ES2534288T3 - Composiciones terapéuticas contra el cáncer que seleccionan como objetivo 4Ig-B7-H3 - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo que se une de manera específica a un polipéptido 4Ig-B7-H3 para el uso en el tratamiento de un paciente con un tumor, en el que el anticuerpo es capaz de inducir la lisis de una célula tumoral a la que se une el anticuerpo, y dicho anticuerpo comprende una o más modificaciones en la región Fc que aumentan la afinidad del anticuerpo hacia un FcγR activante respecto del anticuerpo que comprende una región Fc de tipo natural.

Description

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resistentes a la lisis por parte de un linfocito T citotóxico, o lo más preferiblemente una célula NK. "Resistente" o que "no responde" describe los pacientes tratados con una terapia del cáncer (p.ej., una inmunoterapia) que no es adecuada clínicamente para tratar o aliviar uno o más síntomas asociados al cáncer. En general, tales pacientes padecen una enfermedad grave constantemente activa, y requieren una terapia adicional para mejorar los síntomas asociados a su cáncer. La frase también puede describir pacientes que responden a la terapia, aunque padecen efectos secundarios, recaen, desarrollan resistencia, etc.

Aspectos adicionales

En otro aspecto, la presente descripción proporciona anticuerpos producidos mediante el uso de cualquiera de los métodos descritos en la presente memoria. La descripción también abarca los fragmentos y derivados de los anticuerpos que tienen sustancialmente la misma especificidad y actividad hacia el antígeno (p.ej., que se pueden unir a los mismos antígenos que el anticuerpo de origen). Tales fragmentos incluyen, sin limitación, fragmentos Fab, fragmentos Fab'2, CDR y ScFv.

En otro aspecto, cualquier método anteriormente mencionado que implica un anticuerpo que se une a un polipéptido 4Ig-B7-H3 se puede llevar a cabo con anticuerpos 5B14 o 7-517, o con anticuerpos que compiten con ellos. Así, en un aspecto, la descripción abarca el uso, según cualquiera de los métodos de la presente memoria, de un anticuerpo que compite con los anticuerpos monoclonales 5B14 o 7-517. Opcionalmente, un anticuerpo que compite con el anticuerpo 5B14 o 7-517 no es el anticuerpo 5B14 o 7-517 propiamente dicho, respectivamente. Preferiblemente, dichos anticuerpos son anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, o anticuerpos humanos.

La expresión "compite con", cuando se refiere a un anticuerpo monoclonal particular (p.ej. 5B14 o 7-517) significa que un anticuerpo compite con el anticuerpo monoclonal (p.ej. 5B14 o 7-517) en un ensayo de unión mediante el uso de moléculas 4Ig-B7-H3 recombinantes o moléculas 4Ig-B7-H3 expresadas en la superficie. Por ejemplo, si un anticuerpo reduce la unión de 5B14 o 7-517 a una molécula 4Ig-B7-H3 en un ensayo de unión, el anticuerpo "compite" con 5B14 o 7-517. Un anticuerpo que "compite" con 5B14 o 7-517 puede competir con 5B14 o 7-517 por la unión a la molécula 4Ig-B7-H3 humana.

En otro aspecto, la descripción comprende un anticuerpo que se une a un polipéptido 4Ig-B7-H3, en el que el anticuerpo es 5B14 o 7-517. También abarca una célula hospedadora, en particular un hibridoma que produce cualquiera de los anticuerpos anteriormente mencionados.

Se propone que los anticuerpos monoclonales de la presente descripción tendrán una aplicación útil en procedimientos inmunoquímicos habituales, tales como métodos de ELISA y de transferencia de Western y en procedimientos inmunohistoquímicos tales como tinción de tejidos, así como en otros procedimientos que pueden utilizar anticuerpos específicos hacia epítopos del antígeno 4Ig-B7-H3. Además, se propone que se pueden utilizar los anticuerpos monoclonales específicos hacia 4Ig-B7-H3 particulares de especies diferentes en otras aplicaciones útiles. En general, se pueden usar los anticuerpos tanto policlonales como monoclonales hacia 4Ig-B7-H3 en una diversidad de aspectos. Por ejemplo, se pueden emplear en protocolos de clonación de anticuerpos para obtener cADNs o genes que codifican otros 4Ig-B7-H3. También se pueden usar en estudios de inhibición para analizar el efecto de los péptidos relacionados con 4Ig-B7-H3, en especial un receptor de 4Ig-B7-H3 hallado en las células NK, en células o animales. Los anticuerpos hacia 4Ig-B7-H3 también serán útiles en estudios de inmunolocalización para analizar la distribución de 4Ig-B7-H3 durante diversos acontecimientos celulares, por ejemplo, para determinar la distribución celular o específica de tejido de los polipéptidos 4Ig-B7-H3 en diferentes puntos en la progresión tumoral. Una aplicación especialmente útil de tales anticuerpos es en la purificación de 4Ig-B7-H3 nativo o recombinante, por ejemplo, mediante el uso de una columna de afinidad con anticuerpos, p.ej. para co-precipitar un receptor de 4Ig-B7-H3 a partir de una muestra biológica derivada de células NK. La operación de tales técnicas inmunológicas será conocida para los expertos en la técnica a la luz de la presente descripción.

En otro aspecto, la presente descripción proporciona equipos que comprenden uno o más de los anticuerpos descritos en la presente memoria. En un aspecto, el equipo comprende al menos un anticuerpo diagnóstico y al menos un anticuerpo terapéutico (p.ej., citotóxico). En otro aspecto, el anticuerpo diagnóstico y el anticuerpo terapéutico se unen de manera específica al mismo receptor de las células NK. En otro aspecto, el equipo comprende también instrucciones para usar los anticuerpos según los presentes métodos.

La descripción también comprende composiciones farmacéuticas que comprenden uno o más de los presentes anticuerpos, o un fragmento o derivado de los mismos, y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

Descripción de las Figuras

Figura 1: Reactividad del mAb 5B14 con líneas celulares de neuroblastoma.

Se tiñeron diferentes líneas celulares de neuroblastoma con mAb 5B14 o mAbs hacia las moléculas indicadas, seguido de un segundo reactivo específico de isotipo anti-ratón de cabra conjugado a PE y se analizaron mediante citometría de flujo. Los perfiles blancos indican las células incubadas con el segundo reactivo solamente.

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Figura 2: Análisis citofluorimétrico comparativo de la reactividad de 5B14 y GD2 en células de neuroblastoma recién obtenidas. Dos aspirados de médula ósea representativos derivados de niños afectados por neuroblastoma en el estadio 4 (A) o en un estadio 1 no metastásico (B) se analizaron mediante fluorescencia doble y análisis citofluorimétrico con mAb 5B14 o mAbs hacia las moléculas indicadas, seguido de un segundo reactivo específico de isotipo anti-ratón de cabra conjugado a PE o FITC. Se muestran otros tres aspirados de médula ósea en el estadio 4 representativos caracterizados por diferentes números de células de neuroblastoma infiltrantes en el panel C. Se indica el análisis estadístico (en cuanto al % de células positivas).

Figura 3: Detección inmunohistoquímica de células positivas para GD2 y 5B14 en aspirados de MO de casos de neuroblastoma en estadio IV. Panel A: Preparación de citocentrifugación de aspirado de MO (mAb GD2, APAAP, aumento 20x.) con inmunotinción de células individuales y agrupamientos de células NB. En el fondo, fragmentos que muestran cierta inmunotinción. Panel B: Detalle a un aumento mayor (mAb GD2, APAAP, 63x): el brillo de la inmunotinción para el mAb GD2 puede enmascarar las características morfológicas de las células, por lo que interfiere así con el reconocimiento y la evaluación cuantitativa del número de células NB. Panel C: Citocentrifugación de un aspirado de MO de la misma muestra que en A. (mAb 5B14, APAAP, 20x). Panel D: Detalle a un aumento mayor (mAb 5B14, APAAP, 63x) de una agrupación de células del mismo aspirado de MO que en B. La calidad más tenue y débil (que GD2) de la inmunotinción es visible en contraposición a un fondo algo más "limpio". Las características morfológicas de los núcleos son fácilmente distinguibles.

Figura 4. Caracterización bioquímica de la molécula reactiva con 5B14 y análisis citofluorimétrico de los transfectantes celulares. Panel A: Las líneas celulares 293T y ACN se marcaron superficialmente con 125I y se inmunoprecipitaron con el mAb 5B14. Las muestras, sin tratar (-) o tratadas (+) con N-glicosidasa F, se analizaron mediante SDS-PAGE del 8% en condiciones reductoras. Se indican los marcadores de los pesos moleculares (kD).

Panel B: Las células CHO-K sin transfectar o transfectadas con el cADN de 4Ig-B7-H3 se tiñeron con el mAb 5B14 seguido de un segundo reactivo específico de isotipo anti-ratón de cabra conjugado con PE y se analizaron mediante citometría de flujo. Los perfiles blancos indican las células incubadas con el segundo reactivo solamente.

Figura 5. Las moléculas 4Ig-B7-H3 protegen a las células objetivo de la citotoxicidad mediada por NK. Una población de células NK policlonales se analizó en cuanto a la actividad citolítica hacia CHO-K o transfectantes 4Ig-B7H3-CHO-K (panel A), o hacia dos poblaciones celulares de neuroblastoma recién purificadas representativas (NB1 y NB2) (panel B, izquierda) en ausencia de mAb o en presencia de mAbs hacia 4Ig-B7-H3 (5B14) o hacia HLA de clase I (A6-136). La proporción efector/objetivo usada fue 2:1 (panel A) o 20:1 (panel B). Los resultados son representativos de tres experimentos independientes; la desviación estándar de la media de los triplicados fue <5%. Obsérvese que las células de neuroblastoma fueron sumamente homogéneas, tal como se indica por el hecho de que las moléculas 4Ig-B7-H3 y GD2 fueron expresadas por toda la población celular (citometría de flujo de NB1 y NB2 en el panel B, derecha). Los perfiles blancos indican las células incubadas con el segundo reactivo solamente.

Figura 6. Las moléculas solubles de B7-H3 no inducen la producción de IFN-gamma por las células NK. Una población de células NK policlonales representativa de un donante sano se estimuló, o no, con moléculas solubles unidas a placas (2Ig-B7-H3, 4Ig-B7-H3, MICA) o el mAb anti-NKp30 y se determinó la producción de IFN-gamma mediante ELISA. Los datos son representativos de 4 experimentos independientes.

Figura 7: Muestra la Tabla 1, la reactividad superficial del mAb 5B14 en diferentes tipos de células. Se analizó la reactividad con los mAbs 5B14 y anti-GD2 en células normales y en líneas celulares cultivadas in vitro mediante inmunofluorescencia indirecta y análisis de FACS. Intensidad de fluorescencia media (MFS): solapando con el control negativo (-) (MFI ajustado a 5); MFI por debajo de 20 (+/-); MFI entre 20 y 100 (+); MFI por encima de 100 (++).

Figura 8: Estructura de los dominios de 4-Ig-B7-H3 como se describe en Steinberger et al, (2004).

Descripción detallada de la invención

Introducción

La presente descripción proporciona métodos nuevos para producir y usar anticuerpos adecuados para el diagnóstico y el tratamiento de trastornos proliferativos, en particular tumores, trastornos inflamatorios y trastornos inmunoproliferativos. Están incluidos los anticuerpos, derivados de anticuerpos, o fragmentos de anticuerpos producidos mediante el uso de los métodos descritos en la presente memoria, al igual que los métodos para diagnosticar y tratar a pacientes mediante el uso de los anticuerpos. En particular, la descripción proporciona compuestos que facilitan la activación de las células NK humanas; estos compuestos actúan bloqueando las interacciones de la proteína 4Ig-B7-H3 con el receptor de 4Ig-B7-H3 inhibitorio (4Ig-B7-H3R) en las células NK y neutraliza las señales inhibitorias del receptor, lo que da como resultado la potenciación de la citotoxicidad de las células NK en las células NK que expresan 4Ig-B7-H3R. Esta potenciación de la actividad de las células NK tiene una amplia diversidad de aplicaciones terapéuticas. La potenciación de las células NK puede ser beneficiosa para el tratamiento de trastornos proliferativos tales como tumores, así como enfermedades infecciosas y trastornos

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inflamatorios. También se ha demostrado que la potenciación de las células NK da como resultado una eficacia incrementada de los anticuerpos terapéuticos, en particular los anticuerpos capaces de inducir la destrucción celular mediada por ADCC de una célula objetivo a la que se unen (por ejemplo, anticuerpos que se unen a antígenos tumorales). En la presente memoria se discute adicionalmente una diversidad de tales anticuerpos terapéuticos.

Además, basándose en el descubrimiento de que la proteína 4Ig-B7-H3 se expresa de manera selectiva en las células en proliferación excesiva (p.ej. células tumorales o inmunitarias), la presente descripción proporciona un método para tratar trastornos caracterizados por tales células en proliferación excesiva seleccionando como objetivo específicamente aquellas células que expresan 4Ig-B7-H3, preferiblemente mediante el uso de anticuerpos citotóxicos. De esta manera, se reduce específicamente el número de células en proliferación excesiva, a la vez que se conservan otras células inmunitarias y no inmunitarias. El compuesto que selecciona como objetivo las células que expresan 4Ig-B7-H3 puede actuar por medio de cualquier mecanismo adecuado, p.ej., neutralizando el efecto protector de la proteína 4Ig-B7-H3 en la célula en proliferación, seleccionando como objetivo las células en proliferación para la destrucción por parte del sistema inmunitario (p.ej. por medio de la citotoxicidad dependiente de anticuerpos, también denominada ADCC), o destruyendo las células directamente poniéndolas en contacto con un agente citotóxico tal como un radioisótopo, toxina, o fármaco. Además, basándose en el mismo descubrimiento, la descripción también proporciona métodos diagnósticos de enfermedades, ya que la detección de 4Ig-B7-H3 se puede usar como herramienta diagnóstica para identificar células en proliferación (p.ej. tumores, trastornos inmunoproliferativos). En general, los presentes métodos que se refieren a la selección como objetivo de las células que expresan 4Ig-B7-H3 implica el uso de anticuerpos monoclonales específicos para 4Ig-B7-H3. De manera ventajosa, se usan dos grupos de anticuerpos. Un grupo, que comprende anticuerpos marcados directamente o indirectamente, tienen una naturaleza de diagnóstico, y se usan para determinar si 4Ig-B7-H3 se expresa en las células (p.ej. células tumorales) de un paciente. El segundo grupo, usado para el tratamiento, corresponde a anticuerpos monoclonales que se generan en general en un animal que no es un ser humano, pero que se han hecho adecuados para el uso en seres humanos, p.ej., están humanizados o son quiméricos. En ciertos aspectos, los anticuerpos se derivatizan adicionalmente con agentes citotóxicos, directamente o indirectamente, de manera que destruyen las células que expresan 4Ig-B7-H3. Por ejemplo, los anticuerpos se pueden unir a isótopos radiactivos, polipéptidos citotóxicos, o moléculas pequeñas citotóxicas.

Definiciones

Tal como se usa en la presente memoria, los siguientes términos tienen los significados atribuidos a ellos, a menos que se especifique de otra manera.

Tal como se usa en la presente memoria, células "NK" se refiere a una subpoblación de linfocitos que están implicados en la inmunidad no convencional. Las células NK se pueden definir en virtud de ciertas características y propiedades biológicas, tales como la expresión de antígenos de superficie específicos que incluyen CD16, CD56 y/o CD57, la ausencia del complejo TCR alfa/beta o gamma/delta en la superficie de la célula, la capacidad de unirse y destruir células que no expresan antígenos MHC/HLA "propios" mediante la activación de enzimas citolíticas específicas, la capacidad de destruir células tumorales u otras células enfermas que expresan un ligando para los receptores activantes de NK, y la capacidad de liberar moléculas proteicas denominadas citocinas que estimulan o inhiben la respuesta inmunitaria. Se puede usar cualquiera de estas características y actividades para identificar células NK, mediante el uso de métodos muy conocidos en la técnica.

Tal como se usa en la presente memoria, "estado de 4Ig-B7-H3" se refiere a la identidad y la prominencia de la proteína 4Ig-B7-H3 expresada en células en proliferación o en otras células (p.ej. células tumorales, células dendríticas, células inmunitarias en proliferación, etc.) extraídas de un individuo, p.ej., un paciente de cáncer. Por ejemplo, un examen de las células extraídas de un paciente puede descubrir que 4Ig-B7-H3 se expresa en un 30%, 40%, 50%, etc., de las células. "Expresado de manera prominente" se refiere a la proteína 4Ig-B7-H3 que se expresa en un número sustancial de células en proliferación excesiva o células tumorales extraídas de un paciente dado. Aunque la definición del término "expresado de manera prominente" no está limitado por un valor de porcentaje preciso, en la mayoría de los casos una proteína que se dice que se "expresa de manera prominente" estará presente en al menos un 20%, 30%, 40%, preferiblemente un 50%, 60%, 70%, o más del neuroblastoma, melanoma, carcinoma u otras células en proliferación excesiva extraídas de un paciente.

El término "anticuerpo", tal como se usa en la presente memoria, se refiere a anticuerpos policlonales y monoclonales. Dependiendo del tipo de dominio constante de las cadenas pesadas, los anticuerpos se asignan a una de cinco clases principales: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM. Algunas de estas se dividen adicionalmente en subclases

o isotipos, tales como IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, y similares. Una unidad estructural de inmunoglobulina (anticuerpo) ejemplar comprende un tetrámero. Cada tetrámero está compuesto de dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, y cada par tiene una cadena "ligera" (alrededor de 25 kDa) y una cadena "pesada" (alrededor de 5070 kDa). El extremo N-terminal de cada cadena define una región variable de alrededor de 100 a 110 o más aminoácidos que es responsable principalmente del reconocimiento del antígeno. Las expresiones cadena ligera variable (VL) y cadena pesada variable (VH) se refieren a estas cadenas ligeras y pesadas, respectivamente. Los dominios constantes de la cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan "alfa", "delta", "épsilon", "gamma" y "mu", respectivamente. Las estructuras de las subunidades y las

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configuraciones tridimensionales de las diferentes clases de inmunoglobulinas son muy conocidas. IgG y/o IgM son las clases preferidas de anticuerpos empleados en esta descripción, e IgG es la especialmente preferida, debido a que son los anticuerpos más habituales en situaciones fisiológicas y debido a que son los que se producen de manera más sencilla en el ámbito del laboratorio. Preferiblemente, el anticuerpo de esta descripción es un anticuerpo monoclonal. Los anticuerpos especialmente preferidos son los anticuerpos humanizados, quiméricos, humanos, o de otra manera adecuados para seres humanos. Los "anticuerpos" también incluyen cualquier fragmento o derivado de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente memoria.

La expresión "se une de manera específica a" significa que un anticuerpo se puede unir preferiblemente en un ensayo de unión competitiva a la molécula de unión, p.ej. la proteína 4Ig-B7-H3 o un receptor de 4Ig-B7-H3, tal como se determina mediante el uso de ambas formas recombinantes de las proteínas, los epítopos que se hallan en ellas,

o las proteínas nativas presentes en la superficie de células NK aisladas o células objetivo relevantes. Los ensayos de unión competitiva y otros métodos para determinar la unión específica se describen adicionalmente más adelante y se conocen bien en la técnica.

Un anticuerpo "adecuado para seres humanos" se refiere a cualquier anticuerpo, anticuerpo derivatizado, o fragmento de anticuerpo que se puede usar como seguridad en seres humanos, p.ej., para los métodos terapéuticos descritos en la presente memoria. Los anticuerpos adecuados para seres humanos incluyen todos los tipos de anticuerpos humanizados, quiméricos, o completamente humanos, o cualquier anticuerpo en el que al menos una porción del anticuerpo procede de seres humanos o está modificado de otra manera para evitar la respuesta inmunitaria que se provoca en general cuando se usan anticuerpos nativos que no son humanos.

Los péptidos o moléculas pequeñas "tóxicas" o "citotóxicas" abarcan cualquier compuesto que puede frenar, detener, o invertir la proliferación de las células, disminuir su actividad (p.ej., la actividad citolítica de las células NK) de cualquier manera detectable, o destruirlas directamente o indirectamente. Los compuestos tóxicos o citotóxicos pueden funcionar, por ejemplo, destruyendo las células mediante la inducción de ADCC, provocando la apoptosis o de otra manera. Tal como se usa en la presente memoria, un "péptido" tóxico puede incluir cualquier péptido, polipéptido, o derivado, que incluye derivados de péptidos o de polipéptidos con aminoácidos no naturales o uniones modificadas. Una "molécula pequeña" tóxica puede incluir cualquier compuesto o elemento tóxico, preferiblemente con un tamaño menor de 10 kD, 5 kD, 1 kD, 750 D, 600 D, 500 D, 400 D, 300 D, o más pequeño.

"Fragmento inmunógeno" significa en la presente memoria cualquier fragmento polipeptídico o peptídico que es capaz de provocar una respuesta inmunitaria tal como (i) la generación de anticuerpos que se unen a tal fragmento y/o que se unen a cualquier forma de la molécula que comprende dicho fragmento, lo que incluye el receptor asociado a membrana y los mutantes derivados del mismo, (ii) la estimulación de una respuesta de células T que implica las células T que reaccionan con el complejo bi-molecular que comprende cualquier molécula del MHC y un péptido derivado de dicho fragmento, (iii) la unión de vehículos transfectados tales como bacteriófagos o bacterias que expresan genes que codifican inmunoglobulinas de mamíferos. De manera alternativa, un fragmento inmunógeno se refiere también a cualquier construcción capaz de generar una respuesta inmunitaria como se definió anteriormente, tal como un fragmento peptídico conjugado a una proteína portadora mediante un acoplamiento covalente, una construcción de polipéptido recombinante quimérico que comprende dicho fragmento peptídico en su secuencia de aminoácidos, y de manera específica incluye las células transfectadas con un cADN cuya secuencia comprende una porción que codifica dicho fragmento.

Para los fines de la presente descripción, un anticuerpo "humanizado" se refiere a un anticuerpo en el que la región estructural constante y variable de una o más inmunoglobulinas humanas está fusionada con la región de unión, p.ej. la CDR, de una inmunoglobulina animal. Tales anticuerpos humanizados están diseñados para mantener la especificidad de unión del anticuerpo no humano del cual derivan las regiones de unión, y para evitar una reacción inmunitaria hacia el anticuerpo no humano.

Un "anticuerpo quimérico" es una molécula de anticuerpo en la que (a) la región constante, o una porción de la misma, está alterada, sustituida o intercambiada de manera que el sitio de unión al antígeno (región variable) está unido a una región constante de una clase, función efectora y/o especie diferente o alterada, o una molécula completamente diferente que confiere propiedades nuevas al anticuerpo quimérico, p.ej., una enzima, toxina, hormona, factor de crecimiento, fármaco, etc.; o (b) la región variable, o una porción de la misma, está alterada, sustituida o intercambiada con una región variable que tiene una especificidad hacia el antígeno diferente o alterada.

Un anticuerpo "humano" es un anticuerpo obtenido de ratones transgénicos o de otros animales que se han "modificado" para producir anticuerpos humanos específicos en respuesta a una exposición antigénica (véase, p.ej., Green et al. (1994) Nature Genet 7:13; Lonberg et al. (1994) Nature 368:856; Taylor et al. (1994) Int Immun 6:579). También se puede construir un anticuerpo completamente humano mediante métodos de transfección genéticos o cromosómicos, así como mediante la tecnología de expresión en fagos, todos los cuales se conocen en la técnica (véase, p.ej., McCafferty et al. (1990) Nature 348:552-553). Los anticuerpos humanos se pueden generar también mediante células B activadas in vitro (véanse, p.ej., las pat. de EE.UU. nºs 5.567.610 y 5.229.275). Un anticuerpo humano se puede obtener también determinando la secuencia de un anticuerpo aislado a partir de un ser humano y expresando una secuencia nucleotídica que codifica dicho anticuerpo a partir de una célula hospedadora

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En un aspecto, los anticuerpos derivan de uno o más anticuerpos monoclonales ya existentes que reconocen 4Ig-B7-H3 o 4Ig-B7-H3R, p.ej. 5B14 o 7-517 (para este último véase, p.ej., Steinberger et al. (2004) J. Immunol. 172:2352-2359). Tales anticuerpos se pueden marcar directamente o indirectamente (es decir, usarlos con un anticuerpo secundario marcado) para el uso como anticuerpos diagnósticos para la etapa de tipificación descrita en la presente memoria para determinar el estado de 4Ig-B7-H3 de los pacientes. Además, los anticuerpos se pueden hacer adecuados para la administración a seres humanos y, opcionalmente, se pueden hacer tóxicos como se describe en la presente memoria para el uso como anticuerpos citotóxicos en los presentes métodos terapéuticos.

Los presentes anticuerpos diagnósticos o terapéuticos (p.ej. citotóxicos) pueden ser anticuerpos de tamaño completo

o fragmentos de anticuerpos o derivados. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen los fragmentos Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, y Fv; diacuerpos; moléculas Fv de cadena simple (scFv); polipéptidos de cadena simple que contienen solamente un dominio variable de la cadena ligera, o un fragmento del mismo que contiene las tres CDRs del dominio variable de la cadena ligera, sin un resto de la cadena pesada asociado; los polipéptidos de cadena simple que contienen solamente una región variable de la cadena pesada, o un fragmento de la misma que contiene las tres CDRs de la región variable de la cadena pesada, sin un resto de la cadena ligera asociado; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos. Tales fragmentos y derivados y métodos para prepararlos se conocen bien en la técnica. Por ejemplo, se puede usar pepsina para digerir un anticuerpo por debajo de las uniones disulfuro en la región de la bisagra para producir F(ab)'2, un dímero de Fab que es él mismo una cadena ligera unida a VH-CH1 mediante un enlace disulfuro. El F(ab)'2 se puede reducir en condiciones suaves para romper la unión disulfuro en la región de la bisagra, por lo que se convierte el dímero F(ab)'2 en un monómero Fab'. El monómero Fab' es esencialmente Fab con parte de la región de la bisagra (véase Fundamental Immunology (Paul ed., 3ª ed. 1993)). Aunque los diversos fragmentos de anticuerpos se definen en cuanto a la digestión de un anticuerpo intacto, un experto apreciará que tales fragmentos se pueden sintetizar de novo químicamente o mediante el uso de la metodología de ADN recombinante.

La preparación de anticuerpos monoclonales o policlonales se conoce bien en la técnica, y se puede usar cualquiera de un gran número de técnicas disponibles (véase, p.ej., Kohler y Milstein, Nature 256:495-497 (1975); Kozbor et al., Immunology Today 4: 72 (1983); Cole et al., págs. 77-96 en Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy (1985)). Las técnicas para la producción de anticuerpos de cadena simple (Pat. de EE.UU. nº 4.946.778) se pueden adaptar para producir anticuerpos hacia polipéptidos deseados. Además, se pueden usar ratones transgénicos, u otros organismos tales como otros mamíferos, para expresar anticuerpos humanizados, quiméricos, o modificados de forma similar. De manera alternativa, se puede usar la tecnología de expresión en fagos para identificar anticuerpos y fragmentos Fab heterodiméricos que se unen específicamente a antígenos seleccionados (véase, p.ej., McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990); Marks et al., Biotechnology 10:779-783 (1992)). En un aspecto, el método comprende seleccionar, de una biblioteca o un repertorio, un anticuerpo monoclonal o un fragmento o derivado del mismo que reacciona de manera cruzada con al menos un receptor de NK. Por ejemplo, el repertorio puede ser cualquier repertorio (recombinante) de anticuerpos o fragmentos de los mismos, opcionalmente expresado por cualquier estructura adecuada (p.ej., fago, bacterias, complejo sintético, etc.).

La etapa de inmunizar a un mamífero no humano con un antígeno se puede llevar a cabo de cualquier manera conocida en la técnica (véase, por ejemplo, E. Harlow y D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1988)). En general, el inmunógeno se suspende o se disuelve en un tampón, opcionalmente con un adyuvante, tal como adyuvante completo de Freund. Los expertos en la técnica conocen bien los métodos para determinar la cantidad de inmunógeno, los tipos de tampones y las cantidades de adyuvante, y los mismos no no son limitantes de ningún modo en la presente descripción.

De forma similar, también se conoce en la técnica la localización y la frecuencia de inmunización suficiente para estimular la producción de anticuerpos. En un protocolo de inmunización típico, se inyecta a los animales no humanos de manera intraperitoneal el antígeno en el día 1 y de nuevo alrededor de una semana más tarde. Esto va seguido de inyecciones de recuerdo del antígeno alrededor del día 20, opcionalmente con un adyuvante tal como adyuvante incompleto de Freund. Las inyecciones de recuerdo se llevan a cabo de manera intravenosa, y se pueden repetir durante varios días consecutivos. Esto va seguido de una inyección de refuerzo en el día 40, de manera intravenosa o intraperitoneal, en general sin adyuvante. Este protocolo da como resultado la producción de células B productoras de anticuerpos específicos del antígeno después de alrededor de 40 días. También se pueden utilizar otros protocolos, con tal de que den como resultado la producción de células B que expresan un anticuerpo dirigido al antígeno usado en la inmunización.

En otro aspecto, se aíslan los linfocitos de un mamífero no humano sin inmunizar, se cultivan in vitro, y después se exponen al inmunógeno en el cultivo celular. Los linfocitos se recogen después y se lleva a cabo la etapa de fusión descrita más adelante.

Para los anticuerpos monoclonales, que se prefieren para los fines de la presente descripción, la siguiente etapa es el aislamiento de células, p.ej., linfocitos, esplenocitos, o células B, a partir del mamífero no humano inmunizado y la fusión posterior de esos esplenocitos, o células B, o linfocitos, con una célula inmortalizada para formar un hibridoma que produce anticuerpos. Por lo tanto, la expresión "preparar anticuerpos de un animal inmunizado", tal como se usa en la presente memoria, incluye obtener células B/esplenocitos/linfocitos de un animal inmunizado y usar esas

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preferiblemente un 40%, se considera que es un anticuerpo que se une a sustancialmente el mismo epítopo o determinante que el anticuerpo de control. Preferiblemente, tal anticuerpo de ensayo reducirá la unión del anticuerpo de control al sustrato en al menos un 50%. Se apreciará que el orden de los anticuerpos de control y de ensayo se puede invertir, es decir, el anticuerpo de control se une primero a la superficie y el anticuerpo de ensayo se pone en contacto con la superficie posteriormente. Preferiblemente, el anticuerpo que tiene una afinidad superior por los antígenos del sustrato se une a la superficie que contiene el sustrato en primer lugar, ya que se esperará que la disminución de la unión observada para el segundo anticuerpo (suponiendo que los anticuerpos están reaccionando de manera cruzada) sea de mayor magnitud. Se proporcionan ejemplos adicionales de tales ensayos en los Ejemplos y en Saunal et al. (1995) J. Immunol. Meth 183: 33-41.

En un aspecto, los anticuerpos anti-4Ig-B7-H3 son capaces de interaccionar con múltiples proteínas de la familia B7, es decir, son capaces de interaccionar con 4Ig-B7-H3 y al menos otra proteína de la familia B7, en particular si se asegura que tales anticuerpos no muestran una reactividad cruzada excesiva con otras proteínas no relacionadas. De forma similar, los anticuerpos anti-4Ig-B7-H3R son capaces de interaccionar con múltiples receptores de proteínas de la familia B7, es decir, son capaces de interaccionar con 4Ig-B7-H3R y al menos otro receptor de una proteína de la familia B7.

Preferiblemente, los anticuerpos anti-4Ig-B7-H3 o anti-4Ig-B7-H3R no muestran una reactividad cruzada excesiva con otras proteínas no relacionadas. Preferiblemente, los anticuerpos monoclonales que reconocen un epítopo de 4Ig-B7-H3 o 4Ig-B7-H3R reaccionarán con un epítopo que está presente en un porcentaje sustancial de las células objetivo o NK, respectivamente, en especial en pacientes (p.ej., que tienen un trastorno proliferativo, tumor, trastorno inflamatorio, etc.), pero no reaccionarán de manera significativa con células B CD20+, o con otras células inmunitarias o no inmunitarias. Preferiblemente, los anticuerpos anti-4Ig-B7-H3 o anti-4Ig-B7-H3R no reaccionarán de manera significativa con otras proteínas de la familia B7 o con los receptores de las mismas, respectivamente. Otras proteínas de la familia B7 incluyen, por ejemplo, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), B7-H2 (ICOS-L), B7-H1 (PD-L1), B7-DC (PD-L2, B7-H4 (B7S1, B7x) y BT3). Los receptores para otras proteínas de la familia B7 incluyen, pero sin limitación, CD28, ICOS o CTLA-4, PD-1 y BTLA, principalmente expresados en las células T. En los aspectos preferidos, el anticuerpo tampoco será reactivo con monocitos, granulocitos, plaquetas, y glóbulos rojos. En los aspectos preferidos, los anticuerpos reconocerán solamente un único receptor para la proteína 4Ig-B7-H3, por lo que se limita tanto como sea posible el efecto de los anticuerpos terapéuticos (p.ej., citotóxicos) a las células en proliferación excesiva subyacentes al trastorno.

Una vez que se identifica un anticuerpo que reconoce de manera específica 4Ig-B7-H3 o 4Ig-B7-H3R, se puede ensayar en función de su capacidad de unirse a las células objetivo (p.ej. células en proliferación, células tumorales, células dendríticas) o células NK, respectivamente. Las células objetivo se pueden extraer de pacientes con trastornos proliferativos tales como neuroblastoma, melanoma o carcinoma, por ejemplo.

Un anticuerpo que reconoce de manera específica 4Ig-B7-H3 se puede validar en un inmunoensayo para ensayar su capacidad de unirse a las células objetivo extraídas de pacientes con un trastorno, por ejemplo un trastorno proliferativo. Por ejemplo, se lleva a cabo una biopsia de un tumor y las células se extraen de una diversidad de pacientes, p.ej. una biopsia con aguja o aspirado de médula ósea en el caso de sospecha de neuroblastoma. La capacidad de un anticuerpo dado de unirse a las células objetivo se determina después mediante el uso de métodos habituales muy conocidos para los expertos en la técnica. Los anticuerpos que se descubre que se unen a una porción sustancial de las células objetivo (p.ej., 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o más) de un porcentaje significativo de pacientes (p.ej., 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50% o más) son adecuados para el uso en la presente descripción, tanto para fines de diagnóstico durante la etapa de tipificación del estado de 4Ig-B7-H3 descrita en la presente memoria, como para el uso en los métodos terapéuticos descritos en la presente memoria, p.ej., para la derivatización para formar anticuerpos citotóxicos adecuados para seres humanos. Sin embargo, se apreciará que un anticuerpo que se une a una proporción menor de células objetivo todavía se puede usar de manera ventajosa, por ejemplo para eliminar o prevenir la posibilidad de escape de las células tumorales de la lisis por las células NK. Para determinar la unión de los anticuerpos a las células, los anticuerpos se pueden marcar directamente o indirectamente. Cuando se marcan indirectamente, generalmente se añade un anticuerpo secundario marcado. La unión de los anticuerpos a las células se puede detectar después mediante el uso, p.ej., de un análisis citofluorométrico (p.ej. FACScan). Véase, p.ej., Zambello et al. (2003) Blood 102:1797 o cualquier otro método habitual.

Anticuerpos potenciadores de NK

En el caso de anticuerpos potenciadores de NK, los anticuerpos anti-4Ig-B7-H3 y anti-4Ig-B7-H3R de esta descripción son capaces de neutralizar la inhibición mediada por 4Ig-B7-H3R de la citotoxicidad de las células NK. Estos anticuerpos son así anticuerpos "neutralizantes" o "inhibitorios", en el sentido de que bloquean, al menos parcialmente y de manera detectable, la ruta de señalización inhibitoria mediada por un 4Ig-B7-H3R cuando interacciona con la molécula 4Ig-B7-H3. La inhibición de la inhibición mediada por 4Ig-B7-H3 o 4Ig-B7-H3R de la citotoxicidad de las células NK se puede determinar mediante diversos ensayos o pruebas, tales como ensayos de unión o ensayos celulares.

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Una vez que se identifica un anticuerpo que se une a 4Ig-B7-H3 o 4Ig-B7-H3R, se puede ensayar en función de su capacidad de neutralizar el efecto inhibitorio de 4Ig-B7-H3R en las células NK intactas. En un aspecto específico, la actividad neutralizante se puede ilustrar mediante la capacidad de dicho anticuerpo de reconstituir la lisis por parte de clones NK positivos para 4Ig-B7-H3R de las células objetivo positivas para 4Ig-B7-H3. En otro aspecto específico, la actividad neutralizante del anticuerpo se define mediante la capacidad del anticuerpo de inhibir la unión de moléculas 4Ig-B7-H3 a 4Ig-B7-H3R. En un aspecto, se puede determinar la actividad inhibitoria de un anticuerpo de esta descripción en un ensayo de citotoxicidad basado en células, tal como se describe en la presente memoria.

En otra variante, se puede determinar la actividad inhibitoria de un anticuerpo de esta descripción en un ensayo de liberación de citocinas, en el que las células NK se incuban con el anticuerpo de ensayo y una línea de células objetivo que expresan 4Ig-B7-H3 reconocida por una molécula 4Ig-B7-H3R de la población NK, para estimular la producción de citocinas por las células NK (por ejemplo, la producción de IFN-γ y/o GM-CSF). En un protocolo ejemplar, se determina la producción de IFN-γ de PBMC mediante la tinción de la superficie celular e intracitoplásmica y el análisis mediante citometría de flujo después de alrededor de 4 días de cultivo. Brevemente, se puede añadir Brefeldina A (Sigma Aldrich) a una concentración final de alrededor de 5 µg/ml durante aproximadamente las últimas 4 horas de cultivo. Las células se pueden incubar después con mAb anti-CD3 y anti-CD56 antes de la permeabilización (IntraPrep™; Beckman Coulter) y la tinción con PE-anti-IFN-γ o PE-IgG1 (Pharmingen). Se puede medir la producción de GM-CSF e IFN-γ por parte de las células NK activadas policlonales en los sobrenadantes mediante el uso de ELISA (GM-CSF: DuoSet Elisa, R&D Systems, Minneapolis, MN; IFN-γ: equipo OptE1A, Pharmingen).

Los anticuerpos de esta descripción pueden neutralizar parcialmente o completamente la inhibición mediada por 4IgB7-H3R de la citotoxicidad de las células NK. La expresión "neutralizar la inhibición mediada por 4Ig-B7-H3R de la citotoxicidad de las células NK", tal como se usa en la presente memoria, significa la capacidad de incrementar en al menos alrededor de un 20%, preferiblemente en al menos alrededor de un 30%, al menos alrededor de un 40%, al menos alrededor de un 50% o más (p.ej., alrededor de un 25-100%) la lisis específica obtenida en la misma proporción célula efectora:célula objetivo con células NK o líneas de células NK que no se bloquean por sus 4Ig-B7-H3R, tal como se mide mediante un ensayo clásico de liberación de cromo de la citotoxicidad, en comparación con el nivel de lisis específica obtenido sin anticuerpo cuando una población de células NK que expresan un 4Ig-B7-H3R se pone en contacto con una célula objetivo que expresa la molécula 4Ig-B7-H3 afín (reconocida por el 4Ig-B7-H3R expresado en la célula NK). Por ejemplo, los anticuerpos preferidos de esta descripción son capaces de inducir la lisis de poblaciones de células objetivo (ya coincidan o sean compatibles con HLA o no, o sean autólogas) que expresan 4Ig-B7-H3R, es decir, poblaciones de células que no serían lisadas de manera eficaz por las células NK en ausencia de dicho anticuerpo. Por lo tanto, los anticuerpos de esta descripción se pueden definir también por facilitar la actividad de las células NK in vivo.

Tras la inmunización y la producción de anticuerpos en un vertebrado o célula, se pueden llevar a cabo etapas de selección particulares para aislar los anticuerpos tal como se reivindica. A este respecto, en un aspecto específico, la descripción también se refiere a métodos para producir tales anticuerpos, que comprenden:

a) inmunizar a un mamífero no humano con un inmunógeno que comprende un polipéptido 4Ig-B7-H3 o 4Ig-B7-H3R, o un fragmento del mismo, o una célula que expresa cualquiera de los anteriores;

b) preparar anticuerpos a partir de dicho animal inmunizado, en los que dichos anticuerpos se unen a un polipéptido 4Ig-B7-H3 o 4Ig-B7-H3R,

c) seleccionar los anticuerpos de (b) que son (i) capaces de neutralizar la inhibición de la citotoxicidad de las células NK en una población de células NK que expresan dicho polipéptido 4Ig-B7-H3R, o (ii) capaces de neutralizar la inhibición de la citotoxicidad de las células NK hacia las células objetivo que expresan 4Ig-B7-H3.

En un aspecto preferido, los anticuerpos preparados en la etapa (b) son anticuerpos monoclonales. Así, la expresión "preparar anticuerpos de dicho animal inmunizado", tal como se usa en la presente memoria, incluye obtener células B de un animal inmunizado y usar esas células B para producir un hibridoma que expresa anticuerpos, así como obtener anticuerpos directamente del suero de un animal inmunizado.

En otro aspecto preferido, los anticuerpos seleccionados en la etapa (c) provocan al menos alrededor de un 10 % de lisis específica mediada por células NK que expresan un 4Ig-B7-H3R, y preferiblemente al menos alrededor de un 40% de lisis específica, al menos alrededor de un 50% de lisis específica, o más preferiblemente al menos alrededor de un 70% de lisis específica (p.ej., alrededor de un 60-100% de lisis específica), tal como se mide en un ensayo de liberación de cromo habitual, hacia una célula objetivo que expresa una proteína 4Ig-B7-H3, en comparación con la lisis o la citotoxicidad obtenida a la misma proporción efector/objetivo con células NK que no están bloqueadas por tal proteína 4Ig-B7-H3.

Opcionalmente, el método también o de manera alternativa puede comprender además etapas adicionales para producir fragmentos del anticuerpo monoclonal o derivados del anticuerpo monoclonal o tales fragmentos, p.ej., como se describe en otra parte en la presente memoria.

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En un aspecto preferido, el animal no humano usado para producir anticuerpos según los métodos aplicables de la descripción es un mamífero, tal como un roedor (p.ej., ratón, rata, etc.), ganado bovino, porcino, caballo, conejo, cabra, oveja, etc. Además, el mamífero no humano se puede modificar genéticamente para producir anticuerpos "humanos", tal como el XenoMouse™ (Abgenix) o HuMAb-Mouse™ (Medarex). Tales métodos se describen adicionalmente en la presente memoria en la sección titulada "Producción de anticuerpos adecuados para el uso en seres humanos".

En otra variante, la descripción proporciona un método para obtener un anticuerpo que comprende:

a) seleccionar, de una biblioteca o repertorio, un anticuerpo monoclonal, un fragmento de un anticuerpo monoclonal, o un derivado de cualquiera de los mismos que se une de manera específica al polipéptido 4Ig-B7-H3 o 4Ig-B7-H3R, y

b) seleccionar un anticuerpo, fragmento, o derivado de (a) que es capaz de neutralizar la inhibición de la citotoxicidad de las células NK en una población de células NK que expresan 4Ig-B7-H3R.

El repertorio puede ser cualquier repertorio (recombinante) de anticuerpos o fragmentos de los mismos, opcionalmente expresados por cualquier estructura adecuada (p.ej., fago, bacterias, complejo sintético, etc.). La selección de anticuerpos inhibitorios se puede llevar a cabo como se describió anteriormente, y como se ilustra adicionalmente en los ejemplos.

Estos anticuerpos son así anticuerpos "neutralizantes" o "inhibitorios", en el sentido de que bloquean, al menos parcialmente y de manera detectable, la ruta de señalización inhibitoria mediada por un 4Ig-B7-H3R con interacciona con la molécula 4Ig-B7-H3. La inhibición de la inhibición mediada por 4Ig-B7-H3 o 4Ig-B7-H3R de la citotoxicidad de las células NK se puede determinar mediante diversos ensayos o pruebas, tales como ensayos de unión o ensayos celulares.

Se apreciará que dependiendo de la aplicación y del formato particular, los anticuerpos potenciadores de las células NK pueden ser eliminadores o no eliminadores hacia las células a las que se unen. Por ejemplo, un anticuerpo potenciador de células NK que se une a 4Ig-B7-H3 y que bloquea la interacción de la proteína 4Ig-B7-H3 con su receptor puede ser ventajosamente, pero no es necesario que sea, eliminador hacia las células que expresan 4Ig-B7-H3 a las que se une. Opcionalmente, los anticuerpos eliminadores comprenden un resto citotóxico. Opcionalmente, los anticuerpos eliminadores comprenden una región Fc, preferiblemente de la subclase IgG1 o IgG3. En otro aspecto, un anticuerpo eliminador se modifica para incrementar la unión a FcγR3a (CD16) en las células NK, y preferiblemente comprende una o más sustituciones de aminoácidos en la región Fc del anticuerpo, tal como se describe adicionalmente en la presente memoria.

Un anticuerpo potenciador de células NK que se une a 4Ig-B7-H3R en las células NK y que bloquea la interacción del receptor de 4Ig-B7-H3 con 4Ig-B7-H3 puede ser de manera ventajosa, pero no es necesario que sea, no eliminador. Tal anticuerpo no eliminador puede tener la ventaja de evitar la eliminación potencial de las células NK implicadas en la destrucción de las células objetivo. En otros aspectos, un anticuerpo no eliminador comprende o consiste en un fragmento de unión al antígeno, opcionalmente unido además a un resto (por ejemplo un polímero de PEG) capaz de incrementar la semivida en suero del fragmento. En otros aspectos, este anticuerpo comprende una región Fc de la subclase IgG2 o IgG4. En otro aspecto, este anticuerpo se modifica para disminuir la unión a FcγR3a (CD16) en las células NK, y preferiblemente comprende una o más sustituciones de aminoácidos en la región Fc del anticuerpo, tal como se describe adicionalmente en la presente memoria.

Anticuerpos que se unen a células objetivo que expresan 4Ig-B7-H3

En el caso de los anticuerpos que se unen a células que expresan 4Ig-B7-H3, los anticuerpos anti-4Ig-B7-H3 de esta descripción pueden ser útiles en métodos diagnósticos y/o terapéuticos. Cuando se usan como método diagnóstico, tales anticuerpos pueden ser útiles para identificar células en proliferación excesiva u otras células que expresan 4Ig-B7-H3, por ejemplo para diagnosticar un tumor o para identificar células que son resistentes a la lisis por las células NK. Tales anticuerpos diagnósticos se pueden usar in vivo o in vitro, es decir, se pueden administrar a un individuo o se pueden usar para detectar células en una muestra biológica o en un cultivo celular. Cuando se usan como método terapéutico, los anticuerpos que se unen a células que expresan 4Ig-B7-H3 pueden neutralizar el efecto protector de la proteína 4Ig-B7-H3 en la célula, seleccionando como objetivo las células para la destrucción por parte del sistema inmunitario (p.ej. por medio de la citotoxicidad dependiente de anticuerpos, también denominada ADCC), o destruyendo las células directamente poniéndolas en contacto con un agente citotóxico tal como un radioisótopo, toxina, o fármaco.

Se apreciará que dependiendo de la aplicación y formato particular, los anticuerpos que se unen a células que expresan 4Ig-B7-H3 (p.ej. preferiblemente anticuerpos anti-4IG-B7-H3) pueden bloquear, pero no necesariamente, las interacciones entre la proteína 4Ig-B7-H3 y 4Ig-B7-H3R, y además no es necesario que neutralicen el efecto protector de la proteína 4Ig-B7-H3 hacia la célula que expresa 4Ig-B7-H3. En particular, tal mecanismo de bloqueo o neutralización puede no ser necesario cuando los anticuerpos anti-4IG-B7-H3 siguen siendo capaces de seleccionar

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como objetivo las células para la destrucción por parte del sistema inmunitario (p.ej. por medio de la citotoxicidad dependiente de anticuerpos, también denominada ADCC), o cuando los anticuerpos anti-4IG-B7-H3 son capaces de destruir las células directamente poniéndolas en contacto con un agente citotóxico tal como un radioisótopo, toxina,

o fármaco. No obstante, en los aspectos preferidos, un anticuerpo es capaz de (a) bloquear las interacciones entre la proteína 4Ig-B7-H3 y 4Ig-B7-H3R, y (b) mediar en la eliminación de las células objetivo, y esta última etapa de eliminación comprende en general seleccionar como objetivo las células para la destrucción por parte del sistema inmunitario (p.ej. por medio de la citotoxicidad dependiente de anticuerpos, también denominada ADCC), o poniéndolas en contacto con un agente citotóxico. Opcionalmente, los anticuerpos eliminadores comprenden un resto citotóxico. Opcionalmente, los anticuerpos eliminadores comprenden una región Fc, preferiblemente de la subclase IgG1 o IgG3. En otro aspecto, este anticuerpo se modifica para incrementar la unión a FcγR3a (CD16) en las células NK, y preferiblemente comprende una o más sustituciones de aminoácidos en la región Fc del anticuerpo, tal como se describe adicionalmente en la presente memoria.

También se apreciará que dependiendo de la aplicación y formato particular, los anticuerpos que se unen a células que expresan 4Ig-B7-H3 (p.ej. preferiblemente anticuerpos anti-4IG-B7-H3) pueden ser eliminadores o no eliminadores hacia las células que expresan 4Ig-B7-H3. Por ejemplo, un anticuerpo que neutraliza el efecto protector de la proteína 4Ig-B7-H3 hacia la célula en proliferación bloqueando la interacción de la proteína 4Ig-B7-H3 con su receptor no necesita ser eliminador hacia las células que expresan 4Ig-B7-H3 a las que se une. En los aspectos preferidos, este anticuerpo comprende o consiste en un fragmento de unión al antígeno, opcionalmente unido además a un resto capaz de incrementar la semivida en suero del fragmento. En otros aspectos, este anticuerpo comprende una región Fc de la subclase IgG2 o IgG4. En otro aspecto, este anticuerpo se modifica para disminuir la unión a FcγR3a (CD16) en las células NK, y preferiblemente comprende una o más sustituciones de aminoácidos en la región Fc del anticuerpo, tal como se describe adicionalmente en la presente memoria.

Producción de anticuerpos adecuados para el uso en seres humanos

Una vez que se producen anticuerpos monoclonales, en general en animales no humanos, que se pueden unir de manera específica a 4Ig-B7-H3 o 4Ig-B7-H3R, los anticuerpos se modificarán en general para hacer que sean adecuados para el uso terapéutico en seres humanos. Por ejemplo, si no son anticuerpos humanos, se pueden humanizar, se pueden hacer quiméricos, o se pueden seleccionar de una biblioteca de anticuerpos humanos mediante el uso de métodos muy conocidos en la técnica. Tales anticuerpos adecuados para seres humanos se pueden usar directamente en los presentes métodos terapéuticos, o se pueden derivatizar adicionalmente hasta anticuerpos citotóxicos, tal como se describe más adelante, para el uso en los métodos.

En un aspecto preferido, el ADN de un hibridoma que produce un anticuerpo de esta descripción, p.ej. un anticuerpo similar a 5B14, se puede modificar antes de la inserción en un vector de expresión, por ejemplo, sustituyendo la secuencia codificante por dominios constantes de las cadenas ligeras y pesadas humanas en lugar de las secuencias no humanas homólogas (p.ej., Morrison et al. (1984) PNAS 81:6851), o uniendo de manera covalente a la secuencia codificante de la inmunoglobulina todo o parte de la secuencia codificante de un polipéptido que no es una inmunoglobulina. De esa manera, se preparan anticuerpos "quiméricos" o "híbridos" que tienen la especificidad de unión del anticuerpo original. En general, tales polipéptidos que no son inmunoglobulinas se sustituyen por los dominios constantes de un anticuerpo de la descripción.

En un aspecto especialmente preferido, el anticuerpo de esta descripción está humanizado. Las formas "humanizadas" de los anticuerpos según esta descripción son inmunoglobulinas quiméricas específicas, cadenas de inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')2, u otras subsecuencias de unión a antígenos de los anticuerpos) que contienen una secuencia mínima derivada de la inmunoglobulina murina o de otra que no es humana. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo del receptor) en las que los residuos de una región determinante de la complementariedad (CDR) del receptor se sustituyen por residuos de una CDR del anticuerpo original (anticuerpo donante) a la vez que se mantiene la especificidad deseada, afinidad, y capacidad del anticuerpo original. En algunos casos, los residuos estructurales de Fv de la inmunoglobulina humana se pueden sustituir por los residuos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se hallan ni en el anticuerpo del receptor ni en las secuencias de las CDR o estructurales importadas. Estas modificaciones se hacen para perfeccionar y optimizar adicionalmente el comportamiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todo de al menos uno, y en general dos, dominios variables, en el que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las del anticuerpo original y todas o sustancialmente todas las regiones FR son las de una secuencia consenso de inmunoglobulina humana. Para detalles adicionales, véase, Jones et al. (1986) Nature 321: 522; Reichmann et al. (1988) Nature 332: 323; Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534 (1988); Presta (1992) Curr. Op. Struct. Biol. 2:593.

La elección de dominios variables humanos, tanto ligeros como pesados, a usar en la producción de los anticuerpos humanizados es muy importante para reducir la antigenicidad. Según el método denominado "Best-Fit", la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de esta descripción se criba con respecto a la biblioteca completa de secuencias de dominios variables humanos conocidos. La secuencia humana que es la más cercana a la de ratón se acepta entonces como la región estructural (FR) humana para el anticuerpo humanizado (Sims et al. (1993) J.

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tóxicos. En tales casos, el anticuerpo monoespecífico marcado se puede inyectar en el paciente, en el que después se une y destruye las células que expresan el antígeno objetivo, y el anticuerpo sin unir se elimina simplemente del organismo. También se pueden usar estrategias indirectas, tales como el "Sistema de Aumento de la Afinidad" (AES) (véase, p.ej., la Pat. de EE.UU. nº 5.256.395; Barbet et al. (1999) Cancer Biother Radiopharm 14:153-166). Esta aproximación particular implica el uso de un hapteno radiomarcado y un anticuerpo que reconoce tanto el receptor de las células NK como el hapteno radiactivo. En este caso, el anticuerpo se inyecta primero en el paciente y se deja que se una a las células objetivo, y después, una vez que se deja que el anticuerpo sin unir se elimine del torrente sanguíneo, se administra el hapteno radiomarcado. El hapteno se une al complejo anticuerpo-antígeno en las células que expresan 4Ig-B7-H3 en proliferación excesiva, por lo que las destruye, y el hapteno sin unir se elimina el organismo.

Se puede usar cualquier tipo de resto con un efecto citotóxico o citoinhibitorio junto con los presentes anticuerpos para inhibir o destruir células que expresan 4Ig-B7-H3 específicas, que incluyen radioisótopos, proteínas tóxicas, moléculas pequeñas tóxicas, tales como fármacos, toxinas, inmunomoduladores, hormonas, antagonistas de hormonas, enzimas, oligonucleótidos, inhibidores de enzimas, radionúclidos terapéuticos, inhibidores de la angiogénesis, fármacos quimioterápicos, alcaloides de la vinca, antraciclinas, epidofilotoxinas, taxanos, antimetabolitos, agentes alquilantes, antibióticos, inhibidores de COX-2, SN-38, antimitóticos, agentes antiangiogénicos y apoptóticos, en particular doxorrubicina, metotrexato, taxol, CPT-11, camptotecanos, mostazas nitrogenadas, gemcitabina, alquil sulfonatos, nitrosoureas, triazenos, análogos de ácido fólico, análogos de pirimidina, análogos de purina, complejos de coordinación de platino, exotoxina de Pseudomonas, ricina, abrina, 5fluorouridina, ribonucleasa (RNasa), DNasa I, enterotoxina-A estafilocócica, proteína antiviral de Phytolacca, gelonina, toxina diftérica, exotoxina de Pseudomonas, y endotoxina de Pseudomonas y otras (véase, p.ej., Remington's Pharmaceutical Sciences, 19ª Ed. (Mack Publishing Co. 1995); Goodman y Gilman, The Pharmacological Basis of Therapeutics (McGraw Hill, 2001); Pastan et al. (1986) Cell 47:641; Goldenberg (1994) Cancer Journal for Clinicians 44:43; Pat. de EE.UU. nº 6.077.499). Se apreciará que una toxina puede ser de origen animal, vegetal, fúngico, o microbiano, o se puede crear de novo mediante síntesis química.

Las toxinas u otros compuestos se pueden unir al anticuerpo directamente o indirectamente, mediante el uso de cualquiera de un gran número de métodos disponibles. Por ejemplo, se puede unir un agente en la región de la bisagra del componente de anticuerpo reducido por medio de la formación de enlaces disulfuro, mediante el uso de entrecruzadores tales como 3-(2-piridilditio)propionato de N-succinilo (SPDP), o por medio de un resto de carbohidrato en la región Fc del anticuerpo (véase, p.ej., Yu et al. (1994) Int. J. Cancer 56: 244; Wong, Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking (CRC Press 1991); Upeslacis et al., "Modification of Antibodies by Chemical Methods", en Monoclonal antibodies: principles and applications, Birch et al. (eds.), páginas 187-230 (Wiley-Liss, Inc. 1995); Price, "Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies", in Monoclonal antibodies: Production, engineering and clinical application, Ritter et al. (eds.), páginas 60-84 (Cambridge University Press 1995), Cattel et al. (1989) Chemistry today 7:51-58, Delprino et al. (1993) J. Pharm. Sci 82:699-704; Arpicco et al. (1997) Bioconjugate Chemistry 8:3; Reisfeld et al. (1989) Antibody, Immunicon. Radiopharm. 2:217).

En un aspecto preferido, el anticuerpo se derivatizará con un isótopo radiactivo, tal como I-131. Se puede usar cualquiera de varios isótopos radiactivos adecuados, que incluyen, pero sin limitación, Indio-111, Lutecio-171, Bismuto-212, Bismuto-213, Astato-211, Cobre-62, Cobre-64, Cobre-67, Itrio-90, Yodo-125, Yodo-131, Fósforo-32, Fósforo-33, Escandio-47, Plata-111, Galio-67, Praseodimio-142, Samario-153, Terbio-161, Disprosio-166, Holmio166, Renio-186, Renio-188, Renio-189, Plomo-212, Radio-223, Actinio-225, Hierro-59, Selenio-75, Arsénico-77, Estroncio-89, Molibdeno-99, Rodio-105, Paladio-109, Praseodimio-143, Prometio-149, Erbio-169, Iridio-194, Oro198, Oro-199, y Plomo-211. En general, el radionúclido tiene preferiblemente una energía de desintegración en el intervalo de 20 a 6.000 keV, preferiblemente en el intervalo de 60 a 200 keV para un emisor Auger, 100-2.500 keV para un emisor beta, y 4.000-6.000 keV para un emisor alfa. También se prefieren los radionúclidos que se desintegran sustancialmente con generación de partículas alfa.

Al seleccionar un resto citotóxico para la inclusión en los presentes métodos, es deseable asegurarse de que el resto no ejercerá efectos secundarios in vivo significativos contra los tejidos normales que mantienen la vida, tales como uno o más tejidos seleccionados de corazón, riñón, cerebro, hígado, médula ósea, colon, mama, próstata, tiroides, vesícula biliar, pulmón, glándulas suprarrenales, músculo, fibras nerviosas, páncreas, piel, u otros órganos o tejidos que mantienen la vida en el organismo humano. La expresión "efectos secundarios significativos", tal como se usa en la presente memoria, se refiere a un anticuerpo, ligando o conjugado de anticuerpo, que, cuando se administra in vivo, producirá únicamente efectos secundarios insignificantes o clínicamente manejables, tales como los que aparecen normalmente durante la quimioterapia.

Una vez que se obtienen anticuerpos que se sabe que se unen de manera específica al antígeno deseado (p.ej., preferiblemente 4Ig-B7-H3), y que se han hecho adecuados para el uso en seres humanos, y opcionalmente derivatizados para incluir un resto tóxico, se determinará en general su capacidad de interaccionar con, afectar a la actividad de, y/o destruir las células objetivo. En general, los ensayos descritos anteriormente para detectar la unión del anticuerpo a 4Ig-B7-H3 y 4Ig-B7-H3R, que incluye ensayos basados en competición, ELISAs, radioinmunoensayos, transferencia de Western, ensayos basados en BIACORE, y ensayos de citometría de flujo, se

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Especificidad del Ab

DCI Nombre comercial Indicaciones Típicas

Anti-CD20

rituximab MabThera®, Rituxan® LNH B

Anti-CD20

Zevalin LNH

Anti-CD20

Bexocar LNH

Anti-CD52

alemtuzumab CAMPATH-1H® LLC, aloinjerto

Anti-CD33

SMART-M195 LMA

Anti-CD33

Zamyl™ Leucemia mieloide aguda

Anti-antígeno HLA-DR

SMART-ID10 LNH

Anti-HLA-DR

Remitogen™ LNH B

Anti-CD22

epratuzumab LymphoCide™ LNH B

Anti-HER2

MDX-210 Cáncer de próstata y otros cánceres

Anti-erbB2 (HER-2/neu)

trastuzumab Herceptin®, Cáncer de mama metastásico

Anti-CA125

OvaRex Cáncer de ovario

Anti-MUC1

TriAb Cáncer de mama metastásico

Anti-MUC1

BravaRex Cánceres metastásicos

Antígeno anti-PEM

Theragyn, Therex Cáncer ovárico, cáncer de mama

Anti-CD44

bivatuzumab Cáncer de cabeza y cuello

Anti-gp72

MAb, 105AD7 idiotípico cáncer colorrectal

Anti-EpCAM

Anti-EpCAM; MT201 IS-IL2 cáncer

Anti-VEGF

MAb-VEGF NSCLC metastásico, cáncer colorrectal

Anti-CD18

AMD Fab degeneración macular relacionada con la edad

Anti-CD18

Anti-CD 18 Infarto de miocardio

Anti-receptor de VEGF

IMC-1cl I cáncer colorrectal

Anti-nuC242

nuC242-DMI Cáncer colorrectal, gástrico, y pancreático

Anti-EGFR

MAb425 cáncer

Anti-EGFR

ABX-EGF cáncer

Anti-EGFR (HER-1, erbB1)

cetuximab Cánceres ORL y colorrectal

Anti-MUC-1

Therex® Cánceres de mama y epiteliales

Anti-CEA

CEAVac cáncer colorrectal

Anti-CEA

labetuzumab CEA-Cide™ Tumores sólidos

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Especificidad del Ab

DCI Nombre comercial Indicaciones Típicas

Anti-αVβ3

Vitaxin Leiomiosarcoma, cáncer colorrectal y otros (antiangiogénico)

Anti-KDR (VEGFR2)

Cánceres (anti-angiogénico)

Anti-proteína de fusión VRS

palivizumab Synagis® Enfermedades virales

Idem

Numax™

Idem

CMV

sevirumab Protovir Infección por CMV

HBs

tuvirumab Ostavir™ Hepatitis B

Anti-CD25

basiliximab Simulect® Prevención/tratamiento del rechazo de aloinjertos

Anti-CD25

daclizumab Zénapax® Prevención/tratamiento del rechazo de aloinjertos

anti-TNF-α

infliximab Remicade™ Enfermedad de Crohn, artritis reumatoide

anti-CD80

IDEC-114 psoriasis

anti-IgE

E-26 Asma y rinitis alérgica

anti-IgE

omalizumab XolairTM Asma

anti-IgE

Rhu-mAb E25 Alergia/asma

anti-integrina αL (CD11a, LFA-1)

efalizumab Xanelim™ psoriasis

Anti-beta 2 integrina

LDP-01 Ictus, rechazo de aloinjerto

anti-integrina αL (CD11a, LFA-1)

anti-CD11a psoriasis

anti-CD4

keliximab siplizumab MEDI-507 GVHD, psoriasis

anti-CD4

OKT4A Rechazo de aloinjerto

Anti-CD3

OKT3 Rechazo de aloinjerto

Anti-CD3

SMART-aCD3 Enfermedad autoinmunitaria, rechazo de aloinjerto, psoriasis

Anti-CD64

anemia

anti-CD147

GvHD

anti-integrina α4 (α4β1α4β7)

natalizumab Antegren® Esclerosis Múltiple, Crohn

Anti-integrina β7

Crohn, colitis ulcerosa

Alpha 4 beta 7

LDP-02 Colitis ulcerosa

Anti-HLA-DR10 beta

Oncolym LNH

Anti-CD3

Nuvion Neoplasias malignas de células T

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Especificidad del Ab

DCI Nombre comercial Indicaciones Típicas

Anti-gangliósido GD2

Trigem Melanoma metastásico y cáncer de pulmón de células pequeñas

Anti-antígeno SK-1

Carcinoma colorrectal y pancreático

anti-CD4*

clenoliximab

Anti-IL-8

ABX-IL8 psoriasis

Anti-VLA-4

Antegren EM

Anti-CD40L

Antova LES, rechazo de aloinjerto

Anti-CD40L

IDEC-131 EM, LES

Anti-E-selectina

CDP850 psoriasis

Anti-CD11/CD18

Hu23F2G EM, ictus

Anti-ICAM-3

ICM3 psoriasis

Anti-CBL

ABX-CBL GvHD

anti-CD147

Anti-CD23

IDEC-152 Asma, alergias

Anti-CD25

Simulect Rechazo de aloinjerto

Anti-T1-ACY

ACY-110 Cáncer de mama

Anti-TTS

TTS-CD2 Cáncer pancreático, renal

Anti-TAG72

AR54 Cáncer de mama, de ovario, de pulmón

Anti-CA19.9

GivaRex Colorrectal, pancreático, gástrico

Anti-PSA

ProstaRex Cáncer de próstata

Anti-HMFG1

R1550 Cáncer de mama, gástrico

pemtumomab

Theragyn Cáncer gástrico, ovárico

Anti-hCG

CTP-16, CTP-21 Múltiples cánceres

Anti-colágeno de Tipos I-V

HU177; HUIV26; XL313 Múltiples cánceres

Anti-CD46

Crucell/J&J Múltiples cánceres

Anti-17A-1

Edrecolomab Panorex Cáncer colorrectal

Anti-HM1.24

AHM Mieloma múltiple

Anti-CD38

Anti-CD38

Mieloma múltiple

Anti-Receptor de IL15

HuMax-lymphoma Linfoma

Anti-IL6

B-E8 Linfoma

Anti-TRAIL-R1

TRM-1 Múltiples cánceres

Anti-VEGF2

Múltiples cánceres

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Especificidad del Ab

DCI Nombre comercial Indicaciones Típicas

Anti-BlyS

Lymphostat Múltiples cánceres

Anti-SCLC, CEA y DTPA

Pentacea Cáncer de pulmón

Anti-CD52

CAMPATH Leucemia, Linfoma

Anti-antígeno Lewis Y

IGN311 Cánceres epiteliales

Anti-VE cadherina

E4G10 Múltiples cánceres

Anti-CD56

BB10901, huN901DC1 Cáncer colorrectal, de pulmón

Anti-mertansina/mucina

Cantuzumab Cáncer Colorrectal, de pulmón, pancreático

Anti-AFP

AFP-cide Cáncer de hígado

Anti-CSAp

Mu-9 cáncer colorrectal

Anti-CD30

MDX-060 Melanoma, Enfermedad de Hodgkin

Anti-PSMA

MDX-070 Cáncer de próstata

Anti-CD15

MDX-11 Leucemia

Anti-TAG72

MDX-020 Cáncer colorrectal

Anti-CD19,CD3 bispecífico

MT103 Linfoma

Anti-antígeno de mesotelina

SS1-PE38 Cáncer cerebral y ovárico, mesotelioma

Anti-ADN e histonas

Cotara Cánceres colorrectal, pancreático, sarcoma, cerebral y otros

Anti-integrina a5B1

Anti-a5 B1 Múltiples cánceres

Anti-p97

SGN17/19 Melanoma

Anti-CD5

Genimune Leucemia, Linfoma

En ciertos ejemplos preferidos, el método de la descripción comprende una o varias inyecciones de dos o más compuestos que potencian la actividad de las células NK, preferiblemente bloqueando un receptor inhibitorio o estimulando un receptor activante de una célula NK. Así, estos dos o más compuestos se pueden usar en 5 combinación. Un primer de dichos dos o más compuestos puede ser un compuesto de la descripción que inhibe la actividad de 4Ig-B7-H3R o que bloquea una interacción de 4Ig-B7-H3 y 4Ig-B7-H3R. Un segundo compuesto puede ser cualquiera de los compuestos capaces de bloquear un receptor inhibitorio o de estimular un receptor activante de una célula NK. Esto puede servir para provocar un aumento aún mayor de la ADCC y de la eficacia de los anticuerpos terapéuticos adicionales tal como se discute más adelante, y/o puede servir para reducir la dosis de un 10 compuesto particular que bloquea un receptor inhibitorio o que estimula un receptor activante de una célula NK. Por ejemplo, se sabe que los compuestos tales como IL-2 son tóxicos a dosis incrementadas. La descripción, por tanto, proporciona preferiblemente un método de tratamiento de una enfermedad en un sujeto que lo necesita que comprende: a) administrar a dicho sujeto al menos dos compuestos, preferiblemente en el que uno o ambos compuestos son un anticuerpo o un fragmento del mismo, que bloquea un receptor inhibitorio o que estimula un

15 receptor activante de una célula NK; y b) administrar a dicho sujeto un anticuerpo terapéutico. Por ejemplo, un régimen preferido es uno en el que dichos dos compuestos son (i) un anticuerpo que inhibe la actividad de 4Ig-B7-H3R o que bloquea una interacción de 4Ig-B7-H3 y 4Ig-B7-H3R, y (ii) un compuesto seleccionado del grupo que consiste en: un anticuerpo que estimula un receptor de NKp30, NKp44, NKp46 o NKG2D, un receptor KIR activante, un anticuerpo que bloquea un receptor KIR inhibitorio o receptor NKG2A, IL-2, IL-12, IL-15, IL-18 e IL-21.

20 Se describen aspectos y ventajas adicionales de esta descripción en la siguiente sección experimental, que se debería considerar ilustrativa pero no limitante del alcance de esta solicitud.

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Claims (1)

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