ES2564855T3 - Método y sistema óptico de alto rendimiento para determinar el efecto de una sustancia de ensayo sobre las células vivas - Google Patents
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Abstract
Un aparato para obtención de imágenes digitales de células vivas bajo el efecto de una sustancia de ensayo, que comprende: un aparato de grabación digital (801) para designar de un modo automático una o más regiones celulares a partir de un fotograma de vídeo de una grabación de vídeo de las células vivas antes de la exposición a la sustancia de ensayo; y una tira de película ópticamente transparente o semitransparente (602) capaz de adherirse a las células vivas y de presentar las células vivas al aparato de grabación digital (801); caracterizado por un canal de fluidos (501) que tiene un puerto de entrada para fluidos (502) en un extremo de la entrada (503) y un puerto de salida para fluidos (504) en un extremo de salida (505); un dispositivo de bombeo de fluidos conectado al puerto de entrada (502) del canal de fluidos (501), donde la tira de película ópticamente transparente o semitransparente (602) es capaz de atravesar el canal de fluidos (501); al menos una celda de flujo (702) colocada sobre la película (602), comprendiendo la celda de flujo (702) una cavidad (803) que tiene una superficie superior ópticamente transparente (804) y paredes laterales (805) capaces de formar un sello con la película (602) para formar un ambiente cerrado (809); y un accionador vertical (807) conectado a la al menos una celda de flujo (702) capaz de elevar la al menos una celda de flujo (702) por encima de la película (602) o descender la al menos una celda de flujo (702) sobre la película (602).
Description
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DESCRIPCION
Metodo y sistema optico de alto rendimiento para determinar el efecto de una sustancia de ensayo sobre las celulas vivas
Campo de la invencion
La invencion se refiere en general a un aparato para detectar y medir rapidamente efectos electrofisiologicos, proarntmicos, inotropicos y otros de sustancias in vitro sobre celulas vivas, basados en protocolos de deteccion tales como respuestas contractiles, esquemas de deteccion optica y estimulacion electrica programada adaptada.
Antecedentes de la invencion
Los metodos actuales para evaluar los diversos efectos de farmacos sobre tejidos cardfacos u otros biologicos in vivo usan de forma rutinaria tecnicas de registro intracelular que requieren tiempo y que son tecnicamente complejas. Adicionalmente, en la mayona de los casos, estas evaluaciones generalmente se aplican a preparaciones sincitiales o a celulas aisladas de una en una.
Normalmente, los registros intercelulares obtenidos en ausencia y/o presencia de diversas sustancias se comparan para las pruebas de los efectos de dichas diversas sustancias sobre el potencial de accion cardfaco de la fibra muscular. Entre otros aspectos, una sustancia puede afectar al potencial de accion cardfaco de la fibra muscular retrasando la repolarizacion cardfaca (manifestada como la prolongacion de la duracion del potencial de accion o DPA) o acelerando la repolarizacion (manifestado como el acortamiento de la DPA).
Por desgracia, existen varias deficiencias: Los metodos actuales para obtener estos registros intracelulares son diffciles de mantener; los experimentos usados para obtener los registros intracelulares son lentos, principalmente como resultado de largos tiempos de equilibrado de farmacos, especialmente para musculos cardfacos; y los registros intracelulares requieren recoleccion de tejidos de multiples muestras para garantizar tamanos adecuados de las muestras. Ademas, este enfoque no se evalua sobre el efecto potencial de una sustancia para afectar a la contractilidad (una propiedad inherente de muchos tejidos excitables) o cambios en la excitabilidad (otra propiedad inherente de muchos tejidos excitables).
El retraso en la repolarizacion cardiaca se considera un marcador sustituto de la proarritmia cardfaca (y, en particular, Torsades de Pointes). Se ha demostrado repetidamente que los efectos de las sustancias que retrasan la repolarizacion cardiaca son exagerados durante la estimulacion mas lenta, un efecto denominado "dependencia de uso inverso". Desafortunadamente, normalmente no se consideran los efectos de las sustancias durante la electroestimulacion acelerada (o irregular). Esto puede ser crucial en la evaluacion del riesgo de proarritmia asociado con la rara taquicardia ventricular polimorfica inducida por farmacos conocida como Torsades de Pointes, dado que el ritmo de inicio normalmente implica un patron de estimulacion irregular o latidos prematuros.
Se prefieren respuestas celulares integradas, tales como las proporcionadas a partir de miocitos aislados, para evaluar los efectos electrofisiologicos de las sustancias sobre un cuerpo, ya que esencialmente se desconoce que canales ionicos cardfacos o protemas contractiles pueden verse afectados por los productos qmmicos y/o compuestos en fase de evaluacion de la seguridad o la eficacia.
La capacidad de una celula viva para responder mecanicamente (es decir, para expandirse o contraerse) a un estfmulo, particularmente estimulacion electrica, depende, entre otras cosas, de la recuperacion de la celula de la estimulacion electrica anterior. En otras palabras, la expansion o contraccion de una celula debido a la estimulacion electrica depende parcialmente de la rapidez de "retorno a la normalidad" de una celula, o la repolarizacion, a partir de una estimulacion electrica anterior. En el caso de las celulas cardfacas, esta capacidad de respuesta se denomina refractariedad, que esta estrechamente relacionada con el "potencial de accion cardfaco”.
El potencial de accion cardfaco de una celula puede verse afectado por muchos factores. Por ejemplo, se ha demostrado que la introduccion/exposicion de las sustancias a una celula tiene un efecto sobre el potencial de accion cardfaco. Se dice que algunas sustancias, como los farmacos y/o otros productos qmmicos, que retrasan la repolarizacion y prolongan la duracion del potencial de accion cardfaco, prolongan la refractariedad. Como ejemplo, las sustancias para potenciar la corriente de entrada de iones (por ejemplo, sodio o calcio) pueden provocar aumentos en el potencial de accion cardfaco. Al hacerlo, estas sustancias limitan la capacidad de una celula para responder a una estimulacion muy rapida o prematura. Mediante el uso de dichas sustancias se puede prolongar la refractariedad debido a (1) la reduccion de las corrientes repolarizantes de salida o (2) la reduccion transitoria y/o el retraso de la recuperacion de canales que conducen corrientes de entrada excitatorias.
De un modo similar, se dice que las sustancias que aceleran la repolarizacion y acortan la duracion del potencial de accion cardfaco acortan la refractariedad. Los cambios en la refractariedad se han relacionado con proarritmia. Por ejemplo, la repolarizacion retrasada se ha relacionado con proarritmia ventricular (incluyendo Torsades de Pointes), mientras que la repolarizacion auricular acortada (y refractariedad) se ha relacionado con proarritmia auricular (tal
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como aleteo auricular y fibrilacion) y fibrilacion ventricular.
Aunque los cambios en la refractariedad pueden ser el resultado de los efectos sobre las corrientes ionicas, conocer los efectos de una sustancia sobre cualquier corriente ionica individual no predice adecuadamente los efectos sobre la refractariedad, ya que multiples corrientes ionicas pueden actuar de un modo integrado para definir la refractariedad, y las sustancias pueden afectar a multiples corrientes ionicas de un modo indeterminado a concentraciones diferentes. Por tanto, los cambios en la refractariedad normalmente se evaluan en un sistema celular integrado intacto (por ejemplo, una fibra muscular). Sin embargo, las medidas electrofisiologicas directas de los cambios (utilizando microelectrodos o tecnicas de registro basadas en electrodos en parches) y la medicion de los cambios en la refractariedad de los sistemas celulares integrados son tediosas, tecnicamente complejas, y no se prestan a un mayor rendimiento.
Por lo tanto, es deseable proporcionar un aparato adecuado para llevar a cabo un metodo mejorado para detectar el efecto de una sustancia sobre un cuerpo, que supere las desventajas de las metodologfas utilizadas actualmente.
El metodo que se puede llevar a cabo mediante el aparato de la invencion proporciona la evaluacion de los efectos, en particular los efectos electrofisiologicos, de los farmacos sobre las celulas, en particular de los miocitos cardiacos, sin utilizar las tecnicas de registro intracelular tecnicamente exigentes de los metodos conocidos, al tiempo que se requiere menos uso de muestras de una manera mas sencilla y que se requiere una experiencia tecnica minima. El metodo mencionado anteriormente tambien proporciona la evaluacion simultanea de cambios en los efectos mecanicos (en particular, la contractilidad cardiaca) de sustancias de ensayo sobre las celulas mientras se estudian los parametros electrofisiologicos (cambios en la repolarizacion y la excitabilidad).
Ademas, el metodo que se puede llevar a cabo mediante el aparato de la invencion utiliza metodos opticos no invasivos para determinar las respuestas y las celulas se evaluan en condiciones fisiologicas. Los esquemas de deteccion del metodo mencionado anteriormente son menos exigentes tecnicamente. Ademas, los esquemas de deteccion de la presente invencion son mas rapidos y mas eficientes que los abordajes conocidos. Los metodos de deteccion de bordes existentes no pueden escalarse facilmente para soportar muchas mediciones de varias celdas en paralelo. La deteccion de bordes tambien es un problema cuando los bordes no estan bien definidos debido al bajo contraste de la imagen, los residuos o cuando una camara de celda de flujo experimental contiene celulas muy empaquetadas que pueden solaparse parcialmente. Por ultimo, este abordaje es aplicable a diversos tipos de celulas (por ejemplo, miocitos cardfacos auriculares y ventriculares) y se puede utilizar para celulas derivadas de cualquier tejido contractil donde se desencadena una respuesta mecanica o dependiente de la recuperacion de la excitabilidad electrica.
Sumario de la invencion
La invencion proporciona un aparato rapido, de alto rendimiento, no invasivo y eficiente para la medicion de los efectos de sustancias tales como compuestos y farmacos sobre las celulas excitables El aparato de la invencion puede llevar a cabo un metodo para medir una respuesta de una pluralidad de celulas a una sustancia de ensayo mediante:
(1) proporcionar una grabacion de video digital de una pluralidad de celulas antes de la exposicion a una sustancia ensayo y una grabacion de video digital de la pluralidad de las celulas despues de la exposicion a una sustancia de ensayo, comprendiendo cada una de las grabaciones de video una pluralidad de fotogramas de video, comprendiendo cada uno de los fotogramas de video una pluralidad de pfxeles,
(2) seleccionar una o mas regiones celulares de cada fotograma de video de la grabacion de video de la pluralidad de celulas antes de la exposicion a una sustancia de ensayo,
(3) seleccionar un marco de referencia de entre los fotogramas de video de la grabacion de video de una pluralidad de celulas antes de la exposicion a una sustancia de ensayo y de entre los fotogramas de video de la grabacion de video de la pluralidad de las celulas despues de la exposicion a una sustancia de ensayo,
(4) cuantificar los cambios de pfxeles dentro de cada region celular en cada fotograma del video de la grabacion de video de la pluralidad de celulas antes de la exposicion a una sustancia de ensayo mediante la comparacion de las una o mas regiones celulares del fotograma del video de la grabacion de video de una pluralidad de celulas antes de la exposicion a una sustancia de ensayo en las una o mas regiones celulares del marco de referencia de la grabacion de video de una pluralidad de celulas antes de la exposicion a una sustancia de ensayo,
(5) calcular una curva de tiempo - respuesta para cada region celular basada en el cambio de los pfxeles cuantificado frente al tiempo,
(6) definir una o mas regiones de interes dentro de cada region celular,
(7) aplicar las una o mas regiones de interes a la grabacion de video de la pluralidad de celulas despues de la exposicion a una sustancia de ensayo y al marco de referencia de la grabacion de video de una pluralidad de celulas despues de la exposicion a una sustancia de ensayo,
(8) cuantificar los cambios de pfxeles dentro de cada region de interes en cada fotograma del video de la grabacion de video de la pluralidad de celulas despues de la exposicion a una sustancia de ensayo mediante la comparacion de las una o mas regiones de interes de los fotogramas del video de la grabacion de video de una
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pluralidad de celulas despues de la exposicion a una sustancia de ensayo en las una o mas regiones de interes del marco de referencia de la grabacion de video de una pluralidad de celulas despues de la exposicion a una sustancia de ensayo, y
(9) calcular una curva de tiempo - respuesta para cada region de interes basada en el cambio de los pfxeles cuantificado frente al tiempo.
El aparato de la invencion tambien puede llevar a cabo un metodo para un protocolo experimental para la obtencion de una grabacion de video de la pluralidad de las celulas antes de la exposicion a la sustancia de ensayo y una grabacion de video de la pluralidad de las celulas despues de la exposicion a la sustancia de ensayo mediante
(1) exponer una pluralidad de celulas a un estimulo,
(2) simultaneamente grabar en video la pluralidad de celulas para obtener una grabacion de video de la pluralidad de celulas antes de la exposicion a una sustancia de ensayo,
(3) exponer la pluralidad de celulas a una sustancia de ensayo,
(4) exponer la pluralidad de celulas al estimulo, y
(5) simultaneamente grabar en video la pluralidad de celulas para obtener una grabacion de video de la pluralidad de celulas despues de la exposicion a una sustancia de ensayo.
El metodo mencionado anteriormente incluye ademas un metodo para un protocolo experimental para la obtencion de una grabacion de video de una pluralidad de celulas antes de la exposicion a la sustancia de ensayo y una grabacion de video de la pluralidad de las celulas despues de la exposicion a la sustancia de ensayo mediante (1) grabacion de video de la pluralidad de celulas antes de la exposicion a una sustancia de ensayo, (2) exposicion de la pluralidad de celulas a una sustancia de ensayo, y (3) grabacion de video de las celulas despues de la exposicion a la sustancia de ensayo. En una realizacion preferida, esta metodologfa se aplica cuando las celulas son espontaneamente contractiles.
En determinados ejemplos, el metodo proporciona (1) detectar, medir y/o verificar con rapidez y eficacia los efectos de los productos qmmicos, compuestos, y/o farmacos sobre la despolarizacion cardfaca, la contractilidad y la excitabilidad utilizando tanto tecnicas basadas en optica como protocolos de simulacion adaptados y (2) cribar y seleccionar con rapidez y eficacia e compuestos para determinar los efectos electrofisiologicos y/o proanitmicos (asf como efectos sobre la contractilidad y la excitabilidad) en las celulas vivas, especialmente en los miocitos cardfacos. Las celulas pueden derivar de preparaciones cardiacas nativas, representando las preparaciones una respuesta farmacologica basada en celulas integrada.
De acuerdo con la invencion, se proporciona un aparato para presentar las celulas vivas para la obtencion de imagenes digitales durante la medicion de la respuesta de las celulas a una sustancia de ensayo. Un aparato de acuerdo con la invencion sirve para almacenar y alimentar las celulas vivas hasta el momento en que se realiza el ensayo, para el transporte de las celulas vivas de una seccion del aparato a otra, y para presentar las celulas vivas al aparato de grabacion digital al tiempo que se exponen las celulas a una sustancia de ensayo, por ejemplo un farmaco, y, opcionalmente a un protocolo de estimulacion electrica. Un aparato de acuerdo con la invencion incluye:
un canal de fluidos que tiene un Puerto de entrada para fluidos y una salida para fluidos en un extremo de salida; un dispositivo de bombeo de fluido conectado al puerto de entrada del canal de fluidos;
una tira de pelfcula opticamente transparente o semitransparente que corre a traves del canal de fluido; la pelfcula capaz de adherirse a las celulas vivas;
al menos una celda de flujo colocada sobre la pelfcula, comprendiendo la celda de flujo una cavidad que tiene una superficie superior opticamente transparente y paredes laterales capaces de formar un sello con la pelfcula para formar un ambiente cerrado; y
un accionador vertical conectado a la al menos una celda de flujo capaz de elevar la al menos una celda de flujo por encima de la pelfcula o descender la al menos una celda de flujo sobre la pelfcula.
Breve descripcion de las figuras
Las figuras adjuntas, que se incluyen para proporcionar una comprension adicional de la invencion y se incorporan y constituyen una parte de esta divulgacion, ilustran realizaciones preferidas de la invencion y, junto con la descripcion detallada, sirven para explicar los principios de la invencion. En las figuras:
La figura 1 ilustra un ejemplo de una curva de respuesta-tiempo calculada de acuerdo con un metodo que puede llevar a cabo el aparato de la presente invencion y de acuerdo con un protocolo de pulsos preprogramados mostrado debajo de la curva de respuesta-tiempo, de acuerdo con la invencion. El protocolo de pulsos preprogramados representado en la figura 1 exhibe estfmulos separados regularmente interrumpidos de una forma regular con estfmulos prematuros colocados progresivamente mas cerca de los estfmulos separados regularmente durante el curso del protocolo de pulsos.
La figura 2 ilustra el aparato de la presente invencion.
La figura 3 ilustra los recuentos de pfxeles de respuesta-tiempo superpuestos (normalizados con el promedio de la respuesta de estimulacion electrica) para un protocolo de estimulacion electrica con estfmulos prematuros en
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un grupo de miocitos.
La figura 4 ilustra el funcionamiento de la aplicacion opcional de criterios de eliminacion predeterminados a las curvas de respuesta-tiempo de las regiones celulares y la eliminacion de esas regiones celulares correspondientes con las curvas de respuesta-tiempo que no cumplen los criterios de eliminacion predeterminados. Se representa un fotograma de video que se ha segmentado en regiones celulares (lmeas discontinuas); las cajas solidas indican las regiones celulares que cumplen los criterios de exclusion predeterminados para convertirse en regiones de interes.
La figura 5 es un diagrama esquematico que ilustra un aparato para una forma de realizacion preferida de la invencion.
La figura 6 es una ilustracion de una tira de pelfcula polimerica flexible opticamente transparente o semitransparente que puede usarse para transportar las celulas vivas de una seccion a otra dentro del aparato de la invencion.
La figura 7 es una vista en planta de un conjunto de una o mas celdas de flujo que se pueden usar para presentar las celulas vivas al dispositivo de grabacion digital, al tiempo que se exponen las celulas vivas a una sustancia de ensayo y, opcionalmente, administrar un protocolo de estimulacion electrica a las celulas vivas.
La figura 8 es una vista en seccion frontal que representa el conjunto de una o mas celdas de flujo, el mecanismo de sujecion, y un dispositivo de grabacion digital.
Descripcion detallada de las realizaciones
La presente invencion proporciona un aparato rapido, no invasivo y eficiente para la determinacion del efecto de una sustancia de ensayo (por ejemplo, compuestos o farmacos) sobre celulas vivas excitables. El aparato de la invencion puede llevar a cabo un metodo para medir una respuesta de una pluralidad de celulas a una sustancia de ensayo mediante:
(1) proporcionar una grabacion de video digital de una pluralidad de celulas antes de la exposicion a una sustancia ensayo y una grabacion de video digital de la pluralidad de las celulas despues de la exposicion a una sustancia de ensayo, comprendiendo cada una de las grabaciones de video una pluralidad de fotogramas de video, comprendiendo cada uno de los fotogramas de video una pluralidad de pfxeles,
(2) seleccionar una o mas regiones celulares de cada fotograma de video de la grabacion de video de la pluralidad de celulas antes de la exposicion a una sustancia de ensayo,
(3) seleccionar un marco de referencia de entre los fotogramas de video de la grabacion de video de una pluralidad de celulas antes de la exposicion a una sustancia de ensayo y de entre los fotogramas de video de la grabacion de video de la pluralidad de las celulas despues de la exposicion a una sustancia de ensayo,
(4) cuantificar los cambios de pfxeles dentro de cada region celular en cada fotograma del video de la grabacion de video de la pluralidad de celulas antes de la exposicion a una sustancia de ensayo mediante la comparacion de las una o mas regiones celulares del fotograma del video de la grabacion de video de una pluralidad de celulas antes de la exposicion a una sustancia de ensayo en las una o mas regiones celulares del marco de referencia de la grabacion de video de una pluralidad de celulas antes de la exposicion a una sustancia de ensayo,
(5) calcular una curva de tiempo - respuesta para cada region celular basada en el cambio de los pfxeles cuantificado frente al tiempo,
(6) definir una o mas regiones de interes dentro de cada region celular,
(7) aplicar las una o mas regiones de interes a la grabacion de video de la pluralidad de celulas despues de la exposicion a una sustancia de ensayo y al marco de referencia de la grabacion de video de una pluralidad de celulas despues de la exposicion a una sustancia de ensayo,
(8) cuantificar los cambios de pfxeles dentro de cada region de interes en cada fotograma del video de la grabacion de video de la pluralidad de celulas despues de la exposicion a una sustancia de ensayo mediante la comparacion de las una o mas regiones de interes de los fotogramas del video de la grabacion de video de una pluralidad de celulas despues de la exposicion a una sustancia de ensayo en las una o mas regiones de interes del marco de referencia de la grabacion de video de una pluralidad de celulas despues de la exposicion a una sustancia de ensayo, y
(9) calcular una curva de tiempo - respuesta para cada region de interes basada en el cambio de los pfxeles cuantificado frente al tiempo.
En realizaciones donde se aplica un estfmulo a la pluralidad de celulas, el estimulo puede comprender un protocolo de estimulacion electrica pre-programado. Por ejemplo, la pluralidad de celulas puede estimularse electricamente mediante un protocolo preprogramado de estimulacion electrica de trenes de impulsos consecutivos de ritmo regular (cada uno separado por una pausa) donde cada tren aumenta o disminuye opcionalmente la frecuencia o la amplitud con respecto al tren de impulsos anterior. El protocolo de estimulacion electrica preprogramada tambien puede incluir uno o mas pulsos prematuros. Por ejemplo, un protocolo de pulsos preprogramados puede exhibir estfmulos separados regularmente interrumpidos de una forma regular con estfmulos prematuros colocados progresivamente mas cerca de los estfmulos separados regularmente durante el curso del protocolo de pulsos para definir refractariedad. El protocolo de estimulacion electrica preprogramada tambien puede incluir aumentar o disminuir de forma incremental las amplitudes del pulso. Por ejemplo, un protocolo de pulsos de preprogramado puede presentar estfmulos con una amplitud o intensidad que disminuyen progresivamente durante el curso del protocolo de pulsos
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para definir la excitabilidad.
En otras realizaciones de la invencion, la pluralidad de celulas es electricamente excitable y responde con un cambio en la forma, la morfologfa o la reorganizacion interna (incluyendo, pero sin limitaciones, la contraccion). Tambien se pueden usar celulas aisladas, grupos o islotes de celulas individuales o multiples, laminas o capas de celulas, o tejidos. Como alternativa, tambien se puede usar una pluralidad de celulas que responden a estimulos qmmicos o mecanicos con un cambio en la forma, la morfologfa, o la reorganizacion interna. Como alternativa, la pluralidad de celulas puede ser espontaneamente activa (por ejemplo, algunos tipos de celulas madre) y puede no ser necesario ningun estfmulo.
El metodo mencionado anteriormente incluye un analisis de las grabaciones de video digital de una pluralidad de celulas tomadas al menos dos penodos de tiempo: una grabacion de video de la pluralidad de celulas antes de la exposicion a la sustancia de ensayo y una grabacion de video de la pluralidad de las celulas despues de la exposicion de la sustancia de ensayo. En ejemplos donde se aplica un estfmulo a la pluralidad de celulas, las grabaciones de video se obtienen mediante
(1) exponer una pluralidad de celulas a un estimulo,
(2) simultaneamente grabar en video la pluralidad de celulas para obtener una grabacion
pluralidad de celulas antes de la exposicion a una sustancia de ensayo,
(3) exponer la pluralidad de celulas a una sustancia de ensayo,
(4) exponer la pluralidad de celulas al estimulo, y
(5) simultaneamente grabar en video la pluralidad de celulas para obtener una grabacion
pluralidad de celulas despues de la exposicion a una sustancia de ensayo.
Las grabaciones de video digitales de la pluralidad de celulas tambien pueden tomarse mientras la pluralidad de celulas se expone a diferentes concentraciones de una sustancia de ensayo.
El metodo mencionado anteriormente incluye ademas un metodo para un protocolo experimental para la obtencion de una grabacion de video de una pluralidad de celulas antes de la exposicion a la sustancia de ensayo y una grabacion de video de la pluralidad de las celulas despues de la exposicion a la sustancia de ensayo mediante (1) grabacion de video de la pluralidad de celulas antes de la exposicion a una sustancia de ensayo, (2) exposicion de la pluralidad de celulas a una sustancia de ensayo, y (3) grabacion de video de las celulas despues de la exposicion a la sustancia de ensayo. En una realizacion preferida, esta metodologfa se aplica cuando las celulas son espontaneamente contractiles.
En determinados ejemplos de la invencion, los cambios en la refractariedad de una celula (por ejemplo, un miocito) se determinan basandose en las respuestas contractiles derivadas del estimulo o un calcio intracelular transitorio responsable de iniciar la contraccion. En particular, los efectos del farmaco sobre la repolarizacion se pueden evaluar sobre la base de la capacidad de una pluralidad de celulas, en particular miocitos, para contraerse durante un protocolo de estimulacion electrica programable donde la velocidad de estimulacion aumenta progresivamente o la estimulacion regular se interrumpio con un estfmulo prematuro. En particular, los efectos del farmaco sobre la excitabilidad se pueden evaluar sobre la base de la capacidad de una pluralidad de celulas, en particular miocitos, para contraerse durante un protocolo de estimulacion electrica programable donde la fuerza del estfmulo se incrementa o disminuye de forma progresiva. Estos efectos contractiles se caracterizan en base a la amplitud y el patron de las respuestas, que incluye la velocidad de estimulacion a la que las celulas no responden a un unico estfmulo, y despues a varios estfmulos. En otros ejemplos, se pueden usar colorantes sensibles al voltaje o sensibles a los iones (por ejemplo, calcio o sodio sensible) para medir directamente los efectos electrofisiologicos de una sustancia de ensayo en una celula. En tales ejemplos, la capacidad de las celulas para responder puede detectarse a partir de los cambios en, por ejemplo, transitos de calcio intracelulares como fluctuaciones en la intensidad de emision de los colorantes fluorescentes dependientes de calcio intracelular, las fluctuaciones en la senal de los colorantes sensibles al voltaje, o variaciones en parametros de la imagen microscopica tales como el enfoque o la dispersion de la luz.
De acuerdo con la invencion, se seleccionan una o mas regiones celulares de cada grabacion de video. Las una o mas regiones celulares se seleccionan mediante la aplicacion de criterios de seleccion de region celular predeterminados. Por ejemplo, cada region celular puede corresponder con cada celula reflejada en el fotograma del video para excluir las partes de cada fotograma del video que no han realizado una imagen de una celula. Alternativamente, cada fotograma de video de la grabacion de video puede segmentarse independientemente de la presencia, presencia parcial, o ausencia de una celula en cada segmento para seleccionar las regiones celulares (por ejemplo, una red). Las regiones celulares se designan de una forma automatica, donde las regiones celulares derivan de protocolos de segmentacion preprogramados, que pueden designar regiones celulares de acuerdo con los criterios predeterminados disenados para seleccionar las partes del fotograma del video correspondientes con cada celula cuya imagen se ha obtenido o mediante seleccion de las regiones del fotograma del video tal como se ilustran en la figura 4. De acuerdo con un ejemplo que no es parte de la invencion reivindicada en el presente documento, las regiones celulares se pueden designar mediante inspeccion manual de la grabacion del video y segmentacion o seleccion de las partes correspondientes con cada celula cuya imagen se ha obtenido en la
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grabacion del v^deo. Las partes localizadas fuera de las regiones celulares pueden excluirse opcionalmente de analisis posteriores. En un ejemplo de la invencion, la region celular puede comprender la totalidad del fotograma del video.
De acuerdo con un metodo que puede llevar a cabo el aparato de la presente invencion, se selecciona un fotograma de video de la grabacion de video de la pluralidad de celulas antes de la exposicion a la sustancia de ensayo se selecciona como marco de referencia. Preferentemente, el marco de referencia se selecciona para que coincida con un periodo de tiempo donde la pluralidad de celdas esta en un estado de reposo. Cuando la pluralidad de celulas antes de la exposicion a la sustancia de ensayo se ha sometido a un estimulo, se puede elegir un marco de referencia para que coincida con un punto de tiempo donde las celulas no responden a un estimulo de pulso. Por ejemplo, se puede elegir un marco referencia mediante la determinacion de la ubicacion temporal mas probable del estado de reposo de la region celular, por ejemplo, mediante la seleccion del fotograma de video que es similar al numero mas alto de fotogramas basados en sumar los cambios de recuento de pfxeles para cada fotograma de video o un subconjunto de fotogramas para todas las ubicaciones de referencia posibles o un subconjunto de ubicaciones de referencia. Como alternativa se puede elegir un marco de referencia mediante la determinacion de la ubicacion temporal mas probable de estado de reposo de la region celular calculando una intensidad de pixel para cada fotograma de video, y seleccionando como marco de referencia el fotograma de video que tiene la intensidad de pixel mas baja o mas alta calculada en funcion de si el material celular es mas oscuro o mas claro que el espacio circundante; este procedimiento de seleccion del marco de referencia es particularmente preferible cuando la pluralidad de celulas es activa de forma espontanea. En otra alternativa, el marco de referencia se selecciona mediante el calculo de una media recortada de todos los fotogramas de video de la grabacion de video de la pluralidad de celulas antes de la exposicion a una sustancia de ensayo para formar un marco promedio, que se selecciona como el marco de referencia de la grabacion de video de la pluralidad de celulas antes de la exposicion a una sustancia de ensayo.
Los cambios en el pixel se pueden cuantificar dentro de cada region celular en cada fotograma del video de la grabacion de video de la pluralidad de celulas antes de la exposicion a una sustancia de ensayo mediante la comparacion de las una o mas regiones celulares del fotograma del video de la grabacion de video de una pluralidad de celulas antes de la exposicion a una sustancia de ensayo en las una o mas regiones celulares del marco de referencia de la grabacion de video de una pluralidad de celulas antes de la exposicion a una sustancia de ensayo. Por ejemplo, los cambios de pfxeles se pueden cuantificar comparando cada pixel de las una o mas regiones celulares con un correspondiente pixel del marco de referencia de la grabacion de video de la pluralidad de las celulas con un pixel correspondiente del marco de referencia de la grabacion de video de la pluralidad de celulas y contando los pfxeles que cambian mediante un valor preseleccionado. Como alternativa, los cambios de pfxeles se pueden cuantificar mediante el calculo de una intensidad de pixel agregada de las una o mas regiones celulares derivadas de la media, la mediana, la moda, la media recortada o una metodologfa similar del promediado de las intensidades de los pfxeles y comparando la intensidad de pixel agregada de la una o mas regiones celulares con la intensidad de pixel agregada de las una o mas regiones celulares derivadas mediante la realizacion de la misma metodologfa de promediado en las una o mas regiones celulares del marco de referencia.
Se calcula una curva de respuesta - tiempo que comprende uno o mas picos para cada region celular basada en la cantidad de cambio del pixel en funcion del tiempo. En la figura 1 se muestra un ejemplo de una curva de respuesta
- tiempo calculada de acuerdo con el metodo mencionado anteriormente. Los valores tales como la duracion de la contraccion (representada como, por ejemplo, el 10-90 % del TWITCH total); la contraccion maxima (una medida del estado inotropico); la velocidad maxima de acortamiento (+dL/dT)max), la velocidad maxima de relajacion (-dL/dT), el tiempo desde el acortamiento inicial al maximo (Tmaximo) y el tiempo desde el acortamiento maximo hasta la relajacion (Tmaximo-90, una medida del estado lusitropico) se pueden calcular mediante el analisis de la curva respuesta - tiempo. Los valores agregados, tales como el periodo refractario, la perdida de respuesta a la estimulacion prematura, el ruido (por ejemplo, el ruido basal del pico a la altura), la altura maxima promedio y la anchura maxima promedio tambien se pueden calcular mediante el analisis de la curva de respuesta - tiempo.
Dentro de cada region celular se definen una o mas regiones de interes. Cada region celular pude definirse simplemente como una region de interes, es decir las regiones celulares y las regiones de interes pueden coincidir unas con otras. Los criterios de exclusion predeterminados se pueden aplicar a la curva de respuesta - tiempo; las regiones celulares que no cumplen los criterios de exclusion predeterminados se eliminan del analisis posterior. Las categonas de criterios de exclusion predeterminados incluyen, por ejemplo, los valores calculados a partir de analisis de la curva de respuesta - tiempo. Por ejemplo, se puede excluir una region celular por tener una curva de respuesta
- tiempo que presenta una duracion de la contraccion fuera de un intervalo predeterminado de valores. Como resultado de la aplicacion de los criterios de exclusion predeterminados, por consiguiente se pueden excluir del analisis posterior las regiones celulares que contienen celulas no respondedoras y subrespondedoras y la una o mas regiones de interes se definen como las regiones celulares que tienen curvas de respuesta - tiempo que cumplan los criterios de exclusion predeterminados. Se pueden definir ejemplos de regiones de interes que correspondan con las regiones celulares que tienen celulas que exhiben comportamiento contractil deseable.
De acuerdo con el metodo mencionado anteriormente, las regiones de interes se someten a un analisis adicional aplicandose a la grabacion de video de la pluralidad de las celulas despues de la exposicion a una sustancia de
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ensayo.
Un fotograma de video de la grabacion de video de la pluralidad de celulas tras la exposicion a la sustancia de ensayo se selecciona como marco de referencia. Preferentemente, el marco de referencia se selecciona para que coincida con un periodo de tiempo donde la pluralidad de celdas esta en un estado de reposo. Cuando la pluralidad de celulas despues de la exposicion a la sustancia de ensayo se ha sometido a un estimulo, se puede elegir un marco de referencia para que coincida con un punto de tiempo donde las celulas no responden a un estfmulo de pulso. Por ejemplo, se puede elegir un marco referencia mediante la determinacion de la ubicacion temporal mas probable del estado de reposo de la region de interes, por ejemplo, mediante la seleccion del fotograma de video que es similar al numero mas alto de fotogramas basados en sumar los cambios de recuento de pfxeles para cada fotograma de video o un subconjunto de fotogramas para todas las ubicaciones de referencia posibles o un subconjunto de ubicaciones de referencia. Como alternativa se puede elegir un marco de referencia mediante la determinacion de la ubicacion temporal mas probable de estado de reposo de la region de interes calculando una intensidad de pixel para cada fotograma de video, y seleccionando como marco de referencia el fotograma de video que tiene la intensidad de pixel mas baja o mas alta calculada en funcion de si el material celular es mas oscuro o mas claro que el espacio circundante; este procedimiento de seleccion del marco de referencia es particularmente preferible cuando la pluralidad de celulas es activa de forma espontanea. En otra alternativa, el marco de referencia se selecciona mediante el calculo de una media recortada de todos los fotogramas de video de la grabacion de video de la pluralidad de celulas despues de la exposicion a una sustancia de ensayo para formar un marco promedio, que se selecciona como el marco de referencia de la grabacion de video de la pluralidad de celulas despues de la exposicion a una sustancia de ensayo.
De acuerdo con el metodo mencionado anteriormente, los cambios de pfxeles se cuantifican dentro de cada region de interes en cada fotograma del video de la grabacion de video de la pluralidad de celulas despues de la exposicion a una sustancia de ensayo mediante la comparacion de las una o mas regiones de interes de los fotogramas del video de la grabacion de video de una pluralidad de celulas despues de la exposicion a una sustancia de ensayo en las una o mas regiones de interes del marco de referencia de la grabacion de video de una pluralidad de celulas despues de la exposicion a una sustancia de ensayo. Por ejemplo, los cambios de pfxeles se pueden cuantificar comparando cada pixel de las una o mas regiones de interes con un correspondiente pixel del marco de referencia de la grabacion de video de la pluralidad de las celulas con un pixel correspondiente del marco de referencia de la grabacion de video de la pluralidad de celulas y contando los pfxeles que cambian mediante un valor preseleccionado. Como alternativa, los cambios de pfxeles se pueden cuantificar mediante el calculo de una intensidad de pixel agregada de las una o mas regiones de interes derivadas de la media, la mediana, la moda, la media recortada o una metodologfa similar del promediado de las intensidades de los pfxeles y comparando la intensidad de pixel agregada de la una o mas regiones de interes con la intensidad de pixel agregada de las una o mas regiones de interes derivadas mediante la realizacion de la misma metodologfa de promediado en las una o mas regiones de interes del marco de referencia.
Opcionalmente, en un ejemplo de la invencion se eliminan de la consideracion posterior las subregiones dentro de las regiones de interes que no cumplen los criterios de eliminacion de subregiones predeterminados. Por ejemplo, los criterios de eliminacion de subregiones se pueden basar en un cambio no deseable de la intensidad promedio.
Opcionalmente, para restar las diferencias de variacion lenta en la cuantificacion de pfxeles, se puede aplicar un algoritmo de correccion basal a las unas o mas regiones de interes.
Se calcula una curva de respuesta - tiempo que comprende uno o mas picos para cada region de interes basada en la cantidad de cambio del pixel en funcion del tiempo. En la figura 1 se muestra un ejemplo de una curva de respuesta - tiempo calculada de acuerdo con el metodo mencionado anteriormente. Los valores tales como la duracion de la contraccion (representada como, por ejemplo, el 10-90 % del TWITCH total); la contraccion maxima (una medida del estado inotropico); la velocidad maxima de acortamiento (+dL/dT)max), la velocidad maxima de relajacion (-dL/dT), el tiempo desde el acortamiento inicial al maximo (Tmaximo) y el tiempo desde el acortamiento maximo hasta la relajacion (Tmaximo-90, una medida del estado lusitropico) se pueden calcular mediante el analisis de la curva respuesta - tiempo. Los valores agregados, tales como el periodo refractario, la perdida de respuesta a la estimulacion prematura, el ruido (por ejemplo, el ruido basal del pico a la altura), la altura maxima promedio y la anchura maxima promedio tambien se pueden calcular mediante el analisis de la curva de respuesta - tiempo.
De acuerdo con el metodo mencionado anteriormente, las curvas de respuesta - tiempo se pueden comparar para las regiones de interes antes de la exposicion a la sustancia de ensayo y despues de la exposicion a la sustancia de ensayo. Es evidente que, en la practica, las curvas de respuesta generadas representan representaciones de alta calidad del comportamiento celular individualizado y/o agregado. Por tanto, la comparacion de las curvas de respuesta de las regiones de interes antes y despues de la exposicion a la sustancia de ensayo representan el efecto directo de una sustancia de ensayo en la pluralidad de celulas y permite realizar predicciones exactas del efecto de una sustancia en un sistema celular integrado del que derivo la pluralidad de celulas. Los cambios en la excitabilidad electrica pueden, por ejemplo, evaluarse basandose en la presencia o ausencia de una curva de respuesta - tiempo (provocada por un protocolo de estimulacion de los estfmulos aplicados regularmente con una amplitud que aumenta o disminuye progresivamente) utilizada para definir un umbral para la respuesta contractil. Las aplicaciones espedficas de la presente invencion incluyen, por ejemplo, la prediccion de los efectos adversos de
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las sustancias farmacologicas sobre el tejido del corazon.
En un ejemplo de la invencion, las celulas son miocitos cardfacos (ya sea de origen auricular o ventricular), que se colocan y se obtiene la imagen en una camara experimental, preferentemente un celda de flujo, y se mantienen a una temperature predeterminada. Preferiblemente, para los estudios optimos de comportamiento de la pluralidad de celulas, la temperatura es o esta cerca de la temperatura fisiologica, aunque se pueden usar otras temperaturas. Los miocitos cardfacos no contiguos pueden obtenerse mediante metodologfas conocidas, tal como la desagregacion del musculo cardfaco. Preferiblemente, la pluralidad de celulas sometidas a un protocolo de estimulacion se estimula usando una estimulacion de campo de 1,0 Hertz durante superfusion con solucion de Tyrode tamponada con HEPES. Las sustancias de ensayo se superfusionan, preferentemente, con la sustancia de ensayo contenida en una solucion tampon salina fisiologica. Cada pluralidad de celulas se visualiza preferentemente a aumentos de 1-3X. El video se graba a un muestreo preferida de 30 Hz o mayor.
En algunos ejemplos, la invencion incluye el analisis de grabaciones de video de multiples camaras experimentales, conteniendo cada una pluralidad de celulas para analizar. En tales ejemplos, se pueden ver una o mas camaras experimentales con un unico dispositivo de formacion de imagenes de video, donde el dispositivo de formacion de imagenes y la o las camaras se pueden mover uno respecto al otro. Como alternativa, multiples dispositivos de formacion de imagenes de video se pueden dedicar a una o mas camaras experimentales y fijar sus posiciones ffsicas de uno respecto al otro. La captura y analisis de video para cada camara pueden avanzar en paralelo, de acuerdo con las tecnicas descritas anteriormente. Dichos ejemplos proporcionan ensayos paralelos en cualquier momento dado y permiten el examen simultaneo de los efectos de multiples sustancias de ensayo, diferentes concentraciones de sustancias de ensayo, o ambos. Para cada camara, tambien es posible evaluar las relaciones de concentracion-respuesta a las sustancias de ensayo mediante el control de la concentracion de la sustancia de ensayo en cada camara y la repeticion de los protocolos experimentales.
En otros ejemplos, se pueden realizar varias grabaciones de video de la pluralidad de celulas despues de la exposicion a la sustancia de ensayo para que coincidan con la exposicion de la pluralidad de celulas con diferentes concentraciones de la sustancia de ensayo, o una sustancia de ensayo diferente. Tales grabaciones se analizanan de acuerdo con el metodo de la invencion como se ha descrito anteriormente.
En otros ejemplos, la invencion utiliza el software de analisis fuera de lmea o en lmea, ya sea en lmea o dentro de una red interna, lo que permite la seleccion automatica de las regiones celulares y/o regiones de interes, en base a los parametros contractiles predefinidos, la adicion automatica de la sustancia de ensayo, la recoleccion y compilacion de datos y la generacion de informes. Ademas, las curvas de respuesta - tiempo y cualquier valor calculados a partir de la misma se pueden almacenar para su referencia posterior, por lo que la invencion no tiene por que implementarse a tiempos posteriores en la misma pluralidad de celulas. Por tanto, la invencion proporciona un sistema para evaluar simultaneamente los efectos de las sustancias de ensayo sobre varias pluralidades de celulas.
En ejemplos concretos, el metodo que se puede llevar a cabo con el aparato de la presente invencion describe un ensayo de deteccion selectiva QT automatizado in vitro para evaluar la repolarizacion tanto acelerada como retardada sobre la base de los cambios en las contracciones de la contraccion y la refractariedad de los miocitos cardiacos ventriculares o las celulas madre cardiacas aislados. En la practica del ensayo, que incluye las metodologfas de grabacion de video y de analisis de datos descritas anteriormente, el efecto de los farmacos que afectan a la repolarizacion cardiaca, al estado inotropico, y a la excitabilidad y estan relacionados con proarritmia se evalua facil y rapidamente. Los efectos dependientes de la concentracion se pueden evaluar como parte de la caracterizacion del farmaco y se representan como curvas de concentracion - respuesta. Los efectos inotropicos positivos y negativos sobre la contractilidad cardfaca se evaluan en base a la amplitud de las respuestas contractiles. El ensayo permite una rapida y facil evaluacion de las expansiones y/o contracciones celulares, en particular de los miocitos, usando tecnicas de cambio de pixel basadas opticamente, estimulacion electrica programable y analisis por ordenador, anulando la necesidad de registros con microelectrodos y analisis limitantes del tiempo (y laboriosos). Adicionalmente, el ensayo puede cumplir de forma rapida y eficiente la urgente necesidad de un ensayo de repolarizacion funcional e integrado con un rendimiento mayor para detectar compuestos para responsabilidades de repolarizacion QT cardfaca. El ensayo proporciona varias ventajas sobre los metodos actuales que no estan adaptados para la deteccion selectiva de alto rendimiento debido a limitaciones en el rendimiento por las condiciones experimentales requeridas (incluyendo periodos largos de recuperacion y de equilibrio, y un numero pequeno de fibras por tejido muscular), los costes de mano de obra y el uso de animales. Adicionalmente, como resultado del uso de metodos opticos para medir las respuestas celulares y evaluar las celulas que no son miembros de un sistema celular integrado (es decir, celulas no contiguas) en condiciones fisiologicos controlados, los metodos descritos en el presente documento son mas faciles de realizar y requieren menos tiempo que los metodos anteriores, y obvian la necesidad de tecnicas de registro con microelectrodos para evaluar las respuestas electrofisiologicas a productos qmmicos y farmacos.
Por tanto, el ensayo de acuerdo con el metodo descrito anteriormente puede evaluar los cambios en la refractariedad en miocitos aislados basandose en las respuestas contractiles a estfmulos electricos. Los resultados ilustrados en las figuras 1-4 demuestran la tecnica basica y los registros obtenidos al evaluar el periodo refractario
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eficaz de un grupo de miocitos ca^acos aislados de acuerdo con el metodo que se puede llevar a cabo con el aparato de la presente invencion. La figura 2 ilustra un ejemplo de un aparato ffsico usado para estimular y registrar. La figura 1 ilustra un protocolo de estimulacion tipico y las respuestas estilizadas. En la figura 1, los miocitos ventriculares se estimularon electricamente usando un protocolo de pulsos pareados donde los miocitos se estimularon electricamente (usando estimulacion de campo) con un tren de estimulos de 3 grupos de pulsos comprendido cada uno por 3 estfmulos electricos a intervalos de 1 segundo y un estfmulo prematuro cuyo intervalo era variable. El periodo refractario eficaz (PRE) se definio como el intervalo del estimulo prematuro mas largo que no desencadena contracciones mensurables de los miocitos de una magnitud igual al 25 % de la respuesta estimulada regula promedio. La figura 3 ilustra las respuestas de recuento de pfxeles superpuestos (normalizadas a la respuesta de estimulacion electrica promedio) para estfmulos prematuros a intervalos de 500, 300 y 200 milisegundos. El PRE medido para este grupo de miocitos estaba entre 200-300 milisegundos y se pueden interpolar de forma lineal para que sea de 240 ms. Se puede conseguir una resolucion mayor disminuyendo el tamano de la etapa de los pulsos prematuros crecientes.
En este ejemplo, la estimulacion de campo se consiguio mediante dos electrodos de platino conectados a un estimulador de ondas cuadradas bifasicas. LA duracion de un unico pulso de estimulo fue de 5 milisegundos, mientras que la intensidad se fijo en ciento veinte por ciento (120 %) por encima del umbral, que es de aproximadamente 7 voltios/cm. La temperatura del bano se mantuvo a una temperatura controlada a la temperatura fisiologica o cerca de ella. Las senales de estimulacion electrica y las contracciones de los miocitos se registraron de forma simultanea.
En la invencion se proporciona un aparato para presentar las celulas vivas para la obtencion de imagenes digitales durante la medicion de la respuesta de las celulas a una sustancia de ensayo. El aparato sirve para almacenar y alimentar las celulas vivas hasta el momento en que se realiza el ensayo, para el transporte de las celulas vivas de una seccion del aparato a otra, y para presentar las celulas vivas al aparato de grabacion digital al tiempo que se exponen las celulas a una sustancia de ensayo, por ejemplo un farmaco, y, opcionalmente a un protocolo de estimulacion electrica. Un aparato de acuerdo con la invencion incluye un canal de fluidos que tiene un puerto de entrada para fluidos en un extremo de entrada y una salida de fluidos en un extremo de salida; un dispositivo de bombeo de fluidos conectado al puerto de entrada del canal de fluidos; una tira de pelfcula opticamente transparente o semitransparente que atraviesa el canal de fluidos; la pelfcula capaz de adherirse a las celulas vivas; al menos una celda de flujo colocada sobre la pelfcula, comprendiendo la celda de flujo una cavidad que tiene una superficie superior opticamente transparente y paredes laterales capaces de formar un sello con la pelfcula para formar un entorno cerrado; y un accionador vertical conectado a la al menos una celda de flujo capaz de elevar la al menos una celda de flujo por encima de la pelfcula o bajar la al menos una celda de flujo sobre la pelfcula.
El aparato para almacenar y alimentar las celulas vivas comprende un canal de fluidos alargado 501 que tiene un puerto de entrada para fluidos 502 en un extremo de entrada 503 y una salida para fluidos o puerto de drenaje 504 en un extremo de salida 505. En una realizacion preferida, las dimensiones del canal de fluidos 501 son 25,4 mm de ancho x 22,225 mm de profundidad x 914,4 mm de longitud (1" anchura x 7/8" profundidad x 36" longitud). En esta realizacion, un dispositivo de bombeo de fluidos adecuado, por ejemplo una bomba peristaltica, esta conectado al puerto de entrada 502 del canal de fluidos 501 de forma que determinados fluidos, por ejemplo soluciones tampon 506, puede mantenerse a un nivel deseado 507 y fluye desde el extremo de entrada 503 del canal de fluidos 501 al extremo de salida 505 con el fin de alimentar las celulas vivas 601. Asimismo, en una realizacion preferida se proporciona un dispositivo 508 para calentar una seccion del canal de fluidos 501 a una temperatura igual o cercana a las temperaturas ambientales, de modo que las celulas vivas 601 en esta region del canal de fluidos 501 se pueden mantener a temperaturas fisiologicas o cercanas a ellas.
En una realizacion preferida de la invencion, el aparato para transportar las celulas vivas 601 se consigue sembrando las celulas vivas 601 en una tira de pelfcula polimerica flexible opticamente transparente o semitransparente 602. En una realizacion preferida, la pelfcula polimerica 602 mide aproximadamente 0,127 mm de espesor x 22,225 de anchura x 1168,4 de longitud (.005" espesor x 7/8" anchura x 46" longitud). En otra realizacion preferida, la pelfcula polimerica 602 comprende una tira continua de pelfcula de FEP (etilenpropileno fluorado) que se ha tratado especialmente, por ejemplo, mediante polimerizacion en plasma de una subcapa de amina funcionalizada 603 para estimular la fijacion de las celulas vivas 601 a la pelfcula polimerica 602. De acuerdo con esta realizacion, la tira continua de pelfcula polimerica con celulas sembradas 601 602 se traslada segun sea necesario mediante un mecanismo de direccion motorizado con rodillo de traccion.
En una realizacion preferida, las celulas vivas 601 se presentan al aparato de grabacion digital 801 y se exponen a una sustancia de ensayo colocando una seccion de la pelfcula polimerica con celulas sembradas 601.602 bajo un grupo de una o mas celdas de flujo 701, donde cada celda de flujo 702 comprende una cavidad 803 que tiene una superficie superior opticamente transparente 804 y paredes laterales elastomericas 805 para facilitar el sellado de la pelfcula polimerica 602. En una realizacion preferida, las dimensiones de cada celda de flujo son aproximadamente 1,5 mm de anchura x 1,5 mm de altura x 8 mm de longitud. En esta realizacion se proporciona aberturas 703 en cada extremo de las celdas de flujo de modo que se puede inyectar una sustancia de ensayo en un extremo y salir por el otro extremo. Opcionalmente, en esta realizacion las aberturas 703 en cada extreme de la celda de flujo incluyen contactos electricos que se usan para administrar un protocolo de estimulacion electrica a las celulas vivas.
Asimismo, en esta realizacion el grupo de una o mas celdas de flujo 701 esta conectado a un mecanismo de pinzamiento 806 comprendido por un accionador vertical motorizado 807 y un soporte de conexion 808 de forma que las celdas de flujo pueden elevarse por encima o pinzarse de forma forzada contra la superficie superior de la pelfcula polimerica 602. Cuando se pinzan, cada celda de flujo forma un ambiente independiente reversible y 5 completamente encerrado 809 alrededor de una seleccion de celulas vivas, lo que permite la introduccion de una sustancia de ensayo, la administracion de un protocolo de estimulacion electrica opcional y las grabaciones de video digital de las celulas vivas encerradas 601.
Claims (4)
- 51015202530REIVINDICACIONES1. Un aparato para obtencion de imagenes digitales de celulas vivas bajo el efecto de una sustancia de ensayo, que comprende:un aparato de grabacion digital (801) para designar de un modo automatico una o mas regiones celulares a partir de un fotograma de v^deo de una grabacion de video de las celulas vivas antes de la exposicion a la sustancia de ensayo; yuna tira de pelfcula opticamente transparente o semitransparente (602) capaz de adherirse a las celulas vivas y de presentar las celulas vivas al aparato de grabacion digital (801); caracterizado porun canal de fluidos (501) que tiene un puerto de entrada para fluidos (502) en un extremo de la entrada (503) y un puerto de salida para fluidos (504) en un extremo de salida (505); un dispositivo de bombeo de fluidos conectado al puerto de entrada (502) del canal de fluidos (501), donde la tira de pelfcula opticamente transparente o semitransparente (602) es capaz de atravesar el canal de fluidos (501);al menos una celda de flujo (702) colocada sobre la pelfcula (602), comprendiendo la celda de flujo (702) una cavidad (803) que tiene una superficie superior opticamente transparente (804) y paredes laterales (805) capaces de formar un sello con la pelfcula (602) para formar un ambiente cerrado (809); y un accionador vertical (807) conectado a la al menos una celda de flujo (702) capaz de elevar la al menos una celda de flujo (702) por encima de la pelfcula (602) o descender la al menos una celda de flujo (702) sobre la pelfcula (602).
- 2. El aparato de la reivindicacion 1, que comprende ademas un dispositivo de calentamiento (508) para calentar una parte del canal de fluidos (501).
- 3. El aparato de la reivindicacion 1, donde la tira de pelfcula opticamente transparente o semitransparente (602) es continua.
- 4. El aparato de la reivindicacion 1, donde la al menos una celda de flujo (702) comprende ademas contactos electricos en cada extremo capaces de administrar un protocolo de estimulacion electrica a las celulas vivas.
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