ES2659718T3

ES2659718T3 - Anticuerpos anti-GT468 monoclonales para el tratamiento del cáncer

Info

Publication number: ES2659718T3
Application number: ES09778564.6T
Authority: ES
Inventors: Ugur Sahin; Özlem TÜRECI; Michael Koslowski; Rita Mitnacht-Kraus
Original assignee: Johannes Gutenberg Universitaet Mainz; Ganymed Pharmaceuticals GmbH
Current assignee: Johannes Gutenberg Universitaet Mainz; Ganymed Pharmaceuticals GmbH
Priority date: 2008-09-16
Filing date: 2009-09-16
Publication date: 2018-03-19
Anticipated expiration: 2029-09-16
Also published as: EP2342234A2; KR101818741B1; LT2342234T; SI2342234T1; BRPI0918178B1; IL211010A0; EP2342234B1; BRPI0918178A8; CN105753988A; IL211010A; HRP20180262T1; BRPI0918178B8; WO2010031551A3; KR20110055699A; TR201802090T4; AU2009294896A1; MX2011002856A; PL2342234T3; CN104628858B; IL242204A0

Abstract

Un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de: (i) un anticuerpo producido u obtenido de un clon depositado bajo el número de acceso. DSM ACC2944 (51-1A-1), (ii) un anticuerpo que es una forma quimerizada o humanizada del anticuerpo en (i), y (iii) un anticuerpo que comprende la porción de unión a antígeno o sitio de unión a antígeno del anticuerpo en (i), en el que dicho anticuerpo se une a un polipéptido que consiste de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 de la secuencia e inhibe la proliferación de células que expresan dicho polipéptido.

Description

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Los anticuerpos descritos aquí se pueden obtener mediante un método que comprende la etapa de inmunizar un animal con una proteína o péptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID No: 2-10 y 35-82, o un fragmento inmunogénico o su derivado, o un ácido nucleico o célula anfitriona que expresa dicha proteína o péptido, o fragmento inmunogénico o derivado del mismo. Preferiblemente, un anticuerpo de las enseñanzas es específico para las proteínas, péptidos o fragmentos inmunogénicos o derivados anteriormente mencionados de los mismos. En el contexto de una proteína o péptido utilizado en la inmunización, un derivado se refiere a una variante de dicha proteína o péptido que tiene las mismas propiedades inmunogénicas que la proteína o péptido del que se deriva. En particular, la derivada de una proteína o péptido cuando se utiliza en la inmunización para la producción de anticuerpos, en particular anticuerpos monoclonales, proporciona anticuerpos que tienen la misma especificidad que los anticuerpos obtenidos cuando se utiliza la proteína o el péptido en la inmunización. Por ejemplo, tal derivado puede incluir la eliminación, sustitución o adición de uno o más aminoácidos. En particular, puede incluir la adición de uno o más aminoácidos tales como cisteína en el extremo N o el extremo C o ambos.

En una realización particularmente preferida, el anticuerpo de la invención se produce mediante un clon que tiene el número de acceso. DSM ACC2822 (4E9-1H9), DSM ACC2826 (9B6-2A9), DSM ACC2824 (59D6-2F2), DSM ACC2825 (61C11-2B5), DSM ACC2823 (78H11-1H6), DSM ACC2895 (22-1A-1), DSM ACC2893 (22-2A-1), DSM ACC2896 (22-9B1), DSM ACC2897 (23-33A-1), DSM ACC2891 (23-19A-1), DSM ACC2894 (F11#33F7D12), DSM ACC2892 (4A12 2D4 1A10), DSM ACC2898 (4E9 1D12 2D4), DSM ACC2961 (42H11 1C11 2B2), DSM ACC2962 (51G6 2H3 2B4), DSM ACC2943 (16-5B-1), DSM ACC2956 (20-11A-1), DSM ACC2947 (29-1A-2), DSM ACC2964 (29-8B-1), DSM ACC2959 (35-48B-1), DSM ACC2963 (35-50A-2a), DSM ACC2957 (38-10B-1), DSM ACC2958 (38-1A-1), DSM ACC2948 (44-3A2), DSM ACC2949 (45-2A-1), DSM ACC2950 (45-8A-2), DSM ACC2951 (48-3B-1), DSM ACC2952 (48-4A-1), DSM ACC2946 (49-3A-1), DSM ACC2945 (49-8A-1), DSM ACC2944 (51-1A-1), DSM ACC2953 (53-13A-2), DSM ACC2955 (53-29A-1), DSM ACC2960 (54-4B-2), DSM ACC2954 (56-4A-2) o DSM ACC3001 (62-9B-1).

En una realización, el anticuerpo descrito aquí se acopla a un agente terapéutico tal como una toxina, un radioisótopo, un fármaco o un agente citotóxico.

En un aspecto adicional, las actuales enseñanzas se refieren a un hibridoma capaz de producir el anticuerpo de la invención. Los hibridomas preferidos son aquellos que tienen el número de acceso. DSM ACC2822 (4E9-1H9), DSM ACC2826 (9B6-2A9), DSM ACC2824 (59D6-2F2), DSM ACC2825 (61C11-2B5), DSM ACC2823 (78H11-1H6), DSM ACC2895 (22-1A-1), DSM ACC2893 (22-2A-1), DSM ACC2896 (22-9B-1) 5 DSM ACC2897 (23-33A-1), DSM ACC2891 (23-19A-1), DSM ACC2894 (F11 # 33F7D12), DSM ACC2892 (4A12 2D4 1A10), DSM ACC2898 (4E9 1D12 2D4), DSM ACC2961 (42H11 1C11 2B2), DSM ACC2962 (51G6 2H3 2B4), DSM ACC2943 (16-5B-1), DSM ACC2956 (20-1 1A-1), DSM ACC2947 (29-1A-2), DSM ACC2964 (29-8B-1), DSM ACC2959 (35-48B-1), DSM ACC2963 (35-50A-2a), DSM ACC2957 (38-10B-1), DSM ACC2958 (38-1A-1), DSM ACC2948 (44-3A-2), DSM ACC2949 (45-2A-1), DSM ACC2950 (45-8A-2), DSM ACC2951 (48-3B-1), DSM ACC2952 (48-4A-1), DSM ACC2946 (49-3A-1), DSM ACC2945 (49-8A-1), DSM ACC2944 (51-1A-1), DSM ACC2953 (53-13A-2), DSM ACC2955 (53-29A-1), DSM ACC2960 (54-4B-2), DSM ACC2954 (56-4A-2) o DSM ACC3001 (62-9B-1).

Los anticuerpos de la invención se designan aquí haciendo referencia a la designación del anticuerpo y/o haciendo referencia al clon que produce el anticuerpo, por ejemplo, 4E9-1H9.

Preferiblemente, los anticuerpos de la invención tienen la capacidad de discriminar variantes de GT468 expresadas por diferentes tipos de células que incluyen células cancerosas y células no malignas.

Los anticuerpos de la invención preferiblemente intervienen en la muerte de células que expresan GT468 y/o se caracterizan por la asociación de GT468 con su superficie celular uniéndose a GT468. Preferiblemente GT468 se expresa en la superficie de dichas células. En una realización, los anticuerpos de la invención inducen citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), por ejemplo, por lo menos aproximadamente 20-40% de lisis mediada por CDC, preferiblemente aproximadamente 40-50% de lisis mediada por CDC, y más preferiblemente más de 50% de lisis mediada por CDC de células que expresan GT468 y/o caracterizadas por asociación de GT468 con su superficie celular. Alternativamente o además de inducir CDC, los anticuerpos de la invención pueden inducir citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) de células que expresan GT468 y/o que se caracteriza por asociación de GT468 con su superficie celular en presencia de células efectoras (por ejemplo, monocitos, mononucleares células, células NK y PMN). Los anticuerpos de la invención pueden tener la capacidad de inducir apoptosis de células que expresan GT468 y/o que se caracteriza por asociación de GT468 con su superficie celular, inducir la adhesión homotípica de células que expresan GT468 y/o que se caracteriza por asociación de GT468 con su superficie celular y/o inducen fagocitosis de células que expresan GT468 y/o se caracterizan por la asociación de GT468 con su superficie celular en presencia de macrófagos. Los anticuerpos de la invención pueden tener una o más de las propiedades funcionales descritas anteriormente. Preferiblemente, los anticuerpos de la invención inducen lisis mediada por CDC y lisis mediada por ADCC de células que expresan GT468 y/o se caracterizan por asociación de GT468 con su superficie celular y más preferiblemente inducen lisis mediada por ADCC de células que expresan GT468 y/o se caracterizan por asociación de GT468 con su superficie celular mientras que no inducen la lisis mediada por CDC de dichas células. Las células objetivo de ejemplo para los anticuerpos de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, células cancerosas que expresan GT468 y/o se caracterizan por la asociación de GT468 con su superficie celular. En una realización preferida particular, la muerte de células mediadas por anticuerpos

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Las actuales enseñanzas también incluyen la administración simultánea o secuencial de dos o más anticuerpos anti-GT468 de la invención, en el que preferiblemente por lo menos uno de dichos anticuerpos es un anticuerpo quimérico anti-GT468 y por lo menos otro anticuerpo es un anticuerpo anti-GT468 humano, los anticuerpos que se unen a los mismos

: o diferentes epítopos de GT468. Preferiblemente, se administra primero un anticuerpo GT468 quimérico de las enseñanzas seguido de la administración de un anticuerpo anti-GT468 humano de las enseñanzas, en el que el anticuerpo anti-GT468 humano se administra preferiblemente durante un período de tiempo prolongado, es decir, como terapia de mantenimiento.

Los anticuerpos, conjugados, moléculas biespecíficas/multiespecíficas y composiciones de las actuales enseñanzas se pueden utilizar en una variedad de métodos para inhibir el crecimiento de células que expresan GT468 y/o que se caracteriza por asociación de GT468 con su superficie celular y/o matar selectivamente células que expresan GT468 y/o se caracteriza por la asociación de GT468 con su superficie celular al poner en contacto las células con una cantidad eficaz del anticuerpo, conjugado, molécula o composición biespecífica/multiespecífica, de modo que se inhibe el crecimiento de la célula y/o se mata la célula. En una realización, el método incluye matar la célula que expresa GT468 y/o se caracteriza por la asociación de GT468 con su superficie celular, opcionalmente en presencia de células efectoras, por ejemplo, por CDC, apoptosis, ADCC, fagocitosis, o por una combinación de dos o más de estos mecanismos. Las células que expresan GT468 y/o se caracterizan por asociación de GT468 con su superficie celular que se puede inhibir

: o eliminar utilizando los anticuerpos de las enseñanzas incluyen células cancerosas.

Los anticuerpos, conjugados y moléculas y composiciones biespecíficas/multiespecíficas de las actuales enseñanzas se pueden utilizar para tratar y/o prevenir una diversidad de enfermedades que implican células que expresan GT468 y/o se caracterizan por asociación de GT468 con su superficie celular administrando los anticuerpos a pacientes que sufren de tales enfermedades. Las enfermedades a modo de ejemplo que se pueden tratar (por ejemplo, mejorar) o prevenir incluyen, pero no se limitan a, enfermedades tumorigénicas. Ejemplos de enfermedades tumorigénicas, que pueden tratarse y/o prevenirse, incluyen enfermedades cancerosas tales como cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer gástrico, cáncer de ovario, cáncer hepatocelular, cáncer de colon, cáncer de páncreas, cáncer de esófago, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de riñón , en particular carcinoma de células renales, cáncer de próstata, cáncer de hígado, melanoma, sarcoma, mieloma, neuroblastoma, coriocarcinoma placentario, cáncer de cuello uterino y cáncer de tiroides, y sus formas metastásicas. En una realización, la enfermedad del cáncer es cáncer metastásico en el pulmón.

En un aspecto, las enseñanzas se refiere a un método para inhibir una o más actividades seleccionadas de motilidad, migración, invasión, crecimiento (proliferación) y formación de colonias, preferiblemente crecimiento y/o formación de colonias de una célula que expresa GT468 y/o caracterizada por asociación de GT468 con su superficie celular, que comprende poner en contacto la célula con una cantidad eficaz de un anticuerpo, conjugado, molécula biespecífica/multiespecífica o composición de la enseñanza. GT468 se expresa preferiblemente en la superficie de dicha célula.

En un aspecto adicional, las enseñanzas se refieren a un método para tratar o prevenir una enfermedad o trastorno que implica células que expresan GT468 y/o se caracteriza por asociación de GT468 con su superficie celular que comprende administrar a un sujeto un anticuerpo, conjugado, molécula biespecífica/multiespecífica o composición de las enseñanzas. Preferiblemente la enfermedad o trastorno es una enfermedad relacionada con tumores y en realizaciones particulares se selecciona del grupo que consiste en cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer gástrico, cáncer de ovario, cáncer hepatocelular, cáncer de colon, cáncer de páncreas, cáncer de esófago, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de riñón, en particular carcinoma de células renales, cáncer de próstata, cáncer de hígado, melanoma, sarcoma, mieloma, neuroblastoma, coriocarcinoma placentario, cáncer de cuello uterino y cáncer de tiroides, y las formas metastásicas de los mismos. En una realización, la enfermedad del cáncer es cáncer metastásico en el pulmón. GT468 se expresa preferentemente en la superficie de dichas células.

Las enseñanzas pueden implicar el uso de los agentes y composiciones descritos en este documento para un tratamiento profiláctico y/o terapéutico de enfermedades tumorales, es decir, para tratar a un paciente que tiene una enfermedad tumoral o que está en riesgo de desarrollar una enfermedad tumoral. En un aspecto, las enseñanzas proporcionan métodos para inhibir el crecimiento tumoral que comprende la administración de uno o más de los agentes y composiciones descritos en este documento.

Preferiblemente, los agentes y composiciones descritos en este documento se administran de manera que la sustancia terapéuticamente activa no se administra o no se administra sustancialmente a un tejido u órgano donde las células cuando el tejido u órgano está libre de tumores expresan sustancialmente GT468 y/o caracterizado por la expresión de GT468 con su superficie celular tal como tejido de placenta y/o tejido de testículo. Para este fin, los agentes y composiciones descritos en este documento pueden administrarse localmente.

En un aspecto, las enseñanzas proporcionan un anticuerpo como se describe en el presente documento para uso en los métodos de tratamiento descritos en este documento. En una realización, las enseñanzas proporcionan una composición farmacéutica como se describe en el presente documento para uso en los métodos de tratamiento descritos en este documento.

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Como se ejemplifica aquí, los anticuerpos de las enseñanzas se pueden obtener directamente de hibridomas que expresan el anticuerpo, o se pueden clonar y expresar de forma recombinante en una célula anfitriona (por ejemplo, una célula CHO o una célula linfocítica). Otros ejemplos de células anfitrionas son microorganismos, tales como E. coli, y hongos, tales como levadura. Alternativamente, pueden producirse de forma recombinante en un animal o planta transgénica no humana. Sin embargo, las actuales enseñanzas también prevén realizaciones en las que los anticuerpos se producen mediante inmunización o vacunación utilizando estrategias de inmunización como se describe aquí in situ en un paciente.

Las células de hibridoma preferidas para producir anticuerpos de las enseñanzas son las depositadas en DSMZ (Inhoffenstr. 7B, 38124 Braunschweig, Alemania) con las siguientes designaciones y números de acceso:

1.: 4E9-1H9, número de acceso DSM ACC2822, depositado el 13 de marzo, 2007

2.: 9B6-2A9, número de acceso DSM ACC2826, depositado el 13 de marzo, 2007

3.: 59D6-2F2, número de acceso DSM ACC2824, depositado el 13 de marzo, 2007

4.: 61C11-2B5, número de acceso DSM ACC2825, depositado el 13 de marzo, 2007

5.: 78H11-1H6, número de acceso DSM ACC2823, depositado el 13 de marzo de 2007

6.: 22-1A-1, número de acceso DSM ACC2895, depositado el 11 de marzo, 2008

7.: 22-2A-1, número de acceso DSM ACC2893, depositado el 11 de marzo, 2008

8.: 22-9B-1, número de acceso DSM ACC2896, depositado el 11 de marzo, 2008

9.: 23-33A-1, número de acceso DSM ACC2897, depositado el 11 de marzo, 2008

10.: 23-19A-1, número de acceso DSM ACC2891, depositado el 11 de marzo de 2008

11.: F11#33F7D12, número de acceso DSM ACC2894, depositado el 11 de marzo, 2008

12.: 4A12 2D4 1A10, número de acceso DSM ACC2892, depositado el 11 de marzo, 2008

13.: 4E9 1D12 2D4, número de acceso DSM ACC2898, depositado el 11 de marzo, 2008

14.: 42 H11 1C11 2B2, número de acceso DSM ACC2961, depositado el 1 de septiembre, 2008

15.: 51G6 2H3 2B4, número de acceso DSM ACC2962, depositado el 1 de septiembre de 2008

16.: 16-5B-1, número de acceso DSM ACC2943, depositado el 1 de septiembre, 2008

17.: 20-11A-1, número de acceso DSM ACC2956, depositado el 1 de septiembre, 2008

18.: 29-1A-2, número de acceso DSM ACC2947, depositado el 1 de septiembre, 2008

19.: 29-8B-1, número de acceso DSM ACC2964, depositado el 2 de septiembre, 2008

20.: 35-48B-1, número de acceso DSM ACC2959, depositado el 1 de septiembre de 2008

21.: 35-50A-2a, número de acceso DSM ACC2963, depositado el 1 de septiembre, 2008

22.: 38-10B-1, número de acceso DSM ACC2957, depositado el 1 de septiembre, 2008

23.: 38-1A-1, número de acceso DSM ACC2958, depositado el 1 de septiembre, 2008

24.: 44-3A-2, número de acceso DSM ACC2948, depositado el 1 de septiembre, 2008

25.: 45-2A-1, número de acceso DSM ACC2949, depositado el 1 de septiembre de 2008

26.: 45-8A-2, número de acceso DSM ACC2950, depositado el 1 de septiembre, 2008

27.: 48-3B-1, número de acceso DSM ACC2951, depositado el 1 de septiembre, 2008

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La expresión “GT468 expresada en la superficie de las células” significa que GT468 expresado por las células se encuentra en asociación con la superficie de dichas células.

GT468 está asociado con la superficie de las células si está ubicado en la superficie de dichas células y es accesible a la unión por los anticuerpos específicos de GT468 agregados a las células. En realizaciones preferidas, una célula que se caracteriza por la asociación de GT468 con su superficie celular es una célula que expresa GT468. Debe entenderse que en el caso en que GT468 es expresado por células, el GT468 asociado con la superficie de dichas células puede ser solo una porción del GT468 expresado, en particular el dominio extracelular del mismo como se definió anteriormente.

De acuerdo con la invención, GT468 no se expresa sustancialmente en una célula y/o no está sustancialmente asociado con una superficie celular si el nivel de expresión y/o asociación es menor en comparación con la expresión y/o asociación en células de placenta o tejido de placenta. Preferiblemente, el nivel de expresión y/o asociación es menor que 10%, preferiblemente menor que 5%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1% o 0.05% de la expresión y/o asociación en células placentarias

: o tejido placentario o incluso más bajo. Preferiblemente, GT468 no se expresa sustancialmente en una célula y/o no está sustancialmente asociado con una superficie celular si el nivel de expresión y/o asociación excede el nivel de expresión y/o asociación en tejido no cancerígeno no canceroso de uno o más de cerebro, pulmón, mama, colon, hígado, estómago, riñón, próstata, páncreas, ovario, bazo, piel, miocardio y endometrio en no más de 2 veces, preferiblemente 1,5 veces, y preferiblemente no excede el nivel de expresión y/o asociación en dicho(s) tejido(s) no cancerígeno(s) no tumorigénico. Preferiblemente, GT468 no se expresa sustancialmente en una célula y/o no está sustancialmente asociado con una superficie celular si el nivel de expresión o asociación está por debajo del límite de detección y/o si el nivel de expresión

: o asociación es demasiado bajo para permitir la unión por anticuerpos específicos GT468 agregados a las células.

De acuerdo con la enseñanza, GT468 se expresa en una célula y/o se asocia con una superficie celular si el nivel de expresión y/o asociación excede el nivel de expresión y/o asociación en tejido no cancerígeno no canceroso de uno o más de cerebro, pulmón, mama, colon, hígado, estómago, riñón, próstata, páncreas, ovario, bazo, piel, miocardio y endometrio, preferiblemente en más de 2 veces, preferiblemente 10 veces, 100 veces, 1000 veces o 10000 veces Preferiblemente, GT468 se expresa en una célula y/o se asocia con una superficie celular si el nivel de expresión o asociación está por encima del límite de detección y/o si el nivel de expresión o asociación es lo suficientemente alto como para permitir la unión por anticuerpos específicos GT468 agregado a las celdas preferiblemente, GT468 expresado en una célula se expresa o expone en la superficie de dicha célula.

El término “balsa” se refiere a los microdominios de membrana ricos en esfingolípidos y colesterol localizados en el área de la valva exterior de la membrana plasmática de una célula. La capacidad de ciertas proteínas para asociarse dentro de dichos dominios y su capacidad de formar “agregados” o “agregados focales” puede afectar la función de la proteína. Por ejemplo, la translocación de las moléculas de GT468 a tales estructuras, después de unirse a los anticuerpos de la actual enseñanza, crea una alta densidad de complejos de antígeno-anticuerpo GT468 en las membranas plasmáticas. Tal alta densidad de complejos antígeno-anticuerpo GT468 puede permitir la activación eficiente del sistema del complemento durante la CDC.

De acuerdo con la invención, el término “enfermedad” se refiere a cualquier estado patológico, que incluye cáncer, en particular aquellas formas de cáncer descritas aquí.

“Enfermedades asociadas con células que expresan GT468 y/o caracterizadas por asociación de GT468 con su superficie celular” significa de acuerdo con la invención que la expresión y/o asociación en células de un tejido u órgano enfermo aumenta preferiblemente en comparación con el estado en un tejido u órgano saludable. Un aumento se refiere a un aumento de por lo menos 10%, en particular por lo menos 20%, por lo menos 50%, por lo menos 100%, por lo menos 200%, por lo menos 500%, por lo menos 1000%, por lo menos 10000% o incluso Más. En una realización, la expresión y/o asociación con la superficie celular solo se encuentra en un tejido enfermo, mientras que la expresión en un tejido sano se reprime. De acuerdo con la invención, las enfermedades asociadas con células que expresan GT468 y/o que se caracterizan por la asociación de GT468 con su superficie celular incluyen enfermedades tumorales tales como enfermedades de cáncer. Además, de acuerdo con la invención, las enfermedades tumorales tales como las enfermedades del cáncer son preferiblemente aquellas en las que las células tumorales o cancerosas expresan GT468 y/o se caracterizan por la asociación de GT468 con su superficie celular.

Como se utiliza en el presente documento, una “enfermedad tumoral”, “enfermedad relacionada con tumor” o “enfermedad tumorigénica” incluye una enfermedad caracterizada por crecimiento celular regulado aberrantemente, proliferación, diferenciación, adhesión y/o migración, que puede dar como resultado la producción de o tendencia a producir tumores y/o metástasis tumorales. Por “célula tumoral” se entiende una célula anormal que crece por una proliferación celular rápida e incontrolada y continúa creciendo después de que cesan los estímulos que iniciaron el nuevo crecimiento.

Por “tumor” se entiende un grupo anormal de células o un tejido que crece por una proliferación celular rápida e incontrolada y continúa creciendo después de que cesan los estímulos que iniciaron el nuevo crecimiento. Los tumores muestran una falta parcial o completa de organización estructural y coordinación funcional con el tejido normal, y generalmente forman una masa distinta de tejido, que puede ser benigna, premaligna o maligna.

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específicas. Los epítopos conformacionales y no conformacionales se distinguen porque la unión al primero, pero no al último se pierde en presencia de disolventes desnaturalizantes.

El término “epítopo discontinuo”, como se utiliza en el presente documento, significa un epítopo conformacional en un antígeno de proteína que se forma a partir de por lo menos dos regiones separadas en la secuencia primaria de la proteína.

El término “molécula biespecífica” pretende incluir cualquier agente, por ejemplo, un complejo de proteína, péptido o proteína o péptido, que tiene dos especificidades de unión diferentes. Por ejemplo, la molécula puede unirse o interactuar con (a) un antígeno de superficie celular, y (b) un receptor de Fc en la superficie de una célula efectora. El término “molécula multiespecífica” o “molécula heteroespecífica” pretende incluir cualquier agente, por ejemplo, un complejo de proteína, péptido o proteína o péptido, que tenga más de dos especificidades de unión diferentes. Por ejemplo, la molécula se puede unir a, o interactuar con, (a) un antígeno de superficie celular, (b) un receptor de Fc en la superficie de una célula efectora, y (c) por lo menos otro componente. De acuerdo con lo anterior, la invención incluye, pero no se limita a, moléculas biespecíficas, triespecíficas, tetraspecíficas y otras multiespecíficas que se dirigen a GT468, y a otros objetivos, tales como receptores de Fc sobre células efectoras. El término “anticuerpos biespecíficos” también incluye diacuerpos. Los diacuerpos son anticuerpos bivalentes biespecíficos en los que los dominios VH y VL se expresan en una sola cadena polipeptídica, pero utilizando un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, lo que obliga a los dominios a emparejarse con dominios de otra cadena y la creación de dos sitios de unión a antígeno (véase, por ejemplo, Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448; Poljak, R.J., et al. (1994) Estructura 2: 1121-1123).

Las enseñanzas también incluyen derivados de los anticuerpos descritos en el presente documento que, para los fines de la invención, están abarcados por el término “anticuerpo”. El término “derivados de anticuerpos” se refiere a cualquier forma modificada de un anticuerpo, por ejemplo, un conjugado del anticuerpo y otro agente o anticuerpo. Tal como se utiliza en el presente documento, un anticuerpo se deriva de una secuencia de línea germinal particular si el anticuerpo se obtiene de un sistema inmunizando un animal o explorando una colección de genes de inmunoglobulina, y en el que el anticuerpo seleccionado es por lo menos 90%, más preferiblemente por lo menos 95%, aún más preferiblemente por lo menos 96%, 97%, 98%, o 99% idénticos en secuencia de aminoácidos a la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de inmunoglobulina de línea germinal. Típicamente, un anticuerpo derivado de una secuencia particular de la línea germinal mostrará no más de 10 diferencias de aminoácidos, más preferiblemente, no más de 5, o incluso más preferiblemente, no más de 4, 3, 2 o 1 diferencia de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de inmunoglobulina de línea germinal.

Como se utiliza en el presente documento, el término “heteroanticuerpos” se refiere a dos o más anticuerpos, derivados de estos, o regiones de unión a antígenos unidos entre sí, por lo menos dos de los cuales tienen especificidades diferentes. Estas diferentes especificidades incluyen una especificidad de unión por un receptor de Fc en una célula efectora, y una especificidad de unión por un antígeno o epítopo en una célula objetivo, por ejemplo, una célula tumoral.

Los anticuerpos descritos en este documento pueden ser anticuerpos humanos. El término “anticuerpo humano”, como se utiliza en el presente documento, pretende incluir anticuerpos que tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Los anticuerpos humanos de las enseñanzas pueden incluir residuos de aminoácidos no codificados por secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o específica de sitio in vitro o por mutación somática in vivo).

El término “anticuerpo monoclonal” como se utiliza en el presente documento se refiere a una preparación de moléculas de anticuerpo de composición molecular única. Un anticuerpo monoclonal muestra una única especificidad de unión y afinidad por un epítopo particular. En una realización, los anticuerpos monoclonales se producen mediante un hibridoma que incluye una célula B obtenida de un animal no humano, por ejemplo, un ratón, fusionado a una célula inmortalizada.

El término “anticuerpo recombinante”, como se utiliza en este documento, incluye todos los anticuerpos que se preparan, expresan, crean o aíslan por medios recombinantes, tales como (a) anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico o transcromosómico con respecto a los genes de inmunoglobulina o un hibridoma preparado a partir de ellos, (b) anticuerpos aislados de una célula anfitriona transformada para expresar el anticuerpo, por ejemplo, de un transfectoma, (c) anticuerpos aislados de una colección recombinante de anticuerpos combinatoria, y (d) anticuerpos preparados, expresado, creado o aislado por cualquier otro medio que implique el empalme de secuencias del gen de inmunoglobulina a otras secuencias de ADN.

El término “transfectoma”, como se utiliza en este documento, incluye células anfitrionas eucarióticas recombinantes que expresan un anticuerpo, tales como células CHO, células NS/0, células HEK293, células HEK293T, células vegetales u hongos, que incluyen células de levadura.

Como se utiliza en el presente documento, un “anticuerpo heterólogo” se define en relación con un organismo transgénico que produce dicho anticuerpo. Este término se refiere a un anticuerpo que tiene una secuencia de aminoácidos o una secuencia de ácidos nucleicos codificante correspondiente a la encontrada en un organismo que no está constituido por el organismo transgénico, y que generalmente deriva de una especie distinta del organismo transgénico.

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secuencia de control de expresión de forma natural y el término “heterólogo” significa que el ácido nucleico no está funcionalmente unido a la secuencia de control de la expresión de forma natural.

Un ácido nucleico, tal como un ácido nucleico que expresa ARN y/o proteína o péptido, y una secuencia de control de expresión están “funcionalmente” unidos entre sí, si están unidos covalentemente entre sí de tal manera que la expresión

o transcripción de dicho el ácido nucleico está bajo el control o bajo la influencia de dicha secuencia de control de la expresión. Si el ácido nucleico se va a traducir en una proteína funcional, entonces, con una secuencia de control de expresión funcionalmente unida a una secuencia codificante, la inducción de dicha secuencia de control de expresión da como resultado la transcripción de dicho ácido nucleico, sin provocar un cambio de marco en la secuencia codificante o dicha secuencia de codificación no puede traducirse en la proteína o péptido deseado.

El término “secuencia de control de la expresión” comprende, de acuerdo con la invención, promotores, sitios de unión a ribosomas, potenciadores y otros elementos de control que regulan la transcripción de un gen o la traducción de un mARN. En realizaciones particulares de la invención, las secuencias de control de la expresión se pueden regular. La estructura exacta de las secuencias de control de la expresión puede variar como una función de la especie o tipo de célula, pero generalmente comprende secuencias 5' -no transcritas y 5' y 3' – no traducidas que participan en el inicio de la transcripción y traducción, respectivamente, tales como Caja TATA, secuencia de tapado, secuencia CAAT, y similares. Más específicamente, las secuencias de control de expresión 5' no transcritas comprenden una región promotora que incluye una secuencia promotora para el control transcripcional del ácido nucleico unido funcionalmente. Las secuencias de control de expresión también pueden comprender secuencias potenciadoras o secuencias activadoras aguas arriba.

De acuerdo con la invención, el término “promotor” o “región promotora” se refiere a una secuencia de ácido nucleico que se localiza aguas arriba (5') a la secuencia de ácido nucleico que se expresa y controla la expresión de la secuencia proporcionando un sitio de reconocimiento y unión para ARN-polimerasa. La “región promotora” puede incluir sitios de reconocimiento y unión adicionales para otros factores que están implicados en la regulación de la transcripción de un gen. Un promotor puede controlar la transcripción de un gen procariótico o eucariótico. Adicionalmente, un promotor puede ser “inducible” y puede iniciar la transcripción en respuesta a un agente inductor o puede ser “constitutivo” si la transcripción no está controlada por un agente inductor. Un gen que está bajo el control de un promotor inducible no se expresa o solo se expresa en una pequeña medida si está ausente un agente inductor. En presencia del agente inductor, el gen se enciende o se aumenta el nivel de transcripción. Esto está mediado, en general, por la unión de un factor de transcripción específico.

Los promotores que se prefieren de acuerdo con la invención incluyen promotores para SP6, polimerasa T3 y T7, promotor de ARN U6 humano, promotor de CMV y promotores híbridos artificiales de los mismos (por ejemplo, CMV) donde una parte o partes están fusionadas a una parte o partes de promotores de genes de otras proteínas celulares tales como por ejemplo GAPDH humano (gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa) e incluyendo o no un(os) intrón(es) adicional(es).

De acuerdo con la invención, el término “expresión” se utiliza en su significado más general y comprende la producción de ARN o de ARN y proteína/péptido. También comprende la expresión parcial de ácidos nucleicos. Adicionalmente, la expresión puede llevarse a cabo de forma transitoria o estable.

En una realización preferida, una molécula de ácido nucleico está de acuerdo con la presente invención en un vector, cuando sea apropiado con un promotor, que controla la expresión del ácido nucleico. El término “vector” se utiliza aquí en su significado más general y comprende cualquier vehículo intermediario para un ácido nucleico que permite que dicho ácido nucleico, por ejemplo, se introduzca en células procarióticas y/o eucarióticas y, cuando sea apropiado, se integre en un genoma Los vectores de este tipo preferiblemente se replican y/o expresan en las células. Los vectores comprenden plásmidos, fagémidos, bacteriófagos o genomas virales. El término “plásmido”, como se utiliza en el presente documento, se refiere en general a una construcción de material genético extracromosómico, habitualmente un dúplex de ADN circular, que puede replicarse independientemente del ADN cromosómico.

Como vector de expresión de un anticuerpo, se puede utilizar ya sea de un tipo de vector en el que están presentes la cadena pesada y la cadena ligera del anticuerpo en diferentes vectores o un vector en el que la cadena pesada y la cadena ligera están presentes en el mismo vector.

La enseñanza dada en este documento con respecto a secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos específicas, por ejemplo, los que se muestran en el listado de secuencias, deben interpretarse de manera que también se relacionen con modificaciones de dichas secuencias específicas que dan como resultado secuencias que son funcionalmente equivalentes a dichas secuencias específicas, por ejemplo, secuencias de aminoácidos que exhiben propiedades idénticas o similares a las de las secuencias de aminoácidos específicas y secuencias de ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos que exhiben propiedades idénticas o similares a las de las secuencias de aminoácidos codificadas por las secuencias de ácido nucleico específicas. De manera similar, las enseñanzas dadas en este documento con respecto a anticuerpos específicos o hibridomas que producen anticuerpos específicos se deben interpretar de manera que también se relacionen con anticuerpos caracterizados por una secuencia de aminoácidos y/o secuencia de ácido nucleico que se modifica en comparación con la secuencia de aminoácidos y/o secuencia de ácido nucleico de los anticuerpos específicos pero que son funcionalmente equivalentes. Una propiedad importante es retener la unión de un anticuerpo a su objetivo o sostener las funciones efectoras de un anticuerpo. Preferiblemente, una

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transfectadas con ADN de plásmido GT468 fueron inyectadas intraperitonealmente (i.p.). En general, el inmunógeno se administró cada dos semanas. Los ratones con respuestas inmunes detectables se reforzaron tres días antes de la esplenectomía para la generación de anticuerpos monoclonales.

Tabla 3. Protocolos de inmunización

Clon: 1. Inmunizació n 2. Inmunizació n 3. Inmunizació n 4. Inmunización 5. Inmunización 6. Inmunizació n Refuerzo

42H1 1 1C11 2B2: Péptido acoplado a KLH (Seq_ID80) Péptido acoplado a KLH (Seq_ID80) Péptido acoplado a KLH (Seq_ID80) Péptido acoplado a KLH (Seq_ID80) Péptido (Seq_ ID80)

51G6 2H3 2B4 1E3: Péptido acoplado a KLH (Seq_ID80) Péptido acoplado a KLH (Seq_ID80) Péptido acoplado a KLH (Seq_ID80) Péptido acoplado a KLH (Seq_ID80) Péptido (Seq_ ID80)

78H1 1 1H6: Péptido acoplado a KLH (Seq_ID81) Péptido acoplado a KLH (Seq_ID81) Péptido acoplado a KLH (Seq_ID81) Péptido acoplado a KLH (Seq_ID81) Péptido (Seq_ ID81)

165B-1: ADN GT468 (Seq_ ID84) + CpG (Seq ID83) ADN G468 (Seq_ ID84) + CpG (Seq_ ID83) ADN GT468 (Seq_ ID84) + CpG (Seq ID83) Proteína recomb. GT 468 (Seq_ID87) Proteína recomb. GT468 (Seq_ ID87)

20-11A-1: ADN GT468 (Seq_ ID84) +PEImanosa ADN GT468 (Seq_ ID84) +PEImanosa ADN GT468 (Seq_ ID84) +PEImanosa Proteína recomb. GT468 (Seq_ID87) Proteína recomb. GT468 (Seq_ID87) Proteína recomb. GT468 (Seq_ ID87)

221A-1: ADN GT468 (Seq_ ID84) +PEImanosa ADN GT468 (Seq_ ID84) +PEImanosa Proteína recomb. GT468 (Seq ID87) Proteína recomb. GT468 (Seq_ ID87)

291A-2 298B-1: ADN GT468 (Seq_ ID84) +PEImanosa ADN GT468 (Seq_ ID84) +PEImanosa ADN GT468 (Seq_ ID84) +PEImanosa Proteína recomb. GT468 (Seq_ID87) Proteína recomb. GT468 (Seq_ID87) ADN transcrito de células HEK293 GT468 (Seq_ ID84)

35-48B-1 3550A2a: ADN GT468 (Seq_ ID84) + PEImanosa ADN GT468 (Seq_ ID84) + PEImanosa ADN GT468 (Seq_ ID84) + PEImanosa Células HEK293 transfectada s con ADN GT468 (Seq_ ID84) Proteína recomb. GT468 (Seq_ID87) Mezcla de péptidos (Seq_ ID5771)

381A-1 38-10B-1: ADN GT468 (Seq_ ID84) + PEImanosa ADN GT468 (Seq_ ID84) + PEImanosa ADN GT468 (Seq_ ID84) + PEImanosa Células HEK293 transfectada s con ADN GT468 (Seq ID86) Células HEK293 transfectada s con ADN GT468 (Seq_ ID85)

443A-2: ADN GT468 (Seq_ ID84) + PEImanosa ADN GT468 (Seq_ ID84) + PEImanosa ADN GT468 (Seq_ ID84) + PEImanosa Células HEK293 transfectada s con ADN GT468 (Seq_ ID85) Células HEK293 transfectada s con ADN GT468 (Seq_ ID85)

452A-1 458A-2: ADN GT468 (Seq_ ID84) + PEImanosa ADN GT468 (Seq_ ID84) + PEImanosa ADN GT468 (Seq_ ID84) + PEImanosa Células HEK293 transfectada s con ADN GT468 (Seq_ ID85) Células HEK293 transfectada s con ADN GT468 (Seq_ ID85)

483B-1: ADN GT468 (Seq_ ID84) ADN GT468 (Seq_ ID84) ADN GT468 (Seq_ ID84) Células HEK293 transfectada Células HEK293 transfectada

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484A-1: + PEImanosa + PEImanosa + PEImanosa s con ADN GT468 (Seq_ ID85) s con ADN GT468 (Seq_ ID85)

49-: ADN GT468 ADN GT468 ADN GT468 ADN GT468 Células Células

3A-1: (Seq_ ID84) + PEI (Seq_ ID84) + PEI (Seq_ ID84) + PEI (Seq_ ID85) + PEI- HEK293 transfectada HEK293 transfectada

49: manosa manosa manosa manosa s con ADN s con ADN

8A-1: GT468 (Seq ID 85) GT468 (Seq_ID 85)

51-: Péptido Péptido Células

1A-1: acoplado a KLH (Seq_ID82) acoplado a KLH (Seq_ID82) HEK293 transfectada s con ADN GT468 (Seq_ ID85)

53-: ADN GT468 ADN GT468 ADN GT468 ADN GT468 ADN GT468 ADN GT468 Células

13A-2: (Seq_ ID84) (Seq_ ID84) (Seq_ ID84) (Seq_ ID85) (Seq_ ID85) (Seq_ ID85) HEK293

53: + PEI + PEI + PEI + CpG (Seq_ + CpG (Seq_ + CpG (Seq_ transfectada

29A-1: manosa manosa manosa ID83) ID83) ID83) s con ADN GT468 (Seq_ ID85)

54-: ADN GT468 ADN GT468 ADN GT468 Células Células

4B-2: (Seq_ ID85) + CpG (Seq_ID83) (Seq_ ID85) + CpG (Seq_ID83) (Seq_ ID85) + CpG (Seq_ID83) HEK293 transfectada s con ADN GT468 (Seq_ ID85) HEK293 transfectada s con ADN GT468 (Seq_ ID85)

56-: ADN GT468 ADN GT468 ADN GT468 Células Células

4A-2: (Seq_ID85) + CpG (Seq_ID83) (Seq_ID85) + CpG (Seq_ID83) (Seq_ID85) + CpG (Seq_ID83) HEK293 transfectada s con ADN GT468 (Seq_ ID85) HEK293 transfectada s con ADN GT468 (Seq_ ID85)

La siguiente tabla enumera los anticuerpos obtenidos y sus isotipos. Tabla 4. Anticuerpos monoclonales obtenidos utilizando diferentes estrategias de inmunización

Hibridoma: Isotipo

42H11 1C11 2B2: IgG2b

51G6 2H3 2B4: IgG1

16-5B-1: IgG2a

20-11A-1: IgG2a

29-1A-2: IgG1

29-8B-1: IgG1

35-48B-1: IgG3

35-50A-2a: IgG2a

38-10B-1: IgG2b

38-1A-1: IgG2b

44-3A-2: IgG2a

45-2A-1: IgG2b

45-8A-2: IgG1

48-3B-1: IgG3

48-4A-1: IgG3

49-3A-1: IgG2a

49-8A-1: IgG1

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51-1A-1: IgG2a

53-13A-2: IgG2a

53-29A1: IgG2b

54-4B-2: IgG2b

56-4A-2: IgG2a

Estos anticuerpos y dos anticuerpos adicionales 78H11 1H6 (isotipo: IgG1) y 22-1A-1 (isotipo: IgG2b) obtenidos en los ejemplos 7 y 8, respectivamente, se usaron para pruebas adicionales.

5 Se realizó un ELISA específico de péptido utilizando el conjunto de 51 péptidos de sobreposición (15meros) con un solapamiento de 11aa mostrado en la Fig. 13 y 25 para identificar los epítopos de la proteína GT468 a la que se unen los anticuerpos monoclonales. Los sobrenadantes de hibridoma purificados se probaron cada uno en el ELISA para la unión específica a todos los péptidos. Como control se usó un péptido irrelevante.

10 Como se indica en la Tabla 5, 15 sobrenadantes mostraron unión específica a los péptidos GT468. De estos 15 sobrenadantes, 13 sobrenadantes unidos a 1 péptido, o a 2 o 3 péptidos adyacentes que sugieren el reconocimiento de un epítopo lineal de GT468, y 2 sobrenadantes unidos a péptidos que, por lo menos parcialmente, no son adyacentes, lo que sugiere una relación lineal/definición conformacional del epítopo. 9 sobrenadantes no mostraron unión específica a péptidos GT468 en el ELISA específico de péptido, sin embargo, mostraron unión en el FACS o en el IF, lo que sugiere

15 reactividad a epítopos conformacionales no lineales de GT468.

Tabla 5. Prueba de anticuerpos monoclonales en un ELISA específico de péptido

Hibridoma: Reactividad (péptido)

42H11 1C11 2B2: 47, 48

51G6 2H3 2B4: 47, 48

78H11 1H6: 50, 51

16-5B-1: 47, 48

20-11A-1: 47, 48

22-1A-1: 50, 51

29-1A-2: 27, 29, 30

29-8B-1: 49-51

35-48B-1: 13

35-50A-2a: Negativo

38-10B-1: Negativo

38-1A-1: Negativo

44-3A-2: 31, 32

45-2A-1: Negativo

45-8A-2: Negativo

48-3B-1: Negativo

48-4A-1: Negativo

49-3A-1: 29-31

49-8A-1: 37, 38

51-1A-1: 36, 37

53-13A-2: 33, 34

53-29A-1: Negativo

54-4B-2: 34, 37

56-4A-2: Negativo

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Claims

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