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ES2695550T3 - Método para rejuvenecer células - Google Patents

Método para rejuvenecer células Download PDF

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ES2695550T3
ES2695550T3 ES12712670T ES12712670T ES2695550T3 ES 2695550 T3 ES2695550 T3 ES 2695550T3 ES 12712670 T ES12712670 T ES 12712670T ES 12712670 T ES12712670 T ES 12712670T ES 2695550 T3 ES2695550 T3 ES 2695550T3
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ES
Spain
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cells
senescence
reprogramming
senescent
expression
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Application number
ES12712670T
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English (en)
Inventor
Alexandre Prieur
Ollivier Milhavet
Jean-Marc Lemaitre
Laure Lapasset
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Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite de Montpellier I
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Universite de Montpellier
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite de Montpellier I
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Universite de Montpellier
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Abstract

Un método ex vivo para preparar células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) a partir de una población de células diana que comprende células senescentes o células que sobreexpresan efectores de senescencia p16INK4A o p21CIP, comprendiendo dicho método: a) cultivar una población de células diana que comprende células senescentes o células que sobreexpresan efectores de senescencia p16INK4A o p21CIP en condiciones apropiadas para reprogramar dicha población de células diana en iPSCs, en donde dichas condiciones apropiadas comprenden aumentar la expresión en dicha población de células diana de la siguiente combinación de factores de reprogramación: i. Oct4, ii. Klf4, iii. Sox2, iv. c-Myc, v. Lin28, vi. y, Nanog.

Description

DESCRIPCION
Metodo para rejuvenecer celulas
S e c to r d e la te c n ic a
La divulgacion se refiere a un metodo para reprogramar celulas de donantes envejecidos o celulas senescentes en celulas pluripotentes que han perdido las marcas de senescencia. En particular, la divulgacion se refiere a un metodo ex vivo para preparar celulas madre pluripotentes inducidas (iPSC por sus siglas en ingles) a partir de una poblacion de celulas diana de donantes envejecidos o celulas senescentes, comprendiendo dicho metodo las etapas de cultivar dicha poblacion de celulas diana en condiciones apropiadas para reprogramar dichas celulas en iPSC, en donde dichas condiciones apropiadas comprenden aumentar la expresion en dichas celulas diana de al menos la combinacion de los siguientes factores de reprogramacion: Oct4, Klf4, Sox2, c-Myc, Lin28 y, opcionalmente Nanog. E s ta d o d e la te c n ic a
El descubrimiento de celulas madre pluripotentes inducidas (iPSC) de S. Yamanaka12, y el muy rapido avance de la tecnologfa de iPSC han abierto una nueva v^a en la medicina regenerativa autologa, segun lo cual es posible derivar celulas pluripotentes espedficas de pacientes a partir de celulas somaticas adultas. Las iPSC se han obtenido reproduciblemente en diferentes tipos de celulas por expresion forzada del coctel de factores de transcripcion de OCT4, SOX2, c-MYC y KLF4 o mediante una combinacion alternativa de factores sustituyendo KLF4 y c-MYC por NANOG y LIN283.
La senescencia celular esta ligada al envejecimiento fisiologico y se caracteriza por una detencion del ciclo celular estable como respuesta a diversas formas de estfmulos de estres, entre los que se incluyen la activacion de oncogen o telomeros extremadamente acortados denominados senescencia replicativa910. Una caractenstica comun es la activacion de las rutas de supresor de tumor p53/p21CIP1 y pRb/p16INK4A en estas celulas, asociadas con alteracion de la morfologfa, un aumento de la actividad de p-galactosidasa asociada a senescencia (SA-p-Gal), secretoma SA espedfica (SASP) y formacion de focos de heterocromatina asociados a senescencia (SAHF por sus siglas en ingles), que se cree que estan relacionados con la represion de genes que promueven la division celular11. La patente europea EP 2096169 divulga un proceso para generar celulas madre pluripotentes inducidas a partir de celulas somaticas, que comprende la etapa de introducir los seis genes siguientes: gen de la familia Oct, gen de la familia Klf, gen de la familia Sox, gen de la familia Myc, Lin28 y Nanog en celulas somaticas. Sin embargo, esta combinacion espedfica de factores de reprogramacion nunca se ha aplicado para celulas senescentes ni en celulas de donantes envejecidos.
Recientemente, varios grupos han descrito que la senescencia celular es una barrera para la reprogramacion debido a la regulacion al alza de p53, p16INK4A y p21CIP1, lo que indica que el envejecimiento celular podna ser una importante limitacion de esta tecnologfa. Por consiguiente, se ha propuesto la ablacion de diferentes efectores de senescencia como posible solucion para mejorar la eficacia de la generacion de iPSC4'8.
La patente internacional WO 2011/016588 senala el uso de inhibidores funcionales de p53 junto con un coctel de factores de reprogramacion que consiste en Oct3/4, Sox2, Klf4, L-myc y Lin28. Se han utilizado ARNsh p53 como inhibidores funcionales de p53.
Los autores de la invencion han demostrado ahora que el uso de la combinacion espedfica de seis factores OCT4, NANOG, SOX2, kLF4, c-MYC y LIN28 permite una reprogramacion eficiente de fibroblastos senescentes y centenarios proliferativos en iPSC humanas, sin necesidad de extirpar efectores de senescencia, en contraposicion con el prejuicio tecnico en la especialidad en relacion con la reprogramacion de celulas senescentes.
Por otra parte, los autores de la invencion han demostrado que esta reprogramacion restaura el tamano de los telomeros, el perfil de expresion de gen, el estres oxidativo y el metabolismo mitocondrial segun se observa en celulas madre embrionicas humanas (hESC por sus siglas en ingles). Sorprendentemente las iPSC derivadas de celulas envejecidas y senescentes no retiene marcas detectables del fenotipo de envejecimiento celular y son indistinguibles de hESC. Finalmente, las iPSC re-diferenciadas en fibroblastos presentan un mayor potencial para proliferar y un perfil de expresion de gen equivalente al de fibroblastos proliferativos jovenes, lo cual demuestra que la estrategia de reprogramacion de acuerdo con la presente divulgacion borra todas las evidencias de fenotipo de envejecimiento celular, lo cual define un nuevo metodo para producir celulas rejuvenecidas.
Segun la informacion del autor de la solicitud, la divulgacion es la primera descripcion de un metodo para producir iPSC con celulas de donantes envejecidos o celulas senescentes, de modo que la divulgacion puede ser muy util en particular en medicina regenerativa autologa, con la que sena posible derivar celulas pluripotentes espedficas de paciente de un adulto envejecido o celulas somaticas senescentes y asimismo encontraran numerosas aplicaciones en el campo de investigacion. Por otra parte, la divulgacion es util como metodo general para rejuvenecer celulas senescentes o celulas de donantes envejecidos, ya sea in vitro o in vivo.
O b je to d e la in v e n c io n
La invencion se describe en las reivindicaciones
Un primer aspecto de la divulgacion se refiere a un metodo ex vivo para preparar celulas madre pluripotentes inducidas (iPSC) desde una poblacion de celulas diana que comprende celulas de donantes envejecidos o celulas senescentes o celulas que sobreexpresan efectores de senescencia p16INK4A o p21CIP, comprendiendo dicho metodo las etapas de:
a) proporcionar dicha poblacion de celulas diana que comprenden celulas de donantes envejecidos o celulas senescentes o celulas que sobreexpresan efectores de senescencia p16INK4A o p21CIP, y
b) cultivar dicha poblacion de celulas diana en condiciones apropiadas para reprogramar dicha poblacion de celulas diana en iPSC, en donde dichas condiciones apropiadas comprenden aumentar la expresion en dicha poblacion de celulas diana de al menos la siguiente combinacion de factores de reprogramacion:
i. un factor de reprogramacion codificado por un gen de la familia de genes Oct,
ii. un factor de reprogramacion codificado por un gen de la familia de genes Klf,
iii. un factor de reprogramacion codificado por un gen de la familia de genes Sox,
iv. un factor de reprogramacion codificado por un gen de la familia de genes Myc y
v. Lin28,
vi. y, opcionalmente, Nanog.
En una realizacion preferente, dichas condiciones apropiadas comprenden aumentar la expresion en dicha poblacion de celulas diana de los siguientes factores de reprogramacion: Oct4, Klf4, Sox2, c-Myc (o L-myc), Lin28 y, opcionalmente, Nanog. En una realizacion relacionada, dichas condiciones apropiadas comprenden aumentar la expresion en dicha poblacion de celulas diana de los siguientes factores de reprogramacion: Oct4, Klf4, Sox2, c-Myc (o L-myc), Lin28 y Nanog.
Los autores de la invencion han demostrado que a traves del metodo de la divulgacion es posible borrar complemente las marcas de senescencia. Por tanto, de manera ventajosa, la poblacion de celulas diana puede seleccionarse de la poblacion de celulas que comprende celulas somaticas adultas de donantes envejecidos o celulas senescentes como fibroblastos senescentes, o de cualquier tipo de celulas que albergan la fisiologfa anciana o asociada a senescencia, como por ejemplo smdrome de envejecimiento prematuro. En una realizacion espedfica, la poblacion de celulas diana es una poblacion de celulas humanas obtenida de un sujeto adulto que tiene al menos 50 anos de edad, aparentemente sin lfmite en cuanto a la edad, ya que se reprogramo eficientemente una poblacion de celulas de un donante anciano de 101 anos con esta esta estrategia, por ejemplo al menos 60, 70, 80, 90, o100 anos, por ejemplo, que necesita terapia celular autologa regenerativa.
Ventajosamente, es posible que el metodo no comprenda ninguna etapa de silenciamiento directo de los efectores de senescencia, como p21CIP1 y/o p16INK4A y/o p53. En particular, es posible que el metodo no comprenda ningun uso de inhibidores funcionales de p53, como ARNsh p53.
En una realizacion, las condiciones para aumentar la expresion de los factores de reprogramacion enumerados comprenden
(a) introducir uno o mas vectores de expresion que comprenden las secuencias que codifican de dichos factores de reprogramacion; o
(b) entregar directamente una cantidad eficaz de cada factor de reprogramacion o su precursor de ARN, en dicha poblacion de celulas diana.
En una realizacion espedfica, el metodo de la divulgacion comprende la etapa de transfectar dicha poblacion de celulas diana con una combinacion de vectores virales, comprendiendo cada vector viral la secuencia que codifica cada uno de los factores de reprogramacion Oct4, Klf4, Sox2, c-Myc (o L-myc), Lin28 y, opcionalmente, Nanog. La divulgacion se refiere ademas a las celulas madre pluripotentes inducidas que se pueden obtener a traves del metodo descrito, en particular, a celulas madre pluripotentes inducidas que se pueden obtener a traves del metodo y que se obtienen de celulas senescentes y envejecidas.
La divulgacion se refiere ademas a un metodo in vitro para rejuvenecer celulas de donantes envejecidos o celulas senescentes que comprende reprogramar celulas de donantes envejecidos o celulas senescentes en celulas madre pluripotentes inducidas, aumentando la expresion en dichas celulas de donantes envejecidos o celulas senescentes de al menos una combinacion de los siguientes factores de reprogramacion:
i. un factor de reprogramacion codificada por un gen de la familia de genes Oct,
ii. un factor de reprogramacion codificada por un gen de la familia de genes Klf,
iii. un factor de reprogramacion codificada por un gen de la familia de genes Sox,
iv. un factor de reprogramacion codificada por un gen de la familia de genes Myc, y,
v. Lin28,
vi. y, opcionalmente, Nanog.
La divulgacion se refiere ademas a una composicion para su uso in vivo en el rejuvenecimiento de celulas de donantes envejecidos o celulas senescentes en un sujeto que lo necesita, comprendiendo dicha composicion medios para aumentar la expresion de los siguientes factores de reprogramacion Oct4, Klf4, Sox2, c-Myc, Lin28 y, opcionalmente, Nanog en dichas celulas envejecidas o senescentes.
En una realizacion, dichos medios para aumentar la expresion de dichos factores de reprogramacion comprenden una combinacion de protema Oct4, protema Klf4, protema Sox2, protema c-Myc, protema Lin28 y, opcionalmente, protema Nanog, en donde dicha protema esta asociada a medios apropiados para entregar dicha protema en el nucleo de las celulas que se van a rejuvenecer.
Alternativamente, dicho medio para aumentar la expresion de dichos factores de reprogramacion puede comprender una combinacion de precursor de ARN de Oct4, precursor de ARN de Klf4, precursor de ARN de Sox2, precursor de ARN de c-Myc, precursor de ARN de Lin28 y, opcionalmente, precursor de ARN de Nanog, en donde cada precursor de ARN esta asociado a un medio apropiado para entregar cada ARN precursor en el citoplasma de las celulas que se van a rejuvenecer.
Las composiciones, tal como se han descrito, pueden ser adecuadas ventajosamente para aplicacion topica.
D e sc r ip c io n d e ta l la d a d e la in v e n c io n
Un primer aspecto de la divulgacion se refiere a un metodo ex vivo para preparar celulas madre pluripotentes inducidas (iPSc) a partir de una poblacion de celulas diana que comprende celulas de donantes envejecidos o celulas senescentes o celulas que sobreexpresan efectores de senescencia p16INK4A o p21CIP, comprendiendo dicho metodo las etapas de:
a) proporcionar dicha poblacion de celulas diana que comprende celulas de donantes envejecidos o celulas senescentes o celulas que sobreexpresan efectores de senescencia p16INK4A o p21CIP, y
b) cultivar dicha poblacion de celulas diana en condiciones apropiadas para reprogramar dicha poblacion de celulas diana en iPSC, en donde dichas condiciones apropiadas comprenden aumentar la expresion en dicha poblacion de celulas diana de al menos la siguiente combinacion de factores de reprogramacion:
i. un factor de reprogramacion codificado por un gen de la familia de genes Oct,
ii. un factor de reprogramacion codificado por un gen de la familia de genes Klf,
iii. un factor de reprogramacion codificado por un gen de la familia de genes Sox,
iv. un factor de reprogramacion codificado por un gen de la familia de genes Myc y
v. Lin28,
vi. y, opcionalmente, Nanog.
Tal como se utiliza en el presente documento, el termino "pluripotente" se refiere a celulas que tienen la capacidad de dar lugar a una progenie que puede experimentar diferenciacion en condiciones apropiadas para dar tipos de celulas que presentan colectivamente caractensticas asociadas con linajes celulares de tres capas germinales (endodermo, mesodermo y ectodermo). Las celulas madre pluripotentes pueden contribuir al tejido de un organismo prenatal, postnatal o adulto. Puede emplearse una prueba convencional aceptada en la especialidad, como pueda ser la capacidad para formar teratoma en ratones SCID de 8-12 semanas de vida, para establecer la pluripotencia de una poblacion de celulas. Sin embargo, tambien es posible utilizar la identificacion de varias caractensticas de celulas madre pluripotentes para identificar celulas pluripotentes.
Mas concretamente, las celulas madre pluripotentes humanas pueden expresar alguno, y opcionalmente todos los marcadores de la siguiente lista no exhaustiva: SSEA-3, SSEA-4, TRA-I -60, TRA-I -81, t Ra -2-49/6E, ALP, Sox2, E-cadherina, UTFI, oct4, Lin28, Rexl y Nanog.
Tal como se utiliza en el presente documento, la expresion "celula madre pluripotente inducida" se refiere a una celula madre pluripotente derivada artificialmente de una celula no pluripotente. Una celula no pluripotente puede ser una celula con menor potencia para auto-renovarse y diferenciarse que una celula madre pluripotente. Las celulas con menor potencia pueden ser, pero sin limitarse a ellas, celulas madre somaticas, celulas progenitoras espedficas de tejido, celulas primarias o secundarias. Una ventaja que cabe destacar del metodo de la presente invencion es que permite producir celulas madre pluripotentes inducidas de cualquier celula somatica, incluyendo celulas envejecidas o senescentes, que anteriormente no se consideraban como capaces de inducir pluripotencia debido a su fenotipo de envejecimiento.
El termino “reprogramacion” se refiere al proceso de cambiar de destino de una celula diana por el de un tipo de celula diferente, causado por la expresion de un reducido grupo de factores (o factores de reprogramacion) en las celulas diana. Por ejemplo, Takahashi y Yamanaka, 20061 han descrito metodos para reprogramar celulas de fibroblastos en celulas madre pluripotentes inducidas expresando ectopicamente Oct3/4, Sox2, cmyc y Klf4.
En consecuencia, un “factor de reprogramacion” es un factor, puede ser por ejemplo un factor de transcripcion, que puede utilizarse para reprogramar una celula diana. La expresion “factor de reprogramacion” incluye ademas cualquier molecula analoga que imite la funcion del factor con respecto a la capacidad de reprogramacion.
P o b la c io n d e c e lu la s d ia n a p a ra s u u s o e n el m e to d o d e la d iv u lg a c io n
La poblacion de celulas diana para su uso el metodo de la presente divulgacion es ventajosamente una poblacion de celulas que comprende celulas de donantes envejecidos o celulas senescentes o celulas que sobreexpresan efectores de senescencia p16INK4A o p21CIP Estas celulas pueden obtenerse de celulas vivas de tejidos congelados de animales.
El termino "celulas senescentes" se refiere a celulas que presentan una detencion del ciclo celular generalmente durante la transicion G1 del ciclo celular, o en algunos casos en G2, provocado por el agotamiento replicativo debido al desgaste de los telomeros o como respuesta al estres como pueda ser lesion del ADN, farmacos quimioterapeuticos o expresion aberrante de oncogenes. Esta detencion se implanta principalmente a traves de la activacion de p53 y la regulacion al alza de los inhibidores de quinasa dependiente de ciclina (CDK) p16INK4A y p21CIP1 (Collado et al. 2007, Cell, 130: 223-233).
Las "Celulas senescentes" pueden caracterizarse por al menos una de las siguientes caractensticas:
- activacion de las rutas de supresion de tumor p53/ p21CIP1 y pRb/ p16INK4A (en adelante denominados efectores de senescencia),
- celulas detenidas irreversiblemente en G1,
- acortamiento del tamano del telomero,
- expresion de actividad p-galactosidasa asociada a senescencia (SA p-Gal),
- modificacion de cromatina espedfica como focos de heterocromatina asociados a senescencia (SAHF), - secretoma espedfica,
- actividad mitocondrial general reducida/alterada.
La detencion celular irreversible en G1 puede evaluarse por FACS, tal como describen Matsuura et al25 y se resume brevemente a continuacion:
para analizar el ciclo de la celula, se fijan celulas tripsinizadas con EtOH al 70 % refrigerado durante al menos 15 minutos a 4 °C. Se centrifugan las celulas fijadas y se resuspenden en PBS antes de tenir con yoduro de propidio (10 |jg/ml) mas ARNasa (250 jg/ml) durante 30 minutos y analisis por citometna de flujo, utilizando por ejemplo un FacsCalibur II (BD Biosciences).
El acortamiento del tamano de telomeros puede caracterizarse por evaluacion de la longitud media del fragmento de restriccion terminal (TRF) por ejemplo por analisis de transferencia de Southern, por ejemplo, tal como se describe en los Ejemplos mas adelante.
Matsuura et al25 describe un metodo para detectar la expresion de actividad p-galactosidasa asociada a senescencia (SA p-Gal) y se resume brevemente a continuacion:
se tinen cultivos de celulas segun lo descrito (Dimri et al. Proc Natl Acad Sci EE.UU. 1995 Sep 26; 92 (20):9363-7). Brevemente, se lavan las celulas con solucion salina tamponada con fosfato (PBS) y se fijan con paraformaldehndo al 1 % durante 3 minutos a temperatura ambiente, a continuacion se lava tres veces con PBS durante 5 minutos cada una a temperatura ambiente. Se lleva a cabo el tenido durante toda la noche en una incubadora enriquecida sin CO2 a 37 °C utilizando una solucion pH 6 con un contenido de fosfato sodico (dibasico) 40 mM, acido dtrico 40 mM, NaCl 150 mM, MgCb 2 mM, ferrocianuro potasico 5 mM, ferrocianuro potasico 5 mM, 1 mg/ml X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-b-D-galactosida, Pierce Chemical Co., Rockford, IL). Se anaden sales de cianuro y X-gal a partir de reservas de 100X recientes en PBS y dimetilformamida, respectivamente. A continuacion, se lavan las celulas tres veces con PBS durante 5 minutos cada una a temperatura ambiente, antes del examen microscopico y la fotograffa.
En los Ejemplos mas adelante se describe un metodo para detectar la expresion de focos de heterocromatina asociados a senescencia (SAHF) por inmunofluorescencia indirecta.
La actividad mitocondrial general puede evaluarse midiendo el potencial de transmembrana generado por el gradiente de protones. En los ejemplos mas adelante se describe por ejemplo un metodo para medir este parametro utilizando un colorante cationico JC-1.
Las celulas de donantes envejecidos comprenden una serie de celulas proliferativas que presentan ciertas caractensticas de celulas senescentes, en particular
- regulacion al alza de supresores de tumor p16INK4A y p21CIP1 (en adelante denominados efectores de senescencia).
- menor capacidad para proliferar,
- hipometilacion de las CpG global genomica,
- heterochromatinizacion no programada.
La regulacion al alza de los supresores de tumor p16INK4A y p21CIP1 puede observarse aplicando tecnicas habituales en la especialidad para medir la expresion de protemas y/o la expresion de ARNm, por ejemplo, transferencia de Western, transferencia de Northern o PCR en tiempo real. La regulacion al alza se observa cuando se observa una expresion significativa mas alta de p16INK4A y p21CIP1 en las celulas de ensayo en comparacion con las celulas controladas (no senescentes), por ejemplo celulas madre embrionicas.
Los autores de la invencion han demostrado que las celulas proliferativas y senescentes de donantes envejecidos (de mas de 70 anos de edad) tienen una firma diferente, por ejemplo, por lo que respecta al metabolismo o la expresion genica, a la de las celulas de donantes jovenes. Las iPSC obtenidas de acuerdo con el metodo tienen una firma que esta mas proxima a las celulas madre embrionicas y se distinguen en ese sentido de las iPSC obtenidas con un coctel convencional de 4 factores reprogramacion OCT4, SOX2, c-MYC y kLF4.
Segun la informacion del autor de la solicitud, el metodo de la divulgacion que comprende el uso de una combinacion de al menos 5, preferentemente 6 factores de reprogramacion espedficos es el unico metodo descrito en la especialidad para generar celulas madre pluripotentes inducidas a partir de celulas senescentes o celulas de donantes envejecidos. Por consiguiente, el metodo de la divulgacion es particularmente util para poblaciones de celulas susceptibles de contener en una alta proporcion celulas senescentes.
En una realizacion preferente del metodo de la divulgacion, dicha poblacion de celulas diana comprende al menos 10 %, 20 %, 30 %, 40 % o al menos 50 % de celulas que presentan al menos una o mas (o todas) las siguientes caractensticas del fenotipo de envejecimiento:
- regulacion al alza de los supresores de tumor p16INK4A y p21CIP1 (en adelante denominados efectores de senescencia),
- celulas detenidas irreversiblemente en G1,
- expresion de actividad de p-galactosidasa asociada a senescencia (SA p-Gal),
- expresion de focos de heterocromatina asociados a senescencia (SAHF),
- actividad mitocondrial general alterada.
En otra realizacion espedfica, dicha poblacion de celulas diana son celulas, por ejemplo celulas dermicas o celulas de fibroblasto, obtenidas de un sujeto adulto que tiene al menos 50 anos de edad, por ejemplo, al menos 60, 70, 80, 90 o al menos 100 anos de edad.
Dicha poblacion de celulas diana puede obtenerse de especies de mairnfero y, preferentemente, de especies de roedores, primates o seres humanos, mas preferentemente de la especie humana.
La poblacion de celulas diana puede obtenerse desde varios tejidos, preferentemente, de un paciente envejecido humano que necesita un tratamiento regenerativo autologo.
Los metodos para obtener muestras de diversos tejidos y los metodos para establecer celulas primarias son muy conocidos en la especialidad (vease p.ej., Jones y Wise, Methods Mol Biol. 1997).
En una realizacion espedfica, dicha poblacion de celulas diana se obtiene de celulas primarias de sangre, medula osea, tejido adiposo, piel, pelo, apendices de la piel, organos internos, como el corazon, los intestinos o el hfgado, tejidos mesenquimales, musculo, hueso, cartflago o tejidos esqueletales.
C o m b in a c io n d e f a c to re s d e r e p ro g ra m a c io n p a ra s u u s o e n el re ju v e n e c im ie n to y g e n e ra c io n d e iPSC Una caractenstica esencial de la presente divulgacion es el uso de la siguiente combinacion de factores de reprogramacion para su uso en el rejuvenecimiento o la induccion de celulas madre pluripotentes a partir de una poblacion de celulas diana:
i. un factor de reprogramacion codificado por un gen de la familia de genes Oct, preferentemente Oct4, ii. un factor de reprogramacion codificado por un gen de la familia de genes Klf, preferentemente Klf4, iii. un factor de reprogramacion codificado por un gen de la familia de genes Sox, preferentemente Sox2, iv. un factor de reprogramacion codificado por un gen de la familia de genes Myc, preferentemente c-Myc, v. Lin28, y, opcionalmente,
vi. Nanog.
La combinacion de factores de reprogramacion para su uso en el rejuvenecimiento o la induccion de celulas madre pluripotentes a partir de la poblacion de celulas diana, como celulas senescentes o celulas de donantes envejecidos, puede incluir por ejemplo la combinacion de 5 factores de reprogramacion Oct4, Klf4, Sox2, c-Myc (o L-myc) y Lin28, o los 6 factores de reprogramacion Oct4, Klf4, sox2, c-Myc (o L-myc), Lin28 y Nanog. En una realizacion preferente, no se utilizan inhibidores funcionales de p53.
Tal como se utiliza en el presente documento, un inhibidor funcional de p53 es cualquier sustancia capaz de inhibir la funcion de la protema p53 o (b) la expresion del gen p53. Dichas sustancias se describen por ejemplo en la patente internacional WO 2011/016588. De manera sobre todo espedfica, el metodo de la presente invencion no contiene el uso de ningun medio de expresion de ARNsi o ARNsh contra p53 en la poblacion de celulas diana (p.ej., celulas senescentes).
Tal como se utiliza en el presente documento, el termino " familia Oct " se refiere a la familia de factores de transcripcion octameros ("Oct") que desempenan un papel crucial en mantener la pluripotencia. POU5F1 (dominio POU, clase 5, factor de transcripcion 1) conocido tambien como Oct3/4 es un representante de la familia Oct. La ausencia de Oct3/4 en celulas Oct-3/4+, como blastomeros o celulas madre embrionicas, conduce a una diferenciacion de trofoblasto espontanea y la presencia de Oct-3/4 da lugar por tanto a la pluripotencia y potencial de diferenciacion de las celulas madre embrionicas. Entre los ejemplos de protemas Oct3/4 se incluyen protemas codificadas por el gen oct3/4 murinas (Numero de acceso de Genbank NM_013633) y el gen humano Oct3/4 (Numero de acceso de Genbank nM_002701).
Los terminos "Oct3/4", "Oct4," "OCT4," " protema Oct4," " protema OCT4" y similares se refiere por tanto a cualquier forma natural del factor de transcripcion 4 octamero o variantes de los mismos que mantienen la actividad del factor de transcripcion Oct4 (p.ej., dentro de al menos un 50 %, 80 %, 90 % o 100 % de actividad en comparacion con Oct4 de tipo silvestre segun se mide a traves de metodos conocidos en la tecnica). En algunas realizaciones, las variantes tienen al menos 90 % de identidad de la secuencia de aminoacidos a traves de su secuencia completa en comparacion con el polipeptido Oct4 natural. En otras realizaciones, la protema Oct4 es la protema identificada con la referencia de Genbank ADW77327.1.
Tal como se utiliza en el presente documento, el termino " familia Sox" se refiere a genes Sox asociados con el mantenimiento de la pluripotencia similares a oct-374, si bien estan asociados con celulas madre multipotentes y unipotentes en contraste con Oct-3/4, que se expresa exclusivamente en celulas madre pluripotentes. Si bien Sox2 fue el gen inicial utilizado para la induccion13, se ha descubierto que otros genes de la familia Sox funcionan tambien en el proceso de induccion. Sox1 produce iPSC con una eficiencia similar a Sox2 y los genes Sox3, Sox15 y Sox18 generan tambien iPSC.
Entre los ejemplos de protemas Sox2 se incluyen protemas codificadas por el gen Sox2 murino (Numero de acceso de Genbank nM_011443) y el gen humano Sox2 (Numero de acceso de Genbank NM_003106).
Los terminos "Sox2," "SOX2," " protema Sox2," " protema SOX2 " y similares tal como se hace referencia en el presente documento incluyen cualquier forma natural del factor de transcripcion Sox2 o variantes de los mismos que mantienen la actividad de factor de transcripcion Sox2 (p.ej., dentro de al menos un 50 %, 80 %, 90 % o 100 % de actividad en comparacion con el Sox2 de tipo silvestre, cuando se mide a traves de metodos conocidos en la especialidad). En algunas realizaciones, las variantes tienen al menos un 90 % de identidad de secuencia de aminoacidos a traves de toda la secuencia en comparacion con el polipeptido Sox2 natural. En otras realizaciones, la protema Sox2 es una protema tal como se identifica con la referencia del NCBI NP_003097.1.
Tal como se utiliza en el presente documento, el termino "familia Klf " se refiere a genes Klf identificados inicialmente como un factor para la generacion de iPSC de raton y que segun se ha demostrado constituyen un factor para la generacion de iPSC humanas. Entre los ejemplos de protemas Klf4 se incluyen las protemas codificadas por el gen klf4 murino (Numero de acceso de Genbank NM_010637) y el gen klf4 humano (Numero de acceso de Genbank NM_004235).
Los terminos "KLF4," " protema KLF4" y similares tal como se hace referencia en el presente documento incluyen cualquiera de las formas naturales del factor de transcripcion KLF4 o variantes de los mismos que mantienen la actividad de transcripcion del KLF4 (p.ej., dentro de al menos un 50 %, 80 %, 90 % o 100 % de actividad en comparacion con KLF4 de tipo silvestre segun se mide a traves de metodos conocidos en la especialidad). En algunas realizaciones, las variantes tienen al menos un 90 % de identidad de secuencia de aminoacidos a traves de toda la secuencia en comparacion con el polipeptido KLF4 natural. En otras realizaciones, la protema KLF4 es la protema segun se identifica con la referencia del NCBI NP_004226.3.
Tal como se utiliza en el presente documento, los factores de la familia Myc se refieren a factores codificados por proto-oncogenes myc relacionados con el cancer. Se ha demostrado que c-Myc es un factor relacionado con la generacion de iPSC de raton e iPSC humanas. Entre los ejemplos de protemas c-Myc se incluyen las protemas codificadas por el gen c-myc murino (Numero de acceso de Genbank NM_010849) y el gen c-myc humano (Numero de acceso de Genbank NM_002467). Se utilizo tambien N-Myc o L-myc como posible factor de reprogramacion reemplazando c-Myc
Los terminos "c-Myc," C-MYC," "protema c-Myc ", "protema C-MYC" y similares tal como se hace referencia a ellos en el presente documento incluyen cualquier forma natural del factor de transcripcion c-Myc o variantes de los mismos que mantienen la actividad del factor de transcripcion de cMyc (p.ej. dentro de al menos un 50 %, 80 %, 90 % o 100 % de actividad en comparacion con cMyc de tipo silvestre segun se mide a traves de metodos conocidos en la especialidad). En algunas realizaciones, las variantes tienen al menos un 90 % de identidad de secuencia de aminoacidos a traves de toda la secuencia en comparacion con el polipeptido c-Myc natural. En otras realizaciones, la protema c-Myc es la protema tal como se identifica con la referencia del NCBI n P_002458.2.
El termino "Nanog" o "nanog" se refiere a un factor de transcripcion cnticamente relacionado con la auto-renovacion de celulas madre embrionicas no diferenciadas. En los seres humanos, esta protema esta codificada por el gen NANOG. Entre los ejemplos de nanog se incluye la protema codificada por el gen murino (Numero de acceso de Genbank XM_132755) y el gen Nanog humano (Numero de acceso de Genbank nM_024865).
El termino "Nanog" o "nanog" y similares a los que se hace referencia en el presente documento incluye tambien cualquier forma natural del factor de transcripcion Nanog o variantes de los mismos que mantienen la actividad del factor de transcripcion Nanog (p.ej., dentro de al menos 50 %, 80 %, 90 % o 100 % de actividad en comparacion con Nanog de tipo silvestre, segun se mide a traves de metodos conocidos en la especialidad). En algunas realizaciones, las variantes tienen al menos un 90 % de identidad de la secuencia de aminoacidos a traves de toda su secuencia en comparacion con el polipeptido Nanog natural. En otras realizaciones, la protema Nanog es la protema segun se identifica por la referencia del NCBI NP_079141.
El termino "Lin28" u "homologo A de Lin-28" es una protema que esta codificada por el gen LIN28 en seres humanos. Es un marcador de celulas madre embrionicas humanas no diferenciadas y codifica una protema de union a ARNm citoplasmica que se une y potencia la traduccion del ARNm de IGF-2 (factor de crecimiento 2 de tipo insulina). Se ha demostrado tambien que Lin28 se une a ARNpre-mi de Let-7 y bloquea la produccion de microARN de let-7 maduro en celulas madre embrionicas de raton. Yu et al., han demostrado que es un factor en la generacion de IPSC si bien no es obligatorio.3 Entre los ejemplos de Lin28 se incluye la protema codificada por el gen murino (Numero de acceso de Genbank NM_145833) y gen Lin28 humano (Numero de acceso de Genbank NM_024674).
El termino "Lin28" u "homologo A de Lin28" y similares tal como se hace referencia en el presente documento incluye cualquiera de las formas naturales del factor de trascripcion Lin28 o variantes de los mismos que mantienen la actividad del factor de transcripcion Lin28 (p.ej., dentro de al menos 50 %, 80 %, 90 % o 100 % en comparacion con Lin28 de tipo silvestre segun se mide a traves de metodos conocidos en la especialidad). En algunas realizaciones, las variantes tienen al menos un 90 % de identidad de secuencias de aminoacidos a traves de toda la secuencia en comparacion con el polipeptido Lin28 natural. En otras realizaciones, la protema Lin28 es una protema segun se identifica con la referencia del NCBI NP_078950.
Tal como se utiliza en el presente documento, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoacidos esta en funcion del numero de posiciones identicas compartidas por las secuencias (es decir, % de identidad = No. de posiciones identicas/total de No. de posiciones x 100), teniendo en cuenta el numero de huecos y la longitud de cada hueco, que ha de introducirse para un alineamiento optimo de las dos secuencias. La comparacion de secuencias y la determinacion del porcentaje de identidad entre dos secuencias pueden llevarse a cabo utilizando un algoritmo matematico, tal como se describe a continuacion.
El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoacidos puede determinarse aplicando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17, 1988) que se ha incorporado en el programa ALIGN (version 2.0), aplicando la tabla de restos de pesos PAM120, una penalizacion de longitud e hueco de 12 y una penalizacion de huecos de 4.
Las personas especializadas podran seleccionar otros factores de reprogramacion correspondientes de origen en otros animales, como ratones, ratas, vacas, caballos, ovejas, cerdos, cabras, camellos, antilopes y perros. Ventajosamente, las personas especializadas podran seleccionar el efector de reprogramacion correspondiente a partir de las mismas especies que las celulas diana utilizadas como material de partida en el metodo de la divulgacion.
Las personas especializadas podran seleccionar tambien analogos de uno o mas de los factores de reprogramacion mencionados. Tal como se utiliza en el presente documento, el termino “analogo” se refiere a un compuesto que tiene una estructura diferente pero que proporciona los mismos resultados que el factor de reprogramacion para su uso en la generacion de iPSC y que puede por tanto reemplazar dicho factor de reprogramacion en un metodo para generar celulas madre pluripotentes inducidas.
Por ejemplo, Wenlin Li y Sheng Ding. Trends in Pharmacological Sciences Volumen 31, publicacion 1, enero 2010, Paginas 36-45 o Feng et al. Cell Stem Cell 2009 abril 3; 4(4):301-12 (vease en particular los analogos divulgados en las Tablas 1 y 2 de Feng et al., 2009), describen analogos de dichos factores de reprogramacion.
C o n d ic io n e s p a ra a u m e n ta r la e x p re s io n d e f a c to r d e re p ro g ra m a c io n
En los metodos de la divulgacion pueden emplearse cualquiera de las condiciones disponibles en la especialidad para aumentar la expresion de un factor de reprogramacion, siempre y cuando dichas condiciones tengan como resultado la presencia del factor de reprogramacion en una cantidad apropiada para reprogramar dichas celulas diana en celulas madre pluripotentes inducidas.
Dentro de la tecnica se han descrito varios metodos para aumentar la expresion de factores de reprogramacion. Para una revision vease Hanna JH, Saha K, Jaenisch R. Cell. 2010 Nov 12; 143(4):508-25; o, Sheng Ding. Trends in Pharmacological sciences Volumen 31, publicacion 1, enero 2010, paginas 36-45; y, Feng et al. Cell Stem Cell. 2009 abril 3; 4(4):301-12.
En realizaciones preferentes, pueden utilizarse la siguiente alternativa para aumentar la expresion de los factores de reprogramacion:
(i) potenciar la expresion endogena del gen que codifica dicho factor de reprogramacion,
(ii) permitir la expresion ectopica de dicho factor de reprogramacion introduciendo un vector de expresion que comprende una secuencia de codificacion de dicho factor de reprogramacion ligado operativamente para controlar secuencias en la poblacion de celulas diana, o
(iii) entregar a las celulas una cantidad apropiada de dicho factor de reprogramacion o su precursor de ARN. En otra realizacion, se utilizan uno o mas vectores de expresion que comprenden la secuencia de codificacion de la combinacion de factores de reprogramacion, por ejemplo, la secuencia de codificacion de Oct4, la secuencia de codificacion de Sox2, la secuencia de codificacion de Klf4, la secuencia de codificacion de c-Myc, la secuencia de codificacion de Lin28, y, opcionalmente, la secuencia de codificacion de Nanog y/o secuencias de codificacion que tienen al menos un 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95 % de identidad con la secuencia de codificacion nativa correspondiente de Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc, Lin28 y, opcionalmente, Nanog.
Tal como se utiliza en el presente documento, el termino "secuencia de codificacion" se refiere a una secuencia de nucleotidos que, tras la transcripcion, da lugar al producto codificado. La transcripcion de la secuencia de codificacion de acuerdo con la presente divulgacion puede llevarse a efecto facilmente en conexion con un promotor adecuado. Preferentemente, la secuencia de codificacion corresponde a la secuencia de ADNc de un gen que da lugar tras la transcripcion a un factor de reprogramacion.
El porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleotidos puede determinarse aplicando por ejemplo algoritmos como el programa BLASTN para secuencias de acidos nucleicos utilizando como defectos una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) de 19, m=5, N=4 y una comparacion de ambas cadenas.
Los vectores de expresion para expresion ectopica de los factores de reprogramacion pueden ser por ejemplo un vector de plasmido, un vector de cosmido, un vector de cromosoma artificial bacteriano (BAC), un vector a base de transposicion (como por ejemplo PiggyBac) o un vector viral.
En una realizacion espedfica, los vectores de expresion utilizados para aumentar la expresion de dichos factores de reprogramacion son vectores virales. Entre los ejemplos de dichos vectores virales se incluyen vectores que tienen su origen en retrovirus como VIH (virus de inmunodeficiencia humana), MLV (virus de leucemia murina), ASLV (virus de sarcoma /leucosis aviar), SNV (virus de necrosis de bazo), RSV (virus de sarcoma de Rous), MMTV (virus de tumor mamario de raton), etc., lentivirus, virus adenoasociados, y virus de herpes simple, pero no se limita a ellos. Los metodos para generar celulas madre pluripotentes inducidas a base de vectores de expresion que codifican factores de reprogramacion se han descrito en la tecnica, vease por ejemplo los documentos WO2007/69666, EP2096169-A1 o WO2010/042490.
Normalmente, la secuencia de codificacion de cualquiera de los factores de reprogramacion, tal como se utilizan en el metodo de la divulgacion, por ejemplo, la secuencia de codificacion de Oct4, la secuencia de codificacion de Sox2, la secuencia de codificacion de Klf4, la secuencia de codificacion de c -Myc, la secuencia de codificacion de Nanog y/o la secuencia de codificacion de Lin28 pueden estar operativamente ligadas a secuencias de control, por ejemplo, un promotor, capaz de llevar a efecto la expresion de la secuencia de codificacion en la poblacion de celulas diana. Dicho vector de expresion puede incluir ademas elementos de regulacion que controlan su expresion, como por ejemplo un promotor, un codon de iniciacion, un codon de parada, una senal de poliadenilacion y un potenciador. El promotor puede ser constitutivo o inducible. El vector puede ser autoreplicable o puede estar integrado en el ADN de la celula hospedadora.
Alternativamente, el vector para expresion ectopica es un vector viral y se producen y utilizan partfculas virales para introducir la secuencia de codificacion de dichos factores de reprogramacion en dicha poblacion de celulas diana que comprende celulas envejecidas o senescentes. Se pretende que el termino “partfculas virales” haga referencia a partfculas que contienen protemas estructurales virales y a una secuencia que codifica dichos factores de reprogramacion.
Las partmulas virales pueden prepararse transformando o transfectando una celula empaquetada con un vector viral que transporta las secuencias de codificacion de nucleotidos de dicha combinacion de factores de reprogramacion. En los ejemplos, mas adelante, se preparan partmulas virales de lentivirus.
La poblacion de celulas diana puede transfectarse a continuacion utilizando los vectores de expresion tal como se han descrito.
El termino “transfeccion” o “transfectar” se refiere a un proceso de introduccion de moleculas de acido nucleico en la celula. Las moleculas de acido nucleico pueden ser secuencias de genes que codifican protemas completas o porciones funcionales de las mismas. Es util cualquier metodo de transfeccion apropiado en los metodos descritos en el presente documento.
La incorporacion de las secuencias de codificacion o sus secuencias de control directamente en el genoma de celulas diana puede causar la activacion o inactivacion de mutaciones de oncogenes o genes supresores de tumor, respectivamente. Para determinadas aplicaciones, en particular aplicaciones medicas, puede ser necesario evitar cualquier modificacion genetica de las celulas diana.
En una tercera realizacion, se introducen los factores de reprogramacion, por ejemplo, Oct4, Sox2, Flk4, c-Myc, Nanog y Lin28, o el ADN o ARN codificante correspondiente, en las celulas diana sin integracion de material genetico exogeno en el ADN hospedador, es decir, sin introducir la secuencia de nucleotidos en el genoma de la celula.
Puede entregarse un vector de expresion como por ejemplo un vector de plasmido en dichas celulas para expresion ectopica del factor de reprogramacion, en forma de ADN desnudo. Alternativamente, pueden introducirse a Rn que codifican dichos factores de reprogramacion ya esten o no qmmicamente modificados, en las celulas para reprogramarlas (vease por ejemplo Warren L, et al, 2010, cell Stem Cell. Nov 5; v7(5):618-30).
Se han descrito otros vectores de expresion por ejemplo en la patente internacional WO 2009115295.
Estos acidos nucleicos pueden entregarse a las celulas diana con la ayuda por ejemplo de un liposoma o un polfmero cationico, por ejemplo, utilizando protocolos de transfeccion convencionales en celulas de mairnfero.
En particular, pueden emplearse metodos de transfeccion apropiados que no utilizan ADN viral o partroulas virales como un sistema de entrega para introducir las moleculas de acido nucleico en la celula diana en los metodos descritos en el presente documento. Entre los ejemplos de metodos de transfeccion se incluyen sin imitacion transfeccion con fosfato calcico, transfeccion con liposoma, nucleofeccion, sonoporacion, transfeccion por choque de calor, magnetofeccion y electroporacion. En algunas realizaciones, se introducen las moleculas de acido nucleico en las celulas diana por electroporacion seguido de procedimientos convencionales perfectamente conocidos en la tecnica.
Alternativamente, la protema del factor de reprogramacion o los fragmentos del mismo que presentan propiedades similares a las de protemas intactas con respecto a la reprogramacion de celulas diana pueden entregarse en dichas celulas diana con ayuda de vetnculos qmmicos, como peptidos de penetracion en la celula incluyendo, sin limitacion, peptidos derivados de TAT.
Dentro de la especialidad se han descrito tambien metodos para mejorar la eficiencia de la generacion de iPSC. En particular, en el metodo de la divulgacion, puede recurrirse a la introduccion y/o adicion de diversos agentes para mejorar la eficiencia de generacion. Entre los ejemplos de sustancias para mejorar la eficiencia de generacion de iPSC se incluyen, sin limitacion, inhibidores de histona deacetilasa (como por ejemplo acido valproico, ticostatina A, lactato sodico, MC1293 y M344) e inhibidores de la expresion de acido nucleico como ARNsi y ARNsh para inhibidores de histona metiltransferasa HDAC y G9a e inhibidores de sistema de expresion de acido nucleico como ARNs y ARNsh para G9a (vease por ejemplo Feng et al., 2009, supra).
En una realizacion concreta, los metodos de acuerdo con la divulgacion no comprenden ninguna etapa de silenciamiento directo de los efectores de senescencia y en particular el silenciamiento directo de efectores de p53. Se entiende por “silenciamiento directo” el uso de una sustancia que actua directamente en la expresion del gen de interes, por ejemplo, gen p53 y no una sustancia que actue como factor aguas arriba. Una forma de silenciar un gen es el uso de ARNsi o ARNsh dirigido directamente a la secuencia de genes que se va a inhibir.
C o m p o s ic io n e s q u e c o m p re n d e n iPSC q u e s e p u e d e o b te n e r a t r a v e s d e lo s m e to d o s d e la d iv u lg a c io n La divulgacion se refiere tambien a composiciones a base de celulas que comprenden iPSC que se pueden obtener a traves del metodo, tal como se ha descrito (en adelante, denominadas “las composiciones de iPSC”) y un vehmulo farmaceuticamente aceptable. Cabe destacar que las iPSC de acuerdo con la presente divulgacion no tienen las caractensticas del fenotipo de envejecimiento, aunque derivan de celulas de donantes envejecidos o celulas senescentes.
Estas composiciones de iPSC pueden comprender normalmente iPSC obtenidas de un paciente que padece un trastorno relacionado con el envejecimiento, como por ejemplo trastornos causados por un defecto en la helicasa, incluyendo smdrome de Wermer, smdromes de Cockayne, Rothmund-Thomson y Bloom y xeroderma pigmentosa y tricotiodistrofia u otros trastornos incluyendo, sin limitacion, progeria de Hutchinson-Giford o smdrome de Wiedemann-Rautenstrauch.
C o m p o s ic io n d e c e lu la s o b te n id a s p o r d ife re n c ia c io n d e iP S C q u e s e p u e d e n o b te n e r c o n lo s m e to d o s d e la d iv u lg a c io n y s u s u s o s .
Las iPSC obtenidas a partir de los metodos de la divulgacion, en particular, de celulas de donantes envejecidos, pueden cultivarse ventajosamente in vitro en condiciones de diferenciacion, para generar celulas diferenciadas, como musculo, cartflago, hueso, tejido dermico, tejido cardfaco o vascular y otros tejidos de interes.
Por lo tanto, la divulgacion se refiere a los metodos de preparacion de composiciones que comprenden celulas diferenciadas, comprendiendo dicho metodo las etapas de:
(a) proporcionar una composicion que comprende celulas iPS obtenidas a partir de los metodos de la divulgacion a partir de celulas diana de donantes envejecidos; y,
(b) cultivar dicha composicion que comprende celulas iPS, en condiciones apropiadas para su diferenciacion en los linajes de celulas deseados.
Las personas especializadas pueden aplicar protocolos conocidos para diferenciar celulas madre, como celulas madre pluripotentes inducidas, celulas ES o celulas madre mesenquimales en los linajes de celulas deseados. Un aspecto de la divulgacion se refiere al uso de dicha composicion que comprende dichos linajes de celulas derivados de la diferenciacion de iPSC, en adelante denominadas celulas diferenciadas de la divulgacion.
Las celulas diferenciadas de la divulgacion tienen la particularidad de tener un fenotipo rejuvenecido, por ejemplo, con respecto al tamano de los telomeros, el perfil de expresion de gen, el metabolismo y el numero de ciclos celulares antes de que aparezca el fenotipo de senescencia, al tiempo que se derivan de celulas de donantes envejecidos, por ejemplo donantes de mas de 70 anos de edad. Las celulas diferenciadas de la divulgacion pueden emplearse por tanto en diversas aplicaciones, en particular, en investigacion o el campo terapeutico.
Un importante campo de aplicacion es la terapia celular o medicina regenerativa. Estas iPSC o la composicion de celulas diferenciadas puede ser util tambien para generar modelos celulares de trastornos relacionados con el envejecimiento tal como se ha descrito.
Por ejemplo, pueden cultivarse celulas primarias, como celulas de fibroblasto obtenidas de un paciente que padece un defecto genetico y corregirse geneticamente de acuerdo con los metodos conocidos en la especialidad y, posteriormente reprogramarse y rejuvenecerse en iPSC de acuerdo con los metodos de la presente divulgacion y diferenciarse en linajes de celulas adecuados para su readministracion al paciente, por ejemplo, al mismo paciente que el donante de celulas (tratamiento autologo).
De manera similar, es posible aplicar medicina regenerativa para curar potencialmente cualquier enfermedad que sea el resultado de un malfuncionamiento, lesion o fallo del tejido regenerando los tejidos danados in vivo o bien implantando directamente in vivo una composicion que comprende iPSC o bien sus derivados que comprenden progenitores apropiados o linajes de celulas o celulas diferenciadas de la invencion. Preferentemente, dichos tejidos danados son tejidos danados de trastornos relacionados con el envejecimiento o pacientes envejecidos, de mas de 50, 60, 70, 80, 90 o mas de 100 anos de edad.
En un aspecto, las celulas iPS o las celulas diferenciadas de la divulgacion pueden ser utiles para terapia regenerativa autologa de un paciente que padece trastornos relacionados con el envejecimiento o un paciente envejecido que necesita una terapia regenerativa debido a un trastorno espedfico o tratamientos asociados con dichos trastornos, incluyendo sin limitacion trastornos de cancer, trastornos autoinmunes e inflamatorios trastornos del musculo y el esqueleto, trastornos neurologicos, diabetes y otros trastornos metabolicos.
Por lo tanto, en un aspecto, la divulgacion se refiere a composiciones de iPSC o celulas diferenciadas de la divulgacion para su uso como un producto de terapia celular para su implantacion en un mairnfero, por ejemplo, un paciente humano, preferentemente, un paciente envejecido que tiene mas de 50, 60, 70, 80, 90 o mas de 100 anos de edad, siendo lo mas preferente como injerto autologo (es decir, celulas que tienen el mismo genotipo que las celulas del paciente).
En otra realizacion espedfica, las composiciones de iPSC o celulas diferenciadas de la divulgacion se utilizan para el tratamiento de lesiones de articulaciones o cartflago, musculo o hueso.
En otra realizacion espedfica, las composiciones de iPSC o celulas diferenciadas de la divulgacion tambien pueden utilizarse ventajosamente para la produccion de tejidos dermicos, por ejemplo, tejidos de la piel, para su uso en medicina regenerativa (terapia a base de celulas) o en investigacion. En otra realizacion concreta, las composiciones de iPSC o celulas diferenciadas de la divulgacion puede utilizarse tambien ventajosamente para la produccion, pero sin limitarse a ellas, de celulas dermicas, musculares o esqueletales de pacientes sanos o enfermos para la identificacion sistematica de aplicaciones en la industria farmaceutica. Dichas pruebas de identificacion sistematica pueden emplearse para investigar nuevos farmacos con aplicaciones clmicas o para pruebas toxicologicas.
En otra realizacion espedfica, las composiciones de iPSC o celulas diferenciadas de la divulgacion pueden emplearse para regenerar tejido cardfaco o vascular.
En otra realizacion concreta, las composiciones de iPSC o celulas diferenciadas de la divulgacion pueden utilizarse tambien para generar tejido del cerebro o tejido neuronal, por ejemplo, en un paciente que padece un trastorno neurodegenerativo.
M eto d o s p a ra r e ju v e n e c e r c e lu la s d ia n a
En otro aspecto, la divulgacion se refiere a un metodo para rejuvenecer celulas de donantes envejecidos o celulas senescentes.
En particular, la divulgacion se refiere a un metodo in vitro para rejuvenecer celulas de donantes envejecidos o celulas senescentes, comprendiendo dicho metodo la reprogramacion de dichas celulas diana en celulas madre pluripotentes inducidas, aumentando la expresion en dichas celulas diana de al menos los siguientes factores de reprogramacion:
(i) un factor de reprogramacion codificado por un gen de la familia de genes Oct, por ejemplo Oct4,
(ii) un factor de reprogramacion codificado por un gen de la familia de genes Klf, por ejemplo Klf4,
(iii) un factor de reprogramacion codificado por un gen de la familia de genes Sox, por ejemplo Sox2,
(iv) un factor de reprogramacion codificado por un gen de la familia de genes Myc, por ejemplo, c-myc o L-myc, y, (v) Lin28,
(vi) y, opcionalmente, Nanog.
El termino “rejuvenecer” se refiere a un proceso de borrar las modificaciones epigeneticas que participan en el fenotipo de envejecimiento celular. El fenotipo de envejecimiento celular puede caracterizarse, entre otros, por los siguientes marcadores:
- activacion de las rutas de supresor de tumor p53/ p21CIP1 y pRb/ p16INK4A (en adelante denominados efectores de senescencia),
- celulas detenidas irreversiblemente en G1,
- acortamiento del tamano del telomero,
- expresion de actividad p-galactosidasa asociada a senescencia (SA p-Gal),
- modificacion de cromatina espedfica como focos de heterocromatina asociados a senescencia (SAHF), - secretoma espedfica,
- actividad mitocondrial general reducida/alterada.
Se observa un proceso de rejuvenecimiento cuando se reduce o se suprime uno o todos estos marcadores del fenotipo de envejecimiento en celulas envejecidas o senescentes debido al proceso de rejuvenecimiento.
En una realizacion preferente, el metodo in vitro para rejuvenecer celulas de donantes envejecidos o celulas senescentes comprende el cultivo de dichas celulas de donantes envejecidos o celulas senescentes en condiciones apropiadas para aumentar la expresion de la siguiente combinacion de factores de reprogramacion que consiste en Oct4, Klf4, Sox2, c-Myc, Lin28 y, opcionalmente, Nanog.
La combinacion de factores de reprogramacion puede utilizarse in vivo para rejuvenecer tejido en un paciente que lo necesita. Por tanto, la divulgacion se refiere ademas a una composicion para su uso in vivo en el rejuvenecimiento de celulas senescentes o envejecidas en un paciente que lo necesita, comprendiendo dicha composicion un medio para aumentar la expresion de la siguiente combinacion de factores de reprogramacion que consiste en Oct4, Klf4, Sox2, c-Myc, Lin28 y, opcionalmente, Nanog.
En algunas realizaciones, dicho medio para aumentar la expresion de dichos factores de reprogramacion comprende una cantidad apropiada de protema Oct4, protema Klf4, protema Sox2, protema c-Myc, protema Lin28 y, opcionalmente, protema Nanog, estando asociada cada protema a un medio apropiado para entregar dicha protema en el nucleo de las celulas senescentes para su rejuvenecimiento.
Los medios para entregar la protema en una celula incluyen, sin limitacion, los vedculos qdmicos como por ejemplo peptidos de penetracion en celula como penetratina o peptidos derivados de TAT.
En otras realizaciones, dicho medio para aumentar la expresion de dichos factores de reprogramacion comprende una cantidad apropiada de precursor de ARN de Oct4, precursor de ARN de Klf4, precursor de ARN de Sox2, precursor de a Rn de c-Myc, precursor de ARN de Lin28 y, opcionalmente, precursor de ARN de Nanog, asociados con medios apropiados para entregar dichos precursores de ARN en el citoplasma de las celulas senescentes para su rejuvenecimiento.
Estas composiciones, tal como se han descrito, son particularmente adecuadas para aplicacion topica, por ejemplo, para aplicacion sobre la piel o dermica, por ejemplo para el tratamiento de trastornos de la piel.
La divulgacion se ilustra mejor con los siguientes ejemplos. No obstante, no debera considerarse que dichos ejemplos limiten el alcance de la invencion.
E JE M P L O S
M ETODOS
Se obtuvieron celulas de donantes envejecidos del Coriell Institute for Medical Research (NJ, EE.UU.). Se obtuvieron celulas senescentes replicativas por cultivo celular extensivo hasta la detencion del crecimiento del ciclo celular, evaluado por FACS y se detecto la actividad de p-galactosidasa asociada con senescencia, tal como se ha descrito anteriormente25
Se utilizaron celulas madre embrionicas humanas H9 y H1 como celulas de referencia obtenidas del WiCell Research Institute (WI, EE.UU). Se mantuvieron hESC e iPSC utilizando procedimientos convencionales hESC en fibroblastos embrionicos de raton OF-1 (MEF) en medio de cultivo KO DMEM (medio hESC) suplementado con 20 % de reemplazamiento de suero inactivado, 0,1 mM de aminoacidos no esenciales, 2 mM de L-glutamina (todos ellos de Invitrogen), 0,1 mM de p-mercaptoetanol y 10 ng/ml de factor de crecimiento de fibroblastos basico (bFGF, Peprotech) o cultivo sin alimentador en matrigel (BD Biosciences) con medio mTeSR definido qmmicamente (Stemcell Technologies) tal como se ha descrito anteriormente26.
Para la generacion de iPSC humanas, se obtuvieron vectores lentivirales que conteman ADNc de genes OCT4, SOX2, NANOG y lIN28 humanos de Addgene y descritos anteriormente por Yu et al3. Se subclonaron ADNc de KLF4 y c-MYC en la misma estructura principal del vector a partir de los vectores descritos por T akahashi et al.23. Se utilizo la lmea celular 293T (Invitrogen) para producir lentivirus de expresion de transgen. Se sembraron los fibroblastos primarios humanos a 2 105 celulas por cada disco de 35 mm un dfa antes de la transduccion. Se mezclaron cantidades iguales de sobrenadantes que conteman cada uno seis lentivirus, se transfirieron al disco de fibroblasto y se incubaron durante toda la noche. Veinticuatro horas despues de la transduccion, se reemplazo el medio que contema lentivirus por un segundo sobrenadante. Seis dfas despues de la transduccion, se recogieron los fibroblastos por tripsinacion y se reemplazaron en un disco de 100 mm sobre la capa de alimentador de MEF. Al dfa siguiente, se reemplazo el medio con medio hESC suplementado con 10 ng/ml bFGF. Se cambio el medio cada dfa. Treinta a cuarenta dfas tras la transduccion, se recogieron las colonias y se transfirieron a un disco de 35 mm en una capa de alimentador con 2 ml de medio hESC suplementado con 10 mg/ml bFGF.
RESU LTA D O S
Se indujeron fibroblastos diploides humanos proliferativos de un donante de 74 anos de edad (en adelante 74P) en senescencia replicativa por paso en serie (74S). Se evaluo la senescencia celular al cabo de 18 pasos (51 duplicaciones de poblacion) por analisis FACS, aumento de la actividad SA-p-Gal, regulacion al alza de inhibidores CDK p16INK4A y p21CIP1 y formacion de SAHF. Asimismo, se mantuvo estas celulas senescentes mas de dos meses en cultivo sin ningun aumento detectable del numero de celulas, lo cual confirmo la robustez de la detencion del ciclo celular. Inicialmente, se trato de generar iPSC desde estos fibroblastos senescentes por sobrexpresion de un grupo de genes que conteman LIN28 (OCT4, NANOG, SOX2, LIN28) para comparar con los resultados experimentales anteriores publicados con el grupo de 4 factores de reprogramacion OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC y descritos originalmente como ineficientes para esquivar la senescencia. Se realizo la transduccion de todos estos genes de factor de reprogramacion con lentivirus individuales. Al cabo de 40 dfas, no se observo ninguna nueva proliferacion ni formacion de colonias hESC semejante a iPSC. Esto se confirmo por la ausencia de expresion detectable de genes de pluripotencia endogena en la poblacion de celulas infectadas, mientras que la RT-PCR cuantitativa demostro una transduccion viral eficiente. Estos resultados demuestran que el grupo de factores de reprogramacion que contienen LIN28 no es capaz de revertir el estado de senescencia replicativa para generar iPSC, tal como se ha descrito anteriormente con la combinacion OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC.
Cabe destacar que se ha descrito que la sobrexpresion de NANOG acelera la reprogramacion de manera independiente de la velocidad de division celular predominantemente y la sobrexpresion de LIN28, similar a la inhibicion a la ruta p53/ p21CIP1 aumenta la velocidad de division celular, con el resultado de una cinetica acelerada de la produccion de iPSC1314. Por lo tanto, se lanza la hipotesis de que la barrera de senescencia podna superarse utilizando un protocolo optimizado para una mayor eficiencia de reprogramacion basada en la combinacion de los 6 factores de reprogramacion OCT4, NANOG, SOX2, KLF4, LIN28 y c-MYC introducidos por partfculas lentivirales individuals , sin inhibicion transitoria o permanente de inductores de senescencia.
Para analizar la hipotesis de los autores de la invencion, se infectaron celulas 74P y 74S dos veces con una mezcla de lentivirus individuals portadores de 6 genes. Una semana despues de la infeccion, se observo la desaparicion de SAHF en fibroblastos senescentes infectados (74S inf) lo cual revelo una primera etapa de reprogramacion. A continuacion, se colocaron las celulas en placa sobre alimentadores de fibroblasto en medio hESC y al cabo de 18­ 20 dfas, se recupero la proliferacion en celulas senescentes infectadas. Las colonias semejantes a hESC aparecieron al cabo de 35-40 dfas tras la infeccion. Se produjeron colonias de tipo iPSC a partir de fibroblastos senescentes (74S), con una eficiencia de reprogramacion media de 0,015-0,03 %, similar a los fibroblastos proliferativos (74P) infectados en las mismas condiciones. Se seleccionaron al azar 6 colonias de fibroblastos de donante de 74 anos de edad proliferativos (iPSC 74P) y senescentes (iPSC 74S) y caracterizaron ademas 3 clones que se expandieron despues con exito en condiciones de cultivo de alimentador hESC regular o sin alimentador. El cultivo a largo plazo y la evaluacion de la expresion de marcadores de celula madre confirmaron el mantenimiento con exito y la reprogramacion de estas celulas, que se han cultivado ahora durante mas de 35 pasos. El analisis de inmunocitoqmmica demostro la presencia continua de marcadores de superficie celular SSEA-4 y TRA-1-60 que caracterizan celulas madre pluripotentes humanas. Los analisis de RT-PCR cuantitativa demostraron que las iPSC volvieron a expresar genes de marcador pluripotente OCT4, SOX2, NANOG y REX1 endogenos al mismo nivel que las lmeas hESC H1 y H9 o la lmea iPSC de clon 4 IMR90 generadas en el Laboratorio Thomson (iPSC IMR90 TH Cl 43) y cultivadas en paralelo, al mismo tiempo que no se detecto transcripto en los fibroblastos parentales. Para corroborar esta reactivacion de genes endogenos, se investigo el estado de metilacion de ADN de dinucleotidos de CpG en una region rica en CpG descrita en promotores OCT4 y NANOG. El analisis de secuenciacion genomico de bisulfito demostro que ambos promotores OCT4 y NANOG fueron desmetilados en iPSC de celulas senescentes (iPSC 74S Cl F) o proliferativas (iPSC 74P Cl H), con tanta eficiencia como iPSC iMR90 TH Cl 43 publicadas anteriormente, cuando se compararon con el estado de metilacion de hESC H9, mientras que las mismas regiones fueron altamente metiladas en fibroblastos parentales.
Para excluir cualquier efecto espedfico de tipo celula, se repitio el mismo protocolo utilizando fibroblastos embrionicos humanos IMR90 inducidos en senescencia replicativa por paso en serie. De manera similar a los fibroblastos de donante de 74 anos de edad, no se tuvo exito en generar iPSC utilizando ambos grupos de 4 factores descritos anteriormente, mientras que se obtuvo una eficiencia de reprogramacion similar de los fibroblastos IMR90 proliferativos o senescentes con la combinacion de los 6 factores.
A continuacion, se valoro el estado pluripotente de las iPSC generadas evaluando la capacidad de diferenciacion de iPSC 74S en comparacion con clones 74P iPSC. Todas las iPSC fueron capaces de diferenciarse en tres linajes embrionicos tempranos, endodermo, ectodermo y mesodermo, tal como se demostro utilizando inmunotincion con anticuerpos espedficos contra SMA, mAP2 y FOXA2 respectivamente. Se obtuvieron resultados similares con fibroblastos IMR90 senescentes. En conjunto, todos estos resultados indican que la combinacion de 6 factores de transcripcion, OCT4, NANOG, SOX2, KLF4, LIN28 y c-MYC es una estrategia de reprogramacion de exito para revertir el estado de senescencia celular que lleva a la generacion de iPSC.
Durante el envejecimiento, el numero de celulas senescentes aumenta en el cuerpo humano y se cree que altera la homeostasia de tejido. Sin embargo, tiene lugar una mayor expresion de p16INK4A y p21CIP1 en celulas proliferativas de donantes envejecidos y se cree que disminuye progresivamente su capacidad proliferativa15. Queda pendiente de resolver si las celulas proliferativas de los centenarios podnan reprogramarse eficientemente hacia pluripotencia o si retienen algunos marcadores espedficos del fenotipo de envejecimiento celular. Para investigar este punto espedfico, se utilizaron fibroblastos de donantes de 92, 94, 96 y 101 anos de edad para los experimentos de reprogramacion, utilizando los 6 factores en combinacion. Tal como indican los experimentos anteriores sobre celulas senescentes, se pudo generar iPSC de todos los fibroblastos de donantes envejecidos con una eficiencia similar a la obtenida con fibroblastos senescentes. Todos los clones de iPSC generaron genes de pluripotencia endogenos re-expresados OCT4, SOX2, NANOG y REX1, tal como se presento para dos clones para cada lmea de fibroblastos parental, que se confirmo tambien por la desmetilacion de CpG en regiones de promotor OCT4 y NANOG. Cabe destacar que tambien se observo la desmetilacion parcial del promotor NANOG en fibroblastos parenterales de donantes envejecidos lo cual esta en consonancia con la desmetilacion global del genoma ya descrito en personas de edad16, lo que podna tambien contribuir a los efectos en reprogramacion. Por otra parte, se detecto la re-expresion de los marcadores de superficie de la celula de pluripotencia SSEA-4 y TRA-1-60 y finalmente, se demostro su capacidad para diferenciar derivados de endodermo, ectodermo y mesodermo, tal como se juzgo por Inmunotincion con anticuerpos SMA, mAP2 y FOXA2, respectivamente.
Estos resultados demuestran la eficiencia del procedimiento de reprogramacion para reinstaurar con exito el estado pluripotente y la auto-renovacion de fibroblastos centenarios; por lo tanto, el envejecimiento celular y el fenotipo senescente asociado frecuentemente no es un lfmite para reprogramar hacia pluripotencia.
Si bien los autores de la invencion han tenido exito para generar iPSC utilizando fibroblastos de donantes envejecidos y senescentes, una cuestion esencial fue elucidar si la induccion de un estado pluripotente podna borrar los marcadores principales del fenotipo de envejecimiento celular. Previamente se hada demostrado que la reprogramacion induda la desaparicion de SAHF, lo cual demuestra la plasticidad de organizacion del genoma de celulas senescentes. Se analizo entonces otras evidencias del envejecimiento y senescencia en las iPSC de la invencion y se observo que las iPSC generadas desde fibroblastos senescentes replicativos de donantes de 74 anos de edad no reteman la expresion de p21CIP1 y p16INK4A heredada de su estado senescente, tal como se demuestra con el analisis de inmunotransferencia. Se obtuvieron tambien resultados similares con fibroblastos senescentes replicativos embrionicos IMR90. Asimismo, todos las iPSC generadas de centenarios tuvieron tambien una expresion regulada a la baja de protemas p21CIP1 y p16INK4A, similar a lmeas hESC. Estos resultados indican que es posible volver a establecer la expresion de p21CIP1 y p16INK4A al nivel bajo encontrado en hESC.
Los fibroblastos proliferativos de donantes envejecidos se caracterizan normalmente por telomeros de tamano heterogeneo, cuya longitud media depende del tamano heredado parental y del numero diversos de divisiones que tienen lugar durante la vida, pero que no se correlacionan necesariamente con la capacidad de proliferacion. Sin embargo, la senescencia replicativa siempre esta asociada con telomeros cortos. Los telomeros cortos se reconocen como ADN danado, que conlleva la activacion de la cascada de senalizacion de respuesta de lesion de ADN y desencadena la detencion del ciclo de la celula asociado a senescencia. Aunque las iPSC presentan generalmente un mayor tamano de telomero en comparacion con las celulas diferenciadas parentales 17, los autores de la invencion se preguntaron si las iPSC obtenidas de celulas senescentes o de celulas centenarias presentaban telomeros de una mayor longitud. Para abordar la cuestion, se utilizaron analisis de transferencia de Southern para examinar la longitud media del fragmento de restriccion terminal (TRF) de las iPSC obtenidas de celulas senescentes replicativas, en comparacion con celulas proliferativas. Se observo que la longitud de telomero de las iPSC de donantes de 74 anos de edad, tanto proliferativas como celulas senescentes aumento a un tamano equivalente al observado en hESC H9. A diferencia de los fibroblastos parentales, que entraron en senescencia replicativa despues de 50 duplicados de poblacion y 60-63 duplicados para fibroblastos embrionicos IMR90, los autores de la invencion pudieron cultivar todas las lmeas de iPSC continuamente, que permanecieron estables despues de mas 110 duplicaciones de poblacion. De manera similar, se aumento la longitud de ADN telomerica en las iPSC derivadas de fibroblastos embrionicos IMR90 senescentes o proliferativas, despues de la reprogramacion. Aunque los telomeros de centenarios se acortaron menos de tamano que los fibroblastos senescentes, fue posible reestablecer el tamano a la misma longitud que las hESC. Cabe destacar que en algunos clones de iPSC se observo un tamano mas largo que el encontrado en H9 hESC, lo que indica que el tamano de los telomeros en celulas pluripotentes no tiene un tamano maximo heredado. Indica asimismo algunos posibles desarrollos en la generacion de iPSC para una mayor capacidad de proliferacion de celulas diferenciadas, adecuadas para terapia a base de celulas en medicina regenerativa.
En conjunto, estos datos resaltan que el protocolo de reprogramacion de la presente invencion conduce a borrar las marcas mas comunes de senescencia y envejecimiento en las iPSC generadas.
Para evaluar mejor la capacidad pluripotente de iPSC derivadas envejecidas y senescentes, se seleccionaron 3 clones de iPSC de fibroblastos senescentes y proliferativos envejecidos iPSC 74P C1H, iPSC 74S Cl F y iPSC 96 Cl 1. En primer lugar se confirmo la capacidad completa de estos clones de progresar hacia la diferenciacion terminal mediante la formacion de teratoma en ratones, lo cual llevo a la aparicion de estructuras de tipo organico organizadas en los tres linajes embrionicos. Se realizaron tambien analisis de impresion de huellas de ADN (repeticion en tandem corta, STR) para confirmar que los clones iPSC se derivaban de sus correspondientes fibroblastos parentales. Se verifico tambien que los 6 transgenes utilizados para la reprogramacion se regularon a la baja casi completamente.
A continuacion, se llevo a cabo el analisis de transcriptoma de 3 clones seleccionados y su contrapartida parental, que se comparo con el grupo de datos de hESC e iPSC, construidos de forma compendiada (18). Primero se confirmo que se expresaban los genes pluripotentes espedficos en las iPSC de la invencion a un nivel similar que hESC e iPSC del compendio (19). A continuacion, se llevo a cabo un agrupamiento jerarquico de los 3 clones de iPSC de la invencion y sus fibroblastos parentales combinados con varios fibroblastos hESC, iPSC y post-natales. Sorprendentemente se observo que los fibroblastos proliferativos, senescentes y envejecidos se agrupaban en comparacion con los fibroblastos post-natales, lo cual indica que comparten una firma de envejecimiento comun general. Ademas, las iPSC derivadas de fibroblastos proliferativos y senescentes obtenidos utilizando la infeccion de 6 factores son significativamente mas similares a hESC que las iPSC previamente descritas derivadas de 4 factores de infeccion.
Dado que el estres oxidativo y la disfuncion mitocondrial se describen perfectamente en la senescencia y el envejecimiento2021, los autores de la invencion se preguntaron si estas funciones se reprogramaban tambien espedficamente de celulas senescentes o envejecidas. El analisis de transcriptoma permitio estudiar genes relacionados con ambos procesos, tal como se ha descrito anteriormente22. Tambien este caso, el agrupamiento de transcriptosomas con este subgrupo de genes espedficos indico que las modificaciones globales en los perfiles de expresion asociadas con estas funciones alteradas fueron espedficas para los fibroblastos envejecidos y senescentes, cuando se compararon con fibroblastos embrionicos proliferativos jovenes o post-natal y que las iPSC derivadas de la invencion restablecieron estas funciones a un estado de tipo embrionico. A continuacion, se evaluo la actividad mitocondrial general en las iPSC derivadas en comparacion con las hESC, midiendo el potencial de transmembrana (A^m) generado por el gradiente de protones, que es un indicador de la funcion mitocondrial sana. Para este fin, se utilizo el colorante cationico JC-1 y se cuantifico la relacion e intensidad de fluorescencia de sus dos formas por microscopia confocal y analisis de citometna de flujo. Tal como se ha mostrado anteriormente, la relacion rojo/verde disminuyo con la senescencia20,21 y tambien parece estar asociada con el envejecimiento. Sorprendentemente, se observo una mayor relacion entre las iPSc y un nivel similar al observado en hESC, lo cual confirma que la reprogramacion restauro la actividad mitocondrial de las iPSC derivadas de fibroblastos viejos y senescentes. Se obtuvieron resultados similares con iPSC de fibroblastos IMR90 senescentes y proliferativos. Asimismo, no se observaron diferencias en la distribucion y morfologfa de mitocondrias en iPSC por microscopia electronica cuando se comparo con H1 hESC. El analisis de las propiedades mitocondriales ilustra como la reprogramacion nuclear, al restablecer los programas de expresion genica, podnan rejuvenecer la fisiologfa de celulas sanas restaurando la funcion alterada de organelos celulares cuya disfuncion esta relacionada con el envejecimiento celular. Finalmente, utilizando un ensayo de diferenciacion de fibroblastos2324 se demostro que estas celulas no entraban prematuramente en senescencia. De hecho, los fibroblastos derivados de 74P, S y 96 iPSCs no revelaron actividad SA-p-Gal tras 10 duplicaciones de poblacion y presentaron una velocidad de proliferacion equivalente a los fibroblastos proliferativos jovenes. Para excluir la posibilidad de que la estrategia de reprogramacion de la invencion no estaba asociada con ninguna mutacion de las rutas de induccion de senescencia, se demostro la capacidad de los fibroblastos re-diferenciados de volver a entrar en senescencia replicativa. Tras un cultivo extensivo, estas celulas pasaron a ser senescentes, tal como lo demuestra una mayor actividad SA-p-Gal asociada con la detencion del ciclo de la celula y una mayor expresion de p16INK4A y p21CIP1 y un tamano de telomero recortado. Cabe destacar que aumento el numero de duplicaciones de poblacion (PD) necesario para desencadenar senescencia replicativa. Mientras que los fibroblastos parentales de 74 anos entraron en la senescencia replicativa tras 51 PD, los fibroblastos re-diferenciados de IPSC 74S C1 F entraron en la senescencia replicativa al cabo de 58 PD. La proliferacion readquirida potencial es similar a la de iPSC 74P C1H derivados de fibroblastos parentales proliferativos 74 de edad p D 60, que se infectaron a PD 12. Estas celulas presentaron un potencial de duplicacion de poblacion de 39 PD antes del agotamiento de senescencia replicativa. Se observo un restablecimiento similar de la capacidad de proliferacion de fibroblastos de 96 de edad y se explico por el alargamiento de los telomeros. Como conclusion, la estrategia de reprogramacion de la invencion, que supera el estado de senescencia, tambien fue capaz de aumentar la vida celular. El analisis de transcriptoma por agrupamiento jerarquico, en comparacion con los fibroblastos parentales con HI hESC diferenciados y post-natales en fibroblastos demostro finalmente que el perfil de expresion genica global de los fibroblastos rediferenciados tempranamente de las iPSC de la invencion generadas de donantes ancianos y fibroblastos senescentes son diferentes de los fibroblastos parentales y mas proximos a fibroblastos embrionicos derivados de la lmea HI hESC. Este resultado se confirmo tambien por los perfiles de expresion de gen asociados a estres oxidativo y actividad mitocondrial, lo cual confirma la fisiologfa rejuvenecida de las celulas envejecidas y senescentes de la invencion.
En conjunto, los resultados de la invencion demuestran que es posible reprogramar celulas senescentes replicativas y celulas derivadas de centenarios en iPSC utilizando una combinacion espedfica de genes, lo cual demuestra que el envejecimiento y la senescencia no son una barrera para reprogramar hacia la pluripotencia. Tambien mejora la comprension de los autores de la invencion de la reprogramacion de celulas fundamental y subraya la importancia subestimada de las modificaciones epigeneticas que participan en el proceso de envejecimiento celular, que es evidentemente susceptible de ser reprogramada tambien. Es sobre todo importante que los autores de la invencion hayan demostrado que mediante el uso de una estrategia de reprogramacion adecuada es posible rejuvenecer la fisiologfa celular, lo que indica la posible reversibilidad de aspectos importantes del fenotipo de envejecimiento. Estos resultados promueven tambien el posible desarrollo de modelos de enfermedad relacionadas con la edad y apoyan el desarrollo de nuevas estrategias a base de celulas terapeuticas para borrar ciertas patologfas relacionadas con la edad.
N u c le o tid o s y s e c u e n c ia s d e a m in o a c id o s u ti le s p a ra la p u e s ta e n p ra c t ic a d e lo s m e to d o s d e la d iv u lg a c io n b la 1:
No. D e sc rip c io n S e c u e n c ia
1 Secuencia gen Oct3/4 CCTTCGCAAGCCCTCATTTCACCAGGCCCCCGGCTTGGGGCGCCTT Humana
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R EFER EN C IA S:
1 Takahashi, K. & Yamanaka, S., Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 126 (4), 663-676 (2006).
2 Takahashi, K. et al., Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell 131 (5), 861-872 (2007).
3 Yu, J. et al., Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science 318 (5858), 1917-1920 (2007).
4 Marion, R.M. et al., A p53-mediated DNA damage response limits reprogramming to ensure iPS cell genomic integrity. Nature 460 (7259), 1149-1153 (2009).
5 Li, H. et al., The Ink4/Arf locus is a barrier for iPS cell reprogramming. Nature 460 (7259), 1136-1139 (2009).
6 Banito, A. et al., Senescence impairs successful reprogramming to pluripotent stem cells. Genes Dev 23 (18), 2134-2139 (2009).
7 Utikal, J. et al., Immortalization eliminates a roadblock during cellular reprogramming into iPS cells. Nature 460 (7259), 1145-1148 (2009).
8 Kawamura, T. et al., Linking the p53 tumour suppressor pathway to somatic cell reprogramming. Nature 460 (7259), 1140-1144 (2009).
9 Campisi, J. & d'Adda di Fagagna, F., Cellular senescence: when bad things happen to good cells. Nat Rev Mol cell Biol 8 (9), 729-740 (2007).
10 Collado, M., Blasco, M.A., & Serrano, M., Cellular senescence in cancer y aging. Cell 130 (2), 223-233 (2007). 11 Zhang, R., Chen, W., & Adams, P.D., Molecular dissection of formation of senescence-associated heterochromatin foci. Mol Cell Biol 27 (6), 2343-2358 (2007).
12 Liao, J. et al., Enhanced efficiency of generating induced pluripotent stem (iPS) cells from human somatic cells by una combinacion de six factores de transcripcion. Cell Res 18 (5), 600-603 (2008).
13 Hanna, J. et al., Direct cell reprogramming is a stochastic process amenable to acceleration. Nature 462 (7273), 595-601 (2009).
14 Yu, J. et al., Human Celulas madre pluripotentes inducidas Free of Vector y Transgene Sequences. Science (2009).
15 Krishnamurthy, J. et al., Ink4a/Arf expression is a biomarker of aging. J Clin Invest 114 (9), 1299-1307 (2004). 16 Zhang, W. et al., Comparison of global DNA methylation profiles in replicative versus premature senescence. life Sci 83 (13-14), 475-480 (2008).
17 Marion, R.M. et al., Telomeres acquire embryonic stem cell characteristics in pluripotent stem cells inducidas. Cell stem Cell 4 (2), 141-154 (2009).
18 Assou, S. et al., A meta-analysis of human embryonic stem cells transcriptome integrated into a web-based expression atlas. Stem Cells 25 (4), 961-973 (2007).
19 Guenther, M.G. et al., Chromatin structure y gene expression programs of human embryonic and pluripotent stem cells inducidas. Cell Stem Cell 7 (2), 249-257.
20 Passos, J.F. et al., Mitochondrial dysfunction accounts for the stochastic heterogeneity in telomere-dependent senescence. PLoS Biol 5 (5), e110 (2007).
21 Moiseeva, O., Bourdeau, V., Roux, A., Deschenes-Simard, X., & Ferbeyre, G., Mitochondrial dysfunction contributes to oncogene-induced senescence. Mol Cell Biol 29 (16), 4495-4507 (2009).
22 Prigione, A., Fauler, B., Lurz, R., Lehrach, H., & Adjaye, J., The senescence-related mitochondrial/oxidative stress pathway is repressed in human induced pluripotent stem cells. Stem Cells 28 (4), 721-733 (2010).
23 Park, I.H. et al., Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature 451 (7175), 141-146 (2008).
24 Assou, S. et al., A gene expression signature shared by human mature oocytes y embryonic stem cells. BMC genomics 10, 10 (2009).
25 Matsuura, F. et al., Senescent phenotypes of skin fibroblasts from patients with Tangier disease. Biochemical y biophysical research communications 357 (2), 493-498 (2007).
26 Ludwig, T.E. et al., Feeder-independent culture of human embryonic stem cells. Nat Methods 3 (8), 637-646

Claims (8)

REIVINDICACIONES
1. Un metodo ex vivo para preparar celulas madre pluripotentes inducidas (iPSCs) a partir de una poblacion de celulas diana que comprende celulas senescentes o celulas que sobreexpresan efectores de senescencia p16INK4A o p21CIP, comprendiendo dicho metodo:
a) cultivar una poblacion de celulas diana que comprende celulas senescentes o celulas que sobreexpresan efectores de senescencia p16INK4A o p21CIP en condiciones apropiadas para reprogramar dicha poblacion de celulas diana en iPSCs, en donde dichas condiciones apropiadas comprenden aumentar la expresion en dicha poblacion de celulas diana de la siguiente combinacion de factores de reprogramacion:
i. Oct4,
ii. Klf4,
iii. Sox2,
iv. c-Myc,
v. Lin28,
vi. y, Nanog.
2. El metodo de la reivindicacion 1, en donde dicha poblacion de celulas diana es una poblacion de celulas que comprende celulas senescentes humanas, por ejemplo celulas senescentes de fibroblasto humanas.
3. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, que no comprende ademas una etapa de silenciamiento de efectores de senescencia en dicha poblacion de celulas diana.
4. El metodo de la reivindicacion 3, en donde dicha etapa posterior de silenciamiento de efectores de senescencia consiste en el silenciamiento de efectores p21CIP y/o p16INK4A y/o p53.
5. El metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 to 4, en donde dichas condiciones para aumentar la expresion de factores de reprogramacion comprenden
a) introducir uno o mas vectores de expresion que comprenden las secuencias codificantes de dicha combinacion de factores de reprogramacion en dicha poblacion de celulas diana; o,
b) entregar directamente una cantidad eficaz de cada factor de reprogramacion de la combinacion o su precursor de ARN en dicha poblacion de celulas diana.
6. El metodo de la reivindicacion 5, que comprende la etapa de transfectar dicha poblacion de celulas diana con una combinacion de vectores virales, comprendiendo cada vector viral la secuencia de codificacion de cada uno de los factores de reprogramacion respectivamente: Oct4, klf4, Sox2, c-Myc, Lin28 y Nanog.
7. Un metodo in vitro para rejuvenecer celulas senescentes o celulas que sobreexpresan efectores de senescencia p16INK4A o p21CIP o una poblacion de celulas diana que comprende al menos 40 % de las celulas que despliegan al menos una o mas de las siguientes caractensticas del fenotipo de envejecimiento:
o regulacion al alza de los supresores de tumor P16INK4a o p21CIP1,
o celulas detenidas irreversiblemente en G1,
o expresion de actividad p-galactosidasa asociada con senescencia (SA p-Gal),
o expresion de focos de heterocromatina asociados con senescencia (SAHF),
comprendiendo dicho metodo la reprogramacion de dicha poblacion de celulas diana, celulas que sobreexpresan efectores de senescencia p16INK4A o p21CIP, o celulas senescentes, en celulas madre pluripotentes inducidas rejuvenecidas, aumentando la expresion en dicha poblacion de celulas diana, celulas que sobreexpresan efectores de senescencia p16INK4A o p21CIP, o celulas senescentes, de al menos una combinacion de los siguientes factores de reprogramacion:
i. Oct4,
ii. Klf4,
iii. Sox2,
iv. c-Myc,
v. Lin28,
vi. y, Nanog,
en donde se suprime uno o todos los siguientes fenotipos de envejecimiento en las celulas madre pluripotentes inducidas rejuvenecidas:
- activacion de efectores de senescencia p16INK4A o p21CIP,
- celulas detenidas irreversiblemente en G1,
- acortamiento del tamano de telomeros,
- expresion de actividad beta-galactosidasa asociada a senescencia,
- modificacion de cromatina espedfica como focos de heterocromatina asociados a senescencia.
8. El metodo de la reivindicacion 7, en donde dicha poblacion de celulas diana se ha obtenido desde un sujeto adulto que tiene al menos 50 anos de edad.
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Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20140051600A1 (en) * 2012-08-16 2014-02-20 Mandala Biosciences Llc SUPERCENTENARIAN INDUCED PLURIPOTENT STEM (sciPS) CELLS AND METHODS OF MAKING AND USING THEREOF
WO2016057574A1 (en) 2014-10-06 2016-04-14 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Method to reduce oncogenic potential of induced pluripotent stem cells from aged donors
US20170313988A1 (en) * 2014-10-21 2017-11-02 Consiglio Nazionale Delle Ricerche Methods and agents for cellualr reprogramming
EP3297680A2 (en) 2015-05-20 2018-03-28 Yeda Research and Development Co. Ltd Method of targeting senescent cells
CN105061594B (zh) * 2015-07-16 2019-03-19 中国人民解放军第二军医大学 一种抗人Oct4单克隆抗体及其制备与应用
WO2017079029A1 (en) * 2015-11-02 2017-05-11 ORIG3N Inc. Cell cycle block improves efficiency in generating induced pluripotent stem cells
US11692174B2 (en) 2017-02-08 2023-07-04 Sapphiros Ai Bio Llc Systems, methods, and apparatus for induced pluripotent stem cell isolation and combinatorial production
WO2019166702A1 (fr) 2018-02-28 2019-09-06 Hagalife Utilisation d'un procédé d'irradiation flash pour augmenter la longévité et/ou pour retarder les effets du vieillissement chez les mammifères
BR112020018602A2 (pt) * 2018-03-13 2020-12-29 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Reprogramação celular transiente para reversão de envelhecimento celular
CN110628821B (zh) * 2018-06-25 2022-02-18 首都医科大学宣武医院 一种细胞模型及其制备方法、应用
JP7241483B2 (ja) * 2018-07-23 2023-03-17 株式会社ノエビア 皮膚用組成物
EP3856226A1 (en) * 2018-09-28 2021-08-04 President and Fellows of Harvard College Cellular reprogramming to reverse aging and promote organ and tissue regeneration
WO2020206187A1 (en) * 2019-04-02 2020-10-08 Centagen, Inc Engineered system of stem cell rejuvenation to treat aging and disease
GB201909975D0 (en) * 2019-07-11 2019-08-28 Babraham Inst Novel reprogramming method
IL275186A (en) 2020-06-07 2022-01-01 Yeda Res & Dev Human antibodies against grp94 and uses
AU2021386370A1 (en) * 2020-11-24 2023-06-22 Lyell Immunopharma, Inc. Methods for making, compositions comprising, and methods of using rejuvenated t cells
EP4163379A4 (en) * 2020-12-22 2024-08-14 Inst Zoology Cas METHODS FOR IDENTIFYING AND/OR REGULATION OF SENESCENCE
WO2023288287A2 (en) * 2021-07-15 2023-01-19 Turn Biotechnologies, Inc. Synthetic, persistent rna constructs and methods of use for cell rejuvenation and for treatment
WO2023205406A1 (en) * 2022-04-21 2023-10-26 Restoration Biologics Llc Nutritional or dietary supplement to enhance regenerative medicine therapies
WO2024052434A1 (en) 2022-09-06 2024-03-14 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Engineering sox/oct heterodimerization to induce high-grade developmental reset
CN115607689A (zh) * 2022-10-13 2023-01-17 呈诺再生医学科技(北京)有限公司 Klf7基因在制备逆转细胞衰老的药物中的应用

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1214443A4 (en) * 1999-09-07 2003-08-27 Advanced Cell Tech Inc METHOD FOR REPAIRING TANDEM REPEATED DNA SEQUENCES AND EXTENDING THE LIFE SPAN OF A CELL USING CORE TRANSFER
CN101356270B (zh) 2005-12-13 2014-02-12 国立大学法人京都大学 核重新编程因子
EP2096169B1 (en) 2007-10-31 2020-11-18 Kyoto University Nuclear reprogramming method
EP2268796A1 (en) 2008-03-17 2011-01-05 Helmholtz Zentrum München Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt (GmbH) Vectors and methods for generating vector-free induced pluripotent stem (ips) cells using site-specific recombination
CN102159710B (zh) * 2008-07-16 2015-09-02 生物载体株式会社 使用染色体非整合型病毒载体制造经初始化的细胞的方法
WO2010042490A1 (en) 2008-10-06 2010-04-15 Boston Medical Center Corporation A single lentiviral vector system for induced pluripotent (ips) stem cells derivation
KR101764437B1 (ko) * 2009-03-20 2017-08-02 메소블라스트, 아이엔씨. 재프로그램된 다분화능 세포의 생성 방법
EP2462225B1 (en) * 2009-08-07 2019-03-06 Kyoto University Method of efficiently establishing induced pluripotent stem cells

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