ES2608841T3 - Vacunas contra la gripe con cantidades reducidas de escualeno - Google Patents

Abstract

Una vacuna contra el virus de la gripe para su uso para provocar una respuesta inmunitaria en un paciente de 6 a < 36 meses de edad que comprende: (i) la hemaglutinina de al menos dos cepas del virus de la gripe A y al menos dos cepas del virus de la gripe B, en laque el concentración de hemaglutinina por cepa es al menos 25 μg/ml; y (ii) un adyuvante en emulsión de aceite en agua con gotas de aceite submicrónicas, que comprende escualeno, en la que la concentración de escualeno es <= 10 mg/ml y la cantidad mínima de escualeno por dosis es de 0,5 mg, y en la que las cepas del virus de la gripe B incluyen una cepa del virus de la gripe B de tipo B/Victoria/2/87 y una cepa del virus de la gripe B del tipo B/Yamagata/16/88 y en la que la vacuna tiene un volumen de dosis unitaria de 0,2-0,3 ml o 0,5 ml.

Description

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Vacunas contra la gripe con cantidades reducidas de escualeno

DESCRIPCION

Campo de la tecnica

La presente invencion esta en el campo de las vacunas para proteger contra la infeccion del virus de la gripe y, en particular, de las vacunas que incluyen cantidades reducidas de escualeno con respecto a las vacunas comercializadas.

Tecnica anterior

Las vacunas contra la gripe generalmente no incluyen un adyuvante, excepto el producto PREPANDRIX™ (GlaxoSmithKline) y el producto FLUAD™ (Novartis Vaccines).

El adyuvante de la vacuna estacional monovalente prepandemica PREPANDRIX™ es una emulsion de aceite en agua. El antlgeno y el adyuvante de la emulsion se suministran en viales distintos de 10 dosis para la mezcla en el punto de uso en una proporcion de volumen de 1:1. La ficha tecnica del producto muestra que cada dosis tiene un volumen de 0,5 ml y contiene 3,75 pg HA con 10,68mg de escualeno y 4,85 mg de polisorbato 80.

El adyuvante en la vacuna estacional trivalente FLUAD™ es una emulsion de aceite en agua. El antlgeno y el adyuvante de emulsion se suministran en formato premezclado en una jeringa precargada. La ficha tecnica del producto muestra que cada dosis tiene un volumen de 0,5 ml y contiene 15 pg de hemaglutinina (HA) por cepa con 9,75 mg de escualeno y 1,175 mg de polisorbato 80. Como se divulga en la referencia 1, la vacuna se prepara mezclando en una emulsion 2X con una solucion de antlgeno 2X a una proporcion en volumen de 1:1, para dar una solucion final con la emulsion y el antlgeno a la concentracion 1X. Esta proporcion de mezcla 1:1 se explica adicionalmente en el capltulo 10 de la referencia 75. Las modificaciones de esta mezcla se divulgan en la referencia 2.

En comparacion con el producto FLUAD™, la referencia 3 divulga vacunas trivalentes contra la gripe con cantidades menores de HA (3x5 pg de HA/dosis) y cantidades menores de escualeno (5,35 mg/dosis). La vacuna incluye conservante tiomersal y se administro a seres humanos como una dosis de 0,5 ml.

En el documento WO2008/068631 se describen vacunas que incluyen el antlgeno de cuatro cepas del virus de la gripe.

Es un objeto de la invencion proporcionar otras formulaciones mejoradas de vacunas contra la influenza con adyuvante y, en particular, de las vacunas contra la gripe estacional.

Divulgacion de la invencion

La invencion proporciona una vacuna contra el virus de la gripe para su uso para provocar una respuesta inmunitaria en un paciente de 6 a < 36 meses de edad que comprende: (i) la hemaglutinina de al menos dos cepas del virus de la gripe A y al menos dos cepas del virus de la gripe B, en laque el concentracion de hemaglutinina por cepa es al menos 25 pg/ml; y (ii) un adyuvante en emulsion de aceite en agua con gotas de aceite submicronicas, que comprende escualeno, en la que la concentracion de escualeno es < 10 mg/ml y la cantidad minima de escualeno por dosis es de 0,5 mg, y en la que las cepas del virus de la gripe B incluyen una cepa del virus de la gripe B de tipo B/Victoria/2/87 y una cepa del virus de la gripe B del tipo B/Yamagata/16/88 y en la que la vacuna tiene un volumen de dosis unitaria de 0,2-0,3 ml o 0,5 ml.

Otros aspectos de la invencion son como se define en las reivindicaciones adjuntas.

La divulgacion tambien proporciona una vacuna contra el virus de la gripe sin mercurio, que comprende: (i)

hemaglutinina de al menos una cepa del virus de la gripe A y al menos una cepa del virus de la gripe B; y (ii) un

adyuvante en emulsion de aceite en agua con gotas de aceite submicronicas, que comprende escualeno, en el que la concentracion de escualeno es < 19mg/ml.

En otra realizacion, la divulgacion proporciona una vacuna contra el virus de la gripe que tiene un volumen de dosis unitaria entre 0,2 y 0,3 ml, en la que la vacuna comprende: (i) hemaglutinina de al menos una cepa del virus de la gripe A y al menos una cepa del virus de la gripe B; y (ii) un adyuvante en emulsion de aceite en agua con gotas de aceite submicronicas, que comprende escualeno, en el que la concentracion de escualeno es < 19mg/ml.

En otra realizacion, la divulgacion proporciona una vacuna contra el virus de la gripe que comprende: (i)

hemaglutinina de al menos una cepa del virus de la gripe A y al menos una cepa del virus de la gripe B; y (ii) un

adyuvante en emulsion de aceite en agua con gotas de aceite submicronicas, que comprende escualeno, en el que la concentracion de escualeno es < 9,75 mg/ml o 4,88 mg/ml.

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En otra realizacion, la divulgacion proporciona una vacuna contra el virus de la gripe que tiene un volumen de dosis unitaria entre 0,2 y 0,3 ml, que comprende: (i) hemaglutinina de al menos una cepa del virus de la gripe A y al menos una cepa del virus de la gripe B; y (ii) un adyuvante en emulsion de aceite en agua con gotas de aceite submicronicas, que comprende escualeno, en el que la concentration de escualeno es 19,5 mg/ml, 9,75 mg/ml o 4,88 mg/ml.

En otra realizacion, la divulgacion proporciona una vacuna contra el virus de la gripe que comprende: (i) hemaglutinina de al menos dos cepas del virus de la gripe A y al menos dos cepas del virus de la gripe B; y (ii) un adyuvante en emulsion de aceite en agua con gotas de aceite submicronicas, que comprende escualeno, en el que la concentracion de escualeno es < 19mg/ml.

Preparation de la vacuna

Actualmente hay disponibles varias formas de vacuna contra el virus de la gripe y, generalmente, las vacunas estan basadas en el virus vivo o en el virus inactivado. Las vacunas inactivadas pueden estar basadas en viriones enteros, viriones fraccionados o en los antlgenos de superficie purificados. Los antlgenos de la gripe tambien pueden presentarse en forma de virosomas. La invention se puede utilizar con cualquiera de estos tipos de vacunas, pero normalmente se utilizara con vacunas inactivadas.

Cuando se usa un virus inactivado, la vacuna puede comprender el virion entero, el virion fraccionado o antlgenos de superficie purificados (incluida la hemaglutinina y, normalmente tambien incluida la neuraminidasa). Entre los medios qulmicos para la inactivation de un virus se incluyen el tratamiento con una cantidad eficaz de uno o mas de los siguientes agentes: detergentes, formaldehldo, p-propiolactona, azul de metileno, psoraleno, carboxifulereno (C60), etilamina binaria, etilenimina acetilo, o combinaciones de los mismos. En la tecnica se conocen procedimientos no qulmicos de inactivacion viral, tales como, por ejemplo, luz UV o irradiation gamma.

Los viriones se pueden recoger a partir de fluidos que contienen virus mediante varios procedimientos. por ejemplo, un proceso de purification puede implicar centrifugation zonal usando una solution de gradiente lineal de sacarosa que incluye detergente para romper los viriones. A continuation se pueden purificar los antlgenos, despues de la dilution opcional, mediante diafiltracion.

Los viriones fraccionados se obtienen mediante tratamiento de viriones purificados con detergentes (por ejemplo, eter etllico, polisorbato 80, desoxicolato, fosfato de tri-N-butilo, Triton X-100, Triton N101, bromuro de cetiltrimetilamonio, Tergitol NP9, etc.) para producir preparaciones de subviriones, incluyendo el proceso de fraccionamiento 'Tween-eter". Los procedimientos de fraccionamiento del virus de la gripe son bien conocidos en la tecnica, veanse, por ejemplo, las referencias 4-9, etc. El fraccionamiento del virus normalmente se lleva a cabo alterando o fragmentando virus enteros, sean infecciosos o no infecciosos, con una concentracion de alteration de un agente separador. La alteracion da como resultado una solubilization total o parcial de las protelnas del virus, que altera la integridad del virus. Los agentes de fraccionamiento preferentes son tensioactivos no ionicos e ionicos (por ejemplo, cationicos), por ejemplo alquilglicosidos, alquiltioglicosidos, azucares acilo, sulfobetalnas, betalnas, polioxietilenalquileteres, N,N-dialquil-glucamidas, Hecameg, alquilfenoxi-polietoxietanoles, compuestos de amonio cuaternario, sarcosil, CTAB (bromuros de cetiltrimetilamonio), fosfato de tri-N-butilo, Cetavlon, sales de miristiltrimetilamonio, lipofectina, lipofectamina y DOT-MA, los octilfenoxipolioxietanoles o nonilfenoxipolioxietanoles (por ejemplo, los tensioactivos Triton, tales como Triton X-100 o Triton N101), esteres de polioxietilensorbitano (los tensioactivos Tween), eteres de polioxietileno, esteres de polioxietileno, etc. Un procedimiento de fraccionamiento util utiliza los efectos consecutivos de desoxicolato de sodio y formaldehldo, y el fraccionamiento puede tener lugar durante la purificacion del virion inicial (por ejemplo, en una solucion de gradiente de densidad lineal de sacarosa). Por tanto, un proceso de fraccionamiento puede implicar el aclaramiento del material que contiene el virion (para eliminar el material no virion), la concentracion de los viriones recogidos (por ejemplo, utilizando un procedimiento de adsorcion, tal como adsorcion de CaHPO4), la separation de los viriones enteros de material no virion, el fraccionamiento de los viriones usando un agente de fraccionamiento en una etapa de centrifugacion en gradiente de densidad (por ejemplo, utilizando un gradiente de sacarosa que contiene un agente de fraccionamiento, tal como desoxicolato de sodio) y, despues, filtration (por ejemplo, ultrafiltracion) para eliminar los materiales no deseados. Los viriones fraccionados pueden resuspenderse de forma util en una solucion isotonica de cloruro sodico tamponada con fosfato de sodio. Los productos PREPANDRIX™, BEGRIVAC™, FLUARIX™, FLUZONE™ y FLUSHIELD™ son vacunas fraccionadas.

Las vacunas de antlgenos de superficie purificados comprenden antlgenos de la superficie del virus de la gripe hemaglutinina y, por lo general, tambien neuraminidasa. Los procesos para la preparation de estas protelnas de forma purificada son bien conocidos en la tecnica. Los productos FLUVIRIN™, FLUAD™, AgRiPPAL™ e INFLUVAC™son ejemplos

Otra forma de antlgeno de la gripe inactivado es el virosoma [10] (partlculas de liposomas similares a virus sin acido nucleico), como en los productos INFLEXAL V™ e INVAVAC™. Los virosomas se pueden preparar mediante solubilizacion del virus de la gripe con un detergente, seguido de la eliminacion de la nucleocapside y la

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reconstitucion de la membrana que contiene las glucoprotelnas virales. Un procedimiento alternative para la preparacion de virosomas implica la adicion de glicoprotelnas de membrana virales a cantidades en exceso de fosfollpidos, para dar liposomas con protelnas virales en su membrana.

Seleccion de la cepa

Las vacunas de la divulgacion incluyen hemaglutinina de al menos una cepa de virus de la gripe A y al menos una cepa del virus de la gripe B. Las diferentes cepas tlpicamente se cultivaran por separado y despues se mezclan despues de que se han recogido los virus y se han preparado los antlgenos. Por tanto, un proceso de la presente divulgacion puede incluir la etapa de mezclar antlgenos de mas de una cepa de la gripe. Las cepas utilizadas con la invencion pueden tener un HA natural como se encuentran en un virus de tipo salvaje, o una HA modificada. por ejemplo, se sabe modificar la HA para retirar los determinantes (por ejemplo, las regiones hiperbasicas alrededor del sitio de escision HA1/HA2) que hacen que un virus sea altamente patogeno en las especies de aves. Las hemaglutininas de los virus de la gripe B utilizadas con la invencion tienen, preferiblemente, Asn en el aminoacido 197, de modo que proporcionan un sitio de glicosilacion [11].

Un virus de la gripe usado con la invencion puede ser una cepa reordenada y puede haberse obtenido mediante tecnicas de genetica inversa. Las tecnicas de genetica inversa .[por ejemplo,12-16] permiten preparar in vitro virus de la gripe con segmentos de genoma deseados mediante el uso de plasmidos u otros vectores artificiales. Normalmente implica la expresion (a) moleculas de ADN que codifican moleculas de ARN virales deseadas, por ejemplo, a partir de promotores de poli o promotores de la ARN polimerasa de bacteriofago, y (b) moleculas de ADN que codifican protelnas virales, por ejemplo, de promotores de polll, de forma que la expresion de ambos tipos de ADN en una celula conduce al ensamblaje de un virion infeccioso intacto completo. El ADN proporciona, preferiblemente, la totalidad del ARN y las protelnas vitales, pero tambien es posible utilizar un virus auxiliar para proporcionar algunos de los ARN y protelnas. Se pueden usar procedimientos basados en plasmidos utilizando plasmidos separados para la produccion de cada aRn viral [17-19] y estos procedimientos tambien implicaran el uso de plasmidos para expresar la totalidad o algunas de las protelnas virales (por ejemplo, solo las protelnas PB1, PB2, PA y NP), usandose hasta 12 plasmidos en algunos procedimientos. Para reducir el numero de plasmidos necesarios, un abordaje [20] combina una pluralidad de casetes de transcription de ARN polimerasa I (para la slntesis de ARN viral) en el mismo plasmido (por ejemplo, secuencias que codifican 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 o los 8 segmentos ARNv de la gripe A) y una pluralidad de regiones codificantes de protelnas con promotores de la ARN polimerasa II en otro plasmido (por ejemplo, secuencias que codifican 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 o los 8 transcritos de ARNm de la gripe A). Los aspectos preferidos del procedimiento de referencia 20 implican: (a) regiones que codifican ARNm de PB1, PB2 y PA en un unico plasmido; y (b) los 8 segmentos que codifican ARN en un unico plasmido. La inclusion de los segmentos de NA y hA de un plasmido y los otros seis segmentos en otro plasmido tambien puede facilitar las cosas.

Como alternativa al uso de promotores de poll para codificar los segmentos de ARN virales, es posible utilizar promotores la polimerasa de bacteriofago [21]. Por ejemplo, los promotores para las SP6, T3 o T7 polimerasas se pueden usar convenientemente. Debido a la especificidad de especie de los promotores de poll, los promotores de la polimerasa de bacteriofago pueden ser mas convenientes para muchos tipos de celulas (por ejemplo, MDCK), aunque una celula tambien debe ser transfectada con un plasmido que codifica la enzima polimerasa exogena.

En otras tecnicas es posible utilizar promotores dobles de poll y polll para codificar simultaneamente los ARN virales y los ARNm expresables a partir de un unico molde [22, 23].

Por tanto, un virus de la gripe puede incluir uno o mas segmentos de ARN de un virus A/PR/8/34 (normalmente 6 segmentos de A/PR/8/34, siendo los segmentos HA y N de una cepa vacunal, es decir un virus reordenado 6:2). Tambien puede incluir uno o mas segmentos de ARN de un virus A/WSN/33 o de cualquier otra cepa de virus util para la generacion de virus reordenados para la preparacion de vacunas. Un virus de la gripe A puede incluir menos de 6 (es decir, 0,1, 2, 3, 4 o 5) segmentos virales de un virus de la gripe AA/6/60 (A/Ann Arbor/6/60). Un virus de la gripe B puede incluir menos de 6 (es decir, 0,1, 2, 3, 4 o 5) segmentos virales de un virus de la gripe AA/1/66 (B/Ann Arbour/1/66). Tlpicamente, la invencion protege contra una cepa que puede transmitirse de persona a persona, y, asl, el genoma de la cepa normalmente incluira al menos un segmento de ARN que se origino en un virus de mamlfero (por ejemplo, en un ser humano). Puede incluir el segmento NS que se origino en un virus de la gripe aviar.

Las cepas cuyos antlgenos se pueden incluir en las composiciones pueden ser resistentes a la terapia antiviral (por ejemplo, resistentes a oseltamivir [24] y/o zanamivir), incluyendo las cepas pandemicas resistentes [25].

Las cepas particularmente utiles son aquellas que no se han pasado por huevos en ninguna etapa entre el aislamiento de un paciente y la replication en un sistema de cultivo celular, ambos incluidos. Las celulas MDCK se pueden utilizar exclusivamente para todas las etapas desde el aislamiento a la replicacion del virus.

En algunas realizaciones, las cepas utilizadas con la invencion tienen hemaglutinina con una preferencia de union por oligosacaridos con un disacarido terminal Sia(a2,6)Gal en comparacion con los oligosacaridos con un disacarido

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terminal Sia(a2,3)Gal. Los virus de la gripe humana se unen a los oligosacaridos del receptor que tienen un disacarido terminal Sia(a2,6)Gal (acido sialico unido a a-2,6 to galactosa), pero los huevos y las celulas Vero tienen oligosacaridos en el receptor con un disacarido terminal Sia(a2,6)Gal. El crecimiento de los virus de la gripe humana en celulas tales como MDCK proporciona una presion de seleccion en la hemaglutinina para mantener la union de Sia(a2,6)Gal nativo, a diferencia de los pases en huevos.

Para determinar si un virus tiene una preferencia de union por los oligosacaridos con un disacarido terminal (Sia(a2,6)Gal en comparacion con los oligosacaridos con un disacarido terminal Sia(a2,3)Gal se pueden usar varios ensayos. Por ejemplo, la referencia 26 describe un ensayo ligado a enzimas en fase solida para la actividad de union al receptor del virus de la gripe, que da mediciones sensibles y cuantitativas de las constantes de afinidad. La referencia 27 utilizo un ensayo en fase solida en el que se evaluo la union de los virus a dos sialoglicoprotelnas diferentes (ovomucoide, con determinantes de Sia (a2,3)Gal; y a2-macroglobulina de cerdo, con determinantes de Sia(a2,6)Gal ), y tambien describe un ensayo en el que la union del virus se evaluo contra dos analogos del receptor: acido sialico libre (Neu5Ac) y 3'-sialillactosa (Neu5Aca2-3Galp1-4Glc). La referencia 28 informa sobre un ensayo que utiliza una matriz de glicanos que era capaz de diferenciar claramente las preferencias de los receptores para los enlaces a2,3 o a2,6 . La referencia 29 informa sobre un ensayo basado en la aglutinacion de eritrocitos humanos enzimaticamente modificados para contener Sia(a2,6)Gal o Sia(a2,3)Gal. Dependiendo del tipo de ensayo, se puede llevar a cabo directamente con el propio virus, o se puede realizar indirectamente con hemaglutinina purificada a partir del virus.

En algunas realizaciones, las cepas de la gripe usadas con la invencion tienen glicoprotelnas (incluyendo hemaglutinina) con un patron de glicosilacion diferente de los virus derivados del huevo. Por tanto, las glicoprotelnas incluiran glicoformas que no se ven en huevos de gallina.

Actualmente, el virus de la gripe A muestra dieciseis subtipos de HA: H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 y H16. La invencion puede proteger contra uno o mas de estos subtipos. La invencion puede proteger contra uno o mas de los subtipos de NA del virus de la gripe A N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8 o N9. Las vacunas en el presente documento incluyen el antlgeno de al menos una cepa del virus de la gripe A y normalmente incluiran antlgeno de al menos dos cepas del virus de la gripe A, por ejemplo, 2 o 3 cepas del virus de la gripe A. Cuando se incluyen dos cepas del virus de la gripe A, estas normalmente seran una cepa H1 y una cepa H3. Cuando se incluyen tres cepas del virus de la gripe A, estas normalmente seran una cepa H1, una cepa H3 y una cepa asociada a pandemia. En algunas realizaciones, la cepa H3 reacciona de forma cruzada con A/Moscow/10/99; en otras realizaciones, la cepa H3 reacciona de forma cruzada con A/Fujian/411/2002. La referencia 30 divulga vacunas que incluyen los antlgenos A/H1N1, A/H3N2, A/H5N1 y B.

Las caracterlsticas de una cepa de virus asociado a una pandemia son: (a) contiene una nueva hemaglutinina en comparacion con las hemaglutininas en las cepas humanas en circulacion actualmente, es decir una que no ha sido evidente en la poblacion humana desde hace mas de una decada (por ejemplo, H2), o previamente no se ha visto en absoluto en la poblacion humana (por ejemplo, H5, H6 o H9, que por lo general solo se han encontrado en las poblaciones de aves), de tal manera que el receptor de la vacuna y la poblacion humana en general son inmunologicamente intactos con respecto a la hemaglutinina de la cepa; (b) que es capaz de transmitirse horizontalmente en la poblacion humana; y (c) es patogenico para los seres humanos. Una cepa del virus de la gripe asociada a pandemia para su uso con la invencion tendra tlpicamente un subtipo H2, H5, H7 o H9 por ejemplo, H5N1, H5N3, H9N2, H2N2, H7N1 o H7N7. Se prefieren las cepas H5N1. Las cepas pandemicas pueden tener un subtipo H1 (por ejemplo, H1N1); por ejemplo, la HA puede producir reaccion inmunologica cruzada con la cepa A/California/04/09.

El virus de la gripe B actualmente no muestra diferentes subtipos de HA, pero las cepas de virus de la gripe B si entran en dos linajes distintos. Estos linajes surgidos a finales de la decada de 1980 y tienen HA que pueden distinguirse antigenica y/o geneticamente entre si [31]. Las cepas del virus de la gripe B actuales son de tipo B/Victoria/2/87 o de tipo B/Yamagata/16/88. Estas cepas normalmente se distinguen antigenicamente, pero las diferencias en las secuencias de aminoacidos se han descrito tambien para distinguir los dos linajes, por ejemplo, cepas de tipo B/Yamagata/16/88 a menudo (pero no siempre) tienen protelnas HA con deleciones en el resto de aminoacido 164, numerado en relacion con la secuencia de HA 'Lee40' [32].

Las composiciones de la invencion incluyen antlgenos de dos cepas del virus de la gripe B, que incluyen una cepa de tipo B/Vietoria/2/87 y una cepa de tipo B/Yamagata/16/88.

Las vacunas para su uso de acuerdo con la invencion incluyen antlgenos de dos cepas de virus de la gripe A y dos cepas de virus de la gripe B (vacunas "ABBA"). Por tanto, las vacunas ABBA preferentes para su uso de acuerdo con la invencion incluiran hemaglutinina de: (i) una cepa H1N1; (ii) una cepa H3N2; (iii) una cepa de tipo B/Victoria/2/87; y (iv) una cepa de tipo B/Yamagata/16/88.

En algunas realizaciones de ABBA, al menos dos de las cepas de virus de la gripe B pueden tener hemaglutininas distintas pero neuraminidasas relacionadas. Por ejemplo, ambas pueden tener una neuraminidasa de tipo B/Victoria/2/87[33] o ambas pueden tener una neuraminidasa de tipo B/Yamagata/16/88. Por ejemplo, dos

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neuraminidasas de tipo B/Victoria/2/87 pueden tener manas una o mas de las siguientes caracterlsticas de secuencia: (1) no es una serina en el resto 27, sino preferentemente una leucina; (2) no es un glutamato en el resto 44, sino preferentemente una lisina; (3) no es una treonina en el resto 46, sino preferentemente una isoleucina; (4) no es una prolina en el resto 51, sino preferentemente una serina; (5) no es unan arginina en el resto 65, sino preferentemente una histidina; (6) no es una glicina en el resto 70, sino preferentemente un glutamato; (7) no es una leucina en el resto 73, sino preferentemente una fenilalanina; y/o (8) no es una prolina en el resto 88, sino preferentemente una glutamina. Del mismo modo, en algunas realizaciones, se ha comunicado la neuraminidasa puede tener una delecion en el resto 43 o puede tener una treonina; una delecion en el resto 43, que surge de una delecion trinucleotldica en el gen de NA, como caracterlstica de las cepas de tipo B/Victoria/2/87, aunque las cepas recientes han recuperado Thr-43 [33]. Por el contrario, por supuesto, las caracterlsticas opuestas pueden ser compartidas por dos neuraminidasas de tipo B/Yamagata/16/88, por ejemplo, S27, E44, T46, P51, R65, G70, L73, y/o P88. Estos aminoacidos se numeran en relacion con la secuencia de la neuraminidasa del 'Lee40' [34]. Por lo tanto, una vacuna ABBA puede utilizar dos cepas B que son antigenicamente distintas para HA (una de tipo B/Yamagata/16/88, una de tipo B/Victoria/2/87), sino que estan relacionadas para NA (tanto de tipo B/Yamagata/16/88 como de tipo B/Victoria/2/87).

La invencion no esta restringida a las vacunas tetravalentes, sino que abarca las vacunas pentavalentes, hexavalentes, heptavalentes etc. Un ejemplo de vacuna pentavalente puede incluir tres cepas de gripe A (por ejemplo, una cepa H1 y dos cepas h3, como se ha tratado anteriormente), mas dos cepas de la gripe B. Por ejemplo, una vacuna A-A-A-B-B puede incluir hemaglutinina de: (i) una cepa H1N1; (ii) una cepa H3N2 de tipo A/Moscow/10/99; (iii) una cepa H3N2 de tipo A/Fujian/411/2002; (iv) una cepa de tipo B/Victoria/2/87; y (v) una cepa de tipo B/Yamagata/16/88. Otra vacuna A-A-A-B-B puede incluir hemaglutinina de: (i) una cepa H1N1; (ii) una cepa H3N2; (iii) una cepa H5 del virus de la gripe A, tal como una cepa H5N1; (iv) una cepa de tipo B/Victoria/2/87; y (v) una cepa de tipo B/Yamagata/16/88. Una vacuna A-A-A-A-B-B puede incluir hemaglutinina de: (i) una cepa h1n1; (ii) una cepa H3N2 de tipo A/Moscow/10/99; (iii) una cepa H3N2 de tipo A/Fujian/411/2002; (iv) una cepa H5 del virus de la gripe A, tal como una cepa H5N1; (v) una cepa de tipo B/Victoria/2/87; y (vi) una cepa de tipo B/Y amagata/16/88.

Dosificacion de la hemaglutinina

La hemaglutinina (HA) es el inmunogeno principal en las vacunas antigripales inactivadas actuales y las dosis de las vacunas estan estandarizadas en funcion de los niveles de HA, tlpicamente medidos por SRID. Las vacunas existentes contienen normalmente aproximadamente 15 pg de HA por cepa en una dosis de 0,5 ml, aunque se pueden usar dosis mas bajas, por ejemplo, para ninos (por lo general una dosis 0,25 ml a la misma concentracion de HA), o en situaciones de pandemia o cuando se usa un adyuvante. Se han usado dosis fraccionadas, tales como ^ (es decir, 7,5 pg de HA por cepa), % y A, al igual que dosis mas altas (por ejemplo, dosis 3x o 9 x [35,36]).

En general, de acuerdo con la presente divulgacion, la cantidad de HA por dosis puede estar en el intervalo de 0,1 y 150 pg por cepa, preferiblemente entre 0,1 y 50 pg, por ejemplo, 0,1-20 pg, 0,1-15 pg, 0,1-10 pg, 0,1-7,5 pg, 0,5-5 pg, etc. Entre las dosis concretas se incluyen, por ejemplo, aproximadamente 45, aproximadamente 30, aproximadamente 15, aproximadamente 10, aproximadamente 7,5, aproximadamente 5, aproximadamente 3,8, aproximadamente 1,9, aproximadamente 1,5 pg por cepa. En algunas realizaciones de la divulgacion, la concentracion de HA por cepa en una composicion es de al menos 12 pg/ml (es decir, al menos 6 pg por cepa en un volumen de 0,5 ml, que es mayor que la concentracion usada en la referencia 3). Por lo general, la concentracion sera > 15 pg/ml por ejemplo, > 20 pg/ml, > 25 pg/ml, > 30 pg/ml o mas Una concentracion de 15 pg/ml por cepa o 30 pg/ml por cepa es tlpica.

En las vacunas para su uso de acuerdo con la invencion, la concentracion de hemaglutinina por cepa es al menos 25 pg/ml.

Normalmente, la concentracion de HA sera la misma para cada cepa en una composicion. En algunas realizaciones, sin embargo, las concentraciones seran todos multiplos enteros de la concentracion mas baja. Por ejemplo, si la concentracion de HA mas baja para una cepa en particular es 15 pg/ml, las otras concentraciones de Ha en la composicion seran 15 pg/ml, 30 pg/ml, 45 pg/ml o 60 pg/ml.

Como se ha mencionado anteriormente, la invencion por lo general se utilizara con vacunas inactivadas. En algunas realizaciones, sin embargo, se puede utilizar con vacunas vivas. En lugar de estar estandarizadas en torno al contenido de HA, la dosificacion de las vacunas vivas se mide por la mediana de la dosis infecciosa de cultivo tisular (DICT50). Una DICT50 de entre 106 y 108 (preferiblemente entre 106,5-107,5) por cepa es tlpica. El virus de la gripe puede ser atenuado. El virus de la gripe puede ser sensible a la temperatura. El virus de la gripe puede estar adaptado al frlo.

Lineas celulares

La fabricacion de vacunas para su uso con la invencion puede utilizar huevos SPF como sustrato para el crecimiento viral, en el que el virus se recoge de fluidos alantoideos infectados de huevos de gallina. En lugar de

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ello, sin embargo, pueden usarse ilneas celulares que soportan la replicacion del virus de la gripe. La ilnea celular sera tlpicamente de origen mamlfero. Las celulas de origen mamlfero adecuadas incluyen, pero no se limitan a, celulas de hamster, ganado vacuno, primate (incluido, seres humanos y monos) y perro, aunque no se prefiere el uso de celulas de primate. Se pueden usar varios tipos de celulas, tales como celulas renales, fibroblastos, celulas de la retina, celulas pulmonares, etc. Ejemplos de celulas de hamster apropiadas son las llneas celulares que tienen los nombres BHK21 o HKCC. Las celulas de mono adecuados son, por ejemplo, celulas de mono verde africano, tales como celulas de rinon como en la llnea celular Vero [37-39]. Las celulas perro adecuadas son, por ejemplo, celulas de rinon, como en las llneas celulares CLDK y MDCK.

Por tanto, las llneas celulares adecuadas incluyen, entre otros: MDCK; CHO; CLDK; HKCC; 293T; BHK; Vero; MRC- 5; PER.C6 [40]; FRhL2; WI-38; etc. Las llneas celulares adecuadas estan ampliamente disponibles en, por ejemplo, la Coleccion Americana de Cultivos Tipo (ATCC) [41], en los depositos de celulas Coriell [42] o en la Coleccion Europea de Cultivos Tipo (ECACC). Por ejemplo, la ATCC suministra varias celulas Vero diferentes con los numeros de catalogo CCL-81, CCL-81.2, cRl-1586 y CrL-1587, y suministra celulas MDCK con el numero de catalogo CCL- 34, PER.C6 esta disponible del ECACC con el numero de deposito 96022940.

Las llneas de celulas mas preferidas son aquellas con glicosilacion de tipo de mamlfero. Como alternativa menos preferida a las llneas de celulas de mamlferos, los virus pueden cultivarse en llneas celulares aviares [por ejemplo, las referencias. 43-45], incluidas las llneas celulares derivadas de patos (por ejemplo, retina de pato) o gallinas. Los ejemplos de llneas celulares aviares incluyen celulas madre embrionarias de ave [43,46] y celulas de retina de pato [44]. Las celulas madre embrionarias de ave adecuadas incluyen la llnea celular EBx derivada de celulas madre embrionaria de pollo, EB45, EB14, y EB14-074 [47]. Tambien se pueden usar fibroblastos de embrion de pollo (CEF). En lugar de utilizar celulas de aves, sin embargo, el uso de celulas de mamlfero significa que las vacunas pueden carecer de ADN aviar y protelnas de huevo (tales como ovoalbumina y ovomucoide), reduciendo de ese modo la alergenicidad.

Las llneas celulares mas preferidas para cultivar virus de la gripe son llneas celulares MDCK [48-51], derivadas de rinon canino de Madin Darby. La llnea celular MDCK original esta disponible de la ATCC como CCL-34, pero tambien se pueden usar derivados de esta llnea celular y otras llneas celulares MDCK. Por ejemplo, la referencia 48 divulga una llnea celular MDCK que se adapto para el crecimiento en cultivo en suspension ( 'MDCK 33016', depositada como DSM ACC 2219). Del mismo modo, la referencia 52 divulga una llnea celular derivada de MDCK que crece en suspension en cultivo sin suero ( "B-702 ', depositada como FERM BP-7449). La referencia 53 divulga celulas MDCK no tumorigenicas, incluyendo 'MDCK-S' (ATCC PTA-6500), 'NMCK-SF101' (ATCC PTA-6501), 'MDCK-SF102' (ATCC PTA-6502) y 'MDCK-SF103' (PTA-6503). La referencia 54 divulga llneas celulares MDCK con alta susceptibilidad a la infeccion, incluyendo celulas 'MDCK.5F1' (ATCC CRL-12042). Se puede usar cualquiera de estas llneas celulares MDCK.

El virus puede cultivarse en las celulas en cultivo adherente o en suspension. Tambien se pueden usar cultivos microportadores. En algunas realizaciones, las celulas pueden adaptarse de este modo para el crecimiento en suspension.

Las llneas celulares se cultivan, preferiblemente, en medio de cultivo sin suero y/o medio sin protelnas. Un medio se conoce como un medio sin suero en el contexto de la presente invencion, en el que no hay aditivos de suero de origen humano o animal. Las celulas que crecen en tales cultivos contienen de forma natural protelnas, pero se entiende que un medio sin protelna significa uno en el que la multiplicacion de las celulas (por ejemplo, antes de la infeccion) se produce con exclusion de protelnas, factores de crecimiento, otros aditivos de protelnas y protelnas no sericas, pero, opcionalmente, pueden incluir protelnas tales como la tripsina u otras proteasas que pueden ser necesarias para el crecimiento viral.

Las llneas celulares que apoyan la replicacion del virus de la gripe se cultivan, preferiblemente, por debajo de 37 °C [55] (por ejemplo, 30-36 °C, o a aproximadamente 30 °C, 31 °C, 32 °C, 33 °C, 34 °C, 35 °C, 36 °C) durante la replicacion viral.

Los procedimientos para la propagacion del virus de la gripe en celulas cultivadas generalmente incluye las etapas de inoculacion de un cultivo de celulas con un inoculo de la cepa que se va a cultivar, cultivo de las celulas infectadas durante un perlodo de tiempo deseado para la propagacion de virus, tal como, por ejemplo, como se determina mediante el tltulo de virus o la expresion del antlgeno (por ejemplo, entre 24 y 168 horas despues de la inoculacion) y la recoleccion del virus propagado. Las celulas cultivadas se inoculan con un virus (medido por PFU o DICT50) a una relacion celular de 1:500 a 1:1, preferiblemente de 1:100 a 1:5, mas preferiblemente de 11:50 a 1:10. El virus se anade a una suspension de las celulas o se aplica a una monocapa de las celulas y el virus se absorbe en las celulas durante al menos 60 minutos, pero normalmente menos de 300 minutos, de preferencia entre 90 y 240 minutos a de 25 °C a 40 °C, preferiblemente de 28 °C a 37 °C. El cultivo de celulas infectadas (por ejemplo, monocapas) se pueden eliminar mediante congelacion-descongelacion o por accion enzimatica para aumentar el contenido viral de los sobrenadantes de cultivo recogidos. Los fluidos recogidos se inactivan despues o se almacenan congelados. Las celulas cultivadas pueden infectarse a una multiplicidad de infeccion ("m.o.i.") de aproximadamente 0,0001 a 10, preferiblemente de 0,002 a 5, mas preferiblemente a 0,001 a 2. Aun mas

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preferiblemente, las celulas se infectan a una m.o.i de aproximadamente 0,01. Las celulas infectadas se pueden recoger de 30 a 60 horas despues de la infeccion. Preferiblemente, las celulas se recogen de 34 a 48 horas despues de la infeccion. Aun mas preferiblemente, las celulas se recogen de 34 a 40 horas despues de la infeccion. Las proteasas (normalmente tripsina) generalmente se anaden durante el cultivo celular para permitir la liberacion viral y las proteasas se pueden anadir en cualquier etapa adecuada durante el cultivo por ejemplo, antes de la inoculacion, al mismo tiempo que la inoculacion, o despues de la inoculacion [55].

En algunas realizaciones, en particular con celulas MDCK, una llnea celular no se pasa desde el banco de celulas de trabajo maestro mas alla de 40 niveles de duplication de la poblacion.

El inoculo viral y el cultivo viral estan, preferentemente, libres de (es decir, se habran analizado y han dado un resultado negativo para la contamination) virus del herpes simple, virus sincitial respiratorio, virus de la parainfluenza 3, coronavirus del SARS, adenovirus, rinovirus, reovirus, poliomavirus, bimaviruses, circovirus, y/o parvovirus [56]. Se prefiere particularmente ausencia del virus del herpes simple.

ADN de la celula huesped

Cuando el virus se ha cultivado en una llnea celular, es una practica estandar reducir al mlnimo la cantidad de ADN de la llnea celular residual en la vacuna final, con el fin de minimizar cualquier actividad oncogenica del ADN.

Por lo tanto una composition de vacuna preparada para su uso de acuerdo con la invention contiene, preferiblemente, menos de 10 ng (preferiblemente menos de 1 ng, y, mas preferiblemente, menos de 100 pg) del ADN de la celula huesped residual por dosis, aunque puede haber presentes pequenas cantidades de ADN de la celula huesped.

Se prefieren las vacunas que contienen <10 ng (por ejemplo, <1 ng, <100 pg) de ADN de la celula huesped por 15 pg de hemaglutinina, como lo son las vacunas que contienen <10 ng (por ejemplo, <1 ng, <100 pg) de ADN de la celula huesped por volumen de 0,25 ml. Se prefieren las vacunas que contienen <10 ng (por ejemplo, <1 ng, <100 pg) de ADN de la celula huesped por 50 pg de hemaglutinina, como lo son las vacunas que contienen <10 ng (por ejemplo, <1 ng, <100 pg) de ADN de la celula huesped por volumen de 0,5 ml.

Se prefiere que la longitud promedia de cualquier ADN residual de la celula huesped es de menos de 500 pb, por ejemplo, menos de 400 pb, menos de 300 pb, menos de 200 pb, menos de 100 pb, etc.

El ADN contaminante puede retirarse durante la preparation de la vacuna usando procedimientos de purification estandar por ejemplo, cromatografla, etc. La retirada del ADN residual de la celula huesped puede potenciarse mediante tratamiento con nucleasa, por ejemplo mediante el uso de una DNasa. Un procedimiento conveniente para la reduction de la contaminacion del ADN de la celula huesped se divulga en las referencias 57 y 58, que implican un tratamiento de dos etapas, primero utilizando una DNasa (por ejemplo, benzonasa), que puede utilizarse durante el crecimiento viral, y luego un detergente cationico (por ejemplo, CTAb), que se puede usar durante la rotura del virion. Tambien se puede usar retirada mediante p-propiolactona.

La medicion del ADN de la celula huesped residual es ahora un requisito reglamentario de rutina para productos biologicos y esta dentro de las capacidades normales del experto en la materia. El ensayo utilizado para medir el ADN sera tlpicamente un ensayo validado [59,60]. Las caracterlsticas de rendimiento de un ensayo validado se pueden describir en terminos matematicos y cuantificables, y se han identificado las posibles fuentes de error. Generalmente se han analizado las caracterlsticas del ensayo, tales como la exactitud, la precision, la especificidad. Una vez que se ha calibrado y analizado un ensayo (por ejemplo, contra de cantidades estandar conocidas de ADN de la celula huesped) se pueden realizar mediciones cuantitativas de ADN de forma rutinaria. Se pueden usar tres tecnicas principales para la cuantificacion del ADN. procedimientos de hibridacion, tales como transferencias Southern o transferencias por ranura [61]; procedimientos de inmunoensayo, tales como el sistema Threshold™ [62]; y PCR cuantitativa [63]. Estos procedimientos son familiares para el experto en la materia, aunque las caracterlsticas precisas de cada procedimiento puede depender de la celula huesped en cuestion por ejemplo, la election de sondas para la hibridacion, la eleccion de los cebadores y/o sondas para la amplification, etc. El sistema Threshold™ de Molecular Devices es un ensayo cuantitativo de los niveles de picogramos de ADN total, y se ha utilizado para el seguimiento de los niveles de ADN contaminante en los productos biofarmaceuticos [62]. Un ensayo tlpico implica la formation no especlfica de secuencia de un complejo de reaction entre una protelna de union a ADNss biotinilada, un anticuerpo anti-ADNss conjugado con ureasa y ADN. Todos los componentes del ensayo se incluyen en el kit de ensayo de ADN total completo disponible del fabricante. Varios fabricantes comerciales ofrecen ensayos de PCR cuantitativa para detectar el ADN de la celula huesped residual por ejemplo, AppTec™ Laboratory Services, BioReliance™, Althea Technologies, etc. Una comparacion de un ensayo de hibridacion quimioluminiscente y el sistema Threshold™ de AND total para la medicion de la contaminacion del ADN de la celula huesped de una vacuna viral humana se puede encontrar en la referencia 64.

Composiciones farmaceuticas

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Las vacunas para su uso de acuerdo con la invencion normalmente incluyen componentes ademas de los antlgenos de la gripe, por ejemplo, normalmente incluyen uno o mas vehlculos farmaceutico y/o excipientes farmaceuticos. Una discusion detallada de estos componentes esta disponible en la referencia 65. Tambien se pueden incluir adyuvantes adicionales.

Las composiciones generalmente estaran en forma acuosa en el punto de administracion.

Una composicion puede incluir conservantes tales como tiomersal o 2-fenoxietanol. En algunas realizaciones, sin embargo, la vacuna debe, a diferencia del producto PREPANDRIX™, estar sustancialmente libre de material de mercurio, por ejemplo, sin tiomersal [8,66]. Las vacunas que no contienen mercurio son mas preferidas y se puede incluir a-tocoferol succinato como alternativa a los compuestos de mercurio [8]. Las vacunas sin conservantes son particularmente preferidas.

Para controlar la tonicidad, se prefiere incluir una sal fisiologica, tal como una sal de sodio. Se prefiere cloruro sodico (NaCl), que puede estar presente a entre 1 y 20 mg/ml. Entre otras sales que pueden estar presentes se incluyen cloruro potasico, dihidrogeno fosfato de potasio, fosfato disodico, y/o cloruro de magnesio, etc. Cuando el adyuvante esta en un recipiente separado al de los antlgenos, puede haber cloruro de sodio presente en ambos recipientes.

Las composiciones pueden tener una osmolalidad de entre 200 mOsm/kg y 400 mOsm/kg, preferentemente entre 240-360 mOsm/kg y puede estar dentro del intervalo de 290-310 mOsm/kg.

Las composiciones pueden incluir uno o mas tampones. Entre los tampones tlpicos se incluyen: un tampon fosfato; un tampon Tris; un tampon borato; un tampon succinato; un tampon histidina (particularmente con un adyuvante de hidroxido de aluminio); o un tampon citrato. Normalmente, los tampones estaran incluidos en el intervalo de 5-20 mM. Generalmente, el pH de una composicion estara entre 5,0 y 8,1, y mas normalmente entre 6,0 y 8,0, por ejemplo entre 6,5 y 7,5 o entre 7,0 y 7,8.

Preferentemente, la composicion es esteril. Preferentemente, la composicion es apirogena, por ejemplo que contiene < 1 UE (unidad de endotoxina, una medida estandar) por dosis y, preferentemente, <0,1 UE por dosis. Preferentemente, la composicion no tiene gluten.

Las composiciones de la invencion pueden incluir detergente, por ejemplo un tensioactivo de ester de polioxietilensorbitano (conocido como "Tweens”), un octoxinol (tal como, octoxinol-9 (Triton X-100) o t- octilfenoxipolietoxietanol), un bromuro de cetiltrimetilamonio (“CTAB”) o desoxicolato de sodio, en particular para una vacuna fraccionada de antlgeno de la superficie. El detergente puede estar presente solamente en pequenas cantidades. Por tanto, la vacuna puede incluir menos de 1 mg/ml de cada uno de octoxinol-10 y polisorbato 80. Otros componentes residuales en cantidades de trazas podrlan ser antibioticos (por ejemplo, neomicina, kanamicina, polimixina B). Cuando adyuvante esta en un recipiente separado de los antlgenos, este detergente normalmente estara presente en el recipiente que contiene el antlgeno (por ejemplo, antlgeno con polisorbato 80 y octoxinol 10).

La composicion puede incluir material para una unica inmunizacion o puede incluir material para multiples inmunizaciones (es decir, un kit “multidosis”). La inclusion de un conservante se prefiere en las disposiciones multidosis. Como alternativa (o ademas) a la inclusion de un conservante en composiciones de multidosis, las composiciones pueden estar contenidas en un recipiente que tiene un adaptador aseptica para la retirada de material.

Normalmente, las vacunas humanas contra la gripe se administran mediante inyeccion intramuscular en un volumen de dosificacion unitaria de aproximadamente 0,5 ml. En algunas realizaciones de la invencion, sin embargo, se puede usar una dosis unitaria con un la mitad de este volumen (es decir, aproximadamente 0,25 ml). Este volumen de dosificacion reducida es particularmente util con los ninos. Incluso pueden ser utiles dosis mas bajas (por ejemplo, 0,2 ml) para la inyeccion intradermica.

Preferentemente, las vacunas se almacenan a una temperatura entre 2 °C y 8 °C. No deberan estar congeladas. Idealmente deberan mantenerse fuera de la luz directa.

Las vacunas pueden suministrarse en cualquier recipiente adecuado, ya sea formuladas listas para la administracion o como un kit de partes para la mezcla extemporanea antes de la administracion por ejemplo, como antlgeno y componentes adyuvantes separados (como en el producto PREPANDRIX™). Entre los recipientes adecuados incluyen frascos, jeringas (por ejemplo, jeringas desechables), aerosoles nasales, etc. Estos recipientes deben ser esteriles. Cuando una composicion/componente esta en un vial, el vial estara hecho preferentemente de material de vidrio o plastico. Preferentemente, el vial se esteriliza antes de que la composicion se anada. Para evitar problemas con pacientes sensibles al latex, los viales se sellan, preferentemente, con un tapon sin latex y es de preferencia la ausencia de latex en todo material de envasado. El vial puede incluir una dosis unica de vacuna o puede incluir mas de una dosis (un vial “multidosis”), por ejemplo 10 dosis. Los viales preferidos estan hechos de vidrio incoloro. Un vial puede tener una tapa (por ejemplo, un cierre Luer) adaptada de tal manera que una jeringa se puede insertar en la tapa. Un vial puede tener una tapa que permite la extraccion aseptica de su contenido, en particular para viales

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multidosis. Cuando un componente se envasa en una jeringa, la jeringa puede tener una aguja unida a ella. Si una aguja no esta fijada, puede suministrarse una aguja por separado con la jeringa para su ensamblaje y uso. Dicha aguja puede estar tapada. Se prefieren las agujas de seguridad. Son tlpicas las agujas de 2,54 cm y 0,61 mm, 2,54 cm y 0,51 mm y 1,6 cm y 0,51 mm. Las jeringas pueden proporcionarse con etiquetas que se pueden despegar en las que figurara impreso el numero de lote, la estacion de gripe y la fecha de caducidad de los contenidos, con el fin de facilitar el mantenimiento de un registro. Preferentemente, el embolo de la jeringa tiene un tapon para evitar que el embolo se saque accidentalmente durante la aspiracion. Las jeringas pueden tener una tapa y/o un embolo de caucho de latex. Las jeringas desechables contienen una dosis unica de vacuna. Generalmente, la jeringa tiene un capuchon en la punta para sellar la punta antes de insertar una aguja y el capuchon de la punta esta hecho de, preferentemente, un caucho de butilo.

Los recipientes pueden estar marcados de modo que muestren un volumen de la mitad de la dosis, para, por ejemplo, facilitar su administracion en ninos. por ejemplo, una jeringa que contiene una dosis de 0,5 ml puede tener una marca que muestre el volumen de 0,25 ml. Por tanto, una vacuna se puede envasar con un volumen de dosis unitaria de 0,5 ml, pero se puede administrar como un volumen de dosis unitaria de 0,25 ml, estando facilitada esta mitad de la dosis con marcas en el recipiente.

Cuando se usa un recipiente de vidrio (por ejemplo, una jeringa o un vial), se prefiere usar un recipiente hecho de vidrio de borosilicato en lugar de un vidrio de cal sodada.

Un recipiente puede embalarse (por ejemplo, en la misma caja) con un folleto que incluya los detalles de la vacuna, por ejemplo instrucciones de administracion, detalles de los antlgenos que lleva la vacuna etc. Asimismo, las instrucciones pueden contener advertencias para, por ejemplo, tener disponible con facilidad una solucion de adrenalina para el caso de que se produzca una reaccion anafilactica grave tras la vacunacion, etc.

Adyuvantes

En el punto de uso, las vacunas para su uso de acuerdo con la invencion incluyen, ventajosamente, un adyuvante, que puede funcionar mejorando las respuestas inmunitarias (humorales y/o celulares) suscitadas en un paciente que recibe la composition. Se he demostrado que la presencia de un adyuvante de emulsion de aceite en agua (en particular, uno que comprende escualeno) mejora la cepa de la reactividad cruzada de las respuesta inmunitarias para las vacunas contra la gripe estacional [67] y pandemica [68,69].

Las emulsiones de aceite en agua para su uso con las composiciones de la presente divulgation incluyen al menos un aceite y al menos un tensioactivo, siendo el(los) aceite(s) y el(los) tensioactivo(s) biodegradables (metabolizables) y biocompatibles. Generalmente, las gotas de aceite en la emulsion tienen un diametro inferior a 5 pm, e incluso pueden tener un diametro de submicrones, alcanzandose estos pequenos tamanos con un microfluidificador para proporcionar emulsiones estables. Se prefieren las gotas con un tamano inferior a 220 nm, ya que pueden someterse a esterilizacion en filtro.

Las composiciones de la divulgacion se pueden usar con aceites como los procedentes de un animal (como un pez) o una fuente vegetal. Entre las fuentes de aceites vegetales se incluyen nueces, semillas y granos. Como ejemplos de aceites de nuez estan el aceite de cacahuete, el aceite de soja, el aceite de coco y el aceite de oliva, los disponibles con mayor frecuencia. Se puede usar aceite de jojoba, obtenido, por ejemplo, de la semilla de jojoba. Entre los aceites de semillas se incluyen aceite de cartamo, aceite de semilla de algodon, aceite de semilla de girasol, aceite de semilla de sesamo, etc. En el grupo de los granos, el aceite de malz es el mas facilmente disponible, pero tambien se puede usar el aceite de otros granos de cereales como el trigo, la avena, el centeno, el arroz, el teff, el triticale, etc. Los esteres de acido graso de 6-10 atomos de carbono del glicerol y de 1,2- propanodiol, aunque no se producen de forma natural en los aceites de semilla, se pueden preparar mediante hidrolisis, separation y esterification de los materiales adecuados a partir de los aceites de frutos secos y de semillas. Las grasas y los aceites de la leche de mamlfero son metabolizables y, por tanto, pueden usarse en la practica de esta divulgacion. Los procedimientos para la separacion, purification, saponification y otros medios necesarios para obtener aceites puros de fuentes animales se conocen bien en la materia.

La mayorla de los peces contienen aceites metabolizables que pueden recuperarse facilmente. Por ejemplo, el aceite de hlgado de bacalao, los aceites de hlgado de tiburon y el aceite de ballena, como esperma de ballena, son ejemplos de los diversos aceites de pescado que se pueden usar en la presente memoria descriptiva. Una serie de aceites de cadena ramificada se sintetizan bioqulmicamente en unidades de isopreno de 5 carbonos y normalmente se denominan terpenoides. El aceite de hlgado de tiburon contiene un terpenoide ramificado, insaturado conocido como escualeno, 2,6,10,15,19,23-hexametil-2,6,10,14,18,22-tetracosahexaeno, El escualano, el analogo saturado del escualeno, tambien puede usarse. Los aceites de pescado, incluidos el escualeno y el escualano, estan disponibles facilmente en fuentes comerciales o pueden obtenerse mediante procedimientos conocidos en la tecnica. El escualeno se usa en la presente invencion.

Las emulsiones que contienen escualeno ya estan incluidos en los productos FLUAD™ y PREPANDRIX™. En la vacuna FLUAD™, la cantidad total de HA es 4 pg (3 x 15 pg) y la cantidad total de escualeno es 9,75mg, en un

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volumen de dosis de 0,5 ml (es decir, 19, 5mg/ml de escualeno). En la vacuna PREPANDRIX™, la cantidad total de HA es 3,75 |jg (monovalente) y la cantidad total de escualeno es 10,68 mg, tambien en un volumen de dosis de 0,5 ml (es decir, 21,4 mg/ml de escualeno). En la invencion, la concentracion de escualeno < 10mg/ml al tiempo que conserva un efecto adyuvante y la concentracion puede ser, por ejemplo, < 5 mg/ml, < 2,5mg/ml. Una cantidad minima de 0,5 mg de escualeno por dosis es util (por ejemplo, vease la referencia 3). Ejemplos de cantidades por dosis incluyen 4,9 mg, 2,7 mg, 2,4 mg, 1,2 mg etc.

Otros aceites utiles son los tocoferoles, que se incluyen ventajosamente en vacunas para su uso en pacientes de edad avanzada (por ejemplo, de 60 anos o mayores), ya que se ha notificado que la vitamina E tienen un efecto positivo sobre la respuesta inmunitaria en este grupo de pacientes [70]. Tambien tienen propiedades antioxidantes que pueden ayudar a estabilizar las emulsiones [71]. Existen varios tocoferoles (a, p, y, 5, £ o ^), pero normalmente se usa el a. Un a-tocoferol preferido es DL-a-tocoferol. Se sabe que el a-tocoferol succinato es compatible con vacunas contra la gripe y que es un conservante util como alternativa a los compuestos de mercurio [8].

Se pueden usar mezclas de aceites, por ejemplo, escualeno y a-tocoferol. Un contenido de aceite en el intervalo de 2-20 % (en volumen) es tlpico.

Los tensioactivos se pueden clasificar por su “EHL” (equilibrio hidrofilo/lipofilo). Los tensioactivos preferidos de la invencion tienen un EHL de al menos 10, preferentemente de al menos 15 y mas preferentemente de al menos 16. La invencion se puede usar con tensioactivos que incluyen, entre otros: los tensioactivos de esteres de polioxietilensorbitano (normalmente denominados los Tween), especialmente polisorbato 10 y polisorbato 80; copollmeros de oxido de etileno (OE), oxido de propileno (OP), y/u oxido de butileno (OB), vendidos con el nombre comercial de DOWFAX™, tal como copollmeros de bloque de OE/OP, octoxinoles, en los que puede variar el numero de grupos etoxi (oxi-1,2-etanodiilo) que se repiten, de los que el octoxinol-9 (Triton X-100, o t- octilfenoxipoiletoxietanol) es de particular interes; (octilfenoxi)polietoxietanol (IGEPAL CA-630/NP-40); fosfollpidos tales como fosfatidilcolina (lecitina); etoxilatos de nonilfenol, tales como la serie NP de Tergitol™; eteres grasos de polioxietileno derivados de alcoholes laurllico, cetllico, estearllico y olellico (conocidos como tensioactivos Brij), tales como eter monolaurllico de trietilenglicol (Brij 30); esteres de sorbitano (normalmente conocidos como los SPAN), tal como trioleato de sorbitano (Span 85) y monolaurato de sorbitano, se prefieren los tensioactivos no ionicos. El tensioactivo mas preferido para la inclusion en la emulsion es polisorbato 80 (monooleato de polioxietilensorbitano; Tween 80).

Se pueden usar mezclas de tensioactivos, por ejemplo mezclas de Tween 80/Span 85. Una combination de un ester de polioxietilensorbitano y un octoxinol tambien es adecuado. Otra combinacion util comprende lauret 9 mas un ester de polioxietilensorbitano y/o un octoxinol.

Cantidades preferidas de tensioactivos (% en peso) son: esteres de polioxietilensorbitano (tal como Tween 80) 0,01 a 1 %, en particular aproximadamente 0,1 %; octilfenoxi o nonilfenoxi polioxietanoles (tales como Triton X-100 u otros detergentes de la serie Triton) 0,001 a 0,1 %, en particular 0,005 a 0,02 %; eteres de polioxietileno (tales como lauret 9) 0,1 a 20%, preferentemente de 0,1 a 10% y, en particular, 0,1 a 1% o aproximadamente 0,5 %.

Particularmente preferidas son las emulsiones de aceite en agua que contienen escualeno que contienen polisorbato 80. La relation en peso de escualeno:polisorbato 80 puede estar entre 1 y 10, por ejemplo entre 2 y 9, por ejemplo, aproximadamente 2,2 o aproximadamente 8,3. Entre los adyuvantes de emulsion de aceite en agua especlficos se incluyen, sin caracter limitante:

• Una emulsion submicrometrica de escualeno, polisorbato 80 y trioleato de sorbitano. La composition de la emulsion en volumen puede ser de aproximadamente 5 % de escualeno, aproximadamente 0,5 % de polisorbato 80 y aproximadamente 0,5 % de Span 85. En terminos de peso, estas proporciones se convierten en 4,3 % de escualeno, 0,5 % de polisorbato 80 y 0,48 % de Span 85. Este adyuvante se conoce como 'MF59'' [7274], como se describe con mayor detalle en el capltulo 10 de la referencia 75 y el capltulo 12 de la referencia 76. La emulsion de MF59 incluye, de forma ventajosa, iones citrato, por ejemplo tampon de citrato sodico 10mM.

• Una emulsion submicrometrica de escualeno, un tocoferol y polisorbato 80. Estas emulsiones pueden tener de 2 a 10 % de escualeno, de 2 a 10 % de tocoferol y de 0,3 a 3 % de polisorbato 80, y la proportion en peso de escualeno:tocoferol es, preferentemente, < 1 (por ejemplo, 0,90), ya que esto puede proporcionar una emulsion mas estable. El escualeno y el polisorbato 80 pueden estar presentes en una proporcion en volumen de aproximadamente 5:2 o en una proporcion en peso de aproximadamente 11:5. Una de estas emulsiones puede prepararse mediante la disolucion de Tween 80 en PBS, para dar una solution al 2 %, despues mezclando 90 ml de esta solucion con una mezcla de (5 g de DL-a-tocoferol y 5 ml de escualeno) y, posteriormente, microfluidificando la mezcla. La emulsion resultante tiene gotas de aceite en submicrones, por ejemplo con un diametro promedio de entre 100 y 250 nm, preferentemente de aproximadamente 180 nm. La emulsion tambien puede incluir un llpido A de monofosforilo 3-O-desacilado (“3d-MPL”). Otra emulsion util de este tipo puede comprender, por dosis humana, 0,5-10 mg de escualeno, 0,5-11 mg de tocoferol, y 0,1-4 mg de polisorbato 80

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• Una emulsion de escualeno, un tocoferol y un detergente Triton (por ejemplo, Triton X-100). La emulsion puede incluir tambien 3d-MPL (vease mas adelante). La emulsion puede contener un tampon fosfato.

• Una emulsion que comprende un polisorbato (por ejemplo, polisorbato 80), un detergente Triton (por ejemplo, Triton X-100) y un tocoferol (por ejemplo, un a-tocoferol succinato). La emulsion puede incluir estos tres componentes en una proporcion de masa de aproximadamente 75:11:10 (por ejemplo, 750 pg/ml de polisorbato 80, 110 pg/ml de Triton X-100 y 100 pg/ml de a-tocoferol succinato) y estas concentraciones deberan incluir cualquier contribucion de estos componentes de antlgenos. La emulsion debe tambien incluir escualeno. La emulsion debe tambien incluir un 3d-MPL. La fase acuosa puede contener un tampon fosfato.

• Una emulsion de escualeno, poloxamero 80 y poloxamero 401 ("Pluronic™ L121"). La emulsion puede estar formulada en solucion salina tamponada con fosfato a pH 7,4. Esta emulsion es un vehlculo de liberacion util para dipeptidos de muramilo y se ha usado con treonil-MDP en el adyuvante "SAF-1" [77] (0,05-1 % de Thr- MDP, 5 % de escualano, 2,5 % de Pluronic L121 y 0,2 % de polisorbato 80). Tambien se puede usar son Thr- MDP, como en el adyuvante “AF" [78] (5 % de escualano, 1,25 % de Pluronic L121 y 0,2 % de polisorbato 80). Se prefiere la microfluidificacion.

• Una emulsion que comprende escualeno, un disolvente acuoso, un tensioactivo no ionico hidrofilo de eter de polioxietilenalquilo (por ejemplo, eter cetoestearlilico de polioxietileno (12) y un tensioactivo no ionico hidrofobo (por ejemplo, un ester de sorbitano o ester de manida, tal como monooleato de sorbitano o “Span 80”). Preferentemente, la emulsion es termorreversible y/o tiene al menos un 90 % de las gotas de aceite (en volumen) con un tamano inferior a 200 nm [79]. La emulsion puede tambien incluir uno o mas de: alditol; un agente crioprotector (por ejemplo, un azucar tal como dodecilmaltosido y/o sacarosa); y/o un alquilpoliglicosido. La emulsion puede tambien incluir un agonista de TLR4 [80]. Dichas emulsiones pueden liofilizarse.

• Una emulsion de escualeno, poloxamero 105 y Abil-Care [81]. La concentracion final (peso) de estos componentes en vacunas con adyuvante es 5 % de escualeno, 4 % de poloxamero 105 (poliol pluronic) y 2 % de Abil-Care 85 (Bis-PEG/PPG-16/16 PEG/PPG-16/16 dimeticona; triglicerido caprllico/caprico).

• Una emulsion que tiene de 0,5-50 % de un aceite, 0,1-10 % de un fosfollpido y 0,05-5 % de un tensioactivo no

ionico. Como se ha descrito en la referencia 82, componentes fosfollpidos preferidos son fosfatidilcolina,

fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilinositol, fosfatidilglicerol, acido fosfatldico, esfingomielina y cardiolipina. Los tamanos submicronicos de las gotas son ventajosos.

• Una emulsion submicronica de aceite en agua de un aceite no metabolizable (tal como un aceite mineral ligero)

y al menos un tensioactivo (tal como lecitina, Tween 80 o Span 80). Se pueden incluir aditivos, tal como QuilA

saponina, colesterol, un conjugado de saponina-lipofilo (tal como GPI-0100, descrito en la referencia 83, producido mediante la adicion de amina alifatica a desacilsaponina a traves del grupo carboxilo del acido glucuronico), bromuro de dimetilodooctadecilamonio y/o N,N-dioctadecil-N,N-bis(2-hidroxietil)propanodiamina.

• Una emulsion en la que una saponina (por ejemplo, QuilA o QS21) y un esterol (por ejemplo, colesterol) se asocian en forma de micelas helicoidales [84].

• Una emulsion que comprende un aceite mineral, un alcohol graso etoxilado lipofilo no ionico y un tensioactivo hidrofilo no ionico (por ejemplo, un alcohol graso etoxilado y/o copollmero de bloque de polioxietileno- polioxipropileno) [85].

• Una emulsion que comprende un aceite mineral, un alcohol graso etoxilado hidrofilo no ionico y un tensioactivo lipofilo no ionico (por ejemplo, un alcohol graso etoxilado y/o copollmero de bloque de polioxietileno- polioxipropileno) [85].

Las emulsiones pueden combinarse con antlgeno a antlgenos durante la fabricacion de la vacuna o se pueden suministrar como un componente separado para la mezcla con un componente que contiene el antlgeno separado extemporaneamente, en el momento de la liberacion (como en el producto PREPANDRIX™). Cuando estos dos componentes son llquidos, la proporcion en volumen de los dos llquidos para mezclar puede variar (por ejemplo, entre 5:1 y 1:5), pero normalmente es de aproximadamente 1:1.

Despues de mezclar el antlgeno y el adyuvante, el antlgeno hemaglutinina permanecera generalmente en solucion acuosa, pero puede distribuirse alrededor de la interfase aceite/agua. En general, poca o ninguna hemaglutinina entrara en la fase de aceite de la emulsion.

La proporcion en peso entre el escualeno y la hemaglutinina (cantidad total) en una composition de la invention puede estar en el intervalo de 20 a 180, por ejemplo, 25-30, 50-60, 105-115.

Procedimientos de tratamiento y administration de la vacuna

Las composiciones de la presente divulgation son adecuadas para la administration a pacientes humanos y la divulgation proporciona un procedimiento para elevar una respuesta inmunitaria en un paciente, que comprende la etapa de administrar tal composicion de la presente divulgacion al paciente.

La presente invencion tambien proporciona una composicion de la presente divulgacion para su uso como medicamento.

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La divulgacion tambien proporciona el uso de al menos una gripe. Un antlgeno del virus, al menos un antlgeno del virus de la gripe B y escualeno (por ejemplo, en forma de una emulsion de aceite en agua), en la fabricacion de una composition para la inmunizacion activa contra la enfermedad de la gripe, en el que la composition es una vacuna que tiene las caracterlsticas descritas anteriormente.

Estos procedimientos y usos se utilizaran generalmente para generar una respuesta de anticuerpos, preferiblemente una respuesta de anticuerpos protectores. Los procedimientos para evaluar las respuestas de anticuerpos, la capacidad de neutralization y la protection despues de la vacunacion contra el virus de la gripe son bien conocidos en la tecnica. En los estudios con seres humanos se ha demostrado que los tltulos de anticuerpos contra la hemaglutinina del virus de la gripe humano se correlacionan con la proteccion (el tltulo de inhibition de la hemaglutinacion en una muestra de suero de aproximadamente 30-40 da una proteccion de aproximadamente un 50% frente a la infection por un virus homologo) [86]. Las respuestas de anticuerpos se miden normalmente mediante la inhibicion de la hemaglutinacion, mediante microneutralizacion, mediante inmunodifusion radial simple (SRID) y/o mediante hemolisis radial simple (SRH). Estas tecnicas de ensayos on bien conocidas en la tecnica.

Las composiciones de la invention se pueden administrar de varias formas. La via de inmunizacion mas preferida es mediante inyeccion intramuscular (por ejemplo, en el brazo o la pierna), pero otras vlas disponibles incluyen inyeccion subcutanea, inyeccion intradermica [87,88], intranasal [89-91], oral [92], bucal, sublingual, transcutanea, transdermica [93], etc.

Las vacunas preparadas de acuerdo con la divulgacion pueden usarse para tratar tanto a ninos como adultos. Las vacunas contra la gripe se recomiendan actualmente para su uso en la inmunizacion pediatrica y de adultos, a partir de los 6 meses de edad. Por tanto, el paciente puede ser menor de 1 ano de edad, de 6 anos a mas de 36 meses de edad, de 1-5 anos de edad, de 5-15 anos de edad, de 15-55 anos de edad o de al menos 55 anos de edad. Los pacientes preferidos para recibir las vacunas son los ancianos (por ejemplo, > 50 anos de edad, > 60 anos de edad y, preferiblemente, >65 anos), los jovenes (por ejemplo, < 5 anos de edad), pacientes hospitalizados, trabajadores de la salud, personal de servicios armados y militares, mujeres embarazadas, enfermos cronicos, pacientes inmunodeficientes, pacientes que han tomado un compuesto antiviral (por ejemplo, un compuesto de oseltamivir o zanamivir; vease mas adelante) en los 7 dlas anteriores a recibir la vacuna, personas con alergia al huevo y personas que viajan al extranjero. No obstante, las vacunas de la presente divulgacion no son adecuadas unicamente para estos grupos y pueden usarse en una poblacion mas general.

Las composiciones preferidas de la invencion satisfacen 1, 2 o 3 de los criterios de eficacia del CPMP. En adultos (18-60 anos de edad), estos criterios son: (1) seroproteccion > 70 % ; (2) seroconversion > 40 % y/o (3) un incremento del GMT >2,5 veces. En ancianos (> 60 anos de edad), estos criterios son: (1) seroproteccion > 60 % ; (2) seroconversion > 30 % y/o (3) un incremento del GMT >2 veces. Estos criterios se basan en estudios abiertos con al menos 50 pacientes.

El tratamiento puede seguir un calendario de dosis unica o un calendario de multiples dosis. Las multiples dosis pueden usarse en un calendario de inmunizacion primaria y/o en un calendario de inmunizacion de refuerzo. En un calendario de multiples dosis, las diversas dosis pueden administrarse por la misma via o por vlas diferentes, por ejemplo una sensibilization parenteral y refuerzo mucoso, una sensibilization mucosa y refuerzo parenteral, etc. La administration de mas de una dosis (normalmente dos dosis) es particularmente util en pacientes que no han recibido inmunidad previa, por ejemplo en personas que nunca han recibido una vacuna contra la gripe antes o para vacunas que incluyen un subtipo de HA nuevo. Normalmente las dosis multiples se administraran con 1 semana de separation (por ejemplo, con aproximadamente 2 semanas, aproximadamente 3 semanas, aproximadamente 4 semanas, aproximadamente 6 semanas, aproximadamente 8 semanas, aproximadamente 12 semanas, aproximadamente 16 semanas, etc.).

Las vacunas producidas de acuerdo con la presente divulgacion se pueden administrar a los pacientes sustancialmente al mismo tiempo (por ejemplo, durante la misma consulta medica o visita a un centro de atencion medica profesional o vacunacion) que otras vacunas, por ejemplo, sustancialmente al mismo tiempo que una vacuna contra el sarampion, una vacuna contra las paperas, una vacuna contra la rubeola, una vacuna MMR (paperas, sarampion y rubeola), una vacuna contra la varicela, una vacuna MMRV (paperas, sarampion, rubeola y varicela), una vacuna contra la difteria, una vacuna contra el tetanos, una vacuna contra la tos ferina, una vacuna DTP (difteria, tos ferina y tetanos), una vacuna conjugada contra H. influenzae b, una vacuna contra el virus de la polio inactivada, una vacuna contra el virus de la hepatitis B, una vacuna conjugada meningococica (tal como una vacuna tetravalente A-C-W135-Y), una vacuna contra el virus sincitial respiratorio, una vacuna neumococica conjugada, etc. La administracion sustancialmente al mismo tiempo que una vacuna neumococica y/o una vacuna meningococica es particularmente util en pacientes de edad avanzada.

Del mismo modo, las vacunas para su uso de acuerdo con la invencion pueden administrarse a los pacientes sustancialmente al mismo tiempo (por ejemplo, durante la misma consulta medica o visita a un profesional sanitario) que un compuesto antiviral, y, en particular, un compuesto antiviral activo contra el virus de la gripe (por ejemplo, oseltamivir y/o zanamivir). Estos antivirales incluyen inhibidores de la neuraminidasa, tales como un acido (3r, 4R, 5S)-4-acetilamino-5-amino-3(1-etilpropoxi)-1-ciclohexeno-1-carboxllico o acido 5-(acetilamino)4-

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[(aminoiminometil)amino]-2,6-anhidro-3,4,5-tridesoxi-D-glicero-D-galactonon-2-en6nico, incluyendo esteres de los mismos (por ejemplo, los esteres de etilo) y sales de los mismos (por ejemplo, las sales de fosfato). Un antiviral preferido es acido (3R, 4R, 5S)A-acetilamino-5-amino-3(1-etilpropoxi)-1-ciclohexeno-1-carboxllico, ester de etilo, fosfato (1:1), tambien conocido como fosfato de oseltamivir (Tamiflu™).

Aspectos generates

El termino “que comprende" abarca (que incluye” ademas de “constituido por”, por ejemplo una composici6n “que comprende” X puede estar constituido s6lo por X o puede incluir algo adicional, por ejemplo X + Y.

La palabra “sustancialmente” no excluye “completamente”, por ejemplo, una composici6n que esta “sustancialmente libre” de Y puede estar completamente libre de Y. Cuando sea necesario, la palabra “sustancialmente” puede omitirse de la definici6n de la invenci6n.

El termino “aproximadamente” en relaci6n con un valor numerico x es opcional y significa, por ejemplo, x ± 10 %.

A menos que se indique especlficamente, un procedimiento que comprende una etapa de mezclar dos o mas componentes no requiere ningun orden especlfico de mezcla. Por tanto, los componentes se pueden mezclar en cualquier orden. Cuando hay tres componentes, dos componentes se pueden combinar entre si y, despues, la combinaci6n puede combinarse con el tercer componente, etc.

Cuando se usan materiales animales (y particularmente bovinos) en el cultivo de celulas, deberan obtenerse de fuentes que esten libres de encefalopatlas espongiformes transmisibles (EST) y, en particular, libres de encefalopatla espongiforme bovina (EEB). En general, se prefiere cultivar celulas en ausencia total de materiales derivados de animales.

Cuando se utiliza un sustrato de celulas para procedimientos de reordenaci6n o genetica inversa, o para crecimiento viral, es, preferiblemente, uno que ha sido aprobado para su uso en la producci6n de vacunas humanas, por ejemplo, como en la Farmacopea Europea, capltulo general 5.2.3.

Modos para realizar la invencion

Se dividen 595 pacientes (ninos varones y mujeres de 6 a < 36 meses de edad) en 17 grupos de 35 cada uno. Cada uno de los grupos recibe la vacuna contra la gripe trivalente (A/H1N1, A/H3N2, B) o tetravalente (t1/H1N1, A/H3N2, B/Victoria, B/Yamagata). La vacuna se administra como un volumen de 0,5 ml (15 pg/dosis/cepa; 45 pg o 60 pg en total) o como un volumen de 0,25 ml (7,5 pg/dosis/cepa; 22,5 pg o 30 pg en total). Uno de los grupos recibe una dosis pediatrica de una vacuna inactivada trivalente comercializada existente. La vacuna se administra mediante inyecci6n intramuscular y se suministra en jeringas precargadas o en viales. Se prueban tres cantidades de adyuvantes diferentes (obtenidas mediante diluci6n).

La vacuna trivalente incluye cepas de la gripe recomendadas para la temporada de gripe de 2008-2009 en el hemisferio norte: virus de tipo A/Brisbane/59/2007, de tipo A/Brisbane/10/2007, y de tipo B/Florida/4/2006. El virus de tipo B/Florida/4/2006 esta en el linaje B/Yamagata, por lo que la vacuna tetravalente incluy6 ademas el antlgeno del virus de tipo B/Malaysia/2506/2004, que esta en el linaje de B/Victoria.

Los sujetos reciben dos dosis de la vacuna los dlas 1 y 29 (a excepci6n de dos grupos, que reciben una sola dosis el dla 1) y las respuestas inmunitarias especlficas de la gripe se evaluan mediante el analisis de la sangre obtenida en el momento basal (antes de la vacunaci6n), el dla 28 y el dla 50. Las muestras de suero se evaluan mediante la ensayos de inhibici6n de la hemaglutinaci6n (HI) especlfica de cepa contra las cepas de la gripe A/H1N1, A/H3N2 y B, incluyendo las cepas hom6logas y heterovariantes.

Por tanto, los 17 grupos son los siguientes:

Grupo

H1N1(pg) H3N2 ( pg) B/Yarn ( pg) B/Vic ( pg) Escualeno(mg) Numero de dosis Dosis (ml)

A

7,5 7,5 7,5 - - 2 0,25

B

15 15 15 - - 2 0,5

C

7,5 7,5 7,5 7,5 - 2 0,25

D

15 15 15 15 - 2 0,5

E

7,5 7,5 7,5 - 1,22 2 0,25

F

7,5 7,5 7,5 7,5 1,22 2 0,25

G

7,5 7,5 7,5 - 2,44 2 0,25

H

15 15 15 - 2,44 2 0,5

I

7,5 7,5 7,5 7,5 2,44 2 0,25

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Grupo

H1N1(pg) H3N2 ( pg) B/Yarn ( pg) B/Vic ( pg) Escualeno(mg) Numero de dosis Dosis (ml)

J

15 15 15 15 2,44 2 0,5

K

7,5 7,5 7,5 - 4,88 2 0,25

L

15 15 15 - 4,88 2 0,5

M

7,5 7,5 7,5 7,5 4,88 2 0,25

N

15 15 15 15 4,88 2 0,5

O

15 15 15 - 9,75 1 0,5

P

15 15 15 15 9,75 1 0,5

Q

7,5 7,5 7,5 - - 2 0,25

En un estudio adicional, 357 pacientes (varones y mujeres > 65 anos de edad) se dividen en 8 grupos. Cada uno de los grupos recibe una vacuna contra la gripe trivalente (A/H1N1, A/H3N2, B) mediante inyeccion intramuscular (0,5 ml), con o sin una emulsion de escualeno en agua. La vacuna se suministra en jeringas precargadas. Se prueban tres cantidades de adyuvantes diferentes (obtenidas mediante dilucion).

Las cepas de la gripe son como se recomiendan para la temporada de gripe de 2008-2009 en el hemisferio norte: virus de tipo A/Brisbane/59/2007, de tipo A/Brisbane/10/2007, y de tipo B/Florida/4/2006. Los sujetos reciben una dosis unica y las respuestas inmunitarias especlficas de la gripe se evaluan mediante el analisis de la sangre obtenida en el momento basal (antes de la vacunacion), a los 7 dlas (dla 8) y a los 21 dlas (dla 22) despues de la vacunacion. Las muestras de suero se evaluan mediante ensayos de inhibicion (HI) de la hemaglutinacion especlfica de cepa contra las cepas de la gripe A/H1N1, A/H3N2 y B. Tambien se realizan ensayos de inmunidad mediada por celulas.

Por tanto, los ocho grupos son los siguientes:

Grupo

H1N1 (pg) H3N2 ( pg) b ( pg) Escualeno(mg) Dosis (ml)

A

15 15 15 - 0,5

B

15 30 15 - 0,5

C

15 15 15 2,44 0,5

D

15 30 15 2,44 0,5

E

15 15 15 4,88 0,5

F

15 30 15 4,88 0,5

G

15 15 15 9,75 0,5

H

15 30 14 9,75 0,5

Para ambas cepas de la gripe A, los tres criterios del CHMP se cumplen en los grupos de pacientes C-H (es decir, las vacunas con adyuvante).

Para la cepa de la gripe B, los tres criterios del CHMP se cumplen en los grupos que reciben 4,8 8mg de escualeno o 9,75 mg de escualeno. En el grupo que recibe la vacuna sin adyuvante, solo uno de los criterios del CHMP se cumple, pero en el grupo que recibe 2,44 mg de escualeno se cumplen dos de los tres criterios del CHMP. Por lo tanto, incluso una dosis baja de escualeno en la vacuna puede aumentar la proteccion inmunitaria contra las cepas de gripe A y B.

Referencias

[1] Minutello et al. (1999) Vaccine 17:99-104.

[2] Documento WO2007/052155.

[3] Documento WO2008/043774.

[4] Documento WO02/28422.

[5] Documento WO02/067983.

[6] Documento WO02/074336.

[7] Documento WO01/21151.

[8] Documento WO02/097072.

[9] Documento WO2005/113756.

[10] Huckriede et al. (2003) Methods Enzymol 373:74-91.

[11] Saito et al. (2004) J Med Virol 74(2):336-43.

[12] Hoffmann et al. (2002) Vaccine 20:3165-3170.

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10

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25

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35

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45

50

55

60

65

[13] Subbarao et al. (2003) Virology 305:192-200.

[14] Liu et al. (2003) Virology 314:580-590.

[15] Ozaki et al. (2004) J. Virol. 78:1851-1857.

[16] Webby et al. (2004) Lancet 363:1099-1103.

[17] Documento W000/60050.

[18] Documento W001/04333.

[19] Patente de Estados Unidos 6649372.

[20] Neumann et al. (2005) Proc Natl Acad Sci USA 102:16825-9.

[21] Documento W02006/067211.

[22] Documento W001/83794.

[23] Hoffmann et al. (2000) Virology 267(2):310-7.

[24] Herlocher et al. (2004) J Infect Dis 190(9):1627-30.

[25] Le et al. (2005) Nature 437(7062): 1108.

[26] Gambaryan y Matrosovich (1992) J Virol Methods 39(1-2): 111-23.

[27] Mastrosovich et al. (1999) J Virol 73: 1146-55.

[28] Stevens et al, (2006) J Mol Biol 355:1143-55.

[29] Couceiro y Baum (1994) Mem Inst Oswaldo Cruz 89(4):587-91.

[30] Documento W02008/068631.

[31] Rota et al. (1992) J Gen Virol 73:2737-42.

[32] GenBank sequense GI:325176,

[33] McCullers et al. (1999) J Virol 73:7343-8.

[34] GenBank sequense GI:325237.

[35] Treanor et al. (1996) J Infect Dis 173:1467-70.

[36] Keitel et al. (1996) Clin Diagn Lab Immunol 3:507-10.

[37] Kistner et al. (1998) Vaccine 16:960-8.

[38] Kistner et al. (1999) Dev Biol Stand 98:101-110.

[39] Bruhl et al. (2000) Vaccine 19:1149-58.

[40] Pau et al. (2001) Vaccine 19:2716-21.

[41]
http://www.atcc.org/

[42]
http://locus.umdnj.edu/

[43] Documento W003/076601.

[44] Documento W02005/042728.

[45] Documento W003/043415.

[46] Documento W001/85938.

[47] Documento W02006/108846.

[48] Documento W097/37000.

[49] Brands et al, (1999) Dev Biol Stand 98:93-100.

[50] Halperin et al. (2002) Vaccine 20:1240-7.

[51] Tree et al, (2001) Vaccine 19:3444-50.

[52] Documento EP-A-1260581 (W001/64846).

[53] Documento W02006/071563.

[54] Documento W02005/113758.

[55] Documento W097137001.

[56] Documento W02006/027698.

[57] Documento EP-B-0870508.

[58] Documento US 5948410.

[59] Lundblad (2001) Biotechnology and Applied Biochemistry 34:195-197.

[60] Gula para la Industria: Validacion del metodo bioanalltico. U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration Center for Drug Evaluation and Research (CDER) Center for Veterinary Medicine (CVM). Mayo de 2001.

[61] Ji et al. (2002) Biotechniques. 32:1162-7.

[62] Briggs (1991) J Parenter Sci Technol. 45:7-12.

[63] Lahijani et al. (1998) Hum Gene Ther. 9:1173-80.

[64] Lokteff et al. (2001) Biologicals. 29:123-32.

[65] Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy. 20a edicion, ISBN: 0683306472.

[66] Banzhoff (2000) Immunology Letters 71:91-96.

[67] 0'Hagan (2007) Expert Rev Vaccines. 6(5):699-710.

[68] Bernstein et al. (2008) J Infect Dis. 197(5):667-75.

[69] Stephenson et al. (2005) J Infect Dis. 191(8):1210-5.

[70] Han et al. (2005) Impact of Vitamin E on Immune Function and Infectious Disease in the Aged at Nutrition, Immune functions and Health EuroConference, Paris, 9-10 Junio de 2005.

[71] Documento US -6630161.

[72] Documento W090/14837.

[73] Podda y Del Giudice (2003) Expert Rev Vaccines 2:197-203.

[74] Podda (2001) Vaccine 19: 2673-2680.

[75] Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Powell y Newman) Plenum Press 1995 (ISBN 0-

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60

65

306-44867-X).

[76] Vaccine Adjuvants: Preparation Methods and Research Protocols (Volumen 42 de Methods in Molecular Medicine series). ISBN: 1-59259-083-7. Ed. O'Hagan.

[77] Allison y Byars (1992) Res Immunol 143:519-25.

[78] Haxiharan et al. (1995) Cancer Res 55:3486-9.

[79] Documento US-2007/0014805.

[80] Documento US-2007/0191314.

[81] Suli et al. (2004) Vaccine 22(25-26): 3464-9.

[82] Documento WO95111700.

[83] Patente de Estados Unidos 6.080.725.

[84] Documento WO2005/09718.

[85] Documento WO2006/113373.

[86] Potter y Oxford (1979) Br Med Bull 35: 69-75.

[87] Halperin et al. (1979) Am J Public Health 69:1247-50.

[88] Herbert et al. (1979) J Infect Dis 140:234-8.

[89] Greenbaum et al. (2004) Vaccine 22:2566-77.

[90] Zurbriggen et al. (2003) Expert Rev Vaccines 2:295-304.

[91] Piascik (2003) J Am Pharm Assoc (Wash DC). 43:728-30.

[92] Mann et al. (2004) Vaccine 22:2425-9.

[93] Chen et al. (2003) Vaccine 21:2830-6.

Claims (7)

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   REIVINDICACIONES

   1. Una vacuna contra el virus de la gripe para su uso para provocar una respuesta inmunitaria en un paciente de 6 a < 36 meses de edad que comprende: (i) la hemaglutinina de al menos dos cepas del virus de la gripe A y al menos dos cepas del virus de la gripe B, en laque el concentracion de hemaglutinina por cepa es al menos 25 pg/ml; y (ii) un adyuvante en emulsion de aceite en agua con gotas de aceite submicronicas, que comprende escualeno, en la que la concentracion de escualeno es < 10 mg/ml y la cantidad minima de escualeno por dosis es de 0,5 mg, y en la que las cepas del virus de la gripe B incluyen una cepa del virus de la gripe B de tipo B/Victoria/2/87 y una cepa del virus de la gripe B del tipo B/Yamagata/16/88 y en la que la vacuna tiene un volumen de dosis unitaria de 0,2-0,3 ml o 0,5 ml.
2. 2. La vacuna para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que la hemaglutinina esta en forma de viriones fraccionados o antlgenos de superficie purificados.
3. 3. La vacuna para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, que tiene un volumen de dosis unitaria de 0,25 ml.
4. 4. La vacuna para su uso de acuerdo con cualquier reivindicacion precedente,

   (a) que comprende hemaglutinina de: (i) una cepa del virus de la gripe A H1N1; (ii) una cepa del virus de la gripe A H3N2; (iii) una cepa del virus de la gripe B de tipo B/Victoria/2/87; y (iv) una cepa del virus de la gripe B de tipo B/Yamagata/16/88; y/o

   (b) en la que la relacion en peso de escualeno y hemaglutinina en la vacuna esta en el intervalo de 20 a 180.
5. 5. La vacuna para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 y 4, en la que la vacuna es

   (a) una vacuna contra la gripe inactivada tetravalente con una cepa A/H1N1, una cepa A/H3N2 , una cepa del virus de la gripe B en el linaje B/Yamagata y una cepa del virus de la gripe B en el linaje B/Victoria , que tiene una concentracion de hemaglutinina de 30 pg/ml por cepa, una concentracion de escualeno de 9,75mg/ml y un volumen de dosificacion unitaria de 0,5 ml; o

   (b) una vacuna contra la gripe inactivada tetravalente con una cepa A/H1N1, una cepa A/H3N2 , una cepa del virus de la gripe B en el linaje B/Yamagata y una cepa del virus de la gripe B en el linaje B/Victoria , que tiene una concentracion de hemaglutinina de 30 pg/ml por cepa, una concentracion de escualeno de 4,88 mg/ml y un volumen de dosificacion unitaria de 0,5 ml.
6. 6. La vacuna para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que la vacuna es

   (a) una vacuna contra la gripe inactivada tetravalente con una cepa A/H1N1, una cepa A/H3N2 , una cepa del virus de la gripe B en el linaje B/Yamagata y una cepa del virus de la gripe B en el linaje B/Victoria , que tiene una concentracion de hemaglutinina de 30 pg/ml por cepa, una concentracion de escualeno de 9,75mg/ml y un volumen de dosificacion unitaria de 0,25 ml; o

   (b) una vacuna contra la gripe inactivada tetravalente con una cepa A/H1N1, una cepa A/H3N2 , una cepa del virus de la gripe B en el linaje B/Yamagata y una cepa del virus de la gripe B en el linaje B/Victoria , que tiene una concentracion de hemaglutinina de 30 pg/ml por cepa, una concentracion de escualeno de 4,88 mg/ml y un volumen de dosificacion unitaria de 0,25 ml.
7. 7. Uso de una vacuna como se define en cualquier reivindicacion precedente en la fabricacion de un medicamento para provocar una respuesta inmunitaria en un paciente de 6 a < 36 meses de edad.