ES2686695T3 - Cetorreductasas - Google Patents

Abstract

Cetorreductasa que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 85% de identidad con la SEQ ID NO: 2, donde la cetorreductasa es capaz de reducir estereoselectivamente 4-cloro-3-oxobutanoato de etilo.

Description

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DESCRIPCION

Cetorreductasas

Las cetorreductasas (KRED, también llamadas “alcohol dehidrogenasas'” ADH o “carbonil reductasas”) catalizan la reducción de aldehídos y cetonas a los correspondientes alcoholes primarios y secundarios, respectivamente. Estas enzimas también son capaces de catalizar la reacción inversa, es decir la oxidación de alcoholes primarios y secundarios a los correspondientes aldehídos y cetonas, respectivamente.

La reducción de cetonas a alcoholes secundarios es de gran interés para aplicaciones industriales, ya que los compuestos carbonilos pro-quirales se reducen estereoselectivamente para obtener alcoholes quirales. En algunas aplicaciones industriales, también es deseable la conversión estereoselectiva de alcoholes secundarios a cetonas para la resolución quiral de compuestos racémicos, esto es para permitir el aislamiento de enantiómeros. La oxidación enzimática de alcoholes primarios a aldehídos y la reducción enzimática de aldehídos a alcoholes primarios con frecuencia se considera de menor relevancia en aplicaciones industriales, pero también se catalizan con KRED. El uso de un mismo KRED para la reacción de oxidación o reducción, respectivamente, se puede ver influido por el ajuste del equilibrio químico de la reacción enzimática.

La reducción catalizada por KRED requiere un cofactor reducido como donador de electrones. Algunas KRED utilizan dinucleótidos de adenina y nicotinamida reducidos (NADH) como cofactor, otras KRED utilizan fosfatos de dinucleótido de adenina y nicotinamida reducidos (NADPH) y ciertas cetorreductasas aceptan ambos, NADH y NADPH. Por tanto, la oxidación catalizada por KRED requiere un cofactor oxidado como aceptor de electrones. Para esta reacción, las KRED utilizan el dinucleótido de adenina y nicotinamida oxidado (NaD+) o fosfato de dinucleótido de adenina y nicotinamida (NADP+) o ambos, NAD+ y NADP+.

Las KRED son enzimas ubicuas que se encuentran en todos los reinos de la vida. Las KRED bien conocidas comerciales se derivan de hígado de caballo (HLADH), levadura de pan (YADH) y bacterias, como Thermoanaerobium brockii (TBADH) y Lactobacillus kefir (LKADH).

Según su identidad de secuencia y sus características bioquímicas, las KRED pueden clasificarse en diferentes familias proteínicas. Los miembros pertenecientes a la familia SDR (Deshidrogenasa/Reductasa de cadena corta) tienen enzimas de cadena corta sin ningún ion metálico. Por el contrario, los miembros de la familia MDR (Deshidrogenasa/Reductasa de cadena media) tienen enzimas de cadena de tamaño dependientes de Zn2+. Otro grupo de KRED tiene enzimas de cadena larga que dependen de Fe2+ (véase K. Drauz, H. Groger, O. May, Ezyme Catalysis in Organic Synthesis, Wiley VCH, Weinheim, 2012).

Para aplicaciones industriales, es deseable utilizar KRED de actividad y estereoselectividad altamente específica. Otro criterio importante para el uso industrial de las KRED es también su estabilidad de proceso a largo plazo, que con frecuencia se relaciona con una alta estabilidad a altas temperaturas y una gran estabilidad frente a disolventes. Si los sustratos ya son quirales, también es deseable utilizar KRED de alta estereoespecificidad.

La ingeniería enzimática permite perfeccionar enzimas. Esta técnica implica desarrollar variantes de una enzima de partida con características mejoradas (véase S. Lutz, U.T. Bornscheuer, Protein Engineering Handbook, Wiley VCH, Weinheim, 2009).

La utilización in vitro de KRED en procesos de reducción requiere un sistema de regeneración para el NAD(P)H. Sistemas de regeneración habituales son glucosa deshidrogenasa (GDH) o formiato deshidrogenasa, que se aplican junto con las KRED. La regeneración de cofactores también puede hacerse mediante la KRED misma, por oxidación concomitante de un cosustrato (a menudo alcoholes primarios o secundarios, por ejemplo oxidación de isopropanol a acetona). El uso concomitante de las KREd como catalizadores de reducción y sistemas de regeneración de cofactores requiere la aceptación concurrente de un ceto sustrato y el cosustrato para la regeneración de cofactores. La selección de un cosustrato específico puede depender de la actividad específica de la KRED para ese cosustrato y de la estabilidad de la KRED bajo las condiciones específicas de regeneración del cofactor.

Además de la reducción reversible de aldehídos, existen pocos estudios referidos a la catálisis por cetorreductasas de la oxidación de aldehídos para obtener los correspondientes ácidos. Sin embargo, esta reacción se considera más como una reacción secundaria y no como la función principal (véase K. Drauz, H. Groger, O. May, Enzyme Catalysis in Organic Synthesis, Wiley VCH, Weinheim, 2012).

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Ejemplos de uso industrial de las KRED para generar compuestos valiosos son la reducción de 1 -fenil-2- acetona por la KRED de Rhodococcus erythroplis, la reducción de acetoacetato de etilo por la KRED de Lactobacillus brevis o la reducción de 6-benciloxi-3,5-dioxohexanoato de etilo por una KRED derivada de Acinetobacter calcoaceticus (véase: A. Liese, K. Seelbach, C. Wandrey, Industrial Biotransformations, Wiley VCH, Weinheim, 2006).

Incluso aunque en la literatura se describe un gran número de KRED que catalizan reducciones asimétricas, sólo unas pocas KRED se utilizan en procesos patentados. Muchos procesos contienen cetorreductasa de Lactobacillus kefir (LKADH) o variantes de la misma. El documento US 8.426.178 describe un proceso para la reducción estereoselectiva de N,N-dimetil-3-ceto-3-(2-tienil)-1-cetopropanoamina a (S)-N,N-dimetil-3-hidroxi-3- (2-tienil)-1-propanoamina mediante variantes de LKADH. La US 8.512.973 describe un proceso para la reducción estereoselectiva de una acetofenona 2',6'-sustituida al correspondiente (S)-1-fenetanol sustituido mediante variantes de KRED de Lactobacillus kefir, Lactobacillus brevis o Lactobacillus manor. En la US 7.977.078 se describe un método para la reducción estereoselectiva de 3-cetotiolano a (R)-3-hidroxitiolano mediante variantes de LKADH. La US 8.617.853 describe un proceso de reducción estereoselectiva del sustrato 2-[3-[3-[2-(7-cloro-2-quinolinil)etenil]fenil]-3-oxopropil]benzoato de metilo a (S,E)-metil-2-(3-(3-(2-(7- cloroquinolin-2-il)vinil)fenil)-3-hidroxipropil)benzoato mediante variantes de KRED de Lactobacillus brevis, Lactobacillus kefir o Lactobacillus manor. La US 8.273.554 describe un proceso para la reducción estereoselectiva de 5-((4S)-2-oxo-4-fenil(1,3-oxazolidin-3-il)-1-(4-fluorofenil)-pentano-1,5-diona a (4S)-3-[(5S)- 5-(4-fluorofenil)-5-hidroxipentanoil]-4-fenil-1,3-oxazolidin-2-ona mediante variantes de LKADH. La US 6.645.746 describe un método para la reducción asimétrica de (S)-6-cloro-5-hidroxi-3-oxohexanoato de terc- butilo a (3R,5S)-6-cloro-3,5-dihidroxihexanoato de terc-butilo mediante la cetorreductasa de Candid magnolia. La US 7.393.667 describe la preparación de 2-propanoles, como 1-[4-(4-halo-2-metil-1H-indol-5-iloxi)-5-metil- pirrolo[2.1-f][1,2,4]triacin-6-iloxi]propan-2-ol mediante reducción estereoselectiva de un compuesto oxo correspondiente utilizando cetorreductasa de Pichia angusta. La US 8.288.131 se refiere a un método para la reducción estereoselectiva de 2-metilpentanal a (R)-2-metilpentanol mediante variantes de LKADH. La WO 2011/022548 describe un método para la conversión estereoselectiva de 1-(3-hidroxifenil)-2- (metilamino)etanona a (R)-fenilefrina mediante variantes de LKADH. En la WO 2012/046254 se describe un proceso de reducción enzimática estereoselectiva de 4-oxo-4-[3-(trifluorometil)-5,6-dihidro[1,2,4]triazolo[4,3- a]pirazin-7(8H-il)-1-(2,4,5-trifluorofenil)butan-2-ona para la preparación de (S) ó (R)-3-hidroxi-1-(3- (trifluorometil)-5,6-dihidro-[1,2,4]triazolo[4,3-a]pirazin-7(8H)-il)-4-(2,4,5-trifluorofenil)butan-1-ona con KRED de Saccharomyces cerevisiae, Rhodotorula rubra, Pichia methanolica o E. coli. La US 8.257.952 describe variantes de LKADH capaces de reducir estereoselectivamente 2-benzamidometil-3-oxobutirato de metilo a (2R,3R)-metil-2-benzamidometil-3-hiroxibutirato. La US 7.629.157 describe variantes de cetorreductasas de Candida magnolia capaces de convertir estereoselectivamente 4-cloroacetoacetato de etilo en (S)-4-cloro-3- hidroxibutirato de etilo.

La EP 1 553 170 se refiere a un polipéptido formador de (R)-N-bencil-3-pirrolidinol, un polinucleótido que codifica para dicho polipéptido y su uso. Se indica que el polipéptido tiene las siguientes características físicas y químicas (1) a (4): (1) actividad: actúa sobre N-bencil-3-pirrolidinona con NADH o NADPH como coenzima para formar (R)-N-bencil-3-pirrolidinol; (2) pH óptimo para la actividad: 5,5 a 6,0; (3) temperatura óptima para la actividad: 50°C a 55°C; (4) peso molecular: alrededor de 55.000, determinado por análisis de filtración en gel, alrededor de 28.000 determinado por electroforesis en gel de poliacrilamida sDs.

La base de datos de proteínas en línea ("Database Protein online”), n° de acceso WP_022887115, se refiere a una deshidrogenasa de cadena corta de Glaciibacter superstes.

Sin embargo, las cetorreductasas de la técnica anterior no son satisfactorias en todos los sentidos y existe una demanda de cetorreductasas con ventajas en comparación con las cetorreductasas convencionales, en particular en lo que se refiere a una alta estabilidad de procesado para la producción industrial de compuestos alcohólicos quirales y una buena actividad de regeneración del cofactor, respectivamente. En este sentido, la alta estabilidad de proceso en aplicaciones industriales pueden incluir una estabilidad química y física y una actividad enzimática en entornos acuosos, no acuosos y/o en sistemas bifásicos, y/o con altas concentraciones de sustrato y/o a temperaturas elevadas y/o con adición de disolventes miscibles con agua y/o un amplio rango de pH desde 4-11 y/o en soportes sólidos (es decir inmovilizadas) y/o bajo altas fuerzas de cizalladura (por ejemplo producidas por agitación, bombeo, filtración con membrana). Otros factores, como la selectividad de sustrato, Km, la actividad específica, la estereoselectividad, estereoespecificidad, diastereoselectividad, regioselectividad, inhibición de sustrato, inhibición de producto, inhibición por otros factores, por ejemplo componentes del extracto en bruto, contaminantes del sustrato o subproductos y la capacidad de expresión soluble recombinante en un huésped adecuado pueden jugar un papel importante. Cuando el sustrato es un sustrato quiral, es decir que contiene ya uno o más centros quirales y/o ejes en sí, puede ser deseable que la estereoselectividad de la reducción enzimática de un grupo carbonilo pro-quiral contenido en dicho sustrato quiral no se vea esencialmente afectada por dicho uno o más centros quirales y/o ejes.

Un objetivo de la invención proporcionar cetorreductasas perfeccionadas.

Este problema se ha resuelto por el objeto de las reivindicaciones de la patente.

La invención proporciona nuevas cetorreductasas, en particular cetorreductasas diseñadas que muestran características mejoradas en comparación con la enzima de tipo silvestre, preferiblemente la cetorreductasa de 5 tipo silvestre de sEq ID NO:2.

Un primer aspecto de la invención se refiere a una cetorreductasa que comprende una secuencia de aminoácidos con una homología de al menos un 72% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2.

La cetorreductasa según la invención comprende esta secuencia de aminoácidos con una homología definida con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2. Esto significa que la cetorreductasa según la invención 10 puede comprender dicha secuencia de aminoácidos como una subsecuencia de su secuencia de aminoácidos completa o que la cetorreductasa según la invención puede esencialmente consistir en dicha secuencia de aminoácidos. Cuando la cetorreductasa según la invención comprende dicha secuencia de aminoácidos como una subsecuencia de su secuencia de aminoácidos completa, dicha secuencia de aminoácidos completa puede extenderse, es decir puede comprender residuos adicionales de aminoácidos en el extremo N y/o el extremo 15 C de dicha subsecuencia. Esta extensión puede ser ventajosa, por ejemplo cuando la cetorreductasa debe inmovilizarse en un soporte sólido, por ejemplo con propósitos de purificación.

En el sentido de la invención, preferentemente la homología se calcula como identidad utilizando BLASTP (Stephen F. Altschul, Thomas L. Madden, Alejando A. Schaffer, Kinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller y David J. Lipman (1997) “Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search 20 programs”, Nucleic Acids, Res. 25:3389-3402; Stephen F. Altschul, John C. Wootton, E. Michael Gertz, Richa Agarwala, Aleksandr Morgulis, Alejandro A. Schaffer y Yi-Kuo Yu (2005) “Protein database searches using compositionally adjusted substitution matrices” FEBS J. 272-5101-5109), preferiblemente utilizando la versión BLASTP 2.2.29+ (
http://blast.ncbi.nlm.nih.govBlast.cgi), preferiblemente utilizando los siguientes ajustes:

• Campo “Entrar Secuencia Consultada”: Subrango consultado: ninguno

25» Campo “Seleccionar Conjunto de Búsqueda”: Base de datos: Secuencias proteínicas no redundantes (nr); parámetros opcionales: ninguno

• Campo “Selección de Programa”: algoritmo: blastp (proteína-proteína BLAST).

• Parámetros de algoritmo: Campo “Parámetros Generales”: Secuencias Diana Máx: 100; consultas cortas: Ajuste automático de parámetros para secuencias de entrada cortas; umbral previsto: 10; tamaño de palabra:

30 3; máx, de coincidencias en un rango de consultas: 0.

• Parámetros de algoritmo; Campo “Parámetros de Puntuación”: Matriz: BLOSUM62; Costo del gap: Existencia: 11 Extensión 1; Ajustes de composición: Ajuste de matriz de clasificación de composición condicional.

• Parámetros de algoritmo: Campo “Filtros y enmascaramiento”: Filtro: ninguno; máscara: ninguno.

Preferentemente, la cetorreductasa según la invención es capaz de reducir estereoselectivamente ceto- 35 sustratos a alcoholes secundarios y/o de oxidar alcoholes secundarios a ceto-productos.

Preferentemente, las cetorreductasas según la invención son capaces de oxidar alcoholes primarios a aldehídos y/o de reducir aldehídos a alcoholes primarios.

En algunas realizaciones, las cetorreductasas según la invención son capaces de oxidar un compuesto aldehído a un ácido carboxílico.

40 Preferentemente, la cetorreductasa comprende una secuencia de aminoácidos con una homología de al menos un 72%, preferiblemente de al menos un 75%, o de al menos un 80% o de al menos un 82% o de al menos un 84%, con mayor preferencia de al menos un 86% o al menos un 88%, todavía con más preferencia de al menos un 90% o al menos un 91%, con especial preferencia de al menos un 92% o al menos un 93%, incluso mayor preferencia de al menos un 94% o al menos un 95%, con particular preferencia de al menos un 96% o al menos 45 un 97% y particularmente de al menos un 98% o al menos un 99% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2.

Sorprendentemente se ha descubierto que las cetorreductasas según la invención tienen:

- una gran actividad

- una amplia tolerancia de sustrato 50- una alta estereoselectividad

- una alta estereoespecificidad y/o

- una gran estabilidad en diferentes disolventes, opcionalmente conteniendo co-sustratos tales como isopropanol.

Para el propósito de la descripción, la estereoselectividad es la propiedad de una reacción química por la que un único reactivo forma una mezcla desigual de estereoisómeros durante la creación no-estereoespecífica de 5 un nuevo estereocentro o durante la transformación no-estereoespecífica de uno previamente existente. La selectividad se produce típicamente por diferencias en efectos estéricos y electrónicos en las rutas mecanicistas que conducen a diferentes productos. Preferentemente, la conversión de un sustrato a un producto quiral bajo catálisis de la cetorreductasa según la invención proporciona el producto quiral deseado con un exceso enantiomérico de como mínimo un 50%ee, en especial como mínimo del 75%ee, con mayor 10 preferencia como mínimo del 90%ee, todavía con mayor preferencia como mínimo del 95%ee, con especial

preferencia como mínimo del 97%ee, con mayor preferencia como mínimo del 98%ee y en particular como

mínimo del 99%ee.

Para el propósito de la descripción, la estereoespecificidad es la propiedad de un mecanismo de reacción que conduce a diferentes productos de reacción estereoisoméricos a partir de diferentes reactivos

15 estereoisoméricos o que ser produce solamente sobre uno (o un subconjunto) de estereoisómeros.

Preferentemente, la conversión del sustrato quiral en otro producto quiral bajo catálisis de la cetorreductasa según la invención proporciona el producto quiral deseado con un exceso diastereomérico de como mínimo el 50%ed, en especial de como mínimo el 75ed, todavía con mayor preferencia como mínimo del 90%ed, con especial preferencia como mínimo del 95%ed, con particular preferencia como mínimo del 97%ed, con muy 20 especial preferencia como mínimo del 98%ed y en particular como mínimo del 99%ed.

En una realización preferente, la cetorreductasa según la invención puede reducir preferiblemente estereoselectivamente un ceto-sustrato de fórmula general (I)

O

imagen1

(I)

a un alcohol secundario, o la cetorreductasa según la invención es capaz de reducir preferentemente de modo 25 estereoespecífico un sustrato aldehido de fórmula general (I’)

O

imagen2

(I1)

a un alcohol primario,

donde X e Y se seleccionan, cada uno independientemente, de grupos hidrocarburo alifático o alicíclicos (Ci- 12), saturado o insaturado, no sustituido o mono- o polisustituido; grupos hidrocarburo aromático (C6-10) no

30 sustituido o mono- o polisustituido, opcionalmente unido a la fracción CO mediante grupos hidrocarburo alifático (C1-12) saturado o insaturado, no sustituido o mono- o polisustituido; grupos hidrocarburo heteroaromáticos, no sustituidos o mono- o polisustituidos, opcionalmente unidos a la fracción CO mediante grupos hidrocarburo alifático(C1-12) saturados o insaturados, no sustituidos o mono- o polisustituidos; y grupos de azúcar o desoxiazúcares que comprenden en cada caso mono-, di- u oligosacáridos,

35 donde mono- o polisustituido significa sustituido independientemente con uno o más grupos funcionales seleccionados de -halo, -OH, =O, -O-alquilo(C1-12), -O-arilo(C6-10), -O-heteroarilo, -OCO-alquilo(C1-12), -OCO- arilo(Ca-10), -OCO-heteroarilo, -SH, -S-alquilo(C1-12), -S-arilo(Ca-10), -S-heteroarilo, -S(=O)1-2OH, -NO, -NO2, -N3, -NH2, -NH(alquilo(Ci-i2)), -N(alquilo(Ci.i2»2, -NH(arilo(Ca-i0)), -N(arilo(Ca-i0»2, -NH(heteroarilo), -

N(heteroarilo)2, -CN, - CHO, - CO2H, CO-alquilo(C1-2), -CO-arilo(Ca-10) y -CO-heteroarilo.

40 Preferentemente, X e Y se seleccionan independientmente de alquilo(Ci-i2) no sustituido o mono- o polisustituido; arilo(Ca-i0) no sustituido o mono- o polisustituido, opcionalmente unido a la fracción CO mediante

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grupos alquileno(Ci-i2) no sustituidos o mono- o polisustituidos; heteroarilo no sustituido o mono- o polisustituido, opcionalmente unido a la fracción CO mediante un grupo alquileno(Ci-i2) no sustituido o mono- o polisustituido; y grupos de azúcar o desoxiazúcar, en cada caso comprendiendo mono-, di- u oligosacáridos;

donde mono- o polisustituido significa sustituido independientemente con uno o más grupos funcionales seleccionados de-halo, -OH, =O, -O-alquilo(C1-12), -O-arilo(C6-10), -O-heteroarilo, -OCO-alquilo(C1-12), -OCO- arilo(Ca-10), -OCO-heteroarilo, -SH, -S-alquilo(C1-12), -S-arilo(C6-10), -S-heteroarilo, -S(=O)1-2OH, -NO, -NO2, -N3, -NH2, -NH(alquilo(Ci-i2)), -N(alquilo(Ci-i2))2, -NH(arilo(Ca-io)), -N(arilo(Ca-io))2, -NH(heteroarilo), -

N(heteroarilo)2, -CN, - CHO, - CO2H, CO-alquiío(Ci_2), -CO-arilo(Ca-io) y -CO-heteroarilo.

Para el propósito de la descripción, capaz de reducir preferiblemente de modo estereoselectivo un ceto-sustrato significa que, en presencia de un cofactor apropiado, bajo condiciones adecuadas (preferiblemente en agua a un pH de 7,0 y a 37°C), la cetorreductasa presenta al menos cierta actividad frente a al menos un ceto-sustrato, dando lugar a un alcohol secundario.

Para el propósito de la descripción, grupos hidrocarburo alifáticos(Ci-i2) saturados o insaturados incluyen, sin limitación, alquilo, alquenilo o alquinilo, tales como -CH3, -CH2CH3, -CH2CH2CH3, -CH(CH3)2, -CH(CH3)CH2CH3, -CH2CH(CH3)2, -C(CH3)3, -CH=CH2, -CH=CHCH=CH2, -CeCH y -CH=CHC=CH.

CH CH CH CH ,

Para el propósito de la descripción, los grupos hidrocarburo alicíclicos (C1-12) saturados o insaturados incluyen, sin limitación, cicloalquilo(C3-i2), donde 1 ó 2 átomos del anillo de carbono pueden sustituirse opcionalmente por heteroátomos seleccionados de N, O y S (heterocicloalquilo(Ci-i2)).

Para el propósito de la descripción, grupos hidrocarburo aromáticos (Ca-10) (= arilo(Ca-io)) incluyen, sin limitación, fenilo y naftilo.

Para el propósito de la descripción, los grupos hidrocarburo heteroaromáticos (= heteroarilo) incluyen, sin limitación, sistemas de anillo monocíclicos, bicíclicos y tricíclicos. Ejemplos de heteroarilos monocíclicos incluyen, sin limitación, acetidinilo, acepanilo, aziridinilo, diazepinilo, 1,3-dioxolanilo, dioxanilo, ditianilo, furilo, imidazolilo, imidazolinilo, imidazolidinilo, isotiazolilo, isotiazolinilo, isotiazolidinilo, isoxazolilo, isoxazolinilo, isoxazolidinilo, morfolinilo, oxadiazolilo, oxadiazolinilo, oxadiazolidinilo, oxazolilo, oxazolinilo, oxazolidinilo, piperazinilo, piperidinilo, piranilo, pirazinilo, pirazolilo, pirazolinilo, pirazolidinilo, piridinilo, pirimidinilo, piridazinilo, pirrolilo, pirrolinilo, pirrolidinilo, tetrahidrofuranilo, tetrahidrotienilo, tetrazinilo, tetrazolilo, tiadiazolilo, tiadiazolinilo, tiadiazolidinilo, tiazolilo, tiazolinilo, tiazolidinilo, tienilo, tiomorfolinilo, 1,1-dioxidotiomorfolinilo (tiomorfolinsulfona), tiopiranilo, triazinilo, triazolilo y tritianilo. Ejemplos de heteroarilos bicíclicos incluyen, sin limitación, benzimidazolilo, benzodioxinilo, benzotiazolilo, benzotienilo, benzotriazolilo, benzoxazolilo, benzofuranilo, benzopiranilo, benzotiopiranilo, cinnolinilo, indazolilo, indolilo, 2,3-dihidroindolilo, indolizinilo, naftiridinilo, isobenzofuranilo, isobenzotienilo, isoindolilo, isoquinolinilo, ftalazinilo, 4H-pirido(1,2-a)pirimidin-4- ona, piranopiridinilo, quinolinilo, quinolizinilo, quinoxalinilo, quinazolinilo, tetrahidroisoquinolinilo, tetrahidroquinolinilo y tiopiranopiridinilo. Ejemplos de heteroarilos tricíclicos incluyen, sin limitación, acridinilo, carbozolilo, carbolinilo, dibenzo(b,d)furanilo, dibenzo(b,d)tienilo, nafto(2,3-b)furano, nafto(2,3-b)tienilo, fenazinilo, fenotiazinilo, fenoxazinilo, tiatrenilo, tioxantenilo y xantenilo.

Para el propósito de la descripción, mono- o polisustituido con relación con alquilo (por ejemplo -alquilo(C1-12)), cicloalquilo (por ejemplo -cicloalquilo(C3-8)), arilo (por ejemplo -arilo(Ca-1o)) y heteroarilo respectivamente, preferentemente independientemente, significan el reemplazo de un hidrógeno del núcleo por uno o más grupos funcionales seleccionados entre -halo (preferiblemente -F, -Cl, -Br, -I), -OH, =O, -O-alquilo(C1-12), -O-arilo(Ca- 10), -O-heteroarilo, -OCO-alquilo(C1-12), -OCO-arilo(Ca-1o), -OCO-heteroarilo, -SH, -S-alquilo(C1-12), -S-arilo(Ca- 10), -S-heteroarilo, -S(=O)1-2OH, -NO, -NO2, -N3, -NH2, -NH(alquilo(C1-12)), -N(alquilo(C1-12))2, -NH(arilo(Ca-1o)), - N(arilo(Ca-1o))2, -NH(heteroarilo), -N(heteroarilo)2, -CN, - cHo, - CO2H, CO-alquilo(C1-2), -CO-arilo(Ca-10) y -CO- heteroarilo.

Para el propósito de la descripción, grupos de azúcar o desoxiazúcar, que comprenden en cada caso mono-, di- u oligosacáridos, significan que el sustrato ceto de fórmula general (I) o el sustrato aldehído de fórmula general (I') pueden ser un compuesto polihidroxicarbonilo, opcionalmente unido a otros compuestos polihidroxicarbonilo mediante enlaces acetal y/o cetal. Por ejemplo, cuando X es un alquilo(C1) monosustituido con -OH e Y es un alquilo(C2) polisustituido con -OH, donde cada átomo de carbono lleva un único sustituyente -OH, el sustrato ceto de fórmula general (I) es una cetotetrosa que comprende ambos enantiómeros, D- eritrulosa y L-eritrulosa. De modo análogo, el sustrato ceto de fórmula general (I) puede ser una cetopentosa o una cetohexosa, que a su vez pueden estar unidas a otros grupos de azúcar formando así disacáridos u oligosacáridos. Correspondientemente, cuando X es un alquilo(C2) polisustituido con -OH, donde cada átomo de carbono lleva un solo sustituyente -OH, el sustrato aldehído de fórmula general (I') es una aldotriosa que comprende ambos enantiómeros, D-glicerinaldehído y L-glicerinaldehído. De modo análogo, el sustrato

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aldehido de fórmula géneral (I') puede ser una aldotetrosa, aldopentosa o una aldohexosa, que a su vez pueden estar unidas a otros residuos de azúcar formando así disacáridos u oligosacáridos.

En una realización preferente, la cetorreductasa según la invención es capaz de reducir estereoselectivamente un sustrato ceto seleccionado del grupo consistente en:

i) derivados de 3-aril-3-cetopropanoamina de acuerdo con la fórmula general (II)

imagen3

donde

R1 y R2 se seleccionan, cada uno independientemente, del grupo consistente en -H; -alquilo(C1_12) no sustituido o mono- o polisustituido; -cicloalquilo(C3-8) no sustituido o mono- o polisustituido; -arilo(Ca-10) no sustituido o mono- o polisustituido, opcionalmente unido a través un grupo hidrocarburo alifático(Ci_i2) saturado o insaturado, no sustituido o mono- o polisustituido; o heteroarilo no sustituido o mono- o polisustituido, opcionalmente unido mediante un grupo hidrocarburo alifático(Ci-i2) saturado o insaturado, no sustituido o mono- o polisustituido, donde

Ri y R2, junto con el átomo de nitrógeno al que están conectados, forman un anillo heterocicloalquilo(C2-8) no sustituido o mono- o polisustituido o un anillo heteroarilo no sustituido o mono- o polisustituido; preferiblemente, Ri y R2 son alquilo(Ci-i2), con mayor preferencia -CH3;

R3, R4, R5 y Ra se seleccionan, cada uno indpenedientemente, de -H; alquilo(Ci-i2) no sustituido o mono- o polisustituido; o donde R3 y R4 juntos son =O; preferentemente R3 y R4 juntos son =O, y R5 y Ra son -H; y

R7 es arilo(Ca-io) no sustituido o mono- o polisustituido; o -heteroarilo no sustituido o mono- o polisustituido; preferentemente R7 es un heteroarilo no sustituido o mono- o polisustituido; con mayor preferencia un heteroarilo no sustituido; en especial tienilo; en particular 2-tienilo;

donde un sustrato cetopropanoamina

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ceto particularmente preferente de este tipo es N,N-dimetil-3-ceto-3-(2-tienil)-1-

donde otro sustrato ceto de este tipo particularmente preferente es N-monometil-3-ceto-3-(2-tienil)-1- cetopropanoamina

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ii) derivados de 5-hidroxi-3-oxohexanoato de acuerdo con la fórmula general (III)

donde

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R6 es -alquilo(Ci-i2) no sustituido o mono- o polisustituido; o -arilo(Ca-io) no sustituido o mono- o polisustituido, opcionalmente unido a un grupo hidrocarburo alifático(Ci-i2) saturado o insaturado, no sustituido o mono- o 5 polisustituido; preferiblemente R8 es -alquilo(C1_12), con mayor preferencia -C(CH3)3;

Rges -H; -halo (preferiblemente cloro, bromo, yodo); -CN; u OR11, donde R11 es hidrógeno o un grupo protector (como benziloxi); preferiblemente Rg es -halo ó -CN; con mayor preferencia -Cl ó -CN;

R10 es -H; -alquilo(Ci-i2) no sustituido o mono- o polisustituido, o -arilo(Ca-io) no sustituido o mono- o polisustituido, opcionalmente unido a un grupo hidrocarburo alifático(Ci_i2) saturado o insaturado, no sustituido 10 o mono- o polisustituido; preferentemente R10 es -H;

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donde un sustrato ceto de este tipo particularmente preferente es (5S)-6-cloro-5-hidroxi-3-oxohexanoato de terc-butilo

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donde un sustrato ceto de este tipo particularmente preferente es (5R)-6-ciano-5-hidroxi-3-oxohexanoato de terc-butilo

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20 R12, R13, R14, R15 y Ría se seleccionan independientemente del grupo consistente en -H; -halo (preferiblemente

cloro, bromo e yodo); -alquilo(Cí-í2) no sustituido o mono- o polisustituido; -arilo(Ca-ío) no sustituido o mono- o polisustituido opcionalmente unido a través de un grupo hidrocarburo alifático(Cí-í2) saturado o insaturado, no sustituido o mono- o polisustituido; -heteroarilo no sustituido o mono- o polisustituido, opcionalmente unido a través de un grupo hidrocarburo alifático(Cí-í2) saturado o insaturado, no sustituido o mono- o polisustituido; y

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-OR18, donde R18 es -H, -alquilo(Ci_i2) no sustituido o mono- o polisustituido o -arilo(C6-io) no sustituido o mono- o polisustituido opcionalmente unido a través de un grupo hidrocarburo alifático(Ci-i2) saturado o insaturado, no sustituido o mono o polisustituido; preferentemente R12, R13, R14, R15 y R16 son, independientemente, -H, - halo u OR18; en especial -H, -Cl u OCH3;

R17 es -H, -halo (preferiblemente cloro, bromo e yodo); -alquilo(C1_12) no sustituido o mono o polisustituido; - arilo(C6-10) no sustituido o mono- o polisustituido, opcionalmente unido a través de un grupo hidrocarburo alifático(C1-12) saturado o insaturado, no sustituido o mono- o polisustituido; heteroarilo no sustituido o mono- o polisustituido, opcionalmente unido a través de un grupo hidrocarburo alifático(C1_12) saturado o insaturado, no sustituido o mono- o polisustituido; -OR19, -NH2, -NHR19 o NR19R20, donde R19 y R20 se seleccionan en cada caso independientemente de entre -alquilo(C1-12) no sustituido o mono- o polisustituido; -arilo(C6-10) no sustituido o mono- o polisustituido, opcionalmente unido a través de un grupo hidrocarburo alifático(C1-12) saturado o insaturado, no sustituido o mono- o polisustituido; o heteroarilo no sustituido o mono- o polisustituido, opcionalmente unido a través de un grupo hidrocarburo alifático(C1-12) saturado o insaturado, no sustituido o mono- o polisustituido; preferentemente R17 es -H;

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iv) derivados de benzoilo de acuerdo con la fórmula general (V)

O

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(V)

donde

R21 y R22 se seleccionan independientemente entre arilo(C6-10) no sustituido o mono- o polisustituido y heteroarilo no sustituido o mono- o polisustituido; preferentemente R21 es -arilo(C6-10) no sustituido o mono- o polisustituido y R22 es heteroarilo no sustituido o mono- o polisustituido; con mayor preferencia R21 es -arilo(C6- 10) no sustituido y R22 es heteroarilo no sustituido;

donde un sustrato ceto de este tipo particularmente preferente es fenil-(2-piridil)-metanona

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5 R23 y R24 se seleccionan independientemente del grupo consistente en -H y alquilo(Ci-i2); y preferentemente

R23 es -CH2CH3 y R24 es alquilo(C1_12); en especial R23 es -CH2CH3 y R24 es -CH3;

donde un sustrato ceto de este tipo particularmente preferente es etilsecodiona (etil-3-metoxi-8,14-secogona- 1,3,5(10),9(11)-tetraeno-14,17-diona).

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vi) 3-quinuclidona (es decir 1-azabiciclo[2.2.2]octan-3-ona);

vii) 4-cloro-3-oxobutanoato de etilo;

viii) 3-oxo-3-fenilpropanoato de etilo y

ix) Cetosa, preferiblemente cetotetrosa, cetopentosa o cetohexosa;

15 o la cetorreductasa según la invención es capaz de reducir preferiblemente de modo estereoespecífico un sustrato aldehído selesscionado del grupo consistente en

x) 2-butanal (sinónimo de isobutiraldehído) (debido a que este sustrato ceto es un aldehido no-proquiral, la reducción no se produce de modo estereoselectivo); y

xi) 1-heptanal (debido a que este sustrato ceto es un aldehído no proquiral, la reducción no se produce de 20 modo estereoselectivo);

donde en cada caso mono- o polisustituido significa sustituido independientemente con uno o más grupos funcionales seleccionados de -halo, -OH, -O-alquNo(C-M2), -O-arilo(C6-1o), -O-heteroarilo, -OCO-alquNo(C-M2), - OCO-arilo(C6-1o), -OCO-heteroarilo, -SH, -S-alquNo(C-M2), -S-arilo(C6-1o), -S-heteroarilo, -S(=O)-i_2OH, -NO, -

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NO2, -N3, -NH2, -NH(alquilo(Ci-i2)), -N(alquilo(C-M2))2, -NH(arilo(Ca-io)), -N(arilo(C6-10))2, -NH(heteroarilo), - N(heteroarilo)2, -CN, - cHo, - CO2H, CO-alquilo(Ci-2), -CO-arilo(C6-io) y -CO-heteroarilo.

En algunas realizaciones de la invención, las cetorreductasas según la invención son capaces de reducir sustratos aldehído o capaces de reducir preferiblemente de modo estereoselectivo sustratos ceto de acuerdo con las fórmulas generales (I) a (VI), o 3-quinuclidona o 4-cloro-3-oxobutanoato de etilo, 3-oxo-3- fenilpropanoato de etilo, 2-butanal o 1-heptanal, según se define más arriba, para obtener los respectivos alcoholes primarios o secundarios. En algunas realizaciones de la invención, las cetorreductasas según la invención son capaces de oxidar sustratos aldehído, por ejemplo 2-butanal o 1-heptanal, para obtener los correspondientes ácidos carboxílicos.

En algunas realizaciones, las cetorreductasas según la invención son capaces de reducir

estereoselectivamente derivados de 3-aril-3-cetopropanoamina de acuerdo con la fórmula general (II), preferiblemente N,N-dimetil-3-ceto-(2-tienil-1-cetopropanoamina a preferentemente (1S)-3-(dimetilamino)-1-(2- tienil)propan-1-ol. Ejemplos de tales cetorreductasas comprenden una secuencia de aminoácidos de acuerdo con las SEQ ID NO: 47, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 62, 72, 85, 86, 87, 88 u 89; preferiblemente las SEQ ID NO: 55, 58 u 87 y con mayor preferencia la SEQ ID NO: 58.

En algunas realizaciones, las cetorreductasas según la invención son capaces de reducir

estereoselectivamente derivados de 3-aril-3-cetopropanoamina de acuerdo con la fórmula general (II), preferiblemente N-monometil-3-ceto-3-(2-tienil)-1-cetopropanoamina, para obtener preferiblemente (1S)-3- (metilamino)-1-(2-tienil)propan-1-ol. Ejemplos de tales cetorreductasas comprenden una secuencia de aminoácidos de acuerdo con las SEQ ID No: 19, 28, 40, 46, 47, 49, 50, 55, 56, 57, 58, 59, 62, 64, 67, 72, 81, 82, 83, 85, 86, 87, 88, 89, 92 o 93, preferiblemente las SEQ ID NO: 58, 87 o 92 y con de mayor preferencia la SEQ ID NO: 87.

En algunas realizaciones, las cetorreductasas de acuerdo con la invención son capaces de reducir estereoselectivamente derivados de 5-hidroxi-3-oxohexanoato de acuerdo con la fórmula general (III), de preferencia (5S)-6-cloro-5-hidroxi-3-oxohexanoato de terc-butilo, para obtener preferiblemente (3R,5S)-6-cloro- 3,5-dihidroxihexanoato de terc-butilo. Ejemplos de tales cetorreductasas comprenden una secuencia de aminoácidos de acuerdo con las SEQ ID NO: 34, 36, 40, 49, 53, 54, 55, 60, 61, 62, 64, 65, 66, 67, 68, 70, 72,

73, 74, 75, 76, 77, 78, 81, 82, 83, 92, o 93, preferiblemente las SEQ ID NO: 62, 91 o 92 y con mayor preferencia

la SEQ ID NO: 91

En algunas realizaciones, las cetorreductasas de acuerdo con la invención son capaces de reducir estereoselectivamente derivados de 5-hidroxi-3-oxohexanoato de acuerdo con la fórmula general (III), de preferencia (5R)-6-ciano-5-hidroxi-3-oxohexanoato de terc-butilo, para obtener preferiblemente (3R,5R)-6- ciano-3,5-dihidroxihexanoato de terc-butilo. Ejemplos de tales cetorreductasas comprenden una secuencia de aminoácidos de acuerdo con las SEQ ID NO: 34, 36, 40, 49, 55, 60, 61, 62, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72,

73, 74, 75, 76, 77, 78, 81, 82, 83, 84, 92 o 93, preferiblemente las SEQ ID NO: 62, 91 o 92 y con mayor

preferencia la SEQ ID NO: 91.

En algunas realizaciones, las cetorreductasas de acuerdo con la invención son capaces de reducir estereoselectivamente derivados de acetofenona de acuerdo con la fórmula general (IV), de preferencia 1-(4- clorofenil)etanona para obtener 1-(4-clorofenil)etanol. Ejemplos de tales cetorreductasas comprenden una secuencia de aminoácidos de acuerdo con las SEQ ID NO: 7, 9, 12, 15, 17, 18, 23, 24, 28, 31, 36, 38, 39, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 58, 62, 72, 81, 82, 83, 87 o 92, preferiblemente las SEQ ID NO: 7, 15 o 28 y con mayor preferencia la SEQ ID NO: 28.

En algunas realizaciones, las cetorreductasas de acuerdo con la invención son capaces de reducir estereoselectivamente derivados de acetofenona de acuerdo con la fórmula general (IV), preferiblemente 1-(2- metoxifenil)etanona a 1-(2-metoxifenil)etanol. Ejemplos de tales cetorreductadas comprenden una secuencia de aminoácidos de acuerdo con las SEQ ID NO: 15, 17, 22, 24, 26, 36, 38, 40, 58, 60, 61, 62, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 75, 76, 77, 78, 81, 82, 83, 86, 92 o 93, preferiblemente las SEQ ID NO: 17, 72 o 92 y con mayor preferencia la SEQ ID NO: 72.

En algunas realizaciones, las cetorreductasas de acuerdo con la invención son capaces de reducir estereoselectivamente derivados de benzoilo de acuerdo con la fórmula general (V), de preferencia fenil-(2- piridil)-metanona a fenil-(2-piridil)-metanol. Ejemplos de tales cetorreductasas comprenden una secuencia de aminoácidos de acuerdo con las SEQ ID NO: 21, 24, 28, 36, 38, 39, 40, 44, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 81, 82, 83, 85, 86, 87, 88, 89, 92 o 93, preferiblemente las SEQ ID NO: 72, 82 o 92, con mayor preferencia la SEQ ID NO: 72.

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En algunas realizaciones, las cetorreductasas de acuerdo con la invención son capaces de reducir estereoselectivamente derivados de secodiona de acuerdo con la fórmula general (VI), de preferencia etilsecodiona (etil-3-metoxi-8,14-secogona-1,3,5(10),9(11)-tetraeno-14,17-diona) a preferiblemente etilseconol (etil-3-metoxi-8,14-secogona-1,3,5(10),9(11)-tetraeno-14-ona-17-l3-ol). Ejemplos de tales cetorreductasas comprenden una secuencia de aminoácidos de acuerdo con las SEQ ID NO: 61,62, 65, 66, 69, 70, 71, 75, 78,

82, 83, 86, 92 o 93, preferiblemente las SEQ ID NO: 69, 70 o 71 y con mayor preferencia la SEQ ID NO: 70.

En algunas realizaciones, las cetorreductasas de acuerdo con la invención son capaces de reducir estereoselectivamente el sustrato ceto 3-oxo-3-fenilpropanoato de etilo para obtener 3-hidroxi-3- fenilpropanoato de etilo. Ejemplos de tales cetorreductasas comprenden una secuencia de aminoácidos de acuerdo con las SEQ ID NO: 17, 34, 36, 40, 46, 47, 52, 60, 61, 62, 64, 65, 66, 25 67, 68, 70, 71,72, 73,

74, 75, 76, 77, 78, 81, 82, 83, 84, 92 o 93, preferiblemente las SEQ ID NO: 46, 76 o 78 y con mayor preferencia la SEQ ID NO: 76.

En algunas realizaciones, las cetorreductasas de acuerdo con la invención son capaces de reducir estereoselectivamente el sustrato ceto 4-cloro-3-oxobutanoato de etilo para obtener preferiblemente (3S)-4- cloro-3-hidroxibutanoato de etilo. Ejemplos de tales cetorreductasas comprenden una secuencia de aminoácidos de acuerdo con las SEQ ID NO: 2, 63 o 90.

En algunas realizaciones, las cetorreductasas de acuerdo con la invención son capaces de reducir estereoselectivamente el sustrato ceto 3-quinuclidona (sinónimo de clorhidrato de 1-azabiciclo[2.2.2]octan-3- ona) a 3-quinuclidinol (sinónimo de 1-azabiciclo[2,2,2]octan-3-ol). Ejemplos de tales cetorreductasas comprenden una secuencia de aminoácidos de acuerdo con las SEQ ID NO: 17, 21,26, 38, 40, 62, 72, 73, 81,

83, 86, 92 o 93, preferiblemente las SEQ ID NO: 17, 21 o 73, con mayor preferencia la SEQ ID NO: 17.

En algunas realizaciones, las cetorreductasas de acuerdo con la invención son capaces de oxidar un alcohol secundario para obtener la correspondiente cetona, por ejemplo oxidar 2-butanol a 2-butanal.

En algunas realizaciones, las cetorreductasa de acuerdo con la invención son capaces de oxidar un alcohol primario para obtener un compuesto aldehido, por ejemplo oxidar 1-heptanol a 1-heptanal.

En algunas realizaciones, las cetorreductasas de acuerdo con la invención son capaces de oxidar un compuesto aldehido para obtener un ácido carboxílico.

Preferentemente, la cetorreductasa de acuerdo con la invención es capaz de oxidar un cosustrato para regenerar cofactores con una alta actividad específica, preferiblemente una actividad específica de 0,1-100 U/mg, en especial 1-50 U/mg, y con mayor preferencia 10-12 U/mg de liofilizado de cetorreductasa. Cosustratos en el sentido de la invención son alcoholes primarios o secundarios convertidos (preferiblemente oxidados) por una cetorreductasa de acuerdo con la invención concomitantemente a la conversión (preferiblemente reducción) de un sustrato ceto.

Cosustratos adecuados previstos para la regeneración de cofactores pueden seleccionarse según su actividad específica preferiblemente del grupo consistente en isopropanol, 2-butanol, 2-pentanol, 2-hexanol y 2-heptanol. Preferentemente, la cetorreductasa de acuerdo con la invención convierte el isopropanol en acetona con una alta actividad específica. Un liofilizado de cetorreductasa se puede obtener, por ejemplo, mediante disrupción celular según se describe en el ejemplo 2 (véase más abajo) y liofilización subsiguiente del extracto bruto.

Para determinar la actividad de oxidación en relación a un cosustrato dado, la cetorreductasa de acuerdo con la invención se incuba, preferentemente en una solución tampón que contiene un 20% del cosustrato, por ejemplo isopropanol y un cofactor, por ejemplo 0,25 mM de NAD(P), a 30°C. La actividad de oxidación se determina midiendo la disminución de la absorbancia a 340 nm que resulta de la reducción de NAD(P). La cetorreductasa con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 tiene, bajo las condiciones específicas, una actividad específica de 10,5 U/mg de liofilizado de cetorreductasa para la oxidación en isopropanol.

Preferentemente, las cetorreductasas de acuerdo con la invención tienen una alta estabilidad en los cosustratos, de preferencia en isopropanol, 2-butanol, 2-pentanol, 2-hexanol y/o 2-heptanol. Preferiblemente después de 48h de incubación previa de la cetorreductasa a 30°C en un cosustrato acuoso al 50%, isopropanol, la cetorreductasa tiene una actividad residual de al menos un 1%, preferiblemente al menos un 10% o al menos un 20%, todavía más preferiblemente al menos del 30% o al menos del 40%, todavía con más preferencia de al menos un 50% o al menos un 60%, incluso con más preferencia de al menos un 70% o al menos un 80%, o con mayor preferencia de al menos un 85% o al menos un 90%, particularmente de al menos un 95% o al menos un 99%, con relación a la actividad antes de la incubación previa. A este respecto, la actividad residual en el sentido de esta invención describe la actividad residual cetorreductasa de una enzima después de la incubación previa con un cosustrato en comparación con la actividad después de la incubación previa sin el

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cosustrato. Para determinar la estabilidad en el cosustrato, incluyendo por ejemplo isopropanol. la cetorreductasa de acuerdo con la invención se incuba previamente en una disolución tampón, preferentemente a pH 9, conteniendo un 50% del cosustrato, por ejemplo isopopanol, a 30°C, durante 48 h, y la actividad enzimática de la cetorreductasa se compara con una enzima previamente incubada sin el cosustrato. La actividad residual de la cetorreductasa de acuerdo con la invención es del 100% cuando ambas actividades enzimáticas son idénticas: es decir, cuando no hay pérdida de actividad si se compara con la actividad con incubación previa sin cosustrato. En las condiciones descritas, la cetorreductasa con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2 muestra una actividad residual del 100%.

Una conversión eficiente de cosustratos por la cetorreductasa y la estabilidad de cetorreductasa en el cosustrato son de relevancia particular para la configuración de procesos industriales eficientes de reducción de sustratos ceto o aldehído con el fin de obtener alcoholes secundarios o primarios. La estabilidad de la cetorreductasa de la invención en un cosustrato y su capacidad de conversión de cosustratos de acuerdo con la invención también es relevante para la conversión inversa de alcoholes primarios y secundarios en sustrato ceto y aldehído.

En algunas realizaciones, la cetorreductasa de acuerdo con la invención muestra una mejor actividad específica, estabilidad térmica y/o estereoselectividad con el diseño de la SEQ ID NO:2.

Una mejor actividad específica de acuerdo con la invención se refiere a una actividad específica de una cetorreductasa diseñada por ingeniería que es mayor que la actividad específica de cetorreductasa no diseñada. Preferentemente, la actividad específica es como mínimo del 10%, como mínimo del 50%, como mínimo del 100%, como mínimo1,5 veces, como mínimo 2 veces, como mínimo 3 veces, como mínimo 5 veces, como mínimo 10 veces, como mínimo 20 veces, como mínimo 50 veces, como mínimo 100 veces, como mínimo 200 veces, como mínimo 300 veces, como mínimo 500 veces, como mínimo 700 veces, como mínimo 1000 veces, como mínimo 10.000 veces, como mínimo 100.000 veces mayor que la actividad específica de la cetorreductasa no diseñada. La actividad específica mejorada puede significar también que la cetorreductasa diseñada por ingeniería muestra una actividad determinada hacia el sustrato deseado, mientras que la cetorreductasa no diseñada no tiene una actividad significativa con dicho sustrato.

Una estabilidad térmica mejorada de acuerdo con la invención se refiere a una mayor actividad específica residual de una cetorreductasa de diseño por ingeniería después de una incubación de 48 h a 30°C en comparación con la cetorreductasa no diseñada de SEQ ID NO:2. Alternativamente una estabilidad térmica mejorada de acuerdo con esta invención se puede referir a la misma actividad específica residual de una cetorreductasa diseñada en comparación con la cetorreductasa no diseñada después de su incubación a una temperatura mayor o durante un tiempo más largo a la misma temperatura.

Una mejor estereoselectividad de acuerdo con la invención se refiere a un exceso enantiomérico del producto proporcionado mediante una cetorreductasa diseñada por ingeniería que es mayor que el exceso enantiomérico del producto proporcionado por la cetorreductasa no diseñada de SEQ ID NO:2. El exceso enantiomérico proporcionado por una cetorreductasa diseñada por ingeniería aumenta preferiblemente en como mínimo un 0,1% ee, como mínimo un 0,5%ee, como mínimo un 1%ee, como mínimo un 2%ee, como mínimo un 3%ee, como mínimo un 5%ee, como mínimo un 7%ee, como mínimo un 10%ee, como mínimo un 20%ee, como mínimo un 30%ee, como mínimo un 40%ee, como mínimo un 50%ee, como mínimo un 60%ee, como mínimo un 70%ee, como mínimo un 80%ee, como mínimo un 90%ee, como mínimo 95%ee, como mínimo 97%ee, como mínimo 98%ee, o como mínimo 99%ee, en comparación con la cetorreductasa no diseñada. La estereoselectividad mejorada también puede significar que la cetorreductasa diseñada por ingeniería tiene una cierta estereoselectividad hacia el producto quiral deseado, mientras que la cetorreductasa no diseñada no tiene ninguna estereoselectividad significativa hacia dicho producto quiral.

Preferentemente, la actividad específica mejorada de la cetorreductasa diseñada por ingeniería comparada con la cetorreductasa no diseñada de SEQ ID NO:2 se determina bajo condiciones de reacción normalizadas, típicamente a 30°C, en una solución tampón acuosa que contiene el sustrato, el cofactor, suplementos opcionales y cetorreductasa. Preferentemente, la solución tampón se selecciona del grupo consistente en 10200 mM Tris/HCl pH 7-9 que contiene 2 mM de MgCh, 10-200 mM de fosfato sódico/NaOH pH de 6-8, ó 10200 mM de trietanolamina/HCl pH 7-9. Preferentemente, el cofactor NADH se añade a una concentración final de entre 0,05 y 10 mM. El sustrato, que se añade preferiblemente a una concentración final entre 5 mM y 1M, preferentemente se selecciona del grupo consistente en 4-cloro3-oxobutanoato de etilo, 1-(4- clorofenil)etanona, 1-(2-metoxifenil)etanol, (5R)-6-ciano-5-hidroxi-3-oxohexanoato de terc-butilo, N,N-dimetil-3- ceto-3-(2-tienil)-1-cetopropanoamina, etilsecodiona (etil-3-metoxi-8,14-secogona-1,3,5(10),9(11)-tetraeno- 14,17-diona), (5S)-6-cloro-5-hidroxi-3-oxohexanoato de terc-butilo y N-monometil-3-ceto-3-(2-tienil)-1- cetopropanoamina, fenil-(2-piridil)-metanona, 3-oxo-3-fenilpropanoato de etilo, 3-quinuclidona, 2-butanal y 1- heptanal. Otros suplementos opcionales se seleccionan preferentemente del grupo consistente en 1-5% Triton™ X-100 (v/v) y 0,5 a 10% de DMSO (v/v). La cetorreductasa se añade, preferiblemente, como un extracto

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bruto sobrenadante. El extracto bruto se obtiene rompiendo el huésped de expresión que contiene la cetorreductasa y centrifugado subsiguiente para separar los desechos celulares y el sobrenadante del extracto bruto que contiene la cetorreductasa. La actividad específica se determina, de preferencia, midiendo la formación del producto, agotamiento del cofactor NADH reducido y/o agotamiento del sustrato. En caso de que la actividad específica se determine midiendo la formación del producto o agotamiento del sustrato, se puede aplicar un sistema de regeneración del cofactor (isopropanol o GDH/glucosa) en la reacción estándar. No se aplica ningún sistema de regeneración del cofactor en caso de que la actividad específica se determine midiendo el agotamiento del cofactor NADH reducido. En caso de aplicarse un sistema de regeneración del cofactor, se puede sustituir el cofactor NADH reducido por el cofactor NAD+ oxidado, que es reducido por el sistema de regeneración del cofactor.

La estereoselectividad mejorada de la cetorreductasa diseñada por ingeniería comparada con la cetorreductasa no diseñada por ingeniería de SEQ ID NO:2 se determina preferiblemente bajo condiciones de reacción estándar según se describe más arriba para la determinación de la actividad específica mejorada. Se aplica una analítica quiral para analizar el producto formado en la reacción.

La mejor estabilidad térmica de la cetorreductasa diseñada por ingeniería comparada con la cetorreductasa no diseñada por ingeniería de SED ID NO:2, se determina preferentemente incubando la cetorreductasa que contiene el extracto bruto durante 15 minutos a una temperatura dada (preferiblemente la temperatura a la que la cetorreductasa no diseñada por ingeniería de SEQ ID NO:2 muestra una actividad residual del 10%) en un ciclador PCR. A continuación se incuba el extracto bruto sobre hielo durante 30 minutos. Se separan las proteínas no solubles por centrifugado y el sobrenadante se analiza en cuanto a su actividad residual de cetorreductasa en un ensayo estándar de cetorreductasa. En este ensayo estándar se oxida un sustrato apropiado para la cetorreductasa, por ejemplo isopropanol, por ejemplo para obtener acetona, mediante la cetorreductasa, con la reducción concomitante de NAD+ a NADH (ya que ningún otro sustrato de cetorreductasa está presente en este ensayo estándar, isopropanol funciona como sustrato para la cetorreductasa y no se aplica para la regeneración del cofactor). El aumento de NADH se controla midiendo la absorción a 340 nm en un fotómetro estándar. El ensayo se realiza bajo condiciones de reacción estándar, es decir típicamente a 30°C en una solución tampón acuosa que contiene el sustrato (por ejemplo isopropanol), el cofactor y la cetorreductasa. Preferiblemente, la cetorreductasa se añade como sobrenadante del extracto bruto. El extracto bruto se obtiene rompiendo el huésped de expresión que contiene la cetorreductasa y subsiguiente centrifugado para separar los desechos celulares y el sobrenadante del extracto bruto que contiene la cetorreductasa. La solución tampón preferentemente se selecciona del grupo consistente en 10-200 mM de tris/HCl pH 7-9 que contiene 2 mM de MgCh, 10-200 mM de fosfato sódico/NaOH pH 6-9 o 10-200 mM de trietanolamina/HCl pH 7-9.

Preferentemente, el cofactor NAD+ se añade a una concentración final de 0,05 a 10 mM. La cetorreductasa se añade preferentemente al sobrenadante del extracto bruto. El extracto crudo se obtiene rompiendo el huésped de expresión que contiene la cetorreductasa y centrifugando entonces para separar los desechos celulares y el sobrenadante del extracto bruto que contiene la cetorreductasa.

En una realización preferente, la cetorreductasa diseñada por ingeniería de acuerdo con la invención difiere del tipo silvestre de cetorreductasa de SEQ ID NO: 2 en 1 a 70 aminoácidos, típicamente en 1 a 50 aminoácidos, más típicamente en 1 a 30 aminoácidos, incluso todavía más típicamente en 1 a 20 aminoácidos y en particular típicamente en 1 a 11 aminoácidos.

E este respecto, ingeniería significa que uno o más aminoácidos en una posición dada se sustituyen por cualquier otro aminoácido proteinogénico seleccionado del grupo consistente en Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr y Val. En una realización preferida, la sustitución no modifica la longitud de secuencia, es decir un residuo de un solo aminoácido se sustituye por otro residuo de un solo aminoácido. Sin embargo, también es posible eliminar uno o más residuos de aminoácido sin sustitución y/o insertar uno o más residuos aminoácidos.

En principio una sustitución en cualquier posición de una enzima puede ser una sustitución conservadora, en la que este aminoácido se sustituye por un aminoácido de características comparables (por ejemplo sustitución de un aminoácido hidrófobo por otro aminoácido hidrófobo). Además, una sustitución en cualquier posición de una enzima puede ser una sustitución no conservadora, donde este aminoácido se sustituye por un aminoácido de otras características (por ejemplo sustitución de un aminoácido hidrófobo por un aminoácido hidrófilo),

La técnica de ingeniería enzimática puede estudiarse en: S. Lutz, U.T. Bomscheuer, Protein Engineering Handbook, Wiley VCH, Weinheim 2009.

Cualquier sustitución de acuerdo con esta invención excluye sustituciones de aminoácidos en posiciones de la cetorreductasa de acuerdo con esta invención que son indispensables para la actividad catalítica de la

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cetorreductasa, de preferencia las posiciones N120, S148, Y161 y K165 de la SEQ ID NO: 2. Por otro lado, se sabe en la técnica actual que las posiciones de secuencia que participan en elementos previsibles de estructuras proteínicas, por ejemplo alfa-hélices u hojas beta o interacciones iónicas, son sensibles a la mutagénesis y pueden no requerir una sustitución o solamente una sustitución simultánea con una contraposición.

La invención también se refiere a cetorreductasas diseñadas por ingeniería que difieren de la secuencia de aminoácidos del tipo silvestre de cetorreductasa de SEQ ID NO: 2 en 1 a 70 cambios de residuos, preferiblemente en 1 a 50 cambios de residuos, con mayor preferencia en 1 a 30 cambios de residuos, incluso todavía con más preferencia en 1 a 20 cambios de residuos y con la máxima preferencia en 1 a 11 cambios de residuos, preferiblemente incluyendo cambios en una o más de las siguientes posiciones de la SEQ ID NO: 2: Y21, V23, S33, L39, R40, A43, P68, V89, G95, P97, T98, D103, G109, V119, L121, V124, Y125, I149, L150, S154, E155, T157, A158, T163, H190, Y193, L198, L199, A201, A206, Y207, V299 y V247.

Preferentemente, la cetorreductasa diseñada por ingeniería de acuerdo con la invención difiere de la secuencia de aminoácidos de tipo silvestre de cetorreductasa de la SEQ ID NO:2 en 1 a 70, preferiblemente en 1 a 50, todavía con más preferencia en 1 a 30, incluso con mayor preferencia en 1 a 20 y con máxima preferencia en 1 a 11 cambios de residuos, incluyendo preferentemente uno o más de los siguientes cambios de residuos:

Y21Q;

V23T;

S33A;

L39V;

R40C;

A43E o G;

P68S;

V89F;

G95A, E, M, Q, S o V; P97A, E, K, N, V o Y; T98A o G;

D103E;

G109Y;

V119Y;

L121Q;

V124I;

Y125F;

I149A, G, L, M, Q, T o V; L150A, F, H o S;

S154G;

E155A, D, F, G, K, L o S; T157Y;

A158G, L, P, Q, S, V o W; T163A oS;

H190C;

Y193A, F, G, P, T ó V; L198M;

L199A, F, I oT;

A201G;

A206G;

Y207R o L;

V229I; y/o V247I.

De preferencia, la cetorreductasa diseñada por ingeniería de acuerdo con la invención es capaz de reducir cualquier sustrato aldehído o es capaz de reducir estereoselectivamente cualquier sustrato ceto, preferentemente el sustrato ceto de fórmula general (i); o los derivados de 3-aril-3-cetopropanoamina de acuerdo con la fórmula general (II); o los derivados de 5-hidroxi-3-oxohexanoato de acuerdo con la fórmula general (III); o los derivados de acetofenona de acuerdo con la fórmula general IV); o los derivados benzoilo de acuerdo con la fórmula general (V); o los derivados de secodiona de acuerdo con la fórmula general (VI); o 3- quinuclidona; o 3-oxo-3-fenilpropanoato de etilo; o 4-cloro-3-oxobutanoato de etilo; o cetosa, o el sustrato aldehído de acuerdo con la fórmula general (I'); o 2-butanal; o 1-heptanal; y preferiblemente presenta una mejor actividad específica, una mejor estabilidad térmica y/o estereoselectividad si se compara con el tipo silvestre de cetorreductasa de SEQ ID NO:2.

Preferentemente, las cetorreductasas diseñadas por ingeniería de acuerdo con la invención son capaces de reducir cualquier sustrato aldehído o ceto, de preferencia sustratos ceto de fórmula general (1); o derivados de 3-aril-3-cetopropanoamina de acuerdo con la fórmula general (II); o derivados de 5-hidroxi-3-oxohexanoato de acuerdo con la fórmula general (III); o derivados de acetofenona de acuerdo con la fórmula general (IV); o derivados de benzoilo de acuerdo con la fórmula general (V); o derivados de secodiona de acuerdo con la fórmula general (VI); o 3-quinuclidona; o 3-oxo-3-fenilpropanoato de etilo; 4-cloro-3-oxobutanoato de etilo; o cetona; o el sustrato aldehído de acuerdo con la fórmula general (I'); o 2-butanol; o 1-heptanal; y difiere de la secuencia de aminoácidos del tipo silvestre de cetorreductasa de SEQ ID NO:2 en 1-70 cambios de residuos aminoácidos, preferiblemente 1 a 50 aminoácidos, con mayor preferencia 1 a 30 aminoácidos, incluso todavía con más preferencia por 1 a 20 aminoácidos y con máxima preferencia 1 a 11, incluyendo preferiblemente cambios en uno o más de las siguientes posiciones: Y21, V23, S33, L39, R40, A43, P68, V89, G95, P97, T96,

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D103, V119, L121, V124, Y125, I149, L150, S154, E155, T157, A158, T163, H190, Y193, L198, L199, A201, A206, Y207, V229 y V247.

Preferentemente, las cetorreductasas diseñadas por ingeniería de acuerdo con la invención son capaces de reducir cualquier sustrato aldehído o capaces de reducir estereoselectivamente cualquier sustrato ceto, preferiblemente el sustrato ceto de fórmula general (I); o derivados de 3-aril-3-cetopropanoamina de acuerdo con la fórmula general (II); o derivados de 5-hidroxi-3-oxohexanoato de acuerdo con la fórmula general (III); o derivados de acetofenona de acuerdo con la fórmula general (IV), o derivados de benzoilo de acuerdo con la fórmula general (V); o derivados de secodiona de acuerdo con la fórmula general (VI); o 3-quinuclidona; o 3- oxo-3-fenilpropanoato de etilo; 4-cloro-3-oxobutanoato de etilo; o cetosa; o el sustrato aldehído de acuerdo con la fórmula general (I'); o 2-butanal; o 1-heptanal; y difieren de la secuencia de aminoácidos de la cetorreductasa del tipo silvestre de SEQ ID NO:2 en 1 a 70, preferiblemente 1 a 50, con más preferencia 1 a 30, incluso con más preferencia 1 a 20 y con mayor preferencia 1 a 11 cambios de residuos, incluyendo, preferentemente, uno

0 más de los siguientes cambios de residuos: Y21Q, V23T; S33A; L39V; R40C; A43E o G; P68S; V89f; G95A; E, M, Q, S o V; P97A, E, K, N, V o Y; T98A o G; D103E; G109Y; V119Y; L121Q; V124I; Y125F; I149A, G, L, M, Q, T o V; L150A, F, H o S; S154G; E155A, D, F, G, K, L o S; T157Y; A158G,L, P, Q, S, V o W; T163A o S; H190C; Y193A, F, G, P, T o V; L198M; L199A, F, I, o T; A201G; A206G; Y207R o L; V229I; y V247I.

Preferentemente, las cetorreductasas diseñadas por ingeniería de acuerdo con la invención son capaces de reducir estereoespecífcamente uno de los siguientes sustratos N,N-dimetil-3-ceto-3-(2-tienil)-1- cetopropanoamina, N-monometil-3-ceto-3-(2-tienil)-1-cetopropanoamina, (5R)-6-ciano-5-hidroxi-3- oxohexanoato de terc-butilo, (5S)-6-cloro-5-hidroxi-3-oxohexanoato de terc-butilo, 1-(4-clorofenil)etanona, 1-(2- metoxifenil)etanona, fenil-(2-piridil)-metanona, etilsecodiona, 3-oxo-3-fenilpropanoato de etilo, 3-quinuclidona,

3- cloro-3-oxobutanoato de etilo; o el sustrato aldehído de acuerdo con la fórmula general (I'); o 2-butanal; o 1- heptanal; y difieren de la secuencia de aminoácidos de la cetorreductasa de tipo silvestre de SEQ ID NO:2 en

1 a 70 cambios de residuos aminoácidos, preferentemente 1 a 50 cambios de residuos aminoácidos; con más preferencia 1 a 30 cambios de residuos aminoácidos, incluso todavía con más preferencia 1 a 20 cambios de residuos aminoácidos y con mayor preferencia 1 a 11 cambios de residuos, incluyendo preferentemente cambios en una o varias de las siguientes posiciones: Y21, V23, S33, L39, R40, A43, p68, V89, G95, P97, T98, D103, G109, V119, L121, V124, Y125, I149, L150, S154, E155, T157, A158, T163, H190, Y193, L198, L199, A201, A206, Y207, V229 y V247.

Preferentemente, las cetorreductasas diseñadas por ingeniería de acuerdo con la invención son capaces de reducir estereoespecíficamente uno de los siguientes sustratos: N,N-dimetil-3-ceto-3-(2-tienil)-1- cetopropanoamina, N-monometil-3-ceto-3-(2-tienil)1-cetopropanoamina, (5R)-6-ciano-5-hidroxi-3- oxohexanoato de terc-butilo, (5S)-6-cloro-5-hidroxi-3-oxohexanoato de terc-butilo, 1-(4-clorofenil)etanona, 1-(2- metoxifenil)etanona, fenil-(2-piridil)-metanona, etilsecodiona, 3-oxo-3-fenilpropanoato de etilo, 3-quinuclidona,

4- cloro-3-oxobutanoato de etilo; o cetosa; o el sustrato aldehído de acuerdo con la fórmula general (I'); o 2- butanal; o 1-heptanal; y difieren de la secuencia de aminoácidos de la cetorreductasa de tipo silvestre de SEQ ID NO:2, en 1 a 70, preferiblemente 1 a 50; con más preferencia en 1 a 30, incluso con más preferencia 1 a 20 y de con mayor preferencia 1 a 11 cambios de residuos, incluyendo uno o más de los siguientes cambios de residuos: Y21Q; V23T; S33A; L39V; R40C; A43E o G; P68S; V89F; G95A, E, M, Q, S o V; P97A, E, K, N, V o Y; T98A o G; D103E; G109Y; V119Y; L121Q; V124I; Y125F; I149A, G, L, M, Q, T o V; L150A, F, H o S; S154G; E155A, D, F, G, K, L o S; T157Y; A158G, L, P, Q, S, V o W; T163A o S; H190C; Y193A, F, G, P, T o V; L198M; L199A, F, I o T; A201G; A206G; Y207R o L; V299I y V247I.

Preferentemente, la cetorreductasa diseñada por ingeniería de acuerdo con la invención que difiere de la cetorreductasa del tipo silvestre de SEQ ID NO:2 comprende una secuencia de aminoácidos o consiste esencialmente en una secuencia de aminoácidos que tiene uno de los siguientes conjuntos de sustituciones de aminoácidos en comparación con la SEQ ID NO:2:

No. Intercambio de aminoácidos frente a SEQ ID NO.2_____________SEQ ID del mutante

1

V89F SEQ ID NO:4

2.

Y125F SEQ ID NO:5

3.

V229I SEQ ID NO:6

4.

G95Q, L150F, E155S, A158L, L199T SEQ ID NO:7

5.

G95S, L150A, E155S, Y193V, L199A SEQ ID NO:8

6.

G95E,L150H, A158L SEQ ID NO:9

7,

G95Q, P97A.A158Q, L199T SEQ ID NO:10

S.

G95M, P97V, L150F, E155S, A158V, Y193P, L199T SEQ ID NO:11

9.

G95S, P97Y, L150F, E155S, A158Q, L199I SEQ ID NO:12

10.

G95Q, P97K, L150F, E155S, A158L, Y193A, L199T SEQ ID NO: 13

11.

G95M, P97K, L150F, E155L, A158S, Y193A, L199A SEQ ID NO:14

12.

G95M, P97Y, L150A, E155A, A158G, Y193A SEQ ID NO:15

13.

R40C, G95M, P97A, A158Q, L199I SEQ ID NO:16

14.

G95M, P97N, L150A, A158L, Y193A SEQ ID NO:17

15.

G95S, L150F, E155F, A158Q, Y193F, L199T SEQ ID NO:18

16.

G95M, P97V, L150A, E155L, A158Q, Y193F, L199A SEQ ID NO:19

17.

G95Q, P97A, L150F, E155S, A158V, Y193V, L199I SEQ ID NO:20

18.

P68S, G95M, P97Y, E155F, A158L, Y193A SEQ ID NO:21

19.

G95M, E155K, A158L.Y193T SEQ ID NO:22

20.

G95M, E155S, A158V, Y193F, L199T SEQ ID NO:23

21

G95A, P97N, L150A, E155L, A158L, Y193P SEQ ID NO:24

22.

G95Q, P97V, L150S, E155G, A158P, Y193V, L199T SEQ ID NO:25

23.

G95M, L150A, E155F, A158S, Y193A, L199T SEQ ID NO:26

24.

G95S, P97E, L150A, E155L, A158L, Y193V, L199T SEQ ID NO:27

25.

G95S, A158L, Y193V, L199A SEQ ID NO:28

26.

L150F, A158Q, Y193P SEQ ID NO:29

27.

G95S, P97A, L150A, E155L, A158Q, Y193F, L199A SEQ ID NO:30

28.

G95S, A158L, Y193T SEQ ID NO:31

29

L150F, E155K, A158S, Y193P, L199F SEQ ID NO:32

30.

G95E, L150A, E155S, A158L, Y193V, L199T SEQ ID NO:33

5

Claims (5)

1. 5
2. 2.

   10
3. 3.

   15
4. 4.

   20
5. 5.

   25

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   40

   45 6.

   Cetorreductasa que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 85% de identidad con la SEQ ID NO: 2, donde la cetorreductasa es capaz de reducir estereoselectivamente 4-cloro-3- oxobutanoato de etilo.

   Cetorreductasa según la reivindicación 1, que

   (i) convierte isopropanol en acetona a una tasa de 0,01-100 U/mg de liofilizado de cetorreductasa; y/o

   (ii) después de incubación durante 48 h en isopropanol acuoso al 50% a 30°C muestra una actividad residual de como mínimo un 1% con respecto a su actividad antes de la incubación.

   Cetorreductasa según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende una secuencia de

   aminoácidos con al menos un 95% de identidad con las SEQ ID NO: 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14,

   15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,

   42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68,

   69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92 o 93.

   Procedimiento para la:

   - reducción de un sustrato ceto a un alcohol secundario.

   - reducción de un sustrato aldehido a un alcohol primario.

   - oxidación de un sustrato de alcohol secundario a un producto ceto.

   - oxidación de un sustrato de alcohol primario a un aldehido, y/o

   - oxidación de un sustrato aldehido a un ácido carboxílico.

   donde el procedimiento comprende el paso de hacer reaccionar el sustrato y un cofactor apropiado en presencia de una cetorreductasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

   Procedimiento según la reivindicación 4, donde

   (i) el sustrato es 4-cloro-3-oxobutanoato de etilo, que se reduce estereoselectivamente a (3S)-4-cloro- 3-hidroxibutanoato de etilo con una cetorreductasa que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2;

   (ii) el sustrato es (5R)-6-ciano-5-hidroxi-3-oxohexanoato de terc-butilo, que se reduce estereoselectivamente a (3R,5R)-6-ciano-3,5-dihidroxi-hexanoato de terc-butilo con una cetorreductasa que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 91;

   (iii) el sustrato es N,N-dimetil-3-ceto-3-(2-tienil)-1-cetopropanoamina, que se reduce estereoselectivamente a (1S)-3-(dimetilamino)-1-(2-tienil)-propan-1-ol con una cetorreductasa que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 58;

   (iv) el sustrato es (5S)-6-cloro-5-hidroxi-3-oxohexanoato, que se reduce estereoselectivamente a (3R,5S)-6-cloro-3,5-dihidroxihexanoato de terc-butilo con una cetorreductasa que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 62 o 91;

   (v) el sustrato es etilsecodiona (etil-3-metoxi-8,14-secogona-1,3,5(10),9(11)-tetraeno-14,17-diona), que se reduce estereoselectivamente a 17-13-seconol (etil-3-metoxi-8,14-secogona- 1,3,5(10),9(11)-tetraeno-14-ona-17-l3-ol) con una cetorreductasa que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 70 o

   (vi) el sustrato es N-monometil-3-ceto-3-(2-tienil)-1-cetopropanoamina, que se reduce estereoselectivamente a (1S)-3-(metilamino)-1-(2-tienil)-propan-1-ol con una cetorreductasa que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 58 u 87.

   Uso de una cetorreductasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para:

   - la reducción de un sustrato ceto a un alcohol secundario,

   - la reducción de un sustrato aldehido a un alcohol primario,

   - la oxidación de un sustrato alcohol secundario a un producto ceto,

   - la oxidación de un sustrato alcohol primario a un aldehido, y/o

   - la oxidación de un sustrato aldehido a un ácido carboxilico.

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   (i) el sustrato es 4-cloro-3-oxobutanoato de etilo, que se reduce estereoselectivamente a (3S)-4-cloro- 3-hidroxibutanoato de etilo con una cetorreductasa que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2;

   (ii) el sustrato es (5R)-6-ciano-5-hidroxi-3-oxohexanoato de terc-butilo, que se reduce estereoselectivamente a (3R,5R)-6-ciano-3,5-dihidroxi-hexanoato de terc-butilo con una cetorreductasa que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 91;

   (iii) el sustrato es N,N-dimetil-3-ceto-3-(2-tienil)-1-cetopropanoamina, que se reduce estereoselectivamente a (1S)-3-(dimetilamino)-1-(2-tienil)-propan-1-ol con una cetorreductasa que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 58;

   (iv) el sustrato es (5S)-6-cloro-5-hidroxi-3-oxohexanoato, que se reduce estereoselectivamente a (3R,5S)-6-cloro-3,5-dihidroxihexanoato de terc-butilo con una cetorreductasa que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 62 o 91;

   (v) el sustrato es etilsecodiona (etil-3-metoxi-8,14-secogona-1,3,5(10),9(11)-tetraeno-14,17-diona), que se reduce estereoselectivamente a 17-13-seconol (etil-3-metoxi-8,14-secogona- 1,3,5(10),9(11)-tetraeno-14-ona-17-l3-ol) con una cetorreductasa que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 70 o

   (vi) el sustrato es N-monometil-3-ceto-3-(2-tienil)-1-cetopropanoamina, que se reduce estereoselectivamente a (1S)-3-(metilamino)-1-(2-tienil)-propan-1-ol con una cetorreductasa que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 58 u 87.