ES2615728T3 - Métodos y composiciones para una purificación y un análisis múltiple específico de secuencia de ácidos nucleicos - Google Patents

Abstract

Un conjunto de sondas de ácido nucleico que comprende a) una primera sonda de ácido nucleico que comprende i) un ácido nucleico aislado que tiene una longitud total no superior a 40 nucleótidos que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 344 o un complemento de la misma, en donde dicho ácido nucleico es capaz de hibridarse bajo condiciones rigurosas selectivas con un gen E6 del virus de papiloma humano (HPV) y opcionalmente ii) un marcador y/o un ligando detectable o en donde el ácido nucleico está unido a un soporte sólido, y b) una segunda sonda de ácido nucleico que comprende i) un ácido nucleico aislado que tiene una longitud total no superior a 40 nucleótidos que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada a partir del grupo que consiste en SEQ ID NO: 553 hasta SEQ ID NO: 556 y sus complementos, en donde dicho ácido nucleico es capaz de hibridarse bajo condiciones rigurosas selectivas con un gen L1 de HPV, y opcionalmente ii) un marcador y/o un ligando detectable o en donde el ácido nucleico está unido a un soporte sólido, en donde la primera sonda de ácido nucleico y la segunda sonda de ácido nucleico son capaces de hibridarse bajo condiciones rigurosas con al menos una porción del mismo genoma de HPV, en donde el genoma es un genoma de HPV2, y en donde la primera sonda de ácido nucleico y la segunda sonda de ácido nucleico no son capaces de hibridarse bajo condiciones rigurosas con los genomas de HPV de HPV3, HPV6, HPV10, HPV11, HPV16, HPV18, HPV26, HPV27, HPV28, HPV29, HPV30, HPV31, HPV32, HPV33, HPV34, HPV35, HPV39, HPV42, HPV45, HPV51, HPV52, HPV53, HPV54, HPV56, HPV57, HPV58, HPV59, HPV64, HPV66, HPV67, HPV68, HPV69, HPV70, HPV73, HPV82, HPV84, HPV85, HPV86, HPV87 y HPV94.

Description

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200 mM y desde aproximadamente 0,025% a aproximadamente 0,075% de azida de sodio. En todavía otro aspecto, el medio de recogida a base de detergente comprende, consiste esencialmente o consiste en desde aproximadamente 0,9% a aproximadamente 1,2% de NP-40, desde aproximadamente 0,20% a aproximadamente 0,30% de desoxicolato de sodio, Tris-HCl desde aproximadamente 30 mM a aproximadamente 60 mM, EDTA desde aproximadamente 20 mM hasta aproximadamente 30 mM, NaCl desde aproximadamente 100 mM a aproximadamente 150 mM y desde aproximadamente 0,04% a aproximadamente 0,06% de azida de sodio

En un aspecto, el medio de recogida comprende, consiste esencialmente o consiste en NP-40 y EDTA. En otro aspecto, el medio de recogida comprende, consiste esencialmente o consiste en NP-40, EDTA y azida de sodio. En un aspecto, el medio de recogida comprende, consiste esencialmente o consiste en desoxicolato de sodio, EDTA y azida de sodio. En un aspecto, el medio de recogida comprende, consiste esencialmente o consiste en aproximadamente NP-40, desoxicolato de sodio, EDTA y azida de sodio. En un aspecto, el medio de recogida comprende, consiste esencialmente o consiste en NP-40, desoxicolato de sodio, Tris-HCl, EDTA y azida de sodio.

En otro aspecto, el medio de recogida comprende, consiste esencialmente o consiste en desde 0,5% a aproximadamente 2,0% de NP-40 y EDTA desde 10 mM a aproximadamente 50 mM. En otro aspecto, el medio de recogida comprende, consiste esencialmente o consiste en desde 0,5% a aproximadamente 2,0% de NP-40, EDTA desde 10 mM a aproximadamente 50 mM y desde aproximadamente 0,01% a aproximadamente 0,10% de azida de sodio. En un aspecto, el medio de recogida comprende, consiste esencialmente o consiste en desde aproximadamente 0,10% a aproximadamente 0,40% de desoxicolato de sodio, EDTA desde 10 mM a aproximadamente 50 mM y desde aproximadamente 0,01% a aproximadamente 0,10% de azida de sodio. En un aspecto, el medio de recogida comprende, consiste esencialmente o consiste en desde aproximadamente 0,5% a aproximadamente 2,0% de NP-40, desde aproximadamente 0,10% a aproximadamente 0,40% de desoxicolato de sodio, EDTA desde 10 mM a aproximadamente 50 mM y desde aproximadamente 0,01% a aproximadamente 0,10% de azida de sodio. En un aspecto, el medio de recogida comprende, consiste esencialmente o consiste en desde aproximadamente 0,5% a aproximadamente 2,0% de NP-40, desde aproximadamente 0,10% a aproximadamente 0,40% de desoxicolato de sodio, Tris-HCl desde aproximadamente 25 mM a aproximadamente 75 mM, EDTA desde aproximadamente 10 mM a aproximadamente 50 mM y desde aproximadamente 0,01% a aproximadamente 0,10% de azida de sodio. En ciertos aspectos, el medio comprende o consiste esencialmente en 1% de NP-40, 0,25% de desoxicolato de sodio, Tris-HCl 50 mM, EDTA 25 mM, NaCl 150 mM y 0,09% de azida de sodio. Este medio se denomina frecuentemente en la presente memoria medio de recogida Digene o DCM.

Las muestras se pueden recoger en otros medios de recogida conocidos y se pueden utilizar en los métodos descritos en el presente documento. Ejemplos de otros medios de recogida incluyen PRESERVCYT, SUREPATH, orina y STM (Medio de Transporte de Muestras/Especímenes). Las muestras recogidas en algunos de estos medios pueden requerir un procesamiento antes de que los ácidos nucleicos en las muestras se puedan detectar y analizar. Diversos métodos de procesamiento de muestras (también conocidos como preparación de muestras) se conocen en la técnica. Por ejemplo, muestras de células cervicales recogidas para un análisis citológico en un medio tal como PRESERVCYT, se pueden combinar con un tampón de lisis a base de detergente seguido por la adición de perlas magnéticas que comprenden superficies que se unen a ácidos nucleicos.

En otro aspecto, la muestra puede comprender, consistir o consistir esencialmente en ácidos nucleicos que han sido extraídos a partir de una muestra biológica. Se conocen numerosos métodos para la extracción de ácidos nucleicos a partir de una muestra biológica o ambiental, incluyendo, pero no limitados a: extracción con fenol/cloroformo; cromatografía de intercambio de aniones; ultracentrifugación en gradiente de cloruro de cesio; cromatografía de exclusión por tamaño; y extracción en sal de sílice/caotrópica. Los ácidos nucleicos extraídos se pueden separar adicionalmente de acuerdo con el tamaño, mediante electroforesis en gel y extraer del gel si se desean muestras que comprendan tamaños específicos de ácido nucleico.

B. Ácidos nucleicos diana

Como se ha señalado anteriormente, los métodos descritos en este documento se refieren a la detección y determinación del genotipo de al menos un ácido nucleico diana en una muestra. El al menos un ácido nucleico diana puede ser ADN o ARN, o ambos ADN y ARN y puede ser de cadena sencilla, de cadena doble o parcialmente de cadena sencilla. El al menos un ácido nucleico diana puede estar contenido dentro de un ácido nucleico más grande. La detección del al menos un ácido nucleico diana o del ácido nucleico más grande que comprende el al menos un ácido nucleico diana, se contempla en la presente descripción.

El al menos un ácido nucleico diana puede incluir, sin limitación, ácidos nucleicos que se encuentran en especímenes o cultivos (por ejemplo, cultivos celulares, microbiológicos y víricos), incluyendo muestras biológicas y ambientales. El al menos un ácido nucleico diana se puede encontrar en muestras biológicas procedentes de un animal, incluyendo un ser humano, líquidas, sólidas (por ejemplo, heces) o tisulares, así como productos e ingredientes líquidos y sólidos de alimentos y piensos, tales como artículos lácteos, vegetales, cárnicos y subproductos cárnicos y residuos. El al menos un ácido nucleico diana se puede encontrar en muestras ambientales e incluyen material ambiental tal como muestras de materia de la superficie, suelo, agua e industriales, así como muestras obtenidas a partir de instrumentos, aparatos, equipos, utensilios, artículos desechables y no desechables de procesamiento de alimentos y productos lácteos.

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tidos es capaz de hibridarse con cada ácido nucleico de un conjunto de ácidos nucleicos diana que consisten en los tipos de LR-HPV 2, 3, 6, 7, 10, 11, 13, 27, 28, 30, 32, 40, 42, 43, 53, 54, 55, 61, 62, 67, 69, 70, 71, 72, 74, 81, 83, 84, 85, 86, 87, 89, 90 y 91, o cualquier subconjunto del mismo. En un aspecto, la pluralidad de sondas híbridas de polinucleótidos es capaz de hibridarse con cada ácido nucleico de un conjunto de ácidos nucleicos diana que consiste en los tipos de HR-HPV 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 y 82 o cualquier subconjunto del mismo; y los tipos de LR-HPV 2, 3, 6, 7, 10, 11, 13, 27, 28, 30, 32, 40, 42, 43, 53, 54, 55, 61, 62, 67, 69, 70, 71, 72, 74, 81, 83, 84, 85, 86, 87, 89, 90 y 91 o cualquier subconjunto del mismo.

Si el al menos un ácido nucleico diana se había desnaturalizado mediante un tratamiento alcalino, una o varias sondas de polinucleótidos se pueden diluir en un diluyente de sondas que también puede actuar como tampón neutralizante de la hibridación (para neutralizar el reactivo básico para la desnaturalización).

El diluyente de la sonda, utilizado para las sondas de ADN o ARN, diferirá debido a los diferentes requisitos necesarios para la estabilidad del ADN frente al ARN. Por ejemplo, si las sondas son de ARN, es preferible neutralizar primero la muestra y luego añadir la sonda o, alternativamente, añadir la sonda de ARN y el agente neutralizante (diluyente de la sonda) a la muestra al mismo tiempo, ya que una alcalinidad excesiva puede destruir el ARN. El diluyente de la sonda se puede utilizar para disolver y diluir la sonda y también para ayudar a restaurar la muestra a aproximadamente un pH neutro, por ejemplo, desde aproximadamente pH 6 a aproximadamente pH 9, para proporcionar un entorno más favorable para la hibridación. Un volumen suficiente de diluyente de la sonda, preferiblemente la mitad del volumen de la muestra, se puede utilizar para neutralizar la muestra tratada con una base.

Para las sondas de longitud completa, una solución alcalina calentada se puede añadir a la muestra, a continuación, se puede añadir el diluyente de la sonda a la muestra a temperatura ambiente y, a continuación, la muestra se puede recalentar. Un procedimiento de este tipo puede inhibir la formación de una estructura secundaria. Los anticuerpos tienden a unirse de forma irreversible a estructuras con estructura secundaria. Cuando se utilizan sondas de longitud no completa, tales como sondas truncadas o sintéticas, puede no ser necesario calentar las soluciones o la muestra, debido a que las cuestiones de estructuras secundarias no están presentes. En un aspecto, la muestra no se calienta cuando se emplea con sondas truncadas o sintéticas.

Después del tratamiento con el reactivo para la desnaturalización, se puede añadir a la muestra una parte alícuota de tampón de neutralización, en un aspecto el diluyente de la sonda descrito, en el que se disuelven una o varias sondas, en condiciones adecuadas para permitir que se produzca la hibridación o la unión de la sonda y el al menos un ácido nucleico diana. El tampón de neutralización puede contener una única sal de tamponamiento. En un aspecto, el tampón de neutralización no contiene más de una sola sal de tamponamiento. Las condiciones de la hibridación son suficientes para permitir que una o varias sondas de polinucleótidos se apareen con una secuencia de ácido nucleico complementaria correspondiente, si está presente, en la muestra para formar un híbrido de ácido nucleico de cadena doble.

Se emplean condiciones de hibridación adecuadas para las sondas y diluyentes particulares descritos en el presente documento. Por ejemplo, las sondas y los ácidos nucleicos de la muestra se pueden incubar durante un tiempo de hibridación, preferiblemente desde al menos aproximadamente 5 hasta aproximadamente 30 minutos, desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 20 minutos o desde aproximadamente 7 hasta aproximadamente 15 minutos, o aproximadamente 10 minutos, así como cualquier otro espacio de tiempo dentro de los intervalos citados, suficiente para permitir que una o varias sondas de polinucleótidos se apareen con una secuencia de ácido nucleico complementaria correspondiente. Las condiciones de hibridación pueden incluir una temperatura de hibridación de al menos aproximadamente 65°C, aproximadamente 68,5°C y de aproximadamente 67°C hasta aproximadamente 70°C, así como cualquier valor de temperatura dentro de los intervalos citados. Para al menos un ácido nucleico diana dado y una sonda dada, un experto ordinario en la técnica puede determinar fácilmente las condiciones de hibridación deseadas mediante experimentación de rutina. Un experto ordinario en la técnica apreciará además que el tiempo y la temperatura de la hibridación se deben optimizar, uno con respecto al otro. Por lo tanto, se pueden desarrollar temperaturas de hibridación más altas durante períodos de tiempo más cortos y viceversa. Sin limitaciones, unas condiciones de hibridación rigurosas se pueden controlar mediante el aumento de la temperatura, el aumento de las condiciones iónicas a superiores a 0,5 M (por ejemplo, NaCl), o la reducción de la concentración de PAA. A modo de ejemplo no limitante, unas condiciones de hibridación rigurosas pueden incluir la realización de una reacción de hibridación a temperaturas elevadas, tales como de al menos aproximadamente 65°C, al menos aproximadamente 68,5°C, entre aproximadamente 67°C y aproximadamente 70°C, y entre aproximadamente 69°C y aproximadamente 70°C. Unas condiciones de hibridación rigurosas pueden incluir también temperaturas elevadas, tales como de al menos aproximadamente 65°C, al menos aproximadamente 68,5°C y entre aproximadamente 67°C y aproximadamente 70°C. Una guía extensa para la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Acid Probes, Parte I, Capítulo 2 "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays", Elsevier, New York (1993); y Current Protocols in Molecular Biology, Capítulo 2, Ausubel, et al., compiladores, Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (1995).

Para los fines actuales, unas "condiciones rigurosas" incluyen condiciones con las que solo se producirá la hibridación si existe una falta de apareamiento del 25% o menos entre la molécula de la hibridación y la secuencia diana. Las "condiciones rigurosas" se pueden dividir en determinados niveles de rigor para una definición más precisa. Por

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de la diana en una única reacción para la amplificación simultánea de múltiples ácidos nucleicos diana.

En general, las parejas adecuadas de cebadores específicos de una diana, son oligonucleótidos cortos sintéticos, por ejemplo, que tienen una longitud de más de 10 nucleótidos y menos de 50 nucleótidos. El diseño de cebadores de oligonucleótidos específicos de una diana implica diversos parámetros, tales como puntuaciones de la alineación basadas en una cadena, temperatura de fusión, longitud del cebador y contenido en GC. Cuando se diseña un cebador específico de una diana, uno de los factores importantes es seleccionar una secuencia dentro del fragmento diana que sea específica de la molécula de ácido nucleico que se va a amplificar. Otro factor importante es calcular la temperatura de fusión de un cebador específico de una diana para la reacción. La temperatura de fusión de un cebador específico de una diana se determina por la longitud y el contenido en GC de ese oligonucleótido. Preferiblemente, la temperatura de fusión de un cebador es aproximadamente 10 a 30°C más elevada que la temperatura a la que se llevará a cabo la hibridación del cebador y la amplificación de la diana.

"Hibridación del cebador" se refiere a la unión de un cebador de oligonucleótido a una región del molde de ácido nucleico de cadena sencilla, en condiciones en las que el cebador se une específicamente solo con su secuencia complementaria en una de las cadenas del molde y no a otras regiones en el molde. La especificidad de la hibridación puede estar afectada por la longitud del cebador de oligonucleótido, la temperatura a la que se realiza la reacción de hibridación, la fuerza iónica y el pH de la mezcla de reacción.

Cada cebador específico de una diana se hibrida con cada extremo del ácido nucleico diana y se puede extender en dirección 3'→5' mediante una polimerasa, utilizando la secuencia del nucleótido diana como molde. Para lograr una amplificación específica, se prefiere un cebador específico de la diana homólogo o que se empareje perfectamente. Sin embargo, los cebadores específicos de una diana pueden incluir secuencias en el extremo 5' que no son complementarias con la o las secuencias de nucleótidos diana. Alternativamente, los cebadores específicos de una diana pueden contener nucleótidos o secuencias de principio a fin que no son exactamente complementarias al ácido nucleico diana.

Los cebadores específicos de una diana pueden incluir cualquiera de las bases de desoxirribonucleótidos A, T, G o C y/o una o varias bases de ribonucleótidos A, C, U, G y/o uno o varios nucleótidos modificados (desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos) en donde la modificación no impide la hibridación del cebador con el ácido nucleico o la elongación del cebador específico de la diana o la desnaturalización de las moléculas de cadena doble. Los cebadores específicos de una diana se pueden modificar con grupos químicos tales como fosforotioatos o metilfosfonatos o con enlazadores no nucleótidos para mejorar su rendimiento o para facilitar la caracterización de los productos de la amplificación.

En general, la temperatura de la desnaturalización adecuada para permitir una especificidad del reconocimiento del cebador-molde específico de una diana y un posterior apareamiento, puede estar en un intervalo de temperaturas, por ejemplo, de 20°C a 75°C. Una temperatura de desnaturalización preferida se puede seleccionar según qué helicasa se selecciona para el proceso de fusión. Las pruebas para determinar las temperaturas óptimas de la amplificación de un ácido nucleico en presencia de una helicasa seleccionada, se pueden determinar mediante experimentación de rutina, variando la temperatura de la mezcla de reacción y comparando los productos de la amplificación utilizando electroforesis en gel.

En un aspecto adicional, la amplificación es una amplificación independiente de la secuencia. Tal y como se emplea en la presente memoria, una "amplificación independiente de la secuencia" se refiere a cualquier amplificación que no amplifica una secuencia específica. A modo de ejemplo y no como una limitación, se pueden emplear mezclas de cebadores aleatorios o agentes inductores de mellas para iniciar una amplificación independiente de la secuencia.

Tal y como se emplea en la presente memoria, "mezcla de cebadores aleatorios" se refiere a mezclas de secuencias de oligonucleótidos cortas generadas al azar.

Tal y como se emplea en la presente memoria, una "actividad polimerasa iniciada por una mella" se refiere a una actividad polimerasa en ausencia de cebadores exógenos, que se inicia por rupturas en una cadena sencilla en el molde. La síntesis se inicia en la ruptura de la cadena sencilla en el ADN, en lugar de en el extremo terminal de un cebador sintético exógeno. Con una síntesis iniciada en una mella, la eliminación de los cebadores es innecesaria, reduciendo el coste, el tiempo de manejo y el potencial de pérdida o degradación del producto. Además, la síntesis iniciada en una mella reduce las señales de amplificación falsas causadas por una autoextensión de los cebadores. Las mellas se pueden introducir en lugares definidos, mediante el uso de enzimas que producen una mella en una secuencia de reconocimiento, o se pueden introducir al azar en un polinucleótido diana. Tal y como se emplea en la presente memoria, un "agente que induce una mella" se refiere a cualquier reactivo enzimático o químico o tratamiento físico que introduce rupturas en el enlace fosfodiéster entre dos nucleótidos adyacentes en una cadena de un ácido nucleico de cadena doble. Ejemplos de enzimas que inducen mellas incluyen Bpu10 I, BstNB I, Alw I, BbvC I, BbvC I, Bsm I, BsrD y endonucleasa de E. coli. En un aspecto, al menos una enzima inductora de mellas está incluida como un sustituto de una helicasa en una mezcla de reacción. En otro aspecto, al menos una enzima inductora de mellas se añade a una mezcla de reacción, además de al menos una helicasa.

En un aspecto, la amplificación es una amplificación isotérmica. En otro aspecto, la amplificación isotérmica es una

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vez en los ensayos da como resultado que es sensible a deleciones, mutaciones o inserciones. Por ejemplo, si se elimina esta región diana durante la integración vírica en el genoma hospedador (como se ha observado con la región L1), se puede perder la infección. Adicionalmente, se pueden producir falsos negativos cuando hay mutaciones

o deleciones en la región a la que se dirige la sonda de detección.

En los siguientes ejemplos, se utilizaron los métodos descritos anteriormente para purificar, detectar y caracterizar 26 tipos de HPV, incluyendo todos los HR-HPVs actualmente conocidos.

Ejemplo 1: Diseño del ensayo

Los siguientes ejemplos utilizan todos el mismo diseño general del ensayo. En primer lugar, los ácidos nucleicos de HPV se aíslan a partir de la muestra mediante el uso de captura de híbridos. Después, los ácidos nucleicos de HPV aislados se amplifican utilizando una amplificación del genoma completo. Los ácidos nucleicos de HPV amplificados se separan después, de acuerdo con el serotipo de HPV, usando sondas de captura específicas para cada serotipo individual de HPV inmovilizado sobre una perla marcada de forma exclusiva. Una sonda de detección biotinilada se hibrida después con los ácidos nucleicos de HPV separados y un conjugado de estreptavidina/ficoeritrina (SA-PE) se une a la sonda de detección para generar una señal. Tanto el marcador único de la perla como la señal generada por el SA-PE se miden usando citometría de flujo. El marcador de la perla se utiliza para indicar el genotipo unido a la perla, mientras que la señal de SA-PE se utiliza para indicar la presencia o ausencia de ácido nucleico de HPV unido a cada perla.

A. Preparación de la sonda de purificación.

Se diseñó un conjunto de sondas de purificación de modo que era capaz de aislar ácidos nucleicos de todos los serotipos de HPV existentes. Aunque en principio las sondas podían tener cualquier longitud, se seleccionaron sondas cortas de 25-meros para proporcionar flexibilidad al diseño de la sonda y una preparación sencilla.

El conjunto de sondas de purificación se preparó usando dos criterios básicos. En primer lugar, las sondas se seleccionaron de tal manera que se dispersaron por todo el genoma diana para capturar todas las regiones del genoma. En segundo lugar, se agruparon sondas múltiples en torno a regiones específicas para garantizar que se había purificado cada región que se estaba analizando.

Para reducir al mínimo el número total de sondas requeridas, las sondas se diseñaron de manera que se podía utilizar una única sonda como una sonda de consenso para dos o más tipos de HPV. Para descubrir las secuencias de consenso, se realizaron alineaciones de las secuencias de HPV que se estaban sometiendo a ensayo, por familias. Por ejemplo, todos los miembros de la familia A9 (HPV16), que comprende los HPVs 16, 31, 33, 35, 52, 58 y 67, o la familia A7 (HPV18), que comprende HPV18, HPV39, HPV45, HPV59, HPV68, HPV70 y HPV85, se alinearon mediante ClustalW y la secuencia de consenso se analizó en busca de presencia de una secuencia de 25-meros contigua. Tal secuencia se podía elegir entonces como una sonda candidata. Basándose en el árbol filogenético construido durante el análisis, las dos secuencias relacionadas más estrechamente se alineaban entre sí y se repitió la búsqueda de secuencias de consenso. Por lo tanto, se diseñaron las sondas enumeradas en la Tabla 1 (abajo).

Tabla 1: SECUENCIAS DE LAS SONDAS DE PURIFICACIÓN PARA 27 TIPOS DE HPV

SEQ ID NO.

Nombre Secuencia

1

HPV16-E6E7-1 AACCGAAACCGGUUAGUAUAAAAGC

2

HPV16-E6E7-2 UUAGAAUGUGUGUACUGCAAGCAAC

3

HPV16-E6E7-3 GGUAUAUGACUUUGCUUUUCGGGAU

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HPV16-E6E7-4 AGUAUAUAGAGAUGGGAAUCCAUAU

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HPV16-E6E7-5 ACAACAAACCGUUGUGUGAUUUGUU

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HPV16-E6E7-6 UUAGGUGUAUUAACUGUCAAAAGCC

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HPV16-E6E7-7 GAUUCCAUAAUAUAAGGGGUCGGUG

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HPV16-L1-1 AUGUUGCACGCACAAACAUAUAUUA

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HPV16-L1-2 GUUCCUAAAGUAUCAGGAUUACAAU

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HPV16-L1-3 UCCCUAUUUUCCUAUUAAAAAACCU

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HPV16-L1-4 GUUUGGGCCUGUGUAGGUGUUGAGG

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HPV16-L1-5 GUCAGCCAUUAGGUGUGGGCAUUAG

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HPV16-L1-6 UGUGUUUAAUUGGUUGCAAACCACC

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HPV16-L1-7 GGUGAUUGUCCACCAUUAGAGUUAA

SEQ ID NO.

Nombre Secuencia

15

HPV16-L1-8 CAGUUAUUCAGGAUGGUGAUAUGGU

16

HPV16-A9-1 GAAAUCCUUUUUCUCAAGGACGUGG

17

HPV16-A9-2 CAAUGUGUAGACAUUAUAAACGAGC

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HPV16-A9-3 UUAGACAUUUAUUUAAUAGGGCUGG

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HPV16-A9-5 CAUAUGAUAAUCCUGCAUAUGAAGG

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HPV16-A9-6 AAUAUGAUUUACAGUUUAUUUUUCA

21

HPV16-A9-7 AUCCUUUAUUAAAUAAAUUGGAUGA

22

HPV16/35-A9-8 CUAUUAGUACACAUAAUUAUGAAGA

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HPV31/35-A9-1 GGUACAAUGGGCAUAUGACAAUGAU

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HPV31/35-A9-2 GACAAACAGUAUUACAGCAUAGUUU

25

HPV31/35-A9-3 GAUGGUAUAGAUAUAGUGUGUAUGG

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HPV31/35-A9-4 GAUUAAAUUUGCACGAGGAAAGAGG

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HPV31-E6E7-1 ACGAUGAACUAAGAUUGAAUUGUGU

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HPV31-E6E7-2 ACAGAGGUAUUAGAUUUUGCAUUUA

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HPV31-E6E7-3 UUAAUUAGGUGUAUAACGUGUCAAA

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HPV31-E6E7-4 AGAAGAAAAACAAAGACAUUUGGAU

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HPV31-E6E7-5 AGGAAGGUGGACAGGACGUUGCAUA

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HPV31-L1-1 GAACCAACAUAUAUUAUCACGCAGG

33

HPV31-L1-2 AUCCAUAUUAUUCCAUACCUAAAUC

34

HPV31-L1-3 UCAGGAUUACAAUAUAGGGUAUUUA

35

HPV31-L1-4 GACACUGAAAACUCUAAUAGAUAUG

36

HPV31-L1-5 AAUGUAUAUCAAUGGAUUAUAAACA

37

HPV31-L1-6 CUAUUGGAGAGCAUUGGGGUAAAGG

38

HPV31-L1-7 GGUGAUUGUCCUCCAUUAGAAUUAA

39

HPV31-E6E7-6 UAGUAUAUAGGGACGACACACCACA

40

HPV31-E6E7-7 CUGAAACCCAAGUGUAAACAUGCGU

41

HPV35-E6E7-1 GCUAUGAUUUGUGUAUAGUAUAUAG

42

HPV35-E6E7-2 UCCAGUUGAAAAGCAAAGACAUUUA

43

HPV35-E6E7-3 UUGUAAAUGUGAGGCGACACUACGU

44

HPV35-E6E7-4 AAGAUUUAUUAAUGGGCACAUUUGG

45

HPV35-L1-1 GCACAAACAUCUACUAUCAUGCAGG

46

HPV35-L1-2 CAAUACAGAGUAUUUAGAGUAAAAU

47

HPV35-L1-3 CUAAUAAGUUUGGAUUUCCAGACAC

48

HPV35-L1-4 UGGUUUGGGCCUGUACAGGAGUUGA

49

HPV35-L1-5 GUACAGAUAACAGGGAAUGCAUUUC

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HPV67-E6E7-1 UAACCGAAAACGGUUUGACCGAAAA

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HPV67-E6E7-2 CGAAAAACCACGCAACCUGCACGAA

52

HPV67-E6E7-3 CUUUGGAAACCACGGUGCAUGAAAU

53

HPV67-E6E7-4 CUUUGGACAGAAACGAGGUAUAUGA

54

HPV67-E6E7-5 UCUGUGAGUGCACUUUGCGUUUGUG

SEQ ID NO.

Nombre Secuencia

55

HPV67-E6E7-6 AAUCCAGCAGAUGCUUAUGAACACA

56

HPV67-L1-1 UAUUGAAAUAGGGCGAGGACAGCCU

57

HPV67-L1-2 CUGAUAAUAGGGAAUGCUUGUCUAU

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HPV67-L1-3 UUUGGAACUUAUGAAUACUGUUAUU

59

HPV67-L1-4 GAGCAGGUAAAUUAGGGGAGGAUGU

60

HPV67-L1-5 GCAAACACUUCUGCACUGCAAACCU

61

HPV67-L1-6 GCUAAACCUAAACUAAAACGUUCUU

62

HPV67-L1-7 CAAAACGUAAAAAGGUUAAAAGGUA

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HPV52-E6E7-1 GUGUAGCUAACGCACGGCCAUGUUU

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HPV52-E6E7-2 UGCACGAAUUGUGUGAGGUGCUGGA

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HPV52-E6E7-3 UACAACGAAGAGAGGUAUACAAGUU

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HPV52-E6E7-4 ACGAAUAGUAUAUAGAGACAAUAAU

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HPV52-E6E7-5 GGCAUUAUCAAUAUUCACUGUAUGG

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HPV52-E6E7-6 CUAUGAGCAAUUAGGUGACAGCUCA

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HPV52-E6E7-7 GCCAGAUGGACAAGCAGAACAAGCC

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HPV52-L1-1 UAACAGUAGGACAUCCCUAUUUUUC

71

HPV52-L1-2 AAAAAAGUUUUAGUUCCCAAGGUGU

72

HPV52-L1-3 UUUGAUGAUACUGAAACCAGUAACA

73

HPV52-L1-4 AGGGAAUGUUUAUCUAUGGAUUAUA

74

HPV52-L1-5 UGCAAACCUCCUAUAGGUGAACAUU

75

HPV52-L1-6 AGGAUGGGGACAUGGUAGAUACAGG

76

HPV33/58-A9-1 UAGAAGACAGCGGAUAUGGCAAUAC

77

HPV33/58-A9-2 GCUGUACAGAUUGGUGUAUAACAGG

78

HPV33/58-A9-3 AUUGGUUUAGAACAGCAAUGUCAAA

79

HPV33/58-A9-4 UCAUAUUUUGGAAUGAGUUUAAUAC

80

HPV33/58-A9-5 UUUUGGUUGCAGCCAUUAUCAGAUG

81

HPV33/58-A9-6 AAUAGAGGAAGAGGACAAGGAAAAC

82

HPV33/58-A9-7 AUGGAGGAAAUAUCAGCACGUUUAA

83

HPV33/58-A9-8 CAUCACAAAUUGAACAUUGGAAACU

84

HPV33/58-A9-9 GGACAUUGCAACAAACAAGCUUAGA

85

HPV33/58-A9-10 AUUUUAAAUAUUUUAAAGAGGAUGC

86

HPV33/58-A9-11 AAUAUCCACUACUGAAACUGCUGAC

87

HPV33/58-A9-12 CAAAUAGUUUAAAAUGUUUAAGAUA

88

HPV33/58-A9-13 UGAUGUGUAUUAAUUUUCAUGCACA

89

HPV33/58-A9-14 UCUACAAGGCGCAAGCGUGCAUCUG

90

HPV33/58-A9-15 GAAAACAUACCAAUGGAUACCUUUG

91

HPV33/58-A9-16 GCCCUGUGGCACGCCUUGGUUUAUA

92

HPV33/58-A9-17 CAGAUGUCCGUGUGGCGGCCUAGUG

93

HPV33/58-A9-18 ACAUUGCAGGCUAAUAAAAGUGAUG

94

HPV33/58-A9-19 CAGUACAUGCAAAUAUCCAGAUUAU

SEQ ID NO.

Nombre Secuencia

95

HPV52/67-A9-1 GAGAAAUGGUGCAAUGGGCAUAUGA

96

HPV52/67-A9-2 UUUUUAAAAGGUAUACCUAAAAAAA

97

HPV52/67-A9-3 UAACAGUGCAAUACGAUAAUGAUAA

98

HPV52/67-A9-4 CAGAUGUCCGUGUGGCGGCCUAGUG

99

HPV52/67-A9-5 AGGCCACUGUGUACCUGCCUCCUGU

100

HPV52/67-A9-6 UUAGAGGACUGGCAAUUUGGCCUUA

101

HPV52/67-A9-7 CAUGUUUUAAACUGCUUUUAGGCAC

102

HPV18/45-A7-1 AUGCUGCAUGCCAUAAAUGUAUAGA

103

HPV18/45-A7-2 UUAAAACGAAAGUUUGCAGGAGGCA

104

HPV18/45-A7-3 UCAGAUAGUGGCUAUGGCUGUUCUG

105

HPV18/45-A7-4 UUAGAAAUUUUAAAAGUGAUAAAAC

106

HPV18/45-A7-5 UGUAAAUGGGGAGUAUUAAUAUUAG

107

HPV18/45-A7-6 CACCAAAAUUGCGAAGUAGUGUUGC

108

HPV18/45-A7-7 AUGCAUUUCCAUUUGAUAAAAAUGG

109

HPV18/45-A7-8 GAAAGGACAUGGUCCAGAUUAGAUU

110

HPV18/45-A7-9 UUGAUUGUAAUGACUCUAUGUGCAG

111

HPV18/45-A7-10 UACCAGUGACGACACGGUAUCCGCU

112

HPV18/45-A7-11 GUGGUAACACUACGCCUAUAAUACA

113

HPV18/45-A7-12 GUAAUAAAACUGCUUUUAGGCACAU

114

HPV18-E6E7-1 AGGAUCCAACACGGCGACCCUACAA

115

HPV18-E6E7-2 CUUCACUGCAAGACAUAGAAAUAAC

116

HPV18-E6E7-3 AGGUAUUUGAAUUUGCAUUUAAAGA

117

HPV18-E6E7-4 GAGGCCAGUGCCAUUCGUGCUGCAA

118

HPV18-L1-1 UGGUAAUCCAUAUUUUAGGGUUCCU

119

HPV18-L1-2 UUCCUAAGGUUUCUGCAUACCAAUA

120

HPV18-L1-3 AUCCUGAAACACAACGUUUAGUGUG

121

HPV18-L1-4 AGGACGUUAGGGACAAUGUGUCUGU

122

HPV45-E6E7-1 UGACGAUCCAAAGCAACGACCCUAC

123

HPV45-E6E7-2 UAGACACCUUAAGGACAAACGAAGA

124

HPV45-E6E7-3 GUGUGACGGCAGAAUUGAGCUUACA

125

HPV45-E6E7-4 UACAGCAGCUGUUUUUGAGCACCUU

126

HPV45-L1-1 UGUAGGCAAUCCAUAUUUUAGGGUU

127

HPV45-L1-2 UUCCUAAGGUAUCCGCAUAUCAGUA

128

HPV45-L1-3 AUAAUCCUGAAACACAACGUUUGGU

129

HPV45-L1-4 AGGAUGUUAGGGAUAAUGUGUCAGU

130

HPV39/68-A7-1 CCAUACAAAUUGCCAGACCUGUGCA

131

HPV39/68-A7-2 UCGGUGUAUGCAACUACAUUAGAAA

132

HPV39/68-A7-3 UACAAUGAAAUACAGCCGGUUGACC

133

HPV39/68-A7-4 UUGUAUGUCACGAGCAAUUAGGAGA

134

HPV39/68-A7-5 GAUGAAAUAGAUGAACCCGACCAUG

SEQ ID NO.

Nombre Secuencia

135

HPV39/68-A7-6 AGCGUGAGACAGCACAGGUACUUUU

136

HPV39/68-A7-7 AGUGCUAUAGAUAGUGAAAACCAGG

137

HPV39/68-A7-8 GUAAAAGAUUGUGCAACAAUGUGUA

138

HPV39/68-A7-9 AAAUUUCCUAAUGCAUUUCCAUUUG

139

HPV39/68-A7-10 GAAAAGACUUGGUGCAGAUUAGACU

140

HPV39/68-A7-11 GACGAGGAUGAAGGAGACAAUGAUG

141

HPV39/68-A7-12 AAGCAUAUCAAGCUAUUGAACUGCA

142

HPV39/68-A7-13 CAUUGUCCUGACUCUAUGUGCAGUA

143

HPV39/68-A7-14 ACACCAGUACCAACAUUUACAGGCA

144

HPV39/68-A7-15 CAGGUUCGUGUUAGUAAUUUUGAUU

145

HPV39/68-A7-16 CACCCUUCAUCAUUUGUAACAUUUG

146

HPV39/68-A7-17 AUAAUCCUGCUUUUGAGCCUGUUGA

147

HPV39/68-A7-18 GAUCCGGAUUUUCUGGACAUUGUUC

148

HPV39/68-A7-19 UGCAAAUGUCUGCAGAUGUGUAUGG

149

HPV39/68-A7-20 CUAAACACAAACGUAAACGUGUGUC

150

HPV59/70-A7-1 GCAACAGAUACAGGUUCAGACUUGG

151

HPV59/70-A7-2 AUUUGUGUACAGGCAGAGCGCGAGA

152

HPV59/70-A7-3 UUAGUCAUCAUCCUGUCCAGGUGCA

153

HPV70-E6E7-1 UAUAAAACCAUGCAAAAGUUGCUUG

154

HPV70-E6E7-2 CCUGCAGAACGGCCAUACAAAUUGC

155

HPV70-E6E7-3 UGCAUGCCAAAAAUGUAUUAAAUUU

156

HPV70-E6E7-4 GACGUAUACGAAGAGAAACACAAGU

157

HPV70-E6E7-5 ACAUUGCAAGAGAUUGUUUUAGAUU

158

HPV70-E6E7-6 CUACACUGCACUUAGUAGUAGAAGC

159

HPV70-E6E7-7 GCAGCUGUUUAUGGAGACACUGUCA

160

HPV70-L1-1 GGGUAUCCCUACCUGAUCCUAAUAA

161

HPV70-L1-2 UAUAAUCCUGACACACAACGCCUGG

162

HPV70-L1-3 CUUCAGAGUUAUAUAUUAAAGGCAC

163

HPV70-L1-4 AUGUAUAUUCCCCUUCCCCAAGUGG

164

HPV70-L1-5 CACGUAGUACUAAUUUUACAUUGUC

165

HPV70-L1-6 CUGUAUAUAGCCCUACAAAGUUUAA

166

HPV70-L1-7 UCUAAACACAAACGGAAACGUGUGU

167

HPV59-E6E7-1 UUAUAGUGUAUAGAGACUGUACACC

168

HPV59-E6E7-2 UUUUAUGCAAGAGUAAGAGAAUUAA

169

HPV59-E6E7-3 UAUUAUAGAGAUUCCGUGUAUGGAG

170

HPV59-E6E7-4 UGCCUAAAACCUCUAUGUCCAACAG

171

HPV59-E6E7-5 ACCACAAAAUUAUGAGGAAGUUGAC

172

HPV59-E6E7-6 CUCCGAGAAUGAAAAAGAUGAACCA

173

HPV59-L1-1 UGGACAUCCAUAUUUUAAAGUACCU

174

HPV59-L1-2 UUCCUAAGGUGUCUGCAUAUCAAUA

SEQ ID NO.

Nombre Secuencia

175

HPV59-L1-3 UGGAUGACACUGAAAACUCUCAUGU

176

HPV59-L1-4 GAUAAUGUAUCUGUGGAUUAUAAAC

177

HPV59-L1-5 UGAAUCACUAUAUAUUAAAGGUACU

178

HPV59-L1-6 UAUUCCCCUUCCCCAAGUGGGUCUG

179

HPV59-L1-7 GUGCAGCGCCUGCCCCUACCUCUAC

180

HPV59-L1-8 UCUUCCAGAAAAUAGUGUUGUUUGU

181

HPV59-na-1 UGUAUUGUUUGCCUGUUUGUAUGUU

182

HPV59-na-2 CCGUUUUGUUCAAUCUGCUGCUGUA

183

HPV59-na-3 AAGACAGCAACGACAAGCGCGUAGU

184

HPV54-E6E7-1 AAGCGGAUGUAGAAAACAGUUAUUU

185

HPV54-E6E7-2 ACGGACCAGCCGCGUACUCUAGCUG

186

HPV54-E6E7-3 UAUGCAUAGUUUGCAACUUCCUUGU

187

HPV54-E6E7-4 GCAGAGAUUUAUGCAUUUCAAUAUA

188

HPV54-E6E7-5 GUGGAGACACGGCUUUCCACAUGCU

189

HPV54-E6E7-6 AAAUAAAUUAUAGAAGGCAUCGCGA

190

HPV54-na-1 UGCAUGGAAAUGUGGCUACAAUUGA

191

HPV54-E6E7-7 GUGGAGGUGUGUGUUGUAAGACAGU

192

HPV54-E6E7-8 CAUAAGGGUACUGCAGGAACUGCUU

193

HPV54-na-2 AAACGAAAGUAUAUAGGCAGUCCGU

194

HPV54-na-3 GAGUUUUAUGGACCUAGCACGGUCC

195

HPV54-L1-1 UUAUUGGCUGUUGGACAUCCAUAUU

196

HPV54-L1-2 UAUUCCUAAAGUAUCAGGAUAUCAA

197

HPV54-L1-3 CUAUAGGUGAACACUGGGCUAAAGG

198

HPV54-L1-4 GCUGGUGACUGUCCUCCUUUGGAAU

199

HPV54-L1-5 GGAUUUUAAAACCCUACAAACCUCA

200

HPV54-L1-6 AUUUGUAAAUAUCCUGAUUACCUUA

201

HPV54-L1-7 GUAGUACUAACCUAACAUUGUGUGC

202

HPV54-L1-8 UUCUGACUUUAGGGAGUAUAUUAGA

203

HPV54-na-4 UAUGCUGCAACUCCUAGUGGCUCUA

204

HPV70/85-A7-1 UAGAUGACAGUGUAUUUGACCUGUC

205

HPV70/85-A7-2 UAUGGGGACAGUAUGUUUUUUUGUU

206

HPV70/85-A7-3 GAGGAAUAUGAUUUACAAUUUAUAU

207

HPV85-E6E7-1 CUACCCGACCCUACAAACUACCAGA

208

HPV85-E6E7-2 AAGAUAUAGAAAUAAGCUGUGUAUA

209

HPV85-E6E7-3 AUAGCGACUCUGUGUAUGGGGAAAC

210

HPV85-E6E7-4 AUGAUAUAUUAAUAAGGUGUUUACG

211

HPV85-E6E7-5 AUAUAAUGAAGUGCAAGAGGUUGAC

212

HPV85-E6E7-6 AGGAAGAAAUAGAUGAACCAGAUAA

213

HPV85-L1-1 AUGACACAGAAAAUUCCCAUGUUGC

214

HPV85-L1-2 GAUAAUGUGUCAGUGGAUUAUAAAC

SEQ ID NO.

Nombre Secuencia

215

HPV85-L1-3 GGGAACAUUGGGCUAAGGGUACUGC

216

HPV85-L1-4 UGUCCUCCAUUAGAACUAGUAAAUA

217

HPV85-L1-5 GAAACUUAUAUAUAAAAGGUACUAA

218

HPV85-L1-6 UAUUCUCCAUCACCUAGUGGGUCUA

219

HPV85-L1-7 CAUCUGCCAUUACAUGUCAGAAGGA

220

HPV85-L1-8 UAUGAAAAAUUAAAGUUUUGGAAUG

221

HPV85-na-1 GUUUUUACUUGCUUUAAUUACACUA

222

HPV85-na-2 ACAAGAAAUAUCGUUAAAUAGCUAU

223

HPV85-na-3 CAAGGGAGCAUGGUCUUAAAACAAU

224

HPV26/69-E6E7-1 GCAGGUACAGUGUGUAUAUUGCAAG

225

HPV26/69-E6E7-2 GUGCCGCAACCCGAAAUUGACCUAC

226

HPV26/69-E6E7-3 GGACUAUGAACAAUUUGACAGCUCA

227

HPV26/69-E6E7-4 GUAAUAGUAUAGUGCAGCUAGCUGU

228

HPV26/69-E6E7-5 GUACAGGGUGGUUUUCAGUAGAAGC

229

HPV26/69-E6E7-6 AGAACAGCCCGUUGCAAGACAUAAC

230

HPV26/69-E6E7-7 AUACUGAAGUGGAAACUCUUACGCC

231

HPV26/69-E6E7-8 AGUGUGUGUAGUCAGGGGGGGUCAA

232

HPV26/69-na-1 UGUGGCAGGCUCUGUAGCAGAAAGU

233

HPV26/69-na-2 AUUUAUCAAAAAUGGUGCAAUGGGC

234

HPV26/69-na-3 GGCAAAAUAUGUAAAAGACUGUGCA

235

HPV26/69-na-4 GACAGCAAUGGGAAUCCUGUAUAUG

236

HPV26/69-na-5 UGGUCCAGAUUAGAUUUGGAGGAGG

237

HPV26/69-na-6 AUCUACCUGGCAUUGGACCAGUAAU

238

HPV26/69-na-7 GUUUGUGCUUUGCGUGUGUGUGUGU

239

HPV26/69-L1-1 CCUUUGAUAAUCCUGCAUAUGAACC

240

HPV26/69-L1-2 GUACUAGUGACAGCAAGGUAUAUCU

241

HPV26/69-L1-3 GAAACAGCAUGUUUUUUUUUCUUCG

242

HPV26/69-L1-4 ACAACACAUCCUGCCUCCUACGCUU

243

HPV26/69-L1-5 AAUAAAACUGCUGUUAGGCACAUAU

244

HPV51/82-E6E7-1 CACUUGGGCCUGAAGAAAAGCAAAA

245

HPV51/82-E6E7-2 GUGUAAUAAAGCCAUGCGUGGUAAU

246

HPV51/82-E6E7-3 AAAUUGACUUGCAAUGCUACGAGCA

247

HPV51/82-E6E7-4 UGGACAGGCUACGUGUUACAGAAUU

248

HPV51/82-E6E7-5 AGCAGCCCAUUAGGAGACAUUACAA

249

HPV51/82-E6E7-6 GAUUACUGGACAGUUAUCCGGACAG

250

HPV51/82-E6E7-7 UGUGGAAGCAACGUUGCAGGUAGAU

251

HPV51/82-na-1 ACAGCCACUAGAGGAUGCUAAAAUA

252

HPV51/82-na-2 GUCCAGAUUAGAUUUGGAGGAGGAA

253

HPV51/82-na-3 UGCCAGGAGAAAAUACUAGACUGUU

254

HPV51/82-na-4 UCAACCUGGCAUUGGACCAGUAAUA

SEQ ID NO.

Nombre Secuencia

255

HPV51/82-na-5 ACAAGCCAAUAUGUGCUGCUAAUUG

256

HPV51/82-na-6 UGUGUGUGUGUCUUGUGUUGUGUUG

257

HPV51/82-na-7 ACAUGCAAAGCUGCUGGUACAUGUC

258

HPV51/82-na-8 UGGAGUGGGUUGGGUAUAUUUUUGG

259

HPV51/82-L1-1 GAACUUGAAAUGCAGCCUUUACUUU

260

HPV51/82-L1-2 UGUCUUCAUCUUAUGCAAAUGUUAC

261

HPV51/82-L1-3 UGGGGAUUACUAUUUGUGGCCCUAU

262

HPV51/82-L1-4 AAACGCCGUAAACGUAUACCCUAUU

263

HPV51/82-L1-5 UCUUCCUCUUCCUCUUCAGCCAAAC

264

HPV30/53-E6E7-1 CCGAAAACGGUACAUAUAAAAGCAC

265

HPV30/53-E6E7-2 GACACCAGAGGAAAAACAGUUACAC

266

HPV30/53-E6E7-3 AUGAGCAAUUGAACAGCUCAGAGGA

267

HPV30/53-E6E7-4 CAAUGGCGUCACCUGAAGGUACAGA

268

HPV30/53-E6E7-5 UAAAACGAAAGUAUUUAGGCAGUCC

269

HPV30/53-na-1 CAGCGGGUAUGGCAAUACUUUGGAA

270

HPV30/53-na-2 ACACAGUCACUUUUGGUUACAACCG

271

HPV30/53-na-3 GAAAGGACAUGGUCCAGAUUAGAUU

272

HPV30/53-na-4 CGUGCCAGGAGAAAAUUCUAGACUG

273

HPV30/53-na-5 UACAAGUGUGUAAAGCAAAGGCAUG

274

HPV30/53-na-6 UAAAGGCACAUGGGAAGUGCAUAUG

275

HPV30/53-na-7 GUAUUUAUUGUCCCGACUCUGUGUC

276

HPV30/53-L1-1 GAAAUACCUAUGCAAACAUUUGCUG

277

HPV30/53-L1-2 CACAGACCUGCCUUUACAACACGUA

278

HPV30/53-L1-3 GGUGGUGUGCGUUUUAGUAGGCUUG

279

HPV30/53-L1-4 AGAAGUGGCAAACAAAUAGGUGCUC

280

HPV30/53-L1-5 GAUGGCCUAUAUGAUAUUUAUGCAA

281

HPV30/53-L1-6 UUCCCUAUUUUCUUGCAGAUGGCGG

282

HPV30/53-L1-7 GCUUAGAGGACAAAUACAGAUAUGU

283

HPV30/53-L1-8 UGUAUGACUGUAUGUAUGUGUAAUG

284

HPV56/66-E6E7-1 CCGAAAACGGUACAUAUAAAAGGCA

285

HPV56/66-E6E7-2 CUCAGAGGAUGAGGAUGAGGAUGAA

286

HPV56/66-E6E7-3 GCGGCCACAGCAAGCUAGACAAGCU

287

HPV56/66-E6E7-4 GCGUUAACAGUAACGUGCCCACUCU

288

HPV56/66-E6E7-5 GCAAGUACAAACAGCACAUGCAGAU

289

HPV56/66-na-1 ACAGACGUUGCAAAAACUAAAACGA

290

HPV56/66-na-2 AUGAAUAUGUGCCAGUGGAUAAAGC

291

HPV56/66-na-3 UGAAGGGGGUGAUUGGAAACCCAUU

292

HPV56/66-na-4 GGAUAACGACGAGGACAAAGAAAAC

293

HPV56/66-na-5 UGUAAAGCAAAAGCAUGUAGUGCAA

294

HPV56/66-na-6 GUCCUGACUCUGUGUCUAGUACCUG

SEQ ID NO.

Nombre Secuencia

295

HPV56/66-na-7 GUAUCCCACAGACCAGGAAAACGAC

296

HPV56/66-na-8 GUUUGCGCUUUGCUUUUGUGUUUGU

297

HPV56/66-na-9 AUAGGCCUGCAUUUACUACACGUAG

298

HPV56/66-L1-1 GAUAUAAGUCCUAUUGCACAGGCUG

299

HPV56/66-L1-2 AGGCGCCGUAAACGUAUUCCCUAUU

300

HPV56/66-L1-3 CUACCUCCAACACCUGUUUCAAAGG

301

HPV56/66-L1-4 UUCUAUGUGGUUUUACUUACGCAGG

302

HPV56/66-L1-5 AUAAACCUUAUUGGUUGCAACGUGC

303

HPV56/66-L1-6 ACGCGUGGUUGCAUAAACUAAGGUG

304

HPV34/73-E6E7-1 UAAUAAGGUGCGGAAAAUGCCAAAA

305

HPV34/73-E6E7-2 GACAACUCAGAGGAUGAGGAUGAAA

306

HPV34/73-E6E7-3 AGAAGAUGGCUGAUUCAGGUAAUUG

307

HPV34/73-E6E7-4 CGGGAUGGUUUAAUGUAGAAGCCAU

308

HPV34/73-E6E7-5 UGGGGGAUUUUAUUGAUAAUGCACA

309

HPV34/73-E6E7-6 AAUGCAGACAAUGAGGCUAUACGUG

310

HPV34/73-E6E7-7 GAUAUGGCAAUACUGAAGUGGAAAC

311

HPV34/73-E6E7-8 UAGUGGGUCCAGUAGCAUUUCAAAU

312

HPV34/73-na-1 UUUAACAGAGGACGACGACAAGGAA

313

HPV34/73-na-2 AAGCCUUGCAGUAUCACGAUCCAAA

314

HPV34/73-na-3 UGUUGCAACCUCCUCCACCCUUAGA

315

HPV34/73-na-4 GCCUCUGGCAGACUUUUAUUUUCAA

316

HPV34/73-na-5 AACAGGUUAAGGUUGUAGACCCUGC

317

HPV34/73-na-6 CAGCACAGUGACUUGCAUAAUGCUC

318

HPV34/73-na-7 UACUAGAAGUGGCAAACGUAUAGGU

319

HPV34/73-L1-1 AAAGGUAUACCUGCCCCCUGUGUCU

320

HPV34/73-L1-2 AAAGUUUCAGGUUUGCAAUACAGGG

321

HPV34/73-L1-3 CUGUUGUAGAUACUACUAGAAGCAC

322

HPV34/73-L1-4 UUUUGGCUUCCUGCAGGCAACUUGG

323

HPV34/73-L1-5 UGCACACACAUUUUUUACCCACCCU

324

HPV6/11-E6E7-1 GAAAACGGUUCAACCGAAAACGGUU

325

HPV6/11-E6E7-2 GACCAGUUGUGCAAGACGUUUAAUC

326

HPV6/11-E6E7-3 ACUGCUGGACAACAUGCAUGGAAGA

327

HPV6/11-E6E7-4 GACCCUGUAGGGUUACAUUGCUAUG

328

HPV6/11-E6E7-5 AGACAGCUCAGAAGAUGAGGUGGAC

329

HPV6/11-E6E7-6 GUUGCUGUGGAUGUGACAGCAACGU

330

HPV6/11-na-7 CGGACGAUUCAGGUACAGAAAAUGA

331

HPV6/11-na-8 CAUUAUGCGACUGUGCAGGACCUAA

332

HPV6/11-na-1 ACAGCCAAAAAAGGUAAAGCGACGG

333

HPV6/11-na-2 GAAAAUGGGGGAGAUGGUCAGGAAA

334

HPV6/11-na-3 GAGGACGAGGAAGAUGGAAGCAAUA

SEQ ID NO.

Nombre Secuencia

335

HPV6/11-na-4 GGCAGCACAGUUAUAUGUUCUCCUG

336

HPV6/11-na-5 CUACUACAUACACCCCCGCACAGAC

337

HPV6/11-na-6 CUAUGGGAACACCCUUUAGUCCUGU

338

HPV6/11-L1-7 ACGCCGUAAACGUAUUCCCUUAUUU

339

HPV6/11-L1-1 UAGCGACAGCACAGUAUAUGUGCCU

340

HPV6/11-L1-2 CAGGCUUUGGUGCUAUGAAUUUUGC

341

HPV6/11-L1-3 CUGUGGUAGAUACCACACGCAGUAC

342

HPV6/11-L1-4 GAGUAACCUAAGGUCACACACCUGC

343

HPV6/11-L1-5 CCACACCCUACAUAUUUCCUUCUUA

B. Diseño de la sonda de inmovilización y detección

Para diseñar las sondas de inmovilización y detección, se alinearon todas las secuencias genómicas de HPV disponibles. A partir de esas alineaciones, se seleccionaron los subgrupos de tipos de HPV relacionados más estrecha5 mente, de acuerdo con una clasificación del árbol filogenético. Estos subgrupos de HPV estrechamente relacionados se volvieron a alinear en grupos más pequeños para las regiones E6/E7 y L1 de longitud completa. Se extrajeron sondas de oligonucleótidos específicas para cada tipo de HPV a partir de las regiones de no consenso de las secuencias realineadas. Se seleccionaron las sondas que tenían de 25 a 32 pb y una Tm de 55°C a 70°C. Las sondas se compararon después frente a otros tipos de HPV presentes en la base de datos del NCBI, utilizando una búsque

10 da BLAST para confirmar su carácter único para cada tipo específico de HPV. Se diseñaron múltiples sondas para cada tipo de HPV. Una lista completa de las sondas generadas de acuerdo con este método se encuentra en la Tabla 2 (a continuación). Para proteger frente a una eliminación o mutación que causaría un falso positivo en el ensayo, se desarrolló una sonda para cada una de las regiones E6/E7 y L1 del genoma de HPV. Esto es especialmente útil para las dianas integradas, ya que algunas regiones se pueden alterar durante la integración.

15 Las sondas de inmovilización se modifican con el fin de facilitar la unión a las perlas de detección. En los siguientes ejemplos, se emplean microesferas Luminex® como perla de detección, las cuales están recubiertas con grupos carboxi para facilitar la inmovilización de las sondas de captura. Por lo tanto, todas las sondas de inmovilización contienen una modificación 5' amino-C12.

En los siguientes ejemplos, se utiliza SA-PE para detectar los ácidos nucleicos capturados. En consecuencia, todas

20 las sondas de detección en los siguientes ejemplos tienen una modificación en la biotina 5' para facilitar la detección mediante SA-PE.

Tabla 2: SONDAS DE INMOVILIZACIÓN/DETECCIÓN ESPECÍFICAS DE E6/E7

TIPO DE HPV

ID DE LA SONDA SEQ ID NO SECUENCIA DE LA SONDA

HPV 2

E6__-2A 344 TGTATGGTGCAAACGGCCGTTATCAGAG

E6__-2B

345 ACATTGCATGAACTGCGGGTCATC

imagen15

imagen16 imagen17

HPV 3

E6__-3A 346 TCTACTGTGCAGAAACACCGGAATAGGA

E6__-3B

347 TACGAAACAGCTGACTACAACTGAACTACAA

E6__-3C

348 TCTGGTCATTGGAGGGGGAGCTGTCAGTAC

E6__-3D

349 CAGCTGACTACAACTGAACTACAAGC

HPV 6

E6__-6A 350 GGCTATCCATATGCAGCCTGCGCGTGC

E6__-6B

351 CAAGACATCTTAGACGTGCTAATTCGG

E6__-6C

352 CAAGACATTTTAGACGTGCTAATTCGG

E6__-6D

353 GGTAAAACATATACTAACCAAGGCGCGG

E6__-6E

354 GGTAAAACATATACTAACCAAGGCACGG

HPV 7

E6__-7A 355 ACAGCTAGAACTTTATTTGAATTATGTG

E6__-7B

356 TAACAGCATTTTACAAACAGCTGAGGTGCTG

TIPO DE HPV

ID DE LA SONDA SEQ ID NO SECUENCIA DE LA SONDA

E6__-7C

357 AGCGTGTGTAAAGTGTTTAGAATTTTAT

HPV 10

E6__-10A 358 TGCAGAAGCTATGTCCATGGGTGCACAGGA

E6__-10B

359 GCTTTTGTGTAGAAATTGTGGAATACCTTTG

E6__-10C

360 GGCAGCATTTGCACTTAGAGAATTAT

HPV 11

E6__-11A 361 GTGTGCCTGTTGCTTAGAACTGCAAGGG

E6__-11B

362 ACTAAAGCACATATTGGGAAAGGCACGC

E6__-11C

363 GAGTGCACAGACGGAGACATCAGACAACTAC

HPV 16

E6__-16A 364 CAGACATTTTATGCACCAAAAAAGAACT

E6__-16B

365 AGTTTGTATGGAACAACATTAGAACAGCAAT

E6__-16C

366 CATAAAGTTACCAGATTTATGCACAGAGC

E6__-16D

367 CGATGTATGTCTTGTTGCAGATCATCA

HPV 18

E6__-18A 368 GCTACCTGATCTGTGCACGGAACTGAACA

E6__-18B

369 GCAAGACAGTATTGGAACTTACAG

E6__-18C

370 CCGAGCACGACAGGAACGACTCCAACGACGC

HPV

E6__-26A 371 AGAGAACGACCCAGAACGCTACATGAGC

26

E6__-26B 372 TGCAATTTGTGACCTAAGAGTAGTATATAGAG

E6__-26C

373 ACGTTCGAGTGCTGGAGCAGATGTTAATGGAA

E6__-26D

374 TCCTTGGTGTGCCATCAGTGTGCTGCACAGT

HPV 27b

E6__-27A 375 ACACTGCATGCAGTGCGGGTCAAC

E6__-27B

376 GCGTGTATTGCAGACGAGCGCTTTCAGAC

E6__-27C

377 GCGTGTATTGCAGACGAGCGCTTTCAGAC

E6__-27D

378 AGCGCTTTCAGACGCTGATGTATT

E6__-27E

379 AGCGCTTTCAGACGCTGATGTATT

HPV 28

E6__-28A 380 GCACTGCATATTCTGCGCCAAAGTGC

E6__-28B

381 GCCAAAGTGCTGACCACAGCGGAGCTAT

E6__-28C

382 ACTGCAGGGCATTGTGCGACGCCTGAAGCAC

E6__-28D

383 TGCATAGCTGGCTACTGGAGAGGGAGCTGTC

HPV 29

E6__-29A 384 CAGCCCAGAACTGGCAGCATTTTGC

E6__-29B

385 CGCTGCTTATTGTTTGAAGGCATAAAGC

E6__-29C

386 GTGCCACAAGCCACTTGTCAGAGAGG

E6__-29D

387 CAAAATTTCTGGATACTGGAGAGGGAGTTGC

HPV 30

E6__-30A 388 GCACCATCTTTGTGAGGTACAAGAAACATCG

E6__-30B

389 CAAGAAGGAATTATCCAGCTCAGAGG

E6__-30C

390 GACTGGTATATAGGGAGGACAGCCCA

E6__-30D

391 CACAACGTCCACTGAGACAGCAGTATAAT

E6__30-E

392 CTGCGTGCCCTACAACAGATGCTTATGGGC

HPV 31

E6__31A 393 CTACTGCAAAGGTCAGTTAACAGAAA

E6__31B

394 CTACTGCAAAGGTCAGTTAACAGAAACA

E6__31C

395 TTGACAAACAAAGGTATATGTGATTTG

E6__31D

396 AAAAAGAAACGATTCCACAACATAGG

TIPO DE HPV

ID DE LA SONDA SEQ ID NO SECUENCIA DE LA SONDA

HPV 32

E6__-32A 397 ACCACTTAACCAGTGCTGAAGCGTATGCA

E6__-32B

398 GCATACAGTAGAACAAGAAACAGGACTACTG

E6__-32C

399 CCTGCCAACGTGTGACCCGACAACGTGC

E6__-32D

400 GCCAGTGTAGTAACCGGGGAAACACC

imagen18

E6__-33A 401 CTGTGTTTGCGGTTCTTATCTAAAATTAGTG

imagen19

E6__-33B 402 CACAACATTGAACTACAGTGCGTGGAATGC

imagen20

E6__-33C 403 ATTATTCTGTATATGGACATACATTAGAACA

imagen21

E6__-33D 404 ATTATTCTGTATATGGAAATACATTAGAACA

imagen22

E6__-33E 405 TGTAAAAACGCCATGAGAGGACACAAGCC

HPV 33

E6__-33F 406 ACACAACATTGAACTACAGTGCGTGGA

E6__-33G

407 ACACCACATTGAACTACAGTGCGTGGA

imagen23

E6__-33H 408 ATTATTCGCTATATGGAGAAACATTAGAACA

imagen24

E6__-33I 409 CAGGATATAAATCTAAAACATATTC

imagen25

E6__-33J 410 CAGGATGTAAATCTAAAATATATTC

imagen26

E6__-33K 411 ATCTGCAAATGCAAAATCATATACCTCAG

imagen27

E6__-33L 412 ATCTGCAAATACAAAGTCATATACCTCAG

HPV 34

E6__-34/64A 413 CAGCCTTATGTGAAGAGGTCAACATTTCA

E6__-34/64B

414 GCAGGACATTGTGTTAGATCTGAAACCAACG

E6__-34/64C

415 CACACGCTGACCTATTAGTGTTAGAAGACC

HPV

E6__-35A 416 AGAAGGCCAGCCATATGGAGTATGCATG

35

E6__-35B 417 GAAGAAAAAAAACGATTCCATAACATCGG

E6__-35C

418 ACAGAGCACACACATTGACATACGTAAATTGG

HPV 39

E6__-39A 419 TGCAGACGACCACTACAGCAAACCGAGG

E6__-39B

420 GCAGACGACCACTACAGCAAACCGAGG

E6__-39C

421 CCAGCAGAAAAATTAAGACACCTAAATAGC

E6__-39D

422 AAGAGAAACCCAAGTATAACATCAGATATGCG

E6__-39E

423 CTAACACGAAGAGAAACCCAAGTATAACATC

HPV 40

E6__-40A 424 CAGGCCAGGACCCTGTATGAACTGTGTG

E6__-40B

425 AAGACGGTCCTAAAAACAGCTGAGGTACTG

E6__-40C

426 CGCATGTCCACGGTGCCTGGACCTGCAC

HPV 42

E6__-42A 427 GCACTTAACAGGCGCAGAGGTGCTCGCG

E6__-42B

428 GTATACAGTGGAGAAAGAAACTGGACTACTT

E6__-42C

429 GTACAGCAGACACAGGTAGAACACGGAC

HPV 43

E6__-43A 430 CTTTGACTACGCAGCATATGCAGATACTGT

E6__-43B

431 CAGTGTTTGATTTGTGCATTAGATGC

E6__-43C

432 ATCACCAGTGGAAAAAGTACAGCATA

E6__-43D

433 GCACATCCTGTCTGTGTGTAATTCGAC

HPV 44

E6__-44A 434 GAAAAACGTTAAGTACTGCAGAGGTTT

E6__-44B

435 TAAGTCAATTCTGGACGTGCTGATACG

E6__-44C

436 CCACCTGTGGTACATGTAGTCGGAAGG

TIPO DE HPV

ID DE LA SONDA SEQ ID NO SECUENCIA DE LA SONDA

HPV 45

E6__-45A 437 GCATTACAGGATGGCGCGCTT

E6__-45B

438 CCATTGAACCCAGCAGAAAAACG

E6__-45C

439 GTAGAGAGCTCGGCAGAGGACCTTAGAACAC

HPV 51

E6__-51A 440 GAAGCTTTGAACGTTTCTATGCACAATATA

E6__-51C

441 CAAAAATTAGAGAGTATAGACGTTATAGCAGG

E6__-51D

442 ATGCGCTAATTGCTGGCAACGTACACGAC

imagen28

E6__-52A 443 GAGGATCCAGCAACACGACCCCGGACCC

imagen29

E6__-52B 444 GGCTGCAGTGTGTGCAGTGCAAAAAAGAGC

imagen30

E6__-52C 445 CCATATGGCGTGTGTATTATGTGCCTACGC

imagen31

E6__-52D 446 GATGAGGAGGATACAGATGGTGTGGACCG

imagen32

E6__-52E 447 GAGGATCCAGCGACACGACCCCGG

HPV 52

E6__-52F 448 AGGCTGCAGTGTGTGCAGTGCAAAAAAGAGC

E6__-52G

449 AGGCTGCAGTGTGTGCAGTGTAAAAAAGAGC

E6__-52H

450 TGTGCAGTGCAAAAAAGAGCTACAACGAAGA

imagen33

E6__-52I 451 GGAAAACATTAGAAGAGAGGGTAAAAAAACCA

imagen34

E6__-52J 452 GGAAAACATTAGAAGAGAGGGTAAGAAAACCA

imagen35

E6__-52K 453 GGAAAACATTAGAAGAGAGGGTAAAAAGACCA

imagen36

E6__-52L 454 GGAAAACATTAGAAGAGAGGTTAAAAAAACCA

imagen37

E6__-52M 455 GGAAAACATTAGAAGAGAGGGTCGAAAAACCA

HPV 53

E6__-53A 456 TATATAATTTTGCATATACAGATCTAAGAG

E6__-53B

457 GCAAGAAGGCATTGACAGCGTCAGAGG

E6__-53C

458 GTATAGAGACGGGTATCCGTATGG

E6__-53D

459 ATGGTATAGAGACGGGTATCCGTATGG

HPV 54

E6__-54A 460 GGGGGCAATGTCTGCTACTGAACCCCAC

E6__-54B

461 GCCTTTTGCAAGAAGACGGTGTGTACA

E6__-54C

462 GCTTGTGCACTGTGCCTAGAACTGCACGGGC

E6__-54D

463 ACGGCTATGTGTGTATAGCACGCACACAGG

E6__-54E

464 GGGGGCAATGTCTGCTACTGAAC

E6__-54F

465 GACGGTGTGTACAGCAGATATTTATGCA

HPV 55

E6__-55A 466 TAAATTACAGAATACCTGGAAGGGTCG

E6__-55B

467 CCACCTGTGGTACATGTAACCGGAACG

HPV 56

E6__-56A 468 TTGCAAAAAAGAACTAACACGTGCTGAGG

E6__-56B

469 AGTGTATAGGGATGATTTTCCTTATGC

E6__-56C

470 AACATCTAGAGAACCTAGAGAATCTA

E6__-56D

471 GAACTAACACGTGCTGAGGTATATAAT

HPV 58

E6__-58A 472 GCAATAAACACCATCTGCAATGGATGACC

E6__-58B

473 imagen38

HPV 59

E6__-59A 474 GTATGCAGCGTGTCTGAAATGCATTTCA

E6__-59B

475 GAACATTAGAGGCTGAAACCAAGACACC

E6__-59C

476 CATGAGCTGCTGATACGCTGTTATAGA

TIPO DE HPV

ID DE LA SONDA SEQ ID NO SECUENCIA DE LA SONDA

E6__-59D

477 CTTGTGTGCTACGAGCAATTACCTGACTCCGA

E6__-59E

478 AACATTAGAGGCTGAAACCAAGACACC

HPV 61

E6__-61A 479 CCGTAGGGTCAGCAAAGCACACTCATCTAT

E6__-61B

480 GCAGCAAACCGTTAAGTATACAGG

E6__-61C

481 AGCAAACCGTTAAGTATACAGGAAAAGGAGC

E6__-61D

482 GCTACATGAACTACTGCTGGGCGACTTGTCC

HPV 62

E6__-62A 483 TGTGGACCTGGACGACCTGCACCTA

E6__-62B

484 ACGGCGGTGGCAGCACTCATGCTTT

E6__-62C

485 GGAAAAGGAGTATCAGGTAGAGAGGGG

HPV 66

E6__-66A 486 GATTCCATATTCAGCAATACACAGGAA

E6__-66B

487 GATCCCATATTCAGCAATACACAGGAA

E6__-66C

488 CAAAAAGGAACTTACAAGTTTAGAGC

E6__-66D

489 AGTATATAGAAACAATTGGCCATATGC

E6__-66E

490 CCGGAGTATGGGGCAACATTAGAAAGTA

E6__-66F

491 GTATGGGGCAACATTAGAAAGTA

E6__-66G

492 TATATAGAAACAATTGGCCATATGC

E6__-66H

493 ATTAGTATATAGAAACAATTGGCCATATGCAG

HPV 67

E6__-67A 494 CGGTAAATATATAAAGCACACCAGTGTCCA

E6__-67B

495 CAGTGCAAGAAATATGTTTCAGGACACAGA

E6__-67C

496 AAGTTTGCCCTGCGTGCAGTGCAAAAAAA

E6__-67D

497 CATTCACAGTACAGCAGCAGACGTCCGAAC

HPV 68

E6__-68A 498 GCAGAAGGCAACTACAACGGACAGAGG

E6__-68B

499 TCAAGAAACACAAGTTTAAGTAACTATGCA

HPV 69

E6__-69A 500 CGTCCGAGCGGTGGAGCAGCTGCTGATGGGC

E6__-69B

501 GAGTTTGGTGTGCCACCAGTGTGCTACATAC

E6__-69C

502 GAGTTTGGTGTGCCACCAGTGTG

E6__-69D

503 ACGTCCGAGCGGTGGAGCAGCTGCTG

HPV 70

E6__-70A 504 CCCATACGGAATGGCGCGATTTCCCAAT

E6__-70B

505 ATAGTATATAGAAACGGGGAGCCATATGC

E6__-70C

506 ATAAATATAAATATGCATGGACCACGGCCG

E6__-70D

507 CTCACAAGAGAACCTGCGATCTCTACT

E6__-70E

508 ACAAGTATAAATATAAATATGCATGGACCACG

HPV 71

E6__-71A 509 GTTTGCTGCATGTGCCTGCTGTTTGGAAAT

E6__-71B

510 TAGACACCGGAACGCCAGTTACAGAGCAAC

E6__-71C

511 AGAAAGAATAATTACAGAAGGCAGGCG

HPV 72

E6__-72A 512 ACGATACTGGACGTATTCGGGCTACGG

E6__-72B

513 GTCAGGAAAAGGAATATCAGGTGCAGACAGG

E6__-72C

514 ATGAGAGGGACGGTGTTGGTGTGCAG

HPV 73

E6__-73A 515 AACCTGGACTGTGTGTTTTGCCAACGTGG

E6__-73B

516 GTATAGGCGATATAGACAATCAGTATATGGCA

TIPO DE HPV

ID DE LA SONDA SEQ ID NO SECUENCIA DE LA SONDA

E6__-73C

517 ACTTTAGACCTGAAACCAACAACCGAAAT

E6__-73D

518 ACAAAGCTGATTTAAGAGTGATAGAAGAGT

HPV 74

E6__-74A 519 CCATTTGCAGCGTGCGCCATTTGCTTA

E6__-74B

520 AAACTAGGCGACACCTGGAAAGGGCGCTGC

E6__-74C

521 GTGCAGTGTACAGGACCAGACATCAACAAT

HPV 81

E6__-81A 522 GCTGGGGCCAGCAAATCCTACCAATTTGTTT

E6__-81B

523 CGCAGCGTGCTTGTGCAGAGAAGCTAAAGTAC

E6__-81C

524 GCGGCGGTGGCAATATTCGTGCTTCGGACCA

HPV 82

E6__-82A 525 CCACAAGTAAAGGACATAGTGTTGGAG

E6__-82B

526 GGTGGTGGACGACAAAAAAAGGTTTCAT

E6__-82C

527 GCCTGGTGGGCCCGTGTTGCGCGAACAACT

HPV 83

E6__-83A 528 CCACTGGCACAGCTGTATATACGATGCCAT

HPV 84

E6__-84A 529 TGTGCTGTGCCAGGAATACGAGGTGGAGTTCGACG

E6__-84B

530 AGGAAGAATTAACGGAAGGCGAAGTGC

E6__-84C

531 GTAAAGGAATTACTAATTGTTTGGAGG

HPV 85

E6__-85A 532 CCTATGCAACACACTGGACACATCACTGC

E6__-85B

533 GTTAGAAAAACTAACAAATAGCAATATAT

E6__-85C

534 CTGTATTGCTATGAGGAATTAAACAACTCAG

E6__-85D

535 GACCTATGCAACACACTGGACACATCACTGC

HPV 86

E6__-86A 536 CTAAAGGAATTATTACTGGTCTGGAAA

E6__-86B

537 CAAGACACAGGCGTATCATTGGCACACTT

E6__-86C

538 CTGCATATGGTGGAATTAAATCTGCAT

HPV 87

E6__-87A 539 TTAAGGGAATTATTGCTGGTGTGGAGA

E6__-87B

540 GGGAATTATTGCTGGTGTGGAGATTTGG

E6__-87C

541 GAGCATATGATACACGCGAATCTGCAC

HPV 89

E6__-89A 542 ATATTGCACCAAGGAGCTTACAAC

E6__-89B

543 GGCAGCTGCCCCATGGTGTATGTGCACCG

E6__-89C

544 CGGCCGCACGCCGACCATCCAGGAT

E6__-89D

545 CGTGTGGTGTGTGCTATCGTGCAGTTAGG

HPV 91

E6__-91A 546 GTACGCGGCATTAGCAGTAACAGTAGAG

E6__-91B

547 CGAGTGCACCTCTTGTTATTGTTCAATTCGT

E6__-91C

548 GCACCTCTTGTTATTGTTCAATTCGTC

HPV

E6__-94A 549 GTGCTGCGTGTTCTGCACCAAACAGC

94

E6__-94B 550 CGTGTTCTGCACCAAACAGCTGACCGTAGCC

E6__-94C

551 CAGCTGACCGTAGCCGAATTGACTGC

E6__-94D

552 CTGGAGAGGGTGTTGTGCTTATTGCTGGACAC

Tabla 3: SONDAS DE INMOVILIZACIÓN/DETECCIÓN ESPECÍFICAS DE L1

TIPO DE HPV

ID DE LA SONDA SEQ ID NO SECUENCIA DE LA SONDA

HPV 2

L1__-2A 553 CGATGCTGATTTGTATGATCCAGATACCCA

L1__-2B

554 TCAGTTCCAACTCCAGGCAGTCATGTT

L1__-2C

555 CAAGCGCGCCGCTGTTTCGGGGACCACGC

L1__-2D

556 TCCCTGACCTTTTGGGATGTGGATCTCAGT

HPV 3

L1__-3A 557 CCCCAAATCTTCTAATTCCAAGATGGATATT

L1__-3B

558 AGCAGAATGCGTCACCGGGTGATTGT

L1__-3C

559 TCTAGAGCTTATTACTGCACCTATACAAG

L1__-3D

560 GTTGTACATTAAAGGTGACAGTCAGAGCGGC

HPV 6

L1__-6A 561 AACAGTGTACTAATACACCTGTACAGGC

L1__-6B

562 TCCTATTGACATATGTGGCACTACATGT

L1__-6C

563 TATAATTAAGGGTAGTGGAAATCGCACGT

L1__-6D

564 GCTGCCCCTAAACGTAAGCGCGCC

HPV 10

L1__-10A 565 GGAACCCACCTGCACAGGGCGATTGCCC

L1__-10B

566 CAACGGTGGGGGGCGAGACGTTGGTA

L1__-10C

567 TACCAATATGTGCTTGTGTGTTCCTTCT

L1__-10D

568 GCCTCCCCTGCCACTACGTATGACGCC

HPV 11

L1__-11A 569 TTCATCCCTGTTTGACCCCACTACACAG

L1__-11B

570 AGTGGTGGGTATGGTGGTAATCCTGGTCAG

L1__-11C

571 GGGTACACAATGTTCAAATACCTCTGTACAAAA

L1__-11D

572 TGTTCCCCTTGATATTTGTGGAACTGTCTGC

HPV 16

L1__-16A 573 AACATCCAGACTACTTGCAGTTGGA

L1__-16B

574 ATTTTACAATCCAGATACACAGCGGCTG

L1__-16C

575 AGCAAATGCAGGTGTGGATAATAGA

L1__-16D

576 TCCCCATGTAACAATGTTGCAGTAAATCCA

HPV 18

L1__-18A 577 GCAGGTGGTGGCAATAAGCAGGATA

L1__-18B

578 GGCCTGTGCTGGAGTGGAAATTGGC

L1__-18C

579 CCATGCCGCCACGTCTAATGTTTCTG

L1__-18D

580 GTCTCCTGTACCTGGGCAATATGATG

HPV 26

L1__-26A 581 CCTGCAATAGTTGTGCATGGGGATA

L1__-26B

582 TGGCCAAAAGGCCGAAATTCCTAAG

L1__-26C

583 GACACTGACAACAGGGACAATGTTTCA

L1__-26D

584 GGAGCCCCCTACATCTTCTATTTAT

L1__-26E

585 AAACCTGCAATAGTTGTGCATGGGGATA

L1__-26F

586 GGCGGGGGCTGTTGGGGATGCTATA

L1__-26G

587 GGGGGCTGTTGGGGATGCTATA

L1__26H

588 ACTGGCCAAAAGGCCGAAATTCCTAAG

L1__-26I

589 ATTAAAGGTGCTGAATCAGGCAGGGAGCCC

L1__-26J

590 imagen39

L1__-26K

591 CACTAACTTACCTGCAATAGTTGTGCATGGGGATA

TIPO DE HPV

ID DE LA SONDA SEQ ID NO SECUENCIA DE LA SONDA

HPV 27

L1__-27A 592 AAAACGCACCGCTGTTGCGGGGGCGGCGG

L1__-27B

593 AGCTGAGGTGTCTGATAATACTAATTATAAA

L1__-27C

594 ACTATCTCGGACCCCGGCAGTCATGTG

L1__-27D

595 GGTAGCAATAATAGGTTGGCAGTGCCTAAGGTG

HPV 28

L1__-28A 596 ATCATCCACTAACAAAGCAGATGTGCCCAAA

L1__-28B

597 GTCAAAATACACAACAGGGAGATTGCCCTCCG

L1__-28C

598 TATTACAGGCCAATAAATCGGACGTGCCCT

L1__-28D

599 CAGGGCAACGGGAGGGATGTGATTGGT

HPV 29

L1__-29A 600 ACATTATTCAATTCCCAAATCCTCTGGTA

L1__-29B

601 GGAGGTAGGTCGAGGGCAACCTCTCGGTGTC

L1__-29C

602 CACTGTGTGTGCACGCACTAGTTCCGCTGC

L1__-29D

603 GTTGTGTGCTACCACAGAGTCTCAACCGTTG

HPV 30

L1__-30A 604 GCCCCTCAGGCCCCATTTGACACTACA

L1__-30B

605 GGCTGGTAATTCCAAAACAGATGTT

L1__-30C

606 AAATAACAGGGATCCCCCGCCAAGCTCA

L1__-30D

607 TTCCTTACTATTTATTGTGCATGAATGTATG

HPV 31

L1__-31A 608 CAGTGCTAGGCTGCTTACAGTAGGC

L1__-31B

609 GACAATCCTAAAAAAATAGTTGTACCAAAGGTG

L1__-31C

610 CCGGTGGTCCTGGCACTGATAATAGG

L1__-31D

611 TAGTCCTTGTAGTAACAATGCTATTACCCCT

HPV 32

L1__-32A 612 GCCATTAGATATTATGAACTCCATTAG

L1__-32B

613 GGACATGTATATAAAAGCTTCTAATGG

L1__-32C

614 TATCCAACTCCCAGTGGTTCTATGGTCA

L1__-32D

615 CTGAAGACACATACAAGTCTACTAAC

HPV 33

L1__-33A 616 GCTAAAAAATTATTGGTACCCAAAGTATCA

L1__-33B

617 AGTATCCTGGACAACCGGGTGCTGATAAT

L1__-33C

618 CTTGGATGTAAGCCTCCAACAGGGGAA

L1__-33D

619 CACATCCACCCGCACATCGTCTGCA

HPV 34/ 64

L1__-34/64A 620 ACTAATGGGAAACGTAAGATTGCTGTA

L1__-34/64B

621 GTGGAAACATAGCAGATAGTAGGGAG

L1__-34/64C

622 AGGTACTGTAGGCGATGCTATTCCAGATGACT

L1__-34/64D

623 GTCTGCACCTTCATCATCTAGTACAG

L1__-34/64E

624 AAAGTGGAAACATAGCAGATAGTAGGGAG

HPV 35

L1__-35A 625 CAGTTCTAGGCTATTAGCTGTGGGTCAC

L1__-35B

626 GCAGTACCCAAGGTATCTGGTTTG

L1__-35C

627 ATCATTTTATGATCCCTGCCTCCAGCGTT

L1__-35D

628 AAATATGTTGGTAACTCTGGTAACTCTG

HPV 39

L1__-39A 629 ATATAGGGTATTTCGCGTGACATTGCCC

L1__-39B

630 AAAGGCATGCAAGCCCAATAATGTATCTA

L1__-39C

631 ACGTGCAAACCCCGGTAGTTCTGTATACTG

TIPO DE HPV

ID DE LA SONDA SEQ ID NO SECUENCIA DE LA SONDA

L1__-39D

632 CAGTTTGGTAGACACTTACAGATACC

HPV 42

L1__-42A 633 CAAAAAGGCCAAATAAGACATCTATCCCCAAA

L1__-42B

634 TAATTTATATAACCCAGATACGCAGCGCA

L1__-42C

635 ACATATGGTGGAGGCCCTGGTACAGAC

L1__-42D

636 ACTGTCTGTAGGTAAACGAAAGGCGTCTAC

HPV 45

L1__-45A 637 GTACCTAATGGTGCAGGTAATAAACAGGCTG

L1__-45B

638 GTTTAGAGTAGCTTTACCCGATCCT

L1__-45C

639 TTGGGCATGTGTAGGTATGGAAATTGGT

L1__-45D

640 GCTCATGCAGCTACAGCTGTTATTACGC

HPV 51

L1__-51A 641 CCAAGCATTCTATTGTTATACTAGGTGGGG

L1__-51B

642 CTCAACGCGTGCTGCTATTCCTAAA

L1__-51C

643 GTAATGGCCGTGACCCTATAGAAAG

L1__-51D

644 TATGTTAGTTTTTGTATGCTTGTGCACACT

L1__-51E

645 TTAACTATTAGCACTGCCACTGCTGC

L1__-51F

646 AACCTCAACGCGTGCTGCTATTCCTAAA

L1__-51G

647 AACCTCAACGCGTGCTGCTATTCCTAAAGTA

HPV 52

L1__-52A 648 TATTAAAAACACCAGTAGTGGTAATGGT

L1__-52B

649 AATATGCTGGTAAACCTGGTATAGATAAT

L1__-52C

650 AACCCCTTGTAATAATAATTCAGGAA

L1__-52D

651 CCTACAGCTCATTAACAGTGTAATAC

HPV 53

L1__-53A 652 ATAGCTATTCAGGATACTGCCCCGGAC

L1__-53B

653 CCCATTGGAACTTATCAATTCACCTATT

L1__-53C

654 CGTTATTGGTGAGGAAATACCTAATGAC

L1__-53D

655 CTTTCCGCAACCACACAGTCTATGTC

HPV 54

L1__-54A 656 TTAAAGTACAAAAAACCAATAATAAGCAAAG

L1__-54B

657 CAACCTATGTACACCTAATACATTGGCT

L1__-54C

658 AGTGAGGTACCCCTTGATGTAGCTACCTCA

L1__-54D

659 TACAGCATCCACGCAGGATAGCTTTAATAA

HPV 56

L1__-56A 660 GACTAAGGACAATACCAAAACAA

L1__-56B

661 GTACTGCTACAGAACAGTTAAGTAA

L1__-56C

662 GCCAGTGGCCACCAGCCTAGAA

L1__-56D

663 ACTAGGTCAAAGCCTGCTGTAG

L1__-56E

664 AAAATCTGCTCCTACCTCCACCTCTACAC

L1__-56F

665 ATCTGCTCCTACCTCCACCTCTACAC

HPV 57

L1__-57A 666 GAGCTCTAGGCTCCTCACAGTAGGCCAT

L1__-57B

667 GAAAAATAGCACTAATAAGGTGTCTGTA

L1__-57C

668 CAACCTCTATGATCCCGACACCCAGCGTCTG

L1__-57D

669 TGTCAAAAGTTCTACCGTCCAGACCCCCGGT

HPV 58

L1__-58A 670 CAGTTCCAGACTTTTGGCTGTTGGCA

L1__-58B

671 CAGATATCCCGCACAGCCAGGGTCT

TIPO DE HPV

ID DE LA SONDA SEQ ID NO SECUENCIA DE LA SONDA

L1__-58C

672 CCCGGATGACCTTTATATTAAAGGG

L1__-58D

673 ATTACACTAACTGCAGAGATAATGAC

HPV 59

L1__-59A 674 AAAGGTGGTAATGGTAGACAGGATG

L1__-59B

675 AGCATCTGCTGTTGATACCAAAGATACACGT

L1__-59C

676 GACATACGTGCCAACCCAGGCAGTTATTTA

L1__-59D

677 CCCATCACCAAAACGTGTTAAGCGTCGCAAG

HPV 66

L1__-66A 678 CCGTGAAATCAATCAATACCTTCGC

L1__-66B

679 CATTCCTACAGATTTGTATTGGAAGGGTG

L1__-66C

680 TAGACCCCCTAGACCCAAGGCTAGT

L1__-66D

681 AAAGCACATTAACTAAATATGATGCCCGTG

HPV 67

L1__-67A 682 TATTAGTGGACATCCATTACTTAATAAG

L1__-67B

683 ATAATAAATACCCTAGCCAGCCTGGTA

L1__-67C

684 ACCTACAGATTTGTATTTTAAGGGATCT

L1__-67D

685 CACCTTCTTCTTCCTCTTCCTCCTCTG

L1__-67E

686 GGTAATTGTATGACTGTTGTGTGT

HPV 68

L1__-68A 687 AGTGTTCCTGAGTCTACATTATATAATCCA

L1__-68B

688 ATAAAAATCCTAAAGACAGTAGGGAC

L1__-68C

689 CTTGTAGATACATACCGCTACCTACAA

L1__-68D

690 GGACCAATTCCCATTAGGACGCAAA

HPV 69

L1__-69A 691 TCTGGTTCAACAGCAGAAATTCCTAAAGTG

L1__-69B

692 CTCTCGATTATTAACTTTGGGTCATCCC

L1__-69C

693 CTGCTAATGCAGACACTGATAATAGGGAC

L1__-69D

694 TAAAAATGCACAGTCTCAGGTACAGCGTGGC

HPV 70

L1__-70A 695 GTTTGGCCTTCCGGATCCTTCCCTT

L1__-70B

696 GGATATACGTGAGCGTCCTGGTACTC

L1__-70C

697 TGCCTGCACCGAAACGGCCATACCTG

L1__-70D

698 GTCAGCTAAATCGTCTTCCTCAGCC

HPV 73

L1__-73A 699 CTGGACAAAATACAGATGGTAGAGAA

L1__-73B

700 ACTTCACAAACTGTTAATACTGGTGAT

L1__-73C

701 TGGTGATACCGGTGATAAAATCCCAGATGACC

L1__-73D

702 GGCTAGTAGCTCTACTACAACGTATGCC

HPV 82

L1__-82A 703 ACCAGTACACGTGCTGAAATACCTAAG

L1__-82B

704 CCCTTTAGATATAGCTCAGTCCGTGTGT

L1__-82C

705 GCATTACTATAATAGGGCCGGTGTGGTT

L1__-82D

706 TACTGGTACTGGCCGTGACCCTATTGG

HPV 84

L1__-84A 707 ACTAATGTGCAATATCGTGCGGGTGATTGC

L1__-84B

708 TTTGGATCTCTGCACCACTACCTGT

L1__-84C

709 TCAGTCTTTTTACCTTAAGGGG

L1__-84D

710 GGGCCGCCGCCGCCAAGCCTAAGGAC

HPV 85

L1__-85A 711 TACTTCTGTAGTTACACACGACACTAGA

TIPO DE HPV

ID DE LA SONDA SEQ ID NO SECUENCIA DE LA SONDA

L1__-85B

712 CTGTAAGCCCGGTGCTGTGCAAACAGGTGAC

L1__-85C

713 TGATAGGGCAACACCTGGAAGCTGTATT

L1__-85D

714 TGTGGTTGTTCCACAAAAAAAGGATCCA

HPV 86

L1__-86A 715 CCTGTTACTGTTTCCTCCAGCCCTGGAC

L1__-86B

716 AAACCAGGGGACTGCCCCCCATTA

L1__-86C

717 CTCCACAAGTTTGGAGGATACCTACCGT

L1__-86D

718 GGTGTTTTGGGAGGTTGACCTT

HPV 87

L1__-87A 719 CAAGACAGGGGATTGTCCACCATTGCAA

L1__-87B

720 CGAAAAGTTACAGGAAAACAAGTCC

L1__-87C

721 CTATTTTTTGAAGGGGGCGTCGTCT

L1__-87D

722 TAACAAACCCTATTGGCTGCAGCGGG

HPV 94

L1__-94A 723 GGCCGGTGGTGACCAAAACGTTGGTAG

L1__-94B

724 TGTGCGTCCCTTCTGATGCCTCCACCGCC

L1__-94C

725 CCATCTCTGTCCGCAAACGCTCGGCGACCG

L1__-94D

726 GGCCGGTGGTGACCAAAACGTTGGTA

C. Purificación de la muestra a través de la captura de híbridos.

Frotis cervicales clínicos, muestras de citología de base líquida y orina, todos ellos han sido sometidos a ensayo con los métodos descritos en el presente documento y se ha determinado que eran compatibles. En principio, se podría 5 utilizar cualquier tipo de muestra.

Una parte alícuota de 50 μl de una muestra se coloca en un pocillo de una placa de hibridación de poliestireno y se mezcla con 25 μl de agente de desnaturalización alcalino (DNR) disponible en Qiagen Gaithersburg, Inc. (Gaithersburg, MD). La placa se sella y se agita para mezclar, a continuación, se incuba a 57,5°C durante 15 minutos con agitación a 900 rpm, para desnaturalizar los ácidos nucleicos en la muestra.

10 Después de la desnaturalización, una mezcla de sondas de purificación, en donde cada una comprende las sondas de purificación preparadas en el Ejemplo 1 en NextGen PD con baja viscosidad, se añade a cada reacción hasta una concentración final de 1 nM. La placa se agita para neutralizar. Se prepara 0,02% de reserva de perlas paramagnéticas sólidas en bloqueador YT, 25 μl de la misma se añade a cada reacción. La placa se cubre entonces con un sellador transparente y se incuba a 57,5°C durante 30 minutos con agitación a 900 rpm.

15 D. Amplificación

La placa resultante del Ejemplo 1(C) se coloca sobre una rejilla magnética durante 2 minutos. Se decanta el material sobrenadante y luego la placa se seca con papel absorbente limpio con poca pelusa, como Kimwipes® (Kimberly-Clark Worldwide, Inc.). Las perlas se lavan cuatro veces, mediante la adición de 120 μl del tampón de lavado de la amplificación del genoma completo (WGA) (disponible en Qiagen Gaithersburg, Inc. (Gaithersburg, MD)) en cada

20 pocillo, se espera 1-2 minutos, se decanta y se realiza una transferencia. El tampón de lavado se extrae mediante un multicanal de pequeño volumen. A continuación, se añaden 20 μl de mezcla de reacción de WGA (indicada en la Tabla 3 siguiente) a cada pocillo.

Tabla 3

Mezcla de reacción de WGA con mezcla de RXN REPLI-g Midi de QIAGEN

Reactivos

Rxn (1X)

Tris-HCl, pH 7,5

imagen40 50 mM

MgCl2

imagen41 15 mM

(NH4)2SO4

imagen42 10 mM

KCl

imagen43 50 mM

dNTP

imagen44 4 mM total

imagen45

imagen46

Claims (1)

1. imagen1

   imagen2

   imagen3