ES2647237T3 - Cebadores quiméricos para reacciones de amplificación de ácidos nucleicos mejoradas - Google Patents

Abstract

Un método para reducir o eliminar la formación de artefactos y productos de amplificación no específicos en una reacción de amplificación de ADN polimerasa dependiente de ADN, comprendiendo el método: realizar una reacción de amplificación de ácido nucleico usando al menos un oligonucleótido quimérico de ARN/ADN como cebador directo o inverso o como una sonda y usando una ADN polimerasa dependiente de ADN; en el que el oligonucleótido quimérico comprende al menos un ribonucleótido que no está localizado en, pero está localizado dentro de diez nucleótidos del extremo 3' del oligonucleótido quimérico; en el que el al menos un ribonucleótido impide la síntesis de ADN a partir de dímeros de cebador-cebador o dímeros de cebador-sonda; y en el que no hay dos ribonucleótidos en el oligonucleótido quimérico que estén adyacentes entre sí.

Description

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entre el extremo 3' de un cebador y una base complementaria en el mismo cebador.

Por lo tanto, en una reacción de amplificación de ADN polimerasa dependiente de ADN, si un ribonucleótido está presente muy cerca de una base complementaria al extremo 3' de otro cebador o sonda o a su propio extremo 3', la

5 elongación del dímero de cebadores o el dímero cebador-sonda se verá obstaculizada debido a la presencia del ribonucleótido en la zona de iniciación y la generación de productos de amplificación no específicos se reducirá o incluso se eliminará.

Por consiguiente, la presente invención proporciona un método para reducir o eliminar productos de amplificación no

10 específicos en una reacción de amplificación de ADN polimerasa dependiente de ADN que comprende realizar una reacción de amplificación de ácido nucleico usando al menos un oligonucleótido quimérico de ARN/ADN como cebador directo o inverso y una ADN polimerasa dependiente de ADN para amplificar una secuencia diana, y opcionalmente una o más sondas oligonucleotídicas, en donde el oligonucleótido quimérico comprende al menos un ribonucleótido; y en donde el número de ribonucleótidos dentro de uno a 10 nucleótidos del extremo 3' del

15 oligonucleótido quimérico permitirá la iniciación de la síntesis de ADN y no evitará la elongación del ADN cuando el cebador forma un dúplex con la secuencia diana deseada e impedirá la iniciación de la síntesis de ADN a partir de dímeros de cebador-cebador o dímeros de cebador-sonda; y en donde no hay dos ribonucleótidos que estén adyacentes entre sí en el cebador.

20 Se obtiene una mejor eficacia en la reducción de productos de amplificación no específicos cuando el cebador directo y el cebador inverso son ambos quimeras de ARN/ADN. En algunas realizaciones, todos los cebadores y sondas usados en la reacción de amplificación tienen la misma base en el extremo 3'. Es deseable que todos los cebadores tengan el mismo extremo 3' para minimizar el número de bases que se van a modificar. En una realización preferida, el extremo 3' de todos los cebadores usados en la reacción de amplificación es A o T.

25 En algunas realizaciones, al menos un cebador o sonda quimérica comprende un ribonucleótido ubicado en o adyacente al menos a uno de los nucleótidos que es complementario a su propio extremo 3' o al extremo 3' de otro cebador o sonda en la mezcla de reacción.

30 En diversas realizaciones, cada cebador quimérico o sonda comprende al menos un ribonucleótido localizado en o dentro de uno a 5 nucleótidos de al menos uno de los nucleótidos que es complementario a su propio extremo 3' o el extremo 3' de otro cebador o sonda en la mezcla de reacción. En realizaciones preferidas, cada cebador quimérico o sonda comprende un ribonucleótido situado en o adyacente a al menos uno de los nucleótidos que es complementario a su propio extremo 3' o al extremo 3' de otro cebador o sonda en la mezcla de reacción.

35 Se pueden usar numerosas configuraciones, en términos de la colocación de las bases de ARN, en la quimera de ARN/ADN descrita en la presente invención, que varía de la modificación de uno cualquiera de los nucleótidos complementarios a su propio cebador o al otro cebador o cebadores del extremo 3', o la modificación de su vecino o vecinos, a la modificación de todos estos nucleótidos, siempre que no se produzcan fragmentos de ARN en el

40 oligonucleótido modificado. Sin embargo, no es necesario modificar todos los nucleótidos complementarios al extremo 3' de sí mismo y otro cebador o cebadores o el vecino o vecinos de todos estos nucleótidos, ya que pueden producirse regiones llenas de ARN y bloquear la elongación.

Las bases de ARN se pueden dispersar a lo largo del cebador desde el extremo 3' a la última base 5'. Dado que los

45 dímeros de cebadores son el artefacto más prevalente, las bases más importantes para modificar se ubican en el centro del cebador. El extremo 5' del cebador es la base menos importante en la lista de modificaciones. En el diseño de la quimera, es preferible evitar cadenas de ARN que podrían bloquear la elongación del ADN.

El diseño y uso de cebadores de amplificación en general es bien conocido en la técnica. Los cebadores de la

50 presente invención se distinguen por la inclusión de bases de ARN en la secuencia de cebador. Otros aspectos del cebador, tales como la longitud total y la secuencia, se seleccionan siguiendo la práctica estándar del diseño de cebadores. Un experto en la técnica reconocerá que con un diseño cuidadoso, la secuencia óptima de un cebador o sonda de quimera de ARN/ADN para una aplicación específica requerirá una mínima experimentación.

55 El método descrito se puede usar con cualquier reacción de amplificación de ácido nucleico, para reacciones singleplex y multiplex y para ensayos que requieren una reacción de amplificación de ácido nucleico como una etapa anterior, tal como análisis de HRM. Las formas de amplificación de ácidos nucleicos para el uso de la quimera de ARN/ADN descrita incluyen reacciones de amplificación de ácidos nucleicos que implican amplificación exponencial, ya sea isotérmica o con ciclos térmicos, reacciones de amplificación de ácidos nucleicos que requieren amplificación

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En algunas realizaciones, el kit comprende además los medios para detectar los productos de la reacción de amplificación. Está disponible una diversidad de opciones para medir los productos de amplificación a medida que se forman. Un método utiliza etiquetas, tales como tintes, que solo se unen al ADN bicatenario. En este tipo de enfoque, 5 el producto de amplificación (que es bicatenario) se une a moléculas de colorante en solución para formar un complejo. Con los tintes apropiados, es posible distinguir entre las moléculas de colorante libres en solución y las moléculas de colorante unidas al producto de amplificación. Por ejemplo, ciertos colorantes fluorescentes solamente cuando se unen al producto de amplificación. Los ejemplos de colorantes que se pueden usar en métodos de este tipo general incluyen, pero sin limitación, Syber Green™ y Pico Green™ de Molecular Probes, Inc., LCGreen de

10 Idaho technology., bromuro de etidio, yoduro de propidio, cromomicina, naranja acridina, Hoechst 33258, Toto-1, Yoyo-1, DAPI (clorhidrato de 4',6-diamidino-2-fenilindol).

Además, la medición y detección de productos de amplificación también pueden realizarse, por ejemplo, controlando la radiactividad, la colorimetría, la absorción, la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET), los

15 parámetros magnéticos, o la actividad enzimática. Por lo tanto, las etiquetas para los cebadores y/o sondas, que pueden emplearse incluyen, pero sin limitación, fluoróforos, cromóforos, isótopos radiactivos, reactivos densos de electrones, enzimas y ligandos que tienen compañeros de unión específicos (por ejemplo, biotina-avidina).

Síntesis de cebadores quiméricos de ARN/ADN

20 La síntesis de los cebadores quiméricos de ARN/ADN se realiza usando medios químicos estándar bien conocidos en la técnica, por ejemplo, el método de dietilfosforamidita de Beaucage et al., 1981, Tetrahedron Lett. 22:18591862; y el método de soporte sólido de la Patente de Estados Unidos N.º 4.458.066. Preferiblemente, la reacción de síntesis se realiza en un sintetizador de ADN automático disponible en el mercado usando fosforamiditas de

25 nucleótidos disponibles en la técnica. Las fosforamiditas y los soportes de nucleótidos adecuados para sintetizar oligonucleótidos que contienen nucleótidos modificados como se usan en el presente documento están disponibles en el mercado. La síntesis de oligonucleótidos quiméricos de ARN/ADN se realiza mediante la adición por etapas de monómeros de desoxinucleósidos y ribonucleósidos a una cadena en crecimiento. Cada adición implica el acoplamiento de un grupo reactivo 3' fósforo de un monómero nucleosídico al 5' hidroxilo de otro nucleósido unido a

30 un soporte sólido. Después de la adición del nucleósido final, el oligonucleótido se escinde del soporte, los grupos protectores se eliminan de las bases, y el oligonucleótido quimérico de ARN/ADN se purifica para su uso.

Eficiencia

35 Sin desear quedar ligando a ninguna teoría o mecanismo particular, se cree que la eficacia de la iniciación de la síntesis de ADN en una reacción de amplificación de ADN polimerasa dependiente de ADN se ve obstaculizada cuando el ARN está incrustado en la zona de iniciación, mientras que el la eficacia de la elongación del ADN se ve menos afectada cuando el ARN está incrustado en la secuencia plantilla.

40 Sin embargo, cuando se produce una hibridación sin plantilla no deseable, tal como un dímero de cebador de quimera de ARN/ADN, la zona de iniciación incluye bases de ARN. De nuevo, sin desear quedar ligado a ninguna teoría o mecanismo en particular, se supone que esto hace que los ciclos de amplificación sean cinética y/o termodinámicamente ineficaces. La incorporación de bases de ARN en cebadores de ADN probablemente desestabiliza el apareamiento de bases. Sin embargo, la desestabilización de los dímeros de cebadores es

45 probablemente más profunda que la desestabilización del híbrido de ADN cebador-diana. Nakano et al. investigaron la termodinámica de las uniones quiméricas con el ADN y demostraron que el vecino más cercano ∆G37 °C de las uniones quiméricas (rd/dd y dr/dd) era diferente de los híbridos de ADN (dd/dd) (Nakano et al. (2004) J Am Chem Soc, 126, 1088-1095). No siempre se aumentó, pero se produjo con más frecuencia.

50 Por lo tanto, el uso de cebadores quiméricos de ARN/ADN reduce los artefactos de dímero de cebadores en reacciones de amplificación de ADN de plantilla bajas dando como resultado una sensibilidad de detección aumentada en cualquier reacción de polimerización de ADN dependiente de ADN.

Esto se ilustra con más detalle en el siguiente ejemplo, usando una secuencia diana hipotética. Con referencia a la

55 figura 1, la secuencia expuesta en la diana de plantilla SEQ ID NO: 1 debe amplificarse con cebadores de quimera de ARN/ADN (cebador directo: SEQ ID NO:2; cebador inverso: SEQ ID NO:3). En el primer ciclo de amplificación, la iniciación y la síntesis de la longitud completa del amplicón implica utilizar únicamente bases de ADN como plantilla.

Con referencia ahora a la figura 2 y la figura 3, se puede ver que después de la fusión y la hibridación, el segundo y

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