ES2654065T3 - Anticuerpo monoclonal anti-tenascina humana - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo monoclonal anti-tenascina humana, cuyas secuencias de la región variable de cadena ligera y pesada son SEQ ID 3 y SEQ ID 4, respectivamente, y sus conjugados, siendo capaces dichos conjugados de unirse a un epitopo antigénico dentro de la región A(1-4)-D de la tenascina humana.

Description

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en la que Q es un grupo -(CH2)n-, en el que n es un número entero de 4 a 12, en cuyo caso R’ no está presente, o Q se selecciona del grupo que consiste en -(CH2)a-CH(R’)b-(CH2)b-, en el que a y b son independientemente números enteros de 0 a n, R’ es como se define a continuación, o Q es ciclohexilo, fenilo, en cuyo caso R’ es un sustituyente del anillo de ciclohexilo o fenilo; R es hidrógeno o -A, en el que -A es un macrociclo de fórmula (II):

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en la que los diversos Y, que pueden ser iguales o diferentes, se seleccionan del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C1-C4 lineal o ramificado, -(CH2)m-COOH, en el que m es un número entero de 1 a 3, X es hidrógeno, o el grupo -CH2-U, en el que U se selecciona del grupo que consiste en metilo, etilo y p-aminofenilo, o X es el grupo (CHW)o-Z, en el que o es un número entero de 1 a 5, W es hidrógeno, metilo o etilo, Z es un grupo heterocíclico de 5

o 6 miembros que contiene uno o más heteroátomos seleccionados de O, N-R1, en el que R1 es hidrógeno o alquilo C1-C4 lineal o ramificado, y S; o

Z se selecciona del grupo que consiste en -NH2 -NH-C(=NH)-NH2, o -S-R22, en el que R2 es alquilo C1-C4 lineal o ramificado;

p es el número 2 o 3;

R’ se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C1-C4 lineal o ramificado, -(CH2)q-T, en el que T se selecciona del grupo que consiste en -S-CH3, -OH, -COOH, y q es el número 1 o 2;

R" tiene los mismos significados que R’, con las siguientes condiciones: si R es -A, R" es hidrógeno; si R es hidrógeno, R" es -A, o R y R" son, respectivamente, -(CH2)r-A (para R), en el que r es un número entero de 4 a 12, y -A (para R’), siendo Q un grupo -(CH2)n, en el que n es un número entero de 4 a 12.

Estos compuestos se describen en el documento WO 02/066075.

En una realización particularmente preferida, en el vial que contiene avidina, esta última es un dímero de avidina en el que las dos moléculas de avidina están unidas a través de grupos -NH2 por medio de suberato, o es un dímero de avidina en el que dos moléculas de avidina están unidas a través de grupos -COOH por medio de polietilenglicol con un peso molecular de 3.400, tal como se describe en el documento WO 03/075960.

En los kits según la invención, el anticuerpo, sus fragmentos proteolíticos, sus derivados, opcionalmente biotinilados, pueden estar en combinación con otros anticuerpos anti-tenascina, preferiblemente dirigidos a la región similar a EGF de la proteína, o en combinación con otros anticuerpos específicos de tumor.

Todos los aspectos de esta invención, además de ser aplicables a la terapia de tumores que expresan tenascina, también son aplicables al diagnóstico de tumores y, en particular, a procedimientos de inmunolocalización de tumores, por ejemplo, formación de imágenes. Otro objeto de la presente invención es un recipiente, preferiblemente en forma de un vial adecuado para la inyección, que contiene un anticuerpo o sus fragmentos proteolíticos o sus derivados, opcionalmente biotinilados y/o radiomarcados.

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En otro aspecto de la invención, el anticuerpo o sus fragmentos, derivados recombinantes o análogos, se emplean en combinación con un segundo anticuerpo específico de tenascina, en un ensayo ELISA de tipo "sandwich" in vitro,, en condiciones en las que dicho segundo anticuerpo se une a un segundo epitopo antigénico de la tenascina, para determinar los niveles de tenascina en circulación, y en particular las isoformas que contienen la región A(1-4)-D.

El siguiente ejemplo ilustra más a fondo la invención.

Ejemplo 1

Con el fin de generar un nuevo hibridoma con especificidad para BC-2 pero que no produce una cadena ligera no funcional, se inmunizaron ratones Balb/c con el fragmento A(1-4)-D de la tenascina humana, que contiene el epitopo reconocido por BC-2 (Siri, A., et al., Nucl. Acid Res., 19(3):525-531, 1991; Balza, E., et al., FEBS, 332:39-43, 1993). La representación esquemática de la tenascina C humana y la estrategia adoptada para generar el anticuerpo similar a BC-2 se ilustran en la figura 1. Células de bazo de ratones inmunizados con el fragmento Tn (A(1-4)-D) se fusionaron con células de mieloma que no producen inmunoglobulinas Sp2/0-Ag14 según métodos convencionales (Cianfriglia, M., et al., Methods Enzymol., 121:193-210, 1986), y la población de hibridoma obtenida se sometió a una selección por medio de un ensayo ELISA con tenascina purificada a partir de células de melanoma humano SK-Mel 28 (ICLC HTL99010). Los hibridomas que segregan anticuerpos anti-tenascina se clonaron dos veces mediante diluciones limitantes en medio de crecimiento que contenía FCS y dos veces en medio sin proteínas de origen animal (Animal Derived Component Free Medium HyClone, HyQR Perbio).

Se logró la producción del material de referencia ST2485 cultivando las células de hibridoma cST2485 en un biorreactor de dos litros; dos subclonaciones de dilución limitante sucesivas del banco de células de posproducción ("Post Production Cell Bank", PPCB) de cST2485 condujeron a la selección del subclón cST2485/A3e/A12f, empleado para la producción del banco de células maestras ("Master Cell Bank", MCB) y el banco de células de trabajo ("Working Cell Bank", WCB).

ST2485 es una inmunoglobulina de ratón de isotipo IgG1/k.

La figura 2 muestra el análisis de SDS-PAGE (a, b) y transferencia Western (c, d) del anticuerpo ST2485 en condiciones reductoras y no reductoras. En condiciones reductoras (b, d), se observa una banda doble al nivel de la cadena ligera del anticuerpo; el análisis de la transferencia Western demuestra que las dos bandas son inmunorreactivas como cadenas ligeras de inmunoglobulina. El análisis cromatográfico de hidroxiapatito del anticuerpo ST2485, mostrado en la figura 3, confirma una heterogeneidad suave del anticuerpo por medio del pico ligeramente asimétrico. En el mismo análisis, por otra parte, el anticuerpo BC-2 presenta un perfil claramente heterogéneo, en el que pueden distinguirse tres picos, de los cuales solo el pico 1 se corresponde con el anticuerpo homogéneo totalmente funcional.

Para definir la naturaleza de la heterogeneidad del anticuerpo ST 2485, una muestra de este se sometió a una digestión de los restos N-glicósido con la enzima PNGasa F (péptido-N-glicosidasa de Flavobacterium). La digestión enzimática se realizó empleando el kit de desglicosilación Prozyme (n.º de catálogo GE51001), en las condiciones indicadas por el fabricante: aproximadamente 8 g de ST2485 y 5 mU de enzima se hicieron reaccionar durante la noche a 37 °C en 10 l de mezcla de reacción. El anticuerpo ST2485, digerido y no digerido, se ensayó en un gel de poliacrilamida al 12% en condiciones reductoras. El gel se tiñó con azul brillante de Coomassie.

La digestión provocó la desaparición de la banda de cadena ligera de alto peso molecular, según se demuestra mediante el análisis de SDS-PAGE en condiciones reductoras ilustrado en la figura 4. Este descubrimiento demuestra que las dos bandas de cadena ligera del anticuerpo ST2485 se corresponden con sus variantes glicosilados (alto peso molecular) y no glicosilados (bajo peso molecular). La existencia de un sitio de N-glicosilación potencial también fue confirmada por los datos de la secuencia de ADNc de inmunoglobulina (figura 17).

La región variable de la cadena ligera kappa fue amplificada por el ADNc circularizado empleando una pareja de cebadores (5’ GGGAAGATGGATACAGTTGGT-G, 5’ CAAGAGCTTCAACAGGAATGAG) que reconocen la región constante del anticuerpo, según se describe en M. Sassano et al., Nucl. Ac. Res., (1994) 22, 1768-1769.

La unión de ST2485 a la región A(1-4)-D de la tenascina es específica, según se demuestra mediante el análisis de la transferencia Western presentado en la figura 5. El anticuerpo se une a la tenascina humana y al fragmento A(1-4)-D, pero no al fragmento similar a EGF de la misma proteína, que contiene el epitopo reconocido por el anticuerpo BC-4.

El anticuerpo ST2485 se une a la tenascina humana en un epitopo diferenciado o en un epitopo parcialmente compartido con BC-2, según se demuestra mediante un ensayo ELISA competitivo entre los dos anticuerpos, ilustrado en la figura 6. El anticuerpo biotinilado BC-2, a una concentración establecida en experimentos preliminares, se dispensa con BC-2 no biotinilado (curva 1) o ST2485 (curva 2) en concentraciones crecientes en placas sensibilizadas con el antígeno de tenascina C (a), o el fragmento Tn A(1-4)-D (b). La unión del anticuerpo biotinilado se mide después de la adición de HRP-estreptavidina y el sustrato cromogénico relacionado TMB. El anticuerpo ST2485 provoca una inhibición del 40% de la unión de BC-2 a la tenascina C o al fragmento Tn A(1-4)-D.

Se evaluó la inmunorreactividad de ST2485 en comparación con BC-2 mediante un ensayo ELISA con la tenascina

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C y con el fragmento Tn A(1-4)-D, tal como se muestra en la figura 7. Los anticuerpos ST2485 y BC-2 y las inmunoglobulinas de ratón normales (nMIgG) se dispensaron a concentraciones crecientes en placas sensibilizadas con tenascina C (a) o con el fragmento Tn A(1-4)-D (b); la adición del anticuerpo antirratón secundario marcado con fosfatasa alcalina y el sustrato cromogénico relacionado (pNPP) permite determinar la curva de dosis-respuesta de los anticuerpos. La cantidad de ST2485 necesaria para obtener DO 1,0 es aproximadamente 13 veces menor que la cantidad de BC-2 con la tenascina completa (a), y aproximadamente 10 veces menor que la cantidad de BC-2 con el fragmento Tn (A1-4-D)(b).

Se evaluó la afinidad del anticuerpo ST2485 con la tenascina C y con el fragmento Tn (A1-4-D) mediante un análisis BIAcore. Con la tenascina C, la KD1 de ST2485 es de 9,77 x 10-10 M (ka1 = 6,02 x 105; kd1 = 5,88 x 10-4), mientras que la KD1 de BC-2 es de 2,54 x 10-7 M (ka1 = 9,85 x 103; kd1 = 2,5 x 10-3). Con el fragmento Tn (A1-4-D), la KD1 de ST2485 es de 9,72 x 10-10 M (ka1 = 3,28 x 105; kd1 = 3,19 x 10-4) mientras que la KD1 de BC-2 es de 7,39 x 10-8 M (ka1 = 2,68 x 104; kd1 = 1,93 x 10-3).

El mantenimiento de la inmunorreactividad después de la biotinilación constituye un requisito fundamental para el anticuerpo empleado en la prelocalización y, por tanto, se evaluó el comportamiento de ST2485 biotinilado (8,3 biotinas/molécula) mediante ensayos de ELISA y BIAcore, en comparación con BC-2 biotinilado (7,6 biotinas/molécula). Con respecto a la figura 8, los anticuerpos ST2485 y BC-2, biotinilados y no biotinilados, y las inmunoglobulinas de ratón normales (nMIgG) se dispensaron a concentraciones crecientes en placas sensibilizadas con tenascina C (a) o con el fragmento Tn A(1-4)-D (b); la adición del anticuerpo antirratón secundario marcado con fosfatasa alcalina y el sustrato cromogénico relacionado (pNPP) permite determinar la curva de dosis-respuesta de cada anticuerpo biotinilado, comparado con el anticuerpo no biotinilado (inmunorreactividad residual). La inmunorreactividad residual de ST2485 y BC-2 biotinilados con la tenascina C es igual a 76% y 88%, respectivamente. Con el fragmento Tn A(1-4)-D, la inmunorreactividad residual para ST2485 y BC-2 es del 73% y 83%, respectivamente.

El análisis BIAcore de los anticuerpos biotinilados con la tenascina completa muestra una afinidad KD1 = 2,88 x 10-9 M para ST2485 biotinilado (ka1 = 2,8 x 105; kd1 = 8,07 x 10-4) y una afinidad KD1 = 3,71 x 10-7 M para BC-2 biotinilado (ka1 = 6,0 x 103; kd1 = 2,23 x 10-3). Así, ST2485 biotinilado mantiene unas buenas características de inmunorreactividad y afinidad, conservando una afinidad por la tenascina aproximadamente 100 veces mayor que la del BC-2 biotinilado.

Estudios inmunohistoquímicos sobre diversos tumores humanos (mama, pulmón, estómago, colon) han demostrado la localización de ST2485 al nivel de la matriz extracelular, similar a la indicada para BC-2 (Natali, PG, et al., Int. J. Cancer, 47:811-816, 1991). Estos estudios también han demostrado la capacidad de ST2485 de producir una reacción cruzada con la tenascina murina, incluyendo la expresada en tejidos de ratón normales, como puede observarse en la figura 9. Se incubaron secciones de tumor LMM3 (carcinoma mamario murino) e intestino murino normal fijado en formol con 10 g/ml de ST2485 o de anticuerpo IgG1 murino normal (control). Después de una incubación con el anticuerpo antirratón secundario biotinilado y el complejo de avidina-biotina-peroxidasa (kit Vectastain Elite ABC) se detectó la unión a la tenascina mediante la adición del sustrato colorimétrico DAB (Vector). El contraste se realizó con hematoxilina de Mayer. Las secciones de LMM3 y de intestino murino fueron positivas con ST2485, pero no con el anticuerpo control. No fue posible realizar estos estudios en comparación con BC-2, puesto que este anticuerpo no reconoce las secciones de tejidos fijadas incrustadas en parafina. La capacidad de ST2485 de reconocer la tenascina murina, incluyendo la expresada por tejidos normales, potencia la importancia de los resultados obtenidos en los estudios de biodistribución de anticuerpos en el modelo murino descrito a continuación.

Con el fin de evaluar la capacidad del anticuerpo para localizarse en la masa tumoral se realizaron estudios de biodistribución de ST2485 y BC-2 marcados con 125I y biotinilados. Estos estudios se realizaron en ratones atímicos ("nude") a los que se les había implantado tumores humanos que expresan tenascina, según el protocolo representado esquemáticamente en la figura 10.

Los animales recibieron una inyección subcutánea de 4 x 106 células HT-29 de carcinoma de colon humano en 0,1 ml de disolución salina estéril. Después de 15 días, cuando el tumor hubo alcanzado una masa de aproximadamente

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200 mg, grupos de cinco animales recibieron administraciones intravenosas de 125I-BC2, 125I-ST2485, o inmunoglobulinas de ratón normal (nMIg), todos biotinilados (7-9 biotinas/mol) y en cinco dosis diferentes: 0,2-0,5-12-5 g/ratón en 100 l de PBS estéril. Cinco días después de la administración de los anticuerpos, los animales se sacrificaron y se tomaron muestras de sangre, bazo, riñón, hígado y tumor para determinar la radiactividad presente. Veinticuatro horas antes del sacrificio, los animales recibieron una administración intravenosa de avidina en 100 l de PBS estéril, a unas dosis 100 veces mayores que la del anticuerpo (persecución).

Los resultados, presentados en las figuras 11 y 11a, demuestran que ambos BC-2 y ST2485 se localizan específicamente en el tumor, independientemente de la dosis (las cantidades de anticuerpo se expresan como porcentaje de la dosis inyectada por gramo de tejido: %ID/gr). Además, ST2485 muestra una mayor localización en el tumor comparado con BC-2 en todas las dosis ensayadas, y siempre mantiene una proporción mayor de tumor a no tumor (figuras 12 y 12a). En particular, a la dosis de 1 g/ratón, la acumulación de ST2485 en el tumor es igual a 16% de la dosis inyectada, mientras que la acumulación de BC-2 no es mayor que 5% a cualquiera de las dosis

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ensayadas. A la dosis de of 1 g/ratón, la proporción tumor:sangre para ST2485 es mayor que 20 (dosis óptima), mientras que para el anticuerpo BC-2, esta proporción nunca es mayor que 6 a cualquiera de las dosis ensayadas. En los otros órganos, las proporciones de tumor a no tumor para ST2485 a la dosis de 1 g/ratón son de 9, 26, y 43 con relación al bazo, riñón e hígado, respectivamente. Por otra parte, para BC-2, estas proporciones son siempre menores que 7 a todas las dosis ensayadas. Las proporciones de tumor a no tumor se muestran en las figuras 12 y 12a.

Con el fin de evaluar la posibilidad del uso combinado de los anticuerpos anti-tenascina ST2485 y ST2146 en los métodos PAGRIT® y IART, estando ST2416 dirigido a un epitopo localizado en la región similar a EGF de la proteína (De Santis, R., et al., Br. J. Cancer, 88:996-1003, 2003, documento WO 03/072608), se realizaron experimentos de aditividad in vitro e in vivo con los dos anticuerpos. La figura 13, en dos ensayos de ELISA realizados con placas sensibilizadas con tenascina C, muestra la ausencia de interferencia de epitopo entre los anticuerpos ST2485 y ST2146 (13a) y la naturaleza aditiva de su unión al antígeno (13b). Para la evaluación de la interferencia (a) se dispensó un anticuerpo biotinilado ST2485, a concentraciones crecientes, a microplacas sensibilizadas con tenascina C en ausencia (1) y en presencia (2) de ST2146 a una concentración saturante: las curvas superpuestas 1 y 2 indican la ausencia de interferencia de epitopo entre los dos anticuerpos, ya que la unión de ST2485 biotinilado a la tenascina no se vio afectada por la presencia de ST2146 (y viceversa; los datos no se muestran). La curva 3 muestra la señal obtenida cuando se siembra ST2485 biotinilado en presencia de ST2485 no biotinilado saturante (control).

La figura 13b muestra el ensayo de aditividad, en el que se dispensaron los anticuerpos biotinilados ST2485 y ST2146 en dosis saturantes, por separado o juntos, a microplacas sensibilizadas con tenascina C: la mezcla de los dos anticuerpos produce una señal igual a la suma de las señales, demostrando así que la unión de los dos anticuerpos es aditiva.

También se ensayó la aditividad in vitro de los dos anticuerpos empleando un análisis BIACore, tal como se muestra en las figuras 14 y 14a. La tenascina fue inmovilizada sobre el chip (chip detector CM5, Biosense) según el método descrito (De Santis R., et al., Br. J. Cancer, 88:996-1003, 2003). Se administraron dos inyecciones consecutivas del primer anticuerpo (ST2485 en a, ST2146 en c) a concentraciones saturantes (10 M), seguidas de la inyección del segundo anticuerpo anti-tenascina (ST2146 en a; ST2485 en c). Los sensogramas a) y c) muestran que los dos anticuerpos son capaces de unirse a los respectivos epitopos de una manera aditiva, tal como se muestra por el aumento en la señal de resonancia producida por cada anticuerpo individual. Los sensogramas b) y d) representan las inyecciones de ST2485 y ST2146, respectivamente, cada una seguida de los respectivos anticuerpos de control de isotipo, mIgG2b y mIgG1.

El estudio de aditividad de los dos anticuerpos ST2485 y ST2146 también se realizó in vivo en el modelo animal previamente descrito. El esquema del estudio se ilustra en la figura 15, mientras que los resultados obtenidos se presentan en la figura 16, expresados en ng de anticuerpo por gramo de tumor. Los datos confirman la aditividad de los dos anticuerpos también en el modelo animal. La mezcla de los dos anticuerpos marcados, de hecho, presenta una acumulación en el tumor que asciende al 93% del valor teórico (suma matemática de los dos anticuerpos marcados individuales). Se trataron grupos de animales control con mezclas del anticuerpo radiomarcado y un segundo anticuerpo "frío" para evitar cualquier interferencia.

Se amplificó la región variable de la cadena ligera kappa comenzando a partir del ADNc circularizado empleando una pareja de cebadores (5’ GGGAAGATGG-ATACAGTTGGTG 3’, 5’ CAAGAGCTTCAACAGGAATGAG 3’) que reconocen la región constante de la cadena ligera del anticuerpo, según se describe en M. Sassano, et al., Nucl. Ac. Res., (1994) 22, 1768-1769.

Se amplificó la región variable de la cadena pesada gamma comenzando a partir del ADNc circularizado empleando una pareja de cebadores (5’ ATGGAGTTAG-TTTGGGCAGCAG 3’, 5’ GCACAACCACCATACTGAGAAG 3’) que reconocen la región constante de la cadena pesada del anticuerpo, según se describe en M. Sassano, et al., Nucl. Ac. Res., (1994) 22, 1768-1769.

La figura 17 muestra la secuencia SEQ ID 1 de la región variable de la cadena ligera (VL) de ST2485.

La figura 18 muestra la secuencia SEQ ID 2 de la región variable de la cadena pesada (VH) de ST2485.

La caracterización comparativa de ST2485 comparado con BC-2 demuestra que el anticuerpo ST2485 posee las siguientes características:

-reconoce un epitopo dentro de la región A(1-4)-D de la tenascina humana, cercano o parcialmente solapante con el de BC-2;

-es un anticuerpo homogéneo con respecto a la composición de la cadena ligera y pesada, porque la heterogeneidad observada es debida a variantes de glicosilación de la cadena ligera;

-es más inmunorreactivo que BC-2;

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-tiene mayor afinidad por el antígeno que BC-2;

-es comparable a BC-2 con respecto al mantenimiento de la inmunorreactividad después de la biotinilación;

-es mejor que BC-2 con respecto a la localización tumoral en el modelo animal;

-se une de una manera aditiva con el anticuerpo monoclonal anti-tenascina ST2146 a la tenascina C, tanto in vitro como in vivo en el modelo animal.

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