ES2683554T3 - Conjugados fluorescentes - Google Patents

Abstract

Un conjugado fluorescente que comprende un resto de fluorocromo F acoplado a un resto selectivo T, en donde el resto F tiene la fórmula (I):**Fórmula** en donde Y es seleccionado independientemente y para cada caso entre SO3H, SO3 - y SO3M, en donde M es un catión monovalente o Y se selecciona entre SO3 - y SO3Na; x, z e y son independientemente seleccionados de un entero de 1 a 8; y en donde el resto T tiene afinidad por un marcador tumoral.

Description

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

DESCRIPCION

Conjugados fluorescentes Campo

La presente invencion se refiere al campo de la investigacion biomedica y en particular a los compuestos y metodos utiles para diagnostico, por ejemplo, en el diagnostico in vitro o in vivo de tumores.

Antecedentes

El cancer es actualmente la causa de aproximadamente el 13% de las muertes en el mundo. A pesar de decadas de intensa investigacion, el cancer continua siendo la segunda causa principal de muerte en los pafses altamente desarrollados, con aproximadamente el 25% de las muertes. Para muchos tipos de cancer, la cirugfa (a menudo en combinacion con quimioterapia, radioterapia o hipertermia) es el pilar de la intervencion terapeutica.

Un cancer tambien se dice que es una neoplasia maligna, o un tumor maligno. Una neoplasia es un crecimiento anomalo de tejido. Las neoplasias se diferencian en neoplasias benignas, precancerosas o neoplasias in situ, y neoplasias malignas. Muchas, aunque no todas, las neoplasias tambien forman tumores, que son lesiones solidas o llenas de lfquidos que pueden diferenciarse anatomicamente del tenido no afectado. Al igual que las neoplasias, los tumores pueden ser benignos, precancerosos, o malignos. En el lenguaje comun, asf como en la descripcion de la presente invencion, sin embargo, el termino “tumor” puede utilizarse como sinonimo de “tumor maligno”.

El pronostico vital de los pacientes con cancer depende de la etapa de la enfermedad en que la misma es diagnosticada. Del veinte al treinta por ciento de los pacientes que sufren canceres digestivos desarrollaran recurrencia locorregional como unica recidiva. Los tumores ovaricos epiteliales tambien muestran una evolucion locorregional cuando alcanzan la etapa III. Varios anos atras se demostro que la reseccion quirurgica completa es un factor muy importante para la mejora del pronostico de los pacientes. Esta estrategia de citorreduccion maxima forma parte de los protocolos terapeuticos que incluyen quimioterapia sistemica o intraperitoneal posiblemente asociada a hipertermia.

La planificacion de una cirugfa curativa es un parametro importante para el futuro de los pacientes. La deteccion de todos los nodulos tumorales y sus diseminaciones es un punto importante que tiene influencia sobre el pronostico posquirurgico. La diferenciacion entre tejidos tumorales y normales no siempre es facil, especialmente cuando los pacientes han recibido tratamiento neoadyuvante. Los cirujanos se grnan entonces solo por sus sentidos visual y tactil, y por su experiencia. No se dispone por ahora de ninguna tecnica intraoperatoria que los ayude a visualizar el alcance del tumor.

Se ha sugerido que la cirugfa de reseccion del cancer puede mejorarse mediante el uso de fotodeteccion in situ. La fotodeteccion se basa en la exposicion de los tejidos potencialmente afectados con un compuesto que tiene afinidad por un tumor y que se consigue visualizar opticamente a una longitud de onda de luz seleccionada.

La fotodeteccion de tumores se desarrollo originalmente en los anos 80 con el uso de derivados de la hematoporfirina, tal como fotofrina. Las principales limitaciones del fotodiagnostico con estas moleculas son la escasa selectividad de las mismas por los tejidos cancerosos y su capacidad para reaccionar qmmicamente e inducir alta fotosensibilizacion o necrosis. Esta ultima limitacion es, en realidad, una ventaja en el tratamiento fotodinamico, para el que tambien se proponen estos compuestos.

Folli et al. utilizaron un conjugado de un anticuerpo contra el antfgeno carcinoembrionario (CEA) con fluorescema para visualizar los tumores en los pacientes con carcinoma colorrectal (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 89, pags. 79737977, 1992). La inmunofotodeteccion de las lesiones del carcinoma de colon LS174T con un conjugado del mAb anti- CEA 35A7 e indocianina (Cy5) quedo demostrada en un modelo de raton por Gutowsky et al. (Clin. Cancer Res., vol. 7, pp. 1142-1148, 2001).

Sin embargo, la utilidad clmica de estos conjugados es algo escasa. Los conjugados de anticuerpos con fluorescema poseen una longitud de onda de excitacion y de emision bastante bajas, lo que da lugar a poca penetracion de tejido y un grado sustancial de autofluorescencia inespedfica de los tejidos no cancerosos inducidos por el rayo laser utilizado para excitar el componente coloreado. La toxicologfa de los conjugados con Cy5 es desconocida y no ha sido bien comprobada en la bibliograffa.

La presente invencion aborda estos y otros problemas y desventajas asociados a la fotodeteccion de tumores. Uno de los objetos de la invencion es dar a conocer conjugados mejorados que resulten utiles para la fotodeteccion de tumores malignos o precancerosos que son clmicamente viables, que superan una o varias desventajas de la tecnica anterior, y que tienen una o varias de las siguientes propiedades: un alto grado de especificidad de tumores, una alta sensibilidad de tal manera que permita la deteccion de lesiones tumorales muy pequenas, buena tolerancia clmica, alta estabilidad, poca interferencia con otros tintes, y buena capacidad de manufacturacion.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Otro objeto de la invencion es dar a conocer mejores metodos de diagnostico para tumores in vitro y usos diagnosticos para tumores in vivo, mediante el uso de dichos conjugados. In vivo, tales usos diagnosticos pueden ser parte de tratamientos novedosos, tal como metodos de reseccion tumoral mejorados.

Otro objeto de la invencion es dar a conocer metodos para preparar dichos conjugados.

Otros objetos de la invencion resultaran claros sobre la base de la siguiente descripcion de la invencion y las reivindicaciones de patente.

Compendio de la invencion

En breve, la invencion da a conocer un conjugado fluorescente que comprende un resto de fluorocromo F acoplado a un resto selectivo T, en donde el resto F tiene la formula (I) tal como se define mas adelante, en donde Y, para cada caso y de forma independiente, es seleccionado entre SO3H, SO3- y SO3M, en donde M es un cation monovalente; x, z e y son independientemente seleccionados de un entero de 1 a 8; y en donde el resto T tiene afinidad por un marcador tumoral. En una realizacion, el resto de fluorocromo F puede tener la formula (II) tal como se define a continuacion.

El marcador tumoral por el que el resto selectivo T tiene afinidad puede ser un antigeno tumoral, tal como un antigeno expresado o sobreexpresado por ciertas celulas tumorales. Un ejemplo de dicho antigeno es el antigeno carcinoembrionario (cEa). El resto selectivo T por sf mismo puede ser un ligando no peptfdico, un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, o una protema de fusion que comprende por lo menos una region variable de un anticuerpo. En una realizacion, el resto selectivo T es un anticuerpo, en particular un anticuerpo monoclonal quimerico, humanizado o humano.

En otro aspecto, la invencion da a conocer una composicion que comprende dicho conjugado, opcionalmente, en combinacion con otros ingredientes activos o inactivos. Por ejemplo, la composicion puede ser esteril y comprender ingredientes inactivos, tal como agua para inyeccion, componentes amortiguadores, uno o varios estabilizantes tal como aminoacidos, accesorios de liofilizacion tal como mono-, di- u oligosacaridos, agentes de isotonicidad y similares. La composicion puede tambien comprender una pequena cantidad del resto selectivo T en forma no conjugada.

En otro aspecto, la invencion da a conocer un metodo para preparar el conjugado. El metodo comprende las etapas de (a) dar a conocer un fluorocromo que tiene la formula (III) tal como se define mas adelante, en donde Y es seleccionado para cada caso y de forma independiente entre SO3H, SO3- y SO3M, en donde M es un cation monovalente; x, z e y son independientemente seleccionados de un entero de 1 a 8, y Z se selecciona entre un contraion, hidrogeno, succinimidilo, sulfosuccinimidilo, y nitrofenilo; (b) dar a conocer un agente selectivo que tiene afinidad por un marcador tumoral; y (c) acoplar el fluorocromo con el agente selectivo. En una realizacion, el fluorocromo tiene la formula (IV) tal como se define mas adelante.

Ademas, la invencion da a conocer usos clmicos y no clmicos del conjugado y de la composicion que comprende el conjugado. El uso in vitro incluye el uso para detectar una celula tumoral o celulas tumorales en una muestra, o para diagnosticar y/o vigilar un tumor in vitro. Clmicamente, el conjugado y/o la composicion que comprende el conjugado pueden utilizarse para detectar focos de un tumor que expresa el marcador tumoral o para determinar la ubicacion de un tumor que expresa al marcador tumoral en un paciente. Por ejemplo, pueden utilizarse para detectar celulas tumorales o tejido tumoral en un margen de reseccion en un paciente que es sometido o que ha sido sometido a cirugfa de reseccion. En una realizacion, una composicion que comprende el conjugado se administra a un paciente que tiene un tumor que expresa el marcador tumoral por el cual el resto selectivo T tiene afinidad, por ejemplo, por inyeccion intravenosa, intraperitoneal, subcutanea o intramuscular, o perfusion, o por inhalacion o administracion topica, por ejemplo, como un pulverizador; comenzar la cirugfa de reseccion tumoral en el paciente en menos de aproximadamente las 72 horas posteriores, e iluminar un tejido en un sitio de reseccion del paciente que es sometido a cirugfa de reseccion con luz de longitud de onda de aproximadamente 660 a 700 nm. De esta forma, la localizacion del tumor, que incluye la localizacion de nodulos o lesiones muy pequenas que senan de otro modo invisibles al ojo humano, se visualizaran para que grnen al cirujano en la reseccion completa del tejido tumoral y/o la verificacion de que la reseccion ha sido completa.

Breve descripcion de los dibujos

En la figura 1 se muestra la fluorescencia de los micronodulos tumorales in situ (columna A) y resecados (columna B) en un modelo de raton de carcinomatosis peritoneal LS-174T, visualizado a 700 nm despues de la administracion de 20 |jg del conjugado fluorescente del ejemplo 3.

En la figura 2A se muestran imagenes de tumores en un modelo de raton de tumor subcutaneo de cancer colorrectal humano (HT-29) que sobreexpresa el CEA, tomadas 48 horas despues de la administracion de 30 |ig de los conjugados fluorescentes (A: conjugado fluorescente del ejemplo 3; B: conjugado de control). Las columnas de izquierda a derecha muestran las imagenes tomadas con luz blanca, fluorescencia (visualizacion a 700 nm) y en superposicion.

5

10

15

20

25

30

35

40

En la figura 2B se muestran imagenes de los tumores en un modelo de raton de tumor ortotopico de cancer colorrectal humano (HT-29) que sobreexpresa el CEA, tomadas 48 horas despues de la administracion de 30 |ig del conjugado fluorescente del ejemplo 3 (A: antes de incision, B: despues de incision, C: despues de la exposicion del tumor). Las columnas de izquierda a derecha muestran las imagenes tomadas con luz blanca, fluorescencia (visualizacion a 700 nm) y en superposicion.

En la figura 3 se muestran imagenes tomadas durante cirugfa de un tumor pancreatico primario en un paciente, 48 horas despues de la administracion de 5 mg del conjugado fluorescente del ejemplo 3 (A esta bajo luz blanca, y B es la superposicion de imagen con fluorescencia). La lmea discontinua representa el margen de reseccion propuesto en funcion solamente de la visualizacion y de la palpacion, mientras que la lmea continua presenta el margen de reseccion propuesto en funcion de la visualizacion de fluorescencia. La lmea punteada representa un diagrama aproximado del tumor tal como se muestra mediante la fluorescencia.

En la figura 4 se muestran imagenes de una metastasis peritoneal de un paciente con cancer pancreatico, 48 horas despues de administracion de 5 mg del conjugado fluorescente del ejemplo 3. Las imagenes de la fila A se obtuvieron intraoperatoriamente in vivo y las imagenes de la fila B son ex vivo despues de la reseccion (columna izquierda bajo luz blanca, y columna derecha con fluorescencia como una imagen de superposicion).

Descripcion detallada de la invencion

En un primer aspecto, la presente invencion da a conocer un conjugado fluorescente que comprende un resto de fluorocromo F acoplado a un resto selectivo T, en donde el resto F tiene la formula (I):

»/vyv

imagen1

en donde Y se selecciona independientemente y para cada caso entre SO3H, SO3- y SO3M; M es un cation monovalente; x, z e y son independientemente seleccionados de un entero de 1 a 8; y en donde el resto T tiene afinidad por un marcador tumoral.

Los ejemplos para cationes monovalentes incluyen, aunque sin limitarse a ello, Na, K o amonio. En una de las realizaciones preferidas, Y es seleccionado entre SO3" y sO3Na.

El resto F de fluorocromo, que puede tambien denominarse un tinte o marcacion fluorescente, o un resto de fluoroforo, del conjugado fluorescente de la invencion absorbe la energfa electromagnetica en un intervalo de longitudes de onda preferiblemente en el espectro ultravioleta, visible o infrarrojo, y emite en un intervalo de longitudes de onda generalmente mas largas, preferiblemente en el margen visible o del infrarrojo cercano. Tal como se entiende en la presente memoria, el termino longitud de onda de excitacion (expresado en nm) se refiere al pico, es decir, longitud de onda de absorcion maxima o espedfica del fluorocromo, o la del conjugado fluorescente que comprende el resto de fluorocromo acoplado al resto selectivo T. El termino longitud de onda de emision (expresada en nm) se refiere al pico, es decir a la longitud de onda de emision maxima o espedfica del fluorocromo o la del conjugado fluorescente que comprende el resto de fluorocromo acoplado a un resto selectivo de la invencion.

El resto de fluorocromo F es un derivado de cianina de la formula (I) tal como se describe mas arriba y preferiblemente emite en el espectro visible lejano o infrarrojo cercano (NIR) con un intervalo de longitud de onda de emision con un maximo entre 650 y 750 nm. Cuando se acopla al resto selectivo T, el conjugado resultante tambien emite preferiblemente en un intervalo de emision con un maximo entre 650 y 750 nm.

Los inventores han encontrado que estos restos de fluorocromo tienen caractensticas fluorescentes particularmente favorables tales como desactivacion, rendimiento cuantico, y en particular robustez con respecto al fotoblanqueo, lo que les permite utilizarlas en forma fiable junto con restos selectivos que son activos contra antfgenos

Con respecto a Y, el experto en la tecnica apreciara que, dependiendo del medio qrnmico del conjugado, los grupos SO3H, SO3", SO3M y/o SO3Na pueden tambien convertirse dinamicamente el uno en el otro. Por ejemplo, cuando se disuelve en un medio acuoso, y dependiendo del pH y de la disponibilidad de otros cationes, un grupo representado por Y y seleccionado entre SO3", SO3M y/o SO3Na puede tambien protonarse en SO3H, o puede convertirse en otra

5

10

15

20

25

30

35

40

45

forma de sal tal como de SOaNa a SO3K o viceversa. De acuerdo con esto, la presente invencion cubre tales formas alternativas del compuesto de la formula (I).

Los conjugados particularmente preferidos son los que comprenden un resto de fluorocromo F de la formula (II):

imagen2

En los conjugados fluorescentes, el resto de fluorocromo F esta acoplado a un resto selectivo T; preferiblemente, esta covalentemente unido, es decir, conjugado al resto selectivo T, por medio de un enlace covalente tal como un enlace de amida o ester.

Tal como se menciona en el contexto de la formula (I), la formula (II) debena tambien interpretarse con respecto a los grupos representados por Y de manera que se incluyan las formas de acido sulfonico alternativas tales como SO3H o SO3K que se generan in situ en equilibrio qmmico, dependiendo de, por ejemplo, la composicion y/o el valor de pH de un medio acuoso en donde puede estar disuelto el conjugado. Mas aun, debena entenderse que cada uno de los cuatro grupos de acido sulfonico en la formula (II) pueden estar en la forma de la sal de Na o sal interna y que la formula (II) tal como se muestra representa solamente una de las diferentes posibilidades de representar el compuesto.

Los restos selectivos T de los conjugados fluorescentes tienen afinidad por los marcadores tumorales y pueden unirse o asociarse a un marcador tumoral. Un marcador tumoral debe entenderse como un producto o molecula producido por o presente en un tumor, o producido por mecanicismos celulares normales del paciente en respuesta a la presencia de un tumor. Tal como se utiliza en la presente memoria, a menos que un significado diferente resulte obvio a partir del contexto particular, un tumor significa una neoplasia, que es un grupo o masa de celulas o tejido que surge a partir del crecimiento de celulas anormal o descontrolado. En particular, el marcador tumoral lo produce un tumor que es canceroso o maligno.

El marcador tumoral puede estar presente, por ejemplo, en forma de una protema, una glucoprotema, un receptor, una hormona, una enzima, un antfgeno, o un oncogen o un producto de los mismos. El marcador tumoral puede estar sobreexpresado por las celulas tumorales en comparacion con las celulas normales, o puede ser una sustancia espedfica del tumor que se produce unicamente en las celulas tumorales. Los marcadores tumorales particularmente preferidos contra los cuales puede actuar selectivamente o ser dirigido el resto selectivo T son los que son protemas o receptores de la superficie celular que estan presentes en la superficie de las celula tumoral y/o los que se expresan particularmente en las celulas epiteliales o en los tumores solidos tal como carcinomas o sarcomas.

En una realizacion preferida de la invencion, el marcador tumoral es un antfgeno tumoral. Un antfgeno tumoral es una molecula o un producto que es espedfico de, o se asocia a, las celulas tumorales (por ejemplo, sobreexpresado en las celulas tumorales), que pueden inducir o estimular una reaccion del sistema inmunitario tal como la produccion de anticuerpos y la respuesta celular de linfocitos T y/o linfocitos B. El antfgeno tumoral puede representar o comprender una protema o un lfpido. Puede estar glucosilado (por ejemplo, una glucoprotema), y puede poseer uno o varios epttopos, es decir, regiones o dominios a los que un anticuerpo, linfocito B o linfocito T puede preferiblemente unirse o por los que tiene una afinidad particular.

Los ejemplos de antfgenos tumorales incluyen antfgenos derivados o generados de protemas oncovmcas, antfgenos oncofetales que son normalmente producidos en mayor cantidad solamente durante el desarrollo fetal, antfgenos que se sobreexpresan o acumulan en la celula tumoral con respecto a una celula normal, o antfgenos que son mutantes o se alteran tras la traduccion. Preferiblemente, el marcador tumoral es un antfgeno tumoral seleccionado entre antfgeno carcinoembrionario (CEA), receptor de factor de crecimiento epidermico (EGFR) y receptor 2 del factor de crecimiento epidermico humano (HER2).

En una realizacion preferida de la invencion, el antfgeno tumoral es el antfgeno carcinoembrionario (CEA). El CEA es una glucoprotema oncofetal con un peso molecular de 180-200 kDa que se expresa en las celulas epiteliales. El CEA se expresa en gran cantidad sobre la superficie celular, particularmente en los tumores malignos del colon y recto (sobreexpresado en el 95% de los canceres colorrectales), asf como tambien en los tumores malignos de estomago, intestino delgado, pancreas, tngado, mama, ovario, cuello de utero, vejiga, vesmula y pulmon. El CEA no suele estar localizado y puede expresarse portoda la superficie celular, asf como en la luz intraglandular y la intracelular. El CEA

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

comprende cinco epftopos principales clasificados como GOLD-1 a GOLD-5, tal como se define en Hammarstrom et al. (Cancer Res 1989 (49) 4852-4858), al cual un anticuerpo o fragmento de anticuerpo o protema de fusion anti-CEA pueden tener especificidad de union.

En una de las realizaciones preferidas, el resto selectivo T del conjugado fluorescente de la invencion se dirige y se une a un tumor que expresa el CEA que puede estar localizado en uno o varios tejidos u organos de un paciente seleccionados entre colon, recto, estomago, intestino delgado, pancreas, tftgado, mama, ovario, cuello uterino, vejiga, vesmula, pulmon y esofago.

En otra realizacion preferida, el resto selectivo T del conjugado fluorescente puede unirse a un marcador tumoral que es un receptor. El receptor puede ser espedfico de celula tumoral o puede estar sobreexpresado y presente en mayor cantidad en las celulas tumorales. El resto selectivo T puede actuar como un ligando con respecto a tales receptores y puede ser una pequena molecula no peptfdica, es decir, una entidad qrnmica o compuesto que no incorpora ni comprende ninguna secuencia de aminoacidos.

En una realizacion preferida, el conjugado fluorescente de la invencion comprende un fluorocromo de formula (I) o (II) y un resto selectivo T seleccionado entre un ligando no peptfdico, un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo y una protema de fusion que comprende por lo menos una region variable de un anticuerpo. Preferiblemente, cualquier resto selectivo es capaz de unirse espedficamente a un antfgeno tumoral tal como CEA, HER2 o EGFR. En una realizacion espedfica, el conjugado fluorescente comprende un fluorocromo de la formula (I) o (II) y un resto selectivo T seleccionado entre un ligando no peptfdico, un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo y una protema de fusion que comprende por lo menos una region variable de un anticuerpo, cuyo resto selectivo se une espedficamente al CEA.

En una realizacion particular, el resto selectivo T es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo, o una protema de fusion que comprende por lo menos una region variable de un anticuerpo. En este caso, el anticuerpo, fragmento de anticuerpo o la por lo menos una region variable de un anticuerpo de una protema de fusion puede proceder de o pertenecer a cualquiera de los isotipos o clases de inmunoglobulina IgG, IgA, IgD, o IgM. Un anticuerpo completo es tfpicamente una glucoprotema en forma de Y que comprende un dominio Fc (fragmento cristalizable) y un dominio Fab (fragmento de union al antigeno). Estos se construyen a partir de una pareja de estructuras polipeptfdicas de la cadena pesada (H) y de la cadena ligera (L) interconectadas por enlaces disulfuro para formar la estructura con forma de Y. Cada cadena comprende una region variable (V) y una region constante (C). La cadena pesada comprende una region de cadena variable (Vh) y diferentes regiones constantes (abreviadas Ch1, Ch2 etc.); mientras que la cadena ligera solamente comprende una region de cadena variable (Vl) y una region constante (Cl). Las regiones variables participan en el reconocimiento y la especificidad de union del anticuerpo a un epftopo concreto del antfgeno, y forman los dominios Fab de union al antfgeno.

Los fragmentos de anticuerpo se refieren a cualquier region, cadena o dominio de un anticuerpo, o cualquier construccion, forma estabilizada o conjugado de la misma, que es capaz de interactuar y unirse espedficamente a un antfgeno. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos de dominios de union al antfgeno (Fab, o Fab'), construcciones Fab, fragmentos variables de cadena simple (scFv), anticuerpos con un solo dominio tales como VHH, minicuerpos, diacuerpos etc. La protema de fusion se refiere a una construccion que comprende un fragmento de anticuerpo fusionado con otra protema bioactiva o polipeptido.

En una realizacion preferida, el resto selectivo T del conjugado fluorescente de la invencion es un anticuerpo monoclonal (mAb). Esto puede producirse con los metodos conocidos en la tecnica. Los anticuerpos monoclonales quimericos son particularmente preferidos. Estos son anticuerpos monoclonales tftbridos que comprenden dominios o regiones de cadenas pesada o ligera procedentes de mas de una especie, tal como de anticuerpos humanos y murinos. Opcionalmente, el resto selectivo T del conjugado fluorescente puede ser un anticuerpo humanizado (que generalmente comprende de forma predominante por lo menos el 85-95% de secuencias procedentes de humanos) o un anticuerpo humano procedente exclusivamente de secuencia de anticuerpo de lmea germinal de humano.

Preferiblemente, cualquiera de tales restos selectivos T es capaz de unirse espedficamente al CEA como antfgeno tumoral.

En una realizacion, el resto selectivo T del conjugado fluorescente que comprende un resto de fluorocromo F de la formula (I) es un anticuerpo monoclonal quimerico con especificidades de union por uno o mas de los epftopos del CEA, por ejemplo, los epftopos GOLD-1, GOLD-2, GOLD-3, GOLD-4, o GOLD-5. En una realizacion espedfica, el resto selectivo T tiene afinidad y/o especificidad por el epftopo GOLD-2. En otra realizacion, el resto de fluorocromo F de tales conjugados es de la formula (II) tal como se describe mas arriba.

En una realizacion particularmente preferida, la invencion da a conocer un conjugado fluorescente que comprende un resto de fluorocromo F acoplado a un resto selectivo T, en donde el resto F tiene la formula (II), y en donde el resto T es mAb quimerico dirigido contra el epftopo GOLD-2 del CEA, que comprende cadenas pesadas del alotipo G1m3 y cadenas ligeras del alotipo km3, en donde cada cadena pesada y cada cadena ligera comprende por lo menos un dominio variable de IgG1 de raton y por lo menos un dominio constante humano. Este anticuerpo monoclonal quimerico tiene especificidad de union, tal como se determina con pruebas de union/inhibicion competitiva conocidas en la tecnica, por el epftopo GOLD-2 de CEA.

En particular, el conjugado fluorescente puede estar acoplado a un mAb quimerico dirigido contra el CEA que se expresa y prepara a partir de las siguientes secuencias de nucleotidos:

(A) Cadena pesada (SEQ ID n.°: 1):

GGTACCGCCGCCACCATGCACTCCAGACTCAACCTGGTGTTCCTGGTGCTGATCCTGAAG

GGCGTGCAGTGCGACGTGCAGCTGGTGGAATCTGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGCGGC

TCCAGAAAGCTGTCTTGTGCCGCCTCCGGCTTCACCTTCTCCAACTTCGGCATGCACTGG

ATCCGGCAGGCCCCTGAGAAGGGCCTGGAATGGGTGGCCTATATCTCCGGCGGCTCCTCC

ACCATCTACTTCGCCGACACCCTGAAGGGACGGTTCACCATCTCCCGGGACAACCCCAAG

AACACCCTGTTTCTGCAGATGACCTCCCTGCGGAGCGAGGACACCGCCATCTACTACTGC

GCCAGAGACTACTACATCAACAACTACTGGTACTTCGACGTGTGGGGCGCTGGCACCACC

GTGACAGTGTCATCTGCTAGC

5 (B) Cadena ligera (SEQ ID n.°: 2):

GTCGACGCCGCCACCATGGAATTTCAGACCCAGGTGTTCGTGTTCGTGCTGCTGTGGCTG

TCTGGCGTGGACGGCGACATCGTGATGACCCAGTCCCAGAAATTCATGTCCACCTCCGTG

GGCGACCGGGTGTCCATCACATGCAAGGCCTCTCAGAACGTGCGGAGCGCCGTGGCCTGG

TATCAGCAGACACCTGGCCAGAGCCCCAAGGCCCTGATCTACCTGGCCTCCAACAGATAC

ACCGGCGTGCCCGATCGGTTCACCGGCTCTGGCTCTGGCACCGACTTCACCCTGACCATC

TCCAACGTGCAGTCCGAGGACCTGGCCGACTACTTCTGTCTGCAACACTGGAACTACCCC

CTGACCTTCGGCGGAGGCACCAAGCTGGAACTGAAGCGTACG

La secuencia de nucleotidos de la region variable de la cadena pesada (A) anterior incluye en los extremos 5' y 3', respectivamente, las secuencias para los sitios de restriccion Kpnl y Nhel. La secuencia de nucleotidos de la region variable de la cadena ligera (B) incluye en el extremo 5' y 3' de la secuencia, respectivamente, las secuencias para 10 los sitios de restriccion SalI y BSiWI.

La secuencia de aminoacidos de las regiones variables de este mAb corresponde a la siguiente secuencia:

(A) Cadena pesada (SEQ ID n.°: 3):

Asp Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly Ser Arg Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe Gly Met His Trp lie Arg Gin Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Tyr lie Ser Gly Gly Ser Ser Thr lie Tyr Phe Ala Asp Thr Leu Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Pro Lys Asn Thr Leu Phe Leu Gin Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala He Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Tyr Tyr lie Asn Asn Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

5

10

15

20

25

30

35

40

(B) Cadena ligera (SEQ ID n.°: 4):

Asp lie Val Met Thr Gin Ser Gin Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser lie Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asn Val Arg Ser Ala Val Ala Trp Tyr Gin Gin Thr Pro Gly Gin Ser Pro Lys Ala Leu lie Tyr Leu Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Asn Val Gin Ser Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Leu Gin His Trp Asn Tyr Pro

Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

En una realizacion preferida de la invencion, el conjugado fluorescente puede comprender un resto F que tiene la formula (II) acoplado a un resto selectivo T, en donde T es un mAb quimerico dirigido contra el CEA que comprende una region variable de cadena ligera de SEQ ID n.° 4 y una region variable de cadena pesada de SEQ ID n.° 3.

El conjugado fluorescente de la invencion puede comprender mas de un resto fluorescente F conjugado con un resto selectivo T, tal como desde 1 a aproximadamente 10 restos F por resto selectivo T. Preferiblemente, el numero de restos de fluorocromo F acoplados a un resto selectivo T se selecciona de 1 a 4. En otras palabras, en una molecula de dicho conjugado preferido, n restos F estan acoplados a un resto T, y n es un entero seleccionado de 1 a 4.

Mientras que cada molecula de conjugado se caracteriza porque n es un entero, el compuesto que comprende numerosas moleculas de conjugado puede tener un grado de conjugacion, o un numero promedio de restos F por resto T, que no tiene que ser un entero, pero que es preferiblemente cualquier valor en el margen de aproximadamente 1 a aproximadamente 4.

En este contexto, el resto selectivo T se selecciona preferiblemente entre un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, y una protema de fusion que comprende por lo menos una region variable de un anticuerpo, y uno a cuatro restos de fluorocromo de la formula (I) conjugados con ella. En una realizacion de la invencion, el resto selectivo T es un anticuerpo monoclonal quimerico anti-CEA acoplado a n restos de fluorocromo F de la formula (II), en donde n esta dentro del margen de 1 a 4.

Otro aspecto de la invencion, se cubre una composicion que comprende el conjugado fluorescente tal como se describe mas arriba.

En una realizacion, la composicion comprende una mezcla de conjugados fluorescentes diferentes que difieren solo o principalmente en su grado de conjugacion. En otra realizacion espedfica, la composicion comprende una mezcla de por lo menos 3 o 4 conjugados, todos los cuales comprenden un resto de fluorocromo F que tiene la formula (II) acoplada a un mAb quimerico que tiene afinidad por el epftopo GOLD-2 del CEA, y en donde por lo menos 3 o 4 conjugados difieren entre sf en que el numero de restos de fluorocromo F acoplados a un resto selectivo T es 1, 2, y 3, respectivamente; o 1, 2, 3, y 4, respectivamente.

La composicion puede ademas comprender un compuesto que representa el resto selectivo T en forma no conjugada (o teoricamente, un conjugado con un grado de sustitucion de cero). Por ejemplo, en combinacion con la realizacion descrita previamente, dicha composicion comprende el mAb quimerico no conjugado que tiene afinidad por el epftopo GOLD-2 del CEA junto con por lo menos tres o cuatro conjugados del mismo mAb acoplado con 1, 2, 3, y opcionalmente 4 o mas restos de fluorocromo F de acuerdo con la formula (II), respectivamente. Las poblaciones de conjugados de esta mezcla pueden determinarse mediante los metodos conocidos en la tecnica, por ejemplo, por espectrometna de masas (por ejemplo, MALDI-TOF).

El grado promedio de conjugacion de los conjugados en la composicion es preferiblemente de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 3. El grado de conjugacion es la relacion molar de fluorocromo por anticuerpo que puede determinarse espectrofotometricamente. Asf, la cifra debena entenderse de modo que refleje el grado promedio de conjugacion de los conjugados y cualquier anticuerpo no conjugado presente en la composicion. En otra realizacion, el grado promedio de sustitucion es de aproximadamente 1 a aproximadamente 2. Los inventores han encontrado que mientras que un mayor grado de sustitucion puede proporcionar una visualizacion mejorada, la afinidad por el marcador tumoral que tiene el resto selectivo se reduce con un mayor numero de restos de fluorocromo conjugados con el mismo. Se determino que funciona mejor un grado de sustitucion de aproximadamente 0,5 a aproximadamente

5

10

15

20

25

30

35

40

45

3, en particular para las composiciones que comprenden conjugados de un mAb quimerico que tiene afinidad por el epttopo GOLD-2 del CEA, con un fluorocromo de acuerdo con la formula (II) ya que durante la cirugfa permite una visualizacion excelente de los nodulos, incluso los pequenos, de un tumor que expresa el CEA.

La composicion de la invencion puede ademas comprender excipientes tales como amortiguadores, estabilizantes, crioprotectores y agentes de isotonicidad, agentes de ajuste de pH. Los excipientes particularmente preferidos son los aminoacidos basicos tal como L-arginina y sales de la misma, sales tal como citrato, sales de fosfato de sodio o potasio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, glucidos tales como trehalosa, manitol, maltosa, sacarosa o dextrano, o un tensioactivo no ionico tal como un polisorbato o un poloxamero. El pH de la composicion esta preferiblemente entre 5,2 y 7,2. Preferiblemente, la composicion se preparaba en las condiciones esteriles conocidas en la tecnica, y esta esteril.

En una realizacion particular, la composicion que comprende cualquiera de los conjugados fluorescentes definidos mas arriba es esteril y ademas comprende un amortiguador acuoso y L-arginina, y/o comprende un compuesto que comprende un resto T que no esta acoplado al resto F. En otra realizacion adicional, la composicion que comprende cualquiera de los anteriores conjugados fluorescentes es esteril y comprende un amortiguador acuoso ajustado a un pH de aproximadamente 6,0, hidrocloruro de L-arginina, y un polisorbato, preferiblemente polisorbato 20. Tambien puede incluirse opcionalmente en estas composiciones un glucido tal como trehalosa, manitol, maltosa o sacarosa.

En otra realizacion particular, la concentracion del conjugado fluorescente en la composicion, en funcion del contenido del resto selectivo, por ejemplo el mAb anti-CEA (segun se determina por metodos de espectrofotometna o HPLC conocidos en la tecnica) esta entre 1 mg/mL y 10 mg/mL.

Otro aspecto mas de la invencion da a conocer un metodo para la preparacion de un conjugado fluorescente que comprende las etapas de:

(a) dar a conocer un fluorocromo que tiene la formula (III):

co2z

imagen3

en donde Y se selecciona independientemente y para cada caso entre SO3H , SO3' y SO3M, en donde M es un cation monovalente; x, z e y son independientemente seleccionados de un entero de 1 a 8, y Z se selecciona entre un contraion, hidrogeno, succinimidilo, sulfosuccinimidilo, y nitrofenilo; (b) dar a conocer un agente selectivo que tiene afinidad por un marcador tumoral; y (c) acoplar el fluorocromo con el agente selectivo.

Los ejemplos para cationes monovalentes incluyen, sin limitacion, Na, K o amonio. En una de las realizaciones preferidas, Y se selecciona entre SO3' y SO3Na.

Los conjugados fluorescentes de la invencion que comprenden un resto de fluorocromo F acoplado a un resto selectivo T, en donde el resto F tiene la formula (I) y en donde el resto selectivo T tiene afinidad por un marcador tumoral pueden obtenerse mediante dichos metodos de preparacion.

Las mismas opciones y preferencias con respecto al resto selectivo T y al resto de fluorocromo F tal como se describe en el contexto del conjugado mismo en cualquiera de los parrafos anteriores tambien se aplican al agente selectivo y al fluorocromo a ser utilizado en el metodo. De acuerdo con esto, el agente selectivo es preferiblemente un compuesto que comprende el resto T del conjugado, y el fluorocromo utilizado en el metodo es preferiblemente un compuesto que comprende, o produce, el resto de fluorocromo F del conjugado. El agente selectivo tiene afinidad preferiblemente por un antfgeno tumoral, tal como el antfgeno carcinoembrionario (CEA). La afinidad por el CEA puede ser por cualquiera de sus epftopos conocidos, tal como el epftopo GOLD-2. En una realizacion particularmente preferida, el agente selectivo es un anticuerpo monoclonal quimerico que tiene afinidad por el CEA.

El anticuerpo monoclonal quimerico (mAb) que tiene afinidad por el CEA se puede producir por medio de expresion a partir de las celulas CHO que han sido transfectadas con un vector de expresion que codifica el mAb quimerico. Preferiblemente, el vector de expresion comprende secuencias de nucleotidos que codifican los dominios constantes humanos de anticuerpos y los dominios variables murinos de anticuerpos anti-CEA, preferiblemente dominios variables con la secuencia que se describe mas arriba.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Los fluorocromos utiles para preparar los conjugados pueden prepararse en analogfa con el esquema de reaccion del diagrama la y los metodos descritos en la patente de los Estados Unidos US 8.034.626. Por ejemplo, los fluorocromos pueden sintetizarse a partir de la condensacion de dos derivados de indolenina que comprenden las sustituciones de sulfonato y (alquil)oxi necesarias, en donde uno de los derivados de indolenina esta en forma de un derivado de acetanilido. En una realizacion, un intermedio de indolenina puede prepararse a partir de un precursor aminoaromatico, a traves de las etapas de diazotacion/reduccion seguidas por las etapas de sulfonacion, hidroxilacion, ciclacion de Fischer con una cetona para la indolenina, carboxilalquilacion del sustituyente hidroxilo y cuaternizacion con una sulfona.

En otra realizacion, el fluorocromo es un compuesto de la formula (IV):

imagen4

SO3' SOaNa

Los fluorocromos de la invencion pueden estar activados, preferiblemente como un ester activo (por ejemplo, ester de succinimidilo) para la conjugacion con un resto selectivo T. En una realizacion, el fluorocromo de la formula (I) o (II) se acopla al resto selectivo T por medio de enlaces amida, ester, tioester, disulfuro o carbamato, mediante el uso de los metodos de acoplamiento covalente conocidos en la tecnica. En otra realizacion de la invencion, cuando el resto selectivo T es un anticuerpo, fragmento de anticuerpo o secuencia peptfdica, el fluorocromo esta preferiblemente conjugado a traves de los grupos amino libres del resto selectivo T mediante un enlace amida.

Otro aspecto de la invencion da a conocer el uso in vitro de los conjugados fluorescentes que comprenden un resto de fluorocromo F acoplado a un resto selectivo T que tiene afinidad por un marcador tumoral, en donde el resto F tiene la formula (I) o (II), o para el uso in vitro de una composicion que comprende dichos conjugados fluorescentes, para la deteccion de una celula tumoral en una muestra, o para diagnosticar y/o vigilar un tumor.

En particular, los conjugados fluorescentes pueden utilizarse para la deteccion de celulas tumorales y tumores que expresan un antfgeno tumoral tal como el CEA. En tales casos, el resto selectivo T es preferiblemente seleccionado entre un ligando no peptfdico, un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, y una protema de fusion que comprende por lo menos una region variable de un anticuerpo, tal como se define en cualquiera de las preferencias y opciones previamente descritas. El conjugado fluorescente puede utilizarse para la deteccion de una celula tumoral o puede usarse para diagnosticar o ayudar al diagnostico de una afeccion cancerosa mediante pruebas in vitro de una muestra obtenida de un paciente a partir de un lfquido corporal, tal como suero sangumeo, o de una biopsia de tejido. Preferiblemente, el tumor es un tumor solido, tal como se obtiene o extrae de colon, recto, estomago, intestino, coledoco, pancreas, esofago, ovario, mama, prostata, hugado o pulmon. Ademas, los conjugados fluorescentes pueden ser utiles para vigilar la presencia o progresion de un tumor, por ejemplo, para la valoracion de celulas tumorales o tejido tumoral residuales despues de cirugfa de reseccion y/o quimioterapia.

En otro aspecto adicional, la invencion da a conocer el uso del conjugado y/o la composicion que comprende el conjugado tal como se describe en la presente memoria como una medicamento. Tal como se utiliza en la presente memoria, un medicamento significa un material o producto que es administrado con algun fin medico, tal como para diagnostico o tratamiento, que incluye el tratamiento profilactico de una enfermedad o afeccion de un paciente humano o de un animal. En particular, la invencion da a conocer el uso del conjugado y/o la composicion que comprende el conjugado tal como se describe en la presente memoria como un medicamento o agente para diagnostico. El uso comprende la administracion unica o repetida del conjugado, o de la composicion, al paciente que lo necesita. En una realizacion, el paciente que necesita el conjugado o la composicion es un paciente que ha desarrollado un cancer, o que se encuentra en riesgo de desarrollar un cancer.

La invencion da a conocer ademas el uso de conjugados fluorescentes y/o composiciones de los mismos en la deteccion de los focos de un tumor que expresa el marcador tumoral o para determinar la ubicacion de un tumor que expresa el marcador tumoral en un paciente. El uso puede ser particularmente ventajoso en los pacientes afectados por un cancer caracterizado por una progresion de la enfermedad tal como recidiva, metastasis o diseminacion. Dicha progresion del cancer puede acabar en una distribucion mas amplia de las celulas tumorales o de las masas de tejido.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

En particular, los conjugados fluorescentes y las composiciones pueden utilizarse para detectar focos o para determinar la ubicacion de un tumor que expresa el marcador tumoral o antigeno tumoral, es decir, el marcador tumoral por el cual tiene afinidad el resto T, preferiblemente en la superficie celular. Tal como se entiende en la presente memoria, el termino foco significa el grupo o aglomeracion de celulas o tejido que define un tumor o una lesion que puede desarrollarse en un tumor y distinguirlo del tejido normal circundante.

En una realizacion preferida, el tumor expresa el CEA. En otra realizacion preferida, el paciente tiene cancer colorrectal o digestivo. En la manifestacion avanzada de tales canceres, el paciente puede tener carcinomatosis peritoneal, en la que se producen metastasis generalizadas de tumores cancerosos en el revestimiento de la cavidad peritoneal. En una realizacion particular de la invencion, el conjugado fluorescente que comprende un resto de fluorocromo de la formula (I) o (II) y un resto selectivo T que es un anticuerpo monoclonal quimerico se utiliza para la deteccion de focos de un tumor que expresa el CEA o para determinar la ubicacion de un tumor que expresa el CEA en un paciente.

Durante la reseccion quirurgica de tejido tumoral, el cirujano se basa en la apariencia visual y palpacion para discriminar entre el tejido tumoral y el tejido normal. La reseccion quirurgica es la eliminacion quirurgica, ya sea por completo o de forma parcial, del tejido tumoral presente en el tejido, estructura u organo de un paciente. El tejido tumoral canceroso y maligno puede a menudo estar presente en nodulos pequenos o lesiones (por ejemplo, de tamano submilimetrico) que no son visibles a simple vista. La reseccion tumoral completa es a menudo cntica para el pronostico de un paciente y como tal, es importante que un cirujano sea capaz de identificar correctamente, distinguir los lfmites y margenes de tejido tumoral maligno del de tejido sano y resecar dichos tejidos tumorales, asf como evitar la eliminacion o dano innecesarios de tejido o estructuras sanas durante la retirada quirurgica de un tumor y/o tratamiento quirurgico citorreductor de un paciente.

El conjugado fluorescente que esta descrito mas arriba y/o la composicion que comprende tal conjugado han resultado particularmente utiles para la deteccion de celulas tumorales o tejido tumoral en un margen de reseccion de un paciente sometido, o que se ha sometido, a cirugfa de reseccion de un tumor que expresa el marcador tumoral. Tal como se entiende en la presente memoria, el termino margen de reseccion se refiere a un margen o borde de tejido que rodea el tejido tumoral. El margen de tejido que rodea al tumor resecado debena normalmente ser tejido no canceroso que se extirpa junto con el tumor para garantizar la suficiente eliminacion de todo tejido tumoral maligno, aunque, tal como se describe mas arriba, puede ser diffcil determinar la extension del margen y/o la extension del tumor hacia el tejido normal. Opcionalmente, el margen de reseccion puede tambien entenderse como el margen de reseccion deseado, que puede determinarse o modificarse en funcion del uso del metodo de la invencion.

El metodo para detectar celulas tumorales o tejido tumoral en un margen de reseccion, o cerca de el, en un paciente sometido, o que se ha sometido, a cirugfa de reseccion de un tumor que expresa un marcador tumoral, preferiblemente en donde el marcador tumoral es un antfgeno tumoral, mediante el uso de los conjugados fluorescentes de la invencion o composiciones de los mismos es util para ayudar a los cirujanos durante la cirugfa y tras ella, por ejemplo, cirugfa citorreductora, de manera que se garantiza que se ha retirado todo el tejido tumoral y que se pueden obtener margenes limpios (o negativos), es decir, margenes en donde no se detectan celulas tumorales. En una realizacion preferida, la cirugfa de reseccion es de un tumor que expresa o sobreexpresa el CEA.

El conjugado fluorescente o composicion de la invencion y tal como se describe en cualquiera de los parrafos anteriores, puede utilizarse para la deteccion de celulas tumorales o tejido tumoral, tal como la deteccion del foco de un tumor y/o la determinacion de su ubicacion, asf como en un margen de reseccion de un tumor de un paciente durante o con posterioridad a la reseccion quirurgica de un paciente, en donde el paciente tiene cancer colorrectal, gastrico, biliar, pancreatico, esofagico, ovarico, mamario, de prostata, tugado o pulmon. La celula o tejido tumoral a detectar o a localizarse puede estar en forma de carcinoma o sarcoma que expresa el CEA. Preferiblemente, los conjugados fluorescentes se utilizan para la deteccion de nodulos o lesiones tumorales en el orden de tamano submilimetrico, por ejemplo, en los pacientes que sufren carcinomatosis peritoneal.

En una realizacion particular del uso del conjugado fluorescente o composicion de la invencion para detectar o para localizar celulas tumorales o tejido tumoral, o para detectar los margenes de reseccion de un tumor durante o con posterioridad a la cirugfa de reseccion, el tumor es un tumor digestivo maligno y el conjugado fluorescente comprende un resto de fluorocromo F de la formula (I), o preferiblemente de la formula (II), acoplado a un resto selectivo T que es un anticuerpo monoclonal quimerico dirigido contra el epttopo GOLD-2 del CEA, que comprende cadenas pesadas del alotipo G1m3 y cadenas ligeras del alotipo km3, en donde cada cadena pesada y cada cadena ligera comprende por lo menos un dominio variable de IgG1 de raton y por lo menos un dominio constante humano. El tumor digestivo puede hacer referencia a un tumor localizado en cualquier parte del tubo digestivo, por ejemplo en el esofago, estomago, intestino delgado, intestino grueso, recto, asf como los organos asociados a la digestion tal como pancreas, tugado y vesfcula biliar, y puede encontrarse en el rango de tamano submilimetrico. Particularmente preferidos para este uso son los conjugados en donde dicho anticuerpo monoclonal quimerico comprende una region variable de cadena ligera de SEQ ID n.° 4 y una region variable de cadena pesada de SEQ ID n.° 3.

En otra realizacion particular del uso de los conjugados fluorescentes de la invencion para detectar o localizar celulas tumorales o tejido tumoral, o para detectar los margenes de reseccion de un tumor durante o despues de la cirugfa de reseccion, el tumor es un tumor mamario (maligno) y el conjugado fluorescente utilizado comprende un resto de fluorocromo F de la formula (I), o preferiblemente de la formula (II) acoplado a un resto selectivo T que es un anticuerpo

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

monoclonal quimerico dirigido contra el epftopo GOLD-2 del CEA, que comprende cadenas pesadas del alotipo G1m3 y cadenas ligeras del alotipo km3, en donde cada cadena pesada y cada cadena ligera comprende por lo menos un dominio variable de IgG1 de raton y por lo menos un dominio constante humano. Particularmente preferidos para dicho uso son los conjugados en donde dicho anticuerpo monoclonal quimerico comprende una region variable de cadena ligera de SEQ iD n.° 4 y una region variable de cadena pesada de SEQ ID n.° 3. El tumor mamario tal como se utiliza en la presente memoria puede referirse a un tumor localizado en cualquier tejido asociado a las mamas o tejido mamario, que incluye tejido glandular o ductal y puede tambien incluir nodulos linfaticos regionales, tal como los que se encuentran en la axila. Dichos tumores pueden estar en el orden submilimetrico de tamanos.

En otro aspecto, el uso de los conjugados fluorescentes o composiciones de la invencion tal como para la deteccion de focos de tumores y la determinacion de su ubicacion, o para la deteccion de celulas tumorales o tejido tumoral en un margen de reseccion en un paciente sometido o que se ha sometido a cirugfa de reseccion de un tumor, comprende las etapas de:

(a) administrar el conjugado o composicion a un paciente que padece un tumor;

(b) comenzar la cirugfa de reseccion tumoral en dicho paciente;

(c) iluminar un tejido en un sitio de reseccion del paciente que se somete a cirugfa de reseccion con luz que tiene una longitud de onda de aproximadamente 660 a 700 nm,

en donde la etapa (b) se realiza dentro de un penodo de no mas de aproximadamente 96 o 72 horas despues de la etapa (a).

Como otra alternativa, todos los usos diagnosticos y/o terapeuticos del conjugado o composicion que se describen en la presente memoria pueden tambien expresarse como usos del conjugado o composicion en la fabricacion de un medicamento o agente de diagnostico (util) para los usos de diagnostico y/o terapeuticos especificados.

En la etapa (a) del tratamiento de pacientes que padecen un tumor, los conjugados fluorescentes o composiciones de los mismos pueden administrarse mediante metodos de inyeccion o perfusion conocidos en la tecnica. En particular, los conjugados o composiciones pueden administrarse por inyeccion o perfusion intravenosa, intraperitoneal, subcutanea o intramuscular. Como alternativa, los conjugados fluorescentes o composiciones de los mismos pueden administrarse por inhalacion o por vfatopica. En este contexto, la administracion topica incluye la administracion directa en la piel o en una membrana mucosa externa o interna. La inhalacion puede ser util para el tratamiento de pacientes que tienen un tumor en el aparato respiratorio, por ejemplo, en el pulmon. Cuando se administran por via topica, los conjugados fluorescentes o composiciones de los mismos se administran preferiblemente en forma de pulverizacion.

El conjugado se administra preferiblemente al paciente en una dosis de 0,1 a 50 mg o en una dosis de 5 mg a 100 mg. En este contexto, la dosis significa la cantidad del conjugado y, si estuviera presente, del anticuerpo no conjugado que se administra antes de, por ejemplo, un procedimiento quirurgico o de diagnostico. La dosis puede opcionalmente dividirse y administrarse en intervalos. En el caso de la administracion por inyeccion a un paciente con cancer colorrectal, gastrico, biliar, pancreatico, esofagico, ovarico, mamario, de prostata, tugado o pulmon y que se somete a cirugfa de reseccion, la dosis esta preferiblemente en el orden de aproximadamente 0,2 a 15 mg, tal como de 0,5 a 10 mg o de 5 a 15 mg. Preferiblemente, la dosis administrada es por lo menos de 5 mg. Estos intervalos de dosis se aplican particularmente a los conjugados y composiciones que tienen el grado preferido de sustitucion tal como se describe mas arriba.

Preferiblemente, la etapa (b) se realiza dentro de un penodo de no mas de aproximadamente 96 horas despues de la etapa (a). En otras realizaciones, la etapa (b) se realiza dentro de un penodo de no mas de 72 horas, o no mas de 48 horas, o no mas de 36 horas, o no mas de 24 horas, o no mas de 12 horas despues de completada la etapa (a).

En la etapa (c) del tratamiento, el tejido en el sitio de reseccion del paciente que se somete a cirugfa de reseccion se ilumina con una longitud de onda dentro de la region infrarroja cercana. Los dispositivos opticos para iluminacion utilizados en la etapa (c) actuan selectivamente de manera preferible a la longitud de onda de excitacion de los conjugados fluorescentes, preferiblemente a una longitud de onda entre 660 y 700 nm. En una realizacion del metodo, la etapa (c) se realiza por iluminacion del tejido en un sitio de reseccion del paciente que se somete a cirugfa de reseccion a una longitud de onda de excitacion de 680 nm.

En una realizacion particularmente preferida del tratamiento de un paciente que tiene un tumor, el tumor es un tumor digestivo maligno, y el conjugado fluorescente comprende un resto de fluorocromo F de la formula (I), o preferiblemente de la formula (II) acoplado a un resto selectivo T que es un anticuerpo monoclonal quimerico dirigido contra el epftopo GOLD-2 del CEA, que comprende cadenas pesadas del alotipo G1m3 y cadenas ligeras del alotipo km3, en donde cada cadena pesada y cada cadena ligera comprende por lo menos un dominio variable de IgG1 de raton y por lo menos un dominio constante humano.

En otro aspecto adicional de la invencion, el conjugado fluorescente tal como se describe en cualquiera de las realizaciones anteriores puede tambien comprender o incorporar un isotopo radioactivo, un radiomarcador o un radiotrazador. El conjugado fluorescente radiomarcado puede, por ejemplo, obtenerse mediante la radiomarcacion

directa del conjugado, o por aplicacion del radiomarcador al resto selectivo T antes de la conjugacion. Los conjugados fluorescentes radiomarcados y las composiciones de los mismos pueden utilizarse como medicamentos en las aplicaciones terapeuticas y/o diagnosticas. En una realizacion, el sujeto al cual se le administra el conjugado radiomarcado o la composicion del mismo es un sujeto que ha desarrollado un cancer o que se encuentra en riesgo 5 de desarrollar un cancer.

Ejemplos

Ejemplo 1: Preparacion del anticuerpo monoclonal quimerico anti-CEA Diseno de genes y smtesis

Las secuencias de nucleotidos (A) y (B) que vienen a continuacion, que codifican los dominios variables Vh y Vl 10 murinos nativos, respectivamente, se obtuvieron de un hibridoma de anticuerpo anti-CEA murino, y se sintetizaron de novo y se clonan en vectores de expresion Tandem pVVS hospedadores. Estas secuencias incorporan un numero de modificaciones de nucleotidos (sin cambiar la secuencia nativa de la protema) que garantizan la clonacion optimizada y la expresion optimizada en las celulas CHO. Los sitios de restriccion Kpnl y Nhel estan insertados respectivamente en los extremos 5' y 3' de la secuencia que codifica el dominio Vh. En forma similar, dos secuencias correspondientes 15 a los sitios de restriccion SalI y BSiWI se insertaron, respectivamente, en los extremos 5' y 3' de la secuencia que codifica el dominio Vl.

(A) Cadena pesada (SEQ ID n.° 1):

GGTACCGCCGCCACCATGGACTCCAGACTGAACCTGGTGTTCCTGGTGCTGATCCTGAAGG

GCGTGCAGTGCGACGTGCAGCTGGTGGAATCTGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCTC

CAGAAAGCTGTCTTGTGCCGCCTCCGGCTTCACCTTCTCCAACTTCGGCATGCACTGGATCC

GGCAGGCCCCTGAGAAGGGCCTGGAATGGGTGGCCTATATCTCCGGCGGCTCCTCC

ACCATCTACTTCGCCGACACCCTGAAGGGACGGTTCACCATCTCCCGGGACAACCCCAAG

AACACCCTGTTTCTGCAGATGACCTCCCTGCGGAGCGAGGACACCGCCATCTACTACTGC

GCCAGAGACTACTACATCAACAACTACTGGTACTTCGACGTGTGGGGCGCTGGCACCACC

GTGACAGTGTCATCTGCTAGC

20 (B) Cadena ligera (SEQ ID n.° 2):

GTCGACGCCGCCACCATGGAATTTCAGACCCAGGTGTTCGTGTTCGTGCTGCTGTGGCTG

TCTGGCGTGGACGGCGACATCGTGATGACCCAGTCCCAGAAATTCATGTCCACCTCCGTG

GGCGACCGGGTGTCCATCACATGCAAGGCCTCTCAGAACGTGCGGAGCGCCGTGGCCTGG

TATCAGCAGACACCTGGCCAGAGCCCCAAGGCCCTGATCTACCTGGCCTCCAACAGATAC

ACCGGCGTGCCCGATCGGTTCACCGGCTCTGGCTCTGGCACCGACTTCACCCTGACCATC

TCCAACGTGCAGTCCGAGGACCTGGCCGACTACTTCTGTCTGCAACACTGGAACTACCCC

CTGACCTTCGGCGGAGGCACCAAGCTGGAACTGAAGCGTACG

Smtesis de vector

El vector Tandem pVVS que se selecciono para servir de vector hospedador de los genes de Vh y Vl se preparo mediante digestiones dobles secuenciales con SalI/BsiWI y KpnI/Nhel. Este vector de expresion codifica las 25 secuencias de los dominios constantes de alotipo de IgG1 humano G1m3 para la cadena pesada y de alotipo de IgG1 humano Km3. El vector ademas comprende los siguientes elementos funcionales: un promotor pCMV (para las cadenas pesada y ligera), un intron quimerico entre el promotor y el codon de iniciacion para traduccion, el origen de replicacion de pUC, un sitio de poliadenilacion de bGh, el aislador HS4 TK poliA, un promotor SV40 y genes de resistencia a kanamicina/neomicina para la seleccion celular durante la amplificacion de vector y despues de la 30 transfeccion. Despues de la digestion, los fragmentos resultantes del esqueleto del vector se recuperaron mediante purificacion en gel.

Los fragmentos de inserto que comprenden los insertos de genes de Vh y Vl sinteticos que codifican los dominios Vh y Vl murinos nativos tal como se describe mas arriba se extraen a partir de sus respectivos vectores de expresion Tandem PVVS que utilizan KpnI/Nhel y SalI/BsiWI respectivamente, y se recuperan por purificacion en gel.

35 Todos los fragmentos recuperados se agruparon y se ligaron para generar el vector final para transfeccion.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Transfeccion/seleccion

Las celulas CHO transfectadas por el vector que se describe mas arriba proceden de la lmea de celulas CHO (libre de protema) (referencia # 00102307, lote 02K/008) obtenido de la Coleccion Europea de Cultivos de Celulas (European Collection of Cell Cultures [ECACC]). Esta lmea celular, originalmente adquirida por ECACC en 1985, es un subclon de la lmea celular CHO parental procedente del tejido de ovario de hamster e inicialmente consolidada por Puck et al. (1958).

El banco derivado del vial de la ECACC se denomino Bk1998. Las celulas se adaptaron para crecer sin suero bovino fetal, y despues se clonaron mediante diluciones limitantes. El subclon PF 3B9 fue seleccionado sobre la base de las propiedades de crecimiento y de la capacidad de transfeccion, y se coloco en el banco (banco de celulas Bk4164 ). El banco de celulas BK4164, utilizado para generar el sustrato celular para produccion de anticuerpos del anticuerpo, se preparo a partir de un vial de Bk21146.

Las celulas CHO obtenidas a partir del subclon 3B9 se descongelaron originalmente en el medio para CHO ACF (sin componentes animales) EX-CELL® complementado con L-glutamina a 4 mM y se dejaron crecer a 37°C en una atmosfera humidificada con CO2 al 5% en agitacion orbital. La transfeccion se realizo 2 dfas despues del quinto pase. El vector de expresion tal como se prepara mas arriba fue linealizado por digestion con la enzima de restriccion SWal. La transfeccion se realizo por triplicado con Nucleofection™ (Amaxa) con 10 |jg de ADN y se incubo a 37°C, con CO2 al 5% sin agitacion durante 3 dfas. Despues de un penodo de recuperacion de 3 dfas, la seleccion se inicio mediante la adicion de geneticina (0,5 g/L). Las celulas sometidas a las condiciones de Nucleofection™ sin ADN se utilizaron como control de seleccion del antibiotico.

La clonacion por dilucion lfmite se realizo despues de que la viabilidad celular alcanzara por lo menos el 80% bajo presion de seleccion con geneticina. Para cada uno de los 3 grupos de transfeccion, se sembraron cuarenta placas de 96 pocillos a una densidad celular deseada de 0,5 celulas/pocillo. De estos grupos, se obtuvieron 475 clones a partir de una celula unica. Despues de aproximadamente 18 dfas de cultivo, la concentracion de anticuerpos se evaluo mediante ELISA para seleccionar los 150 clones de mejor produccion para escalado en placas de 24 pocillos. Despues de que las celulas alcanzaron suficiente densidad, se transfirieron a placas de 6 pocillos. Se realizo una posterior seleccion en funcion de la cinetica por lotes de 10 dfas y la produccion de mAb se valoro mediante FastELISA para el escalado de frasco en agitacion. La posterior seleccion basada en la cinetica de alimentacion por lotes y produccion de mAb se valoro mediante HPLC con protema A (escalado hasta biorreactores de 2 L) dio lugar a la seleccion de un clon lfder para la produccion de anticuerpos.

Produccion de anticuerpos

Las celulas del clon lfder se descongelaron y se transfirieron al medio de revitalizacion (medio EX-CELL ® ACF para CHO, L-glutamina a 4 mM). Se determino la densidad de celulas viables y despues de la centrifugacion, los sedimentos celulares se resuspendieron en el medio a una densidad de 2 x 106 celulas/mL despues de la siembra en un frasco de 75 cm2. Las celulas se hicieron crecer a 37°C ± 1°C, con CO2 al 8% ± 2% con oscilacion orbital. A partir del dfa 2, el cultivo se escalo en frascos en agitacion de mayor capacidad en el medio EX-CELL ® ACF para CHO, con L- glutamina a 4 mM, a 37°C ± 1°C, con CO2 al 8% ± 2% con oscilacion orbital. La viabilidad, densidad y crecimiento celulares se valoraron en cada pase y la ausencia de contaminantes se verifico por inspeccion al microscopio. El dfa 17, despues de 7 pases, se reunio el contenido de los frascos en agitacion. Las celulas se cuentan y se utilizan para sembrar dos biorreactores de 15 L a una densidad de 0,5 x 106 celulas viables/mL en un volumen de 7 L. Las celulas se hicieron crecer en un cultivo de alimentacion por lotes en el medio EX-CELL ® ACF para CHO, con L-glutamina a 5 mM, pluronico al 0,2%, a 37°C con pH y regulacion de oxfgeno durante 20 dfas. Se agrego BalanCD™ CHO Feed 3, glucosa y L-glutamina en la cantidad necesaria. La densidad, viabilidad y pH celulares se evaluaron diariamente; tambien se tomaron muestras diariamente desde el dfa 6 para determinar la concentracion de glucosa y desde el dfa 10 para valorar la concentracion de anticuerpos (HPLC con protema A).

El aclaramiento se realiza el dfa 20 al hacer pasar la suspension celular desde cada biorreactor a traves de tres filtros de profundidad en paralelo y despues directamente a traves de un filtro de 0,2 jm. Se reune lo recogido a granel clarificado y se le analiza el contenido de anticuerpos mediante HPLC con protema A, la identidad de la protema recombinante por analisis de transferencia Western, la carga biologica, la contaminacion de micoplasmas y espiroplasmas. La recoleccion a granel se distribuye en botellas para PET de 2 L y se conserva entre -70°C y -90°C.

El posterior procesamiento de la recoleccion a granel se realiza de la siguiente manera: la recoleccion a granel clarificada se descongela durante 24 horas a 15-25°C, y se agrupan el contenido de diferentes botellas y se homogeniza mediante agitacion magnetica. La recoleccion a granel agrupada es primero purificada en una columna de cromatograffa por afinidad con protema A equilibrada con un amortiguador de fosfato de sodio a 50 mM, NaCl a 300 mM, pH 7,0. Despues de los lavados con el amortiguador de equilibrado y despues con un amortiguador de fosfato de sodio a 25 mM, pH 7,0, el anticuerpo utilizando se eluye con un amortiguador de acetato de sodio a 25 mM y pH 3,5. Se recolecta el pico de anticuerpo (basandose en la absorbancia del eluyente a 280 nm) y el eluido de anticuerpo se mantiene a 15-25°C antes de la etapa de ajuste de pH.

5

10

15

20

25

30

El pH del eluido de anticuerpo se ajusta a pH 3,8 con acido cffrico a 0,2 My se incuba durante 60-65 min a 15-25°C mientras se agita. Despues de la neutralizacion a pH 6,5 con Na2HPO4 a 0,5 M, se filtra la solucion por un filtro de 0,2 pm, se recolecta y se conserva a 2-8°C.

La solucion de anticuerpo inactivada por pH se purifica adicionalmente mediante cromatograffa de intercambio cationico con una resina de ligando sulfonato. El pH de la solucion se ajusta a 5,0 con acido cftrico a 0,2 My se carga sobre una columna previamente equilibrada con amortiguador de acetato de sodio a 25 mM, pH 5,0. Despues de los lavados con amortiguador de equilibrado, el anticuerpo se eluye con amortiguador de acetato de sodio a 25 mM, NaCl a 195,2 mM, pH 5,0. La recoleccion se basa en la absorbancia a 280 nm.

La solucion de anticuerpo resultante se purifica adicionalmente por cromatograffa de intercambio anionico con membranas de intercambio ionico de amonio cuaternario equilibradas en amortiguador de fosfato de sodio a 24 mM, NaCl a 53,4 mM, pH 7,0. El pH del eluido de la cromatograffa de intercambio cationico se ajusta a pH 7,0 con amortiguador de Na2HPO4 a 0,5 M y se diluye con un amortiguador de fosfato de sodio a 25 mM, pH 7,0, para alcanzar una conductividad final de 11 mS/cm. La solucion se carga en las membranas y el anticuerpo se recoge en el flujo continuo basandose en la absorbancia a 280 nm. La solucion recolectada se filtra por un filtro de 0,2 pm en un vial para PET de uso unico y esteril, y se conserva a 2-8°C.

La solucion de anticuerpo se concentra despues por ultrafiltracion y se diafiltra contra un amortiguador de Tris-HCl a 10 mM, pH 7,2, con membranas de corte a 30 kDa. Se recolecta la fraccion retenida de la filtracion y se conserva a 15-25°C.

La fraccion retenida se diluye despues hasta 1 mg/mL con un amortiguador de Tris-HCl a 10 mM, pH 7,2, y se hace pasar a traves de un filtro de 0,2 pm, seguido por nanofiltracion (membrana Planova 15 N) previamente equilibrada con el mismo amortiguador. El filtrado se conserva a 15-25°C. En una etapa final, la solucion resultante de anticuerpo a granel purificado se filtra a traves de un filtro de 0,2 pm, se distribuye en botellas de PET esteriles y se conserva entre -70 y -90°C.

Se toman las muestras para la determinacion de la concentracion de anticuerpo mediante HPLC con protema A durante cada una de las etapas de purificacion.

El producto de anticuerpo resultante se caracterizo por los metodos conocidos en la tecnica, tal como UPLC-UV-MS. El peso molecular del anticuerpo es de 148,6 kDa segun se determina por espectrometna de masas MALDI-TOF.

Ejemplo 2: Preparacion de fluorocromo de la formula (IV)

Intermedio de acetanilida (B):

imagen5

so3-

Se hace reaccionar la indolenina A sulfonada con sulfona de 1,4-butano. El intermedio resultante se hace reaccionar con p-anilinoacrolema para proporcionar el intermedio de acetanilida B.

5

10

15

20

25

30

Compuesto intermedio (D):

imagen6

imagen7

El intermedio D se prepara mediante la condensacion de Williamson para formar un derivado carboxialquiloxi del precursor de indolenina C seguido por la cuaternizacion con sulfona de 1,4-butano. La indolenina C se obtiene por diazotacion/reduccion de un precursor aromatico aminado seguido por la formacion de sulfonato, hidroxilacion y ciclacion de Fischer con cetona.

Fluorocromo de la formula (IV):

imagen8

El compuesto B es condensado con el compuesto indolico D. El compuesto de dicarbocianina resultante se activo con W-hidroxisuccinimido (NHS) para proporcionar el fluorocromo de la formula (IV).

Ejemplo 3: Conjugacion del fluorocromo con el mAb quimerico anti-CEA

El anticuerpo purificado del ejemplo 1 se descongela durante aproximadamente 24 horas a 15-25°C. Ultrafiltracion/diafiltracion con membranas de corte en 30 kDa para realizar un intercambio de amortiguador (fosfato de sodio a 0,1 M/carbonato, pH 9,3). El fluorocromo (formula (IV) del ejemplo 2) se disuelve en DMF a una concentracion de 2,25 mg/mL mediante agitacion durante una noche a 15-25°C. Se agrega la DMF a la solucion del anticuerpo (diluida a una concentracion final de 1 mg/mL con el amortiguador de fosfato de sodio a 0,1 M/carbonato, pH 9,3) hasta una concentracion final del 10% v/v. La solucion de fluorocromo se anade entonces a la solucion de anticuerpos a un flujo de 20 mL/min en un exceso molar de 4,5. La mezcla de reaccion resultante se incuba en oscilacion orbital a temperatura ambiente durante aproximadamente 45 min.

Se realiza una segunda etapa de ultrafiltracion/diafiltracion (membranas de corte a 30 kDa) primero con PBS-135mM L-arginina complementada con DMF al 10% (v/v), seguido por el amortiguador de la formulacion PBS-135mM L- arginina para retirar la DMF. La fraccion retenida se diluye despues a una concentracion final (tal como se determina por analisis espectrofotometrico) de 1,0-1,1 mg/mL con el amortiguador de la formulacion y se filtra (0,2 pm).

Con el conjugado fluorescente resultante se rellenan botellas para PET de 0,5 L cerradas con tapas de polietileno de alta densidad, se inserta en bolsas de plastico de color ambar y se conservan a -20°C ± 5°C.

La relacion molar de fluorocromo/anticuerpo se determina por espectrofotometna. Se observa una relacion de conjugacion promedio de 1,5-1,6.

La conjugacion del fluorocromo con el anticuerpo se puede realizar, como alternativa, con DMSO como el solvente de conjugacion. La adicion del fluorocromo en un exceso molar de 4 al anticuerpo (a una concentracion en solucion de 1 mg/mL) con una concentracion de reaccion final del 10% v/v de DMSO, y un tiempo de reaccion entre 5 y 120 min, proporciono un conjugado con una relacion de conjugacion promedio de 1,5-1,6, segun se determina por espectrofotometna. No se observo ninguna diferencia significativa con respecto a las mediciones de intensidad de emision de fluorescencia, fotoblanqueo y rendimiento cuantico obtenidas para estos conjugados fluorescentes

5

10

15

20

25

30

35

40

45

preparados en DMSO en comparacion con los conjugados preparados en concentraciones y condiciones analogas en DMF.

Ejemplo 4: Formulacion

El amortiguador utilizado para la formulacion del conjugado fluorescente preparado de acuerdo con el ejemplo 3 puede adaptarse segun sea necesario para los usos y los metodos dentro del contexto de la invencion. Por ejemplo, el conjugado fluorescente se puede formular preferiblemente en un amortiguador que comprende KH2PO4 a 10 mM (vWr Prolabo), NasCitrato a 10 mM/acido dtrico (Fluka), arginina-HCl a 300 mM (Sigma), Tween 20 al 0,02% (p/v) (Merck), en donde el pH se ajusta a 6,0.

Ejemplo 5: Caracterizacion del conjugado

Estudios de fluorescencia

La desactivacion, el fotoblanqueo y el rendimiento cuantico fluorescente del fluorocromo de la formula (IV) y de un conjugado fluorescente segun se prepara de acuerdo con el ejemplo 3 se determinaron a la longitud de onda de excitacion de 680 nm (proporcionada por el dispositivo optico Fluobeam700), la longitud de onda relevante para uso clmico.

Las muestras del fluorocromo de la formula (IV) en DMF y las muestras del conjugado fluorescente del ejemplo 3 en PBS 135 mM-arginina se prepararon a diferentes concentraciones que oscilaban de 0,05 a 500 |jM.

La intensidad maxima de fluorescencia y la concentracion maxima del fluorocromo antes de la deteccion de la desactivacion o extincion (es decir, la autoinhibicion de la fluorescencia emitida por el propio fluorocromo a una cierta concentracion) se determinaron con un fluonmetro.

Los valores de fluorescencia se obtuvieron despues de la sustraccion de los valores de fluorescencia de fondo de los amortiguadores. Para el conjugado fluorescente, la intensidad maxima de fluorescencia se midio que era de 70 UA (unidades arbitrarias), con una concentracion maxima de 5 jM antes de que se observe la desactivacion. Para el fluorocromo, la intensidad maxima de fluorescencia se midio que era de 120 UAy a una concentracion maxima de 10 jM.

El rendimiento cuantico como una medida para la eficacia de la conversion de luz absorbida en luz emitida se calculo para las muestras a una concentracion de 5 jM en la longitud de onda clmica de 680 nm. Para el fluorocromo sin conjugar de la formula (IV), se determino un rendimiento cuantico de 0,26, mientras que para el fluorocromo conjugado se observo un rendimiento cuantico de 0,15, lo que supoma una reduccion de solamente el 43%.

En terminos de uso clmico, en particular durante las cirugfas de reseccion de tumores, el fluorocromo del conjugado fluorescente debena mantener un nivel estable y adecuado de intensidad de fluorescencia durante un tiempo tan prolongado como fuera posible.

El fotoblanqueo o perdida de actividad fluorescente tambien se evaluo a la longitud de onda clmica de excitacion de 680 nm para las muestras del fluorocromo y del conjugado, asf como un fluorocromo de carbocianina comercialmente disponible, Alexa Fluor® 680, que es un tinte que emite en el rojo lejano cuya longitud de onda maxima de absorcion y de emision son similares (absorcion maxima a 679 nm y emision maxima a 702 nm) a las del fluorocromo de la formula (IV). El fotoblanqueo se evaluo tambien para un conjugado preparado de forma analoga al metodo de conjugacion descrito en el ejemplo 3 del mAb quimerico anti-CEA del ejemplo 1 y Alexa Fluor® 680 (se obtuvo una relacion promedio de fluorocromo por anticuerpo de aproximadamente 1,46). Las muestras de estos conjugados se prepararon en PBS a 1*.

Las muestras se prepararon a concentraciones de 5 jM y se expusieron a luz a 680 nm. La intensidad de fluorescencia emitida se midio a intervalos de 0 h, 30 min y 1, 1,5 y 2 h de exposicion a la luz.

Tabla 1: Emision de fluorescencia con el tiempo (Aex = 680 nm)

Tiempo de exposicion (h)

0 0,5 1 1,5 2

Fluorocromo (formula IV)

100,00 79,73 83,29 73,74 66,3

Conjugado del ejemplo 3

100,00 69,59 35,75 25,43 15,14

Alexa-Fluor 680

100,00 52,13 16,22 5,74 2,01

Conjugado Alexa-Fluor 680

100,00 9,04 2,27 0,98 0,62

Despues de 30 minutos de exposicion continua a la longitud de onda clmica de 680 nm, la fluorescencia del conjugado fluorescente es de aproximadamente el 70%, mientras que la fluorescencia emitida del tinte comercial conjugado al mismo anticuerpo es solamente de aproximadamente el 9%. Despues de 1 hora, la intensidad de fluorescencia del

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

tinte comercial, asf como de su conjugado, es casi nula, mientras que aun se mantiene la fluorescencia del conjugado fluorescente y del fluorocromo no conjugado.

Reactividad cruzada de tejidos

Un estudio de la reactividad cruzada de tejido debida al conjugado fluorescente preparado como en el ejemplo 3 con el uso del conjugado marcado con biotina se llevo a cabo en un panel de 42 frotis de sangre y tejidos humanos congelados de tres individuos no relacionados mediante el uso detecnicas inmunohistoqmmicas convencionales. La tincion espedfica con el conjugado de anticuerpos se hallo limitada al tubo digestivo y a otros pocos tejidos, en componentes epiteliales, principalmente en el borde celular apical o en el lado luminal, lo que se ha descrito en la bibliograffa que expresa el CEA, y que confirma la union del anticuerpo solamente a la diana.

Afinidad por el antigeno.

Tambien se determino la afinidad del conjugado fluorescente segun se prepara en el ejemplo 3 por el antigeno carcinoembrionario destinatario mediante el uso de resonancia de plasmones superficiales (SPR) en un dispositivo BIACORE 3000. El antigeno carcinoembrionario se acoplo a un chip CM5 a traves de los grupos tiol (Surface Thiol Coupling GE healthcare; Instruccion 22-0618-10AB). Las tasas de asociacion y disociacion se midieron con 6 concentraciones de flujo diferentes (de 50 nM a 1,5 nM) del anticuerpo monoclonal quimerico del ejemplo 1, del anticuerpo monoclonal m511 (el anticuerpo murino original en el cual se basan las regiones variables del anticuerpo monoclonal quimerico del ejemplo 1) y del conjugado fluorescente. La adquisicion de datos y los calculos de parametros se realizaron con el programa informatico Bia y los programas de evaluacion Bia. La afinidad del anticuerpo monoclonal quimerico del ejemplo 1 por el CEA (3,27 * 10-11 nM) permanecio muy cercana a la del anticuerpo 511 murino parental (3,82 * 10-11 nM) y no se modifico despues de su marcacion con el fluorocromo coloreado en el infrarrojo cercano (la Kd del conjugado fluorescente de ejemplo 3 se midio como 3,21 * 10-11 nM).

Ejemplo 6: Estudios in vivo.

La eficacia del conjugado fluorescente del ejemplo 3 se valoro in vivo en cuatro modelos de raton diferentes que expresaban el CEA humano.

La distribucion por los tejidos del conjugado fluorescente se determino por mediciones de radioactividad con el uso de un tomografo computarizado por emision monofotonica (SPECT) en un modelo de raton de carcinomatosis peritoneal LS-174T que se implanto de acuerdo con los protocolos establecidos. Los ratones atimicos NMRI inmunodeprimidos se sometieron a trasplante de celulas LS-174T mediante la inyeccion intraperitoneal con celulas LS-174T que sobreexpresaban el CEA. Los ratones recibieron la inyeccion por via intravenosa diez dfas mas tarde con 30 y 50 |ig de conjugado fluorescente radiomarcado con 125I (que se preparo por incubacion del conjugado fluorescente con un reactante de yodacion radiomarcador). La visualizacion de los ratones 48 horas despues del tratamiento con 50 |ig del conjugado (realizado en una camara Nano-SPECT-CT [Bioscan®]) revelo que la radioactividad estaba esencialmente limitada a los nodulos tumorales presentes en la cavidad peritoneal de los ratones. Este resultado se correspondfa con las mediciones de biodistribucion de la radioactividad en los diferentes organos obtenidos despues del sacrificio de los animales.

Los estudios de visualizacion de fluorescencia in vivo tambien se realizaron por inyeccion del conjugado fluorescente no radiomarcado en los ratones atimicos NMRI inmunodeprimidos con carcinomatosis peritoneal desarrollada despues de las inyecciones intraperitoneales de celulas tumorales humanas LS-174T que sobreexpresan el CEA. Despues de 12 dfas de desarrollo de la carcinomatosis, los animales recibieron 20 o 30 |ig de conjugado fluorescente por via intravenosa. Despues de 48 horas, los animales fueron sacrificados y la fluorescencia se visualizo con una sonda optima a las longitudes de onda de excitacion y de emision de 680 nm y 700 nm, respectivamente. En ambas dosis, la distribucion de fluorescencia estuvo claramente limitada a los tumores peritoneales, lo que permitio ver con claridad los micronodulos en la cavidad peritoneal, incluida el area del pancreas (figura 1, columna A, tumores in situ visualizados a 700 nm). Los nodulos de menos de 1 mm y con un peso de menos de 1 mg (de 0,2 a 1,7 mg) fueron identificables y fluorescentes (figura 1, columna B, que muestra cada uno de los tumores resecados de los mismos animales que se muestran en la columna A, visualizados a 700 nm). La inyeccion del conjugado fluorescente en los animales sanos y un conjugado fluorescente irrelevante (con un anticuerpo PX, es decir, anticuerpo monoclonal de IgG1 purificado del mieloma de raton MOPC21 [ref. Kohler et al., Eur J Immunol 1976 (6) 292]) como controles no indujo ninguna tincion espedfica.

Notablemente, el conjugado fluorescente permite la visualizacion de nodulos tumorales que sobreexpresan el CEA, independientemente de la ubicacion de los nodulos tumorales, con lo que se imitan asf las condiciones clmicas.

Se utilizo un modelo basado en un modelo de raton ortotopico de cancer colorrectal humano que expresa el CEA de humano (Tseng et al., Vis. Exp. 2007 (10) 484). Las celulas HT29 que sobreexpresan el CEA se inyectaron por via subcutanea en 4 sitios del lomo de ratonas hembra de seis semanas de edad inmunodeprimidas CD1-FOxn1nu para inducir el desarrollo subcutaneo del tumor de colon humano. Se retiraron entonces los pequenos fragmentos de tumor (aproximadamente de 3 mm de diametro) y se trasplantaron en la pared cecal de los animales para inducir el desarrollo de tumores ortotopicos. La pared cecal fue levemente danada para inducir una reaccion inmunitaria y facilitar la

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

infiltracion de las celulas tumorales. Despues del desarrollo de estos tumores, 30 |ig del conjugado fluorescente de acuerdo con la invencion (o de un conjugado fluorescente con un anticuerpo PX irrelevante, como control) se inyectaron por via intravenosa en el animal. La senal fluorescente en el infrarrojo cercano (700 nm) se midio a 0, 4, 24 y 48 horas de la inyeccion con el sistema de captura de imagenes PEARL (Li-Cor Biosciences) para los tumores subcutaneos o el sistema de captura de imagenes intraoperatorias FLARE (Curadel) para los tumores ortotopicos.

Como resultado, se observo con claridad la inmunofotodeteccion intraoperatoria a 700 nm de los tumores en ubicaciones tanto subcutaneas como ortotopicas (figura 2A y figura 2B, respectivamente). La fluorescencia de los tumores subcutaneos fue de un nivel tan alto que era visible a traves de la piel de los animales (figura 2A, fila A) 48 horas despues de la inyeccion de los anticuerpos. Las metastasis hepaticas de tumores humanos que sobreexpresan el CEA tambien se observaron con el conjugado fluorescente de la invencion. Las celulas LS-174T o las celulas de adenocarcinoma de colon humano LoVo se inyectaron en el bazo de ratones atfmicos Balb/c inmunodeprimidos tal como se describe en los protocolos publicados (ref. Tibbetts et al., Cancer 1993, (71), 315-21). Ambos tipos de celulas sobreexpresan el CEA e inducen el desarrollo de metastasis hepaticas, pero siguen diferentes patrones. Las celulas LoVo inducen la diseminacion de muchas metastasis pequenas por la superficie del hngado, mientras que las celulas LS-174T inducen la formacion de tan solo unas pocas metastasis mas grandes. Los ratones recibieron 30 |ig del conjugado fluorescente 48 horas antes de la visualizacion de la fluorescencia a 700 nm. Como control, a los ratones se les inyecto un conjugado irrelevante basado en el anticuerpo PX. Se hallo que los nodulos tumorales de un tamano muy pequeno, por ejemplo, micrometastasis en la superficie del hngado, que no fueron detectables, es decir, visibles, a simple vista, podnan detectarse con fluorescencia en el raton que tema inyectado el conjugado fluorescente, lo que definio el contorno de estos tumores. Ademas, se demostro que se podfan ver las metastasis hepaticas independientemente de la lmea celular de los nodulos tumorales. No se detectaron tumores en el control.

Se realizo un estudio similar con un modelo para tumores pancreaticos. Se utilizaron en el estudio ratonas hembra inmunodeprimidas CD1-Foxn1nu atfmicas de seis semanas de edad, y se anestesiaron con isoflurano durante la inoculacion de tumor y los procedimientos de toma de imagenes. Los tumores pancreaticos ortotopicos se obtuvieron tal como se describe en Kim et al., Nat. Protoc., 2009, 4, 1670-80. El bazo y el pancreas de los animales fueron ambos externalizados lateralmente a traves de una excision lateral para dejar expuesto todo el pancreas. Se paso una aguja fina paralela a la vasculatura dentro del pancreas a traves de la cual se inyectaron 500.000 celulas BXPC-3-luc2 (lmea celular transfectada con luciferasa). El crecimiento de los tumores ortotopicos se vigilo semanalmente mediante imagenes de bioluminiscencia (BLI), lo que se realizo mediante la inyeccion de 150 mg/kg de una solucion de D- luciferina (SynChem, Inc.) en PBS por via intraperitoneal en un volumen total de 50 pL, 10 minutos antes de la toma de imagenes con el sistema de captura de imagenes de espectro IVIS (Pekin Elmer Life Sciences). Una vez que los tumores ortotopicos fueron detectables por BLI, se inyectaron 30 |ig del conjugado fluorescente por via intravenosa a traves de la vena de la cola de los animales. Los animales se sacrificaron 48 horas despues de la inyeccion, y se examinaron al infrarrojo cercano a 700 nm. Se vefan con claridad los tumores pancreaticos ortotopicos. No se vio nada en los ratones de control inyectados con conjugado inespedfico ni con el tinte de fluorocromo solamente.

Se calculo la relacion de senal-ruido mediante las senales fluorescentes del NIR medidas con el sistema de captura de imagen de animales pequenos Pearl Impulse (LI-COR). Las imagenes se normalizaron y las regiones de interes se seleccionaron para analisis. La senal media espedfica del tumor se dividio por la senal media del tejido circundante para proporcionar las relaciones medias de senal-ruido. Se utilizo una ANOVA de doble cola de mediciones repetidas con la correccion Bonferroni para determinar las relaciones significativas de senal-ruido a partir de diferentes grupos en todos los puntos temporales. A diferencia del tinte de fluorocromo libre, o del conjugado de control irrelevante, que tuvieron valores de relacion de senal-ruido cercanos a 1, la relacion de senal-ruido para el conjugado fluorescente fue mayor que 3.

El analisis inmunohistoqmmico de las resecciones de tumores subcutaneos BXPC-3 tenidos con hematoxilina y eosina confirmo que el conjugado fluorescente estaba unido al tumor, a diferencia de los controles, en los que solamente aparecieron tinciones inespedficas alrededor de las celulas tumorales.

En resumen, se hallo que el conjugado fluorescente, tal como se preparo de acuerdo con el ejemplo 3, permitio la identificacion in vivo de nodulos tumorales que sobreexpresan el CEA, independientemente de la ubicacion de los tumores, y el origen (es decir, colorrectal frente a pancreatico) del tumor, lo que confirmo la capacidad de actuacion selectiva del conjugado fluorescente. Se observo un alto nivel de senal en relacion al ruido, lo que permitio la deteccion de nodulos muy pequenos invisibles a simple vista.

Los estudios farmacologicos para determinar la seguridad y toxicidad de la administracion intravenosa del conjugado fluorescente tambien demostraron que no hubo efectos adversos significativos sobre los sistemas nerviosos central y periferico en las ratas Wistar, ni tampoco sobre las funciones cardiovasculares y respiratorias en los perros Beagle, y que el conjugado se tolera bien hasta las concentraciones de dosis maxima verificadas de 40 mg/kg por dfa en las ratas (85 veces la dosis clmica pretendida) y 5 mg/kg (10 veces la dosis clmica pretendida) en los perros.

Ejemplo 7: Estudios clmicos

(a) Carcinomatosis peritoneal: Un estudio clmico para valorar la seguridad y el comportamiento de un conjugado del ejemplo 3 en 15 pacientes humanos con carcinomatosis peritoneal (tumores metastasicos) de origen digestivo.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Se administraron dosis del conjugado fluorescente del ejemplo 3 en el margen de 5 a 15 mg por inyeccion intravenosa. Los resultados preliminares muestran que no se observaron reacciones adversas en ninguna de estas dosis.

(b) Canceres colorrectal y pancreatico: Un estudio clmico para valorar la seguridad y el comportamiento del conjugado de anticuerpo fluorescente del ejemplo 3 en 30 pacientes humanos con cancer de recto o de pancreas.

Se llevo a cabo un estudio con una dosis de 5 mg del conjugado fluorescente inyectado por via intravenosa 48 horas antes de la cirugfa. En los pacientes estudiados hasta ese momento no se notifico ningun efecto adverso durante las dosificaciones ni directamente despues de las dosis mismas. En general, no se observaron cambios clmicamente significativos de los valores iniciales en los signos vitales.

Los resultados preliminares demuestran una localizacion muy clara de la fluorescencia en los sitios sospechados de tumor. Se realizo la visualizacion intraoperatoria con un sistema de captura de imagenes Artemis Open (Quest Medical Imaging) configurado con los parametros adecuados para el conjugado fluorescente.

En un paciente con cancer pancreatico, el uso del conjugado fluorescente llevo a la identificacion de celulas tumorales ubicadas en una region que normalmente se hubiera considerado un margen de reseccion libre de tumor alrededor del tumor primario localizado en el cuerpo del pancreas (es decir, lo que conlleva la retencion de tejido tumoral), basandose unicamente en la inspeccion visual y la palpacion (figura 3: el margen de reseccion propuesto segun se determina unicamente por inspeccion visual y palpacion esta representado por la lmea discontinua, que hubiera estado demasiado cerca del tejido tumoral, cuyo volumen esta representado por la lmea punteada. El margen de reseccion propuesto segun se determina por fluorescencia esta representado por las lmeas continuas). Debido a la presencia de muchas metastasis peritoneales, solamente se realizo exploracion y estadificacion, es decir, solamente se resecaron las metastasis para biopsia y posterior analisis en la mesa de instrumental del quirofano. El conjugado fluorescente proporciono una clara demarcacion de los focos, asf como los margenes de las metastasis tanto in vivo como ex vivo en el tumor aislado tras la reseccion (figura 3, fila A: imagen de una metastasis in vivo a la luz blanca y con fluorescencia [imagen en superposicion]; figura 3, fila B: imagen de la metastasis aislada ex vivo a la luz blanca y con fluorescencia [imagen en superposicion]).

Se observaron resultados similares en otro paciente con cancer pancreatico despues de la administracion del conjugado fluorescente. Se observo que la fluorescencia delimitaba claramente el tumor sospechoso, que estaba localizado cerca de la cabeza del pancreas.

A un paciente al que se le diagnostico metastasis colorrectal se le administro una dosis de 5 mg del conjugado fluorescente 48 horas antes de la reseccion. La dosis fue bien tolerada sin que se observaran acontecimientos adversos. Se detecto una clara senal fluorescente en del nodulo linfatico parailfaco del lado izquierdo donde se sospechaba que estaba la metastasis, con delineacion de la metastasis. Se realizo una reseccion satisfactoria.

A un paciente con carcinoma rectal localmente avanzado se le administro tambien una dosis de 5 mg del conjugado fluorescente. La dosis fue bien tolerada sin deteccion de acontecimientos adversos. Se realizo una reseccion anterior baja laparoscopica. El tejido de recto resecado fue visualizado en la mesa de instrumental del quirofano. Se observo una clara delineacion del tejido tumoral en el tejido resecado.

Listado de secuencias

<110> SurgiMab S.A.S

<120> Conjugados fluorescentes

<130> SRG15P01PC

<150> EP15170617.3

<151 >

<160> 4

<170> BiSSAP 1.3.6

<210> 1 <211> 441

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Mus musculus con sitios de restriccion Kpnl y Nhel <400> 1

10

15

ccaccatgga

ctccagactg aacctggtgt tcctggtgct gatcctgaag 60

gegaegtgea

gctggtggaa tctggcggag gactggtgca gcctggcggc 120

tgtcttgtgc

cgcctccggc ttcaccttct ccaacttcgg catgcactgg 180

cccctgagaa

gggcctggaa tgggtggcct atatctccgg cggctcctcc 240

tcgccgacac

cctgaaggga cggttcacca tctcccggga caaccccaag 300

ttctgcagat

gacctccctg eggagegagg acaccgccat ctactactgc 360

actacatcaa

caactactgg taettegaeg tgtggggcgc tggcaccacc 420

catctgctag

c 441

ggtaccgccg

ggcgtgcagt

tccagaaagc

atccggcagg

accatctact

aacaccctgt

gccagagact

gtgacagtgt

<210> 2 <211> 402 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Mus musculus con sitios de restriction Sail y BsiWI <400> 2

gtcgacgccg ccaccatgga atttcagacc caggtgttcg tgttcgtgct gctgtggctg tctggcgtgg acggcgacat cgtgatgacc cagtcccaga aattcatgtc cacctccgtg ggcgaccggg tgtccatcac atgcaaggcc tctcagaacg tgcggagcgc cgtggcctgg tatcagcaga cacctggcca gagccccaag gccctgatct acctggcctc caacagatac accggcgtgc ccgatcggtt caccggctct ggctctggca ccgacttcac cctgaccatc tccaacgtgc agtccgagga cctggccgac tacttctgtc tgcaacactg gaactacccc ctgaccttcg gcggaggcac caagctggaa ctgaagcgta eg

<210> <211 > <212> <213>

3

121

PRT

Mus musculus

<400> 3

Asp 1

Ser

Gly

Ala

Lys 65 Leu

Ala

Ala

Val

Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly

5 10 15

Arg

Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe

20 25 30

Met

His Trp lie Arg Gin Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Tyr

lie Ser Gly Gly Ser Ser Thr He Tyr Phe Ala Asp Thr Leu

50

55 60

Gly

Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Pro Lys Asn Thr Leu Phe

70 75 80

Gin

Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala lie Tyr Tyr Cys

85 90 95

Arg

Asp Tyr Tyr He Asn Asn Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly

100 105 110

Gly

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

60

120

180

240

300

360

402

5

<211> 107

<212> PRT <213> Mus musculus

<400> 4

Asp lie Val Met Thr Gin Ser Gin Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 15 10 15

Asp Arg Val Ser lie Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asn Val Arg Ser Ala 20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gin Gin Thr Pro Gly Gin Ser Pro Lys Ala Leu lie 35 40 45

Tyr Leu Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Asn Val Gin Ser

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Leu Gin His Trp Asn Tyr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 5 100 105

Claims (13)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un conjugado fluorescente que comprende un resto de fluorocromo F acoplado a un resto selectivo T, en donde el resto F tiene la formula (I):

   imagen1

   5

   10

   en donde

   Y es seleccionado independientemente y para cada caso entre SO3H, SO3- y SO3M, en donde M es un cation monovalente o Y se selecciona entre SO3- y SO3Na;

   x, z e y son independientemente seleccionados de un entero de 1 a 8;

   y en donde el resto T tiene afinidad por un marcador tumoral.
2. 2. El conjugado de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde el resto F tiene la formula (II):

   imagen2
3. 3. El conjugado de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2, en donde el marcador tumoral es un antigeno tumoral, y en donde el antfgeno tumoral es opcionalmente el antigeno carcinoembrionario (CEA).
4. 4. El conjugado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el resto T se selecciona entre 15 un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, y una protema de fusion que comprende por lo menos una region variable

   de un anticuerpo; y en donde el anticuerpo es opcionalmente un anticuerpo monoclonal quimerico (mAb).
5. 5. El conjugado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el resto T es un anticuerpo monoclonal quimerico que se une a uno o varios epftopos del antigeno CEA.
6. 6. El conjugado de acuerdo con la reivindicacion 5, en donde el resto F tiene la formula (II), y en donde el anticuerpo 20 monoclonal quimerico esta dirigido contra el epftopo GOLD-2 del CEA, comprende cadenas pesadas del alotipo G1m3

   y cadenas ligeras del alotipo km3, en donde cada cadena pesada y cada cadena ligera comprende por lo menos un dominio variable de IgG1 de raton y por lo menos un dominio constante humano.
7. 7. El conjugado de acuerdo con la reivindicacion 6, en donde el anticuerpo monoclonal quimerico comprende una region variable de cadena ligera de SEQ ID n.° 4 y una region variable de cadena pesada de SEQ ID n.° 3.

   25 8. El conjugado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde n restos F estan acoplados a

   un resto T, y en donde n es un entero seleccionado de 1 a 4.
8. 9. Una composicion que comprende el conjugado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde, opcionalmente

   (a) la composicion esta esteril y comprende un amortiguador acuoso y L-arginina;

   (b) la composicion comprende un compuesto que comprende el resto T que no esta acoplado al resto F, y/o

   (c) el grado medio de conjugacion del conjugado en la composicion es de aproximadamente 0,5 a 3.
9. 10. Un metodo para la preparacion de un conjugado fluorescente, que comprende las etapas de

   5 (a) dar a conocer un fluorocromo que tiene la formula (III):

   co2z

   (ch2)

   imagen3

   en donde Y es seleccionado independientemente para cada caso entre SO3H, SO3" y SO3M, en donde M es un cation monovalente, o Y se selecciona entre SO3" y SO3Na;

   x, z e y son independientemente seleccionados de un entero de 1 a 8, y

   10 Z se selecciona entre un contraion, hidrogeno, succinimidilo, sulfosuccinimidilo, y nitrofenilo,

   (b) dar a conocer un agente selectivo que tiene afinidad por un marcador tumoral; y

   (c) acoplar el fluorocromo con el agente selectivo.
10. 11. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 10, en donde el agente selectivo es un anticuerpo monoclonal quimerico que tiene afinidad por el CEA, y/o en donde el fluorocromo es un compuesto de la formula (IV):

    15

    Na03S

    imagen4

    S03' S03Na
11. 12. El uso in vitro del conjugado de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 8 o la composicion de acuerdo con la reivindicacion 9, para la deteccion de una celula tumoral en una muestra, o para diagnosticar y/o vigilar un tumor.
12. 13. El conjugado de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 8 o la composicion de acuerdo con la reivindicacion 9, para ser usados como un medicamento o un agente de diagnostico.

    20 14. El conjugado de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 8 o la composicion de acuerdo con la reivindicacion 9, para

    ser usados en

    (a) detectar focos de un tumor que expresa el marcador tumoral o para determinar la ubicacion de un tumor que expresa el marcador tumoral en un paciente, y/o

    (b) detectar celulas tumorales o tejido tumoral en un margen de reseccion en un paciente que esta sometido, o que se ha sometido, a cirugfa de reseccion de un tumor que expresa el marcador tumoral.
13. 15. El conjugado o la composicion para ser usado de acuerdo con la reivindicacion 13 o 14, en donde el uso comprende las etapas de

    5 (a) administrar el conjugado o composicion a un paciente que padece un tumor;

    (b) comenzar la cirugfa de reseccion de tumor en dicho paciente;

    (c) iluminar un tejido en un sitio de reseccion del paciente que es sometido a la cirugfa de reseccion con luz que tiene una longitud de onda de aproximadamente 660 a 700 nm, en donde la etapa (b) se realiza en un plazo de tiempo de no mas de aproximadamente 96 horas despues de la etapa (a).

    10 16. El conjugado o la composicion para ser usado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15:

    en donde el tumor es un cancer colorrectal, gastrico, biliar, pancreatico, esofagico, ovarico, mamario, de prostata, hngado o pulmon; o

    en donde el tumor es un tumor digestivo maligno, y en donde el conjugado es el conjugado de acuerdo con la reivindicacion 6 o 7; y

    15 en donde el conjugado o la composicion se administra opcionalmente por via topica, por inhalacion, o por inyeccion intravenosa, intraperitoneal, subcutanea o intramuscular, o perfusion.