ES2563781T3 - Método de IRMf para identificar estímulos olfativos del sistema de recompensa dopaminérgico - Google Patents

Abstract

Un método de identificar una muestra de fragancia de interés, para preparar un acuerdo o una fragancia completamente formulada, en donde el método comprende: a) someter a un grupo de sujetos a un primer protocolo que comprende: - hacer que cada sujeto de dicho grupo huela un olor control - capturar escáneres cerebrales de imagenología de resonancia magnética funcional (IRMf) de cada sujeto que huele el olor control de modo que se detecte la actividad cerebral de cada sujeto; b) someter al mismo grupo de sujetos a un segundo protocolo que comprende: - hacer que cada sujeto de dicho grupo huela una muestra de fragancia que se va a probar; - capturar escáneres cerebrales de IRMf de cada sujeto que huele la muestra de fragancia que se va a probar de modo que se detecte la actividad cerebral de cada sujeto; c) promediar la actividad cerebral de todos los sujetos como se obtiene en el primer protocolo y en el segundo protocolo; y d) contrastar la actividad cerebral media resultante obtenida en el segundo protocolo con la actividad cerebral media resultante obtenida en el primer protocolo mediante lo cual se determina un número de vóxeles activados adyacentes; en donde si un grupo de vóxeles activados adyacentes tiene un volumen igual a o mayor que un valor umbral en al menos tres de las siguientes áreas cerebrales, o si un grupo tiene un número de vóxeles activados adyacentes igual a o mayor que un valor umbral en al menos tres de las siguientes áreas cerebrales: VTA, corteza prefrontal, cuerpo estriado y complejo amígdala-hipocampo, entonces la muestra de fragancia probada se considera que es de interés para preparar un acuerdo o una fragancia completamente formulada.

Description

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DESCRIPCION

Metodo de IRMf para identificar estfmulos olfativos del sistema de recompensa dopaminergico Campo tecnico de la invencion

La invencion se refiere al uso de IRM funcional (RMIf) cuantitativa, tecnica de mapeo para distinguir respuestas humanas a estimulos olfativos en particular estimulos por ingredientes de fragancia, acuerdos o fragancias completamente formuladas que inducen un efecto de recompensa.

Antecedentes de la invencion

Las tecnicas de investigacion de consumidores convencionales solo tienen exito limitado en predecir si un producto sera un exito comercial o no. Es deseable tener una tecnica de medir la respuesta del cerebro a estimulos sin el tiempo y la reflexion requeridos en formular y expresar ideas verbalmente, en respuesta a preguntas. Las tecnicas de imagenologfa de resonancia magnetica ofrecen una manera de investigar como responde un consumidor a un estfmulo de una manera no verbal mientras el cerebro interpreta el estfmulo; permite la visualizacion tanto de la respuesta primaria (por ejemplo, en la corteza piriforme, CP) como el procesamiento adicional de las senales sensoriales (por ejemplo, en la corteza orbitofrontal, COF). El consumidor tiene que usar, o experimentar el producto para reaccionar a el y en el contexto de medir respuesta cerebral por IRM esto puede ser diffcil para muchos productos. Sin embargo, es posible introducir estfmulos olfativos a sujetos de una manera exacta y precisa, al tiempo que se mide la respuesta cerebral, usando una forma espedfica de olfactometro.

Un olfactometro es un dispositivo disenado para proporcionar un numero de estfmulos olfativos a sujetos de una manera controlada y reproducible. Los requisitos de la tecnica de escaner de IRM impone restricciones en el diseno de olfactometros adecuados para uso junto con escaneres de IRM. Una restriccion principal es la eliminacion de materiales magneticos de la vecindad del escaner. Debido a la disponibilidad de olfactometros que se pueden usar junto con escaneres de IRM el interes en medir la respuesta cerebral por IRM a estfmulos olfativos ha aumentado significativamente en los ultimos anos. La mayor parte del interes en medidas de IRM con olfato se ha centrado en respuestas hedonicas a estfmulos (vease, por ejemplo, Zatorre R.L. Jones-Gottman M, Rouby C, Neural mechanisms involved in odor pleasantness and intensity judgements Neuroreport 11 2711-2716 (2000) o Kobal G, Kettenmann B, Int. J. Psychophysiology 36 (2)157-163 2000).

Una vision ampliamente sostenida sobre la respuesta emocional es que tenemos 6 emociones basicas (Ekman et al, J of Personality and Social Psychology 1987 v53, p712):

• Ira

• Repulsion

• Miedo

• Felicidad

• Tristeza

• Sorpresa.

Estas emociones estan relacionadas con recompensa, pero recompensa es un efecto de activar estas emociones; de hecho, un desenlace de la activacion de todas estas emociones puede ser recompensa (si se supera el miedo entonces eres valiente y seras recompensado; la proxima vez se puede buscar miedo para experimentar esta recompensa, etc.).

La ruta dopaminergica algunas veces se llama la ruta de la recompensa, y generalmente se asocia con funciones tales como:

- motivacion y respuesta emocional

- recompensa y deseo

- placer, euforia,

- adiccion, compulsion.

Las recompensas generalmente se experimentan como “hacer las cosas mejor” y por tanto gustan, se desean y persiguen. La recompensa se puede expresar usando palabras o expresiones que comunican un sentimiento intenso de bienestar.

Las areas del cerebro implicadas en la ruta dopaminergica se entienden bien, y se pueden encontrar descripciones generales en textos estandar tales como The Brain Atlas, TA.Woolset et al (Wiley 2008, ISBN 978-0-470-08476-2), con detalles mas espedficos en artfculos de revision tal como "Dopaminergic reward system: a short integrative review" por O. Arrias-Carrion et al, International Archives of Medicine 2010, 3:24, y en Everitt et al, Brain Res Brain Res Review 36, p129-138 (2001). La ruta implica el area tegmental ventral (localizada en el mesencefalo dopaminergico), nucleo accumbens, cuerpo estriado (nucleo caudado y putamen), amfgdala, hipocampo y corteza prefrontal (giro frontal superior, medio, inferior) y giro cingulado anterior.

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En una revision de estudios de IRMf usando diversos estimulos Sharpley y Bitsika (Behav Brain Res 13 Jul 2010) advirtieron que el area tegmental ventral (VTA) se activaba tanto por amor materno como romantico, y comentaron que en casi todos los estudios de amor, humor y otras formas de placer, las areas activadas tambien son las asociadas con procesos de recompensa. Sharpley y col. tambien advirtieron que la activacion de VTA y el nucleo accumbens tambien estaba asociada con alegna/felicidad/risa, y esto se puede entender en el contexto de que con frecuencia son los desenlaces de recompensa de una experiencia emocional.

Normalmente, la estimulacion de la ruta de la dopamina se logra por estfmulos “fuertes”; fotograffas de seres amados, recompensa monetaria, etc. No hay evidencia hasta la fecha de que un olor placentero pueda activar la ruta de la dopamina. Sorprendentemente, los presentes inventores han encontrado que esta ruta se puede activar por el olor de una muestra de fragancia (como se define posteriormente). Incluso mas sorprendentemente, los presentes inventores han encontrado que algunas, pero no todas las muestras de fragancia, provocan una recompensa a traves de la ruta dopaminergica, y han disenado un metodo que usa imagenologfa iRMf para cribar materiales de interes. El mismo metodo se puede usar directamente para evaluar la capacidad de cualquier estfmulo olfativo de estimular la ruta de recompensa.

Westermann et al. (J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry 2008, 79:19-24) es un estudio dirigido a determinar la imagenologfa funcional del sistema olfativo cerebral en pacientes con enfermedad de Parkinson. Smejkal et al. (Bratisl. Lek Listy 2003, 104(6): 184-188) es un estudio dirigido a localizar areas cerebrales olfativas secundarias activadas por un estfmulo agradable. Gottfried et al. (J. Neurosci., 15 diciembre, 2002, 22(24): 10829-10837) es un estudio que describe el uso de imagenologfa de resonancia magnetica funcional relacionada con sucesos para delinear los sustratos neurales que subyacen el acondicionamiento olfativo humano.

Compendio de la invencion

En un aspecto, la presente invencion proporciona un metodo segun la reivindicacion 1 de identificar una muestra de fragancia de interes para preparar un acuerdo o una fragancia completamente formulada, en donde el metodo comprende:

a) someter un grupo de sujetos a una prueba de IRMf durante la cual cada sujeto huele un olor control y una muestra de fragancia de prueba;

b) capturar escaneres cerebrales de IRMf de cada sujeto que huele el olor control y la muestra de fragancia de prueba de modo que se detecte la actividad cerebral de cada sujeto;

c) promediar la actividad cerebral de todos los sujetos cuando huelen el olor control y la muestra de fragancia de prueba, respectivamente; y

d) contrastar la actividad cerebral promediada de los sujetos cuando huelen la muestra de la fragancia de prueba con la actividad cerebral promediada de los sujetos cuando huelen el olor control.

En aun un aspecto adicional, la presente invencion proporciona un metodo segun la reivindicacion 6 de preparar un acuerdo o una fragancia completamente formulada, que comprende identificar una muestra de fragancia de interes por el metodo mencionado anteriormente y formular dicha muestra en una fragancia.

En aun otro aspecto, la presente invencion se refiere a un metodo segun la reivindicacion 8 de usar una muestra de fragancia identificada por el metodo mencionado anteriormente en un producto de consumo.

Definiciones

Como se usa en el presente documento, el termino “actividad cerebral” significa actividad fisiologica y bioqmmica en el cerebro humano, o una region del cerebro, asociada con actividad mental, incluyendo, pero no limitada a, aumentos en el flujo sangumeo para activar regiones del cerebro, cambios en el nivel de oxfgeno en la sangre, aumentos en la actividad metabolica (por ejemplo, consumo de glucosa), cambios en el potencial electrico de neuronas, y la liberacion de neurotransmisores. La actividad cerebral se puede medir de forma no invasiva, por ejemplo, midiendo cambios en campos electricos, campos magneticos que emanan del craneo.

Como se usa en el presente documento, el termino “area cerebral” se refiere a un volumen de tejido en el cerebro humano, que puede ser de cualquier forma y que se puede caracterizar anatomica o espacialmente.

Como se usa en el presente documento, los terminos “frontal”, “anterior”, “posterior”, “superior” e “inferior” tienen sus significados acostumbrados en anatoirna. Vease, por ejemplo, Stedman’s Medical Dictionary.

Las localizaciones espedficas dentro del cerebro, o volumenes en el cerebro, tambien se pueden describir mediante referencia a sistemas de coordenadas tridimensionales. Uno de tales sistemas es el descrito por Talairach y Tournox (Stereotaxic Coplanar Atlas of the Human Brain publicado por Thieme en 1988 ISBN 9783137117018), y se basa en unico cerebro considerado tfpico por los autores. Las imagenes o mapas cerebrales de sujetos individuales se pueden comparar a tales cerebros plantilla por comparacion visual, o se pueden usar programas de software

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informatico que mapean los cerebros individuals en un cerebro plantilla. Por ejemplo, el software Statistical Parametric Mapping (SPM), descrito posteriormente, realiza automaticamente un registro espacial y normalizacion de los cerebros individuales en la plantilla MNI. Tambien esta disponible software que determina la correspondencia entre coordinadas MNI y coordenadas de Talairach (por ejemplo, MRIcro, disponible en
www.cla.sc.edu/psyc/faculty/rorden/mricro.html; vease tambien Rorden y Brett (2000), Behavioural Neurology, 12:191-200).

Como se usa en el presente documento, el termino “voxel” se refiere a un punto de datos multidimensional correspondiente a un volumen espedfico en el espacio, y particularmente se refiere a tal punto de datos obtenido de un procedimiento de imagenologfa del cerebro y que corresponde a un volumen espedfico en el cerebro. El tamano del voxel depende del procedimiento y equipo experimental, notablemente la resolucion del instrumento de IRMf. En esta solicitud se uso un instrumento de 1,5 Tesla, pero hoy estan comercialmente disponibles instrumentos de hasta 7 tesla.

Como se usa en el presente documento, el termino “mapa de activacion cerebral” significa un conjunto o matriz de datos en las que cada punto de datos corresponde a un punto o volumen en un cerebro humano. Cada punto de datos puede consistir en un unico dato asociado con una coordenada cerebral, o puede consistir en una matriz de datos multidimensionales asociados con una coordenada cerebral. El mapa de activacion cerebral se puede mostrar como una representacion bi o tridimensional, o se puede almacenar como un conjunto de datos que se muestran graficamente.

Como se usa en el presente documento, el termino “muestra de fragancia”, se supone que significa:

- cualquier material individual, por ejemplo, un “ingrediente de fragancia” (que es sinonimo con los terminos “ingrediente de perfume” y “material de perfume”), que puede ser un ingrediente en un acuerdo o una fragancia completamente formulada;

- una mezcla de materiales individuales como se ha definido anteriormente, tal como por ejemplo un acuerdo o una fragancia completamente formulada. Las mezclas de materiales individuales pueden comprender hasta 40 ingredientes de fragancia, por ejemplo, al menos 10, preferiblemente al menos 20, mas preferiblemente al menos 30 ingredientes de fragancia.

El experto en la materia apreciara que un ingrediente de fragancia puede el mismo comprender muchos compuestos qmmicos individuales y poseer un olor agradable. Esta distincion la entienden quienes son familiares con la tecnica de la creacion de fragancias. Un ingrediente de perfume o material de perfume puede ser cualquier aceite o extracto natural, o compuesto qmmico usado en una composicion de fragancia. Los aceites y extractos naturales se describen en The Essential Oils por E Guenther publicado por Van Nostrand y puede incluir extractos y destilados de cualquier parte de plantas adecuadas: rafces, rizomas, bulbos, cormos, tallo, corteza, duramen, hojas, flores, semillas y fruto. Los ejemplos de tales extractos y destilados incluyen aceites de dtricos tal como aceite de naranja o limon, aceites de arboles tal como aceite de pino o cedro, aceites de hierbas tal como aceite de menta, aceite de tomillo, aceite de romero, aceite de clavo o extractos de flores tal como aceite de rosa, o aceite de geranio. Tambien se conocen una amplia variedad de materiales odonferos sinteticos para uso de perfumena, incluyendo materiales que poseen una variedad de grupos funcionales qmmicos, tal como acetales, alquenos, alcoholes, aldefndos, amidas, aminas, esteres, eteres, iminas, nitrilos, cetales, cetonas, oximas, tioles, tiocetonas, etc. Sin querer estar limitado, en la mayona de los casos, los ingredientes de perfume son compuestos odonferos que tienen pesos moleculares entre 70 unidades de masa y 400 unidades de masa para asegurar la suficiente volatilidad. Los ingredientes de fragancia no contendran grupos funcionales fuertemente ionizantes tal como sulfonatos, sulfatos o iones de amonio cuaternario. Los ingredientes de perfume se describen mas completamente en S. Arctander, Perfume flavors and Chemicals. Vols. I y II, Montclair, N.J., the Merck Index, 8a Edicion, Merck & Co., Inc. Rahway, N.J. y Allured's Flavor and Fragrance Materials 2008 publicado porAllured Publishing Corp ISBN 1-932633-42-1 todos los cuales se incorporan al presente documento mediante referencia.

Descripcion detallada de la invencion

En un primer aspecto, la presente invencion proporciona un metodo de identificar una muestra de fragancia de interes en donde el metodo comprende:

a) someter a un grupo de sujetos a un primer protocolo que comprende:

- hacer que cada sujeto de dicho grupo huela a un olor control,

- capturar escaneres cerebrales de imagenologfa de resonancia magnetica funcional (IRMf) de cada sujeto que huele el olor control de modo que se detecte la actividad la actividad cerebral de cada sujeto;

b) someter al mismo grupo de sujetos a un segundo protocolo que comprende:

- hacer que cada sujeto de dicho grupo huela una muestra de fragancia que se va a probar;

- capturar escaneres cerebrales de IRMf de cada sujeto que huele la muestra de fragancia que se va a probar de modo que se detecte la actividad cerebral de cada sujeto,

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c) promediar la actividad cerebral de todos los sujetos obtenida en el primer protocolo y en el segundo protocolo; y

d) contrastar la actividad cerebral promediada resultante obtenida en el segundo protocolo con la actividad cerebral promediada obtenida en el primer protocolo mediante lo cual se determina un numero de voxeles adyacentes activados;

en donde si un grupo de voxeles adyacentes activados tiene un volumen igual a o mayor que un valor umbral, o si un grupo tiene un numero de voxeles activados adyacentes igual a o mayor que un valor umbral, en al menos tres areas cerebrales seleccionadas de VTA, corteza prefrontal, cuerpo estriado y complejo airngdala-hipocampo, entonces la muestra de fragancia probada se considera que es de interes.

Inhalar cualquier olor provoca actividad cerebral debido al procesamiento del olor, que se detecta por IRMf como se detalla posteriormente. La presente invencion se basa en el sorprendente descubrimiento de que la activacion simultanea de al menos tres de las siguientes areas cerebrales espedficas: el area tegmental ventral dopaminergica, corteza prefrontal, cuerpo estriado y complejo amigdala-hipocampo en respuesta a oler una muestra de fragancia es evidencia de que la ruta dopaminergica se ha activado.

El metodo de la invencion comprende un primer paso donde sujetos en un grupo de sujetos huele cada uno un olor control y la actividad cerebral de cada sujeto se determina usando IRMf. El grupo de sujetos tfpicamente comprende al menos 5 sujetos, preferiblemente al menos 10 sujetos. El olor control es preferiblemente aire o un solvente diluido en aire. Cualquier solvente inodoro comunmente usado en perfumena, por ejemplo, dipropilenglicol o citrato de trietilo, se puede usar en el metodo de la invencion. En una forma de realizacion, el olor control tambien puede ser una muestra de fragancia como se ha definido anteriormente (por ejemplo, un material individual tal como, por ejemplo, rosa absoluto, o un acuerdo o una fragancia existente contra la que se prueba una nueva fragancia) que activa ninguna o solo una de las cuatro areas cerebrales espedficas mencionadas anteriormente (area tegmental ventral, corteza prefrontal, cuerpo estriado y complejo amfgdala-hipocampo).

En un segundo paso, el mismo grupo de sujetos huele una fragancia de prueba y la actividad cerebral de cada sujeto se determina otra vez usando IRMf.

El olor control y la muestra de fragancia se administran a una de las narinas del sujeto a traves de un olfactometro. Para evitar que las vfas nasales se sequen, el olor control y la muestra preferiblemente se humidifican antes de ser introducidas en la nariz.

En un tercer paso, la actividad cerebral de todos los sujetos que han olido el olor control se promedia, y la actividad cerebral de todos los sujetos que han olido la muestra de prueba tambien se promedia.

El siguiente paso comprende contrastar las actividades cerebrales promediadas resultantes. Esto se hace tfpicamente restando la actividad cerebral promediada del 'grupo control' de la actividad cerebral promediada del 'grupo de prueba'. Como resultado de la resta se determina el numero de voxeles activados adyacentes en el espacio tridimensional, es decir, los voxeles adyacentes con flujo sangumeo (o actividad) significativamente diferente, es decir, voxeles que pasan la prueba de la t de Student (p<0,005) en cada area cerebral estudiada. La distribucion de voxeles se analiza y se identifican grupos de voxeles activados. Tamanos de grupos significativos simultaneamente en al menos tres areas cerebrales seleccionadas de area tegmental ventral, corteza prefrontal, cuerpo estriado y complejo amfgdala-hipocampo indican que la ruta de la recompensa esta activada. Este procedimiento se explica en mas detalle posteriormente.

El resultado del paso de contrastar se compara a un valor umbral. El valor umbral preferiblemente se elige basado en una comparacion del valor de un unico voxel respecto a todos los otros valores de todos los otros voxeles en las areas cerebrales estudiadas. El valor umbral se puede basar en el volumen de grupo o en el numero de voxeles activados adyacentes en un grupo. Los voxeles son tfpicamente cubos, o cuboides, que miden, por ejemplo, de aproximadamente 0,5 mm hasta aproximadamente 7 mm por lado. En una forma de realizacion ejemplar, se usa un voxel de 3,0x3,0x3,75 mm3; en esta forma de realizacion el valor umbral se ha ajustado como que es de un mmimo de 9 voxeles activados adyacentes en el espacio tridimensional, o un volumen de grupo (de voxeles activados adyacentes) de al menos aproximadamente 303 mm3.

Alternativamente, el paso de resta definido anteriormente se puede realizar contrastando, para cada sujeto, la actividad cerebral obtenida en el segundo protocolo con la actividad cerebral obtenida en el primer protocolo; y despues promediando la actividad cerebral contrastada resultante de todos los sujetos.

La actividad cerebral se mide detectando senales cerebrales; restar senales 'control' de senales 'medidas' da senales que muestran estfmulos de olor, que despues se computan y transforman en un mapa tridimensional como se explica posteriormente. La actividad cerebral preferiblemente se mide usando el metodo dependiente de nivel de oxfgeno en sangre (BOLD), que es una tecnica reconocida para medir actividad cerebral que se correlaciona con el consumo aumentado de energfa por el cerebro y el contraste entre oxihemoglobina y desoxihemoglobina.

Seleccion de sujetos

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Se requiere que los sujetos puedan leer y escribir y tengan la capacidad de proporcionar consentimiento informado. Los sujetos potenciales se excluyen si tienen trastorno psiquiatrico presente o pasado diferente de simples fobias pero incluyendo toxicomama/drogodependencia determinado por Structured Clinical Interview for DSM-IV Axis I Disorders (SCID-I) (First et al., (1195); antecedentes de enfermedad neurologica; un estado medico actualmente inestable; han usado medicacion psicotropica en 5 semividas del tiempo de procedimiento; cualquier implante metalico o metralla que hana un procedimiento de IRM inseguro; dispositivos medicos no removibles tales como marcapasos o audffonos fijos; incapacidad previa para tolerar un procedimiento de IRM; o claustrofobia suficientemente grave para inducir ansiedad sustancial en espacios cerrados. Otros criterios de exclusion incluyen edad menor de 9 anos, antecedentes de cualquier enfermedad que se sabe tiene un impacto en la funcion olfativa (por ejemplo, diabetes, enfermedad de Parkinson, insuficiencia renal, etc.). Un examen ENT (ofdo, nariz y garganta) completo excluyo patologfas que podnan interferir con la capacidad olfativa: rinitis o sinusitis aguda o grave cronica, desviacion del tabique grave, antecedentes de traumatismo, polipos nasales, etc. Los sujetos tambien completaron un inventario de predominancia manual para la participacion en el experimento. Se prefiere evitar variaciones debido al sexo o predominancia manual, de modo que los sujetos se seleccionan para comprender paneles o grupos de un solo sexo y que tienen la misma mano predominante.

Habiendo pasado los criterios de seleccion anteriores solo se seleccionaron sujetos normosmicos para la prueba. Varias pruebas estan comercialmente disponibles para asegurar que los sujetos tienen un sentido del olor normal. Tales pruebas vanan desde pruebas de identificacion de olor a pruebas mas sofisticadas de umbral y discriminacion. Cualquier prueba adecuada debe estar validada y ser fiable. En el ejemplo dado a continuacion se uso una prueba de “Sniffin' Sticks” para evaluar la funcion olfativa. Para informacion adicional sobre Sniffin Sticks vease T Hummel, B Sekinger, SR Wolf, E Pauli, y G Kobal Sniffin Sticks: Olfactory Performance Assessed by the Combined Testing of Odor Identification, Odor Discrimination and Olfactory Threshold en Chem. Senses 1997 vol 22 pp39-52 o T Hummel, K Rosenheim, C-G Konnerth y G Kobal Screening Olfactory Function with a Four Minute Odor Investigation Test Reliability Normative Data and Investigations in Patients with Olfactory Loss en Ann. Otol. Rhinol. and Laryngol 2001 vol 110 pp976-981. Sniffin Sticks estan disponibles de Burghardt Gmbh Wedel Alemania. Para la presentacion del olor el experimentador retira la tapa durante aproximadamente 3 s y la punta de la pluma se coloca aproximadamente a 2 cm delante de ambas narinas. La prueba de identificacion de olor implica la evaluacion de 12 olores comunes (canela, platano, limon, regaliz, pina, cafe, clavo, rosa, cuero, pescado, naranja, menta). Usando una tarea de eleccion multiple, la identificacion de los odorantes individuales se realizo a partir de una lista de 4 descriptores por olor. El intervalo entre presentaciones de olor fue 20-30 s. Todas las medidas se realizaron en una habitacion silenciosa con aire acondicionado. Se requenan 10 o mas respuestas correctas para la participacion en los experimentos posteriores.

Preparacion de las muestras de prueba

Las muestras de prueba de los materiales de fragancia se prepararon para tener intensidad olfativa igual usando el metodo estatico de ASTM E544 (1999) Standard Practice for Referencing the Intensity of Ambient Odours Procedure B Static Methods usando n-butanol como referencia.

Escaner de IRMf

Se puede usar cualquier dispositivo de IRM adecuado para lograr las imagenes de IRMf deseadas, que sea capaz de operar usando una secuencia imagenologfa de eco de espm, eco planar (SE-EPI). Este protocolo EPI se optimiza detectando cambios sutiles en los niveles de oxfgeno en sangre en el cerebro a lo largo del tiempo. El escaner EPI es una manera eficaz de medir cambios en la senal dependiente del nivel de oxfgeno en sangre (BOLD) que se ha mostrado que se correlaciona con precision con cambios en la actividad neural. Se tomaron escaneres que cubnan el cerebro entero lo que permitir el seguimiento continuo del cerebro entero a lo largo de cada evaluacion. Los escaneres de IRM adecuados estan disponibles de Siemens AG, Phillips, GE Healthcare, Varian, Toshiba e Hitachi.

Olfactometro

Se puede usar cualquier olfactometro que sea adecuado para uso con un escaner de IRMf. Los disenos adecuados de olfactometros han sido descritos por Kobal (Electroencephalography and clinical neurophysiology 71, 241-250, 1988) y Sobel (J. Neuroscience methods 78, 115-123, 1997) y olfactometros comerciales adecuados estan disponibles de Burghart Medezintechnik GmbH de Wedel Alemania. Para minimizar el movimiento de cabeza los odorantes se aplican por via intranasal por medio de una canula con un diametro interno de 2-3 mm. Esta canula se inserta por ~1 cm en la narina de modo que su abertura esta mas alla de la valvula nasal. La presentacion de los odorantes no activa simultaneamente mecano o termorreceptores en la mucosa nasal, ya que los pulsos de olor estan embebidos en una corriente de aire (tfpicamente 6-8 l/min) que fluye constantemente termostatizada (36°C), humidificada (HR del 80%) que se vuelve rapidamente indetectable despues de unos minutos. Por tanto, los sujetos no perciben ningun cambio cuando el olfactometro cambia de un estado de no estfmulo a un estfmulo y viceversa, ni los sujetos experimentan ninguna interferencia de estimulacion mecanica o termica. Las velocidades del flujo de aire estan determinadas por controladores de flujo de masa que, junto con valvulas de cambio, estan controladas por ordenador. Por tanto, el equipo permite la configuracion de secuencias de estfmulos con diferente calidad,

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intensidad, duracion o intervalo interestimulo y multiples repeticiones para alcanzar la maxima exactitud y precision en la presentacion de las muestras.

Analisis de los datos estadisticos

Los metodos para el analisis estadfstico de los cambios en la actividad cerebral se conocen en la tecnica y, para algunos dispositivos de medida de actividad cerebral, estan comercialmente disponibles paquetes de software informatico que estan espedficamente adaptados para analizar los datos. Por ejemplo, los datos de SPECT, TEP o IRM se pueden analizar usando los paquetes Dot o EMMA (Extensible MATLAB Medical image Analysis) que estan ambos libremente disponibles del paquete de software MNI o SPM que esta libremente disponible del Laboratorio de Imagenologfa funcional de Wellcome Department of Imaging Neuroscience en University College de Londres, UK (
www.fil.ion.ucl.ac.uk/spm/). Los softwares EMMA y SPM se basan en el lenguaje de programacion MATLAB® (MathWorks, Inc., Natick, Mass.), con rutinas adicionales en el lenguaje de programacion C. Un modulo SPM se incorpora en el software comercialmente disponible MEDx (Medical Numerics, Inc., Sterling, Va.).

El software SPM usa un modelo estadfstico parametrico en cada voxel, usando un modelo lineal general para describir la variabilidad de los datos en terminos de efectos experimentales y de confusion, y variabilidad residual. Las hipotesis expresadas en terminos de los parametros del modelo se evaluan en cada voxel con estadfstica univariable. La convolucion temporal del modelo lineal general para IRMf permite la aplicacion de resultados de regresion correlacionada en serie, lo que permite la construccion de imagenes estadfsticas de la serie en tiempo de IRMf. El problema de comparaciones multiples de evaluar simultaneamente toda la estadfstica de los voxeles se aborda usando la teona de campos aleatorios continuos, que asume que la imagen estadfstica en una buena representacion en red de un campo aleatorio estacionario continuo subyacente. Los resultados para la caractenstica de Euler producen valores p corregidos para cada hipotesis de voxel. Ademas, la teona permite la computacion de valores p corregidos para grupos de voxeles k que superan un umbral determinado, y para conjuntos enteros de grupos por encima del umbral, lo que produce pruebas estadfsticas mas poderosas a costa de algo de poder localizador (vease, Friston et al., Magnetic Resonance in Medicine 35 346-355 1996 y referencias de la misma).

El enfoque estadfstico usado para evaluar el conjunto general de datos de IRMf es una variante de serie de tiempo de la forma del analisis de varianza (ANOVA) de un modelo lineal general. El analisis estadfstico prueba cada voxel del cerebro, para cada sujeto, contra la hipotesis nula (que a lo largo de la duracion de la prueba la subida y cafda de la senal BOLD proveniente de ese voxel no se correlaciona con los inicios y finales de los ciclos de presentacion de los olores). Se crea un modelo ponderado que empieza con un simple modelo de tipo onda cuadrada de sucesos del momento encendido-apagado para una unica variable de tarea de interes.

El modelo ANOVA permite usar regresores para variables molestas. En la presente invencion, se usa la potencia de la senal global del cerebro entero como tal regresor. La potencial de la senal global del cerebro respondera de fluctuaciones en el cerebro causadas por ciclos respiratorios, ciclos de flujo cardiaco, parpadeo, etc. Estas variaciones de senales se producen a traves de cerebro entero, y con frecuencia pueden ser de una magnitud mayor que los cambios localizados en la senal BOLD resultante de la senal olfativa. Estas variaciones de senal que se producen a traves del cerebro se pueden restar de las senales de IRMf medidas para mostrar las senales resultantes de los estfmulos de olor.

El producto resultante de la computacion ANOVA en los datos de IRMf de una unica persona es una matriz tridimensional de valores t que se pueden representar como un mapa tridimensional. Este mapa de valores t se puede convertir despues en un mapa de probabilidad (un mapa de valores p correspondientes) y los resultados se pueden mostrar graficamente a cualquier umbral que se desee (por ejemplo, p<0,05). Los resultados se pueden superponer sobre una imagen de IRM de mayor resolucion, para facilitar la identificacion de estructuras corticales de granulos mas finos.

Para combinar los datos de mas de un sujeto, primero se normaliza el cerebro de cada sujeto en un espacio esterotactico tridimensional comun antes de computar el mapa t de cada individuo. A continuacion, el valor de la suma de los pesos de contraste para cada voxel de cada sujeto computado durante el ANOVA (basicamente, el numerador de la estadfstica t) se introduce como un unico punto de datos en una nueva computacion de estadfstica t de “segundo nivel”. En esta computacion de segundo nivel, despues, el valor medio de cada voxel a traves de sujetos se modela como el termino efecto y la varianza entre sujetos como el termino error. Una consecuencia importante de este enfoque que hay que tener en cuenta es que es muy poco probable que un voxel muestre activacion significativa en el mapa de nivel de grupo, a menos que virtualmente todos los sujetos muestren activacion en ese voxel. Tambien se considera solo que las areas cerebrales se activan si un numero de voxeles adyacentes muestran una significacion estadfstica por encima del estandar de probabilidad designado.

Para fines de analisis estadfstico y exposicion grafica, los datos sin procesar sobre la actividad cerebral habitualmente se agrupan en voxeles que corresponden a volumenes fijados del cerebro del sujeto. El tamano del voxel puede variar dependiendo de la capacidad de resolucion del dispositivo de medida de la actividad cerebral o el grado deseado de precision en identificar regiones cerebrales. Se debe indicar, sin embargo, que voxeles mas pequenos tiene peores proporciones de senal respecto a ruido y mayores artefactos de susceptibilidad debido a

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efectos de volumenes parciales. Tfpicamente, los voxeles son cubos, o cuboides que miden, por ejemplo, de 0,5 mm a 7 mm por lado (por ejemplo, 3,0x3,0x3,0 mm3). Los datos se pueden mostrar despues graficamente codificando por color los voxeles segun algun valor estad^stico y mostrando las secciones transversales en las que los niveles de actividad o cambios en los niveles de actividad se mapean en dos dimensiones. Generando una serie de tales secciones transversales coplanares, se puede mapear el volumen cerebral entero.

Cuando se realizan analisis estadfsticos en imagenes cerebrales, los investigadores pueden seleccionar un valor de probabilidad apropiado para evaluar la significacion estadfstica. El valor particular elegido puede variar dependiendo del fin del analisis estadfstico y el nivel de certeza requerido. En los estudios descritos en el ejemplo se eligio que el nivel para significacion estadfstica fuera p<0,005.

El metodo descrito anteriormente hace posible identificar muestras de fragancia que provocan una recompensa a traves de la ruta dopaminergica.

Un aspecto adicional de la invencion se refiere a un metodo para preparar un acuerdo o una fragancia completamente formulada que comprende:

a) identificar al menos una muestra de fragancia de interes por el metodo descrito anteriormente;

b) formular dicha(s) muestra(s) de fragancia en un acuerdo o fragancia completamente formulada.

En una forma de realizacion, el acuerdo o la fragancia completamente formulada comprende vainillina.

Las muestras de fragancia asf identificadas, que provocan una recompensa a traves de la ruta dopaminergica, tambien se pueden usar en productos de consumo tal como productos para el hogar, productos de lavandena, productos de cuidado personal y productos cosmeticos (incluyendo fragancias alcoholicas y agua de colonia). Tales productos incluyen detergentes, por ejemplo, detergentes para lavadora, suavizantes y acondicionadores de ropa, champus, acondicionadores de cabello, lociones para la piel, aceites corporales, desodorantes, productos de proteccion solar.

La invencion se ilustra mediante los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplo 1

Se seleccionaron 18 sujetos mujeres diestras para tomar parte en el experimento de IRMf. Se olieron los siguientes aromas agradables segun el procedimiento detallado a continuacion:

Vainillina, preparada por recristalizacion de una calidad comercial, se uso como solucion al 15% en dipropilenglicol;

Thesaron® (el nombre comercial de trans-2,2,6-trimetilciclohexanocarboxilato de etilo) esta disponible de Takasago, y se uso como una solucion al 20% en dipropilenglicol;

Rosa absoluta de Marruecos (disponible de Biolandes, Francia) se uso como una solucion al 0,5% en dipropilenglicol;

Acetato de isobornilo (IBA, disponible de Arco, Francia) se uso como una solucion al 1% en dipropilenglicol.

Las muestras se prepararon para tener igual intensidad de olor. Los estfmulos de olor se administraron a la narina derecha de los sujetos en el escaner a traves de un olfactometro de dilucion de aire controlado por ordenador (Burghart OM8b), que permitfa la alternancia entre condiciones de estimulacion olfativa (ON) y no olfativa (OFF) en un diseno de bloque de 20 s ON/20 s OFF. Los estfmulos se administraron durante 1 s cada 2 s durante el periodo ON. Cada periodo ON iba seguido por un periodo OFF basal de 2 s concordante cuando se administro solo aire puro humidificado (como olor control). Cada uno de los estfmulos se presento en bloques alternantes en una carrera de barrido resultante de 240 s. Se construyeron cuatro protocolos con orden de bloques aleatorizado y se aplicaron en orden aleatorizado a traves de los sujetos. Despues de las carreras funcionales, se adquirieron escaneres anatomicos. Entre carreras se incluyeron descansos de 2 min. El tiempo de escaneado total fue aproximadamente 50 min. Al final de la sesion de escaneo, a los sujetos se les ofrecio de nuevo los 4 estfmulos en la misma

organizacion en un orden aleatorizado y se les pidio valorarlos para intensidad, hedonismo y excitacion.

Los datos se adquirieron usando un escaner de RM de 1,5 T (Sonata; Siemens, Erlangen, Alemania). Para las

superposiciones anatomicas se adquirio un escaner axial ponderado en T1 (secuencia turboflash) con 224

secciones, tamano de voxel 1,6x1,1x1,5 mm3, un tiempo de repeticion (TR) de 2130 ms, tiempo de eco (TE) de 3,93 ms, y dos medias (2130/3,93/2). Los estudios de IRMf se realizaron en el plano axial (orientado paralelo respecto al plano esfenoidal para minimizar artefactos de hueso) usando una secuencia multiseccion de imagenologfa eco de espm echo planar (SE-EPI). Los parametros del escaner inclrnan una matriz de 64x64, tamano de voxel de 3x3x3,75 mm3, TR de 2500 ms, y un tE de 35 ms. Se adquirieron un total de 120 imagenes en cada una de las 24 localizaciones de seccion por paradigma.

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Los datos de neuroimagenologfa se pre- y posprocesaron usando SPM5 (Wellcome Department of Cognitive Neurology, Londres, UK implementado en Matlab R2007b; The MatWorks, Inc., Natick, MA, EE UU). Los datos funcionales se registraron, realinearon para corregir los problemas de movimiento y despues se corresgistraron a las imagenes estructurales correspondientes. Ademas, se analizaron las imagenes espacialmente normalizadas (estereotacticamente transformada en espacio MNI ICBM-152, plantilla MNI suministrada por SPM2) y alisadas (por medio de un filtro gaussiano FWHM de 7x7x7 mm3).

El analisis de los datos para las muestras se resume en la tabla 1. Se ajusto un grupo de un mmimo de 9 voxeles activados adyacentes en el espacio 3D como el valor umbral (p<0,005), para el experimento basado en el analisis de SPM. “SI” significa que al menos 9 voxeles adyacentes estaban activados. El contraste se realizo frente a sin olor (aire).

Tabla 1

Vainillina Thesaron Rosa absoluto IBA

Mesencefalo (VTA)

SI NO NO NO

Corteza prefrontal

SI SI SI SI

Cuerpo estriado

SI SI NO SI

Complejo airngdala- hipocampo

SI NO NO NO

En conclusion, de los materiales probados, vainillina mostro activacion en todas las areas cerebrales que pertenecen a la ruta dopaminergica. Los otros olores agradables no activaron la ruta dopaminergica.

Ejemplo 2

Se repitio el procedimiento del ejemplo 1 contrastando vainillina con rosa absoluto como el olor control (ambos olores se prepararon como en el ejemplo 1). Se ajusto un grupo de un mmimo de 9 voxeles activados adyacentes en el espacio 3D como el valor umbral (p<0,005), para el experimento basado en el analisis de SPM. “SI” significa que al menos 9 voxeles adyacentes estaban activados. Los resultados se presentan en la tabla 2

Tabla 2

Vainillina

Mesencefalo (VTA)

SI

Corteza prefrontal

SI

Cuerpo estriado

NO

Complejo amfgdala- hipocampo

SI

En este ejemplo, vainillina tambien mostro activacion de la ruta dopaminergica.

Ejemplo 3

Se realizo un experimento adicional usando un procedimiento experimental similar al ejemplo 1, siendo los cambios como sigue.

El olfactometro usado se basaba en la grna de aire inodoro a traves de recipientes de vidrio llenos con muestras de fragancia lfquidas, de modo que aire saturado con olor en el espacio de cabeza del recipiente por encima de la muestra de fragancia lfquida se arrastra hacia el sujeto. Los estfmulos de olor humidificados bien se presentaron de una manera pulsatil a los sujetos o se consume en el medio ambiente. Durante los momentos cuando a los sujetos no se les presentan estfmulos de olor, reciben aire humidificado, inodoro (como olor control). Tfpicamente, la duracion del pulso fue 1 s, el intervalo fue 2 s. El flujo de aire tfpicamente usado fue 2 l/min; los olores (prueba y control) se presentaron a ambas narinas, de modo que se presento 1 l/min a cada narina. Esta estimulacion pulsatil con olor tfpicamente continuo durante 21 s (la denominada fase ON), despues el sistema cambio a aire inodoro, que se presento durante el siguiente periodo de 21 s (la denominada fase OFF). La duracion del estfmulo, intervalo interestfmulo, duracion de las fases ON y OFF se controlaron por ordenador, de modo que las secuencias siempre siguieron el curso que se habfa programada antes del inicio de la sesion. El procedimiento de escaneado fue como en el ejemplo 1.

En el protocolo anterior, 26 mujeres olieron vainillina (como una solucion en dipropilenglicol - 3 g de vainillina en 10 g de solvente) y un acuerdo, designado con la referencia de Takasago DGFRUI067K, con un caracter de fruta roja que no contiene vainillina (dicho acuerdo se uso sin diluir). Como se ha descrito anteriormente, los olores se contrastaron frente al aire. Se ajusto un grupo de un mmimo de 9 voxeles activados adyacentes en el espacio 3D

como el valor umbral (p<0,005), para el experimento basado en el analisis de SPM. “SI” significa que al menos 9 voxeles adyacentes estaban activados. Los resultados se presentan en la tabla 3.

Tabla 3

5

Vainillina DGFRUI067K

Mesencefalo (VTA)

NO NO

Corteza prefrontal

SI SI

Cuerpo estriado

SI SI

Complejo airngdala- hipocampo

SI SI

En este ejemplo, vainillina mostro otra vez activacion de la ruta dopaminergica. El acuerdo probado que no contema vainillina tambien mostro activacion de la ruta dopaminergica.

Claims (7)

1. 10

   15

   20

   25
2. 2.

   30 3.
3. 4. 35
4. 5.
5. 6.

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6. 7. 45
7. 8.

   50

   REIVINDICACIONES

   Un metodo de identificar una muestra de fragancia de interes, para preparar un acuerdo o una fragancia completamente formulada, en donde el metodo comprende:

   a) someter a un grupo de sujetos a un primer protocolo que comprende:

   - hacer que cada sujeto de dicho grupo huela un olor control

   - capturar escaneres cerebrales de imagenologfa de resonancia magnetica funcional (IRMf) de cada sujeto que huele el olor control de modo que se detecte la actividad cerebral de cada sujeto;

   b) someter al mismo grupo de sujetos a un segundo protocolo que comprende:

   - hacer que cada sujeto de dicho grupo huela una muestra de fragancia que se va a probar;

   - capturar escaneres cerebrales de iRMf de cada sujeto que huele la muestra de fragancia que se va a probar de modo que se detecte la actividad cerebral de cada sujeto;

   c) promediar la actividad cerebral de todos los sujetos como se obtiene en el primer protocolo y en el segundo protocolo; y

   d) contrastar la actividad cerebral media resultante obtenida en el segundo protocolo con la actividad cerebral media resultante obtenida en el primer protocolo mediante lo cual se determina un numero de voxeles activados adyacentes;

   en donde si un grupo de voxeles activados adyacentes tiene un volumen igual a o mayor que un valor umbral en al menos tres de las siguientes areas cerebrales, o si un grupo tiene un numero de voxeles activados adyacentes igual a o mayor que un valor umbral en al menos tres de las siguientes areas cerebrales: VTA, corteza prefrontal, cuerpo estriado y complejo airngdala-hipocampo,

   entonces la muestra de fragancia probada se considera que es de interes para preparar un acuerdo o una fragancia completamente formulada.

   El metodo de la reivindicacion 1, en donde el olor control es aire o un solvente de perfumena inodoro diluido en aire.

   El metodo de la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en donde el grupo de sujetos comprende al menos 5, preferiblemente al menos 10 sujetos.

   El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el valor de volumen de grupo umbral es aproximadamente 303 mm3.

   El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el numero umbral de voxeles activados adyacentes es nueve.

   Un metodo de preparar un acuerdo o una fragancia completamente formulada que comprende:

   a) identificar una muestra de fragancia de interes por el metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5;

   b) formular dicha(s) muestra(s) de fragancia en un acuerdo o una fragancia completamente formulada.

   Un metodo segun la reivindicacion 6, en donde el acuerdo o la fragancia completamente formulada comprende vainillina.

   Metodo de preparar un producto domestico, un producto de lavandena, un producto de cuidado personal o un producto cosmetico, en donde una muestra de fragancia identificada por el metodo definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 se usa en dicho producto domestico, producto de lavandena, producto de cuidado personal o producto cosmetico.