ES2618832T3

ES2618832T3 - Composición TNFR-FC estabilizada que comprende arginina

Info

Publication number: ES2618832T3
Application number: ES08006091.6T
Authority: ES
Inventors: Wayne R. Gombotz; Richard L. Remmele Jr.
Original assignee: Immunex Corp
Current assignee: Immunex Corp
Priority date: 2002-02-27
Filing date: 2003-02-27
Publication date: 2017-06-22
Anticipated expiration: 2023-02-27
Also published as: US20140377264A1; JP2005527503A; WO2003072060A2; AU2003219958A1; DK1946776T3; AU2003219958B2; DE60322513D1; US7648702B2; EP1478394B1; ATE402716T1; CA2476934A1; US20100086559A1; US11104714B2; US8828947B2; PL374608A1; JP2010106036A; SI1478394T1; EP1478394A4; US8119604B2; HUE031630T2

Abstract

Una composición farmacéutica que es una formulación acuosa estable que comprende una forma soluble del receptor p75 TNF fusionada a un dominio Fc y un inhibidor de agregación, en el que el inhibidor de agregación es Larginina.

Description

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DESCRIPCION

Composition TNFR-FC estabilizada que comprende arginina

Esta aplicacion reivindica el beneficio de la Solicitud Provisional de U.S. No. 60/360,257, archivada el 27 de febrero de 2002.

Campo de la invention

La presente invention se relaciona con una composition farmaceutica acuosa adecuada para almacenamiento a largo plazo de polipeptidos que contienen una forma soluble del receptor p75 TNF fusionado a un dominio, metodos de fabrication de la composition, uso de la composition en un metodo de tratamiento y kit que contienen el mismo.

Antecedentes

El documento WO 00/62790 A2 (Immunex Corporation) divulga metodos para tratar trastornos medicos caracterizados por elevados niveles de expresion anormal de TNF-a administrando un antagonista TNF-a tal como un TNFR:Fc recombinante.

El documento WO 01/43773 A1 (Genentech Inc.) divulga metodos para el tratamiento de un trastorno mediado LFA-1 o un trastorno mediado TNF-a por administration, respectivamente, un antagonista LFA-1 o un antagonista TNF-a. El documento WO 01/43773 A1 tambien divulga etanercept liofilizado (ENBREL®), una proteina de fusion que comprende p75 humano unido a la portion Fc de IgG1 humana, reconstituida en agua bacteriostatica; y el uso de esta composition reconstituida en el tratamiento, entre otros, de la artritis.

Despues de la production, los polipeptidos deben almacenarse tipicamente antes de su uso. Frecuentemente, cuando se almacenan durante periodos prolongados, los polipeptidos son inestables en solution (Manning et al., 1989, Pharm Res. 6: 903 - 918). Por consiguiente, se han desarrollado pasos de procesamiento adicionales para permitir una vida de almacenamiento mas larga incluyendo el secado, por ejemplo, la liofilizacion. Sin embargo, las composiciones farmaceuticas liofilizadas son menos convenientes para el usuario final.

Las practicas tipicas para mejorar la estabilidad del polipeptido se pueden resolver variando la concentration de elementos con la formulation, o anadiendo excipientes para modificar la formulation (Patentes U.S. Nos. 5.580.856 y 6.171.586). El uso de aditivos, al tiempo que mejora el almacenamiento, puede dar como resultado polipeptidos inactivos. Ademas, en el caso de la liofilizacion, la etapa de rehidratacion puede introducir condiciones que resultan en la inactivation del polipeptido, por ejemplo, por agregacion o desnaturalizacion (Hora et al., 1992, Pharm Res., 9: 33-36, Liu Et al., 1991, Biotechnol., Bioeng., 37: 177 - 184). De hecho, la agregacion de polipeptidos es indeseable ya que puede resultar en inmunogenicidad (Cleland et al., 1993, Crit. Rev. Therapeutic Drug Carrier Systems, 10: 307 - 377 y Robbins et al., 1987, Diabetes, 36: 838 -845).

La presente invention aborda estas cuestiones proporcionando una nueva formulation liquida estable que permite el almacenamiento a largo plazo de un polipeptido que contiene una forma soluble del receptor de p75 TNF fusionado a un dominio Fc.

Resumen

La invention se refiere, en parte, a una composition farmaceutica acuosa estable que comprende una cantidad terapeuticamente efectiva de una forma soluble del receptor p75 TNF fusionado a un dominio Fc y, un inhibidor de agregacion, en el que el inhibidor de agregacion es L-arginina.

Opcionalmente, la composition puede incluir un amortiguador, un modificador de la tonicidad y uno o mas excipientes. En un aspecto, el amortiguador mantiene el pH de la composition en un intervalo de aproximadamente 6,0 y aproximadamente 7,0. Preferiblemente, el dominio Fc que contiene polipeptido es estable en la presente formulation por al menos tres meses a 2-8°C y/o es estable despues de uno o mas ciclos de congelation y descongelacion de la formulacion.

La invention tambien se refiere a un metodo de formulation de una composition farmaceutica que comprende combinar una forma soluble del receptor de p75 TNF fusionado a un dominio Fc con L-arginina. Opcionalmente, tambien se puede anadir a la composition farmaceutica un amortiguador, un modificador de la tonicidad y/o un excipiente. En un aspecto, la composition farmaceutica se formula a un intervalo de pH entre pH 6,0 y 7,0.

La invention tambien se relaciona con la composition farmaceutica de la invention para uso en un metodo de tratamiento de un mamifero que comprende administrar una cantidad terapeuticamente efectiva de la composition farmaceutica descrita aqui, en la que el mamifero tiene una enfermedad o trastorno que puede tratarse beneficiosamente con una forma soluble del receptor de p75 TNF fusionado a un dominio Fc en la composition.

En otra realization, la presente invention se refiere a un kit o recipiente, que contiene una composition farmaceutica acuosa de la invention. El kit tambien puede ir acompanado de instrucciones para uso

Breve descripcion de los dibujos

Figura 1: Cromatografia de exclusion de tamano (SEC) datos para los lotes A, B, C y D, y el lote 1 almacenado por hasta 1 ano a 2-8 0C.

Figura 2: SEC datos para los lotes A, B, C y D, y el lote 1 almacenado por hasta 1 ano a 370C.

5 Figura 3: SEC desnaturalizado (dSEC) datos para los lotes A, B, C y D, y el lote 1 almacenado por hasta 1 ano a 2- 80C.

Figura 4: dSEC datos para los lotes A, B, C y D, y el lote 1 almacenado por hasta 1 ano a 370C.

Figura 5: Cromatografia de interaccion hidrofoba (HIC) Pico 1 y Pre-pico 1 datos para los lotes A, B, C y D, y el lote 1 almacenado por hasta 1 ano a 2-80C.

10 Figura 6: HIC Pico 1 y Pre-pico 1 datos para los lotes A, B, C y D, y el lote 1 almacenado por hasta 1 ano a 370C. Figura 7: HIC Pico 2 datos para los lotes A, B, C y D, y el lote 1 almacenado por hasta 1 ano a 2-80C.

Figura 8: HIC Pico 2 datos para los lotes A, B, C y D, y el lote 1 almacenado por hasta 1 ano a 370C.

Figura 9: HIC Pico 3 datos para los lotes A, B, C y D, y el lote 1 almacenado por hasta 1 ano a 2-80C.

Figura 10: HIC Pico 3 datos para los lotes A, B, C y D, y el lote 1 almacenado por hasta 1 ano a 370C.

15 Figura 11: Actividad de union de lotes A, B, C y D, y el lote 1 almacenado por 12 meses a -70, 2-8, 30, y 370C.

Figura 12: Bioactividad de los lotes A, B, C y D, y el lote 1 almacenado por 12 meses a -70, 2-8, 30, y 370C. Descripcion detallada

En el almacenamiento a largo plazo de composiciones farmaceuticas que contienen polipeptidos, que incluyen formulaciones acuosas y liofilizadas, los polipeptidos activos se pueden perder debido a la agregacion y/o degradacion. 20 Por lo tanto, la presente invencion esta dirigida a una formulacion acuosa que sorprendentemente permite el almacenamiento a largo plazo estable de una composicion farmaceutica en la que el ingrediente activo en la composicion es una forma soluble del receptor de p75 TNF fusionado a un dominio Fc.

Esta formulacion es util, en parte, porque es mas conveniente para usar para el paciente, ya que esta formulacion no requiere ningun paso adicional tal como la rehidratacion.

25 Como se usa aqui, la frase "composicion farmaceutica" se entiende que hace referencia a una formulacion compuesta de un polipeptido preparado de tal manera que es adecuado para inyeccion y/o administracion en un paciente en necesidad de las mismas. Mas particularmente, una composicion farmaceutica es sustancialmente esteril y no contiene agentes que sean indebidamente toxicos o infecciosos para el receptor. Ademas, debe entenderse que, tal como se usa aqui, una solucion o formulacion liquida indica una preparacion liquida que contiene una o mas sustancias 30 quimicas disueltas en un solvente adecuado o una mezcla de solventes mutuamente miscibles.

Ademas, como se usa aqui, se entiende que el termino "aproximadamente" indica que puede haber variacion en la concentracion de un componente de la formulacion descrita que puede ser del 5%, 10%, 15% o hasta e incluyendo 20% del valor dado. Por ejemplo, si una formulacion tiene aproximadamente 10 mg/ml de un dominio Fc que contiene polipeptido, se entiende que indica que una formulacion puede tener entre 8 a 12 mg/ml del polipeptido declarado.

35 En una realizacion, la formulacion esta compuesta de una forma soluble del receptor de p75 TNF fusionado a un dominio Fc, un inhibidor de agregacion seleccionado de L-arginina y, opcionalmente, un amortiguador, un modificador de tonicidad y excipientes adicionales segun sea necesario. La L-arginina se ha usado para ayudar a replegar polipeptidos insolubles, particularmente aquellos expresados a altos niveles en cuerpos de inclusion en bacterias. Sin embargo, la L-arginina no se ha usado exitosamente para mejorar la estabilidad del dominio Fc que contiene 40 polipeptidos en composiciones farmaceuticas (Soejima et al., 2001, J. Biochem., 130: 369-277).

Se contempla que la preparacion de la composicion debe hacerse considerando la limitacion de la incomodidad en el sitio de inyeccion. Se contempla adicionalmente que tambien se pueden incluir ingredientes activos adicionales en la composicion descrita actualmente, por ejemplo, para reducir la incomodidad en el sitio de inyeccion. Tales ingredientes activos incluyen, pero no estan limitados a farmacos antiinflamatorios no esteroideos tales como, por ejemplo, 45 trometamina, en una dosificacion apropiada.

Polipeptidos

El dominio Fc que contiene polipeptido es una forma soluble del receptor p75 NF fusionado a un dominio Fc (TNFR:Fc).

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Un TNFR:Fc comercialmente disponibles es conocido como etanercept (Enbrel®, Immunex Corporation), que es un polipeptido de fusion dimerico que consiste en la porcion de union al ligando extracelular del receptor del factor de necrosis tumoral de 75 kilodaltons (p75) humano (TNFR) unido a la porcion Fc de la IgG1 humana. El componente Fc de etanercept contiene el dominio pesado 2 (CH2) constante, el dominio pesado 3 (CH3) y la region bisagra, pero no el dominio pesado 1 (CH1) constante de la IgG1 humana.

Se produce Etanercept por tecnologia de ADN recombinante en un sistema de expresion de celulas de mamifero de ovario de hamster chino (CHO). Consiste en 934 aminoacidos y tiene un peso molecular aparente de aproximadamente 150 kilodaltons (Physicians Desk Reference, 2002, Medical Economics Company Inc.).

Otros polipeptidos adecuados para uso en la presente formulacion incluyen antigenos de diferenciacion (denominados polipeptidos CD) o sus ligandos o polipeptidos sustancialmente similares a cualquiera de estos, que estan fusionados a un dominio Fc de un anticuerpo. Dichos antigenos son divulgados en Leukocyte Typing VI (Proceedings of the VIth International Workshop and Conference, Kishimoto, Kikutani et al., eds., Kobe, Japon, 1996). Polipeptidos CD similares son divulgados en talleres posteriores. Los ejemplos de dichos antigenos tambien incluyen CD27, CD30, CD39, CD40, y ligandos para los mismos (ligando CD27, ligando CD30, etc.). Varios de los antigenos CD son miembros de la familia del receptor TNF, que tambien incluyen ligando 41BB y OX40. Los ligandos son usualmente miembros de la familia TNF, como son el ligando 41BB y el ligando OX40. Por consiguiente, se pueden formular los miembros de las familias TNF y TNFR como se describe aqui.

Los polipeptido activos enzimaticamente o sus ligandos tambien se pueden formular como se describio aqui. Los ejemplos incluyen polipeptidos de fusion recombinante que comprenden un dominio Fc de un anticuerpo fusionado a todo o parte de uno de los siguientes polipeptidos o sus ligandos o un polipeptido sustancialmente similar a uno de estos: miembros de la familia de la metaloproteinasa-desintegrina, diversas quinasas, glucocerebrosidasa, superoxido dismutasa, activador del plasminogeno tisular, Factor VIII, Factor IX, apolipoproteina E, apolipoproteina AI, globinas, un antagonista de IL-2, alfa-1-antitripsina, enzima de conversion TNF-alfa, ligandos para cualquiera de las enzimas anteriormente mencionadas, y numerosas otras enzimas y sus ligandos.

Las formulaciones y metodos como se describen aqui tambien se pueden usar para preparar composiciones farmaceuticas que comprenden anticuerpos, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos quimericos, es decir, anticuerpos que tienen dominios de inmunoglobulina de anticuerpo constante humanos acoplados a uno o mas dominios de inmunoglobulina de anticuerpo variable murino, y/o anticuerpos no humanos, o fragmentos de los mismos. Los ejemplos especificos de anticuerpos adecuados para uso en la presente formulacion incluyen anticuerpos disponibles comercialmente tales como muromonab-CD3 (Orthoclone OKT-3®, Ortho Biotech), abciximab (Reo- Pro®, Lilly), rituximab (Rituxan®, IDEC), dacliximab (Zenapax®, Roche Laboratories), basiliximab (Simulect®, Novartis), infliximab (Remicade®, Centocor), palivizumab (Synagis®, MedImmune), trastuzumab (Herceptin®, Genentech), ozogamicina gemtuzumana (Mylotarg™, Wyeth-Ayerst) y alemtuzumab (Campath®, Berlex). Actualmente cada uno de los anteriores esta disponible ya sea como un polvo liofilizado que requiere rehidratacion o como un concentrado que requiere dilucion antes de la administracion. La presente formulacion obvia la necesidad de cualquier manipulacion antes de la administracion, por ejemplo, rehidratacion o dilucion, mientras se preserva la estabilidad de los ingredientes activos sobre almacenamiento de largo plazo.

La composicion farmaceutica como se describe aqui tambien puede ser usada para almacenar polipeptidos que comprenden un anticuerpo conjugado a una sustancia citotoxica o luminiscente. Dichas sustancias incluyen: derivados de maitansina (tales como DM1); enterotoxinas (tales como enterotoxinas estafilococicas); isotopos de yodo (tales como yodo-125); isotopos de tecnecio (tales como Tc-99m); fluorocromos de cianina (tales como Cy5.5.18); y polipeptidos que inactivan ribosomas (tales como la bouganina, la gelonina o la saporina-S6).

Los ejemplos de anticuerpos o anticuerpo/citotoxina o conjugados de anticuerpo/luminoforo incluyen aquellos que reconocen uno o mas de los siguientes antigenos: CD2, CD3, CD4, CD8, CD11a, CD14, CD18, CD20, cD22, CD23, CD25, CD33, CD40, CD44, CD52, CD80 (B7.1), CD86 (B7.2), CD147, IL-4, IL-5, IL-8, IL-10, receptor IL-2, receptor IL- 4, receptor IL-6, receptor IL-13, PDGF-P, VEGF, TGF, TGF-P2, TGF-P1, receptor EGF, receptor VEGF, complemento C5, IgE, antigeno tumoral CA125, antigeno tumoral MUC1, antigeno PEM, LCG (que es un producto de gente que se expresa en asociacion con cancer de pulmon), HER-2, una glicoproteina TAG-72 asociada al tumor, el antigeno SK- 1, epitopos asociados al tumor que estan presentes en niveles elevados en los sueros de pacientes con cancer de colon y/o pancreatico, epitopos o polipeptidos asociados a cancer expresados en celulas de cancer de mama, de colon, de celulas escamosas, de prostata, de pancreas, de pulmon y/o de rinon y/o en melanoma, glioma o celulas de neuroblastoma, Los receptores 1, 2, 3 y 4 de TRAIL, el nucleo necrotico de un tumor, integrina alfa 4 beta 7, la integrina VLA-4, integrinas B2, TNF-a, la molecula de adhesion VAP-1, la molecula de adhesion de celulas epiteliales (EpCAM), molecula de adhesion intercelular-3 (ICAM-3), adhesina de leucointegrina, la glicoproteina plaquetaria gp IIb/IIIa, cadena pesada de miosina cardiaca, hormona paratiroidea, rNAPc2 (que es un inhibidor del factor VIIa-factor tisular), MHC I, antigeno carcinoembrionario (CEA), alfa-fetoproteina (AFP), factor de necrosis tumoral (TNF), CTLA- 4 (que es un antigeno asociado a linfocitos T citotoxicos), receptor Fc-y-1, antigeno HLA-DR 10 -selectina, IFN- y, virus sincitial respiratorio, virus de inmunodeficiencia humana (VIH), virus de hepatitis B (VHB), Streptococcus mutans y Staphylococcus aureus.

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Tambien se pueden usar las formulaciones para anticuerpos anti-idiotipicos, o polipeptidos sustancialmente similares, que incluyen pero no estan limitados a anticuerpos anti-idiotipicos contra: un anticuerpo dirigido al antigeno tumoral gp72; un anticuerpo contra el gangliosido GD3; o un anticuerpo contra el gangliosido GD2.

El dominio Fc que contiene polipeptidos adecuados para almacenamiento en la presente composicion farmaceutica se pueden producir mediante celulas anfitrionas vivientes que expresan el polipeptido, tal como hibridomas en el caso de anticuerpos, o celulas anfitrionas que han sido disenadas geneticamente para producir el polipeptido en el caso de polipeptidos o anticuerpos de fusion. Los metodos de ingenieria genetica celular para producir polipeptidos son bien conocidos en la tecnica. Vease, por ejemplo, Ausubel et al., eds. (1990), Current Protocols in Molecular Biology (Wiley, Nueva York). Dichos metodos incluyen introducir acidos nucleicos para codificar y permitir expresion del polipeptido en las celulas anfitrionas vivientes. Estas celulas anfitrionas pueden ser celulas bacterianas, celulas fungicas, o, preferiblemente, celulas animales cultivadas en cultivo. Las celulas anfitrionas bacterianas incluyen, pero no estan limitadas a, celulas de Escherichia coli. Los ejemplos de cepas de E. coli adecuadas incluyen: HB101, DH5(, GM2929, JM109, KW251, NM538, NM539, y cualquier cepa de E. coli que falla en escindir ADN foraneo. Las celulas anfitrionas fungicas que pueden ser usadas incluyen, pero no estan limitadas a, celulas de Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris y Aspergillus. Algunos ejemplos de lineas de celulas animales que se pueden usar son CHO, VERO, BHK, HeLa, Cos, MDCK, 293, 3T3, y Wl38. Las lineas de celulas animales nuevas se pueden establecer usando metodos bien conocidos por aquellos expertos en la tecnica (por ejemplo, por transformacion, infeccion viral, y/o seleccion). Opcionalmente, el polipeptido puede ser secretado por celulas anfitrionas en el medio.

La purificacion del dominio Fc expresado que contiene el polipeptido se puede realizar por cualquier metodo estandar. Cuando el dominio Fc que contiene polipeptido se produce intracelularmente, los residuos en forma de particulas se eliminan, por ejemplo, por centrifugacion o ultrafiltracion. Cuando el polipeptido se secreta en el medio, los sobrenadantes de dichos sistemas de expresion se pueden concentrar primero usando filtros de concentracion de polipeptidos estandar. Tambien se pueden anadir inhibidores de proteasa para inhibir la proteolisis y se pueden incluir antibioticos para prevenir el crecimiento de microorganismos.

Se puede purificar el dominio Fc que contiene el polipeptido usando, por ejemplo, cromatografia de hidroxiapatita, electroforesis en gel, dialisis y cromatografia de afinidad, y cualquier combinacion de tecnicas de purificacion conocidas o aun por descubrir. Por ejemplo, se puede usar la proteina A para purificar el dominio Fc que contienen el polipeptido que estan basados en cadenas pesadas gamma 1, gamma 2 o gamma 4 humanas (Lindmark et al., 1983, J. Immunol. Meth. 62: 1-13). La proteina G se recomienda para todos los isotipos de raton y para gamma 3 humano (Guss et al., 1986, EMBO J. 5: 1567-1575).

Tambien se pueden usar tras tecnicas para la purificacion de polipeptidos tales como fraccionamiento en una columna de intercambio ionico, precipitacion con etanol, HPLC de fase inversa, cromatografia sobre silice, cromatografia sobre heparina SEPHAROSET™, cromatografia sobre una resina de intercambio anionico o cationico (tal como una columna de acido poliaspartico), cromatofoco, SDS - PAGE, y precipitacion con sulfato de amonio, dependiendo de la necesidad.

Composicion farmaceutica

La presente composicion farmaceutica esta preparada por combinacion, adicionalmente al polipeptido purificado descrito anteriormente, un inhibidor de agregacion. Ademas, se pueden anadir segun sea necesario un amortiguador, un modificador de tonicidad y un excipiente adicional. Alguien de experiencia ordinaria en la tecnica entendera que se puede hacer en cualquier orden apropiado la combinacion de diferentes componentes que van a ser incluidos en la composicion, es decir, se puede anadir primero el amortiguador, en la mitad o de ultimo y el modificador de tonicidad tambien se puede anadir primero, en la mitad o de ultimo. Alguien de experiencia ordinaria en la tecnica tambien debe entender que alguna de estas sustancias quimicas puede ser incompatible en ciertas combinaciones, y por consiguiente, son constituidas facilmente con diferentes sustancias quimicas que tienen propiedades similares pero son compatibles en la mezcla relevante.

Los inhibidores de agregacion reducen la tendencia de un polipeptido a asociarse en complejos ternarios o cuaternarios inadecuados o no deseados. Inesperadamente, los presentes inventores han encontrado que los aminoacidos L-arginina y/o L-cisteina actuan para reducir la agregacion del dominio Fc que contiene polipeptido en una formulacion por largos periodos, por ejemplo dos anos o mas. La concentracion del inhibidor de la agregacion en la formulacion esta preferiblemente entre aproximadamente 1 mM a 1M, mas preferiblemente aproximadamente 10 mM a aproximadamente 200 mM, mas preferiblemente aproximadamente 10 mM a aproximadamente 100 mM, aun mas preferiblemente aproximadamente 15 mM a aproximadamente 75 mM, y aun mas preferiblemente aproximadamente 25 mM. Estos compuestos estan disponibles de proveedores comerciales.

Los agentes de amortiguacion mantienen el pH en un intervalo deseado y diversos amortiguadores adecuados para uso en la composicion farmaceutica de la invencion incluyen histidina, fosfato de potasio, citrato de sodio o potasio, acido maleico, acetato de amonio, tris-(hidroximetil)-aminometano (tris), diversas formas de acetato y dietanolamina. Un amortiguador preferido es fosfato de sodio ya que su capacidad de amortiguacion esta en o cerca del pH 6,2. La concentracion del amortiguador en la formulacion esta preferiblemente entre aproximadamente 1 mM a aproximadamente 1 M, mas preferiblemente aproximadamente 10 mM a aproximadamente 200 mM. Los

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amortiguadores son bien conocidos en la tecnica y son fabricados por metodos conocidos y disponibles de proveedores comerciales.

Cuando el pH de la composicion farmaceutica se establece en o cerca de los niveles fisiologicos, se maximiza la comodidad del paciente tras la administracion. En particular, se prefiere que el pH este dentro de un intervalo de pH de aproximadamente 5,8 a 8,4, prefiriendose aproximadamente 6,2 a 7,4, sin embargo, debe entenderse que el pH puede ajustarse segun sea necesario para maximizar la estabilidad y solubilidad del polipeptido en una formulacion particular y como tal, esta dentro del alcance de la invencion un pH fuera de intervalos fisiologicos, pero tolerable para el paciente.

Se entiende que un modificador de tonicidad es una molecula que contribuye a la osmalidad de una solucion. La osmalidad de una composicion farmaceutica esta regulada preferiblemente con el fin de maximizar la estabilidad del ingrediente activo y tambien disminuir la incomodidad del paciente tras de administracion. Cuando el suero es aproximadamente 300 +/- 50 milliosmolales por kilogramo. Se prefiere generalmente que una composicion farmaceutica sea isotonica con suero, es decir, que tiene la misma o similar osmalidad, que se logra por adicion de un modificador de tonicidad, por lo tanto se contempla que la osmalidad estara desde aproximadamente 180 a aproximadamente 420 milliosmolales, sin embargo, se debe entender que la osmalidad puede ser ya sea menor o mayor cuando las condiciones especificas lo requieren. Los ejemplos de modificadores de tonicidad adecuados para modificar osmalidad incluyen, pero no estan limitados a aminoacidos (por ejemplo, arginina, cisteina, histidina y glicina), sales (por ejemplo cloruro de sodio, cloruro de potasio y citrato sodico) y/o sacaridos (por ejemplo sacarosa, glucosa y manitol). La concentracion del modificador de tonicidad en la formulacion esta preferiblemente entre aproximadamente 1 mM a 1M, mas preferiblemente aproximadamente 10 mM a aproximadamente 200 mM. Los modificadores de tonicidad son bien conocidos en la tecnica y son fabricados por metodos conocidos y disponibles de proveedores comerciales.

Los excipientes, tambien indicados como aditivos quimicos, co-solutos, o co-solventes, que estabilizan el polipeptido mientras esta en solucion (tambien en formas secas o congeladas) tambien se pueden anadir a una composicion farmaceutica. los ejemplos incluyen pero no estan limitados a azucares/polioles tales como: sacarosa, lactosa, glicerol, xilitol, sorbitol, manitol, maltosa, inositol, trehalosa, glucosa; polimeros tales como: albumina de suero (albumina de suero bovino (BSA), SA humana o HA recombinante), dextrano, PVA, hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC), polietilenimina, gelatina, polivinilpirrolidona (PVP), hidroxietilcelulosa (HEC); solventes no acuosos tales como: alcoholes polihidricos, (por ejemplo, PEG, etilenglicol y glicerol) dimetilsulfoxido (DMSO) y dimetilformamida (DMF); aminoacidos tales como: prolina, L-serina, acido glutamico sodico, alanina, glicina, clorhidrato de lisina, sarcosina y acido gamma-aminobutirico; tensioactivos tales como: Tween-80, Tween-20, SDS, polisorbato, copolimero de polioxietileno; y diversos excipientes tales como: fosfato de potasio, acetato de sodio, sulfato de amonio, sulfato de magnesio, sulfato de sodio, N-oxido de trimetilamina, betaina, iones metalicos (por ejemplo, zinc, cobre, calcio, manganeso y magnesio), CHAPS, monolaurato, 2-O-beta-manoglicerato o cualquier combinacion de los anteriores.

La concentracion de uno o mas excipientes en una formulacion de la invencion esta preferiblemente entre aproximadamente 0,001 a 5 por ciento en peso, de manera mas preferible aproximadamente 0,1 a 2 por ciento en peso. Los excipientes son bien conocidos en la tecnica y son fabricados por metodos conocidos y disponibles de proveedores comerciales.

En una realizacion ilustrativa, una formulacion de la invencion puede comprender aproximadamente 25 a aproximadamente 50 mg de una forma soluble del receptor p75 TNF fusionado a un dominio Fc (etanercept), aproximadamente 10 mM a aproximadamente 100 mM de L-arginina, aproximadamente 10 mM a aproximadamente 50 mM de fosfato de sodio, aproximadamente 0,75% a aproximadamente 1,25% de sacarosa, aproximadamente 50 mM a aproximadamente 150 mM de NaCl, en aproximadamente pH de 6,0 a aproximadamente pH de 7,0. En otra realizacion, la L-arginina puede reemplazarse con L-cisteina (en aproximadamente 1 a aproximadamente 500 micromolar) en la formulacion. En aun otra realizacion, el pH puede ser de aproximadamente pH de 7,0. En otra realizacion especifica, una formulacion de la invencion puede comprender aproximadamente 25 mg/ml de una forma soluble del receptor p75 TNF fusionado a un dominio Fc, aproximadamente 25 mM de L-arginina, aproximadamente 25 mM de fosfato sodico, aproximadamente 98 mM de cloruro sodico, y aproximadamente 1% de sacarosa a aproximadamente pH 6,2.

En aun otra realizacion, una formulacion de una forma soluble del receptor de p75 TNF fusionada a un dominio Fc de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 100 mM de L-arginina, aproximadamente 10 mM a aproximadamente 50 mM de fosfato sodico, aproximadamente 0 a 5% de Mannitol y 0 a 0,2% de Tween 20 a aproximadamente pH de 6 a 7.

En aun otra realizacion, la invencion proporciona un uso para tratar un mamifero que comprende administrar una cantidad efectiva terapeuticamente de la composicion farmaceutica descrita aqui, en la que el mamifero tiene una enfermedad o trastorno que puede ser tratado beneficiosamente con una forma soluble del receptor p75 TNF fusionado a un dominio Fc en la composicion. En aun otra realizacion, el dominio Fc que contiene polipeptido es derivado de las mismas especies de mamiferos que se va a tratar con la composicion. En una realizacion particular, el mamifero es un paciente humano en necesidad del tratamiento. Cuando el dominio Fc que contiene polipeptido de la composicion es una forma soluble del receptor p75 TNF fusionado a un dominio Fc, los ejemplos de enfermedades o trastornos

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que pueden ser tratados incluyen pero no estan limitados a artritis reumatoidea, artritis psoriasica, espondilitis anquilosante, enfermedad de Wegener (granulomatosis), enfermedad de Crohn (o enfermedad inflamatoria del intestino), enfermedad pulmonar obstructiva cronica (EPOC), hepatitis C, endometriosis, asma, caquexia, psoriasis y dermatitis atopica. Las enfermedades o trastornos adicionales que se pueden tratar con TNFR:Fc incluyen aquellos descritos en los documentos WO 00/62790, WO 01/62272 y la Solicitud de Patente U.S. No. 2001/0021380.

Adicionalmente, la presente composicion farmaceutica proporciona almacenamiento a largo plazo mejorado de manera que el ingrediente activo, por ejemplo, una forma soluble del receptor p75 TNF fusionado a un dominio Fc, es estable sobre el transcurso del almacenamiento ya sea en estados liquidos o congelados. Como es usado aqui, la frase almacenamiento "a largo plazo" se entiende que indica que la composicion farmaceutica se puede almacenar por tres meses o mas, por seis meses o mas, y preferiblemente por un ano o mas. El almacenamiento a largo plazo se entiende que indica que la composicion farmaceutica se almacena ya sea como un liquido 2-80C o se congela, por ejemplo, a -20°C o mas frio. Tambien se contempla que la composicion se puede congelar y descongelar mas de una vez. El termino "estable" con respecto a almacenamiento a largo plazo se entiende que indica que el polipeptido activo de la composicion farmaceutica no pierde mas de 20%, o mas preferiblemente 15%, o incluso mas preferiblemente 10%, y lo mas preferiblemente 5% de su actividad en relacion a la actividad de la composicion al principio del almacenamiento.

Dosificacion efectiva de la composicion farmaceutica

La dosificacion apropiada, o cantidad terapeuticamente efectiva, de una forma soluble del receptor p75 TNF fusionado a un dominio Fc de la formulacion dependera de la condicion a tratar, de la gravedad de la afeccion, de la terapia previa y de la historia clinica del paciente y la respuesta al agente terapeutico. La dosificacion apropiada puede ser ajustada de acuerdo con el juicio del medico asistente de tal manera que pueda administrarse al paciente una vez o sobre una serie de administraciones. La composicion farmaceutica se puede administrar como un unico farmaco terapeutico o en combinacion con terapias adicionales segun sea necesario.

En una realizacion, la cantidad efectiva de una forma soluble del receptor p75 TNF fusionado a un dominio Fc por dosificacion de adulto varia desde aproximadamente 1-500 mg/m2, o desde aproximadamente 1-200 mg/m2, o desde aproximadamente 1-40 mg/m2 o aproximadamente 5-25 mg/m2. Alternativamente, se puede administrar una dosificacion plana, cuya cantidad puede variar desde 2-500 mg/dosificacion, 2-100 mg/dosificacion o desde aproximadamente 10-80 mg/dosificacion. Si la dosificacion se debe administran mas de una vez por semana, un intervalo de dosificacion a manera de ejemplo es el mismo como los rangos de dosificacion descritos anteriormente o inferiores y preferiblemente se administran dos o mas veces por semana en un intervalo de dosificacion de 25-100 mg/dosificacion. En otra realizacion, una dosificacion aceptable para administracion por inyeccion contiene 80-100 mg/dosificacion, o alternativamente, que contiene 80 mg por dosificacion. Las dosificaciones se pueden administrar cada dos semanas, dosificaciones semanales, o separadas por varias semanas (por ejemplo 2 a 8). En este ejemplo TNFR:Fc (etanercept) se administra generalmente a 25 mg by por una inyeccion subcutanea individual (SC).

En muchos casos, se obtendra una mejora en la condicion de un paciente con una dosificacion de hasta aproximadamente 100 mg de la composicion farmaceutica de una a tres veces por semana durante un periodo de al menos tres semanas, aunque puede ser necesario un tratamiento durante periodos mas largos para inducir el grado de mejora deseado. Para las condiciones cronicas incurables el regimen puede continuar indefinidamente. Para los pacientes pediatricos (edades 4-17), un regimen adecuado implica una dosificacion de 0,4 mg/kg a 5 mg/kg de los polipeptidos de la invencion, administrados una o mas veces por semana.

En otra realizacion, se contempla que la formulacion farmaceutica de la invencion se prepara en una formulacion a granel y como tal, los componentes de la composicion farmaceutica se ajustan de manera que sean mas altos de lo que se necesitarian para la administracion y diluidos apropiadamente antes de administracion.

Administracion de la composicion farmaceutica

Las composiciones farmaceuticas de esta invencion son particularmente utiles para administracion parenteral, por ejemplo, por via subcutanea, intramuscular, intravenosa, intraperitoneal, intracerebrospinal, intraarticular, intrasinovial y/o intratecal. La administracion parenteral puede ser por inyeccion de bolo o infusion continua. Las composiciones farmaceuticas para inyeccion pueden estar presentes en una forma de dosificacion unitaria, por ejemplo, en ampollas o en recipientes de multidosificacion, con un conservante anadido. Adicionalmente, se ha desarrollado un numero de enfoques de suministro de medicamentos recientes y las composiciones farmaceuticas de la presente invencion son adecuadas para administracion usando estos nuevos metodos, por ejemplo, Inject-ease™, Genject™, plumas inyectoras como GenPen™, dispositivos sin agujas tales como MediJector™ y BioJector™. La presente composicion farmaceutica tambien se puede adaptar a metodos de administracion que aun no se han descubierto. Vease tambien Langer, 1990, Science, 249:1527-1533.

La composicion farmaceutica tambien se puede formular como una preparacion de deposito. Dichas formulaciones de accion prolongada se pueden administrar por implantacion (por ejemplo de manera subcutanea o intramuscularmente) o por inyeccion intramuscular. Asi, por ejemplo, las formulaciones pueden ser modificadas con materiales polimericos

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o hidrofobos adecuados (por ejemplo como una emulsion en un aceite aceptable) o resinas de intercambio ionico, o como derivados escasamente solubles, por ejemplo, como una sal escasamente soluble.

Las composiciones farmaceuticas pueden presentarse, si se desea, en un vial, paquete o dispositivo dispensador que puede contener una o mas formas de dosificacion unitaria que contienen el ingrediente activo. En una realizacion, el dispositivo dispensador puede comprender una jeringa que tiene una dosificacion individual de la formulacion liquida lista para inyeccion. La jeringa puede ir acompanada de instrucciones para la administracion.

En otra realizacion, la presente invencion esta dirigida a un kit o recipiente, que contiene una composicion farmaceutica acuosa de la invencion. La concentracion del polipeptido en la composicion farmaceutica acuosa puede variar en un amplio intervalo, pero esta generalmente dentro del intervalo de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 20.000 microgramos por mililitro (pg/ml) de formulacion acuosa. El kit tambien puede ir acompanado de instrucciones de uso.

La invencion se entendera mas completamente con referencia a los siguientes ejemplos. Sin embargo, los ejemplos no deben ser interpretados como limitantes del alcance de la invencion.

Ejemplos

Ejemplo 1

Con el fin de determinar el mejor excipiente para prevenir la agregacion de un dominio Fc que contiene polipeptido, se produjo y se ensayo TNFR:Fc para la dispersion de luz de una muestra (Is) que contiene el TNFR:Fc con diferentes excipientes despues de la incubacion a 510C +/-10C, y comparados con la dispersion de luz de una muestra control (Ic) con TNFR:Fc solo almacenado a 2-80C. La proporcion se mide como Is/Ic, y una proporcion de uno representa una linea base teorica donde no hay cambio en la dispersion de luz, es decir, agregacion, del compuesto de prueba. Los diferentes excipientes ensayados incluyeron 5% de acido ascorbico, 5% de manitol, 10% de sacarosa, 1% de polivinilpirrolidona (PVP - K15), 0,1% de polietilenglicol (PEG, Mw = 1000), 0,6% de etanol, 1,2% de glicina, 2% de L - arginina, Pluronic F68, 1,6% de betaina y 1,5% de L-cisteina. Sorprendentemente, la L-arginina fue el unico inhibidor de agregacion hallado para mantener la proporcion de Is/Ic debajo de uno durante todo el periodo de prueba de 200 horas.

Ejemplo 2

Se evaluo TNFR:Fc producido y denotado como lotes A, B, C y D contra TNFR:Fc producido por un metodo diferente y que tiene agregacion inicial superior( lote 1) para estabilidad en una formulacion liquida (25 mM de fosfato, 25 mM de L-arginina, 98 mM de NaCl, sacarosa al 1%, en pH de 6.2) en jeringas o en viales de vidrio a -70°C, -20°C, 2-80C, 30°C, y 370C. Se analizaron las muestras por cromatografia de exclusion de tamano (SEC), SEC desnaturalizada (dSEC), cromatografia de interaccion hidrofoba (HIC), electroforesis en gel de poliacrilamida de dodecilsulfato sodico (SDSPAGE) y para la union y bioactividad en diversos puntos temporales. Se puede medir la bioactividad por cualquier numero de ensayos incluyendo por SEC, dSEC, HIC, actividad de union y bioactividad, como se discutio abajo.

Cromatografia de exclusion de tamano:

Se uso SEC para evaluar el nivel de especies de alto peso molecular (HMW) (agregado que se formo) en las muestras durante el almacenamiento. Las especies de bajo peso molecular (LMW) se solucionaron mejor por dSEC y que los datos se pueden encontrar en la siguiente seccion. La Figura 1 muestra los datos de SEC para las muestras almacenadas a 2-80C y la Figura 2 muestra los datos de SEC para muestras almacenadas bajo condiciones aceleradas de 37°C.

Tambien se recolectaron los datos para muestras almacenadas a 30°C (datos no mostrados) y los niveles de especies de HMW con intermedios a aquellos observados en 2-80C y 370C. Durante el almacenamiento por 1 ano a 2-80C, los niveles agregados permanecieron estables, o aumentaron menos de 0.6% en el peor de los casos para el lote A. No se vio un incremento significativo en el agregado durante el almacenamiento a 2-80C. Bajo condiciones aceleradas durante el almacenamiento a 370C, los niveles agregados en el lote 1 aumentaron a 19% durante 12 meses, y a 14% y 12% en el lote A y B, respectivamente. La pendiente de la linea fue muy similar, mostrando que las moleculas agregadas a la misma rata, y que la diferencia entre los lotes A-D y lote 1 se debe a los niveles iniciales de agregados, mas alto en el lote 1 que en los lotes A-D. Para el lote B, no hubo diferencia entre las muestras almacenadas en un vial a -70°C, en una jeringa a -70°C, en una jeringa -20°C, o en una jeringa despues del tratamiento termico y almacenamiento a -20°C (datos no mostrados). Todos los valores estuvieron dentro del 0.4% del vial de control de - 70°C (y el valor de tiempo 0) despues de 12 meses de almacenamiento.

Cromatografia de exclusion de tamano desnaturalizada:

La cuantificacion SEC (dSEC) desnaturalizada de las especies de peso molecular bajo (LMW) se muestra en la Figura 3 para muestras almacenadas a 2-80C, y la Figura 4 para muestras almacenadas a 370C. Se analizaron los lotes A-D y lote 1 por dSEC despues del almacenamiento por hasta 1 ano a 2-80C, pero los lotes C y D no se analizaron en los ultimos 6 meses de almacenamiento bajo las condiciones aceleradas de 370C. Durante el almacenamiento a 370C, lote 1 y lotes A, B, y C mostraron ruptura similar, mientras el lote D mostro ruptura superior durante la tension de calor

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que el lote 1 y los otros lotes. La similitud en los lotes A y B y el lote 1 tambien se vio durante el almacenamiento a 30oC (datos no mostrados), con niveles de ruptura intermedios a aquel visto en 2-80C y 370C. Para el lote B, no hubo diferencia entre las muestras almacenadas en un vial a -70°C, en una jeringa -70°C, en una jeringa a -20°C, o en una jeringa despues del tratamiento termico y almacenadas a - 20 ° C (datos no mostrados). Todos los valores despues de 12 meses de almacenamiento a -70°C y -20°C estuvieron dentro de 0.7% de cada otro y el valor de tiempo 0.

Durante el almacenamiento a 30°C (datos no mostrados), el% LMW por dSEC para el lote A sigue bien con el lote B, aunque ambos lotes muestran niveles ligeramente mayores de ruptura que el lote 1 a esta temperatura. El lote D muestra niveles mas altos de especies de LMW a 2-80C y 370C en todos los puntos de tiempo, incluyendo el tiempo 0. Los productos de ruptura en el lote D parecen ser mas grandes en tanado que lo que tipicamente se observa mediante el analisis dSEC de muestras TNFR:Fc tensionados. Estas diferentes especies se observan despues del almacenamiento a 2-8 ° C y 37 ° C.

Cromatografia de interaccion hidrofoba:

HIC se uso para separar diferentes especies relacionadas de TNFR:Fc. Se ha demostrado que Pico 1 (y un pico de elucion anterior indicado como pre-pico 1) consiste principalmente en especies de bajo peso molecular. El Pico 2 incluye el dimero plegado, intacto (activo).El Pico 3 incluye materiales agregados y dimeros menos activos.

Los datos del Pico 1de HIC se muestran en la Figura 5 para muestras almacenadas a 2-80C y la Figura 6 para muestras almacenadas a 370C. Para todos los lotes excepto el lote D, los niveles de especies de LMW se mantienen relativamente constantes (dentro del 1,2% en 12 meses) para las muestras almacenadas a 2-80C. Si se usa el valor promedio para las muestras de -70°C en lugar del valor de tiempo 0 para el lote A, las curvas de todos los lotes, excepto el lote D, se alinean bien. El lote D muestra mas Pico 1 que los otros lotes, que corrobora los altos niveles de especies de LMW vistos por dSEC. Despues de la tension de calor de las muestras a 37°C por hasta 1 ano, el lote B y el lote 1 muestran aproximadamente 30% de HIC del Pico 1, mientras que el lote A muestra aproximadamente 45% de HIC del Pico 1. El lote D mostro 47% de HIC del Pico 1despues de solamente 6 Meses de tension a 37 0C.

Como se ha indicado anteriormente, HIC del Pico 2 representa la especie activa mas deseada. Las Figuras 7 y 8 muestran el % de HIC del Pico 2 para muestras almacenadas a 2-80C y 370C, respectivamente. Aunque el lote 1 comienza con un Pico 2 inicial mas bajo, conserva el nivel de especies activas durante el almacenamiento durante 12 meses a 2-80C. Los lotes A, B y C tambien retienen especies activas durante los 12 meses de almacenamiento refrigerado. Bajo condiciones aceleradas de 370C, todos los lotes ensayados pierden HIC del Pico 2 durante el almacenamiento.

Los niveles de HIC del Pico 3 permanecieron esencialmente constantes durante 1 ano de almacenamiento a 2-80C (Figura 9). La variacion en % de Pico 3 para todos los lotes oscilo entre 1 y 3%, bien dentro del error de integracion. Para los lotes A, B, C y D, HIC de Pico 3 no muestra resolucion de linea base, que introduce mas variabilidad en la integracion. Para el lote 1, el pico esta mas claramente definido. Despues del almacenamiento a 37 ° C, los niveles de HIC del Pico 3 en el lote 1 son mas variables, pero permanecen bastante constantes, excepto por un posible aumento a los 12 meses (Figura 11). Entre los lotes A-D, no se observaron diferencias claras despues del almacenamiento a 370C, excepto a los 12 meses, cuando el lote B muestra un aumento en el nivel de HIC del Pico 3.

Electroforesis en gel de dodecil sulfato-poliacrilamida de sodio:

Se llevo a cabo analisis SDS-PAGE de muestras almacenadas durante 12 meses a -70°C, -20°C, 2-8°C, 30°C y 37°C. El lote A tenia un aumento en las bandas asociadas con tanto un fragmento de ruptura ~50kD como ~34kD despues del almacenamiento a 2-80C por 1 ano. A temperaturas elevadas, se observo una degradacion extensiva, con muchas bandas de pequeno peso molecular que mostraban intensidades incrementadas.

El lote 1 no mostro ningun cambio despues de un ano de almacenamiento a 2-8°C, pero mostro un fragmento de ruptura aumentado de ~50 kD y ~34 kD despues de 1 ano a 30 y 37°C. El lote B no mostro cambios durante el almacenamiento por 12 meses a -70°C (vial o jeringa) o en jeringas a -20°C, con o sin tratamiento termico para eliminar el sobreenfriamiento. Sin embargo, despues de 12 meses a 2-80C, las bandas correspondientes a tanto los fragmentos de ruptura ~50kD como ~34kD mostraron una intensidad aumentada. El almacenamiento a 30 o 37 0C durante 1 ano dio lugar a rompimiento, con muchas bandas de peso molecular pequeno, ademas de los fragmentos de ruptura ~ 50kD y ~ 34kD discutidos anteriormente.

Se analizaron los lotes C y D despues de almacenamiento por 12 meses a -70°C y 2-80C. El lote 1 y los lotes B, C y D se analizaron despues de un almacenamiento por 12 meses a -70°C y 2-8°C y mostraron patrones de degradacion similares como se ha indicado anteriormente.

Union y Bioactividad:

La Figura 11 muestra los datos de actividad de union derivados de un ELISA, para los lotes A-D y el lote 1 almacenados por 6 y 12 meses a -70°C, 2-8°C, 30°C y 37°C. Las barras de error en las muestras de -70°C indican +/- 30%. Solo valores fuera de estas barras de error seran considerados significativos debido a la variabilidad del ensayo. Los lotes A y B retenian la actividad de union completa despues de 6 meses a 2-8 y 30°C, pero a los 12 meses, solo las muestras

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almacenadas a 2-82C mantenian actividad de union completa. El lote 1 fue capaz de mantener la actividad completa por hasta 12 meses despues del almacenamiento a 2-8 y 30°C, a pesar de mostrar niveles de LMW de 13,6% (por dSEC, datos no mostrados) y 8% de HMW (por SEC; datos no mostrados) despues de 1 ano a 30°C. Los lotes C y D tambien conservaron la actividad de union completa despues de 1 ano de almacenamiento a 2-8°C, a pesar de los niveles mas altos de productos de ruptura observados en el lote D por dSEC e HIC.

Un ejemplo de un bioensayo TNFR: Fc es para inhibir la respuesta de crecimiento negativo de una linea celular a TNF- alfa humana. La presencia de TNF-alfa inhibe las celulas de crecer a traves de la induccion de la apoptosis. La presencia de receptor rhuTNF (TNFR: Fc) soluble biologicamente activo neutraliza especificamente TNF-alfa de una manera dependiente de la dosificacion. Un estandar de referencia, control y muestras de TNFR se anaden y titulan en un formato de placa de microtitulacion de 96 pozos. Se anade una concentracion de celulas conocida a cada pozo seguido por la adicion de TNF-alfa. Despues de un periodo de incubacion, las celulas no adherentes se eliminan lavando suavemente con solucion salina amortiguada con fosfato (PBS) y las celulas restantes se tinen. Despues de un periodo de incubacion, se lee cada pozo. Las unidades de cada pozo son directamente proporcionales a la actividad especifica de TNFR. Los resultados del ensayo de bioactividad (Figura 12) corroboran los datos del ensayo de union.

Conclusiones:

Se mostro que los lotes B y C formulados en una formulacion de fosfato liquido (25 mM de fosfato, 25 mM de L- arginina, 98 mM de NaCl, sacarosa al 1%, pH de 6,2) eran tan estables como el lote 1 en la misma formulacion por 1 ano a - 70°C o 2-8°C. Los lotes A-D mostraron menos agregacion que el lote 1, y fueron equivalentes en terminos de ruptura en especies de menor peso molecular (menos del 4% LMW por dSEC a los 12 meses). Tanto el lote 1 como los lotes A-D mostraron mayor ruptura y agregacion a temperaturas elevadas de 30 y 37°C, pero los lotes que se realizaron igual al lote 1 durante un ano a 2-8°C mostraron equivalencia al lote 1 durante la tension de calor por 1 ano. Se mostro que el lote D era menos estable en el ensayo acelerado con altos niveles de productos de ruptura de bajo peso molecular.

Los datos de la prueba de estabilidad acelerada a 30 y 37°C corresponden a la estabilidad a largo plazo a 2-8°C, y por lo tanto proporciona un metodo para acelerar la prueba de la estabilidad a largo plazo de un polipeptido formulado a temperaturas bajas sin requerir una evaluacion de la estabilidad a largo plazo. Las muestras del lote B almacenadas congeladas en jeringas a -70°C y -20°C mostraron una estabilidad similar a las muestras almacenadas congeladas en un vial a -70°C, que soporta el uso de una realizacion de una jeringa precargada almacenada congelada hasta el suministro al paciente.

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REIVINDICACIONES

1. Una composicion farmaceutica que es una formulacion acuosa estable que comprende una forma soluble del receptor p75 TNF fusionada a un dominio Fc y un inhibidor de agregacion, en el que el inhibidor de agregacion es L- arginina.
2. La composicion de la reivindicacion 1, que comprende ademas un amortiguador.
3. La composicion de la reivindicacion 2, en la que el amortiguador es seleccionado del grupo que consiste en fosfato de sodio, histidina, fosfato de potasio, citrato de sodio o potasio, acido maleico, acetato de amonio, tris(hidroximetil)- aminometano (tris), acetato y dietanolamina.
4. La composicion de la reivindicacion 3, en la que la L-arginina esta en una concentracion de 10 mM a 100 mM.
5. La composicion de una cualquiera de las reivindicaciones 1,2, 3 o 4, que comprende ademas un modificador de la tonicidad.
6. La composicion de la reivindicacion 5, en la que el modificador de la tonicidad se selecciona del grupo que consiste en arginina, cisteina, histidina, glicina, cloruro de sodio, cloruro de potasio, citrato de sodio, sacarosa, glucosa y manitol.
7. La composicion de la reivindicacion 6, en el que el modificador de la tonicidad es cloruro de sodio.
8. La composicion de una cualquiera de las reivindicaciones 1,2, 3, o 4, que comprende ademas un excipiente.
9. La composicion de la reivindicacion 6, que comprende ademas un excipiente.
10. La composicion de la reivindicacion 7, que comprende ademas un excipiente.
11. Una composicion de acuerdo con la reivindicacion 8, en la que el excipiente es seleccionado del grupo que consiste en sacarosa, lactosa, glicerol, xilitol, sorbitol, manitol, maltosa, inositol, trehalosa, glucosa, albumina de suero bovino (BSA), SA humana o HA recombinante, dextrano, PVA, hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC), polietilenimina, gelatina, polivinilpirrolidona (PVP), hidroxietilcelulosa (HEC), polietilenglicol, etilenglicol, glicerol, dimetilsulfoxido (DMSO), dimetilformamida (DMF), prolina, L-serina, acido glutamico sodico, alanina, glicina, clorhidrato de lisina, sarcosina, acido gamma-aminobutirico, Tween-20, Tween-80, SDS, polisorbato, copolimero de polioxietileno, fosfato de potasio, acetato de sodio, sulfato de amonio, sulfato de magnesio, sulfato de sodio, N-oxido de trimetilamina, betaina, iones de zinc, iones de cobre, iones de calcio, iones de manganeso, iones de magnesio, CHAPS, monolaurato de sacarosa y 2-O-betamannoglicerato.
12. La composicion de la reivindicacion 11, en el que el excipiente es sacarosa.
13. La composicion farmaceutica estable de la reivindicacion 1, que comprende 10 mg/ml a 100 mg/ml de forma soluble del receptor p75 TNF fusionado a un dominio Fc, L - arginina, fosfato sodico, cloruro sodico y sacarosa.
14. La composicion de la reivindicacion 13, en la que la L-arginina es de 10 mM a 75 mM.
15. La composicion de la reivindicacion 13, en la que el fosfato sodico es de 5 mM a 100 mM
16. La composicion de la reivindicacion 13, en la que el cloruro de sodio es de 5 mM a 200 mM.
17. La composicion de la reivindicacion 13, en la que la sacarosa es 0.5% a 1.5%.
18. La composicion de la reivindicacion 13, en la que el pH es 5.5 a 7.8.
19. La composicion de la reivindicacion 13, Que tiene 25 mg / ml de forma soluble del receptor de p75 TNF fusionado a un dominio Fc, 25 mM de L-arginina, 25 mM de fosfato de sodio, 98 mM de cloruro de sodio, sacarosa al 1% a pH de 6,2.
20. La composicion de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 13 o 19, en el que la composicion es liquida.
21. La composicion de la reivindicacion 20, en la que la composicion es liquida.
22. Un metodo para formulacion de una composicion que comprende combinar una forma soluble del receptor de p75 TNF fusionado a un dominio Fc con L-arginina.
23. El metodo de la reivindicacion 22, que comprende ademas los pasos de combinar un amortiguador, un modificador de la tonicidad, y un excipiente con la composicion.
24. El metodo de la reivindicacion 22 o 23, en el que la composicion es liquida.
25. Un kit que comprende una composicion que comprende una forma soluble del receptor p75 TNF fusionado a un dominio Fc y L-arginina.
26. El kit de la reivindicacion 25, en el que la composicion es liquida.
27. El kit de la reivindicacion 25 o 26, en el que la composicion se almacena en una jeringa esteril prellenada

5 28. El kit de la reivindicacion 27, en el que la jeringa se almacena a aproximadamente -20 grados C a aproximadamente

-70 grados C.
29. Una composicion farmaceutica de cualquiera de las reivindicaciones 4 613 para uso en un metodo de tratamiento de un mamifero en necesidad del mismo que comprende administrar una cantidad terapeuticamente efectiva de la composicion farmaceutica.

10 30. Uso de L-arginina para estabilizar una forma soluble del receptor de p75 TNF fusionado a un dominio Fc en una

composicion de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21.