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ES2616428T3 - Casete de expresión para lactasa deshidrogenasa, levadura transformada y método para producir ácido láctico - Google Patents

Casete de expresión para lactasa deshidrogenasa, levadura transformada y método para producir ácido láctico Download PDF

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ES2616428T3
ES2616428T3 ES08856191.5T ES08856191T ES2616428T3 ES 2616428 T3 ES2616428 T3 ES 2616428T3 ES 08856191 T ES08856191 T ES 08856191T ES 2616428 T3 ES2616428 T3 ES 2616428T3
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ES
Spain
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gene
lactic acid
expression cassette
yeast
hours
Prior art date
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Active
Application number
ES08856191.5T
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English (en)
Inventor
Kenji Sawai
Hideki Sawai
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Toray Industries Inc
Original Assignee
Toray Industries Inc
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Publication date
Application filed by Toray Industries Inc filed Critical Toray Industries Inc
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    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/56—Lactic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
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    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
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Abstract

Un método de producción de ácido láctico, que comprende una etapa de cultivo para cultivar la cepa de levadura transfornante que comprende al menos un casete de expresión de lactato deshidrogenasa, en donde dicho casete comprende un gen que codifica lactato deshidrogenasa conectado a un sitio aguas abajo de un promotor del gen supresor de defecto exponencial 1 (gen SED1); en donde la cepa de levadura transfomante comprende al menos un casete de expresión de lactato deshidrogenasa en el cromosoma, y la etapa de cultivo es una fermentación continua.

Description

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SEQ ID NO 5: derivado de Homo sapiens
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SEQ ID NO: 6: derivado de Leuconostoc mesenteroides
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[Cepa de levadura transformante]
La presente invención se refiere a una cepa de levadura transformante que tiene al menos un casete de expresión de lactato deshidrogenasa en el cromosoma. La cepa de levadura transformante de acuerdo con la presente invención puede tener el casete de expresión de lactato deshidrogenasa introducido en cualquier posición del
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cromosoma en la que se pueda expresar la LDH desde el casete de expresión de lactato deshidrogenasa. Preferiblemente, en la levadura al menos un gen SED1 esta sustituido por el casete de expresión de lactato deshidrogenasa.
La levadura para su uso en la presente invención se puede utilizar favorablemente, si es una levadura en la que se puede introducir el casete de expresión de lactato deshidrogenasa. Un ejemplo de la misma es una levadura que pertenece a las especies de Saccharomyces, las especies de Schizosaccharomyces, las especies de Zygosaccharomyces, las especies de Kluyveromyces o las especies de Candida. Es preferiblemente una levadura que pertenece a las especies de Saccharomyces. Es más preferiblemente Saccharomyces cerevisiae.
[Método de producción de ácido láctico]
La presente invención se refiere a un método de producción de ácido láctico, que comprende cultivar la cepa de levadura transformante como se define en la reivindicación 1. Es preferiblemente un cultivo continuo de filtración de la solución de cultivo a través de una membrana de separación, recuperación de ácido láctico a partir del producto filtrado, mantenimiento o retro-alimentación de la solución no filtrada a la solución de cultivo y reposición del medio a la solución de cultivo.
Los materiales de fermentación brutos para la levadura utilizada en la presente invención son capaces de aceleran el crecimiento de la levadura en el cultivo de fermentación y el producto de fermentación de ácido láctico deseable se produce de manera eficiente. Una materia prima de fermentación favorable es un medio líquido que contiene fuentes de carbono, fuentes de nitrógeno, sales inorgánicas y, según sea necesario, aminoácidos y nutrientes vestigiales orgánicos, tales como vitaminas en cantidades adecuadas.
Los ejemplos de las fuentes de carbono que se van a utilizar incluyen azúcares tales como glucosa, sacarosa, fructosa, galactosa y la lactosa; mezclas que contengan estos azúcares tales como producto hidrolizado de almidón, jarabe de batata, jarabe de remolacha, melazas Hi Test y extracto de caña de azúcar; ácidos orgánicos tales como ácido acético y ácido fumárico; alcoholes tales como etanol; glicerol; y similares. Los azúcares anteriores son carbohidratos que tienen un grupo aldehído o un grupo cetona, que son los primeros productos de oxidación de los alcoholes polivalentes, y se agrupan en aldosas que tienen grupos aldehído y cetosas que tienen grupos cetona.
Los ejemplos de las fuentes de nitrógeno incluyen amoniaco gaseoso, agua amoniacal, sales de amonio, urea, sales nitrato, otras fuentes de nitrógeno orgánico utilizadas auxiliares (tales como tortas de aceite, producto hidrolizado de haba de soja, productos de descomposición de caseína, otros aminoácidos, vitaminas, aguas de infusión de maíz, levadura o extracto de levadura, extractos de filete, péptidos tales como peptona, varios microbios de fermentación y los productos hidrolizados de los mismos) y similares.
Los ejemplos de las sales inorgánicas añadidas, según sea necesario incluyen sales fosfato, sales de magnesio, sales de calcio, sales de hierro, sales de manganeso y similares.
Cuando se necesita un nutriente en particular para el crecimiento de la levadura que se utiliza en la presente invención, el nutriente se puede añadir en forma de un reactivo convencional o un producto natural que contenga el mismo. Además, se puede añadir un agente antiespumante si es necesario.
La solución de cultivo de fermentación, según se utiliza en la presente invención, representa una solución obtenida después del crecimiento de la cepa de levadura con las materias primas de fermentación. La composición de las materias primas de fermentación que se añaden se puede alterar adecuadamente de acuerdo con la composición de las materias primas de fermentación utilizadas cuando se inicia el cultivo. Si la composición de las materias primas de fermentación añadidas es diferente de la de la materia prima de fermentación añadida al principio, es preferible una modificación que conduzca a un aumento de la productividad de ácido láctico deseable. A menudo es posible disminuir el coste de producción de ácido láctico, es decir, aumentar la productividad de ácido láctico en un sentido amplio, por ejemplo disminuyendo los porcentajes en peso de la fuente de nitrógeno, las sales inorgánicas, los aminoácidos y los nutrientes orgánicos en cantidades vestigiales tales como vitaminas con respecto a la fuente de carbono. Por otra parte, puede ser posible mejorar la productividad de ácido láctico, aumentando el porcentaje en peso de fuente de nitrógeno, las sales inorgánicas, los aminoácidos y los nutrientes orgánicos en cantidades vestigiales, tales como vitaminas con respecto a la fuente de carbono.
En la presente invención, las concentraciones de las materias primas de fermentación tales como azúcar en la solución de cultivo de fermentación se mantienen preferiblemente a 5 g/L o menos. Las concentraciones se mantienen más preferiblemente al 3 g/L o menos, más preferiblemente a 1 g/L o menos. Tiene el objetivo de minimizar la pérdida de las materias primas de fermentación por la retirada de la solución de cultivo de fermentación. Por lo tanto, las concentraciones de las materias primas de fermentación en la solución de cultivo de fermentación son deseablemente lo más bajas posible.
El cultivo de fermentación de levadura se lleva a cabo normalmente, con frecuencia a un pH de 3 a 8 y una temperatura en el intervalo de 20 a 40°C. Debido a que el ácido láctico producto es una sustancia ácida, el pH de la solución de cultivo de fermentación se ajusta a un valor predeterminado en el intervalo anterior con una sustancia alcalina, urea, carbonato de calcio, gas amoníaco o similares.
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enzimas de restricción SalI y NotI; los fragmentos de ADN se separaron por electroforesis en gel de agarosa al 1%; y los fragmentos que contenían el gen ldh derivado de Xenopus laevis se purificaron por un método común. Los fragmentos que contenían el gen ldh se ligaron a los sitios de escisión XhoI/NotI del vector de expresión pTRS11 mostrado en la Figura 5; los ADN plasmídicos se recuperaron mediante un método similar al anterior; y un vector de expresión que contenía el gen ldh derivado de Xenopus laevis insertado se seleccionó mediante escisión de los vectores de expresión con las enzimas de restricción XhoI y NotI. En lo sucesivo, el vector de expresión que contiene el gen ldh derivado de Xenopus laevis insertado así preparado se designará pTRS102.
Un fragmento de PCR de 1,3 kb que contenía el gen ldh derivado de Xenopus laevis y una secuencia terminadora TDH3 se amplificaron mediante PCR utilizando pTRS102 como molde de amplificación y los oligonucleótidos (SEQ ID NO: 9 y 10) como conjunto de cebadores. El oligonucleótido del SEQ ID NO: 9 fue diseñado para que tuviera una secuencia correspondiente a la secuencia de 60 pb aguas arriba del codón de inicio del gen de PDC1.
SEQ ID NO: 9:
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SEQ ID NO: 10:
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A continuación, un fragmento de PCR de 1,2 kb que contenía un gen TRP1 marcador seleccionable de levadura se amplificó mediante PCR utilizando el plásmido pRS424 como molde de amplificación y los oligonucleótidos (SEQ ID NO: 11 y 12) como conjunto de cebadores. El oligonucleótido del SEQ ID NO: 12 fue diseñado para que tuviera una secuencia añadida correspondiente a la secuencia de 60 pb aguas abajo del codón de terminación del gen de PDC1.
SEQ ID NO: 11:
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por electroforesis en gel de agarosa al 1% y se purificó de acuerdo con un método común. Se amplificó por PCR utilizando una mezcla del fragmento de 1,3 kb y el fragmento de 1,2 kb obtenido de este modo como moldes de amplificación y los oligonucleótidos (SEQ ID NO: 9 y 12) como conjunto de cebadores, un fragmento de PCR de aproximadamente 2,5 kb que tenía secuencias equivalente a las secuencias de 60 pb aguas arriba y aguas abajo del gen PDC1, respectivamente, en los extremos 5 y 3 y que contenían el gen ldh derivado de Xenopus laevis, el terminador TDH3 y el gen TRP1 conectado a este.
Los fragmentos de PCR se aislaron por electroforesis en gel de agarosa al 1% y se purificaron de acuerdo con un método común; se transforman en una cepa de levadura Saccharomyces cerevisiae NBRC10505; y se seleccionó un transformante que tenía el gen ldh derivado de Xenopus laevis introducido en el cromosoma en un sitio aguas abajo del promotor del gen de PDC1 mediante cultivo en un medio libre de triptófano.
El hecho de que el transformante obtenido de este modo sea una levadura que tiene un gen ldh derivado de Xenopus laevis introducido en un sitio aguas abajo del promotor del gen de PDC1 en el cromosoma se confirmó de la siguiente manera: En primer lugar, el ADN del genoma del transformante se preparó con un kit de extracción de ADN del genoma Gentorukun (fabricado por Takara Bio Inc.) y la producción de fragmento de ADN amplificado de aproximadamente 2,8 kb se confirmó por PCR utilizando el ADN genómico preparado del transformante como un molde de amplificación y los oligonucleótidos (SEQ ID NO: 12 y 13) como conjunto de cebadores. Por otro lado, los no transformantes proporcionaron fragmentos de ADN amplificados de aproximadamente 2,1 kb mediante PCR. En lo sucesivo, el transformante que tiene el gen ldh derivado de Xenopus laevis introducido en un sitio aguas abajo del promotor del gen de PDC1 en el cromosoma se denominará cepa B2. Las secuencias aguas arriba y aguas abajo del gen de PDC1 se pueden obtener de la base de datos del genoma de Saccharomyces (URL:http: //www.yeastenome.org/).
SEQ ID NO: 13:
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Con posterioridad, la cepa de levadura SW015 descrita en el folleto del documento WO 2007/043253, en la que el gen pdc1 está sustituido por el marcador TRP1 y el gen pdc5 tiene una mutación sensible a la temperatura, y la cepa B2 obtenida anteriormente se conjugaron, para dar una célula diploide. Se hizo que la célula diploide formara un asca en un medio de formación de ascas. El asca se diseccionó con un micromanipulador; se recogieron las respectivas células haploides; y se estudiaron los requisitos nutricionales de las respectivas células haploides. Entre las células haploides obtenidas se seleccionó una cepa que tenía el gen ldh derivado de Xenopus laevis insertado en el locus del gen pdc1 y que tenía una mutación sensible a la temperatura en el gen pdc5 (no viable a 34°C). La cepa de levadura se designó cepa SU014.
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Ejemplo de Referencia 3 y se extrajeron los ARN totales de la levadura. En la extracción del ARN total, la levadura obtenida se suspendió en 10 ml de una solución tampón para la homogeneización (tratado con acetato de sodio 50 mM (pH 5,3), EDTA DEPC 10 mM) a una DO600 de 0,2 y la mezcla se transfirió a un tubo de 50 ml. Se añadieron adicionalmente a la misma 500 µL de SDS al 20%; 12 ml de fenol (saturado con solución de tampón de homogeneización) previamente calentado a 65°C; y la mezcla se agitó con un mezclador Voltex durante 5 segundos. La mezcla se mantuvo a 65°C durante 4 minutos y después se enfrió rápidamente a la temperatura ambiente en un baño de hielo seco/etanol. Se centrifugó a la temperatura ambiente (5 min. 12000 G); el sobrenadante acuoso se transfirió a un tubo separado de 50 ml; y a esto se le añadió PCI (pH 5,3) en la misma cantidad para la extracción. El sobrenadante acuoso se transfirió a un tubo de 50 ml separado; se añadió acetato de sodio 3 M (pH 5,3) en una cantidad 1/10; y la mezcla se sometió a precipitación con etanol. Las bolitas resultantes obtenidas se lavaron dos veces con etanol del 80%, se secaron hasta su solidificación y se disolvieron en agua libre de ARN, para dar una muestra de ARN total.
Se determinó la concentración de la muestra de ARN total obtenida con un absorciómetro y se utilizó 1 µg de la muestra para el análisis de micromatriz de ADN. La micromatriz de ADN se llevó a cabo utilizando "3D-Gen" fabricado por Toray Industries Inc. de acuerdo con el protocolo adjunto. El escáner utilizado fue ScanArray Express (PerkinElmer), y el escaneado se llevó a cabo bajo las condiciones de Cyanine 5 (valor de PMT: 55%) (para la medición de la intensidad de fluorescencia media después de 210 horas de cultivo) o Cyanine 3 (valor de PMT: 70%) (para la medición de la intensidad de fluorescencia media después de 70 horas de cultivo), para proporcionar una imagen. La intensidad de la fluorescencia de cada mancha en la imagen obtenida se digitalizó por medio del soporte lógico GenePix Pro 5.0 (Axon Instruments), y se calculó el valor de la mediana. A continuación, se calculó la intensidad de fluorescencia media de todos los puntos en cada muestra.
Como resultado, el gen CDC19, el gen IPP1, el gen ARF1, el gen CUP5, el gen RPL28, el gen TRX2, el gen HSP104, el gen AHP1, YMR122W-A, el gen CIT1, el gen RPS15, el gen ALD4, YPL225W, el gen HSP26, el gen PGK1, SED1 gen, el gen MFA1, HYP2 gen, el gen HSP12, el gen QCR6, el gen HXK1, el gen TDH3, el gen ENO1, el gen BGL2, YJL133C-A, el gen QCR8, el gen FBA1, el gen CWP2, el gen CCW12, el gen TMA10, el gen SIP18, el gen HOR7 , CCW14 gen y el gen PIR3 se confirman en la muestra después de 70 horas de cultivo como genes que tienen una mayor intensidad de fluorescencia de más de 10 veces o más que la intensidad media de fluorescencia, y el gen Cys3, el gen CDC48, LYS20 gen, el gen HSP31, ARG5,6 gen, el gen RPS24A, el gen RPL29, el gen RPL24A, el gen ADH4, el gen MUP1, el gen RPL11B, THI4 gen, el gen RPL24B, el gen RPS0A, el gen RPL27A, el gen RPL16A, el gen RPS21B, el gen RPS5, el gen HOM6, el gen PDC5, THI7 gen, el gen MET17, el gen ECM40, el gen ARG1, el gen ZPS1, el gen IDH2, el gen CDC19, el gen IPP1, el gen ARF1, el gen RPL28, el gen TRX2, el gen HSP104, el gen AHP1, el gen CIT1, el gen RPS15, el gen ALD4, YPL225X y el gen CCW12 se confirmaron en la muestra después de 210 horas de cultivo como genes que tiene una intensidad de fluorescencia de más de 10 veces
o más que la intensidad de fluorescencia media por medio de lo cual el resultado referente al gen SED1 está de acuerdo con la invención reivindicada todos los demás resultados no están en el alcance de la invención reivindicada. Los resultados se resumen en la Tabla 2.
[Tabla 2]
Muestra 70 horas
Intensidad de fluorescencia media (Cyanine 3) = 2527 Muestra 210 horas Intensidad de fluorescencia media (Cyanine 5) = 2560
Nombre del gen
Intensidad de fluorescencia Nombre del gen Intensidad de fluorescencia
CDC19
32744 CYS3 31699
IPP1
31010 CDC48 48387
ARF1
32791 LYS20 26967
CUP5
48692 HSP31 65535
RPL28
32227 ARG5.6 25938
TRX2
27127 RPS24A 25954
HSP104
37404 RPL29 31691
AHP1
36389 RPL24A 27070
YMR122W-A
26689 ADH4 29111
CIT1
38065 MUP1 36322
RPS15
33355 RPL11B 42975
ALD4
25334 THI4 65535
YPL225W
33524 RPL24B 60397
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Muestra 70 horas
Intensidad de fluorescencia media (Cyanine 3) = 2527 Muestra 210 horas Intensidad de fluorescencia media (Cyanine 5) = 2560
Nombre del gen
Intensidad de fluorescencia Nombre del gen Intensidad de fluorescencia
HSP26
65535 RPS0A 25985
PGK1
45002 RPL27A 26848
SED1
65535 RPL16A 30035
MFA1
52959 RPS21B 41105
HYP2
58791 RPS5 26324
HSP12
59804 HOM6 46392
QCR6
40818 PDC5 65535
HXK1
65535 THI7 37815
TDH3
44578 MET17 65535
ENO1
47131 ECM40 35308
BGL2
40588 ARG1 25772
YJL133C-A
53171 ZPS1 43968
QCR8
65535 IDH2 34806
FBA1
56999 CDC19 31238
CWP2
65535 IPP1 36610
CCW12
65535 ARF1 27340
TMA10(reservado)
52672 RPL28 26537
SIPI8
57587 TRX2 26762
HOR7
50590 HSP104 35829
CCW14
27043 AHP1 29875
PIR3
40635 CIT1 34931
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imagen26 RPS15 38663
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imagen28 ALD4 26524
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imagen30 YPL225W 27404
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imagen32 CCW12 32536
Los resultados identificaron los genes que se expresan en una cantidad mayor de 10 veces o más que la cantidad de expresión relativa media de todos los genes después de 50 horas desde el inicio del cultivo en cultivo continuo con la filtración simultánea de una cepa de levadura que tiene una capacidad para producir ácido láctico.
5 (Ejemplo 2) Introducción del gen ldh en el locus SED1 de acuerdo con la presente invención, así como los loci de los genes, CWP2 y ENO1 que no están en el alcance de la invención.
Basándose en los resultados obtenidos en el Ejemplo 1, el gen ldh mostrado por el SEQ ID NO: 4 se introdujo en los loci del gen SED1, el gen CWP2 y el gen ENO1.
En la introducción del mismo en el locus del gen SED1, se amplificó un fragmento de PCR de 1,3 kb que contenía el
10 gen ldh derivado de Xenopus laevis y la secuencia de terminación TDH3 mediante PCR utilizando pTRS 102 preparado en el Ejemplo de Referencia 1 como molde de amplificación y los oligonucleótidos (SEQ ID NO: 10 y 14) como conjunto de cebadores. El oligonucleótido del SEQ ID NO: 14 fue diseñado para añadir una secuencia correspondiente a la secuencia de 60 pb aguas arriba del codón de iniciación del gen SED 1.
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temperatura y el pH del tanque de reacción 1 se ajustaron (precultivo). Inmediatamente después del pre-cultivo, el medio de fermentación del ácido láctico se suministró continuamente al mismo, y el ácido láctico fue producido mediante cultivo continuo, mientras se controlaba la cantidad de penetración de membrana para hacer que el volumen de la solución de fermentación en el aparato de cultivo continuo se mantuviera constante a 1,5 L. Las
5 concentraciones de ácido láctico producido y de glucosa residual en la solución de fermentación que penetra a través de la membrana se verificaron según fue necesario. La concentración de ácido láctico acumulado se determinó por el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1 y la concentración de glucosa se determinó mediante el uso del "Ensayo de Glucosa Wako C" (nombre comercial registrado, fabricado por Wako Pure Chemical Industries).
10 El rendimiento de ácido láctico/azúcar y la tasa de producción de ácido láctico, tal como se calcula a partir del ácido láctico y de la glucosa suministrados, calculada a partir de la concentración de glucosa, se resumen en las Tablas 4 y 5, junto con los resultados obtenidos en el Ejemplo de Referencia 1, por medio de lo cual SU015, SU018, SU020 y SU025 están de acuerdo con la invención reivindicada. El cálculo se hizo de acuerdo con la Fórmula 3, y el tiempo en la Tabla es el tiempo transcurrido después del comienzo del cultivo.
15 [Tabla 4]
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Nombre de la cepa Rendimiento de ácido láctico (%) imagen40
50-100 horas
100-150 horas 150-200 horas 200-250 horas 250-300 horas
Ejemplo de referencia 1
SU014 65 75 66 45 20
Ejemplo 4
SU015 68 73 72 70 67
SU016
67 74 72 69 65
SU017
70 73 75 73 70
SU018
75 80 82 82 79
SU019
51 63 57 38 18
SU020
54 65 63 60 62
SU021
53 62 62 58 56
SU022
57 66 68 65 63
SU023
60 70 68 68 70
SU024
45 54 50 33 15
SU025
48 58 55 54 56
SU026
48 57 55 53 52
SU027
50 60 59 59 57
SU028
52 63 64 61 62
[Tabla 5]
imagen41
Nombre de la cepa Velocidad de producción de ácido láctico (g/L/h) imagen42
50 horas
100 horas 150 horas 200 horas 250 horas 300 horas
Ejemplo de referencia 1
SU014 2,5 3,1 3,1 2,6 1,7 0,8
Ejemplo 4
SU015 2,9 3,1 3 3 2,8 2,5
SU016
2,9 3 3 3 2,8 2,5
SU017
2,9 3,1 3,1 3,1 3 2,9
SU018
3,1 3,3 3,4 3,4 3,4 3,2
SU019
1,8 2,0 2,3 2,1 1,4 0,5
SU020
1,9 2,2 2,5 2,4 2,3 2,4
SU021
2,0 2,2 2,3 2,2 2,0 1,9
SU022
2,1 2,4 2,6 2,5 2,4 2,4
30
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Claims (1)

  1. imagen1
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