ES2546402T3 - Composiciones a base de hierbas y métodos para tratar trastornos hepáticos - Google Patents

Abstract

Una composición a base de hierbas para su uso para el tratamiento de trastornos hepáticos, que comprende la especie de plantas Cordia lutea y al menos una especie de los géneros Annona o Curcuma, teniendo las especies propiedades hepatoprotectoras.

Description

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31-08-2015

DESCRIPCIÓN

Composiciones a base de hierbas y métodos para tratar trastornos hepáticos

5 Campo de la invención

La presente invención se refiere a nuevas composiciones a base de hierbas y a su uso en la prevención y/o tratamiento de trastornos hepáticos. Más particularmente, las composiciones a base de hierbas de la presente solicitud comprende la especie de plantas Cordia lutea y al menos una especie de los géneros de plantas Annona o

10 Curcuma, o extractos de los mismos.

Antecedentes de la invención

La formación de especies de radicales de oxígeno (ERO) está implicada en la patogenia de muchas enfermedades

15 agudas y crónicas, que van desde enfermedades inmunológicas inflamatorias a infarto de miocardio y cáncer. Algunos de los efectos perjudiciales de la formación excesiva de ERO incluyen la peroxidación lipídica de los lípidos de membrana, el daño oxidativo a los ácidos nucleicos y los hidratos de carbono, así como la oxidación de las proteínas sulfhidrilo y otros grupos sensibles. La defensa proporcionada por los sistemas antioxidantes es esencial para la supervivencia. La desintoxicación de las ERO en una célula la realizan los sistemas enzimáticos y no

20 enzimáticos que constituyen el sistema de defensa antioxidante (Middleton Jr. E., Chithan K., y Heoharides TC. The Effects of Plant Flavonoids on Mammalian Cells: Implications for Inflammation, Heart Disease, and Cancer. Pharmacol Rev 52:673 -751, 2000).

La peroxidación de lípidos puede ser biológicamente importante en la exacerbación de una lesión tisular debido a la

25 citotoxicidad potencial de los productos finales resultantes de la peroxidación. Por ejemplo, los productos de la peroxidación lipídica de las células pueden ser cancerígenos. Recientemente, se ha hecho hincapié en el papel que desempeña la peroxidación de lípidos en el desarrollo de arteriosclerosis, accidentes cerebrovasculares, infarto de miocardio, daños cerebrales y en la médula espinal después de sufrir isquemia, cáncer, inflamación, toxicidad por hierro, y hepatotoxicidad inducida por agentes químicos y biológicos (Middleton Jr. E., Chithan K., and Heoharides

30 T.C. The Effects of Plant Flavonoids on Mammalian Cells: implications for Inflammation, Heart Disease, and Cancer. Pharmacol Rev 52:673 -751, 2000).

Las enfermedades hepáticas crónicas causan miles de muertes anuales en todo el mundo y son la décima causa de muerte en Estados Unidos. Actualmente, los trastornos hepáticos, especialmente los causados por infecciones

35 víricas, son un problema grave de salud, y su éxito en el tratamiento constituye un gran reto. No existe un tratamiento eficaz para la mayoría de las hepatopatías. Actualmente, algunos pacientes con hepatitis vírica son tratados con interferón (IFN); sin embargo, la terapia de IFN solo ha tenido éxito en aproximadamente el 25 % de los casos.

40 El IFN no está disponible para todos los pacientes, ya que la terapia de seis meses requerida es cara. Además, este tratamiento tiene varios efectos secundarios como síntomas graves similares a los de la gripe, letargo, pérdida de cabello y mal sabor en la boca. El IFN ataca al virus a través del sistema inmunológico, pero no invierte el daño causado por la infección, como la cirrosis hepática o la funcionalidad disminuida del bazo.

45 Otros tratamientos, como la terapia de ribavirina, mejoran los resultados en las exploraciones médicas e histológicas, especialmente en combinación con IFN. Sin embargo, los costes del tratamiento también son altos y hay un riesgo significativo de suspender el tratamiento por efectos adversos (Mc Hutchison, J.G. y Poynard T. Combination therapy with interferon plus Ribavirin for the initial treatment of chronic Hepatitis C. Semin Liver Dis 1999; 19 (suppl 1): 57 -65; Davil G.L. Combination therapy with interferon alpha and Ribavirin as treatment of

50 interferon relapse in chronic hepatitis C. Semin Liver Dis 1999; 19 (suppl 1): 49 -55).

La Organización Mundial de la Salud (OMS) estima que el 3 % de la población mundial está infectada con hepatitis C y que hay aproximadamente 170 millones de portadores crónicos que están en riesgo de desarrollar cirrosis y / o cáncer de hígado. La OMS no puede permitirse tratar a 170 millones de personas en el mundo con medicamentos

55 como Rebetron, que consiste en ribavirina e interferón alfa 2B, cuyo tratamiento cuesta 2.000 dólares por mes, durante 6 -12 meses; además, estos tratamientos requieren un amplio apoyo médico para tratar los efectos adversos causados por los medicamentos.

Puesto que no hay terapia o medicación sintética eficaz y lo suficientemente segura para el tratamiento de

60 hepatopatías, muchos pacientes han recurrido a la medicina alternativa a base de elementos naturales. A pesar de importantes avances en la medicina moderna, las plantas medicinales permanecen como un elemento necesario a la hora de desarrollar tratamientos precisos, seguros y eficaces para los trastornos hepáticos. En los últimos años ha habido un cambio hacia la evaluación terapéutica de los productos a base de hierbas para el tratamiento de enfermedades hepáticas, algunos de las cuales están resultando seguros y moderadamente eficaces.

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Varias publicaciones científicas señalan el hecho de que muchos grupos de metabolitos de origen vegetal muestran actividad antioxidante y hepatoprotectora. Esto se observa particularmente entre fenoles, especialmente los pertenecientes al grupo bencenoide, donde tournefolal, los ácidos tournefólicos A y B, y el éster etílico del ácido tournefólico, aislados de las partes aéreas, es decir, tallo, hojas, flores y frutos, de Tounnefortia sarmentosa,

5 muestran actividad antioxidante e inhiben la peroxidación de las lipoproteínas de baja densidad (Lin Y.L., Chang Y.Y., Kuo Y.H., Shiao M.S. Anti-lipid-peroxidative principles from Tounefortia samentosa. J Nat Prod. 2002 May; 65(5):745 -7). La curcumina, también bencenoide, muestra una actividad de captación de aniones superóxido (Kunchandy E., Rao M.N.A. Int. J. Pharmaceut., 57: 173 -176 (1989)) y ácido nítrico (Sreejayan N., Rao M.N.A. J. Pharm. Pharmacol., 49: 105 -107 (1997)) en modelos experimentales que muestran inhibición de la peroxidación de lípidos en hígado de rata (Reddy A.C., Lokesh B.R. Food Chem. Toxicol., 32: 279 -283 (1994)).

Otros elementos fenólicos, como los taninos, muestran actividad antioxidante (Satoh, K., Sakagami, H., 1996. Ascorbyl radical scavenging activity of polyphenols. Anticancer Res. 16: 2885 -2890) y hepatoprotectora (Miyamoto, K.I., Nomura, M., Murayama, T., Furukawa, T., Hatano, T., Yashida, T., Koshiura, R., Okuda, T., 1993. Antitumor 15 activities of ellagitannins against sarcoma -180 in mice. Biol. Pharm. Bull. 16: 379 -387), inhibiendo la peroxidación de lípidos en microsomas hepáticos y en las mitocondrias (Okuda T., Kimuar Y., Yoshida T., Hatano T., Okunda H., Arichi S. Studies on the activities of tannins and related compounds from medicinal plants and drugs. I. Inhibitory effects on lipid peroxidation in mitochondria and microsomes of liver. Chem. Pharm. Bull. 31: 1625 -1631 (1983)). El ácido tánico redujo la incidencia de neoplasias hepáticas en ratones (Hirose M., Ozaki K., Takaba K., Fukushima S., Shirai T., Ito, N. Modifying effects of the naturally occurring antioxidants gamma -oryzanol, phytic acid, tannic acid and n-tritriacontane-16, 18-dione in a rat wide-spectrum organ carcinogenesis model. Carcinogenesis 12: 1971 1921 (1991)). Los resultados de una amplia investigación clínica demostraron la eficacia y la seguridad de los polifenoles cuando se trata del tratamiento de disfunciones hepatobiliares y problemas digestivos, tales como una sensación de estar lleno, pérdida de apetito, náuseas y dolor abdominal. Además, se ha encontrado que estos

25 elementos tienen efectos preventivos y hepatoprotectores contra la gastropatía inducida por antiinflamatorios o esteroideos (Ruiyc. Advances in pharmacological studies of silymarin. Mem Inst Oswaldo Cruz 1991; 86:79 -85; Scevola D, Barbacini G, Grosso A, Bona S, Perissoud D. Flavonoids and hepatic cyclic monophosphates in liver injury. Boll Ins Sieroter Milan 1984; 63:77 -82).

Las cumarinas son otro tipo de compuestos polifenólicos que se pueden encontrar en abundancia en el reino vegetal. Muchos de ellos muestran una actividad biológica interesante, por ejemplo, las 4 metoxicumarinas tienen propiedades colerécticas (Takeda, S.; Aburada, M.J. Pharmacobio-Dyn. 4: 724 (1981)). La 7,8-dihidroxi-4-metilcumarina y la 7,8-diacetoxi-4-metil-cumarina tienen propiedades antioxidantes y, por lo tanto, se consideran eficaces secuestrantes de radicales de oxígeno (Raj, H.G.; Parmar, V.S.; Jain, S.C.; Priyadarsini, K.I.; Mittal, J.P.; Goel, S.;

35 Poonam; Himanshu; Malhotra, S.; Singh, A.; Olsen, C.E.; Wngel, J. Bioorg. Med. Chem. 6: 833 (1998)). Además, este grupo de moléculas muestran efectos protectores contra la toxicidad inducida por un oxidante conocido (tbutilhidroperóxido) en cultivos de células HepG2 y de hepatocitos humanos primarios (Bernard Refouvelet, Catherine Guyon, Yves Jacquot, Corinne Girard, Herve Fein, Francoise Bevalotb, Jean-Francois Robert a, Bruno Heyd, Georges Mantion, Lysiane Richert, Alain Xicluna, Synthesis of 4-hydroxycoumarin and 2,4-quinolinediol derivatives and evaluation of their effects on the viability of HepG2 cells and human hepatocytes culture. European Journal of Medicinal Chemistry 39: 931 -937 (2004)).

Los terpenoides son otro grupo de metabolitos derivados de plantas que también muestran actividad antioxidante (Zhu M, Chang Q, Wong LK, Chong FS, Li RC. Triterpene antioxidants from Ganoderma lucidum. Phytotherapy

45 Research 13: 529 -31 (1999)) y hepatoprotectora (James, L.P., Mayeux, P.R., Honson, J.A. Acetaminophen-induced hepatotoxicity. Drug Metabolism Disposition 31: 499 -506 (2003)). El triterpeno celastrol muestra un potente efecto inhibidor contra la peroxidación de lípidos en las mitocondrias hepáticas. Los experimentos in vitro e in vivo, así como otras pruebas clínicas, han demostrado los efectos de actividad gastroprotectora (Zhu M, Chang Q, Wong LK, Chong FS, Li RC. Triterpene antioxidants from Ganoderma lucidum. Phytotherapy Research 13: 529 -31 (1999)) y hepatoprotectora de varios terpenoides, tales como el ácido oleanólico, ácido ursólico, alfa-hederina, glicirricina y lupeol (Liu, J., Liu, Y., Mao, Q. The effects of 10 triterpenoid compounds on experimental liver injury in mice. Fundamental and Applied Toxicology 22: 34 -40 (1994)) (Sunitha S., Nagaraj M., Varalakshmi P. Hepatoprotective effect of lupeol and lupeol linoleate on tissue antioxidant defence system in cadmium-induced hepatotoxicity in rats. Fitoterapia 72: 516 -523 (2001)).

55 Database WPI, Week 200577, Thomson Scientific, London, GB; AN 2005 -749515 & CN 1 593 495 A (Xing L) 16 March 2005 (2005 -03 -16) divulga una composición farmacéutica que comprende Annona squamosa y Curcuma aromatica para el tratamiento de hepatocarcinoma.

Joyeux M et al: "Screening of antiradical, antilipoperoxidant and hepatoprotective effects of nine plant extracts used in Caribbean folk medicine", Phytotherapy Research 1995 GB, vol. 9, no. 3, 1995, páginas 228 -230, ISSN: 0951 418X divulga los efectos antirradicales y hepatoprotectores de Annona muricata y Curcuma domestica.

Chang Fang-Rong et al: "New adjacent bis-tetrahydrofuran Annonaceous acetogenins from Annona muricata.",

65 Planta Medica, vol. 69, nº 3, March 2003 (2003 -03), páginas 241 -246, ISSN: 0032 -0943 divulga la citotoxicidad de Annona muricata contra líneas celulares de hepatoma humano.

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Gutierrez Alfonso et al: "Medicinal plants of the Tunal, district of Lalaquiz, Huancabamba, Piura, Peru", Acta Pharmacologica Sinica, Nature Publishing Group, US, CN, vol. 27, no. Suppl. 1, 1 July 2006 (2006 -07 -01), página 332, XP009155364, ISSN: 1671 -4083 divulga el uso médico de Cordia lutea.

5 Afzal M et al: "Antioxidant activity of Cordia myxa L. and its hepatoprotective potential", Electronic Journal of Environmental, Agricultural and Food Chemistry, Universidade De Vigo, ES, vol. 6, nº 6, 1 June 2007 (2007 -06 01), páginas 2109 -2118, XP008123584, ISSN: 1573 -4377 divulga las propiedades de antioxidante y hepatoprotector de Cordia myxa.

10 Existe la necesidad de un tratamiento seguro y eficaz para los trastornos hepáticos virales y no virales que abordan algunas de las desventajas de los métodos de tratamiento actuales.

Sumario de la invención

15 De acuerdo con un aspecto amplio de la invención, se proporcionan composiciones a base de hierbas que comprende las especies de plantas Cordia lutea y al menos una especie de los géneros de plantas Annona o Curcuma. En una realización, la composición a base de hierbas comprende Cordia lutea y una especie de cada uno de los géneros de plantas Annona y Curcuma.

20 En otra realización, se proporciona una composición herbaria que comprende flores de Cordia lutea y al menos una de hojas de Annona spp o raíces de Curcuma spp. En otra realización, se proporciona una composición a base de hierbas que comprende flores de Cordia lutea, hojas de Annona muricata y raíces de Curcuma longa. Las composiciones a base de hierbas de la presente invención son útiles para la prevención y / o tratamiento de trastornos hepáticos.

25 En otro aspecto amplio, la invención se refiere a composiciones de hierbas que comprenden extractos de las especies de plantas Cordia lutea y al menos uno de los géneros de plantas Annona y Curcuma. En una realización, la composición de hierbas comprende un extracto de Cordia lutea en combinación con Annona o Curcuma. En una realización, la composición a base de hierbas comprende Cordia lutea y una especie de cada uno de los géneros de

30 plantas Annona y Curcuma.

En otra realización, se proporciona una composición herbaria que comprende un extracto de flores de Cordia lutea y al menos una de las hojas de Annona spp, o raíces de Curcuma spp, para su uso en la prevención y tratamiento de trastornos hepáticos. En una realización adicional, la composición de hierbas comprende extractos, por ejemplo

35 extractos hidroalcohólicos, de flores de Cordia lutea y al menos uno de hojas de Annona muricata o raíces de Curcuma longa. Se entiende que también se pueden usar otros disolventes distintos a hidroalcohol, tales como agua, hexanos, cloroformo y similares. En una realización adicional, la composición de hierbas comprende extractos hidroalcohólicos de flores de Cordia lutea, hojas de Annona muricata y raíces de Curcuma longa.

40 La invención proporciona además el uso de una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición de hierbas que comprende las especies de plantas Cordia lutea o un extracto de la especie de plantas Cordia lutea para la preparación de un medicamento para la prevención o el tratamiento de trastornos hepáticos en un paciente.

La invención proporciona además el uso de una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición de hierbas

45 que comprende las especies de plantas Cordia lutea o un extracto de la especie de plantas Cordia lutea para la preparación de un medicamento para neutralizar los radicales libres y para prevenir la formación de radicales libres en un paciente que sufre un trastorno hepático.

Cada uno de Cordia lutea, Annona spp y Curcuma spp, o extractos de los mismos, exhiben propiedades

50 hepatoprotectoras significativas y son eficaces en la prevención y / o tratamiento de trastornos hepáticos. Cordia lutea, y extractos de la misma, fue particularmente eficaz. Sorprendentemente, sin embargo, se descubrió que las diversas combinaciones de Cordia lutea con Annona spp y Curcuma spp, o extractos de los mismos, y, en particular, la combinación de Cordia lutea, Annona spp y Curcuma spp, o extractos de los mismos, mostraron una sinergia adicional, lo que sugiere que la eficacia y / o las propiedades de cada una de las plantas actúan en conjunto.

55 Particularmente eficaces fueron las combinaciones de Cordia lutea, Annona spp y Curcuma spp, o extractos de los mismos, en una relación en peso de 1:1:1, más preferentemente, 5:1:1, e incluso más preferentemente, 8:1:1, respectivamente. En otra realización, la relación en peso de Cordia lutea: Annona spp: Curcuma spp, o extractos de los mismos, es 1:0,05 -1:0,05 -1. En un aspecto, la concentración de Curcuma spp en mezclas no debe exceder de la concentración de Cordia lutea o Annona spp.

60 Al menos una de las ventajas de las composiciones hierbas de la presente invención es su seguridad y eficacia. Por ejemplo, se descubrió que las composiciones de hierbas que comprenden extractos de los géneros de plantas de interés eran no tóxicas a nivel celular y tisular, no tóxicas en estudios de toxicidad aguda en ratones y ratas, y que eran seguras para uso humano.

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Las composiciones de hierbas de la presente invención también podrían actuar profilácticamente través de la prevención de la infección viral u otros agentes que causan trastornos hepáticos. Por lo tanto, pueden usarse para tratar trastornos hepáticos causados por la infección viral, reacciones autoinmunes, consumo de xenobióticos y todos aquellos trastornos que puedan comprometer la función hepática. El tratamiento puede ser terapéutico y / o

5 profiláctico.

Las composiciones a base de hierbas de la presente invención se pueden administrar por vía oral o parenteral (tópica, rectal, intravenosa, intramuscular o hipodérmica). El tratamiento puede administrarse por vía oral en una forma líquida o sólida (por ejemplo, en comprimido), en una dosis, varias dosis o mediante un método de liberación lenta o de depósito. En la alternativa, las composiciones a base de hierbas pueden ser en forma de una sustancia similar al té, donde se puede añadir agua caliente para formar una bebida caliente o fría.

Los extractos hidroalcohólicos de un órgano de la planta seleccionado para su uso en la preparación de una composición de hierbas de la presente invención pueden obtenerse por un método que comprende: 15  secar el órgano de la planta seleccionada y moler el órgano de la planta desecado para obtener un polvo que tiene un tamaño de partícula en el intervalo de aproximadamente 0,35 mm a aproximadamente 0,1 mm;

 macerar el polvo en una solución hidroalcohólica de aproximadamente 6 a aproximadamente 8 días a aproximadamente la temperatura ambiente para obtener un extracto del órgano de la planta;

 concentrar el extracto por evaporación en un evaporador rotatorio; y

 liofilizar y esterilizar el extracto.

25 Se entiende que también se pueden usar otros métodos de concentración conocidos en la técnica.

Las composiciones a base de hierbas de la presente invención poseen actividad antioxidante en hepatocitos aislados de ratas, por ejemplo, una disminución en los niveles de malonildialdehído (MDA) cuando los hepatocitos están expuestos a un inductor de la peroxidación lipídica, y una recuperación de los niveles de glutatión (GSH) tras la inducción de daños. Por lo tanto, las propiedades hepatoprotectoras de las composiciones a base de hierbas de la presente invención pueden ser en parte un resultado de sus propiedades antioxidantes y la inhibición de la propagación de radicales libres.

35 Las composiciones a base de hierbas de la presente invención también poseen propiedades regenerativas o proliferativas. Por lo tanto, en un aspecto de la presente invención, las composiciones a base de hierbas de la presente invención son útiles para la regeneración de las células hepáticas en los pacientes.

La presencia de grupos químicos de metabolitos secundarios, tales como fenoles, taninos, terpenoides, lactonas y cumarinas, en los órganos seleccionados de las plantas de los géneros y especies de interés puede explicar, al menos en parte, algunas de las acciones biológicas observadas.

Los trastornos hepáticos tratados o prevenidos mediante la administración a un paciente de una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición de hierbas de la presente invención pueden producirse a causa de una

45 infección viral, tal como hepatitis B y / o C, o un trastorno hepático no viral, tales como fibrosis, cirrosis y hepatitis no viral.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas

Para los fines de la presente invención, el término "extracto" significa un concentrado de componentes de plantas hidrosolubles agua y / o solubles en alcohol y / o solubles en un disolvente adecuado, tal como solubles en hexano y solubles en cloroformo, de la parte de la planta extraída y puede estar en forma líquida o sólida (por ejemplo, polvo).

La invención se describirá a continuación en términos de los ejemplos siguientes. 55

Ejemplo 1

Extracto hidroalcohólico de Cordia spp: 250 g de flores de Cordia lutea se secaron mediante deshidratación y después de maceraron con 1 -1,5 litros de una solución hidroalcohólica (etanol-agua en una proporción de aproximadamente 65:35 a aproximadamente 75:25) durante de 6 a 8 días a temperatura ambiente. Después, las flores maceradas en etanol se concentraron a baja presión utilizando un evaporador rotatorio estándar. El residuo formado se liofilizó y esterilizó después. Una masa de 14 -22 g se obtuvo en el extracto bruto, obteniéndose 6 – 9 % de la masa de la muestra. Se preparó una solución madre de 5 mg / ml para la prueba mediante la disolución de 5 mg en 0,7 % de etanol / agua destilada.

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Ejemplo 2

Extracto hidroalcohólico de Annona spp: Se secaron 250 g de hojas de Annona muricata usando un horno a una temperatura de aproximadamente 45 a 55 grados Celsius. Las hojas secas se sometieron después a un proceso de

5 molienda usando un molinillo de hoja estándar. El polvo obtenido se tamizó hasta obtener una fracción de tamaño de partícula medido de aproximadamente 0,35 a aproximadamente 0,10 milímetros. Después, el polvo se maceró con 1 -1,5 litros de una solución hidroalcohólica (etanol-agua en una proporción de aproximadamente 65:35 a aproximadamente 75:25) durante de 6 a 8 días a temperatura ambiente. Después, el polvo macerado en etanol se concentró a baja presión utilizando un evaporador rotatorio estándar. El residuo se liofilizó y esterilizó después. Una masa de 14 -22 g se obtuvo en el extracto bruto, obteniéndose 5 – 8 % de la masa de la muestra. Se preparó una solución madre de 5 mg / ml para la prueba mediante la disolución de 5 mg en 0,7 % de etanol / agua destilada.

Ejemplo 3

15 Extracto hidroalcohólico de Curcuma spp: Se secaron 250 g de raíces de Curcuma longa usando un horno a una temperatura de 45 a 55 grados Celsius. Las raíces secas se sometieron después a un proceso de molienda usando un molinillo de hoja estándar. El polvo obtenido se tamizó hasta obtener una fracción de tamaño de partícula medido entre 0,35 y 0,10 milímetros. Después, se macera con 1 -1,5 litros de una solución hidroalcohólica (etanol-agua a

65:35 a 75:25) durante de 6 a 8 días a temperatura ambiente. Esto se concentra a continuación a baja presión usando un evaporador rotatorio estándar. El residuo se liofiliza y esteriliza después. Una masa de 10 -16 g se obtiene en el extracto bruto, obteniéndose 4 – 7 % de la masa de la muestra. Se preparó una solución madre de 5 mg / ml para la prueba mediante la disolución de 5 mg en 0,7 % de etanol / agua destilada.

Ejemplo 4

25 Una composición herbaria que comprende extractos de flores de Cordia lutea, de hojas de Annona muricata, y raíces de Curcuma longa se preparó del siguiente modo. Los extractos brutos liofilizados obtenidos en los Ejemplos 1, 2 y 3 se mezclaron en ese orden en las siguientes proporciones: 8 mg:1 mg:1 mg para dar una relación en peso de 8:1:1 (1:0,125:0,125), respectivamente, y se preparó una solución madre 5 mg / ml para la prueba disolviendo 5 mg de la mezcla liofilizada en 0,7 % de etanol / agua destilada.

Ejemplo 5

Preparación de hepatocitos

35 Los extractos de composiciones a base de hierbas de la presente invención se analizaron usando cultivos de hepatocitos primarios de rata para determinar sus efectos antioxidantes in vitro. Por lo general, se realizaron pruebas utilizando ratas macho (Sprague Dawley) proporcionadas por CRIFFA (Santa Perpetua de La Mogoda, Barcelona), que se conservaron en el Centro de Investigación del Hospital de La Fe de Valencia hasta que se realizó el aislamiento de los hepatocitos. La manipulación y el sacrificio de los animales se llevó a cabo de acuerdo con los reglamentos nacionales, la disposición 609/86 de la Unión Europea, así como los principios sobre manipulación y uso de animales de laboratorio publicados por el Instituto Nacional de Salud (NIH).

El aislamiento de los hepatocitos de rata se basó en el método de Berry y Friend (M.N. Berry, D.S. Friend. High yield

45 preparation of isolated rat liver parenchymal cells. J. Cell. Biol. 43:506 -520, 1969), que consiste en una infusión en el hígado in situ con una solución que contiene colagenasa, que actúa como una enzima disgregante. Poco después de la administración de anestesia a los animales con una inyección intraperitoneal de tiobarbital, se realiza una laparotomía abdominal y se canula la vena cava con una cánula de 1 mm de diámetro. Inicialmente, se perfunde una solución salina para limpiar el órgano utilizando una bomba peristáltica ajustada a un flujo de 18 -20 ml / min. Una vez que este proceso haya finalizado, se añade la solución de colagenasa para desintegrar el hígado. La suspensión celular obtenida durante este proceso se filtra y se centrifuga, y, después de retirar la colagenasa, se resuspende en el cultivo, y las células se cultivan en una matriz extracelular apropiada.

La suspensión de las células obtenidas en los diferentes aislamientos se cultivó con una densidad de 8 x 104 células

55 / cm2 viables en placas de 96 pocillos para observar la formación de radicales libres y la citotoxicidad. La cuantificación del glutatión y la peroxidación lipídica se evaluaron en células cultivadas en placas de 24 pocillos. Antes de cultivar los hepatocitos, las placas se cubrieron con fibronectina (3,5 µg/cm2). Las células se cultivaron en un medio de Ham F-12 / Lebovitz L-15 (1: 1), complementado con selenito de sodio (170 µg/ml), suero bovino fetal al 2 %, penicilina (50 mU / ml), estreptomicina (50 µg/ml), seroalbúmina bovina al 0,2 % e insulina (10 nM). Después de la resuspensión, se obtuvo una alícuota para realizar un recuento de células y determinar su viabilidad usando el método de exclusión con azul tripán. El grado de incorporación de azul tripán en las células depende de la integridad de la membrana plasmática, y, por lo tanto, se puede utilizar como un indicador de muerte celular. Por lo tanto, se añadió azul tripán al 0,4 % a una alícuota de la suspensión celular y las células que no se tiñeron de azul se contaron en cinco campos diferentes utilizando un microscopio y una cámara de Neubauer. El porcentaje de

65 viabilidad se calculó del siguiente modo:

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% de viabilidad = Número de células no azules x100 Número total de células

Viabilidad celular usando dimetil-tetrazolio (MTT)

5 La viabilidad celular se determinó midiendo la absorción y reducción de dimetil-tetrazolio (MTT), un sustrato de color amarillo claro, a formazán, un metabolito insoluble azul. Esta reacción de reducción celular mide la actividad deshidrogenasa mitocondrial, cuya actividad depende del grado de integridad de los orgánulos, y, por lo tanto, es un claro indicador del número de células viables en el cultivo. En este caso, el MTT se utiliza como un sustrato de sales de tetrazolio que muestra un color amarillo, y, con la actividad de succinato deshidrogenasa mitocondrial, genera un metabolito azul insoluble (formazán), que se puede cuantificar midiendo la absorción usando un lector de ELISA, que mide la absorción en el intervalo de 405 -630 nm.

Con la excepción de las pruebas cuando la exposición fue demasiado breve, por ejemplo, en la producción de

15 radicales libres, durante el resto de las pruebas de peroxidación de lípidos y glutatión, se realizó un estudio de la viabilidad celular en paralelo. Se incubaron hepatocitos de rata en una placa de 96 pocillos se incubaron en condiciones idénticas a las de los otros experimentos. Una vez completado el período de incubación, se añadió el MTT al cultivo y se incubó durante dos horas. El formazán generado se disolvió en sulfóxido de dimetilo (DMSO) y, e última instancia, su absorción se evaluó a 550 nm mediante un lector de ELISA. Las células no tratadas con composiciones a base de hierbas se utilizaron como control positivo de la viabilidad (MJ Gomex-Lechon y JV Castell. In Vitro Toxicity Testing. En: Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures. Ed. J.B. Griffiths, A. Doyle y D.G. Newell. ISBN: 0471928526. John Wiley & Sons Ltd. Baffins Lane, England, 1998; 12B: 5,6; J.V. Castell, M.J. Gomez-Lechon, In vitro alternatives to animal pharmaco-toxicology. Farmaindustria Ed. JV Castell and MJ Gomez-Lechon. Madrid, 1992; M.J. Gomez-Lechon, T. Donato, X. Ponsoda, R. Fabra, R. Trullenque y J.V. Castell. Isolation, culture

25 and use of human hepatocytes in drug research. IN VITRO METHODS IN PHARMACEUTICAL RESEARCH. ISBN 0 -12 -163390-X. Eds.; J.V. Castell and M.J. Gomez-Lechon eds. pp. 129 -154. Academic Press. London (1997)).

Producción de radicales libres

Con el fin de cuantificar la producción de radicales libres, los cultivos primarios de hepatocitos de rata, cultivados en una placa de 96 pocillos, se incubaron con composiciones a base de hierbas de la presente invención en las siguientes concentraciones: 4, 20, 100 y 500 µg/ml, junto con 5-clorometil-2',7'-diclorohidrofluoresceína (DCFH-DA), un agente fluorescente que se propaga bien a través de la membrana plasmática debido a su propiedad apolar y su estructura no iónica, y, cuando hay oxígeno presente, emite fluorescencia(Lautraite S, Bigot-Lasserre D, Bars R y 35 Carmichael N. Optimisation of cell-based assays for medium throughput screening of oxidative stress. Toxicol in vitro

17:207 -220 (2003)). Una vez completado el período de incubación, las células se expusieron a t-butilhidroperóxido (t-BOOH), con la composición a base de hierbas presente, e inmediatamente después, la emisión de fluorescencia se leyó (to) a 485 nm (estimulación) y a 527 nm (emisión), Finalmente, las células se incubaron a 37 °C y la fluorescencia se leyó a intervalos de 30 minutos durante un período de 2 horas. Las células tratadas con quercetina (un flavonoide con actividad antioxidante conocido) se utilizaron como control positivo de la prueba (Boots A.W., Bast A. y Haenen G.R. No role of DT-diaphorase (NqOl) in the protection against oxidized quercetin. FEBS Lett 579: 677 -682). La cuantificación se expresa en % de los radicales libres con respecto al control (células inducidas con la estimulación oxidativa, en ausencia de la composición a base de hierbas). Con el fin de cuantificar los radicales libres, las composiciones a base de hierbas se disolvieron primero en solución de etanol-agua en un intervalo de 0,5

45 -1 %.

Peroxidación lipídica y reducción de glutatión

Para medir la peroxidación lipídica y la reducción de glutatión, las células de hígado de rata aisladas se cultivaron en placas de 24 pocillos con una densidad de 80.000 células viables / cm2. Después de un período de estabilización del cultivo de 1 hora, las células se preincubaron con la composición a base de hierbas a 4, 20, 100 y 500 µg/ml durante un período de 24 horas. Una vez finalizada la preincubación, se expuso a las células a t-BOOH 250 mM con el ingrediente activo de las fórmulas objeto de esta invención, utilizando las concentraciones indicadas anteriormente. Una vez transcurrido el período de 24 horas, se recogieron las células y se centrifugaron a 1.200 rpm durante 5

55 minutos; a continuación, el líquido se recuperó para medir la producción de malonildialdehído (MDA). Las monocapas se lavaron y se congelaron para evaluar los niveles de proteína y glutatión (GSH). Las células no tratadas se utilizaron como controles de la oxidación basal y las células tratadas exclusivamente con t-butilo se utilizaron como controles de la oxidación inducida.

La peroxidación de lípidos se determinó mediante la cuantificación de la producción de MDA en el cultivo (M.J. Gomex-Lechon y J.V. Castell. In Vitro Toxicity Testing. En: Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures. Ed. J.B. Griffiths, A. Doyle y D.G. Newell. ISBN: 0471928526. John Wiley & Sons Ltd. Baffins Lane, England, 1998; 12B: 5,6;

J.V. Castell y M.J. Gomez-Lechon, In vitro alternatives to animal pharmaco-toxicology. Farmaindustria Ed. J.V. Castell y M.J. Gomez-Lechon. Madrid, 1992; M.J. Gomez-Lechon, T. Donato, X. Ponsoda, R. Fabra, R. Trullenque y

65 J.V. Castell. Isolation, culture and use of human hepatocytes in drug research. IN VITRO METHODS IN PHARMACEUTICAL RESEARCH. ISBN 0 -12 -163390-X. Eds. J.V. Castell y M. J. Gomez-Lechon eds. pp. 129

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154. Academic Press. London (1997)). Para llevar a cabo esta cuantificación, las células se incubaron y después se centrifugaron a 1.200 rpm durante 5 minutos para eliminar los restos celulares. El líquido recuperado se incubó a 100 °C durante 60 minutos en la oscuridad, con un tampón que contenía SDS al 7 %, HCl 0,1 N, ácido fosfotúngstico al 1 %, y ácido tiobarbitúrico al 0,67 %. Las muestras se sometieron a extracción, se añadió 1 ml de butanol y se 5 centrifugaron a 3.000 rpm durante 10 minutos. La lectura de la fase orgánica (sobrenadante) a 530 nm (estimulación) y 595 (emisión) determinó la formación de MDA en las condiciones de incubación de la composición a base de hierbas analizada. El MDA diluido en el cultivo se utilizó como patrón. Las células no tratadas se utilizaron como controles negativos de la oxidación basal y las células tratadas exclusivamente con t-BOOH se utilizaron como controles de la oxidación inducida. La concentración de proteínas en las monocapas de células se utilizó para

10 normalizar los datos.

La cuantificación de los niveles de glutatión (GSH) se realizó a través de una reacción fluorométrica con oftalaldehído (OPT) (M.J. Gomex-Lechon y J.V. Castell. In Vitro Toxicity Testing. En: Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures. Ed. J.B. Griffiths, A. Doyle y D.G. Newell. ISBN: 0471928526. John Wiley & Sons Ltd. Baffins 15 Lane, England, 1998; 12B: 5,6; J.V. Castell, M.J. Gomez-Lechon, In vitro alternatives to animal pharmaco-toxicology. Farmaindustria Ed. JV Castell and MJ Gomez-Lechon. Madrid, 1992; M.J. Gomez-Lechon, T. Donato, X. Ponsoda,

R. Fabra, R. Trullenque y J.V. Castell. Isolation, culture and use of human hepatocytes in drug research. IN VITRO METHODS IN PHARMACEUTICAL RESEARCH. ISBN 0 -12 -163390-X. Eds. J.V. Castell y M. J. Gomez-Lechon eds. pp. 129 -154. Academic Press. London (1997)). Las células incubadas durante 24 horas con las 20 concentraciones de la composición de hierbas antes mencionada anteriormente se sometieron a ultrasonidos en un tampón (ácido tricloroacético al 5 % y EDTA mM) durante 1 -2 segundos. Se añadieron fosfato de sodio (0,1 M), NaOH (1M) y una disolución OPT a la alícuota de líquido obtenida después de centrifugar la placa a 3.000 rpm durante 30 minutos. Las muestras sonicadas durante 1 -2 segundos se mantuvieron en oscuridad durante 30 minutos para leer la fluorescencia a 360 (estimulación) 450 nm (emisión). GSH 10 mM diluido en un tampón de

25 homogeneización se utilizó como patrón. El nivel de glutatión basal se obtuvo a partir de células no tratadas y se usó t-BOOTH como control positivo en la disminución de nivel de GSH. La evaluación de proteínas en las monocapas de células se utilizó para normalizar los datos.

Ejemplo 6

30 El aumento de las concentraciones de la composición de hierbas de los Ejemplos 1, 2, 3 y 4 se analizó para determinar la producción de radicales libres, la peroxidación de lípidos y los niveles de glutatión, como se ha descrito anteriormente, utilizando hepatocitos de rata aislados. Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla 1 que se expone a continuación.

35

Tabla 1. Efecto hepatoprotector in vitro de la composición de hierbas de los Ejemplos 1, 2, 3 y 4 en las muestras en las que se aplicó el agente oxidante t-BOOH -Los valores se muestran como media ± error estándar de la media. *p<0,05 como un porcentaje del grupo tratado con t-BOOH.

Tratamientos

Concentración (µg/ml) Radicales libres (%)* Peroxidación lipídica (pmoles de MDA/ mg deproteína) Niveles de glutatión (nmoles de GSH/ mg deproteína)

Células no tratadas

00 00 65,0 ± 13,0

t-BOOH

500 µM 100 ± 14,2 822,2 ± 41,1 9,2 ± 0,7

Ejemplo 1

4 79,5 ± 1,4 754,0 ± 5,5 10,4 ± 3,1

Ejemplo 2

4 103,8 ± 6,2 1.055,5 ± 54,8 33,3 ± 2,3

Ejemplo 3

4 93,8 ± 4,9 725,5 ± 135,7 27,2 ± 1,3

Ejemplo 4

4 77,6 ± 1,4 1.054,6 ± 88,4 36,3 ± 5,1

Ejemplo 1

20 43,8 ± 1,6 671,3 ± 88,8 17,9 ± 5,4

Ejemplo 2

20 56,6 ± 10,7 956,5 ± 200,2 29,8 ± 1,6

Ejemplo 3

20 48,2 ± 2,9 650,3 ± 0,0 27,1 ± 0,7

Ejemplo 4

20 41,4 ± 8,9 530,3 ± 0,0 29,5 ± 5,2

Ejemplo 1

100 16,2 ± 0,3 112,0 ± 0,0 53,3 ±0,3

Ejemplo 2

100 17,8 ± 2,8 431,8 ± 104,0 51,1 ± 3,6

Ejemplo 3

100 20,3 ± 1,1 410,4 ± 72,5 45,2 ± 1,5

Ejemplo 4

100 15,9 ± 0,4 153,8 ± 10,2 54,8 ± 5,9

Ejemplo 1

500 4,1 ± 0,5 70,9 ± 17,8 -

Ejemplo 2

500 00 0,0 ± 0,0 -

Ejemplo 3

500 6,1 ± 0,5 383 ± 33,7 -

Ejemplo 4

500 3,7 ±0,3 0,0 ± 0,0 -

Quercetina

5 µM 51,5 ± 2,1 - -

Quercetina

25 µM 18,8 ± 1,2 - -

* expresado como una proporción del control positivo (t-BOOH)

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Como puede verse en la Tabla 1, Ejemplo 4, la relación en peso 8:1:1 de los tres extractos, es decir, el Ejemplo 1 (Cordia lutea), el Ejemplo 2 (Annona muricata) y el Ejemplo 3 (Curcuma longa), mostró consistentemente una efecto mayor que los ejemplos individuales a dosis equivalentes, en particular, a las concentraciones más elevadas de 100 µg/ml y 500 µg/ml. Esto sugiere un efecto sinérgico cuando los tres extractos se combinan en las proporciones

5 anteriores. De los tres extractos individuales analizados, el Ejemplo 1 mostró resultados mejores que los de los Ejemplos 2 y 3, lo que sugiere que el Ejemplo 1, solo o en combinación, puede ser importante para la hepatoprotección del hígado.

Ejemplo 7

10 Se analizaron concentraciones crecientes de la composición a base de hierbas del Ejemplo 4 para la producción de radicales libres y la peroxidación lipídica, como se ha descrito anteriormente, utilizando dos hepatocitos de rata aislados independientes. Los resultados combinados obtenidos se muestran en la Tabla 2 que se expone a continuación.

15 Tabla 2. Efecto hepatoprotector in vitro de la composición de hierbas del Ejemplo 4 en las muestras en las que se aplicó el agente oxidante t-BOOH -Los valores se muestran como mediana ± error estándar de la mediana. *p<0,05 con respecto al grupo tratado con t-BOOH.

Tratamientos

Concentración (µg/ml) Radicales libres (%)* Peroxidación lipídica (pmoles de MDA/ mg deproteína) Niveles de glutatión (nmoles de GSH/ mg deproteína)

Células no tratadas

0 0 38,5 ± 9,2

t-BOOH

1 100 2147,3 ± 539,0 7,5 ± 0,4

Ejemplo 4

4 71,2 ± 8,7* 2337,2 ± 522,6 14,5 ± 4,9

20

34 ± 10,3* 915,4 ± 175,0 11,5 ± 4,1

100

12,0 ± 5,4* 83,0 ± 34,0 39,9 ± 9,6*

500

2,2 ± 2,2* 27,0 ± 18,6 37,6 ± 10,8*

Quercetina

25 µM 13,2 ± 5,6* - -

* expresado como una proporción del control positivo (t-BOOH)

20 Como puede verse en la Tabla 2, la incubación de la composición a base de hierbas del Ejemplo 4 con t-BOOH reduce la formación de radicales libres. Esta acción protectora de la composición a base de hierbas del Ejemplo 4 era dependiente de la dosis y es comparable a la reducción de los radicales libres que tuvo lugar en las células incubadas con quercetina, un antioxidante conocido. Mientras que las concentraciones de 100 y 500 µg/ml mostraron una acción de bloqueo casi total en la oxidación de t-BOOH, se observó una disminución sustancial a

25 aproximadamente 34 % incluso a la concentración más baja de 20 µg/ml.

Los resultados de la evaluación de la peroxidación lipídica mediante cuantificación con MDA utilizando la composición a base de hierbas del Ejemplo 4 mostraron un comportamiento similar, ya que los niveles de MDA disminuyen a medida que la concentración de la composición a base de hierbas del Ejemplo 4 aumenta, como se

30 muestra en la Tabla 2.

La Tabla 2 también muestra los efectos de la preincubación de los hepatocitos con la composición a base de hierbas del Ejemplo 4 sobre GSH utilizando dos cultivos de hepatocitos de rata independientes. Estos valores se comparan con la reducción inducida por el oxidante t-BOOH. Los niveles de GSH aumentaron a medida que la concentración

35 de la composición a base de hierbas del Ejemplo 4 aumentaba; los niveles de GSH eran esencialmente los mismos que con las células no tratadas a las concentraciones de 100 y 500 µg/ml, lo que muestra que a concentraciones altas, el Ejemplo 4 restaura esencialmente los niveles normales de proteínas de GSH.

Un estudio de la viabilidad celular en paralelo se realizó en las pruebas de peroxidación de lípidos y de glutatión.

40 Cuando se completaron el periodo de preincubación y el tratamiento de la composición a base de hierbas del Ejemplo 4 no se observó toxicidad alguna en los hepatocitos de rata aislados, es decir, se observó esencialmente el 100 % de viabilidad incluso a las concentraciones más altas, lo que indica que la composición del Ejemplo 4 era esencialmente no tóxica para los hepatocitos de rata aislados en los niveles más altos.

45 De los resultados anteriores se puede observar que la composición a base de hierbas del Ejemplo 4 actúa como un antioxidante que bloquea la formación de radicales libres y, por tanto, reduce la peroxidación de lípidos. Además, los niveles de GSH se conservan, en particular, cuando se utilizan concentraciones de 100 µg/ml o superiores del Ejemplo 4. Por lo tanto, la composición a base de hierbas del Ejemplo 4 también puede actuar como una composición hepatoprotectora para el hígado.

50 La composición a base de hierbas del Ejemplo 4 también mostró mayores mejoras clínicas (véase más adelante) y fue más eficaz en la reducción de diversos síntomas causados por daños en el hígado como resultado de la infección de hepatitis C. En particular, se observaron menos náuseas y menos sensación de ardor en el estómago

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con los pacientes que tomaron la mezcla de los tres extractos de hierbas, frente a los que tomaron los extractos individuales por separado. Esto sugiere además que puede haber beneficios adicionales en la toma de una mezcla de los tres extractos como es el caso del Ejemplo 4.

5 Ejemplo 8

El efecto genotóxico de la composición del Ejemplo 4 sobre los linfocitos humanos de sangre periférica se evaluó mediante la prueba de electroforesis alcalina en células individuales (la Prueba Comet), que se realiza en un cultivo primario de linfocitos humanos con el fin de evaluar el potencial de daños genéticos causados por el ingrediente activo de esta invención (M. J. Gomez-Lechon, T. Donato, X. Ponsoda, R. Fabra, R. Trullenque y J. V. Castell. Isolation, culture and use of human hepatocytes in drug research. IN VITRO METHODS IN PHARMACEUTICAL RESEARCH. ISBN 0 -12 -163390-X. Eds. J.V. Castell y M. J. Gomez-Lechon eds. pp. 129 -154. Academic Press. London (1997)).

15 El cultivo celular usó linfocitos obtenidos a partir de 20 ml de sangre total a partir de un donante sano; los linfocitos se aislaron mediante centrifugación diferencial y el uso de 20 ml de Lymphoprep (Sigma). Después de la centrifugación, el anillo de células de linfocitos se extrajo con una pipeta. Las células se lavaron después con PBS y se centrifugaron a 1.000 rpm durante 10 minutos. Por último, el botón de células se resuspendió en 6 ml de medio de congelación hasta que se utilizó en los diferentes experimentos realizados. Los linfocitos se expusieron durante 1 hora a 37 °C a las siguientes concentraciones de la composición del Ejemplo 4: 100, 200 y 500 µg/ml.

Se analizaron cien células en cada tratamiento y el momento del cambio de estado como un indicador del daño. El programa de análisis Comet 5 se utilizó para este análisis, que es una prueba de genotoxicidad que detecta daños primarios en el ADN en las células (Genet. Mol. Res. 2(4): 410 -417 (2003)). Se realizó el análisis estadístico de los

25 resultados obtenidos usando la prueba no paramétrica de Kruskal Wallis, p <0,05.

Los ingredientes activos del Ejemplo 4 no indujeron ningún daño en el ADN (que se detectaría como roturas en una cadena simple y manchas que son lábiles a álcali) cuando se aplican hasta 500 µg/ml en linfocitos de sangre periférica, en estas condiciones de prueba.

Ejemplo 9

La toxicidad aguda del extracto del Ejemplo 4 se analizó usando la prueba de la dosis límite en ratones albinos (Balb / C / CNPB) y la Prueba de clase tóxica aguda en ratas albinas (Holtzmann) de la siguiente manera.

35 Prueba de la dosis límite

El extracto del Ejemplo 4 y una sustancia de control (una solución salina) se administraron por vía oral utilizando un catéter intragástrico de acuerdo con lo siguiente:

Especie : Ratones albinos (Mus musculus) Endogámicos : Balb/C/CNPB Número de animales : 10 animales por grupo experimental Sexo : Machos y hembras Peso corporal : 20 -25 g.

Grupo I (en tratamiento): A estos animales se administró una dosis de 2.000 mg / kg del extracto del Ejemplo 4. Grupo II (Control): A estos animales se les administró un disolvente o solución salina (igual que el volumen de extracto).

45 Los ratones fueron sometidos a un periodo de ayuno de 4 horas antes del experimento; a continuación, el producto se administró en consecuencia y los animales estuvieron en observación continua durante 4 horas. Al no aparecer mortalidad, el período de observación se amplió a 14 días después de administrar el extracto, y después hasta 21 días, con el fin de realizar una observación de la recuperación de los animales y la reversibilidad de los efectos.

El peso corporal de los animales se registró al inicio del experimento, así como los días 7º, 14º y 21º, cuando fue posible después de la administración de las sustancias, con el fin de establecer si habrá una pérdida o ganancia de peso.

55 Al final del experimento, se sacrificó a los animales mediante un procedimiento de dislocación cervical, donde el cráneo se separa de la columna vertebral mediante la aplicación de presión en la base del cráneo y la columna cervical. De esta manera, no hay ninguna sensibilidad al dolor, ya que la médula espinal se separa del encéfalo.

Se realizó una necropsia en todos los animales que sobrevivieron hasta el final del experimento. En el caso de los animales que murieron durante el experimento, se evaluó el color, el tamaño, y el peso de sus órganos.

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El análisis macroscópico de los órganos no se encontró ningún cambio visible en los ratones del Grupo I, a los que se administró el extracto (Ejemplo 4) a una dosis de 2.000 mg / kg. Los resultados obtenidos muestran la inocuidad del extracto a una dosis de 2.000 mg / Kg. pc, ya que no se observaron ni mortalidad ni signos clínicos ni cambios macroscópicos y, por lo tanto, no había ninguna prueba toxicidad en los órganos.

5 En resumen, el método de la dosis límite mostró que el extracto acuoso liofilizado del ejemplo 4 no causó ninguna muerte a una dosis de 2.000 mg / kg administrada por vía oral. Por lo tanto, el extracto acuoso liofilizado del Ejemplo 4 se puede clasificar como CTA0 no tóxico, lo que significa que no se puede clasificar a través de método de la dosis límite.

Prueba de la clase tóxica aguda (CTA)

El extracto del Ejemplo 4 y una sustancia de control (una solución salina) se administraron por vía oral utilizando un catéter intragástrico de acuerdo con lo siguiente: 15 Especie : Ratas albinas (Rattus novergicus)

Endogámicos : Holtzmann

Número de animales : 3 animales por grupo experimental

Sexo : Machos y hembras

Peso corporal : 120 -160 g.

Grupo I (en tratamiento): A estos animales se administró una dosis de 2.000 mg / kg del extracto del Ejemplo 4. Grupo II (Control): A estos animales se les administró un disolvente o solución salina (igual que el volumen de extracto).

Este experimento se realizó con ratas machos y hembras, a los que se sometió a una cuarentena de una semana, se dividieron en dos grupos compuestos por tres animales de cada sexo y se pesaron y se marcaron con fines de identificación. Antes de la evaluación, se sometió a los animales a un período de ayuno de 12 horas; a continuación, el extracto del Ejemplo 4 y la sustancia de control se administraron a los dos grupos de acuerdo con la tabla de

25 dosis. Inmediatamente después se administraron las sustancias, se observaron los animales en busca de signos tóxicos a nivel de sistema / órgano: autónomo, comportamiento, sensorial, neuromuscular, respiratorio, ocular, gastrointestinal, urinario, y otros, como el peso corporal. El peso corporal de los animales se registró los días 7º y 14º después de la administración de las sustancias.

Después de 14 días, se sacrificó a los animales siguiendo los principios éticos de la experimentación con animales; a esto le siguió un estudio macroscópico para analizar el tamaño, el color y la consistencia de los siguientes órganos: corazón, riñones, hígado, bazo, estómago, pulmones, cerebro, ovarios y testículos. El análisis macroscópico de los órganos no se encontró ningún cambio visible cuando se administró el extracto a una dosis de

2.000 mg / kg.

35 Los resultados obtenidos muestran la inocuidad del extracto a una dosis de 2.000 mg / kg del Ejemplo 4, ya que no se observaron mortalidad ni signos clínicos ni cambios macroscópicos, de modo que no se encontró ningún signo de toxicidad en los órganos. Por tanto, de acuerdo con el método de la clase tóxica agua, el extracto acuoso liofilizado del ejemplo 4 no causó ninguna muerte a una dosis de 2.000 mg / kg administrada por vía oral. Por lo tanto, el extracto acuoso liofilizado del Ejemplo 4 se puede clasificar como CTA0 no tóxico, lo que significa que no se puede clasificar a través del método de la clase tóxica aguda.

Ejemplo 10

45 Se realizó un estudio clínico no controlado en 10 pacientes adultos de raza caucásica (5 hombres y 5 mujeres, con edades comprendidas entre 37 y 58 años), todos ellos diagnosticados de hepatitis C crónica, y tres de ellos con hepatitis B, además de C. Todos ellos mostraron los síntomas de hepatitis crónica y algunos habían recibido previamente tratamiento antiviral sin obtener buenos resultados. El tiempo estimado, a partir de la historia de la infección por el virus, varió entre 4 y 30 años.

La duración de la enfermedad sintomática, de acuerdo con la historia clínica, varió de 1 a 12 años. La evaluación del estado de cada paciente se realizó a través de su historia clínica (incluyendo síntomas y signos), así como estudios serológicos, bioquímicos y de ultrasonidos realizados al inicio del tratamiento y después de 28 días de tratamiento con la composición utilizada en el Ejemplo 4.

55 La presencia de hepatitis C se identificó mediante la detección de anticuerpos anti-VHC, usando un sistema ELISA de segunda generación. La presencia de hepatitis B se confirmó a través de un análisis del antígeno de superficie (HBsAg) y del antígeno nuclear (HBc Ag). Los daños hepatológicos se evaluaron mediante HCV FIBROSURE (550123). Se realizó un estudio con ultrasonidos tridimensionales para determinar el volumen del hígado, las

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características de sus límites y las alteraciones de ultrasonidos del parénquima hepático. La evaluación de las características de la vena porta, el bazo y la presencia de ascitis también se incluyeron en el estudio.

El estudio bioquímico de las alteraciones producidas por la hepatitis B y C crónica se basa en cuatro criterios: (1)

5 pruebas para medir la capacidad de síntesis del hígado; (2) pruebas para medir las alteraciones causadas por la fibrosis que conducen a la obstrucción intrahepática (evaluación de los niveles de bilirrubina y fosfatasa); (3) pruebas para medir la actividad necroinflamatoria en los hepatocitos, incluyendo una prueba para evaluar el hepatocarcinoma (medición de la transaminasa piruvato glutamato (GPT), glutamato oxalato transaminasa (GOT), gamma-glutamil transpeptidasa (GGT) y alfa-fetoproteína (AFT)); y (4) pruebas para medir la función de desintoxicación del hígado (medición de amoníaco).

Antes del tratamiento, se observaron síntomas, como malestar general, fatiga y dolor en las articulaciones y dolores, en todas (100 %) de los 10 pacientes; se observó depresión en el 90 %, un 80 % de los pacientes sintió dolor muscular y se observaron falta de concentración y trastornos del sueño en 60 % y 50 % de los pacientes,

15 respectivamente. Se observó dolor de cabeza en el 30 % de los pacientes. Se observaron síntomas gastrointestinales, tales como la indigestión (malestar abdominal y / o acidez gástrica) se en el 60 % de los casos; se encontraron náuseas en el 50 % de los pacientes, y disfunción intestinal alcanzó el 40 %; mientras que se notificaron dispepsia, sensación de plenitud y dolor abdominal en el 30 % de los casos. La exploración clínica mostró que el hallazgo más frecuente fue el dolor abdominal a la palpación, sobre todo en el hipocondrio derecho y el epigastrio, que se observó en el 70 % de los casos; se encontró ictericia e hígado palpable en el 20 % de los pacientes, mientras que ascitis, bazo palpable, equimosis y edema de miembros inferiores aparecieron en el 10 %.

Para determinar el nivel de éxito del tratamiento con el Ejemplo 4 sobre la calidad de vida (en términos de salud) de los 10 pacientes con hepatitis C crónica, también se registraron los efectos psicológicos, biológicos y clínicos del

25 tratamiento. El cuestionario Health Quality of Life (HQLQ) es un instrumento validado que mide la calidad de vida basándose en un conjunto de indicadores genéricos del informe SF-36, que consiste en un conjunto de ocho parámetros. Estos parámetros miden la resistencia física (RP), el dolor corporal (BP), la percepción de la salud general (GH), la vitalidad (VT), el funcionamiento social (SF), las limitaciones debidas a factores emocionales (RE) y la salud mental (MH), y se agregan y se utilizan como parámetros para desarrollar el resumen del componente físico (PCS) y el Resumen del Componente Mental (MCS).

La evaluación antes del tratamiento mostró que todos los pacientes tenían dificultades para caminar más de una milla, en comparación con el 21,9 % de la población general, el 50 % de los pacientes tenía dificultades para subir escaleras, en comparación con el 7,1 % de a población general, el 55,5 % de los pacientes mostró limitaciones para

35 caminar 100 yardas, en comparación con el 14,1 % de la población general; el 100 % de los pacientes declaró que tenían dificultades para realizar su trabajo, en comparación con solo el 45 % de la población general; el 30 % de los pacientes estudiados declaró que el dolor interfería con su capacidad de trabajo, en comparación con el 9,5 % de la población general; y el 90 % de los pacientes informó un estado de salud "regular" o "mala", en comparación con el 13,1 % de la población general. En general, la calidad de vida relacionada con la salud de los 10 pacientes con hepatitis C crónica se ha visto comprometida sustancialmente.

Los diez pacientes fueron tratados con 140 mg de la composición del Ejemplo 4, tres dosis al día, durante 28 días. La dieta de los pacientes fue variada; sin embargo, se evitó el consumo excesivo de grasa y no hubo consumo de alcohol. Después de 28 días de tratamiento con la composición del Ejemplo 4, se observaron los siguientes cambios.

45 Hubo cambios significativos en las lecturas de ultrasonidos en 90 % de los pacientes. En seis casos, se produjo una reducción de la ecogenicidad difusa en comparación con la lectura tomada antes del tratamiento y una reducción en el tamaño del hígado y el bazo. En tres casos, la ecografía mostró signos estables cuando en comparación con la primera lectura de control, y en un caso, el paciente evolucionó desfavorablemente, mostrando aumento en la ecogenicidad y la ascitis.

La evaluación clínica tras el tratamiento con la composición del Ejemplo 4 mostró una reducción en los síntomas generales del 60 % al 80 % de promedio, la incomodidad general se redujo en el 70 %, el dolor osteo-articular, la fatiga severa se redujo en un 60 %, la depresión y el dolor osteo-muscular disminuyó en el 60 % y el 50 %,

55 respectivamente, la falta de concentración y los trastornos del sueño disminuyeron al 40 % y 20 %. Los pacientes que todavía sufrían estos síntomas generales experimentaron una disminución en su intensidad. Este estudio también mostró una reducción de los síntomas gastrointestinales. La indigestión y la disfunción intestinal disminuyeron en un 30 %; la dispepsia disminuyó al 20 % y las náuseas al 10 %, mientras que el dolor abdominal no estaba presente en ninguno de los casos. Los pacientes que siguieron sufriendo molestias gastrointestinales informaron que la intensidad había disminuido. Cuando se completó el tratamiento con la composición del Ejemplo 4, el dolor al tacto en el hipocondrio derecho se redujo al 20 %. Otros signos, tales como ictericia, hígado palpable, ascitis, edema de miembros inferiores, equimosis e hígado palpable, se mantuvieron sin cambios en el 20 % y el 10 % respectivamente.

65 El estudio sobre la calidad de vida relacionada con la salud se basó en la información recopilada a través del cuestionario Health Quality of Life Questionnaire (HQLQ), que utiliza un conjunto de parámetros genéricos del

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Informe sobre la salud SF-36. Este informe utiliza un conjunto de normas obtenidas a partir de datos recogidos de la población en general en Estados Unidos. Estas normas promedian 50 puntos con una desviación estándar de 10; las puntuaciones más altas indican un mejor estado de salud. El estudio de la calidad de vida mostró que, antes del tratamiento, la calidad de vida de los 10 pacientes se vio comprometida sustancialmente. Sin embargo, la evaluación

5 realizada después del tratamiento con la composición del Ejemplo 4 durante 28 días mostró que el HQL de 6 pacientes se restableció a niveles normales o superiores a lo normal (por encima de 50); tres pacientes mostraron HQL restaurado a cerca de los niveles normales (varios puntos en la escala SF-36 eran cercanos o mayores de 50, mientras que otros estaban ligeramente por debajo de 50). Solo un caso retuvo una baja puntuación en la calidad de la salud.

Las pruebas bioquímicas de la función hepática realizadas antes del tratamiento (registro de control inicial) y 28 días después del tratamiento con la composición del Ejemplo 4 mostraron que, tras el tratamiento, tres pacientes experimentaron un aumento sustancial en los niveles de colinesterasa (entre 71,1 % y 81,1 %); en dos casos hubo un aumento moderado (entre 62,1 % y 54,9 %); en cuatro casos se produjo un aumento de entre 34 % y 40 %; y un

15 caso mostró un aumento mínimo del 15,7 %. Por lo tanto, el 90 % de los pacientes tenía una capacidad normal para sintetizar esta enzima, lo que sugiere una recuperación funcional de los hepatocitos. Las concentraciones de protrombina aumentaron después del tratamiento (entre el 24,8 % y 33,3 %) en cuatro casos con un incremento moderado (entre el 8,8 % y 19,2 %) en otros cuatro casos; una disminución insignificante de 0,5 % en un paciente, y una disminución de 9,0 % en el otro caso. En general, el 70 % de los pacientes alcanzó niveles normales y mostró signos de recuperación funcional en sus hepatocitos.

Una comparación entre las lecturas pre-albúmina en el momento del control inicial (antes del tratamiento) y la del control final (28 días después del tratamiento con la composición del Ejemplo 4) mostró un aumento significativo de entre 19,5 % y 26,9 % en tres pacientes, variaciones insignificantes de 0,0 % y 5,0 % en otros tres pacientes,

25 mientras que los otros cuatro casos experimentaron una reducción entre el 18,0 % y el 28,2 %. Por lo tanto, siete de los diez pacientes alcanzaron niveles normales, mientras que al inicio del tratamiento, solo había cuatro pacientes con lecturas normales indicativas de una recuperación de la función de los hepatocitos.

También se realizaron pruebas para medir la obstrucción intrahepática (colestasis); una comparación entre las lecturas de bilirrubina en el momento del control inicial y del control final del tratamiento con la composición del Ejemplo 4, mostró una disminución de 36,9 %, 15,4 % y 4,6 % en tres pacientes, respectivamente, que en un principio tenían niveles más altos de lo normal de bilirrubina. Un paciente, que tenía inicialmente niveles más altos de lo normal, informó de un aumento del 23,3 %. Los otros seis casos no tenían niveles más altos de lo normal al principio y no mostraron ningún cambio con el tratamiento. Una comparación entre las lecturas de la fosfatasa

35 alcalina en el momento del control inicial y la del control final del tratamiento con la composición del Ejemplo 4, mostró un incremento del 23,9 % en el de un paciente que tenía niveles más altos de lo normal antes del tratamiento. Los otros nueve pacientes se mantuvieron dentro de los niveles normales.

Con respecto a los índices de inflamación y lesión hepática, una comparación entre las lecturas de GPT en el momento del control inicial y la del control final del tratamiento con la composición del Ejemplo 4 mostró una disminución de entre 6,2 % y 84,7 % en seis pacientes que inicialmente tenían niveles más altos de lo normal de este elemento. Los otros dos pacientes que inicialmente tenían niveles más altos de lo normal informaron un incremento de 16,1 % y 57,5 % y los otros dos casos se mantuvieron en niveles normales. Una comparación entre los niveles de GOT en el momento del control inicial y la del control final del tratamiento con la composición del

45 Ejemplo 4, mostró un incremento de entre 3,8 % y 74,3 % en cinco pacientes que inicialmente tenían niveles más altos de lo normal. Los otros tres casos tenían niveles normales antes y después del tratamiento.

Una comparación entre las lecturas de GGT en el momento del control inicial y la del control final del tratamiento con la composición del Ejemplo 4, mostró una disminución de entre 11,3 % y 48,6 % en tres pacientes que inicialmente tenían niveles mayores de lo normal este elemento; otros dos pacientes informaron de un aumento de 2,1 % y 5,7 %, respectivamente, y los otros cinco casos se mantuvieron dentro de los niveles normales. Las lecturas de AFT en el momento del control inicial y la del control final del tratamiento con la composición del Ejemplo 4 mostraron que nueve pacientes iniciaron el tratamiento con valores normales; ocho eran todavía normales al final del tratamiento y uno experimentó un ligero aumento (8,5´%); el paciente restante, que comenzó el tratamiento con altos niveles de

55 esta sustancia, mantuvo niveles altos.

Con el fin de evaluar la capacidad de desintoxicación del hepatocito, también se registraron los niveles de amoníaco. Las lecturas de amoníaco en el momento del control inicial y la del control final del tratamiento con la composición del Ejemplo 4 mostró que nueve pacientes comenzaron y terminaron con niveles normales, mientras que el otro con niveles mayores de lo normal al comienzo del estudio terminó con un nivel por encima de lo normal.

Las lecturas de transferrina en el momento del control inicial y la del control final del tratamiento con la composición del Ejemplo 4 mostró que un paciente, que tenía inicialmente niveles mayores de lo normal, finalizó el tratamiento con niveles normales; dos pacientes, que inicialmente tenían niveles mayores de lo normal continuaron por encima

65 de dichos niveles normales, y los pacientes que comenzaron con niveles normales se mantuvieron dentro de los límites normales.

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En resumen, la evaluación realizada después del tratamiento de 28 días con la composición del Ejemplo 4 estableció que hubo una reducción significativa en los síntomas observados en los pacientes, una mejora moderada en los indicadores de enfermedad hepática y una mejora significativa en las enzimas de medición del daño en los hepatocitos. En el grupo de pacientes con signos de lesión hepática hubo una reducción en los índices de daños, así

5 como mediante ecosonografía. Ningún paciente mostró un aumento de sus síntomas, alteraciones hematológicas u otras complicaciones. La evolución de los pacientes con signos de hepatitis activa mejoró más que aquellos con fibrosis avanzada (cirrosis).

Los resultados obtenidos a partir del ensayo clínico demuestran que las composiciones a base de hierbas de la

10 presente invención mejoran la función hepática, así como mejoran las propiedades regenerativas y proliferativas de los hepatocitos. Estas composiciones se pueden usar de forma profiláctica, ya que previenen o minimizan los efectos adversos causados por infecciones virales, o la acción de otros agentes que inducen disfunción hepática. Por lo tanto, las composiciones a base de hierbas de la presente invención son útiles en el tratamiento de trastornos hepáticos causados por infección viral, reacciones autoinmunes, ingestión de drogas, xenobióticos o toxinas.

15

Ejemplo 11

La composición del Ejemplo 4 se analizó en una paciente mujer de 46 años de edad que sufría hepatitis B y C crónicas, en el estado sin fibrosis, con un período de inoculación del virus de 4 años y 1 año de la enfermedad, que

20 no consumía medicamentos antivirales. La composición del Ejemplo 4 se administró por vía oral, tres dosis 1de 40 mg al día durante 28 días. Los síntomas clínicos del paciente se controlaron, se realizaron exámenes ecográficos y análisis bioquímicos antes y 28 días después del tratamiento.

El tratamiento con la composición del Ejemplo 4 durante 28 días logró eliminar los síntomas generales mostrados

25 por el paciente antes de iniciar el tratamiento (malestar general, fatiga intensa, trastornos del sueño, depresión, dolor articular y muscular). Además, con el tratamiento, los síntomas gastrointestinales, como indigestión y dolor a la palpación, desaparecieron.

El control ecográfico realizado en el día 28 mostró que había una evolución favorable en la reducción de la 30 ecogenicidad difusa que el paciente mostró antes del tratamiento.

Los análisis bioquímicos se muestran en la tabla 3.

Tabla 3 Estudio bioquímico llevado a cabo en un paciente con hepatitis B y C crónicas que recibió un tratamiento 35 con la composición del

Ejemplo 4 durante 28 días

Variables (valores normales)

Antes del tratamiento Día 28 de tratamiento

Pre-albúmina (<20 mg / dl)

27,0 19,4

Tiempo de Protrombina (11 s)

13,0 11,8

Concentración de protrombina (100 %)

80,0 96,6

GPT (0,0 -38,0 UI)

71 51

GOT (0,0 -40,0 UI)

55 41

GGT (9,0 -35,0 U/l)

72 37

El tratamiento con la composición del Ejemplo 4 no afectó a los niveles normales de bilirrubina total, bilirrubina directa, bilirrubina indirecta, AFP, amoníaco, TNF alfa y recuento de plaquetas.

40 Los resultados en este ejemplo muestran que la composición del Ejemplo 4 puede reducir el daño hepático inducido por la coinfección de la hepatitis B y C.

Ejemplo 12

45 La composición del Ejemplo 4 se analizó en una paciente mujer de 47 años de edad que sufría hepatitis C crónica, en el estado sin fibrosis, con un período de inoculación del virus de 15 años y 5 años de la enfermedad, que no consumía medicamentos antivirales. La composición del Ejemplo 4 se administró por vía oral, tres dosis 1de 40 mg al día durante 28 días. Los síntomas clínicos del paciente se controlaron, se realizaron exámenes ecográficos y análisis bioquímicos antes y 28 días después del tratamiento.

50 El tratamiento con la composición del Ejemplo 4 durante 28 días logró eliminar los síntomas generales mostrados por el paciente antes de iniciar el tratamiento (malestar general, fatiga intensa, trastornos del sueño, dolor articular). Además, el tratamiento con la composición del Ejemplo 4 disminuyó o eliminó los síntomas generales como dolor muscular y dolor de cabeza, así como los síntomas gastrointestinales como náuseas, disfunción intestinal y dolor a

55 la palpación.

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La exploración ecográfica realizada el día 28 mostró una reducción de la ecogenicidad difusa que el paciente mostraba antes del tratamiento.

Los análisis bioquímicos se muestran en la tabla 4.

Tabla 4 Estudio bioquímico llevado a cabo en un paciente con hepatitis B y C crónicas que recibió un tratamiento con la composición del Ejemplo 4 durante 28 días

Variables (valores normales)

Antes del tratamiento Día 28 de tratamiento

Pre-albúmina (<20 mg / dl)

25,0 18,1

Tiempo de Protrombina (11 s)

13,0 11,5

Concentración de protrombina (100 %)

80,0 100

GPT (0,0 -38,0 UI)

50 32

GOT (0,0 -40,0 UI)

41 31

Transferrina (300 -360 ug/dl)

377 339

El tratamiento con la composición del Ejemplo 4 no afectó a los niveles normales de bilirrubina total, bilirrubina

10 directa, bilirrubina indirecta, fosfatasa alcalina, GGT, AFP, amoníaco, TNF alfa y recuento de plaquetas, que eran normales antes del tratamiento.

Los resultados en este ejemplo muestran que la composición del Ejemplo 4 puede reducir el daño hepático inducido por la infección por hepatitis C.

15 Ejemplo 13

Los perfiles fitoquímicoS de los extractos de hexano e hidroalcohólicos de los géneros de la presente invención se obtuvieron como sigue. Se tomó una muestra de 125 g de cada uno de los órganos seleccionados de cada una de

20 las especies en cuestión. Se usó hexano (un disolvente apolar) para realizar una extracción exhaustiva a temperatura ambiente, renovando el disolvente cada 48 horas. El extracto de hexano se obtuvo tras la eliminación del disolvente en un proceso de evaporación rotatoria de baja presión. A continuación, el residuo de la extracción con hexano se trató con etanol-agua (70:30) y se llevó a cabo una extracción exhaustiva. Después, el disolvente de etanol-agua se retiró hasta que el producto estaba completamente seco.

25 El perfil fitoquímico se obtuvo de acuerdo con la metodología descrita por Chhabra, S.C. et al. Phytochemical Screening of Tanzanian Medical Plants. J Ethnopharmacol. (1984) 11(2): 157 -79, con el fin de determinar los grupos químicos de los metabolitos secundarios presentes en las especies. Solo los alcaloides requirieron la extracción en medio básico. Los perfiles fitoquímicos de las flores de Cordia spp, las hojas de Annona spp y las

30 raíces de Curcuma spp se muestran en las Tablas 5, 6 y 7, respectivamente.

Tabla 5 Perfil fitoquímico de las muestras de flores de la especie Cordia

Masa de la muestra vegetal: 1255 gramos

Extracto de hexano

Extractos hidroalcohólicos (EtOH / agua: 70/30)

Masa obtenida 11,25 g

1,93 g 9,32 g

% de la masa obtenida

17,16 % 82,84 %

1

Alcaloides - +

2

Saponinas ND ++

3

Esteroides - -

4

Triterpenoides ++ ++

5

Taninos ND +++

6

Fenoles ND +++

7

Flavonoides ND ++

8

Quinonas - +

9

Lactonas y Cumarinas ++ +++

10

Lípidos y aceites esenciales - ND

11

Aminas y aminoácidos ND ++

Tabla 6 Perfil fitoquímico de las muestras de hojas de la especie Annona

Masa de la muestra vegetal: 1255 gramos

Extracto de hexano

Extractos hidroalcohólicos (EtOH / agua: 70/30)

Masa obtenida 14,87 g

5,77 g 9,10 g

% de la masa obtenida

38,80 % 61,20 %

1

Alcaloides - +

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Masa de la muestra vegetal: 1255 gramos

Extracto de hexano

Extractos hidroalcohólicos (EtOH / agua: 70/30)

2

Saponinas ND +

3

Esteroides ++ ++

4

Triterpenoides - -

5

Taninos ND +++

6

Fenoles ND +++

7

Flavonoides ND +

8

Quinonas - ++

9

Lactonas y Cumarinas + +++

10

Lípidos y aceites esenciales - ND

11

Aminas y aminoácidos ND ++

Tabla 7 Perfil fitoquímico de las muestras de raíz de la especie Curcuma

Masa de la muestra vegetal: 1255 gramos

Extracto de hexano

Extractos hidroalcohólicos (EtOH / agua: 70/30)

Masa obtenida 11,58 g

3,95 g 7,63 g

% de la masa obtenida

34,11 % 65,89 %

1

Alcaloides - -

2

Saponinas ND -

3

Esteroides - -

4

Triterpenoides +++ +++

5

Taninos ND +++

6

Fenoles ND +++

7

Flavonoides ND ++

8

Quinonas + +++

9

Lactonas y Cumarinas +++ +++

10

Lípidos y aceites esenciales +++ ND

11

Aminas y aminoácidos ND ++

LEYENDA: (-) Prueba negativa (+) Prueba positiva; ND: Esta prueba no se realizó en este extracto; CONTENIDO: (+) Poco (++) Medio (+++) Mucho

Los resultados obtenidos de las flores de la especie Cordia de la Tabla 5 muestran la fuerte presencia de fenoles, 5 taninos, lactonas y cumarinas en el extracto hidroalcohólico de una muestra de flores de esta especie.

Ejemplo 13

Un comprimido de la composición del Ejemplo 4 utilizado en los estudios de pacientes anteriores se formuló para dar 10 comprimidos recubiertos de 300 mg con 140 mg de la composición del Ejemplo 4. La composición del comprimido se muestra en la Tabla 8. Tabla 8 Fórmula farmacéutica de comprimido recubierto

Componente

Contenido %

Composición del Ejemplo 4

46,6

Celulosa

21,5

Almidón de maíz

20,9

Polivinilpirrolidona

4,3

Talco

3,4

Aerosil 200

0,5

Estearato de magnesio

0,5

Hidroxipropilcelulosa

2,0

Tween 80

0,3

La composición de la presente ejemplo también puede formularse como cápsulas (300 mg) como se muestra en la Tabla 9.

Tabla 9 Fórmula farmacéutica de cápsula de gel

Componente

Contenido %

Composición del Ejemplo 4

46,6

Almidón de maíz

9,4

Polivinilpirrolidona

44

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Por último, una suspensión de las composiciones de la presente invención también se puede formular como sigue. Se produjo una suspensión con sabor con 1 % de las composiciones a base de hierbas de la presente invención para proporcionar 140 mg de la composición a base de hierbas por 15 ml de dosis (una cucharada). La composición de la suspensión se muestra en la Tabla 10.

Tabla 10 Fórmula farmacéutica de suspensión aromatizada Fórmula Farmacéutica

Componente

Contenido %

Composición del Ejemplo 4

1

Sorbitol

19,61

Benzoato sódico

0,21

Metabisulfito sódico

0,13

Glicerina

3,27

Sacarina sódica

0,06

Aroma de frambuesa

0,01

Edetato disódico, dihidrato

< 0,01

Etanol

1

Agua desionizada, c.s.p.

74,7

Las fórmulas se produjeron conforme a las Directrices de las Buenas Prácticas de Fabricación (BPF).

10 Preferentemente, las tres fórmulas descritas anteriormente se administran tres veces al día, 30 -60 minutos antes de las comidas.

Las fórmulas farmacéuticas pueden incluir composiciones a base de hierbas de la presente invención en sus formas líquidas, sólidas y semi-sólidas, de modo que los ingredientes activos en los mismos se puedan liberar rápidamente

15 o lentamente. La administración de las fórmulas farmacéuticas de esta invención puede ser oral, rectal, intravenosa, intramuscular, hipodérmica, tópica o por medio de otros métodos, en una sola dosis, varias dosis, a través de métodos de liberación lenta o rápida o un depósito.

Claims (17)

1. REIVINDICACIONES

   1. Una composición a base de hierbas para su uso para el tratamiento de trastornos hepáticos, que comprende la

   especie de plantas Cordia lutea y al menos una especie de los géneros Annona o Curcuma, teniendo las especies 5 propiedades hepatoprotectoras.
2. 2. La composición a base de hierbas para su uso de la reivindicación 1, que comprende una especie de cada uno de los géneros de plantas Annona y Curcuma.

   10 3. La composición a base de hierbas para su uso de la reivindicación 1, donde las flores de Cordia lutea se utilizan en la composición.
3. 4. La composición a base de hierbas para su uso de las reivindicaciones 1 -3, donde la especie de Annona es

   Annona muricata y la especie de Curcuma es Curcuma longa. 15

4. 5.

   La composición de hierbas de la reivindicación 4, donde las hojas de Annona muricata o las raíces de Curcuma longa o ambos se utilizan en la composición.

5. 6.

   Una composición a base de hierbas para tratar trastornos hepáticos, que comprende un extracto de la especie de

   20 plantas Cordia lutea y un extracto de al menos una especie de los géneros de plantas Annona o Curcuma, teniendo las especies propiedades hepatoprotectoras.
6. 7. La composición a base de hierbas de la reivindicación 6, que además comprende una especie de cada uno de los

   géneros de plantas Annona y Curcuma. 25

7. 8.

   La composición a base de hierbas de la reivindicación 6, donde el extracto es de las flores de Cordia lutea.

8. 9.

   La composición a base de hierbas de las reivindicaciones 6 -8, donde la especie de Annona es Annona muricata

   y la especie de Curcuma es Curcuma longa. 30

9. 10.

   La composición de hierbas de la reivindicación 9, donde el extracto de Annona muricata es de hojas o el extracto de Curcuma longa es de raíces o ambos.

10. 11.

    La composición de hierbas de la reivindicación 10, donde los extractos de flores de Cordia lutea, de hojas de

    35 Annona muricata y de raíces de Curcuma longa están presentes en una relación en peso de 1: 1: 1 a 8: 1: 1, respectivamente.
11. 12. La composición de hierbas de la reivindicación 10, donde los extractos de flores de Cordia lutea, de hojas de

    Annona muricata y de raíces de Curcuma longa están presentes en una relación en peso de 1:0,025 -1:0,025 -1, 40 respectivamente.
12. 13. La composición de hierbas de la reivindicación 10, donde los extractos de flores de Cordia lutea, de hojas de Annona muricata y de raíces de Curcuma longa están presentes en una relación en peso de 8:1:1, respectivamente.

    45 14. La composición de hierbas de la reivindicación 13, donde los extractos son extractos hidroalcohólicos.
13. 15. Uso de una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición de hierbas que comprende las especies de plantas Cordia lutea o un extracto de la especie de plantas Cordia lutea para la preparación de un medicamento para el tratamiento o la prevención o de trastornos hepáticos en un paciente.

    50
14. 16. Uso de una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición de hierbas que comprende las especies de plantas Cordia lutea o un extracto de la especie de plantas Cordia lutea para la preparación de un medicamento para neutralizar los radicales libres y para prevenir la formación de radicales libres en un paciente que sufre un trastorno hepático.

    55

15. 17.

    Uso de acuerdo con la reivindicación 14 o 15, donde las flores de Cordia lutea se utilizan en la composición.

16. 18.

    Uso de una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición a base de hierbas de acuerdo con

    reivindicaciones 1 -14 para la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de trastornos 60 hepáticos en un paciente.
17. 19. Uso de una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición a base de hierbas de acuerdo con reivindicaciones 1 -14 para la preparación de un medicamento para neutralizar radicales libres y para prevenir la formación de radicales libres en un paciente que sufre un trastorno hepático.

    18