre para transportar un anticuerpo a traves de la barrera hematoencefalica implican modificar por ingenieria genetica celulas progenitoras neurales (NPC) para expresar el anticuerpo de interes y despues implantar las celulas madre en el cerebro del individuo para tratar. Vease Behrstock et al. (2005) Gene Ther. 15 Dic. 2005 publicacion en linea avanzada (indica que las NPC modificadas geneticamente para expresar el factor neurotrofico GDNF redujeron los sintomas de enfermedad de Parkinson cuando se implantaron en los cerebros de modelos de roedores y primates).

Los metodos basados en receptor y canal de transporte de un anticuerpo a traves de la barrera hematoencefalica incluyen, pero sin limitacion, uso de bloqueadores de glucocorticoides para aumentar la permeabilidad de la barrera hematoencefalica (vease, por ejemplo, Publicaciones de Solicitud de Patente de Estados Unidos N.° 2002/0065259, 2003/0162695 y 2005/0124533); activacion de canales de potasio (vease, por ejemplo, Publicacion de Solicitud de Patente de Estados Unidos N.° 2005/0089473), inhibicion de transportadores de farmacos ABC (vease, por ejemplo,

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Publicacion de Solicitud de Patente de Estados Unidos N.° 2003/0073713); recubrimiento de anticuerpos con una transferrina y modulation de la actividad del o los receptores de transferrina (vease, por ejemplo, Publicacion de Solicitud de Patente de Estados Unidos N.° 2003/0129186) y cationizar los anticuerpos (vease, por ejemplo, Patente de Estados Unidos N.° 5.004.697).

Los anticuerpos de la invention se formularian, dosificarian y administrarian de una manera coherente con la buena practica medica. Los factores para consideration este contexto incluyen el trastorno particular que se trate, el mamifero particular que se trate, la afeccion clinica del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de suministro del agente, el metodo de administration, el programa de administration, y otros factores conocidos por los practicantes medicos. El anticuerpo puede formularse opcionalmente con uno o mas agentes usados en la actualidad para prevenir o tratar el trastorno en cuestion, aunque no es necesario. La cantidad eficaz de dichos otros agentes depende de la cantidad de anticuerpo presente en la formulation, el tipo de trastorno o tratamiento y otros factores analizados anteriormente. Estos se usan en general en las mismas dosificaciones y con vias de administracion como se describen en el presente documento, o aproximadamente de 1 a 99 % de las dosificaciones descritas en el presente documento, o en cualquier dosificacion y por cualquier via que se determine empmca/clmicamente que sea apropiada.

Para la prevention o el tratamiento de la enfermedad, la dosificacion apropiada de un anticuerpo de la invencion (cuando se usa solo en combination con otros uno o mas agentes terapeuticos adicionales) dependera del tipo de enfermedad para tratar, el tipo de anticuerpo, la gravedad y la evolution de la enfermedad, si el anticuerpo se administra para fines preventivos o terapeuticos, la terapia previa, el historial clinico del paciente y la respuesta al anticuerpo, y el criterio del medico a cargo. El anticuerpo se administra convenientemente al paciente de una vez o a lo largo de una serie de tratamientos. Dependiendo del tipo y gravedad de la enfermedad, de aproximadamente 1 |jg/kg a 15 mg/kg (por ejemplo, 0,1 mg/kg-10 mg/kg) de anticuerpo puede ser una dosificacion candidata inicial para administracion al paciente, bien, por ejemplo, mediante una o mas administraciones separadas, o bien mediante infusion continua. Una dosificacion diaria tipica podria variar de aproximadamente 1 jg/kg a 100 mg/kg o mas, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para administraciones repetidas a lo largo de varios dias o mas, dependiendo de la afeccion, el tratamiento generalmente se mantendria hasta que se produjera una supresion deseada de sintomas de la enfermedad. Una dosificacion a modo de ejemplo del anticuerpo estaria en el intervalo de aproximadamente 0,05 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg. Por lo tanto, una o mas dosis de aproximadamente 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg o 10 mg/kg (o cualquier combinacion de las mismas) puede administrarse al paciente. Dichas dosis pueden administrarse intermitentemente, por ejemplo cada semana o cada tres semanas (por ejemplo, de modo que el paciente reciba de aproximadamente dos a aproximadamente veinte, o por ejemplo aproximadamente seis dosis del anticuerpo). Puede administrarse una dosis de carga inicial mayor, seguida de una o mas dosis menores. Un regimen de dosificacion a modo de ejemplo comprende administrar una dosis de carga inicial de aproximadamente 4 mg/kg, seguida de una dosis de mantenimiento semanal de aproximadamente 2 mg/kg del anticuerpo. Sin embargo, pueden ser utiles otros regimenes de dosificacion. El progreso de esta terapia se supervisa facilmente por tecnicas y ensayos convencionales.

Metodos de diagnostico y metodos de deteccion

Los anticuerpos anti-FGF19 de la invencion son utiles en ensayos que detectan la expresion de FGF19 (tales como ensayos de diagnostico o pronostico) en celulas o tejidos especificos en los que los anticuerpos se marcan como se describe continuamente y/o se inmovilizan en una matriz insoluble. Sin embargo, se entiende que puede usarse cualquier anticuerpo anti-FGF19 adecuado en realizaciones que impliquen deteccion y diagnostico. Se describen en el presente documento algunos metodos para preparar anticuerpos anti-FGF19 y se conocen bien en la tecnica metodos para preparar anticuerpos anti-FGF19.

En otro aspecto, la divulgation proporciona metodos para deteccion de FGF19, comprendiendo los metodos detectar complejo FGF19-anticuerpo anti-FGF19 en la muestra. El termino "deteccion" como se usa en el presente documento incluye deteccion cualitativa y/o cuantitativa (medicion de niveles) con o sin referencia a un control.

En otro aspecto, la divulgacion proporciona metodos para diagnosticar un trastorno asociado a expresion y/o actividad de FGF19, comprendiendo los metodos detectar complejo de FGF19-anticuerpo anti-FGF19 en una muestra biologica de un individuo que tiene o se sospecha que tiene el trastorno. En algunas realizaciones, la expresion de FGF19 es expresion aumentada o expresion anomala (no deseada).

En otro aspecto, la divulgacion proporciona cualquiera de los anticuerpos anti-FGF19 descritos en el presente documento, en los que el anticuerpo anti-FGF19 comprende un marcador detectable.

En otro aspecto, la divulgacion proporciona un complejo de cualquiera de los anticuerpos anti-FGF19 descritos en el presente documento y FGF19. En algunas realizaciones, el complejo esta in vivo o in vitro. En algunas realizaciones, el complejo comprende una celula cancerosa. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-FGF19 se marca de forma detectable.

Pueden usarse anticuerpos anti-FGF19 (por ejemplo, cualquiera de los anticuerpos FGF19 descritos en el presente

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documento) para la deteccion de FGF19 en uno cualquiera de varios metodos de ensayo de deteccion bien conocidos.

En un aspecto, la divulgacion proporciona metodos para detectar un trastorno asociado a expresion y/o actividad de FGF19, comprendiendo los metodos detectar FGF19 en una muestra biologica de un individuo. En algunas realizaciones, la expresion de FGF19 es expresion aumentada o expresion anomala. En algunas realizaciones, el trastorno es un tumor, cancer y/o un trastorno proliferativo celular, tal como cancer colorrectal, cancer pulmonar, carcinoma hepatocelular, cancer de mama y/o cancer pancreatico. En algunas realizaciones, la muestra biologica es suero o de un tumor.

En otro aspecto, la divulgacion proporciona metodos para seleccionar tratamiento para un individuo, comprendiendo los metodos: (a) detectar la expresion de FGF19 en la muestra biologica de un individuo, si la hubiera; y (b) posteriormente a la etapa (a), seleccionar tratamiento para el individuo, en el que la selection del tratamiento se basa en la expresion de FGF19 detectada en la etapa (a). En algunas realizaciones, se detecta expresion de FGF19 aumentada en la muestra biologica del individuo en relation con un valor de referencia o una muestra de control. En algunas realizaciones, se detecta expresion de FGF19 reducida en la muestra biologica de un individuo en relacion con un valor de referencia o una muestra de control en el individuo. En algunas realizaciones, se detecta expresion de FGF19 y se selecciona tratamiento con un anticuerpo anti-FGF19. Se describen en el presente documento metodos para tratar un trastorno con un anticuerpo anti-FGF19 y se ejemplifican en el presente documento algunos metodos.

En otro aspecto, la divulgacion proporciona metodos para tratar a un individuo que tiene o se sospecha que tiene un cancer, un tumor y/o un trastorno proliferativo celular o un trastorno hepatico (tal como cirrosis) administrando una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-FGF19, en el que ademas se detecta expresion de FGF19 y/o FGFR4 en celulas y/o tejido del paciente humano antes, durante o despues de la administration de un anticuerpo anti-FGF19. En algunas realizaciones, se detecta sobreexpresion de FGF19 antes, durante y/o despues de la administracion de un anticuerpo anti-FGF19. En algunas realizaciones, se detecta expresion de FGFR4 antes, durante y/o despues de la administracion del anticuerpo anti-FGF19. La expresion puede detectarse antes; durante; despues; antes y durante; antes y despues; durante y despues; o antes, durante y despues de la administracion de un anticuerpo anti- FGF19. Se describen en el presente documento metodos de para tratar un trastorno con un anticuerpo anti-FGF19 y se ejemplifican en el presente documento algunos metodos.

Por ejemplo, una muestra biologica puede ensayarse con respecto a FGF19 obteniendo la muestra de una fuente deseada, mezclando la mezcla con anticuerpo anti-FGF19 para permitir que el anticuerpo forme complejo de anticuerpo/FGF19 con cualquier FGF19 presente en la mezcla, y detectar cualquier complejo de anticuerpo/FGF19 presente en la mezcla. La muestra biologica puede prepararse para ensayo por metodos conocidos en la tecnica que son adecuados para la muestra particular. Los metodos de mezcla de la muestra con anticuerpos y los metodos de deteccion de complejo de anticuerpo/FGF19 se eligen de acuerdo con el tipo de ensayo usado. Dichos ensayos incluyen inmunohistoquimica, ensayos competitivos y de tipo sandwich y ensayos de inhibition esterica. Para la preparation de muestras, puede usarse una muestra tisular o celular de un mamifero (normalmente un paciente humano). Los ejemplos de muestras incluyen, pero sin limitation, celulas de cancer tales como celulas de cancer de colon, de mama, de prostata, de ovario, de pulmon, de estomago, de pancreas, linfoma y leucemia. FGF19 tambien puede medirse en suero. La muestra puede obtenerse por diversos procedimientos conocidos en la tecnica incluyendo, pero sin limitacion, escision quirurgica, aspiration o biopsia. El tejido puede ser nuevo o congelado. En una realization, la muestra se fija y se incluye en parafina o similares. La muestra tisular puede fijarse (es decir conservarse) por metodologia convencional (Vease por ejemplo, “Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology", 3a edition (1960) Lee G. Luna, HT (ASCP) Editor, The Blakston Division McGraw-Hill Book Company, Nueva York; The Armed Forces Institute of Pathology Advanced Laboratory Methods in Histology and Pathology (1994) Ulreka V. Mikel, Editor, Armed Forces Institute of Pathology, American Registry of Pathology, Washington, D.C.). Un experto habitual en la materia apreciara que la election de un fijador se determina por el fin para el que va a tenirse histologicamente o analizarse de otro modo la muestra. Un experto habitual en la materia tambien apreciara que la longitud de fijacion depende del tamano de la muestra tisular y el fijador usado. Como ejemplo, puede usarse formalina tamponada neutra, de Bouin o paraformaldehido para fijar una muestra. En general, la muestra se fija en primer lugar y se deshidrata despues mediante una serie ascendente de alcoholes, se infiltra y se incluye en parafina u otro medio de section de modo que la muestra tisular pueda seccionarse. Como alternativa, se puede seccionar el tejido y fijar las secciones obtenidas. Como ejemplo, la muestra tisular puede incluirse y procesarse en parafina por metodologia convencional (vease, por ejemplo, “Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology", mencionado anteriormente). Los ejemplos de parafina que pueden usarse incluyen, pero sin limitacion, Paraplast, Broloid y Tissuemay. Una vez que la muestra tisular se ha incluido, la muestra puede seccionarse mediante un microtomo o similares (vease por ejemplo, “Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology", mencionado anteriormente). Como ejemplo de este procedimiento, las secciones pueden variar de aproximadamente tres micrometros a aproximadamente cinco micrometros de grosor. Una vez seccionadas, las secciones pueden unirse a portaobjetos por varios metodos convencionales. Los ejemplos de adhesivos de portaobjetos incluyen, pero sin limitacion, silano, gelatina, poli-L- lisina y similares. Como ejemplo, las secciones incluidas en parafina pueden unirse con portaobjetos con carga positiva y/o portaobjetos recubiertos con poli-L-lisina. Si se ha usado parafina como el material de inclusion, las

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secciones tisulares generalmente se desparafinizan y se rehidratan en agua. Las secciones tisulares pueden desparafinizarse por varias metodologias convencionales. Por ejemplo, pueden usarse xilenos y una serie descendiente gradualmente de alcoholes (vease por ejemplo, “Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology", mencionado anteriormente). Como alternativa, pueden usarse agentes no organicos desparafinizantes disponibles en el mercado tales como Hemo-De7 (CMS, Houston, Texas).

Todos los metodos analiticos para FGF19 usan uno o mas de los siguientes reactivos: analogo de FGF19 marcado, analogo de FGF19 inmovilizado, anticuerpo anti-FGF19 marcado, anticuerpo anti-FGF19 inmovilizado y conjugados estericos. Los reactivos marcados tambien se conocen como “indicadores”.

El marcado usado es cualquier funcionalidad detectable que no interfiera con la union de FGF19 y anticuerpo anti- FGF19. Se conocen numerosos marcadores para su uso en inmunoensayo, incluyendo los ejemplos restos que pueden detectarse directamente, tales como fluorocromo, marcadores quimioluminiscentes y radiactivos, asi como restos, tales como enzimas, que deben hacerse reaccionar o derivatizarse para poder detectarse.

El marcador usado es cualquier funcionalidad detectable que no interfiera con la union de FGF19 y anticuerpo anti- FGF19. Se conocen numerosos marcadores para su uso en inmunoensayo, incluyendo los ejemplos restos que pueden detectarse directamente, tales como fluorocromo, marcadores quimioluminiscentes y radiactivos, asi como restos, tales como enzimas, que deben hacerse reaccionar o derivatizarse para poder detectarse. Los ejemplos de dichos marcadores incluyen los radioisotopos 32P, 14C, 125I, 3H y 131I, fluoroforos tales como quelados de tierras raras o fluoresceina y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansilo, umbeliferona, luceriferasas, por ejemplo, luciferasa de luciernaga y luciferasa bacteriana (Patente de Estados Unidos N.° 4.737.456), luciferina, 2,3- dihidroftalazinedionas, peroxidasa de rabano rusticano (HRP), fosfatasa alcalina, p-galactosidasa, glucoamilasa, lisozima, sacarido oxidasas, por ejemplo, glucosa oxidasa, galactosa oxidasa, y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, oxidasas heterociclicas tales como uricasa y xantina oxidasa, acopladas con una enzima que emplea peroxido de hidrogeno para oxidar un precursor de colorante tal como HRP, lactoperoxidasa o microperoxidasa, biotina/avidina, marcadores de espin, marcadores de bacteriofagos, radicales libres estables y similares.

Estan disponibles metodos convencionales para unir estos marcadores covalentemente con proteinas o polipeptidos. Por ejemplo, pueden usarse agentes de acoplamiento tales como dialdehidos, carbodiimidas, dimaleimidas, bis-imidatos, bencidina bis-diazotizada y similares para marcar los anticuerpos con los marcadores fluorescentes, quimioluminiscentes y enzimaticos anteriormente descritos. Vease, por ejemplo, Patente de Estados Unidos N.° 3.940.475 (fluorimetria) y 3.645.090 (enzimas); Hunter et al., Nature, 144: 945 (1962); David et al., Biochemistry, 13: 1014-1021 (1974); Pain et al., J. Immunol. Methods, 40: 219-230 (1981); y Nygren, J. Histochem. y Cytochem., 30: 407-412 (1982). Son marcadores preferidos en el presente documento enzimas tales como peroxidasa de rabano rusticano y fosfatasa alcalina. La conjugation de dicho marcador, incluyendo las enzimas, con el anticuerpo es un procedimiento de manipulation convencional para un experto habitual en las tecnicas de inmunoensayo. Vease, por ejemplo, O'Sullivan et al., “Methods for the Preparation of Enzyme-antibody Conjugates for Use in Enzyme Immunoassay”, en Methods in Enzymology, ed. J.J. Langone y H. Van Vunakis, Vol. 73 (Academic Press, Nueva York, Nueva York, 1981), pp. 147-166.

Se requiere inmovilizacion de reactivos para ciertos metodos de ensayo. La inmovilizacion implica separar el anticuerpo anti-FGF19 de cualquier FGF19 que permanezca libre en solution. Esto se consigue convencionalmente mediante insolubilizacion del anticuerpo anti-FGF19 o analogo de FGF19 antes del procedimiento de ensayo, como mediante adsorcion a una matriz o superficie insoluble en agua (Bennich et al., documento U.S. 3.720.760), mediante acoplamiento covalente (por ejemplo, usando reticulation de glutaraldehido) o insolubilizando el anticuerpo anti-FGF19 o analogo de FGF19 posterior, por ejemplo, mediante inmunoprecipitacion.

La expresion de proteinas en una muestra puede examinarse usando protocolos de inmunohistoquimica y tincion. Se ha mostrado que la tincion inmunohistoquimica de secciones tisulares es un metodo fiable para evaluar o detectar la presencia de proteinas en una muestra. Las tecnicas de inmunohistoquimica (“IHC”) utilizan un anticuerpo para explorar y visualizar antigenos celulares in situ, generalmente por metodos cromogenicos o fluorescentes. Para preparation de muestras, puede usarse una muestra tisular o celular de un mamifero (normalmente un paciente humano). La muestra puede obtenerse por diversos procedimientos conocidos en la tecnica incluyendo, pero sin limitation, escision quirurgica, aspiration o biopsia. El tejido puede ser nuevo o congelado. En una realization, la muestra se fija y se incluye en parafina o similares. La muestra tisular puede fijarse (es decir conservarse) por metodologia convencional. Un experto habitual en la materia apreciara que la election de un fijador se determina por el fin para el que la muestra va a tenirse histologicamente o analizarse de otro modo. Un experto habitual en la materia tambien apreciara que la longitud de fijacion depende del tamano de la muestra tisular y el fijador usado.

Puede realizarse IHC en combination con tecnicas adicionales tales como tincion morfologica y/o hibridacion in situ de fluorescencia. Estan disponibles dos metodos generales de IHC; ensayos directos e indirectos. De acuerdo con el primer ensayo, la union de anticuerpo con el antigeno diana (por ejemplo, FGF19) se determina directamente. Este ensayo directo usa un reactivo marcado, tal como un marcador fluorescente o un anticuerpo primario marcado con enzima, que puede visualizarse sin interaction de anticuerpo adicional. En un ensayo indirecto tipico, el anticuerpo

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primario no conjugado se une con el antigeno y despues se une un anticuerpo secundario marcado con el anticuerpo primario. Cuando se conjuga el anticuerpo secundario con un marcador enzimatico, se anade un sustrato cromogenico o fluorogenico para proporcionar visualizacion del antigeno. Se produce amplificacion de senal porque varios anticuerpos secundarios pueden reaccionar con diferentes epitopos en el anticuerpo primario.

El anticuerpo primario y/o secundario usado para inmunohistoquimica normalmente se marcara con un resto detectable. Estan disponibles numerosos marcadores que pueden en general agruparse en las siguientes categorias:

Aparte de los procedimientos de preparation de muestras analizados anteriormente, puede desearse tratamiento adicional de la section tisular antes de, durante de o despues de IHC. Por ejemplo, pueden llevarse a cabo metodos de recuperation de epitopos, tales como calentamiento de la muestra tisular en tampon de citrato (vease, por ejemplo, Leong et al. Appl. Immunohistochem. 4(3): 201 (1996)).

Despues de una etapa de bloqueo opcional, la seccion tisular se expone a anticuerpo primario durante un periodo de tiempo suficiente y en condiciones adecuadas para que el anticuerpo primario se una con el antigeno proteico diana en la muestra tisular. Las condiciones apropiadas para conseguir esto pueden determinarse por experimentation rutinaria. El alcance de la union de anticuerpo con la muestra se determina usando uno cualquiera de los marcadores detectables analizados anteriormente. Preferentemente, el marcador es un marcador enzimatico (por ejemplo, HRPO) que cataliza una alteration quimica del sustrato cromogenico tal como cromogeno de 3,3'- diaminobenzidina. Preferentemente el marcador enzimatico se conjuga con un anticuerpo que se une especificamente con el anticuerpo primario (por ejemplo el anticuerpo primario es anticuerpo policlonal de conejo y el anticuerpo secundario es anticuerpo de cabra anti-conejo).

Las muestras de ensayo preparadas de este modo pueden montarse y taparse con cubreobjetos. Despues se determina la evaluation de portaobjetos, por ejemplo usando un microscopio, y pueden emplearse criterios de intensidad de tincion, usados habitualmente en la tecnica.

Otros metodos de ensayo, conocidos como ensayos competitivos o de tipo sandwich, estan bien establecidos y se usan ampliamente en la industria de diagnostico comercial.

Los ensayos competitivos se basan en la capacidad de un analogo de FGF19 indicador para competir con el FGF19 de la muestra de ensayo por un numero limitado de sitios de union a antigeno de anticuerpo anti-FGF19. El anticuerpo anti-FGF19 generalmente esta insolubilizado antes o despues de la competition y despues el indicador y FGF19 unidos al anticuerpo anti-FGF19 se separan del indicador no unido y FGF19. Esta separation se consigue por decantation (cuando el companero de union estaba preinsolubilizado) o por centrifugation (cuando el companero de union se precipito despues de la reaction competitiva). La cantidad de FGF19 de muestra de ensayo es inversamente proporcional a la cantidad de indicador unido como se mide por la cantidad de sustancia marcadora. Se preparan curvas de respuesta a dosis con cantidades conocidas de FGF19 y se comparan con los resultados de ensayo para determinar cuantitativamente la cantidad de FGF19 presente en la muestra de ensayo. Estos ensayos se denominan sistemas de ELISA cuando se usan enzimas como los marcadores detectables.

Otra especie de ensayo competitivo, denominado un ensayo “homogeneo”, no requiere una separacion de fases. Aqui, se prepara un conjugado de una enzima con el FGF19 y se usa de modo que cuando el anticuerpo anti-FGF19 se una con el FGF19 la presencia del anticuerpo anti-FGFl9 modifique la actividad enzimatica. En este caso, el FGF19 o sus fragmentos activos inmunologicamente se conjugan con un enlace organico bifuncional con una enzima tal como peroxidasa. Se seleccionan conjugados para su uso con anticuerpo anti-FGF19 de modo que la union del anticuerpo anti-FGF19 inhiba o potencie la actividad enzimatica del marcador. Este metodo en si mismo se practica ampliamente con el nombre de EMIT.

Se usan conjugados estericos en metodos de impedimento esterico para ensayo homogeneo. Estos conjugados se sintetizan mediante enlaces covalentes de un hapteno de bajo peso molecular con un fragmento de FGF19 pequeno de modo que el anticuerpo para hapteno sea sustancialmente incapaz de unirse con el conjugado al mismo tiempo que un anticuerpo anti-FGF19. En este procedimiento de ensayo el FGF19 presente en la muestra de ensayo se unira con un anticuerpo anti-FGF19, permitiendo de este modo que el anti-hapteno se una con el conjugado, dando como resultado un cambio en el caracter del hapteno conjugado, por ejemplo, un cambio en la fluorescencia cuando el hapteno es un fluoroforo.

Los ensayos de tipo sandwich son particularmente utiles para la determination de FGF19 o anticuerpos anti-FGF19. En ensayos de tipo sandwich secuenciales se usa un anticuerpo anti-FGF19 inmovilizado para adsorber la muestra de ensayo FGF19, la muestra de ensayo se retira como por lavado, el FGF19 unido se usa para adsorber un segundo anticuerpo anti-FGF19, marcado, y el material unido se separa despues del indicador residual. La cantidad del indicador unido es directamente proporcional al FGF19 de muestra de ensayo. En ensayos de tipo sandwich “simultaneos” la muestra de ensayo no se separa antes de anadir el anti-FGF19 marcado. Un ensayo de tipo sandwich secuencial usando un anticuerpo monoclonal anti-FGF19 como un anticuerpo y un anticuerpo anti-FGF19 policlonal como el otro es util en el ensayo de muestras para FGF19.

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Los anteriores son meramente ensayos de deteccion a modo de ejemplo para FGF19. Otros metodos actuales o desarrollados posteriormente que usen anticuerpo anti-FGF19 para la determinacion de FGF19 se incluyen dentro del alcance de la presente, incluyendo los bioensayos descritos en el presente documento.

En un aspecto, la invencion proporciona metodos para detectar (por ejemplo, presencia o ausencia o cantidad de) un polinucleotido o polinucleotidos (por ejemplo, polinucleotidos de FGF19) en una muestra biologica de un individuo, tal como un sujeto humano. Pueden emplearse diversos metodos para detectar polinucleotidos e incluyen, por ejemplo, RT-PCR, taqman, metodos de amplificacion, micromatrices de polinucleotidos y similares.

Se conocen bien metodos para la deteccion de polinucleotidos (tales como ARNm) e incluyen, por ejemplo, ensayos de hibridacion usando sondas de ADN complementarias (tal como hibridacion in situ usando ribosondas de FGF19 marcadas), transferencia de Northern y tecnicas relacionadas, y diversos ensayos de amplificacion de acido nucleico (tales como RT-PCR usando cebadores complementarios especificos para FGF19, y otros metodos de deteccion de tipo amplificacion, tales como, por ejemplo, ADN ramificado, SPIA, Ribo-SPIA, SISbA, TMA y similares).

Las muestras biologicas de mamiferos pueden ensayarse convenientemente, por ejemplo, con respecto a ARNm de FGF19 usando analisis de Northern, transferencia puntual o PCR. Por ejemplo, se conocen bien en la tecnica ensayos de RT-PCR tales como ensayo de PCR cuantitativa. En una realizacion ilustrativa de la invencion, un metodo para detectar ARNm de FGF19 en una muestra biologica comprende producir ADNc de la muestra mediante transcripcion inversa usando al menos un cebador; amplificar el ADNc producido de este modo usando un polinucleotido de FGF19 como cebadores con sentido y antisentido para amplificar ADNc de FGF19 en el mismo; y detectar la presencia o ausencia del ADNc de FGF19 amplificado. Ademas, dichos metodos pueden incluir una o mas etapas que permiten determinar la cantidad (niveles) de ARNm de FGF19 en una muestra biologica (por ejemplo mediante examen simultaneo de los niveles de una secuencia de ARNm de control comparativa de un gen constitutivo tal como un miembro de la familia de actina). Opcionalmente, puede determinarse la secuencia del ADNc de FGF19 amplificado.

Pueden marcarse sondas y/o cebadores con un marcador detectable, tal como, por ejemplo, un radioisotopo, compuesto fluorescente, compuesto bioluminiscente, un compuesto quimioluminiscente, quelante metalico o enzima. Dichas sondas y cebadores pueden usarse para detectar la presencia de polinucleotidos de FGF19 en una muestra y como un medio para detectar una celula que expresa proteinas FGF19. Como entendera el experto en la materia, pueden prepararse multitud de cebadores y sondas diferentes (por ejemplo, basandose en las secuencias proporcionadas en el presente documento) y usarse eficazmente para amplificar, clonar y/o determinar la presencia o ausencia de y/o cantidad de ARNm de FGF19.

Los metodos opcionales de la invencion incluyen protocolos que comprenden deteccion de polinucleotidos, tales como polinucleotido de FGF19, en una muestra tisular o celular usando tecnologias de micromatrices. Por ejemplo, usando micromatrices de acido nucleico, muestras de ARNm de ensayo y de control de muestras tisulares de ensayo y de control se transcriben de forma inversa y se marcan para generar sondas de ADNc. Las sondas se hibridan despues con una matriz de acidos nucleicos inmovilizado en un soporte solido. La matriz se configura de modo que se conozca la secuencia y posicion de cada miembro de la matriz. Por ejemplo, puede disponerse una selection de genes que tienen potencial para expresarse en ciertas patologias en un soporte solido. La hibridacion de una sonda marcada con un miembro de matriz particular indica que la muestra de la que derivo la sonda expresa ese gen. El analisis de expresion genica diferencial de tejido enfermo puede proporcionar information valiosa. La tecnologia de micromatrices utiliza tecnicas de hibridacion de acido nucleico y tecnologia informatica para evaluar el perfil de expresion de ARNm de miles de genes en un unico experimento. (Vease, por ejemplo, documento WO 01/75166 publicado el 11 de octubre de 2001; (vease, por ejemplo, documento U.S. 5.700.637, Patente de Estados Unidos 5.445.934 y Patente de Estados Unidos 5.807.522, Lockart, Nature Biotechnology, 14: 1675-1680 (1996); Cheung, V.G. et al., Nature Genetics 21(Supl): 15-19 (1999) para un analisis de fabrication de matrices). Las micromatrices de ADN son matrices en miniatura que contienen fragmentos genicos que se sintetizan directamente en o se aplican puntualmente en vidrio u otros sustratos. Habitualmente se representan miles de genes en una unica matriz. Un experimento de micromatriz tipico implica las siguientes etapas: 1. preparation de diana marcada con fluorescencia de ARN aislado de la muestra, 2. hibridacion de la diana marcada con la micromatriz, 3. lavado, tincion y exploration de la matriz, 4. analisis de la imagen escaneada y 5. generation de perfiles de expresion genica. En la actualidad se usan dos tipos principales de micromatrices de ADN: matrices de oligonucleotidos (habitualmente de 25 a 70 unidades) y matrices de expresion genica que contienen productos de PCR preparados a partir de ADNc. Al formar una matriz, los oligonucleotidos pueden prefabricarse y aplicarse puntualmente a la superficie o sintetizarse directamente en la superficie (in situ).

El sistema Affymetrix GeneChip® es un sistema de micromatrices disponible en el mercado que comprende matrices fabricadas por sintesis directa de oligonucleotidos en una superficie de vidrio. Matrices de sonda/gen: se sintetizan oligonucleotidos, habitualmente de 25 unidades, directamente en una oblea de vidrio por una combination de fotolitografia basada en semiconductor y tecnologias de sintesis quimica de fase solida. Cada matriz contiene hasta 400.000 oligos diferentes y cada oligo esta presente en millones de copias. Ya que las ondas oligonucleotidicas se sintetizan en localizaciones conocidas en la matriz, los patrones de hibridacion y las intensidades de senal pueden

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interpretarse con respecto a identidad genica y niveles de expresion relativa por el software Affymetrix Microarray Suite. Cada gen esta presentado en la matriz por una serie de sondas oligonucleotidicas diferentes. Cada par de sondas consiste en un oligonucleotido perfectamente coincidente y un oligonucleotido desapareado. La sonda perfectamente coincidente tiene una secuencia exactamente complementaria al gen particular y de este modo mide la expresion del gen. La sonda desapareada difiere de la sonda perfectamente coincidente por una sustitucion de una unica base en la posicion de base central, alterando la union del transcrito del gen diana. Esto ayuda a determinar la hibridacion de fondo y no especifica que contribuye a la senal medida para el oligo perfectamente coincidente. El software Microarray Suite resta las intensidades de hibridacion de las sondas desapareadas de las de las sondas perfectamente coincidentes para determinar el valor o intensidad absoluto o especifico para cada conjunto de sondas. Las sondas se eligen basandose en la informacion actual de GenBank y otros depositos de

nucleotidos. Se cree que las secuencias reconocen regiones unicas del extremo 3' del gen. Se usa un Horno de

Hibridacion GeneChip (horno “asador”) para llevar a cabo la hibridacion de hasta 64 matrices a la vez. La estacion de fluidos realiza lavado y tincion de las matrices de sondas. Esta completamente automatizada y contiene cuatro modulos, conteniendo cada modulo una matriz de sondas. Cada modulo se controla independientemente mediante el software Microarray Suite usando protocolos de fluidos preprogramados. El escaner es un escaner de

fluorescencia de laser confocal que mide la intensidad de fluorescencia emitida por el ARNc marcado unido a las

matrices de sondas. La estacion de trabajo informatica con software Microarray Suite controla la estacion de fluidos y el escaner. El software Microarray Suite puede controlar hasta ocho estaciones de fluidos usando hibridacion pre- programada, lavado y protocolos de tincion para la matriz de sondas. El software tambien adquiere y convierte los datos de intensidad de hibridacion en una decision de presencia/ausencia para cada gen usando algoritmos apropiados. Finalmente, el software detecta cambios en la expresion genica entre experimentos mediante analisis de comparacion y formatea los resultados en archivos .txt que pueden usarse con otros programas informaticos para analisis de datos adicionales.

En algunas realizaciones, se detecta supresion genica, mutacion genica o amplificacion genica de FGF19. La supresion genica, mutacion genica o amplificacion puede medirse por uno cualquiera de una amplia diversidad de protocolos conocidos en la tecnica, por ejemplo, mediante transferencia de Southern convencional, transferencia de Northern para cuantificar la transcripcion de ARNm (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 5201-5205 (1980)), transferencia puntual (analisis de ADN), o hibridacion in situ (por ejemplo, FISH), usando una sonda marcada de forma apropiada, metodos citogeneticos o hibridacion genomica comparativa (CGH) usando una sonda marcada de forma apropiada. Ademas, estos metodos pueden emplearse para detectar supresion genica de ligando, mutacion de ligando o amplificacion genica de FGF19. Como se usa en el presente documento, “detectar la expresion de FGF19” abarca la deteccion de la supresion genica, mutacion genica o amplificacion genica de FGF19.

Adicionalmente, se puede examinar el estado de metilacion del gen de FGF19 en una muestra tisular o celular. Se producen con frecuencia desmetilacion aberrante y/o hipermetilacion de islas de CpG en regiones reguladoras genicas 5' en celulas inmortalizadas y transformadas, y puede dar como resultado expresion alterada de diversos genes. Se conocen bien en la tecnica diversos ensayos para examinar el estado de metilacion de un gen. Por ejemplo, se puede utilizar, en enfoques de hibridacion de Southern, enzimas de restriction sensibles a metilacion que no pueden escindir secuencias que contengan sitios de CpG metilados para evaluar el estado de metilacion de islas de CpG. Ademas, MSP (PCR especifica de metilacion) puede perfilar rapidamente el estado de metilacion de todos los sitios de CpG presentes en una isla de CpG de un gen dado. Este procedimiento implica la modification inicial de ADN por bisulfito sodico (que convertira todas las citocinas no metiladas en uracilo) seguido de amplificacion usando cebadores especificos para ADN metilado frente al no metilado. Tambien pueden encontrarse protocolos que implican interferencia en metilacion por ejemplo en Current Protocols In Molecular Biology, Unidad 12, Frederick M. Ausubel et al. eds., 1995; De Marzo et al., Am. J. Pathol. 155(6): 1985-1992 (1999); Brooks et al, Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev., 1998, 7: 531-536); y Lethe et al., Int. J. Cancer 76(6): 903-908 (1998). Como se usa en el presente documento “detectar la expresion de FGF19” abarca deteccion de la metilacion del gen de FGF19.

En un aspecto, la divulgation proporciona deteccion de expresion del polipeptido y/o polinucleotido de FGFR4 (solos o en conjunto (simultaneamente y/o secuencialmente) con expresion de FGF19) en una muestra biologica. Usando metodos conocidos en la tecnica, incluyendo los descritos en el presente documento, puede detectarse la expresion del polinucleotido y/o polipeptido de FGFR4. Como ejemplo, las tecnicas de IHC descritas anteriormente pueden emplearse para detectar la presencia de una o mas de dichas moleculas en la muestra. Como se usa en el presente documento, se entiende que “en conjunto” abarca cualquier deteccion simultanea y/o secuencial. Por lo tanto, se contempla que en realizaciones en las que se esta examinando una muestra biologica no solamente con respecto a la presencia de FGF19 sino tambien con respecto a la presencia de FGFR4, pueden prepararse portaobjetos separados del mismo tejido o la misma muestra, y cada portaobjetos ensayarse con un reactivo que se una con FGF19 y/o FGFR4, respectivamente. Como alternativa, puede prepararse un unico portaobjetos de la muestra tisular o celular, y pueden usarse anticuerpos dirigidos a FGF19 y FGFR4 en relation con un protocolo de tincion multicolor para permitir la visualization y deteccion de FGF19 y FGFR4.

En otro aspecto, la divulgacion proporciona metodos para diagnosticar un trastorno asociado a la expresion y/o actividad de FGFR4, comprendiendo los metodos detectar FGFR4 en una muestra biologica de un individuo. En algunas realizaciones, la expresion de FGFR4 es expresion aumentada o expresion anomala. En algunas

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realizaciones, el trastorno es un tumor, cancer y/o un trastorno proliferativo celular, tal como cancer colorrectal, cancer de pulmon, carcinoma hepatocelular, cancer de mama y/o cancer pancreatico. En algunas realizaciones, la muestra biologica es suero o de un tumor.

En otro aspecto, la divulgacion proporciona metodos para diagnosticar un trastorno asociado a la expresion y/o actividad de FGFR4 y FGF19, comprendiendo los metodos detectar FGFR4 y FGF19 en una muestra biologica de un individuo. En algunas realizaciones, la expresion de FGF19 es expresion aumentada o expresion anomala. En algunas realizaciones, la expresion de FGFR4 es expresion aumentada o expresion anomala. En algunas realizaciones, el trastorno es un tumor, cancer y/o un trastorno proliferativo celular, tal como cancer colorrectal, cancer de pulmon, carcinoma hepatocelular, cancer de mama y/o cancer pancreatico. En algunas realizaciones, la muestra biologica es suero o de un tumor. En algunas realizaciones, se detecta expresion de FGFR4 en una primera muestra biologica y se detecta expresion de FGF19 en una segunda muestra biologica.

En otro aspecto, la divulgacion proporciona metodos para seleccionar el tratamiento para un individuo, comprendiendo los metodos: (a) detectar la expresion de FGFR4 en una muestra biologica de un individuo, si la hubiera; y (b) posteriormente a la etapa (a), seleccionar el tratamiento para un individuo, en el que la seleccion del tratamiento se basa en la expresion de FGFR4 detectada en la etapa (a). En algunas realizaciones, se detecta la expresion de FGFR4 aumentada en la muestra biologica del individuo en relacion con un valor de referencia o una muestra de control. En algunas realizaciones, se detecta expresion de FGFR4 reducida en la muestra biologica del individuo en relacion con un valor de referencia o una muestra de control en el individuo. En algunas realizaciones, se detecta expresion de FGFR4 y se selecciona el tratamiento con un anticuerpo anti-FGF19.

En otro aspecto, la divulgacion proporciona metodos para seleccionar el tratamiento para un individuo, comprendiendo los metodos: (a) detectar la expresion de FGF19 y FGFR4 en la muestra biologica, si la hubiera; y (b) posteriormente a la etapa (a), seleccionar el tratamiento para un individuo, en el que la seleccion del tratamiento se basa en la expresion de FGF19 y FGFR4 detectada en la etapa (a). En algunas realizaciones, se detecta expresion de FGF19 aumentada en la muestra biologica del individuo en relacion con un valor de referencia o una muestra de control. En algunas realizaciones, se detecta expresion de FGF19 reducida en la muestra biologica del individuo en relacion con un valor de referencia o muestra de control en el individuo. En algunas realizaciones, se detecta expresion de FGFR4 aumentada en la muestra biologica del individuo en relacion con un valor de referencia o muestra de control. En algunas realizaciones, se detecta expresion de FGFR4 reducida en la muestra biologica del individuo en relacion con un valor de referencia o muestra de control en el individuo. En algunas realizaciones, se detecta expresion de FGFR4 y FGF19 y se selecciona el tratamiento con un anticuerpo anti-FGF19. En algunas realizaciones, se detecta expresion de FGFR4 en una primera muestra biologica, y se detecta expresion de FGF19 en una segunda muestra biologica.

En otro aspecto, la divulgacion proporciona metodos para tratar a un individuo que tiene o se sospecha que tiene un cancer, un tumor y/o un trastorno proliferativo celular o un trastorno hepatico (tal como cirrosis) administrando una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-FGF19, en el que ademas la expresion de FGF19 y/o FGFR4 se detecta en celulas y/o tejido del paciente humano antes, durante o despues de la administracion de un anticuerpo anti-FGF19. En algunas realizaciones, se detecta sobreexpresion de FGF19 antes, durante y/o despues de la administracion de un anticuerpo anti-FGF19. En algunas realizaciones, se detecta expresion de FGFR4 antes, durante y/o despues de la administracion de un anticuerpo anti-FGF19. La expresion puede detectarse antes; durante; despues; antes y durante; antes y despues; durante y despues; o antes, durante y despues de la administracion de un anticuerpo anti- FGF19.

En algunas realizaciones que implican deteccion, se detecta expresion de senalizacion molecular corriente abajo de FGFR4 ademas de o como alternativa a deteccion de FGFR4. En algunas realizaciones, la deteccion de senalizacion molecular corriente abajo de FGFR4 comprende uno o mas de deteccion de fosforilacion de MAPK, FRS2 o ERK2.

Algunas realizaciones que implican la deteccion comprenden ademas deteccion de la activacion de la ruta de Wnt. En algunas realizaciones, la deteccion de la activacion de la ruta de Wnt comprende uno o mas de fosforilacion de tirosina de p-catenina, expresion de genes diana de Wnt, mutacion de p-catenina y union de E-cadherina a p- catenina. Se conoce en la tecnica la deteccion de la activacion de la ruta de Wnt y se describen y ejemplifican en el presente documento algunos ejemplos.

En algunas realizaciones, el tratamiento es para un cancer seleccionado del grupo que consiste en cancer colorrectal, cancer de pulmon, cancer ovarico, cancer de la hipofisis, cancer pancreatico, fibroadenoma mamario, cancer de prostata, carcinomas de celulas escamosas de cabeza y cuello, sarcoma de tejido blando, cancer de mama, neuroblastomas, melanoma, carcinoma de mama, cancer gastrico, cancer colorrectal (CRC), carcinomas epiteliales, cancer de cerebro, cancer endometrial, cancer de testiculo, colangiocarcinoma, carcinoma de la vesicula biliar y carcinoma hepatocelular.

Se describen en el presente documento muestras biologicas, por ejemplo, en la definicion de muestra biologica. En algunas realizaciones, la muestra biologica es suero o de un tumor.

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En realizaciones que implican la deteccion de expresion de FGF19 y/o FGFR4, puede detectarse la expresion del polionucleotido de FGF19 y/o FGFR4 y/o expresion de polipeptido de FGF19 y/o FGFR4. En algunas realizaciones que implican la deteccion de expresion de FGF19 y/o FGFR4, se detecta la expresion de ARNm de FGF19 y/o FGFR4. En otras realizaciones, se detecta la expresion de polipeptido de FGF19 y/o FGFR4 usando un agente anti- FGF19 y/o un agente anti-FGFR4. En algunas realizaciones, se detecta la expresion de polipeptido de FGF19 y/o FGFR4 usando un anticuerpo. Puede usarse cualquier anticuerpo adecuado para deteccion y/o diagnostico, incluyendo anticuerpos monoclonales y/o policlonales, un anticuerpo humano, un anticuerpo quimerico, un anticuerpo de afinidad madurada, un anticuerpo humanizado y/o un fragmento de anticuerpo. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-FGF19 descrito en el presente documento se usa para deteccion. En algunas realizaciones, se detecta expresion de polipeptido de FGF19 y/o FGFR4 usando inmunohistoquimica (IHC). En algunas realizaciones, la expresion de FGF19 se puntua en 2 o mas usando IHC.

En algunas realizaciones que implican la deteccion de expresion de FGF19 y/o FGFR4, puede detectarse presencia y/o ausencia y/o nivel de expresion de FGF19 y/o FGFR4. La expresion de FGF19 y/o FGFR4 puede aumentarse. Se entiende que la ausencia de expresion de FGF19 y/o FGFR4 incluye niveles insignificantes o minimos. En algunas realizaciones, la expresion de FGF19 en la muestra biologica de ensayo es mayor que la observada para una muestra biologica de control (o nivel de control o de referencia de expresion). En algunas realizaciones, la expresion de FGF19 es al menos aproximadamente 2 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 75 veces, 100 veces, 150 veces mayor o mayor en la muestra biologica de ensayo que en la muestra biologica de control. En algunas realizaciones, la expresion del polipeptido de FGF19 se determina en un ensayo de inmunohistoquimica (“IHC") que puntua al menos 2 o mas para intensidad de tincion. En algunas realizaciones, se determina que la expresion del polipeptido de FGF19 en un ensayo de IHC puntua al menos 1 o mas, al menos 3 o mas para intensidad de tincion. En algunas realizaciones, la expresion de FGF19 en la muestra biologica de ensayo es menor que la observada para una muestra biologica de control (o nivel de expresion de control).

En algunas realizaciones, se detecta expresion de FGF19 en suero y se detecta expresion de FGFR4 en una muestra tumoral. En algunas realizaciones, se detecta expresion de FGF19 y expresion de FGFR4 en una muestra tumoral. En algunas realizaciones, se detecta expresion de FGF19 en suero o una muestra tumoral, y se detecta senalizacion molecular corriente abajo de FGFR4 y/o expresion de FGFR4 en una muestra tumoral. En algunas realizaciones, se detecta expresion de FGF19 en suero o una muestra tumoral, y se detecta activacion de la ruta de Wnt en una muestra tumoral. En algunas realizaciones, se detecta la expresion de FGF19 en suero o una muestra tumoral, y se detecta senalizacion molecular corriente abajo de FGFR4 y/o expresion de FGFR4 y/o activacion de la ruta de Wnt en una muestra tumoral.

Artteulos de fabricacion

En otro aspecto de la divulgacion, se proporciona un articulo de fabricacion que contiene materiales utiles para el tratamiento, la prevencion y/o el diagnostico de los trastornos descritos anteriormente. El articulo de fabricacion comprende un recipiente y una etiqueta o prospecto en o asociado al recipiente. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, frascos, viales, jeringas, etc. Los recipientes pueden formarse de diversos materiales tales como vidrio o plastico. El recipiente contiene una composition que es por si sola o cuando se combina con otra composition u otras composiciones eficaz para el tratamiento, la prevencion y/o el diagnostico de la afeccion y puede tener un orificio de acceso esteril (por ejemplo el recipiente puede ser una bolsa de solution intravenosa o un vial que tiene un tapon perforable por una aguja de inyeccion hipodermica). Al menos un agente activo en la composicion es un anticuerpo de la invention. La etiqueta o el prospecto indican que la composicion se usa para tratar la afeccion elegida, tal como cancer. Ademas, el articulo de fabricacion puede comprender (a) un primer recipiente con una composicion contenida en el mismo, en el que la composicion comprende un anticuerpo de la invencion; y (b) un segundo recipiente con una composicion contenida en el mismo. El articulo de fabricacion en esta realization puede comprender ademas un prospecto que indica que la primera y la segunda composiciones de anticuerpos pueden usarse para tratar una afeccion particular, por ejemplo, cancer. Como alternativa, o adicionalmente, el articulo de fabricacion puede comprender ademas un segundo (o tercer) recipiente que comprende un tampon farmaceuticamente aceptable, tal como agua bacteriostatica para inyeccion (BWFI), solucion salina tamponada con fosfato, solucion de Ringer y solucion de dextrosa. Puede incluir ademas otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y de usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas y jeringas.

Los siguientes son ejemplos de los metodos y composiciones de la invencion. Se entiende que pueden practicarse diversas otras realizaciones, dada la description general proporcionada anteriormente.

Ejemplos

Los siguientes materiales y metodos se usaron en los Ejemplos.

Los numeros de restos son de acuerdo con Kabat (Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 5a Ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)).

Injertos de region hipervariable directos en el marco conservado consenso humano aceptor

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El fagemido usado para este trabajo es un vector de presentacion de Fab-g3 monovalente y consiste en 2 fases abiertas de lectura bajo el control de un unico promotor de phoA. La primera fase abierta de lectura consiste en la secuencia senal stII fusionada con los dominios VL y CH1 de la cadena ligera aceptora y la segunda consiste en la segunda senal de stII fusionada con los dominios VH y CH1 de la cadena pesada aceptora seguida de la proteina de cubierta de fago menor P3.

Para preparar los injertos de HVR, se injertaron regiones hipervariables de anticuerpo 1A6 murino (mu1A6) (Figura 8; vease documento US20070673411) en los marcos conservados aceptores consenso huKI y huIII para generar el injerto de HVR directo de 1A6 (injerto de 1A6) (Figuras 1 y 2). En el dominio VL las siguientes regiones se injertaron en el aceptor consenso humano: posiciones 24-34 (L1), 50-56 (L2) y 89-97 (L3). En el dominio VH, se injertaron las posiciones 26-35 (H1), 49-65 (h2) y 93-102 (H3). MacCallum et al. (MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)) han analizado estructuras cristalinas de complejos de antigeno y de anticuerpo y han descubierto que las posiciones 49, 93 y 94 de la cadena pesada son parte de la region de contacto por lo tanto parece razonable incluir estas posiciones en la definicion de HVR-H2 y HVR-H3 cuando se humanizan anticuerpos. Se evaluaron clones correctos por secuenciacion de ADN.

Maduracion de afinidad

Se expreso FGF19 humano en celulas CHO y se purifico por medios convencionales.

Para maduracion de la afinidad, se generaron bibliotecas de fagos basadas en el injerto de HVR que tenian mutaciones introducidas en los bucles de HVR, por ejemplo, como se describe en Dennis, documento WO2005080432.

Se identificaron clones de alta afinidad mediante cinco ciclos de seleccion frente a proteina FGF19 humana con rigurosidad progresivamente aumentada. Brevemente, para los 2 primeros ciclos de seleccion, se inmovilizo FGF19 directamente en placas de microtitulacion MaxiSorp (Nunc) a 2 ^g/ml en PBS. Ciclos sucesivos de seleccion usaron FGF19 biotinilado (b-FGF19) en un metodo de seleccion soluble (vease, por ejemplo, Fuh et al. J. Mol. Biol. (2004)). FGF19 se biotinilo (b-lFGF-19) usando Sulfo-NHS-LC-biotina (Pierce). Se utilizaron un periodo de union corto y concentraciones bajas de b-FGF19 para permitir la seleccion de clones que poseian velocidades de asociacion mas rapidas.

Produccion de Fab e IgG

Para expresar proteina Fab para medidas de afinidad, se introdujo un codon de terminacion entre la cadena pesada y g3 en el vector de presentacion en fagos. Los clones se transformaron en celulas E. coli 34B8 y se cultivaron en medio C.R.A.P. completo a 30 °C (Presta et al. Cancer Res. 57: 4593-4599 (1997)). Las celulas se recogieron por centrifugacion, se suspendieron en PBS, PMSF 100 ^M, benzamidina 100 ^M, EDTA 2,5 mM y se rompieron usando un microfluidificador. Se purifico Fab con cromatografia de afinidad de Proteina G.

Para fines de exploracion, se produjeron inicialmente variantes de IgG en celulas 293. Se transfectaron vectores que codificaban VL y VH (25 ^g) en celulas 293 usando un sistema FuGene. Se mezclaron 500 ^l de FuGENE con 4,5 ml de medio DMEM que no contenia FBS. Este se incubo a temperatura ambiente durante 5 minutos. Los 25 ^g de cada cadena se anadieron a esta mezcla y se incubaron a temperatura ambiente durante 20 minutos. Se pipeteo 1 ml de mezcla en cada matraz para transfeccion durante una noche a 37 °C en CO2 5 %. Al dia siguiente el medio que contenia la mezcla de transfeccion se retiro y se reemplazo con 23 ml de medio PS04 con 0,1 ml/l de oligoelementos (A0934) y 10 mg/l de insulina (A0940). Las celulas se devolvieron al incubador de CO2 5 % a 37 °C durante 5 dias adicionales despues de lo cual se recogio el medio. El medio se centrifugo a 1000 rpm durante 5 minutos y despues se esterilizo por filtracion usando un filtro de baja union a proteina de 0,22 ^m. Se anadieron 2,5 ml de PMSF 0,1 M por cada 125 ml de medio como un inhibidor de proteasa y despues se almaceno a 4 °C.

Determinaciones de afinidad

Se realizaron determinaciones de afinidad por resonancia de plasmon superficial usando un BIAcore™-2000. Se usaron dos protocolos. Se inmovilizo IgG variante 1A6 purificado directamente (aproximadamente 550 UR) en acetato sodico 10 mM pH 4,8 en una microplaca sensora CM5 y se inyectaron diluciones dobles en serie del FGF19 (0,08-1250 nM) en PBST a un caudal de 30 ^l/min. Cada muestra se analizo con asociacion de 4 minutos y disociacion de 10 minutos. Despues de cada inyeccion la microplaca se regenero usando Glicina 10 mM pH 1,7. La respuesta de union se corrigio restando las UR de una celda de flujo con un IgG irrelevante inmovilizado a densidad similar. Se uso un modelo de Languir 1:1 de ajuste simultaneo de kon y koff para analisis cinetico.

Tambien se ensayo IgG variante 1A6 no purificado a partir de sobrenadantes de cultivo usando un metodo de captura anti-IgG humano en el BIAcore™ 2000. Se inmovilizaron aproximadamente 2700 UR de IgG de conejo anti- humano (Pierce n.° 31143) en acetato sodico 10 mM pH 4,0 en una microplaca sensora CM5. La concentration de

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IgG variante 1A6 no purificado se normalizo para capturar aproximadamente 200 UR de IgG de 5 ^l de sobrenadante; se capturo un IgG irrelevante en una celda de flujo de control. Se inyecto FGF19 (una dilucion en serie doble, de 0,08 a 1000 nM en PBST) a un caudal de 30 ^l/min. Cada muestra se analizo con asociacion de 4 minutos y disociacion de 10 minutos. Despues de cada inyeccion la microplaca se regenero usando Glicina 10 mM pH 1,7. El IgG anti-humano inmovilizado se recargo despues con sobrenadante de cultivo que contenia IgG variante 1A6 no purificado para la siguiente dilucion de FGF19. Se corrigio la respuesta de union restando el control de celda de flujo de IgG irrelevante de celdas de flujo de IgG variantes 1A6. Se uso un modelo de Languir 1: 1 de ajuste simultaneo de kon y koff para analisis cinetico.

Ensayo de union a receptor de fase solida

Se recubrieron placas de 96 pocillos Maxisorb durante una noche a 4 °C con 50 ^l de inmunoglolubina anti-humana especifica de fragmento Fcy (Jackson Immunoresearch) 2 ^g/ml y se uso para capturar proteinas quimericas FGFR- Fc 1 ^g/ml (R & D Systems). Los sitios de union no especifica se saturaron con PBS/BSA a 3 % durante 1 hora y se incubo FGF19 (0,25 ^g/ml) durante 2 h en PBS/BSA a 0,3 % en presencia de oligosacaridos (0,5 ^g/ml; Neoparin Inc.) y el anticuerpo anti-FGF19 indicado (0-10 ^g/ml). La union de FGF19 se detecto usando un anticuerpo policlonal especifico de FGF19 biotinilado (0,5 ^g/ml; BAF969; R & Systems) seguido de estreptavidina-HRP y sustrato colorimetrico TMB.

Fosforilacion de FGFR4/MAPK

Se trataron celulas HEPG2 privadas de alimento durante una noche en medio sin suero con 250 ng/ml de FGF19 durante 10 min en presencia o ausencia de anticuerpos. Las celulas se lisaron en tampon R27A (Upstate) con NaF 10 mM, ortovanadato sodico 1 mM, y comprimido inhibidor de proteasa completo (Roche). Se prepararon lisados, se sometieron a electroforesis y se analizaron por inmunotransferencia usando anticuerpos especificos anti-fosfo-MAPK y anti-MAPK (Cell Signaling). Para inmunoprecipitacion de FGFR4, se incubaron cantidades iguales de proteinas con 1 ^g de anticuerpo anti-FGFR4 especifico (1G7; Genentech, Inc.) inmovilizado en proteina A-Sepharose durante 2 h a 4 °C y despues se lavo con tampon de lisis y se eluyo con tampon Laemmli 2x, se hirvio y se microcentrifugo. Se realizo inmunostransferencia con anticuerpo anti-fosfotirosina (4G10, UpState), anticuerpo anti-fosfo-ERK2 (Santa Cruz Biotech). Se desprendieron las membranas (Pierce) y se volvieron a explorar con anticuerpos apropiados para determinar proteinas totales.

Transferencia de Western para FGF19

Se homogeneizaron tejidos de higado en tampon RIPA modificado (Tris-Cl 50 mM, pH 7,5; NaCl 150 mM; IGEPAL 1 %; EDTA 1 mM; desoxicolato sodico 0,25 %; NaF 1 mM; Na3VO4 1 mM; coctel de inhibidores de proteasa (Sigma- Aldrich, St. Louis, MO) y se clarifico por centrifugacion. Se determinaron las concentraciones proteicas de los lisados usando el reactivo de ensayo de proteinas BCA (Pierce, Rockford, IL). Se incubaron cantidades iguales de proteinas con anticuerpo especifico inmovilizado en proteina A-Sepharose (Sigma-Aldrich) durante 2 horas a 4 °C con rotacion suave. Las perlas se lavaron exhaustivamente con tampon de lisis y se eluyeron inmunocomplejos en tampon Laemmli 2X, se hirvieron y se microcentrifugaron. Se resolvieron proteinas en SDS-PAGE, se transfirieron a membrana de nitrocelulosa y se incubaron con anticuerpos primarios especificos. Despues de lavar e incubar con anticuerpos secundarios, se visualizaron proteinas inmunorreactivas por el sistema de deteccion de ECL (Amersham, Arlington Ht. IL). Se cargaron proteinas humanas y de cynomolgus recombinantes a una concentracion de 100 ng o 200 ng.

Experimento de xenoinjertos

Se inocularon ratones hembras BALB/c atimicos de seis a ocho semanas de edad (Charles Rivers Inc.) por via subcutanea con tumor de colon HCT116 5x106 (200 ^l/raton). Despues de 7 dias, se separaron aleatoriamente ratones portadores de tumores de volumenes equivalentes (-100 mm3) en grupos (n=10) y se trataron por via intraperitoneal una vez a la semana. Los tumores se midieron con un calibrador electronico (Fowler Sylvac Ultra-Cal Mark III) y se regulo el volumen tumoral promedio usando la formula: (W2 X L)/2 (W, el diametro menor; L, el diametro mayor).

Fosforilacion de FGFR4, FRS2, ERK y p-catenina en tumores de xenoinjertos

Se homogeneizaron tumores escindidos de animales tratados en tampon de lisis [Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, NP-40 1 %, EDTA1 mM, desoxicolato sodico 0,25 %, NaF1 mM, ortovanadato sodico 1 mM, inhibidor de proteasa completa (Roche)]. Se incubaron cantidades iguales de proteinas con 1 ^g de anticuerpo especifico de FGFR4 (1G7; Genentech, Inc.) o FRS2 (UpState) inmovilizado en proteina A-Sepharose durante 2 h a 4 °C y despues se lavo con tampon de lisis y se eluyo con tampon de Laemmli 2x, se hirvio, y se microcentrifugo. Se realizaron inmunotransferencias con anticuerpo anti-fosfotirosina (4G10, UpState), anticuerpo anti-fosfo-ERK2 (Santa Cruz Biotech) o anticuerpo anti-p-catenina desfosforilada en el extremo N terminal (UpSate). Las membranas se desprendieron (Pierce) y se volvieron a explorar con anticuerpos apropiados para determinar las proteinas

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totales.

Resultados y analisis Humanizacion de IA6

El marco conservado aceptor humano usado para humanizacion de 1A6 consiste en el dominio VL kappa I humano consenso y el dominio VH consenso de subgrupo III humano. Los dominios VL y VH de mu1A6 se alinearon con los dominios kappa I y de subgrupo III humanos; cada HVR se identifico y se injerto en el marco conservado aceptor humano para generar un injerto de HVR 1A6 que podia presentarse como un Fab en fagos (Figuras 1 y 2).

Los fagos que expresaban el injerto 1A6 se unieron con huFGF19 inmovilizado; sin embargo, cuando se expreso el injerto de 1A6 como un IgG, el analisis de Biacore de su afinidad por FGF19 revelo que la afinidad de union se habia reducido en mas de 50 veces en relacion con el anticuerpo 1A6 quimerico, en gran medida debido a una reduction en la velocidad de asociacion (Kon) (Tabla 2).

Tabla 2: Analisis de Biacore de 1A6 quimerico e injerto de 1A6 Union a FGF19 humano soluble Ka (M/s) Kd (s-1) KD (pM)

1A6 quimerico 1,47E+06 5,30E-05 36

injerto de 1A6 5,93E+04 1,24E-04 2091

Se generaron bibliotecas de fagos basadas en el injerto de HVR 1A6 que tenian mutaciones introducidas en los bucles de HVR. Estas bibliotecas se seleccionaron durante 2 ciclos frente a FGF19 inmovilizado seguido de 3 ciclos adicionales de selection usando duraciones cortas para union a concentraciones bajas de b-FGF19 soluble. Se observo enriquecimiento, definido como el numero de fagos recuperados en presencia de b-FGF dividido por el numero de fagos recuperados en ausencia de b-FGF despues del ciclo 3. Despues de 5 ciclos de seleccion, se seleccionaron clones para analisis de secuencia de ADN. Se observaron cambios de secuencia que se dirigen a cada uno de los HVR (Figura 3).

Se reformatearon clones seleccionados como IgG para analisis adicional por Biacore. Varios clones tuvieron afinidades mejoradas en comparacion con el anticuerpo de injerto 1A6 (Tabla 3). Esos clones tuvieron cambios en la region variable de cadena ligera (S34T, S34A o Q90S) o en la region variable de cadena pesada (V34A, H35Q, V50L, A100bR o A100bP/M100cS).

Tabla 3: Analisis de Biacore de anticuerpos con afinidad madurada seleccionada

________________Union a FGF19 humano soluble________________

Ka (veces mas lento) Kd (veces mas rapido) KD (veces mas debil)

1A6 quimerico

1 1 1

injerto de 1A6

24,8 2,3 58,1

hu1A6.S34T (HVR-L1)

12,0 1,2 14,0

hu1A6.S34A (HVR-L1)

7,7 1,2 9,1

hu1A6.Q90S (HVR-L3)

10,4 1,5 16,0

hu1A6.V34A (HVR-H1)

12,5 0,9 10,5

hu1A6.H35Q (HVR-H1)

5,0 1,3 6,6

hu1A6.V50L (HVR-H2)

6,3 0,9 5,7

hu1A6.A100bR (HVR-H3)

2,6 0,9 2,3

hu1A6.A100bP/M 100kS (HVR-H3)

1,7 0,5 0,9

Los mejores clones tuvieron un cambio del injerto 1A6 (bien S34A o S34G) y mostraron afinidad de union similar al anticuerpo 1A6 por FGF19 humano.

Eliminacion de un sitio formador de acido iso-aspartico potencial en HVR-L2 de 1A6 humanizado

Para evitar problemas de fabrication potenciales, se elimino un sitio formador de acido iso-aspartico potencial (Asp- Gly) en HVR-L2 de las variantes 1A6 humanizadas convirtiendo D56 a Glu (D56E) o Ser (D56S). Ninguna sustitucion tuvo un efecto en la union con FGF19 como se determino por Biacore. Las Tablas 4 y 5 muestran el analisis de Biacore en los anticuerpos sustituidos D56S.

Tabla 4: Analisis de Biacore de anticuerpo 1A6 quimerico y variantes 1A6 de afinidad madurada con FGF19 humano

Union a FGF19 humano soluble

Ka (M/s) Kd (s-1) KD (dM)

1A6 quimerico

1,70E+06 5,40E-05 32

hu1A6.S34A/D56S (HVR-L1/L2)

3,90E+05 4,60E-05 118

hu1A6.S34G/D56S (HVR-L1/L2)

1,40E+05 1,60E-05 114

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Tabla 5: Analisis de Biacore de anticuerpo 1A6 quimerico y variantes 1A6 de afinidad madurada con FGF19 de

cynomolgus

1A6 quimerico

hu1A6.S34A/D56S (HVR-L1/L2) hu1A6.S34G/D56S (HVR-L1/L2)

Union a FGF19 de Cyno soluble Ka (M/s) Kd (s-1) KD (pM)

7,60E+05 6,60E-05 87

1,60E+05 7,70E-05 481

5,30E+04 4,80E-05 906

Por tanto, partiendo de un injerto de los 6 HVR 1A6 murinos, la expansion de HVR-H2 para incluir la posicion 49 (Glicina), la expansion de HCR-H3 para incluir las posiciones 93 (Valina) y 94 (Arginina), la adicion de 1 cambio en HVR-L1 conduce a un anticuerpo 1A6, de alta afinidad, completamente humanizado, con una afinidad de union por FGF19 humano que es similar a la del anticuerpo 1A6 murino parental. Tambien se han identificado otras variantes de 1A6 humanizadas que son potencialmente terapeuticamente adecuadas. Ademas, se ha determinado que anticuerpos humanizados seleccionados descritos en el presente documento tienen al menos actividad biologica comparable con el anticuerpo 1A6 parental, por ejemplo, en ensayos de fosforilacion de receptores, etc.

Caracterizacion de un anticuerpo de la invencion

Se caracterizo el anticuerpo anti-FGF19 humanizado 1A6.v1 de la siguiente manera:

(1) En un ensayo para ensayar la capacidad de 1A6.v1 para bloquear la union de FGF19 con su receptor, FGFR4, 1A6.v1 fue capaz de bloquear la union de FGF19 con su receptor al menos tan bien como un anticuerpo comparador, concretamente un anticuerpo quimerico (que comprendia las regiones variables del anticuerpo 1A6 parental murino (dominios variables representados en la Figura 8) fusionado con una region Fc humana). Cuando se ensayo a traves de un intervalo de concentracion de anticuerpos de aproximadamente 1 - 67 nM, en condiciones como se ha descrito en la seccion de Materiales y Metodos anterior, se descubrio que 1A6.v1 tenia un valor de CI50 que era similar a un anticuerpo comparador tal como el anticuerpo 1A6 quimerico. Vease Figura 9.

(2) 1A6.v1 tambien se ensayo con respecto a union entre especies entre ser humano y primate (mono Cynomolgus). Se descubrio que 1A6.v1 se unia especificamente con receptor de FGF19 humano y de primate (mono Cynomolgus). El analisis in situ revelo que la expresion de FGF19 de cyno en higado mostraba un patron similar a la expresion de FGF19 humano en tejido de higado. Vease Figura 10.

(3) Se ensayo 1A6.v1 con respecto a eficacia in vitro usando una linea celular del tumor de colon (celulas HCT116). Los resultados de este estudio mostraron que el anticuerpo 1A6.v1 era capaz de inhibir la fosforilacion de FGFR4, FRS2 y ERK in vitro. Vease Figura 11.

(4) 1A6.v1 se ensayo con respecto a eficacia in vivo usando un modelo de xenoinjerto tumoral basado en una linea celular de tumor de colon (celulas HCT116). Los resultados de este estudio de eficacia mostraron que el anticuerpo 1A6.v1 era capaz de inhibir el crecimiento de tumores in vivo. Ademas, la fosforilacion de FGFR4, FRS2 y ERK se inhibio en tumores de xenoinjerto HCT116 tratados con anticuerpo anti-FGF19 1A6.v1. Vease Figura 12.

Aunque la invencion anterior se ha descrito en algun detalle como ilustracion y ejemplo con el fin de mejorar la claridad del entendimiento, las descripciones y ejemplos no deberian interpretarse como limitantes del alcance de la invencion.

Claims (15)

1. 5

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   15

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   40

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   55

   60

   REIVINDICACIONES

   1. Una forma humanizada de un anticuerpo anti-FGF19 murino que comprende:

   (i) una cadena ligera que comprende (a) secuencias de region hipervariable (HVR)-L1 que comprende la secuencia A1-A11, en donde A1-A11 es KASQDINSFLA (SEQ ID NO: 11); (b) HVR-L2 que comprende la secuencia B1-B7, en donde B1-B7 es RANRLVD (SEQ ID NO: 2), RANRLVS (SEQ ID NO: 13) o RANRLVE (SEQ ID NO: 14); y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia C1-C9, en donde C1-C9 es LQYDEFPLT (SEQ ID NO: 3); y

   (ii) una cadena pesada que comprende (a) la HVR-H1 que comprende la secuencia D1-D10, en donde D1-D10 es GFSLTTYGVH (SEQ ID NO: 4); (b) la HVR-H2 que comprende la secuencia E1-E17, en donde E1-E17 es GVIWPGGGTDYNAAFES (SEQ ID NO: 7); y (c) la HVR-H3 que comprende la secuencia F1-F13, en donde F1- F13 es VRKEYANLYAMDY (SEQ ID NO: 8); y

   (iii) una secuencia marco conservada consenso del subgrupo 1 K humano de cadena ligera y (iv) una secuencia

   marco conservada consenso del subgrupo III humano de cadena pesada.
2. 2. El anticuerpo de la reivindicacion 1, en el que B1-B7 es RANRLVD (SEQ ID NO: 2).
3. 3. El anticuerpo de la reivindicacion 1, en el que B1-B7 es RANRLVS (SEQ ID NO: 13).
4. 4. El anticuerpo de la reivindicacion 1, en el que B1-B7 es RANRLVE (SEQ ID NO: 14).
5. 5. Un acido nucleico que codifica el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4.
6. 6. Un vector que comprende el acido nucleico de la reivindicacion 5.
7. 7. Una celula hospedadora que comprende el acido nucleico de la reivindicacion 5.
8. 8. Una composicion que comprende el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde, opcionalmente, la composicion comprende un vehiculo.
9. 9. Un metodo para preparar un anticuerpo anti-FGF19 de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, comprendiendo dicho metodo (a) expresar un vector de la reivindicacion 6 en una celula hospedadora adecuada y (b) recuperar el anticuerpo, en donde, opcionalmente, la celula hospedadora es procariota o eucariota.
10. 10. Un anticuerpo anti-FGF19 de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 para su uso en un metodo para tratar un tumor, un cancer o un trastorno proliferativo celular, comprendiendo el metodo administrar una cantidad eficaz de dicho anticuerpo anti-FGF19 a un individuo que necesite dicho tratamiento.
11. 11. El anticuerpo anti-FGF19 para uso de la reivindicacion 10, en donde el cancer se selecciona del grupo que consiste en cancer de mama, cancer colorrectal, cancer de pulmon, cancer esofagico, cancer de vejiga, cancer ovarico, cancer pancreatico y carcinoma hepatocelular, o en donde el trastorno proliferativo es cancer.
12. 12. El anticuerpo anti-FGF19 para uso de las reivindicaciones 10 u 11, que comprende ademas administrar al sujeto una cantidad eficaz de un segundo medicamento, en donde el anticuerpo anti-FGF19 es un primer medicamento.
13. 13. El anticuerpo anti-FGF19 para uso de la reivindicacion 12, en donde el segundo medicamento es (i) otro anticuerpo, un agente quimioterapeutico, un agente citotoxico, un agente anti-angiogenico, un agente inmunosupresor, un profarmaco, una citocina, un antagonista de citocina, radioterapia citotoxica, un corticosteroide, un anti-emetico, una vacuna de cancer, un analgesico o un agente inhibidor del crecimiento, o (ii) tamoxifeno, letrozol, exemestano, anastrozol, irinotecan, cetuximab, fulvestrant, vinorelbina, erlotinib, bevacizumab, vincristina, imatinib, sorafenib, lapatinib o trastuzumab.
14. 14. El anticuerpo anti-FGF19 para uso de las reivindicaciones 12 o 13, en donde el segundo medicamento se administra antes de o despues de la administration del anticuerpo anti-FGF19, o se administra simultaneamente con el anticuerpo anti-FGF19.
15. 15. Un anticuerpo anti-FGF19 de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 para su uso en un metodo para modular una enfermedad asociada a la desregulacion del eje de senalizacion FGF19/FGFR4, comprendiendo dicho metodo administrar a un sujeto una cantidad eficaz de dicho anticuerpo, en donde la enfermedad es cirrosis.