ES2667258T3

ES2667258T3 - Anticuerpos multivalentes

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Publication number: ES2667258T3
Application number: ES10754975.0T
Authority: ES
Inventors: Ralph Adams; Emma Dave; David Paul Humphreys
Original assignee: UCB Biopharma SRL
Current assignee: UCB Biopharma SRL
Priority date: 2009-09-10
Filing date: 2010-09-10
Publication date: 2018-05-10
Anticipated expiration: 2030-09-10
Also published as: EP2475682B1; US20160333105A1; US10421816B2; WO2011030107A1; EP2475682A1; US20120283415A1

Abstract

Un anticuerpo recombinante o una cadena pesada y cadena ligera asociada del mismo que comprende: una cadena pesada que comprende un fragmento de región constante, estando localizado dicho fragmento de región constante entre dos dominios variables que no son un par cognado, comprendiendo además la cadena pesada una región Fc con al menos un dominio seleccionado de CH2, CH3 y combinaciones de los mismos, con la condición de que la cadena pesada no contenga más de un dominio CH1 y contenga solo dos dominios variables, y una cadena ligera que comprende un fragmento de región constante localizado entre dos dominios variables que no son un par cognado, en el que dichas cadenas pesada y ligera están alineadas para proporcionar un primer sitio de unión formado por un primer par cognado de dominios variables y un segundo sitio de unión formado por un segundo par cognado de dominios variables; y en el que el anticuerpo recombinante es biespecífico, y en el que el fragmento de región constante de la cadena pesada consiste en un dominio CH1 o un dominio CL con la condición de que cuando el fragmento de región constante en la cadena pesada sea un dominio CH1, el fragmento de región constante en la cadena ligera consista en un dominio CL, y cuando el fragmento de región constante de la cadena pesada sea un dominio CL, el fragmento de región constante de la cadena ligera consista en un dominio CH1.

Description

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44 y el residuo de cisteína genomanipulado de VL está en posición 100.

En una realización, hay un enlace disulfuro entre los dominios variables que forman un primer sitio de unión, por ejemplo en el primer par cognado.

En una realización, hay un enlace disulfuro entre los dominios variables que forman un segundo sitio de unión, por ejemplo en el segundo par cognado.

En una realización, hay un enlace disulfuro entre los dominios variables que forman un primer sitio de unión y un enlace disulfuro adicional entre los dominios variables que forman un segundo sitio de unión. Se apreciará que las localizaciones de los pares de cisteína en cada de uno de los pares cognados pueden ser iguales o diferentes.

En una o más realizaciones de la presente memoria, no hay enlaces disulfuro intercatenarios en las regiones Fc, por ejemplo en la región de bisagra de las mismas.

Como alternativa, una o más realizaciones de la presente memoria pueden proporcionarse con uno o más (tales como dos) enlaces disulfuro en las regiones Fc, tal como la región de bisagra de las mismas.

En una realización, hay un enlace disulfuro entre los pares de dominios variables que forman un primer sitio de unión y/o los dominios variables que forman un segundo sitio de unión y uno o más enlaces disulfuro entre las regiones Fc, tal como la región de bisagra de las mismas.

En una realización, hay un enlace disulfuro entre los dominios variables del primer par cognado y/o los dominios variables del segundo par cognado y un enlace disulfuro entre los fragmentos de región constante, tales como CH o

CL. Estos últimos pueden incluir opcionalmente uno o más enlaces disulfuro entre las regiones Fc, tales como la región de bisagra de las mismas.

Un enlace o enlaces disulfuro en la región Fc puede estar en un área correspondiente aproximadamente a la región de bisagra en anticuerpos naturales.

Pueden emplearse regiones Fc modificadas, por ejemplo como se divulga en el documento WO2008/131242.

En una realización, el fragmento de región constante, por ejemplo en la cadena pesada, comprende un dominio CH1. En una realización, el fragmento de región constante consiste en un dominio CH1. En una realización, se usa un dominio CH1 modificado que termina en la cisteína intercatenaria, por ejemplo en posición 233 (Numeración de Kabat en la 4ª edición de 1987) de IgG1. La secuencia de un CH1 de IgG1 modificado que termina en la cisteína intercatenaria se proporciona en la Figura 5 (SEQ ID NO: 70).

En una realización, el fragmento de región constante, por ejemplo en la cadena ligera, comprende un dominio CL. En una realización, el fragmento de región constante en la cadena ligera consiste en un dominio CL. En una realización, el fragmento de región constante en la cadena ligera consiste en cKappa o cLambda.

En una realización, la cadena ligera comprende un dominio CL. En una realización, la región constante en la cadena ligera consiste en un dominio CL, por ejemplo cKappa (SEQ ID NO:81).

Por consiguiente, en una realización, se proporciona un anticuerpo recombinante o un componente de cadena pesada/ligera del mismo que comprende:

una cadena pesada que comprende un fragmento de región constante consistente en CH1,

estando localizado dicho fragmento de región constante entre dos dominios variables que no son un par cognado,

comprendiendo además la cadena pesada una región Fc con al menos un dominio seleccionado de CH2, CH3 y combinaciones de los mismos,

con la condición de que la cadena pesada contenga solo un CH1 y contenga solo dos dominios variables, y

una cadena ligera que comprende un fragmento de región constante consistente en un dominio CL localizado entre dos dominios variables que no son un par cognado,

en el que dichas cadenas pesada y ligera están alineadas para proporcionar un primer sitio de unión formado por un primer par cognado de dominios variables y un segundo sitio de unión formado por un segundo par cognado de dominios variables,

En una realización, la región Fc comprende dominios CH2 y/o CH3. En una realización, el fragmento Fc N-terminal es -CH2CH3, véase por ejemplo CH2CH3 de IgG1 como se muestra en la Figura 9 (SEQ ID NO: 87). En una realización alternativa, la región Fc comprende o consiste en -CH2CH3CH2CH3 N-terminal. Esta última puede estar proporcionada con un ligante entre el CH3 medio y CH2 (tal como -CH2CH3liganteCH2CH3) para permitir al CH2CH3 terminal flexibilidad para alinearse con el primer CH2CH3 (que está enlazado con el extremo C del resto de la molécula). Véase por ejemplo el documento WO2008/012543. Esta disposición de Fc puede prolongar la semivida

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y/o permitir flexibilidad para controlar/proporcionar fragmentos de anticuerpo que no son reticulantes, si se desea.

En una realización, desde el extremo N la cadena pesada se dispone como sigue: un dominio variable (por ejemplo del primer par cognado), CH1 y un dominio variable (por ejemplo del segundo par cognado), CH2 y CH3. En esta disposición, CH1 puede estar fusionado, por ejemplo, con el dominio variable de, por ejemplo, el primer par cognado y ligado a través de un péptido con el dominio variable de, por ejemplo, el segundo par cognado.

En un ejemplo, el extremo N de CH1 está fusionado con el extremo C de un dominio variable del primer par cognado y el extremo C de CH1 está ligado a través de un péptido con el extremo N de un dominio variable del segundo par cognado.

En una realización, desde el extremo N la cadena pesada se dispone como sigue: un VH (por ejemplo del primer par cognado), un CH1, un VH (por ejemplo del segundo par cognado), CH2 y CH3, por ejemplo en esta disposición CH1 puede estar fusionado con un VH, por ejemplo del primer par cognado, y ligado a través de un péptido con el VH de, por ejemplo, el segundo par cognado.

En una realización, desde el extremo N la cadena pesada se dispone como sigue: un VL (por ejemplo del primer par cognado), un CH1, un VL (por ejemplo del segundo par cognado), CH2 y CH3, por ejemplo en esta disposición CH1 puede estar fusionado con un VL de, por ejemplo, el primer par cognado, y ligado a través de un péptido con el VL de, por ejemplo, el segundo par cognado.

En una realización, desde el extremo N la cadena pesada se dispone como sigue: un VH (por ejemplo del primer par cognado), un CH1, un VL (por ejemplo del segundo par cognado), CH2 y CH3, por ejemplo en esta disposición CH1 puede estar fusionado con el VH del primer par cognado, y ligado a través de un péptido con el VL de, por ejemplo, el segundo par cognado.

En una realización, desde el extremo N la cadena pesada se dispone como sigue: un VL (por ejemplo del primer par cognado), un CH1, un VH (por ejemplo del segundo par cognado), CH2 y CH3, por ejemplo en esta disposición el CH1 puede estar fusionado con el VL de, por ejemplo, el primer par cognado, y ligado a través de un péptido con el VH de, por ejemplo, el segundo par cognado.

En una realización, desde el extremo N la cadena ligera se dispone como sigue: un VL (por ejemplo de un primer par cognado), un CL y un VL (por ejemplo de un segundo par cognado), por ejemplo un CL puede estar fusionado con el VL de, por ejemplo, el primer par cognado y ligado a través de un péptido con el VL de, por ejemplo, el segundo par cognado.

En un ejemplo, el extremo N del dominio CL está fusionado con el extremo C de un dominio variable del primer par cognado y el extremo C del dominio CL está ligado a través de un péptido con el extremo N de un dominio variable del segundo par cognado.

En una realización, desde el extremo N la cadena ligera se dispone como sigue: un VL (por ejemplo de un primer par cognado), un CL y un VH (por ejemplo de un segundo par cognado), por ejemplo CL puede estar fusionado con el VL de, por ejemplo, el primer par cognado y ligado a través de un péptido con el VH de, por ejemplo, el segundo par cognado.

En una realización, desde el extremo N la cadena ligera se dispone como sigue: un VH (por ejemplo de un primer par cognado), un CL y un VL (por ejemplo de un segundo par cognado), por ejemplo un CL puede estar fusionado con el VH de, por ejemplo, el primer par cognado y ligado a través de un péptido con el VL de, por ejemplo, el segundo par cognado.

En una disposición alternativa, el CL en la cadena ligera se reemplaza por CH1 y se proporciona a la cadena pesada un CL, por ejemplo reemplazando al dominio CH1 de la misma.

Las cadenas pesada y ligera se elegirán para forman los dominios de unión requeridos.

En una realización, los componentes de cadena pesada/ligera individuales se unen entre sí proporcionando un anticuerpo por un enlace disulfuro, por ejemplo en la región de bisagra de las cadenas pesadas. Pueden emplearse bisagras modificadas como en la Tabla 1.

Se han descrito ya una serie de regiones de bisagra modificadas, por ejemplo en los documentos US5.677.425, US6642356, WO9915549, WO2005003170, WO2005003169, WO2005003170, WO9825971 y WO2005003171. La bisagra se localizará habitualmente entre el segundo dominio variable en la cadena pesada y la región Fc (CH2CH3). Los ejemplos particulares de bisagras incluyen aquellas mostradas en la Tabla 1.

Tabla 1. Secuencias ligantes de bisagra

SEQ ID NO:: SECUENCIA

1: DKTHTCAA

2: DKTHTCPPCP A

3: DKTHTCPPCPATCPPCPA

4: DKTHTCPPCPATCPPCPATCPPCPA

5: DKTHTCPPCPAGKPTLYNSLVMSDTAGTCY

6: DKTHTCPPCP AGKPTHVNVSVVMAEVDGTCY

7: DKTHTCCVECPPCPA

8: DKTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPA

9: DKTHTCPSCPA

En un ejemplo, la región Fc comprende además una región de bisagra consistente en la secuencia dada en una cualquiera de las SEQ ID NO 1-9. En un ejemplo, la región Fc tiene la secuencia dada en la Figura 5 (SEQ ID 5 NO:76).

La disposición de CL en la cadena ligera y de CH1 en el fragmento de región constante de cadena pesada se piensa que minimiza la dimerización inapropiada.

Los inventores creen que proporcionar dominios variables como pares cognados en el Construcción final esto optimiza y mantiene las propiedades de unión a antígeno del sitio de unión formado por el par relevante.

10 Se cree que los puentes disulfuro en los pares cognados son ventajosos porque ayudan a estabilizar el formato.

Se dan a continuación ejemplos de ligantees peptídicos adecuados, por ejemplo en la Tabla 2.

Tabla 2. Secuencias ligantes flexibles

SEQ ID NO:: SECUENCIA

10: SGGGGSE

11: DKTHTS

12: (S)GGGGS

13: (S)GGGGSGGGGS

14: (S)GGGGSGGGGSGGGGS

15: (S)GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS

16: (S)GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS

17: AAAGSG-GASAS

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SEQ ID NO:: SECUENCIA

43: NPSLNPPSYLHRAPSRIS

44: LPWRTSLLPSLPLRRRP

45: PPLFAKGPVGLLSRSFPP

46: VPPAPVVSLRSAHARPPY

47: LRPTPPRVRSYTCCPTP

48: PNVAHVLPLLTVPWDNLR

49: CNPLLPLCARSPAVRTFP

(S) es opcional en las secuencias 13 a 16.

Los ejemplos de ligantees rígidos incluyen las secuencias peptídicas GAPAPAAPAPA (SEQ ID NO:64), PPPP (SEQ ID NO:65) y PPP. En una realización, el ligante peptídico es un péptido de unión a albúmina. Se proporcionan ejemplos de péptidos de unión a albúmina en el documento WO 2007/106120 e incluyen:

Tabla 3

SEQ ID NO:: SECUENCIA

50: DLCLRDWGCLW

51: DICLPRWGCLW

52: MEDICLPRWGCLWGD

53: QRLMEDICLPRWGCLWEDDE

54: QGLIGDICLPRWGCLWGRSV

55: QGLIGDICLPRWGCLWGRSVK

56: EDICLPRWGCLWEDD

57: RLMEDICLPRWGCLWEDD

58: MEDICLPRWGCLWEDD

59: MEDICLPRWGCLWED

60: RLMEDICLARWGCLWEDD

61: EVRSFCTRWPAEKSCKPLRG

62: RAPESFVCYWETICFERSEQ

63: EMCYFPGICWM

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Típicamente, estos ligantees peptídicos se usan para conectar el extremo C de CH1 con el extremo N del dominio variable del segundo par cognado (típicamente VH) y el extremo C de CL con el extremo N de un dominio variable del segundo par cognado (típicamente VL). Por consiguiente, el ligante peptídico puede ser uno cualquiera de los ligantees proporcionados en las SEQ ID NO 10-65 o PPPP o GS. En un ejemplo, el ligante puede ser uno cualquiera de los ligantees proporcionados en las SEQ ID NO 13-16 pero que carece de la serina N-terminal (S). Preferiblemente, el ligante peptídico es SGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:72).

Se apreciará que pueden hacerse una o más sustituciones, adiciones y/o deleciones aminoacídicas en los dominios variables de anticuerpo proporcionados por la presente invención sin alterar significativamente la capacidad del anticuerpo de unirse al antígeno diana y neutralizar la actividad del mismo. El efecto de cualquier sustitución, adición y/o deleción aminoacídica puede probarse fácilmente por un especialista en la materia, por ejemplo usando ensayos in vitro, por ejemplo un ensayo BIAcore.

Los dominios de región constante de la molécula de anticuerpo de la presente invención, si están presentes, pueden seleccionarse teniendo en cuenta la función propuesta de la molécula de anticuerpo, y en particular las funciones efectoras que puedan requerirse. Por ejemplo, los dominios de región constante pueden ser dominios de IgA, IgD, IgE, IgG o IgM humanos. En particular, pueden usarse dominios de región constante de IgG humanos, especialmente de los isotipos IgG1 e IgG3, cuando la molécula de anticuerpo se pretende para usos terapéuticos y se requieren funciones efectoras de anticuerpo. Como alternativa, pueden usarse los isotipos IgG2 e IgG4 cuando la molécula de anticuerpo se pretenda para fines terapéuticos y no se requieran funciones efectoras de anticuerpo. Se apreciará que pueden usarse también las variantes de secuencia de estos dominios de región constante. Por ejemplo, pueden usarse moléculas de IgG4 en que la serina en posición 241 se ha cambiado por prolina como se describe en Angal et al., Molecular Immunology, 1993, 30 (1), 105-108. Se entenderá también por un especialista en la materia que los anticuerpos pueden experimentar una variedad de modificaciones postraduccionales. El tipo y extensión de estas modificaciones a menudo dependen de la estirpe celular hospedadora usada para expresar el anticuerpo así como de las condiciones de cultivo. Tales modificaciones pueden incluir variaciones de glicosilación, oxidación, formación de dicetipiperazina, isomerización de aspartato y desamidación de asparagina. Es una modificación frecuente la pérdida del residuo básico carboxiterminal (tal como lisina o arginina) debido a la acción de carboxipeptidasas (como se describe en Harris, RJ. Journal of Chromatography 705: 129-134, 1995). Por consiguiente, la lisina C-terminal de la cadena del dominio Fc de anticuerpo dada en las Figuras 5 y 9 y las SEQ ID NO: 76 y 87 puede estar ausente.

En una realización, la cadena pesada de anticuerpo comprende un dominio CH1 y la cadena ligera de anticuerpo comprende un dominio Cl, o bien kappa o bien lambda.

Las moléculas de anticuerpo de la presente divulgación tienen adecuadamente una alta afinidad de unión por cada antígeno, en particular picomolar. La afinidad puede medirse usando cualquier método adecuado conocido en la materia, incluyendo BIAcore. En una realización, la molécula de anticuerpo de la presente divulgación tiene una afinidad de unión de aproximadamente 100 pM o mejor. En una realización, la molécula de anticuerpo de la presente divulgación

tiene una afinidad de unión de aproximadamente 50 pM o mejor. En una realización, la molécula de anticuerpo de la presente divulgación tiene una afinidad de unión de aproximadamente 40 pM o mejor. En una realización, la molécula de anticuerpo de la presente divulgación tiene una afinidad de unión de aproximadamente 30 pM o mejor. En una realización, la molécula de anticuerpo de la presente divulgación es totalmente humana o humanizada y tiene una afinidad de unión de aproximadamente 100 pM o mejor.

Las moléculas de anticuerpo o componentes de cadena pesada/ligera del mismo de la presente divulgación pueden unirse a uno o más antígenos de interés y son capaces de unirse a al menos dos antígenos simultáneamente.

En un ejemplo, el primer par cognado de dominios variables se une al primer antígeno de interés, mientras que el segundo par cognado de dominios variable se une a un segundo antígeno de interés.

En una realización, un antígeno de interés unido por la molécula de anticuerpo o componente de cadena pesada/ligera del mismo puede ser una proteína asociada a célula, por ejemplo una proteína de superficie celular sobre células tales como células bacterianas, células de levadura, linfocitos T, células endoteliales o células tumorales, o puede ser una proteína soluble. Los antígenos de interés pueden ser también cualquier proteína médicamente relevante tal como aquellas proteínas reguladas positivamente durante enfermedad o infección, por ejemplo receptores y/o sus ligandos correspondientes. Los ejemplos particulares de proteínas de superficie celular incluyen moléculas de adhesión, por ejemplo integrinas tales como integrinas β1, p.ej. VLA-4, E-selectina, P selectina o L-selectina, CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD11a, CD11b, CD18, CD19, CD20, CD23, CD25, CD33, CD38, CD40, CD45, CDW52, CD69, CD134 (OX40), ICOS, BCMP7, CD137, CD27L, CDCP1, DPCR1, DPCR1, dudulina2, FLJ20584, FLJ40787, HEK2, KIAA0634, KIAA0659, KIAA1246, KIAA1455, LTBP2, LTK, MAL2, MRP2, similar a nectina 2, NKCC1, PTK7, RAIG1, TCAM1, SC6, BCMP101, BCMP84, BCMP11, DTD, antígeno carcinoembrionario (CEA), globulina de grasa de leche humana (HMFG1 y 2), antígenos de MHC de clase I y MHC

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granulocitos-macrófagos (GM-CSF), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor de crecimiento nervioso (NGF) u otros factores de crecimiento e inmunoglobulinas.

Otras moléculas efectoras pueden incluir sustancias detectables útiles, por ejemplo, en diagnóstico. Los ejemplos de sustancias detectables incluyen diversas enzimas, grupos protésicos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes, nucleidos radiactivos, metales emisores de positrones (para uso en tomografía de emisión de positrones) e iones metálicos paramagnéticos no radiactivos. Véase en general la patente de EE.UU. nº 4.741.900 para iones metálicos que pueden conjugarse con anticuerpos para uso como diagnóstico. Las enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa o acetilcolinesterasa; los grupos protésicos adecuados incluyen estreptavidina, avidina y biotina; los materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina, fluoresceína, cloruro de dansilo y ficoeritrina; los materiales luminiscentes adecuados incluyen Luminol; los materiales bioluminiscentes adecuados incluyen luciferasa, luciferina y aecuorina y los nucleidos radiactivos adecuados incluyen 125I, 131I, 111In y 99Tc.

En otro ejemplo, la molécula efectora puede aumentar la semivida del anticuerpo in vivo, y/o reducir la inmunogenicidad del anticuerpo y/o potenciar el suministro de un anticuerpo a través de una barrera epitelial al sistema inmunitario. Los ejemplos de moléculas efectoras adecuadas de este tipo incluyen polímeros, albúmina, proteínas de unión a albúmina o compuestos de unión a albúmina tales como aquellos descritos en el documento WO05/117984.

Cuando la molécula efectora es un polímero, en general puede ser un polímero sintético o de origen natural, por ejemplo un polímero de polialquileno, polialquenileno o polioxialquileno de cadena lineal o ramificada opcionalmente sustituido o un polisacárido ramificado o no ramificado, p.ej. un homopolisacárido o heteropolisacárido.

Los sustituyentes opcionales específicos que pueden estar presentes en los polímeros sintéticos anteriormente mencionados incluyen uno o más grupos hidroxilo, metilo o metoxi.

Los ejemplos específicos de polímeros sintéticos incluyen poli(etilenglicol), poli(propilenglicol), poli(vinilalcohol) de cadena lineal o ramificada opcionalmente sustituidos o derivados de los mismos, especialmente poli(etilenglicol) opcionalmente sustituido tal como metoxipoli(etilenglicol) o derivados del mismo.

Los polímeros de origen natural específicos incluyen lactosa, amilosa, dextrano, glicógeno o derivados de los mismos.

"Derivados" como se usa en la presente memoria pretende incluir derivados reactivos, por ejemplo grupos reactivos selectivos de tiol tales como maleimidas y similares. El grupo reactivo puede estar ligado directamente o a través de un segmento ligante al polímero. Se apreciará que el residuo de tal grupo formará en algunos casos parte del producto como grupo ligante entre el fragmento de anticuerpo y el polímero.

El tamaño del polímero puede variar como se desee, pero estará generalmente en el intervalo de peso molecular medio de 500 Da a 50000 Da, por ejemplo de 5000 a 40000 Da tal como de 20000 a 40000 Da. El tamaño de polímero puede seleccionarse en particular basándose en el uso pretendido del producto, por ejemplo la capacidad de localizarse en ciertos tejidos tales como tumores o de alargar la semivida en circulación (para revisión, véase Chapman, 2002, Advanced Drug Delivery Reviews, 54, 531-545). Por tanto, por ejemplo, cuando se pretende que el producto deje la circulación y penetre en tejido, por ejemplo para uso en el tratamiento de un tumor, puede ser ventajoso usar un polímero de peso molecular pequeño, por ejemplo con un peso molecular de alrededor de 5000 Da. Para aplicaciones en que el producto permanece en circulación, puede ser ventajoso usar un polímero de mayor peso molecular, por ejemplo que tenga un peso molecular en el intervalo de 20000 Da a 40000 Da.

Los polímeros adecuados incluyen un polímero de polialquileno, tal como poli(etilenglicol), o especialmente un metoxipoli(etilenglicol) o un derivado de los mismos, y especialmente con un peso molecular en el intervalo de aproximadamente 15000 Da a aproximadamente 40000 Da.

En un ejemplo, los anticuerpos para uso en la presente divulgación están enlazados con restos de poli(etilenglicol) (PEG). En un ejemplo particular, el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo y las moléculas de PEG pueden estar enlazadas a través de cualquier cadena lateral aminoacídica o grupo funcional aminoacídico terminal localizado en el fragmento de anticuerpo, por ejemplo cualquier grupo amino, imino, tiol, hidroxilo o carboxilo libre. Tales aminoácidos pueden aparecer naturalmente en el fragmento de anticuerpo o pueden genomanipularse en el fragmento usando métodos de ADN recombinante (véanse por ejemplo los documentos US 5.219.996; US 5.667.425; WO98/25971). En un ejemplo, se modifica la molécula de anticuerpo de la presente divulgación, en el que la modificación es la adición al extremo C-terminal de su cadena pesada de uno o más aminoácidos para permitir el enlazamiento de una molécula efectora. Adecuadamente, los aminoácidos adicionales forman una región de bisagra modificada que contiene uno o más residuos de cisteína con los que puede enlazarse la molécula efectora. Pueden usarse múltiples sitios para enlazar dos o más moléculas de PEG.

En una realización, se liga una molécula de PEG con una cisteína 171 en la cadena ligera, por ejemplo véase el documento WO2008/038024. Adecuadamente, las moléculas de PEG están ligadas covalentemente a través de un

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grupo tiol de al menos un residuo de cisteína localizado en el fragmento de anticuerpo. Cada molécula de polímero enlazada con el fragmento de anticuerpo modificado puede estar covalentemente ligada al átomo de azufre de un residuo de cisteína localizado en el fragmento. La ligación covalente será generalmente un enlace disulfuro o, en particular, un enlace de azufre-carbono. Cuando se usa un grupo tiol como punto de enlazamiento, pueden usarse moléculas efectoras activadas apropiadamente, por ejemplo derivados selectivos de tiol tales como maleimidas y derivados de cisteína. Puede usarse un polímero activado como material de partida en la preparación de fragmentos de anticuerpo modificados con polímero como se describe anteriormente. El polímero activado puede ser cualquier polímero que contenga un grupo reactivo con tiol tal como un ácido o éster α-halogenocarboxílico, p.ej. yodoacetamida, una imida, p.ej. maleimida, una vinilsulfona o un disulfuro. Tales materiales de partida pueden obtenerse comercialmente (por ejemplo, de Nektar, anteriormente Shearwater Polymers Inc., Huntsville, AL, EE.UU.)

o pueden prepararse a partir de materiales de partida disponibles comercialmente usando procedimientos químicos convencionales. Las moléculas de PEG particulares incluyen metoxi-PEG-amina 20 K (obtenible de Nektar, anteriormente Shearwater; Rapp Polymere; y SunBio) y M-PEG-SPA (obtenible de Nektar, anteriormente Shearwater).

La presente divulgación proporciona también ADN aislado que codifica un anticuerpo descrito en la presente memoria o un fragmento del mismo de una cadena pesada o ligera del mismo.

En un aspecto adicional, se proporciona un vector que comprende dicho ADN.

Los métodos generales mediante los que los vectores pueden construirse, métodos de transfección y métodos de cultivo son bien conocidos por los especialistas en la materia. A este respecto, se hace referencia a "Current Protocols in Molecular Biology", 1999, F. M. Ausubel (ed), Wiley Interscience, Nueva York y al Maniatis Manual producido por Cold Spring Harbor Publishing.

La presente divulgación incluye también una célula hospedadora que comprende dicho vector y/o ADN.

Puede usarse cualquier sistema de célula hospedadora/vector adecuado para expresión de las secuencias de ADN que codifican la molécula de anticuerpo de la presente invención. Pueden usarse también sistemas bacterianos, por ejemplo E. coli y otros microbianos, o sistemas de expresión de células hospedadoras eucarióticas, por ejemplo de mamífero. Las células hospedadoras de mamífero adecuadas incluyen células CHO, de mieloma o hibridoma.

La presente divulgación proporciona también un proceso para la producción de una molécula de anticuerpo según la presente invención que comprende cultivar una célula hospedadora que contiene un vector (y/o ADN) de la presente invención en condiciones adecuadas para conducir a la expresión de proteína a partir de ADN que codifica la molécula de anticuerpo de la presente invención, y aislar la molécula de anticuerpo.

La molécula de anticuerpo puede comprender solo un polipéptido de cadena pesada o ligera, en cuyo caso tiene que usarse solo una secuencia de codificación de polipéptido de cadena pesada o cadena ligera para transfectar las células hospedadoras. Para la producción de productos que comprenden tanto cadenas pesadas como ligeras, la estirpe celular puede transfectarse con dos vectores, un primer vector que codifica un polipéptido de cadena ligera y un segundo vector que codifica un polipéptido de cadena pesada. Como alternativa, puede usarse un solo vector, incluyendo el vector secuencias que codifican polipéptidos de cadena ligera y de cadena pesada.

Los anticuerpos y fragmentos según la presente divulgación se expresan a buenos niveles a partir de células hospedadoras. Por tanto, las propiedades de los anticuerpos y/o fragmentos están optimizadas y son favorables al procesamiento comercial.

Los anticuerpos de la presente invención son útiles en el tratamiento y/o la profilaxis de una afección patológica.

Por tanto, se proporciona un anticuerpo o componente monocatenario del mismo para uso en tratamiento mediante la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz del mismo. En una realización, el anticuerpo o componente monocatenario del mismo se administra en forma de una formulación farmacéutica.

Por tanto, la presente invención proporciona también una composición farmacéutica que comprende una molécula de anticuerpo de la presente invención en combinación con uno o más de un excipiente, diluyente o portador farmacéuticamente aceptable. Por consiguiente, se proporciona el uso de un anticuerpo de la invención para la fabricación de un medicamento. La composición se suministrará habitualmente como parte de una composición farmacéutica estéril que incluirá normalmente un portador farmacéuticamente aceptable. Una composición farmacéutica de la presente invención puede comprender adicionalmente un coadyuvante farmacéuticamente aceptable.

La presente divulgación proporciona también un proceso para la preparación de una composición farmacéutica o de diagnóstico que comprende añadir y mezclar la molécula de anticuerpo de la presente invención junto con uno o más de un excipiente, diluyente o portador farmacéuticamente aceptable.

La molécula de anticuerpo puede ser el único ingrediente activo en la composición farmacéutica o de diagnóstico, o puede estar acompañada por otros ingredientes activos incluyendo otros ingredientes de anticuerpo, por ejemplo

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valor del punto isoeléctrico del anticuerpo o fragmento, por ejemplo si el pH de la formulación es 7, entonces puede ser apropiado un pI de 8-9 o superior. Aún sin desear limitarse por la teoría, se piensa que esto puede proporcionar en última instancia una formulación final con estabilidad mejorada, por ejemplo el anticuerpo o fragmento permanece en disolución.

Las composiciones farmacéuticas de esta invención pueden administrarse mediante cualquier serie de vías incluyendo, pero sin limitación, las vías oral, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intramedular, intratecal, intraventricular, transdérmica, transcutánea (por ejemplo, véase el documento WO98/20734), subcutánea, intraperitoneal, intranasal, entérica, tópica, sublingual, intravaginal o rectal. Pueden usarse también pistolas inyectoras para administrar las composiciones farmacéuticas de la invención. Típicamente, las composiciones terapéuticas pueden prepararse como inyectables, en disoluciones o suspensiones líquidas. Pueden prepararse también formas sólidas adecuadas para disolución, o suspensión, en vehículos líquidos antes de la inyección.

El suministro directo de las composiciones se logrará generalmente mediante inyección subcutánea, intraperitoneal, intravenosa o intramuscular o suministradas al espacio intersticial de un tejido. Las composiciones pueden administrarse también a una lesión. El tratamiento de dosificación puede ser un programa de una sola dosis o un programa de múltiples dosis.

Se apreciará que el ingrediente activo en la composición será una molécula de anticuerpo. Como tal, será susceptible de degradación en el tracto gastrointestinal. Por tanto, si la composición se va a administrar por una vía que use el tracto gastrointestinal, la composición necesitará contener agentes que protejan al anticuerpo de degradación, pero que liberen el anticuerpo una vez se ha absorbido desde el tracto gastrointestinal.

Está disponible una discusión a fondo de los portadores farmacéuticamente aceptables en Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, N.J. 1991).

En una realización, se proporciona la formulación en forma de formulación para administraciones tópicas, incluyendo inhalación.

Las preparaciones inhalables adecuadas incluyen polvos inhalables, aerosoles medidores que contienen gases propelentes o disoluciones inhalables exentas de gases propelentes. Los polvos inhalables según la divulgación que contienen la sustancia activa pueden consistir únicamente en las sustancias activas anteriormente mencionadas o en una mezcla de las sustancias activas anteriormente mencionadas con un excipiente fisiológicamente aceptable.

Estos polvos inhalables pueden incluir monosacáridos (p.ej., glucosa o arabinosa), disacáridos (p.ej., lactosa, sacarosa, maltosa), oligosacáridos y polisacáridos (p.ej., dextranos), polialcoholes (p.ej. dextranos), polialcoholes (p.ej., sorbitol, manitol, xilitol), sales (p.ej., cloruro de sodio, carbonato de calcio) o mezclas de estos entre sí. Se usan adecuadamente monosacáridos o disacáridos, con el uso de lactosa o glucosa, particular pero no exclusivamente en forma de sus hidratos.

Las partículas para deposición en el pulmón requieren un tamaño de partícula menor de 10 micrómetros, tal como de 1-9 micrómetros, por ejemplo de 0,1 a 5 µm, en particular de1 a 5 µm. El tamaño de partícula del ingrediente activo (tal como el anticuerpo o fragmento) es de importancia primordial.

Los gases propelentes que pueden usarse para preparar los aerosoles inhalables son conocidos en la materia. Los gases propelentes adecuados se seleccionan de entre hidrocarburos tales como n-propano, n-butano o isobutano y halogenohidrocarburos tales como derivados clorados y/o fluorados de metano, etano, propano, butano, ciclopropano o ciclobutano. Los gases propelentes anteriormente mencionados pueden usarse por sí mismos o en mezclas de los mismos.

Son gases propelentes particularmente adecuados derivados de alcano halogenados seleccionados de entre TG 11, TG 12, TG 134a y TG227. De los hidrocarburos halogenados anteriormente mencionados, son particularmente adecuados G134a (1,1,1,2-tetrafluoroetano) y TG227 (1,1,1,2,3,3,3-heptafluoropropano) y mezclas de los mismos.

Los aerosoles inhalables que contienen gas propelente pueden contener también otros ingredientes tales como codisolventes, estabilizantes, agentes tensioactivos (tensioactivos), antioxidantes, lubricantes y medios para ajustar el pH. Todos estos ingredientes son conocidos en la materia.

Los aerosoles inhalables que contienen gas propelente según la invención pueden contener hasta un 5 % en peso de sustancia activa. Los aerosoles según la invención contienen, por ejemplo, de 0,002 a 5 % en peso, de 0,01 a 3 % en peso, de 0,015 a 2 % en peso, de 0,1 a 2 % en peso, de 0,5 a 2 % en peso o de 0,5 a 1 % en peso de ingrediente activo.

Como alternativa, las administraciones tópicas al pulmón pueden ser también mediante administración de una formulación en disolución o suspensión líquida, por ejemplo empleando un dispositivo tal como un nebulizador, por ejemplo un nebulizador conectado con un compresor (p.ej., el nebulizador Pari LC-Jet Plus(R) conectado con un compresor Pari Master(R) fabricado por Pari Respiratory Equipment, Inc., Richmond, Va.).

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El anticuerpo de la invención puede suministrarse dispersado en un disolvente, p.ej. en forma de una disolución o suspensión. Puede suspenderse en una disolución fisiológica apropiada, p.ej. solución salina u otro disolvente farmacológicamente aceptable o una disolución tamponada. Las disoluciones tamponadas conocidas en la materia pueden contener de 0,05 mg a 0,15 mg de edetato de disodio, de 8,0 mg a 9,0 mg de NaCl, de 0,15 mg a 0,25 mg de polisorbato, de 0,25 mg a 0,30 mg de ácido cítrico anhidro y de 0,45 mg a 0,55 mg de citrato de sodio por 1 ml de agua para conseguir un pH de aproximadamente 4,0 a 5,0. Una suspensión puede emplear, por ejemplo, anticuerpo liofilizado.

Las suspensiones o formulaciones en disolución terapéuticas pueden contener también uno o más excipientes. Los excipientes son bien conocidos en la materia e incluyen tampones (p.ej., tampón citrato, tampón fosfato, tampón acetato y tampón bicarbonato), aminoácidos, urea, alcoholes, ácido ascórbico, fosfolípidos, proteínas (p.ej. seroalbúmina), EDTA, cloruro de sodio, liposomas, manitol, sorbitol y glicerol. Las disoluciones o suspensiones pueden encapsularse en liposomas o microesferas biodegradables. La formulación se proporcionará generalmente en una forma sustancialmente estéril empleando procesos de fabricación estériles.

Estos pueden incluir la producción y esterilización por filtración del disolvente/disolución tamponado usado para la formulación, la suspensión aséptica del anticuerpo en la disolución de disolvente tamponada estéril y la dispensación de la formulación en contenedores estériles mediante métodos familiares para los especialistas en la materia.

La formulación nebulizable según la presente divulgación puede proporcionarse, por ejemplo, en forma de unidades de dosis única (p.ej. envases o viales de plástico sellados) empaquetados en envoltorios de lámina metálica. Cada vial contiene una dosis unitaria en un volumen de, p.ej., 2 ml de disolvente /tampón de disolución.

Se piensa que los anticuerpos de la presente divulgación son adecuados para suministro mediante nebulización.

Comprender en el contexto de la presente memoria descriptiva pretende significar incluir.

Cuando sea técnicamente apropiado, pueden combinarse realizaciones de la invención.

Se describen realizaciones en la presente memoria que comprenden ciertos rasgos/elementos. La divulgación se extiende también a realizaciones separadas que consisten o consisten esencialmente en dichos rasgos/elementos.

La presente invención se describe además solo a modo de ilustración en los siguientes ejemplos, que hacen referencia a las Figuras acompañantes.

Ejemplos

Generación del anticuerpo (FabFv)2Fc

Se generó (FabFv)2Fc (Figura 3D) mediante el método de PCR de superposición que ligaba una región de codificación de A26 gH2 Fab 2G4S 645 gH1 existente con Fc de gamma 1 (véanse las Figuras 4 y 5). El empalme es el final de 645 gH1 y la bisagra inferior de Fc de g1. Se clonó la región de codificación anterior en el vector de expresión de mamífero UCB estándar bajo el control del promotor HCMV-MIE y poliA de SV40E. Se emparejó el ADN con un plásmido similar que codifica la correspondiente cadena ligera (A26 gL8 CK 2G4S 645 gL1, véanse las figuras 6 y 7) y se usó para transfectar células HEK293 en discos de 6 pocillos. Se usó 293fectin de Invitrogen para transfectar las células y se incubaron entonces las células durante 6 días en una plataforma agitada a 37 ºC. Se recolectaron los sobrenadantes y se cuantificó la cantidad de anticuerpo secretado por ELISA. Se sometieron entonces los sobrenadantes a análisis BIAcore. Se muestran las secuencias del anticuerpo en las Figuras 4-7.

Ensayo BIAcore

El A26Fab es específico de OX40 y 645Fv tiene especificidad por seroalbúmina humana (HSA). El 645 se ha descrito anteriormente en el documento WO2009040562.

Se determinaron las afinidades de unión y parámetros cinéticos para la interacción de (A26Fab-645Fv)2-Fc (con el formato mostrado en la Figura 3D) con HSA (Jackson ImmunoResearch, 009-000-051) y hOX40 (Ancell 513-020) mediante resonancia de plasmón de superficie (SPR) realizada en un Biacore 3000 usando chips sensores CM5 y tampón de migración HBS-EP (HEPES 10 mM (pH 7,4), NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, 0,005 % v/v de tensioactivo P20). Se capturaron las muestras de (A26Fab-645Fv)2-Fc en la superficie del chip sensor usando un anticuerpo monoclonal de cabra específico de Fc humano F(ab')2 (Jackson ImmunoResearch, 109-006-098) o anti-CH1 humano generado en laboratorio. Se consiguió la inmovilización covalente del anticuerpo de captura mediante química de acoplamiento de amina estándar.

Cada ciclo de ensayo consistía en capturar en primer lugar (A26Fab-645Fv)2-Fc usando una inyección de 1 min, antes de una fase de asociación consistente en una inyección de 3 min de antígeno, después de lo cual se monitorizaba la disociación durante 10 min. Después de cada ciclo, se regeneraba la superficie de captura con 2 inyecciones de 1 min de HCl 40 mM seguidas de 30 s de NaOH 5 mM. Los caudales usados eran 10 µl/min para captura, 30 µl/min para las fases de asociación y disociación y 10 µl/min para regeneración.

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Tabla C Resumen de la unión de HSA a las fusiones A26 Fab-645-Fv e IgG-645-Fv

Construcción: Albúmina ka (1/Ms) kd (1/s) KD (nM) Estequiometría

A26-Fab-645-Fv: HSA 1,68E+04 1,16E-04 6,92 0,71

A26-Fab: HSA Sin unión imagen10 imagen11 imagen12

(A26Fab-645Fv)2-Fc: HSA 6,21E+04 6,00E-05 0,97 0,55

A26-IgG: HSA Sin unión imagen13 imagen14 imagen15

Tabla D Unión dual a HSA y hOX40 (HSA a 2 uM, hOX40 a 50 nM)

Construcción: Analito Respuesta corregida por tampón Respuesta de OX40 + HSA

A26-Fab: HSA 5,84 imagen16

imagen17: hOX40 99,02 imagen18

imagen19: HSA + hOX40 103,1 104,86

A26-Fab-645-Fv: HSA 106,65 imagen20

imagen21: hOX40 74,23 imagen22

imagen23: HSA + hOX40 179,55 180,88

A26-IgG: HSA 3,12 imagen24

imagen25: hOX40 97,91 imagen26

imagen27: HSA + hOX40 101,68 101,03

(A26Fab-645Fv)2-Fc: HSA 107,6 imagen28

imagen29: hOX40 79,54 imagen30

imagen31: HSA + hOX40 186,19 187,14

5 PAGE-SDS

Se añadieron a 26 µl de muestra 10 µl de tampón de disociación de dodecilsulfato de litio 4X, para las muestras no reducidas 4 µl de N-etilmaleimida 100 mM y para las muestras reducidas 4 µl de tampón reductor 10X. Se agitaron con vórtex las muestras, se incubaron a 100 ºC durante 3 min, se enfriaron y se centrifugaron a 16000xg durante 30

s. Se cargaron 15 µl de las muestras preparadas en geles de acrilamina al 4-20 % con Tris/glicina-SDS y se hicieron

10 migrar durante 100 min a 125 V, voltaje constante. Se tiñeron los geles con tinte de proteína azul de Coomassie y se destiñeron con ácido acético al 7,5 %.

Los resultados se muestran en la Figura 8. La Figura 8 muestra un gel de poliacrilamida al 4-20 % teñido con azul de Coomassie. Todas las muestras se han hecho migrar en condiciones no reductoras (mitad izquierda del gel) y reductoras (mitad derecha del gel). Los 4 carriles marcados gA26IgG eran sobrenadantes celulares de mamífero que 15 expresaban IgG completa. En condiciones no reductoras, hay una banda principal a ∼200 kDa que es el anticuerpo completo que comprende dos cadenas pesadas (vH1-CH1-CH2-CH3) y dos cadenas ligeras (vK-CK) ligadas por enlaces disulfuro. En condiciones reductoras, hay 2 bandas principales, una a ∼55 kDa que es la cadena pesada y otra a ∼30 kDa que es la cadena ligera. Los 2 carriles marcados gA26Fab-Fv645 eran sobrenadantes celulares de

Claims

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