ES2698565A1 - Procedimiento para la elaboración de nanopartículas lipídicas, y nanopartículas lipídicas con los macrófagos cerebrales como células diana - Google Patents
Procedimiento para la elaboración de nanopartículas lipídicas, y nanopartículas lipídicas con los macrófagos cerebrales como células diana Download PDFInfo
- Publication number
- ES2698565A1 ES2698565A1 ES201800272A ES201800272A ES2698565A1 ES 2698565 A1 ES2698565 A1 ES 2698565A1 ES 201800272 A ES201800272 A ES 201800272A ES 201800272 A ES201800272 A ES 201800272A ES 2698565 A1 ES2698565 A1 ES 2698565A1
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- lipid
- lipid nanoparticles
- cholesterol
- nucleic acid
- peg
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 title claims abstract description 160
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 title claims abstract description 97
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 55
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 title claims abstract description 31
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 title claims abstract description 31
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 16
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 15
- 230000027455 binding Effects 0.000 title description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 46
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 44
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 44
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 10
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims abstract description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 8
- 239000007822 coupling agent Substances 0.000 claims abstract description 7
- 150000002703 mannose derivatives Chemical class 0.000 claims abstract description 5
- 230000000626 neurodegenerative effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- -1 cationic lipid Chemical class 0.000 claims description 38
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 claims description 37
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 30
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 30
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 claims description 22
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 claims description 21
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 claims description 21
- ATUOYWHBWRKTHZ-UHFFFAOYSA-N Propane Chemical compound CCC ATUOYWHBWRKTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- 229910001868 water Inorganic materials 0.000 claims description 20
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 claims description 19
- ISXSJGHXHUZXNF-LXZPIJOJSA-N [(3s,8s,9s,10r,13r,14s,17r)-10,13-dimethyl-17-[(2r)-6-methylheptan-2-yl]-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-dodecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-3-yl] n-[2-(dimethylamino)ethyl]carbamate;hydrochloride Chemical compound Cl.C1C=C2C[C@@H](OC(=O)NCCN(C)C)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 ISXSJGHXHUZXNF-LXZPIJOJSA-N 0.000 claims description 17
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 14
- 239000000693 micelle Substances 0.000 claims description 13
- 239000012071 phase Substances 0.000 claims description 13
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 11
- 239000001294 propane Substances 0.000 claims description 10
- 230000000536 complexating effect Effects 0.000 claims description 8
- 239000008188 pellet Substances 0.000 claims description 8
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 8
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 7
- PSLWZOIUBRXAQW-UHFFFAOYSA-M dimethyl(dioctadecyl)azanium;bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)CCCCCCCCCCCCCCCCCC PSLWZOIUBRXAQW-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 7
- GLGLUQVVDHRLQK-WRBBJXAJSA-N n,n-dimethyl-2,3-bis[(z)-octadec-9-enoxy]propan-1-amine Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCCOCC(CN(C)C)OCCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC GLGLUQVVDHRLQK-WRBBJXAJSA-N 0.000 claims description 7
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 7
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 6
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 claims description 6
- WGYKZJWCGVVSQN-UHFFFAOYSA-N propylamine Chemical group CCCN WGYKZJWCGVVSQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 claims description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 6
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 5
- 241000446313 Lamella Species 0.000 claims description 5
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 claims description 5
- SNKAWJBJQDLSFF-YEUCEMRASA-N [2-({2,3-bis[(9z)-octadec-9-enoyloxy]propyl phosphonato}oxy)ethyl]trimethylazanium Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC(COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC SNKAWJBJQDLSFF-YEUCEMRASA-N 0.000 claims description 5
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 5
- 238000005056 compaction Methods 0.000 claims description 5
- 238000010668 complexation reaction Methods 0.000 claims description 5
- 230000001687 destabilization Effects 0.000 claims description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 5
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 claims description 5
- LDGWQMRUWMSZIU-LQDDAWAPSA-M 2,3-bis[(z)-octadec-9-enoxy]propyl-trimethylazanium;chloride Chemical compound [Cl-].CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCCOCC(C[N+](C)(C)C)OCCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC LDGWQMRUWMSZIU-LQDDAWAPSA-M 0.000 claims description 4
- WALUVDCNGPQPOD-UHFFFAOYSA-M 2,3-di(tetradecoxy)propyl-(2-hydroxyethyl)-dimethylazanium;bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCOCC(C[N+](C)(C)CCO)OCCCCCCCCCCCCCC WALUVDCNGPQPOD-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 4
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 claims description 4
- 241001441550 Zeiformes Species 0.000 claims description 4
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 claims description 4
- JGENYNHRIOHZOP-UHFFFAOYSA-N ethyl 2-(trimethylazaniumyl)ethyl phosphate Chemical class CCOP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C JGENYNHRIOHZOP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 4
- 238000005621 mannosylation reaction Methods 0.000 claims description 4
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 4
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 claims description 4
- LVNGJLRDBYCPGB-LDLOPFEMSA-N (R)-1,2-distearoylphosphatidylethanolamine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[NH3+])OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC LVNGJLRDBYCPGB-LDLOPFEMSA-N 0.000 claims description 3
- YHHSONZFOIEMCP-UHFFFAOYSA-N 2-(trimethylazaniumyl)ethyl hydrogen phosphate Chemical class C[N+](C)(C)CCOP(O)([O-])=O YHHSONZFOIEMCP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- GZDFHIJNHHMENY-UHFFFAOYSA-N Dimethyl dicarbonate Chemical compound COC(=O)OC(=O)OC GZDFHIJNHHMENY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- HIHOWBSBBDRPDW-PTHRTHQKSA-N [(3s,8s,9s,10r,13r,14s,17r)-10,13-dimethyl-17-[(2r)-6-methylheptan-2-yl]-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-dodecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-3-yl] n-[2-(dimethylamino)ethyl]carbamate Chemical compound C1C=C2C[C@@H](OC(=O)NCCN(C)C)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HIHOWBSBBDRPDW-PTHRTHQKSA-N 0.000 claims description 3
- SWLVFNYSXGMGBS-UHFFFAOYSA-N ammonium bromide Chemical compound [NH4+].[Br-] SWLVFNYSXGMGBS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000001125 extrusion Methods 0.000 claims description 3
- 229960004956 glycerylphosphorylcholine Drugs 0.000 claims description 3
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 claims description 3
- PORPENFLTBBHSG-MGBGTMOVSA-N 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycerol-3-phosphate Chemical group CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC PORPENFLTBBHSG-MGBGTMOVSA-N 0.000 claims description 2
- UKJLNMAFNRKWGR-UHFFFAOYSA-N cyclohexatrienamine Chemical group NC1=CC=C=C[CH]1 UKJLNMAFNRKWGR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 claims description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 2
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 claims description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 2
- 208000020016 psychiatric disease Diseases 0.000 claims description 2
- 229940063675 spermine Drugs 0.000 claims description 2
- OPCHFPHZPIURNA-MFERNQICSA-N (2s)-2,5-bis(3-aminopropylamino)-n-[2-(dioctadecylamino)acetyl]pentanamide Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCN(CC(=O)NC(=O)[C@H](CCCNCCCN)NCCCN)CCCCCCCCCCCCCCCCCC OPCHFPHZPIURNA-MFERNQICSA-N 0.000 claims 3
- KHWUKFBQNNLWIV-KPNWGBFJSA-N (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-dimethyl-17-[(2R)-6-methylheptan-2-yl]-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-dodecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-3-ol hydrochloride Chemical compound Cl.C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 KHWUKFBQNNLWIV-KPNWGBFJSA-N 0.000 claims 2
- DNQHPJQDWYMVSV-KTKRTIGZSA-N CCCCCCCC/C=C\CCCCCCCC(=O)OC1=CC=CC=C1C(=O)N Chemical compound CCCCCCCC/C=C\CCCCCCCC(=O)OC1=CC=CC=C1C(=O)N DNQHPJQDWYMVSV-KTKRTIGZSA-N 0.000 claims 2
- XULFJDKZVHTRLG-JDVCJPALSA-N DOSPA trifluoroacetate Chemical compound [O-]C(=O)C(F)(F)F.CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCCOCC(C[N+](C)(C)CCNC(=O)C(CCCNCCCN)NCCCN)OCCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC XULFJDKZVHTRLG-JDVCJPALSA-N 0.000 claims 2
- ROSDSFDQCJNGOL-UHFFFAOYSA-N Dimethylamine Chemical compound CNC ROSDSFDQCJNGOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- TWOFBVMVSYSAFW-UFUGHDFUSA-N N'-(3-aminopropyl)butane-1,4-diamine (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-dimethyl-17-[(2R)-6-methylheptan-2-yl]-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-dodecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-3-ol guanidine Chemical compound NC(N)=N.NC(N)=N.NCCCCNCCCN.C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 TWOFBVMVSYSAFW-UFUGHDFUSA-N 0.000 claims 2
- QFMZQPDHXULLKC-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(diphenylphosphino)ethane Chemical compound C=1C=CC=CC=1P(C=1C=CC=CC=1)CCP(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 QFMZQPDHXULLKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- CITHEXJVPOWHKC-UUWRZZSWSA-N 1,2-di-O-myristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCCCCCCC CITHEXJVPOWHKC-UUWRZZSWSA-N 0.000 claims 1
- LVQAUWCYEILDRB-CLFAGFIQSA-N 2-[3-(2-hydroxyethyl)-2-[(Z)-octadec-9-enyl]imidazol-3-ium-1-yl]ethyl (Z)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCCC=1N(CCOC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC)C=C[N+]=1CCO LVQAUWCYEILDRB-CLFAGFIQSA-N 0.000 claims 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 1
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-M Trifluoroacetate Chemical compound [O-]C(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 claims 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 claims 1
- 150000003840 hydrochlorides Chemical class 0.000 claims 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract description 6
- 238000007306 functionalization reaction Methods 0.000 abstract description 5
- 230000007170 pathology Effects 0.000 abstract description 4
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 abstract 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract 1
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 abstract 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 abstract 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 36
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 15
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 12
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 11
- WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N phosphatidylcholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N 0.000 description 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 11
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 9
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 8
- 102100033279 Prostaglandin-H2 D-isomerase Human genes 0.000 description 8
- 101710145576 Prostaglandin-H2 D-isomerase Proteins 0.000 description 8
- 230000008499 blood brain barrier function Effects 0.000 description 8
- 210000001218 blood-brain barrier Anatomy 0.000 description 8
- 239000010408 film Substances 0.000 description 8
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 8
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 8
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 description 7
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 description 7
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 7
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 7
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 7
- 108020000948 Antisense Oligonucleotides Proteins 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 6
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 6
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 6
- 210000003067 perivascular macrophage Anatomy 0.000 description 6
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- 238000004627 transmission electron microscopy Methods 0.000 description 6
- SNKAWJBJQDLSFF-NVKMUCNASA-N 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC SNKAWJBJQDLSFF-NVKMUCNASA-N 0.000 description 5
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 5
- COQLPRJCUIATTQ-UHFFFAOYSA-N Uranyl acetate Chemical compound O.O.O=[U]=O.CC(O)=O.CC(O)=O COQLPRJCUIATTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 5
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 5
- 210000001718 meningeal macrophage Anatomy 0.000 description 5
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 108010031099 Mannose Receptor Proteins 0.000 description 4
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 4
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000011258 core-shell material Substances 0.000 description 4
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 4
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 4
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N methane Chemical compound C VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 108091052347 Glucose transporter family Proteins 0.000 description 3
- 102000042092 Glucose transporter family Human genes 0.000 description 3
- 241000700157 Rattus norvegicus Species 0.000 description 3
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 238000002296 dynamic light scattering Methods 0.000 description 3
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 3
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 3
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 3
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 3
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 3
- 238000000185 intracerebroventricular administration Methods 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 210000004779 membrane envelope Anatomy 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 2
- DSNRWDQKZIEDDB-SQYFZQSCSA-N 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-sn-glycerol) Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OC[C@@H](O)CO)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC DSNRWDQKZIEDDB-SQYFZQSCSA-N 0.000 description 2
- WTBFLCSPLLEDEM-JIDRGYQWSA-N 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OC[C@H](N)C(O)=O)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC WTBFLCSPLLEDEM-JIDRGYQWSA-N 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 6-carboxyfluorescein Chemical compound C12=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C2C11OC(=O)C2=CC=C(C(=O)O)C=C21 BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000234282 Allium Species 0.000 description 2
- 235000002732 Allium cepa var. cepa Nutrition 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100025064 Cellular tumor antigen p53 Human genes 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylethanolamin Natural products NCCOP(O)(=O)OCC(O)CO JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 2
- 108030003866 Prostaglandin-D synthases Proteins 0.000 description 2
- 102000048176 Prostaglandin-D synthases Human genes 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 2
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 235000011089 carbon dioxide Nutrition 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 2
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 2
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 description 2
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 210000003140 lateral ventricle Anatomy 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 210000002418 meninge Anatomy 0.000 description 2
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 2
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 2
- WEXRUCMBJFQVBZ-UHFFFAOYSA-N pentobarbital Chemical compound CCCC(C)C1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O WEXRUCMBJFQVBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000008104 phosphatidylethanolamines Chemical class 0.000 description 2
- YHHSONZFOIEMCP-UHFFFAOYSA-O phosphocholine Chemical compound C[N+](C)(C)CCOP(O)(O)=O YHHSONZFOIEMCP-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000007447 staining method Methods 0.000 description 2
- 238000013517 stratification Methods 0.000 description 2
- KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N succinimide Chemical compound O=C1CCC(=O)N1 KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 239000010409 thin film Substances 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 2
- USMYORLRWPKVRD-GCHJQGSQSA-N (2S,3S,4S,5S,6R)-2-(4-aminophenyl)-6-(hydroxymethyl)oxane-2,3,4,5-tetrol Chemical compound NC1=CC=C(C=C1)[C@@]1(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO USMYORLRWPKVRD-GCHJQGSQSA-N 0.000 description 1
- WYTZZXDRDKSJID-UHFFFAOYSA-N (3-aminopropyl)triethoxysilane Chemical compound CCO[Si](OCC)(OCC)CCCN WYTZZXDRDKSJID-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000954 2-hydroxyethyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])O[H] 0.000 description 1
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010048998 Acute phase reaction Diseases 0.000 description 1
- 239000012099 Alexa Fluor family Substances 0.000 description 1
- 102000013918 Apolipoproteins E Human genes 0.000 description 1
- 108010025628 Apolipoproteins E Proteins 0.000 description 1
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 101150041968 CDC13 gene Proteins 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000116 DAPI staining Methods 0.000 description 1
- 108010008286 DNA nucleotidylexotransferase Proteins 0.000 description 1
- 102100033215 DNA nucleotidylexotransferase Human genes 0.000 description 1
- OTMSDBZUPAUEDD-UHFFFAOYSA-N Ethane Chemical compound CC OTMSDBZUPAUEDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 1
- YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N Ketamine Chemical compound C=1C=CC=C(Cl)C=1C1(NC)CCCCC1=O YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WTDRDQBEARUVNC-UHFFFAOYSA-N L-Dopa Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C(O)=C1 WTDRDQBEARUVNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000174 L-prolyl group Chemical group [H]N1C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[C@@]1([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 102000019298 Lipocalin Human genes 0.000 description 1
- 108050006654 Lipocalin Proteins 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010059712 Pronase Proteins 0.000 description 1
- 102000000574 RNA-Induced Silencing Complex Human genes 0.000 description 1
- 108010016790 RNA-Induced Silencing Complex Proteins 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- HEDRZPFGACZZDS-MICDWDOJSA-N Trichloro(2H)methane Chemical compound [2H]C(Cl)(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-MICDWDOJSA-N 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- JLPULHDHAOZNQI-JLOPVYAASA-N [(2r)-3-hexadecanoyloxy-2-[(9e,12e)-octadeca-9,12-dienoyl]oxypropyl] 2-(trimethylazaniumyl)ethyl phosphate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCC\C=C\C\C=C\CCCCC JLPULHDHAOZNQI-JLOPVYAASA-N 0.000 description 1
- GXIBDMYNXXCHFL-CLFAGFIQSA-N [2-aminoethoxy-[(Z)-octadec-9-enoyl]oxyphosphoryl] (Z)-octadec-9-enoate Chemical compound C(CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC)(=O)OP(=O)(OC(CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC)=O)OCCN GXIBDMYNXXCHFL-CLFAGFIQSA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000004658 acute-phase response Effects 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 238000000211 autoradiogram Methods 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 210000000133 brain stem Anatomy 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 208000015114 central nervous system disease Diseases 0.000 description 1
- 210000001638 cerebellum Anatomy 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000003098 cholesteric effect Effects 0.000 description 1
- ACSIXWWBWUQEHA-UHFFFAOYSA-N clodronic acid Chemical compound OP(O)(=O)C(Cl)(Cl)P(O)(O)=O ACSIXWWBWUQEHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002286 clodronic acid Drugs 0.000 description 1
- ACSIXWWBWUQEHA-UHFFFAOYSA-L clondronate(2-) Chemical compound OP([O-])(=O)C(Cl)(Cl)P(O)([O-])=O ACSIXWWBWUQEHA-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- MHUWZNTUIIFHAS-CLFAGFIQSA-N dioleoyl phosphatidic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(O)=O)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC MHUWZNTUIIFHAS-CLFAGFIQSA-N 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 231100000318 excitotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003492 excitotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 229920005570 flexible polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000003862 glucocorticoid Substances 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001320 hippocampus Anatomy 0.000 description 1
- 230000036571 hydration Effects 0.000 description 1
- 238000006703 hydration reaction Methods 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 239000011261 inert gas Substances 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 229960003299 ketamine Drugs 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229960004502 levodopa Drugs 0.000 description 1
- 150000002634 lipophilic molecules Chemical class 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 238000007726 management method Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 description 1
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 1
- 230000004001 molecular interaction Effects 0.000 description 1
- 210000000865 mononuclear phagocyte system Anatomy 0.000 description 1
- 239000012120 mounting media Substances 0.000 description 1
- FFJMLWSZNCJCSZ-UHFFFAOYSA-N n-methylmethanamine;hydrobromide Chemical compound Br.CNC FFJMLWSZNCJCSZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000031990 negative regulation of inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 230000009251 neurologic dysfunction Effects 0.000 description 1
- 208000015015 neurological dysfunction Diseases 0.000 description 1
- 230000007171 neuropathology Effects 0.000 description 1
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 230000036542 oxidative stress Effects 0.000 description 1
- 230000000242 pagocytic effect Effects 0.000 description 1
- 229960001412 pentobarbital Drugs 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 210000003024 peritoneal macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010587 phase diagram Methods 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 150000003141 primary amines Chemical class 0.000 description 1
- 230000000861 pro-apoptotic effect Effects 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- UQOQENZZLBSFKO-POPPZSFYSA-N prostaglandin J2 Chemical compound CCCCC[C@H](O)\C=C\[C@@H]1[C@@H](C\C=C/CCCC(O)=O)C=CC1=O UQOQENZZLBSFKO-POPPZSFYSA-N 0.000 description 1
- 150000003180 prostaglandins Chemical class 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 238000002390 rotary evaporation Methods 0.000 description 1
- 238000005204 segregation Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 229960002317 succinimide Drugs 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 229940037128 systemic glucocorticoids Drugs 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000031998 transcytosis Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 230000002227 vasoactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N xylazine Chemical compound CC1=CC=CC(C)=C1NC1=NCCCS1 BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001600 xylazine Drugs 0.000 description 1
- 238000000733 zeta-potential measurement Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/44—Oils, fats or waxes according to two or more groups of A61K47/02-A61K47/42; Natural or modified natural oils, fats or waxes, e.g. castor oil, polyethoxylated castor oil, montan wax, lignite, shellac, rosin, beeswax or lanolin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
- B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nanotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medical Informatics (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Procedimiento para la elaboración de nanopartículas lipídicas, y nanopartículas lipídicas con los macrófagos cerebrales como células diana. La invención se refiere a un procedimiento para elaborar nanopartículas lipídicas especialmente dirigidas contra los macrófagos cerebrales perivasculares y meníngeos, que incluye la adición de un derivado de manosa en su capa lipídica como componente funcional que favorece la interacción con la membrana plasmática de las células diana. La funcionalización de las nanopartículas lipídicas se realiza en una etapa intermedia del procedimiento y mediante una reacción directa en la que no se necesita un agente acoplante, evitando la utilización de agentes tóxicos. La invención también se refiere a las nanopartículas lipídicas multilamelares que se obtienen mediante este procedimiento cuyo núcleo, especialmente denso, incluye un ácido nucleico con interés terapéutico y a sus aplicaciones frente a patologías neurológicas/ neurodegenerativas y/o psiquiátricas.
Description
D E S C R I P C I Ó N
PROCEDIMIENTO PARA LA ELABORACIÓN DE NANOPARTÍCULAS LIPÍDICAS, Y NANOPARTÍCULAS LIPÍDICAS CON LOS MACRÓFAGOS CEREBRALES COMO
CÉLULAS DIANA
SECTOR DE LA TÉCNICA
La presente invención se encuadra en los sectores de la farmacología y la biotecnología. Más concretamente, en la nanofarmacología y la nanobiotecnología con el desarrollo de nanopartículas lipídicas que contienen material genético cuya utilidad se centra en el tratamiento de patologías del sistema nervioso central.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La barrera hematoencefálica (BHE) es fundamental para aislar y proteger al cerebro de la entrada de sustancias potencialmente Indeseables o dañinas a través del sistema de circulación de la sangre. Además de su efecto protector, la BHE también supone un Impedimento para la entrada de sustancias terapéuticas en el cerebro, bien porque no la pueden atravesar en cantidad suficiente como para ejercer efectivamente su función, bien porque son rápidamente degradadas, o porque los mecanismos activos de la propia barrera los bombean hacia el exterior.
Por otro lado, son muchas las enfermedades que pueden afectar al cerebro y que preocupan a la sociedad, y son muchos los estudios que se están realizando para desarrollar las terapias adecuadas. Sin embargo, más Importante que encontrar principios activos efectivos es desarrollar métodos para que los fármacos administrados lleguen de forma eficiente hasta el cerebro traspasando la BHE. En Chen, Y. et al. (2004). Drug Delivery Across the Blood-Brain Barrier. Curr Drug Deliv 1:361-376 se recopilan distintos métodos para administrar terapias capaces de atravesar la BHE. Existen en la actualidad métodos invasivos basados en cirugía o en la disrupción de la BHE mediante osmosis, cltocinas o productos vasoactivos. Los métodos no invasivos cubren diferentes aproximaciones mediante transporte basado en interacciones moleculares (enlaces de hidrógeno, compuestos lipofílicos), transcitosis mediada por portadores y receptores e Inhibición del sistema de flujo (sistemas de liberación de productos químicos, liposomas, nanopartículas). A consecuencia del desarrollo de estos métodos se han producido grandes avances en el uso de liposomas para la
administración de fármacos. En Arias, J.L. (2013). Liposomes ¡n drug delivery: a patent review (2007 - present). Expert Opin Ther Pat 23:1399-414 encontramos una revisión de las patentes publicadas entre 2007 y 2012 sobre el uso de liposomas como vehículos sistémlcos de fármacos, y entre ellas se recogen algunas relacionadas con su uso en cerebro.
Uno de los usos más extendidos de los liposomas es la depleción de los macrófagos cerebrales residentes. Los macrófagos cerebrales residentes forman parte de la BHE y son esenciales en la regulación de la entrada de moléculas al parénquima cerebral, además de orquestar una respuesta pro/antiinflamatoria dependiendo del estímulo inflamatorio. Según su localización, se subdividen en macrófagos perivasculares y meníngeos. De este modo, van Rooijen y Sanders (Van Rooijen N, Sanders A (1994). Liposome mediated depletion of macrophages: mechanism of action, preparador) of liposomes and applications. J Immunol Methods 174 (1-2):83-93) desarrollaron una técnica de depleción selectiva de macrófagos perivasculares y meníngeos tras la administración intracerebroventricular de la molécula proapoptótica clodronato (diclorometileno-bisfosfonato) en una suspensión concentrada y heterogénea de liposomas con una distribución amplia de tamaños y formas. El método de elaboración de liposomas descrito por estos autores considera la mezcla de fosfatidllcolina y colesterol en cloroformo, retirando el cloroformo mediante evaporación en vacío para obtener una fina película de fosfolípidos que, posteriormente, se dispersa en una solución acuosa y se mantiene bajo nitrógeno durante 1,5-2 horas. El procedimiento de formación de liposomas se completa con sonicación, lavado con PBS, sedimentación y resuspensión final en PBS.
Posteriormente, dichos liposomas se han modificado para favorecer su unión específicamente a los macrófagos de la BHE. Du, D. et al., en su artículo The role of glucose transporters in the distribution of p-aminophenyl-alpha-D-mannopyranos¡de modified liposomes within mice brain de 2014 {J. Control Release 182:99-110), describen la funcionalización de liposomas con un derivado de mañosa, p-aminofenil-a-D-manopiranósido (MAN), para que estos atraviesen la BHE y se dirijan específicamente a ciertas zonas del cerebro (córtex, cerebelo, tronco encefálico e hipocampo). La incorporación de MAN a la superficie del llposoma se realiza una vez formado el liposoma, según un procedimiento que comprende el uso de glutaraldehído como agente acoplante y la posterior diálisis para eliminar tanto el glutaraldehído como el
componente MAN no unidos al liposoma. Ese estudio se enfoca en el diseño de vehículos capaces de cruzar la BHE a través de los transportadores de glucosa (GLUT) localizados en las células endoteliales. El estudio considera la unión inespecífica del derivado manosilado a la superficie del liposoma, aunque no garantiza un alto rendimiento de funcionalización ni realiza una optimización de la composición lipídica.
Atendiendo a las moléculas terapéuticas utilizadas en preparados liposomales específicos para atravesar la BHE, se han incluido distintos ácidos nucleicos en liposomas, especialmente oligonucleótidos antisentido con genes diana específicos. El documento Neurons Are Protected from Excitotoxic Death by p53 Antisense Oligonucleotides Delivered in Anionic Liposomes (Lakkaraju, A. et al. (2001) J Biol Chem 276:32000-32007) hace referencia a un estudio comparativo de la eficacia de distintos liposomas aniónicos y catiónicos como vehículos de oligonucleótidos antisentido dirigidos específicamente a inhibir la expresión de p53 en neuronas. Entre los liposomas descritos en la literatura se encuentran aquellos constituidos por la interacción del oligonucleótido con DOPC/DOPG, DOPC/DOPS, DOPC/DOPA o DC-Colesterol/DOPE (siendo DOPC, dioleoil-glicerofosfocolina; DOPG, dioleoil-glicerofosfoglicerol; DOPS, dioleoil-glicerofosfoserina; DC-Colesterol, dimetilaminoetano-carbamil-colestero!; y DOPE, dioleoil-fosfoetanolamina). En estos estudios, el DC-Colesterol se selecciona como componente lipídico catiónico modelo, ya que es bien tolerado por las neuronas por su baja toxicidad; sin embargo, en estos estudios también se comprueba que las neuronas sobreviven al desafío solo cuando la proporción de lípido catiónico da lugar a un complejo con carga neta superficial negativa. En caso de que la carga sea neutra o positiva, se observa una gran pérdida de neuronas.
La patente ES2638309T3 describe conjugados formados por ácidos nucleicos específicos para una diana de interés y un componente lipídico que permite la distribución de los ácidos nucleicos a células específicas en el sistema nervioso central. Estos conjugados comprenden liposomas con fosfolípidos neutros tales como POPC (palmitoil-oleoil-glicerofosfocolina), DSPE (distearoil-glicerofosfoetanolamina) o colesterol, junto con pequeñas cantidades de lípidos catiónicos.
En el trabajo Mannose receptor-mediated gene transfer into macrophages using novel mannosylated cationic liposomes (Kawakami, S. et al. (2000) Gene Therapy 7:292-299), se hace referencia a complejos ADN-liposoma en los que el liposoma se funcionaliza
con un derivado de colestero! manosilado (colesten-5-i!oxi-N-(4-((1-imino-2-(3-D-tiomanosil-etil)amino)butii)formamida). Este estudio demuestra que estos liposomas funcionalizados permiten obtener una alta transfección en macrófagos peritoneales de ratón. La eficacia en la transfección se basa en el hecho de que los macrófagos expresan grandes cantidades de receptores de mañosa en su superficie, por tanto, los receptores de mañosa reconocen y absorben los complejos de ADN y liposomas manosilados.
El documento Multifunctional Nanoparticles Facilítate Molecular Targeting and mIRNA Delivery to Inhibit Atherosclerosis in ApoE(-/-) Mice de Kheirolomoon, A., et al. ((2015) ACS Nano 9:8885-8897) describe unos liposomas del tipo “core-shell” que poseen un núcleo (“core”) constituido por un olígonucleótido (anti-miRNA) estabilizado electrostáticamente con DOTAP (dioleoiloxi-trimetilamonio propano). Además, presentan una cubierta (“shell”) lipídica neutra constituida por HSPC (fosfatidilcolina de soja hidrogenada), colesterol y DSPE-PEG2k (distearoil-glicerofosfoetanolamina-N[metoxi(polietilenglicol)-2000]). En este caso, la incorporación de un oligopéptido al componente lipídico pegilado hace que los liposomas obtenidos se dirijan a las células endoteliales diana.
En la búsqueda de una estrategia para la regulación de los macrófagos residentes en el sistema nervioso central y poder solucionar el obstáculo terapéutico que supone la BHE, la utilización de nanoliposomas (también denominadas nanopartículas lipídicas), como vehículos de ácidos nucleicos con efectos potencialmente terapéuticos, es una de las herramientas que actualmente ofrecen mayor promesa. Sin embargo, aún no se ha desarrollado una metodología sencilla y eficiente que permita obtener este tipo de nanovehículos liposomales específicamente dirigidos a los macrófagos perivasculares y meníngeos para modificarlos selectivamente.
EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN
Procedimiento para la elaboración de nanopartículas lipídicas, y nanopartículas lipídicas con los macrófagos cerebrales como células diana.
Un aspecto de la presente invención se refiere a un procedimiento para obtener nanopartículas lipídicas de tipo "core-shell”, o núcleo-corona, de estructura multilamelar conteniendo el material genético hibridado con un lípido catiónico biocompatible a alta
compactación en las láminas acuosas existentes entre las lámelas de las nanopartículas lipídicas. El procedimiento de síntesis de estas estructuras híbridas multilamelares incluye la complejación del ácido nucleico en fase acuosa con un lípldo catiónico biocompatible en fase orgánica. Dicha reacción de complejación permite la formación de estructuras encapsulantes similares a micelas inversas suspendidas en fase homogénea de marcado carácter orgánico (monofase de Bligh & Dyer, compuesta por cloroformo, metanol y agua). Dichas estructuras son coloides de asociación constituidos por el lípido catiónico biocompatible, con su fracción hidrofóbica expuesta al medio exterior disolvente (hacia la superficie de la micela) y su extremo polar dispuesto hacia el interior de una cavidad hidrofíiica (mayoritariamente acuosa en el corazón de la micela). Bajo condiciones de complejación con el ácido nucleico (de carga negativa), este queda residente en el interior de la estructura micelar inversa, interactuando con la cabeza polar del lípido catiónico biocompatible, todos los contraiones y el agua intersticial contenida en el interior de una nanocavidad altamente hidrofíiica en el corazón de la micela inversa. El material genético es un ácido nucleico. En general, puede ser de cualquier tipo (ácido ribonucleico o ácido desoxirribonucleico, monocatenario, bicatenario, lineal, circular o combinaciones de ellos) con la limitación de que su tamaño y flexibilidad sean compatibles con su Inserción en una cavidad de dimensiones nanométricas. Por tanto, mediante esta estrategia puede complejarse cualquier tipo de oligonucleótido, enrollado o lineal (microARN, ARNsi, ARNm) e Incluso ADN plasmídico. Asimismo, la secuencia del ácido nucleico puede incluir análogos de nucleótidos o nucleótidos modificados, con la única limitación de contener hidrofilicidad suficiente para mostrar una preferencia por la cavidad acuosa del interior de los complejos. La diferente carga del ácido nucleico se estabiliza variando la cantidad de lípido catiónico de la formulación. Ejemplos no limitativos de lípido catiónico biocompatible son: 1,2-di-0-octadecen¡i-3-trimetilamonio propano (DOTMA), 1,2-dioleiloxi-3-dimetillaminopropano (DODMA), dioleoiloxi-trimetilamonio propano (DOTAP), bromuro de amonio 1,2-dimiristiloxi-propil-3-dimetil-hidroxi etil amonio (DMRIE), cloruro de 1-[2-(oleoiloxi)etilo]-2-oleil-3-(2-hídrox¡etil)¡midazol¡nio (DOTIM), díoctadecíl-amido-gllcllo-espermina (DOGS), bromuro de 1,2-diol¡iloxipropil-3-dimetilhidroxietilamonio (DORIE), N1-[2-((1S)-1-[(3-aminopropil)amino]-4-[di(3-am¡noproplljaminojbutilcarboxamidojetilj-SA-dltoleiloxij-benzamida (MVL5), N4-colesterilespermina HCI Sal (GL67), bis-guanidium-tren-colesterol (BGTC), bís-guanidiniumespermidine-colesterol (BGSC), 3(3>-[N-(N',N'-dimetilaminoetano)-carbamo¡l]coiesterol clorhidrato (DC-Chol o DC-colesterol), cloruro de 1,2-dioleoil-sn-gllcero-3-etilfosfocolina
y derivados de etilfosfocolina (DOEPC), 213-dioleiloxi-N-(2-(esperminecarboxamido) etil)-N,N-dimetil-1-propanaminium trifluoroacetato (DOSPA). Alternativas clásicas de lípido catiónico utilizadas en estudios modelo son: bromuro de diactadecil-dimetilamonio (DODAB), bromuro de dimetildioctadecilamonio (DDAB), 1,2-diestearoil-3-trimetiiamonio propano (DSTAP). Preferentemente, dada su disponibilidad comercial, estabilidad química y coste reducido, se seleccionan derivados catiónicos de colesterol como BGTC, BGSC y, más preferentemente, DC-colesterol, un lípido natural funcionalizado con carga positiva.
En un primer paso del procedimiento se facilita la interacción del ácido nucleico disuelto en agua con el lípido catiónico biocompatible disuelto en cloroformo, en presencia de metano! estabilizando la monofase orgánica (pueden considerarse otras formulaciones similares a tas formadoras de monofase en el diagrama de fases de Bligh & Dyer). Preferentemente, se utiliza una formulación con el mínimo de cloroformo: 50% metano!, 30% cloroformo y 20% de agua (porcentajes en masa).
A continuación, se procede a la desestabilización de la monofase de Bligh & Dyer mediante la disminución efectiva del porcentaje de agente compatibilizante (metanol) a través de la adición de cloroformo y agua (preferentemente, hasta alcanzar una composición final: 30% metanol, 40% cloroformo y 30% de agua). Esto causa la separación de fases acuosa y orgánica, con la consiguiente segregación de los complejos híbridos en forma de micelas inversas en la fase orgánica y el posible exceso de ácido nucleico en la fase acuosa. En este segundo paso se concentran las micelas inversas en forma de partículas neutralizadas (ácido nucleico con lípido catiónico biocompatible) separándolas en una fase orgánica que más tarde servirá como medio de mezcla con el resto de lípidos que constituirán las bicapas de las futuras nanopartículas lipídicas multilamelares.
Por otro lado, se prepara la mezcla lipídica que constituye la base estructural de la estructura multilamelar basada en bicapas lipídicas. Para ello se crea una mezcla lipídica formadora de bicapas conteniendo entre sus componentes lípidos neutros manosilados que constituyen el elemento funcional que interactuará de forma específica con los macrófagos cerebrales residentes. Dichas bicapas lipídicas constituirán la estructura multilamelar capaz de compactar ácido nucleico a alta densidad. Concretamente, se utiliza una mezcla de fosfolípido insaturado y colesterol,
proporcionando fluidez a las bicapas lipídicas, junto con una pequeña cantidad de lípido manosilado, el cual proporciona funcionalidad y cuenta con suficiente flexibilidad para interactuar con los receptores de mañosa de la superficie de los macrófagos. Como fosfolípido insaturado, preferentemente se utiliza POPC. Como lípido manosilado se selecciona preferentemente DSPE-PEG(020GS)-MAN y se incluye una cantidad de lípido manosilado comprendida entre el 5 y el 15%, en masa.
Preferentemente, se utiliza un fosfolípido pegilado basado en diesteroilfosfatidiletanolamina (DSPE-PEG) funcionalizado con una mañosa en su extremo. Para ello, se utiliza un lípido fusionado a una cadena de polietilenglicol (PEG) y un grupo reactivo ester succinimidil (NHS) en su extremo (DSPE-PEG-NHS) y se hace reaccionar el grupo -NHS con el grupo -NH2 de p-aminofenil-a-D mannopiranosido (MAN) mediante una reacción directa que no necesita ningún agente acoplante. Para la formación de la película lipídica que más tarde constituirá la corona de la nanopartícula lipídica debe retirarse el solvente orgánico que ha servido para su homogeneización. Para ello puede emplearse cualquier método conocido por el experto en la materia para la evaporación del solvente orgánico como, por ejemplo, rotavapor (vacío), gas inerte.
En sustitución del fosfolípido insaturado POPC podrían utilizarse otras fosfocolinas insaturadas de características similares en cuanto a fluidez como, por ejemplo, 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DMPC), DOPC o L-a-fosfatidilcolina (eggPC).
Asimismo, podrían utilizarse lípidos pegilados y lipidos funcionalizados con mañosa basándose en la reacción del grupo reactivo ester succinimidil (NHS) con p-aminofenila-D mannopiranosido (MAN). Ejemplos no limitantes pueden ser: DSPE-PEG-NHS, DOPE-PEG-NHS, N-(succinimidiloxi-glutaril)-L-a-fosfatidiletanolamina, 1 -palmitoil-2-oleoil (POPE-PEG-NHS), N-(succinimidiloxi-glutaril)-L-a-fosfatidiletanolamina, dipalmitoil (DPPE-PEG-NHS), N-(succinimidiloxi-glutaril)-L-a-fosfatidiletanolamina,1,2-bís(dimetillfosfino)etano (DMPE-PEG-NHS).
Respecto a la composición del interior multilamelar de la partícula lipídica, la cantidad de lípido catiónico biocompatible que asegura su estabilidad estructural se determina en función del ácido nucleico que se utiliza. Con el objetivo de maximizar la carga de ácido nucleico, durante el segundo paso del procedimiento, se puede suplementar la cantidad de lípido catiónico biocompatible hasta extraer completamente el ácido nucleico que
haya podido quedar atrapado en la fase orgánica de la emulsión de Bligh and Dyer. La relación de los lípidos que conforman el componente funcional también puede modificarse, variando alrededor del contenido fosfolípido-PEG-MAN. El intervalo de colesterol puede abarcar entre el 10 y 40%, correspondiendo el resto al fosfolípido insaturado y al fosfolípido pegilado. La proporción de los lípidos estructurales (formadores de bicapa) y el lípido catiónico biocompatible (DC-colesterol complejante del ácido nucleico) se mantiene mayoritaria, preferentemente en una proporción de 5:1.
La fase orgánica que se obtiene con la desestabilización de la monofase de Bligh & Dyer contiene micelas inversas de lípido catiónico conteniendo el ácido nucleico en su interior. La película lipídica obtenida en el primer paso arriba descrito se disuelve en la fase orgánica de la emulsión Bligh & Dyer, formando una disolución en la que se encuentran las micelas inversas protegiendo los ácidos nucleicos del núcleo y los lípidos disueltos en fase orgánica.
A continuación, se añade una solución acuosa libre de nucleasas a la fase orgánica del paso anterior, de tal manera que el sistema se vuelve heterogéneo en forma de emulsión. Mediante la iniciación del proceso de inversión de fases, la fase orgánica conteniendo la mezcla nucleolipídica compleja queda suspendida en agua. La inversión de fases se completará tras la evaporación posterior del componente orgánico (más volátil que el agua), dando lugar a la suspensión de las nanopartículas lipídicas en fase acuosa.
Por lo tanto, un aspecto de la invención se refiere a un procedimiento para obtener nanopartículas lipidicas, con los macrófagos cerebrales como células diana, que incluye los siguientes pasos:
la . complejación de un ácido nucleico disuelto en agua con un lípido catiónico biocompatible en cloroformo, para formar micelas inversas mediante formación de una monofase de Bligh & Dyer por la adición de metanol hasta homogeneización;
2a. desestabilización de la monofase de Bligh & Dyer, y concentración de las partículas hidrofóbicas del paso 1a mediante la adición de cloroformo y agua;
lb . preparación de los lípidos formadores de bicapa: fosfolípido insaturado/colesterol/lípido-PEG-MAN que incluye la manosilación del componente ¡Ípido-PEG-NHS mediante reacción directa de la cabeza succinimidil éster (NHS) con el grupo -NH2 de p-aminofenil-a-D mannopiranosido (MAN);
2b. preparación de una película lipídica con los lípidos del paso 1b;
3. inserción de la película lipídica del paso 2b en la fase orgánica del paso 2a mediante disolución;
4. interacción de las micelas inversas con los lípidos formadores de bicapa, ambos presentes en la disolución del paso 3, inducida por la adición de agua a la fase orgánica;
5. extracción del disolvente orgánico y obtención de las nanopartículas lipídicas multilamelares en solución acuosa.
En este procedimiento, es especialmente interesante la manosilación que se realiza en un único paso y que no requiere la utilización de ningún agente acoplante y, especialmente, no requiere el uso de glutaraldehído.
La limpieza de las nanopartículas lipídicas se puede realizar por sedimentación (centrifugación), eliminando en el sobrenadante las vesículas lipídicas que no contienen ácidos nucleicos y los posibles ácidos nucleicos no encapsulados. Finalmente, las nanopartículas lipídicas son resuspendidas en tampón libre de nucleasas. Mediante esta sucesión de pasos, se evita el procedimiento tradicional de extrusión para homogeneizar el tamaño de las nanopartículas lipídicas, técnica que se utiliza habitualmente en el estado de la técnica, y que conduce a una elevada pérdida de carga nucleotídica en la fase acuosa.
Por otro lado, la metodología utilizada hasta la fecha para funcionalizar lípidos con mañosa emplea una reacción dependiente de activación con glutaraldehído, el cual actúa como agente enlazante. Sin embargo, el glutaraldehído es desnaturalizante y citotóxico. Mediante la reacción directa entre un derivado de ácido activado vía succinimida (lipido-PEG-NHS) y una amina primaria del p-aminofenil-a-D manopiranosido para formar una amida entre ambos reactivos, se evita la utilización de este agente citotóxico. Además, la incorporación de lípido-PEG-MAN en una etapa intermedia de su proceso de formación, permite su concentración en la superficie de la nanopartícula lipídica por exclusión de tamaño en el interior de las lámelas, obteniendo nanoparticulas lipídicas núcleo-corona fuertemente funcionalizadas en superficie mediante un método integrativo, a diferencia de los métodos indirectos descritos hasta la fecha en los que la mañosa es coincubada con los liposomas una vez estos han sido formados. Esta funcionalización directa favorece la propia eficacia del proceso (maximizando la carga de MAN en superficie), evitando al tiempo la autoasociación entre
las moléculas de MAN (en el interior de la partícula). Asimismo, la adición de lípidos pegllados mejora la farmacocinétlca, proporciona protección frente al sistema reticuloendotelial y convierte a las nanopartículas lipldlcas en vehículos más específicos hacia las células diana, proporcionando una cubierta de camuflaje, y más grandes en apariencia.
Otro aspecto de la invención se refiere a la obtención de nanopartículas lipídicas de tipo “core-shell", o núcleo-corona, obtenidas mediante el procedimiento descrito en esta memoria. Estas nanopartículas lipídicas, al elaborarse sin la utilización de agentes acoplantes, cuyo ejemplo más paradigmático es el glutaraldehído, están, con toda seguridad, libres de este tipo de agentes citotóxicos y pueden, por lo tanto, utilizarse in vivo o en cultivos de células con mucha más seguridad que las nanopartículas lipídicas en cuya elaboración se utilizan agentes acoplantes.
Estas nanopartículas lipídicas están especialmente preparadas para interaccionar con macrófagos cerebrales perivasculares y meníngeos. El “core" o núcleo contiene una carga farmacológicamente activa de un ácido nucleico y una cantidad electroequivalente de lipido catiónico biocompatible. En términos prácticos, la metodología empleada proporciona una eficiencia de encapsulación del ácido nucleico próxima al 100% mediante la formación de estructuras lamelares de tipo "cebolla" en las que el lipido catiónico biocompatible se encuentra acomplejando el ácido nucleico en el interior de las láminas acuosas formadas entre blcapas lipídicas concéntricas.
El ácido nucleico puede ser en general de cualquier tipo (ácido ribonucleico o ácido desoxirribonucleico, monocatenarío, blcatenarlo, lineal, circular, enrollado o lineal, o combinaciones de ellos) con la limitación de que su tamaño y flexibilidad le permitan mantenerse insertado en una cavidad de dimensiones nanométricas. Puede tratarse, por ejemplo, de cualquier tipo de oligonucleótido, (microARN, ARNsi, ARNm, ADN plasmídico). Asimismo, la secuencia del ácido nucleico puede incluir análogos de nucleótidos o nucleótidos modificados, con la única limitación de contener hidrofilicidad suficiente para mostrar una preferencia por la cavidad acuosa del interior de los complejos.
En cuanto al lipido catiónico biocompatible incluido en el “core” de la nanopartícula lipídlca, ejemplos no limitativos son: DOTMA, DODMA, DOTAP, DMRIE, DOTIM,
DOGS, DORIE, MVL5, GL67, BGTC, BGSC, DC-Chol o DC-colesterol, DOEPC y derivados de etilfosfocolina, DOSPA. Alternativas clásicas de lípido catiónico utilizadas en estudios modelo son DODAB, DDAB. Preferentemente, dada su disponibilidad comercial, estabilidad química y coste reducido, se seleccionan derivados catlónicos de colesterol como BGTC, BGSC y, más preferentemente, DC-colesterol, un lípido natural funcionalizado con carga positiva.
El “core” de las nanopartículas lipídicas presenta una estructura multilamelar condensada (se considera que un objeto lipídico es multilamelar si tiene, al menos, 3 bicapas lipídicas, o lámelas). Las nanopartículas de la invención incluyen, al menos, 3 lámelas y, en la mayoría de los casos un número muy superior (ver Figura 3 (A)). La corona de las nanopartículas lipídicas, o “shell”, segrega la mayoría del lípido pegilado exponiendo este polímero flexible hacia la superficie libre externa, la cual sirve como cubierta de camuflaje y protección ante la degradación, favoreciendo la interacción adhesiva con los macrófagos diana: macrófagos cerebrales perivasculares y meníngeos. La corona de las nanopartículas lipídicas de la invención incluye:
- una fosfocolina que proporcione fluidez y estabilidad a las bicapas lipídicas;
- colesterol neutro proporcionando rigidez y facilitando la interacción con biomembranas lipídicas con alto contenido en fosfatidiletanolamina (PE);
-un lípido pegilado (lípido-PEG-NHS-MAN) proporcionando una gran cabeza polimérica segregable a la superficie libre externa de la partícula y la capacidad funcional del paminofenil-a-D manopiranosido (MAN) mediante su unión al brazo flexible macromolecular (PEG) mediante el grupo puente NHS. Se aprovecha la singularidad que tienen los macrófagos diana de reconocer el azúcar mañosa (presente en los carbohidratos de la pared celular de numerosas bacterias) y la capacidad de las nanopartículas lipídicas tapizadas de este fosfolípido pegilado, para favorecer su adhesión con la membrana plásmatica mediante la funcionalización con la mañosa en su superficie.
En una realización preferida, el lípido pegilado está basado en diesteroilfosfatidiletanolamina (DSPE-PEG-NHS-MAN).
Los lípidos pegilados incluidos en la formulación presentan una cabeza polar de tamaño macromolecular. Debido a su exclusión por tamaño en la estructura laminar, la superficie externa de dichas nanopartículas lipídicas compuestas aparece tapizada de grupos
mañosa, los cuales permiten la selectividad de la nanopartícula por los macrófagos meníngeos y perivasculares. Esta estructura estratificada, como si se tratase de una cebolla (lámelas interiores y superficie externa funcionallzada), es diferente a los liposomas convencionales descritos hasta la fecha, los cuales son fundamentalmente unilamelares según se obtienen por extrusión.
En una realización preferida de la invención las nanopartículas lipídicas que tienen como célula diana a los macrófagos cerebrales comprenden:
- un núcleo multilamelar formado por oligonucleótidos antisentido y DC-colesterol, - una cubierta lipídica fluida de base estructural compuesta por fosfolípido y colesterol y un componente funcional de base lipídica pegilado y funcionalizado con un derivado de mañosa;
y presentan una configuración multilamelar con alto grado de compactación, entendiendo por multilamelar que tienen, al menos, 3 lámelas y por alto grado de compactación que el lípido catlónico biocompatlble está complejando el ácido nucleico en el núcleo en una estructura tipo sándwich.
Preferentemente, los oligonucleótidos antisentido se diseñan como GapmeRs, cuya liberación en macrófagos residentes produce el silenciamlento selectivo de genes de esos macrófagos, y la cubierta lipídica multilamelar incluye POPC/colesterol/DSPE-PEG-MAN.
Otro aspecto de la invención se refiere a un kit para la depleción de macrófagos cerebrales que incluye nanopartículas lipídicas formadas por un núcleo con oligonucleótidos antisentido y DC-colesterol, y una cubierta lipídica de fosfolípido, colesterol y un componente de base lipídica pegilado y funcionalizado con un derivado de mañosa. Preferentemente, los oligonucleótidos antisentido son GapmeRs, cuya liberación en macrófagos residentes produce el silenciamiento selectivo de genes de esos macrófagos, y la cubierta lipídica multilamelar está constituida por POPC/colesterol/DSPE-PEG-MAN.
Como consecuencia del procedimiento para la elaboración de estos nanollposomas las nanopartículas lipídicas están estratificadas en una estructura núcleo-corona comprendiendo un núcleo multilamelar muy compacto con alta carga de ácido nucleico y una corona superficial de lipidos neutros y funclonalizados. En la figura 3 puede
observarse este tipo de estructura. El hecho de que las nanopartículas lipídicas de la invención sean multilamelares les confiere la ventaja de liberar lentamente su contenido una vez se liberan en el tejido in vivo o in vitro.
Estas nanopartículas lipídicas tienen como células diana a los macrófagos perivasculares y meníngeos cerebrales que son macrófagos residentes del cerebro con actividad fagocítica constitutiva, de origen hematopoyético, que ocupan el cerebro a una tasa constante de reposición en el espacio perivascular y meníngeo. Hasta la fecha se ha descrito que tienen un papel fundamentalmente regulador en la activación de respuestas de fase aguda frente a un estímulo inmune, como son la síntesis y liberación de glucocorticoides o la respuesta febril; se han identificado como centinelas inmunes, regulando la acumulación y tráfico de macromoléculas (por ejemplo, el péptido (3-amilolde), virus, bacterias y leucocitos periféricos al parénquima cerebral en distintos modelos animales de neuropatologías; se han propuesto como una importante fuente de estrés oxidativo que puede estar implicado en la disfunción cerebrovascularque tiene lugar en modelos animales de Alzheimer e hipertensión; y se han identificado como principal reservorio del virus VIH en el sistema nervioso central, ocasionando diversas disfunciones neurológicas.
Por lo tanto, la modulación génica de estas células inmunes, que tienen un claro papel regulador de la fisiología del sistema nervioso central, mediante ácidos nucleicos con efectos farmacológicos vehiculados por nanopartículas lipídicas constituye una interesante estrategia terapéutica para el manejo de la respuesta inmune/inflamatoria que forma parte de la etiofisiopatología de múltiples patologías neurológicas/ neurodegenerativas y psiquiátricas, de manera que se puede elaborar un método para el tratamiento de dichas patologías utilizando las nanopartículas lipídicas de la invención en un paciente aquejado de alguna enfermedad del sistema nervioso central. Otro aspecto de la invención se refiere a las nanopartículas lipídicas que se han descrito en esta memoria para su uso en la elaboración de un medicamento frente a enfermedades neurológicas/ neurodegenerativas y/o psiquiátricas. Asimismo, la invención también se refiere a aquellas composiciones farmacéuticas que incluyen las nanopartículas lipídicas descritas en esta memoria, junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Para complementar la descripción que se está realizando y con objeto de ayudar a una
mejor comprensión de las características de la invención, se acompaña como parte integrante de dicha descripción un juego de dibujos en donde, con carácter ilustrativo y no limitativo, se ha representado lo siguiente:
Figura 1. Esquema ilustrativo de la metodología para la preparación de las nanopartículas lipídicas, los números indican el número de cada ejemplo y los marcos de colores corresponden a los porcentajes de disolvente indicados en cada cuadro de texto específico.
Figura 2. Espectro de resonancia magnética de protón tras la síntesis del lípido manosilado DSPE-PEG-manosilado. En color rojo se han marcado las señales nuevas tras la unión con la mañosa.
Figura 3. Imágenes obtenidas mediante tinción negativa por microscopía electrónica de transmisión (TEM) de nanopartículas lipídicas complejando el ARNm (A-D) y en ausencia de ARNm (E-F).
Figura 4. Imágenes de doble inmunofluorescencia de secciones coronales de tejido cerebral de ratas.
Figura 5. Imágenes de hibridación “in situ" de secciones coronales de tejido cerebral de ratas con la sonda caracterizada por SEQ ID NO:3. Localización del ARNm del enzima L-PGDS-en células de localización perivascular.
Figura 6. Imágenes de hibridación “in situ" de secciones coronales de tejido cerebral de ratas con la sonda caracterizada por SEQ ID NO:3. Localización del ARNm del enzima L-PGDS en las meninges.
REALIZACIÓN PREFERENTE DE LA INVENCIÓN
Ejemplo 1. Elaboración del núcleo multilamelar. Figura 1 (1).
Como herramienta para la inactivación de cualquier ARNm (ARN mensajero) o ARNInc (ARN no codificante de más de 200 nucleótidos) se utilizó un LNA GapmeR diseñado previa petición y comercializado por la empresa Exiqon®. Un GapmeR es una cadena de 14-16 nucleótidos de ADN monocatenario que se diseña con las regiones
flanqueantes modificadas con nucleótidos LNA (Locked Nucleic Acid o ácido nucleico bloqueado) para aumentar la afinidad de la cadena de ADN por el ARN diana. Al hlbridarse el GapmeR con el ARN diana, se genera una estructura hueca en la región central del ADN-ARN que activa la ARNasa H de la célula y esta enzima se encarga de degradar el ARN diana.
Se seleccionó una secuencia antisentido para la inhibición del enzima L-PGDS, responsable de la síntesis de la prostaglandina antiinflamatoria 15d~Prostaglandina J2, La secuencia, original y diseñada bajo petición por la empresa Exlqon®, fue: 5 '-3 '-TACTCTTGAATGCACT (caracterizada por SEQ ID NO:1), marcada en 5’ con un isómero derivado de la fluoresceína (FAM, carboxifluoresceína) emitiendo a 488mm.
Como control negativo para este experimento también se diseñó y utilizó una sonda original antisentido sin sentido (“no sense”) cuya secuencia fue 5 '-3 '-AACACGTCTATACGC (caracterizada por SEQ ID NO:2), marcada en 5’ con FAM, emitiendo a 488mm.
En un vial de vidrio de 1,5 mL, se disolvieron 0,54 mg de DC-Cho! (Avanti® Polar Lipids) en 90 (Jl de CHC!3, se añadieron 300 pl de metanol y 90 pl de H20 libre de ARNasas conteniendo 20 nmoles de GapmeR El contenido de ese vial se agitó formándose una monofase (corresponde al contenido 20% H20, 50% MeOH, 30% CHChen el diagrama Bligh&Dyer) que se dejó incubar durante toda la noche.
Ejemplo 2. Desestabilización de la monofase de Bligh&Dyer y concentración de las partículas hidrofóbicas en la fase orgánica. Figura 1 (2).
Se añadieron CHCb (120 pL) y H20 libre de nucleasas (120 pL) para reducir el porcentaje de metanol y situarse en una zona del diagrama de Bligh&Dyer (30% H20, 30% MeOH, 40% CHCb), donde los disolventes se separan en fases. Los lípidos catiónlcos biocompatibles, al estar complejando el GapmeR, lo protegen y lo arrastran a la fase orgánica, más densa (inferior dentro del tubo). Estas micelas no se desestabillzaron al quedar agua de hidratación entre la interacción lípido catlónico blocompatible-GapmeR.
Se mezcló en vértex y se separaron las fases bajo centrifugación suave (800 rpm, 4 minutos), recuperando la fase orgánica que quedó localizada en la parte inferior del tubo
después de la centrifugación.
Ejemplo 3. Preparación de una película lipídica con lípidos neutros manosilados: POPC/colesterol/DSPE-PEG-MAN. Figura 1 (3).
Como fosfocolina fluida, se eligió para este ejemplo POPC (1 -palmitoil-2-oieoil-snglicero-3-fosfocolina) que, junto con el colesterol, se adquirió en Avanti® Polar Lipids. Para la manosilación del lípido pegilado funcionalizado con el grupo NHS, a una solución de DSPE-PEG(2000)-NHS (50 mg, 1 equiv.; (NOF Europe GmbH)) en tetrahidrofurano (THF) (6 mL) se añadió MAN (4,5 mg, 1 equiv.; 4-aminofenil a-D-manopiranosido; Sigma-Aldrich, Merck). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 6 h y la reacción fue seguida por cromatografía en capa fina. Después, el disolvente se eliminó al vacío y el producto se utilizó sin necesidad de volver a realizar purificación.
En la figura 2, se muestra el espectro de resonancia magnética de protón tras la síntesis del lípido manosilado. En color rojo se han marcado las señales que aparecen tras la unión de la mañosa al lípido pegilado DSPE-PEG. El ensayo se realizó con un espectrómetro Bruker Avance 300 (1H: 300 MHz) a 298 K usando solventes parcialmente deuterados como estándar interno.
PULPROG zg30
TD 32768
SOLVENT CDC13
RG 184.03
DW 
83.200 usec
Tabla 1. Configuración del ensayo de resonancia magnética de protón realizado según el ejemplo 3.
Se preparó una película Itpídica mezclando los lípidos disueltos en cloroformo siguiendo una relación POPC/colesterol/DSPE-PEG-MAN de 52:40:8 mol%, teniendo en cuenta una ratio POPC/DC-Cho! de 5,2:1. Después, se eliminó el cloroformo al vacío, quedando los lípidos formando una fina película en el fondo del vial.
Ejemplo 4. Inserción de los lípidos de la corona en la fase orgánica del ejemplo 2. Figura 1 (4).
Se utilizaron 210 pL de la fase orgánica obtenida en el ejemplo 2 para disolver la película lipídica elaborada en el ejemplo 3. Se mezclaron y se incubaron durante 2 horas,
Ejemplo 5. Obtención de las nanopartículas lipídicas. Figura 1 (5).
Se mezclaron 210pL de H2O libre de nucleasas y los 210pL de la fase orgánica obtenida en el ejemplo 4 y se formó una emulsión mezclando con un vértex.
A continuación, se extrajo de la emulsión la fase orgánica (cloroformo y metanol) con un rotavapor (evaporación rotatoria) obteniendo las nanopartículas lipídicas disueltas en una fase acuosa cuyo volumen se ajustó con tampón PBS libre de nucleasas hasta un volumen final de 250pl.
Ejemplo 6. Limpieza de las nanopartículas lipídicas. Figura 1 (6).
Las nanopartículas lipídicas del ejemplo 5 se centrifugaron a 14000 rpm durante 15 minutos, para sedimentarlas y eliminar las vesículas lipídicas que no contenían GapmeR así como posibles moléculas de GapmeR que no se hubieran encapsuiado por rotura de las nanopartículas.
Finalmente, el pellet resultante de la centrifugación se resuspendió en 250 pl de tampón PBS libre de nucleasas.
Ejemplo 7. Caracterización de los liposomas mediante dispersión de luz dinámica, Potencial Zeta y TEM
Dispersión de luz dinámica (DLS): En el ejemplo 6, después de la sedimentación de las nanopartículas lipídicas por centrifugación, se obtuvieron dos fases, la primera es el sobrenadante, en el cual se localizan los liposomas menos densos porque no contienen el denso y compacto núcleo formado por lípidos catiónicos biocompatibles complejando el ácido nucleico, y la segunda es un pellet, en el cual se encuentran concentradas las nanopartículas lipídicas.
El diámetro medio y la distribución de vesículas se midieron por dispersión de luz dinámica. Para ello, las muestras se diluyeron (1:100) en tampón PBS y se midieron a 25°C, considerando un índice de refracción medio de 1.335, en un Malvern Zetasizer NS instrument. Se considera que un índice de polidispersidad por debajo de 0,1 representa una muestra bastante monodispersa, es decir, homogénea. En la tabla 2, se muestran los resultados obtenidos en tres repeticiones para cada fase tras el paso de limpieza del ejemplo 6; entre medida y medida se dejó un tiempo de espera de 30 minutos. Las medidas realizadas a partir del pellet resuspendido en PBS indican que las muestras obtenidas son bastante monodispersas y que el tamaño medio de las nanopartículas lipídicas se encuentra en torno a 170 nm. Las muestras medidas de una
fracción del sobrenadante indican mayor polidispersidad y un mayor tamaño medio, de aproximadamente 193 nm. En ambos casos parecen estables con el tiempo.
Tabla 2. Resultados obtenidos para la medida del diámetro efectivo y el índice de polidispersidad de las fases obtenidas tras la sedimentación de las nanopartículas lipídicas (sobrenadante y pellet) mediante dispersión de luz dinámica.
Potencial Zeta (mV): Se realizó una medición indirecta de la carga superficial neta de las nanopartículas lipídicas midiendo el potencial zeta de sus suspensiones acuosas diluidas, en un Malvern Zetasizer NS instrument (Malvern Instruments Ltd, UK). Para ello, la muestra se colocó en una celda de electroforesis equipada con electrodos de oro, las muestras se diluyeron en una proporción 1:50 y se midieron a 25°C.
En la tabla 3, se muestran los resultados obtenidos en 5 repeticiones de cada fase (sobrenadante y pellet). En la medición de las nanopartículas lipídicas del pellet, se obtuvieron valores tanto positivos como negativos cercanos a la neutralidad, indicando que los lípidos catiónicos biocompatibles que conforman las nanopartículas lipídicas se encuentran complejando (interaccionando) los fragmentos de GapmeR de carga contraria, apareciendo una compensación de cargas que da lugar a un potencia! zeta esencialmente nulo. En el sobrenadante se localizan las nanopartículas lipídicas menos densas que no contienen GapmeR. En estos objetos, el exceso de lípidos catiónicos produce un exceso de carga positiva. Esto se observó en las medidas de potencial zeta del sobrenadante, las cuales presentan una carga superficial neta altamente catiónica.
Tabla 3. Potencial zeta medido en las fases obtenidas tras la sedimentación de las nanopartícuias lipídicas en el ejemplo 6.
Tinción negativa en Microscopía electrónica de transmisión (NS-TEM): Se analizó por TEM la microestructura de las nanopartícuias lipídicas con un método de tinción negativa mediante cationes uranilo (UCV), los cuales marcan preferencialmente el componente nucíeotídico de carga negativa. Para su examen, se combinaron volúmenes iguales de la muestra diluida en PBS y acetato de uranilo (2%) y se dejaron incubar durante 1 min a temperatura ambiente. Se colocó una gota de esta solución en una rejilla de cobre recubierta de carbono Formvar durante 5 min. Se eliminó el exceso de líquido usando papeles de filtro. Después de secar la rejilla a temperatura ambiente durante 5 minutos, se realizaron micrografías con un microscopio electrónico de transmisión JEOL 1010 operando a 100 kV (resolución = 0.35 nm). Las micrografías se captaron usando una cámara Megaview II.
La microscopía electrónica de transmisión empleando el método de tinción negativa es una técnica muy útil que proporciona información sobre las propiedades químicas y estructurales en muestras de liposomas o cápsulas lipídicas. El acetato de uranilo presenta preferencia por grupos amino y fosfato, por lo que la alta presencia de grupos fosfato y amino en el ARN convierte esta metodología en una técnica muy adecuada para su localización. Asimismo, la presencia de grupos fosfato a nivel de la cabeza en
los fosfolípidos, también permite la tinción de membranas, pero con menor intensidad que en el caso de los ácidos nucleicos. Mediante esta técnica, se ha confirmado la multilamelaridad de las nanopartículas lipídicas de la invención y la estratificación tipo “core-shell” de dichas nanopartículas. En la figura 3 se muestran tres imágenes de tinción negativa mediante microscopía electrónica de transmisión (A, C, E). La imagen A corresponde al núcleo de una nanopartícula lipídica. Estas regiones están compuestas por moléculas de DC-Colesterol complejando GapmeR. Debido a la presencia de grupos amino en el DC-Colesterol y de grupos amino y fosfato en GapmeR, estas regiones se convierten en estructuras de mayor contraste debido a la mayor interacción con el acetato de uranilo. En esta imagen, es posible apreciar la presencia de estructuras tipo sándwich. En la gráfica B se muestra el análisis de la escala de gris en función de la distancia en una región de la imagen A (línea roja) utilizando el software libre ImageJ. En rojo se muestra el ajuste a una función sinusoidal con una distancia pico-pico de 9,24 ±0 ,12 nm, lo cual es compatible con una estructura lamelar periódica formada por bicapas lipídicas de entre 4 y 5 nm de espesor, flanqueadas por láminas acuosas interlamelares de entre 5 y 4 nm de espesor donde se aloja el ARN complejado con el DC-colesterol catiónico incluido en la composición de las bicapas lipídicas. En la imagen C se muestra el mismo estudio en una nanopartícula lipídica en la que se visualiza con claridad la corona menos electrodensa, y por tanto con una cantidad reducida de ARN. Debido a la multilamelaridad de las nanopartículas lipídicas, también es apreciable periodicidad entre las diferentes lámelas que constituyen la corona, aunque se observa una distancia promedio levemente mayor que en la región del núcleo, con distancias de repetición aproximadas de 9,9 ± 0,3 nm (gráfica D), lo cual es esperable debido a la repulsión entre bicapas lipídicas del “sheir con menor compensación de cargas por parte del ARN que la ocurrida en el “core” compacto. También se observa cómo el contraste en estas regiones es más débil que en el “core”, puesto que el acetato de uranilo únicamente está reaccionando con los grupos fosfato de las cabezas de los fosfolípidos, y en mucha menor extensión con el ARN. A modo de control, la imagen E corresponde a un liposoma multiíamelar no complejado recogido de la fase sobrenadante obtenida en el ejemplo 6. Debido a la carencia de RNA reteniendo los lípidos catiónicos en el “core”, la composición lipídica es más uniforme y la tinción con acetato de uranilo no diferencia una estratificación del tipo "core-sheH" (imagen E), presentando una periodicidad de 9,9 ± 0,3 nm (gráfica F) que es muy similar a la observada en la región correspondiente al “shel!" libre de ARN (gráfica D).
Ejemplo 8. Silenciamiento del gen del enzima Prostaglandina D sintasa lipocalina {L-PGDS)
Para producir la inhibición de un gen con un alto grado de expresión de forma constitutiva por los macrófagos perivasculares cerebrales y meníngeos, se seleccionó el gen que codifica para el enzima antiinflamatorio Prostaglandina D sintasa lipocalina (L-PGDS).
Teniendo en cuenta el tiempo necesario para que las nanopartículas lipídicas liberen su contenido dentro de los macrófagos diana, se optó por buscar una herramienta génica que presentara un tiempo de inhibición extendido, como es el caso de los GapmeRs. Como ya se ha indicado en el ejemplo 1, los GapmeRs son una nueva herramienta para la inactivación de cualquier ARNm o ARNInc. A diferencia de otros ARN de interferencia (siRNA), los GapmeRs no solo alcanzan dianas citoplasmáticas, sino también nucleares, como ARN de cadena larga no codificante (ARNInc) y todos los ARN de tamaño pequeño (ARNsn). Además, producen menos efectos indeseados, ya que no se unen al complejo RISC (RNA-induced silencing complex), ni lo saturan. Una de sus principales ventajas es su alta estabilidad, debido a que todo su esqueleto es de fosforotioato, disminuyendo los efectos secundarios.
La secuencia antisentido utilizada para la inhibición del enzima L-PGDS, caracterizada por SEQ ID NO:1, se describe en el ejemplo 1 y está marcada en 5’ con un isómero derivado de la fluoresceína (FAM, carboxifluoresceína) emitiendo a 488mm. La adición de este fluoróforo permite estudiar a través de técnicas de inmunofluorescencia (que se detallan a continuación) la localización del GapmeR en el cerebro de rata tras su administración por vía intracerebroventricular (icv) (detallada a continuación) encapsulado en las nanopartículas lipídicas de la invención.
Como control negativo para este ejemplo también se utilizó una sonda antisentido “no sense”, caracterizada por SEQ ID NO:2, también marcada con fluoresceína.
Para la evaluación directa de la inhibición de la expresión génica de L-PGDS con el GapmeR descrito en el ejemplo 1 y encapsulado en nanopartículas lipídicas, se optó por la utilización de la técnica inmunohistoquímica de hibridación “in situ” (ISH), que consiste en marcar una hebra sencilla de ARN, denominada sonda, y permitir que se empareje con su secuencia complementaria en el ARN presente en una muestra de tejido. En
nuestro caso la sonda fue encargada a ¡a empresa Microsynth®, y su secuencia es 5’-3': CTC ACC TGT GTT TAC TCT TGA ATG CAC TTA TCC GGT TGG GGC AGG, caracterizada por SEQ ID NO:3, y se marcó en el extremo 3’ con 33P-dATP, mediante una enzima deoxinucleotidil transferasa terminal. Por otro lado, el tejido utilizado para la prueba fue cortes de cerebro de rata (como se detalla a continuación).
Inyección intracerebroventricular (ICV): Estos experimentos se realizaron en ratas Wistar. Para la realización de las inyecciones ICV, se utilizaron coordenadas referidas al ventrículo lateral derecho, se anestesió a los animales con una inyección intraperltoneal de ketamina y xilacina (2,5:1, mg/kg, s.c.) y se montaron en el marco estereotáxico. Las nanopartículas lipídicas que contenían, respectivamente, GapmeR, antisentido y su vehículo (H20 libre de nucleasas) se infundieron lentamente en un volumen de 25 pL durante 10 minutos usando una jeringa Hamilton (Bonaduz, AG Swltzerland®) y una aguja 26 GA a través de un inyector estereotáxico motorizado (Stoelting 53311®) en el ventrículo lateral derecho.
Inmunofluorescencia: Los animales (ratas Wistar) fueron sacrificados con una sobredosis de pentobarbltal. Inmediatamente después el cerebro fue extraído, congelado en hielo seco y almacenado a -80°C. Se cortaron secciones coronales de tejido cerebral de 14 pm de espesor y se colocaron en portaobjetos. Primero fueron objeto de tres lavados con KPBS (tampón fosfato salino con potasio) 0,02M (pH= 7,4), durante 5 minutos a temperatura ambiente. Para eliminar la autofluorescencia se incubaron con glicina 10mM, durante 20 minutos a temperatura ambiente, recibieron otros tres lavados de KPBS e inmediatamente fueron bloqueados con BSA (albúmina de suero bovino) 10%, disuelta en KPBS con tritón 0,1%, durante 30 minutos. Los cortes se incubaron con los correspondientes anticuerpos primarios (ab64693) antirreceptor de mañosa (CD206), durante toda una noche, diluidos en la solución de bloqueo; tras 3 lavados con KPBS recibieron los correspondientes anticuerpos secundarlos (Alexa Fluor® 555 (A31572)), durante una hora a temperatura ambiente. Finalmente, se realizaron tres lavados con KPBS, y un último lavado con agua desionizada, durante 5 minutos. Después de secarlos, los cortes se montaron en portas con medio de montaje Fluoroshield® (Sigma Aldrich) que Incluía 4’16-diamidino-2-fen¡l¡ndol diclorhidrato (DAPI). Las secciones coronales se cubrieron con cubreobjetos y se congelaron a -20°C o se visualizaron inmediatamente en un microscopio de epí-fluorescencla TI-FL Epi-fl lllumlnator® de alto rendimiento Nikon Eclipse Ti Series.
Las imágenes de la figura 4, de doble inmunofluorescencia, indican la presencia de los GapmeR (marcados en verde) en los macrófagos perivasculares (A) y meníngeos (B) (marcados en rojo). La tinción DAPI (en azul), que identifica núcleos celulares, permite observar cómo hay presencia de GapmeR a nivel tanto nuclear como citoplasmático. Estos resultados confirman que los GapmeR han sido incorporados por los macrófagos diana.
Hibridación “in situ” (ISH): Los animales (ratas Wistar) fueron sacrificados con una sobredosis de pentobarbital. Inmediatamente después el cerebro fue extraído, congelado en hielo seco y almacenado a -80°C. Se cortaron secciones coronales de tejido cerebral de 14 pm de espesor y se colocaron en portaobjetos tratados con 3-aminopropil-trietoxisilano, preservándolas a -40°C. Se fijaron los tejidos con paraformaldehido (PFA) al 4% y se trataron con la proteasa pronasa para facilitar la accesibilidad de la sonda al ARNm de interés. A continuación, se cubrieron los tejidos con el tampón de hibridación que contiene, aproximadamente, 1,5 nM de la sonda cuya secuencia está caracterizada por SEQ ID NO:3 y está marcada con P radioactivo y se incubaron a 42°C, durante 24 h. Después, se lavaron las secciones hibridadas y se expusieron a una película fotográfica durante 1-4 semanas. A continuación, se analizaron los autorradiogramas y se obtuvieron las imágenes en un microscopio de epifluorescencia TI-FL Epi-fl llluminator® de alto rendimiento Nikon Eclipse Ti Series.
En las figuras 5 y 6, se muestran imágenes de ISH en las que se aprecia la presencia de ARNm para la L-PGDS (puntos y manchas negras) en células de localización perivascular (figura 5) y en las meninges (figura 6), en los cortes de cerebro de animales tratados con liposomas cargados con solo el vehículo de los GapmeR (control) (A) y animales que han recibido GapmeR antisentido “no sense” como control negativo (B). En los cortes que corresponden a animales que han recibido nanopartículas lipídicas con el GapmeR descrito en el ejemplo 1 (C), se aprecia una clara ausencia/reducción en la señal para el ARNm de L-PGDS, lo que confirma su inhibición.
Claims (1)
- REIVINDICACIONES1. Procedimiento para la elaboración de nanopartículas lipídicas de tipo núcleo/corona que incluye los siguientes pasos:la . complejación de un ácido nucleico disuelto en agua con un lípido catiónico biocompatible en cloroformo, para formar micelas inversas mediante formación de una monofase de Bligh & Dyer por la adición de metanol hasta homogeneización;2a. desestabilización de la monofase de Bligh & Dyer, y concentración de las partículas hidrofóbicas del paso 1a mediante la adición de cloroformo y agua;lb . preparación de los lípidos formadores de bicapa: fosfolípido ¡nsaturado/colesterol/lípido-PEG-MAN que incluye la manosilación del componente lípido-PEG-NHS mediante reacción directa de la cabeza succinimidil éster (NHS) con el grupo -NH2 de p-aminofenil-a-D mannopiranosido (MAN);2b. preparación de una película lipídica con los lípidos del paso 1b;3. inserción de la película lipídica del paso 2b en la fase orgánica del paso 2a mediante disolución;4. interacción de las micelas inversas con los lípidos formadores de bicapa, ambos presentes en la disolución del paso 3, inducida por la adición de agua a la fase orgánica;5. extracción del disolvente orgánico y obtención de las nanopartículas lipídicas multilamelares en solución acuosa;y en el que la manosilación no requiere un agente acoplante.2. Procedimiento según la reivindicación 1 en el que no se realiza homogeneización por extrusión del tamaño de las nanopartículas lipídicas obtenidos en el paso 5.3. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1-2 en el que se añaden los siguientes pasos:6. Limpieza por sedimentación de las nanopartículas lipídicas y eliminación de las vesículas lipídicas sin ácido nucleico y del ácido nucleico no encapsulado.7. Resuspensión del pellet de nanopartículas lipídicas en solución acuosa.4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que el lípido catiónico biocompatible se selecciona del grupo formado por: 1,2-di-0-octadecenil-3-trimetilamonio propano (DOTMA), 1,2-dioleiloxi-3-dimetillaminopropano (DODMA), dioleoiloxi-trimetilamonio propano (DOTAP), bromuro de amonio 1,2-dimiristiloxi-propil 3-dimetil-hidroxi etil amonio (DMRIE), cloruro de 1 -[2-(oleoiloxi)etilo]-2-oleil-3-(2-hidroxietil)imidazol¡nio (DOTIM), dioctadecil-amido-glicilo-espermina (DOGS), bromuro de 1,2-dioliiloxipropil-3-dimetil-h¡droxietilamonio (DORIE), N1-[2-((1S)-1-[(3-aminopropil)amino]-4-[di(3-amino-propil)amino]butilcarboxamido)etil]-3,4-di[oleiloxi]-benzamida (MVL5), N4-colesteril-espermina HCI Sal (GL67), bis-guanidium-trencolesterol (BGTC), bis-guanidinium-espermidine-colesterol (BGSC), 3li-[N-(N',N'-dimetilaminoetano)-carbamoil]colesterol clorhidrato (DC-Chol o DC-colesterol), cloruro de 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina y derivados de etilfosfocolina (DOEPC), 2,3-dioleilox¡-N-(2-(esperm¡necarboxamido)etil)-N,N-dimetil-1-propanaminium trifluoroacetato (DOSPA), bromuro de diactadecil-dimetilamonio (DODAB), bromuro de dimetildioctadecilamonio (DDAB), 1,2-diestearoil-3-trimetilamonio propano (DSTAP).5. Procedimiento según la reivindicación 4 en el que lípido catiónico biocompatible seleccionado es DC-colesterol.6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que el ácido nucleico es un ácido ribonucleico o un ácido desoxirribonucleico, monocatenario, bicatenario, lineal, circular, enrollado, o combinaciones de los mismos, un oligonucleótido, microRNA, siRNA, mRNA o DNA plasmídico.7. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que el ácido nucleico es un GapmeR.8. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que el fosfolípido insaturado del paso 1b se selecciona entre las fosfocolinas insaturadas dioleoil-glicerofosfocolina (DOPC), 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DMPC), L-afosfatidilcolina (eggPC), o palmitoil-oleoil-glicerofosfocolina (POPC).9. Procedimiento según la reivindicación 8 en el que el fosfolípido insaturado seleccionado es POPC.10. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que el lípido pegilado del paso 1b se selecciona del grupo formado por DSPE-PEG-NHS, DOPE-PEG-NHS, N-{succinimidiloxi-glutaril)-L-a-fosfat¡diletanolamina, 1 -palmitoil-2-oleoil (POPE-PEG-NHS), N-(succinimid¡loxi-glutar¡l)-L-a-fosfatidiletanolamina, dipalmitoil (DPPE-PEG-NHS), N-(succ¡nimid¡lox¡-glutaril)-L-a-fosfatidiletanolamina,1,2-bis (dimetillfosfino)etano (DMPE-PEG-NHS).11. Procedimiento según la reivindicación 10 en el que el lípido seleccionado es es diesteroiifosfatidiletanolamina (DSPE-PEG(2000)-NHS),12. Nanopartículas lipídicas con los macrófagos cerebrales como células diana obtenidas mediante el procedimiento definido por cualquiera de las reivindicaciones 1 11.13. Nanopartículas lipídicas con los macrófagos cerebrales como células diana que contienen:- un núcleo formado por:- un ácido nucleico, y- un lípido catiónico biocompatible,- una corona formada por:- un fosfolípido insaturado y colesterol, y- un componente de base lipídica pegilado y funcionalizado con un derivado de mañosa,caracterizadas por ser multilamelares con alto grado de compactación, entendiendo por multilamelares que tienen, al menos, 3 lámelas y por alto grado de compactación que el lípido catiónico está complejando el ácido nucleico en el núcleo en una estructura tipo sándwich.14. Nanopartículas lipídicas según reivindicación 13 en las que el lípido catiónico biocompatible se selecciona del grupo formado por: 1,2-di-0-octadecenil-3-trlmetilamonio propano (DOTMA), 1,2-dioleiloxi-3-dimetillaminopropano (DODMA), dioleoiloxi-trimetilamonio propano (DOTAP), bromuro de amonio 1,2-dimiristiloxi-propil-3-dimetll-hidroxi etil amonio (DMRIE), cloruro de 1-[2-(oleoiloxi)etilo]-2-oleil-3-(2-hidroxietil)imidazolinio (DOTIM), dioctadecil-amido-glicilo-espermlna (DOGS), bromuro de 1,2-dioliiloxipropil-3-dimetil-hidroxiet¡lamonio (DORIE), N1-[2-((1S)-1-[(3-aminopropil)amino]-4-[di(3-amino-propil)amino]butilcarboxamido)etll]-3,4-di[oleiloxi]-benzamida (MVL5), N4-colesteril-esperm¡na HCI Sal (GL67), bis-guanidium-trencolesterol (BGTC), bis-guanidinium-espermidine-colesterol (BGSC), 3(J-[N-(N',N'-dimetilaminoetano)-carbamoil]colesterol clorhidrato (DC-Chol o DC-colesterol), cloruro de 1,2-dioleo¡l-sn-giicero-3-et¡lfosfocol¡na y derivados de etilfosfocolina (DOEPC), 2,3-dioleiloxi-N-(2-(esperminecarboxamido)etil)-N,N-dimetil-1-propanam!nium trifluoroacetato (DOSPA), bromuro de diactadecil-dimetilamonio (DODAB), bromuro de dimetildioctadecilamonio (DDAB), 1,2-diestearoil-3-trimetilamonio propano (DSTAP).15. Nanopartículas lipídicas según la reivindicación 14 en las que lípido catiónico biocompatible seleccionado es DC-colesterol.16. Nanopartículas lipídicas según cualquiera de las reivindicaciones 13-15 en las que el ácido nucleico se selecciona entre un ácido ribonucleico o un ácido desoxirribonucieico, monocatenario, bicatenario, lineal, circular, enrollado, o combinaciones de los mismos, un oligonucleótido, microARN, ARNsi, ARNm, o ADN plasmídico17. Nanopartículas lipídicas según la reivindicación 16 en las que el ácido nucleico es una Gapmer.18. Nanopartículas lipídicas según cualquiera de las reivindicaciones 13-17 en las que el fosfolípido insaturado de la corona se selecciona entre las fosfocolinas insaturadas dioleoil-glicerofosfocolina (DOPC), 1t2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DMPC), L-afosfatidilcolina (eggPC), o palmitoil-oleoil-glicerofosfocolina (POPC).19. Nanopartículas lipídicas según la reivindicación 18 en las que el fosfolípido insaturado es POPC.20. Nanopartículas lipídicas según cualquiera de las reivindicaciones 13-19 en las que el componente de base lipídica pegilado se selecciona del grupo formado por DSPE, DOPE, POPE, DPPE, DMPE.21. Nanopartículas lipídicas según la reivindicación 20 en las que el componente de base lipídica seleccionado es DSPE.22. Nanopartículas lipídicas según cualquiera de las reivindicaciones 13-21 en las que el derivado de mañosa es p-aminofenil-a-D manopiranosido.23. Nanopartículas lipídicas según cualquiera de las reivindicaciones 12-22 en las que la proporción fosfolípido insaturado/colesterol/lipido manosilado es de 45-85/10-40/5-15 por ciento, en masa, respectivamente.24 Nanopartículas lipídicas según cualquiera de las reivindicaciones 12-23 para su uso en la elaboración de un medicamento frente a enfermedades neurológicas/ neurodegenerativas y/o psiquiátricas.25. Composición farmacéutica que incluye las nanopartículas lipídicas definidas en cualquiera de las reivindicaciones 12-23 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.26. Kit para la depleción de macrófagos cerebrales que incluye las nanopartículas lipídicas definidas en cualquiera de las reivindicaciones 12-23.27. Kit según la reivindicación 26 en el que el ácido nucleico de las nanopartículas lipídicas es un GapmeR.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES201800272A ES2698565B2 (es) | 2018-12-12 | 2018-12-12 | Procedimiento para la elaboración de nanopartículas lipídicas, y nanopartículas lipídicas con los macrófagos cerebrales como células diana |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES201800272A ES2698565B2 (es) | 2018-12-12 | 2018-12-12 | Procedimiento para la elaboración de nanopartículas lipídicas, y nanopartículas lipídicas con los macrófagos cerebrales como células diana |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2698565A1 true ES2698565A1 (es) | 2019-02-05 |
| ES2698565B2 ES2698565B2 (es) | 2019-07-16 |
Family
ID=65207714
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES201800272A Active ES2698565B2 (es) | 2018-12-12 | 2018-12-12 | Procedimiento para la elaboración de nanopartículas lipídicas, y nanopartículas lipídicas con los macrófagos cerebrales como células diana |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| ES (1) | ES2698565B2 (es) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2024246304A1 (fr) * | 2023-06-02 | 2024-12-05 | Inhatarget Therapeutics | Composition pharmaceutique pour inhalation |
| WO2024246303A1 (fr) * | 2023-06-02 | 2024-12-05 | Inhatarget Therapeutics | Composition pharmaceutique pour inhalation |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111467321A (zh) * | 2020-03-26 | 2020-07-31 | 深圳市新合生物医疗科技有限公司 | 一种mRNA核酸类药物胞内递送系统、制备方法和应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2638309T3 (es) * | 2010-04-19 | 2017-10-19 | Nlife Therapeutics S.L. | Composiciones y métodos para la distribución selectiva de moléculas de oligonucleótidos a tipos específicos de neuronas |
-
2018
- 2018-12-12 ES ES201800272A patent/ES2698565B2/es active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2638309T3 (es) * | 2010-04-19 | 2017-10-19 | Nlife Therapeutics S.L. | Composiciones y métodos para la distribución selectiva de moléculas de oligonucleótidos a tipos específicos de neuronas |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| DU DAN ET AL. The role of glucose transporters in the distribution of p-aminophenyl-alpha-D-mannopyranoside modified liposomes within mice brain. Journal of Controlled Release MAY 28 2014. , 28/05/2014, Vol. 182, Páginas 99-110 [en línea][recuperado el 25/01/2019]. ISSN 0168-3659(print) ISSN 1873-4995(electronic), (DOI: doi:10.1016/j.jconrel.2014.03.006) <p>especialmente páginas 99-100</p> * |
| KAWAKAMI S ET AL. Mannose receptor-mediated gene transfer into macrophages using novel mannosylated cationic liposomes.. Gene therapy England Feb 2000. , 31/01/2000, Vol. 7, Páginas 292 - 299 [en línea][recuperado el 25/01/2019]. ISSN 0969-7128 (Print), (DOI: pubmed:10694809) páginas 292-293, 297-298 * |
| KHEIROLOMOOM AZADEH ET AL. Multifunctional Nanoparticles Facilitate Molecular Targeting and miRNA Delivery to Inhibit Atherosclerosis in ApoE(-/-) Mice.. ACS nano United States 22 Sep 2015. , 22/09/2015, Vol. 9, Páginas 8885 - 8897 [en línea][recuperado el 25/01/2019]. ISSN 1936-086X (Electronic), (DOI: doi:10.1021/acsnano.5b02611 pubmed:26308181) especialmente páginas 8886-8887, 8894-8895; figura 1 * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2024246304A1 (fr) * | 2023-06-02 | 2024-12-05 | Inhatarget Therapeutics | Composition pharmaceutique pour inhalation |
| WO2024246303A1 (fr) * | 2023-06-02 | 2024-12-05 | Inhatarget Therapeutics | Composition pharmaceutique pour inhalation |
| BE1031669B1 (fr) * | 2023-06-02 | 2025-01-14 | Inhatarget Therapeutics | Composition pharmaceutique pour inhalation |
| BE1031668B1 (fr) * | 2023-06-02 | 2025-01-16 | Inhatarget Therapeutics | Composition pharmaceutique pour inhalation |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2698565B2 (es) | 2019-07-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US10155945B2 (en) | Method of producing lipid nanoparticles for drug delivery | |
| Bhattacharya et al. | Advances in gene delivery through molecular design of cationic lipids | |
| Hope et al. | Cationic lipids, phosphatidylethanolamine and the intracellular delivery of polymeric, nucleic acid-based drugs | |
| Tranchant et al. | Physicochemical optimisation of plasmid delivery by cationic lipids | |
| ES2641272T3 (es) | Composiciones que comprenden proteínas o polipéptidos fusogénicos derivados de la prosaposina para aplicación en sistemas de suministro de fármacos transmembrana | |
| Habrant et al. | Design of ionizable lipids to overcome the limiting step of endosomal escape: application in the intracellular delivery of mRNA, DNA, and siRNA | |
| US5705385A (en) | Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer | |
| CA2752143C (en) | Delivery of nucleic acid-like compounds | |
| CN103906504B (zh) | 制备用于药物递送的脂质纳米颗粒的方法 | |
| US9655848B2 (en) | Liposomes for in-vivo delivery | |
| CN101970687A (zh) | 用于体内基因输送的自组装胶束样纳米颗粒 | |
| JP7595984B2 (ja) | 脂質ナノ粒子 | |
| US20110190623A1 (en) | Thermally-activatable liposome compositions and methods for imaging, diagnosis and therapy | |
| ES2698565B2 (es) | Procedimiento para la elaboración de nanopartículas lipídicas, y nanopartículas lipídicas con los macrófagos cerebrales como células diana | |
| MacLachlan et al. | Diffusible‐PEG‐Lipid Stabilized Plasmid Lipid Particles | |
| CA3139578A1 (en) | Nanovesicles and its use for nucleic acid delivery | |
| Miller | Nonviral liposomes | |
| Nóbrega et al. | Non-viral vectors for gene therapy | |
| CN106913880A (zh) | 一种含有rspo1的靶向给药系统及其制备与应用 | |
| US20240197636A1 (en) | Tissue-specific nucleic acid delivery by mixed cationic lipid particles | |
| WO2019023770A1 (pt) | Composição para terapia gênica do sistema nervoso central, processo de obtenção e uso da mesma | |
| Uyechi-O’Brien et al. | Mechanisms for cationic lipids in gene transfer | |
| Sorgi et al. | Drug delivery applications | |
| Ilies et al. | Pyridinium amphiphiles in gene delivery–Present and perspectives | |
| Nele et al. | Liposomes as DNA, mRNA and oligonucleotide delivery vectors |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| BA2A | Patent application published |
Ref document number: 2698565 Country of ref document: ES Kind code of ref document: A1 Effective date: 20190205 |
|
| FG2A | Definitive protection |
Ref document number: 2698565 Country of ref document: ES Kind code of ref document: B2 Effective date: 20190716 |