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ES2566629T3 - Fármacos de ácido nucleico ENA que modifican el corte y empalme en precursores de ARNm - Google Patents

Fármacos de ácido nucleico ENA que modifican el corte y empalme en precursores de ARNm Download PDF

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ES2566629T3
ES2566629T3 ES12182252.2T ES12182252T ES2566629T3 ES 2566629 T3 ES2566629 T3 ES 2566629T3 ES 12182252 T ES12182252 T ES 12182252T ES 2566629 T3 ES2566629 T3 ES 2566629T3
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gmp
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ams
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Application number
ES12182252.2T
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English (en)
Inventor
Masafumi Matsuo
Yasuhiro Takeshima
Makoto Koizumi
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Daiichi Sankyo Co Ltd
Orphan Disease Treatment Institute Co Ltd
Original Assignee
Daiichi Sankyo Co Ltd
Orphan Disease Treatment Institute Co Ltd
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Publication date
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Abstract

Un compuesto capaz de inducir el salto del exón 50 del gen de la distrofina, que es (a) un oligonucleótido que consiste en la secuencia de nucleótidos mostrada en una cualquiera de las SEC ID Nº 41, 40, 42, 43, 46, 44 y 45, donde al menos uno de los azúcares que constituyen el oligonucleótido está modificado, y donde dicho azúcar es Dribofuranosa y al menos una modificación de dicho azúcar es 2'-O,4'-C-alquilenación de la D-ribofuranosa, o (b) un compuesto representado por la fórmula general (IV'') o (V'') o una sal farmacológicamente aceptable del mismo, donde dichas fórmulas generales se definen del siguiente modo: BT"4-BM"4-BB"4 (IV") donde BT"4 es un grupo representado por uno cualquiera de los siguientes (4a") a (4j"): (4a")HO-, (4b")HO-Ba-, (4c")HO-Bc-Ba-, (4d")HO-Bt-Bc-Ba-, (4e")HO-Bg-Bt-Bc-Ba-, (4f')HO-Bg-Bg-Bt-Bc-Ba-, (4g")HO-Ba-Bg-Bg-Bt-Bc-Ba-, (4h")HO-Bt-Ba-Bg-Bg-Bt-Bc-Ba-, (4i")HO-Bc-Bt-Ba-Bg-Bg-Bt-Bc-Ba-, o (4j")HO-Bg-Bc-Bt-Ba-Bg-Bg-Bt-Bc-Ba- BM"4 es un grupo representado por la siguiente fórmula (4"): -Bg-Bg-Bc-Bt-Bg-Bc-Bt-Bt-Bt- (4") BB"4 es un grupo representado por uno cualquiera de los siguientes (104a") a (104j"): (104a")-CH2CH2OH, (104b")-Bg-CH2CH2OH, (104c")-Bg-Bc-CH2CH2OH, (104d")-Bg-Bc-Bc-CH2CH2OH, (104e")-Bg-Bc-Bc-Bc-CH2CH2OH, (104f")-Bg-Bc-Bc-Bc-Bt-CH2CH2OH, (104g")-Bg-Bc-Bc-Bc-Bt-Bc-CH2CH2OH, (104h")-Bg-Bc-Bc-Bc-Bt-Bc-Ba-CH2CH2OH, (104i")-Bg-Bc-Bc-Bc-Bt-Bc-Ba-Bg-CH2CH2OH, o (104j")-Bg-Bc-Bc-Bc-Bt-Bc-Ba-Bg-Bc-CH2CH2OH donde Bg es un grupo representado por la siguiente fórmula (G1) o (G2); Ba es un grupo representado por la siguiente fórmula (A1) o (A2); Bc es un grupo representado por la siguiente fórmula (C1) o (C2); y Bt es un grupo representado por la siguiente fórmula (U1) o (T2):**Fórmula**

Description

Fármacos de ácido nucleico ENA que modifican el corte y empalme en precursores de ARNm
5 Campo técnico
La presente invención se refiere a agentes farmacéuticos de ácido nucleico ENA capaces de modificar el corte y empalme de precursores de ARNm. Más especificamente, la presente invención se refiere a compuestos de oligonucleótido antisentido para secuencias potenciadoras del corte y empalme en el exón 50 del gen de la distrofina, asi como agentes terapéuticos para la distrofia muscular que comprenden los compuestos.
Técnica antecedente
La distrofia muscular, que es una enfermedad muscular genética, se dasifica de forma aproximada en distrofia
15 muscular de Ouchenne (oMO) y distrofia muscular de Becker (BMO). La oMo es la enfermedad muscular genética que aparece más frecuentemente y sucede en una proporción de 1 por 3.500 nacimientos de varones. Los pacientes de DMD muestran sintomas de debilitación de los músculos en su niñez; después de ello, la atrofia muscular progresa de forma constante y provoca la muerte a la edad de aproximadamente 20. Actualmente, no existe agente terapéutico eficaz para OMo. El desarrollo de agentes terapéuticos está fuertemente demandado por pacientes con DMD en todo el mundo. La BMD en muchos casos sucede en la adultez y la mayoria de los pacientes son capaces de una supervivencia normal aunque se observa ligera debilitación de los músculos. Se han identificado mutaciones de deleciones en el gen de la distrofina en 2/3 casos de oMo y BMO. El progreso de los síntomas clinicos en pacientes con DMO o BMO es predecible dependiendo de si dichas deleciones alteran la fase de lectura traduccional del ARNm o mantienen esa fase de lectura (Monaco A.P. et al., Genomics 1988: 2:90-95). Aunque la biologia
25 molecular para comprender la oMo se ha profundizado de este modo, aún no se ha establecido un método eficaz para tratar la DMD.
Cuando los pacientes de DMO tienen una mutación de desplazamiento de fase, la proteina distrofina desaparece completamente de los músculos esqueléticos de los pacientes. Por otro lado, la proteina distrofina se produce a partir de ARNm en fase en tejidos musculares derivados de pacientes con BMo, aunque la proteina está incompleta. Como método para tratar la oMO, se conoce un método en que una mutación fuera de fase (la fase de lectura de aminoácidos está desplazada) se convierte en una mutación en fase (la fase de lectura se mantiene) modificando el ARNm de la distrofina (Matsuo M., Brain Dev 1996; 18:167-172). Recientemente, se ha informado de que el ratón mdx sintetizaba una dislrofina que contiene deleción como resultado de la inducción de salto de exón con un
35 oligonucle6tido complementario a la secuencia consenso de corte y empalme del gen de la distrofina (Wilton S.O. et al., Neuromusc Oisord 1999: 9:330-338; Mann C.J. et al., Proc Natl Acad Sci USA 2001: 98:42-47). En estos estudios, el salto de exón se induce usando como diana la secuencia consenso de corte y empalme localizada en el limite entre dos exones.
Se asevera que el corte y empalme está regulado por secuencias potenciadoras de corte y empalme (SES). De hecho, se ha demostrado que alterando las SES en el exón 19 del gen de la distrofina con un oligonucleótido antisentido complementario al mismo, sucede un salto completo del exón 19 en células linfoblastoides normales (Takeshima Y et al., J Glin Invest 1995: 95:515-520; Pramono lA et al., Biochem Biophys Res Gommun 1996: 226:445-449).
45 También se ha informado de que introduciendo un oligonucleótido complementario a la SES en el exón 19 del gen de la distrofina para inducir de este modo el salto de exón, se producía satisfactoriamente una distrofina que contiene delecíón en células musculares derivadas de pacientes con OMO que portan deleción del exón 20 (Takeshima Y et al., Brain & Oevelopment 2001: 23:788-790; publicación de patente japonesa no examinada N° H11-140930; publicación de patente japonesa no examinada N° 2002-10790). Esto indica que reparando el desplazamiento de la fase de lectura induciendo un salto del exón 19 con un oligonucleótido antisentido complementario a la SES en el exón 19 del gen de la distrofina se provoca la producción de una proteina distrofina cuya función está parcialmente restaurada; y por tanto es posible cambiar de DMD a BMO. Si es posible convertir la OMO, una miostrofia grave, en BMO ligera, puede esperarse prolongar las vidas de los pacientes.
Actualmente, se están desarrollando análogos oligonucleotidicos que tienen actividad antisentido estable y excelente (publicación de patente japonesa no examinada N° 2000-297097).
El documento EP-A-1 160 318 describe oIigonucleótidos antisentido propuestos para tratar la distrofia muscular de Duchenne relacionada con los exones adyacentes al exón 43 o 53. Aartsma-Rus et al. (2002) Neuromuscular Disorders 12-S71-S77 analizan terapias de corrección génica dirigidas a la restauración de la fase de lectura en pacientes con distrofia muscular de Ouchenne. El documento WO 2004/083446 describe métodos para generar oligonucleótidos con que puede saltarse un exón en un pre-ARNm y por tanto para excluirse de un ARNm producido del mismo. El documento EP-A-1 191 098 describe un AON que representa la secuencia potenciadora de corte y 65 empalme en el exón 45 del gen humano de la distrofina, y sugiere su uso en la preparación de un oligonucleólido antisentido para su uso en la inducción del salto del exón 45. Mann et al (2002) J Gene Med 4: 644-654 describe
sallo de exon inducido por oligonudeótido antisentido en el modelo de ratón mdx de distrofia muscular. HOlding et al (1993) J Med Genet 30: 903-909 describe métodos para diagnóstico preimplantacional de distrofia muscular de Duchenne.
5 Un objeto de la presente invención es proporcionar agentes terapéuticos con rango de aplicación más amplio y mayor eficacia, mejorando los oligonucleótidos antisentido para la SES en el exón 50 del gen de la distrofina.
Descripción de la invención
10 Como resultado de investigaciones extensivas e intensivas hacia la consecución del objeto descrito anterionnente, los presentes inventores han conseguido diseñar y sintetizar esas secuencias de nucleótidos y compuestos de oligonucleótido antisentido que tienen mayor efecto de salto de exón sobre el exón 50 del gen de la distrofina. Por tanto, la presente invención se ha conseguido.
15 La presente invención puede resumirse del siguiente modo. 11] Un compuesto capaz de inducir el salto del exón 50 del gen de la distrofina, que es (a) un oligonucle6tido que consiste en la secuencia de nucleótidos mostrada en una cualquiera de las SEC ID N° 41, 40, 42, 43, 46, 44 Y 45, donde al menos uno de los azúcares que constituyen el oligonucleótido está modificado, y donde dicho azúcar es Dribofuranosa y al menos una modificaci6n de dicho azúcar es 2'-0,4'-C alqu ilenación de la D-ribofuranosa, o (b) un
20 compuesto representado por la fórmula general (IV") o (V") o una sal fannacol6gicamente aceptable del mismo, donde dichas fónnulas generales se definen del siguiente modo:
25 donde Br4 es un grupo representado por uno cualquiera de los siguientes (4a") a (4j"):
(4a")HO-, (4b")HO-Ba-, (4c")HO-Bc-Ba-, (4d")HO-Bt-Bc-Ba-, (4e")HO-Bg-Bt -Bc-Ba-, (4f)HO-Bg-Bg-Bt-Bc-Ba-,
30 (4g")HO-Ba-Bg-Bg-Bt-Bc-Ba-, (4h")HO-Bt-Ba-Bg-Bg-Bt-Bc-Ba-, (4i")HO-Bc-Bt-Ba-Bg-Bg-Bt-Bc-Ba-, o (4j")HO-Bg-Bc-Bt-Ba-Bg-Bg-Bt-Bc-Ba
BM-4 es un grupo representado por la sigu iente fónnula (4"): -Bg-Bg-Bc-Bt-Bg-Bc-Bt-Bt-Bt-(4") Be-4 es un grupo representado por uno cualquiera de los siguientes (104a") a (104j"):
(104a"}-CH2CH2ÜH, (1 04b"}-Bg-CH2CH2ÜH, (1 04c"}-Bg-Bc-CH2CH20H, ( 1 04d"}-Bg-Bc-Bc-CHzCH.2ÜH, (1 04e")-Bg-Bc-Bc-Bc-CHzCHzOH , (1 04f")-Bg-Bc-Bc-Bc-Bt -CHzCH.2ÜH, (1 04g"}-Bg-Bc-Bc-Bc-Bt-Bc-CHzCHzOH, ( 1 04h"}-Bg-Bc-Bc-Bc-Bt-Bc-Ba-CHzCHzOH,
40 (104i")-Bg-Bc-Bc-Bc-Bt-Bc-Ba-Bg-CH2CH.2ÜH, o (1 04j")-Bg-Bc-Bc-Bc-Bt -Bc-Ba-Bg-Bc-CHzCH.2ÜH
donde Bg es un grupo representado por la siguiente fórmula (G1) o (G2); Ba es un grupo representado por la siguiente fónnula (A1) o (A2); Bc es un grupo representado por la siguiente fónnula (C1) o (C2); y Bt es un grupo 45 representado por la siguiente fónnula (U1) o (T2):
( G2)
(G 1)
~{D
(A2)
CA 1)
,
x y
I
(C2 )
(e 1)
H'C~
NH
lL./NAo
(U 1)
(T 2)
x o
I
5 donde X es individual e independientemente un grupo representado por la siguiente fónnula (XI) o (X2):
I O I
O I
I
S=P-OH
(X 2)
O=P-OH
(X 1)
I
I
O
O I
I
y es individual e independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo hidroxilo o un grupo alcoxi con 1-6
10 átomos de carbono; y Z es individual e independientemente un enlace sencillo o un grupo alquileno con 1-5 átomos de carbono; con la condición de que al menos uno de los nucleósidos que constituyen el compuesto representado por la fórmula (IV") tenga un grupo 2'-Q,4'-C-alquileno.
15 Br s-BM-s-BB-S (V")
donde 81"5 es un grupo representado por uno cualquiera de los siguientes (5a~) a (Si"):
(5a")HO-, (5b")HO-Ba-,
20 (Sc")HO-Bg-Ba-, (Sd")HO-Bg-Bg-Ba-, (5e")HO-Ba-Bg-Bg-Ba-, (Sr)HO-Bc-Ba-Bg-Bg-Ba-, (Sg")HO-Bc-Bc-Ba-Bg-Bg-Ba-, (ShN)HO-Bt-Bc-Bc-Ba-Bg-Bg-Ba-, (Si")HO-Bg-BI-Bc-Bc-Ba-Bg-Bg-Ba-, o (SnHO-Ba-Bg-BI-Bc-Bc-Ba-Bg-Bg-Ba
BM"s es un grupo representado por la sigu iente fórmula (5~): -Bg-Bc-BI-Ba-Bg-Bg-Bt-Bc-Ba-(S") Be"s es un grupo representado por uno cualquiera de los siguientes (105a") a (10Sn:
(105a"}-CH2CH2ÜH, (1 05b"}-Bg-CH1CH2ÜH, (1 05c")-Bg-Bg-C HzCHzOH, ( 1 05d")-Bg-Bg-Bc-CHzCH2ÚH, (1 05e")-Bg-Bg-B c-Bt-CHzCHzOH, (1 05f)-Bg-Bg-Bc-Bt-Bg-CHzCH2ÚH, (1 05g")-Bg-Bg-B c-Bt-Bg-Bc-CHzCH2ÜH, ( 1 05h"}-Bg-Bg-Bc-Bt -Bg-Bc-BI-CH2CH20H, (105i")-Sg-Sg-Sc-Bt-Bg-Bc-Bt-Bt-CH2CH20H, o (1 OSn-Bg-Bg-Bc-BI-Bg-Bc-Bt-BI-BI-CH2CH20H
donde 8g, Ba, BI Y Be son como se han definido anteriormente;
con la condición de que la menos uno de los nucleósidos que constituyen el compuesto representado por la
fórmula (V") tenga un grupo 2'-0,4'-C-alquileno;
[2] El compuesto de 11] anterior o una sal farmacológicamente aceptable del mismo, donde al menos uno de los fosfatos que constituyen el oligonucle6tido está modificado. 13] El compuesto de 11] o [2] anterior o una sal farmacológicamente aceptable del mismo, que comprende adicionalmente 2'-O-alquilación de la O-ribofuranosa. [4[ El compuesto de [2[ anterior o una sal farmacológicamente aceptable del mismo, donde la modificación del fosfato es tioación del grupo fosfato. 15] El compuesto de acuerdo con uno cualquiera de (1] a [4] anterior, que está representado por una cualquiera de las fórmulas seleccionadas entre el grupo que consiste en
HO_Gmp_Gmp _e2P¡"2p-G"'"_Cmp _ r 2p _T"2p_Ump_Gmp-Ce2p_C""'_Cmp _1"2p_ce2p_Amp_Gmp_Ce2p-CH2CH20H ; HO_Gmp_ Ce2P _T"2P-Amp-Gmp_Gmp _T"2P_Ce2P-Amp_Gmp_Gmp _Ce2P _r 2P_Gmp_Cmp _1""2¡:I_r 2P_Ump-CH2CH2ÜH; HO_Gmp_Gmp_Celp _ r lP_Gmp_Cm?_T'" p_1"IP_Ump_Gmp_Cel?_Cmp_Cmp _T"IP_Ce,p-Amp_Gmp-C..IP -CH2CH20H; HO_Gmp_Cel?_1"IP -A elp_Gmp_ Gmp _r 'p_Celp-A mp _Gmp_Gmp_Celp _-relp_Gmp -C"'? _r 'p_r lp_Ump-CH2CH20H; HO_GIDS _Gms _Ce2¡:l_r 2P_Gms _C"'s_r 2¡:l_ r lp-U"'"_Gm~_C..2p-C"'~-C"'"_r ?p_C..2p-Am~_Gm~_C~?p-CHOCH20H; HO_Gm~_C~?p_r lp-Am~_Gm~_Gm~_r ;):P_CA?p-Am"_ Gm$_GITlS_Ce2p _1"2p_Gms_Cm$_T"2p_r 2p_tf's -CH2CH20 H; HO_GITlS_Gm$_CelP _T"'P_Gm$_C"'s_1"lP _T"'P_Um$_Gms_CeIP_ ITlS _r lp_Cel p -A ms _GITlS_Ce,p-CH2CH20H; HO_GITlS_Ce,p_r 'p-A ms _CITlS_Gms _r 'p_Ce,p-A ms _Gms_GITlS_Ce,p_r lp-ITlS _r lp _r lp_Ums-CH2CH20H; HO_Gms_Gms_Ce2s _r 2S _Gms _cns_r 2S _~-U"" _GITlS_Ce2$_cns_cns _1""2S _Ce2s_ Am$_GITlS_Ce2s-CH2CH2ÜH; HO_Gms_Ce2s _1"2s-Ams_Gms_Gms _1"2$_C..2$ -A lTlS_Gms_GITlS_Ce2s _1"2$_GITlS_C"'s_1"2$_T"2$_ Um•-CH2CH20H: HO-G"'" _Gm•_Ce,.-1""'. -G"'" _Cm._T"I._r la -tr·-G"'"_Cela-C"'._C"'. _1""'. _Ce,. -A ma._Gm•_Ce'._ CH2CH20 H; HO_Gm$_Cels _T"IS -A m$ -G"'" _Gm$_T"'$_Cels-A m$ _GITlS_Gm$_Cels _T"'s_Gms _Cm$_T"IS _T"IS _Um$_ CH2CH20H; HO-Amp_Gmp _r 2P_Ce2¡:l_Ce2P-Amp_Gmp _Gmp-Ae2p-G"'" _Ce2¡) _ r 2P-Amp_Gmp_Gmp _r 2P_Ce2¡)-Amp_
p_Gmp T"'P_Celp-Amp
CH2CH20H; HO-Amp_Gmp _r 'p_Celp_Ce,p-Amp_Gmp _Gmp-A el p -G"'" _Celp _T"'P-Amp_Gm_ _ CH2CH20 H; HO-Ams_GITlS _1"2p_Ce2p_Ce2p-AlTlS_Gms_GITlS-A e2p_GITlS_Ce2p _1"2p-Ams_Gm$_Gms _1"2p_Ce2p-Ams_ CH2CH20 H; HO-Ams_GIllS _r Ip_CeIP_CeIP-Ams_Gms_GIllS-Ae,p_Gms_Ce,p_1""Ip-AlllS_Gms_Gms_LeIp_CeIP-Ams_ CH2CH20H; HO-A ms _GIDS _~_Ce2s _Ce2s-A ms _GIDS _Gms-A..2s _GIDS _Ce2$_r 2s-A ms _Gms_Gms _rzs_Ce2s-A ms_ CH2CH20H; HO-Ams_Gms _1"1$ _cel$_Cels -Ams_GITlS_Gm$ -A ..1$ _Gms_Cels _T'lS -A m$ _Gms _Gm$_1"15_Cels -Ams_ CH2CH20H HO-Amp_Ce2p_Ce2p-G"'" _Cmp_Ce2!>_T"2p_Ump-C"'P_Ce2p-Amp-C"'P_T"2p_Ce2!>-A"'" _Gmp-Ae2p-G"'" _ CH2CH20 H; y HO-Ams_Ce2s_Ce2s_Gms_C"'5_Ce2s_1"2$ _Ums_Cm$_Ce2$ -A lTlS_Cm$_T"2$_Ce2s-A m$ -G"'" -A e3s_Gms_
CH2CH20 H;
_~~~~~~~~~r~~~~~~~~~~ AIDS , Gms, C'ms, y i.r s s~n g~pos que ti~nen I~s siguientes e~truct~ras, 'resp~ctiva~ent~: ' , , , ,
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~Nx) ~O..J N 't:=t
(Aa 'B )
I
S=P-OH
I
0,
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H,C-..)l.NH
l~)."o
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<NH, N:6
H eH' N
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O,
I °NH
H'C'C N)..,O
~
,
°
S=P-OH
,
0,
(U "'" )
o una sal farmacológicamente aceptable de los mismos: 5 [6] El compuesto de acuerdo con [5] donde dicha fórmula se selecciona entre HO_Gmp_G"'Il_C'~2P_r'2P_Gmp_Cmp_
HO_Gmp_Cc2p r 2p_Cc2P
T"2p_T"2p·Ump_Gmp_Cc2¡>_Cmp_Cmp _T"2P_Cc2p-Amp_Gmp_Cc2p-CH2CH20 H; _r 2p-Amp-G"'I>_Gmp _ _
Amp_Gmp_Gmp_Ce2p r 2p_Gmp _Cmp 1"2p -r2p_Ump-CH2CH20 H· HO_Gms_Gms_Ce2s 1"2s
_ _ _ _1"21. _Gms_C"'s_ _1"2s_U"'s_Gms_Ce2s_ Cm$ _Cm$_~2$_CEl2$ -A m$ _Gm$_CEl 2$.-CH1CH2ÜH; HO_Gm$ _CElÜ_~2$-Am$_G M$_Gm$_~2$._CEl2$.-Am$_Gm$_Gm$_CEt2$_ru_Gm$_ Cm$ _~_r 2s_Um$ -CH2CH20H· HO-A mp_Gmp _rz.._Ce2p-Ce2p-Amp_Gmp _Gmp-Ae2p_Gmp_Ce2P _r 2p-Amp-G"'I>_Gmp _r 2pCe2p-A mp -CH2CHOH; HO-Am$_Gms _1"2s_Ce2s_Ce2,.-Ams_Gm$_Gms-Ae2s_Gm$_Ce15 _1"21.-Am$_Gms_Gm$_T"2s_Ce15-Ams_ CH2CH20H; HO-A'"P_C.,21'_C~2P-G"'I'_C'nl' _C~2P_1"21'_U"lI'-C"'P_C~2P-A"'I'_C'nl' _ r 2P_C~2P-A"'P-G"'p -A d I>-G"'p-CH2CH20 H; y HO-A m$_Ce2$. _Ce2$. _Gm$_C"'s_Ce2s _r 2s_Um$-C"'$ _Ce2$ -A ms_Cm$_r2$_Ce2$-Am$_Gm$-Ae2$_Gm$ -CH2CH2H.
[7] Un agente terapéutico para la distrofia muscular, que comprende el compuesto de uno cualquiera de [1] a [6] anterior o una sal farmacológicamente aceptable del mismo.
[8] El agente terapéutico de [7] anterior, cuya diana de tratamiento es aquellos pacientes en que la cantidad total de los aminoácidos en la fase de lectura abierta del gen de la distrofina será un múltiplo de 3 cuando el ex6n 50 del gen de la distrofina se ha saltado.
[9] Un compuesto de acuerdo con uno cualquiera de [1] a [6] anterior o un agente terapéutico de acuerdo con [7] u [8] anterior para su uso en el tratamiento de la distrofia muscular.
[10] Uso de un compuesto de acuerdo con uno cualquiera de [1] a [6] anterior en la fabricación de un medicamento para tratar la distrofia muscular.
[11] Uso de acuerdo con [10] anterior, donde la diana de tratamiento es aquellos pacientes en que la cantidad total de los aminoácidos en la fase de lectura abierta del gen de la distrofina será un múltiplo de 3 cuando el exón 50 del gen de la distrofina se ha saltado.
[12] Un agente terapéutico de acuerdo con [7] u [8], un compuesto o agente terapéutico de acuerdo con [9] anterior o un uso de acuerdo con [10] u [11] anterior donde dicha distrofia muscular es distrofia muscular de Ouchenne.
El término "oligonucleótido" usado en la presente invención abarca no solamente oligo ADN u oligo ARN, sino también un oligonucleótido en que al menos una D-ribofuranosa que constituye el oligonucleótido está 2'-0alquilada; un oligonucleótido en que al menos una D-ribofuranosa que constituye el oligonucle6tido está 2'-O,4'-Calquilenada; un oligonucle6tido en que al menos un fosfato que constituye el oligonucleótido está tioado; o una combinación de los mismos. Dichos oligonucle6tidos en que al menos una D-ribofuranosa que constituye el oligonucleótidos está 2'-O-alquilada o 2'-0,4'-C-alquilenada tiene elevada fuerza de unión a ARN y elevada resistencia a nucleasa. Por tanto, se espera que produzcan mayores efectos terapéuticos que los nucleótidos naturales (es decir aligo AON u aligo ARN). Además, un oligonucleótido en que al menos un fosfato que constituye el oligonucleótido está tioado también tiene elevada resistencia a nucleasa y, por tanto, se espera que produzca mayor efecto terapéutico que los nucleótidos naturales (es decir oligo ADN u oligo ARN). Un oligonucleótido que comprende tanto el azúcar modificado como el fosfato modificado como se ha descrito anterionnente aún tiene mayor resistencia a nucleasa y, por tanto, se espera que produzca aún mayor efecto terapéutico.
Con respecto al oligonucleótido de la presente invención, ejemplos de la modificación del azúcar incluyen, aunque sin limitación, 2'-O-alquilación (por ejemplo, 2'-O-metilación, 2'-O-aminoetilación, 2'-O-propilación, 2'-O-alilación, 2'O-metoxietilación, 2'-O-butilación, 2'-0-pentilación, o 2'-O-propargilación) de D-ribofuranosa; 2'-0,4'-C-alqu ilenación (por ejemplo, 2'-0,4'-C-etilenación, 2'-0,4'-C-metilenación, 2'-0,4'-C-propilenación, 2'-0,4'-C-tetrametilación o 2'O,4'-C-pentametilación) de D-ribofuranosa; 3'-desoxi-3'-amino-2'-desoxi-D-ribofuranosa; y 3'-desoxi-3'-amino-2'desoxi-2'-fluoro-D-ribofuranosa.
Con respecto al oligonucleótido de la presente invención, ejemplos de la modificación del fosfato incluyen, aunque sin limitación, fosforotioato, metilfosfonato, metiltiofosfonato, fosforoditioato y fosforoamidato.
Con respecto a Y en las fónnulas (G1), (A1), (C1) y (U1), ejemplos del grupo alcoxi con 1-6 átomos de carbono incluyen, aunque sin limitación, grupo metoxi, grupo aminoetoxi, grupo propoxi, grupo aliloxi, grupo meloxieloxi, grupo butoxi, grupo pentiloxi, y grupo propargiloxi.
Con respecto a Z en las fórmulas (G2), (A2), (C2) Y (T2), ejemplos del grupo alquileno con 1-5 átomos de carbono incluyen, aunque sin limitación, grupo metileno, grupo etileno, grupo propileno, grupo tetrametileno y grupo pentametileno.
Ejemplos preferibles del compuesto representado por la fórmula general (IV") incluyen los siguientes compuestos.
(IV"-1 )HO_Gmp _Gmp _Ce2p 1"2p _r 2l> _Gmp_Cmp _ _r 2p-U"'P_Gmp _Ce2p_Cmp-C"'P_T"2p_Ce2p-A mp _Gmp_Ce2p-CH2 CH,2ÜH; (IV"_
p
2)HO_Gmp_Ce2P _r 2l> -Amp_Gmp_Gm_rz.._Ce2P-Amp-G"'I>_Gmp_Ce2p _T e2P-G"'I>_Cmp _r 2p_r 2P_Ump-CH2CH2ÚH; (IV" -3)HOGmp-G"'I>_Celp_r lp_Gmp_Cmp _rl p_r lp_Ump_Gmp_Celp-C"'P _Cmp _rl p_Cel p -A mp_Gmp_Cel p -CH2CH20H; (IV" -4 )HO-G"'I>_Cel P_ lp_Celp-Amp_Gmp_Gmp _Celp lp _Gmp_Cmp r lp $_Gm$_Ce2P
lp-A mp _Gmp_Gmp _r _r _ _r lp-U"'P -CH2CH20H; (JV" _5)HO_Gm_r 2pGm~_Cm <_ r 2p_r 2p-U"'~-G"'" _C~'r_Cm~_Cm~_r 2p_C~'r-Am~_Gm<_C"'r-CH2CH20 H; (IV" -6 )HO_Gm<_C"2p_r 'r-Am"_G"'"_Gm~_ 1"2p_Ce2p_Ams _Gms_Gms_Ce2p_r 2p_Gms _C"'s_1"2p_r 2p_Ums_CH2C H20 H; (IV" _7)HO_Gms_Gms_CelP _1"1P_GmS_Cm.._T"lP_1"1P _ Um$_Grn$_Calp_Cm$_Cm$_relp_Celp-Am$_Gms_Celp-CH2CH20H; (JV"_8)HO_Gm$_Celp _r lp-Am$_Gm$_Gm$_r lp_Cel p -A ms_Gms_ Gm$_Ce lp _r lp _Gm$_C"'s_relp _r lp _Um$ -CH2CH20H; (IV" _9)HO_Gm$_Gm$_Ce2$_r 2$_G ms_Cm$_~_r2$_Um$_G ms_Ce2$_Cm$_ Cms 1"2s_Ce2s-Ams_Gms_Ce2s-CH2CH,2ÜH; 1"15_Ce2s-Ams_Gms_Gms_Ce2s -r2s_Gms
_ (IV"-1 O )HO_Gms_Ce2s _1"2s-Ams_Gms_Gms _ _ _ Cms _r 2S _T"2S_Ums-CH2CH20H; (IV"-11 )HO_Gms_Gm$_Cels _T"lS_Gm$_C"'s_relS _T"lS_Ums_Gms_Cels_C"'s_Cms _T"1S_Ceb-Ams_ Gm$_Cel$ -CH02CH2ÜH; (IV" _12)HO_Gms_Cel$_r 1s-Arn$_G m$_Gm$_r l $ _Cel$ -A m$_Gm$_G ms_Ceh _r l $ _Gm$_C"'s_r l $_r l $_
m
u $ -CH2C H20H. Son especialmente preferibles (IVH-' ), (IVH-2), (IVH-9) y (IVH-, O).
Ejemplos preferibles del compuesto representado por la fórmula general (V") incluyen los siguientes compuestos. (VH-1 )HO-A mp_Gmp _r'2P_C'~lP_CelP-Amp_Gmp _Gmp-Aelp_Gmp_CelP_r'lP-Amp_Gmp_Gmp _r'lP_CelP-Amp-CHl CHz{)H; (V"-2)HO
5 Amp_Gmp _T"lP_CelP _Ce1P-Amp-Gmp_Gmp-Aelp-Gmp_CelP _T"lP-Amp_Gmp_Gmp_T"lP _CelP-Amp-CH1CH10 H; (VH-3)HO-A ms _Gms_ 1"21'_C.,21'_C~2P_A<OS-G"'" _G<Os-A~2p_G'"'s_C.,2p _1"21'-A"'" _G'"'s-G"'"_r 21'_C.,21'_A'"'s-CH2CH20H; (V"'-4 )HO-A"'" -G'"'"_T"lP_C~l1'_ C'~lp-Am$_G ms_Gm$ -A elp_Gms_Celp_r'lp-Ams_G ms_Gms _r'lp_Celp-Am$-CH2CH20H; (VH-5)HO-Ams_Gm$_r'2S_Ce2s_Ce2$-Am$_
Gms_Gms-Ae2$_Gms_Ce2$_r 2s-Ams_Gms_Gms _1"2$_Ce2s-Ams-CHOCHOH; (V~-6)HO-A ms_Gms _1"lS_Ce1s_Cels -Ams_Gms_Gms _ Aels_G m$_C'~lS_l"ls_Ams_Gm$_G ms _l"'s_C'~lS_Ams-CH2CH20H. Son especialmente preferibles (V"-1) Y(VH_5).
10 , r 1p, Ae2p, Gelp, CelpEn la presente memoria descriptiva, Ae1P, Ge1p, Ce1p, r lp, Amp, Gmp, Cmp, Ump, Ae1s, Ge1s, Ce1s, l"ls, Ae2s , Ge2s, Ce2s, l"2S, Ams, Gms, Cms, trs y Ph son grupos que tienen las siguientes estructuras, respectivamente.
NH,
°
~N:C; ~N-{NH '8...l. N A -V0--S NH,
N
~ (A e1 P) 0--0 (G e1 p)
I I O-P-OH O-P-OH
I I
0, 0,
°
H3C~NH
'lÁ
'8°
O-O (T e1 P) I
O=P-OH
I
0,
NH2 °
(:() ~N:cr
N ~O~ N NH,
V0--S
(G -ezP )
~ (A0 2P) L"h6
I I
° °
O=P-OH O-P-OH
I I
0, 0,
NH,
M~+NH
~:Ó N~O A
~0----JN N N NH,
r OCH3 ( A mI»
O OCH3 (G"''' 1
I I
O=í-OH O=P-OH
I
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N
~ (A e2. )
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S~P-OH
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0,
o
<+NH
N--lA
~0')l
NNH,
~OCH3
(Gmo )
I
S= P-OH
I
O,
o
(Ph)
<)-O-~-O
-
I
La expresión "sal farmacológicamente aceptable del mismo" usada en la presente memoria descriptiva se refiere a sales del oligonucle61ido de la invención (por ejemplo, oligonucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos 5 mostrada en una cualquiera de las SEC ID N° 40 a 46) o sales de aquellos compuestos representados por las fórmulas generales (IV") y (V"). Los ejemplos de dichas sales incluyen sales de metales tales como sales de metales alcalinos (por ejemplo, sales de sodio, sales de potasio, sales de litio), sales de metales alcalino-térreos (por ejemplo, sales de calcio, sales de magnesio), sales de aluminio, sales de hierro, sales de zinc, sales de cobre, sales de níquel, sales de cobalto y similares; sales amina tales como sales inorgánicas (por ejemplo, sales de amonio), 10 sales orgánicas [por ejemplo sales de t-octilamina, sales de dibencilamina, sales de morfOlina, sales de glucosamina, sales de fenilglicina alqu il éster, sales de etilendiamina, sales de N-metilglucamina, sales de guanidina, sales de dietilamina, sales de trietilamina, sales de diciclohexilamina; sales de N',N'-dibenciletilendiamina, sales de cloroprocaina, sales de procaina, sales de dietanolamina, sales de N-bencil-fenetilamina, sales de piperazina, sales de tetrametilamonio, sales de tris(hidroximetil)aminometano] y similares; sales de ácidos inorgánicos tales como 15 sales de hidroácidos halogenados (por ejemplo, fluorhidratos, clorhidratos, bromhidratos, yodhidratos), nitratos, percloratos, sulfatos, fosfatos y similares; sales de ácidos orgánicos tales como sulfonatos de alcano inferior (por ejemplo, metanosulfonatos, trifluorometanosulfonatos, etanosulfonatos), aril sulfonatos (por ejemplo, bencenosulfonatos, p-toluenosulfonatos), acetatos, malatos, fumaratos, succinatos, citratos, tartratos, oxalatos, maleatos y similares; y sales de aminoácidos (por ejemplo, sales de glicina, sales de lisina, sales de arginina, sales
20 de ornitina, glutamatos, aspartatos). Estas sales pueden prepararse de acuerdo con métodos conocidos.
Debe apreciarse que los compuestos representados por las fórmulas generales (IV") y (V") pueden ex:istir como hidratos y que dichos hidratos también se incluyen en la presente invención.
25 El oligonucleótido de la invención, los compuestos representados por las fórmulas generales (IV") y (V") (a partir de ahora en este documento, mencionados como el "compuesto de la invención") y sales farmacológicamente aceptables de los mismos son eficaces como agentes farmacéuticos para tratar la distrofia muscular.
El compuesto de la invención puede sintetizarse en base al método descrito en la bibliografia (Nucleic Acids
30 Research, 12: 4539 (1984» usando un sintetizar comercial (por ejemplo, PerkinElmer Modelo 392 que emplea el método de fosforoamidita). En cuanto a los reactivos de fosforoamidita usados en la sintesis, están disponibles reactivos comerciales para nucle6sidos naturales y 2'-0-metilnucle6sidos (es decir 2'-0-metilguanosina, 2'-0metiladenosina, 2'-0-metilcitosina y 2'-O-metiluridina). En cuanto a 2'-O-alqu il-guanosina, -adenosina, -citosina y uridina donde el grupo alquilo tiene 2-6 átomos de carbono, pueden sintetizarse o adquirirse como se describe a
35 continuación.
2'-Q-aminoetil-guanosina, -adenosina, -citosina y -uridina pueden sintetizarse de acuerdo con Blommers et al., Biochemistry (1998), 37: 17714-17725.
40 2'-0-propil-guanosina, -adenosina, -citosina y -uridina pueden sintetizarse de acuerdo con Lesnik, EA et al., Biochemistry (1993), 32: 7832-7838.
2'-O-alil-guanosina, -adenosina, -citosina y -uridina están disponibles en el mercado.
2'-O-metoxietil-guanosina, -adenosina, -citosina y -uridina pueden sintetizarse de acuerdo con la patente de Estados Unidos N° 6261840 o Martin, P., Helv. Chim. Acta. (1995) 78: 486-504.
2'-O-butil-guanosina, -adenosina, -citosina y -uridina pueden sintetizarse de acuerdo con Lesnik, E.A. et al., Biochemistry (1993), 32: 7832-7838.
2'-O-pentil-guanosina, -adenosina, -citosina y -uridina pueden sintetizarse de acuerdo con lesnik, EA et al., Biochemistry (1993), 32: 7832-7838.
2'-O-propargil-guanosina, -adenosina, -citosina y -uridina están disponibles en el mercado.
2'-O,4'-C-metileno-guanosina, -adenosina, 5-metil-citosina y -timidina pueden sintetizarse de acuerdo con el método
15 descrito en el documento W099f14226. 2'-0,4'-C-alquileno-guanosina y -adenosina donde el grupo alquileno tiene 2-5 átomos de carbono, 5-metil-citosina y -timidina pueden sintetizarse de acuerdo con el método descrito en el documento WOOOf47599.
En la tioación de grupos fosfato, los derivados tioato pueden obtenerse en base a los métodos descritos en Tetrahedron letters, 32, 3005 (1991) Y J. Am. Chem. Soc., 112, 1253 (1990), usando azufre y un reactivo tal como disulfuro de tetraetiltiuram (TETO; Applied Biosystems) o reactivo de Beaucage (Glen Research) que reacciona con un fosfato trivalente para formar un tioato.
Con respecto al vidrio de poro controlado (DPG) usado en el sintetizador, el uso de un CPG modificado (descrito en
25 el Ejemplo 12b de la publicación de patente japonesa no examinada N° H7-87982) permite la síntesis de oligonucleótidos a los cuales se ha unido un grupo 2-hidroxietilfosfato en el extremo 3'. Además, el uso del modificador 3'-amino C3 CPG, modificador 3'-amino C7 CPG, Gliceril CPG (Glen Research), 3'-specer C3 SynBase CPG 1000 o 3'-specer C9 SynBase CPG 1000 (link Tectmologies) permite la síntesis de oligonucleótidos a los cuales se ha unido un grupo hidroxialquilfosfato o grupo aminoalquilfosfato al extremo 3'.
los compuestos de la presente invención y sales farmacológicamente aceptables de los mismos tienen un efecto de inducir el salto del exón 50 del gen de la distrofina. los compuestos de la invención representados por las fórmulas generales (IV") y (V") Y sales farmacológicamente aceptables de los mismos tienen elevada fuerza de unión a ARN y elevada resistencia a nucJeasa. Por lo tanto, los compuestos de la invención y sales farmacológicamente aceptables
35 de los mismos son útiles como agentes farmacéuticos para tratar la distrofia muscular.
Cuando el compuesto de la invención o una sal farmacológicamente aceptable del mismo se usa como agente terapéutiCO para la distrofia muscular, el compuesto o una sal farmacológicamente aceptable o éster del mismo puede administrarse por sí mismo. Como alternativa, el compuesto o una sal farmacológicamente aceptable o éster del mismo puede mezclarse con excipientes o diluyentes farmacológicamente aceptables apropiados, preparados en comprimidos, cápsulas, gránulos, polvos, jarabes, etc. y administrarse por via oral; o prepararse en inyecciones, supositorios, parches, medicinas extemas, etc. y administrarse por via parenteral.
Estas formulaciones pueden prepararse por métodos bien conocidos usando aditivos tales como excipientes
45 [excipientes orgánicos por ejemplo derivados de azúcar (tales como lactosa, azúcar blanco, glucosa, manitol y somitol), derivados de almidón (tal como almidón de maiz, almidón de patata, almidón a y dextrina), derivados de celulosa (tales como celulosa cristalina), goma arábiga, dextrano, pululano y similares; y excipientes inorgánicos por ejemplo derivados de silicato (tales como anhidrido de ácido silícico ligero, silicato de aluminio sintético, silicato de calcio y aluminato metasilícato de magneSiO), fosfatos (tales como hidrogenofosfato de calcio), carbonatos (tales como carbonato de calcio), sulfatos (tales como sulfato de calcio) y similares], lubricantes (por ejemplo, sales metálicas de ácido esteárico tal como ácido esteárico, estearato de calcio, y estearato de magnesio; talco; silice coloidal; ceras tales como cera de abejas y espermaceti; ácido bórico; ácido adipico; sulfatos tales como sulfato sódico; glicol; ácido fumárico; benzoato sódico; Dl leucina; lauril sulfatos tales como lauril sulfato sódico y lauril sulfato de magnesio; materiales de ácido silícico tales como anhidrido de ácido silícico y ácido silícico hidrato;
55 derivados de almidón mencionados anteriormente), aglutinantes (por ejemplo, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, polivinilpirrolidona, macrogol, compuestos enumerados anteriormente como excipientes), disgregantes (por ejemplo, derivados de celulosa tales como hidroxiprop ilcelulosa de baja sustitución, carboximetilcelulosa, carboximetilcelulosa de calcio, carboximetilcelulosa sódica reticulada de forma interna; almidones/celulosas modificadas químicamente tales como carboximetil almidón, carboximetil almidón sódico, polivinilpirrolidona reticulada), emulsionantes (por ejemplo, arcilla coloidal tal como bentonita, Veegum; hidróxidos metálicos tales como hidróxido de magnesio, hidróxido de aluminio; tensioactivos aniónicos tales como lauril sulfato sódico, estearato de calcio; tensioactivos catiónicos tales como cloruro de benzalconio; tensioactivos no iónicos tales como polioxietilen alquil éteres, ésteres de ácido graso de polioxietilen sorbitán, éster de ácido graso de sacarosa), estabilizantes (por ejemplo, ésteres de ácido paraoxibenzoico tales como metil parabeno, propil parabeno; alcoholes tales como
65 clorobutanol, alcohol bencílico, feniletil alcohol; cloruro de benzalconio; fenoles tales como fenol, cresol; timerosal; ácido deshidroacético; ácido sórbico), agentes aromatizantesJaromáticos (por ejemplo, edulcorantes usados de
forma convencional, acidificantes, aromáticos, etc.) o diluyentes.
El agente terapéutico de la presente invención comprende preferiblemente 0,05-5 ¡.unoleslml del compuesto de la invención o una sal farmacológicamente aceptable del mismo, el 0,02-10% p/v de carbohidratos o alcoholes 5 polihídricos, y el 0,01-0,4% p/v de tensioactivos farmacológicamente aceptables. Un intervalo más preferible para el contenido del compuesto de la invención o una sal farmacológicamente aceptable del mismo es 0, 1-1 ~moles/ml.
Para los carbohidratos anteriores, los monosacáridos yJo disacáridos son especialmente preferibles. Ejemplos de estos carbohidratos y alcoholes polihidricos incluyen, aunque sin limitación, glucosa, galactosa, manosa, lactosa, 10 maltosa, manitol y sorbitol. Éstos pueden usarse solos o en combinación.
Ejemplos preferibles de tensioactivos incluyen, aunque sin limitación, mono-a tri-ésteres de polioxietilen sorbitán, alquil fen il polioxietileno, taurocolato sódico, colato sódico y ésteres de alcoholes polihidricos. Son especialmente preferibles mono-a tri-ésteres de polioxietilen sorbitán, donde son ésteres especialmente preferibles oleatos,
15 lauratos, estearatos y palmitatos. Estos tensioactivos pueden usarse solos o en combinación.
Más preferiblemente, el agente terapéutico de la invención comprende 0,03-0,09 M de sal neutra farmacológicamente aceptable, por ejemplo cloruro sódico, cloruro de potasio y/o cloruro de calcio.
20 Aún más preferiblemente, el agente terapéutico de la invención puede comprender 0,002-0,05 M de tampón farmacológicamente aceptable. Ejemplos de tampones preferibles incluyen citrato sódico, glicinato sódico, fosfato sódico y tris(hidroximetil)aminometano. Estos tampones pueden usarse solos o en combinación.
El agente terapéutico descrito anteriormente de la invención puede suministrarse en estado de solución. Sin
25 embargo, considerando el almacenamiento del agente terapéutico durante algún periodo de tiempo, habitualmente, es preferible liofilizar el agente terapéutico con el fin de estabilizar el oligonucleótido antisentido y evitar de este modo la disminución de su efecto terapéutico. El agente terapéutico liofilizado puede reconstruirse con un liquido disolvente (por ejemplo, agua destitada para inyección) en el momento de uso, y usarse en estado de solución. Por tanto, el agente terapéutico de la invención abarca dicho agente terapéutico liofilizado a reconstruirse con un liquido
30 disolvente en el momento de uso de modo que los componentes individuales estén bajo intervalos de concentración específicos. Para potenciar la solubilidad del producto liofilizado, el agente terapéutico puede contener adicionalmente albúmina o aminoácidos tales como glicina.
Cuando el compuesto de la invención o una sal farmacológicamente aceptable del mismo se administra a seres
35 humanos, por ejemplo, el compuesto o sal puede administrarse por via oral o intravenosa a una dosis de aproximadamente 0,1-100 mg/kg de peso corporal por dia, preferiblemente 1-50 mg/kg de peso corporal por día para pacientes adultos una vez al dia o dividido en varias porciones. La dosis y la cantidad de veces de administración pueden cambiarse apropiadamente dependiendo del tipo de enfermedad, condiciones, la edad del paciente, la vía de administración, etc.
40 La administración del compuesto de la invención o una sal farmacológicamente aceptable del mismo a pacientes con DMD puede realizarse, por ejemplo, como se describe a continuación. En resumen, el compuesto de la invención o una sal farmacológicamente aceptable del mismo puede prepararse por métodos bien conocidos para los especialistas en la técnica, esterilizarse por métodos convencionales y después formularse en, por ejemplo, una
45 solución de inyección con una concentración de 1200 ~g/ml. Esta solución se suministra por goteo, por ejemplo, al paciente de forma intravenosa en forma de infusión de modo que el oligonucleótido antisentido se administra al paciente a una dosis de, por ejemplo, 20 mg/kg de peso corporal. Dicha administración puede repetirse, por ejemplo, 4 veces a intervalos de 2 semanas. Entonces, mientras se confirma el efecto terapéutico usando indicadores tales como la expresión de la proteína distrofina en tejidos de biopsia muscular, los niveles en suero de creatina quinasa y
50 los síntomas d íniCOS, este tratamiento se repite apropiadamente. Si se reconoce el efecto terapéutico y aún no se observan efectos secundarios definidos, se continúa este tratamiento; en principio, la administración se continúa toda la vida.
La presente memoria descriptiva incluye los contenidos descritos en las memorias descriptivas y/o dibujos de las 55 solicitudes de patente japonesa N° 2002-340857 Y N" 2003-204381 basadas sobre lo cual la presente solicitud reivindica prioridad.
Breve descripción de los dibujos
60 La Fig. 1 muestra los efectos de los compuestos de los Ejemplos 1 a 6 (A0108, A0109, A0110, A0111, A0112 y A0113) sobre el salto del exón 50. La Fig. 2 muestra los efectos de los compuestos de los Ejemplos 2, 4, 5 y 7 (A0109, A0111, A0112 y A0128) sobre el salto del exón 50.
Mejores modos de realizar la invención
A partir de ahora en este documento, la presente invención se descri bina específicamente con referencia a los siguientes Ejemplos. Estos Ejemplos se proporcionan solamente con fines ilustrativos, y no pretenden limitar la 5 presente invención.
(EJEMPLO DE REFERENCIA 1) Síntesis de hAON4
hAON4 [FAM-CUG CUU CCU CCAACC (SEC ID N° 23); todos los nucleótidos son 2'-O-metilnucle6tidos y estan
10 enlazados entre si por un enlace fosforotioato] que se describe en un documento (van oeutekom, J.C.T. et al. (2001) Hum. Mol. Genet. 10, 1547-1554) Y se conoce como un oligonucleótido que induce el salto del exón 46, se sintetizó de acuerdo con el documento anterior.
FAM es un grupo de fluorescencia con la siguiente estructura.
HO
COOH
":1
HN~.. S
-
~-JI-o
FA..,
(EJEMPLO DE REFERENCIA 2) Sintesis de hAON6
20 hAON6 [FAM-GUU AUC UGC UUC CUC CAA CC (SEC ID N° 24); todos los nucleótidos son 2'-O-metilnucleótidos y estan enlazados entre si por un enlace fosforotioato] que se describe en un documento (van Deutekom, J.C.T. et al. (2001) Hum. Mol. Genet. 10, 1547-1554) Y se conoce como un oligonucleótido que induce el salto del exón 46, se sintetizó de acuerdo con el documento anterior.
25 (EJEMPLO DE REFERENCIA 3)
hAON8 [FAM-GCU UUU CUU UUA GUU GCU GC (SEC ID N° 25); todos los nucleótidos son 2'-O-metilnucleótidos y estan enlazados entre sí por un enlace fosforotioato] que se describe en un documento (van Deutekom, J.C.T. et al. (2001) Hum. Mol. Genet. 10, 1547-1554) Y se conoce como un oligonucleótido que induce el salto del exón 46, se
30 sintetizó de acuerdo con el documento anterior.
(EJEMPLO DE REFERENCIA 4)
S intesis de HO_Gmp-A elp-Amp-Amp-Amp_Ce1P_Gmp-C"'P_Ce1P_Gmp-Cm¡> _C"1P-Amp_T"1P_Ump_Ump_Ce1P _r 2p-CH2CH20 H 35 (A0100)
El presente compuesto se sintetizó con un sintetizador automatico de ácidos nucleicos (sintetizador de AoN/ARN PerkinElmer ASI modelo 394) a una escala de 40 nmol. Las concentraciones de disolventes, reactivos y fosforoamidilas en ciclos individuales de sintesis fueron las mismas que las usadas en la sintesis de oligonucleótidos 40 naturales. Los disolventes, reactivos y fosforoamiditas de 2'-O-metilnucleósido (forma adenosina: producto N° 271822-41; forma guanosina: producto N° 27-1826-41; forma citidina: producto ND 27-1823-02; forma uridina: producto N° 27-1825-42) fueron productos de Amersham Pharmada. Como fosforoamiditas no naturales, se usaron aquellos compuestos descritos en el Ejemplo 55 (5'-O-dimetoxitritil-2'-0,4'-C-etileno-6-N-benzoiladenosina-3'-O-(2-cianoetil N,N-diisopropil)fosforoamidila), Ejemplo 68 (5'-O-dimetoxitritil-2'-0,4'-C-etileno-N-isobutililguanosina-3'-O-(2-cianoetil 45 N,N-diisopropil)fosforoamidita), Ejemplo 63 (5'-O-dimetoxitritil-2'-O,4'-C-etileno-4-N-benzoil-5-metiIcitidina-3'-O-(2cianoetil N,N-diisopropil)fosforoamidila), y Ejemplo 50 (5'-O-dimetoxitritil-2'-0,4'-C-etileno-5-metiluridina-3'-O-(2cianoetil N,N-diisopropil)fosforoamidita) de la publicación de patente japonesa no examinada N° 2000-297097. El presente compuesto se sintetizó en un vidrio de poro controlado modificado (CPG) (descrito en el Ejemplo 12b de la publicación de patente japonesa no examinada N° H7-87982) como soporte sólido. Sin embargo, el periodo de
50 tiempo para la condensación de amidilas fue de 15 mino
El analogo oligonucleotidico protegido que tiene la secuencia de interés se trató con amoniaco acuoso concentrado para cortar de este modo el 0lig6mero del soporte y, al mismo tiempo, retirar los grupos cianoetilo protectores en átomos de fósforo y los grupos protectores en bases de ácido nucleico. El disolvente se retiró por destilación a 55 presión reducida, y el residuo resultante se purificó por HPLC de fase inversa ]Shimadzu modelo LC-10VP; columna: Merck, Chromolith Performance RP-18e (4,6 x 100 mm); solución A: acetonitrilo al 5%, acetato de trietilamina acuoso 0,1 M (TEAA), pH 7,0; solución B: acetonitrilo B%: 10% ~45% (8 min, gradiente lineal); 60°C; 2 ml/min; 254 nm]. Se recogió la fracción eluida a 6,55 mino Después de retirar por destilación el disolvente a presión reducida, se añadió solución acuosa de ácido acético al 80% al residuo, que después se dejó durante 20 min para retirar el grupo 5 DMTr. Después de retirar por destilación el disolvente, el residuo resultante se disolvió en 0,5 mi de agua y se filtró con Ultrafree-MC (Millipore: producto N° UFC4 OHV 25). El disolvente se retiró por destilación para obtener de este modo el compuesto de interés (1,40 unidades ~60) (Amas (H20) = 264 nm). Cuando se analizó por HPLC de fase inversa [columna: Merck, Chromolith Performance RP-18e (4,6 x 100 mm); solución A: acetonitrilo al 5%, acetato de trietilamina acuoso 0,1 M (TEAA), pH 7,0; solución B: acetonitrilo al 25%, TEAA 0,1 M B%: 20% ~ 100% (10 min,
10 gradiente lineal); 6QoC; 2 mlfmin; 254 nm], el presente compuesto se eluyó a 5,40 minoEl compuesto se identificó por análisis espectrométrico de masas ESI de iones negativos (valor calculado: 6246,28; valor medido: 6245,68).
La secuencia de nucleótidos del presente compuesto es complementaria a los nucleótidos N°. 6555-6572 del ADNc de la distrofina (N° de acceso a Gene Bank NM_004006.1).
(EJEMPLO 1)
Síntesis de
(A010B)
El compuesto del Ejemplo 1 que tiene una secuencia de interés se sintetizó del mismo modo en que se sintetizó el compuesto del Ejemplo de referencia 4. Después de la desprotección, el producto resultante se purificó por HPLC de fase inversa [Shimadzu modelo LC-10VP; columna: Merck, Chromolith Performance RP-18e (4,6 x 100 mm); solución A: acetonitrilo al 5%, acetato de trietilamina acuoso 0,1 M (TEAA), pH 7,0; solución B: acetonitrilo B%: 10% 25 ~ 45% (8 min, gradiente lineal); 60OC; 2 ml/min; 254 nm]. Se recogió la fracción eluida a 6,74 mino Después de retirar el disolvente por destilación a presión reducida, se añadió solución acuosa de ácido acético al 80% al residuo, que después se dejó durante 20 min para retirar el grupo DMTr. Después de retirar por destilación el disolvente, el residuo resultante se disolvió en 0,5 mi de agua y se filtró con Ultrafree-MC (Millipore: producto N° UFC4 OHV 25). El disolvente se retiró por destilación para obtener de este modo el compuesto de interés (4,91 unidades A2GO) (Amax
30 (H20 ) = 263 nm). Cuando se analizó por HPLC de fase inversa [columna: Merck, Chromolith Performance RP-18e (4,6 x 100 mm); solución A: acetonitrilo al 5%, acetato de trietilamina acuoso 0,1 M (TEAA), pH 7,0; solución B: acetonitrilo al 25%, TEAA 0,1 M B%: 20% ~ 100% (10 min, gradiente lineal); 60OC; 2 mlimin; 254 nm), el presente compuesto se eluyó a 5,94 mino El compuesto se identificó por análisis espectrométrico de masas ESI de iones negativos (valor calculado: 6159,18; valor medido: 6159,35).
35 La secuencia de nucleótidos del presente compuesto es complementaria a los nucleótidos N° 7447-7464 del ADNc de la distrofina (N° de acceso a Gene Bank NM_004006.1).
(EJEMPLO 2)
S íntesis de HO-Amp_Ce2¡:I_Ce2¡:l_G mp -Cmp_Ce2¡:l_-ye2P_Ump-C"'P _Ce2P-Amp-C"'P _-ye2P_Ce2¡:l_Amp-Gmp-Ae2¡:l_G mp -CH2CH20H (A0109)
El compuesto del Ejemplo 2 que tiene una secuencia de interés se sintetizó del mismo modo que se síntetizó el
45 compuesto del Ejemplo de referencia 4. Después de la desprotección, el producto resultante se purificó por HPLC de fase inversa [Shimadzu modelo LC-10VP; columna: Mercl<, Chromolith Performance RP-18e (4,6 x 100 mm); solución A: acetonitrilo al 5%, acetato de trietilamina acuoso 0,1 M (TEAA), pH 7,0; solución B: acetonitrilo B%: 10% ~ 45% (8 min, gradiente lineal); 60OC; 2 ml/min; 254 nm]. Se recogió la fracción eluida a 6,72 mino Después de retirar el disolvente por destilación a presión reducida, se añadió solución acuosa de ácido acético al 80% al residuo,
50 que después se dejó durante 20 min para retirar el grupo DMTr. Después de retirar por destilación el disolvente, el residuo resultante se disolvió en 0,5 mi de agua y se filtró con Ultrafree-MC (Millipore: producto N° UFC4 OHV 25). El disolvente se retiró por destilación para obtener de este modo el compuesto de interés (3,30 unidades A260) (Amax (H20) = 261 nm). Cuando se analizó por HPLC de fase inversa [columna: Mercl<, Chromolith Performance RP-18e (4,6 x 100 mm); solución A: acetonitrilo al 5%, acetato de trietilamina acuoso 0,1 M (TEAA), pH 7,0; solución B:
55 acetonitrilo al 25%, TEAA 0,1 M B%: 20% ~ 100% (10 min, gradiente lineal); 60OC; 2 mlimin; 254 nm), el presente compuesto se eluyó a 5,53 mino El compuesto se identificó por análisis espectrométrico de masas ESI de iones negativos (valor calculado: 6221,27; valor medido: 6220,43).
La secuencia de nudeótidos del presente compuesto es complementaria a los nucleótidos N° 7465-7482 del ADNc 60 de la distrofina (N° de acceso a Gene Bank NM_004006.1).
(EJEMPLO 3)
Síntesis de 65 (A0110)
El compuesto del Ejemplo 3 que tiene una secuencia de interés se sintetizó del mismo modo que se sintetizó el compuesto del Ejemplo de referencia 4. Después de la desprotección, el producto resultante se purificó por HPLC de fase inversa [Shimadzu modelo LC-1QVP; columna: Merck, Chromolith Performance RP-18e (4,6 x 100 mm); solución A: acetonitrilo al 5%, acetato de trietilamina acuoso 0,1 M (TEAA), pH 7,0; solución B: acetonitrilo B%: 10% 5 -+ 45% (10 min, gradiente lineal); 60OC; 2 ml/min; 254 nm]. Se recogió la fracción eluida a 7,18 mino Después de retirar el disolvente por destilación a presión reducida, se añadió solución acuosa de ácido acético al 80% al residuo, que después se dejó durante 20 min para retirar el grupo DMTr. Después de retirar por destilación el disolvente, el residuo resultante se disolvió en 0,5 mi de agua y se filtró con Ultrafree-MC (Miliipore: producto N° UFC4 OHV 25). El disolvente se retiró por destilación para obtener de este modo el compuesto de interés (3,92 unidades A2GO) (Amax
10 (H20) = 258 nm). Cuando se analizó por HPLC de fase inversa [columna: Merck, Chromolith Performance RP-18e (4,6 x 100 mm); solución A: acetonitrilo al 5%, acetato de trietilamina acuoso 0,1 M (TEAA), pH 7,0; solución B: acetonitrilo al 25%, TEAA 0,1 M S%: 20% -+ 100% (10 min, gradiente lineal); 60OC; 2 mllmin; 254 nm], el presente compuesto se eluyó a 5,66 mino El compuesto se identificó por analisis espectrométrico de masas ESI de iones negativos (valor calculado: 6289,26; valor medido: 6288,99).
La secuencia de nucleótidos del presente compuesto es complementaria a los nucleótidos N° 7483-7500 del ADNc de la distrofina (N° de acceso a Gene Bank NM_004006.1).
(EJEMPLO 4)
r 2p
Síntesis de HO-Gmp_Gmp_Ce2p _r 2p-Gmp_Cmp _ _r 2p_Ump_Gmp_Ce2!>_Cmp_Cmp _r 2p_Ce2p-Amp_Gmp_Ce2p-CH2CH.¡ÜH (A01 11)
El compuesto del Ejemplo 4 que tiene una secuencia de interés se sintetizó del mismo modo que se sintetizó el
25 compuesto del Ejemplo de referencia 4. Después de la desprotección, el producto resultante se purificó por HPLC de fase inversa [Shimadzu modelo LC-10VP; columna: Merck, Chromolith Performance RP-18e (4,6 x 100 mm); solución A: acetonitrilo al 5%, acetato de trietilamina acuoso 0,1 M (TEAA), pH 7,0; solución B: acetonitrilo S%: 10% -+ 45% (8 min, gradiente lineal); 60°C; 2 ml/min; 254 nm]. Se recogió la fracción eluida a 5,91 mino Después de retirar el disolvente por destilación a presión reducida, se añadió solución acuosa de ácido acético al 80% al residuo,
30 que después se dejó durante 20 min para retirar el grupo DMTr. Después de retirar por destilación el disolvente, el residuo resultante se disolvió en 0,5 mi de agua y se filtró con Ultrafree-MC (Miliipore: producto N° UFC4 OHV 25). El disolvente se retiró por destilación para obtener de este modo el compuesto de interés (9.48 unidades A260) (I.max (H20) = 260 nm). Cuando se analizó por HPLC de fase inversa [columna: Merck, Chromolith Performance RP-18e (4,6 x 100 mm); solución A: acetonitrilo al 5%, acetato de trietilamina acuoso 0,1 M (TEAA), pH 7,0; solución B:
35 acetonitrilo al 25%, TEAA 0,1 M S%: 20% -+ 100% (10 min, gradiente lineal); 60OC; 2 ml/min; 254 nm], el presente compuesto se eluyó a 4,81 mino El compuesto se identificó por análisis espectrométrico de masas ESI de iones negativos (valor calculado: 6245,24; valor medido: 6244,86).
La secuencia de nucleótidos del presente compuesto es complementaria a los nucleótidos N° 7501-7518 del ADNc 40 de la distrofina (N° de acceso a Gene Bank NM_004006.1).
(EJEMPLO 5)
Sintesis de 45 H(A0112)
El compuesto del Ejemplo 5 que tiene una secuencia de interés se sintetizó del mismo modo que se sintetizó el compuesto del Ejemplo de referencia 4. Después de la desprotección, el producto resultante se purificó por HPLC de fase inversa [Shimadzu modelo LC-10VP; columna: Merck, Chromolith Performance RP-18e (4,6 x 100 mm); 50 solución A: acetonitrilo al 5%, acetato de Irietilamina acuoso 0,1 M (TEAA), pH 7,0; solución B: acetonilrilo S%: 10% -+ 45% (8 min, gradiente lineal); 60OC; 2 ml/min; 254 nm]. Se recogió la fracción eluida a 6,00 mino Después de retirar el disolvente por destilación a presión reducida, se añadió solución acuosa de ácido acético al 80% al residuo, que después se dejó durante 20 min para retirar el grupo DMTr. Después de retirar por destilación el disolvente, el residuo resultante se disolvió en 0,5 mi de agua y se filtró con Ultrafree-MC (Miliipore: producto N° UFC4 OHV 25). 55 El disolvente se retiró por destilación para obtener de este modo el compuesto de interés (0,200 unidades A2GO) (I.max (H20) = 253 nm). Cuando se analizó por HPLC de fase inversa [columna: Merck, Chromolith Performance RP-18e (4,6 x 100 mm); solución A: acetonitrilo al 5%, acetato de trietilamina acuoso 0,1 M (TEAA), pH 7,0; solución
B: acetonitrilo al 25%, TEAA 0,1 M S%: 20% -+ 100% (10 min, gradiente lineal); 60°C; 2 ml/min; 254 nm], el presente
compuesto se eluyó a 4,33 mino El compuesto se identificó por analisis espectrométrico de masas ESI de iones 60 negativos (valor calculado: 6365,37; valor medido: 6365,99).
La secuencia de nucleótidos del presente compuesto es complementaria a los nucleótidos N° 7518-7536 del ADNc de la distrofina (N° de acceso a Gene Bank NM_004006.1).
(EJEMPLO 6)
Sintesis de (A0113)
El compuesto del Ejemplo 6 que tiene una secuencia de interés se sintetizó del mismo modo que se sintetizó el compuesto del Ejemplo de referencia 4. Después de la desprotección, el producto resultante se purificó por HPLC de fase inversa [Shimadzu modelo LC-10VP; columna: Merck, Chromolith Performance RP-18e (4,6 x 100 mm); solución A: acetonitrilo al 5%, acetato de trietilamina acuoso 0,1 M (TEAA), pH 7,0; solución B: acetonitrilo B%: 10% -+ 45% (8 min, gradiente lineal); 60OC; 2 ml/min; 254 nm]. Se recogió la fracción eluida a 5,22 mino Después de retirar el disolvente por destilación a presión reducida, se añadió solución acuosa de ácido acético al 80% al residuo, que después se dejó durante 20 min para retirar el grupo DMTr. Después de retirar por destilación el disolvente, el residuo resultante se disolvió en 0,5 mi de agua y se filtró con Ultrafree-MC (Miliipore: producto N° UFC4 OHV 25). El disolvente se retiró por destilación para obtener de este modo el compuesto de interés (4,96 unidades A2GO) (Amax
15 (H20 ) = 260 nm). Cuando se analizó por HPLC de fase inversa [columna: Merck, Chromolith Performance RP-18e (4,6 x 100 mm); solución A: acetonitrilo al 5%, acetato de trietilamina acuoso 0,1 M (TEAA), pH 7,0; solución B: acetonitrilo al 25%, TEAA 0,1 M B%: 20% -+ 100% (10 min, gradiente lineal); 60OC; 2 ml/min; 254 nm], el presente compuesto se eluyó a 4,96 mino El compuesto se identificó por análisis espectrométrico de masas ESI de iones negativos (valor calculado: 6317,31; valor medido: 6317,06).
La secuencia de nucleótidos del presente compuesto es complementaria a los nucleótidos N° 7534-7551 del ADNc de la distrofina (N° de acceso a Gene Bank NM_004006.1).
(EJEMPLO 7) 25 SI ntesis de HO_Gmp_Ce2p _T"2P -A mp_GIIl!>_Gmp _T"2P_Ce2p-Amp_Gmp_GIIl!>_Ce2p _T"2p_Gmp-C"'P_T"2p_1"2p_Ump-CH2CH20H (A0128)
El compuesto del Ejemplo 7 que tiene una secuencia de interés se sintetizó del mismo modo que se sintetizó el compuesto del Ejemplo de referencia 4. Después de la desprotección, el producto resultante se purificó por HPLC de fase inversa [Shimadzu modelo LC-10VP; columna: Merck, Chromolith Performance RP-18e (4,6 x 100 mm); solución A: acetonitrilo al 5%, acetato de trietilamina acuoso 0,1 M (TEAA), pH 7,0; solución B: acetonitrilo B%: 10% -+ 45% (8 min, gradiente lineal); 60OC; 2 ml/min; 254 nm[. Se recogió la fracción eluida a 5,61 mino Después de retirar el disolvente por destilación a presión reducida, se añadió solución acuosa de ácido acético al 80% al residuo, 35 que después se dejó durante 20 min para retirar el grupo DMTr. Después de retirar por destilación el disolvente, el residuo resultante se disolvió en 0,5 mi de agua y se filtró con Ultrafree-MC (Miliipore: producto N° UFC4 OHV 25). El disolvente se retiró por destilación para obtener de este modo el compuesto de interés (1 ,11 unidades Aloo). Cuando se analizó por HPLC de fase inversa [columna: Merck, Chromolith Performance RP-18e (4,6 x 100 mm); solución A: acetonitrilo al 5%, acetato de trietilamina acuoso 0,1 M (TEAA), pH 7,0; solución B: acetonitrilo al 25%,
TEAA 0,1 M B%: 20% -+ 80% (8 min, gradiente lineal); 60°C; 2 ml/min; 254 nm], el presente compuesto se eluyó a 5,59 mino El compuesto se identificó por análisis espectrométrico de masas ESI de iones negativos (valor calculado: 6310,27; valor medido: 6310,33).
La secuencia de nucleótidos del presente compuesto es complementaria a los nucleótidos N° 7510-7527 del ADNc 45 de la distrofina (N° de acceso a Gene Bank NM_004006.1).
(EJEMPLO 8)
Sintesis de HO Am$_C"b_C,,2$_Gms_C"'s_C'~2S_1"2S_Um$_Cms_C'~2S_Am$_C"'s_1"2S_c ,,2s_Ams _Gm$_Ae2$_Gms-CH2CH20H (A0135)
El compuesto del Ejemplo 8 que tiene una secuencia de interés se sintetizó del mismo modo que se sintetizó el compuesto del Ejemplo de referencia 4. Sin embargo, la parte con un enlace fosforotioato se sulfuró tratando con una solución mixta de hidruro de xantano 0,02 M/acetonitrilo-piridina (mezcla 9:1) durante 15 min, en lugar de la 55 etapa de oxidación con yodo-H2Ü. Después de la desprotección, el producto resultante se purificó por HPLC de fase inversa [Shimadzu modelo LC-l0VP; columna: Merck, Chromolith Performance RP-18e (4,6 x 100 mm); solución A: acetonitrilo al 5%, acetato de trietilamina acuoso 0,1 M (TEAA), pH 7,0; solución B: acetonitrilo B%: 10% -+ 45% (8 min, gradiente lineal); 60°C; 2 ml/min; 254 nm]. Se recogió la fracción eluida a 6,87 mino Después de retirar el disolvente por destilación a preSión reducida, se añadió solución acuosa de ácido acético al 80% al residuo, Que después se dejó durante 20 min para retirar el grupo DMTr. Después de retirar por destilación el disolvente, el residuo resultante se disolvió en 0,5 mi de agua y se filtró con Ultrafree-MC (Miliipore: producto N° UFC4 OHV 25). El disolvente se retiró por destilación para obtener de este modo el compuesto de interés (9,06 unidades Aloo). Cuando se analizó por HPLC de intercambio iónico [columna: Tosoh TSK-gel DEAE-5PVV (7,5 x 75 mm); solución A: acetonitrilo al 20%; solución B: acetonitrilo al 20%, tampón fosfato 67 mM (pH 6,8), KBr 1,5 M; gradiente: solución B
65 20 -+ 80% (10 min, gradiente lineal); 40OC; 2 ml/min], el presente compuesto se eluyó a 6,92 mino
La secuencia de nucle6tidos del presente compuesto es complementaria a los nucle6tidos N° 7465-7482 del ADNc de la distrofina (N° de acceso a Gene Bank NM_004006.1).
(EJEMPLO DE ENSAYO) Método para el análisis de la capacidad de inducción del salto de exón por ENA 5 antisentido
Preparación de cultivo primario de células mioblásticas
Se estableció un cultivo primario de células mioblásticas como se describe a continuación.
1.
Se cortaron muestras de tejido muscular tomadas del musculo recto del muslo de pacientes con distrofia muscular de Duchenne en trozos finos y se lavaron con PBS dos veces.
2.
El tejido muscular de 1 anterior se trató con Difco Bacto™ triptona 250 (solución al 5% en PBS) a 37°C durante 30 min para obtener de este modo células libres enzimáticamente.
15 3. Las células libres de 2 anterior se lavaron con DMEM (que contenia FBS al 20%) dos veces.
4.
Las células de 3 anterior se suspendieron en DMEM (que contenia FBS al 20% y ultroser G al 4%).
5.
Las células en suspensión de 4 se pasaron a través de una malla (Becton Dickinson: filtro celular 35-2360) para recuperar solamente célu las libres.
6.
Las células recuperadas de 5 anterior se sembraron en placas recubiertas con gelatina.
7.
Las células se cultivaron a 3JOC en una atmósfera de C02 a15% en aire.
Inducción de diferenciación
La diferenciación de las célu las musculares se indujo como se describe a continuación.
1.
Las células cultivadas obtenidas anteriormente se sembraron en placas de 6 pocillos (recubiertas con gelatina). Cuando las células se hicieron confluyentes, se intercambió el medio con DMEM (que contenia suero de caballo al 2% (HS)).
2.
Después de un cultivo de 4 dias, las células se transfectaron con los compuestos preparados en los Ejemplos (ENA) como se describe a continuación.
Transfección de ENA
Las célu las mioblásticas se transfectaron con los compuestos preparados en los Ejemplos (ENA) como se describe 35 a continuación.
1.
Se disolvieron 200 pmol de cada uno de los compuestos preparados en los Ejemplos (10 ~lg/20 111 de milliQ) en 100 l.tI de Opti-MEM (GIBCO-BRL).
2.
Se añadieron 6 111 de reactivo Plus (GIBCO-BRL) a la solución de 1 anterior, que después se dejó a temperatura ambiente durante 15 mino
3.
En otro tubo, se disolvieron 8111 de Lipofectamina (GIBCO-BRL) en 100 l1Jde Opti-MEM.
4.
Después de completar el tratamiento de 2 anterior, la solución de 3 anterior se añadió a la solución de 2 anterior. La solución resultante se dejó a temperatura ambiente durante otros 15 mino
5. Las célu las mioblásticas 4 dias después del inicio de la inducción de diferenciación se lavaron con PBS una 45 vez. Después, se añadieron 800 111 de Opti-MEM a las mismas.
6.
Después de completar el tratamiento de 4 anterior, la solución tratada se añadió a las células de 5 anterior.
7.
Las células de 6 anterior se cultivaron a 37°C en una atmósfera de C02 al 5% en aire durante 3 h. Después, se añadieron 500 111 de DMEM (que contenia HS al 6%) a cada pocillo.
8.
Las células se cultivaron adicionalmente.
Extracción de ARN
Se extrajo el ARN como se describe a continuación.
55 1. Las células transfectadas con ENA se cultivaron durante 2 dias y después se calentaron con PBS una vez. A estas células, se añadieron 500 111 de ISOGEN (Nippon Gene).
2.
Las células se dejaron a temperatura ambiente durante 5 min, seguido de recuperación de ISOGEN en cada pocillo en tubos.
3.
Se extrajo el ARN de acuerdo con el protocolo de ISOGEN (Nippon Gene).
4.
Finalmente, se disolvió el ARN en 20 JIJde DEPW.
Trascripción inversa
La transcripción inversa se realizó como se describe a continuación.
1.
A 2 ~g de ARN, se añadió DEPW (agua esterilizada tratada con dietilpirocarbonato) para hacer una solución de 6 ~J.
2.
A la solución de 1 anterior, se añadieron 2 ~I de hexámero aleatorio (Invitrogen: 3 119/111 de producto se diluyó a factor 20 antes de su uso).
5 3. La solución resultante se calentó a 65° durante 10 mino
4.
Después, la solución se enfrió en hielo durante 2 mino
5.
A la solución de reacción anterior, se añadió lo siguiente:
transcriptasa inversa MMLV (Invitrogen: 200 Ulf.lI) 1 IlJ
10 inhibidor de ribonucleasa placentaria humana (Takara: 40 U/IlJ) 1111 OTT (adjuntado a transcriptasa inversa MMLV) 1 111 tampón (adjuntado a transcriptasa inversa MMLV) 4 ~I dNTP (adjuntado a Takara Ex Taq) 5 ~I
15 6. La solución resultante se mantuvo a 37°C durante 1 h, Y después se calentó a 95°C durante 5 mino
7. Después de la reacción, la solución se almacenó a -80°C.
Reacción de PCR
20 La reacción de PCR se realizó como se describe a continuación.
1. Se mezclaron los siguientes componentes y después se calentaron a 94°C durante 4 mino Producto de transcripción inversa 3).11 Cebador directo (10 pmol/llJ) 1 ~I
25 Cebador inverso (10 pmol/lll) 1 111 dNTP (adjuntados a TAKARA Ex Taq) 2 IlJ Tampón (adjuntada a TAKARA Ex Taq) 2111 ExTaq (TAKARA) 0,1 111 Agua esterilizada 11 ~I
30 2. Después del tratamiento mencionado anteriormente a 94°C durante 4 min, se realizaron 35 ciclos de 94°C durante 1 min/60°C durante 1 minl72°C durante 3 mino
3. Después, la solución de reacción se calentó a 7'¡OC durante 7 mino Las secuencias de nucleótidos de los cebadores directo e inverso usados en las reacciones de PCR para detectar el salto del exón 50 son como se describe a continuación. Exón 50:
35 Directo: 5'-CAAGGAGAAATTGAAGCTCAA-3' (exón 48) (SEC ID N° 81) Inverso: 5'-CGATCCGTAATGATTGTTCTAGC-3' (exón 52) (SEC ID N° 82)
3. El producto de PCR se analizó por electroforesis en gel de agarosa a12%.
40 El gel resultante se tiñó con bromuro de etidio. La banda resultante (A) (donde estaba saltado un exón) y la banda (B) (donde no estaba saltado un exón) se visualizaron con un dispositivo de fotografiado de gel (Printgraph Modelo AE-6911 FXFO; ATTO) y se determinaron cuantitativamente con ATTO Densitograph ver.4.1 para Macintosh. Los valores obtenidos se pusieron en la fórmula N(A+B)x100 para obtener la eficacia de salto ("lo). 5. La banda donde había sucedido salto se cortó, y el producto de PCR se subclonó en el vector pT7 Blue-T
45 (Novagen), seguido de reacción de secuenciación con el kit Thermo Sequenase TM 11 dye terminator cicle sequencing (Amersham Pharmacia Siotec) y la confirmación de la secuencia de nucleótidos con ASI PRISM 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). Los procedimientos de reacción fueron de acuerdo con el manual adjuntado al kit.
50 [Resultados]
Las Fig. 1 Y 2 muestran ejemplos de salto del exón 50 inducido por los compuestos A0108-113 y A0128. En la Fig. 2, se realizó el ensayo en condiciones en que la concentración de los compuestos fuera 40 pmollml. Como se muestra en estas Figuras, se observó salto del exón 50 cuando se usaban estos compuestos.
(EJEMPLO DE FORMULACiÓN 1)
De acuerdo con la siguiente prescripción, se mezclaron y disolvieron cantidades necesarias de componentes base. A esta solución, se disuelve uno cualquiera de los compuestos de los Ejemplos 1 a 8 o una sal de los mismos para 60 preparar una solución de un volumen especifico. La solución resultante se filtra con un filtro de membrana de 0,22 ~m de tamaño de poro para obtener de este modo una preparación para administración intravenosa.
Uno cualquiera de los compuestos de los Ejemplos 1 a 8 o una sal de los mismos 500 mg Cloruro sódico 8,6g 65 Cloruro de potasio 0,3g
Cloruro de calcio 0,33 9 Agua destilada para inyección para dar un volumen total de 1000 mi
(EJEMPLO DE FORMULACiÓN 2)
De acuerdo con la siguiente prescripción, se mezclaron y disolvieron cantidades necesarias de componentes base. A esta solución, se disuelve uno cualquiera de los compuestos de los Ejemplos 1 a 8 o una sal de los mismos para preparar una solución de un volumen especifico. La solución resultante se filtra con un filtro de 15 nm de tamaño de poro (PLANOVE 15: Asahi Kasei) para obtener de este modo una preparación para administración intravenosa.
Uno cualquiera de los compuestos de los Ejemplos 1 a 8 o una sal de los mismos 100 mg Cloruro sódico 8,3 9 Cloruro de potasio 0,3 9 Cloruro de calcio 0,33 9
15 Hidrogenofosfato sódico· 12H1Ü 1,8 9 1N HCI cantidad apropiada (pH 7,4) Agua destilada para inyección para dar un volumen total de 1000 mi
(EJEMPLO DE FORMULACiÓN 3)
De acuerdo con la siguiente prescripción, se mezclaron y disolvieron cantidades necesarias de componentes base. A esta solución, se disuelve uno cualquiera de los compuestos de los Ejemplos 1 a 8 o una sal de los mismos para preparar una solución de un volumen especifico. La solución resultante se filtra con un filtro de 35 nm de tamaño de poro (PLANOVE 35: Asahi Kasei) para obtener de este modo una preparación para administración intravenosa.
25 Uno cualquiera de los compuestos de los Ejemplos 1 a 8 o una sal de los mismos 100 mg Cloruro sódico 8,3 9 Cloruro de potasio 0,3 9 Cloruro de calcio 0,33 9 Glucosa 0,4 9 Hidrogenofosfato sódico· 12H1Ü 1,8 9 1N HCI cantidad apropiada (pH 7,4) Agua destilada para inyección para dar un volumen total de 1000 mi
35 Aplicabilidad industrial
Los compuestos de la presente invención y sales farmacológicamente aceptables de los mismos tienen un efecto de inducir el salto del exón 50 del gen de la distrofina y por tanto son útiles como agentes farmacéuticos para tratar la distrofia muscular.
Texto de libre de lista de secuencias
La SEC ID N° 23 muestra la secuencia de nucleótidos del oligonucleótido preparado en el Ejemplo de referencia 1. La SEC ID N° 24 muestra la secuencia de nucleótidos del oligonucleótido preparado en el Ejemplo de referencia 2.
45 La SEC ID N° 25 muestra la secuencia de nucleótidos del oligonucleótido preparado en el Ejemplo de referencia 3. La SEC ID N° 30 muestra la secuencia de nucleótidos del oligonucle6tido preparado en el Ejemplo de referencia 4 (A0100). La SEC ID N° 40 muestra la secuencia de nucle6tidos del oligonucleótido preparado en el Ejemplo 1 (A010Bl. La SEC ID N° 41 muestra la secuencia de nucleótidos de los oIigonucleótidos preparados en los Ejemplos 2 y 8 (A0109 YA0135). La SEC ID W 42 muestra la secuencia de nucleótidos del oligonucleótido preparado en el Ejemplo 3 (A0110). La SEC ID N° 43 muestra la secuencia de nucleótidos del oligonucle6tido preparado en el Ejemplo 4 (A0111 l. La SEC ID N° 44 muestra la secuencia de nucleótidos del oligonucle6lido preparado en el Ejemplo 5 (A0112). La SEC ID N° 45 muestra la secuencia de nucleótidos del oligonucleótido preparado en el Ejemplo 6 (A0113). La SEC ID N° 46 muestra la secuencia de nucleótidos del oligonucle6tido preparado en el Ejemplo 7 (A0128). La SEC ID N° 81 muestra la secuencia de nucle6tidos del cebador directo (para la reacción de
55 PCR para detectar el sallo del exón 50) usado en el Ejemplo de ensayo. La SEC ID N° 82 mueslra la secuencia de nucleótidos del cebador inverso (para la reacción de PCR para detectar el salto del exón 50) usado en el Ejemplo de ensayo.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> Kobe University SANKYO CO., L TD.
<120> Compuestos farmacéuticos de ácido nucleico ENA que pueden modificar el corte y empalme de precursores de ARNm
<130> N94646A
<150> JP 2002-340857 <151>
5
<150> JP 2003-204381 <151>
<160> 88
<170> Patentln versión 3.1
15
<210> 1 <211>31 <212> ADN <213> Ol igonude6tido sintético <400> 1 gcctgagctg atctgctggc atcttgcagt t 31
<210> 2 <211> 15 <212> ADN <213> Oligonudeótido sintético
25
<400> 2 gatctgctgg catct 15
<210> 3 <211> 22 <212> ADN <213> Ol igonudeótido sintético
<400> 3 gatctgctgg catcttgcag tt
22
35
<210>4 <211> 19 <212> ADN <213> Ol igonude6tido sintético
<400> 4 agctgatctg ctggcatct
19
45
<210> 5 <211> 24 <212> ADN <213> Oligonucleótido sintético
<400>5 gcctgagctg atctgctggc atct
24
55
<210> 6 <211>20 <212> ADN <213> Ol igonudeótido sintético <400> 6 gatctgctgg catcttgcag 20
<210> 7 <211> 18 <212> ADN <213> Ol igonudeótido sintético
65
<400> 7 gatctgctgg catcttgc 18
5
<210> 8 <211>21 <212> ADN <213> Ol igonucleótido sintético <400> 8 gcatgctcaa gaggaacttc c 21
<210> 9 <211>21 <212> ADN <213> Ol igonucleótido sintético
15
<400> 9 tagcaactgg cagaattcga t 21
<210> 10 <211>23 <212> ADN <213> Ol igonucle6tido sintético
<400> 10 agttgagtct tcgaaactga gca
23
25
<210>11 <211> 18 <212> ADN <213> Ol igonudeótido sintético
<400> 11 aaactgagca aatttgct
18
35
<210> 12 <211> 18 <212> ADN <213> Ol igonucleótido sintético
<400> 12 ttgagtcttc aaaactga
18
45
<210> 13 <211> 18 <212> ADN <213> Oligonucleótido sintético <400> 13 gtgcaaagtt gagtcttc 18
<210> 14 <211> 15 <212> ADN <213> Ol igonucle6tido sintético
55
<400> 14 gccgctgccc aatgc 15
<210> 15 <211> 18 <212> ADN <213> Ol igonucleótido sintético
<400> 15 cgctgcccaa tgccatcc
18
65
<210> 16 <211> 18
<212> ADN
<213> Ol igonucleótido sintético
<400> 16 cagtttgccg ctgcccaa 18
<210> 17
<211> 18
<212> ADN
<213> Ol igonucleótido sintético
<400> 17 tgttctgaca acagtttg 18
<210> 18 <211>20
<212> ADN
<213> Ol igonucleótido sintético
<400> 18 gcttttcttt tagttgctgc 20
<210> 19 <211>22
<212> ADN
<213> Ol igonucleótido sintético
<400> 19 cttttagttg ctgctctttt ce 22
<210> 20
<211> 18
<212> ADN
<213> Ol igonucleótido sintético
<400> 20 tttccaggt tcaagtgg 18
<210> 21
<211> 15
<212> ADN
<213> Oligonucleótido sintético
<400> 21 ctgcttcctc caacc 15
<210> 22 <211>20
<212> ADN
<213> Ol igonucleótido sintético
<400> 22 gttatctgct tcctccaacc 20
<210> 23
<211> 15
<212> ADN
<213> Ol igonucleótido sintético
<400> 23 cugcuuccuc caacc 15
<210> 24 <211>20
<212> ADN
<213> Oligonucleótido sintético
<400> 24 guuaucugcu uccuccaacc 20
<210> 25 <211>20
<212> ADN
<213> Ol igonucleótido sintético
<400> 25 gcuuuucuuu uaguugcugc 20
<210> 26
<211> 24
<212> ADN
<213> Oligonucleótido sintético
<400> 26 ggtatcagta caagaggcag gctg 24
<210> 27 <211>20
<212> ADN
<213> Ol igonucleótido sintético
<400> 27 cacttctaat agggcttgtg 20
<210> 28 <211>27
<212> ADN
<213> Oligonucleótido sintético
<400> 28 gctgaacagt ttctcagaaa gacacaa 27
<210> 29 <211>20
<212> ADN
<213> Oligonucleótido sintético
<400> 29 tccactggag atttgtctgc 20
<210> 30
<211> 18
<212> ADN
<213> Ol igonucleótido sintético
<400> 30 gaaaacgccg ccatuuct 18
<210>31
<211> 18
<212> ADN
<213> Ol igonucleótido sintético
<400> 31 ctgulagcca ctgattaa 18
<210> 32
<211> 18
<212> ADN
<213> Oligonucleótido sintético
<400> 32 tgagaaactg tucagcut 18
<210> 33
<211> 18
<212> ADN
<213> Ol igonucleótido sintético
<400> 33 caggaattug tgucuutc 18
<210> 34
<211> 18
<212> ADN
<213> Ol igonucleótido sintético
<400> 34 gtaultagca tgutccca 18
<210> 35
<211> 18
<212> ADN
<213> Ol igonucleótido sintético
<400> 35 agcatgttcc caatuctc 18
<210> 36
<211> 18
<212> ADN
<213> Ol igonucleótido sintético
<400> 36 gccgccatuu cucaacag 18
<210> 37
<211> 18
<212> ADN
<213> Ol igonucleótido sintético
<400> 37 cataatgaaa acgccgcc 18
<210> 38
<211> 18
<212> ADN
<213> Ol igonucleótido sintético
<400> 38 tucccaatuc tcaggaat 18
<210> 39
<211> 18
<212> ADN
<213> Ol igonucleótido sintético
<400> 39 ccautugtau ttagcatg 18
<210> 40
<211> 18
<212> ADN
<213> Ol igonucleótido sintético
<400> 40 ctcagatcuu ctaacuuc 18
<210> 41
<211> 18
<212> ADN
<213> Ol igonucleótido sintético
<400>41 accgcctucc actcagag 18
<210> 42
<211> 18
<212> ADN
<213> Ol igonucleótido sintético
<400> 42 tcttgaagta aacggtut 18
<210> 43 <211>18
<212> ADN
<213> Oligonucle6tido sintético
<400> 43 ggctgcttug ccctcagc 18
<210> 44
<211> 18
<212> ADN
<213> Ol igonudeótido sintético
<400> 44 agtccaggag ctaggtca 18
<210> 45
<211> 18
<212> ADN
<213> Ol igonucleótido sintético
<400> 45 gctccaatag tggtcagt 18
<210> 46
<211> 18
<212> ADN
<213> Ol igonucleótido sintético
<400> 46 gctaggtcag gctgcttu 18
<210> 47
<211> 18
<212> ADN
<213> Ol igonucle6tido sintético
<400> 47 gcagccuctc gctcactc 18
<210> 48
<211> 18
<212> ADN
<213> Ol igonucleótido sintético
<400> 48 tcuuccaaag cagccuct 18
<210> 49
<211> 18
<212> ADN
<213> Ol igonucle6tido sintético
<400> 49 tgcagtaatc uatgagtt 18
<210> 50
<211> 18
<212> ADN
<213> Ol igonucle6tido sintético
<400> 50 gttucagcut ctgtaagc 18
<210> 51
<211> 18
<212> ADN
<213> Ol igonucle6tido sintético
<400> 51 tgtaggacat tggcagtt 18
<210> 52
<211> 18
<212> ADN
<213> Ol igonucle6tido sintético
<400> 52 tccttacggg tagcaucc 18
<210> 53
<211> 18
<212> ADN
<213> Ol igonucle6tido sintético
<400> 53 agctcututa ctcccttg 18
<210> 54
<211> 18
<212> ADN
<213> Ol igonucle6tido sintético
<400> 54 ccautgutuc aucagctc 18
<210> 55
<211> 18
<212> ADN
<213> Ol igonucle6tido sintético
<400> 55 ctatgagttt cttccaaa 18
<210> 56 <211>20
<212> ADN
<213> Ol igonucleótido sintético
<400> 56 tgtgtcacca gaguaacagt 20
<210> 57 <211>20
<212> ADN
<213> Ol igonucleótido sintético
<400> 57 aggttguguc accagagtaa
20
5
<210> 58 <211>20 <212> ADN <213> Ol igonucleótido sintético
<400> 58 agtaaccaca gguugtgtca
20
15
<210> 59 <211>20 <212> ADN <213> Oligonucleótido sintético
<400> 59 ttgatcaagc agagaaagcc
20
<210> 60 <211>20 <212> ADN <213> Ol igonucleótido sintético
25
<400> 60 cacccucugu gauuutataa 20
<210> 61 <211>20 <212> ADN <213> Ol igonucleótido sintético
35
<400> 61 acccaccauc acccuctgtg <210> 62 <211>20 <212> ADN <213> Ol igonucleótido sintético 20
<400> 62 cctcaagguc acccaccatc
20
45
<210> 63 <211> 18 <212> ADN <213> Ol igonucleótido sintético
<400> 63 taacagucug aguaggag
18
55
<210> 64 <211> 18 <212> ADN <213> Ol igonucleótido sintético
<400> 64 ggcatuucua guutggag
18
<210> 65 <211> 18 <212> ADN <213> Ol igonucleótido sintético
65
<400> 65 agccagucgg uaagttct 18
<210> 66
<211> 18
<212> ADN
<213> Ol igonucleótido sintético
<400> 66 agtttggaga uggcagtt 18
<210> 67
<211> 18
<212> ADN
<213> Oligonucle6tido sintético
<400> 67 ctgattctga attcuutc 18
<210> 68
<211> 18
<212> ADN
<213> OligonucJe6tido sintético
<400> 68 ttcttgtact tcatccca 18
<210> 69
<211> 18
<212> ADN
<213> Ol igonucJeótido sintético
<400> 69 ccuccggttc t9aag9t9 18
<210> 70
<211> 18
<212> ADN
<213> Ol igonucleótido sintético
<400> 70 cattucautc aactgttg 18
<210> 71
<211> 18
<212> ADN
<213> Ol igonucleótido sintético
<400>71 ttccttagct uccagcca 18
<210> 72
<211> 18
<212> ADN
<213> Ol igonucJe6tido sintético
<400> 72 taagacctgc tcagcutc 18
<210> 73
<211> 18
<212> ADN
<213> Ol igonucJeótido sintético
<400> 73 cttggctctg gcctgucc 18
<210> 74
<211> 18
<212> ADN <213> Ol igonucle6tido sintético
5
<400> 74 ctcctuccat gactcaag 18
<210> 75 <211> 18 <212> ADN <213> Ol igonucle6tido sintético
<400> 75 ctgaaggtgt tcttgtac
18
15
<210> 76 <211> 18 <212> ADN <213> Ol igonucle6tido sintético
<400> 76 ttccagccat tgtgttga
18
25
<210> 77 <211> 18 <212> ADN <213> Ol igonucle6tido sintético
<400> 77 ctcagctuct tccttagc
18
35
<210> 78 <211> 18 <212> ADN <213> Ol igonucle6tido sintético <400> 78 gcttcutccu tagcutcc 18
<210> 79 <211> 22 <212> ADN <213> Ol igonucle6tido sintético
45
<400> 79 tagtctacaa caaagctcag gt 22
<210> 80 <211>20 <212> ADN <213> Ol igonucle6tido sintético
<400> 80 cttccccagt tgcattcaat
20
55
<210> 81 <211>21 <212> ADN <213> Ol igonucleótido sintético
<400> 81 caaggagaaa ttgaagctca a
21
65
<210> 82 <211>23 <212> ADN <213> Ol igonucleótido sintético
<400> 82 cgatccgtaa tgattgttct agc
5
<210> 83 <211>21 <212> ADN <213> Oligonucleótido sintético
10
<400> 83 tggacagaac ttaccgactg 9
15
<210> 84 <211>20 <212> ADN <213> Ol igonucleótido sintético
<400> 84 ggcggaggtc tttggccaac
20
20
<210> 85 <211>22 <212> ADN <213> Ol igonucleótido sintético
25
<400> 85 aaggattcaa cacaatggct gg
30
<210> 86 <211>20 <212> ADN <213> Ol igonudeótido sintético
35 40
<400> 86 gtaacaggac tgcatcatcg 20 <210> 87 <211> 18 <212> ADN <213> Ol igonucleótido sintético <400> 87 ggcattucta guttggag 18
45
<210> 88 <211> 18 <212> ADN <213> Ol igonucleótido sintético
50
<400> 88 agtutggaga tggcagtt 18

Claims (9)

  1. REIVINDICAC IONES
    1. Un compuesto capaz de inducir el salto del exón 50 del gen de la distrofina, que es (a) un oligonucleótido que consiste en la secuencia de nucleótidos mostrada en una cualquiera de las SEC ID N° 41, 40, 42, 43, 46, 44 Y 45,
    5 donde al menos uno de los azúcares que constituyen el oligonucleótido está modificado, y donde dicho azúcar es Dribofuranosa y al menos una modificación de dicho azúcar es 2'-O,4'-C-alquilenación de la D-ribofuranosa, o (b) un compuesto representado por la fórmula general (IV") o (V") o una sal farmacológicamente aceptable del mismo, donde dichas fórmulas generales se definen del siguiente modo:
    (IV")
    donde Bn es un grupo representado por uno cualquiera de los siguientes (4a") a (4j"):
    (4a~)HO-, (4b")HO-Ba-,
    15 (4c~)HO-Bc-Ba-, (4d")HO-Bt-Bc-Ba-, (4e~)HO-Bg-Bt-Bc-Ba-, (4f)HO-Bg-Bg-Bt-Bc-Ba-, (4g~)HO-Ba-Bg-Bg-Bt-Bc-Ba-, (4h")HO-Bt-Ba-Bg-Bg-Bt-Bc-Ba-, (4r)HO-Bc-Bt-Ba-Bg-Bg-Bt-Bc-Ba-, o (4j")HO-Bg-Bc-Bt-Ba-Bg-Bg-Bt-Bc-Ba
    20 BM-4 es un grupo representado por la siguiente fórmula (4"): -Bg-Bg-Bc-Bt-Bg-Bc-Bt-Bt-Bt-(4") BB-4 es un grupo representado por uno cualquiera de los siguientes (104a") a (104j"):
    (104a"}-CH2CH2ÚH, (1 04b~}-Bg-CH2CH2ÚH, (1 04c"}-Bg-Bc-CH2CH20H, ( 1 04d")-Bg-Bc-Bc-CH2CH2ÚH,
    25 (1 04e")-Bg-Bc-Bc-Bc-CH2CH20 H , (1 04F)-Bg-Bc-Bc-Bc-Bt-CH2CH2ÚH, (1 04g")-Bg-Bc-Bc-Bc-Bt-Bc-CH2CH20 H, ( 1 04h~)-Bg-Bc-Bc-Bc-Bt-Bc-Ba-CH2CH20H, (1 04i")-Bg-Bc-Bc-Bc-Bt -Bc-Ba-Bg-CH2CH2ÚH, o (1 04n-Bg-Bc-Bc-Bc-Bt -Bc-Ba-Bg-Bc-CH2CH2ÜH
    30 donde Bg es un grupo representado por la siguiente fórmula (G1) o (G2); Ba es un grupo representado por la siguiente fórmula (A1) o (A2); Bc es un grupo representado por la siguiente fórmula (C1) o (C2); Y Bt es un grupo representado por la siguiente fórmula (U1) o (T2):
    o
    o <:(;NH <:C""
    --g "A"~
    (G 1)
    ~NA"", (G2)
    ,-, ------o
    , , I
    I
    H,<:ÓN
    ( A2)
    <:6 ~N
    (A 1)
    ~N ,.-:
    , , o
    x
    I
    35 I
    "'N
    ¿:~o ""'éI NAo
    (e2)
    (c 1)
    p ~
    y , o
    I
    í
    H'C~
    l/N"
    NAo
    (Un (T 2)
    x o I
    donde X es individual e independientemente un gl1Jpo representado por la siguiente fórmula (XI) o (X2):
    I O I
    Q I I S=P-OH
    Q=P-QH (X 2 )
    (X 1)
    I
    I O
    Q I I
    y es individual e independientemente un átomo de hidrógeno, un gl1Jpo hidroxilo o un grupo alcoxi con 1-6 átomos de carbono; y Z es individual e independientemente un enlace sencillo o un gl1Jpo alquileno con 1-5 atomos de carbono; con la condición de que al menos uno de los nucleósidos que constituyen el compuesto representado por la fórmula (IV") tenga un gl1Jpo 2'-0,4'-C-alquileno.
    donde Brs es un grupo representado por uno cualquiera de los siguientes (Sa") a (Sr):
    (Sa")HO-, (Sb")HO-Ba-, (Sc")HO-Bg-Ba-, (Sd")HO-Bg-Bg-Ba-, (5e")HO-Ba-Bg-Bg-Ba-, (5f)HO-Bc-Ba-Bg-Bg-Ba-, (Sg")HO-Bc-Bc-Ba-Bg-Bg-Ba-, (Sh")HO-Bt-Bc-Bc-Ba-Bg-Bg-Ba-, (Si")HO-Bg-Bt-Bc-Bc-Ba-Bg-Bg-Ba-, o (Sj")HO-Ba-Bg-Bt-Bc-Bc-Ba-Bg-Bg-Ba
    BM-Ses un gl1Jpo representado por la siguiente fórmula (5"): -Bg-Bc-Bt-Ba-Bg-Bg-Bt-Bc-Ba-(5") BB-S es un gl1Jpo representado por uno cualquiera de los siguientes (1 OSa") a (105j"):
    (10Sa")-CH-zCH.2ÜH, (105b")-Bg-CH-zCH.2ÜH, (1 OSc")-Bg-Bg-C H-zCH-zOH, ( 1 OSd")-Bg-Bg-Bc-CH2CH2ÚH, (1 05e")-Bg-Bg-B c-Bt-CH-zCH-zOH, (1 05f)-Bg-Bg-Bc-Bt-Bg-CH-zCH2ÜH, (1 05g")-Bg-Bg-B c-Bt-Bg-Bc-CH-zCH2ÜH, ( 1 05h")-Bg-Bg-Bc-Bt-Bg-Bc-Bt-CH2CH20H, (10Si")-Bg-Bg-Bc-Bt-Bg-Bc-Bt-Bt-CH-zCH-zOH, o (1 OSj")-Bg-Bg-Bc-Bt-Bg-Bc-Bt-Bt-Bt-CH-zCH-zOH
    donde Bg, Ba, Bt y Bc son como se han definido anteriormente; con la condición de que la menos uno de los nucleósidos que constituyen el compuesto representado por la fórmula (V"l tenga un grupo 2'-0,4'-C-alquileno.
  2. 2.
    El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 o una sal farmacológicamente aceptable del mismo, donde al menos uno de los fosfatos que constituyen el oligonucleótido está modificado.
  3. 3.
    El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 o 2 o una sal farmacológicamente aceptable del mismo, que comprende adicionalmente 2'-Q-alquilación de la D-ribofuranosa.
  4. 4.
    El compuesto de acuerdo con la reivindicaciÓn 2 o una sal farmacológicamente aceptable del mismo, donde la modificación del fosfato es tioación del 9 I1JpO fosfato.
  5. 5.
    El compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que está representado por una cualquiera de las fórmulas seleccionadas entre el grupo que consiste en
    HO_Gmp_G mp_Ce2p _r2l>_Gmp_Cmp _1"'21'_1"'2p-u"'P _G mp_Ce2p-C"'P -C"'P _1"'2p_c c2p-Amp_Gmp_Ce2$>-CH2CH20H; HO_Gmp_ Ce2p _T"2p_AmI'_Gmp_G mp _T"2p_Ce2p-Amp_Gmp_Gmp-Ce2p_T"2p_Gmp _Cmp _T"2p_r 2p -u"'P-CH2CH20 H; HO_Gmp_Gmp_Celp _ 1P_Gmp_Cmp 1P _Ump_Gmp_C61 p_Cmp_Cmp 1P_C61p-Amp_Gmp_Cé1p-CH2CH20 H; HO_Gmp_C61p
    r _r'P_r _r _r 1P -Amp_Gmp_
    Gmp 1p _Gmp_Cmp 1p
    _r lp_Ce1p-Amp_Gmp_Gmp _C'~lp_r _r _r'p -u"'P -CH2CH20H; HO_Gm$_Gms_Ce2¡)_r 2P_Gms_C"'s _ r 2¡)_ -ro2p_u"" _Gm$_Ce2p_Cm._C"" _1"21>_Ce2p-Am._Gms_Ce2p-CH2CH20 H; HO_Gms_Ce2p _1"2p-Am._Gm$_1"21>_Ce2p-Ams_Gm$_Gm• _ C~2P_1"21>-G"" _ 1"21>_rZI'-CH2CH20H; HO-G"" -G"'"_C~l1'_1"11'_G'"'S-C"'"_1"11'_1"11> _U,",S-G"'"_C~ll>-C"'"_C'''S_1"11>_C~ll>-A"'"_ Gms_Ce1p-CH2CH20H; HO_Gms_Ce1p_1"'lp-Am$_Gms_Gm$_1"'lp_Celp-Ams_Gms_Gm$_Celp_1"'lp _Gms_Cm$_r lp_r 1p _u"'s _ CH2CH20H; HO-Gms_Gm•_Ce2• _ -ro2•_Gms _Cms _-ro2s _1"2s_Um•_Gm•_Ce2•_Cms_C"" _ro2p_Ce2S-Am._Gms_C"2s-CH2CH20H; HO_Gms_C'~2S_1"'2S-Ams_Gms_Gms _r 2s_C'~2S-Am$_Gms_Gm$_Ce2s _r 2S_Gm$_C"'s _ r 2S _1"'2S-tt " -CH2CH20H; HO_Gm$_Gms_ Ce1s _1"1._Gms_C"" _-rol._-ro1S _u"" _Gms_Ce1s _C"" _C"'s-Lel._Cel•-Ams_Gm•_Cel•-CH2CH20 H; HO_Gms _Cels _1"lS-Ams_Gm• _ Gms _-ro1s _Ce1s -Ams_Gms_Gms_Ce1s _-ro's_Gms_Cms_1"15_1"ls_Ums-CH2CH20 H; HO-AmI'_Gmp_r 2p_Ce2p_Ce2p_AmI'_Gmp_Gmp_ Ae2p_G mp_Ce2P _1"'21>-Amp_Gmp_Gmp _1"'2P_Ce2¡)-Amp-CH2CH20H; HO-Amp_Gmp _-yalp_Ce1p_Ce1p-Amp_Gmp_Gmp-Aelp_Gmp _ Ce1p_-ro1P-Amp_Gmp_Gmp _-ro1P_Celp-Amp-CH2CH20H; HO-A ms_Gm• _ 1"21'_Ce2p_Ce2l>-Ams_Gm•_Gms-Ae2l>_Gms-Ce2p_1"2p-Am._ ITlS_Gms _1"21>_Ce2p-Am.-CH2CH,2ÜH; HO-A m. _Gms _1"11'_Celp_Ce1p-Am._Gms _Gm•-Aelp_Gm•_Ce1p _1"11'-Ams_Gms_Gms _1"11'_ Ce1p-Ams-CH2CH20H; HO-Am$_Gms _r 2S_Ce2s_Ce2•-Ams_Gm$_Gms-Ae2s_Gm$_Ce3s _r 2s-Am$_Gms_Gm$_-yezs_Ce2s-Ams_ CH2CH20H; HO-Ams_Gm$_1"'1$_Ce1s-C'~1$-Ams_Gms_Gms-Ael$_Gms_C'~ls_-yalS-Am$_Gms_Gms _r 1s_C'~ls-Am$-CH2CH2ÚH;
    2p
    HO-Amp_Ce2p_Ce2p-Gmp_Cmp_Ce2p _-ro_u"'P -C"'P_Ce2p_AmI'-C"'P _1"21'_Ce2p_AmI'_Gmp-Ae2p_Gmp-CH2CH20 H; y HO-Am._ Ce2s_Ce2•_Gms_C"'s_Ce2s _T"2._u"'s_Cms_Ce2s-Ams_Cms _1"25_Ce2s-Ams_Gms-Ae2._Gms-CH2CH,2ÜH;
    _~~~~~~~~~r~~~~~~~~~~~
    Gms, Cms
    , y't¡"S ~on g~pos'qUe tlenen'las Si'gUie~tes ~structuras', respectiv~me~te:' , , , , , ,
    °
    ~N-(NH
    JL)...
    L.--0~ N NH2
    ~ (Gelp)
    I
    O=P-OH
    I
    0,
    NH,
    °
    ~Nx) /JCNH
    N NA-NH,
    -Vo--.j' N
    2 P) (G''' ) I I
    ~ (A -~
    ° °
    Q= ° P-OH O=P-OH
    I I
    0, 0,
    ( 15 NH, <:C° NH
    R "A~
    (A"'~ )
    o OCHs (G"''')
    h N e", N
    I I
    O=P-OH
    O=í-OH
    I
    0,,-0,,
    Nti,
    (:CJ
    -V0-J
    N
    ~ (A-2-)
    I
    °
    S=P-OH
    I
    0,
    (C"" )
    o una sal fannacológicamente aceptable de los mismos.
    15 7. Un agente terapéutico para la distrofia muscular, que comprende el compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 o una sal farmacológicamente aceptable del mismo.
  6. 8. El agente terapéutico de acuerdo con la reivindicación 7, cuya diana de tratamiento es aquellos pacientes en que
    la cantidad total de los aminoácidos en la fase de lectura abierta del gen de la distrofina será un múltiplo de 3 cuando 20 el exón 50 del gen de la distrofina se ha saltado.
  7. 9. Un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o un agente terapéutico de acuerdo con la reivindicación 7 u 8 para su uso en el tratamiento de la distrofia muscular.
    25 10. Uso de un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en la fabricación de un medicamento para tratar la distrofia muscular.
  8. 11. Uso de acuerdo con la reivindicación 10, donde la diana de tratamiento es aquellos pacientes en que la cantidad
    total de los aminoácidos en la fase de lectura abierta del gen de la dislrofina será un múltiplo de 3 cuando el exón 50 30 del gen de la distrofina se ha saltado.
  9. 12. Un agente terapéutico de acuerdo con la reivindicación 7 u 8, un compuesto o agente terapéutico de acuerdo con la reivindicación 9 o un uso de acuerdo con la reivindicación 10 u 11 donde dicha distrofia muscular es distrofia muscular de Duchenne.
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Families Citing this family (62)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001083740A2 (en) 2000-05-04 2001-11-08 Avi Biopharma, Inc. Splice-region antisense composition and method
EP2530153B1 (en) * 2002-11-25 2016-03-16 Masafumi Matsuo ENA nucleic acid drugs modifying splicing in mRNA precursor
USRE48960E1 (en) 2004-06-28 2022-03-08 The University Of Western Australia Antisense oligonucleotides for inducing exon skipping and methods of use thereof
ES2361325T3 (es) 2004-06-28 2011-06-16 The University Of Western Australia Oligonucleótidos antisentido para inducir la omisión de exón y métodos de uso de los mismos.
EP1877555A2 (en) * 2005-04-22 2008-01-16 Academisch Ziekenhuis Leiden Modulation of exon recognition in pre-mrna by interfering with the binding of sr proteins and by interfering with secondary rna structure.
WO2007123391A1 (en) 2006-04-20 2007-11-01 Academisch Ziekenhuis Leiden Therapeutic intervention in a genetic disease in an individual by modifying expression of an aberrantly expressed gene.
EP1857548A1 (en) 2006-05-19 2007-11-21 Academisch Ziekenhuis Leiden Means and method for inducing exon-skipping
DK2049664T3 (da) 2006-08-11 2012-01-02 Prosensa Technologies Bv Enkeltstrengede oligonukleotider, som er komplementære til repetitive elementer, til behandling af med DNA-repetitiv-ustabilitet associerede lidelser
EP2167135A2 (en) * 2007-07-12 2010-03-31 Prosensa Technologies B.V. Molecules for targeting compounds to various selected organs, tissues or tumor cells
CN103212085A (zh) 2007-07-12 2013-07-24 普罗森那技术公司 用于使化合物靶向多种选定器官或组织的分子
PL2203173T3 (pl) 2007-10-26 2016-06-30 Academisch Ziekenhuis Leiden Środki i sposoby przeciwdziałania zaburzeniom mięśni
USRE48468E1 (en) 2007-10-26 2021-03-16 Biomarin Technologies B.V. Means and methods for counteracting muscle disorders
NZ587178A (en) 2008-02-08 2011-11-25 Prosensa Holding Bv Methods and means for treating dna repeat instability associated genetic disorders
EP2119783A1 (en) 2008-05-14 2009-11-18 Prosensa Technologies B.V. Method for efficient exon (44) skipping in Duchenne Muscular Dystrophy and associated means
KR20110082576A (ko) 2008-10-24 2011-07-19 에이브이아이 바이오파마 인코포레이티드 Ｄｍｄ를 위한 다중 엑손 스키핑 조성물
NZ595955A (en) 2009-04-24 2012-10-26 Prosensa Technologies Bv Oligonucleotide comprising an inosine for treating dmd
SMT201800579T1 (it) 2009-11-12 2019-01-11 Univ Western Australia Molecole antisenso e metodi per trattare patologie
AU2014280918B2 (en) * 2009-12-18 2016-11-17 Arrowhead Pharmaceuticals, Inc. Organic compositions to treat HSF1-related diseases
MX369004B (es) 2009-12-18 2019-10-24 Novartis Ag Composiciones orgánicas para tratar las enfermedades relacionadas con hsf1.
JP6141018B2 (ja) 2009-12-24 2017-06-07 バイオマリン テクノロジーズ ベー．フェー． 炎症性障害を治療するための分子
TWI541024B (zh) 2010-09-01 2016-07-11 日本新藥股份有限公司 反義核酸
EP2750715B1 (en) 2011-08-30 2018-10-31 The Regents of The University of California Identification of small molecules that enhance therapeutic exon skipping
CN110055243B (zh) 2011-12-28 2024-03-26 日本新药株式会社 反义核酸
CN112251436A (zh) 2012-01-27 2021-01-22 比奥马林技术公司 治疗杜兴型肌营养不良症和贝克型肌营养不良症的具有改善特性的rna调节性寡核苷酸
JP6928025B2 (ja) * 2012-01-27 2021-09-01 バイオマリン テクノロジーズ ベー．フェー． デュシェンヌ型及びベッカー型筋ジストロフィーの治療のための改善された特徴を有するｒｎａ調節オリゴヌクレオチド
ES2798301T3 (es) * 2012-06-18 2020-12-10 Daiichi Sankyo Co Ltd Intermedio para producción de análogos de nucleósidos, y procedimiento para su producción
KR102390965B1 (ko) 2013-03-14 2022-04-26 사렙타 쎄러퓨틱스 인코퍼레이티드 근육 이영양증의 치료를 위한 엑손 스키핑 조성물
MX2015013117A (es) 2013-03-15 2016-07-14 Sarepta Therapeutics Inc Composiciones mejoradas para tratar distrofia muscular.
DK3118311T3 (en) 2014-03-12 2019-03-11 Nippon Shinyaku Co Ltd Antisense nucleic acid
SG10201912858VA (en) 2014-06-17 2020-02-27 Nippon Shinyaku Co Ltd Antisense nucleic acids
PL3351633T3 (pl) 2015-09-15 2020-11-02 Nippon Shinyaku Co., Ltd. Antysensowny kwas nukleinowy
JP2019525742A (ja) 2016-06-30 2019-09-12 サレプタ セラピューティクス， インコーポレイテッド 筋ジストロフィーに対するエクソンスキッピングオリゴマー
CN110337308B (zh) 2016-12-19 2023-09-01 萨勒普塔医疗公司 用于肌肉萎缩症的外显子跳跃寡聚体缀合物
LT3554552T (lt) 2016-12-19 2022-10-10 Sarepta Therapeutics, Inc. Egzoną praleidžiantys oligomerų konjugatai nuo raumenų distrofijos
CA3046793A1 (en) 2016-12-19 2018-06-28 Sarepta Therapeutics, Inc. Exon skipping oligomer conjugates for muscular dystrophy
KR20190100225A (ko) * 2016-12-28 2019-08-28 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 알포트 증후군 치료약
CN110381980A (zh) 2017-01-06 2019-10-25 艾维迪提生物科学有限责任公司 核酸-多肽组合物以及诱导外显子跳读的方法
JP7048574B2 (ja) 2017-03-10 2022-04-05 国立研究開発法人国立成育医療研究センター アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび糖原病Ｉａ型予防または治療用組成物
GB201711809D0 (en) 2017-07-21 2017-09-06 Governors Of The Univ Of Alberta Antisense oligonucleotide
EA201991450A1 (ru) 2017-09-22 2019-12-30 Сарепта Терапьютикс, Инк. Конъюгаты олигомеров для пропуска экзона при мышечной дистрофии
WO2019067975A1 (en) 2017-09-28 2019-04-04 Sarepta Therapeutics, Inc. POLYTHERAPIES FOR TREATING MUSCLE DYSTROPHY
US20210145852A1 (en) 2017-09-28 2021-05-20 Sarepta Therapeutics, Inc. Combination Therapies for Treating Muscular Dystrophy
WO2019172286A1 (ja) 2018-03-09 2019-09-12 第一三共株式会社 糖原病Ｉａ型治療薬
US10765760B2 (en) 2018-05-29 2020-09-08 Sarepta Therapeutics, Inc. Exon skipping oligomer conjugates for muscular dystrophy
CA3101321A1 (en) 2018-06-26 2020-01-02 Nippon Shinyaku Co., Ltd. Composition comprising antisense oligonucleotide and use thereof for treatment of duchenne muscular dystrophy
SG11202100934PA (en) 2018-08-02 2021-02-25 Dyne Therapeutics Inc Muscle targeting complexes and uses thereof for treating dystrophinopathies
WO2020028864A1 (en) 2018-08-02 2020-02-06 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating facioscapulohumeral muscular dystrophy
US11168141B2 (en) 2018-08-02 2021-11-09 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating dystrophinopathies
CA3150715A1 (en) 2019-09-10 2021-03-18 Makoto Koizumi Conjugate of galnac-oligonucleotide for delivery to liver and manufacturing method thereof
KR20220083707A (ko) 2019-10-18 2022-06-20 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 2 고리성 포스포르아미다이트의 제조 방법
CA3165316A1 (en) 2019-12-19 2021-06-24 Nippon Shinyaku Co., Ltd. Antisense nucleic acid enabling exon skipping
EP4083208A4 (en) 2019-12-26 2024-01-03 Nippon Shinyaku Co., Ltd. ANTISENSE NUCLEIC ACID THAT INDUCES EXON 50 SKIP
CN115210376A (zh) 2020-02-28 2022-10-18 日本新药株式会社 诱导外显子51的跳读的反义核酸
US11987795B2 (en) 2020-11-24 2024-05-21 The Broad Institute, Inc. Methods of modulating SLC7A11 pre-mRNA transcripts for diseases and conditions associated with expression of SLC7A11
JP2024519451A (ja) 2021-04-30 2024-05-14 サレプタ セラピューティクス， インコーポレイテッド 筋ジストロフィーのための治療法
IL309626A (en) 2021-06-23 2024-02-01 Nippon Shinyaku Co Ltd A combination of antisense oligomers
US11771776B2 (en) 2021-07-09 2023-10-03 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating dystrophinopathies
US11638761B2 (en) 2021-07-09 2023-05-02 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating Facioscapulohumeral muscular dystrophy
CN117980006A (zh) 2021-07-09 2024-05-03 达因疗法公司 用于治疗肌养蛋白病的肌肉靶向复合物和制剂
EP4389893A1 (en) 2021-08-21 2024-06-26 Takeda Pharmaceutical Company Limited Human transferrin receptor binding peptide-drug conjugate
EP4215614A1 (en) 2022-01-24 2023-07-26 Dynacure Combination therapy for dystrophin-related diseases
EP4493693A1 (en) 2022-03-17 2025-01-22 Sarepta Therapeutics, Inc. Phosphorodiamidate morpholino oligomer conjugates

Family Cites Families (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2544164B2 (ja) 1987-11-28 1996-10-16 新明工業株式会社 ピストンリング組み付け装置
JPH07505293A (ja) * 1992-03-31 1995-06-15 アボツト・ラボラトリーズ 多重リガーゼ連鎖反応方法
US6436635B1 (en) * 1992-11-06 2002-08-20 Boston University Solid phase sequencing of double-stranded nucleic acids
JPH0787982A (ja) 1993-01-29 1995-04-04 Sankyo Co Ltd 修飾オリゴデオキシリボヌクレオチド
US5525470A (en) * 1994-01-26 1996-06-11 Hybridon, Inc. Method of sequencing [short] oligonucleotides
US5563255A (en) * 1994-05-31 1996-10-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide modulation of raf gene expression
US5853990A (en) * 1996-07-26 1998-12-29 Edward E. Winger Real time homogeneous nucleotide assay
AU9063398A (en) 1997-09-12 1999-04-05 Exiqon A/S Oligonucleotide analogues
JPH11140930A (ja) 1997-11-13 1999-05-25 Matsushita Electric Works Ltd シャワー装置
HU228398B1 (en) * 1999-02-12 2013-03-28 Daiichi Sankyo Company Novel nucleosides and oligonucleotide analogues
JP2000325085A (ja) 1999-05-21 2000-11-28 Masafumi Matsuo デュシェンヌ型筋ジストロフィー治療剤
US6165728A (en) * 1999-11-19 2000-12-26 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of NCK-2 expression
US6261840B1 (en) 2000-01-18 2001-07-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of PTP1B expression
US6653467B1 (en) * 2000-04-26 2003-11-25 Jcr Pharmaceutical Co., Ltd. Medicament for treatment of Duchenne muscular dystrophy
CA2407309C (en) 2000-04-28 2011-08-02 Xiao Xiao Dna sequences encoding dystrophin minigenes and methods of use thereof
RU2165149C1 (ru) 2000-07-03 2001-04-20 Шапошников Валерий Геннадьевич Система формования и упаковки изделий из сахарной ваты
US6920153B2 (en) * 2000-07-17 2005-07-19 Nortel Networks Limited Architecture and addressing scheme for storage interconnect and emerging storage service providers
JP4836366B2 (ja) * 2000-08-25 2011-12-14 雅文 松尾 デュシェンヌ型筋ジストロフィー治療剤
US6727355B2 (en) * 2000-08-25 2004-04-27 Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. Pharmaceutical composition for treatment of Duchenne muscular dystrophy
EP1191097A1 (en) 2000-09-21 2002-03-27 Leids Universitair Medisch Centrum Induction of exon skipping in eukaryotic cells
JP3781687B2 (ja) 2001-02-23 2006-05-31 松下電器産業株式会社 遺伝子診断装置及び遺伝子診断方法
AU2002365157A1 (en) * 2001-11-08 2003-07-15 The Johns Hopkins University Methods and systems of nucleic acid sequencing
JP2003204381A (ja) 2002-01-04 2003-07-18 Hitachi Ltd 情報通信端末装置
EP2530153B1 (en) * 2002-11-25 2016-03-16 Masafumi Matsuo ENA nucleic acid drugs modifying splicing in mRNA precursor
WO2004083432A1 (en) 2003-03-21 2004-09-30 Academisch Ziekenhuis Leiden Modulation of exon recognition in pre-mrna by interfering with the secondary rna structure

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