ES2586934T3 - Dispositivos microfluídicos para medir la coagulación plaquetaria, y sistemas y métodos asociados - Google Patents

Abstract

Un dispositivo fluídico que comprende: un sistema (114, 214) de microestructuras, que consta generalmente de bloques rígidos (108, 208) y estructuras generalmente flexibles (110, 210); por lo menos un canal de fluido (102, 202) de tamaño suficiente para albergar el conjunto (114, 214), donde el canal de fluidos (102, 202) está configurado para inducir el flujo del fluido de una muestra biológica a través del sistema (114, 214); y medios para detectar el grado de desviación de una o más de las estructuras flexibles (110, 210) del sistema (114, 214) hacia un bloque (108,208).

Description

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DESCRIPCION

Dispositivos microflmdicos para medir la coagulacion plaquetaria, y sistemas y metodos asociados

Referencia cruzada a aplicaciones relacionadas

La presente solicitud reivindica el beneficio de las siguientes solicitudes pendientes:

I.Solicitud de Patente Provisional USA N° 61/645 191, presentada el 10 de mayo 2012;

2.Solicitud de Patente Provisional USA N° 61/709 809, presentada el 4 de octubre 2012;

3.Solicitud de Patente USA N° 13/663,339, presentada el 29 de octubre 2012; and 4.Solicitud de Patente Provisional USA N° 61/760 849, presentada el 5 de febrero 2013.

Declaracion relativa a la investigacion con patrocinio federal

Esta invencion se ha realizado con ayuda gubernamental segun N66001-11-1-4129 concedida por SPA WAR - Space and Naval Warfare Systems Center (SSC). El gobierno tiene determinados derechos sobre la invencion.

Campo tecnico

La presente tecnologfa se refiere en general a dispositivos microflmdicos para medir la coagulacion plaquetaria, y sistemas y metodos asociados.

Antecedentes

Las plaquetas son esenciales para detener la perdida de sangre para que se cure el tejido. En una herida, las plaquetas experimentan un proceso de coagulacion de activacion, cambio de forma, secrecion y agregacion que en ultimo termino conduce a un coagulo hemostatico que contiene filamentos de fibrina y plaquetas. Las plaquetas desempenan una funcion biomecanica singular en la hemostasis: sus fuerzas actina-miosina potencian las adhesiones de integrina y evitan la fibrinolisis, aproximando entre sf los filamentos de fibrina y las plaquetas.

La hemodinamica tiene un importante papel en la actividad de las plaquetas. Se pueden dar elevados gradientes de velocidad de cizallamiento en puntos en los que los vasos sangumeos se curvan, ramifican o estrechan, y pueden surgir en un stent vascular o una valvula artificial. Se ha observado que esos gradientes de cizallamiento hacen que las plaquetas se adhieran a la pared vascular, lo que conduce a su activacion y agregacion. Elevados gradientes de cizallamiento pueden provocar un proceso autonomo en el que la agregacion plaquetaria aumenta el gradiente de cizallamiento local, lo que a su vez hace que las plaquetas se adhieran y agreguen.

El metodo primario con el que el cuerpo responde a una lesion es la formacion de coagulos para detener la hemorragia. La fuerza de un coagulo depende en gran medida de la capacidad de las celulas plaquetarias atrapadas en su interior para contraerse con fuerza, lo que endurece la malla de fibrina que rodea a las plaquetas y fija el coagulo a la herida para evitar la ruptura. La adecuada formacion de coagulos es cntica en pacientes con traumatismos, ya que una formacion de coagulos deficiente va asociada a un incremento significativo de la mortalidad. Por ejemplo, los pacientes traumatologicos con disfuncion plaquetaria pueden presentar lesiones mas graves y empeoramiento del shock. Pueden requerir mas transfusiones de sangre y presentar mayores indices de mortalidad. Los pacientes en tales situaciones necesitan ser transportados mas rapidamente desde el escenario de la lesion y pueden ser objeto de intervenciones de triaje de “control de danos”, como una estrategia de reanimacion hipotensiva. A su llegada al hospital, a esos pacientes se les pueden aplicar tratamientos mas tempranos y agresivos, incluyendo transfusiones de productos sangumeos a medida, y pueden ser derivados mas rapidamente a cirugfa urgente.

Los tests diagnosticos tradicionales que determinan si las plaquetas se coagulan adecuadamente son tecnicamente complejos, y requieren una importante cantidad de sangre para su realizacion. Ademas, esos tests pueden requerir una cantidad de tiempo importante para una lectura completa. Este tiempo de procesado puede retrasar la aplicacion de potenciales tecnicas de tratamiento en los pacientes traumatologicos, incrementando asf la posibilidad de un resultado negativo.

Shiring Feghhi et al: “Mechanobiology of Platelets: Techniques to Study the Role of Fluid Flow and Platelet Retraction Forces at the Micro- and Nano-Scale” (Mecanobiologfa de las Plaquetas: Tecnicas para Estudiar la Funcion del Flujo de Fluidos y las Fuerzas de Retraccion Plaquetaria a Micro y Nanoescala), International Journal of Molecular Sciences vol. 12, N°. 12, 7 de diciembre 2011, paginas 9009-9030 presenta un sensor de fuerza microescala para medir las fuerzas de traccion celular. Este sensor es un sistema de postes verticales, de tamano micro y flexibles, que se curvan de forma proporcional a las fuerzas que aplican las celulas a los extremos de los postes. Los postes estan hechos de PDMS utilizando litografia blanda, similar a la fabricacion de dispositivos microflmdicos.

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Breve descripcion de los dibujos

La Figura 1A es una ilustracion parcialmente esquematica de una camara de flujo microflmdica configurada segun las diferentes realizaciones de la tecnologfa.

La Figura 1B es una ilustracion parcialmente esquematica de un sistema de micropostes sometidos a flujo de fluidos en la camara de la Figura 1A segun las diferentes realizaciones de la tecnologfa.

La Figura 2 es una vista superior de un sistema de micropostes configurado segun las diferentes realizaciones de la tecnologfa.

La Figura 3 es una vista isometrica lateral de un dispositivo de analisis de plaquetas para la medicion de las fuerzas de las plaquetas, y configurado segun las diferentes realizaciones de la tecnologfa.

La Figura 4 es un diagrama de bloques que ilustra un metodo para medir la coagulacion plaquetaria en una muestra biologica, segun las diferentes realizaciones de la tecnologfa.

Las Figuras 5A-5C son graficos que ilustran la activacion del cizallamiento requerida para iniciar la desviacion de los micropostes en tres pacientes representativos, segun las diferentes realizaciones de la tecnologfa.

La Figura 6 es un diagrama de bloques que ilustra un metodo para seleccionar el tratamiento de un paciente, en respuesta al umbral* de activacion de cizallamiento del paciente, segun las diferentes realizaciones de la tecnologfa.

Descripcion detallada

La presente tecnologfa se refiere en general a dispositivos microflmdicos para la medicion de la coagulacion plaquetaria, y sistemas y metodos relacionados. En algunas realizaciones, un dispositivo flrndico incluye un sistema de microestructuras incluyendo pares de bloques en general ngidos, y postes generalmente flexibles. El dispositivo flrndico comprende ademas por lo menos un canal de fluido configurado para aceptar el sistema. El canal de fluido esta configurado para inducir el flujo del fluido de una muestra biologica, como sangre entera, a traves del sistema. El dispositivo flrndico puede incluir ademas un componente de deteccion, configurado para medir el grado de desviacion de uno o mas de los postes flexibles en el sistema. En algunas realizaciones, el dispositivo flrndico comprende un dispositivo manual, utilizable para los tests de fuerzas de las plaquetas y coagulacion en el punto de atencion sanitaria.

Mas abajo se describen detalles espedficos de varias realizaciones de la tecnologfa, con referencia a las Figuras 1A-6. No se dan en la siguiente presentacion otros datos describiendo estructuras y detalles bien conocidos, asociados frecuentemente a herramientas de investigacion celular, o dispositivos flrndicos de punto de atencion, para evitar complicar innecesariamente la descripcion de las diversas realizaciones de la tecnologfa. Muchos de los detalles, dimensiones, angulos y otras caractensticas mostradas en las figuras son simplemente ilustrativos de realizaciones espedficas de la tecnologfa. En consecuencia, otras realizaciones pueden tener otros detalles, dimensiones, angulos y caractensticas sin apartarse del espmtu o ambito de la presente tecnologfa. Por consiguiente, una persona con conocimientos ordinarios en la materia comprendera que la tecnologfa puede tener otras realizaciones con elementos adicionales, o la tecnologfa puede tener otras realizaciones sin algunas de las caractensticas que se muestran y describen mas abajo con referencia a las Figuras 1A-6.

La Figura 1A es una ilustracion parcialmente esquematica de una camara de flujo de fluidos 100 configurada segun las diferentes realizaciones de la tecnologfa. La camara 100 puede incluir un canal principal 102 a traves del cual fluye el fluido desde una entrada 122 a una salida 124. En algunas realizaciones, el fluido puede comprender sangre entera o plaquetas, u otros fragmentos de sangre entera, incluyendo plasma y protemas plasmaticas. En otras realizaciones, el fluido puede comprender por lo menos uno de lo siguiente: celulas endoteliales, celulas tumorales circulantes, celulas cancerosas, fibroblastos, celulas de musculo liso, cardiomiocitos, hematfes, leucocitos, bacterias, megacariocitos, enzimas, minerales, biominerales, o fragmentos de lo que antecede. Si bien la Figura 1A ilustra un unico canal principal 102, en otras realizaciones la camara 100 puede incluir varios canales de fluidos. En realizaciones con multiples canales de fluidos, el usuario puede introducir distintos fluidos, muestras biologicas y/o reactivos en los distintos canales. O como se describira en mas detalle a continuacion, la camara 100 puede incluir multiples canales de fluidos capaces de funcionar en paralelo, y estudiar distintas caractensticas de una muestra de fluido. Por ejemplo, la camara 100 puede estudiar una muestra de control frente a una muestra modificada, o puede introducir una muestra en multiples canales de fluidos con distintas qrnmicas de superficie.

El canal principal 102 esta configurado para aceptar uno o mas sistemas 114 de microestructuras, tales como micropostes. En varias realizaciones, el sistema 114 esta posicionado en o cerca de una base o fondo 118 del canal principal 102, de forma que el flujo puede fluir esencialmente sobre y a traves del sistema 114. Como se describira con mas detalle mas adelante, en algunas realizaciones, el sistema 114 comprende uno o mas pares de microestructuras. En algunos casos, cada par de microestructuras incluye un bloque generalmente ngido 108 proximo a un poste 110 generalmente flexible. Como se comentara en

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mas detalle mas abajo, en algunas de las realizaciones la parte superior del poste 110 comprende una punta magnetica 116. La punta magnetica 116 del extremo superior del poste 110 puede ser de cobalto, rnquel, samario y otros metales de tierras raras obtenidos por deposicion electroqmmica en los poros de una plantilla. En otras realizaciones, la punta magnetica 116 comprende otros materiales, o esta formada o depositada por otros metodos.

En diversas formaciones, el bloque 108 esta aguas arriba del poste aguas abajo 110. En algunas realizaciones, el bloque 108 y el poste 110 estan separados por 5-15 pm, y en una realizacion concreta estan separados por 9 pm. En varias realizaciones, el sistema 114 puede incluir otras combinaciones de bloques 108 y postes 110. Por ejemplo, la relacion de bloques 108 a postes 110 puede no ser de 1:1, sino que puede haber multiples postes 110 proximos a un unico bloque 108. En otras realizaciones, esta proporcion se invierte. Aun en otras realizaciones, el poste 110 esta aguas arriba del bloque 108. El poste 110 puede actuar como una viga elastica en voladizo, que se desvfa proporcionalmente a la fuerza aplicada a su punta superior. Por ejemplo, la desviacion puede ser un continuo desde la base a la punta del poste 110. En varias realizaciones, el poste 110 se desvfa significativamente mas que el bloque 108. En algunos casos, la desviacion del bloque 108 es insignificante o inexistente.

El sistema 114 puede incluir tambien una o mas valvulas de spin 126 debajo o junto a uno o mas postes 110 o bloques 108. Por ejemplo, puede haber una valvula de spin 126 por cada par de microestructuras bloque-y-poste, y la valvula de spin 126 puede estar posicionada entre el bloque 108 y el poste 110. Como se describira en mas detalle mas abajo, la valvula de spin 126 puede utilizarse para medir los cambios en el campo magnetico provocados por la punta magnetica 116 del poste 110 desviandose hacia el bloque 108. La valvula de spin 126 puede utilizar el efecto magnetorestrictivo (GMR) gigante en pelfculas finas. La valvula de spin 126 puede incluir una tira de metales de pelfcula delgada con pulverizacion catodica en pilas alternadas de capas magneticas y no magneticas. Debido a las interacciones de los espines de los electrones en las distintas capas, la resistencia de la tira es sensible a los cambios en el campo magnetico en el plano. La valvula de spin 126 puede tener sensibilidad magnetica del orden de 1 nT, que puede alcanzar una relacion senal-ruido de 20:1. En algunas realizaciones, el cambio de resistencia de la valvula de spin 126 puede ser medido estableciendo una configuracion de puente Wheatstone.

En varias realizaciones, la camara de flujo 100 esta dimensionada para su uso en el punto de asistencia. Por ejemplo, la camara de flujo 100 puede estar dimensionada para acoger una muestra relativamente pequena (ej., menos de 3 pl) de un fluido como puede ser sangre. En algunas realizaciones, una gota de sangre es suficiente para que funcione el dispositivo. En una realizacion, el canal principal 102 tiene una longitud de 2 cm, una anchura de 4 mm, y una profundidad de 0,5 mm. El canal principal 102 puede tener otras dimensiones en distintas realizaciones. En varias realizaciones, la camara de flujo 100 esta sellada hermeticamente. Como se describira mas abajo con referencia a la Figura 3, en algunas realizaciones, toda o una porcion de la camara 100 o el sistema 114 comprende una tarjeta configurada para ser colocada en un dispositivo manual que activa un test de fluido o lee los resultados del test (ej., la magnitud de las fuerzas de las plaquetas).

La Figura 1B es una vista parcialmente esquematica del sistema de microestructuras 114 de la Figura 1A sometido al flujo del fluido y configurado segun las diferentes realizaciones de la tecnologfa. Con referencia a las Figuras 1A y IB juntas, en funcionamiento, el sistema 114 esta situado en el canal principal 102 y expuesto a condiciones de flujo de fluidos (ej., condiciones de flujo laminar para crear gradiente de cizallamiento en el sistema 114) por un periodo de tiempo determinado. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el sistema 114 puede ser situado dentro del canal 102 y se puede aplicar continuamente flujo de sangre entera durante menos de un minuto. En otras realizaciones, el flujo se puede aplicar intermitentemente, o durante mas o menos de un minuto. Por ejemplo, se puede suministrar el flujo durante un minuto o menos, cinco minutos o menos o quince minutos o menos. En algunas realizaciones, el flujo puede ser suministrado sin que se requiera ninguna accion del usuario u otra intervencion.

En varias realizaciones, el termino “flujo de fluido” puede referirse a un fluido bombeado o movido mecanicamente de otro modo, un fluido a presion (ej., introducido con una jeringa), o puede referirse a inmersion (sin bombeo). Mientras una unidad de flujo (ej., una bomba) 104 se muestra conectada a la camara de flujo 100 y configurada para recircular el medio a traves de la camara 100 y proporcionar flujo estatico, laminar y/o alterado en la direccion de las flechas de flujo, en otras realizaciones la unidad de flujo 104 esta ausente, y la muestra de fluido es introducida en el canal principal 102 por la entrada 122. Por ejemplo, la muestra de fluido puede ser recogida (ej., en tubos de heparina u otros anticoagulantes), cargada en una jeringa y bombeada por el canal principal 102 a velocidades de cizallamiento de pared de fisiologicamente normales (2000 s-1) a patologicamente elevadas (12000 s-1). En algunas realizaciones, la muestra de fluido puede ser retirada del canal principal 102 por la salida 124, mientras en otras realizaciones la muestra de fluido permanece en el canal principal 102 tras el test para facilidad de eliminacion. En realizaciones con una unidad de flujo 104, la unidad de flujo 104 puede comprender una bomba de desplazamiento positivo, una bomba piezoelectrica, un vacfo parcial, una bomba de diafragma, una bomba peristaltica, una bomba hidrostatica u otro dispositivo.

Cuando la muestra de fluido (ej., sangre entera) es introducida en el canal principal 102, las plaquetas que fluyen se adhieren rapidamente a las microestructuras (ej., encima y entre el bloque 108 y el poste 110)

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para formar un coagulo en microescala 120. Mas espedficamente, las plaquetas se agregan en el coagulo 120, que forma un puente mecanico entre las estructuras del bloque 108 y el poste 110 en el sistema 114. Las plaquetas se contraen bajo las fuerzas de cizallamiento, haciendo que el poste 110 se desvfe hacia el bloque 108 como una viga elastica en voladizo que se curve en proporcion a la fuerza aplicada en su extremo. El grado de desviacion del poste 110 puede utilizarse para cuantificar cuanta fuerza estan produciendo las plaquetas en la sangre, con lo que consecuentemente se puede identificar cualquier deficiencia en la coagulacion. En varias realizaciones, el bloque 108 y el poste 110 estan lo suficientemente juntos como para disuadir a los eritrocitos y los blancos de aposentarse en el espacio de coagulo entre el bloque 108 y el poste 110.

Para medir la desviacion de un poste 110, la diferencia entre la posicion de su extremo y la base puede ser analizada por las imagenes de microscopfa de contraste de fase y de fluorescencia, tomadas en la parte superior y la base del sistema 114. La magnitud y direccion de cada fuerza de traccion (F) pueden ser calculadas a partir de la desviacion (5) mediante la relacion:

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La longitud L y el diametro D de las microestructuras del sistema pueden ser medidas utilizando un microscopio electronico de barrido. En algunas realizaciones, el diametro del poste 110 es 2,2 pm y la longitud es 7 pm. El modulo de Young del material del poste (ej., polidimetil siloxano (PDMS), E = 2,5 MPa) puede ser determinado por ensayo de traccion.

La punta magnetica 116 del poste 110 puede ser utilizada para medir las fuerzas en las plaquetas con un componente de deteccion magnetica. Por ejemplo, la punta magnetica 116 puede tener un momento dipolar no orientado paralelo a la valvula de spin 126. En el caso de una punta magnetica de mquel 116, el momento dipolar inicial sera 4,8 pAm2. Suponiendo que la punta magnetica 116 esta aproximadamente a 60 pm del sensor, su momento dipolar producira un campo magnetico en el plano de “ 4,4 pT. Esta medicion sera la lectura basal para un poste no desviado 110.

Cuando las fuerzas de las plaquetas desvfan el poste 110 hacia el bloque 108, la punta magnetica 116 gira con un angulo 0. Debido a la reorientacion del momento dipolar p' de la punta magnetica 116, hay un descenso en el campo magnetico en el plano medido en la valvula de spin 126. En una realizacion concreta, una fuerza de 40 nN es producida por el coagulo 120. Asf, en base a una constante de resorte de 221 nN/pm para un poste 110 hecho de SU-8, habra una rotacion de aproximadamente 0,3° en la punta magnetica 116 del poste 110. Esta rotacion hara que el momento dipolar p' de la punta magnetica 116 cambie su orientacion tambien en 0,3°, lo que provocara una cafda de p0-p' = 20 nT en el campo magnetico en el plano medido por la valvula de spin 126. Aunque una cafda de 20 nT puede ser demasiado pequena para la mayona de los magnetometros comerciales de bajo coste (ej., un sensor de efecto Hall o magnetometro de saturacion), la valvula de spin 126 puede ser lo bastante sensible como para detectar tal cambio en el campo magnetico. Como se comentara mas adelante con referencia a la Figura 2, el sistema 114 puede incluir tambien almohadillas de contacto que permiten la conexion entre la valvula de spin 126 y el equipo electronico para detectar las fuerzas de las plaquetas.

En otras realizaciones, otros componentes magneticos, como nanocables magneticos, pueden ser integrados o colocados dentro o junto a otras secciones del poste 110. Por ejemplo, en algunas realizaciones, un nanocable es integrado en aproximadamente por lo menos los 2/3 superiores del poste 110 y es usado para la deteccion magnetica. La desviacion del poste utilizando nanocables puede ser detectada mediante un magnetometro, ej. una valvula de spin o un sensor GMR colocado junto (ej., debajo) al sistema magnetizado 114. En otras realizaciones, los imanes se omiten desde el poste 110 y las mediciones de las fuerzas de las plaquetas en los postes 110 pueden realizarse utilizando microscopio optico y procesamiento de imagenes. Determinados componentes de deteccion optica para detectar fuerzas en los postes 110 pueden incluir un microscopio de contraste de fase, un microscopio de fluorescencia, un microscopio confocal o un fotodiodo. En otras realizaciones se pueden utilizar otros componentes de deteccion optica.

Los sistemas 114 comentados mas arriba pueden ser fabricados utilizando diversas tecnicas de plantillas o mediante conformado. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el sistema 114 puede ser creado por fundicion de una pelfcula de PDMS o un material similar con un grosor de 0,25 mm sobre un cubreobjetos de vidrio del N° 2. En otras realizaciones, se pueden utilizar otros materiales y/o grosores de materiales. En algunas realizaciones, las microestructuras individuales comprenden, silicona, polfmeros, metal o ceramica. En una realizacion concreta, los postes individuales 110 se hacen utilizando SU-8 fotoresistente, con una constante de resorte de aproximadamente 221 nN/pm. En algunas realizaciones, las microestructuras u otra porcion de la camara 100 pueden estar sustancialmente recubiertas con una capa antifouling.

El sistema 114 de microestructuras puede ser micromoldeado con las formas, disposiciones o patrones deseados. Por ejemplo, en algunas realizaciones, los bloques individuales 108 son generalmente de

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forma rectangular, con angulos agudos configurados para generar elevadas fuerzas de cizallamiento. En otras realizaciones, los bloques 108 tienen otras formas, como cunas, triangulos, columnas, esferas, estrellas, etc. En una realizacion concreta, el bloque 108 tiene una altura de aproximadamente 10- 60 pm, una anchura de 10-30 pm, y una profundidad de 5-20 pm. En algunas realizaciones, los postes individuales 110 tienen en general forma de columnas, pero pueden tener otras formas en otras realizaciones. En una realizacion concreta, los postes 110 tienen una altura de aproximadamente 10-60 pm, y un diametro de aproximadamente 2-6 pm. En algunas realizaciones, la punta magnetica 116 comprende una capa de mquel de un grosor aproximado de 1 pm, y un diametro aproximado de 3 pm. En otras realizaciones, los postes 110 pueden tener otras dimensiones.

Puede ser conveniente tratar o recubrir las microestructuras u otra parte del dispositivo 100 con una qmmica de superficie o agente de union. Por ejemplo, en algunas realizaciones, un elemento de union (ej., fibronectina) puede ser absorbido en la superficie de un sello de PDMS. Los sellos pueden no seguir ningun patron (“sello plano”) o un conjunto de patrones de relieve positivo, en forma de una rejilla de cuadrados (“sellos cuadrados”). Cuando el elemento de union es absorbido, el sello puede ser colocado en contacto conformal con el sustrato, para transferir la fibronectina a las regiones de contacto. Despues cada sustrato puede ser tratado con 0,2% Pluronic F127 u otro material adecuado para asegurar las celulas se adhieren a zonas en las que se imprimio la fibronectina y prevenir la absorcion de protemas y la adhesion de las plaquetas al bloque en el canal principal 102. Esto puede ayudar a separar las plaquetas de los otros constituyentes de la sangre del test. En algunas realizaciones, las paredes del canal principal 102 estan recubiertas con una tincion fluorescente y luego colageno tipo I y Factor von Willebrand.

En algunas realizaciones, las microestructuras individuales (o puntas de las microestructuras) estan sustancialmente recubiertas con por lo menos una qmmica de superficie o elemento de union, como pueden ser protemas, glucanos, poliglucanos, glucoprotemas, colageno, vitronectina, laminina, anticuerpos monoclonales, plasmina, agonistas (ej., trombina o calcio), protemas de matriz (ej., fibrinogeno, fibronectina, Factor von Willebrand), enzimas, minerales, biominerales, inhibidores de la actividad de la actina-miosina (ej., Y-27632, ML-7, o blebistatina), y/o fragmentos de lo anterior. En algunas realizaciones, las microestructuras estan recubiertas con protemas de matriz extracelular que permiten a las plaquetas fijarse a ellas, como lo hanan a la pared de un vaso danado. En algunas realizaciones, microestructuras de cada microcanal pueden ser selladas con Factor von Willebrand a concentraciones del orden de 10-50 pg/ml.

Como se ha comentado antes, en algunas realizaciones el dispositivo 100 incluye multiples canales, capaces de funcionar en paralelo para estudiar distintas caractensticas de la muestra. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el dispositivo 100 puede incluir multiples canales, cada uno de ellos con una qmmica de superficie de distinta microestructura. En una realizacion concreta, un primer microcanal funciona como un canal de control, un segundo canal incluye una qmmica de superficie de una microestructura que fomenta la coagulacion, y un tercer canal incluye una qmmica de superficie de microestructura que inhibe la coagulacion plaquetaria. Multiples canales pueden combinarse para realizar simultaneamente pruebas con una gama de componentes de la formacion de coagulos.

La Figura 2 es una vista superior de un sistema 214 de microestructuras para su uso en la camara de flujo de fluidos 100 de la Figura 1. El sistema 214 es albergado en un microcanal 202 que incluye una entrada de fluidos 222 y una salida de fluidos 224. El sistema 214 comprende un patron de pares de bloques 208 y los correspondientes postes aguas abajo 210. Mientras la realizacion ilustrada incluye una rejilla de pares de microestructuras en filas y columnas, en otras realizaciones los pares pueden situarse en disposiciones distintas, o puede haber mas o menos hileras y columnas. Por ejemplo, en algunas realizaciones puede haber 100 bloques 208 y 100 postes 210. Ademas, los bloques 208 y los postes 210 no tienen que estar por pares, sino que puede haber varios postes 210 por bloque 208 (ej., los postes 210 pueden rodear al bloque 208), o puede haber multiples bloques 208 por poste 210.

Una serie de valvulas de spin 226 se posicionan en el sistema 214, cada valvula de spin 226 entre un bloque 208 y un poste 210. Una o mas almohadillas de contacto 230 para conectar las valvulas de spin 226 al equipo electronico estan situadas a lo largo del borde del sistema 214. Puede utilizarse un equipo de adquisicion de datos y de procesado de senal para determinar la desviacion de los postes 210 de la manera descrita mas arriba. Un cambio de tension en las valvulas de spin 226 indica la fuerza que estan produciendo las plaquetas en una muestra de sangre. Si las plaquetas de una muestra se danan, se produce un cambio menor en la tension medida.

La Figura 3 es una vista isometrica lateral de un dispositivo de ensayo de plaquetas 350 para medir las fuerzas de las plaquetas, y configurado segun las diferentes realizaciones de la tecnologfa. En algunas realizaciones, el dispositivo 350 puede comprender un sistema de ensayo de punto de asistencia facilmente transportable, de tamano manual (ej., con dimensiones inferiores o iguales a 10 cm x 8 cm x 5 cm). El dispositivo 350 puede incluir una parte receptora 354 capaz de contener una tarjeta de muestra 300. La tarjeta de muestra 300 puede comprender una camara de flujo o un sistema como la camara de flujo 100, o el sistema 114 comentados mas arriba con referencia a la Figura 1, o partes de ellos. En varias realizaciones, la tarjeta 300 puede incluir un canal de fluido o multiples canales con distintas condiciones de ensayo (ej., distintas qmmicas de superficie de microestructura) capaces de funcionar en

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paralelo. En otras realizaciones, distintas tarjetas 300 pueden ser utilizadas para distintas condiciones de ensayo. En algunas realizaciones, el dispositivo 350 puede ser reutilizable, con nuevas muestras de fluido colocadas en tarjetas 300 nuevas o esterilizadas. En otras realizaciones, el dispositivo de ensayo 350 es desechable y disenado para un solo uso.

El dispositivo de ensayo 350 puede incluir varios componentes electronicos, tales como equipo de adquisicion de datos y/o de procesado de senal que puede acoplarse a las almohadillas de contacto 230 descritas mas arriba con referencia a la Figura 2. Tales componentes electronicos pueden recibir y/o procesar los datos de desviacion de microestructuras. En algunas realizaciones, los datos de desviacion se procesan dentro del dispositivo 350, y se genera un valor de salida de funcion plaquetaria. Tales datos de salida pueden ser transmitidos a un usuario via una pantalla 352 en el dispositivo 350 o una pantalla remota.

La Figura 4 es un diagrama de bloques que ilustra un metodo 400 de medicion de la coagulacion plaquetaria en una muestra biologica, segun realizaciones de la tecnologfa. En el bloque 410, el metodo 400 incluye la colocacion de un sistema de bloque-y-poste de microestructuras en un dispositivo de flujo de fluidos. Como se ha comentado mas arriba, en varias realizaciones el bloque comprende una estructura, generalmente ngida, cercana a un poste en general flexible. En algunas realizaciones, el poste puede incluir una punta magnetica.

En el bloque 420, el metodo 400 incluye ademas hacer circular fluido sobre las microestructuras. En varias realizaciones, el fluido comprende una muestra de sangre, y en algunas realizaciones es una muestra de sangre entera de aproximadamente 3 pl. El metodo de circulacion de fluido puede realizarse en una camara de flujo de fluidos, como la camara descrita mas arriba con referencia de la Figura 1A. En varias realizaciones, el fluido puede ser introducido sin ningun paso de lavado o aclarado. En el bloque 430, el metodo 400 incluye inducir la formacion de coagulo sobre las microestructuras, en un espacio situado encima y entre el bloque y el poste. Este paso puede incluir causar la desviacion de por lo menos una de las microestructuras, como puede ser la desviacion del poste hacia el bloque. El metodo 400 puede incluir ademas la medicion de la desviacion de las microestructuras 440. En varias realizaciones, la desviacion se mide mediante un montaje de deteccion magnetica, como es mediante el uso de valvulas de spin, para medir los cambios en el campo magnetico.

Las Figuras 5A-5C son graficos que ilustran la activacion del cizallamiento requerida para iniciar la desviacion de los micropostes en tres pacientes representativos (donantes de plaquetas) y segun las diferentes realizaciones de la tecnologfa. El nivel umbral de activacion del cizallamiento puede determinarse observando el gradiente de cizallamiento necesario para causar la desviacion de un microposte en un sistema de micropostes en una camara de flujo de fluidos, como la camara de flujo de fluidos descrita mas arriba con referencia a la Figura 1A. Como se muestra, los pacientes presentan distintos niveles de activacion de cizallamiento necesarios para la contraccion de las plaquetas y la correspondiente formacion de coagulos. Algunos pacientes tienen niveles umbrales de cizallamiento bajos para la activacion, mientras que otros presentan umbrales de cizallamiento mas altos. Por ejemplo, las plaquetas del paciente de la Figura 5A estan inactivas a 2.000 1/s, pero comienzan a generar fuerza a 5.000 1/s. En la Figura 5B, las plaquetas del paciente requirieron 8.000 1/s para activarse, mientras que las plaquetas del paciente de la Figura 5C requirieron 12.000 1/s para activarse. Esto puede significar que parte de la poblacion tiene mayor tendencia a la activacion de cizallamiento in-vivo. Como se comentara mas abajo con referencia a la Figura 6, esta caractenstica puede tenerse en cuenta al adaptar la terapia o el tratamiento. Esto puede proporcionar informacion a los medicos sobre la actividad plaquetaria de un paciente para el tratamiento antiplaquetario, o en casos tales como la recuperacion postquirurgica.

La Figura 6 es un diagrama de bloques que ilustra un metodo 600 de seleccion del tratamiento de un paciente en respuesta al umbral de activacion del cizallamiento del paciente, segun realizaciones de la tecnologfa. En el bloque 610, el metodo incluye inducir un gradiente de cizallamiento en una muestra de fluido, como puede ser una muestra de sangre. El gradiente de cizallamiento puede ser inducido en una camara de flujo de fluidos, como la camara descrita mas arriba con referencia a la Figura 1A. En el bloque 620, el metodo 600 incluye ademas la determinacion del nivel umbral de activacion de cizallamiento requerido para la formacion de coagulo. El nivel umbral puede determinarse observando el gradiente de cizallamiento necesario para causar la desviacion de un microposte en un sistema de micropostes en la camara de flujo de fluidos. En el bloque 630, el metodo 600 incluye seleccionar un tratamiento para el paciente, en base al nivel umbral de activacion de cizallamiento. Por ejemplo, un paciente con un bajo umbral de cizallamiento al que se haya practicado un stent arterial puede necesitar chequeos mas frecuentes de reoclusion, ya que sus plaquetas pueden unirse facilmente. En un ejemplo inverso, una persona con un umbral de cizallamiento superior puede no necesitar una dosis alta de farmacos anticoagulantes, debido a una resistencia innata a la activacion del cizallamiento. El metodo 600 puede proporcionar asf un tratamiento adaptado a la situacion particular del paciente.

La tecnologfa presentada aqrn ofrece varias ventajas sobre los sistemas existentes. Por ejemplo, los dispositivos presentados aqrn pueden detectar de forma rapida y precisa la funcion plaquetaria en los entornos de asistencia de emergencia. Los dispositivos pueden ser portatiles, funcionando con pilas, y requerir poco o ningun tiempo de calentamiento. La muestra puede ser solamente de unos pocos microlitros y la prueba se realiza en menos de cinco minutos. Ademas, el dispositivo puede ser

relativamente sencillo, sin piezas moviles que puedan tener un fallo mecanico, y sin requerir vibracion o centrifugacion. Ademas un dispositivo tan sencillo se puede fabricar de forma relativamente economica.

Claims (15)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   55

   REIVINDICACIONES

   1. Un dispositivo flmdico que comprende:

   un sistema (114, 214) de microestructuras, que consta generalmente de bloques ngidos (108, 208) y estructuras generalmente flexibles (110, 210); por lo menos un canal de fluido (102, 202) de tamano suficiente para albergar el conjunto (114, 214), donde el canal de fluidos (102, 202) esta configurado para inducir el flujo del fluido de una muestra biologica a traves del sistema (114, 214); y medios para detectar el grado de desviacion de una o mas de las estructuras flexibles (110, 210) del sistema (114, 214) hacia un bloque (108,208).
2. 2. El dispositivo de la reivindicacion 1, donde el sistema (114, 214) comprende pares de los bloques generalmente ngidos (108, 208) y estructuras en general flexibles (110, 210), o donde las microestructuras estan hechas de por lo menos uno de los materiales siguientes: silicona, polfmeros, metal o ceramica.
3. 3. El dispositivo de la reivindicacion 1, donde los medios de deteccion comprenden por lo menos uno de los siguientes: un componente de deteccion optico o un componente de deteccion magnetica.
4. 4. El dispositivo de la reivindicacion 3, donde el componente de deteccion magnetico es una valvula de spin (126, 226), una sonda Hall, o un magnetometro de saturacion.
5. 5. El dispositivo de la reivindicacion 3, donde las estructuras en general flexibles individuales (110, 210) incluyen un material magnetico (116), y de preferencia donde el componente de deteccion magnetico comprende valvulas de spin (126, 226) colocadas entre bloques individuales (108, 208), y estructuras en general flexibles (110, 210), y configurado para detectar los cambios en un campo magnetico en el sistema (114, 214) causados por la desviacion de las estructuras en general flexibles (110, 210) incluyendo el material magnetico.
6. 6. El dispositivo de la reivindicacion 3, donde el componente de deteccion optico es un microscopio de contraste de fase, un microscopio de fluorescencia, un microscopio confocal o un fotodiodo.
7. 7. El dispositivo de la reivindicacion 1, donde la muestra biologica comprende por lo menos uno de lo siguiente: sangre entera, plasma, protemas plasmaticas, protemas que se encuentran en sangre u otros fluidos biologicos, plaquetas, celulas endoteliales, celulas tumorales circulantes, celulas cancerosas, fibroblastos, celulas de musculo liso, cardiomiocitos, eritrocitos, leucocitos, bacterias, megacariocitos o fragmentos de ellos.
8. 8. El dispositivo de la reivindicacion 1, donde como mmimo algunas de las microestructuras estan por lo menos parcialmente recubiertas con por lo menos un elemento de union seleccionado de un grupo compuesto por protemas, enzimas, minerales bioactivos, glucanos, poliglucanos, glucoprotemas, colageno, factor von Willebrand, vitronectina, laminina, anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, plasmina, agonistas, protemas de la matriz, inhibidores de la actividad actina-miosina, y fragmentos de ellos.
9. 9. El dispositivo de la reivindicacion 1, donde el dispositivo flmdico comprende un dispositivo de tamano manual (350), o donde el dispositivo comprende ademas una pantalla (352) configurada para mostrar una caractenstica de la muestra biologica, basada en el grado de desviacion de una o mas de las estructuras generalmente flexibles (110, 210).
10. 10. Un metodo analttico que comprende:

    Colocar un par de microestructuras en una camara de flujo de fluidos (100), incluyendo ese par un bloque en general ngido (108, 208) cercano a una estructura en general flexible (110, 210); el fluido circulante sobre las microestructuras; y medir la desviacion de la estructura en general flexible (110, 210).
11. 11. El metodo de la reivindicacion 10, donde colocar el par de microestructuras en la camara de flujo de fluidos (100) comprende colocar una microestructura como mmimo parcialmente recubierta de por lo menos uno de los siguientes: enzimas, minerales, factor von Willebrand, una protema, glucano, poliglucano, glucoprotema, colageno, vitronectina, laminina, anticuerpo monoclonal, anticuerpo policlonal, plasmina, agonista, protema de la matriz, un inhibidor de la actividad actina-miosina o fragmentos de ellos.
12. 12. El metodo de la reivindicacion 10, donde el fluido circulante sobre las microestructuras comprende hacer circular un fluido biologico sobre las microestructuras, y de preferencia hacer circular el fluido biologico sobre las microestructuras comprende hacer circular un fluido biologico que contenga por lo menos uno de los siguientes: protemas plasmaticas, minerales, factor von Willebrand, una protema, glucano, poliglucano, glucoprotema, colageno, vitronectina, laminina, anticuerpo monoclonal, anticuerpo policlonal, plasmina, agonista, protema de la matriz, un inhibidor de la actividad actina-miosina, o fragmentos de ellos.
13. 13. El metodo de la reivindicacion 10, donde la medicion de la desviacion de la estructura generalmente flexible (110, 210) comprende utilizar un componente de deteccion optico para medir la desviacion de la

    estructura en general flexible (110, 210).
14. 14. El metodo de la reivindicacion 10, donde la medicion de la desviacion de la estructura generalmente flexible (110, 210) comprende la utilizacion de un componente de deteccion magnetico para medir la desviacion de la estructura generalmente flexible (110, 210), y de preferencia utilizar el componente de

    5 deteccion magnetico comprende utilizar uno o mas de los siguientes: una valvula de spin (126, 226), una sonda Hall, o un magnetometro de saturacion para medir el cambio en un campo magnetico causado por la desviacion de la estructura generalmente flexible (110,210).
15. 15. El metodo de la reivindicacion 10, donde colocar el par de microestructuras en la camara de flujo de fluidos (100) comprende colocar el bloque generalmente ngido (108, 208) en una posicion aguas arriba en

    10 relacion con la estructura en general flexible (110, 210), o donde el metodo comprende ademas inducir la formacion de coagulos.