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ES2532634T5 - Procedimientos y medios para el salto eficiente del exón 45 en el pre-ARNm de la distrofia muscular de Duchenne - Google Patents

Procedimientos y medios para el salto eficiente del exón 45 en el pre-ARNm de la distrofia muscular de Duchenne Download PDF

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ES2532634T5
ES2532634T5 ES09788160.1T ES09788160T ES2532634T5 ES 2532634 T5 ES2532634 T5 ES 2532634T5 ES 09788160 T ES09788160 T ES 09788160T ES 2532634 T5 ES2532634 T5 ES 2532634T5
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antisense oligonucleotide
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antisense
cell
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Gerardus Johannes Platenburg
Judith Christina Theodora Van Deutekom
Annemieke Aartsma-Rus
Garrit-Jan Boudewijn Van Ommen
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Leids Universitair Medisch Centrum LUMC
Biomarin Technologies BV
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Description

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de azúcar formando de este modo un resto de azúcar bicíclico. Un LNA preferido comprende ácido nucleico provisto de puentes de 2'-O,4'-C-etileno (Morita et al. 2001. Nucleic Acid Res Suplemento N.º: 1: 241-242). Estas sustituciones vuelven al análogo o equivalente de nucleótidos resistente a ARNasa H y resistente a nucleasas e incrementan la afinidad por el ARN objetivo.
Se entiende por una persona experta que no es necesario para todas las posiciones en un oligonucleótido antisentido modificarse uniformemente. Además, más de uno de los análogos o equivalentes mencionados anteriormente se puede incorporar en un oligonucleótido antisentido individual o incluso en una posición individual en un oligonucleótido antisentido. En ciertas realizaciones, un oligonucleótido antisentido de la invención tiene al menos dos tipos diferentes de análogos o equivalentes.
Un oligonucleótido antisentido preferido de acuerdo con la invención comprende un oligonucleótido antisentido 2'-O-alquilfosforotioato, tal como ribosa 2'-O-metil modificada (ARN), ribosa 2'-O-etil modificada, ribosa 2'-O-propil modificada, y/o derivados sustituidos de estas modificaciones tales como derivados halogenados.
Un oligonucleótido antisentido más preferido de acuerdo con la invención comprende una ribosa 2'-O-metil-fosforotioato.
Un equivalente funcional de un oligonucleótido antisentido de la invención se puede definir como un oligonucleótido según se define en el presente documento en el que una actividad de dicho equivalente funcional se mantiene al menos en algún grado. Preferentemente, una actividad de dicho equivalente funcional es inducir salto del exón 45 y proporcionar una proteína distrofina funcional. Dicha actividad de dicho equivalente funcional se evalúa preferentemente por lo tanto por detección de salto del exón 45 y cuantificando la cantidad de una proteína distrofina funcional. Una proteína de distrofina funcional se define preferentemente en el presente documento como que es una distrofina capaz de unir actina y miembros del complejo proteico DGC. La valoración de dicha actividad de un oligonucleótido se hace preferentemente por RT-PCR o por análisis de inmunofluorescencia o de prueba de bandas de Western. Dicha actividad se mantiene preferentemente al menos en algún grado cuando ella representa al menos el 50 %, o al menos el 60 %, o al menos el 70 % o al menos el 80 % o al menos el 90 % o al menos el 95 % o más de la actividad correspondiente de dicho oligonucleótido del que deriva el equivalente funcional.
Se entenderá también por una persona experta que oligonucleótidos antisentido distintos se pueden combinar para el salto de manera eficaz del exón 45 del pre-ARNm de DMD humano. En una realización preferida, una combinación de al menos dos oligonucleótidos antisentido se usa en un procedimiento de la divulgación, tal como dos oligonucleótidos antisentido distintos, tres oligonucleótidos antisentido distintos, cuatro oligonucleótidos antisentido distintos, o cinco oligonucleótidos antisentido distintos o incluso más. También está abarcado por la presente divulgación combinar varios oligonucleótidos o moléculas como se representan en la tabla 1 salvo SEQ ID NO: 68.
Un oligonucleótido antisentido puede unirse a un resto que potencia la captación del oligonucleótido antisentido en células, preferentemente células miogénicas o células musculares. Ejemplos de tales restos son colesteroles, carbohidratos, vitaminas, biotina, lípidos, fosfolípidos, péptidos de penetración celular que incluyen pero no están limitados a antennapedia, TAT, transportano y aminoácidos cargados positivamente tales como oligoarginina, poliarginina, oligolisina o polilisina, dominios de unión a antígenos tales como proporcionados por un anticuerpo, un fragmento Fab de un anticuerpo, o un dominio de unión a antígenos de cadena individual tal como un dominio de unión a antígenos de cadena individual de camélidos.
Un oligonucleótido antisentido preferido comprende un PMO unido a péptido.
Un oligonucleótido antisentido preferido que comprende uno o más análogos o equivalentes de nucleótidos modula ayustamiento en una o más células musculares, incluyendo células musculares cardiacas, tras administración sistémica. A este respecto, la administración sistémica de un oligonucleótido antisentido que comprende un análogo o equivalente nucleotídico específico podría resultar en marcar como objetivo un subconjunto de células musculares, mientras que un oligonucleótido antisentido que comprende un análogo nucleotídico distinto da como resultado el marcado como objetivo de un subgrupo diferente de células musculares. Por lo tanto, en una realización se prefiere usar una combinación de oligonucleótidos antisentido que comprende diferentes análogos o equivalentes de nucleótidos para modular el salto de exón 45 del pre-ARNm de DMD humano.
En la divulgación, una célula puede proverse con una molécula capaz de interferir con secuencias esenciales que dan como resultado el salto altamente eficiente de exón 45 del pre-ARNm de DMD humano por expresión oligonucleotídica antisentido derivada de plásmidos o por expresión vírica proporcionada por un vector basado en virus. Un vector basado en virus tal comprende un casete de expresión que dirige la expresión de un oligonucleótido antisentido según se define en el presente documento. Vectores basados en virus preferidos incluyen vectores basados en adenovirus o vectores basados en virus adenoasociados. La expresión se dirige preferentemente por un promotor de polimerasa III, tal como un promotor de ARN U1, un promotor de ARN U6, o un promotor de ARN U7. Una célula muscular o miogénica se puede proporcionar con un plásmido para expresión oligonucleotídica antisentido proporcionando el plásmido en una solución acuosa. Alternativamente, se puede proporcionar un plásmido por transfección usando agentes de transfección tales como, por ejemplo, LipofectAMINE™ 2000 (Invitrogen) o polietilenimida (PEI; ExGen500 (MBI Fermentas)), o derivados de los mismos.
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Un sistema de expresión de oligonucleótidos antisentido preferido es un vector basado en virus asociados a adenovirus (AAV). Se han desarrollado vectores basados en AAV de cadena individual y de cadena doble que se pueden usar para expresión prolongada de secuencias nucleotídicas antisentido pequeñas para el salto altamente eficiente del exón 45 del pre-ARNm de DMD.
Un vector basado en AAV preferido comprende un casete de expresión que está dirigido por un promotor de la polimerasa III (Pol III). Un promotor Pol III preferido es, por ejemplo, un promotor de ARN U1, un promotor de ARN U6,
o un promotor de ARN U7.
La invención por lo tanto proporciona también un vector basado en virus, que comprende un casete de expresión dirigido por promotor Pol III para expresión de una o más secuencias antisentido de la invención para inducir el salto del exon 45 del pre-ARNm de DMD humano.
Composición farmacéutica
Si se requiere, un oligonucleótido antisentido de la invención o un vector que expresa un oligonucleótido antisentido de la invención se puede incorporar en una mezcla o composición farmacéuticamente activa añadiendo un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Por lo tanto, en un aspecto adicional, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un oligonucleótido antisentido de acuerdo con la invención, y/o un vector basado en virus que expresa las secuencia(s) antisentido de acuerdo con la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Una composición farmacéutica preferida comprende un oligonucleótido antisentido según se define en el presente documento y/o un vector según se define en el presente documento y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable, combinado opcionalmente con un oligonucleótido antisentido y/o un vector que es capaz de modular el salto del exón 7, 44, 46, 51, 53, 59, 67 del pre-ARNm de DMD.
Los excipientes preferidos incluyen excipientes capaces de formar complejos, vesículas y/o liposomas que administran una molécula según se define en el presente documento, preferentemente un oligonucleótido que forma un complejo o atrapado en una vesícula o liposoma por una membrana celular. Se conocen en la técnica muchos de estos excipientes. Los excipientes adecuados comprenden polietilenimina y derivados, o polímeros catiónicos similares, incluyendo copolímeros de polipropilenimina o polietilenimina (PEC) y derivados, anfífilos sintéticos, lipofectinaTM, DOTAP y/o proteínas de cápsides víricas que son capaces de autoensamblaje en partículas que pueden administrar tal oligonucleótido antisentido según se define en el presente documento a una célula, preferentemente a una célula muscular. Se ha demostrado que tales excipientes administran de forma eficaz ácidos nucleicos (oligonucleótidos tales como antisentido) a una amplia diversidad de células cultivadas, incluyendo células musculares. Los inventores presentes han obtenido resultados muy buenos usando polietilenimina (PEI, ExGen500, MBI Fermentas) como se muestra en el ejemplo. Su potencial de transfección alto se combina con una toxicidad de baja a moderada exenta en términos de supervivencia celular general. La facilidad de modificación estructural se puede usar para permitir modificaciones adicionales y el análisis de sus características de transferencia de ácidos nucleicos (in vivo) adicionales y de su toxicidad adicional.
La lipofectina representa un ejemplo de agente de transfección liposomal. Consiste en dos componentes lipídicos, un lípido catiónico cloruro de N-[1-(2,3 dioleoiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamonio (DOTMA) (cp. DOTAP que es la sal metilsulfato) y un lípido neutro dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE). El componente neutro media la liberación intracelular. Otro grupo de sistemas de administración son nanopartículas poliméricas.
Policationes tales como dietilaminoetilaminoetil (DEAE)-dextrano, que se conoce bien como reactivo de transfección de ADN puede combinarse con cianoacrilato de butilo (PBCA) y cianoacrilato de hexilo (PHCA) para formular nanopartículas catiónicas que pueden administrar un oligonucleótido antisentido a través de las membranas celulares dentro de las células.
Además de estos materiales de nanopartículas comunes, el péptido catiónico protamina ofrece una aproximación alternativa para formular un oligonucleótido antisentido como coloides. Este sistema de nanopartículas coloidal puede formar los así llamados proticles,que se pueden preparar por un simple procedimiento de autoensamblaje para empaquetar un oligonucleótido antisentido y mediar liberación intracelular de un oligonucleótido antisentido. La persona experta puede seleccionar y adaptar cualquiera de los excipientes anteriores u otros excipientes y sistemas de administración comercialmente disponibles alternativos para empaquetar y administrar un oligonucleótido antisentido para usar en la invención actual para administrar dicho oligonucleótido antisentido para el tratamiento de Distrofia Muscular de Duchenne en seres humanos.
Además, un oligonucleótido antisentido de la invención podría unirse covalentemente o no covalentemente a un ligando objetivo específicamente diseñado para facilitar la captación dentro de la célula, dentro del citoplasma y/o de su núcleo. Tal ligando podría comprender (i) un compuesto (incluyendo pero no limitado a estructuras peptídicas (o estructuras similares a las peptídicas)) que reconoce elementos celulares, tisulares o de órganos que facilita la captación celular y/o (ii) un compuesto químico capaz de facilitar la captación dentro de las células y/o la liberación intracelular de un oligonucleótido antisentido a partir de vesículas, por ejemplo endosomas o lisosomas.
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Por lo tanto, en una realización preferida, se formula un oligonucleótido antisentido de la invención en un medicamento que se proporciona con al menos un excipiente y/o un ligando que dirige a objetivo para administración y/o con un dispositivo de administración de dicho compuesto a una célula y/o que potencia su administración intracelular. De acuerdo con ello, la invención también comprende una composición farmacéuticamente aceptable que comprende un oligonucleótido antisentido de la invención y que comprende adicionalmente al menos un excipiente y/o un ligando que dirige a objetivo para administración y/o un dispositivo de administración de dicho compuesto a una célula y/o que potencia su administración intracelular. Se entiende que una molécula o compuesto o un oligonucleótido antisentido puede no estar formulado en una composición o preparación individual. Dependiendo de su identidad, la persona experta conocerá que tipo de formulación es la más apropiada para cada compuesto.
En una realización preferida, se usa una concentración in vitro de un oligonucleótido antisentido según se define en el presente documento, que está oscilando entre 0,1 nM y 1 mM. Más preferentemente, la concentración usada está oscilando entre 0,3 a 400 nM, incluso más preferentemente entre 1 a 200 nM de molécula o un oligonucleótido según se define en el presente documento se puede usar a una dosis que está oscilando entre 0,1 y 20 mg/kg, preferentemente 0,5 y 10 mg/kg. Si se usan varios oligonucleótidos antisentido, estas concentraciones pueden referirse a la concentración total de oligonucleótidos antisentido o a la concentración de cada oligonucleótido antisentido añadido. Los intervalos de concentración de oligonucleótido(s) antisentido como se dan anteriormente son concentraciones preferidas para usos in vitro o ex vivo. La persona experta entenderá que dependiendo del/de los oligonucleótido(s) antisentido usado(s), de la célula objetivo a tratarse, del objetivo génico y de sus niveles de expresión, el medio usado y las condiciones de incubación y de transfección, la concentración de oligonucleótido(s) usada puede variar adicionalmente y puede necesitar optimizarse algo adicionalmente.
Más preferentemente, un oligonucleótido antisentido y un compuesto adjunto a usarse para evitar, tratar DMD se producen de forma sintética y se administran directamente a una célula, un tejido, un órgano y/o pacientes en forma de formulación en una composición o preparación farmacéuticamente aceptable. La administración de una composición farmacéutica al sujeto se lleva a cabo preferentemente por una o más inyecciones parenterales, por ejemplo administraciones intravenosa y/o subcutánea y/o intramuscular y/o intratecal y/o intraventricular, preferentemente inyecciones, en uno o en múltiples sitios en el cuerpo humano.
Uso
En aún un aspecto adicional, la divulgación proporciona el uso de un oligonucleótido antisentido de acuerdo con la invención, y/o un vector basado en virus que expresa una o más secuencias antisentido de acuerdo con la invención y/o una composición farmacéutica, para inducir y/o promover ayustamiento del pre-ARNm de DMD . El ayustamiento está modulado preferentemente en una célula miogénica humana o en una célula muscular in vitro. Es más preferido que el ayustamiento esté modulado en seres humanos en una célula miogénica o en una célula muscular in vivo.
De acuerdo con ello, la divulgación se refiere adicionalmente al uso de un oligonucleótido antisentido según se define en el presente documento y/o del vector según se define en el presente documento y/o de la composición farmacéutica según se define en el presente documento induciendo y/o promoviendo el ayustamiento del pre-ARNm de DMD o para la preparación de un medicamento para el tratamiento de un paciente de DMD.
En este documento y en sus reivindicaciones, el verbo "comprende" y sus conjugaciones se usan en sentido no limitativo para significar que los elementos después de la palabra están incluidos, pero los elementos no mencionados específicamente no están excluidos. Además el verbo "consistir" se puede reemplazar por "consistir esencialmente en" significando que un oligonucleótido antisentido o un vector basado en virus o una composición según se define en el presente documento pueden comprender componente(s) adicional(es) a los identificados específicamente, no alterando dichos componente(s) adicionales la característica única de la invención. Además, la referencia a un elemento por el artículo indefinido"un" or"una" no excluye la posibilidad de que más de un elemento esté presente, a menos que el contexto requiera claramente que haya uno y solo uno de los elementos. Por tanto, el artículo indefinido "un" o "una" significa normalmente "al menos uno". Cada una de las realizaciones como se identifican en el presente documento pueden combinarse conjuntamente a menos que se indique lo contrario.
Los siguientes ejemplos se ofrecen solo para propósitos ilustrativos, y no están destinados a limitar el alcance de la presente invención de ningún modo.
Legendas de la figura
Figura 1. En los miotubos de control de seres humanos, una serie de AON (PS220 a PS225; SEQ ID NO: 3 a 8), todos uniendo a un tramo continuo de al menos 21 nucleótidos dentro de una secuencia específica del exón 45 (es decir SEQ ID NO: 2), se pusieron a prueba a dos concentraciones diferentes (200 y 500 nM). Todos los seis AON fueron eficaces en inducir el salto específicoa del exón 45, como se conforma por análisis de secuencia (no mostrado). PS220 (SEQ ID NO: 3) sin embargo, indujo de forma reproducible los niveles más altos de salto del exón 45 (véase Fig. 2). (NT: células no tratadas, M: marcador de tamaño).
Figura 2. En los miotubos de control de seres humanos, se puso a prueba PS220 25-mero (SEQ ID NO: 3) a concentración creciente. Se observaron niveles de salto del exón 45 de hasta el 75 % (a 400 nM) de forma reproducible, como se valora por Análisis de Agilent LabChip.
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Figura 3. En miotubos control humanos, las eficiencias de un AON45-5 17-mero "corto" (SEQ ID NO: 68) y de su homólogo PS220 25-mero "largo" solapante se compararon directamente a 200 nM y 500 nM. PS220 fue marcadamente más eficiente a ambas concentraciones: al 63 % cuando se compara con al 3 % obtenido con 45-5. (NT: células no tratadas, M: marcador de tamaño).
Ejemplos
Ejemplos 1 y 2
Materiales y procedimientos
El diseño de AON estaba basado en estructuras secundarias abiertas (parcialmente) solapantes del ARN de exón objetivo como se predijo por el programa m-fold (Zuker,M. (2003) Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. Nucleic Acids Res., 31, 3406-3415) y estaba basado en sitios de unión a proteína SR teóricos (parcialmente) solapantes como se predijo por numerosos programas de software tales como ESEfinder (Cartegni,L. et al.(2003) ESEfinder: A web resource to identify exonic splicing enhancers. Nucleic Acids Res, 31, 3568-71; Smith, P.
J. et al. (2006) An increased specificity score matrix for the prediction of SF2/ASF-specific exonic splicing enhancers. Hum.Mol.Genet., 15, 2490-2508) que predice sitios de unión para las cuatro proteínas SR más abundantes (SF2/ASF, SC35, SRp40 y SRp55). AON se sintetizaron por Prosensa Therapeutics B.V. (Leiden, Países Bajos) y contienen 2'-O-metil ARN y armazones de fosforotioato (PS) de longitud total.
Cultivo de tejidos, transfección y análisis por RT-PCR
Los cultivos de miotubos derivados de un individuo saludable ("ser humano control") se obtuvieron como se describe anteriormente (Aartsma-Rus et al. Hum Mol Genet 2003; 12(8): 907-14). Para el rastreo de los AON, se transfectaron los cultivos de miotubos con 0 a 500 nM de cada AON. El reactivo de transfección polietilenimina (PEI, ExGen500 MBI Fermentas) se usó de acuerdo con las instrucciones del fabricante, con 2 µl de PEI por µg de AON. Las eficacias de salto del exón se determinaron por análisis de RT-PCR anidada usando cebadores en los exones que flanquean el exón 45. Se aislaron fragmentos de PCR a partir de geles de agarosa para verificación de secuencia. Para cuantificación, los productos de PCR se analizaron usando el kit Agilent DNA 1000 LabChip y el bioanalizador Agilent 2100 (Agilent Technologies, EE.UU.).
Resultados
Una serie de secuencias dirigidas a objetivo de AON dentro de SEQ ID NO: 2 dentro del exón 45 se diseñaron y se pusieron a prueba en cultivos de miotubos normales, por transfección y RT-PCR subsiguiente y análisis de secuencia de ARN aislado subsiguiente. PS220 (SEQ ID NO: 3) indujo reproduciblemente niveles más altos de salto del exón 45, cuando se comparó con PS221-PS225 (Figura 1). Niveles altos de salto de 45 hasta el 75 % se obtuvieron ya a PS220 400 nM (Figura 2). En una comparación directa, PS220 (un 25-mero) fue de forma reproducible más eficiente en inducir el salto del exón 45 que su homólogo 17-mero más corto AON 45-5 (SEQ ID NO: 68; anteriormente publicado como h45AON5 (Aartsma-Rus et al. Am J Hum Genet 2004; 74: 83-92)), tanto a concentraciones de AON de 200 nM como de 500 nM y con el 63 % frente al 3% respectivamente a 500 nM (Figura 3). Este resultado se debe probablemente al hecho de que la longitud prolongada de PS220, de hecho solapando completamente AON 45-5, incrementa la energía libre del complejo AON-objetivo de tal forma que también se incrementa la eficacia de inducir el salto del exón 45.
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Claims (1)

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ES09788160.1T 2008-10-27 2009-01-13 Procedimientos y medios para el salto eficiente del exón 45 en el pre-ARNm de la distrofia muscular de Duchenne Active ES2532634T5 (es)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/NL2008/050673 WO2009054725A2 (en) 2007-10-26 2008-10-27 Means and methods for counteracting muscle disorders
WOPCT/NL2008/050673 2008-10-27
PCT/NL2009/050006 WO2010050801A1 (en) 2008-10-27 2009-01-13 Methods and means for efficient skipping of exon 45 in duchenne muscular dystrophy pre-mrna

Publications (2)

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Families Citing this family (53)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL1766010T3 (pl) 2004-06-28 2011-07-29 Univ Western Australia Antysensowne oligonukleotydy do indukcji pominięcia egzonu i sposoby ich zastosowania
USRE48960E1 (en) 2004-06-28 2022-03-08 The University Of Western Australia Antisense oligonucleotides for inducing exon skipping and methods of use thereof
EP3238737B1 (en) 2007-10-26 2022-04-06 Academisch Ziekenhuis Leiden Means and methods for counteracting muscle disorders
EP2119783A1 (en) 2008-05-14 2009-11-18 Prosensa Technologies B.V. Method for efficient exon (44) skipping in Duchenne Muscular Dystrophy and associated means
EP3428278A1 (en) 2008-10-24 2019-01-16 Sarepta Therapeutics, Inc. Multiple exon skipping compositions for dmd
WO2011036640A2 (en) * 2009-09-24 2011-03-31 Cellectis Meganuclease reagents of uses thereof for treating genetic diseases caused by frame shift/non sense mutations
PT2499249T (pt) 2009-11-12 2018-11-21 Univ Western Australia Moléculas antisentido e métodos para tratar patologias
TWI541024B (zh) 2010-09-01 2016-07-11 日本新藥股份有限公司 反義核酸
WO2012109296A1 (en) * 2011-02-08 2012-08-16 The Charlotte-Mecklenburg Hospital Authority D/B/A Carolinas Medical Center Antisense oligonucleotides
AU2012360702C1 (en) 2011-12-28 2018-09-20 National Center Of Neurology And Psychiatry Antisense nucleic acid
CN112251436A (zh) * 2012-01-27 2021-01-22 比奥马林技术公司 治疗杜兴型肌营养不良症和贝克型肌营养不良症的具有改善特性的rna调节性寡核苷酸
EP3608407A1 (en) * 2012-07-03 2020-02-12 BioMarin Technologies B.V. Oligonucleotide for the treatment of muscular dystrophy patients
CN105378081B (zh) 2013-03-14 2019-06-14 萨勒普塔医疗公司 用于治疗肌营养不良的外显子跳跃组合物
BR112015022998A2 (pt) 2013-03-15 2017-11-14 Sarepta Therapeutics Inc composições melhoradas para o tratamento de distrofia muscular
US11236338B2 (en) * 2013-09-05 2022-02-01 Sarepta Therapeutics, Inc. Antisense-induced exon2 inclusion in acid alpha-glucosidase
JP6519842B2 (ja) * 2013-10-04 2019-05-29 国立大学法人神戸大学 福山型筋ジストロフィー治療用アンチセンス核酸
UA120849C2 (uk) * 2014-03-12 2020-02-25 Ніппон Шин'Яку Ко., Лтд. Антисенсовий олігомер
HRP20220379T1 (hr) 2014-06-10 2022-05-27 Erasmus University Medical Center Rotterdam Antisense oligonukleotidi korisni u liječenju pompeove bolesti
PL3351633T3 (pl) * 2015-09-15 2020-11-02 Nippon Shinyaku Co., Ltd. Antysensowny kwas nukleinowy
US20190127733A1 (en) 2015-10-09 2019-05-02 Wave Life Sciences Ltd. Oligonucleotide compositions and methods thereof
CN108778344A (zh) * 2016-03-02 2018-11-09 里兰斯坦福初级大学理事会 抗流感病毒的泛基因型药剂和其使用方法
US11339392B2 (en) 2016-03-02 2022-05-24 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Pan-genotypic agents against influenza virus and methods of using the same
MA45328A (fr) 2016-04-01 2019-02-06 Avidity Biosciences Llc Compositions acide nucléique-polypeptide et utilisations de celles-ci
AU2017254106B2 (en) 2016-04-18 2024-07-11 Sarepta Therapeutics, Inc. Antisense oligomers and methods of using the same for treating diseases associated with the acid alpha-glucosidase gene
MA45290A (fr) * 2016-05-04 2019-03-13 Wave Life Sciences Ltd Procédés et compositions d'agents biologiquement actifs
MX2018016052A (es) 2016-06-30 2019-05-02 Sarepta Therapeutics Inc Oligomeros de omision de exon para distrofia muscular.
AU2017291960B2 (en) * 2016-07-05 2024-03-14 Biomarin Technologies B.V. Pre-mRNA splice switching or modulating oligonucleotides comprising bicyclic scaffold moieties, with improved characteristics for the treatment of genetic disorders
MX2019006882A (es) 2016-12-19 2019-08-16 Sarepta Therapeutics Inc Conjugados de oligomeros de omision de exon para distrofia muscular.
MX2019006989A (es) 2016-12-19 2019-08-16 Sarepta Therapeutics Inc Conjugados de oligomeros de omision de exon para distrofia muscular.
EP4115908A1 (en) 2016-12-19 2023-01-11 Sarepta Therapeutics, Inc. Exon skipping oligomer conjugates for muscular dystrophy
KR20190104381A (ko) 2017-01-06 2019-09-09 어비디티 바이오사이언시스 엘엘씨 핵산-폴리펩티드 조성물 및 엑손 스키핑을 유도하는 방법
GB201711809D0 (en) 2017-07-21 2017-09-06 Governors Of The Univ Of Alberta Antisense oligonucleotide
EA201991450A1 (ru) 2017-09-22 2019-12-30 Сарепта Терапьютикс, Инк. Конъюгаты олигомеров для пропуска экзона при мышечной дистрофии
US20210145852A1 (en) 2017-09-28 2021-05-20 Sarepta Therapeutics, Inc. Combination Therapies for Treating Muscular Dystrophy
WO2019071028A1 (en) 2017-10-04 2019-04-11 Avidity Biosciences Llc NUCLEIC ACID-POLYPEPTIDE COMPOSITIONS AND USES THEREOF
EP3720448A4 (en) 2017-12-06 2021-11-03 Avidity Biosciences, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS OF TREATMENT OF MUSCLE ATROPHY AND MYOTONIC DYSTROPHY
US10765760B2 (en) 2018-05-29 2020-09-08 Sarepta Therapeutics, Inc. Exon skipping oligomer conjugates for muscular dystrophy
JP2021526796A (ja) * 2018-06-13 2021-10-11 サレプタ セラピューティクス， インコーポレイテッド 筋ジストロフィーに対するエクソンスキッピングオリゴマー
US11168141B2 (en) 2018-08-02 2021-11-09 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating dystrophinopathies
AU2019316103A1 (en) 2018-08-02 2021-03-11 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating facioscapulohumeral muscular dystrophy
KR20210081322A (ko) 2018-08-02 2021-07-01 다인 세라퓨틱스, 인크. 근육 표적화 복합체 및 디스트로핀병증을 치료하기 위한 그의 용도
WO2020118246A1 (en) * 2018-12-06 2020-06-11 Wave Life Sciences Ltd. Oligonucleotide compositions and methods thereof
US11578090B2 (en) 2019-06-06 2023-02-14 Avidity Biosciences, Inc. Nucleic acid-polypeptide compositions and uses thereof
WO2020247818A1 (en) 2019-06-06 2020-12-10 Avidity Biosciences, Inc. Una amidites and uses thereof
US20230045557A1 (en) * 2019-12-19 2023-02-09 Nippon Shinyaku Co., Ltd. Antisense nucleic acid enabling exon skipping
CN118109468A (zh) 2019-12-26 2024-05-31 日本新药株式会社 诱导外显子50的跳读的反义核酸
MX2022010545A (es) 2020-02-28 2022-09-21 Nippon Shinyaku Co Ltd Acidos nucleicos antisentido que inducen la omision del exon 51.
AU2021237465A1 (en) 2020-03-19 2022-10-13 Avidity Biosciences, Inc. Compositions and methods of treating Facioscapulohumeral muscular dystrophy
US11638761B2 (en) 2021-07-09 2023-05-02 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating Facioscapulohumeral muscular dystrophy
US11771776B2 (en) 2021-07-09 2023-10-03 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating dystrophinopathies
AU2022309028A1 (en) 2021-07-09 2024-01-25 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and formulations for treating dystrophinopathies
AU2022424485A1 (en) 2021-12-27 2024-07-11 Nippon Shinyaku Co., Ltd. Method for producing oligonucleic acid compound
US12071621B2 (en) 2022-04-05 2024-08-27 Avidity Biosciences, Inc. Anti-transferrin receptor antibody-PMO conjugates for inducing DMD exon 44 skipping

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE60042338D1 (de) 1999-10-04 2009-07-16 Univ New Jersey Med TAR RNA bindende Peptide
JP4836366B2 (ja) * 2000-08-25 2011-12-14 雅文 松尾 デュシェンヌ型筋ジストロフィー治療剤
US6727355B2 (en) * 2000-08-25 2004-04-27 Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. Pharmaceutical composition for treatment of Duchenne muscular dystrophy
WO2004083432A1 (en) * 2003-03-21 2004-09-30 Academisch Ziekenhuis Leiden Modulation of exon recognition in pre-mrna by interfering with the secondary rna structure
PL1766010T3 (pl) * 2004-06-28 2011-07-29 Univ Western Australia Antysensowne oligonukleotydy do indukcji pominięcia egzonu i sposoby ich zastosowania
AU2006237727B2 (en) * 2005-04-22 2012-06-28 Academisch Ziekenhuis Leiden Modulation of exon recognition in pre-mRNA by interfering with the binding of SR proteins and by interfering with secondary RNA structure.
EP1857548A1 (en) * 2006-05-19 2007-11-21 Academisch Ziekenhuis Leiden Means and method for inducing exon-skipping
EP3238737B1 (en) 2007-10-26 2022-04-06 Academisch Ziekenhuis Leiden Means and methods for counteracting muscle disorders
US8084601B2 (en) 2008-09-11 2011-12-27 Royal Holloway And Bedford New College Royal Holloway, University Of London Oligomers
EP3428278A1 (en) * 2008-10-24 2019-01-16 Sarepta Therapeutics, Inc. Multiple exon skipping compositions for dmd
US9607308B2 (en) 2011-06-29 2017-03-28 American Express Travel Related Services Company, Inc. Spend based digital ad targeting and measurement

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CA2741629A1 (en) 2010-05-06
HK1160169A1 (en) 2012-08-10
ES2532634T3 (es) 2015-03-30
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DK2607484T3 (en) 2016-03-07
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SI2607484T1 (sl) 2016-11-30
AU2009310557A1 (en) 2010-05-06
PL2607484T3 (pl) 2016-06-30
AU2009310557A8 (en) 2011-09-29
ES2562658T3 (es) 2016-03-07
WO2010050801A1 (en) 2010-05-06

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