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ES2687050T3 - Método de bioensayo para la detección de sustancia fisiológicamente activa - Google Patents

Método de bioensayo para la detección de sustancia fisiológicamente activa Download PDF

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ES2687050T3
ES2687050T3 ES11850746.6T ES11850746T ES2687050T3 ES 2687050 T3 ES2687050 T3 ES 2687050T3 ES 11850746 T ES11850746 T ES 11850746T ES 2687050 T3 ES2687050 T3 ES 2687050T3
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ES
Spain
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glp
calcium
cell
sensitive protein
camp
Prior art date
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ES11850746.6T
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English (en)
Inventor
Naohiro Araki
Mitsuru Iida
Kiyotaka Machida
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
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Publication date
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Abstract

Un kit para su uso en la medición de la cantidad de una forma activa de GLP-1 o la cantidad de AVP en una muestra biológica, que comprende una célula que expresa un GPCR acoplado a G que es un receptor de GLP-1 o V2R, un canal de calcio dependiente de AMPc y una proteína sensible al calcio.

Description

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DESCRIPCIÓN
Método de bioensayo para la detección de sustancia fisiológicamente activa Campo técnico
La presente invención se refiere a un kit para su uso en la medición de la cantidad de una forma activa de GLP-1 o la cantidad de AVP en una muestra biológica, a un método de diagnóstico de diabetes insípida o SIADH, a un método de determinación de cualquiera de una infusión de líquido hipotónico o hipertónico a seleccionar, a un método de determinación del efecto de un fármaco terapéutico relacionado con GLP-1 y a un método de cribado de un antagonista de GPCR acoplado a G.
Técnica anterior
Los receptores a los se unen sustancias fisiológicamente activas pueden servir de dianas para el desarrollo de fármacos. Particularmente, los receptores que alteran la concentración de AMPc intracelular como segundos mensajeros, tales como los receptores acoplados a la proteína G (en lo sucesivo, también denominados GPCR), son importantes como dianas para el desarrollo de fármacos. Se han desarrollado hasta la fecha muchos agentes que se unen a dichos receptores. Los ejemplos de dichos GPCR incluyen receptores a los se une la arginina vasopresina (en lo sucesivo, también denominada AVP) o el péptido 1 de tipo glucagón (en lo sucesivo, también denominado GLP-1).
La arginina vasopresina producida por la glándula pituitaria es una hormona peptídica con un peso molecular de 1000 que está compuesta por 9 aminoácidos. La AVP es un tipo de hormona importante de la regulación del agua y de los electrolitos que realiza la reabsorción de agua en el riñón dependiendo de la disminución en el volumen de sangre circulante y un aumento en la osmolaridad en plasma. El ensayo de AVP en plasma se aplica clínicamente ampliamente a, por ejemplo, el diagnóstico de trastornos del metabolismo del agua y de los electrolitos, tales como la diabetes insípida que es una afección patológica que implica la disminución de la secreción de AVP o el síndrome de secreción inapropiada de AVP en el que se observa en su lugar el aumento en la secreción de AVP. Además, la AVP no solo se ensaya para enfermedad endocrina, sino que también se usa como un marcador para el pronóstico de cáncer de pulmón de células pequeñas o para insuficiencia cardíaca aguda. Se usa ampliamente como método para ensayar AVP un kit de ELISA por el que se permite que AVP químicamente marcada compita con AVP en una muestra y AVP se cuantifica basándose en una tasa de inhibición competitiva. Sin embargo, el método de ELISA que usa la técnica de competición tiene mala sensibilidad y tiene limitaciones en el ensayo de una muestra a microescala en sangre. Puesto que AVP es un péptido de bajo peso molecular, no se puede ensayar AVP en plasma con alta sensibilidad debido a la falta de disponibilidad de un ensayo de ELISA de sándwich que use anticuerpos de sándwich contra una pluralidad de determinantes antigénicos que permiten mayor sensibilidad. Así, en la práctica clínica todavía se usa ampliamente un método de radioinmunoensayo que usa AVP marcada con isótopo, que se desarrolló por Robertson et al. en 1973, como un método de ensayo de AVP en plasma (Bibliografía no de patente 1).
Se conocen como receptores de AVP un receptor de V1a, un receptor de V1b y un receptor de V2 (en lo sucesivo, también denominados V2R). Se ha informado que el antagonista selectivo del receptor de vasopresina V2 tolvaptan es eficaz para hiponatremia (insuficiencia cardíaca, cirrosis hepática y el síndrome de secreción inapropiada de hormona antidiurética (SIADH)) (Bibliografía no de patente 2).
La incretina, un tipo de hormona gastrointestinal, es secretada del tubo digestivo en respuesta a la estimulación de la ingesta alimentaria y potencia la secreción de insulina de las células beta pancreáticas. Se conocen GLP-1 y GIP (péptido inhibidor gástrico o polipéptido insulinotrópico dependiente de glucosa) como las principales moléculas activas de las hormonas incretinas. Entre ellas, el péptido GLP-1 ha recibido la mayor atención como un regulador de la glucosa en sangre.
GLP-1 no solo promueve la secreción de insulina dependiente de glucosa, sino que también participa en la inhibición de la secreción de glucagón de células alfa pancreáticas y además en la inhibición del vaciamiento gástrico. Además, GLP-1 puede actuar centralmente sobre el hipotálamo para suprimir el apetito, dando como resultado el control de aumento de peso. Puesto que esta serie de acciones fisiológicas provoca un efecto deseable sobre el tratamiento de la diabetes mellitus de tipo 2, se la llevado a cabo ampliamente el desarrollo de fármacos que pretende potenciar la acción de GLP-1.
GLP-1 es secretado de células L intestinales y se convierte en GLP-1 (7-37) o GLP-1 (7-36 amida) por procesamiento. Ambas formas tienen actividad fisiológica equivalente contra receptores de GLP-1. En sangre, 80 % o más de las formas activas de GLP-1 son las formas GLP-1 (7-36 amida). Estos péptidos GLP-1 se denominan "formas activas de GLP-1". La forma activa de GLP-1 se inactiva inmediatamente en GLP-1 (9-37 o 9-36 amida) mediante la escisión de su resto del extremo N por dipeptidil peptidasa-IV (DPP-IV). A este respecto, se han desarrollado y se han usado clínicamente ampliamente (Bibliografía no de patente 3) inhibidores de DPP-IV que pretenden potenciar la acción de GLP-1. Además, también se han desarrollado derivados de GLP-1 resistentes a DPP-IV y funcionan como fármacos clínicos. Además, los agentes que dirigen la acción de potenciamiento de la secreción de GLP-1 también están en ensayo clínico como fármacos antidiabéticos de última generación
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(Bibliografía no de patente 4). Se espera un aumento en la demanda en un futuro cercano de un método para medir con exactitud y rápidamente la concentración en suero de la forma activa de GLP-1 en la determinación del efecto de estos fármacos potenciadores de la acción de GLP-1.
Además, se ha informado recientemente que la concentración en suero en ayunas de la forma activa de GLP-1 es mucho más baja en asiáticos que en occidentales, que sugiere que se requerirá un método de ensayo altamente sensible capaz de detectar diferencias en la concentración en suero de la forma activa de GLP-1 entre razas o entre individuos (Bibliografía no de patente 5).
Ya se ha lanzado un kit de EIA (inmunoensayo enzimático) basado en un método de sándwich de dos anticuerpos como método de medición de la concentración en suero de la forma activa de GLP-1 antes de someterse a degradación. El kit existente se usa en, por ejemplo, la determinación del efecto de inhibidores de DPP-IV que inhiben la degradación de GLP-1. La sensibilidad de detección más baja del método de EIA existente es aproximadamente 1-2 pM (3,3-6,6 pg/ml) para la forma activa de GLP-1 (7-36 amida) y también es del mismo nivel para la forma de GLP-1 (7-37). Puesto que la concentración en ayunas de la forma activa de GLP-1 es 1 pM o más baja en asiáticos, se requiere mayor sensibilidad para medir con exactitud la concentración en ayunas de la forma activa de GLP-1. A este respecto, la concentración y purificación de una muestra son necesarias para el kit existente (Bibliografía no de patente 6).
La Bibliografía de patente 1 y 2 desvela células que expresan un GPCR, un canal de CNG y apoaecuorina recombinante para medir niveles de AMPc intracelular.
La Bibliografía no de patente 7 desvela un ensayo de alto rendimiento para la monitorización en tiempo real de cambios de AMPc en células vivas usando un colorante sensible al potencial de membrana fluorescente.
Lista de referencias
Bibliografía no de patente
Bibliografía no de patente 1: Robertson, G.L., et al., J. Clin. Invest. 52:2340, 1973 Bibliografía no de patente 2: Plosker G.L., Drugs. 70(4):443-54, 2010
Bibliografía no de patente 3: Chronic administration of alogliptin, a novel, potent, and highly selective dipeptidyl peptidase-4 inhibitor, improves glycemic control and beta-cell function in obese diabetic ob/ob mice. European Journal of Pharmacology 588: 325-332 (2008) Moritoh, Y. et al.
Bibliografía no de patente 4: Targeting GRP120 and other fatty acid-sensing GPCRs ameliorates insulin resistance and inflammatory diseases. Trends in Pharmacol. Sci. 32:543-550 (2011) Talukdar, S. et al.
Bibliografía no de patente 5: Little enhancement of meal-induced glucagon-like peptide 1 secretion in Japanese: Comparison of type 2 diabetes patients and healthy controls. Journal of Diabetes investigation 1: 56-59 (2010) Yabe, D. et al.
Bibliografía no de patente 6: Analysis of glucagon-like peptide 1; what to measure? Clinica Chimica Acta 412, 1191-1194 (2011) Heijboer, A.C. et al.
Bibliografía no de patente 7: Real-time and high throughput monitoring of cAMP in live cells using a fluorescent membrane potential-sensitive dye. ASSAY and Drug Development Technologies 4 (4): 461-474 (2006) Tang, Y. et al.
Bibliografía de patente 1: US 2009/104644 Bibliografía de patente 2: WO 2007/100618 Sumario de la invención Problema técnico a resolver
Es un objeto de la presente invención un kit para su uso en la medición de la cantidad de una forma activa de GLP-1 o la cantidad de AVP en una muestra biológica, que se puede usar más convenientemente que los kits convencionales sin el uso de un radioisótopo que requiere técnicas o equipo especiales. Además, es un objeto adicional de la presente invención proporcionar un método de diagnóstico de diabetes insípida o SIADH, un método de determinación de cualquiera de una infusión de líquido hipotónico o hipertónico a seleccionar, un método de determinación del efecto de un fármaco terapéutico relacionado con gLP-1 y un método de cribado de un antagonista de GPCR acoplado a G.
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Solución al problema
Los presentes inventores se centraron en la interacción entre un receptor que altera la concentración de AMPc intracelular, un canal de calcio dependiente de AMPc y una proteína sensible al calcio y se centraron en V2R y un receptor al que se une GLP-1 (en lo sucesivo, también denominado un receptor de GLP-1) como ejemplos del receptor que altera la concentración de AMPc intracelular. Los presentes inventores usaron además la proteína sensible al calcio para medir la cantidad de entrada de ion de calcio en una célula estimulada por AMPc que se forma por la unión de ligandos a estos receptores. Como resultado, los presentes inventores han medido satisfactoriamente las cantidades de ligandos, y, por consiguiente, completado la presente invención.
En un primer aspecto, la presente invención proporciona un kit para su uso en la medición de la cantidad de una forma activa de GLP-1 o la cantidad de AVP en una muestra biológica, que comprende una célula que expresa un GPCR acoplado a G que es un receptor de GLP-1 o V2R, un canal de calcio dependiente de AMPc y una proteína sensible al calcio.
En una realización preferida, el kit es para diagnosticar diabetes insípida o SIADH, para determinar cualquiera de una infusión de líquido hipotónico o hipertónico a seleccionar o para determinar el efecto de un fármaco terapéutico relacionado con GLP-1.
En un segundo aspecto, la presente invención proporciona un método de diagnóstico de diabetes insípida o SIADH, un método de determinación de cualquiera de una infusión de líquido hipotónico o hipertónico a seleccionar o un método de determinación del efecto de un fármaco terapéutico relacionado con GLP-1, que comprende las siguientes etapas (A) a (C):
(A) preparar una mezcla que contiene una célula que expresa un "receptor que altera la concentración de AMPc", un canal de calcio dependiente de AMPc y una proteína sensible al calcio, un sustrato luminiscente para la proteína sensible al calcio, un medio sin Ca2+ y una muestra derivada de la sangre de un sujeto de prueba;
(B) añadir una disolución que contiene Ca2+ a la mezcla preparada en (A); y
(C) medir la luminiscencia de la proteína sensible al calcio emitida de la célula.
En un tercer aspecto, la presente invención proporciona un método de cribado de un antagonista de un GPCR acoplado a G, que comprende las siguientes etapas (A') a (C'):
(A') preparar una mezcla que contiene una célula que expresa un "receptor que altera la concentración de AMPc", un canal de calcio dependiente de AMPc y una proteína sensible al calcio, un sustrato luminiscente para la proteína sensible al calcio, un medio sin Ca2+, un agonista de GPCR expresado en la célula y un compuesto de prueba;
(B') añadir una disolución que contiene Ca2+ a la mezcla preparada en (A'); y
(C') medir la luminiscencia de la proteína sensible al calcio emitida de la célula.
En un cuarto aspecto, la presente invención proporciona un método de cribado de un antagonista de GPCR acoplado a G, que comprende las siguientes etapas (A") a (C"):
(A") preparar una mezcla que contiene una célula que expresa un "receptor que altera la concentración de AMPc", un canal de calcio dependiente de AMPc y una proteína sensible al calcio, un sustrato luminiscente para la proteína sensible al calcio, un medio que contiene Ca2+, un agonista de GPCR expresado en la célula y un compuesto de prueba;
(B") añadir forskolina a la mezcla preparada en (A"); y
(C") medir la luminiscencia de la proteína sensible al calcio emitida de la célula.
Efectos de la invención
Con los kits y métodos según la presente invención, se puede medir por procedimientos simples y seguros la cantidad de una forma activa de GLP-1 o la cantidad de AVP en una muestra biológica sin la necesidad de procedimientos complicados acompañados del uso de radioisótopos.
Breve descripción de los dibujos
[Figura 1] La Figura 1 muestra que la luminiscencia emitida de células CHO que expresan V2R humano, canal de CNG modificado y aecuorina modificada depende de una concentración de AVP.
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[Figura 2] La Figura 2 muestra una cantidad de luminiscencia emitida de las células CHO que expresan un receptor de vasopresina humana (V2R humano), canal de CNG modificado y aecuorina modificada, en presencia de una baja dosis de AVP.
[Figura 3] La Figura 3 muestra los efectos del tiempo de incubación sobre una cantidad de luminiscencia emitida de las células CHO que expresan V2R humano, canal de CNG modificado y aecuorina modificada.
[Figura 4] La Figura 4 muestra los efectos de una cantidad de plásmido de expresión de V2R introducido en una cantidad de luminiscencia emitida de las células CHO que expresan V2R humano, canal de CNG modificado y aecuorina modificada.
[Figura 5] La Figura 5 muestra una relación entre una densidad de células CHO que expresan V2R humano, canal de CNG modificado y aecuorina modificada, y una cantidad de luminiscencia de las células.
[Figura 6] La Figura 6 muestra una relación entre una densidad de células CHO que expresan V2R humano, canal de CNG modificado y aecuorina modificada, y una cantidad de luminiscencia de las células, donde la cantidad de luminiscencia se indica como un valor relativo que se calcula basándose en la suposición de que un valor relativo para cada blanco es 1.
[Figura 7] La Figura 7 muestra los efectos de una concentración de CaCl2 añadido sobre una cantidad de luminiscencia emitida de las células CHO que expresan V2R humano, canal de CNG modificado y aecuorina modificada.
[Figura 8] La Figura 8 muestra que un kit proporcionado por la presente invención es capaz de cuantificar AVP.
[Figura 9] La Figura 9 muestra la comparación de los intervalos de medición entre un kit proporcionado por la presente invención y un kit de AVP usando radioinmunoensayo.
[Figura 10] La Figura 10 muestra el ensayo de plasma individual normal y plasma con un alto nivel de AVP usando un kit proporcionado por la presente invención.
[Figura 11] La Figura 11 muestra la evolución temporal de una cantidad de luminiscencia emitida de las células CHO que expresan V2R humano, canal de CNG modificado y aecuorina modificada. Se muestra el cambio dependiente del tiempo en la cantidad de luminiscencia para 0 a 5 pg/ml AVP.
[Figura 12] La Figura 12 muestra el plásmido pmCNGa2.
[Figura 13] La Figura 13 muestra el plásmido pcDNA mt s AEQ.
[Figura 14] La Figura 14 muestra la concentración de un compuesto y la cantidad de luminiscencia después del cultivo de células con un antagonista de la vasopresina (OPC-41061) en un medio que contiene calcio y la posterior adición de AVP 10"7 M.
[Figura 15] La Figura 15 muestra la concentración de AVP y la cantidad de luminiscencia después del cultivo de células con cada concentración de AVP en un medio que contiene calcio y la posterior adición de AVP 10"7 M (concentración constante).
[Figura 16] La Figura 16 muestra la concentración de un compuesto y la cantidad de luminiscencia después del cultivo de células con un antagonista de la vasopresina (OPC-41061) en un medio que contiene calcio, la posterior adición de AVP 10"7 M y la adición adicional de forskolina 10"4 M.
[Figura 17] La Figura 17 muestra que la luminiscencia emitida de líneas celulares CHO que expresan el receptor de GLP-1 humano, canal de CNG modificado y aecuorina modificada depende de la concentración de una forma activa de GLP-1.
[Figura 18] La Figura 18 muestra los efectos del tiempo de incubación sobre la cantidad de luminiscencia emitida de líneas celulares CHO que expresan receptor de GLP-1 humano, canal de CNG modificado y aecuorina modificada.
[Figura 19] La Figura 19 muestra los efectos de la cantidad de plásmido de expresión del receptor de GLP-1 introducido sobre la cantidad de luminiscencia emitida de líneas celulares CHO que expresan receptor de GLP- 1 humano, canal de CNG modificado y aecuorina modificada.
[Figura 20] La Figura 20 muestra una relación entre una densidad de líneas celulares CHO que expresan el receptor de GLP-1 humano, canal de CNG modificado y aecuorina modificada, y la cantidad de luminiscencia de las células.
[Figura 21] La Figura 21 muestra una relación entre la densidad de líneas celulares CHO que expresan receptor de GLP-1 humano, canal de CNG modificado y aecuorina modificada, y la cantidad de luminiscencia
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de las células, donde la cantidad de luminiscencia se indica como un valor relativo que se calcula basándose en la suposición de que un valor relativo para cada blanco es 1.
[Figura 22] La Figura 22 muestra que un kit proporcionado por la presente invención es capaz de cuantificar una forma activa de GLP-1.
[Figura 23] La Figura 23 muestra la comparación de los intervalos de medición entre un kit proporcionado por la presente invención y un kit existente para una forma activa de GLP-1 usando ensayo de EIA.
[Figura 24] La Figura 24 muestra un estudio sobre la especificidad de un kit proporcionado por la presente invención para una forma activa de GLP-1 entre péptidos relacionados con incretina.
[Figura 25] La Figura 25 muestra el ensayo de la degradación de una forma activa de GLP-1 por la enzima DPP-IV en plasma humano usando un kit proporcionado por la presente invención.
[Figura 26] La Figura 26 muestra concentraciones de exenatida y GLP-1 y la cantidad de luminiscencia cuando se añadieron un agonista de receptor de GLP-1 Byetta (exenatida), que es un fármaco terapéutico para la diabetes mellitus, y una forma activa de GLP-1 (7-36 amida) a las líneas celulares.
[Figura 27] La Figura 27 muestra la concentración de un fragmento de exendina de antagonista del receptor de GLP-1 (9-39) y la cantidad de luminiscencia después del cultivo de células con el fragmento de exendina (9-39) y la posterior adición de GLP-1 (7-36 amida) 10 pM (concentración final).
[Figura 28] La Figura 28 muestra el plásmido pmCNGa2.
[Figura 29] La Figura 29 muestra el plásmido pcDNA mt sAEQ.
Descripción detallada
1. Célula que expresa "receptor que altera la concentración de AMPc" a la que se une sustancia fisiológicamente activa, canal de calcio dependiente de AMPc y proteína sensible al calcio, y composición y kit que comprende la célula
En el presente documento se desvela una célula que expresa un "receptor que altera la concentración de AMPc" a la que se une una sustancia fisiológicamente activa, un canal de calcio dependiente de AMPc y una proteína sensible al calcio, y una composición y un kit que comprende la célula.
La sustancia fisiológicamente activa es una sustancia que ejerce acción fisiológica o acción farmacológica sobre los organismos. Los ejemplos de la sustancia fisiológicamente activa incluyen aminas fisiológicamente activas, aminoácidos que actúan como neurotransmisores, péptidos fisiológicamente activos (por ejemplo, vasopresina e incretina), mediadores de lípidos y quimiocinas. Los ejemplos de la vasopresina incluyen AVP. Los ejemplos de la hormona incretina incluyen péptidos relacionados con gLP-1 (por ejemplo, GLP-1, productos de degradación de GLP-1, GLP-2, oxintomodulina y glucagón) y fármacos de péptido fisiológicamente activos de tipo GLP-1 (exenatida y liraglutida).
El "receptor que altera la concentración de AMPc" es un receptor que altera la concentración de AMPc en una célula que expresa el receptor por la unión de una sustancia fisiológicamente activa como su ligando al receptor. Los ejemplos del "receptor que altera la concentración de AMPc" incluyen receptores cuyo segundo mensajero es AMPc, por ejemplo, GPCR cuyo segundo mensajero es AMPc. Los ejemplos de GPCR cuyo segundo mensajero es AMPc incluyen GPCR acoplado a G.
Ejemplos de GPCR acoplado a G incluyen un receptor de vasopresina V2 y un receptor de GLP-1.
En una realización, la presente invención proporciona un kit que comprende una célula que expresa un GPCR acoplado a G que es un receptor de GLP-1 o V2R, un canal de calcio dependiente de AMPc y una proteína sensible al calcio, para su uso en la medición de la cantidad de una forma activa de GLP1 o la cantidad de AVP en una muestra biológica.
Aparte de la realización, teóricamente, se puede cuantificar un ligando que se une a GPCR acoplado a Gq usando una célula que expresa GPCR acoplado a Gq y una proteína sensible al calcio. Específicamente, la entrada de ion de calcio desde el canal IP3 del retículo endoplásmico en el citoplasma estimulada por la unión del ligando a GPCR acoplado a Gq se puede detectar usando la proteína sensible al calcio para cuantificar el ligando. Sin embargo, el ligando se puede cuantificar con mayor sensibilidad usando la célula que expresa el GPCR acoplado a G, un canal de calcio dependiente de AMPc y una proteína sensible al calcio, como está comprendido en la realización. Por ejemplo, se puede detectar AVP con mayor sensibilidad por un sistema para detectar AVP usando una célula que expresa el GPCR acoplado a G V2R, un canal de calcio dependiente de AMPc y una proteína sensible al calcio que por un sistema para detectar AVP usando una célula que expresa el GPCR acoplado a Gq V1a (o V1b) y una proteína sensible al calcio.
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La sustancia fisiológicamente activa se puede asociar a una enfermedad. Como se usa en el presente documento, la enfermedad asociada a la sustancia fisiológicamente activa es una enfermedad en la que participa la sustancia fisiológicamente activa. Los ejemplos de la enfermedad asociada a la sustancia fisiológicamente activa incluyen una enfermedad que se desarrolla debido a una cantidad anormalmente grande o pequeña de la sustancia fisiológicamente activa, una enfermedad cuya afección patológica progresa debido a una cantidad anormalmente grande o pequeña de la sustancia fisiológicamente activa, una enfermedad que se desarrolla debido a una ausencia de funciones normales ejercidas por la sustancia fisiológicamente activa, y una enfermedad cuya afección patológica progresa debido a una ausencia de funciones normales ejercidas por la sustancia fisiológicamente activa. Los ejemplos de la enfermedad asociada a la sustancia fisiológicamente activa incluyen el síndrome de la secreción inapropiada de hormona antidiurética (en lo sucesivo, también denominado ADH), diabetes insípida y diabetes de mellitus de tipo 2.
En una realización, el kit que comprende la célula que expresa un GPCR acoplado a G que es un receptor de GLP-1 o V2R, un canal de calcio dependiente de AMPc y una proteína sensible al calcio, proporcionado por la presente invención, puede ser un kit para diagnosticar una enfermedad asociada a la sustancia fisiológicamente activa.
2. Célula que expresa V2R, canal de calcio dependiente de AMPc y proteína sensible al calcio, y composición y kit que comprende la célula
En una realización, la presente invención proporciona un kit que comprende una célula que expresa V2R, un canal de calcio dependiente de AMPc y una proteína sensible al calcio.
V2R es un tipo de receptor al que se une AVP. Este receptor aumenta AMPc activando la adenilato ciclasa. El origen de V2R es un mamífero. El origen puede ser, por ejemplo, un humano, un ratón, bovino o una rata. Además, V2R puede tener uno o varios (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10) aminoácidos modificados (añadidos, sustituidos, delecionados) apropiadamente en la secuencia de aminoácidos, o V2R puede ser una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene 70 % o más, 80 % o más, 85 % o más, 90 % o más, 95 % o más, 98 % o más, o 99 % o más de identidad con la secuencia de aminoácidos de V2R natural; se une a AVP; y tiene la función de aumentar AMPc mediante la activación de la adenilato ciclasa.
V2R puede ser una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID N°: 1. Además, V2R puede ser una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene 70 % o más, 80 % o más, 85 % o más, 90 % o más, 95 % o más, 98 % o más, o 99 % o más de identidad con la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID N°: 1; se une a AVP; y tiene la función de aumentar AMPc mediante la activación de la adenilato ciclasa.
Como se usa en el presente documento, AVP deriva de un mamífero. AVP puede derivar de, por ejemplo, un humano, un ratón, bovino o una rata. AVP puede tener uno o varios (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10) aminoácidos modificados (añadidos, sustituidos, delecionados) apropiadamente en la secuencia de aminoácidos, o puede ser una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene 70 % o más, 80 % o más, 85 % o más, 90 % o más, 95 % o más, 98 % o más, o 99 % o más de identidad con la secuencia de aminoácidos de AVP natural; se une a V2R; y tiene la función de aumentar AMPc mediante la activación de la adenilato ciclasa.
El canal de calcio dependiente de AMPc es un canal que cambia la cantidad de entrada de ion de calcio en una célula en respuesta al cambio en la concentración de AMPc, e incluye canales que aumentan la cantidad de entrada de ion de calcio en una célula en respuesta al aumento en la concentración de AMPc. Los ejemplos del canal de calcio dependiente de AMPc incluyen un canal de calcio CNG (canal de iones regulado por nucleótidos cíclicos). El canal de iones CNG puede tener uno o varios (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10) aminoácidos modificados (añadidos, sustituidos, delecionados) en la secuencia de aminoácidos y se puede modificar (incluyendo sustituir, añadir y delecionar) de forma que presente, por ejemplo, mayor sensibilidad a AMPc que GMPc. El canal de iones CNG puede ser una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene 70 % o más, 80 % o más, 85 % o más, 90 % o más, 95 % o más, 98 % o más, o 99 % o más de identidad con la secuencia de aminoácidos del canal de iones CNG natural y aumenta la cantidad de entrada de ion de calcio en una célula en respuesta al aumento en la concentración de AMPc. Los ejemplos de la modificación incluyen la sustitución de la 460a cisteína en un canal de iones CNG de ratón con triptófano, la sustitución del 583° ácido glutámico en un canal de iones CNG de ratón con metionina, la sustitución de la 537a treonina en un canal de iones CNG bovino con serina, metionina, valina, o alanina, y sus combinaciones. Estas sustituciones ejemplificadas anteriormente también son aplicables a la sustitución de aminoácidos en sitios correspondientes en otras especies de animal. Por ejemplo, la treonina en un canal de iones CNG de ratón correspondiente a la 537a treonina en el canal de iones CNG bovino se puede sustituir con serina, metionina, valina o alanina. Dicha sustitución se puede realizar en una o más posición (posiciones). Por ejemplo, se realiza la sustitución de la 460a cisteína en el canal de iones CNG de ratón con triptófano, y también se puede realizar la sustitución del 583° ácido glutámico con metionina.
El canal de iones CNG puede consistir en una subunidad a y/o una subunidad p. Puede ser de cualquier constitución, por ejemplo, consistir en al menos una subunidad seleccionada del grupo que consiste en una subunidad a2, una subunidad a3, una subunidad a4 y una subunidad p1b. Además, la subunidad se puede modificar como se ha descrito anteriormente.
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El canal de iones CNG es de origen mamífero. El origen puede ser, por ejemplo, un humano, un ratón, bovino, una rata o un cerdo. El canal de iones CNG puede ser una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID N°: 2. Además, el canal de iones CNG puede ser una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene 70 % o más, 80 % o más, 85 % o más, 90 % o más, 95 % o más, 98 % o más, o 99 % o más de identidad con la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID N°: 2 y aumenta la cantidad de entrada de ion de calcio en una célula en respuesta al aumento en la concentración de AMPc.
La proteína sensible al calcio incluye proteínas cuya estructura cambia en respuesta al calcio, e incluye proteínas que emiten luminiscencia en respuesta al calcio y proteínas que actúan como un denominado sensor de calcio.
Los ejemplos de la proteína sensible al calcio incluyen aecuorina, cameleon (Invitrogen Corp.), Case12 (Evrogen), una proteína que comprende dos GFP que se diferencian en color, unidos a calmodulina sensible al calcio y una secuencia parcial de cinasa de cadena ligera de miosina que se une a ella, una proteína sensible al calcio que comprende calmodulina unida a entre los restos 144° y 146° en la secuencia de aminoácidos de GFP, y una proteína de sonda N° G3-85 o A1-2 descrita en la publicación de solicitud de patente japonesa 2002-153279, y sus apoproteínas, si las hay, (por ejemplo, apoaecuorina).
La secuencia de aminoácidos de la proteína sensible al calcio se puede modificar (añadir, sustituir, delecionar) apropiadamente según el fin o se puede modificar para aumentar la cantidad de luminiscencia y/o para mejorar una relación SN. La modificación incluye la adición, sustitución y deleción de uno o varios (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10) aminoácidos en la secuencia de aminoácidos, y la modificación a una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene 70 % o más, 80 % o más, 85 % o más, 90 % o más, 95 % o más, 98 % o más o 99 % o más de identidad con la secuencia de aminoácidos de la proteína sensible al calcio natural y emite luminiscencia en respuesta al calcio. Por ejemplo, la proteína sensible al calcio se puede modificar de forma que su gen se optimice para uso de codones humanos y tenga una señal de direccionamiento mitocondrial.
La proteína sensible al calcio puede ser una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID N°: 3. Además, la proteína sensible al calcio puede ser una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene 70 % o más, 80 % o más, 85 % o más, 90 % o más, 95 % o más, 98 % o más, o 99 % o más de identidad con la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID N°: 3 y emite luminiscencia en respuesta al calcio.
La célula que expresa V2R, un canal de calcio dependiente de AMPc y una proteína sensible al calcio, como está comprendida en el kit de la presente invención, expresa transitoria o establemente cada uno de V2R, el canal de calcio dependiente de AMPc y la proteína sensible al calcio.
La célula puede ser una línea celular tal como una célula CHO, una célula HEK293 o una célula 3T3.
Por ejemplo, la célula que expresa V2R, un canal de calcio dependiente de AMPc y una proteína sensible al calcio, como está comprendida en el kit de la presente invención, puede ser una célula CHO que expresa establemente cada proteína, en la que V2R consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID N°: 1, el canal de calcio dependiente de AMPc es un canal de iones CNG modificado que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID N°: 2 y la proteína sensible al calcio es apoaecuorina modificada que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID N°: 3. Además, la célula que expresa V2R, un canal de calcio dependiente de AMPc y una proteína sensible al calcio, como está comprendida en el kit de la presente invención, puede ser, por ejemplo, una célula CHO que expresa establemente V2R, el canal de calcio dependiente de AMPc y la proteína sensible al calcio, cada uno de los cuales es una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene 70 % o más, 80 % o más, 85 % o más, 90 % o más, 95 % o más, 98 % o más, o 99 % o más de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N°: 1-3 y mantiene las funciones de V2R, el canal de calcio dependiente de AMPc o la proteína sensible al calcio.
Además, se puede usar una célula que expresa naturalmente una o más proteínas seleccionadas del grupo que consiste en V2R, el canal de calcio dependiente de AMPc y la proteína sensible al calcio. En este caso, la célula que expresa V2R, un canal de calcio dependiente de AMPc y una proteína sensible al calcio, como está comprendida en el kit de la presente invención, también se puede preparar forzando a la célula a expresar transitoria o establemente la(s) proteína(s) que no son expresadas en la célula. Los ejemplos de dicha célula incluyen una célula derivada de riñón que expresa endógenamente V2R que es forzado a expresar transitoria o establemente cada uno del canal de calcio dependiente de AMPc y la proteína sensible al calcio y una célula derivada de tejido olfativo que expresa endógenamente el canal de iones CNG que es forzado a expresar transitoria o establemente cada uno de V2R y la proteína sensible al calcio.
Se pueden crioconservar la célula que expresa V2R, un canal de calcio dependiente de AMPc y una proteína sensible al calcio, como está comprendida en el kit de la presente invención. La crioconservación se puede realizar a -20 °C a -80 °C, por ejemplo -80 °C, en una disolución de crioconservación de células. La disolución de crioconservación de células incluye CELLBANKER (R) (Nippon Zenyaku Kogyo Co., Ltd ), BAMBANKER (R) (Lymphotec Inc.), Cellvation (R) (CELOX LABORATORIES, Inc.), CryoStor (R) (BIOLIFE SOLUTIONS Ltd.). Las células se pueden crioconservar en un gran número del mismo lote de manera que se reduzca drásticamente un
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error de medición derivado de la célula entre las composiciones o kits. Como resultado, se puede mejorar la reproducibilidad de los resultados de medición. Además, la célula que expresa V2R, un canal de calcio dependiente de AMPc y una proteína sensible al calcio, como está comprendida en el kit de la presente invención, mantiene sensibilidad suficiente para detectar AVP presente en sangre humana, incluso después de que se crioconserve y descongele usando un baño caliente. Además, después de la descongelación, la célula se transfiere simplemente a un recipiente apropiado y se cultiva durante aproximadamente 3 horas en un medio apropiado, y el estado de la célula no se deteriora por un reactivo añadido para detectar AVP, o por componentes derivados de sangre humana.
Se puede usar una composición que comprende la célula que expresa V2R, un canal de calcio dependiente de AMPc y una proteína sensible al calcio, como se ha descrito anteriormente, para medir la cantidad de AVP in vitro, para determinar cualquiera de una infusión de líquido hipotónico o hipertónico a seleccionar, para medir la actividad de un agonista o antagonista de V2R, para diagnosticar una enfermedad asociada a AVP, para determinar un humano que tiene un alto riesgo de desarrollar una enfermedad asociada a AVP y/o para determinar el efecto terapéutico sobre un humano en tratamiento.
Por consiguiente, en el presente documento se desvelan una composición y un kit para medir la cantidad de AVP in vitro, para determinar cualquiera de una infusión de líquido hipotónico o hipertónico a seleccionar, para medir la actividad de un agonista o antagonista de V2R, para diagnosticar una enfermedad asociada a AVP, para determinar un humano que tiene un alto riesgo de desarrollar una enfermedad asociada a AVP o para determinar el efecto terapéutico sobre un humano en tratamiento de una enfermedad asociada a AVP, que comprende la célula que expresa V2R, un canal de calcio dependiente de AMPc y una proteína sensible al calcio.
La célula que expresa V2R, un canal de calcio dependiente de AMPc y una proteína sensible al calcio es como se ha descrito anteriormente.
La enfermedad asociada a AVP incluye una enfermedad que implica la producción o acción anormal de AVP. Los ejemplos de la enfermedad asociada a AVP incluyen el síndrome de secreción inapropiada de hormona antidiurética (en lo sucesivo, también denominada ADH) (en lo sucesivo, también denominado SiaDh) y diabetes insípida.
SIADH es una enfermedad que se desarrolla debido a la secreción inapropiadamente creciente de AVP o sensibilidad renal anormalmente elevada a AVP. Normalmente, SIADH no ocurre como una única enfermedad y se desarrolla como una complicación o síntoma parcial de una enfermedad diferente. Por ejemplo, SIADH se desarrolla en asociación con enfermedades tales como enfermedades pulmonares (por ejemplo, neumonía y tuberculosis pulmonar), enfermedades nerviosas centrales (por ejemplo, meningitis) y tumores productores de hormona antidiurética ectópica (por ejemplo, cáncer de pulmón (por ejemplo, cáncer de pulmón de células pequeñas) y cáncer pancreático) o en asociación con tratamiento con fármacos (por ejemplo, tratamiento con vincristina y clofibrato). SIADH se diagnostica basándose en, por ejemplo, los siguientes criterios de diagnóstico (Tabla 1).
[Tabla 1]
Criterios para diagnosticar SIADH
Pasajes de la guía del diagnóstico de síndrome de secreción inapropiada de vasopresina (SIADH)nota)
I. Síntoma principal
1. Síntomas de hiponatremia tales como fatiga, pérdida de apetito y alteración de la consciencia, que no son específicos
2. No se encuentra deshidratación II. Resultados del examen
1. Hiponatremia: concentración de sodio en suero que se encuentra por debajo de 135 meq/l
2. Nivel de vasopresina en plasma: el nivel de sodio en suero es inferior a 135 meq/l y el nivel de vasopresina en plasma es igual a o superior a la sensibilidad de medición.
**3. Baja osmolalidad en plasma: la osmolalidad en plasma se encuentra por debajo de 280 mOsm/kg
4. Hiperestenuria: la osmolalidad en orina supera 300 mOsm/kg
5. Sustentación de la natriuresis: la concentración de sodio en orina es 20 meq/l o mayor
6. Función renal normal: el nivel de creatinina en suero es 1,2 mg/dl o inferior.
7. Función adrenocortical normal: el nivel de cortisol en suero es 6 pg/dl o superior.
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[Criterios de diagnóstico]
El diagnóstico definitivo se hace cuando están presentes los resultados 1 a 7 de II y no se encuentra deshidratación. [Diagnóstico diferencial] Se excluyen los siguientes que conducen a hiponatremia:
1. Hiponatremia con un exceso de un líquido extracelular: Insuficiencia cardíaca, cirrosis hepática durante la retención ascítica y síndrome nefrótico
2. Hiponatremia con una sustancial fuga de sodio: pérdida de sodio renal, diarrea y vómitos
**Nota) Health and Labour Sciences Research Grants for Research on Measures for Intractable Diseases from the Ministry of Health, Labour and Welfare of Japan Survey and Research on Diencephalic-Pituitary Dysfunction: 2008 Annual Report of Research: March 2009: p. 124
La diabetes insípida es una enfermedad que implica la excesiva micción resultante de la reducida síntesis o acción de AVP. La diabetes insípida incluye diabetes insípida central y diabetes insípida renal. La diabetes insípida central se diagnostica por, por ejemplo, 1. confirmación de la excesiva micción (3 l/día o más), 2. análisis de orina: negativo para glucosa en orina y bala osmolalidad de la orina, 3. confirmación de la disfunción secretora de AVP por un ensayo de carga con 5 % de solución salina hipertónica, 4. búsqueda de una lesión en una región del hipotálamo o la glándula pituitaria por obtención de imágenes de diagnóstico (MRI), y 5. confirmación de la capacidad para concentrar la orina por administración de desmoresina.
La cantidad de AVP se puede medir in vitro usando el siguiente evento:
Cuando está presente AVP en una muestra biológica, AVP aumenta AMPc actuando sobre el V2R expresado en la célula como está comprendido en el kit de la presente invención. Como resultado, el canal de iones CNG se activa de manera que aumenta la entrada de calcio en la célula. Así, la proteína sensible al calcio emite luminiscencia. Esto significa que la presencia de AVP en la muestra se representa por la luminiscencia de la proteína sensible al calcio como salida.
En una realización de la presente invención, el uso del kit proporcionado por la presente invención basado en el fenómeno descrito anteriormente puede medir la cantidad de AVP en una muestra biológica.
Como se usa en el presente documento, la muestra biológica incluye muestras derivadas de organismos tales como sangre, orina y una muestra preparada a partir de sangre o sangre e incluye, por ejemplo, sangre humana, una muestra preparada a partir de sangre humana, orina humana y una muestra preparada a partir de orina humana. La muestra biológica se puede diluir apropiadamente con una disolución acuosa apropiada. Por ejemplo, una muestra de orina humana se puede diluir 4 a 20 veces con solución salina fisiológica y usar con el kit proporcionado por la presente invención.
Usando el kit proporcionado por la presente invención, la cantidad de AVP en sangre humana u orina se puede medir usando el evento para diagnosticar que un sujeto de prueba tiene una enfermedad asociada a AVP (por ejemplo, diabetes insípida o SIADH) o no.
Por ejemplo, cuando se sospecha que un sujeto de prueba tiene SIADH, se puede diagnosticar que el sujeto de prueba tiene SIADH o no por uso del evento descrito en (1) usando el kit proporcionado por la presente invención midiendo la cantidad de luminiscencia de la proteína sensible al calcio emitida de la célula tratada con una muestra de sangre del sujeto de prueba y la cantidad de luminiscencia de la proteína sensible al calcio emitida de la célula tratada con la misma cantidad de una muestra de sangre de un individuo normal (estándar) que la de la muestra de sangre del sujeto de prueba. Por ejemplo, cuando la cantidad de luminiscencia emitida de la célula tratada con la muestra de sangre del sujeto de prueba es superior a la emitida de la célula tratada con la muestra de sangre del individuo normal (estándar), se puede determinar que la concentración en suero de AVP del sujeto de prueba es superior a la del individuo normal. Esto constituye motivos para el diagnóstico de SIADH del sujeto de prueba.
Además, por ejemplo, cuando se sospecha que un sujeto de prueba tiene diabetes insípida, se puede diagnosticar que el sujeto de prueba tiene diabetes insípida o no por uso del evento descrito en (1) usando el kit proporcionado por la presente invención midiendo la cantidad de luminiscencia de la proteína sensible al calcio emitida de la célula tratada con una muestra de sangre del sujeto de prueba y la cantidad de luminiscencia de la proteína sensible al calcio emitida de la célula tratada con la misma cantidad de una muestra de sangre de un individuo normal (estándar) que la de la muestra de sangre del sujeto de prueba. Por ejemplo, cuando la cantidad de luminiscencia emitida de la célula tratada con la muestra de sangre del sujeto de prueba es inferior a la emitida de la célula tratada con la muestra de sangre del individuo normal (estándar), se puede determinar que la concentración en suero de
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AVP del sujeto de prueba es más baja que la del individuo normal. Esto constituye motivos para el diagnóstico de diabetes insípida del sujeto de prueba.
Para la medición de la cantidad de luminiscencia, se prefiere medir el valor integrado durante el tiempo dado. Por ejemplo, el valor integrado se puede medir durante 5 segundos, 10 segundos, 15 segundos, 20 segundos, 30 segundos, 40 segundos, 50 segundos, o 1 minuto.
Cuando se administra una infusión de fluido a un paciente diagnosticado de SIADH usando el kit proporcionado por la presente invención, se selecciona una infusión de fluido hipertónico. Cuando se administra una infusión de fluido a un paciente diagnosticado de diabetes insípida usando el kit proporcionado por la presente invención, se selecciona una infusión de fluido hipotónico. Por consiguiente, el kit proporcionado por la presente invención se usa para determinar cualquiera de una infusión de fluido hipotónico o una infusión de fluido hipertónico a administrar a un paciente.
Además, la cantidad de AVP en sangre humana u orina se puede medir usando el kit proporcionado por la presente invención para determinar un humano que tiene un alto riesgo de desarrollar una enfermedad asociada a AVP, por ejemplo, un humano que tiene un alto riesgo de desarrollar SIADH o diabetes insípida.
Por ejemplo, cuando la concentración en suero de AVP medida usando el kit proporcionado por la presente invención en el examen médico es inferior al valor numérico de un paciente con SIADH y superior al valor numérico de un individuo normal, se puede determinar que es persona es un humano que tiene un alto riesgo de desarrollar SIADH. Cuando la concentración en suero de AVP es superior al valor numérico de un paciente con diabetes insípida e inferior al valor numérico de un individuo normal, se puede determinar que esta persona es un humano que tiene un alto riesgo de desarrollar diabetes insípida. Además, cuando la concentración en suero de AVP aumenta gradualmente con el tiempo, se puede determinar que esta persona es un humano que tiene un alto riesgo de desarrollar SIADH. Cuando la concentración en suero de AVP disminuye gradualmente con el tiempo, se puede determinar que esta persona es un humano que tiene un alto riesgo de desarrollar diabetes insípida.
Además, la cantidad de AVP en sangre humana u orina se puede medir usando el kit proporcionado por la presente invención para determinar la eficacia de tratamiento para un humano en tratamiento de una enfermedad asociada a AVP, por ejemplo, un humano con SIADH o diabetes insípida en tratamiento de la misma.
Por ejemplo, se pueden medir la concentración de AVP en muestras de sangre recogidas del mismo individuo tanto antes como después del tratamiento y el cambio dependiente del tiempo en la concentración usando el kit proporcionado por la presente invención para determinar la presencia o ausencia de eficacia del tratamiento. Por ejemplo, cuando la concentración en suero de AVP medida usando el kit proporcionado por la presente invención es inferior después del tratamiento que antes del tratamiento, se puede determinar que es eficaz el tratamiento de SIADH. Cuando la concentración en suero de AVP es superior después del tratamiento que antes del tratamiento, se puede determinar que es eficaz el tratamiento de diabetes insípida.
La actividad de un agonista o antagonista de V2R se puede medir usando el kit proporcionado por la presente invención. Por ejemplo, la actividad de un agonista de V2R se puede medir añadiendo el agonista de V2R a la composición como está comprendida en el kit de la presente invención en ausencia de AVP y cuantificando la luminiscencia de la proteína sensible al calcio. Además, por ejemplo, la actividad de un antagonista de V2R se puede medir añadiendo el antagonista de V2R a la composición como está comprendida en el kit de la presente invención en presencia de AVP y cuantificando la luminiscencia de la proteína sensible al calcio.
Un kit que comprende una composición que comprende la célula que expresa V2R, un canal de calcio dependiente de AMPc y una proteína sensible al calcio proporcionado por la presente invención puede comprender además al menos un seleccionado del grupo que consiste en un medio para cultivo celular, una disolución de detección, un sustrato luminiscente para la proteína sensible al calcio o una disolución acuosa del mismo, una placa para cultivo celular o un tubo de ensayo, AVP o una disolución acuosa del mismo y un suero de control humano normal.
El kit se puede preparar apropiadamente por los expertos en la técnica. Por ejemplo, cada sustancia que constituye el kit y la composición se envasan individualmente, y estos envases se pueden poner juntos en un recipiente tal como una caja para preparar un kit.
La composición que comprende la célula que expresa V2R, un canal de calcio dependiente de AMPc y una proteína sensible al calcio, como está comprendidos en el kit de la presente invención, se puede preparar apropiadamente, y se prepara, por ejemplo, suspendiendo la célula a una densidad de 3 X 106 células/ml en una disolución acuosa.
El medio para cultivo celular es adecuado para mantener la célula proporcionada por la presente invención. El medio para cultivo celular puede ser sin Ca2+ o sin Ca2+/Mg2+.
La disolución de detección puede contener CaCI2, azul de tripano, un catión que es capaz de causar la luminiscencia de aecuorina y se puede sustituir por calcio (por ejemplo, un ion de cadmio o un ion de estroncio), un ion de magnesio, un ion de cinc, un ion de sulfato y/o un ion de carbonato. Las concentraciones de CaCI2 y azul de tripano se pueden ajustar apropiadamente por los expertos en la técnica. Por ejemplo, la concentración de CaCl2 es 9 a 100
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mM, y la concentración de azul de tripano es 0,001 a 0,010%. La disolución de detección es, por ejemplo, una disolución acuosa que contiene CaCh 9 mM y 0,002 % de azul de tripano. La concentración final de CaCl2 cuando se mide la cantidad de luminiscencia de la proteína sensible al calcio se puede establecer a 3 a 33 mM. Además, la disolución de detección puede contener un catión que se puede sustituir por calcio, un ion de magnesio, un ion de cinc, un ion de sulfato y/o un ion de carbonato, por ejemplo, disolviendo el catión que se puede sustituir por calcio, el ion de magnesio, el ion de cinc, el ion de sulfato y/o el ion de carbonato en la disolución de detección.
El sustrato luminiscente para la proteína sensible al calcio incluye coelenteracina o un derivado de coelenteracina que sirve de sustrato luminiscente para aecuorina. El derivado de coelenteracina incluye ViviRen (R), (Promega Corp.: éster 8-bencil-2-(4-hidroxibencil)-6-(4-hidroxifenil)imidazo[1,2-a]pirazin-3-butiriloximetílico). Se puede establecer apropiadamente la concentración del sustrato luminiscente (por ejemplo, ViviRen) para la proteína sensible al calcio. La disolución acuosa del sustrato luminiscente para la proteína sensible al calcio es, por ejemplo, una disolución acuosa de ViviRen 4 mM (Promega Corp.).
Los ejemplos de la placa para cultivo celular incluyen los que permiten la medición de la cantidad de luminiscencia usando un luminómetro, por ejemplo, una placa de 96 pocillos que permite el cultivo celular.
El tubo de ensayo se puede seleccionar apropiadamente por los expertos en la técnica. Por ejemplo, se puede usar un tubo de ensayo adecuado para un aparato para medir la luminiscencia emitida de la proteína sensible al calcio.
Se puede usar AVP como agonista de V2R. Se puede usar AVP como control positivo. AVP puede ser AVP humano. La concentración de AVP se puede preparar apropiadamente por los expertos en la técnica.
El suero de control humano normal se puede usar como control negativo y se puede preparar apropiadamente por los expertos en la técnica.
El kit proporcionado por la presente invención también es útil para ayuda de diagnóstico que ayuda a un médico a diferenciar una enfermedad asociada a AVP (por ejemplo, SIADH o diabetes insípida) de otras enfermedades en vista de los síntomas clínicos del paciente y/u otros resultados de exámenes. Por ejemplo, la medición de la cantidad de AVP en una muestra de sangre de un paciente que presenta síntomas de SIADH usando el kit proporcionado por la presente invención puede ser útil para el diagnóstico diferencial entre SIADH e insuficiencia cardíaca. Además, la medición de la cantidad de AVP en una muestra de sangre de un paciente que presenta síntomas de diabetes insípida usando el kit proporcionado por la presente invención puede ser útil para el diagnóstico diferencial entre diabetes insípida y polidipsia primaria.
El kit que comprende la célula que expresa V2R, un canal de calcio dependiente de AMPc y una proteína sensible al calcio, proporcionado por la presente invención, es capaz de detectar AVP, un agonista de V2R o un antagonista de V2R con alta sensibilidad.
Por consiguiente, el kit proporcionado por la presente invención no incluye preferentemente un instrumento o un aparato para concentrar AVP, un agonista de V2R o un antagonista de V2R de una muestra biológica (por ejemplo, columnas (por ejemplo, columnas C18 tales como columnas Sep-Pak C18) o un aparato de ultrafiltración).
3. Célula que expresa receptor de GLP-1, canal de calcio dependiente de AMPc y proteína sensible al calcio, y composición y kit que comprende la célula
En una realización, la presente invención proporciona un kit que comprende una célula que expresa un receptor de GLP-1, un canal de calcio dependiente de AMPc y una proteína sensible al calcio.
El receptor de GLP-1 es un tipo de receptor al que se une un péptido GLP-1. Este receptor aumenta AMPc, activando la adenilato ciclasa. El origen del receptor de GLP-1 es un mamífero. El origen puede ser, por ejemplo, un humano, un ratón, bovino o una rata. Además, el receptor de GLP-1 puede tener uno o varios (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10) aminoácidos modificados (añadidos, sustituidos, delecionados) apropiadamente en la secuencia de aminoácidos, o el receptor de GLP-1 puede ser una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene 70 % o más, 80 % o más, 85 % o más, 90 % o más, 95 % o más, 98 % o más, o 99 % o más de identidad con la secuencia de aminoácidos del receptor de GLP-1 natural; se une a GLP-1; y tiene la función de aumentar AMPc mediante la activación de la adenilato ciclasa.
El receptor de GLP-1 puede ser una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID N°: 8. Además, el receptor de GLP-1 puede ser una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene 70 % o más, 80 % o más, 85 % o más, 90 % o más, 95 % o más, 98 % o más, o 99 % o más de identidad con la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID N°: 8; se une a GLP-1; y tiene la función de aumentar AMPc mediante la activación de la adenilato ciclasa.
Como se usa en el presente documento, el péptido relacionado con GLP-1 deriva de un mamífero. El péptido relacionado con GLP-1 puede derivar de, por ejemplo, un humano, un ratón, bovino, una rata o un conejo. GLP-1 puede tener uno o varios (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10) aminoácidos modificados (añadidos, sustituidos, delecionados) apropiadamente en la secuencia de aminoácidos o puede tener un grupo modificador tal como un
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ácido graso introducido en un aminoácido en el péptido. Alternativamente, GLP-1 puede ser una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene 70 % o más, 80 % o más, 85 % o más, 90 % o más, 95 % o más, 98 % o más, o 99 % o más de identidad con la secuencia de aminoácidos de GLP-1 natural; se une a un receptor de GLP-1; y tiene la función de aumentar AMPc mediante la activación de la adenilato ciclasa. Además, el fármaco de péptido fisiológicamente activo de tipo GLP-1 puede derivar de, por ejemplo, un lagarto o puede ser una proteína que tiene 50, 60, 70, 80, 90, 95 o 98 % o más de identidad de secuencia de aminoácidos con GLP-1 natural; se une a un receptor de GLP-1; y tiene la función de aumentar AMPc mediante la activación de la adenilato ciclasa. Los ejemplos del fármaco de péptido fisiológicamente activo de tipo GLP-1 incluyen exenatida y liraglutida.
Se puede usar lo descrito anteriormente en "2. Célula que expresa V2R, canal de calcio dependiente de AMPc y proteína sensible al calcio, y composición y kit que comprende la célula" como el canal de calcio dependiente de AMPc y la proteína sensible al calcio.
La célula que expresa un receptor de GLP-1, un canal de calcio dependiente de AMPc y una proteína sensible al calcio, como está comprendida en el kit de la presente invención, expresa transitoria o establemente cada uno del receptor de GLP-1, el canal de calcio dependiente de AMPc y la proteína sensible al calcio. La célula puede ser una línea celular tal como una célula CHO, una célula HEK293 o una célula 3T3. Por ejemplo, la célula que expresa un receptor de GLP-1, un canal de calcio dependiente de AMPc y una proteína sensible al calcio, como está comprendida en el kit de la presente invención, puede ser una célula CHO que expresa establemente cada proteína, en el que el receptor de GLP-1 consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID N°: 8, el canal de calcio dependiente de AMPc es el canal de iones CNG modificado que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID N°: 2, y la proteína sensible al calcio es apoaecuorina modificada que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID N°: 3. Además, la célula del receptor de GLP-1, como está comprendida en el kit de la presente invención, puede ser, por ejemplo, una célula CHO que expresa establemente el receptor de GLP-1, el canal de calcio dependiente de AMPc y la proteína sensible al calcio, cada uno de los cuales es una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene 70 % o más, 80 % o más, 85 % o más, 90 % o más, 95 % o más, 98 % o más, o 99 % o más de identidad con la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID N°: 8, 2 y 3 y mantiene las funciones del receptor de GLP-1, el canal de calcio dependiente de AMPc o la proteína sensible al calcio.
Además, se puede usar una célula que expresa naturalmente una o más proteínas seleccionadas del grupo que consiste en el receptor de GLP-1, el canal de calcio dependiente de AMPc y la proteína sensible al calcio. En este caso, la célula que expresa un receptor de GLP-1, un canal de calcio dependiente de AMPc y una proteína sensible al calcio, como está comprendida en el kit de la presente invención, también se puede preparar forzando a la célula a expresar transitoria o establemente la(s) proteína(s) que no son expresadas en la célula. Los ejemplos de dicha célula incluyen una célula derivada de páncreas que expresa endógenamente el receptor de GLP-1 que es forzado a expresar transitoria o establemente cada uno del canal de calcio dependiente de AMPc y la proteína sensible al calcio y una célula derivada de tejido olfativo que expresa endógenamente el canal de iones CNG que es forzada a expresar transitoria o establemente cada uno del receptor de GLP-1 y la proteína sensible al calcio.
Se puede crioconservar la célula que expresa un receptor de GLP-1, un canal de calcio dependiente de AMPc y una proteína sensible al calcio, como está comprendida en el kit de la presente invención. La crioconservación se puede llevar a cabo similarmente a la célula que expresa V2R, un canal de calcio dependiente de AMPc y una proteína sensible al calcio como se ha descrito anteriormente en "2. Célula que expresa V2R, canal de calcio dependiente de AMPc y proteína sensible al calcio, y composición y kit que comprende la célula".
La célula que expresa un receptor de GLP-1, un canal de calcio dependiente de AMPc y una proteína sensible al calcio, como está comprendida en el kit de la presente invención, mantiene sensibilidad suficiente para detectar GLP-1 presente en sangre humana, incluso después de que se crioconserve y descongele usando un baño caliente. Además, después de descongelar, la célula se transfiere simplemente a un recipiente apropiado y se cultiva durante varias horas en un medio apropiado, y el estado de la célula no se deteriora por un reactivo añadido para detectar GLP-1, o por componentes derivados de sangre humana.
En el presente documento se desvelan una composición y un kit para medir la cantidad de una forma activa de GLP-1 in vitro, para medir la actividad de un agonista o antagonista de receptor de GLP-1 o para determinar el efecto terapéutico sobre un humano en el tratamiento de una enfermedad asociada a GLP-1, que comprende la célula que expresa un receptor de GLP-1, un canal de calcio dependiente de AMPc y una proteína sensible al calcio.
La célula que expresa un receptor de GLP-1, un canal de calcio dependiente de AMPc y una proteína sensible al calcio es como se ha descrito anteriormente.
La enfermedad asociada a GLP-1 incluye una enfermedad que se trata deseablemente por potenciamiento en la acción de GLP-1, tal como diabetes mellitus de tipo 2.
En el tratamiento de la diabetes mellitus de tipo 2, se usa un inhibidor de DPP-IV, que es una enzima degradadora de GLP-1, con el fin de potenciar la acción de GLP-1. Alternativamente, se usa un análogo de GLP-1 que tiene resistencia a la degradación por DPP-IV en el tratamiento de la misma.
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La cantidad de GLP-1 se puede medir in vitro usando el siguiente evento:
Cuando la forma activa de GLP-1 está presente en una muestra biológica, la forma activa de GLP-1 aumenta AMPc actuando sobre el receptor de GLP-1 expresado en la célula como está comprendida en el kit de la presente invención. Como resultado, el canal de iones CNG se activa de manera que aumenta la entrada de calcio en la célula. Así, la proteína sensible al calcio emite luminiscencia. Esto significa que la presencia de la forma activa de GLP-1 en la muestra se representa por la luminiscencia de la proteína sensible al calcio como salida.
La cantidad de la forma activa de GLP-1 en una muestra biológica se puede medir por el uso del evento usando el kit proporcionado por la presente invención.
La muestra biológica es como se ha descrito anteriormente en "2. Célula que expresa V2R, canal de calcio dependiente de AMPc y proteína sensible al calcio, y composición y kit que comprende la célula".
Además, se puede ensayar la forma activa de GLP-1 en sangre humana u orina usando el kit proporcionado por la presente invención para determinar la eficacia de tratamiento para un humano en tratamiento de una enfermedad asociada a GLP-1, por ejemplo, un humano con diabetes mellitus de tipo 2 en tratamiento que aumenta la cantidad de una forma activa de GLP-1.
Por ejemplo, se pueden medir la concentración de la forma activa de GLP-1 en muestras de sangre recogidas del mismo individuo tanto antes como después del tratamiento, y el cambio dependiente del tiempo en la concentración usando el kit proporcionado por la presente invención para determinar la presencia o ausencia de eficacia del tratamiento. Por ejemplo, cuando la concentración en suero de la forma activa de GLP-1 medida usando la composición como está comprendida en el kit de la presente invención es mayor después del tratamiento que antes del tratamiento, se puede determinar que es eficaz un fármaco terapéutico que aumenta la cantidad de una forma activa de GLP-1 (por ejemplo, un inhibidor de DPP-IV).
Se puede medir la actividad de un agonista o antagonista de GLP-1 usando el kit proporcionado por la presente invención. Por ejemplo, se puede medir la actividad de un agonista de GLP-1 añadiendo el agonista de gLP-1 a la composición como está comprendida en el kit de la presente invención en ausencia de GLP-1 y cuantificando la cantidad de luminiscencia de la proteína sensible al calcio. Además, por ejemplo, se puede medir la actividad de un antagonista de GLP-1 añadiendo el antagonista de GLP-1 a la composición como está comprendida en el kit de la presente invención en presencia de GLP-1 y cuantificando la cantidad de luminiscencia de la proteína sensible al calcio.
Un kit que comprende una composición que comprende la célula que expresa un receptor de GLP-1, un canal de calcio dependiente de AMPc y una proteína sensible al calcio puede comprender además al menos uno seleccionado de un medio para cultivo celular, una disolución de detección, un sustrato luminiscente para la proteína sensible al calcio o una disolución acuosa del mismo, una placa para cultivo celular o un tubo de ensayo, GLP-1 o una disolución acuosa del mismo y un plasma de control humano normal.
El kit se puede preparar apropiadamente por los expertos en la técnica. Por ejemplo, se envasan individualmente cada sustancia que constituye el kit y la composición, y estos envases se pueden poner juntos en un recipiente tal como una caja para preparar un kit.
Se puede usar GLP-1 como un agonista de receptor de GLP-1. Se puede usar GLP-1 como control positivo. GLP-1 puede ser GLP-1 derivado de humano. La concentración de GLP-1 se puede ajustar apropiadamente por los expertos en la técnica.
Las otras sustancias contenidas en el kit se pueden preparar con referencia a la descripción de "2. Célula que expresa V2R, canal de calcio dependiente de AMPc y proteína sensible al calcio, y composición y kit que comprende la célula".
El kit que comprende la célula que expresa un receptor de GLP-1, un canal de calcio dependiente de AMPc y una proteína sensible al calcio, proporcionado por la presente invención, es capaz de detectar GLP-1, un agonista de receptor de GLP-1 o un antagonista de receptor de GLP-1 con alta sensibilidad.
Por consiguiente, el kit proporcionado por la presente invención no incluye preferentemente un instrumento o un aparato para concentrar GLP-1, un agonista de receptor de GLP-1 o un antagonista de receptor de GLP-1 de una muestra biológica (por ejemplo, columnas (por ejemplo, columnas C18 tales como columnas Sep-Pak C18) o un aparato de ultrafiltración).
Además, el kit proporcionado por la presente invención puede ser capaz de medir la cantidad total de tanto la forma activa de GLP-1 (7-36) como la forma activa de GLP-1 (7-37) por una única operación.
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4. Método de bioensayo que usa célula que expresa V2R, canal de calcio dependiente de AMPc y proteína sensible al calcio
En una realización, la presente invención también proporciona un método de diagnóstico de diabetes insípida o SIADH, un método de determinación de cualquiera de una infusión de líquido hipotónico o hipertónico a seleccionar o un método de determinación del efecto de un fármaco terapéutico relacionado con GLP-1, que comprende las siguientes etapas (A) a (C):
(A) preparar una mezcla que contiene una célula que expresa V2R, un canal de calcio dependiente de AMPc y una proteína sensible al calcio, un sustrato luminiscente para la proteína sensible al calcio, un medio sin Ca2+ y una muestra biológica derivada de la sangre de un sujeto de prueba;
(B) añadir una disolución que contiene Ca2+ a la mezcla preparada en (A); y
(C) medir la luminiscencia de la proteína sensible al calcio emitida de la célula.
Los materiales usados en las etapas tales como reactivos, aparatos o muestras biológicas y las condiciones para las etapas se pueden preparar o establecer apropiadamente por los expertos en la técnica con referencia a la descripción de "2. Célula que expresa V2R, canal de calcio dependiente de AMPc y proteína sensible al calcio, y composición y kit que comprende la célula".
Ejemplos de la disolución que contiene Ca2+ incluyen una disolución de CaCl2.
El orden de adición de las sustancias descritas en la etapa (A) del método se puede establecer apropiadamente por los expertos en la técnica.
Un método de medición de la cantidad de AVP en una muestra biológica, un método de diagnóstico de una enfermedad asociada a AVP, un método de determinación de un riesgo de desarrollar una enfermedad asociada a AVP y un método de determinación de la eficacia de tratamiento de una enfermedad asociada a AVP puede comprender las siguientes etapas:
(1) sembrar, en una placa para cultivo celular, una célula que expresa V2R, un canal de calcio dependiente de AMPc y una proteína sensible al calcio, suspendiéndose la célula en un medio sin Ca2+ complementado con un sustrato luminiscente para la proteína sensible al calcio;
(2) añadir una muestra biológica derivada de un sujeto de prueba a la célula y cultivar la célula; y
(3) añadir una disolución de CaCl2 a la célula cultivada y medir la luminiscencia de la proteína sensible al calcio emitida de la célula.
El cultivo de la célula puede ser cultivo estéril, pero no tiene que ser estéril. Por ejemplo, cuando el tiempo de incubación de la célula está dentro de 4 horas, no se requiere cultivo estéril para dicho corto tiempo.
La luminiscencia se emite por la proteína sensible al calcio, tal como aecuorina, inmediatamente después de la adición de la disolución de CaCl2 y se puede medir por un método que se conoce bien por los expertos en la técnica. Por ejemplo, se usa un luminómetro capaz de realizar automática y continuamente la agitación y medición (PerkinElmer Inc., ARVO-Sx), y se puede medir la cantidad de luminiscencia integrando los valores de luminiscencia durante 15-30 segundos después de la agitación. El aparato que se puede usar en la medición de la cantidad de luminiscencia se puede seleccionar apropiadamente por los expertos en la técnica.
La cantidad de AVP en la muestra biológica se mide basándose en la cantidad de luminiscencia de la proteína sensible al calcio obtenida como resultado de llevar a cabo el método. Basándose en la cantidad medida de AVP, se diagnostica una enfermedad asociada a AVP, se determina un riesgo de desarrollar una enfermedad asociada a AVP o se determina la eficacia del tratamiento de una enfermedad asociada a AVP. Por ejemplo, cuando la cantidad de luminiscencia emitida de la célula tratada con una muestra de sangre de un sujeto de prueba que se sospecha que tiene SIADH es superior a la emitida de la célula tratada con una muestra de sangre de un individuo normal (estándar), se puede determinar que la concentración en suero de AVP del sujeto de prueba es superior a la del individuo normal. Así, al sujeto de prueba se le diagnostica SIADH. Además, cuando la cantidad de luminiscencia emitida de la célula tratada con una muestra de sangre de un sujeto de prueba que se sospecha que tiene diabetes insípida es inferior a la emitida de la célula tratada con una muestra de sangre de un individuo normal (estándar), se puede determinar que la concentración en suero de AVP del sujeto de prueba es inferior a la del individuo normal. Así, al sujeto de prueba se le diagnostica diabetes insípida.
La composición que comprende la célula que expresa V2R, un canal de calcio dependiente de AMPc y una proteína sensible al calcio, como está comprendida en el kit proporcionado por la presente invención, es capaz de detectar AVP, un agonista de V2R o un antagonista de V2R con alta sensibilidad.
Por consiguiente, el método proporcionado por la presente invención no incluye preferentemente la etapa de concentrar AVP, un agonista de V2R o un antagonista de V2R de una muestra biológica (por ejemplo, la etapa de
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uso de columnas (por ejemplo, columnas C18 tales como columnas Sep-Pak C18), la etapa de uso de un aparato de ultrafiltración o la etapa de uso de un aparato de concentración por centrifugación).
En una realización alternativa, la presente invención también proporciona un método de cribado de un antagonista de V2R, que comprende las siguientes etapas (A') a (C'):
(A') preparar una mezcla que contiene una célula que expresa V2R, un canal de calcio dependiente de AMPc y una proteína sensible al calcio, un sustrato luminiscente para la proteína sensible al calcio, un medio sin Ca2+, un agonista de V2R expresado en la célula y un compuesto de prueba;
(B') añadir una disolución que contiene Ca2+ a la mezcla preparada en (A'); y
(C') medir la luminiscencia de la proteína sensible al calcio emitida de la célula.
Los materiales usados en las etapas tales como reactivos o aparatos y las condiciones para las etapas se pueden preparar o establecer apropiadamente por los expertos en la técnica con referencia a la descripción de "2. Célula que expresa V2R, canal de calcio dependiente de AMPc y proteína sensible al calcio, y composición y kit que comprende la célula" y el método proporcionado por la presente invención, que comprende las etapas (A)-(C).
Basándose en la cantidad de luminiscencia de la proteína sensible al calcio obtenida como resultado de llevar a cabo el método, los expertos en la técnica pueden determinar que el compuesto de prueba es o no un antagonista de V2R.
En una realización alternativa, la presente invención también proporciona un método de cribado de un antagonista de V2R, que comprende las siguientes etapas (A") a (C"):
(A") preparar una mezcla que contiene una célula que expresa V2R, un canal de calcio dependiente de AMPc y una proteína sensible al calcio, un sustrato luminiscente para la proteína sensible al calcio, un medio que contiene Ca2+, un agonista de V2R expresado en la célula y un compuesto de prueba;
(B") añadir forskolina a la mezcla preparada en (A"); y
(C") medir la luminiscencia de la proteína sensible al calcio emitida de la célula.
Los materiales usados en las etapas tales como reactivos o aparatos y las condiciones para las etapas se pueden preparar o establecer apropiadamente por los expertos en la técnica con referencia a la descripción de "2. Célula que expresa V2R, canal de calcio dependiente de AMPc y proteína sensible al calcio, y composición y kit que comprende la célula" y el método proporcionado por la presente invención, que comprende las etapas (A)-(C).
Este método utiliza la desensibilización del canal de calcio dependiente de AMPc para detectar la actividad de un antagonista de V2R. Específicamente, cuando el compuesto de prueba es un antagonista de V2R, se inhibe la unión del agonista de V2R a V2R. En este estado, la adición de forskolina que activa la adenilato ciclasa forma AMPc, que a su vez activa el canal de calcio dependiente de AMPc (por ejemplo, CNG calcio). Así, la proteína sensible al calcio emite luminiscencia. Sin embargo, si el compuesto de prueba no es un antagonista de V2R, el agonista de V2R se une a V2R para formar AMPc antes de la adición de forskolina, de manera que se activa el canal de calcio dependiente de AMPc (por ejemplo, CNG calcio). En este estado, la posterior adición de forskolina desensibiliza el canal de calcio dependiente de AMPc una vez activado, que ya no se activa mediante la adición de forskolina. Así, la proteína sensible al calcio no emite luminiscencia.
El método proporcionado por la presente invención, que comprende las etapas (A") a (C"), puede ser capaz de cuantificar con exactitud la actividad inhibidora de un antagonista de V2R en un alto intervalo de concentración.
Basándose en la cantidad de luminiscencia de la proteína sensible al calcio obtenida como resultado de llevar a cabo el método, los expertos en la técnica pueden determinar que el compuesto de prueba es o no un antagonista de V2R.
Puesto que el antagonista de V2R se puede utilizar como fármaco hipotensor, fármaco terapéutico para hiponatremia, fármaco terapéutico para SIADH, una composición que comprende el compuesto determinado como antagonista de V2R se puede preparar como resultado de llevar a cabo el método como agente hipotensor, agente terapéutico para hiponatremia o agente terapéutico para SIADH.
5. Método de bioensayo usando célula que expresa receptor de GLP-1, canal de calcio dependiente de AMPc y proteína sensible al calcio
En una realización, la presente invención proporciona un método de diagnóstico de diabetes insípida o SIADH, un método de determinación de cualquiera de una infusión de líquido hipotónico o hipertónico a seleccionar o un método de determinación del efecto de un fármaco terapéutico relacionado con GLP-1 que comprende las siguientes etapas (A) a (C):
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(A) preparar una mezcla que contiene una célula que expresa un receptor de GLP-1, un canal de calcio dependiente de AMPc y una proteína sensible al calcio, un sustrato luminiscente para la proteína sensible al calcio, un medio sin Ca2+ y una muestra derivada de la sangre de un sujeto de prueba;
(B) añadir una disolución que contiene Ca2+ a la mezcla preparada en (A); y
(C) medir la luminiscencia de la proteína sensible al calcio emitida de la célula.
Los materiales usados en las etapas tales como reactivos, aparatos o muestras biológicas y las condiciones para las etapas se pueden preparar o establecer apropiadamente por los expertos en la técnica con referencia a la descripción de "3. Célula que expresa receptor de GLP-1, canal de calcio dependiente de AMPc y proteína sensible al calcio, y composición y kit que comprende la célula" y "4. Método de bioensayo usando célula que expresa V2R, canal de calcio dependiente de AMPc y proteína sensible al calcio".
El orden de adición de las sustancias descritas en la etapa (A) del método se puede establecer apropiadamente por los expertos en la técnica.
Un método de medición de la cantidad de una forma activa de GLP-1 en una muestra biológica o un método de determinación de la eficacia de tratamiento de una enfermedad asociada a GLP-1 puede comprender las siguientes etapas:
(1) sembrar, en una placa para cultivo celular, una célula que expresa un receptor de GLP-1, un canal de calcio dependiente de AMPc y una proteína sensible al calcio, suspendiéndose la célula en un medio sin Ca2+ complementado con un sustrato luminiscente para la proteína sensible al calcio;
(2) añadir una muestra biológica derivada de un sujeto de prueba a la célula y cultivar la célula; y
(3) añadir una disolución de CaCl2 a la célula cultivada y medir la luminiscencia de la proteína sensible al calcio emitida de la célula.
El cultivo de la etapa (2) puede ser cultivo estéril, pero no tiene que ser estéril. Por ejemplo, cuando el tiempo de incubación de la etapa (2) está dentro de 4 horas, no se requiere cultivo estéril para dicho corto tiempo.
En la etapa (3), la luminiscencia se emite por la proteína sensible al calcio, tal como aecuorina, inmediatamente después de la adición de la disolución de CaCl2 y se puede medir por un método que se conoce bien por los expertos en la técnica. Por ejemplo, se usa un luminómetro capaz de realizar automática y continuamente la agitación y medición (PerkinElmer Inc., ARVO-Sx), y se puede medir la cantidad de luminiscencia integrando los valores de luminiscencia durante 15-30 segundos después de la agitación. El aparato que se puede usar en la medición de la cantidad de luminiscencia se puede seleccionar apropiadamente por los expertos en la técnica.
El kit que comprende la célula que expresa un receptor de GLP-1, un canal de calcio dependiente de AMPc y una proteína sensible al calcio, proporcionado por la presente invención, es capaz de detectar GLP-1, un agonista de receptor de GLP-1 o un antagonista de receptor de GLP-1 con alta sensibilidad.
Por consiguiente, el método proporcionado por la presente invención no incluye preferentemente la etapa de concentrar GLP-1, un agonista de receptor de GLP-1 o un antagonista de receptor de GLP-1 de una muestra biológica (por ejemplo, la etapa de uso de columnas (por ejemplo, columnas C18 tales como columnas Sep-Pak C18), la etapa de uso de un aparato de ultrafiltración o la etapa de uso de un aparato de concentración por centrifugación).
Además, la presente invención proporciona un método de cribado de un antagonista de receptor de GLP-1, que comprende las siguientes etapas (A') a (C'):
(A') preparar una mezcla que contiene una célula que expresa un receptor de GLP-1, un canal de calcio dependiente de AMPc y una proteína sensible al calcio, un sustrato luminiscente para la proteína sensible al calcio, un medio sin calcio, un agonista de receptor de GLP-1 expresado en la célula y un compuesto de prueba;
(B') añadir una disolución de calcio que contiene a la mezcla preparada en (A'); y
(C') medir la luminiscencia de la proteína sensible al calcio emitida de la célula.
Los materiales usados en las etapas tales como reactivos o aparatos y las condiciones para las etapas se pueden preparar o establecer apropiadamente por los expertos en la técnica con referencia a la descripción de "3. Célula que expresa receptor de gLP-1, canal de calcio dependiente de AMPc y proteína sensible al calcio, y composición y kit que comprende la célula", "4. Método de bioensayo usando célula que expresa V2R, canal de calcio dependiente de AMPc y proteína sensible al calcio" y el método proporcionado por la presente invención, que comprende las etapas (A)-(C).
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Basándose en la cantidad de luminiscencia de la proteína sensible al calcio obtenida como resultado de llevar a cabo el método, los expertos en la técnica pueden determinar que el compuesto de prueba es o no un antagonista de receptor de GLP-1.
En una realización, un método de cribado de un antagonista de receptor de GLP-1, que comprende las siguientes etapas (A") a (C"):
(A") preparar una mezcla que contiene una célula que expresa un receptor de GLP-1, un canal de calcio dependiente de AMPc y una proteína sensible al calcio, un sustrato luminiscente para la proteína sensible al calcio, un medio que contiene Ca2+, un agonista de receptor de GLP-1 expresado en la célula y un compuesto de prueba;
(B") añadir forskolina a la mezcla preparada en (A"); y
(C") medir la luminiscencia de la proteína sensible al calcio emitida de la célula.
Los materiales usados en las etapas tales como reactivos o aparatos y las condiciones para las etapas se pueden preparar o establecer apropiadamente por los expertos en la técnica con referencia a la descripción de "3. Célula que expresa receptor de gLP-1, canal de calcio dependiente de AMPc y proteína sensible al calcio, y composición y kit que comprende la célula", "4. Método de bioensayo usando célula que expresa V2R, canal de calcio dependiente de AMPc y proteína sensible al calcio" y el método proporcionado por la presente invención, que comprende las etapas (A)-(C).
Basándose en la cantidad de luminiscencia de la proteína sensible al calcio obtenida como resultado de llevar a cabo el método, los expertos en la técnica pueden determinar que el compuesto de prueba es o no un antagonista de receptor de GLP-1.
En lo sucesivo, la presente invención se describirá adicionalmente con referencia a los ejemplos. Los ejemplos que no se encuentran dentro del alcance de las reivindicaciones son para fines ilustrativos.
Ejemplos
A. Experimento en célula que expresa V2R
1. Detalles del método para la construcción de célula congelada
Se amplificó la secuencia de ADNc de V2R humano (Genbank N° NM_001146151.1) (SEQ ID N°: 5) por el método de PCR de una biblioteca de ADNc derivado de humano y se clonó en pUC18. El ADNc de la isoforma 2 del receptor de vasopresina humana (V2R) clonado en pUC18 se reclonó en un vector pEF2 para preparar pEFhV2R.
Se amplificó la secuencia de ADNc de un canal de calcio dependiente de nucleótido cíclico (Genbank N° BC048775) (SEQ ID N°: 4) por el método de PCR a partir de una biblioteca de ADNc derivado de células epiteliales olfativas de ratón (1994 pb) y se clonó en un vector de expresión (pCMVSPORT, Invitrogen Corp.) para preparar pmCNGa2 (Figura 18). Además, para potenciar la selectividad de AMPc y la sensibilidad al mismo, se preparó una construcción pmCNGa2MW que expresa un canal de calcio dependiente de nucleótido cíclico modificado (SEQ ID N°: 6) en el que la 460a cisteína (C) se sustituye con triptófano (W) y el 583° ácido glutámico (E) se sustituye con metionina (M) por el método de PCR de mutación puntual. Además, se trató una secuencia de ADNc de apoaecuorina sintética (676 pb) (SEQ ID N°: 7) que se optimizó para uso de codones humanos por el método de extensión de ADN de oligonucleótidos, y que tiene una señal de direccionamiento mitocondrial, con las enzimas de restricción KpnI y NheI y se clonó en pcDNA3.1 (Invitrogen Corp.) tratado con KpnI y NheI para preparar un vector de expresión de aecuorina pcDNA mt sAEQ (Figura 13).
Se sembraron células CHO a una densidad celular de 1,0*105 células/ml en una placa de Petri de 10 cm2. Al día siguiente, las células se transfectaron con 1 |jg de V2R de pEF2, 2 |jg de pmCNGa2MW y 2 |jg de pcDNA mt sAEQ por placa de Petri usando FuGENE6 (TM) (Roche Applied Science). Al día siguiente, las células se disociaron de la placa de Petri mediante la adición de 400 jl de una disolución de Versene (EDTA) a la placa de Petri y se suspendieron en un medio de DMEM/F12 que contenía 10 ml de 5 % de FCSc. La suspensión obtenida se centrifugó a 1000 rpm durante 5 min. Entonces, el sedimento se disolvió a una densidad de 2-5 * 106 células/ml en 1 ml de CELLBANKER y se almacenó a -80 °C.
2. Curva dependiente de la concentración y sensibilidad de detección más baja de AVP obtenida usando célula congelada
Se descongeló en un baño caliente 1 ml (3 * 106 células/ml) de las células congeladas preparadas en 1 y se suspendieron en 10 ml de un tampón de lavado (medio independiente de CO2 sin calcio, Invitrogen Corp.). Después de la centrifugación a 1000 rpm durante 5 minutos, se añadieron 12 ml de un tampón de cultivo (5 % de PEG6000, medio independiente de CO2 sin calcio) al precipitado obtenido, y se añadieron 6 jl de ViviRen 4 mM (Promega Corp.) al mismo. La mezcla se sembró a 50 jl/pocillo en una placa de 96 pocillos. Se añadió adicionalmente a la misma (n = 3) a 50 jl/pocillo AVP diluida en serie con un tampón de muestra, y las células se cultivaron a
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temperatura ambiente durante 3 h. Se añadió a la misma a 100 pl/pocillo disolución 3 mM de CaCl2, y se midió la cantidad de luminiscencia usando un luminómetro (PerkinElmer Inc., ARVO-Sx; en lo sucesivo, se usó el mismo modelo en los ejemplos). Se muestra en la Figura 1 una curva dependiente de la concentración de AVP.
Como se muestra en la Figura 2 (vista ampliada del intervalo de baja concentración), la cantidad detectable mínima para AVP fue 0,63 pg/ml, de manera que el valor detectado fue capaz de ser significativamente discriminado del valor que se calcula por el valor del blanco + 3 DE. Además, puesto que la aecuorina realiza reacción luminiscente, se obtuvo por este método una alta relación entre señal y blanco (relación S/N) (es decir, a 80 pg/ml de AVP, relación S/N de aproximadamente 56 veces (3194263/56805)).
4. Estudio del tiempo de incubación después de la adición de sustrato (ViviRen) para la luminiscencia de aecuorina
Se descongeló en un baño caliente 1 ml (3 * 106 células/ml) de las células congeladas preparadas en 1 y se suspendieron en 12 ml de un tampón de lavado. Después de la centrifugación a 1000 rpm durante 5 min, se añadieron 12 ml de un tampón de cultivo al precipitado obtenido, y se añadieron 6 pl de ViviRen 4 mM al mismo. La mezcla se sembró a 50 pl/pocillo en una placa de 96 pocillos. Se añadió a la misma a 50 pl/pocillo AVP diluida en serie con un tampón de cultivo. Después de 1, 2, 3, 4 o 5 h, se añadió a la misma a 100 pl/pocillo disolución 3 mM de CaCl2, y se midió la cantidad de luminiscencia usando un luminómetro. Se demostró que la cantidad de luminiscencia alcanzó una meseta 4 h después de la adición de ViviRen (véase la Figura 3).
5. Estudio de la cantidad de plásmido de receptor usada en la transfección
Se sembraron 10 ml de células CHO que tienen una densidad de 1 * 105 células/ml en una placa de Petri de 10 cm2 y se cultivaron durante 1 d. Entonces, se mezclaron 3 pg de pcDNA mt sAEQ, 1 pg de pmCNGa2MW y 0 a 1 pg de plásmido de V2R de pEF2 y se mezclaron adicionalmente con 600 pl de DMEM/F12 y 18 pl de FugEnE6 (Roche Applied Science), y se realizó la transfección. Después del cultivo adicional durante la noche, el medio se retiró, y las células se lavaron con 10 ml de PBS. Entonces, se añadió a las mismas 800 pl de Versene, y las células se cultivaron a 37 °C durante 5 min y luego se suspendieron en 10 ml de un tampón de lavado. Después de la centrifugación a 1000 rpm durante 5 min, el precipitado se disolvió en 12 ml de un cultivo tampón, y se añadió al mismo 6,5 pl de ViviRen 4 mM. La suspensión de células se sembró a 50 pl/pocillo en una placa de 96 pocillos complementada con 50 pl/pocillo de una serie de concentración de AVP. Después del cultivo a temperatura ambiente durante 3 h, se añadió a la misma a 100 pl/pocillo disolución 3 mM de CaCl2, y se midió la cantidad de luminiscencia usando un luminómetro.
Se demostró que se requirió el plásmido de receptor en una cantidad de 1 pg/placa en la transfección para obtener la cantidad óptima de luminiscencia (véase la Figura 4).
6. Optimización de la densidad celular
Se descongeló en un baño caliente 1 ml (3 * 106 células/ml) de las células congeladas preparadas en 1 y se suspendieron en 10 ml de un tampón de muestra. Después de la centrifugación a 1000 rpm durante 5 min, se añadieron 10 ml de un tampón de muestra al precipitado obtenido. Se preparó una serie de células cuya densidad celular se ajustó a las densidades 1,0 * 105 células/ml a 2 * 106 células/ml. Las células se suspendieron mediante la adición de 6 pl de ViviRen 4 mM. La suspensión de células se sembró en una placa de 96 pocillos complementada con 50 pl/pocillo de AVP diluida en serie con un tampón de cultivo. Después del cultivo durante 3 h, se añadió a la misma disolución 3 mM de CaCh a 100 pl/pocillo, y se midió la cantidad de luminiscencia usando un luminómetro.
Como se muestra en las Figuras 5 y 6, la cantidad de luminiscencia aumentó en un modo dependiente de la densidad celular.
7. Estudio de la concentración de disolución de detección de CaCl? añadida
Se descongeló en un baño caliente 1 ml (3 * 106 células/ml) de las células congeladas preparadas en 1 y se suspendieron en 10 ml de un tampón de lavado. Después de la centrifugación a 1000 rpm durante 5 minutos, se añadieron 12 ml de un tampón de cultivo al precipitado obtenido, y se añadieron 6 pl de ViviRen 4 mM al mismo. La mezcla se sembró a 50 pl/pocillo en una placa de 96 pocillos. Se añadió a la misma a 50 pl/pocillo AVP diluida en serie con un tampón de cultivo, y las células se cultivaron durante 3 h. Entonces, se añadió a la misma a 100 pl/pocillo una disolución de detección de CaCl2 (concentraciones finales: 0 a 30 mM), y se midió la cantidad de luminiscencia usando un luminómetro.
Se demostró que las concentraciones óptimas de CaCl2 fueron 30 mM a las que se obtuvieron un bajo valor en el fondo (0) y la alta cantidad de luminiscencia en la muestra (véase la Figura 7).
8. Estudio de la linealidad de la dilución usando disolución de AVP
Se descongeló en un baño caliente 1 ml (3 * 106 células/ml) de las células congeladas preparadas en 1 y se suspendieron en 10 ml de un tampón de lavado. Después de la centrifugación a 1000 rpm durante 5 min, se añadieron 12 ml de un tampón de cultivo al precipitado obtenido, y se añadieron 6 pl de ViviRen 4 mM al mismo. La
mezcla se sembró a 50 pl/pocillo en una placa de 96 pocilios. Las células se cultivaron durante 3 h con una disolución de AVP diluida 1/2, 1/4, 1/8, 1/16 o 1/32 veces con un tampón de muestra.
Después del cultivo durante 3 horas, se añadió a la misma a 100 pl/pocillo disolución 3 mM de CaCl2, y se midió la cantidad de luminiscencia usando un luminómetro.
5 Como se muestra en la Figura 8, se confirmó que la cantidad de luminiscencia aumentó con la linealidad.
11. Comparación de sensibilidad con el kit existente que usa disolución de AVP
Se descongeló en un baño caliente 1 ml (3 * 106 células/ml) de las células congeladas preparadas en 1 y se suspendieron en 10 ml de un tampón de lavado. Después de la centrifugación a 1000 rpm durante 5 min, se añadieron 12 ml de un tampón de cultivo al precipitado obtenido, y se añadieron 6 pl de ViviRen 4 mM al mismo. La 10 mezcla se sembró a 50 pl/pocillo en una placa de 96 pocillos. Las células se cultivaron durante 3 h con una disolución de AVP diluida 1/2, 1/4, 1/8, 1/16 o 1/32 veces con un tampón de muestra.
También se muestran valores por separado medidos usando el kit existente Mitsubishi Chemical Medience AVP-RIA. Los valores obtenidos usando el kit de RIA se indican por una tasa de inhibición competitiva (% de B/B0) contra AVP radiomarcada. Así, para la comparación, se muestran valores calculados según la ecuación 100 - (cantidad de 15 luminiscencia a cada concentración / la máxima cantidad de luminiscencia) * 100. Se confirmó que el kit de la presente invención mantenía la linealidad incluso a una dosis de 20 pg/ml o superior y tenía excelente sensibilidad, en comparación con el kit de RIA existente (véase la Figura 9).
12. Estudio usando muestra clínica humana
Se descongeló en un baño caliente 1 ml (3 * 106 células/ml) de las células congeladas preparadas en 1 y se 20 suspendieron en 10 ml de un tampón de lavado. Después de la centrifugación a 1000 rpm durante 5 min, se añadieron 12 ml de un tampón de cultivo al precipitado obtenido, y se añadieron 6 pl de ViviRen 4 mM al mismo. La mezcla se sembró a 50 pl/pocillo en una placa de 96 pocillos. Se usaron una serie de dilución de AVP que sirvió de disolución patrón, plasma individual normal y plasma con un alto nivel de AVP preparado mediante la adición de AVP. Se diluyeron 80 pl de una muestra mediante la adición de 320 pl de un tampón de cultivo y se añadieron a la 25 placa a 50 pl/pocillo, y las células se cultivaron durante 3 h. Se añadió a la misma a 100 pl/pocillo disolución 3 mM de CaCl2, y se midió la cantidad de luminiscencia usando un luminómetro.
13. Estudio del cambio dependiente del tiempo en la luminiscencia usando el kit que usa célula congelada
Se descongeló en un baño caliente 1 ml (3 * 106 células/ml) de las células congeladas preparadas en 1 y se suspendieron en 10 ml de un tampón de lavado. Después de la centrifugación a 1000 rpm durante 5 min, se 30 añadieron 12 ml de un tampón de cultivo al precipitado obtenido, y se añadieron 6 pl de ViviRen 4 mM al mismo. La mezcla se sembró a 50 pl/pocillo en una placa de 96 pocillos. Se añadió a la misma a 50 pl/pocillo AVP diluida en serie con un tampón de cultivo, y las células se cultivaron durante 3 h. Se añadió a la misma a 100 pl/pocillo disolución 3 mM de CaCl2 y se agitó durante 3 s. Entonces, se midió la cantidad de luminiscencia con el tiempo durante 12 s usando un luminómetro. Como resultado, como se muestra en la Figura 11, se observó luminiscencia 35 relativamente estable tan pronto como se añadió la disolución de CaCl2.
14. Estudio de la detección de AVP y antagonista de V2R por desensibilización
Se descongeló en un baño caliente 1 ml (3 * 106 células/ml) de las células congeladas preparadas en 1 y se suspendieron en 10 ml de un tampón de lavado. La suspensión se centrifugó a 1000 rpm durante 5 min. Se añadieron 12 ml de un tampón de cultivo al precipitado obtenido, y se añadieron 6 pl de ViviRen 4 mM al mismo. La 40 mezcla se sembró a 50 pl/pocillo en una placa de 96 pocillos. Se añadieron a la misma AVP diluida en serie con un tampón de cultivo que contenía calcio, y OPC-41061 a 50 pl/pocillo, y las células se cultivaron durante 3 h. Se añadió a la misma a 50 pl/pocillo AVP 10"7 M, y se midió la cantidad de luminiscencia usando un luminómetro (Figuras 14 y 15). El antagonista de la vasopresina OPC-41061 inhibió la acción de AVP añadida en un modo dependiente de la concentración (Figura 14). Además, cuando se hicieron reaccionar AVP y las células en un medio 45 que contenía calcio, la re-adición de AVP no causó la luminiscencia debido a la reacción que una vez ocurrió en presencia de una alta concentración de AVP. La desensibilización disminuyó la cantidad de luminiscencia en un modo dependiente de la concentración de AVP añadida (Figura 15). Se demostró que AVP también se puede cuantificar por desensibilización. Posteriormente, se añadió adicionalmente forskolina 10-4 M a la misma a 50 pl/pocillo, y se midió la cantidad de luminiscencia usando un luminómetro (Figura 16). Solo cuando el antagonista 50 de la vasopresina inhibió la acción de AVP añadida, se detectó la luminiscencia de forskolina en un modo dependiente de la concentración. Así, se demostró que se puede detectar por desensibilización un antagonista de la vasopresina.
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B. Experimento en célula que expresa receptor de GLP-1 1. Detalles del método de construcción de célula congelada
Se amplificó la secuencia de ADNc del receptor de GLP-1 humano (Genbank N° BC113493) (SEQ ID N°: 9) por el método de PCR de una biblioteca de ADNc derivado de humano y se clonó en pUC18. El ADNc de receptor de GLP-1 humano (GLP-1R) clonado en pUC18 se reclonó en un vector pCIneo para preparar pCIneoGLP-1R.
Se amplificó la secuencia de ADNc de un canal de calcio dependiente de nucleótido cíclico (Genbank N° BC048775) por el método de PCR a partir de una biblioteca de ADNc derivado de células epiteliales olfativas de ratón (1994 pb) y se clonó en un vector de expresión (pCMVSPORT, Invitrogen Corp.) para preparar pmCNGa2. Además, para potenciar la selectividad de AMPc y la sensibilidad al mismo, se preparó una construcción pmCNGa2MW que expresa un canal de calcio dependiente de nucleótido cíclico modificado en el que la 460a cisteína (C) se sustituye con triptófano (W) y el 583° ácido glutámico (E) se sustituye con metionina (M) por el punto-mutación método de PCR. Además, se trató una secuencia de ADNc de apoaecuorina sintética (676 pb) que se optimizó para uso de codones humanos por el método de extensión de ADN de oligonucleótidos, y que tiene una señal de direccionamiento mitocondrial, con enzimas de restricción Kpnl y Nhel y se clonó en pcDNA3.1 (Invitrogen Corp.) tratado con Kpnl y Nhel para preparar un vector de expresión de aecuorina pcDNA mt sAEQ.
Se sembraron líneas celulares CHO a una densidad celular de 1,0 * 105 células/ml en una placa de Petri de 10 cm2. Al día siguiente, las células se transfectaron con 0,1 |jg de pCIneoGLP-1R, 1 |jg de pmCNGa2MW y 4 |jg de pcDNA mt sAEQ por placa de Petri usando FuGENE6 (TM) (Roche Applied Science). Al día siguiente, las células se disociaron de la placa de Petri mediante la adición de 400 jl de una disolución de Versene (EDTA) a la placa de Petri y se suspendieron en un medio de DMEM/F12 que contenía 10 ml de 5 % de FCSc. La suspensión obtenida se centrifugó a 1000 rpm durante 5 min. Entonces, el sedimento se disolvió a una densidad de 2-5 * 106 células/ml en 1 ml de CELLBANKER y se almacenó a -80 °C.
2. Curva dependiente de la concentración y sensibilidad de detección más baja de GLP-1 obtenida usando célula congelada
Se descongeló en un baño caliente 1 ml (3 * 106 células/ml) de las células congeladas preparadas en 1 y se suspendieron en 10 ml de un tampón de lavado (medio independiente de CO2 sin calcio, Invitrogen Corp.). Después de la centrifugación a 1000 rpm durante 5 min, se añadieron 12 ml de un tampón de cultivo (5 % de PEG6000, medio independiente de CO2 sin calcio) al precipitado obtenido, y se añadieron 6 jl de 4 mM ViviRen (Promega Corp.) al mismo. La mezcla se sembró a 90 jl/pocillo en una placa de 96 pocillos. Se añadió adicionalmente a la misma (n = 3) a 10 jl/pocillo la forma activa de GLP-1 (7-36 amida) diluida en serie con un tampón de muestra, y las células se cultivaron a temperatura ambiente durante 3 h. Se añadió a la misma a 50 jl/pocillo disolución 100 mM de CaCl2, y se midió la cantidad de luminiscencia usando un luminómetro (PerkinElmer Inc., ARVO-Sx; en lo sucesivo, se usó el mismo modelo en los ejemplos). Se muestra en la Figura 17 una curva dependiente de la concentración de la forma activa de GLP-1.
La cantidad detectable mínima para la forma activa de GLP-1 fue 0,078 pg/ml de manera que el valor detectado fue capaz de ser significativamente discriminado del valor que se calcula por el valor del blanco + 3 DE. Además, puesto que la aecuorina realiza reacción luminiscente, se obtuvo por este método una alta relación entre señal y blanco (relación S/N) (es decir, a 33 pg/ml de forma activa de GLP-1, relación S/N de aproximadamente 9,3 veces (902623 / 96686)).
3. Estudio del tiempo de incubación después de la adición de sustrato (ViviRen) para la luminiscencia de aecuorina
Se descongeló en un baño caliente 1 ml (3 * 106 células/ml) de las células congeladas preparadas en 1 y se suspendieron en 12 ml de un tampón de lavado. Después de la centrifugación a 1000 rpm durante 5 minutos, se añadieron 12 ml de un tampón de cultivo al precipitado obtenido, y se añadieron 6 jl de ViviRen 4 mM al mismo. La mezcla se sembró a 90 jl/pocillo en una placa de 96 pocillos. Se añadió a la misma a 10 jl/pocillo la forma activa de GLP-1 diluida en serie con un tampón de cultivo. Después de 0, 1, 2, 3, 4, 5 o 7 h, se añadió a la misma a 50 jl/pocillo la disolución 100 mM de CaCh, y se midió la cantidad de luminiscencia usando un luminómetro. Se demostró que la cantidad de luminiscencia alcanzó una meseta 3 h después de la adición de ViviRen (véase la Figura 18).
4. Estudio de la cantidad de plásmido de receptor usada en la transfección
Se sembraron 10 ml de células CHO que tienen una densidad de 0,7 * 105 células/ml en una placa de Petri de 10 cm2 y se cultivaron durante 1 d. Entonces, se mezclaron 4 jg de pcDNA mt sAEQ, 1 jg de pmCNGa2MW y 0 a 1 jg de plásmido de receptor de pCIneoGLP-1 y se mezclaron adicionalmente con 600 jl de DMEM/F12 y 18 jl de FuGENE6 (Roche Applied Science), y se realizó la transfección. Después del cultivo adicional durante la noche, el medio se retiró, y las células se lavaron con 10 ml de PBS. Entonces, se añadió a las mismas 800 jl de Versene, y las células se cultivaron a 37 °C durante 5 min y entonces se suspendieron en 10 ml de un tampón de lavado. Después de la centrifugación a 1000 rpm durante 5 min, el precipitado se disolvió en 12 ml de un cultivo tampón, y se añadieron 6 jl de ViviRen 4 mM al mismo. La suspensión de células se sembró a 90 jl/pocillo en una placa de 96
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Se demostró que el plásmido de receptor se requirió en una cantidad de 0,1 pg/placa en transfección para obtener la cantidad óptima de luminiscencia (véase la Figura 19).
5. Optimización de la densidad celular
Se descongeló en un baño caliente 1 ml (3 *10® células/ml) de las células congeladas preparadas en 1 y se suspendieron en 10 ml de un tampón de muestra. Después de la centrifugación a 1000 rpm durante 5 min, se añadieron 10 ml de un tampón de muestra al precipitado obtenido. Se preparó una serie de células cuya densidad celular se ajustó a las densidades 1,25 * 105 células/ml a 1 * 10® células/ml. Las células se suspendieron mediante la adición de 6 pl de 4 mM ViviRen. La suspensión de células se sembró en una placa de 96 pocillos complementada con 50 pl/pocillo de GLP-1 diluido en serie con un tampón de cultivo. Después del cultivo durante 3 h, se añadió a la misma a 100 pl/pocillo disolución 100 mM de CaCh, y se midió la cantidad de luminiscencia usando un luminómetro.
Como se muestra en las Figuras 20 y 21, la cantidad de luminiscencia aumentó en un modo dependiente de la densidad celular.
6. Estudio de la linealidad de la dilución usando disolución de GLP-1
Se descongeló en un baño caliente 1 ml (3 * 10® células/ml) de las células congeladas preparadas en 1 y se suspendieron en 10 ml de un tampón de lavado. Después de la centrifugación a 1000 rpm durante 5 min, se añadieron 12 ml de un tampón de cultivo al precipitado obtenido, y se añadieron 6 pl de ViviRen 4 mM al mismo. La mezcla se sembró a 50 pl/pocillo en una placa de 96 pocillos. Las células se cultivaron durante 3 h con una disolución de GLP-1 diluido 1/2, 1/4, 1/8, 1/1® o 1/32 veces con un tampón de muestra.
Después del cultivo durante 3 h, se añadió a la misma a 50 pl/pocillo disolución 100 mM de CaCl2, y se midió la cantidad de luminiscencia usando un luminómetro.
Como se muestra en la Figura 22, se confirmó que la cantidad de luminiscencia aumentó con la linealidad.
7. Comparación de sensibilidad con el kit existente que usa disolución de GLP-1
Se descongeló en un baño caliente 1 ml (3 * 10® células/ml) de las células congeladas preparadas en 1 y se suspendieron en 10 ml de un tampón de lavado. Después de la centrifugación a 1000 rpm durante 5 min, se añadieron 12 ml de un tampón de cultivo al precipitado obtenido, y se añadieron ® pl de ViviRen 4 mM al mismo. La mezcla se sembró a 90 pl/pocillo en una placa de 9® pocillos. Las células se cultivaron durante 4 h con una disolución de AVP diluida 1/2, 1/4, 1/8, 1/1® o 1/32 veces con un tampón de muestra.
También se muestran valores por separado medidos usando el kit existente Millipore GLP-1 (Active)-ELISA (EGLP-35K). El kit de ELISA mide la intensidad de fluorescencia mientras que el kit de la presente invención mide la intensidad de quimioluminiscencia. Así, para la comparación, se muestra un valor relativo (%) con respecto a la máxima cantidad de luz (fluorescencia o luminiscencia) emitida de cada muestra. Se confirmó que el kit de la presente invención mantenía la linealidad incluso a una dosis de 1 pg/ml o inferior y tenía excelente sensibilidad, en comparación con el kit de ELISA existente (véase la Figura 23). La sensibilidad de detección más baja fue 3,73 pg/ml para el kit de ELISA existente y 0,078 pg/ml para el kit de la presente invención.
Además, se demostró que el kit proporcionado por la presente invención puede medir la forma activa de GLP-1 en un intervalo de concentración más amplio que el del kit de ELISA existente (véase la Figura 23).
8. Estudio de la especificidad del kit usando péptido de tipo GLP-1
Se descongeló en un baño caliente 1 ml (3 * 10® células/ml) de las células congeladas preparadas en 1 y se suspendieron en 10 ml de un tampón de lavado. Después de la centrifugación a 1000 rpm durante 5 min, se añadieron 12 ml de un tampón de cultivo al precipitado obtenido, y se añadieron ® pl de ViviRen 4 mM al mismo. La mezcla se sembró a 90 pl/pocillo en una placa de 9® pocillos. Las células se cultivaron durante 3 h con una disolución de péptido de tipo GLP-1 diluida 1/10, 1/100, 1/1000, 1/10000 o 1/105 veces con un tampón de muestra. La sensibilidad de la medición del péptido de tipo GLP-1 del kit de la presente invención se indica por el valor de CE50 (pM) de cada péptido (véase la Figura 24). El kit presentó reactividad por el precursor GLP-1 (1-37), oxintomodulina y glucagón, que son agonistas débiles contra el receptor de GLP-1, a una concentración 10000 veces superior en comparación con las formas activas (GLP-1 (7-37) y GLP-1 (7-3® amida)) de GLP-1. Además, el kit reaccionó difícilmente con GLP-1 (9-3® amida), que se forma por la degradación in vivo de la forma activa de GLP-1, o GIP o GLP-2, que es incretina que actúa sobre otros receptores, incluso a una concentración 1 millón de veces superior en comparación con las formas activas de GLP-1. Se demostró que el kit de la presente invención es capaz de ensayar las formas activas de GLP-1, es decir, GLP-1 (7-3® amida) y GLP-1 (7-37), con sensibilidad y especificidad extremadamente altas.
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9. Ensayo de la forma activa de GLP-1 en plasma humano
Se descongeló en un baño caliente 1 ml (3 * 106 células/ml) de las células congeladas preparadas en 1 y se
suspendieron en 10 ml de un tampón de lavado. Después de la centrifugación a 1000 rpm durante 5 min, se
añadieron 12 ml de un tampón de cultivo al precipitado obtenido, y se añadieron 6 pl de ViviRen 4 mM al mismo. La mezcla se sembró a 50 pl/pocillo en una placa de 96 pocillos. Se usaron muestras que contenían GLP-1 preparadas añadiendo la forma activa de GLP-1 (7-36 amida) a una concentración final de 16,5 pg/ml (5 pM) a plasma individual normal o una disolución de tampón. Se añadió inhibidor de DPP-IV de Millipore (DPP44-010) a una concentración de 20 pl por m de plasma con el fin de inhibir la actividad de la peptidasa DPP-IV en plasma. La mezcla se añadió a la placa a 10 pl/pocillo, y las células se cultivaron durante 4 h. Se añadió a la misma a 50 pl/pocillo disolución 100 mM de CaCl2, y se midió la cantidad de luminiscencia usando un luminómetro. Los resultados se muestran en la Figura 25.
La actividad de GLP-1 desapareció con el tiempo en el plasma humano en comparación con la disolución de tampón, y la desaparición se inhibió por el inhibidor de DPP-IV. Se pudo monitorizar la degradación de GLP-1 por la actividad de la enzima DPP-IV usando el kit de la presente invención.
10. Detección de agonista de GLP-1 y antagonista de GLP-1
Se descongeló en un baño caliente 1 ml (3 * 106 células/ml) de las células congeladas preparadas en 1 y se
suspendieron en 10 ml de un tampón de lavado. La suspensión se centrifugó a 1000 rpm durante 5 min. Se
añadieron 12 ml de un tampón de cultivo al precipitado obtenido, y se añadieron 6 pl de ViviRen 4 mM al mismo. La mezcla se sembró a 90 pl/pocillo en una placa de 96 pocillos. Se añadió a la misma exenatida diluida en serie con un tampón de cultivo que contenía calcio, y las células se cultivaron durante 3 h. Se añadió a la misma a 50 pl/pocillo disolución 100 mM de CaCl2, y se midió la cantidad de luminiscencia usando un luminómetro (Figura 26). La exenatida es un péptido de tipo GLP-1 contenido en la glándula salival del lagarto el monstruo de Gila y tiene una larga semivida debido a su resistencia a DPP-IV. La exenatida ya ha sido lanzada como un fármaco terapéutico para la diabetes mellitus de tipo 2. Se demostró que el kit de la presente invención puede ensayar no solo GLP-1 natural, sino también un análogo que tiene actividad agonista de receptor de GLP-1 con alta sensibilidad.
A continuación, se midió la actividad de un antagonista de GLP-1. Se descongeló en un baño caliente 1 ml (3 * 106 células/ml) de las células congeladas preparadas en 1 y se suspendieron en 10 ml de un tampón de lavado. La suspensión se centrifugó a 1000 rpm durante 5 min. Se añadieron 12 ml de un tampón de cultivo al precipitado obtenido, y se añadieron 6 pl de ViviRen 4 mM al mismo. La mezcla se sembró a 90 pl/pocillo en una placa de 96 pocillos.
Se añadió a la misma a 10 pl/pocillo exendina-4 (9-39), y las células se cultivaron durante 3 h. se añadió a la misma a 10 pl/pocillo GLP-1 10-11 M, y se midió la cantidad de luminiscencia usando un luminómetro. El antagonista de GLP-1 exendina-4 (9-39) inhibió la acción agonista de GLP-1 añadido en un modo dependiente de la concentración (Figura 27).
Aplicabilidad industrial
La presente invención puede proporcionar un método y un kit para diagnosticar diabetes insípida o SIADH, para determinar cualquiera de una infusión de líquido hipotónico o hipertónico a seleccionar y para determinar el efecto de un fármaco terapéutico relacionado con GLP-1.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.
<120> Un método de bioensayo para la detección de una sustancia fisiológicamente activa
<130> 670631
<150> JP 2010-288305 <151>
<160> 9
10
<170> PatentIn versión 3.2
<210> 1 <211> 309 <212> PRT <213> Humana
<400> 1
imagen1

Leu Val Ala Trp Ala Phe Ser Leu Leu Leu Ser Leu Pro Gln Leu Phe 165 170 175

lie Phe Ala Gln Arg Asn Val Glu Gly Gly Ser Gly Val Thr Asp Cys 180 185 190

Trp Ala Cys Phe Ala Glu Pro Trp Gly Arg Arg Thr Tyr Val Thr Trp 195 200 205

lie Ala Leu Met Val Phe Val Ala Pro Thr Leu Gly lie Ala Ala Cys 210 215 220

Gln Val Leu lie Phe Arg Glu lie His Ala Ser Leu Val Pro Gly Pro 225 230 235 240

Ser Glu Arg Pro Gly Gly Arg Arg Arg Gly Arg Arg Thr Gly Ser Pro 245 250 255

Gly Glu Gly Ala His Val Ser Ala Ala Val Ala Lys Thr Val Arg Met 260 265 270
Thr Leu Val lie Val Val Val Tyr Val Leu Cys Trp Ala Pro Phe Phe

275 280 285

Leu Val Gln Leu Trp Ala Ala Trp Asp Pro Glu Ala Pro Leu Glu Gly 290 295 300
Gly Cys Ser Arg Gly 305
<210>2 <211> 664 5 <212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> CNG alfa2 modificado
10
<400> 2

Claims (15)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    REIVINDICACIONES
    1. Un kit para su uso en la medición de la cantidad de una forma activa de GLP-1 o la cantidad de AVP en una muestra biológica, que comprende una célula que expresa un GPCR acoplado a G que es un receptor de GLP-1 o V2R, un canal de calcio dependiente de AMPc y una proteína sensible al calcio.
  2. 2. El kit según la reivindicación 1, en el que V2R tiene la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID N°: 1, el canal de calcio dependiente de AMPc es un canal de iones CNG modificado que tiene la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID N°: 2 y la proteína sensible al calcio es apoaecuorina modificada que tiene la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID N°: 3.
  3. 3. El kit según la reivindicación 1, en el que el receptor de GLP-1 tiene la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID N°: 8, el canal de calcio dependiente de AMPc es un canal de iones CNG modificado que tiene la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID N°: 2 y la proteína sensible al calcio es apoaecuorina modificada que tiene la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID N°: 3.
  4. 4. El kit según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el canal de calcio dependiente de AMPc es un canal de iones CNG.
  5. 5. El kit según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la proteína sensible al calcio es apoaecuorina.
  6. 6. El kit según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el kit es para diagnosticar diabetes insípida o SIADH, para determinar cualquiera de una infusión de líquido hipotónico o hipertónico a seleccionar o para determinar el efecto de un fármaco terapéutico relacionado con GLP-1.
  7. 7. El kit según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la célula es una célula congelada.
  8. 8. El kit según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende además un sustrato luminiscente para la proteína sensible al calcio.
  9. 9. El kit según la reivindicación 8, en el que el sustrato luminiscente para la proteína sensible al calcio es coelenteracina o un derivado de coelenteracina.
  10. 10. Un método de diagnóstico de diabetes insípida o SIADH, un método de determinación de cualquiera de una infusión de líquido hipotónico o hipertónico a seleccionar o un método de determinación del efecto de un fármaco terapéutico relacionado con GLP-1, que comprende las siguientes etapas (1) a (3):
    (1) preparar una mezcla que contiene una célula que expresa un GPCR acoplado a G que es un receptor de GLP-1 o V2R, un canal de calcio dependiente de AMPc y una proteína sensible al calcio, un sustrato luminiscente para la proteína sensible al calcio, un medio sin Ca2+ y una muestra derivada de la sangre de un sujeto de prueba;
    (2) añadir una disolución que contiene Ca2+ a la mezcla preparada en (1); y
    (3) medir la luminiscencia de la proteína sensible al calcio emitida de la célula.
  11. 11. Un método de cribado de un antagonista de GPCR acoplado a G, que comprende las siguientes etapas (A') a (C'):
    (A') preparar una mezcla que contiene una célula que expresa un GPCR acoplado a G que es un receptor de GLP-1 o V2R, un canal de calcio dependiente de AMPc y una proteína sensible al calcio, un sustrato luminiscente para la proteína sensible al calcio, un medio sin Ca2+, un agonista de GPCR expresado en la célula y un compuesto de prueba;
    (B') añadir una disolución que contiene Ca2+ a la mezcla preparada en (A'); y
    (C') medir la luminiscencia de la proteína sensible al calcio emitida de la célula.
  12. 12. Un método de cribado de un antagonista de GPCR acoplado a G, que comprende las siguientes etapas (A") a (C"):
    (A") preparar una mezcla que contiene una célula que expresa un GPCR acoplado a G que es un receptor de GLP-1 o V2R, un canal de calcio dependiente de AMPc y una proteína sensible al calcio, un sustrato luminiscente para la proteína sensible al calcio, un medio que contiene Ca2+, un agonista de GPCR expresado en la célula y un compuesto de prueba;
    (B") añadir forskolina a la mezcla preparada en (A"); y
    (C") medir la luminiscencia de la proteína sensible al calcio emitida de la célula.
  13. 13. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, en el que V2R tiene la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID N°: 1, el canal de calcio dependiente de AMPc es un canal de iones CNG modificado que tiene la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID N°: 2 y la proteína sensible al calcio es apoaecuorina modificada que tiene la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID N°: 3.
    5 14. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, en el que el receptor de GLP-1 tiene la
    secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID N°: 8, el canal de calcio dependiente de AMPc es un canal de iones CNG modificado que tiene la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID N°: 2 y la proteína sensible al calcio es apoaecuorina modificada que tiene la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID N°: 3.
  14. 15. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14, en el que el canal de calcio dependiente de 10 AMPc es un canal de iones CNG.
  15. 16. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 15, en el que la proteína sensible al calcio es apoaecuorina.
    imagen1
    imagen2
    imagen3
    imagen4
    imagen5
    Figura 10
    imagen6
    concentración de AVP (pg/ml)
    imagen7
    Plasma Alta
    normal (10 pg/ml)
    Unidad relativa de luz
    imagen8
    URL
    Figura 13
    imagen9
    Figura 14
    imagen10
    5,E-07 5,E*08 5,E*09 5JE-10 6JE-11 5,E*12 OPC-41061 (M)
    —blanco ..A...OP041061
    imagen11
    imagen12
    imagen13
    6LP-1 (7-36 amida) pg/ml
    M1 •
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    Intensidad de luminiscencia (URL)
    Intensidad de luminiscencia (URL)
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    O o o o G
    imagen15
    Figura 22
    imagen16
    imagen17
    ELISA
    Método
    de CNG
    Forma activa de GLP-1 (7-36 amida) (pg/ml)
    imagen18
    GLP-I (1-37)
    GLP-1(7-37)
    GLP-1(7-36 Amida)
    000000
    oxmtomodulma
    O
    900000
    GLP-1(9-36 Amida)
    800000
    GLP-2
    700000
    glucacon
    600000 ‘3
    G P
    500000
    400000
    300000
    200000 §
    00000
    0000 100000
    1000
    pM)
    incretinas
    37)
    LP
    GLP-1(7-37)
    049
    36am¡da)
    3LP
    GLPH (9-i-35amida)
    0000(X
    30B5
    oxmtomodu i na
    00000<
    iLP-2
    glucagón
    4097
    GIP
    100000’
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    4000000
    500000
    1000000
    00000
    plasma humano
    plasma humano +
    inhibidor de DPPIV
    1400000
    n— tampon
    1200000
    1000000
    800000
    pOÜÜÜO
    400000
    200000
    imin)
    Figura 26
    =000000
    exenatida
    4500000
    GLP-1 (7-36 amida)
    000000
    ¿500000 K3Í
    000000
    1500000
    1,25
    imagen20
    imagen21
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