ES2541925T3 - Métodos y composiciones para el uso diagnóstico en pacientes de cáncer - Google Patents

Abstract

Método de identificación de un paciente que sufre de cáncer que podría beneficiarse de la terapia anticáncer alternativa o adicionalmente a la terapia antiangiogénica, que comprende determinar el nivel de expresión del factor de crecimiento placentario (FCPL) en una muestra obtenida del paciente, en la que una expresión incrementada de FCPL en la muestra en comparación con una muestra de referencia indica que el paciente podría beneficiarse de la terapia anticáncer alternativamente o adicionalmente a la terapia antiangiogénica.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos y composiciones para el uso diagnóstico en pacientes de cáncer

Campo de la invención 5

La presente invención se refiere a métodos y composiciones útiles para predecir el resultado clínico y para el seguimiento de pacientes de cáncer tratados mediante terapia antiangiogénica.

Antecedentes de la invención 10

El cáncer es una de las amenazas más mortíferas para la salud humana. Sólo en los EUA, el cáncer afecta a casi 1,3 millones de nuevos pacientes cada año y es la segunda causa más importante de muerte, después de las enfermedades cardiovasculares, siendo responsable de aproximadamente 1 de cada 4 muertes. Los tumores sólidos son responsables de la mayoría de estas muertes. Aunque se han realizado avances significativos en el tratamiento 15 médico de determinados cánceres, la tasa global de supervivencia a 5 años para todos los cánceres sólo ha mejorado en aproximadamente 10% en los últimos 20 años. Los cánceres, o tumores malignos, metastatizan y crecen rápidamente de una manera descontrolada, dificultando de manera extrema la detección y tratamiento precoces.

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Dependiendo del tipo de cáncer, los pacientes típicamente disponen de varias opciones de tratamiento, incluyendo quimioterapia, radiación y fármacos basados en anticuerpos. Los métodos diagnósticos útiles para predecir el resultado clínico de los diferentes regímenes de tratamiento beneficiarían mucho el control clínico de estos pacientes. Varios estudios han explorado la correlación de la expresión génica con la identificación de tipos de cáncer específicos, por ejemplo mediante ensayos mutacionales específicos, análisis de micromatrices, qPCR, etc. 25 Dichos métodos pueden resultar útiles para la identificación y la clasificación del cáncer presentado por el paciente. Sin embargo, se conoce mucho menos sobre el valor predictivo o pronóstico de la expresión génica para el resultado clínico.

De esta manera, existe una necesidad de métodos reproducibles objetivos para predecir el resultado del tratamiento, 30 tal como la supervivencia sin progresión de los pacientes de cáncer o para el seguimiento del progreso de dicho tratamiento y de esta manera seleccionar el régimen de tratamiento óptimo para cada paciente.

Wei SC et al., Gut. 54(5):666-72, mayo de 2005, dan a conocer que el nivel de expresión de FCPL es significativamente superior en tejidos tumorales que en tejidos no tumorales. Parr C. et al., Eur. J. Cancer. 35 41(18):2819-27, dic. de 2005. Epub 2005 Nov. 4 da a conocer que el FCPL se encuentra sobreexpresado en tejidos de cáncer de mama. Taylor A.P. et al., Int. J. Cancer. 105(2):158-64, junio de 2003, describen el papel del FCPL en la rápida restauración del suministro sanguíneo tumoral tras el tratamiento y, de esta manera, la probabilidad incrementada de nuevo crecimiento tumoral.

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Descripción resumida de la invención

Los métodos de la presente invención pueden utilizarse en una diversidad de contextos, incluyendo, por ejemplo, en la ayuda en los métodos de tratamiento de los pacientes de cáncer o en la selección de pacientes durante el curso del desarrollo de fármacos, en la predicción de la probabilidad de éxito al tratar un paciente individual con un 45 régimen de tratamiento particular, en la evaluación de la progresión de la enfermedad, en el seguimiento de la eficacia del tratamiento, en la determinación del pronóstico para pacientes individuales y en la evaluación de la predisposición de un individuo a beneficiarse de una terapia anticáncer particular.

La presente invención se basa en parte en el descubrimiento de que los niveles de expresión de determinados 50 marcadores biológicos en pacientes que sufren de cáncer se correlacionan con un beneficio clínico de la terapia antiangiogénica por sí sola. De acuerdo con lo anteriormente expuesto, en un aspecto la invención proporciona un método de optimización de la eficacia terapéutica en el tratamiento del cáncer, que comprende la etapa de detectar el nivel de expresión del factor de crecimiento placentario (FCPL) en una muestra obtenida del paciente, en la que una expresión incrementada de FCPL en la muestra en comparación con una muestra de referencia indica que el 55 paciente podría beneficiarse de la terapia anticáncer alternativamente o adicionalmente a la terapia antiangiogénica. En algunas realizaciones, el método comprende además la administración de una terapia anticáncer en el paciente, en la que la terapia anticáncer es alternativa o adicional a la terapia antiangiogénica.

En otro aspecto la invención proporciona un método de identificación de un paciente de cáncer que podría 60 beneficiarse de la terapia anticáncer alternativa o adicionalmente a la terapia antiangiogénica, que comprende la etapa de detectar el nivel de expresión del factor de crecimiento placentario (FCPL) en una muestra obtenida del paciente, en la que una expresión incrementada de FCPL en la muestra en comparación con una muestra de referencia indica que el paciente podría beneficiarse de la terapia anticáncer alternativamente o adicionalmente a la terapia antiangiogénica. En una realización, la muestra del paciente se obtiene antes o al inicio de la terapia 65 antiangiogénica. En una realización, la muestra del paciente se obtiene tras iniciarse la terapia antiangiogénica. En

algunas realizaciones, el método comprende además la administración de una terapia anticáncer en el paciente, en la que la terapia anticáncer es alternativa o adicional a la terapia antiangiogénica.

En otro aspecto la invención proporciona un método para predecir la sensibilidad de un paciente de cáncer a la terapia antiangiogénica, que comprende determinar el nivel de expresión del FCPL en una muestra obtenida del 5 paciente, en el que los niveles incrementados de expresión de FCPL en comparación con una muestra de referencia indican que el paciente es menos probable que responda a la terapia antiangiogénica por sí sola. En una realización, la muestra del paciente se obtiene antes o al inicio de la terapia antiangiogénica. En una realización, la muestra del paciente se obtiene tras iniciarse la terapia antiangiogénica. En algunas realizaciones, el método comprende además la administración de una terapia anticáncer en el paciente, en la que la terapia anticáncer es alternativa o 10 adicional a la terapia antiangiogénica.

La invención proporciona además un método de tratamiento de un paciente de cáncer, que comprende administrar en el paciente una terapia anticáncer alternativa o adicionalmente a la terapia antiangiogénica, en la que una muestra del paciente muestra niveles de expresión incrementados de FCPL en comparación con una muestra de 15 referencia. En una realización, la muestra del paciente se obtiene antes o al inicio de la terapia antiangiogénica. En una realización, la muestra del paciente se obtiene después de iniciarse la terapia antiangiogénica. La muestra puede obtenerse del paciente antes de iniciar el tratamiento. En una realización, la muestra presenta un nivel de expresión del FCPL superior o igual a 28 pg/ml. En algunas realizaciones, la muestra puede obtenerse del paciente actualmente bajo tratamiento con terapia antiangiogénica. En una realización, la muestra del paciente se obtiene tras 20 iniciarse la terapia antiangiogénica. En una realización, la muestra presenta un nivel de expresión del FCPL superior o igual a 50 pg/ml.

En otro aspecto, la invención proporciona un método de tratamiento de un paciente de cáncer, que comprende administrar en el paciente una terapia antiangiogénica, en el que una muestra obtenida del paciente muestra niveles 25 de expresión bajos o reducidos de FCPL en comparación con una muestra de referencia. La muestra puede obtenerse del paciente antes de iniciar el tratamiento. En una realización, la muestra presenta un nivel de expresión del FCPL inferior o igual a 28 pg/ml. En algunas realizaciones, la muestra puede obtenerse del paciente actualmente bajo tratamiento con terapia antiangiogénica. En una realización, la muestra del paciente se obtiene después de iniciarse la terapia antiangiogénica. En una realización, la muestra presenta un nivel de expresión del FCPL inferior o 30 igual a 50 pg/ml. En algunas realizaciones, la terapia antiangiogénica comprende la administración de un anticuerpo anti-FCVE, por ejemplo bevacizumab.

En cualquiera de los métodos descritos en la presente memoria, la muestra puede ser una muestra de tejido o celular u obtenerse de sangre, plasma y/o suero. En determinadas realizaciones, la muestra se obtiene del paciente 35 antes de iniciarse el tratamiento del cáncer. En determinadas realizaciones, la muestra se obtiene del paciente después de iniciarse el tratamiento del cáncer. Por ejemplo, la muestra se obtiene dentro de las 24 horas posteriores al inicio del tratamiento del cáncer o en los 2, 3, 5, 10, 14, 20, 25, 28, 42 o 56 días posteriores al inicio del tratamiento del cáncer.

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En cualquiera de los métodos descritos en la presente memoria, los niveles de expresión de uno o más genes o productos génicos puede determinarse al nivel de los ácidos nucleicos, al nivel de las proteínas o nivel de secreción o expresión en superficie de la proteína. En determinadas realizaciones, el incremento de los niveles de expresión de FCPL es un incremento de 1,4 a 1,8 veces del nivel de expresión. En algunas realizaciones, el incremento de los niveles de expresión de FCPL es un incremento de 1,5 veces del nivel de expresión. 45

En algunas realizaciones de los métodos de la invención, el cáncer es carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia. Entre los ejemplos más particulares de dichos cánceres se incluyen cáncer de células escamosas, cáncer de pulmón (incluyendo el cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, adenocarcinoma de pulmón y carcinoma escamoso de pulmón), cáncer de peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer 50 gástrico o de estómago (incluyendo cáncer gastrointestinal), cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer cervical, cáncer ovárico, cáncer hepático, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de glándulas salivares, cáncer de riñón o renal, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer vulvar, cáncer de tiroides, carcinoma hepático y diversos tipos de cáncer de cabeza y cuello, así como linfoma de células B (incluyendo el linfoma no de Hodgkin (LNH) de grado bajo/folicular, LNH 55 linfocítico pequeño, LNH de grado intermedio/folicular, LNH difuso de grado intermedio, LNH inmunoblástico de grado elevado, LNH linfoblástico de grado elevado, LNH de células no hendidas pequeñas de grado elevado, LNH de afectación masiva, linfoma de células de manto, linfoma relacionado con el SIDA y macroglobulinemia de Waldenström), leucemia linfocítica crónica (LLC), leucemia linfoblástica aguda (LLA), leucemia de células pilosas, leucemia mieloblástica crónica y trastorno linfoproliferativo post-trasplante (TLPT), así como la proliferación vascular 60 anormal asociada a facomatosis, edema (tal como el asociado a los tumores cerebrales) o síndrome de Meigs.

En una realización, el cáncer es cáncer de mama, incluyendo, por ejemplo, el cáncer de mama metastásico.

Los métodos de la invención pueden ponerse en práctica con cualquier agente anticáncer indicado posteriormente 65 en la presente memoria. El agente antiangiogénico puede ser cualquiera de los agentes antiangiogénesis indicados

posteriormente en la presente memoria, solos o en combinación. En algunas realizaciones, la terapia antiangiogénica comprende la administración de un anticuerpo anti-FCVE, incluyendo, por ejemplo, un anticuerpo anti-FCVE. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-FCVE es el bevacizumab.

Cualquier realización descrita en la presente memoria o cualquier combinación de la misma se aplica a cualquiera y 5 todos los métodos de la invención descritos en la presente memoria.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 es un gráfico que compara la supervivencia global de pacientes de cáncer de mama con los niveles 10 plasmáticos de FCPL el día 0 (antes del inicio del tratamiento).

La figura 2 es un gráfico que muestra los niveles plasmáticos de FCPL en respuesta al tratamiento con bevacizumab.

La figura 3 es un gráfico que compara la supervivencia global de pacientes de cáncer de mama con los niveles plasmáticos de FCPL el día 14 de tratamiento con bevacizumab. 15

Descripción detallada

La práctica de la presente invención utiliza, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología molecular (incluyendo técnicas recombinantes), microbiología, biología celular, bioquímica e inmunología, que se 20 encuentran comprendidas dentro de los conocimientos del experto en la materia. Dichas técnicas se explican exhaustivamente en la literatura, tal como en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición (Sambrook et al., 1989; "Oligonucleotide Synthesis" (M.J. Gait, ed., 1984)); Animal Cell Culture (R.L. Freshney, ed., 1987); "Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.); "Current Protocols in Molecular Biology" (F.M. Ausubel et al., editores, 1987, y actualizaciones periódicas); "PCR: The Polymerase Chain Reaction" (Mullis et 25 al., editores, 1994).

A menos que se indique lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente memoria presentan los mismos significados entendidos comúnmente por el experto ordinario en la materia a la que se refiere la presente invención. Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 2a ed., J. Wiley & Sons 30 (New York, N.Y., 1994); y March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure, 4a ed., John Wiley & Sons (New York, N.Y., 1992), proporcionan al experto en la materia una guía general de muchos de los términos utilizados en la presente solicitud.

I. Definiciones 35

El término "matriz" o "micromatriz", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una disposición ordenada de elementos de matriz hibridables, preferentemente sondas polinucleótidas (por ejemplo oligonucleótidos), sobre un sustrato. El sustrato puede ser un sustrato sólido, tal como un portaobjetos de vidrio, o un sustrato semisólido, tal como una membrana de nitrocelulosa. Las secuencias de nucleótidos pueden ser de ADN, ARN o cualesquiera 40 permutaciones de los mismos.

Una "secuencia diana", "ácido nucleico diana" o "proteína diana", tal como se utiliza en la presente memoria, es un polinucleótido o proteína de interés, la detección del cual se desea. Generalmente, un "molde", tal como se utiliza en la presente memoria, es un polinucleótido que contiene la secuencia de nucleótidos diana. En algunos casos, las 45 expresiones "secuencia diana", "ADN molde", "polinucleótido de molde", "ácido nucleico diana", "polinucleótido diana", y variaciones de las mismas, se utilizan intercambiablemente.

La "amplificación", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere generalmente al procedimiento de producción de múltiples copias de una secuencia deseada. La expresión "múltiples copias" se refiere a por lo menos 50 2 copias. Una "copia" no se refiere necesariamente a una complementariedad o identidad de secuencias perfecta con la secuencia molde. Por ejemplo, las copias pueden incluir análogos de nucleótidos, tales como desoxiinosina, alteraciones de la secuencia deliberadas (tales como alteraciones de la secuencia introducidas mediante un cebador que comprende una secuencia que es hibridable, pero no complementaria, con el molde) y/o errores de secuencia que se producen durante la amplificación. 55

La expresión/cantidad de un gen, proteína o marcador biológico en una primera muestra es alto o se encuentra incrementado en comparación con la expresión/cantidad en una segunda muestra en el caso de que el nivel de expresión/cantidad del gen, producto génico, por ejemplo la proteína o marcador biológico en la primera muestra, sea mayor que el nivel de expresión/cantidad del gen, producto génico, por ejemplo la proteína o marcador biológico, 60 en la segunda muestra. En una realización, el incremento de nivel de expresión/cantidad del gen, producto génico, por ejemplo proteína o marcador biológico, en la primera muestra es por lo menos aproximadamente 1,5X, 1,75X, 2X, 3X, 4X, 5X, 6X, 7X, 8X, 9X, 10X, 25X, 50X, 75% ó 100X el nivel de expresión/cantidad del gen respectivo, producto génico, por ejemplo la proteína o marcador biológico en la segunda muestra.

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La expresión/cantidad de un gen, proteína o marcador biológico en una primera muestra es bajo o se encuentra reducido en comparación con la expresión/cantidad en una segunda muestra en el caso de que el nivel de expresión/cantidad del gen, producto génico, por ejemplo la proteína o marcador biológico en la primera muestra, sea inferior que el nivel de expresión/cantidad del gen, producto génico, por ejemplo la proteína o marcador biológico, en la segunda muestra. En una realización, la reducción de nivel de expresión/cantidad del gen, producto 5 génico, por ejemplo proteína o marcador biológico, en la primera muestra es por lo menos aproximadamente 1,5X, 1,75X, 2X, 3X, 4X, 5X, 6X, 7X, 8X, 9X, 10X, 25X, 50X, 75% ó 100X el nivel de expresión/cantidad del gen respectivo, producto génico, por ejemplo la proteína o marcador biológico, en la segunda muestra.

Los niveles de expresión/cantidad pueden determinarse basándose en cualquier criterio adecuado conocido de la 10 técnica, incluyendo, aunque sin limitación, el ARNm, el ADNc, las proteínas, los fragmentos de proteína y/o las copias génicas. Los niveles de expresión/cantidades pueden determinarse cualitativa y/o cuantitativamente. En una realización, las muestras se normalizan para ambas diferencias, de cantidad de ARN o proteína analizada y de variabilidad en la calidad de las muestras de ARN o proteína utilizadas. Dicha normalización puede llevarse a cabo midiendo e incorporando la expresión de determinados genes normalizadores, incluyendo genes de mantenimiento 15 bien conocidos, tales como GAPDH. Alternativamente, la normalización puede basarse en la señal media o la mediana de la señal de todos los genes analizados o de un subgrupo grande de los mismos (enfoque de normalización global). Gen a gen, la cantidad normalizada medida de ARNm o proteína tumoral del paciente se compara con la cantidad medida en un juego de referencia. Los niveles de expresión normalizados de cada ARNm o proteína por cada tumor analizado por cada paciente pueden expresarse como porcentaje del nivel de expresión 20 medido en el juego de referencia. El nivel de expresión medido en una muestra de paciente particular que debe analizarse se encontrará en cierto percentil dentro de este intervalo, que puede determinarse mediante métodos bien conocidos de la técnica.

La "detección" incluye cualesquiera medios de detección, incluyendo las detecciones directa e indirecta. 25

El término "muestra" o "muestra de ensayo", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una composición que se obtiene o que se deriva de un sujeto de interés que contiene una entidad celular y/o otra entidad molecular que debe caracterizarse y/o identificarse, por ejemplo basándose en las características físicas, bioquímicas, químicas y/o fisiológicas. En una realización, la definición comprende sangre y otras muestras líquidas 30 de origen biológico y muestras de tejido, tales como espécimen de biopsia o cultivos de tejidos o células derivadas de los mismos. La fuente de la muestra de tejido puede ser tejido sólido, tal como de una muestra de órgano o tejido fresca, congelada y/o conservada, o de biopsia o aspirado; sangre o cualesquiera constituyentes de la sangre; líquidos corporales, y células de cualquier momento de la gestación o del desarrollo del sujeto o plasma. Las muestras pueden obtenerse de un sujeto antes del inicio del tratamiento (por ejemplo el tratamiento del cáncer) o 35 tras el inicio del tratamiento (por ejemplo el tratamiento del cáncer). Las muestras pueden obtenerse en 24 horas, 7, 10, 14, 28, 42 o 56 días después del inicio de tratamiento (por ejemplo el tratamiento del cáncer).

El término "muestra", o "muestra de ensayo" incluye muestras biológicas que han sido manipuladas de cualquier manera tras su obtención, tal como mediante tratamiento con reactivos, la solubilización, o el enriquecimiento en 40 determinados componentes, tal como proteínas o polinucleótidos, o la inclusión en una matriz semisólida o sólida con fines de realización de secciones. Para los fines de la presente memoria, una "sección" de una muestra de tejido se refiere a una parte o trozo individual de una muestra de tejido, por ejemplo una sección delgada de tejido o células cortadas de una muestra de tejido.

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Entre las muestras se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, las células o líneas celulares cultivadas o primarias, los sobrenadantes celulares, los lisados celulares, las plaquetas, el suero, el plasma, el líquido vítreo, el líquido linfático, el líquido sinovial, el líquido folicular, el líquido seminal, el líquido amniótico, la leche, la sangre completa, las células derivadas de la sangre, la orina, el líquido cerebroespinal, la saliva, el esputo, las lágrimas, el sudor, el moco, los lisados tumorales y el medio de cultivo de tejidos, extractos de tejidos tales como tejido homogeneizado, tejido 50 tumoral, extractos celulares y combinaciones de los mismos.

En una realización, la muestra es una muestra clínica. En otra realización, la muestra se utiliza en un ensayo diagnóstico. En algunas realizaciones, la muestra se obtiene de un tumor primario o metastásico. La biopsia de tejido se utiliza con frecuencia para obtener un trozo representativo de tejido tumoral. Alternativamente, pueden 55 obtenerse células tumorales indirectamente en forma de tejidos o líquidos que es conocido o se cree que contienen las células tumorales de interés. Por ejemplo, pueden obtenerse muestras de lesiones de cáncer pulmonar mediante resección, broncoscopia, aspiración con aguja delgada, cepillado bronquial o de esputo, líquido pleural o sangre.

En una realización, se obtiene una muestra de un sujeto o pacientes antes de la terapia antiangiogénica. En otra 60 realización, se obtiene una muestra de un sujeto o paciente antes de la terapia con antagonista de FCVE. En todavía otra realización, se obtiene una muestra de un sujeto o paciente antes de la terapia con anticuerpo anti-FCVE. En todavía otra realización, se obtiene una muestra de un sujeto o paciente después de por lo menos un tratamiento mediante terapia de antagonista de FCVE.

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En una realización, se obtiene una muestra de un sujeto o paciente después de por lo menos un tratamiento mediante terapia antiangiogénica. En todavía otra realización, se obtiene una muestra de un sujeto o paciente después de por lo menos un tratamiento con un anticuerpo anti-FCVE. En algunas realizaciones, se obtiene una muestra de un paciente antes de que haya metastizado el cáncer. En determinadas realizaciones, se obtiene una muestra de un paciente antes de que haya metastizado el cáncer. 5

Una "muestra de referencia" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a cualquier muestra, estándar o nivel que se utilice con fines comparativos. En una realización se obtiene una muestra de referencia de una parte sana y/o no enferma del cuerpo (por ejemplo tejido o células) del mismo sujeto o paciente. En otra realización se obtiene una muestra de referencia de un tejido y/o célula corporal no tratado del cuerpo del mismo sujeto o paciente. 10 En todavía otra realización se obtiene una muestra de referencia de una parte sana y/o no enferma del cuerpo (por ejemplo tejido o células) de un individuo que no es el sujeto o paciente. En todavía otra realización se obtiene una muestra de referencia de un tejido y/o célula no tratado del cuerpo de un individuo que no es el sujeto o paciente.

En determinadas realizaciones, una muestra de referencia es una única muestra o múltiples muestras combinadas 15 del mismo sujeto o paciente que se obtienen en uno o más puntos temporales diferentes de cuando se ha obtenido la muestra de ensayo. Por ejemplo, se obtiene una muestra de referencia del mismo sujeto o paciente en un punto temporal anterior a cuando se ha obtenido la muestra de ensayo. Dicha muestra de referencia puede resultar útil en el caso de que la muestra de referencia se obtenga durante el diagnóstico inicial de cáncer y la muestra de ensayo se obtenga posteriormente, cuando el cáncer se ha convertido en metastásico. 20

En determinadas realizaciones, una muestra de referencia incluye todos los tipos de muestras biológicas definidas anteriormente bajo el término "muestra", la cual se obtiene de uno o más individuos que no son el sujeto o paciente. En determinadas realizaciones se obtiene una muestra de referencia de uno o más individuos con un trastorno angiogénico (por ejemplo cáncer) que no es el sujeto o paciente. 25

En determinadas realizaciones, una muestra de referencia es la combinación de múltiples muestras de uno o más individuos sanos que no son el sujeto o paciente. En determinadas realizaciones una muestra de referencia es una combinación de múltiples muestras de uno o más individuos con una enfermedad o trastorno (por ejemplo un trastorno angiogénico tal como, por ejemplo el cáncer) que no son el sujeto o paciente. En determinadas 30 realizaciones, una muestra de referencia es una muestra agrupada de ARN procedente de tejidos normales o una agrupación de muestras de plasma o suero procedentes de uno o más individuos que no son el sujeto o paciente. En determinadas realizaciones una muestra de referencia es una agrupación de muestras de ARN de tejidos tumorales o una agrupación de muestras de plsama o suero procedentes de uno o más individuos con una enfermedad o trastorno (por ejemplo un trastorno angiogénico tal como, por ejemplo, el cáncer) que no son el sujeto 35 o paciente.

El término "polinucleótido" o "ácido nucleico", tal como se utilizan intercambiablemente en la presente memoria, se refiere a polímeros de nucleótidos de cualquier longitud, e incluye ADN y ARN. Los nucleótidos pueden ser desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos, nucleótidos o bases modificados y/o los análogos de los mismos, o cualquier 40 sustrato que pueda ser incorporado en un polímero por la ADN o ARN polimerasa. Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados, tales como nucleótidos metilados y sus análogos. En caso de encontrarse presente, la modificación de la estructura de los nucleótidos puede realizarse antes o después del ensamblaje del polímero. La secuencia de nucleótidos puede interrumpirse con componentes no nucleotídicos. Un oligonucleótido puede ser adicionalmente modificado tras la polimerización, tal como mediante conjugación con un componente de 45 marcaje. Entre otros tipos de modificación se incluyen, por ejemplo, "caperuzas", la sustitución de uno o más nucleótidos de origen natural con un análogo, modificaciones internucleótidas, tales como, por ejemplo, aquellas con enlaces sin carga (por ejemplo fosfonatos de metilo, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos, etc.) y con enlaces con carga (por ejemplo fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), aquellos que contiene fracciones colgantes, tales como, por ejemplo, proteínas (por ejemplo nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos de señal, pLy-L-lisina, etc.), aquellos 50 con intercalantes (por ejemplo acridina, psoralén, etc.), aquellos que contienen quelantes (por ejemplo metales, metales radioactivos, boro, metales oxidantes, etc.), aquellos que contienen alquilantes, aquellos con enlaces modificados (por ejemplo ácidos nucleicos alfa-anoméricos, etc.), así como las formas no modificadas del polinucleótido o polinucleótidos. Además, puede sustituirse cualquiera de los grupos hidroxilo presente ordinariamente en los azúcares, por ejemplo con grupos fosfonato, grupos fosfato, protegidos con grupos 55 protectores estándares, o activados para preparar enlaces adicionales a nucleótidos adicionales, o pueden conjugarse con soportes sólidos. El OH 5' y 3'-terminal puede fosforilarse o sustituirse con aminas o fracciones de grupos de caperuza orgánicos de entre 1 y 20 átomos de carbono. Otros hidroxilos también pueden derivatizarse con grupos protectores estándares. Los polinucleótidos también pueden contener formas análogas de los azúcares ribosa o desoxirribosa que son generalmente conocidas de la técnica, incluyendo, por ejemplo, 2'-O-metil-2'-O-alilo, 60 2'-fluoro- o 2'-azido-ribosa, análogos de azúcar carboxíclico, azúcares α-anoméricos, azúcares epiméricos tales como arabinosa, xilosas o lixosas, azúcares piranosa, azúcares furanosa, sedoheptulosas, análogos acíclicos y análogos de nucleósidos abásicos, tales como ribósido de metilo. Puede sustituirse uno o más enlaces fosfodiéster por grupos de enlace alternativos. Entre estos grupos de enalce alternativos se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, realizaciones en las que el fosfato se sustituye por P(O)S ("tioato"), P(S)S ("ditioato"), (O)NR 2 ("amidato") P(O)R, 65 P(O)OR', CO o CH2 ("formacetal"), en los que R o R' es independientemente H o alquilo sustituido o no sustituido (1

a 20 C) que contiene opcionalmente un enlace éter (--O--), arilo, alquenilo, cicloalquilo, cicloalquenilo o araldilo. No es necesario que todos los enlaces en un polinucléotido sean idénticos. La descripción anterior se aplica a todos los polinucleótidos a los que se hace referencia en la presente memoria, incluyendo ARN y ADN.

El término "oligonucleótido", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere generalmente a polinucleótidos 5 cortos, generalmente de cadena sencilla, generalmente sintéticos que presentan una longitud generalmente, aunque no necesariamente, inferior a aproximadamente 200 nucleótidos. Los términos "oligonucleótido" y "polinucleótido" no son mutuamente exclusivos. La descripción anterior para los polinucleótidos es igualmente y totalmente aplicable a oligonucleótidos.

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Un "cebador" es generalmente un polinucleótido de cadena sencilla corto, generalmente con un grupo 3'-OH libre, que se une a una diana potencialmente presente en una muestra de interés mediante hibridación con una secuencia diana, y después induce la polimerización de un polinucleótido complementario a la diana.

La expresión "marcador biológico" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere de manera general a una 15 molécula, incluyendo un gen, proteína, estructura de carbohidrato o glucolípico, la expresión de la cual en un tejido o célula de un mamífero puede detectarse mediante métodos estándares (o métodos dados a conocer en la presente memoria) y es predictiva, diagnóstica y/o pronóstico de la sensibilidad de una célula o tejido del mamífero a regímenes de tratamiento basados en la inhibición de la angiogénesis, por ejemplo un agente antiangiogénesis tal como un inhibidor específico de FCVE. Opcionalmente, la expresión de dicho marcador biológicamente se determina 20 que es más elevada que la observada para una muestra de tejido o celular de control/referencia. La expresión de dichos marcadores biológicos puede determinarse utilizando un inmunoensayo multiplexado de alto rendimiento, tal como los disponibles comercialmente de Rules Based Medicine, Inc. o de Meso Scale Discovery. La expresión de los marcadores biológicos también puede determinarse utilizando, por ejemplo, un ensayo PCR o FACS, un ensayo inmunohistoquímico o un ensayo basado en chips génicos. 25

La expresión "muestra de tejido o celular" se refiere a una colección de células obtenida de un tejido de un sujeto o paciente. El origen de la muestra de tejido o celular puede ser tejido sólido, tal como de una muestra de órgano o tejido fresca, congelada y/o conservada, o de biopsia o aspirado; sangre o cualesquiera constituyentes de la sangre; líquidos corporales, tales como líquido cerebroespinal, líquido amniótico, líquido peritoneal o líquido intersticial; 30 células de cualquier momento de la gestación o del desarrollo del sujeto o plasma. La muestra de tejido también puede ser células o líneas celulares primarias o en cultivo Opcionalmente, la muestra de tejido o celular se obtiene de un tejido/órgano canceroso. La muestra de tejido puede contener compuestos que no se encuentran naturalmente entremezclados con el tejido en la naturaleza, tal como conservantes, anticoagulantes, tampones, fijadores, nutrientes, antibióticos o similares. Para los fines de la presente memoria, una "sección" de una muestra de 35 tejido se refiere a una parte o trozo individual de una muestra de tejido, por ejemplo una sección delgada de tejido o células cortadas de una muestra de tejido.

El término "correlacionar" o "correlacionado" se refiere a la comparación, de cualquier manera, entre el rendimiento y/o los resultados de un primer análisis o protocolo y el rendimiento y/o los resultados de un segundo análisis o 40 protocolo. Por ejemplo, pueden utilizarse los resultados de un primer análisis o protocolo al levar a cabo un segundo protocolo, y/o pueden utilizarse los resultados de un primer análisis o protocolo para determinar si debería llevarse a cabo un segundo análisis o protocolo. Con respecto a la realización de análisis o protocolo de expresión génica, pueden utilizarse los resultados del análisis o protocolo de expresión génica para determinar si debería llevarse a cabo un régimen terapéutico específico. 45

El término "marcaje" utilizado en la presente memoria se refiere a un compuesto o composición que se conjuga o fusiona directa o indirectamente con un reactivo, tal como una sonda de ácidos nucleicos o un anticuerpo, facilitando de esta manera la detección del reactivo con el que se encuentra conjugado o fusionado. El marcaje mismo puede ser detectable (por ejemplo marcajes con isótopos radioactivos o marcajes fluorescentes) o, en el caso de un 50 marcaje enzimático, puede catalizar la alteración química de un compuesto sustrato o composición que es detectable.

Un polipéptido de "secuencia nativa" comprende un polipéptido que presenta la misma secuencia de aminoácidos que un polipéptido derivado de la naturaleza. De esta manera, un polipéptido de secuencia nativa puede presentar la 55 secuencia de aminoácidos de un polipéptido de origen natural de cualquier mamífero. Dicho polipéptido de secuencia nativa puede aislarse a partir de la naturaleza o puede producirse por medios recombinantes o sintéticos. La expresión "secuencia nativa" referida a un polipéptido comprende específicamente las formas truncadas o secretadas de origen natural del polipéptido (por ejemplo una secuencia de dominio extracelular), formas variantes de origen natural (por ejemplo formas de procesamiento alternativo) y variantes alélicas de origen natural del 60 polipéptido.

Un polipéptido "variante" se refiere a un polipéptido biológicamente activo que presenta una identidad de secuencia de aminoácidos de por lo menos aproximadamente 80% respecto al polipéptido de secuencia nativa. Entre dichas variantes se incluyen, por ejemplo, polipéptidos en los que se añaden, o se delecionan, uno o más residuos 65 aminoácidos en el extremo N-terminal o C-terminal del polipéptido. Habitualmente una variante presentará una

identidad de secuencia de aminoácidos de por lo menos aproximadamente 80%, más preferentemente de por lo menos aproximadamente 90%, y todavía más preferentemente de por lo menos aproximadamente 95%, respecto al polipéptido de secuencia nativa.

El término "FCVE" o "FCVE-A" se utiliza para referirse al factor de crecimiento vascular endotelial humano de 165 5 aminoácidos y factores de crecimiento vascular endotelial humanos relacionados de 121, 189 y 206 aminoácidos, tal como describen Leung et al., Science 246:1306, 1989, y Houck et al., Mol. Endocrin. 5:1806, 1991, conjuntamente con las formas alélicas naturales y procesadas de los mismos. FCVE-A es parte de una familia génica que incluye FCVE-B, FCVE-C, FCVE-D, FCVE-E, FCVE-F y FCPL. FCVEA se une principalmente a dos receptor tirosina quinasas de alta afinidad, FCVER-1 (Flt-1) y FCVER-2 (Flk-1/KDR), siendo éste último el transmisor principal de las 10 señales mitogénicas de las células vasculares endoteliales de FCVE-A. Además, la neuropilina-1 ha sido identificada como un receptor de las isoformas de FCVE-A de unión a heparina y podría desempeñar una función en el desarrollo vascular. El término "FCVE" o "FCVE-A" se refiere además a los FCVE de especies no humanas tales como el ratón, la rata o los primates. En ocasiones el FCVE de una especie específica se indica mediante términos tales como FCVE_h para el FCVE humano o FCVE_m para el FCVE murino. El término "FCVE" también se utiliza 15 para referirse a formas truncadas o fragmentos del polipéptido que comprenden los aminoácidos 8 a 109 o 1 a 109 del factor de crecimiento vascular endotelial humano de 165 aminoácidos. Puede identificarse en la presente solicitud la referencia a cualquiera de dichas formas de FCVE, por ejemplo como "FCVE (8-109)", "FCVE (1-109)" o "FCVE165". Las posiciones aminoácidas de un FCVE nativo "truncado" se numeran tal como se indica en la secuencia de FCVE nativa. Por ejemplo, la posición aminoácida 17 (metionina) en el FCVE nativo truncado también 20 es la posición 17 (metionina) en el FCVE nativo. El FCVE nativo truncado presenta afinidad de unión para los receptores KDR y Flt-1 comparable a la del FCVE nativo.

El término "FCVE" o "FCVE-A" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere al factor de crecimiento vascular endotelial humano de 165 aminoácidos y factores de crecimiento vascular endotelial humanos relacionados de 121, 25 189 y 206 aminoácidos, tal como describen Leung et al., Science 246:1306, 1989, y Houck et al., Mol. Endocrin. 5:1806, 1991, conjuntamente con las formas alélicas naturales y procesadas de los mismos. El término "FCVE" también se refiere a los FCVE de especies no humanas tales como el ratón, la rata o los primates. En ocasiones el FCVE de una especie específica se indica mediante términos tales como FCVE_h para el FCVE humano, FCVE_m para el FCVE murino, etc. El término "FCVE" se utiliza también para referirse a formas truncadas del polipéptido que 30 comprenden los aminoácidos 8 a 109 o 1 a 109 del factor de crecimiento vascular endotelial humano de 165 aminoácidos. Puede identificarse en la presente solicitud la referencia a cualquiera de dichas formas de FCVE, por ejemplo como "FCVE (8-109)", "FCVE (1-109)" o "FCVE165". Las posiciones aminoácidas de un FCVE nativo "truncado" se numeran tal como se indica en la secuencia de FCVE nativa. Por ejemplo, la posición aminoácida 17 (metionina) en el FCVE nativo truncado también es la posición 17 (metionina) en el FCVE nativo. El FCVE nativo 35 truncado presenta afinidad de unión para los receptores KDR y Flt-1 comparable a la del FCVE nativo.

La expresión "actividad biológica de FCVE" incluye la unión a cualquier receptor de FCVE o cualquier actividad de señalización de FCVE, tal como la regulación de la angiogénesis tanto normal como anormal y la vasculogénesis (Ferrara y Davis-Smyth, Endocrine Rev. 18:4-25, 1997; Ferrara, J. Mol. Med. 77:527-543, 1999), inductora de 40 vasculogénesis y angiogénesis embrionarias (Carmeliet et al., Nature 380:435-439, 1996; Ferrara et al., Nature 380:439-442, 1996) y la modulación de la proliferación cíclica de los vasos sanguíneos en el tracto reproductor femenino y para el crecimiento óseo y la formación del cartílago (Ferrara et al., Nature Med. 4:336-340, 1998; Gerber et al., Nature 5:623-628, 1999). Además de ser un factor angiogénico en la angiogénesis y la vasculogénesis, el FCVE como factor de crecimiento pleiotrópico muestra múltiples efectos biológicos en otros procesos fisiológicos, 45 tales como la supervivencia de las células endoteliales, la permeabilidad y vasodilatación de los vasos, la quimiotaxis de los monocitos y el flujo de entrada del calcio (Ferrara y Davis-Smyth, supra, 1997, y Cebe-Suárez et al., Cell. Mol. Life Sci. 63:601-615, 2006). Además, algunos estudios recientes han informado de efectos mitogénicos del FCVE en unos cuantos tipos celulares no endoteliales, tales como las células epiteliales pigmentarias retinianas, células de conductos pancreáticos y células de Schwann. Guerrin et al., J. Cell Physiol. 164:385-394, 1995; Oberg-50 Welsh et al., Mol. Cell. Endocrinol. 126:125-132, 1997; Sondell et al., J. Neurosci. 19:5731-5740, 1999.

Un "antagonista de FCVE" o "antagonista específico de FCVE" se refiere a una molécula capaz de unión al FCVE, de reducción de los niveles de expresión de FCVE, o neutralizador, bloqueante, inhibidor, anulador, reductor o interfiriente de las actividades biológicas del FCVE, incluyendo, aunque sin limitarse a ellos, la unión del FCVE a uno 55 o más receptores de FCVE y la angiogénesis y supervivencia o proliferación de las células endoteliales mediados por el FCVE. Se incluyen como antagonistas específicos del FCVE que resultan útiles en los métodos de la invención los polipéptidos que se unen específicamente a FCVE, los anticuerpos anti-FCVE y los fragmentos de unión a antígeno de los mismos, las moléculas y derivados de receptores que se unen específicamente a FCVE, secuestrando de esta manera su unión a uno o más receptores, proteínas de fusión (por ejemplo FCVE-Trap 60 (Regeneron)) y FCVE121-gelonina (Peregrine). Los antagonistas específicos de FCVE también incluyen los variantes antagonistas de polipéptidos FCVE, oligómeros de nucleobases antisentido complementarios a por lo menos un fragmento de una molécula de ácidos nucleicos codificante de un polipéptido FCVE, los ARN pequeños complementarios de por lo menos un fragmento de una molécula de ácidos nucleicos codificante de un polipéptido FCVE, ribozimas con diana en FCVE, pepticuerpos contra FCVE y aptámeros FCVE. Entre los antagonistas 65 específicos de FCVE se incluyen además moléculas pequeñas no peptídicas que se unen a FCVE y que son

capaces de bloquear, inhibir, anular, reducir o interferir con las actividades biológicas del FCVE. De esta manera, la expresión "actividades del FCVE" incluye específicamente las actividades biológicas de FCVE mediadas por el FCVE. En determinadas realizaciones, el antagonista del FCVE reduce o inhibe en por lo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o más el nivel de expresión o actividad biológica del FCVE. En algunas realizaciones, el FCVE inhibido por el antagonista específico de FCVE es FCVE (8-109), FCVE (1-109 o FCVE165. 5

Un "anticuerpo anti-FCVE" es un anticuerpo que se une a FCVE con suficiente afinidad y especificidad. En determinadas realizaciones, el anticuerpo seleccionado normalmente presentará una afinidad de unión suficiente para FCVE, por ejemplo el anticuerpo puede unirse a FCVE_h con un valor de Kd de entre 100 nM y 1 pM. Las afinidades del anticuerpo pueden determinarse mediante un ensayo basado en la resonancia del plasmón superficial 10 (tal como el ensayo BIAcore descrito en la publicación de patente PCT nº WO2005/012359), un ensayo de inmunosorción ligada a enzima (ELISA) y ensayos de competición (por ejemplo los RIA), por ejemplo.

En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti-FCVE puede utilizarse como agente terapéutico en el reconocimiento e interferencia de enfermedades o condiciones en las que está implicada la actividad del FCVE. 15 Además, el anticuerpo puede someterse a otros ensayos de actividad biológico, por ejemplo para evaluar su eficacia como terapéutico. Dichos ensayos son conocidos de la técnica y dependen del antígeno diana y el uso pretendido para el anticuerpo. Entre los ejemplos se incluyen el ensayo de inhibición de HUVEC, los ensayos de inhibición del crecimiento de células tumorales (tal como se indica en el documento nº WO 89/06692, por ejemplo), los ensayos de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y de citotoxicidad mediada por el complemento (CDC) 20 (patente US nº 5.500.362) y los ensayos de actividad agonista o de hematopoyesis (ver el documento nº WO 95/27062). Un anticuerpo anti-FCVE habitualmente no se unirá a otros homólogos de FCVE tales como FCVE-B o FCVE-C, ni a otros factores de crecimiento tales como FCPL, FCDP o FCFb. En una realización, el anticuerpo anti-FCVE es un anticuerpo monoclonal que se une al mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal anti-FCVE A4.6.1 producido por el hibridoma de la ATCC nº HB 10709. En otra realización, el anticuerpo anti-FCVE es un anticuerpo 25 monoclonal anti-FCVE humanizado recombinante generado según Presta et al., Cancer Res. 57:4593-4599, 1997, incluyendo, aunque sin limitarse a ellos, el anticuerpo conocido como bevacizumab (BV; AVASTIN®).

El anticuerpo anti-FCVE "bevacizumab (BV)", también conocido como "FCVE rhuMAb" o "AVASTIN®", es un anticuerpo monoclonal anti-FCVE humanizado recombinante generado según Presta et al., Cancer Res. 57:4593-30 4599, 1997. Comprende regiones de marco de la IgG1 humana mutada y regiones determinantes de complementariedad de unión a antígeno del anticuerpo monoclonal murino anti-FCVE_h A4.6.1 que bloquean la unión del FCVE humano a sus receptores. Aproximadamente el 93% de la secuencia de aminoácidos del bevacizumab, incluyendo la mayor parte de las regiones de marco, se deriva de la IgG1 humana, y aproximadamente el 7% de la secuencia se deriva del anticuerpo murino A4.6.1. El bevacizumab presenta una masa 35 molecular de aproximadamente 149.000 daltons y se encuentra glucosilado. El bevacizumab y otros anticuerpos anti-FCVE humanizados se describen adicionalmente en la patente US nº 6.884.879, publicada el 26 de feb. de 2005. Entre los anticuerpos preferentes adicionales se incluyen los anticuerpos de la serie G6 o B20 (por ejemplo G6-31, B20-4.1), tal como se indica en la publicación de patente PCT nº WO2005/012359. Para anticuerpos preferentes adicionales ver las patentes US nº 7.060.269, nº 6.582.959, nº 6.703.020, nº 6.054.297, los documentos 40 nº WO98/45332, nº WO96/30046, nº WO94/10202, la patente nº EP 0666868B1, y las publicaciones de patente US nº 2006009360, nº 20050186208, nº 20030206899, nº 20030190317, nº 20030203409 y nº 20050112126, y Popkov et al., Journal of Immunological Methods 288:149-164, 2004. Entre otros anticuerpos preferentes se incluyen aquellos que se unen a un epítopo funcional en el FCVE humano que comprenden los residuos F17, M18, D19, Y21, Y25, Q89, I91, K101, E103 y C104 o, alternativamente, que comprenden los residuos F17, Y21, Q22, Y25, D63, I83 45 y Q89.

El término "anticuerpo" se utiliza en el sentido más amplio y cubre específicamente los anticuerpos monoclonales (incluyendo los anticuerpos monoclonales de longitud completa), los anticuerpos policlonales, los anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo los anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de anticuerpos con la condición de que 50 muestren la actividad biológica deseada.

Un anticuerpo "bloqueante" o un anticuerpo "antagonista" es uno que inhibe o reduce la actividad biológica del antígeno al que se une. Por ejemplo, un anticuerpo antagonista específico de FCVE se une a FCVE e inhibe la capacidad del FCVE de inducir la proliferación de las células vasculares endoteliales. Los anticuerpos bloqueadores 55 o anticuerpos antagonistas preferentes inhiben por completo la actividad biológica del antígeno.

A menos que se indique lo contrario, la expresión "anticuerpo multivalente" se utiliza en toda la presente memoria para referirse a un anticuerpo que comprende tres o más sitios de unión a antígeno. El anticuerpo multivalente preferentemente se manipula para que presente tres o más sitios de unión a antígeno y generalmente no es un 60 anticuerpo IgM o IgA de secuencia nativa.

Un fragmento "Fv" es un fragmento de anticuerpo que contiene un sitio de reconocimiento y unión de antígeno completo. Esta región consiste de un dímero de un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera estrechamente asociados, puede ser covalentemente en la naturaleza, por ejemplo en scFv. Es en 65 esta configuración que las tres CDR de cada dominio variable interactúan definiendo un sitio de unión a antígeno en

la superficie del dímero VH-VL. Colectivamente las seis CDR o un subgrupo de las mismas confieren especificidad de unión al anticuerpo. Sin embargo, incluso un único dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende únicamente tres CDR específicas para un antígeno) presenta la capacidad de reconocer y unirse a antígeno, aunque habitualmente a una afinidad más baja que el sitio de unión completo.

5

La expresión "anticuerpo monoclonal" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, es decir, los anticuerpos individuales que comprende la población son idénticos excepto por posibles mutaciones naturales que pueden encontrarse presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, estando dirigidos contra un único sitio antigénico. Además, en contraste con las preparaciones de anticuerpos (policlonales) convencionales, que 10 típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal presenta como diana un único determinante del antígeno. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como obtenido de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos y no debe interpretarse como que requiere la producción del anticuerpo mediante cualquier método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que deben utilizarse según la presente invención pueden prepararse mediante el método del 15 hibridoma descrito por primera vez por Kohler et al., Nature 256:495, 1975, o pueden prepararse mediante métodos de ADN recombinante (ver, por ejemplo, la patente US nº 4.816.567). Los "anticuerpos monoclonales" también pueden aislarse a partir de bibliotecas fágicas de anticuerpos utilizando las técnicas descritas en Clackson et al., Nature 352:624-628, 1991, y en Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597, 1991, por ejemplo.

20

Los anticuerpos monoclonales en la presente memoria incluyen específicamente anticuerpos (inmunoglobulinas) "quiméricos" en los que una parte de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga de secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o perteneciente a una clase o subclase particular de anticuerpos, mientras que el resto de la cadena o cadenas es idéntico u homólogo a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpos, 25 así como fragmentos de dichos fragmentos, con la condición de que muestren la actividad biológica deseada (patente US nº 4.816.567, y Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855, 1984).

Las formas "humanizadas" de anticuerpo no humanos (por ejemplo murinos) son anticuerpos quiméricos que contienen una secuencia mínima derivada de una inmunoglobulina no humana. En su mayor parte, los anticuerpos 30 humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpos receptores) en las que los residuos de una región hipervariable del receptor son sustituidos por residuos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante), tal como el ratón, la rata, el conejo o primates no humanos, que presentan la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de región marco (FR) de Fv de la inmunoglobulina humana se sustituyen por los residuos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados 35 pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se realizan para refinar adicionalmente el rendimiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprende sustancialmente la totalidad de por lo menos uno, y típicamente dos, dominios variables en los que la totalidad, o sustancialmente la totalidad, de los bucles hipervariables que corresponden a los de una inmunoglobulina no humana, y la totalidad, o sustancialmente la totalidad, de las FR corresponden a las de una 40 secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado opcionalmente puede comprender por lo menos una parte de una región constante (Fc) de inmunoglobulina, típicamente la de una inmunoglobulina humana. Para más detalles ver Jones et al., Nature 321:522-525, 1986; Riechmann et al., Nature 332:323-329, 1988, y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596, 1992.

45

Un "anticuerpo humano" es un anticuerpo que presenta una secuencia de aminoácidos que corresponde a la de un anticuerpo producido por un ser humano y/o que ha sido preparado utilizando cualquiera de las técnicas para preparar anticuerpos humanos tales como las dadas conocer en la presente memoria. Esta definición de anticuerpo humano excluye específicamente un anticuerpo humanizado que comprende residuos de unión a antígeno no humanos. Pueden producirse anticuerpos humanos utilizando diversas técnicas conocidas. En una realización, el 50 anticuerpo humano se selecciona de una biblioteca fágica, en la que ésta expresa anticuerpos humanos (Vaughan et al., Nature Biotechnology 14:309-314, 1996; Sheets et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 95:6157-6162, 1998; Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227:381, 1991; Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581, 1991). También pueden generarse anticuerpos humanos mediante la introducción de loci de inmunoglobulina humana en animales transgénicos, por ejemplo ratones en los que los genes de inmunoglobulina endógenos han sido parcial o completamente inactivados. 55 Con el reto, se observa la producción de anticuerpos humanos, que es estrechamente similar a la observada en el ser humano en todos los aspectos, incluyendo la reorganización génica, el ensamblaje y el repertorio de anticuerpos. Este enfoque se describe en, por ejemplo, las patentes US nº 5.545.807, nº 5.545.806, nº 5.569.825, nº 5.625.126, nº 5.633.425 y nº 5.661.016, y en las publicaciones científicas siguientes: Marks et al., Biotechnology 10: 779-783, 1992; Lonberg et al., Nature 368: 856-859, 1994; Morrison, Nature 368:812-13, 1994; Fishwild et al., Nature 60 Biotechnology 14: 845-51, 1996; Neuberger, Nature Biotechnology 14: 826, 1996; Lonberg y Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93, 1995. Alternativamente, el anticuerpo humano puede prepararse mediante inmortalización de linfocitos B humanos, produciendo un anticuerpo dirigido contra un antígeno diana (este tipo de linfocitos B puede recuperarse de un individuo o pueden haber sido inmunizados in vitro). Ver, por ejemplo, Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, pág. 77, 1985; Boerner et al., J. Immunol. 147(1):86-95, 1991, y la 65 patente US nº 5.750.373.

Un polipéptido “aislado” o un anticuerpo "aislado" es uno que ha sido identificado y separado y/o recuperar a partir de un componente de su ambiente natural. Los componentes contaminantes de su ambiente natural son materiales que interferirían con los usos diagnósticos o terapéuticos del polipéptido o anticuerpo, y entre ellos pueden incluirse enzimas, hormonas y otros solutos proteicos y no proteicos. En realizaciones preferentes, el polipéptido o anticuerpo 5 se purifica (1) a más de 95% en peso de polipéptido o anticuerpo según se determina mediante el método de Lowry, y más preferentemente más de 99% en peso, (2) hasta un grado suficiente para obtener por lo menos 15 residuos de secuencia de aminoácidos N-terminal o interna mediante la utilización de un secuenciador de taza giratoria, o (3) hasta la homogeneidad mediante SDS-PAGE bajo condiciones reductoras o no reductoras utilizando azul de Coomassie o, preferentemente, tinción de plata. El polipéptido o anticuerpo aislado incluye el polipéptido o 10 anticuerpo in situ dentro de células recombinantes, ya que no se encontrará presente por lo menos un componente del ambiente natural del polipéptido. Sin embargo, habitualmente el polipéptido o anticuerpo aislado se prepara mediante por lo menos una etapa de purificación.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término “tratamiento” se refiere a la intervención clínica en un intento 15 de alterar el curso natural del individuo o célula bajo tratamiento, y puede llevarse a cabo para la profilaxis o durante el curso de la patología clínica. Entre los efectos deseables del tratamiento se incluyen la prevención de la aparición o de la recurrencia de una enfermedad, el alivio de los síntomas, la reducción de cualquier consecuencia patológica directa o indirecta de la enfermedad, la reducción de la tasa de progresión de la enfermedad, la mejora o mitigación del estado de enfermedad, y la remisión o mejora del pronóstico. En algunas realizaciones, los métodos y 20 composiciones de la invención resultan útiles en el intento de retrasar el desarrollo de una enfermedad o trastorno.

Una “cantidad eficaz” se refiere a una cantidad que resulta eficaz, a las dosis y durante los periodos de tiempo necesarios, para conseguir el resultado terapéutico o profiláctico deseado. Una "cantidad terapéuticamente eficaz" de un agente terapéutico puede variar según factores tales como el estado de enfermedad, la edad, el sexo y el 25 peso del individuo, y la capacidad del anticuerpo de inducir una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente eficaz también es una cantidad en la que cualesquiera efectos tóxicos o perjudiciales del agente terapéutico se ven superados por los efectos terapéuticamente beneficiosos. Una “cantidad profilácticamente eficaz” se refiere a una cantidad eficaz, a las dosis y durante los periodos de tiempo necesarios, para conseguir el resultado profiláctico deseado. Típicamente, aunque no necesariamente, debido a que se utiliza una dosis profiláctica en 30 sujetos antes o durante un estadio más temprano de la enfermedad, la cantidad profilácticamente eficaz será inferior a la cantidad terapéuticamente eficaz. En el caso de los tumores precancerosos, benignos de estadio temprano o tardío, la cantidad terapéuticamente eficaz del inhibidor angiogénico puede reducir el número de células de cáncer, reducir el tamaño del tumor primario, inhibir (es decir, enlentecer en cierto grado y preferentemente detener) la infiltración de las células de cáncer en órganos periféricos, inhibir (es decir, enlentecer en cierto grado y 35 preferentemente detener) la metástasis de un tumor; inhibir, en cierto grado, el crecimiento del tumor, y/o aliviar en cierto grado uno o más de los síntomas asociados al trastorno. En la medida en la que el fármaco puede evitar el crecimiento de las células de cáncer existentes y/o eliminarlas, puede ser citostático y/o citotóxico. Para la terapia del cáncer, la eficacia in vivo puede medirse, por ejemplo, mediante la evaluación del tiempo de supervivencia, el tiempo hasta la progresión de la enfermedad (TPE), las tasas de respuesta (TR), la duración de la respuesta y/o la 40 calidad de vida.

La expresión "supervivencia corta sin progresión" se refiere a la progresión en el tiempo de la primera evaluación de tumor. Según el tipo de cáncer o tumor la primera vez que se realiza la evaluación tumoral se produce aproximadamente 4, 3, 2 o 1 mes después del inicio del tratamiento. La planificación temporal de la primera 45 evaluación tumoral depende de lo rápido que progrese la enfermedad particular. En una realización, el tiempo de la primera evaluación tumoral de cáncer renal es de 56 días tras el inicio de la terapia anticáncer.

Los términos “cáncer” y “canceroso” se refieren o describen la condición fisiológica en mamíferos que se caracteriza típicamente por el crecimiento celular no regulado. En esta definición se incluyen los cánceres benignos y malignos. 50 Entre los ejemplos de cáncer se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia. Entre los ejemplos más particulares de dichos cánceres se incluyen cáncer de células escamosas, cáncer de pulmón (incluyendo el cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, adenocarcinoma de pulmón y carcinoma escamoso de pulmón), cáncer de peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico o de estómago (incluyendo cáncer gastrointestinal), cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer cervical, 55 cáncer ovárico, cáncer hepático, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de glándulas salivares, cáncer de riñón o renal, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer vulvar, cáncer de tiroides, carcinoma hepático y diversos tipos de cáncer de cabeza y cuello, así como linfoma de células B (incluyendo el linfoma no de Hodgkin (LNH) de grado bajo/folicular, LNH linfocítico pequeño, LNH de grado intermedio/folicular, LNH difuso de grado intermedio, LNH inmunoblástico de 60 grado elevado, LNH linfoblástico de grado elevado, LNH de células no hendidas pequeñas de grado elevado, LNH de afectación masiva, linfoma de células de manto, linfoma relacionado con el SIDA y macroglobulinemia de Waldenström), leucemia linfocítica crónica (LLC), leucemia linfoblástica aguda (LLA), leucemia de células pilosas, leucemia mieloblástica crónica y trastorno linfoproliferativo post-trasplante (TLPT), así como la proliferación vascular anormal asociada a facomatosis, edema (tal como el asociado a los tumores cerebrales) o síndrome de Meigs. 65

El término "sujeto" o "paciente" se refiere a un mamífero, incluyendo, aunque sin limitación, un mamífero humano o no humano, tal como un bovino, equino, canino, ovino o felino. Preferentemente, el sujeto o paciente es un ser humano.

La expresión "terapia anticáncer" se refiere a una terapia útil en el tratamiento del cáncer. Entre los ejemplos de 5 agentes terapéuticos anticáncer se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, por ejemplo, agentes quimioterapéuticos, agentes inhibidores del crecimiento, agentes citotóxicos, agentes utilizados en la terapia de radiación, agentes antiangiogénesis, agentes apoptóticos, agentes antitubulina y otros agentes para tratar el cáncer, tal como anticuerpos anti-HER2, anticuerpos anti-CD20, antagonista de receptor del factor de crecimiento epidérmico (RFCE) (por ejemplo un inhibidor de tirosina quinasa), inhibidor de HER1/RFCE (por ejemplo erlodnib (TarcevaTM), 10 inhibidores del factor de crecimiento derivado de plaquetas (por ejemplo GleevecTM (mesilato de imatinib)), un inhibidor de COX-2 (por ejemplo celecoxib), interferones, citoquinas, antagonistas (por ejemplo anticuerpos neutralizadores) que se unen a una o más de las dianas siguientes: FCVE, ErbB2, ErbB3, ErbB4, FCDPR-beta, BlyS, APRIL, BCMA o uno o más receptores de FCVE, TRAIL/Apo2, y otros agentes químicos bioactivos y orgánicos, etc. Las combinaciones de los mismos también se encuentran incluidos en la invención. 15

Un "factor o agente angiogénico" es un factor de crecimiento o su receptor que participa en la estimulación del desarrollo de los vasos sanguíneos, por ejemplo induce la angiogénesis, el crecimiento de células endoteliales, la estabilidad de los vasos sanguíneos y/o la vasculogénesis, etc. Por ejemplo, entre los factores angiogénicos se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, por ejemplo, FCVE y miembros de la familia del FCVE y sus receptores 20 (FCVE-B, FCVE-C, FCVE-D, FCVER1, FCVER2 y FCVER3), FCPL, la familia de FCDP, la familia del factor de crecimiento fibroblástico (FCF), ligandos de TIE (angiopoyetinas,s ANGPT1, ANGPT2), TIE1, TIE2, efrinas, Bv8, ligando 4 de tipo Delta (DLL4), Del-1, factores de crecimiento fibroblástico: ácidos (FCFa) y básicos (FCFb), FCF4, FCF9, BMP9, BMP10, folistatina, factor estimulador de colonias de granulocitos (FEC-G), GM-CSF, factor de crecimiento de hepatocitos (FCH)/factor de dispersión (FD), interleuquina-8 (IL-8), CXCL12, leptina, midquina, 25 neuropilinas, NRP1, NRP2, factor de crecimiento placentario, factor de crecimiento de células endoteliales derivadas de plaquetas (FCCE-DP), factor de crecimiento derivado de plaquetas, especialmente FCPL-BB, FCPLR-alfa o FCPLR-beta, pleiotrofina (PTN), progranulina, proliferina, factor de crecimiento transformante alfa (FCT-alfa), factor de crecimiento transformante beta (FCT-beta), factor de necrosis tumoral alfa (FNT-alfa), AlkI, CXCR4, Notch1, Notch4, Sema3A, Sema3C, Sema3F, Robo4, etc. Incluiría además factores que estimulan la angiogénesis, tales 30 como ESM1 y perlecán. También incluiría factores que aceleran la cicatrización de heridas, tales como la hormona de crecimiento, el factor I de crecimiento similar a la insulina (FCSI-I), VIGF, factor de crecimiento epidérmico (FCE), dominio de tipo FCE, múltiple 7 (FCEL7), FCTC y miembros de su familia, y TGF-alfa y TGF-beta. Ver, por ejemplo, Klagsbrun y D’Amore, Annu. Rev. Physiol. 53:217-39, 1991; Streit y Detmar, Oncogene 22:3172-3179, 2003; Ferrara y Alitalo, Nature Medicine 5(12):1359-1364, 1999; Tonini et al., Oncogene 22:6549-6556, 2003 (por ejemplo la Tabla 35 1, que lista los factores angiogénicos conocidos) y Sato, Int. J. Clin. Oncol. 8:200-206, 2003.

Un "agente antiangiogénico", "inhibidor angiogénico", "agente antiangiogénesis" o "inhibidor de angiogénesis" se refiere a una sustancia de peso molecular pequeño, un polinucleótido (incluyendo, por ejemplo, un ARN inhibidor (ARNi o ARNip), un polipéptido, una proteína aislada, una proteína recombinante, un anticuerpo, o conjugados o 40 proteíans de fusión de los mismos, que inhibe la angiogénesis, la vasculogénesis o la permeabilidad vascular no deseable, de manera directa o indirecta. Debe entenderse que el agente antiangiogénico incluye aquellos agentes que se unen y bloquean la actividad angiogénica del factor angiogénico o su receptor. Por ejemplo, un agente antiangiogénico es un anticuerpo u otro antagonista de un agente angiogénico tal como se ha definido anteriormente, por ejemplo anticuerpos de FCVE-A o del receptor de FCVE-A (por ejemplo receptor RIDQ o receptor 45 Flt-1), inhibidores anti-FCDP (por ejemplo Gleevec® (mesilato de imatinib)), moléculas pequeñas que bloquean la señalización de receptores de FCVE (por ejemplo PTK787/ZK2284, SU6668, SUTENT®/SU11248 (malato de sunitinib), AMG706 o los indicados en, por ejemplo, la publicación de patente internacional nº WO 2004/113304). Entre los agentes antiangiogénicos se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, los agentes siguientes: inhibidores de FCVE, tales como antagonista específico de FCVE, inhibidor de FCE, inhibidores de RFCE, Erbitux® (cetuximab, 50 ImClone Systems, Inc., Branchburg, N.J.), Vectibix® (panitumumab, Amgen, Thousand Oaks, CA), inhibidores de TIE2, inhibidores de IGF1R, inhibidores de COX-II (ciclooxigenasa II), inhibidores MPM-2 (metaloproteinasa de matriz 2) e inhibidores de MPM-9 (metaloproteinasa de matriz 9), CP-547.632 (Pfizer Inc., NY, USA), axitinib (Pfizer Inc., AG-013736), ZD-6474 (AstraZeneca), AEE788 (Novartis), AZD-2171, trampa de FCVE (Regeneron/Aventis), Vatalanib (también conocido como PTK-787, ZK-222584, Novartis & Schering AG), Macugen (pegaptanib octasodio, 55 NX-1838, EYE-001, Pfizer Inc./Gilead/Eyetech), IM862 (Cytran Inc. of Kirkland, Wash., USA) y angiozima, un ribozima sintético de Ribozyme (Boulder, Colo.) y Chiron (Emeryville, Calif.) y combinaciones de los mismos. Entre otros inhibidores de la angiogénesis se incluyen trombospondina-1, trombospondina-2, colágeno IV y colágeno XVIII. Los inhibidores de FCVE se dan a conocer en las patentes US nº 6.534.524 y nº 6.235.764. Entre los agentes antiangiogénicos también se incluyen inhibidores de angiogénesis nativos, por ejemplo angiostatina, endostatina, 60 etc. Ver, por ejemplo, Klagsbrun y D'Amore, Annu. Rev. Physiol. 53:217-39, 1991; Streit y Detmar, Oncogene 22:3172-3179, 2003 (por ejemplo la Tabla 3, que lista la terapia antiangiogénica para el melanoma maligno); Ferrara y Alitalo, Nature Medicine 5(12):1359-1364, 1999; Tonini et al., Oncogene 22:6549-6556, 2003 (por ejemplo la Tabla 2, que lista los factores antiangiogénicos conocidos) y Sato, Int. J. Clin. Oncol. 8:200-206, 2003 (por ejemplo, la Tabla 1, que lista los agentes antiangiogénicos utilizados en ensayos clínicos). 65

La expresión "terapia antiangiogénica" se refiere a una terapia útil para inhibir la angiogénesis que comprende la administración de un agente antiangiogénico.

La expresión "agente citotóxico" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a una sustancia que inhibe o impide el funcionamiento de las células y/o provoca la destrucción de las células. La expresión pretende incluir 5 isótopos radioactivos (por ejemplo I131, I125, Y90 y Re186), agentes quimioterapéuticos y toxinas, tales como toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de las mismas.

Un "agente quimioterapéutico" es un compuesto químico que resulta útil en el tratamiento del cáncer. Entre los ejemplos de agentes quimioterapéuticos se incluye un compuesto químico que resulta útil en el tratamiento del 10 cáncer. Entre los ejemplos de agentes quimioterapéuticos se incluyen agentes alquilantes tales como tiotepa y ciclofosfamida Cytoxan®, sulfonatos de alquilo tales como busulfán, improsulfán y piposulfán, aziridinas tales como benzodopa, carbocuona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilamelaminas, incluyendo altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilolmelamina; acetogeninas (especialmente bulatacina y bulatacinona); una camptotecina (incluyendo el análogo sintético topotecán); briostatina; calistatina; CC-15 1065 (incluyendo sus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina y bizelesina); criptoficinas (particularmente criptoficina-1 y criptoficina-8); dolastatina; duocarmicina (incluyendo los análogos sintéticos KW-2189 y CB1-TM1); eleuterobina; pancratistatina; una sarcodictiina; espongistatina; mostazas nitrogenadas tales como clorambucilo, clornafacina, colofosfoamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, hidrocloruro de óxido de mecloretamina, melfalán, novembichina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza uracilo, nitrosoureas tales como 20 carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina y ranimnustina; antibióticos tales como los antibióticos enediina (por ejemplo caliqueamicina, especialmente caliqueamicina gamma 11 y caliqueamicina omega 11 (ver, por ejemplo Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl. 33: 183-186, 1994); dinemicina, incluyendo dinemicina A; bisfosfonatos tales como clodronato; una esperamicina, así como cromóforo neocarzinostatina y cromóforos relacionados antibiótico de cromoproteína enedina), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, 25 carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, Adriamycin®, doxorrubicina (incluyendo morfolino-doxorrubicina, cianomorfolino-doxorrubicina, 2-pirrolino-doxorrubicina y desoxidoxorrubicina), epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas tales como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina, 30 antimetabolitos tales como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU); análogos del ácido fólico, tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina, tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; antiadrenales tales como aminoglutetimida, mitotano, 35 trilostano; reabastecedor de ácido fólico tal como ácido frolínico; aceglatona; glucósido aldofosfamida; ácido aminolevulínico; eniluracilo; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defosfamida; demecolcina; diazicuona; elfornitina; acetato de eliptinio; un epotilón; etoglúcido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinano,; lonidainina; maitansinoides tales como maitansina y ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; losoxantrona; ácido podofilínico; 2-etilhidrazida; procarbazina; complejo de 40 polisacárido PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR); razoxano; rizoxina; sizofirano; espirogermanio; ácido tenuazónico; triazicuona; 2,2',2''-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A y anguidina); uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinósido ("Ara-C"); ciclofosfoamida; tiotepa; taxoides, por ejemplo Taxol® paclitaxel (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), AbraxaneTM sin cremofor, formulación de nanopartículas manipulado con albúmina del 45 paclitaxel (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois) y Taxotere® docetaxel (Rhône-Poulenc Rorer, Antony, Francia); cloranbucilo; Gemzar® gemcitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platino tales como cisplatino y carboplatino; vinblastina; platino; etopósido (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina; Navelbine® vinorelbina; novantrona; tenipósido; edatrexato; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; irinotecán (Camptosar CPT-11) (incluyendo el régimen de tratamiento de irinotecán con 5-FU y 50 leucovorina); inhibidor de topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); retinoides tales como ácido retinoico; capecitabina; combrestatina; leucovorina (LV); oxaliplatino, incluyendo el régimen de tratamiento de oxaliplatino (FOLFOX); inhibidores de PKC-alfa, Raf, H-Ras, RFCE (por ejemplo erlotinib (TarcevaTM)) y FCVE-A que reducen la proliferación celular, y sales, ácido o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriormente indicados. 55

También se encuentran incluidos en dicha definición agentes antihormonales que actúan regulando o inhibiendo la acción hormonal sobre los tumores, tales como antiestrógenos y moduladores selectivos de receptores de estrógenos (MSRE), incluyendo, por ejemplo, tamoxifeno (incluyendo tamoxifeno NOLVADEX®), raloxifeno, droloxifeno, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, queoxifeno, LY117018, onapristona y toremifeno FARESTON®; 60 inhibidores de aromatasa que inhiben el enzima aromatasa, que regula la producción de estrógenos en las glándulas adrenales, tales como, por ejemplo, 4(5)-imidazoles, aminoglutetimida, acetato de megestrol MEGASE®, exemestano AROMASIN®, formestanie, fadrozol, vorozol RIVISOR®, letrozol FEMARA® y anastrozol ARIMIDEX®; (iii) antiandrógenos tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprólido y goserelina, así como troxacitabina (un análogo de citosina nucleósido 1,3-dioxolano); oligonucleótidos antisentido, particularmente los que inhiben la 65 expresión de genes en rutas de señalización que participan en la proliferación celular aberrante, tales como, por

ejemplo, PKC-alfa, Raf y H-Ras; ribozimas tales como un inhibidor de la expresión de FCVE (p.ej. el ribozima ANGIOZYME®) y un inhibidor de la expresión de HER2; vacunas tales como vacunas de terapia génica, por ejemplo vacuna ALLOVECTIN®, vacuna LEUVECTIN® y vacuna VAXID®; rIL-2 PROLEUKIN®; inhibidor de la topoisomerasa-1 LURTOTECAN®, rmRH ABARELIX®; vinorelbina y esperamicinas (ver la patente US nº 4.675.187) y sales farmacéuticamente aceptables, ácidos o derivados de cualquiera de los anteriormente indicados. 5

La expresión "terapia de radiación" se refiere a la utilización de rayos gamma dirigidos o rayos beta para inducir daños suficientes en una célula para limitar su capacidad de funcionar normalmente o para destruir la célula por completo. Se apreciará que existen muchas maneras conocidas de la técnica para determinar la dosis y la duración del tratamiento. Los tratamientos típicos se proporcionan en forma de una administración de una vez y las dosis típicas son de entre 10 y 200 unidades (Grays) cada día. 10

La expresión "reducir o inhibir" se refiere a disminuir o reducir una actividad, función y/o cantidad en comparación con una referencia. La expresión "reducir o inhibir" se refiere a la capacidad o causa de una reducción global preferentemente de 20% o superior, más preferentemente de 50% o superior, y todavía más preferentemente de 75%, 85%, 90%, 95% o superior. Reducir o inhibir puede referirse a los síntomas del trastorno bajo tratamiento, a la 15 presencia o tamaño de las metástasis, al tamaño del tumor primario, o al tamaño o número de vasos sanguíneos en los trastornos angiogénicos.

El término "diagnóstico" se utiliza en la presente memoria para referirse a la identificación de un estado molecular o patológico, enfermedad o condición, tal como la identificación del cáncer, o referirse a la identificación de un 20 paciente de cáncer que podría beneficiarse de un régimen de tratamiento particular. El término "pronóstico" se utiliza en la presente memoria para referirse a la predicción de la probabilidad de beneficio clínico de la terapia anticáncer. El término "predicción" se utiliza en la presente memoria para referirse a la probabilidad de que un paciente responda favorablemente o desfavorablemente a una terapia anticáncer particular. En una realización, la predicción se refiere al grado de dichas respuestas. En una realización, la predicción se refiere a la posibilidad y/o probabilidad 25 de que un paciente sobreviva o mejore tras un tratamiento, por ejemplo un tratamiento con un agente terapéutico particular, y durante un periodo de tiempo determinado sin recurrencia de la enfermedad. Los métodos predictivos de la invención pueden utilizarse clínicamente para realizar decisiones de tratamiento seleccionando las modalidades de tratamiento más apropiadas para cualquier paciente particular. Los métodos predictivos de la presente invención son herramientas valiosas en la predicción de si un paciente es probable que responda 30 favorablemente a un régimen de tratamiento, tal como un régimen terapéutico dado, incluyendo, por ejemplo, la administración de un agente terapéutico o combinación dado, intervención quirúrgica, tratamiento de esteroides, etc., o si es probable la supervivencia a largo plazo del paciente tras un régimen terapéutico.

La "respuesta del paciente" puede evaluarse utilizando cualquier criterio de valoración que indique un beneficio para 35 el paciente, incluyendo, aunque sin limitación, (1) inhibición, en cierto grado, de la progresión de la enfermedad, incluyendo el enlentecimiento y la detención completa, (2) reducción del tamaño de la lesión, (3) inhibición (es decir, reducción, enlentecimiento o detención completa) de la infiltración celular patológica en órganos y/o tejidos periféricos contiguos, (4) inhibición (es decir, reducción, enlentecimiento o detención completa) de la expansión de la enfermedad, (5) alivio, en cierto grado, de uno o más síntomas asociados al trastorno, (6) incremento de la duración 40 de la presentación sin enfermedad tras el tratamiento, y/o (8) mortalidad reducida en un punto temporal dado tras el tratamiento.

La expresión "supervivencia a largo plazo" se utiliza en la presente memoria para referirse a la supervivencia durante por lo menos 1 año, 5 años, 8 años o 10 años tras el tratamiento terapéutico. 45

El término "beneficio" se utiliza en el sentido más amplio y cubre cualquier efecto no deseado e incluye específicamente el beneficio clínico tal como se define en la presente memoria.

El beneficio clínico puede medirse mediante la evaluación de diversos criterios finales, por ejemplo la inhibición, en 50 cierto grado, de la progresión de la enfermedad, incluyendo el enlentecimiento y la detección completa; la reducción del número de episodios y/o síntomas de la enfermedad; la reducción del tamaño de la lesión; la inhibición (es decir, la reducción, enlentecimiento o detección completa) de la infiltración de células patológicas en órganos y/o tejidos periféricos contiguos; la inhibición (es decir, la reducción, enlentecimiento o detención completa) de la expansión de la enfermedad; la reducción de la respuesta autoinmunológica, que puede, aunque no necesariamente, resultar en la 55 regresión o ablación de la lesión de la enfermedad; el alivio, en cierto grado, de uno o más síntomas asociados al trastorno; el incremento de la duración de la presentación sin enfermedad tras el tratamiento, por ejemplo la supervivencia sin progresión; la supervivencia global incrementada; una tasa de respuesta más alta y/o la mortalidad reducida en un punto temporal dado tras el tratamiento.

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II. Métodos de la invención

La presente invención se basa en parte en la identificación de marcadores biológicos específicos que se correlacionan con un beneficio clínico reducido de la terapia antiangiogénica para el tratamiento del cáncer. De esta manera, los métodos y ensayos dados a conocer proporcionan medios convenientes, eficientes y potencialmente 65 económicos de obtención de datos e información útiles para evaluar terapias apropiadas o eficaces para el

tratamiento de los pacientes de cáncer. Por ejemplo, podría llevarse a cabo una biopsia de un paciente de cáncer con el fin de obtener una muestra de tejido o celular, o podría obtenerse una muestra de plasma del paciente y examinarse la muestra mediante diversos ensayos in vitro para determinar si la presión de FCPL se encuentra incrementada respecto a una muestra de control o de referencia. En el caso de que se detecte un incremento de la expresión, el paciente probablemente se beneficiará de la terapia anticáncer alternativa o adicionalmente a la terapia 5 antiangiogénica. De esta manera, la invención proporciona un método de identificación de un paciente de cáncer que podría beneficiarse de la terapia anticáncer alternativa o adicionalmente a la terapia antiangiogénica, que comprende la etapa de detectar el nivel de expresión del factor de crecimiento placentario (FCPL) en una muestra obtenida del paciente, en la que una expresión incrementada de FCPL en la muestra en comparación con una muestra de referencia indica que el paciente podría beneficiarse de la terapia anticáncer alternativamente o 10 adicionalmente a la terapia antiangiogénica. En algunas realizaciones, la muestra se obtiene del paciente antes de iniciar el tratamiento del cáncer, en el que la muestra presenta un nivel de expresión de FCPL superior a 28 pg/ml. En algunas realizaciones, la muestra se obtiene del paciente actualmente sometido a terapia antiangiogénica, en el que la muestra presenta un nivel de expresión de FCPL superior a 50 pg/ml. En algunas realizaciones las muestras son muestras de plasma. 15

La invención proporciona además un método para predecir la sensibilidad de un paciente de cáncer a la terapia antiangiogénica, que comprende determinar el nivel de expresión del FCPL en una muestra obtenida del paciente, en el que los niveles incrementados de expresión de FCPL en comparación con una muestra de referencia indican que el paciente es menos probable que responda a la terapia antiangiogénica por sí sola. En algunas realizaciones, 20 la muestra se obtiene del paciente antes de iniciar el tratamiento del cáncer, en el que la muestra presenta un nivel de expresión de FCPL superior a 28 pg/ml. En algunas realizaciones, la muestra se obtiene del paciente actualmente sometido a terapia antiangiogénica, en el que la muestra presenta un nivel de expresión de FCPL superior a 50 pg/ml. En algunas realizaciones las muestras son muestras de plasma. También se proporciona un método de tratamiento de un paciente de cáncer, que comprende administrar en el paciente una terapia anticáncer 25 alternativa o adicionalmente a la terapia antiangiogénica, en la que una muestra del paciente muestra niveles de expresión incrementados de FCPL en comparación con una muestra de referencia.

En otro aspecto la invención proporciona un método de optimización de la eficacia terapéutica para el tratamiento del cáncer, que comprende determinar el nivel de expresión del FCPL en una muestra obtenida del paciente, en el que 30 los niveles incrementados de expresión de FCPL en comparación con una muestra de referencia indican que el paciente es menos probable que responda a la terapia antiangiogénica por sí sola. La muestra puede obtenerse del paciente antes de iniciar el tratamiento. La muestra puede obtenerse del paciente antes de iniciar el tratamiento. En una realización, la muestra presenta un nivel de expresión del FCPL inferior o igual a 28 pg/ml. En algunas realizaciones, la muestra puede obtenerse del paciente actualmente bajo tratamiento con terapia antiangiogénica. 35 En una realización, la muestra presenta un nivel de expresión del FCPL inferior o igual a 50 pg/ml. En algunas realizaciones, la terapia antiangiogénica comprende la administración de un antagonista de FCVE, tal como, por ejemplo, un anticuerpo anti-FCVE, por ejemplo bevacizumab.

En otro aspecto, la invención proporciona un método de tratamiento de un paciente de cáncer, que comprende 40 administrar en el paciente una terapia antiangiogénica, en el que una muestra obtenida del paciente muestra niveles de expresión bajos de FCPL en comparación con una muestra de referencia. La muestra puede obtenerse del paciente antes de iniciar el tratamiento. En una realización, la muestra presenta un nivel de expresión del FCPL inferior o igual a 28 pg/ml. En algunas realizaciones, la muestra puede obtenerse del paciente actualmente bajo tratamiento con terapia antiangiogénica. En una realización, la muestra presenta un nivel de expresión del FCPL 45 inferior o igual a 50 pg/ml. En algunas realizaciones, la terapia antiangiogénica comprende la administración de un antagonista de FCVE, tal como, por ejemplo, un anticuerpo anti-FCVE, por ejemplo bevacizumab.

Los métodos de la invención implican pacientes con cáncer. El cáncer puede ser, por ejemplo, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y/o leucemia. Entre los ejemplos más particulares de dichos cánceres se incluyen cáncer de 50 células escamosas, cáncer de pulmón (incluyendo el cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, adenocarcinoma de pulmón y carcinoma escamoso de pulmón), cáncer de peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico o de estómago (incluyendo cáncer gastrointestinal), cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer cervical, cáncer ovárico, cáncer hepático, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de glándulas salivares, cáncer de riñón o renal, 55 cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer vulvar, cáncer de tiroides, carcinoma hepático y diversos tipos de cáncer de cabeza y cuello, así como linfoma de células B (incluyendo el linfoma no de Hodgkin (LNH) de grado bajo/folicular, LNH linfocítico pequeño, LNH de grado intermedio/folicular, LNH difuso de grado intermedio, LNH inmunoblástico de grado elevado, LNH linfoblástico de grado elevado, LNH de células no hendidas pequeñas de grado elevado, LNH de afectación masiva, linfoma de células de manto, linfoma relacionado con el SIDA y 60 macroglobulinemia de Waldenström), leucemia linfocítica crónica (LLC), leucemia linfoblástica aguda (LLA), leucemia de células pilosas, leucemia mieloblástica crónica y trastorno linfoproliferativo post-trasplante (TLPT), así como la proliferación vascular anormal asociada a facomatosis, edema (tal como el asociado a los tumores cerebrales) o síndrome de Meigs. En una realización, el cáncer es carcinoma de células renales.

65

Una muestra que comprende un marcador biológico diana puede obtenerse mediante métodos bien conocidos de la técnica y que resultan apropiados para el tipo y localización particulares del cáncer de interés. La biopsia de tejido se utiliza con frecuencia para obtener un trozo representativo de tejido canceroso. Alternativamente, pueden obtenerse células indirectamente en forma de tejidos/líquidos que es conocido o se cree que contienen las células de cáncer de interés. Por ejemplo, pueden obtenerse muestras de lesiones cancerosas mediante resección, broncoscopia, 5 aspiración con aguja delgada, cepillado bronquial o de esputo, líquido pleural o sangre. Pueden detectarse genes o productos génicos de tejido de cáncer o tumoral o de otras muestras corporales, tales como orina, esputo, suero o plasma. Las mismas técnicas comentadas anteriormente para la detección de genes o productos génicos diana en muestras cancerosas pueden aplicarse a otras muestras corporales. Las células de cáncer pueden desprenderse de lesiones de cáncer y aparecer en dichas muestras corporales. Mediante el cribado de dichas muestras corporales 10 puede alcanzarse un diagnóstico precoz simple para dichos cánceres. Además, puede realizarse un seguimiento del progreso de la terapia de manera más fácil mediante el ensayo de dichas muestras corporales para los genes o productos génicos diana.

Los medios de enriquecimiento de una preparación de tejidos en células de cáncer son conocidos de la técnica. Por 15 ejemplo, el tejido puede aislarse a partir de secciones en parafina o criostáticas. Las células de cáncer también puede separarse de las células normales mediante citometría de flujo o microdisección por captura láser. Dichas técnicas, así como otras, de separación de células cancerosas de las normales son bien conocidas. En el caso de que el tejido de cáncer se encuentre altamente contaminado por células normales, la detección del gen de firma o perfil de expresión proteica puede resultar más difícil, aunque las técnicas para minimizar la contaminación y/o los 20 resultados falsos positivos/negativos son conocidas, algunas de ellas se describen posteriormente en la presente memoria. Por ejemplo, también puede evaluarse una muestra para la presencia de un marcador biológico que es conocido que se encuentra asociado a una célula de cáncer de interés pero no a una célula normal correspondiente, o viceversa.

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En los métodos de la invención, se obtiene una muestra de tejido o células de mamífero y se examina para la expresión de uno o más marcadores biológicos (por ejemplo FCPL). La expresión de diversos marcadores biológicos en una muestra puede analizarse mediante varias metodologías, muchas de las cuales son conocidas de la técnica y del experto en la materia, incluyendo, aunque sin limitarse a ellas, análisis inmunohistoquímico y/o de transferencia western, inmunoprecipitación, ensayos de unión moleculares, ELISA, ELIFA, separación celular activada por 30 fluorescencia (FACS) y similares, ensayos cuantitativos basados en sangre (tales como, por ejemplo, ELISA de suero) (para examinar, por ejemplo, los niveles de expresión proteica), ensayos bioquímicos de actividad enzimática, hibridación in situ, análisis northern y/o análisis por PCR de los ARNm, así como cualquiera de entre una amplia diversidad de ensayos que pueden llevarse a cabo mediante análisis de matrices de genes y/o tejidos. Los protocolos típicos para evaluar el estado de los genes y productos génicos se encuentran en, por ejemplo, Ausubel 35 et al., editores, Current Protocols in Molecular Biology, unidades 2 (transferencia northern), 4 (transferencia southern), 15 (inmunotransferencia) y 18 (análisis de PCR), 1995. También pueden utilizarse inmunoensayos multiplexados, tales como los disponibles de Rules Based Medicine o Meso Scale Discovery (MSD).

En algunas realizaciones de la invención se examina la expresión de proteínas diana en una muestra utilizando 40 protocolos de inmunohistoquímica y de tinción. La tinción inmunohistoquímica de secciones de tejido se ha demostrado que es un método fiable de evaluación o detección de la presencia de proteínas en una muestra. Las técnicas inmunohistoquímicas ("IHQ") utilizan un anticuerpo para sondear y visualizar antígenos celulares in situ, generalmente mediante métodos cromogénicos o fluorescentes.

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Para la preparación de muestras, puede utilizarse una muestra de tejidos o células de un mamífero (típicamente un paciente humano). Entre los ejemplos de muestras se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, biopsia de tejidos, sangre, aspirado pulmonar, esputo, líquido linfático, plasma, etc. La muestra puede obtenerse mediante una diversidad de procedimientos conocidos de la técnica, incluyendo, aunque sin limitarse a ellos, la extirpación quirúrgica, la aspiración o la biopsia. El tejido puede ser fresco o congelado. En una realización, la muestra se fija y 50 se incluye en parafina o similar.

La muestra de tejido puede fijarse (es decir, conservarse) mediante metodología convencional (ver, por ejemplo, "Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology", 3a edición, Lee G. Luna, HT (ASCP) editor, The Blakston Division McGraw-Hill Book Company, New York, 1960; The Armed Forces Institute of 55 Pathology Advanced Laboratory Methods in Histology and Pathology, Ulreka V. Mikel, Editor, Armed Forces Institute of Pathology, American Registry of Pathology, Washington, D.C., 1994). El experto en la materia apreciará que la elección de un fijador está determinada por el propósito para el que la muestra debe teñirse histológicamente o analizarse de otro modo. El experto en la materia también apreciará que la duración de la fijación depende del tamaño de la muestra de tejido y del fijador utilizado. A título de ejemplo, la formalina tamponada neutra, la solución 60 de Bouin o el paraformaldehído pueden utilizarse para fijar una muestra.

Generalmente, la muestra se fija en primer lugar y después se deshidrata mediante una serie creciente de alcoholes, se infiltra y se incluye en parafina u otros medios de seccionado de manera que puedan realizarse secciones de la muestra de tejido. Alternativamente, pueden realizarse secciones del tejido y fijar las secciones obtenidas. A título de 65 ejemplo, la muestra de tejido puede incluirse y procesarse en parafina mediante métodos convencionales (ver, por

ejemplo, "Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology", supra). Entre los ejemplos de parafina que puede utilizarse incluyen, aunque sin limitarse a ellos, Paraplast, Broloid y Tissuemay. Tras incluir la muestra de tejido, pueden realizarse secciones de la muestra con un micrótomo o similar (ver, por ejemplo, "Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology", supra). A título de ejemplo de dicho procedimiento, las secciones pueden estar comprendidas entre aproximadamente tres micrómetros y 5 aproximadamente cinco micrómetros de grosor. Tras realizar las secciones, éstas pueden aplicarse en portaobjetos mediante varios métodos estándares. Entre los ejemplos de adhesivos de portaobjetos se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, silano, gelatina, poli-L-lisina y similares. A título de ejemplo, las secciones incluidas en parafina pueden adherirse a portaobjetos de carga positiva y/o portaobjetos cargados con poli-L-lisina.

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En el caso de que se haya utilizado parafina como material de inclusión, las secciones de tejido generalmente se desparafinan y se rehidratan con agua. Las secciones de tejido pueden desparafinarse mediante varios métodos estándares convencionales. Por ejemplo, pueden utilizarse xilenos y una serie gradualmente decreciente de alcoholes (ver, por ejemplo, "Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology", supra). Alternativamente pueden utilizarse agentes no orgánicos desparafinantes disponibles comercialmente, tales 15 como Hemo-De7 (CMS, Houston, Texas).

Opcionalmente, después de la preparación de las muestras, la sección de tejidos puede analizarse mediante IHQ. La IHQ puede llevarse a cabo en combinación con técnicas adicionales, tales como la tinción morfológica y/o la hibridación in situ de fluorescencia. Se dispone de dos métodos generales de IHQ: los ensayos directos y los 20 indirectos. Según el primer ensayo, se determina directamente la unión del anticuerpo al antígeno diana. Dicho ensayo directo utiliza un reactivo marcado, tal como una etiqueta fluorescente o un anticuerpo primario marcado con enzima, que puede visualizarse sin interacción adicional de anticuerpo. En un ensayo indirecto típico, el anticuerpo primario no conjugado se une al antígeno y después se une un anticuerpo secundario marcado al anticuerpo primario. En el caso de que el anticuerpo secundario se conjugue con un marcaje enzimático, se añade un sustrato 25 cromogénico o fluorogénico para proporcionar la visualización del antígeno. La amplificación de la señal se produce porque varios anticuerpos secundarios pueden reaccionar con diferentes epítopos en el anticuerpo primario.

El anticuerpo primario y/o secundario utilizado para la inmunohistoquímica típicamente se marca con una fracción detectable. Se dispone de numerosos marcajes, los cuales pueden clasificarse generalmente en las categorías 30 siguientes:

(a) Radioisótopos, tales como 35S, 14C, 125I, 3H y 131I. El anticuerpo puede marcarse con el isótopo radioactivo utilizando las técnicas descritas en Current Protocols in Immunology, volúmenes 1 y 2, Coligen et al., Ed. Wiley-Interscience, New York, New York, pubs. (1991) por ejemplo y la radioactividad puede medirse utilizando el recuento de centelleo. 35

(b) Partículas de oro coloidal.

(c) Marcajes fluorescentes, incluyendo, aunque sin limitarse a ellos, quelatos de tierra rara (quelatos de europio), rojo Texas, rodamina, fluoresceína, dansilo, lisamina, umbeliferona, ficocriterina, ficocianina o fluoróforos disponibles comercialmente, tales como Spectrum Orange7 y Spectrum Green7, y/o derivados de uno o más cualesquiera de los anteriormente indicados. Los marcajes fluorescentes pueden conjugarse con el anticuerpo 40 utilizando las técnicas dadas a conocer en Current Protocols in Immunology, supra, por ejemplo. La fluorescencia puede cuantificarse utilizando un fluorímetro.

(d) Se encuentran disponibles diversos marcajes de enzima-sustrato y la patente US nº 4.275.149 proporciona una revisión de algunos de ellos. El enzima generalmente cataliza una alteración química del sustrato cromogénico que puede medirse utilizando diversas técnicas. Por ejemplo, el enzima puede catalizar un cambio 45 de color en un sustrato, que puede medirse espectrofotométricamente. Alternativamente, el enzima puede alterar la fluorescencia o quimioluminiscencia del sustrato. Las técnicas para cuantificar un cambio de la fluorescencia se han descrito anteriormente. El sustrato quimioluminiscente se excita electrónicamente mediante una reacción química y seguidamente puede emitir luz que puede medirse (utilizando un quimioluminómetro, por ejemplo) o dona energía a un aceptor fluorescente. Entre los ejemplos de marcajes enzimáticos se incluyen luciferasas (por 50 ejemplo luciferasa de luciérnaga y luciferasa bacteriana, patente US nº 4.737.456), luciferina, 2,3-dihidroftalazindionas, malato deshidrogenasa, ureasa, peroxidasa, tal como peróxidasa de rábano picante (PRP), fosfatasa alcalina,

β-galactosidasa, glucoamilasa, lisozima, sacárido oxidasas (por ejemplo glucosa oxidasa, galactosa oxidasa y 55 glucosa-6-fosfato deshidrogenasa), oxidasas heterocíclicas (tales como uricasa y xantina oxidasa), lactoperoxidasa, microperoxidasa y similares. Las técnicas para conjugar enzimas con anticuerpos se describen en O'Sullivan et al., Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, en: Methods in Enzym. (ed. J. Langone y H. Van Vunakis), Academic press, New York, 73:147-166, 1981.

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Entre los ejemplos de combinaciones de enzima-sustrato se incluyen, por ejemplo:

(i) peroxidasa de rábano picante (PRP) con hidrógeno peroxidasa como sustrato, en la que la hidrógeno peroxidasa oxida un pigmento precursor (por ejemplo ortofenilén-diamina (OFD) o hidrocloruro de 3,3',5,5'-tetrametil-bencidina (TMB), 65

(ii) fosfatasa alcalina (FA) con fosfato de para-nitrofenilo como sustrato cromogénico, y

(iii) β-D-galactosidasa (β-D-Gal) con un sustrato cromogénico (por ejemplo p-nitrofenil-β-D-galactosidasa) o sustrato fluorogénico (por ejemplo 4-metilumbeliferil-β-D-galactosidasa).

El experto en la materia dispone de numerosas combinaciones de enzima-sustrato. Para una revisión general de ellas, ver las patentes US nº 4.275.149 y nº 4.318.980. En ocasiones, el marcaje se conjuga indirectamente con el 5 anticuerpo. El experto en la materia conocerá diversas técnicas para conseguir lo anterior. Por ejemplo, el anticuerpo puede conjugarse con biotina y cualquiera de las cuatro amplias categorías de marcaje indicadas anteriormente puede conjugarse con avidina, o viceversa. La biotina se une selectivamente a avidina y, de esta manera, el marcaje puede conjugarse con el anticuerpo de esta manera indirecta. Alternativamente, para conseguir la conjugación indirecta del marcaje con el anticuerpo, éste se conjuga con un hapteno pequeño y se conjuga uno de los diferentes 10 tipos de marcaje indicados anteriormente con un anticuerpo anti-hapteno. De esta manera, puede llevarse a cabo la conjugación indirecta del marcaje con el anticuerpo.

Aparte de los procedimientos de preparación de muestras comentados anteriormente, puede desearse el tratamiento adicional de la sección de tejidos antes, durante o después de la IHQ. Por ejemplo, pueden llevarse a cabo métodos 15 de recuperación de epítopos, tales como el calentamiento de la muestra de tejidos en tampón citrato (ver, por ejemplo, Leong et al., Appl. Immunohistochem. 4(3):201, 1996).

Tras una etapa opcional de bloqueo, se expuso la sección de tejidos a anticuerpo primario durante un periodo de tiempo suficiente y bajo condiciones adecuadas para que el anticuerpo primario se uniese al antígeno proteico diana 20 en la muestra de tejidos. Las condiciones apropiadas para llevar a cabo lo anterior pueden determinarse mediante experimentación rutinaria. El grado de unión del anticuerpo a la muestra se determina mediante la utilización de cualquiera de los marcajes detectables comentados anteriormente. Preferentemente, el marcaje es un marcaje enzimático (por ejemplo PRP) que cataliza una alteración química del sustrato cromogénico, tal como cromógeno 3,3'-diaminobencidina. Preferentemente, el marcaje enzimático se conjuga con anticuerpo que se une 25 específicamente al anticuerpo primario (por ejemplo el anticuerpo primario es anticuerpo policlonal de conejo y el anticuerpo secundario es anticuerpo de cabra anti-conejo). Los especímenes preparados de esta manera pueden montarse y aplicarse un cubreobjetos. A continuación, la evaluación del portaobjetos se realiza, por ejemplo, utilizando un microscopio y pueden utilizarse criterios de intensidad de tinción utilizados rutinariamente en la técnica.

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En métodos alternativos, la muestra puede ponerse en contacto con un anticuerpo específico para dicho marcador biológico bajo condiciones suficientes para que se forme un complejo de anticuerpo-marcador biológico, y después detectar dicho complejo. La presencia del marcador biológico puede detectarse de varias maneras, tal como mediante transferencia western y procedimientos de ELISA para someter a ensayo una amplia diversidad de tejidos y muestras, incluyendo plasma o suero. Se dispone de un amplio abanico de técnicas de inmunoensayo utilizando 35 dicho formato de ensayo; ver, por ejemplo, las patentes US nº 4.016.043, nº 4.016.043, nº 4.424.279 y nº 4.018.653. Entre ellos se incluyen los ensayos de sitio único y de dos sitios o de "tipo sándwich" de los tipos no competitivos, así como en ensayos de unión competitiva tradicionales. Entre estos ensayos se incluyen además la unión directa de un anticuerpo marcado a un marcador biológico diana.

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Los ensayos de tipo sándwich son de entre los ensayos más útiles y más utilizados. Existen variaciones de la técnica de ensayo de tipo sándwich y todas pretende encontrarse comprendidas en la presente invención. Brevemente, en un ensayo directo típico, se inmoviliza un anticuerpo no marcado sobre un sustrato sólido, y la muestra que debe someterse a ensayo se pone en contacto con la molécula unida. Tras un periodo de incubación adecuado, durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la formación de un complejo de anticuerpo-antígeno, seguidamente se 45 añade un segundo anticuerpo específico del antígeno, marcado con una molécula informadora capaz de producir una señal detectable, y se incuba, permitiendo un tiempo suficiente para la formación de otro complejo de anticuerpo marcado-antígeno. Se desprende por lavado cualquier material no reaccionado y se determina la presencia del antígeno mediante observación de una señal producida por la molécula informadora. Los resultados pueden ser cualitativos, mediante simple observación de la señal visible, o pueden cuantificarse mediante la comparación con 50 una muestra de control que contiene cantidades conocidas de marcador biológico.

Entre las variaciones del ensayo directo se incluyen un ensayo simultáneo, en el que se añaden tanto muestra como anticuerpo marcado simultáneamente al anticuerpo unido. Estas técnicas son bien conocidas por el experto en la materia, incluyendo cualesquiera variaciones menores, tal como resultará muy evidente. En un ensayo de tipo 55 sándwich directo típico, un primer anticuerpo con especificidad para el marcador biológico se une covalentemente o pasivamente a una superficie sólida. La superficie sólida es típicamente vidrio o un polímero, siendo los polímeros más comúnmente utilizados, celulosa, poliacrilamida, nilón, poliestireno, cloruro de polivinilo o polipropileno. Los soportes sólidos pueden encontrarse en forma de tubos, perlas, discos o microplacas, o cualquier otra superficie adecuada para llevar a cabo un inmunoensayo. Los procedimientos de unión son bien conocidos de la técnica y 60 generalmente consisten de la unión entrecruzada covalentemente o la adsorción física y el lavado del complejo de polímero-anticuerpo en preparación para la muestra de ensayo. A continuación se añade una alícuota de la muestra que debe someterse a ensayo al complejo en la fase sólida y se incuba durante un periodo de tiempo suficiente (por ejemplo 2 a 40 minutos o durante la noche en caso de ser más conveniente) y bajo condiciones adecuadas (por ejemplo entre la temperatura ambiente y 40ºC, tal como entre 25ºC y 32ºC, ambos inclusive) para permitir la unión 65 de cualquier subunidad presente en el anticuerpo. Tras el periodo de incubación, la fase sólida con subunidad de

anticuerpo se lava y se seca y se incuba con un segundo anticuerpo específico para una parte del marcador biológico. El segundo anticuerpo se une a una molécula informadora que se utiliza para indicar la unión del segundo anticuerpo al marcador molecular.

Un método alternativo implica inmovilizar los marcadores biológicos diana en la muestra y después exponer la diana 5 inmovilizada a anticuerpo específico que puede encontrarse o no marcado con una molécula informadora. Dependiendo de la cantidad de diana y la intensidad de la señal de la molécula informadora, una diana unida puede ser detectable mediante marcaje directo con el anticuerpo. Alternativamente se expone un segundo anticuerpo marcado específico para el primer anticuerpo al primer complejo de anticuerpo diana, formando un complejo terciario diana de primer anticuerpo-segundo anticuerpo. El complejo se detecta a partir de la señal emitida por la molécula 10 informadora. La expresión "molécula informadora", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una molécula que, por su naturaleza química, proporciona una señal analíticamente identificable que permite la detección de anticuerpo unido a antígeno. Las moléculas informadoras utilizadas más comúnmente en dicho tipo de ensayo son enzimas, fluoróforos o moléculas que contienen radionucleidos (por ejemplo isótopos radioactivos) y moléculas quimioluminiscentes. 15

En el caso de un inmunoensayo enzimático, se conjuga un enzima con el segundo anticuerpo, generalmente mediante glutaraldehído o peryodato. Sin embargo, tal como se reconocerá fácilmente, existe una amplia diversidad de diferentes técnicas de conjugación fácilmente disponibles al experto en la materia. Entre los enzimas utilizados comúnmente se incluyen peroxidasa de rábano picante, glucosa oxidasa, galactosidasa y fosfatasa alcalina, entre 20 otros. Los sustratos que deben utilizarse con los enzimas específicos se seleccionan generalmente para la producción, tras la hidrólisis por el enzima correspondiente, de un cambio de color detectable. Entre los ejemplos de enzimas adecuados se incluyen fosfatasa alcalina y peroxidasa. También resulta posible utilizar sustratos fluorogénicos, que rinden un producto fluorescente y no los sustratos cromogénicos indicados anteriormente. En todos los casos, el anticuerpo marcado con enzima se añade al primer complejo de anticuerpo-marcador molecular, 25 se deja que se una y después se elimina mediante lavado el exceso de reactivo. A continuación se añade una solución que contiene el sustrato apropiado al complejo de anticuerpo-antígeno-anticuerpo. El sustrato reaccionará con el enzima unido al segundo anticuerpo, proporcionando una señal visual cualitativa, que puede cuantificarse adicionalmente, habitualmente mediante espectrofotometría, proporcionando una indicación de la cantidad de marcador biológico que se encuentra presente en la muestra. Alternativamente, pueden acoplarse químicamente 30 con anticuerpos algunos compuestos fluorescentes, tales como fluoresceína y rodamina, sin alterar su capacidad de unión. Al activarlos mediante iluminación con luz de una longitud de onda particular, el anticuerpo marcado con fluorocromo adsorbe la energía lumínica, induciendo un estado de excitabilidad en la molécula, seguido de la emisión de luz de un color característico detectable visualmente con un microscopio óptico. Tal como en el EIA, el anticuerpo marcado fluorescentemente se deja que se una al primer complejo de anticuerpo-marcador molecular. 35 Tras eliminar mediante lavado el reactivo no unido, seguidamente se expone el complejo terciario remanente a luz de la longitud de onda apropiada; la fluorescencia observada indica la presencia del marcador molecular de interés. Las técnicas de inmunofluorescencia y de EIA se encuentran ambas bien establecidas en la técnica. Sin embargo, también pueden utilizarse otras moléculas informadoras, tales como isótopos radioactivos o moléculas quimioluminiscentes o bioluminiscentes. 40

Se encuentra contemplado que las técnicas anteriormente descritas también se utilicen para detectar la expresión del FCPL.

Entre los métodos de la invención se incluyen además protocolos que examinan la presencia y/o la expresión de los 45 niveles de ARNm de FCPL en una muestra de tejido, celular o plasma. Los métodos para la evaluación de los ARNm en células son bien conocidos y entre ellos se incluyen, por ejemplo, ensayos de hibridación utilizando sondas de ADN complementarias (tal como en la hibridación in situ utilizando ribosondas marcadas específicas para FCPL, transferencia northern y técnicas relacionadas) y diversos ensayos de amplificación de ácidos nucleicos (tales como RT-PCR utilizando cebadores complementarios específicos para FCPL, y otros métodos de detección de tipo 50 amplificación, tales como, por ejemplo, ADN ramificado, SISBA, TMA y similares).

Pueden someterse a ensayo convenientemente muestras de tejidos, células o plasma para los ARNm utilizando análisis northern, transferencia por puntos o PCR. Por ejemplo, los ensayos de RT-PCR tales como los ensayos de PCR cuantitativo son bien conocidos de la técnica. En una realización ilustrativa de la invención, un método para 55 detectar un ARNm diana en una muestra biológica comprende producir ADNc a partir de la muestra mediante transcripción inversa utilizando por lo menos un cebador, amplificar el ADNc producido de esta manera utilizando un polinucleótido diana como cebadores de sentido y antisentido con el fin de amplificar los ADNc diana en el mismo, y detectar la presencia del ADNc diana amplificado. Además, dichos métodos pueden incluir una o más etapas que permiten determinar los niveles de ARNm diana en una muestra biológica (por ejemplo examinando 60 simultáneamente los niveles de una secuencia comparativa de ARNm de control de un gen "de mantenimiento", tal como un miembro de la familia de la actina). Opcionalmente puede determinarse la secuencia del ADNc diana amplificado.

Entre los métodos opcionales de la invención se incluyen protocolos que examinan o detectar los ARNm, tales como 65 los ARNm diana, en una muestra de tejidos, células o plasma mediante tecnologías de micromatrices. Utilizando

micromatrices de ácidos nucleicos, las muestras de ARNm de ensayo y de control de muestras de ensayo y de control se transcriben inversamente y se marcan para generar sondas de ADNc. A continuación, las sondas se hibridan con una matriz de ácidos nucleicos inmovilizados en un soporte sólido. La matriz se configura de manera que se conozca la secuencia y posición de cada miembro de la matriz. Por ejemplo, una selección de genes cuya expresión se correlaciona con un beneficio clínico incrementado o reducido de la terapia antiangiogénica puede 5 aplicarse ordenadamente en un soporte sólido. La hibridación de una sonda marcada con un miembro particular de la matriz indica que la muestra de la que se ha derivado la sonda expresa ese gen. El análisis de la expresión génica diferencia del tejido enfermo puede proporcionar información valiosa. La tecnología de micromatrices utiliza técnicas de hibridación de ácidos nucleicos y tecnología de computación para evaluar el perfil de expresión de ARNm de miles de genes en un único experimento (ver, por ejemplo, el documento nº WO 01/75166, publicado el 11 de 10 octubre de 2001; ver, por ejemplo, las patentes US nº 5.700.637, nº 5.445.934 y nº 5.807.522; Lockart, Nature Biotechnology 14:1675-1680, 1996; Cheung V.G. et al., Nature Genetics 21(supl.):15-19, 1999, para un comentario de la preparación de matrices); las micromatrices de ADN son matrices en miniature que contienen fragmentos génicos que se sintetizan directamente o se aplican en puntos sobre sustratos de vidrio u otros sustratos. Habitualmente se encuentran representados miles de genes en una única matriz. Un experimento típico de 15 micromatrices implica las etapas siguientes: 1) preparación de diana marcada fluorescentemente procedente de ARN aislado de la muestra, 2) hibridación de la diana marcada con la micromatriz, 3) lavado, tinción y escaneado de la matriz, 4) análisis de la imagen escaneada, y 5) generación de perfiles de expresón génica. Actualmente se utilizan dos tipos principales de micromatrices de ADN: matrices de oligonucleótidos (habitualmente 25- a 70-meros) y matrices de expresión génica que contienen productos de PCR preparados a partir de ADNc. Durante la formación 20 de una matriz, los oligonucleótidos pueden prefabricarse y aplicarse en puntos en la superficie, o sintetizarse directamente sobre la superficie (in situ).

El sistema Affymetrix GeneChip® es un sistema de micromatrices disponible comercialmente que comprende matrices preparadas mediante síntesis directa de oligonucleótidos sobre una superficie de vidrio. Matrices de 25 sondas/genes: los oligonucleótidos, habitualmente 25-meros, se sintetizan directamente sobre una oblea de vidrio mediante una combinación de fotolitografía basada en semiconductores y tecnologías de síntesis química en fase sólida. Cada matriz contiene hasta 400.000 oligos diferentes y cada oligo se encuentra presente en millones de copias. Debido a que las sondas oligonucleótidas se sintetizan en localizaciones conocidas de la matriz, los patrones de hibridación e intensidades de señal pueden interpretarse en términos de identidad génica y niveles relativos de 30 expresión mediante el software Affymetrix Microarray Suite. Cada gen se representa en la matriz mediante una serie de diferentes sondas oligonucleótidas. Cada pareja de sondas consiste de un oligonucleótido de correspondencia perfecta y un oligonucleótido no correspondiente. La sonda de correspondencia perfecta presenta una secuencia exactamente complementaria al gen particular y, de esta manera, mide la expresión del gen. La sonda no correspondiente difiere de la sonda de correspondencia perfecta en la sustitución de una única base en la posición 35 de la base central, alterando la unión del transcrito del gen diana. Lo anterior ayuda a determinar la hibridación de fondo y no específica que contribuye a la señal medida para el oligo de correspondencia perfecta. El software Microarray Suite resta las intensidades de hibridación de las sondas no correspondientes de las de las sondas de correspondencia perfecta a fin de determinar el valor absoluto o específico de intensidad de cada juego de sondas. Las sondas se seleccionan basándose en información actual de Genbank y otros depósitos de nucleótidos. Se cree 40 que las secuencias reconocen regiones únicas del extremo 3' del gen. Se utiliza un horno de hibridación GeneChip (horno giratorio) para llevar a cabo la hibridación de hasta 64 matrices simultáneamente. La estación de fluidos lleva a cabo el lavado y tinción de las matrices de sondas. Está completamente automatizada y contiene cuatro módulos, conteniendo cada módulo una matriz de sondas. Cada módulo se controla independientemente mediante el software Microarray Suite utilizando protocolos de fluidos preprogramados. El escáner es un escáner confocal de 45 fluorescencia láser que mide la intensidad de fluorescencia emitida por el ARNc marcado unido a las matrices de sondas. La estación de trabajo computerizada con el software Microarray Suite controla la estación de fluidos y el escáner. El software Microarray Suite puede controlar hasta ocho estaciones de fluidos utilizando los protocolos preprogramados de hibridación, lavado y tinción para la matriz de sondas. El software también capta y convierte los datos de intensidad de hibridación en un resultado de presencia/ausencia para cada gen utilizando algoritmos 50 apropiados. Finalmente, el software detecta los cambios de expresión génica entre experimentos mediante análisis comparativo y formatea el resultado en archivos .txt, los cuales pueden ser utilizados en otros programas de software para el análisis posterior de los datos.

La expresión de un marcador biológico seleccionado en una muestra de tejido o celular también puede examinarse 55 mediante ensayos funcionales o basados en la actividad. Por ejemplo, en el caso de que el marcador biológico sea un enzima, pueden llevare a cabo ensayos conocidos de la técnica para determinar o detectar la presencia de la actividad enzimática dada en la muestra de tejido o celular.

Los kits de la invención presentan varias realizaciones. Una realización típica es un kit que comprende un recipiente, 60 una etiqueta en dicho recipiente, y una composición contenida en dicho recipiente, en la que la composición incluye un anticuerpo primario que se une a FCPL, indicando la etiqueta en el recipiente que la composición puede utilizarse para evaluar la presencia de FCPL en por lo menos un tipo de células de mamífero, e instrucciones para utilizar el anticuerpo en la evaluación de la presencia de FCPL en por lo menos un tipo de célula de mamífero. El kit puede comprender además un juego de instrucciones y materiales para preparar una muestra de tejido, células o plasma y 65 aplicar el anticuerpo y la sonda a la misma sección de una muestra de tejido, células o plasma. El kit puede incluir

tanto un anticuerpo primario como uno secundario, en el que el anticuerpo secundario se conjuga con un marcaje, por ejemplo un marcaje enzimático.

Otra realización es un kit que comprende un recipiente, una etiqueta en dicho recipiente, y una composición contenida en dicho recipiente, en la que la composición incluye uno o más polinucleótidos que se hibridan con FCPL 5 bajo condiciones restrictivas; el marcaje en dicho recipiente indica que la composición puede utilizarse para evaluar la presencia de FCPL en por lo menos un tipo de célula de mamífero o plasma, e instrucciones para utilizar el anticuerpo en la evaluación de la presencia de ARN o ADN de FCPL en por lo menos un tipo de célula de mamífero o plasma.

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Entre otros componentes opcionales en el kit se incluyen uno o más tampones (por ejemplo tampón de bloqueo, tampón de lavado, tampón de sustrato, etc.), otros reactivos tales como sustrato (por ejemplo cromógeno) que se altera químicamente con un marcaje enzimático, solución de recuperación de epítopos, muestras de control (controles positivos y/o negativos), uno o más portaobjetos de control, etc.

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Para los métodos de la invención, los agentes terapéuticos anticáncer, los agentes antiangiogénesis y/o los agentes quimioterapéuticos se administran en un paciente humano, según métodos conocidos, tales como la administración intravenosa en forma de bolo, o mediante infusión continua durante un periodo de tiempo, por las vías intramuscular, intraperitoneal, intracerebroespinal, subcutánea, intraarticular, intrasinovial, intratecal, oral, tópica o mediante inhalación. La administración intravenosa o subcutánea del anticuerpo resulta preferente. 20

El tratamiento de la presente invención puede implicar la administración combinada de un anticuerpo anti-FCVE y uno o más agentes quimioterapéuticos. La presente invención contempla la administración de cócteles de diferentes agentes quimioterapéuticos. La administración combinada incluye la coadministración, utilizando formulaciones separadas o una única formulación farmacéutica, y la administración consecutiva en cualquier orden, en la que 25 preferentemente se deja un periodo de tiempo durante el que ambos (o todos) los agentes activos ejercen simultáneamente sus actividades biológicas. La preparación y programas de administración para dichos agentes quimioterapéuticos pueden seguir las instrucciones del fabricante o ser determinadas empíricamente por el experto en la materia. La preparación y programas de administración de la quimioterapia se describen también en Chemotherapy Service Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 1992. El agente quimioterapéutico puede 30 preceder o seguir a la administración del anticuerpo o puede administrarse simultáneamente con el mismo.

Para la prevención o el tratamiento de una enfermedad, la dosis apropiada de un agente terapéutico anticáncer o agente antiangiogénesis dependerá del tipo de enfermedad que debe tratarse, tal como se ha definido anteriormente, de la gravedad y curso de la enfermedad, de si el anticuerpo se administra con fines preventivos o 35 terapéuticos, de la terapia anterior, de la historia clínica del paciente y de la respuesta al anticuerpo, y del criterio del médico responsable. El agente se administra convenientemente en el paciente de una vez o a lo largo de una serie de tratamientos. En un régimen de terapia de combinación, las composiciones de la presente invención se administran en una cantidad terapéuticamente eficaz o sinérgica. En algunas realizaciones, el agente antiangiogénesis es un antagonista de FCVE, por ejemplo un anticuerpo anti-FCVE tal como bevacizumab. 40 Dependiendo del tipo y severidad de la enfermedad, una dosis candidata inicial puede ser de entre aproximadamente 1 pg/kg y 50 mg/kg (por ejemplo de entre 0,1 y 20 mg/kg) para la administración en el paciente mediante, por ejemplo, una o más administraciones separadas o mediante la infusión continua. Una dosis diaria típica puede encontrarse comprendida entre aproximadamente 1 μg/kg y 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para las administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo 45 de la condición, el tratamiento generalmente se mantendría hasta producirse una supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. Sin embargo, pueden resultar útiles otros regímenes de dosificación. En un aspecto preferente, el anticuerpo de la invención se administra cada dos a tres semanas, a una dosis de entre aproximadamente 5 mg/kg y aproximadamente 15 mg/kg. Más preferentemente, dicho régimen de dosificación se utiliza en combinación con un régimen de quimioterapia como la terapia de primera línea para el tratamiento del 50 cáncer colorrectal metastásico. En algunos aspectos, el régimen de quimioterapia implica la administración intermitente de dosis altas tradicional. En algunos otros aspectos, los agentes quimioterapéuticos se administran en dosis más pequeñas y más frecuente sin interrupciones programadas ("quimioterapia metronómica"). Se realiza fácilmente un seguimiento del avance de dicha terapia utilizando técnicas y ensayos convencionales.

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En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-FCVE utilizado en los métodos de la invención es el bevacizumab. En determinadas realizaciones, por ejemplo al utilizarlo en combinación, el bevacizumab se administra en el intervalo de entre aproximadamente 0,05 mg/kg y aproximadamente 15 mg/kg. En una realización, pueden administrarse en el sujeto una o más dosis de aproximadamente 0,5 mg/kg, 1,0 mg/kg, 2,0 mg/kg, 3,0 mg/kg, 4,0 mg/kg, 5,0 mg/kg, 6,0 mg/kg, 7,0 mg/kg, 7,5 mg/kg, 8,0 mg/kg, 9,0 mg/kg, 10 mg/kg o 15 mg/kg (o cualquier combinación de las mismas). 60 Dichas dosis pueden administrarse intermitentemente, por ejemplo cada día, cada tres días, cada semana o cada dos a tres semanas. En otra realización, por ejemplo utilizada en combinación, el bevacizumab se administra por vía intravenosa en el sujeto a una dosis de 10 mg/kg cada dos semanas o de 15 mg/kg cada tres semanas.

Los ejemplos a continuación se proporcionan únicamente a título ilustrativo y no deben interpretarse como limitativos 65 de las enseñanzas en la presente memoria.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: los niveles de FCPL de línea base más altos en pacientes de cáncer se correlacionan con una supervivencia más corta 5

Sujeto de estudio y tratamiento:

Se recogieron muestras de AVF-0776, un estudio de monoterapia de bevacizumab en pacientes con cáncer de mama metastásico que habían recaído tras por lo menos un régimen convencional de quimioterapia para 10 enfermedad metastásica. Todos los sujetos recibieron 3 mg/kg, 10 mg/kg o 20 mg/kg de bevacizumab cada 2 semanas en un total de seis infusiones. Los sujetos sin evidencia de progresión de la enfermedad en la evaluación tumoral del día 70 continuaron recibiendo bevacizumab cada 2 semanas hasta el día 154 (seis infusiones más) y después se sometieron a evaluación tumoral. Los sujetos sin evidencia de progresión de la enfermedad el día 154 recibieron una infusión final de bevacizumab el día 168. Los sujetos que experimentaron progresión de la 15 enfermedad fueron apartados del estudio. Tras completarse el estudio o la retirada, se realizó un seguimiento del estatus de supervivencia a 1 año tras el día 0 de los sujetos.

Muestras y métodos:

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Se extrajo sangre de vena periférica de los sujetos directamente en un tubo de plástico con EDTA BD Vacutainer® con un tapón convencional lavender. Tras la recolección, las muestras se mezclaron suavemente y se dejaron en reposo durante 30 minutos. Se obtuvo plasma mediante centrifugación a 3.000xg durante 20 minutos a temperatura ambiente. Se seleccionaron muestras de un total de 67 pacientes con cáncer de mama metastásico en recaída tratados con bevacizumab y del que se disponían de muestras de plasma en por lo menos dos puntos temporales 25 entre los días 0 y 56 (día 0, día 14, día 28, día 42 y día 56).

Se midieron los niveles de línea base de FCPL en plasma en los pacientes antes de iniciar el tratamiento el día 0 con el kit de factor de crecimiento humano MSD® MS6000 mediante el aparato K11029C-1 Meso Scale Discovery (Gaithersburg, MD) siguiendo las instrucciones del fabricante. Para correlacionar los niveles de FCPL con el 30 resultado clínico, se utilizó la metodología de Kaplan-Meier y la prueba de rangos logarítmicos (Mantel-Cox) para los análisis de duración de supervivencia desde el inicio del estudio (primera dosis).

Resultados:

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La prueba de rangos logarítmicos identificó que los niveles plasmáticos de FCPL de 28 pg/ml en la línea base eran una variable significativa correlacionada con la supervivencia global del paciente (p<0,0026, ver la figura 1). La mediana de tiempo de supervivencia global fue de 171 días en los pacientes con niveles plasmáticos de línea base de FCPL superiores a 28 pg/ml el día 0, antes del inicio del tratamiento. En contraste, la mediana de tiempo de supervivencia global para los pacientes con niveles de línea base de FCPL inferiores o iguales a 28 pg/ml el día 0, 40 antes del inicio del tratamiento, fue de 417 días. Estos resultados indican que el nivel plasmático de línea base de FCPL en un paciente es un factor predictivo del beneficio de supervivencia de los pacientes de cáncer sometidos a terapia antiangiogénesis.

Ejemplo 2: los niveles plasmáticos de FCPL se incrementan en los pacientes tratados con bevacizumab 45

Los pacientes fueron tratados y se recogieron muestras de plasma tal como se ha indicado anteriormente, en el Ejemplo 1. Se realizó un seguimiento de los niveles plasmáticos de FCPL durante el curso del tratamiento con bevacizumab. Los resultados demuestran que los niveles plasmáticos de FCPL se incrementaron tras el tratamiento con bevacizumab (ver la figura 2). Se observaron incrementos de la mediana de más de 1,5 veces en los pacientes 50 los días 14, 28, 42 y 56 tras el tratamiento con bevacizumab.

Ejemplo 3: los niveles plasmáticos más altos de FCPL en los pacientes tras el tratamiento con bevacizumab se correlacionan con una supervivencia global más corta

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Los pacientes fueron tratados y se midieron los niveles plasmáticos de FCPL tal como se ha indicado anteriormente, en el Ejemplo 1. Para correlacionar los niveles plasmáticos de FCPL con el resultado clínico, se utilizó la metodología de Kaplan-Meier y la prueba de rangos logarítmicos (Mantel-Cox) para los análisis de duración de supervivencia desde el inicio del estudio (primera dosis).

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Los resultados de la prueba de rangos logarítmicos identificaron que los niveles plasmáticos de FCPL de 50 pg/ml el día 14 del tratamiento de bevacizumab eran una variable significativa correlacionada con la supervivencia global del paciente (p<0,0003, ver la figura 3). La mediana de tiempo de supervivencia para los pacientes con niveles plasmáticos de línea base de FCPL superiores a 50 pg/ml tras iniciar el tratamiento de bevacizumab fue de 165 días. En contraste, la mediana de tiempo de supervivencia global para los pacientes con niveles plasmáticos de FCPL 65 inferiores o iguales a 50 pg/ml tras iniciar el tratamiento de bevacizumab fue de 431 días. Estos resultados indican

que el nivel plasmático de FCPL en un paciente que había iniciado el tratamiento de terapia antiangiogénica, por ejemplo de bevacizumab, es un factor predictivo del beneficio de supervivencia de los pacientes de cáncer sometidos a terapia antiangiogénesis.

Claims (15)

1. REIVINDICACIONES

   1. Método de identificación de un paciente que sufre de cáncer que podría beneficiarse de la terapia anticáncer alternativa o adicionalmente a la terapia antiangiogénica, que comprende determinar el nivel de expresión del factor de crecimiento placentario (FCPL) en una muestra obtenida del paciente, en la que una expresión incrementada de 5 FCPL en la muestra en comparación con una muestra de referencia indica que el paciente podría beneficiarse de la terapia anticáncer alternativamente o adicionalmente a la terapia antiangiogénica.
2. 2. Método para predecir la sensibilidad de un paciente de cáncer a la terapia antiangiogénica, que comprende determinar el nivel de expresión del FCPL en una muestra obtenida del paciente, en el que los niveles 10 incrementados de expresión de FCPL obtenida del paciente en comparación con una muestra de referencia indica que es menos probable que el paciente responda a la terapia antiangiogénica por sí sola.
3. 3. Método de seguimiento de la eficacia de una terapia antiangiogénica que comprende determinar el nivel de expresión de FCPL en una muestra obtenida del paciente, en el que el nivel incrementado de expresión de FCPL en 15 la muestra obtenida del paciente en comparación con una muestra de referencia indica que es menos probable que el paciente sea sensible a la terapia antiangiogénica por sí sola.
4. 4. Método de seguimiento de la eficacia terapéutica del tratamiento del cáncer, comprendiendo el método que comprende determinar el nivel de expresión de FCPL en una muestra obtenida del paciente, en el que el nivel 20 incrementado de expresión de FCPL en la muestra obtenida del paciente en comparación con una muestra de referencia indica que es menos probable que el paciente sea sensible a la terapia antiangiogénica por sí sola.
5. 5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el nivel de expresión de FCPL en la muestra obtenida del paciente se encuentra incrementada en por lo menos aproximadamente 5 veces en comparación con 25 una muestra de referencia.
6. 6. Método según cualquiera de la reivindicaciones 1 a 4, en el que la terapia antiangiogénica comprende la administración de un antagonista de FCVE.

   30
7. 7. Método según la reivindicación 6, en el que el antagonista de FCVE es un anticuerpo anti-FCVE.
8. 8. Método según la reivindicación 7, en el que el anticuerpo anti-FCVE es el bevacizumab.
9. 9. Método según la reivindicación 5, en el que el cáncer es cáncer de mama. 35
10. 10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la muestra obtenida del paciente es de plasma.
11. 11. Método según la reivindicación 10, en el que el nivel de expresión de FCPL se determina mediante la detección de la proteína FCPL en el plasma. 40
12. 12. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la muestra obtenida del paciente es una muestra obtenida del paciente antes de la terapia antiangiogénica.
13. 13. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la muestra obtenida del paciente es una 45 muestra obtenida del paciente tras iniciar la terapia antiangiogénica.
14. 14. Método según la reivindicación 12, en el que la muestra obtenida del paciente es una muestra obtenida del paciente dentro de las 24 horas posteriores al inicio de la terapia antiangiogénica.

    50
15. 15. Método según la reivindicación 12, en el que la muestra obtenida del paciente es una muestra obtenida del paciente dentro de las 14 horas posteriores al inicio de la terapia antiangiogénica.