ES2615813T3 - Derivados de Polimixina de ácido graso de cola corta y usos de los mismos - Google Patents

Abstract

Un derivado de polimixina de fórmula (I):**Fórmula** en donde: A es un resto de anillo de polimixina seleccionado de las de polimixina A, polimixina B, IL-polimixina-B1, polimixina D, polimixina E, polimixina F, polimixina M, polimixina S, polimixina T, circulina A, octapeptina A, octapeptina B, octapeptina C, u octapeptina D; D es acetilo, propionilo, butanoílo, o pentanoílo; m1 es 0 y m2 y m3 son cada uno 1; Q2 y Q3 son cada uno C>=O; W2 y W3 son cada uno NH; R2' es la cadena lateral de D-alanina, L-serina, o L-treonina; R3' es la cadena lateral de D-asparagina, L-serina, o D-serina; en donde dicho derivado tiene tres cargas positivas a pH fisiológico, y profármacos farmacéuticamente aceptables y sales de los mismos.

Description

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farmacocinéticas que son ventajosas sobre derivados de polimixina que tienen un R(FA) largo o un resto terminal (D) con más de cinco átomos de carbono.

La presente invención proporciona derivados de polimixina de fórmula (I):

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5 en donde: A es un resto de anillo de polimixina seleccionada de las de polimixina A, polimixina B, IL-polimixina –B1,

polimixina D, polimixina E, polimixina F, polimixina M, polimixina S, polimixina T, circulina A, octapeptina A, octapeptina B, octapeptina C, u octapeptina D; D es acetilo, propionilo, butanoílo, o pentanoílo;

10 m1es 0 y m2y m3son cada uno 1;

Q2 y Q3 son cada uno C=O;

W2 y W3 son cada uno NH; R2’ es la cadena lateral de D-alanina, L-serina, o L-treonina; R3’ es la cadena lateral de D-asparagina, L-serina, o D-serina;

15 en donde dicho derivado tiene tres cargas positivas a pH fisiológico, y profármacos farmacéuticamente aceptables y sales de los mismos. También se analizan en esta memoria derivados de polimixina de la fórmula (I):

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en donde:

20 A es un resto de anillo de polimixina; D es un resto terminal que comprende 1 a 5 átomos de carbono; m1, m2, y m3 son independientemente cada uno 0 o 1; Q1, Q2, y Q3 son independientemente cada uno CH2, C=O, o C=S; W1, W2 y W3 son independientemente cada uno NR4, O, o S;

25 R1’, R2’ y R3’ son independientemente cada uno cadenas laterales de aminoácidos naturales o no naturales, alquilo, alquenilo, arilalquilo, arilo, alcoxilo, alcoxicarbonilo, ariloxicarbonilo, alquilamino, o alquinilo; y

R4 es hidrógeno o alquilo; y profármacos farmacéuticamente aceptables y sales de los mismos, siempre que (1) cuando A es un anillo de octapeptina, m1 y m2 son 0, m3 es 1, W3 es NH, Q3 es C=O, y R3’ es la cadena lateral del ácido diaminobutírico

30 (Dab), entonces D no es C2-C5 acilo, y (2) cuando D es acetilo, butanoílo, o pentanoílo, entonces R3’ no es la cadena lateral de Dab. Los compuestos tienen tres cargas positivas a pH fisiológico.

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enlace covalente.

En polimixinas y octapeptinas naturales, R3 es Dab, DDab o DSer.

En polimixinas y octapeptinas naturales, R4 es Dab. Ejemplos de derivados sintéticos que tienen actividad antibacteriana incluyen aquellos en donde R4 es Lys.

En polimixinas y octapeptinas naturales, R5, R8 y R9 son Dab. Ejemplos de derivados sintéticos que tienen actividad antibacteriana incluyen aquellos en donde R5, R8, y R9 pueden ser Lys o ácido 2-amino-4-guanidino butírico.

En polimixinas y octapeptinas naturales, R6 es DPhe o DLeu y R7 es Leu, Ile, Phe o Thr. Derivados sintéticos que tienen actividad antibacteriana incluyen aquellos en donde R6 es DTrp y en donde R7 es Ala.

En polimixinas y octapeptinas naturales, R10 es Thr y Leu. Ejemplos de derivados conocidos que tienen actividad antibacteriana incluyen aquellos en donde R10 es O-acetil-Thr, O-propionil-Thr o O-butiril-Thr.

Las tres (3) cargas positivas presentes en los derivados según la invención se pueden localizar en la porción del anillo heptapeptídico; o dos (2) cargas positivas se pueden localizar en la porción del anillo heptapéptídico mientras la carga positiva restante se localiza en la cadena lateral.

Los derivados según la presente invención se pueden seleccionar del grupo que consiste en: acetil-Thr-DSercyDab-Dab-DPhe-Leu-Dab-Dab-Thr-, es decir Ac-SEQ ID NO: 10; y acetil-Thr-DAsn-cyDab-Dab-DPhe-Leu-DabDab-Thr-, es decir Ac-SEQ ID NO: 39.

Como se muestra en la sección de ejemplos en esta memoria, los compuestos según la presente invención que llevan solamente tres (3) cargas positivas y que tienen un R(FA) que contiene 1 a 5 átomos de carbono pueden ser agentes muy potentes para sensibilizar bacterias Gram-negativas a agentes antibacterianos.

Para la actividad sensibilizadora, al menos dos (2) y más preferiblemente tres (3) cargas positivas están localizadas en la parte del anillo heptapeptídico.

Los trabajos de Teuber (1970), Srinivasa y Ramachandran (1980a), y Sakura et al. (2004) describen, entre otros derivados de polimixina, derivados que tienen solamente dos (2) o tres (3) cargas positivas. Sin embargo, los compuestos llevan una parte de ácido graso R(FA) más larga que 5 átomos de carbono. Por otro lado, la polimixina B nonapéptido y la colistina nonapéptido, ambos previamente conocidos agentes eficaces de sensibilizar bacterias Gram-negativas a antibióticos, carecen de toda la parte R(FA) pero llevan cinco (5) cargas positivas.

Los derivados de polimixina de fórmulas I-V se pueden administrar a un sujeto en forma de profármaco. El profármaco puede comprender una o más fracciones enmascaradoras de carga que enmascaran las cargas positivas del compuesto hasta que se administra al sujeto.

La presente invención proporciona en un aspecto nuevos derivados de polimixina que llevan tres (3) cargas positivas solamente y un R(FA) que contiene 1 a 5 átomos de carbono solamente y que es capaz de sensibilizar una o más especies de bacterias Gram-negativas a un antibiótico o agente antibacteriano.

La susceptibilidad de bacterias a un agente antibacteriano se puede determinar mediante dos métodos microbiológicos. Un procedimiento rápido pero aproximado usa discos de papel de filtro comercialmente disponibles que han sido impregnados con una cantidad específica del agente antibacteriano. Estos discos se colocan en la superficie de placas de agar que han sido inoculadas con una suspensión del organismo que se está ensayando, y se observan las placas por zonas de inhibición de crecimiento. Una técnica más precisa, la prueba de susceptibilidad de dilución de caldo, implica preparar tubos de ensayo que contienen diluciones seriadas del fármaco en medio de cultivo líquido, e inocular después el organismo que se está ensayando dentro de los tubos. Se informa la menor concentración de fármaco que inhibe el crecimiento de la bacteria después de un periodo de incubación adecuado como la concentración inhibidora mínima (MIC).

Los derivados según la presente invención pueden sensibilizar bacterias Gram-negativas clínicamente importantes a agentes antibacterianos, donde dichas bacterias Gram-negativas pueden ser aquellas que pertenecen al género of especies de Acinetobacter, Aeromonas, Alcaligenes, Bordetella, Branhamella, Campylobacter, Citrobacter, Enterobacter, Escherichia, Francisella, Fusobacterium, Haemophilus, Helicobacter, Klebsiella, Legionella, Moraxella, Pasteurella, Plesiomonas, Pseudomonas, Salmonella, Serratia, Shigella, y Yersinia. Las bacterias pueden ser, por ejemplo, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Enterobacter cloacae, Enterobacter aerogenes, otras especies de Enterobacter, Citrobacter freundii, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa y otras especies de Pseudomonas así como muchas otras especies de bacterias Gram-negativas no fermentativas. Las bacterias también incluyen Helicobacter pylori, así como otras bacterias Gram-negativas clínicamente importantes.

Las infecciones bacterianas a tratar incluyen, por ejemplo, bacteriemia, septicemia, infección de piel y tejidos blandos, neumonía, meningitis, infecciones en la región peritoneal pélvica, infección de cuerpo extraño, fiebre en el paciente hematológico, infección asociada con una vía intravenosa u otro catéter, cánula y/o dispositivo, infección en

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grageas, pastillas, cápsulas, sellos y preparaciones microgranulares. Las preparaciones farmacéuticas se pueden preparar usando un excipiente sólido, moliendo opcionalmente la mezcla resultante, y procesando la mezcla de gránulos, después de añadir los auxiliares adecuados si se desea, para obtener núcleos de comprimidos o de grageas. Un soporte/excipiente sólido puede ser una o más sustancias que también pueden actuar como diluyentes, solubilizadores, lubricantes, agentes de suspensión, aglutinantes, conservantes, agentes aromatizantes, agentes humectantes, agentes desintegradores de tabletas, un material encapsulante. Los soportes adecuados incluyen, pero no se limitan a, carbonato de magnesio, estearato de magnesio, talco, dextrosa, lactosa, pectina, almidón, gelatina, tragacanto, metilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica, una cera de bajo punto de fusión, manteca de caco, y similares.

Las preparaciones líquidas adecuadas para administración oral incluyen p. ej. soluciones acuosas, jarabes, elixires, suspensiones acuosas, emulsiones y geles. Las soluciones acuosas se pueden preparar disolviendo el componente activo en agua y añadiendo agentes estabilizantes y espesantes adecuados, así como colorantes y sabores. Las suspensiones acuosas se pueden preparar dispersando el componente activo finamente dividido en agua con material viscoso, como gomas naturales y/o sintéticas, resinas, metilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica y otros agentes de suspensión bien conocidos. Las emulsiones se pueden preparar en soluciones acuosas de polipropilénglicol o pueden contener agentes emulsionantes como lecitina, monooleato de sorbitán o acacia.

Los compuestos según la invención o combinaciones anteriormente descritas también pueden formularse para administración tópica. Los compuestos activos se mezclan en condiciones estériles con soportes/excipientes farmacéuticamente aceptables, incluyendo cualquier agente tamponador y conservantes necesarios. Los ungüentos, cremas y lociones pueden, por ejemplo, formularse con una base acuosa u oleosa con la adición de agentes emulsionantes, dispersantes, de suspensión, espesantes, estabilizantes o colorantes adecuados. Los excipientes comúnmente usados incluyen grasas y aceites animales y vegetales,

ceras, parafinas, almidón, derivados de celulosa, tragacanto, y polietilénglicol.

Otras formulaciones tópicas incluyen, pero no se limitan a, gotas para los oídos, gotas oculares y parches transdérmicos.

Para la administración transdérmica así como transmucosal pueden usarse en la formulación penetrantes generalmente conocidos en la técnica.

Para la administración por inhalación, los compuestos según esta invención y las combinaciones anteriormente descritas se suministran en la forma de una presentación en espray aerosol desde un ventilador, un envase presurizado o un nebulizador con el uso de un propulsor adecuado, p. ej., diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano o dióxido de carbono. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificación se puede determinar proporcionando una válvula para suministrar una cantidad medida. Se pueden formular cápsulas y cartuchos de, p. ej. gelatina para usar en un inhalador o insuflador que contiene una mezcla en polvo del compuesto y una base en polvo adecuada como lactosa o almidón.

Los compuestos según esta invención y las combinaciones anteriormente descritas también pueden formularse en composiciones rectales como enemas de retención o supositorios, que usan bases de supositorio convencionales como manteca de cacao, otros glicéridos, polietilénglicol o una cera de supositorio.

También se describe en esta memoria un método para usar los presentes derivados de polimixina o una combinación de tales derivados como parte del tratamiento clínico de (o para un régimen profiláctico preventivo) sujetos humanos o animales que padecen una enfermedad infecciosa (es decir, una infección bacteriana Gramnegativa), y comprende administrar a dicho sujeto una dosis terapéuticamente eficaz de al menos un derivado según la presente invención, en combinación con un agente antibacteriano.

También se describe en esta memoria un método para sensibilizar bacterias Gram-negativas a un agente antibacteriano, en donde el derivado según la presente invención se administra simultáneamente, o secuencialmente en cualquier orden, con una cantidad terapéuticamente eficaz de dicho agente antibacteriano.

El derivado de la presente invención y el agente antibacteriano se pueden administrar juntos como una formulación o por vías diferentes. Por ejemplo, el derivado de polimixina se puede administrar por vía intravenosa mientras que el agente antibacteriano se administra por vía intramuscular, intravenosa, subcutánea, oral o intraperitoneal. Alternativamente, el derivado puede administrarse por vía intramuscular o intraperitoneal mientras que el agente antibacteriano se administra por vía intravenosa, intramuscular o intraperitoneal, o el derivado se puede administrar en forma de aerosol o nebulizada mientras se administra el agente antibacteriano, p. ej., intravenosamente. El derivado y los agentes antibacterianos se pueden administrar simultanea o secuencialmente, siempre que se administren de una manera suficiente para permitir que ambos logren concentraciones eficaces en el sitio de infección.

La “efectividad terapéutica” se basa en un resultado clínico exitoso y no requiere que un derivado según la presente invención, en combinación con un agente antibacteriano, mate al 100% de las bacterias implicadas en una infección. El éxito del tratamiento depende de lograr un nivel de actividad antibacteriana en el sitio de la infección, suficiente

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En otra realización adicional, los compuestos de la invención pueden tener también una o más propiedades farmacocinéticamente favorables en comparación con compuestos similares con colas de ácidos grasos más largas (es decir, un resto terminal o R(FA) que tiene más de 5 átomos de carbono). Como se muestra en el Ejemplo 8, NAB741 ha aumentado el aclaramiento renal y aumentado la recuperación urinaria en comparación con NAB739. Los compuestos son químicamente idénticos excepto que NAB741 tiene un resto acetilo terminal y NAB739 tiene un resto octanoílo terminal.

Los métodos para sintetizar compuestos según la presente invención incluyen, pero no se limitan a, los siguientes descritos a continuación. Un experto en la técnica es capaz de elegir el método apropiado para que un compuesto específico se sintetice.

1. Los derivados semisintéticos de polimixinas y octapeptinas que llevan una parte heptapeptídica no modificada y una cadena lateral acil-aminoacilo modificada se pueden preparar mediante los procedimientos descritos a continuación:

Protección de los grupos amino libres en el material de partida (polimixina u octapeptina, o modificaciones de las mismas) por métodos conocidos por aquellos expertos en la técnica. La protección se puede conseguir mediante el uso de restos como t-butoxicarbonilo (tBoc), fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc), benciloxicarbonilo (CBZ,Z), aliloxicarbonilo (ALOC), 3-piridil-N-oxido-metoxicarbonilo (como se describe en la publicación de la Patente GB 1323962), usando bases de Schiff como benzaldehído por el método descrito en la publicación de la Patente Japonesa 7115630/1971 o similares que se pueden eliminar mediante condiciones convencionales compatibles con la naturaleza del producto.

En condiciones donde la pobre solubilidad en agua plantea ocasionalmente un problema en las etapas subsiguientes, se puede hacer la protección usando grupos de bloqueo cargados negativamente como un derivado de ácido sulfónico de Fmoc o un derivado de ácido carboxílico de Fmoc, describiéndose el método en la publicación de la Patente de E.E.U.U. 2006004185. También se puede mejorar la solubilidad en agua uniendo un grupo de bloqueo muy hidrófilo adecuado, cargado negativamente, que se puede eliminar, al grupo OH de la treonina.

A continuación, el compuesto se somete a un tratamiento enzimático con enzimas como polimixina deacilasa, polimixina hidrolasa, papaína, ficina, bromelina, subtilopeptidasa, Nagarse u otras enzimas que eliminan una parte terminal de la cadena lateral o incluso toda la cadena lateral de compuestos de polimixina u octapeptina. Este tratamiento se puede continuar opcionalmente por el procedimiento de la degradación de Edman. El compuesto resultante carece de toda la cadena lateral y consiste únicamente en la parte heptapeptídica cíclica, pero tiene un grupo alfa amino N-terminal.

Alternativamente, las polimixinas y octapeptinas que tienen grupos amino protegidos por grupos estables a ácidos como benciloxicarbonilo pueden tratarse con ácido oxálico o ácido fórmico para producir derivados desacilados protegidos, el método descrito por Kurihara et al. (1974). El procedimiento es seguido por un tratamiento enzimático adicional como el anterior y/o por degradación de Edman para producir un heptapéptido.

A partir de ahí, está unido un resto adecuado a la posición alfa-amino libre de la porción del anillo heptapéptido. El resto puede contener un resto acilo o relacionado (R(FA) que tiene en total 1 a 5 átomos de carbono), como resto metilo, acetilo, propionilo, butanoílo, isobutanoílo, valeroílo, o isovaleroílo, así como restos de aminoácido, hasta tres y preferiblemente dos restos. Por ejemplo, se puede preparar un compuesto semisintético con un grupo acilo y dos restos de aminoácidos añadiendo al heptapéptido anteriormente descrito un resto de N-(acil)-treonil-Dtreonilo sintético. Esto se puede conseguir mediante técnicas generales convencionales conocidas por aquellos expertos en la técnica de la química orgánica, estas técnicas que incluyen el uso de restos unidos a N-hidrosuccinimida como se describe en el documento de E.E.U.U. 2006004185. En esta síntesis particular el procedimiento puede implicar el uso de N-acetiltreonil-Dserinil-N-hidrosuccinimida.

2.

Nonapéptidos de polimixina acilados que llevan tres (3) grupos amino libres. La polimixina D posee solamente cuatro (4) cargas positivas y tiene DSer en la posición R3. Los grupos amino libres de la polimixina D se pueden proteger por los medios anteriormente descritos. Esto se continua con un tratamiento enzimático y una etapa de degradación de Edman opcional, para producir un nonapéptido, que puede ser entonces acilado por acilisotiocianato (mediante el método bien conocido por una persona experta en la técnica y descrito en el documento de E.E.U.U. 2006004185), por cloruro de acilo (mediante el método bien conocido por una persona experta en la técnica y descrito en Chihara et al. 1974), o usando restos unidos a N-hidroxisuccinimida (mediante el método bien conocido por una persona experta en la técnica y descrito en el documento de E.E.U.U. 2006004185). Finalmente, se eliminan los grupos protectores. La polimixina D nonapéptido acilada lleva solamente tres (3) grupos amino libres, todos en la porción del anillo heptapeptídico.

De una manera análoga, se puede preparar una polimixina S nonapéptido acilada. Lleva solamente tres (3) grupos amino libres.

3.

Los derivados de polimixina y octapeptina totalmente sintéticos se pueden fabricar por métodos convencionales muy conocidos por aquellos expertos en la técnica. Tales métodos incluyen los procedimientos de síntesis en fase líquida así como procedimientos de síntesis en fase sólida descritos por ejemplo por Sakura et al. (2004), Tsubery et

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al. (2000a, 2000b, 2002, 2005), y Ofek et al. (2004). Los métodos incluyen, por ejemplo, el uso de agentes protectores como Fmoc, tBoc, y CBZ en posiciones estratégicas, así como la etapa de ciclación donde se usa DPPA (difenil fosforazidato) o una mezcla de hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-oxi-tris-pirrolidino-fosfonio (Py-Bop), Nhidroxibenzotriazol (HoBt), y N-metilmorfolina (NMM). Los derivados Fmoc de muchos aminoácidos no-triviales así como D-aminoácidos están comercialmente disponibles. El amino terminal del último resto de aminoácido se deja desprotegido para permitir la reacción directa en el procedimiento de acilación con ácidos como ácido propiónico, ácido butírico, ácido isobutírico, ácido valérico y ácido isovalérico.

4. También puede realizarse la acilación del grupo alfa-amino N-terminal libre de los compuestos intermedios descritos anteriormente (párrafos 1-3) usando anhídridos como anhídrido acético (véase Ejemplo 1), anhídrido propiónico, anhídrido butírico, y anhídrido valérico usando condiciones bien conocidas por una persona experta en la técnica. La N-formilación se puede realizar usando p-nitrofenil formato en N-metil pirrolidina y condiciones bien conocidas por una persona experta en la técnica. La N-metilación se puede realizar usando una mezcla de ácido fórmico y anhídrido acético en dimetilformamida y condiciones bien conocidas por una persona experta en la técnica.

Listado de referencias

Todas las referencias citadas en la presente solicitud se incorporan aquí por referencia en su totalidad.

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Ejemplos

Los siguientes ejemplos ilustran ciertas realizaciones de la presente invención y no deben ser interpretados como limitantes del alcance de la invención.

Ejemplo 1

Síntesis de péptidos

Los derivados de polimixina (“péptidos NAB” o “compuestos NAB”) se sintetizaron mediante química en fase sólida convencional, usando la estrategia de protección Fmoc convencional. El aminoácido en el extremo C-terminal está comercialmente disponible como pre-anclado a la fase sólida y cuando se escinde de la resina con ácido, produce un ácido carboxílico C-terminal.

La estrategia en la protección fue usar tres niveles de protección ortogonal, protección temporal Fmoc para las funciones alfa-amino, grupos que se eliminan durante la etapa de escisión con ácido, y protección semi-permanente para cubrir las funciones reactivas de la cadena lateral mientras se produce la reacción de ciclación. Después de la escisión del péptido de la resina, el ácido carboxílico C-terminal se hace reaccionar con una función amino de la cadena lateral de uno de los aminoácidos para formar un péptido cíclico. Después de la etapa de ciclación, los grupos de protección semi-permanente se eliminan para producir el péptido NAB.

Por consiguiente, la función alfa-amino del aminoácido estaba protegida por fluorenil-metoxicarbonilo (Fmoc) y se eliminó Fmoc por piperidina al 20% en dimetilformamida (DMF) en cada ciclo. El aminoácido que está implicado en la ciclación, es decir, ácido diaminobutírico, estaba protegido por t-butoxicarbonilo (t-Boc), un grupo lábil ácido que se eliminó en la etapa de escisión. El grupo funcional de asparagina estaba protegido por tritilación. Todos los otros aminoácidos que tienen grupos funcionales de cadena lateral estaban protegidos por un grupo que es estable a la etapa de escisión por ácido, es decir, benziloxicarbonilo (Z). Naturalmente los aminoácidos fenilalanina y leucina no

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necesitaron protección de la cadena lateral. El amino terminal no estaba protegido; esto permitió la reacción directa en el procedimiento de acilación.

Las etapas de síntesis de realizaron en un sintetizador comercial automatizado que empleaba hexafluorofosfato de O-(6-clorobenzotriazol-1-il)-N,N,N’,N’-tetrametiluronio (HCTU) como activador.

La acilación se realizó usando un exceso molar de cuatro veces de cada uno, aminoácido o el ácido graso, un exceso molar de cuatro veces del activador HCTU (véase anteriormente) y un exceso molar de ocho veces de Nmetil morfolina. El tiempo de reacción fue de 30 min.

Los aminoácidos se compraron ya protegidos de proveedores estándar.

El péptido se retiró de la resina mediante reacción con una solución de ácido trifluoroacético al 95% y agua al 5% durante 2 horas a temperatura ambiente, para producir el producto parcialmente protegido. El péptido resultante se precipitó con éter dietílico.

La mezcla de ciclación usada fue hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-oxi-tris-pirrolidino-fosfonio (PyBop), Nhidroxibenzotriazol (HoBt), y N-metil morfolina (NMM) al exceso molar de 2, 2 y 4, respectivamente. El péptido se disolvió en dimetilformamida, se añadió la mezcla de ciclación y se dejó reaccionar durante 2 horas. El péptido protegido y ciclado se precipitó por adición de éter dietílico frío. Se eliminó cualquier PyBop residual lavando el péptido con agua.

La acetilación se realizó usando anhídrido acético-diisopropiletilamina-DMF (1:1:18 en vol.).

Los restantes grupos de protección de cadena lateral (Z) se eliminaron mediante deshidrogenación catalítica. El péptido se disolvió en ácido acético-metanol-agua (5:4:1), en una atmósfera de hidrógeno y en presencia de un catalizador de carbón paladio.

El péptido se purificó mediante cromatografía en fase reversa que usan gradientes convencionales de acetonitrilo:agua:ácido trifluoroacético. El producto se secó por liofilización.

El rendimiento fue de 10-20 mg, lo que representa aprox. 10%-20% del teórico, calculado a partir de la cantidad molar (aprox. 100 micromoles) del primer resto aminoacilo unido a la resina.

La pureza, como se estimó mediante HPLC en fase reversa fue más del 90%. Las masas obtenidas fueron las esperadas a partir de los valores teóricos, dentro del error experimental.

Ejemplo 2

Actividad de los compuestos frente a Escherichia coli y Pseudomonas aeruginosa

Los péptidos sintetizados en el Ejemplo 1, que llevaban ambos solamente tres (3) cargas positivas, se estudiaron por su capacidad de sensibilizar E. coli al antibiótico de rifampicina modelo. Esto se ensayó empleando placas de agar LB (LB Agar Lennox, Difco, BD, Sparks, MD, E.E.U.U.) que contienen concentraciones crecientes (0,1 µg/ml, 0,3 µg/ml, 1 µg/ml) de rifampicina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, E.E.U.U.) así como usando placas control de agar LB que no contienen rifampicina.

El organismo indicador E. coli IH3080 (K1:O18) era una cepa encapsulada aislada originalmente de un neonato que padecía meningitis (Vaara et al. 1984) y obtenida del National Public Health Institute de Helsinki, Finlandia.

A partir de un cultivo de toda la noche de IH3080 sobre agar LB, se preparó una suspensión de aprox. 108 células/ml en NaCl al 0,9%. Se pipetearon entonces alícuotas de esta suspensión en las placas de agar y se agitaron las placas suavemente para extender uniformemente la suspensión sobre toda la superficie de la placa. A partir de ahí, se eliminó la parte no absorbida de la suspensión usando una pipeta Pasteur. Después de secar la superficie, se perforaron pequeños pocillos (diámetro, 2 mm) en las placas (cinco pocillos por placa) usando un tubo de metal estrecho, de punta afilada estéril, una punta de pipeta de un solo uso, y succión a vacío. Alternativamente, se usó un hisopo para extender el inóculo. Después se pipetearon las muestras (4 µl y 10 µl) de la solución de péptido en NaCl al 0,9% (a concentraciones de 1 µg/ml y 0,1 µg/ml) a los pocillos y se dejaron absorber los fluidos de muestra. Los controles incluyeron solución de NaCl al 0,9% sin el compuesto a ensayar. Las placas se incubaron entonces durante 18 h a 37ºC, después de lo que se midieron los diámetros de las zonas de inhibición del crecimiento alrededor de cada pocillo; el diámetro del propio pocillo no se redujo. Finalmente, los diámetros se convirtieron en áreas de superficie de inhibición del crecimiento (en mm cuadrados).

La Tabla 2 muestra la actividad de los nuevos compuestos frente a E. coli IH3080 en comparación con la de los compuestos de control. Aunque ambos carecían de la actividad antibacteriana directa de NAB739, sensibilizaron el objetivo a una concentración de 4 µg/ml hasta una concentración de rifampicina tan baja como 0,1 µg/ml. Curiosamente, el NAB747 era antibacteriano directamente frente a P. aeruginosa ATCC 27853. En un pocillo que contenía 10 µg del péptido, provocó una zona de inhibición con un área superficial de 50 mm2. A 4 µg, el valor correspondiente era de 20 mm2.

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NAB 741 NAB 745 NAB 747

10 39 10 Ac Ac Me Ts Tn Ts cyXXfLXXT cyXXfLXXT 3 (3) 3 (3) 4 (3) 0 0 0 95 50 28

* Códigos de una letra para los restos de aminoacilo: F, Phe; L, Leu; N, Asn; S, Ser; T, Thr; X, Dab; Z, Abu; B, Ngammaformil-Dab; J, N-gamma-acetil-Dab. Las letras pequeñas indican restos que están en configuración D.

+ indica la carga positiva del grupo alfa-amino en el N-terminal libre del péptido. Abreviaturas: MO(H)A, la mezcla de 6-metiloctanoil, 6-metilheptanoílo y restos de ácidos grasos relacionados que aparecen en la polimixina B; OA, octanoílo; DA, decanoílo; Ac, acetilo; Me, metilo.

**Actividad antibacteriana medida como la inhibición del crecimiento (en milímetros cuadrados) alrededor de un pocillo que contiene 4 microgramos del compuesto en placas LB.

*** Actividad antibacteriana medida como la inhibición del crecimiento (en milímetros cuadrados) alrededor de un pocillo que contiene 4 microgramos del compuesto en una placa LB que contiene rifampicina (0,1 microgramos/ml).

Ejemplo 3

NAB741 sensibiliza E. Coli, Klebsiella pneumoniae, y Enterobacter cloacae a una amplia gama de agentes antibacterianos

Se determinaron las concentraciones inhibidoras mínimas (MIC) de un conjunto representativo de agentes antimicrobianos usados clínicamente para dos cepas E. Coli (ATCC25922 e IH3080), K. Pneumoniae ATCC13883, y

E. Cloacae ATCC23355 usando medio de agar Mueller-Hinton (nº de producto Lab039; LabM Ltd., Bury, Lancs, U.K.) en presencia de NAB741 (4 µg/ml) así como en su ausencia. Se determinaron las MICs usando tiras-E (Biodisk Ltd., Solna, Suecia) según las instrucciones del fabricante. La concentración de NAB741 usada no inhibía por sí misma el crecimiento de las bacterias diana. La MIC de NAB741 para todas estas cepas fue > 16 µg/ml.

Los resultados se muestran en la Tabla 3. NAB741 a una concentración de 4 µg/ml era capaz de sensibilizar las cepas ensayadas a rifampicina por un factor que va de >64 a >2000. Se define factor de sensibilización como la relación entre la MIC de un antibiótico en ausencia de NAB741 y aquella en la presencia de 4 µg/ml de NAB741. También se observaron extremadamente altos factores de sensibilización a claritromicina (24-340), mupirocina (8192), azitromicina (16-32), para algunas de las cepas a ácido fusídico (128-170), y para E. cloacae a vancomicina (170). Todos estos agentes antibacterianos son notablemente hidrófobos o grandes (vancomicina) y se sabe que son excluidos por la OM intacta de las bacterias Gram-negativas, aunque penetran en la OM dañada.

Tabla 3. Factores de sensibilización* a agentes antibacterianos seleccionados a una concentración de NAB741 de 4 µg/ml

E. coli E. coli K. pneum. E. cloacae ATCC IH 3080 ATCC ATCC 25922 13883 23355

Rifampicina 750 250 >64 >2000 Claritromicina 340 96 24 96 Mupirocina 128 64 8 190 Azitromicina 24 32 32 16 Ácido fusídico 170 130 >5 >130 Vancomicina >16 16 >2 170

* El factor de sensibilización es la relación entre la MIC del antibiótico en ausencia de NAB741 y aquella en presencia de 4 µg/ml de NAB471.

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Ejemplo 6.

NAB471 sensibiliza E. Coli al complemento en suero normal fresco

La capacidad de NAB741 de sensibilizar la cepa lisa y encapsulada de E. coli a la acción bactericida del suero de cobaya normal (GPS) se estudió por el método descrito por Vaara et al. (1984). Se creció E. coli IH3080 (018:K1) en caldo LB (caldo LB Lennox, Difco, BD, Sparks, MD, E.E.U.U.) a 37ºC en un agitador rotatorio en la fase de crecimiento logarítmico temprano, se lavaron con PBS (solución salina tamponada de fosfato, 8,0 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na2HPO4 x 2H2O y 0,2 g de KH2PO4 por litro) y se resuspendieron en PBS, a aprox. 109 células/ml). Se utilizó GPS como fuente de complemento. Se almacenó a -70ºC antes de su uso. Para inactivar el complemento se incubó el suero a 56ºC durante 30 min.

El procedimiento experimental se realizó de la siguiente forma. Se inoculó GPS al 10% en PBS con aprox. 500 CFU (unidades formadoras de colonia) de bacterias por ml y se pipeteó en alícuotas de 0,2 ml en los pocillos de placas de microtitulación. Los pocillos contenían ya cantidades crecientes de NAB7061 en 0,020 ml de NaCl al 0,9%. La placa se incubó a 37ºC durante 2 h después de lo cual se vació cada pocillo en placas LB. Las placas se incubaron durante la noche a 37ºC y se contaron las colonias desarrolladas.

Los resultados se muestran en la Tabla 6. El NAB741 no redujo en sí significativamente el recuento de CFU en ausencia de GPS o en presencia de GPS al 10% inactivado por calor. Sin embargo, fue suficiente una concentración tan baja de NAB741 como 2 µg/ml para reducir el recuento en un factor de aprox. 100 en presencia de GPS fresco al 10%. Por consiguiente, NAB741 actúa sinérgicamente con la maquinaria bactericida del complemento presente en suero fresco, como lo hace PMBN, el agente bien conocido por tener esta propiedad.

Tabla 6. La actividad bactericida sinérgica de NAB741 y suero de cobaya (GPS) al 10% frente a E. Coli IH3080 (018:K1)*

Concentración de NAB741 (µg/ml)

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Nada (PBS)

100 71 86 58

GPS al 10%

>200 5 7 0

GPS

al 10%, >200 >200 >200 125

inactivado por calor

* medida como % de supervivencia después de 2 horas tratamiento a 37ºC

Ejemplo 7.

Preparación y actividad biológica de la sal de sodio de NAB 739 metanosulfonato

Se disolvió acetato de NAB 739 (100 mg) en agua (2 ml) y se añadió solución de formaldehído neutra (400 microlitros de formaldehído acuoso al 30% llevado a pH 7,2 con Na-HCO3 1 N). Después, se añadió solución NaHCO3 1 N (2 ml), y el derivado de formaldehído NAB 739 precipitado se filtró y se lavó con agua. El sólido húmedo se suspendió en agua (5 ml), y se añadió metabisulfito de sodio (100 mg). Se obtuvo una solución clara después de unos pocos minutos y se secó por congelación. El floculante blanco sólido se extrajo con acetona caliente (7,5 ml) y se secó al vacío. El rendimiento fue de 56 mg. El análisis del producto mediante espectrometría de masas ESI reveló un único pico predominante con la masa molecular de 1075,3 que indicaba que la mayor parte del derivado se sulfometiló en cada uno de los tres restos Dab del compuesto NAB 739. También era visible un pico menor que representaba el NAB 739 bloqueado al azar en dos de los tres restos de Dab.

Para la medición de la actividad antibacteriana de las soluciones acuosas de NAB 739 metanosulfonato de sodio, se hicieron tres soluciones diferentes: 1) Una solución (1 mg/ml) hecha en NaCl al 0,9% inmediatamente antes del experimento, 2) una solución (1 mg/ml) hecha en NaCl al 0,9% 24 h antes del experimento y mantenida a 37ºC, 3) una solución (1 mg/ml) hecha en NaCl al 0,9% 48 h antes del experimento y mantenida a 37ºC. Una solución recién hecha de acetato de NAB 739 sirvió como el compuesto control.

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Tabla 7. La actividad bactericida del NAB 739 metanosulfonato comparado con el de NAB 739 frente a E. Coli IH3080*

Compuesto Antigüedad de 0 1 2

4

la solución

NAB 739 MS**

fresca 100 70 62 16

NAB 739 MS**

24 h 55 34 6

NAB 739 MS**

48 h 35 11 0

NAB 739

fresca 21 2 0

*medida como % de supervivencia después de 2 horas de tratamiento a 37 grados centígrados.

**MS, metanosulfonato

La bacteria de prueba era E. coli IH3080. Se cultivó en caldo LB (caldo LB Lennox, Difco, BD, Sparks, MD, E.E.U.U.) a 37ºC en un agitador rotatorio en fase de crecimiento logarítmico temprano, se lavaron con PBS, y se resuspendieron en PBS a aprox. 109 células/ml. Se inoculó PBS con aprox. 500 CFU (unidades formadoras de colonias) de bacterias por ml y se pipetearon en alícuotas de 0,2 ml en pocillos de una placa de microtitulación. Las placas ya contenían concentraciones crecientes de NAB 739 metanosulfonato o el compuesto de control en 0,020 ml de NaCl al 0,9%. La placa se incubó a 37ºC durante 1 h después de lo cual se vació cada pocillo en placas LB. La placa se incubó durante la noche a 37ºC y se contaron las colonias desarrolladas.

Los resultados se muestran en la Tabla 7. La solución fresca de NAB 739 metanosulfonato era mucho menos antibacteriano que el compuesto de control NAB 739. Mantener la solución de NAB 739 metanosulfonato a 37ºC durante 24 h antes de su uso aumentó ligeramente la actividad, mientras que mantenerla 48 h dio como resultado una actividad casi igual a la observada con el compuesto control. Estos resultados indican que NAB 739 metanosulfonato, en analogía con colistina metanosulfonato, se descompone lentamente en soluciones acuosas para producir sustancias antibacterianas más activas, es decir, sustancias menos sulfometiladas y finalmente NAB 739 libre.

Del mismo modo, se prepararon derivados metanosulfonato de NAB 741, NAB 745, NAB 747 y otros compuestos descritos en esta memoria. Estos profármacos se descomponen in vivo para producir compuestos que poseen la capacidad de sensibilizar bacterias diana a otros agentes antibacterianos y complementos del suero

Ejemplo 8.

Comparación de propiedades farmacocinéticas básicas de NAB 741 y NAB 739

Los estudios se realizaron principalmente usando los métodos descritos por Li et al. (2003, 2004). Cada rata (n=4 para ambos compuestos, Sprague-Dawley, macho) se anestesió usando isoflurano, y se insertó una cánula de polietileno en la vena yugular. Se colocó cada rata en una jaula metabólica y se la dejó recuperar del procedimiento durante la noche. Se administró el compuesto de ensayo (acetato, 1 mg/kg) en forma de bolo (en 200 µl de solución salina estéril al 0,9%) a través de la cánula, seguido de lavado con 0,8 ml de solución salina. Se recogieron manualmente nueve muestras de sangre cada una de 200 µl (0, 10, 20, 30, 60, 90, 120, 180, y 240 min) a través de la cánula. Cuando se recogieron las muestras, se retiraron los primeros 100 µl de sangre y se mantuvieron en la jeringa. Después de recoger la muestra real con otra jeringa, el contenido de la primera jeringa se devolvió a la rata junto con 400 µl de solución salina heparinizada. Las muestras de sangre se centrifugaron para obtener plasma. Se recogieron muestras de orina en intervalos de 0-4 h, 4-6 h y 6-24 h. Las muestras de plasma y orina se almacenaron a -80ºC.

Las muestras se analizaron usando cromatografía líquida y espectrometría de masas con interfaz de ionización por electrospray (LC/ionización por electrospray MS). Se añadieron a 100 µl de muestra, 10 µl de patrón interno (NAB 739, 80 µg/ml) y 200 µl (muestras de plasma) o 100 µl (muestras de orina) de acetonitrilo, la mezcla se mezcló en vortex durante 1 min, y se centrifugaron a 10.000 g durante 10 min. La cromatografía empleó la columna de HPLC C18 (50 x 2 mm), ácido fórmico al 0,1% como disolvente A, acetonitrilo al 0,1% como disolvente B, flujo de 0,2 ml/min y el siguiente gradiente: 5%-30% de B en 6 min, 30%-90% de B en 0,5 min, 90% de B mantenido durante 2,5 min, 90%-5% de B en 1 min. El eluyente entre 5,90-7,00 min y 9,00-10,1 min se dirigió al sistema MS que usa una válvula de conmutación. Se monitorizaron los iones moleculares protonados positivos de NAB 741 a m/z de 496,7 y 331,4 y de NAB 739 a m/z igual a 538,8 y 359,6. Se eluyó NAB 741 a 6,65  0,05 min y se eluyó NAB 739 a 9,45  0,05 min. El análisis no compartimentado de los compuestos en plasma se realizó usando el software WinNonlin (versión 4.0, Mountain View, CA, E.E.U.U.), con el modelo de NA201 (entrada de bolo intravenoso para datos de plasma).

Los parámetros farmacocinéticos básicos determinados para NAB 741, fueron los siguientes: vida media (min), 32,7

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Claims (1)

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