ES2428218T3 - Cápsides de AAV rh48 modificadas, composiciones que las contienen y usos de las mismas - Google Patents

Abstract

Un vector de virus adeno-asociado (AAV) que tiene una cápside AAVrh48 (rh48.2) modificada, comprendiendodicha cápside modificada la secuencia de aminoácido de SEQ ID Núm. 44, la cual ha sido modificada para quecontenga una asparagina en la posición 304 de residuo de aminoácido, que de forma nativa es una serina.

Description

Cápsides de AAV rh48 modificadas, composiciones que las contienen y usos de las mismas.

Antecedentes de la invención

Un virus adeno-asociado (AAV), un miembro de la familia Parvovirus, es un pequeño virus icosaédrico, sin envoltura, con genomas de ADN lineales de cadena simple de 4,7 kilobases (kb) a 6 kb. El AAV está asignado al género, Dependovirus, debido a que el virus fue descubierto como contaminante en poblaciones de adenovirus purificadas. El ciclo vital del AAV incluye una fase latente en la que los genomas de AAV, tras la infección, están integrados específicamente en el sitio en cromosomas anfitrión y una fase infecciosa en la que, a continuación de una infección cualquiera por adenovirus o virus simplex del herpes, los genomas integrados son posteriormente rescatados, replicados y empaquetados en virus infecciosos. Las propiedades de no patogenicidad, amplia gama de infectividad de anfitrión, incluyendo células no divisoras, e integración cromosómica potencial específica del sitio, hacen que el AAV sea una herramienta atractiva para transferencia de gen.

Los vectores de AAV han sido descritos en cuanto a su uso como vehículos de suministro tanto para moléculas terapéuticas como inmunogénicas. Hasta la fecha, han existido varios AAVs diferentes bien caracterizados, aislados a partir de humanos o de primates no humanos (NHP).

Recientemente, los investigadores han descrito una gran numero de AAVs de secuencias diferentes [G. Gao et al., Proc. Natil. Acad. Sci. USA, 100(10): 6081-6086 (13 de Mayo de 2003); US-2003-0138772-A1 (24 de Julio de 2003)] y caracterizados estos AAVs en diferentes serotipos y clados [G. Gao, et al., J. Virol., 78(12): 6381-6388 (Junio 2004); Publicación de Patente Internacional núm. WO 2005/033321]. Se ha informado que diferentes AAVs presentan diferentes eficacias de transfección, y también muestran tropismo para diferentes células o tejidos.

Lo que resulta deseable son construcciones basadas en AAV para el suministro de moléculas heterólogas a diferentes tipos de células.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona, según un aspecto, un vector de virus adeno-asociado (AAV) que tiene una cápside de AAVrh48 modificada (rh48.2), comprendiendo dicha cápside modificada una secuencia de aminoácido de SEQ ID Núm. 44, la cual ha sido modificada para que contenga una asparagina en la posición 304 de residuo de aminoácido, la cual es una serina en forma natural. En algunas realizaciones, la cápside está además modificada para que contenga un ácido glutámico en una posición 217 de residuo de aminoácido de SEQ” ID Núm. 44, la cual es de forma natural una lisina.

En realizaciones particulares de la invención, el vector viral porta un transgén que codifica un producto de gen bajo el control de secuencias reguladoras que dirigen expresión del producto en una célula anfitrión.

La invención se extiende también a composiciones que comprenden vectores de AAV conforme a la invención, en combinación con portadores fisiológicamente compatibles.

Un uso particular de vectores y de composiciones de acuerdo con la invención consiste en suministrar un producto de gen a un sujeto.

Según otro aspecto, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una cápside de AAVrh48 modificada, que posee una secuencia de aminoácido de SEQ ID Núm. 44 que ha sido modificada para que contenga una asparagina en la posición 304 de residuo de aminoácido, la cual es de forma natural una serina. En algunas realizaciones, la cápside está además modificada para que contenga un ácido glutámico en la posición 217 de residuo de aminoácido de SEQ ID Núm. 44, la cual es de forma natural una lisina.

Otros aspectos y ventajas de la invención resultarán fácilmente evidentes a partir de la descripción detalladla que sigue de la invención.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es un gráfico que ilustra transducción 293 in vitro de vectores de AAV corregidos en singletón. Las correcciones de singletón están indicadas a continuación del nombre del vector, cuando están presentes, con un número que indica el número de mutaciones realizadas;

Las Figuras 2A-2C son gráficos lineales que ilustran la titulación de vectores de AAV sobre células 293 en multiplicidades de infección comprendidas en la gama de 101 a 104, con una comparación entre rh.8 dominante y rh.8 corregido en singletón (rh.8R) en la Figura 2A, rh.37 dominante y rh.37 modificado (Figura 2B), y AAV2 y AAV8 en la Figura 2C. Como control, una titulación similar de eGFP de AAV2 y de AAV2/8 que expresa que el vector está

presente. El porcentaje (%) de células positivas de eGFP se ha representado sobre el eje Y, y fue ensayado mediante citometría de flujo.

La Figura 3 es un árbol filogenético de secuencias de AAV, que indica su relación filogenética y clados.

Las Figuras 4A-4K son un alineamiento de secuencias de ácido nucleico de la proteína de cápside (vp1) de AAV2 [SEQ ID Núm. 7], cy. 5 [SEQ ID Núm. 8], rh.10 [SEQ ID Núm. 9], rh.13 [SEQ ID Núm. 10], AAV1 [SEQ ID Núm. 11], AAV3 [SEQ ID Núm. 12], AAV6 [SEQ ID Núm. 13], AAV7 [SEQ ID Núm. 14], AAV8 [SEQ ID Núm. 15], hu. 13 [SEQ ID Núm. 16], hu. 26 [SEQ ID Núm. 17], hu. 37 [SEQ ID Núm. 18], hu. 53 [SEQ ID Núm. 19], rh.39 [SEQ ID Núm. 20], rh.43 [SEQ ID Núm. 21] y rh.46 [SEQ ID Núm. 22];

Las Figuras 5A-5D son un alineamiento de las secuencias de aminoácido de la proteína de cápside (vp1) de AAV2 [SEQ ID Núm. 23], cy.5 [SEQ ID Núm. 24], rh.10 [SEQ ID Núm. 25], rh.13 [SEQ ID Núm. 26], AAV1 [SEQ ID Núm. 27], AAV3 [SEQ ID Núm. 28], AAV6 [SEQ ID Núm. 29], AAV7 [SEQ ID Núm. 30], AAV8 [SEQ ID Núm. 31], hu.13 [SEQ ID Núm. 32], hu.26 [SEQ ID Núm. 33], hu.37 [SEQ ID Núm. 34], hu.53 [SEQ ID Núm. 35], rh.39 [SEQ ID Núm. 36], rh.43 [SEQ ID Núm. 37] y rh.46 [SEQ ID Núm. 38];

Las Figuras 6A-6B son un alineamiento de las secuencias de aminoácido de la proteína de cápside (vp1) de rh.13 [SEQ ID Núm. 26], rh.2 [SEQ ID Núm. 39], rh.8 [SEQ ID Núm. 41], hu.29 [SEQ ID Núm. 42], y rh.64 [SEQ ID Núm. 43].

Descripción detallada de la invención

La presente invención ha sido concebida usando el “método de singletón” de la solicitante, la cual tiene como objetivo mejorar el rendimiento de empaquetamiento, la eficacia de transducción y/o la eficiencia de transferencia de gen de un vector de AAV que tiene una cápside de un AAV que contiene uno o más singletones. Este método se describe con mayor detalle en lo que sigue y es también objeto de la solicitud de Patente Europea núm. 06749685.1 (de la cual deriva la presente solicitud por división).

Según se utiliza a través de la presente memoria y de las reivindicaciones, los términos “comprendiendo” e “incluyendo” incluyen otros componentes, elementos, integrantes, etapas y similares. A la inversa, el término “consistiendo” y sus variantes son excluyentes de otros componentes, elementos, integrantes, etapas y similares.

Método de singletón

Según se utiliza en la presente memoria, el término “singletón” se refiere a un aminoácido variable en una posición dada de una secuencia de cápside de AAV seleccionada (es decir, parental). La presencia de un aminoácido variable se determina mediante alineamiento de la secuencia de la cápside de AAV parental con una librería de secuencias funcionales de cápside de AAV. Las secuencias son analizadas a continuación para determinar la presencia de cualesquiera secuencias variables de aminoácido en la cápside de AAV parental donde las secuencias del AAV en la librería de AAVs funcionales tienen una conservación completa. La secuencia de AAV parental es alterada a continuación para cambiar el singletón al aminoácido conservado identificado en esa posición en las secuencias de cápside de AAV funcionales. Una secuencia de AAV parental puede tener de 1 a 6, de 1 a 5, de 1 a 4, de 1 a 3, ó 2 singletones. Una secuencia de AAV parental puede tener más de 6 singletones.

Una vez modificada, la cápside de AAV modificada puede ser usada para construir un vector de AAV que tenga la cápside modificada. Este vector puede ser construido usando técnicas conocidas por los expertos en la materia.

El AAV seleccionado para su modificación de acuerdo con el método, es uno para el que resulta deseable incrementar una cualquiera o más de las tres propiedades funcionales siguientes de AAV, es decir, empaquetamiento en la partícula viral que tiene la cápside de la secuencia de AAV seleccionada, incremento de la eficacia de transducción, o incremento de eficacia de transferencia de gen en comparación con el AAV parental. Por ejemplo, el AAV parental puede estar caracterizado por tener una eficacia de empaquetamiento mas baja que otro AAV relacionado de forma cercana. En otro ejemplo, el AAV parental puede tener una eficacia de transducción más baja en comparación con AAVs relacionados de forma cercana. En otro ejemplo, el AAV parental puede tener una eficacia de transferencia de gen más baja (es decir, una capacidad más baja para suministrar una molécula objetivo in vivo) en comparación con AAVs relacionados de forma cercana. En otros ejemplos, el AAV parental está caracterizado por una función adecuada en cada una de esas categorías, pero se desea una o más funciones incrementadas de esas áreas.

Así, el método proporciona una librería de AAVs funcionales, cuyas secuencias van a ser comparadas con el AAV seleccionado (parental). De manera adecuada, la librería contiene AAVs que tienen una función deseada que está objetivada para la mejora del AAV parental seleccionado. En otras palabras, cada una de las secuencias de la librería de AAVs funcionales está caracterizada por un nivel deseado de capacidad de empaquetamiento, un nivel deseado de eficacia de transducción in vitro, o un nivel deseado de eficacia de transferencia de gen in vivo (es decir, la capacidad para el suministro a un tejido objetivo seleccionado o una célula en un sujeto). Los AAVs funcionales que componen la librería pueden tener individualmente una, dos o todas esas características funcionales. Otras funciones deseadas para la librería pueden ser determinadas fácilmente por un experto en la materia.

En un ejemplo, un AAV funcional es un AAV caracterizado por la capacidad para producir partículas virales con una eficacia de empaquetamiento y transducción equivalente o mayor que la de uno cualquiera de entre AAV1, AAV2, AAV7, AAV8 o AAV9. La función puede ser evaluada en un entorno seudotipado con ITRs de AAV2 y de AAV2 rep. De ese modo, se puede construir un AAV parental alterado usando técnicas convencionales y el vector de AAV se considera funcional si se produce el virus a partir del AAV parental en títulos de al menos un 50% en comparación con la producción de AAV2. Además, la capacidad del AAV para transducir células puede ser determinada fácilmente por un experto en la materia. Por ejemplo, un AAV parental puede ser construido de tal modo que contenga un gen marcador que permita una fácil detección del virus. Por ejemplo, el AAV contiene eGFP u otro gen que permita detección fluorescente. En donde el AAV contiene CMV-eGFP, cuando el virus producido a partir de la cápside de AAV parental alterado es transducido en células 293 a razón de una multiplicidad de infección de 104, se demuestra función donde la eficacia de transducción es mayor de un 5% de fluorescencia de GFP de la totalidad de las células en un contexto en el que las células fueron tratadas previamente con adenovirus humano de tipo natural, tipo 5 en una multiplicidad de infección de 20 durante 2 horas.

De forma adecuada, una librería está compuesta por al menos tres o al menos cuatro secuencias funcionales de cápside de AAV que representan al menos dos clados diferentes. Con preferencia, al menos dos secuencias de cada uno de los clados representados están incluidas en la librería. En determinados ejemplos, se han representado tres, cuatro, cinco, seis o más clados.

Un “clado” es un grupo de AAVs que están filogenéticamente relacionados entre sí según se determina usando un algoritmo de Neighbor-Joining (“Reunión por Vecindad”) mediante un valor de arranque de al menos el 75% (de al menos 1000 replicas) y una medición de distancia de corrección de Poisson de no más de 0,05, en base a alineamiento de la secuencia de aminoácido vp1 de AAV.

El algoritmo Neighbor-Joining ha sido descrito ampliamente en la literatura. Véase, por ejemplo, M. Nei y S. Kumar, Evolución Molecular y Filogenética (Oxford University Press, Nueva York (2000)). Se encuentran disponibles programas de ordenador que pueden ser usados para implementar este algoritmo. Por ejemplo, el programa MEGA v2.1 implementa el método de Nei-Gojobori modificado. Utilizando estas técnicas y programas de ordenador, y la secuencia de una proteína de cápside vp1 de AAV, un experto en la materia puede determinar fácilmente si un AAV seleccionado está contenido en uno de los clados identificados en la presente memoria, o en otro clado, o si está fuera de estos clados.

Mientras que los clados de AAV están basados principalmente en cápsides de vp1 de AAVs que se producen de forma natural, los clados no se limitan a AAVs que se producen de forma natural. Los clados pueden abarcar AAV que no se produce de forma natural incluyendo, sin limitación, AAVs recombinantes, modificados o alterados, quiméricos, híbridos, sintéticos, artificiales, etc., que están filogenéticamente relacionados según se determina usando un algoritmo de Neighbor-Joining al menos en un 75% (de al menos 1000 réplicas) y una medición de distancia de corrección de Poisson de no más de 0,05, en base a alineamiento de la secuencia de aminoácido de vp1 de AAV.

Los clados de AAV que han sido descritos incluyen el Clado A (representado por AAV1 y AAV6), Clado B (representado por AAV2) y el Clado C (representado por el híbrido de AAV2-AAV3), el Clado D (representado por AAV7), el Clado E (representado por AAV8) y el Clado F (representado por AAV9 humano). Estos clados están representados por un miembro del clado que es un serotipo de AAV descrito con anterioridad. El AAV1 y el AAV6 previamente descritos son miembros de un único clado (el Clado A) en el que se recuperaron 4 cepas procedentes de 3 humanos. Los serotipos de AAV3 y AAV5 descritos con anterioridad son claramente distintos entre sí, pero no fueron detectados en la trama descrita en la presente memoria, y no han sido incluidos en ninguno de estos clados.

Una discusión adicional de clados de AAV ha sido proporcionada por G. Gao et al., en J. Virol., 78(13): 6381-6388 (Junio de 2004) y en la publicación de las Patentes Internacionales núms. WO 2004/028817 y WO 2005/033321. Este último documento proporciona también nuevas secuencias de AAV humano.

En un ejemplo, las librerías usadas en el método de la invención excluyen el AAV5. En otro ejemplo, las librerías usadas en el método excluyen el AAV4. Sin embargo, en algunos ejemplos, por ejemplo cuando el AAV parental es similar al AAV5, puede resultar deseable incluir esta secuencia en el alineamiento.

Aunque se puede construir una librería que contenga el mínimo número de secuencias, se puede optimizar la eficacia en la identificación de singletones utilizando una librería que contenga un número mayor de secuencias. Adecuadamente, la librería contiene un mínimo de cuatro secuencias, con al menos dos clados representados. Con preferencia, la librería contiene al menos dos secuencias procedentes de cada uno de los clados representados. En un ejemplo, la librería contiene más de 100 secuencias de AAV. En otro ejemplo, la librería contiene al menos de tres a 100 secuencias de AAV. En otro ejemplo más, la librería contiene al menos de seis a 50 secuencias de AAV.

Los AAVs adecuados para su uso en las librerías funcionales incluyen, por ejemplo, secuencias de AAV1, AAV2, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9 y otras secuencias que ya han sido descritas [G. Gao, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 100(10): 6081-6086 (13 de Mayo de 2003); publicación de Patentes Internacionales núms. WO 2004/042397 y WO 2005/033321]. Un experto en la materia puede seleccionar fácilmente otros AAVs, por ejemplo los aislados utilizando

los métodos descritos en la publicación de Patente Internacional núm. WO 03/093460 A1 (13 de Noviembre de 2003) y la publicación de solicitud de Patente US núm. 2003-0138772 A1 (24 de Julio de 2003).

Las al menos tres secuencias del interior de la librería son al menos idénticas en un 85% de la longitud total de sus secuencias de cápside alineadas.

El término “porcentaje (%) de identidad” puede ser determinado fácilmente para secuencias de aminoácido, sobre la longitud completa de una proteína, o de un fragmento de la misma. Adecuadamente, un fragmento tiene al menos alrededor de 8 aminoácidos de longitud, y puede ser de hasta alrededor de 700 aminoácidos. En general, cuando se hace referencia a “identidad”, “homología” o “similitud” entre dos virus adeno-asociados diferentes, la “identidad”, “homología” o “similitud” se determina con referencia a secuencias “alineadas”. Secuencias “alineadas” o “alineamientos” se refieren a múltiples secuencias de ácido nucleico o secuencias de proteína (aminoácidos), que con frecuencia contienen correcciones para bases o aminoácidos faltantes o adicionales en comparación con una secuencia de referencia.

Los alineamientos se realizan usando cualquiera de una diversidad de Programas de Alineamiento de Secuencia Múltiple disponibles comercialmente o públicamente. Los programas de alineamiento de secuencia están disponibles para secuencias de aminoácidos, por ejemplo los `programas “Clustal X, “MAP”, “PIMA”, “MSA”, “BLOCKMAKER”, “MEME” y “Match-Box”. En general, se utiliza cualquiera de esos programas en configuraciones por defecto, aunque un experto en la materia puede alterar esas configuraciones según lo necesite. Alternativamente, un experto en la materia puede utilizar otro algoritmo o programa de ordenador que proporcione al menos un nivel de identidad o alineamiento como el proporcionado por los algoritmos y programas de referencia. Véase, por ejemplo, J.D. Thomson et al., Nucl. Acids. Res., “Una comparación exhaustiva de múltiples alineamientos de secuencia”, 27(13): 2682-2690 (1999).

También están disponibles múltiples programas de alineamiento de secuencia para secuencias de ácido nucleico. Ejemplos de tales programas incluyen “Clustal W”, “Conjunto de Secuencia CAP”, “MAP” y “MEME”, que son accesibles a través de Servidores Web por internet. Los expertos en la materia conocen otras fuentes para tales programas. Alternativamente, se usan también utilidades de Vector NTI. Existe también un número de algoritmos conocidos en la técnica que pueden ser usados para medir identidad de secuencia de nucleótido, incluyendo los contenidos en los programas descritos en lo que antecede. Según otro ejemplo, las secuencias de polinucleótido pueden ser comparadas usando Fasta™, un programa en Versión 6.1 Fasta™ de GCG que proporciona alineamientos y porcentaje de identidad de secuencia de las regiones de mejor superposición entre las secuencias de consulta y de búsqueda. Por ejemplo, el porcentaje de identidad de secuencia entre secuencias de ácido nucleico puede ser determinado usando Fasta™ con sus parámetros por defecto (un tamaño de palabra de 6 y el factor NOPAM para la matriz de puntuación) según se proporciona mediante GCG Versión 6.1, incorporada en la presente memoria por referencia.

Las secuencias de la cápside de AAV objetivo o parental que se sospecha que contienen un singletón, se comparan con las secuencias de las cápsides de AAV dentro de la librería. Esta comparación se realiza usando un alineamiento de la proteína vp1 de longitud completa de la cápside de AAV.

Un singletón se identifica donde, para una posición de aminoácido seleccionada cuando las secuencias de AAV están alineadas, todos los AAVs de la librería tienen el mismo residuo de aminoácido (es decir, se conservan totalmente), pero el AAV parental tiene un residuo de aminoácido diferente.

Típicamente, cuando el alineamiento se prepara en base a la proteína vp1 de cápside de AAV, el alineamiento contiene inserciones y supresiones que están identificadas de ese modo con respecto a una secuencia de AAV de referencia (por ejemplo, el AAV2) y la numeración de los residuos de aminoácido se basa en una escala de referencia proporcionada para el alineamiento. Sin embargo, cualquier secuencia de AAV dada puede tener menos residuos de aminoácido que la escala de referencia. En la presente descripción, cuando se discute el AAV parental y las secuencias de la librería de referencia, los términos “la misma posición” o la “posición correspondiente” se refieren al aminoácido localizado en el mismo número de residuo en cada una de las secuencias, con respecto a la escala de referencia para las secuencias alineadas. Sin embargo, cuando se consideran fuera del alineamiento, cada una de las proteínas vp1 de AAV puede tener esos aminoácidos localizados en números de residuos diferentes.

Opcionalmente, el método puede ser llevado a cabo usando un alineamiento de ácido nucleico e identificando como singletón un codón que codifique un aminoácido diferente (es decir, un codón no sinónimo). Cuando las secuencias de ácido nucleico de un codón dado no son idénticas en el AAV parental en comparación con las secuencias de ese codón en la librería, pero codifican el mismo aminoácido, éstas se consideran sinónimas y no son un singletón.

De acuerdo con el método, un AAV parental que contiene un singletón se altera de tal modo que el residuo de singletón es sustituido por el residuo de aminoácido conservado de los AAVs de la librería.

De forma conveniente, esta sustitución puede ser llevada a cabo usando técnicas convencionales de mutagénesis dirigida al sitio sobre el codón para el aminoácido variable. Típicamente, la mutagénesis dirigida al sitio se lleva a cabo usando tan pocas etapas como las que se requieren para obtener el codón deseado para el residuo de

aminoácido conservado. Tales métodos son bien conocidos por los expertos en la materia y pueden ser realizados usando métodos publicados y/o kits disponibles comercialmente [por ejemplo, disponibles en Stratagene and Promega]. La mutagénesis dirigida al sitio puede ser llevada a cabo sobre la secuencia genómica de AAV. La secuencia de AAV puede ser portada por un vector (por ejemplo, un esqueleto de plásmido) por motivos de conveniencia.

Alternativamente, un experto en la materia puede alterar el AAV parental usando otras técnicas conocidas por los expertos en la materia.

Un AAV parental puede tener más de un singletón, por ejemplo dos, tres, cuatro, cinco, seis o más. Sin embargo, se puede observar una mejora en la funcionalidad tras la corrección de un singletón. En el ejemplo en el que un AAV parental porta múltiples singletones, se puede alterar cada vez un singletón, seguido de una evaluación del AAV modificado para la potenciación de la función deseada. Alternativamente, se pueden alterar múltiples singletones con anterioridad a la evaluación del AAV modificado en cuanto a potenciación de la función deseada.

Incluso cuando un AAV parental contiene múltiples singletones y mejora funcional se observa alterado en un primer singletón, puede resultar deseable optimizar la función alterando el (los) singletón(es) restante(s).

Típicamente, un AAV parental que haya tenido uno o más singletón(es) alterado(s) de acuerdo con el método, es evaluado en cuanto a funcionalidad empaquetando el AAV en una partícula de AAV. Estos métodos son bien conocidos por los expertos en la materia. Véase, por ejemplo, G. Gao et al., Proc. Natl. Acad. Sci., citado anteriormente; Sambrook et al., Clonación Molecular: Un Manual de Laboratorio, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor NY.

Estos AAVs alterados tienen nuevas cápsides producidas de acuerdo con el método de singletón, y son evaluados en cuanto a su función. Métodos adecuados para evaluar la función del AAV han sido descritos en la presente memoria e incluyen, por ejemplo, la capacidad de producir partículas protegidas de ADNasa, eficacia de transducción celular in vitro, y/o transferencia de gen in vivo. De manera adecuada, los AAVs alterados tienen un número suficiente de singletones alterados para incrementar la función en una o todas esas características, en comparación con la función del AAV dominante.

II. Nuevo AAV

Es posible predecir si un nuevo AAV será funcional usando el método de singletón e identificando la ausencia de un singletón en la secuencia del AAV seleccionado, es decir, un AAV que carezca de un singletón.

De ese modo, en un ejemplo, el método permite la selección de un AAV para su uso en la producción de un vector. Este método incluye seleccionar una secuencia de cápside de AAV parental para su análisis, e identificar la ausencia de cualquier singletón en la cápside de AAV parental en un alineamiento que comprenda la secuencia de cápside de AAV parental y una librería de secuencias de cápside de AAV funcional. Una vez que se determina la ausencia de un singletón en una cápside de AAV seleccionada, el AAV puede ser usado para generar un vector de acuerdo con técnicas conocidas.

La expresión “homología sustancial” o “similitud sustancial”, cuando se refieren a un ácido nucleico, o a un fragmento del mismo, indica que, cuando están óptimamente alineadas inserciones o supresiones de nucleótido apropiadas con otro ácido nucleico (o su cadena complementaria) existe identidad de secuencia de nucleótido en al menos alrededor de un 95 a un 99% de las secuencias alineadas. Con preferencia, la homología se refiere a la secuencia de longitud completa, o a una pauta de lectura abierta de la misma, o a otro fragmento adecuado que sea al menos de 15 nucleótidos de longitud. Ejemplos de fragmentos adecuados se describen en la presente memoria.

Los términos “identidad de secuencia”, “porcentaje de identidad de secuencia” o “idéntico porcentaje”, en el contexto de secuencias de ácido nucleico, se refieren a los residuos en las dos secuencias que sean iguales cuando se alinean para una correspondencia máxima. La longitud de la comparación de identidad de secuencia puede ser sobre la longitud completa del genoma, la longitud completa de una secuencia de codificación de un gen, o un fragmento de al menos alrededor de 500 a 5000 nucleótidos, si se desea. Sin embargo, la identidad entre fragmentos más pequeños, por ejemplo de al menos alrededor de nueve nucleótidos, normalmente de al menos alrededor de 20 a 24 nucleótidos, al menos alrededor de 28 a 32 nucleótidos, al menos alrededor de 36 o más nucleótidos, puede ser también deseable.

El término “homología sustancial” o “similitud sustancial” cuando se refiere a aminoácidos o a fragmentos de los mismos, indica que cuando se alinean óptimamente inserciones o supresiones de aminoácido apropiadas con otro aminoácido (o su cadena complementaria), existe identidad de secuencia de aminoácido en al menos alrededor del 95 a alrededor del 99% de las secuencias alineadas y en ciertas realizaciones, alrededor del 97% de las secuencias alineadas. Con preferencia, la homología es sobre una secuencia de longitud completa, o una proteína de la misma, por ejemplo una proteína cap, una proteína rep, o un fragmento de la misma que sea al menos de 8 aminoácidos, o más deseablemente, de al menos 15 aminoácidos de longitud. Ejemplos de fragmentos adecuados se describen en la presente memoria.

Mediante el término “altamente conservado” se pretende indicar al menos un 80% de identidad, con preferencia al menos un 90% de identidad, y más preferiblemente, sobre el 97% de identidad. La identidad puede ser determinada fácilmente por un experto en la materia recurriendo a algoritmos y programas de ordenador conocidos por los expertos en la materia.

El término “serotipo” es una distinción con respecto a un AAV que tiene una cápside que es serológicamente distinta de otros serotipos de AAV. La distintividad serológica se determina en base a la falta de reactividad cruzada entre anticuerpos respecto al AAV en comparación con otro AAV. La reactividad cruzada se mide típicamente en un ensayo de anticuerpo neutralizante. Para este ensayo, se genera suero policlonal contra un AAV específico en un conejo u otro modelo animal adecuado usando los virus adeno-asociados. En este ensayo, el suero generado contra un AAV específico es comprobado a continuación en cuanto a su capacidad para neutralizar ya sea el mismo AAV (homólogo) o ya sea un AAV heterólogo. La dilución que consigue una neutralización del 50% se considera el título de anticuerpo neutralizante. Si para dos AAVs el cociente del título heterólogo dividido por el título homólogo es inferior a 16 de una manera recíproca, esos dos vectores se consideran como serotipos iguales. A la inversa, si la relación del título heterólogo sobre el título homólogo es de 16 o más de una manera recíproca los dos AAVs se consideran como serotipos distintos.

En un ejemplo adicional, esto puede ser usado para proporcionar AAVs que tengan nuevas cápsides, incluyendo rh.20, rh.32/33, rh.39, rh.46, rh.73 y rh.74. Las secuencias de rh.20 tienen la secuencia de aminoácido de SEQ ID Núm. 1, o una secuencia del 95 al 99% idéntica sobre la longitud completa de SEQ ID Núm. 1. La cápside de rh.32/33 tiene una secuencia de aminoácido de SEQ ID Núm. 2, o secuencias de un 95% a un 99% idénticas con el mismo sobre la longitud completa de SEQ ID Núm. 2. La cápside de rh.39 tiene una secuencia de aminoácido de SEQ ID Núm. 3, o secuencias de un 95% a un 99% idénticas al mismo sobre la longitud completa de SEQ ID Núm.

3. La cápside de rh.46 tiene una secuencia de aminoácido de SEQ ID Núm. 4, o secuencias del 95% al 99% idénticas con el mismo sobre la longitud completa de SEQ ID Núm. 4. La cápside de rh.73 tiene una secuencia de aminoácido de SEQ ID Núm. 5, o secuencias del 95% al 99% idénticas con el mismo sobre la longitud completa de SEQ Id Núm. 5. La cápside de rh.74 tiene una secuencia de aminoácido de SEQ ID Núm. 6, o secuencias del 95% al 99% idénticas con el mismo sobre la longitud completa de SEQ ID Núm. 6. Con preferencia, la identidad de secuencia de estos nuevos cápsides de AAV es tal que carecen de cualquier singletón. Las secuencias del nuevo AAV se proporcionan en el Listado de Secuencias.

En otro ejemplo más, que abarca los AAVs de la invención, las nuevas secuencias de AAV incluyen las proteínas de cápside de AAV corregidas en singletón y las secuencias que codifican estas proteínas de cápside. Ejemplos de secuencias de AAV corregidas en singletón incluyen AAV6.1, AAV6.2, AAV6.1.2, rh.8R, rh.48.1, rh.48.2, rh.48.1.2, hu.44R1, hu.44R2, hu.44R3, hu.29R, ch.5R1, rh.67, rh.54, hu.48R1, hu.48R2, y hu.48R3. Por ejemplo, el AAV6 corregido en singletón, que incluye el AAV6.1, AAV6.2 y AAV6.1.2, ha mostrado una mejora funcional significativa sobre la secuencia de AAV6 parental.

Las proteínas particularmente deseables incluyen las proteínas de cápside de AAV, las cuales son codificadas por las secuencias de nucleótido identificadas en lo que antecede. La cápside de AAV está compuesta por tres proteínas, a saber vp1, vp2 y vp3, las cuales son variantes de empalme alternativas. Otros fragmentos deseables de la proteína de cápside incluyen las regiones constantes y variables, situadas entre regiones hipervariables (HVR). Otros fragmentos deseables de la proteína de cápside incluyen las propias HVR.

Un algoritmo desarrollado para determinar áreas de divergencia de secuencia en AAV2, ha producido 12 regiones hipervariables (HVR) de las que 5 se superponen o forman parte de las cuatro regiones variables descritas con anterioridad. [Chioni et al., J. Virol., 73: 1309-19 (1999); Rutledge et al., J. Virol., 72: 309-319]. Usando este algoritmo y/o las técnicas de alineamiento descritas en la presente memoria, se determinan las HVR de los nuevos serotipos de AAV. Por ejemplo, las HVR se localizan como sigue: HVR1, aa 146-152; HVR2, aa 182-186; HVR3, aa 262-264; HVR4, aa 381-383; HVR5, aa-450-474; HVR6, aa 490-495; HVR7, aa 500-504; HVR8, aa 514-522; HVR9, aa 534-555; HVR10, aa 581-594; HVR11, aa 658-667; y HVR12, aa 705-719 [el sistema de numeración está basado en un alineamiento que usa la vp1 de AAV2 como punto de referencia]. Usando el alineamiento proporcionado en la presente memoria realizado usando el programa Clustal X con configuraciones por defecto, o usando otros programas de alineamiento disponibles comercial o públicamente con configuraciones por defecto tales como las que se describen en la presente memoria, un experto en la materia puede determinar fácilmente los fragmentos correspondientes de las nuevas cápsides de AAV de la invención.

De manera adecuada, los fragmentos son de al menos 8 aminoácidos de longitud. Sin embargo, se pueden utilizar fácilmente fragmentos de otras longitudes deseadas. Tales fragmentos pueden ser producidos recombinantemente o mediante otros medios adecuados, por ejemplo mediante síntesis química.

El método de singletón puede ser usado también para proporcionar otras secuencias de AAV que son identificadas usando la información de secuencia proporcionada en la presente memoria. Por ejemplo, dadas las secuencias proporcionadas en la presente memoria, la infecciosa puede ser aislada usando tecnología de genoma andante(Siebert et al., 1995, Búsqueda de Ácido Nucleico, 23: 1087-1088, Friezner-Degen et al., 1986, JU. Biol. Chem. 261: 6972-6985, BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA). El genoma andante es particularmente adecuado para identificar y aislar las secuencias adyacentes a las nuevas secuencias identificadas de acuerdo con el método. Esta

técnica se usa también para aislar repeticiones terminales invertidas (ITRs) del nuevo AAV, en base a la nueva cápside de AAV y a las secuencias rep proporcionadas en la presente memoria.

Las nuevas secuencias de aminoácidos, péptidos y proteínas del nuevo AAV pueden ser expresadas a partir de secuencias de ácido nucleico de AAV según la invención. Adicionalmente, estas secuencias, péptidos y proteínas de aminoácido pueden ser generadas por medio de otros métodos conocidos en el estado de la técnica, que incluyen, por ejemplo, la síntesis química, mediante otras técnicas sintéticas o mediante otros métodos. La secuencia de cualquiera de las cápsides de AAV proporcionadas en la presente memoria puede ser generada fácilmente usando una diversidad de técnicas.

Las técnicas de producción adecuadas son bien conocidas por el experto en la materia. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., Clonación Molecular: Un Manual de Laboratorio, Cold Spring Harbor Press (Cold Spring Harbor, NY). Alternativamente, los péptidos pueden también ser sintetizados con métodos bien conocidos de síntesis de péptidos de fase sólida (Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85: 2149 (1962); Stewart and Young, Síntesis de Péptidos de Fase Sólida (Freeman, San Francisco, 1969), pp, 27-62). Estos y otros métodos de producción adecuados están dentro del conocimiento de los expertos en la materia y no constituyen limitación alguna de la presente invención.

Las secuencias y proteínas de la invención pueden ser producidas mediante cualquier medio adecuado, incluyendo producción recombinante, síntesis química u otros medios sintéticos. Tales métodos de producción están dentro del conocimiento de los expertos en la materia y no son una limitación de la presente invención.

III. Producción de rAAV con las Nuevas Cápsides de AAV

La invención abarca nuevas secuencias de cápside de AAV generadas por mutación siguiendo el uso del método de singletón descrito en la presente memoria.

Según otro aspecto, la presente invención proporciona moléculas que utilizan las nuevas secuencias de AAV de la invención, para la producción de vectores virales útiles en el suministro de secuencias de gen heterólogas u otras secuencias de ácido nucleico a una célula objetivo.

Las moléculas de la invención que contienen secuencias de AAV incluyen cualquier elemento genético (vector) que pueda ser suministrado a una célula anfitrión, por ejemplo ADN desnudo, un plásmido, fago, transposón, cósmido epísoma, una proteína en un vehículo de suministro no viral (por ejemplo, una portadora a base de lípido), un virus, etc., que transfiera las secuencias transportadas en las mismas.

El vector seleccionado puede ser suministrado mediante cualquier método adecuado, incluyendo transfección, electroporación, suministro de liposoma, técnicas de fusión de membrana, gránulos recubiertos de ADN de alta velocidad, infección viral y fusión de protoplasto. Los métodos usados para construir cualquier realización de la presente invención son conocidos por los expertos en manipulación de ácido nucleico e incluyen técnicas de ingeniería genética, ingeniería recombinante y técnicas sintéticas. Véase, por ejemplo, Sammbrook et al., Clonación Molecular: Un Manual de Laboratorio, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY.

En una realización, los vectores de la invención contienen, inter alia, secuencias que codifican una cápside de AAV de la invención. En otra realización, los vectores de la invención contienen, como mínimo, secuencias que codifican una proteína rep de AAV o un fragmento de la misma. Opcionalmente, vectores de la invención pueden contener ambas proteínas cap y rep de AAV. En vectores en los que se proporcionan ambas rep y cap de AAV, las secuencias rep de AAV y cap de AAV pueden originarse a partir de un AAV del mismo clado. Alternativamente, la presente invención proporciona vectores en los que las secuencias rep proceden de una fuente de AAV que difiere de la que está proporcionando las secuencias cap. En una realización, las secuencias rep y cap son expresadas a partir de fuentes separadas (por ejemplo, vectores separados, o una célula anfitrión y un vector). En otra realización, estas secuencias rep se fusionan en trama con secuencias cap de una fuente de AAV diferente para formar un vector de AAV quimérico. Opcionalmente, los vectores de la invención son vectores empaquetados en una cápside de AAV de la invención. Estos vectores, y otros vectores descritos en la presente memoria, pueden contener además un minigén que comprende un transgén seleccionado que esté flanqueado por la ITR 5’ de AAV y por la ITR 3’ de AAV.

Los vectores descritos en la presente memoria, por ejemplo un plásmido, son útiles para una diversidad de propósitos, pero son particularmente adecuados para su uso en la producción de un rAAV que contiene una cápside que comprende secuencias de AAV o un fragmento de las mismas. Estos vectores, incluyendo el rAAV, sus elementos, construcción y usos, se describen con detalle en la presente memoria.

La invención permite la generación de un virus adeno-asociado recombinante (AAV) que tiene la nueva cápside de AAV de la invención. Dicho método incluye cultivar una célula anfitrión que contiene una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de una nueva cápside de AAV de la invención; un gen rep funcional; un minigén compuesto por, como mínimo, repeticiones terminales invertidas (ITRs) de AAV y un transgén; y suficientes funciones auxiliares para permitir el empaquetamiento del minigén en la proteína de cápside de AAV.

Los componentes requeridos para ser cultivados en la célula anfitrión para empaquetar un minigén de AAV en una

cápside de AAV, pueden ser proporcionados a la célula anfitrión en trans. Alternativamente, uno o más de los componentes requeridos (por ejemplo, minigén, secuencias rep, secuencias cap y/o funciones auxiliares), pueden ser proporcionados por una célula anfitrión estable que haya sido diseñada para contener uno o más de los componentes requeridos usando métodos conocidos por los expertos en la materia. De manera más adecuada, dicha célula anfitrión estable podrá contener el (los) componente(s) requerido(s) bajo el control de un promotor inducible. Sin embargo, el (los) componente(s) requerido(s) puede(n) estar bajo el control de un promotor constitutivo. Ejemplos de promotores inducibles y constitutivos adecuados, se proporcionan en la presente memoria, en la discusión de los elementos reguladores adecuados para su uso con el transgén. En otra alternativa más, una célula anfitrión estable seleccionada puede contener el (los) componente(s) seleccionado(s) bajo el control de un promotor constitutivo y otro(s) componente(s) seleccionado(s) bajo el control de uno o más promotores inducibles. Por ejemplo, se puede generar una célula anfitrión estable que se derive de células 293 (que contenga funciones auxiliares E1 bajo el control de un promotor constitutivo), pero que contenga las proteínas rep y/o cap bajo el control de promotores inducibles. Aún más, otras células anfitrión estables pueden ser generadas por un experto en la materia.

El minigén, las secuencias rep, las secuencias cap y las funciones auxiliares que se requieren para la producción del rAAV de la invención, pueden ser suministradas a la célula anfitrión de empaquetamiento en forma de cualquier elemento genético que transfiera las secuencia portadas por el mismo. El elemento genético seleccionado puede ser suministrado mediante cualquier método adecuado, incluyendo los que se describen en la presente memoria. Los métodos usados para la construcción de cualquier realización de la presente invención, son conocidos por los expertos en la manipulación de ácido nucleico e incluyen técnicas de ingeniería genética, ingeniería recombinante, y técnicas sintéticas. Véase por ejemplo Sambrook et al., Clonación Molecular: Un Manual de Laboratorio, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY. De forma similar, los métodos de generación de viriones de rAAV son bien conocidos y la selección de un método adecuado no constituye una limitación de la presente invención. Véase, por ejemplo, K. Fischer et al., J. Virol., 70: 520-532 (1993) y la Patente US núm. 5.478.745.

A menos que se especifique otra cosa, las ITRs de AAV y otros componentes de AAV seleccionados descritos en la presente memoria, pueden ser fácilmente seleccionados a partir de entre cualquier AAV incluyendo, aunque sin limitación, el AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV9 y una de las otras nuevas secuencias de AAV de la invención. Estas ITRs u otros componentes de AAV pueden ser aislados fácilmente usando técnicas disponibles para los expertos en la materia a partir de una secuencia de AAV. Tal AAV puede ser aislado u obtenido a partir de fuentes académicas, comerciales o públicas (por ejemplo, la American Type Culture Collection, Manassas, VA). Alternativamente, las secuencias de AAV pueden ser obtenidas a través de medios sintéticos o de otros medios adecuados por referencia a secuencias publicadas tales como las que están disponibles en la literatura

o en bases de datos tales como, por ejemplo, GenBank®, PubMed®, o similares.

A.

El minigén

El minigén está compuesto, como mínimo, de un transgén y de sus secuencias reguladoras, y de repeticiones terminales invertidas (ITRs) 5’ y 3’ de AAV. En una realización deseable se usan las ITRs del serotipo 2 de AAV. Sin embargo, se pueden seleccionar ITRs de otras fuentes adecuadas. Este minigén es el que está empaquetado en una proteína de cápside y es suministrado a una célula anfitrión seleccionada.

1. El transgén

El transgén es una secuencia de ácido nucleico, heteróloga respecto a las secuencias de vector que flanquean el transgén, que codifica un polipéptido, una proteína u otro producto de interés. La secuencia de codificación de ácido nucleico está enlazada operativamente a componentes reguladores de una manera que permite la transcripción, la traducción y/o la expresión de transgén en una célula anfitrión.

La composición de la secuencia de transgén dependerá del uso al que se destine el vector resultante. Por ejemplo, un tipo de secuencia de transgén incluye una secuencia informadora, que tras la expresión produce una señal detectable. Tales secuencias informadoras incluyen, sin limitación, secuencias de ADN que codifican β-lactamasa, βgalactosidasa (LacZ), fosfatasa alcalina, quinasa timidina, proteína fluorescente verde (GFP), GFP potenciada (EGFP), cloranfenicol acetiltransferasa (CAT), luciferasa, proteínas de enlace de membrana que incluyen, por ejemplo, CD2, CD4, CD8, la proteína de hemaglutinina de influenza, y otras bien conocidas en el estado de la técnica, a las que se dirigen los anticuerpos de alta afinidad existentes o que puedan ser producidos mediante medios convencionales, y proteínas de fusión que comprenden una proteína de enlace de membrana fusionada apropiadamente con un dominio de etiqueta de antígeno de la, entre otros, hemaglutinina o Myc.

Estas secuencias de codificación, cuando se asocian a elementos reguladores que activan su expresión, proporcionan señales detectables con medios convencionales, incluyendo los ensayos enzimáticos, radiográficos, colorimétricos, de fluorescencia u otros ensayos espectrográficos, ensayos de clasificación de célula activadora fluorescente y ensayos inmunológicos, incluyendo el ensayo inmunoenzimático (ELISA), radioinmunoensayo (RIA) e inmunohistoquímica. Por ejemplo, cuando la secuencia marcadora es el gen LacZ, la presencia del vector portador de la señal es detectada mediante ensayos respecto a actividad de beta-galactosidasa. Cuando el transgén es proteína fluorescente verde o luciferasa, el vector portador de la señal puede ser medido visualmente por el color o

la producción de luz en un luminómetro.

Sin embargo, deseablemente, el transgén es una secuencia no marcadora que codifica un producto que es útil en biología y medicina, tal como proteínas, péptidos, ARN, enzimas, mutantes negativos dominantes, o ARNs catalíticos. Las moléculas de ARN deseables incluyen tARN, dsARN, ARN ribosómico, ARNs catalíticos, siARN, ARN de horquilla pequeña, ARN de empalme trans, y ARNs antisentido. Un ejemplo de una secuencia útil de ARN es una secuencia que inhiba o extinga la expresión de una secuencia de ácido nucleico objetivada en el animal tratado. Típicamente, las secuencias objetivo adecuadas incluyen objetivos oncológicos y enfermedades virales. Véase, como ejemplos de tales objetivos los objetivos oncológicos y los virus identificados en lo que sigue, en la sección relativa a inmunógenos.

El transgén puede ser usado para corregir o mejorar deficiencias de gen, las cuales pueden incluir deficiencias en las que los genes normales se expresan a niveles menores de lo normal o deficiencias en las que el producto de gen funcional no está expresado. Alternativamente, el transgén puede proporcionar un producto a una célula que no esté expresada de forma natural en el tipo de célula o en el anfitrión. Un tipo preferido de secuencia de transgén codifica una proteína terapéutica o un polipéptido que está expresado en una célula anfitrión. La invención incluye además el uso de múltiples transgenes. En determinadas situaciones, se puede usar un transgén diferente para codificar cada subunidad de una proteína, o para codificar diferentes péptidos o proteínas. Esto es deseable cuando el tamaño del ADN que codifica la subunidad de proteína es grande, por ejemplo para una inmunoglobulina, el factor de crecimiento derivado de plaqueta, o una proteína de distrofina. Con el fin de que la célula produzca la proteína multisubunidad, se infecta una célula con el virus recombinante que contiene cada una de las diferentes subunidades. Alternativamente, diferentes subunidades de una proteína pueden ser codificadas por el mismo transgén. En este caso, un transgén simple incluye el ADN que codifica cada una de las subunidades, estando el ADN para cada subunidad separado por un sitio de entrada de ribozima interno (IRES). Esto es deseable cuando el tamaño del ADN que codifica cada una de las subunidades es pequeño, por ejemplo el tamaño total del ADN que codifica las subunidades y los IRES es menor de cinco kilobases. Como alternativa a un IRES, el ADN puede estar separado por secuencias que codifican un péptido 2A, que se somete a autoclave en un evento post-traslacional. Véase, por ejemplo, M.L. Donnelly, et l., J. Gen. Virol., 78 (Pt 1): 13-21 (Enero de 1997); Furler, S., et al., Gene Ther., 8(111): 864-873 (Junio de 2001); Klump H., et al., Gene Ther., 8(10): 811-817 (Mayo de 2001). Este péptido 2A es significativamente más pequeño que un IRES, lo que lo hace muy adecuado para su uso cuando el espacio es un factor limitativo. Con más frecuencia, cuando el transgén es grande, consiste en multi-subunidades, o se cosuministran dos transgenes, el rAAV portador del (de los) transgén(es) o subunidad(es) deseado(s) o se coadministran subunidades para permitirles concatamerizar in vivo para formar un único genoma vector. En una realización de ese tipo, un primer AAV puede portar una casete de expresión que exprese un solo transgén y un segundo AAV puede portar una casete de expresión que exprese un transgén diferente para la co-expresión en la célula anfitrión. Sin embargo, el transgén seleccionado puede codificar cualquier producto biológicamente activo u otro producto, por ejemplo, un producto deseable para su estudio.

Un experto en la materia puede seleccionar fácilmente transgenes adecuados. La selección del transgén no se considera una limitación de la presente invención.

2. Elementos reguladores

Adicionalmente a los elementos principales identificados anteriormente para el minigén, el vector incluye también elementos de control convencionales que están enlazados operativamente al transgén de una manera que permite su transcripción, traducción y/o expresión en una célula transfectada con el vector de plásmido o infectada con el virus producido por medio de la invención. Según se utiliza en la presente memoria, las secuencias “operativamente enlazadas” incluyen tanto secuencias de control de expresión que son contiguas con el gen de interés como secuencias de control de expresión que actúan en trans o a una distancia para controlar el gen de interés.

Las secuencias de control de expresión incluyen secuencias de iniciación, terminación, promotoras y potenciadoras de transcripción apropiadas; señales de procesamiento eficiente de ARN tal como señales de empalme y poliadenilación (poliA); secuencias que estabilizan mARN citoplásmico; secuencias que potencian la eficacia de traducción (es decir, secuencia de consenso de Kozak); secuencias que potencian la estabilidad de la proteína; y cuando se desee, secuencias que potencian la secreción del producto codificado. Un gran número de secuencias de control de expresión, incluyendo promotores que son naturales, constitutivos, inducibles y/o específicos del tejido, son conocidos en el estado de la técnica y pueden ser utilizados.

Ejemplos de promotores constitutivos incluyen, aunque sin limitación, el promotor LTR del virus de sarcoma de Rous retroviral (RSV) (opcionalmente con el potenciador de RSV), el promotor de citomegalovirus (CMV) (opcionalmente con el potenciador de CMV) [véase, por ejemplo, Boshart et al., Célula, 41: 521-530 (1985)], el promotor SV40, el promotor de dihidrofolato reductasa, el promotor de β-actina, el promotor de fosfoglicerol quinasa (PGK), y el promotor de EF1 [Invitrogen]. Los promotores inducibles permiten la regulación de expresión de gen y pueden ser regulados por compuestos suministrados exógenamente, factores medioambientales tales como la temperatura, o la presencia de un estado fisiológico específico por ejemplo fase aguda, un estado de diferenciación particular de la célula, o en células replicantes solamente. Los promotores inducibles y los sistemas inducibles están disponibles en una amplia diversidad de fuentes comerciales que incluyen aunque sin limitación, Invitrogen, Clontech y Ariad. Se

han descrito muchos otros sistemas y pueden ser fácilmente seleccionados por un experto en la materia. Ejemplos de promotores inducibles regulados por compuestos suministrados exógenamente incluyen el promotor de metalotionina (MT) de oveja inducible por zinc, el promotor del virus de tumor mamario del ratón (MMTV) inducible por dexametasona (Dex), el sistema promotor de T7 polimerasa [publicación de Patente Internacional núm. WO 98/10088]; el promotor de insecto de ecdisoma [No et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 3346-3351 (1996)], el sistema reprimible por tetraciclina [Gossen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 5547-5551 (1992)], el sistema inducible por tetraciclina [Gossen et al., Science, 268: 1766-1769 (1995), véase también Harvey et al., Curr. Opin. Chem. Biol., 2: 512-518 (1998)], el sistema inducible por RU486 [Wang et al., Nat. Biotech., 15: 239-243 (1997) y Wang et al., Gene Ther., 4: 432-441 (1997)] y el sistema inducible pro rapamicina [Magari et al., J. Clin. Invest., 100: 2865-2872 (1997)]. Otros tipos de promotores inducibles que pueden ser útiles en este contexto son aquellos regulados por un estado fisiológico específico, por ejemplo, temperatura, fase aguda, un estado de diferenciación particular de la célula, o en células replicantes solamente.

En otra realización, se puede usar el promotor natural para el transgén. El promotor natural puede ser preferido cuando se desee que la expresión del transgén mimetice la expresión natural. El promotor natural puede ser usado cuando la expresión del transgén debe ser regulada temporalmente o mediante desarrollo, o de una manera específica del tejido, o en respuesta a estímulos transcripcionales específicos. En una realización adicional, se pueden usar otros elementos naturales de control de expresión, tal como elementos potenciadores, sitios de poliadenilación o secuencias de consenso de Kozak, para mimetizar la expresión natural.

Otra realización del transgén incluye un gen enlazado operativamente a un promotor específico del tejido. Por ejemplo, si se desea expresión en el músculo esquelético, se debe usar un promotor que sea activo en el músculo.Éstos incluyen los promotores procedentes de genes que codifican la β-actina esquelética, la cadena 2A ligera de miosina, la distrofina, la creatina quinasa muscular, así como los promotores musculares sintéticos con actividades mayores que los promotores que se producen de forma natural (véase Li, et al., Nat. Biotech., 17: 241-245 (1999)). Se conocen ejemplos de promotores que son específicos del tejido para el hígado (albúmina, Miyatake et al., J. Virol.

71: 5124-32 (1997); promotor nuclear del virus de la hepatitis B, Sandig et al., Gene Ther., 3: 1002-9 (1996); alfafetoproteína (AFP), Arbuthnot et al., Hum. Gene Ther., 7: 1503-14 (1996)), osteocalcina ósea (Stein et al., Mol. Biol. Rep., 24: 185-96 (1997)); sialoproteína ósea (Chen et al., J. Bone Miner. Res., 11: 654-64 (1996)), linfocitos (CD2, Hansal et al., J. Immunol., 161: 1063-8 (1998); cadena pesada de inmunoglobulina; cadena receptora de células T), promotor neuronal tal como promotor de enolasa específica de la neurona (NSE) (Andersen et al., Cell. Mol. Neurobiol., 13: 503-15 (1993)), gen de cadena ligera de neurofilamento (Piccioli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,

88: 5611-5 (1991)), y el gen vgf específico de la neurona (Piccioli et al., Neurona, 15: 373-84 (1995)), entre otros.

Opcionalmente, los plásmidos portadores de transgenes terapéuticamente útiles pueden incluir también genes marcadores o informadores seleccionables que pueden incluir secuencias que codifican resistencia a la geneticina, higromicina o la purimicina, entre otros. Tales genes informadores o marcadores seleccionables (preferentemente localizados fuera del genoma viral que va a ser rescatado mediante el método de la invención) pueden ser usados para señalar la presencia de los plásmidos en células bacterianas, tal como resistencia a la ampicilina. Otros componentes del plásmido pueden incluir un origen de replicación. La selección de estos y de otros promotores y elementos de vector es convencional y se encuentran disponibles muchas de tales secuencias [véase, por ejemplo, Sambrook et al., y las referencias citadas en la presente memoria].

La combinación del transgén, promotor/potenciador, y las ITRs 3’ y 5’ de AAV se conoce como un “minigén” por facilidad de referencia. Según las enseñanzas proporcionadas por la presente invención, el diseño de un minigén de ese tipo puede hacerse recurriendo a técnicas convencionales.

3. Suministro del minigén a una célula anfitrión de empaquetamiento

El minigén puede ser transportado sobre cualquier vector adecuado, por ejemplo un plásmido, que se suministra a una célula anfitrión. Los plásmidos útiles en la presente invención pueden estar diseñados de tal modo que los mismos sean adecuados para replicación y, opcionalmente, para integración en células procarióticas, células de mamífero, o ambas. Estos plásmidos (u otros vectores portadores de ITR 5’ de AAV – molécula heteróloga – ITR 3’ de AAV) contienen secuencias que permiten la replicación del minigén en marcadores de selección eucariotas y/o procariotas y de selección para esos sistemas. Los genes marcadores o informadores seleccionables pueden incluir secuencias que codifican resistencia a la geneticina, higromicina o purimicina, entre otras. Los plásmidos pueden contener también ciertos genes informadores o marcadores seleccionables que pueden ser usados para señalar la presencia del vector en células bacterianas, tal como resistencia a la ampicilina. Otros componentes del plásmido pueden incluir un origen de replicación y un amplicón, tal como el sistema amplicón que emplea el antígeno nuclear del virus Epstein Barr. Este sistema amplicón, u otros componentes de amplicón similares, permiten una alta replicación episómica por copia en las células. Con preferencia, la molécula portadora del minigén es transfectada en la célula, donde puede existir transitoriamente. Alternativamente, el minigén (portador de la ITR 5’ de AAV – molécula heteróloga ITR 3’) puede estar integrado de forma estable en el genoma de la célula anfitrión, ya sea cromosómicamente o como episoma. En ciertas realizaciones, el minigén puede estar presente en múltiples copias, opcionalmente en concatámeros de cabeza con cabeza, cabeza con cola o cola con cola. Se conocen técnicas de transfección adecuadas y que pueden ser utilizadas fácilmente para suministrar el minigén a la célula anfitrión.

En general, cuando se suministra el vector que comprende el minigén por transfección, el vector es suministrado en una cantidad de entre alrededor de 5 μg a alrededor de 100 μg de ADN, alrededor de 10 μg a alrededor de 50 μg de ADN en aproximadamente 1 x 104 células a aproximadamente 1 x 1013 células, o en aproximadamente 1 x 105 células. Sin embargo, las cantidades relativas de ADN de vector en las células anfitrión pueden ser ajustadas por un experto en la materia, quién puede tomar en consideración factores tales como el vector seleccionado, el método de suministro y las células anfitrión seleccionadas.

B. Secuencias rep y cap

Además del minigén, la célula anfitrión contiene las secuencias que activan expresión de una nueva proteína de cápside de AAV de la invención (o una proteína de cápside que comprenda un fragmento del mismo) en la célula anfitrión y secuencias rep de la misma fuente que la fuente de las ITRs de AAV encontradas en el minigén, o una fuente de complementación cruzada. Las secuencias cap y rep de AAV pueden ser obtenidas de manera independiente a partir de una fuente de AAV según se ha descrito en lo que antecede y pueden ser introducidas en la célula anfitrión de cualquier manera conocida por un experto en la materia según se ha descrito con anterioridad. Adicionalmente, cuando se seudotipa un vector de AAV, las secuencias que codifican cada una de las proteínas rep esenciales pueden ser suministradas por fuentes de AAV diferentes (por ejemplo, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9). Por ejemplo, las secuencias rep78/68 pueden ser de AAV2, mientras que las secuencias rep52/40 pueden ser de AAV8.

En una realización, la célula anfitrión contiene establemente la proteína de cápside bajo el control de un promotor adecuado, tal como los que se han descrito anteriormente. De manera más deseable, en esta realización, la proteína de cápside se expresa bajo el control de un promotor inducible. En otra realización, la proteína de cápside es suministrada a la célula anfitrión en trans. Cuando se suministra a la célula anfitrión en trans, la proteína de cápside puede ser suministrada por medio de un plásmido que contenga las secuencias necesarias para dirigir expresión de la proteína de cápside seleccionada en la célula anfitrión. De forma más deseable, cuando se suministra a la célula anfitrión en trans, el plásmido que transporte la proteína de cápside transporta también otras secuencias requeridas para empaquetar el rAAV, por ejemplo, las secuencias rep.

En otra realización, la célula anfitrión contiene establemente las secuencias rep bajo el control de un promotor adecuado, tal como los que se han descrito con anterioridad. Más deseablemente, en esta realización, las proteínas rep esenciales son expresadas bajo el control de un promotor inducible. En otra realización, las proteínas rep son suministradas a la célula anfitrión en trans. Cuando se suministran a la célula anfitrión en trans, las proteínas rep pueden ser suministradas por medio de un plásmido que contenga las secuencias necesarias para dirigir la expresión de las proteínas rep seleccionadas en la célula anfitrión. De manera más deseable, cuando se suministra a la célula anfitrión en trans, el plásmido portador de la proteína de cápside transporta también otras secuencias requeridas para el empaquetamiento del rAAV, por ejemplo las secuencias rep y cap.

De ese modo, en una realización, las secuencias rep y cap pueden ser transfectadas a la célula anfitrión en una sola molécula de ácido nucleico y existir de manera estable en la célula a modo de un episoma. En otra realización, las secuencias rep y cap están integradas de forma estable en el cromosoma de la célula. Otra realización tiene las secuencias rep y cap expresadas transitoriamente en la célula anfitrión. Por ejemplo, una molécula útil de ácido nucleico para una transfección de ese tipo comprende, desde 5’ a 3’, un promotor, un separador opcional interpuesto entre el promotor y el sitio de inicio de la secuencia de gen rep, una secuencia de gen rep de AAV, y una secuencia de gen cap de AAV.

Opcionalmente, las secuencias rep y/o cap pueden ser suministradas sobre un vector que contenga otras secuencias de ADN que van a ser introducidas en las células anfitrión. Por ejemplo, el vector puede contener la construcción de rAAV que comprenda el minigén. El vector puede comprender uno o más de los genes que codifican las funciones auxiliares, por ejemplo las proteínas adenovirales E1, E2a, y E4 ORF6, y el gen para ARN VAI.

Con preferencia, el promotor usado en esta construcción puede ser cualquiera de los promotores constitutivo, inducible o natural conocidos por los expertos en la materia o discutidos en lo que antecede. En una realización, se emplea una secuencia de promotor P5 de AAV. La selección del AAV para proporcionar cualquiera de esas secuencias no limita la invención.

En otra realización preferida, el promotor para rep es un promotor inducible, tal como los que se han discutido en lo que antecede en relación con los elementos reguladores de transgén. Un promotor preferido para expresión rep es el promotor T7. El vector que comprende el gen rep regulado por el promotor T7 y el gen cap, es transfectado o transformado en una célula que expresa ya sea de forma constitutiva o ya sea de forma inducible la polimerasa de T7. Véase la publicación de Patente Internacional núm. WO 98/10088, publicada el 12 de Marzo de 1998.

El separador es un elemento opcional en el diseño del vector. El separador es una secuencia de ADN intercalada entre el promotor y el sitio de inicio ATG del gen rep. El separador puede tener cualquier diseño deseado, es decir, puede ser una secuencia aleatoria de nucleótidos, o alternativamente puede codificar un producto de gen, tal como un gen marcador. El separador puede contener genes que incorporan típicamente sitios de inicio/interrupción y de poliA. El separador puede ser una secuencia de ADN no codificante, procedente de un procariota o un eucariota,

una secuencia no codificadora repetitiva, una secuencia codificadora sin controles transcripcionales o una secuencia codificadora con controles transcripcionales. Dos fuentes ejemplares de secuencias separadoras son las secuencias escalera de fago o las secuencias escalera de levadura, las cuales están disponibles comercialmente, por ejemplo en Gibco o Invitrogen, entre otros. El separador puede ser de cualquier tamaño que sea suficiente para reducir la expresión de los productos de gen rep78 y rep68, dejando los productos de gen rep52, rep40 y cap expresados a niveles normales. La longitud del separador puede estar por lo tanto comprendida en la gama de entre aproximadamente 10 bp y aproximadamente 10,0 kbp, con preferencia en la gama de aproximadamente 100 bp a aproximadamente 8 kbp. Para reducir la posibilidad de recombinación, el separador es con preferencia de una longitud menor de 2kbp; sin embargo, la invención no se limita con ello.

Aunque la(s) molécula(s) que proporciona(n) rep y cap pueden existir en la célula anfitrión de forma transitoria (es decir, mediante transfección), se prefiere que una o ambas de las proteínas rep y cap y el (los) promotor(es) que controla(n) su expresión estén expresados establemente en la célula anfitrión, por ejemplo a modo de episoma o por integración en el cromosoma de la célula anfitrión. Los métodos empleados para la construcción de realizaciones de la presente invención son técnicas convencionales de ingeniería genética o de ingeniería recombinante tales como las descritas en las referencias que anteceden. Mientras que esta descripción proporciona ejemplos ilustrativos de construcciones específicas, usando la información proporcionada en la presente memoria, un experto en la materia puede seleccionar y diseñar otras construcciones adecuadas, usando una opción de entre separadores, promotores P5, y otros elementos, incluyendo al menos una señal de inicio y de interrupción traslacional, y la adición opcional de sitios de poliadenilación.

En otra realización de la presente invención, la proteína rep o cap puede ser suministrada de forma estable por una célula anfitrión.

C. Funciones auxiliares

La célula anfitrión de empaquetamiento también requiere funciones auxiliares a efectos de empaquetar el rAAV de la invención. Opcionalmente, estas funciones pueden ser suministradas por un herpesvirus. Más deseablemente, las funciones auxiliares necesarias son proporcionadas cada una de ellas por una fuente de adenovirus de primate humano o no humano, tal como las que se han descrito con anterioridad y/o las que están disponibles a partir de una variedad de fuentes, incluyendo la American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA (US). En una realización actualmente preferida, la célula anfitrión se ha dotado de, y/o contiene, un producto de gen E1a, un producto de gen E1b, un producto de gen E2a, y/o un producto de gen E4 ORF6. La célula anfitrión puede contener otros genes adenovirales tal como el VAI ARN, pero estos genes no se necesitan. En una realización preferida, no están presentes otros genes de adenovirus o funciones de gen en la célula anfitrión.

Mediante “ADN adenoviral que expresa el producto de gen E1a” se indica cualquier secuencia de adenovirus que codifique E1a o cualquier porción funcional de E1a. El ADN adenoviral que expresa el producto de gen E2a y el ADN adenoviral que expresa los productos de gen E4 ORF6 se definen de forma similar. También se incluyen cualesquiera alelos u otras modificaciones del gen adenoviral o de la porción funcional del mismo. Tales modificaciones pueden ser introducidas deliberadamente recurriendo a técnicas convencionales mutagenéticas o de ingeniería genética para potenciar la función adenoviral de alguna manera, así como las variantes alélicas de las mismas que se produzcan de forma natural. Tales modificaciones y métodos para la manipulación de ADN a efectos de conseguir estas funciones de gen de adenovirus, son conocidos en el estado de la técnica.

Los productos de gen E1a, E1b, E2a, y/o E4 ORF6 de adenovirus, así como cualesquiera otras funciones auxiliares deseadas, pueden ser proporcionados usando cualquier medio que permita su expresión en una célula. Cada una de las secuencias que codifican estos productos puede estar sobre un vector separado, o uno o más genes pueden estar sobre el mismo vector. El vector puede ser cualquier vector conocido en el estado de la técnica o divulgado con anterioridad, incluyendo plásmidos, cósmidos y virus. La introducción en la célula anfitrión del vector puede ser lograda con cualquier medio conocido en el estado de la técnica o como se ha divulgado con anterioridad, incluyendo transfección, infección, electroporación, suministro de liposoma, técnicas de fusión de membrana, gránulos recubiertos de ADN de alta velocidad, infección viral y fusión de protoplasto, entre otros. Uno o más de los genes adenovirales pueden estar integrados de forma estable en el genoma de la célula anfitrión, expresados de forma estable a modo de episomas, o expresados transitoriamente. Los productos de gen pueden ser todos expresados transitoriamente, sobre un episoma o integrados de forma estable, o algunos de los productos de gen pueden ser expresados de forma estable mientras otros son expresados transitoriamente. Además, los promotores para cada uno de los genes adenovirales pueden ser seleccionados de forma independiente a partir de un promotor constitutivo, un promotor inducible o un promotor adenoviral natural. Los promotores pueden ser regulados por medio de un estado fisiológico específico del organismo o la célula (por ejemplo, mediante el estado de diferenciación o en células replicantes o quiescentes), o por otros medios, por ejemplo mediante factores añadidos exógenamente.

D. Células anfitrión y líneas de células de empaquetamiento

La propia célula anfitrión puede ser seleccionada a partir de cualquier organismo biológico incluyendo las células procarióticas (por ejemplo, las bacterianas), y las células eucarióticas, incluyendo las células de insecto, células de

levadura y células de mamífero. Las células anfitrión particularmente deseables se eligen entre especies cualesquiera de mamíferos, incluyendo sin limitación células tales como A549, WEHI, 3T3, 10T1/2, BHK, MDCK, COS 1, COS 7, BSC 1, BSC 40, BMT 10, VERO, WI38, HeLa, células 293 (las cuales expresan E1 adenoviral funcional, Saos, C2C12, células L, HT 1080, HepG2 y fibroblasto primario, hepatocito y células de mioblasto derivadas de mamífero que incluyen las de humanos, mono, ratón, rata, conejo y hámster. La selección de las especies de mamífero que proporcionan las células no es una limitación de la presente invención, ni lo es el tipo de célula de mamífero, es decir fibroblasto, hepatocito, célula tumoral, etc. Los requisitos para la célula utilizada son que no sea portadora de genes de adenovirus que sean distintos de E1, E2a y/o E4 ORF6; no contenga ningún otro gen de virus que pueda dar como resultado una recombinación homóloga de un virus contaminante durante la producción de rAAV; y que sea capaz de provocar infección o transfección de ADN y expresión del ADN transfectado. En una realización preferida, la célula anfitrión es una que tenga rep y cap transfectadas establemente en la célula.

Una célula anfitrión útil en la presente invención es una célula anfitrión transformada establemente con las secuencias que codifican rep y cap, y que esté transfectada con el ADN de los adenovirus E1, E2a y E4ORF6, y una construcción portadora del minigén según se ha descrito con anterioridad. Las rep y cap estables que expresan líneas celulares, tal como la B-50 (publicación de solicitud de Patente Internacional núm. WO 99/15685), o las que se describen en la Patente US núm. 5.658.785, pueden ser también empleadas de forma similar. Otra célula anfitrión deseable contiene el ADN adenoviral mínimo que sea suficiente para expresar E4 ORF6. Incluso otras líneas celulares pueden ser construidas usando las nuevas secuencias cap de AAV corregidas en singletón de la invención.

La preparación de una célula anfitrión útil en la presente invención incluye técnicas tales como el ensamblaje de secuencias de ADN seleccionadas. Este ensamblaje puede ser llevado a cabo utilizando técnicas convencionales. Tales técnicas incluyen clonación genómica y de cADN, las cuales son bien conocidas y han sido descritas por Sambrook et al., citado anteriormente, el uso de secuencias solapantes de oligonucleótidos del adenovirus y genomas de AAV, combinadas con reacción de cadena de polimerasa, métodos sintéticos, y cualesquiera otros métodos adecuados que proporcionen la secuencia de nucleótido deseada.

La introducción de las moléculas (como plásmidos o virus) en la célula anfitrión puede ser realizada también usando técnicas conocidas por el experto en la materia y como las discutidas a través de la descripción. En una realización preferida, se usan técnicas de transfección estándar, por ejemplo transfección de CaPO4 o electroporación, y/o infección por medio de vectores de adenovirus híbridos/AAV en líneas celulares tales como la línea celular HEK 293 de riñón embriónico humano (una línea celular de riñón humano que contiene genes E1 de adenovirus funcional que proporciona proteínas de E1 que actúan en trans).

Un experto en la materia podrá comprender fácilmente que las nuevas secuencias de AAV de la invención pueden ser adaptadas fácilmente para su uso en esos y otros sistemas de vector viral para el suministro de gen in vitro, ex vivo o in vivo. De forma similar, un experto en la materia puede seleccionar fácilmente otros fragmentos del genoma de AAV de la invención para su uso en una diversidad de sistemas de vector de rAAV y de no rAAV. Tales sistemas de vector pueden incluir, por ejemplo, lentivirus retrovirus, poxvirus, virus de vacunas, y sistemas adenovirales, entre otros. La selección de estos sistemas de vector no es una limitación de la presente invención.

De ese modo, la invención proporciona además vectores generados usando las secuencias de ácido nucleico y de aminoácidos del nuevo AAV de la invención. Tales vectores son útiles para una diversidad de propósitos, incluyendo el suministro de moléculas terapéuticas y para su uso en regímenes de vacuna. Particularmente deseables para el suministro de moléculas terapéuticas son las cápsides que contienen AAV recombinante del nuevo AAV de la invención. Estas, u otras construcciones de vector que contienen nuevas secuencias de AAV de la invención pueden ser usadas en regímenes de vacuna, por ejemplo para el co-suministro de una citoquina, o para el suministro del propio inmunógeno.

IV. Virus recombinantes y usos de los mismos

Usando las técnicas que se describen en la presente memoria, un experto en la materia puede generar un rAAV que tenga una cápside de un AAV de la invención o que tenga una cápside que contenga uno o más fragmentos de un AAV de la invención. En una realización, se puede utilizar una cápside de longitud completa procedente de un AAV corregido en singletón.

A. Suministro de Virus

Los vectores conforme a la presente invención proporcionan un método para el suministro de un transgén a un anfitrión que incluye transfectar o infectar una célula anfitrión seleccionada con un vector viral recombinante generado con el AAV corregido en singletón (o con fragmentos funcionales del mismo) de la invención. Los métodos de suministro son bien conocidos en el estado de la técnica y no constituyen una limitación de la presente invención.

En una realización deseable, la invención habilita un método para suministro mediado por AAV de un transgén a un anfitrión. Este método incluye transfectar o infectar una célula anfitrión seleccionada con un vector viral recombinante que contiene un transgén seleccionado bajo el control de secuencias que dirigen expresión del mismo

y las proteínas de cápside modificadas de las cápsides.

Opcionalmente, una muestra del anfitrión puede ser ensayada en primer lugar en cuanto a la presencia de anticuerpos en una fuente de AAV seleccionada (por ejemplo, un serotipo). Los expertos en la materia son conocedores de una diversidad de formatos de ensayo para detectar anticuerpos neutralizantes. La selección de tales ensayos no es una limitación de la presente invención. Véase, por ejemplo, Fisher et al., Nature Med., 3(3): 306-312 (Marzo de 1997) y W. C. Manning et al., Terapia Genética Humana, 9: 477-486 (1 de Marzo de 1998). Los resultados de este ensayo pueden ser usados para determinar qué vectores de AAV que contengan proteínas de cápside de una fuente particular son preferidos para el suministro, por ejemplo en base a la ausencia de anticuerpos neutralizantes específicos para esa fuente de cápside.

En un aspecto de este método, el suministro de vector con proteínas de cápside de AAV de la invención puede preceder o seguir al suministro de un gen por medio de un vector con una proteína de cápside de AAV diferente. De ese modo, el suministro de gen por medio de vectores de rAAV puede ser usado para repetir el suministro de gen a una célula anfitrión seleccionada. Deseablemente, los vectores de rAAV administrados posteriormente portan el mismo transgén que el primer vector de rAAV, pero los vectores administrados posteriormente contienen proteínas de cápside de fuentes (y con preferencia, diferentes serotipos) que difieren del primer vector. Por ejemplo, si un primer vector tiene una proteína de cápside corregida en singletón, los vectores administrados posteriormente pueden tener proteínas de cápside seleccionadas a partir del otro AAV, opcionalmente, a partir de otro serotipo, o de otro clado.

Opcionalmente, se pueden usar múltiples vectores de rAAV para suministrar transgenes grandes o múltiples transgenes mediante co-administración de vectores de rAAV concatamerizados in vivo para formar un genoma de vector simple. En una realización de ese tipo, un primer AAV puede portar una casete de expresión que exprese un solo transgén (o una subunidad del mismo) y un segundo AAV puede portar una casete de expresión que exprese un segundo transgén (o una subunidad diferente) para co-expresión en la célula anfitrión. Un primer AAV puede portar una casete de expresión que sea una primera pieza de una construcción policistrónica (por ejemplo, un promotor y transgén, o subunidad) y un segundo AAV puede portar una casete de expresión que sea una segunda pieza de una construcción policistrónica (por ejemplo, un transgén o subunidad y una secuencia de poliA). Estas dos piezas de construcción policistrónica concatamerizan in vivo para formar un solo genoma de vector que co-expresa los transgenes suministrados por el primer y el segundo AAV. En tales realizaciones, el vector de rAAV portador de la primera casete de expresión y el vector de rAAV portador de la segunda casete de expresión pueden ser suministrados en una sola composición farmacéutica. En otras realizaciones, los dos o más vectores de rAAV son suministrados como composiciones farmacéuticas separadas que pueden ser administradas de forma sustancialmente simultánea, o de manera próxima o una después de otra.

Los vectores recombinantes mencionados en lo que antecede pueden ser suministrados a células anfitrión de acuerdo con métodos publicados. El rAAV, con preferencia suspendido en un portador fisiológicamente compatible, puede ser administrado a un paciente mamífero humano o no humano. Los portadores adecuados pueden ser seleccionados fácilmente por un experto en la materia en vista de la indicación para la que sea dirigido el virus de transferencia. Por ejemplo, un portador adecuado incluye solución salina, que puede ser formulada con una diversidad de soluciones tampón (por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato). Otros ejemplos de portadores incluyen solución salina estéril, lactosa, sacarosa, fosfato de calcio, gelatina, dextrano, agar, pectina, aceite de cacahuete, aceite de sésamo y agua. La selección del portador no es una limitación de la presente invención.

Opcionalmente, las composiciones de la invención pueden contener, además del rAAV y del (de los) portador(es), otros ingredientes farmacéuticos convencionales, tal como conservantes o estabilizadores químicos. Ejemplos de conservantes adecuados incluyen clorobutanol, sorbato potásico, ácido sórbico, dióxido de azufre, propil galato, parabenos, etil vanilina, glicerina, fenol y paraclorofenol. Los estabilizadores químicos adecuados incluyen gelatina y albúmina.

Los vectores son administrados en cantidades suficientes para transfectar las células y para proporcionar niveles suficientes de transferencia y expresión de gen como para proporcionar un beneficio terapéutico sin efectos adversos indebidos, o con efectos fisiológicos médicamente aceptables, que pueden ser determinados por los expertos en la ciencia médica. Rutas de administración convencionales y farmacéuticamente aceptables incluyen, aunque sin limitación, suministro directo a un órgano deseado (por ejemplo, el hígado (opcionalmente a través de la arteria hepática) o el pulmón), oral inhalación, intranasal, intratraqueal, intraarterial, intraocular, intravenosa, intramuscular, subcutánea, intradérmica, y otras rutas de administración parental. Las rutas de administración pueden ser combinadas, si se desea.

Las dosificaciones de vector viral dependerán principalmente de factores tales como la condición que va a ser tratada, la edad, el peso y el estado de salud del paciente, y por lo tanto puede variar entre pacientes. Por ejemplo, una dosis humana terapéuticamente efectiva de vector viral está generalmente comprendida en la gama de entre alrededor de 0,1 ml y alrededor de 100 ml de solución que contenga concentraciones de alrededor de 1 x 109 a 1 x 1016 genomas en el vector viral. Una dosis humana preferida para su suministro a órganos grandes (por ejemplo, hígado, músculo, corazón y pulmón) puede ser de alrededor de 5 x 1010 a 5 x 1013 genomas de AAV por 1 kg, a un

volumen de alrededor de 1 a 100 ml. Una dosis preferida para su suministro a un ojo es de aproximadamente 5 x 109 a 5 x 1012 copias de genoma, en un volumen de alrededor de 0,1 ml a 1 ml. La dosis será ajustada de modo que equilibre el beneficio terapéutico frente a cualesquiera efectos colaterales y tales dosis pueden variar dependiendo de la aplicación terapéutica para la que se emplee el vector recombinante. Los niveles de expresión del transgén pueden ser monitorizados para determinar la frecuencia de dosificación resultante en vectores virales, con preferencia vectores de AAV que contienen el minigén. Opcionalmente, se pueden utilizar regímenes de dosificación similares a los descritos a efectos terapéuticos para inmunización usando las composiciones de la invención.

Ejemplos de productos terapéuticos y de productos inmunogénicos para su suministro por los vectores que contienen el AAV de la invención se proporcionan en lo que sigue. Estos vectores pueden ser usados para una diversidad de regímenes terapéuticos o de vacuna, según se describe en la presente memoria. Adicionalmente, estos vectores pueden ser suministrados en combinación con uno o más de otros vectores o ingredientes activos en un régimen terapéutico y/o de vacuna deseado.

B. Transgenes terapéuticos

Los productos terapéuticos útiles codificados por el transgén incluyen hormonas y factores de crecimiento y diferenciación que incluyen, sin limitación, insulina, glucagón, hormona de crecimiento (GH), hormona paratiroidea (PTH), factor de liberación de hormona del crecimiento (GRF), hormona de estimulación del folículo (FSH), hormona leutinizante (LH), gonadotropina coriónica humana (hCG), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), angiopoyetinas, angiostatina, factor de estimulación de colonia de granulocito (GCSF), eritropoyetina (EPO), factor de crecimiento del tejido conectivo (CTGF), factor de crecimiento de fibroblasto básico (bFGF), factor de crecimiento de fibroblasto acídico (aFGF), factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento derivado de plaqueta (PDGF), factores I y II de crecimiento de insulina (IGF-I e IGF-II), uno cualquiera de la súper-familia de factor α de crecimiento de transformación, incluyendo el TGFα, activinas, inhibinas, o cualquier otra de las proteínas BMPs 1-15 morfogénicas óseas (BMP), uno cualquiera de la familia de factores de crecimiento del factor de diferenciación de herogluína/neurogluína/ARIA/neu (NDF), factor de crecimiento de nervio (NGF), factor neurotrópico derivado del cerebro (BDNF), neurotrofinas NT-3 y NT-4/5, factor neurotrópico ciliar (CNTF), factor neurotrópico derivado de línea celular glial (GDNF), neurturina, agrina, una cualquiera de la familia de semaforinas/colapsinas, netrina-1 y netrina-2, factor de crecimiento de hepatocito (HGF), efrinas, noggin, erizo sónico y tirosina hidroxilasa.

Otros productos útiles de transgén incluyen proteínas que regulan el sistema inmune incluyendo, sin limitación, las citoquinas y linfocinas tales como la trombopoyetina (TPO), las interleuquinas (IL) desde IL-1 a IL-25 (incluyendo por ejemplo IL-2, IL-4, IL-12 e IL-18), proteína quimioatrayente de monocito, factor de inhibición de leucemia, factor de estimulación de colonia macrófaga de granulocito, ligando Fas, factores a y � de necrosis tumoral, interferonas a, � y γ, factor de célula madre, ligando flk-2/flt3. Los productos de gen producidos por el sistema inmune son tambiénútiles en la invención. Éstos incluyen, sin limitaciones, inmunoglobulinas IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, inmunoglobulinas quiméricas, anticuerpos humanizados, anticuerpos de cadena simpe, receptores de célula T, receptores de célula T quiméricos, receptores de célula T de cadena simple, moléculas MCH de clase I y de clase II, así como moléculas de inmunoglobulinas de diseño y moléculas MHC. Los productos de gen útiles incluyen también proteínas reguladoras de complemento tales como proteínas reguladoras de complemento, proteína de co-factor de membrana (MCP), factor de aceleración de decaimiento (DAF), CR1, CF2 y CD59.

Otros productos de gen útiles adicionales incluyen uno cualquiera de los receptores para hormonas, factores de crecimiento, citoquinas, linfocinas, proteínas reguladoras y proteínas del sistema inmune. La invención abarca receptores para regulación del colesterol y/o modulación de lípido, incluyendo el receptor de lipoproteína de baja densidad (LDL), el receptor de lipoproteína de alta densidad (HDL), el receptor de lipoproteína de muy baja densidad (VLDL), y receptores scavenger. La invención abarca también vectores que incorporan productos de gen tales como miembros de la súper-familia de receptor de hormona esteroide incluyendo los receptores de glucocorticoide y los receptores de estrógeno, receptores de vitamina D y otros receptores nucleares. Adicionalmente, los productos de gen útiles incluyen factores de transcripción tales como jun, fos, max, mad, factor de respuesta de suero (SRF), AP1, AP2, myb, MyoD y miogenina, proteínas que contienen casilla de ETS, TFE3, E2F, ATF1, ATF2, ATF3, ATF4, ZF5, NFAT, CREB, HNF-4, C/EBP, SP1, proteínas de enlace de casilla CCAAT, factor de regulación de interferón (IRF-1), proteína de tumor de Wilms, proteína de enlace de ETS, STAT, proteínas de enlace de casilla GATA, por ejemplo GATA-3, y la familia bifurcada de proteínas de hélice alada.

Otros productos de gen útiles incluyen carbamoil sintetasa I, ornitina transcarbamilasa, arginosuccinato sintetasa, arginosuccinato liasa, arginasa, fumarilacetato hidrolasa, fenilalanina hidroxilasa, alfa-1 antitripsina, glucosa-6fosfatasa, porfobilinógeno desaminasa, cistationa beta-sintasa, cetoácido descarboxilasa de cadena ramificada, albúmina, isovaleril-coA deshidrogenasa, propionil CoA carboxilasa, metil malonil CoA mutasa, glutaril CoA deshidrogenasa, insulina, beta-glucosidasa, piruvato carboxilato, fosforilasa hepática, fosforilasa quinasa, glicina descarboxilasa, H-proteína, T-proteína, una secuencia de regulador de transmembrana de fibrosis cística (CFTR), y un producto de gen de distrofina (por ejemplo, una mini-o una micro-distrofina). Otros productos de gen útiles adicionales incluyen enzimas tales como las que pueden ser usadas en terapia de sustitución de enzima, la cual es útil en una diversidad de condiciones resultantes de una actividad deficiente de la enzima. Por ejemplo, las enzimas que contienen manosa-6-fosfato pueden ser utilizadas en terapias para enfermedades de almacenamiento lisosómico (por ejemplo, un gen adecuado incluye la que codifica la �-glucuronidasa (GUSB)).

Otros productos de gen útiles adicionales incluyen los usados para el tratamiento de la hemofilia, incluyendo la hemofilia B (incluyendo el factor IX) y la hemofilia A (incluyendo el Factor VIII y sus variantes, tal como la cadena ligera y la cadena pesada del heterodímero y del dominio suprimido en B; documento de Patente US núm. 6.200.560 y documento de Patente US núm. 6.221.349). El gen de Factor VIII codifica 2351 aminoácidos y la proteína tiene seis dominios, designados desde el aminoácido hasta el término carboxi terminal como A1-A2-B-A3-C1-C2 [Wood et al., Nature, 312: 330 (1984); Vehar et al., Nature 312: 337 (1984); y, Toole et al., Nature, 342: 337 (1984)]. El Factor VIII humano se procesa dentro de la célula para producir un heterodímero que comprende principalmente una cadena pesada que contiene los dominios A1, A2 y B, y una cadena ligera que contiene los dominios A3, C1 y C2. Tanto el polipéptido de cadena simple como el heterodímero circulan en el plasma como precursores inactivos, hasta que son activados por escisión de trombina entre los dominios A2 y B, lo que libera el dominio B y da como resultado una cadena pesada que consiste en los dominios A1 y A2. El dominio B es suprimido en forma de procoagulante activado de la proteína. Adicionalmente, en la proteína nativa, dos cadenas de polipéptido (“a” y “b”) que flanquean al dominio B, están enlazadas a un catión de calcio divalente.

En algunas realizaciones, el minigén comprende los primeros 57 pares de bases de la cadena pesada del Factor VIII que codifica la secuencia de señal de 10 aminoácidos, así como la secuencia de poliadenilación de la hormona de crecimiento humano (hGH). En realizaciones alternativas, el minigén comprende además los dominios A1 y A2, así como 5 aminoácidos desde el término N del dominio B, y/o 85 aminoácidos del término C del dominio B, así como los dominios A3, C1 y C2. En otras realizaciones adicionales, los ácidos nucleicos que codifican la cadena pesada y la cadena ligera del Factor VIII son proporcionados en un solo minigén separadas por 42 ácidos nucleicos que codifican 14 aminoácidos del dominio B [documento de Patente US núm. 6.200.560].

Según se utiliza en la presente memoria, una cantidad terapéuticamente efectiva es una cantidad de vector de AAV que produce cantidades suficientes de Factor VIII para reducir el tiempo que tarda en coagular la sangre del sujeto. Generalmente, los hemofílicos severos que tienen menos de un 1% de niveles normales de Factor VIII tienen un tiempo global de coagulación sanguínea mayor de 60 minutos en comparación con los aproximadamente 10 minutos para un no hemofílico.

La presente invención no se limita a ninguna secuencia específica de Factor VIII. Muchas formas naturales y recombinantes de Factor VIII han sido aisladas y generadas. Ejemplos de formas recombinantes y producidas de forma natural del Factor VII pueden ser encontradas en la literatura científica y de patentes, incluyendo los documentos de Patentes US núms. 5.563.045, 5.451.521, 5.422.260, 5.004.803, 4.757.006, 5.661.008, 5.789.203, 5.681.746, 5.595.886, 5.045.455, 5.668.108, 5.633.150, 5.693.499, 5.587.310, 5.171.844, 5.149.637, 5.112.950, 4.886.876; publicación de Patentes Internacionales núms. WO 94/11503, WO 87/07144, WO 92/16557, WO 91/09122, WO 97/03195, WO 96/21035, y WO 91/07490; solicitudes de Patentes Europeas núms. EP 0 672 138, EP 0 270 618, EP 0 182 448, EP 0 162 067, EP 0 786 474, EP 0 533 862, EP 0 506 757, EP 0 874 057, EP 0 795 021, EP 0 670 332, EP 0 500 734, EP 0 232 112, y EP 0 160 457; Sanberg et al., XXº Congreso Intern. De la World Fed. of Hemophilia (1992), y Lind et al., Eu. J. Biochem., 232: 19 (1995).

Las secuencias de ácidos nucleicos que codifican el Factor VIII descrito con anterioridad pueden ser obtenidas usando métodos recombinantes o derivando la secuencia a partir de un vector que se sabe que las incluye. Además, la secuencia deseada puede ser aislada directamente a partir de células y tejidos que la contienen, usando técnicas estándar, tal como extracción con fenol y PCR de cADN o de ADN genómico [Véase, por ejemplo, Sambrook et al.]. Las secuencias de nucleótido pueden ser producidas también sintéticamente, en vez de clonadas. La secuencia completa puede ser ensamblada mediante solapamiento de oligonucleótidos preparados por medio de métodos estándar y ensamblados en una secuencia de codificación completa [Véase, por ejemplo, Edge, Nature, 292: 757 (1981); Nambari et al., Science, 223: 1299 (1984); y Jay et al., J. Biol. Chem. 259: 6311 (1984).

Además, la invención no se limita al Factor VIII humano. Por el contrario, se pretende que la presente invención abarque vectores que incorporan Factor VIII de animales distintos de los humanos, incluyendo sin limitación los animales de compañía (por ejemplo, caninos, felinos y equinos), animales de cría (por ejemplo, bovinos, caprinos y ovinos), animales de laboratorio, mamíferos marinos, grandes gatos, etc.

Los vectores de AAV pueden contener un ácido nucleico que codifique los fragmentos de Factor VIII que no sea en sí mismo biológicamente activo, incluso aunque cuando se administra en el sujeto mejore o restablezca el tiempo de coagulación sanguínea. Por ejemplo, según se ha discutido con anterioridad, la proteína de Factor VIII comprende dos cadenas de polipéptido: una cadena pesada y una cadena ligera separadas por un dominio B que se escinde durante el procesamiento. Según se ha demostrado mediante la presente invención, la co-transducción de células receptoras con las cadenas pesada y ligera de Factor VIII conduce a la expresión de Factor VIII biológicamente activo. Puesto que la mayor parte de los hemofílicos contienen una mutación o supresión en una sola de las cadenas (por ejemplo, la cadena pesada o la ligera), puede ser posible administrar solamente la cadena defectuosa en el paciente para suministrar la otra cadena.

Otros productos de gen útiles incluyen polipéptidos que se producen de forma no natural, tal como polipéptidos quiméricos o híbridos que tienen una secuencia de aminoácido que se produce de forma no natural que contiene inserciones, supresiones o sustituciones de aminoácido. Por ejemplo, las inmunoglobulinas de diseño de cadena simple podrían ser útiles en determinados pacientes inmunocomprometidos. Otros tipos de secuencias de gen que

ocurren de forma no natural incluyen moléculas antisentido y ácidos nucleicos catalíticos, tal como ribozimas, que podrían ser usadas para reducir la sobre-expresión de un objetivo.

La reducción y/o la modulación de expresión de un gen resulta particularmente deseable para el tratamiento de condiciones híper-proliferativas caracterizadas por células híper-proliferantes, como son los cánceres y la psoriasis. Los polipéptidos objetivos incluyen aquellos polipéptidos que se producen exclusivamente, o a niveles más altos, en células híper-proliferativas en comparación con células normales. Los antígenos objetivo incluyen polipéptidos codificados por oncogenes tales como myb, myc, fyn, y el gen de translocación bcr/abl, ras, src, P53, neu, trk y EGRF. Adicionalmente a los productos de oncogén como antígenos objetivo, los polipéptidos objetivo para tratamientos anti-cáncer y regímenes protectores incluyen regiones variables de anticuerpos formadas por linfomas de célula B y regiones variables de receptores de células T de linfomas de células T que, en algunas realizaciones, se usan también como antígenos objetivo para la enfermedad autoinmune. Otros polipéptidos asociados a tumor pueden ser usados como polipéptidos objetivo tal como polipéptidos que se encuentran a niveles más altos en células tumorales incluyendo el polipéptido reconocido por el anticuerpo 17-1A monoclonal y los polipéptidos de enlace de folato.

Otros polipéptidos y proteínas terapéuticos adecuados incluyen los que pueden ser útiles para tratar individuos que sufren enfermedades y desórdenes autoinmunes confiriendo una respuesta inmune protectora de base amplia frente a objetivos que se asocian con autoinmunidad que incluyen receptores de célula y células que producen “anticuerpos auto-direccionados”. Las enfermedades autoinmunes mediadas por células T incluyen artritis reumatoide (RA), esclerosis múltiple (MS), síndrome de Sjögren, sarcoidosis, diabetes mellitus insulino-dependiente (IDDM), tiroiditis autoinmune, artritis reactiva, espondilitis anquilosante, escleroderma, polimiositis, dermatomiositis, psoriasis, vasculitis, granulomatosis de Wegener, enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa. Cada una de estas enfermedades está caracterizada por receptores de células T (TCRs) que enlazan con antígenos endógenos y que inician la cascada inflamatoria asociada a enfermedades autoinmunes.

C. Transgenes inmunogénicos

Adecuadamente, los vectores de AAV de la invención evitan la generación de respuestas inmunes a las secuencias de AAV contenidas dentro del vector. Sin embargo, estos vectores pueden no obstante ser formulados de una manera que permita la expresión de un transgén portado por los vectores para inducir una respuesta inmune a un antígeno seleccionado. Por ejemplo, con el fin de fomentar una respuesta inmune, el transgén puede ser expresado a partir de un promotor constitutivo, el vector puede ser adyuvado según se describe en la presente memoria, y/o el vector puede ser situado en tejido degenerativo.

Ejemplos de transgenes inmunogénicos adecuados incluyen los seleccionados en una diversidad de familias virales. Ejemplos de familias virales deseables frente a las que podría ser deseable una respuesta inmune incluyen la familia de picomavirus, la cual incluye los géneros rinovirus, los cuales son responsables de aproximadamente el 50% de los casos de resfriado común; los géneros enterovirus, los cuales incluyen poliovirus, coxsakievirus, ecovirus y enterovirus humanos tal como el virus de la hepatitis A; y los géneros aptovirus, los cuales son responsables de enfermedades de los pies y la boca, principalmente en animales no humanos. Dentro de la familia de virus de los picomavirus, los antígenos objetivo incluyen VP1, VP2, VP3, VP4 y VPG. Otras familias virales incluyen los astrovirus y la familia calcivirus. La familia calcivirus abarca el grupo de virus Norwalk, los cuales son un importante agente causante de gastroenteritis epidémica. Incluso otra familia viral deseable para su uso en la objetivación de antígenos para inducir respuestas inmunes en humanos y animales no humanos, es la familia togavirus, que incluye los géneros alfavirus, los cuales incluyen los virus de Sindbis, virus de RossRiver y de encefalitis Venezuelan, Eastern & Western Equine, y rubivirus incluyendo el virus de la Rubeola. La familia flaviviridae incluye los virus del dengue, de la fiebre amarilla, de la encefalitis japonesa, de la encefalitis de St. Louis y de la encefalitis transmitida por garrapatas. Otros antígenos objetivo pueden ser generados a partir de la Hepatitis C o de la familia coronavirus, que incluye una cantidad de virus no humanos tales como el virus de la bronquitis infecciosa (aves de corral), el virus de la gastroenteritis transmisible porcina (cerdo), el virus de la encefalomielitis de hemaglutinina porcina (cerdo), el virus de la peritonitis infecciosa felina (gato), el coronavirus entérico felino (gato), el coronavirus canino (perro) y los coronavirus respiratorios humanos, los cuales pueden causar el resfriado común y/o la hepatitis no-A, B o C, y que incluyen la supuesta causa del síndrome respiratorio agudo repentino (SARS). Dentro de la familia coronavirus, los antígenos objetivo incluyen el E1 (también denominado proteína M o matriz), E2 (también denominado proteína S o de Spike), E3 (también denominado HE o hemaglutina-elterosa), glicoproteína (no presente en todos los coronavirus), o N (nucleocápside). Otros antígenos más pueden ser objetivados contra la familia arterivirus y la familia rhabdovirus. La familia rhabdovirus incluye los géneros vesiculovirus (por ejemplo, el Virus de la Estomatitis Vesicular), y los géneros lisavirus (por ejemplo, las rabias). Dentro de la familia rhabdovirus, los antígenos adecuados pueden ser derivados de la proteína G o de la proteína N. La familia filoviridae, la cual incluye virus de la fiebre hemorrágica tales como el virus de Marburg y el Ébola, puede ser una fuente adecuada de antígenos. La familia paramixovirus incluye el virus de la parainfluenza Tipo 1, el virus de la parainfluenza Tipo 3, el virus de la parainfluenza bovina Tipo 3, rubulavirus (virus de las paperas), virus de la parainfluenza Tipo 2, virus de la parainfluenza Tipo 4, virus de la enfermedad de Newcastle (pollos), peste bovina, morbilivirus, que incluye el sarampión y el moquillo canino, y neumovirus, que incluye el virus sincitial respiratorio. El virus de influenza está clasificado dentro de la familia ortomixovirus y es una fuente adecuada de antígeno (por ejemplo, la proteína HA, la proteína N1). La familia bunyavirus incluye los géneros bunyavirus (encefalitis de California, La Crosse), flebovirus

(Fiebre del Valle del Rift), hantavirus (el puremala es un virus de la fiebre de hemahagin), nairovirus (enfermedad de la oveja de Nairobi) y varios bungavirus no asignados. La familia arenavirus proporciona una fuente de antígenos contra virus LCM y de la fiebre de Lassa. Otra fuente de antígenos es la familia bomavirus. La familia reovirus incluye los géneros reovirus, rotavirus (que causa gastroenteritis aguda en niños), orbivirus, y cultivirus (fiebre de la garrapata de Colorado, Lebombo (humanos), encefalosis equina, lengua azul). La familia retrovirus incluye la subfamilia oncorivirinal que abarca tales enfermedades humanas y veterinarias como el virus de la leucemia felina, HTLVI y HTLVII, lentiviral (que incluye el VIH, virus de la inmunodeficiencia del simio, virus de la inmunodeficiencia felina, virus de la anemia infecciosa equina, y spumavirus).

Con respecto al VIH y al VIS, se han descrito muchos antígenos adecuados y que pueden ser fácilmente seleccionados. Ejemplos de antígenos de VIH y de VIS adecuados incluyen, sin limitación, las proteínas gag, pol, Vif, Vpx, VPR, Env, Tat y Rev, así como varios fragmentos de las mismas. Por ejemplo, fragmentos adecuados de la proteína envolvente (env) incluyen, por ejemplo, gp41, gp140 y gp120. Adicionalmente, se han descrito una diversidad de modificaciones a estos y otros antígenos de VIH y VIS. Antígenos adecuados para este propósito son conocidos por los expertos en la materia. Por ejemplo, se puede seleccionar una secuencia que codifique la gag, pol, Vif y Vpr, Env, Tat y Rev, entre otras proteínas. Véase, por ejemplo, la proteína gag modificada que se describe en la Patente US 5.972.596. Véase también las proteínas de VIH y VIS descritas por D.H. Barouch et al., J. Virol., 75(5); 2462-2467 (Marzo de 2001), y R.R. Amara, et al., Science, 292: 69-74 (6 de Abril de 2001). Estas proteínas o subunidades de las mismas pueden ser suministradas solas o en combinación por medio de vectores separados o desde un único vector.

La familia papovavirus incluye la subfamilia poliomavirus (virus BKU y JCU) y la subfamilia papilomavirus (asociada con cánceres o progresión maligna de papiloma). La familia adenovirus incluye virus (EX, AD7, ARD, O.B.) que causan enfermedad respiratoria y/o enteritis. La familia parvovirus incluye parvovirus felino (enteritis felina), panleucopeniavirus felino, parvovirus canino y parvovirus porcino. La familia herpesvirus incluye la subfamilia alfaherpesvirinae, la cual abarca los géneros simplexvirus (VHSI, VHSII), varicelovirus (seudo-rabias, varicela zóster) y la subfamilia betaherpesvirinae, la cual incluye los géneros citomegalovirus (HCMV, muromegalovirus) y la subfamilia gammaherpesvirinae, la cual incluye los géneros linfocriptovirus, EBV (linfoma de Burkitts), herpesvirus humano 6A, 6B y 7, herpesvirus asociado a sarcoma de Kaposi y herpesvirus de cercopitecina (virus B), rinotraqueitis infecciosa, virus de la enfermedad de Marek, y radinovirus. La familia poxvirus incluye la subfamilia cordopoxvirinae, la cual abarca los géneros ortopoxvirus (Variola mayor (Viruela) y Vaccinia (Viruela vacuna)), parapoxvirus, avipoxvirus, capripaxvirus, leporipoxvirus, suipoxvirus y la subfamilia entomopoxvirinae. La familia hepadnavirus incluye el virus de la Hepatitis B. Un virus no clasificado que puede ser una fuente adecuada de antígenos es el virus de la Hepatitis delta, el virus de la Hepatitis E, y los priones. Otro virus que constituye una fuente de antígenos es el Virus Nipan. Incluso otras fuentes virales adicionales pueden incluir el virus de la enfermedad bursal infecciosa aviar y el virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino. La familia alfavirus incluye el virus de la arteritis equina y varios virus de Encefalitis.

La presente invención puede abarcar también vectores que incorporan inmunógenos que son útiles para inmunizar a un humano frente a otros patógenos que incluyen bacterias, hongos, microorganismos parásitos o parásitos multicelulares que infectan vertebrados humanos y no humanos, o procedentes de una célula cancerígena o una célula tumoral. Ejemplos de patógenos bacterianos incluyen los cocos patogénicos gram-positivos que incluyen neumococos, estafilococos (y las toxinas producidas por los mismos, por ejemplo la enterotoxina B), y estreptococos. Los cocos patogénicos gram-negativos incluyen el meningococus, gonococus. Los bacilos patogénicos entéricos gram-negativos incluyen enterobactiaceae; seudomonas, acinetobacterias y eikenella; melioidosis, salmonella; shigella; hemófilos; moraxella; H. ducreyi (que provoca cancroide); especies de brucella (brucelosis); Francisella tularensis (que provoca tularemia); Yersinia pestis (plaga) y otra yersinia (pasteurella); streptobacillus moniliformis y espirilio; los bacilos gram-positivos incluyen listeria monocitogenes; erisipelotrix rhusiopathiae; Corynebacterium diphteria (difteria); cólera; B. anthacis (ántrax); donovanosis (granuloma inguinal); y bartonellosis. Las enfermedades causadas por bacterias patogénicas anaeróbicas incluyen el tétanos; botulismo (Clostridium botullinum y su toxina); Clostridium perfringens y su toxina épsilon; otra clostridia; tuberculosis; lepra, y otras micobacterias. Las enfermedades espiroquetales patogénicas incluyen la sífilis; trepanomatosis; la sífilis pián, pinta y endémica; y la leptoespirosis. Otras infecciones causadas por bacterias patógenas mayores y por hongos patogénicos incluyen muermo (Burkholderia mallei); actinomicosis; nocardiosis; criptococosis; blastomicosis; histoplasmosis y coccidioidomicosis; candidiasis, aspergilosis y mucormicosis; esporotricosis; paracoccidiodomicosis, petrielidiosis, torulopsosis, micetoma y cromomicosis; y dermatofitosis. Las infecciones de Rickettsia incluyen la fiebre del tifus, la fiebre maculosa de las Montañas Rocosas, la fiebre Q (Coxiellaburnetti), y rickettsiosis pustulosa. Ejemplos de infecciones de micoplasma y clamidiales incluyen: micoplasma penuamoniae; linfogranuloma venereum; psitacosis; e infecciones clamidiales perinatales. Los eucariotas patogénicos abarcan protozoos patogénicos y helmintos y las infecciones producidas por los mismos incluyen: amebiasis; malaria; leismaniasis; tripanosomiasis; toxoplasmosis; Pneumocystis carinii; Trichans; Toxoplasma gondii; babesiosis; giardiasis; triquinosis; filariasis; esquistosomiasis; nematodos; trematodos o platijas; e infecciones por cestodo (tenia).

Muchos de estos organismos y/o las toxinas producidas por los mismos han sido identificados por los Centros para el Control de Enfermedades [(CDC), Departamento de Sanidad y Servicios Humanos, USA] como agentes que tienen potencial para su uso en ataques biológicos. Por ejemplo, algunos de estos agentes biológicos incluyen

Bacillus anthracis (ántrax), Clostridium botulinum y sus toxinas (botulismo), Yersinia pestis (plaga), varicela mayor (varicela), Francisella tularensis (tularemia), y fiebres hemorrágicas virales [filovirus (por ejemplo, Ébola, Marburg], y arenavirus [por ejemplo, Lassa, Machupo]), todos los cuales están clasificados en la actualidad como agentes de Categoría A; Coxiella burnetti (fiebre Q); especies Brucella (brucelosis), Burkholderia mallei (muermo), Burkholderia pseudomallei (meloidosis), Ricinus communis y sus toxinas (toxina ricina), Clostridium perfringens y su toxina (toxina épsilon), especie Staphylococcus y sus toxinas (enterotoxina B), Chlamidia psittaci (psitacosis), amenazas de seguridad del agua (por ejemplo, Vibrio cholerae, Chritosporidium parvum), fiebre del tifus (Rickettsia powazekii), y encefalitis viral (alfavirus, por ejemplo encefalitis equina de Venezuela; encefalitis equina Eastern; encefalitis equina Western); todos los cuales están actualmente clasificados como agentes de Categoría B; y virus Nipan y hantavirus, los cuales están actualmente clasificados como agentes de categoría C. Adicionalmente, otros organismos que están clasificados de ese modo o clasificados de forma diferente, pueden ser identificados y/o usados para tal propósito en el futuro. Se comprenderá fácilmente que los vectores virales y otras construcciones descritas en la presente memoria son útiles para suministrar antígenos procedentes de estos organismos, virus, sus toxinas u otros subproductos, que impidan y/o traten infección u otras reacciones adversas con estos agentes biológicos.

La administración de los vectores de la invención para suministrar inmunógenos contra la región variable de los células T provoca una respuesta inmune que incluye CTLs para eliminar esas células T. En artritis reumatoide (RA) han sido caracterizadas varias regiones variables específicas de TCRs que están involucradas en la enfermedad. Estos TCRs incluyen V-3, V-14, V-17 y V-17. Así, el suministro de una secuencia de ácido nucleico que codifique al menos uno de estos polipéptidos provocará una respuesta inmune que tendrá como objetivo células T involucradas en RA. En esclerosis múltiple (MS), varias regiones variables específicas de TCRs que están involucradas en la enfermedad han sido caracterizadas. Estas TCRs incluyen V-7 y V-10. Así, el suministro de una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos uno de estos polipéptidos provocará una respuesta inmune que tendrá como objetivo células T involucradas en MS. En escleroderma, varias regiones variables específicas de TCRs que están involucradas en la enfermedad han sido caracterizadas. Estos TCRs incluyen V-6, V-8, V-14 y V-16, V-3C, V-7, V14, V-15, V-16, V-28 y V-12. Así, el suministro de una molécula de ácido nucleico que codifique al menos uno de estos polipéptidos provocará una respuesta inmune que tendrá como objetivo células T involucradas en escleroderma.

De ese modo, el vector viral recombinante derivado de rAAV de la invención proporciona un vehículo eficiente de transferencia de gen que puede suministrar un transgén seleccionado a una célula anfitrión seleccionada in vivo o ex vivo incluso cuando el organismo tenga anticuerpos neutralizantes respecto a una o más fuentes de AAV. En una realización, el rAAV y las células se mezclan ex vivo; las células infectadas se cultivan usando metodologías convencionales, y las células transducidas son re-infundidas en el paciente.

Estas composiciones son particularmente adecuadas para suministro de gen con fines terapéuticos y a efectos de inmunización, incluyendo inducción de inmunidad protectora. El AAV de la presente invención y las composiciones que lo contienen pueden ser usados también en regímenes de inmunización tales como los descritos en la solicitud de Patente US en co-propiedad núm. 60/565936, depositada el 28 de Abril de 2004 relativa a “Adenovirus secuencial y suministro mediado por AAV de moléculas inmunogénicas”.

Además, las composiciones de la invención pueden ser también usadas para la producción de un producto de gen deseado in vitro. Para producción in vitro, un producto deseado (por ejemplo, una proteína) puede ser contenida a partir de un cultivo deseado a continuación de la transfección de células anfitrión con un rAAV que contenga la molécula que codifica el producto deseado y cultivando el cultivo celular bajo condiciones que permitan expresión. El producto expresado puede ser a continuación purificado y aislado, según se desee. Técnicas adecuadas para transfección, cultivo celular, purificación y aislamiento, son conocidas por los expertos en la materia.

Los ejemplos que siguen ilustran varios aspectos y realizaciones de la invención y del método de singletón en general.

Ejemplo 1

De acuerdo con el método descrito en lo que antecede, se han identificado secuencias de AAV como poseedoras de singletones, cuando se disponen en alineamiento con una librería de secuencias que contienen representantes de cada uno de los clados A, B, C, D, E y F (representados por AAV9). La tabla que sigue ilustra las secuencias de cápside y el singletón que van a ser alterados respecto a una secuencia conservada. Para determinadas mutaciones, el singletón va seguido por un * y después por el residuo de aminoácido que lo sustituye. Para otras mutaciones, el singletón va seguido por su posición de aminoácido y por el residuo que lo reemplaza.

La numeración de aminoácido se basa en las secuencias publicadas para cada uno de esas cápsides de AAV. Véase, por ejemplo, G. Gao, et al., J. Virol., 78(12): 6381-6388 (Junio 2004) y publicación de Patente Internacional núm. WO 2004/042397 [todas las secuencias de la misma depositadas en GenBank], y la publicación de Patente Internacional núm. WO 2005/033321, depositada el 30 de Septiembre de 2004.

Por ejemplo, con referencia a la tabla que sigue, las nomenclaturas deberán ser leídas como sigue. Cy5R1 se refiere a la secuencia de aminoácido de SEQ ID Núm. 24, que ha sido modificada para que contenga un ácido aspártico (D) en la posición 13 de residuo de aminoácido; cy5 tiene una glicina en su secuencia de aminoácido nativo en el residuo núm. 13. Cy5R2 se refiere a la secuencia de aminoácido de SEQ ID Núm. 24, la cual ha sido modificada

para que contenga un ácido aspártico en la posición 13 de aminoácido (glicina en la secuencia nativa y una asparagina en la posición 403 de residuo de aminoácido (ácido aspártico en la secuencia nativa). Cy5R3 tiene la secuencia de aminoácido de SEQ ID Núm. 24, la cual ha sido modificada para que tenga las mismas modificaciones que la Cy5R2 y, adicionalmente, una lisina en la posición 158 (una asparagina de forma nativa) y una glutamina en la posición 161 (una prolina de forma nativa). Dada esta información, un experto en la materia estará fácilmente capacitado para determinar las otras modificaciones de singletón que se mencionan en la tabla que sigue.

Nombre

SEQ ID Núm. (AAV Dominante) Sitios Mutados Clado

cy5

24

Cy5R1

G13D D

Cy5R2

G13D D403N D

Cy5R3

G13D D403N R51K D

Cy5R4

G13D D403N R51K N158K + P161Q D

Rh. 13

26 D

Rh. 13R

E538K D

Rh37

40 D

Rh37R2

E634K T297M D

Rh.2

39 E

rh2R

V6511 E

Rh.8

41

rh.8R

D531E

Rh.48

44

Rh.48.1

K217E B

Rh.48.2

S304N B

Rh.48.1.2

K217E S304N B

Nombre

SEQ ID Núm. (AAV Dominante) Sitios Mutados Clado

Hu.44

45 A

Hu.44R1

E1337K A

Hu.44R2

E137K P446L A

Hu.44R3

E137K P446L G609D A

Rh32/33

2

Hu. 29

42 B

Hu.29R

G396E B

Ch.5

46

Ch.5R1

T611I

rh.67

47 D

rh.58

48 S653N E

Rh.64

43 E

Rh64R1

R697W E

Rh64R2

R697W V686E E

AAV6

29 A

AAV6.2

F129L

AAV6.1

K531E A

AAV6.12

F129L K531E A

rh.54

49 V404M D

hu.48

50 A

hu.48R1

G277S A

hu.48R2

G277S E322K A

hu.48R3

G277S E322K S552N

Ejemplo 2

En un estudio preliminar, se seleccionaron cinco clones para comprobar el método de singletón de la invención. La tabla que aparece a continuación proporciona la descripción de fenotipo de los 5 clones. El número de singletones pronosticado se proporciona con la clasificación de clado y serotipo.

El fenotipo de empaquetamiento se considera insuficiente cuando su título es menor que 1 x 1011 GC, bajo cuando es inferior a 1 x 1012 GC, bueno cuando es inferior a 1 x 1013, y excelente cuando es más alto.

Los fenotipos de transferencia de gen fueron establecidos mediante expresión de gen de CB.A1AT e indicados como sigue: “+++” mejor que el principal candidato para tejido objetivo, “++”, “+” y “-“ respectivamente mejor que el 50%, entre 10 – 50% o menor que un 10% de niveles de suero de A1AT de candidatos principales (músculo: AAV1, hígado: AAV8, Pulmón: AAV9). “n/a” indicaba que el vector no podía ser producido a niveles suficientes para estudios de transferencia de gen in vivo.

La clonación de correcciones de singletón fue como sigue. A partir del plásmido de empaquetamiento original, se realizó mutagénesis dirigida al sitio. A continuación de ello, se ensayó integridad de estructura de vector mediante digestión Pstl y se confirmó la corrección del singletón mediante secuenciación. El vector de expresión de EGFP fue producido a continuación por triplicado sobre un formato de 12 pocillos lado con lado con el vector que contiene el singletón dominante, control positivo de AAV2 y AAV2/8 y una producción sin presencia de plásmido de empaquetamiento como control negativo. Un volumen igual de lisato recolectado después de congelación 3x, fue incubado sobre células 293. Se monitorizó expresión de eGFP mediante citometría de flujo 72 horas después de la transducción.

Se llevó a cabo la mutagénesis dirigida al sitio de los residuos de singletón en clones rh.37, rh.2, ch.5, rh.13 y rh.8. Estas secuencias particulares fueron seleccionadas para representar una diversidad de fenotipos que fueron previamente documentados.

Clon

Empaquetamiento Fenotipo de transferencia de gen # Singletón Clado (serotipo)

Fenotipo

Pulmón Hígado Músculo

rh.37

Insuficiente n/a n/a n/a 2 D (AAVT)

rh.2

Bajo ++ + +++ 1 E (AAV8)

ch.5

Bueno - - - 1 Ch.5

rh.13

Excelente + + + 1 D (AAVT)

rh.8

Bueno - + ++ 1 Rh.8

Se observó un incremento de la expresión del vector para 4 de cada 5 clones. El incremento fue más dramático para el rh.37 y el rh.2, vectores que mostraron previamente tener una baja producción de empaquetamiento. Para esos vectores, las partículas productivas fueron producidas a niveles suficientes para la detección. Los vectores rh.8 y rh.13 mostraron un incremento de transducción.

Con el fin de distinguir los efectos de la mutación de singletón sobre la transducción frente a empaquetamiento y ensamblaje, se realizaron preparaciones de vector a pequeña escala y se titularon respecto a partículas resistentes Dnasa mediante PCR cuantitativo. Para el rh.37, se observó un incremento de dos veces en la producción de vector. El rh.8 mostró un incremento moderado de 5 veces en el título mientras que el rh.13 lo hizo igualmente. Todos los títulos de clones corregidos en singletón estuvieron dentro de una gama aceptable en comparación con la producción de AAV2 y de AAV22/8 y cuando fueron extrapolados a preparaciones a gran escala. El rh.2 no fue ensayado en cuanto a titulación.

A continuación, se monitorizó in vitro el efecto del cambio de singletón en una estructura de transducción con igual número de partículas por célula. Se llevó a cabo una titulación sobre células 293 para rh.8 y rh.13. Se describió un incremento moderado de eficacia de transducción en todos los MOIs.

A partir de este subconjunto inicial de 5 clones, fueron transducidas 3 células de forma productiva. Dos clones fueron incapaces de producir alguna expresión de eGFP en esta estructura. Lo más probable es que esto se deba a un defecto en el empaquetamiento del vector que podría no estar pronosticado por la alternativa de singletón.

El método fue utilizado para corregir cuatro posiciones de singletón pronosticadas en el clon de AAV hu.46, P156S R362C S393F A676. Sin embargo, estas modificaciones no dieron como resultado un AAV que pudiera ser rescatado, lo que indica otro tipo de error fatal en la secuencia del hu.46.

Ejemplo 3 – Análisis in vitro de vectores virales con cápsides alteradas

Usando los métodos descritos en lo que antecede, se alteraron las proteínas de cápside del rh.64 y del hu.29, y a continuación se usaron para construir vectores virales con las cápsides alteradas usando seudotipado según se ha descrito en el Ejemplo 2 y en G. Gao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 11854-9 (3 de Septiembre de 2002).

De forma resumida, los vectores que expresan proteína fluorescente verde potenciada (EGFP) fueron usados para examinar eficiencia de transducción in vitro de los vectores en células de riñón endoteliales humanas (células 293). Estas células 293 fueron incubadas en presencia de 104 GC/célela en partículas de AAVCMVeGFP seudotipadas después de una corta pre-incubación con wtAd5. El número de células positivas de eGFP por 10.000 células en total fue medido mediante análisis FACS con un límite de detección de 5 células/10K.

La modificación de la cápside de Rh.64 proporcionó partículas de rh.64 modificadas que eran sobre 100 veces más eficientes después de un cambio de R697W. Una mutación de V686E posterior produjo un incremento de 2 veces la capacidad de empaquetamiento.

La modificación de la cápside de Hu.29 produjo viriones modificados de rh.64 que fueron rescatados de una capacidad de empaquetamiento deficiente cambiando G396E. SE observó un incremento mayor de 1000 veces en la producción.

Muchos de los más de 20 viriones de AAV modificados que mostraron mejoras de expresión incluyen AAV6.1, hu.48R1, hu.48R2, hu.44R2, hu.44R3, rh.48.2, rh.48.2.1.

Ejemplo 4 – Efecto de singletón en aplicaciones de transferencia de gen in vivo

Los efectos de los mutantes del singletón fueron estudiados en una estructura in vivo. Los estudios de transferencia de gen sobre ratones C57B/6 han sido iniciados sobre un número de vectores modificados de acuerdo con el método de la invención. Los estudios dirigidos y los estudios dirigidos al hígado fueron iniciados y tomados como punto de referencia frente a los candidatos principales actuales para la aplicación particular.

Se seleccionó α-antitripsina (A1AT) humana como gen informador sensible y cuantitativo en los vectores y se expresó bajo el control de promotor de -actina de pollo potenciada en CMV. El empleo de promotor de CB permite que se consigan altos niveles de transferencia de gen de A1AT no específico del tejido y constitutivo, y también permite el uso de la misma preparación de vector para estudios de transferencia de gen en cualquier tejido de interés.

El músculo fue elegido como un primer tejido objetivo. 40 vectores nuevos diferentes (basados en 24 clones diferentes cada uno con su(s) respectivo(s) mutante(s) de singletón) fueron inyectados intramuscularmente en una extremidad posterior de ratón C57B/6. Todos los experimentos fueron realizados con 1 x 1011 GC/animal con una casete de transgén CB.A1At. Los vectores fueron cada vez alicuotados a un mismo volumen (50 µl) por ratón y grupo por clado. Cada estudio individual comprendía uno o dos clados con grupos de control que incluían el serotipo representativo, AAV22/8 y AAV22/1 que sirvió como punto de referencia para transferencia de gen objetivada en el músculo. La expresión de gen fue detectada en el día 7, 14, 28 y 63 post inyección y evaluada mediante un hA1AT ELISA específico.

Para varios aislados y versiones corregidas de singletón, se generaron datos sobre su comportamiento tras la infusión intraportal dirigida al hígado. Los resultados preliminares muestran que la mayoría de los clones corregidos se comportan igual o mejor que el aislado original.

Para un clon particular, en especial el cy.5, la corrección de singletón parece tener un efecto beneficioso sobre la transducción del músculo. El clon cy.5R4 portador de 4 correcciones de singletón mejoró la eficiencia de transferencia de gen sobre un tropismo muscular ya decente presentado por el aislado original. El rendimiento del cy.5R4 es igual, o ligeramente mejor, que los controles AAV2/1 y AAV2/7 tomados como referencia.

Un aislado que había producido previamente títulos demasiado bajos para su evaluación adicional, el rh.64, se comportó excepcionalmente bien en el músculo tras la corrección de un singletón. El rh.64R1 se comportó mejor que el rh64.2 y dio niveles de hA1AT más altos que los conseguidos por su serotipo AAV2/8 relativo más cercano, así como también que el AAV2/7.

En otros estudios, los ratones fueron inyectados con vector por grupos basados en los clados. Se dosificó 1 x 1011 GC/ratón con vector que expresa CB.hA1AT. Se midieron los niveles de suero de hA1AT mediante hA1AT específico ELISA.

Los efectos de singletón sobre transferencia de gen in vivo parecen ser dependientes del tejido aislado y del objetivo. Se realizaron varias observaciones interesantes.

Para ciertos clones de singletón, los efectos son cuantitativamente similares en el músculo y en el hígado (por ejemplo, rh.2, rh.13 o cy.5). Los aislados hu.48 y rh.48 muestran una expresión incrementada en el músculo con un número incrementado de singletones revertidos.

Otros clones como el rh.64 y el AAV6 muestran un perfil de expresión particular. El aislado hu.48R2, por ejemplo, es

alrededor de 10 veces menos eficiente en cuanto a empaquetamiento cuando se compara con el hu.48R3, pero este último es alrededor de 5 veces menos eficiente para transducir músculo. El AAV6 contiene dos singletones. Ambos tienen efectos moderados sobre el empaquetamiento, y combinados llevan el empaquetamiento de AAV6 hasta el nivel del punto de referencia. In vitro, se observa una diferencia apreciable entre el clon dominante y los diferentes clones. In vivo, en el músculo, el AAV6.1 y el AAV6.1.2 muestran transferencia de gen reducida mientras que el AAV6.2 muestra un incremento moderado.

Ejemplo 5 – Evaluación de AAV corregido en singletón en el pulmón y en el hígado

Los vectores de AAV optimizados para eficiencia de empaquetamiento y transferencia de gen mediante la reversión de residuos de singletón fueron evaluados adicionalmente en el pulmón y el hígado. Se presentan los datos para ambos vectores que fueron identificados como no contenedores de singletón o para los que los residuos de singletón fueron convertidos en el aminoácido conservado.

A. Evaluación de transferencia de gen CB.A1AT de AAV al pulmón tras inyección intratraqueal mediada por pi2, rh32.33, AAV2/9, AAV2/5, rh.2R, ch5R

Se compararon varías cápsides de AAV en cuanto a su capacidad para objetivar el pulmón. Se midieron los niveles de hA1AT en suero. Los AAVs evaluados están libres de singletón (pi2, rh32.33, AAV2/9, AAV2/5, rh.2R, ch5R) o bien contienen un residuo de singletón (rh.2, rh.8). El AAV2/5 y el AAV2/9 están representados como puntos de referencia.

Los estudios de transferencia de gen fueron realizados en ratones C57B/6 (machos, 5 por grupo) usando los vectores que portan ya sea la casete de expresión de CB.A1AT (es decir, ITR 5’ de AAV2, promotor de -actina (CB) de pollo, α1-antitripsina (A1AT) humana, ITR 3’ de AAV2) o ya sea la casete de expresión de CB.nLacZ (es decir, ITR 5’ de AAV2, -galactosidasa localizada nuclear (nLacZ), ITR 3’ de AAV2) en las cápsides descritas con anterioridad. De forma resumida, 50 µl de estos vectores corregidos en singletón o libres de singletón fueron coinstilados (1 x 1011 copias de genoma (GC)) intratraquealmente con los vectores portadores de la A1AT y los vectores portadores de la nLacZ (1 x 1011 GC).

En los días 12 y 20, se tomaron 20 sangrías y se midieron los niveles de suero de la A1AT (ng AAT/ml suero). Los datos mostraron un drástico incremento de expresión de α1-antitripsina humana en el pulmón para rh.2 a rh.2R tras la inyección intratraqueal (IT) de 1 x 1011 GC. Además, se evaluaron una diversidad de vectores de AAV que están libres de singletón. Todos los vectores mostraron niveles aceptables de expresión en el pulmón.

B. Evaluación de vectores singletón de AAV6 en comparación con el AAV2/5 y AAV2/9

Se evaluaron clones corregidos en singletón de AAV6. Se preparó AAV6 modificado (AAV6.2) usando el método de corrección de singletón de la invención y las técnicas de seudotipado descritas en la presente memoria. Las partículas de AAV6.2 portadoras de casetes de expresión de A1AT y de LacZ, preparadas según se ha descrito en el Ejemplo 5, fueron co-inyectadas intranasalmente (1 x 1011 GC) e intratraquealmente. Se evaluó la expresión de AAT mediante ELISA en suero y en líquido alveolar bronquial (BAL). Los niveles de expresión fueron normalizados en cuanto a proteína total. Se midió expresión de LacZ mediante ELISA para la -galactosidasa del homogenato del pulmón. La necropsia se llevó a cabo en el día 21.

Estos vectores fueron comparados con AAV2/6, un candidato clínico normal para transferencia de gen del pulmón, con AAV2/5 y con AAV2/9 en un estudio que incluía ratones C57 B1/6 (machos, n = 8/grupo).

El AAV6.2 presentó estadísticamente una mejora significativa sobre el AAV6 en cuanto a excreción de A1AT de suero. El AAV6.2 mostró también niveles más altos de A1AT en comparación con los otros vectores, incluyendo el AAV2/9 y el AAV2/5. Se observó una ligera mejora en cuanto a BAL, así como en cuanto a expresión de LacZ en homogenato de pulmón. Sin embargo, debido a grandes variaciones de animal a animal, no se pudieron extraer conclusiones a partir de la cuantificación de LacZ.

Cuando se evaluó la localización de expresión de gen de AAV, se observó una tinción superior para la LacZ localizada nuclear en el grupo AAV2/6.2 en comparación con el AAV2/6. Existió una importante mejora sobre AAV2/6 y AAV2/5 en cuanto a epitelio de vía respiratoria de pulmón, el objetivo principal para enfermedades tales como la fibrosis quística.

C. Inyección intraportal (iv) de AAV.CB.A1AT (1 x 1011 GC) en ratones C57B1/6 con miembros de AAV de clado B y clado C

Todos los vectores usados están exentos de residuos de singletón ya sea a partir de aislamiento (AAV2/8, AAV2, hu.13, hu.51, hu.11, hu.53) o por mutación (hu.29R). Todos los vectores se compararon con el AAV2/8 (clado E) como punto de referencia.

D. Inyección intravenosa de miembros de AAV de clado E. El rh.64R1, el rh.64R2 y el rh.2R están optimizados en cuanto a singletón. Todos los otros vectores están libres de singletón

5 10

La expresión desde miembros de clado B y de clado C de AAV se encontró similar a equivalente para todos los miembros que incluían hu.29R, un clon optimizado en cuanto a singletón. Este clon particular fue reconstituido en cuanto a capacidad de empaquetamiento a partir de hu.29 y ahora presenta funcionalidad similar de transferencia de gen a otros miembros de la familia de virus. Para los vectores de clado E evaluados, todos los vectores que están o bien libres naturalmente de singletón o bien corregidos en cuanto a residuos de singletón actúan en una gama similar a la del mejor actor para transferencia de gen dirigida al hígado, el AAV2/8. En particular, se encontró que el rh64R1 y el rh.64R2 de AAV son los de interés. El rh.64, que se encontró que era defectuoso en cuanto a empaquetamiento, se comporta ahora igualmente bien en cuanto a transferencia de gen dirigida al hígado tras la conversión de uno (rh.64R1) o dos (rh.64R2) singletones. Para el rh.2 la corrección de singletón corresponde a un incremento dramático de más de 10 veces el suministro de gen. Mientras que la invención ha sido descrita con referencia a realizaciones particularmente preferidas, se apreciará que pueden hacerse modificaciones dentro del alcance de las reivindicaciones anexas.

15

20

25

30

35

Listado de secuencias

<110> Los Fiduciarios de la Universidad de Pennsylvania

<120> Método de incremento de la función de un vector de AAV

<130> RT/12093/4/5/6/7 5 <150> EP 06749685.1

<151>

<150> PCT/US2006/013375

<151>

<150> US 60/669.083 10 <151>

<150> US 60/733.497

<151>

<160> 50

<170> Patentin versión 3.3 15 <210> 1

<211> 738

<212> PRT

<213> virus adeno-asociado de rhesus, rh.20

<400> 1

<210> 2

<211> 733

<212> PRT

<213> clon 32/33 de virus adeno-asociado de Rhesus

<400> 2

<210> 3

<211> 738

<212> PRT

<213> cápside de clon 39 de virus adeno-asociado de Rhesus

<400> 3

<210> 4

<211> 738

<212> PRT

<213> proteína de cápside de clon 46 de virus adeno-asociado de Rhesus

<400> 4

<210> 5

<211> 738

<212> PRT

<213> cápside de clon 73 de virus adeno-asociado de Rhesus

<400> 5

<210> 6

<211> 736

<212> PRT

<213> cápside de clon 74 de virus adeno-asociado de Rhesus

<400> 6

<210> 7

<211> 2208

<212> ADN

<213> serotipo 2 de virus adeno-asociado

<400> 7

<210> 8

<211> 2187

<212> ADN

<213> ácido nucleico de cy.5

<400> 8

<210> 9

<211> 2217

<212> ADN

<213> virus adeno-asociado de Rhesus, rh.10

<400> 9

<210> 10

<211> 2187

<212> ADN

<213> virus adeno-asociado de Rhesus, rh.13

<400> 10

<210>11

<211> 2211

<212> ADN

<213> serotipo 1 de virus adeno-asociado

<400> 11

<210> 12

<211> 2211

<212> ADN

<213> serotipo 3 de virus adeno-asociado

<400> 12

<210> 13

<211> 2208

<212> ADN

<213> serotipo 6 de virus adeno-asociado

<400> 13

<210> 14

<211> 2214

<212> ADN

<213> serotipo 7 de virus adeno-asociado

<400> 14

<210> 15

<211> 2217

<212> ADN

<213> serotipo 8 de virus adeno-asociado

<400> 15

<210> 16

<211> 2208

<212> ADN

<213> virus adeno-asociado, hu.13

<400> 16

<210> 17

<211> 2208

<212> ADN

<213> virus adeno-asociado, hu.26

<400> 17

<210> 18

<211> 2217

<212> ADN

<213> virus adeno-asociado, hu.37

<400> 18

<210> 19

<211> 2205

<212> ADN

<213> virus adeno-asociado, hu.53

<400> 19

<210> 20

<211> 2217

<212> ADN

<213> virus adeno-asociado de Rhesus, rh.39

<400> 20 <210> 21

<211> 2211

<212> ADN

<213> virus adeno-asociado de Rhesus, rh.43

<400> 21

<210> 22

<211> 2217

<212> ADN

<213> virus adeno-asociado de Rhesus, rh.46

<400> 22 <210> 23

<211> 735

<212> PRT

<213> proteína de cápside de serotipo 2 de virus adeno-asociado

<400> 23

<210> 24

<211> 728

<212> PRT

<213> proteína de cápside de cy.5

<400> 24

<210> 25

<211> 738

<212> PRT

<213> proteína de cápside de virus adeno-asociado de Rhesus, rh.10

<400> 25

<210> 26

<211> 728

<212> PRT

<213> proteína de cápside de virus adeno-asociado de Rhesus, rh.13

<400> 26

<210> 27

<211> 738

<212> PRT

<213> proteína de cápside de serotipo 1 de virus adeno-asociado

<400> 27

<210> 28

<211> 736

<212> PRT

<213> proteína de cápside de serotipo 3 de virus adeno-asociado

<400> 28

<210> 29

<211> 736

<212> PRT

<213> proteína de cápside de serotipo 6 de virus adeno-asociado

<400> 29

<210> 30

<211> 737

<212> PRT

<213> proteína de cápside de serotipo 7 de virus adeno-asociado

<400> 30

<210> 31

<211> 738

<212> PRT

<213> proteína de cápside de serotipo 8 de virus adeno-asociado

<400> 31

<210> 32

<211> 735

<212> PRT

<213> proteína de cápside de virus adeno-asociado, hu.13

<400> 32

<210> 33

<211> 735

<212> PRT

<213> proteína de cápside de virus adeno-asociado, hu.26

<400> 33

<210> 34

<211> 738

<212> PRT

<213> proteína de cápside de virus adeno-asociado, hu.37

<400> 34

<210> 35

<211> 734

<212> PRT

<213> proteína de cápside de virus adeno-asociado, hu.53

<400> 35

<210> 36

<211> 738

<212> PRT

<213> proteína de cápside de virus adeno-asociado de Rhesus, rh.39

<400> 36

<210> 37

<211> 736

<212> PRT

<213> proteína de cápside de virus adeno-asociado de Rhesus, rh.43

<400> 37

<210> 38

<211> 738

<212> PRT

<213> proteína de cápside de virus adeno-asociado de Rhesus, rh.46

<400> 38

<210> 39

<211> 738

<212> PRT

<213> proteína de cápside de virus adeno-asociado de Rhesus, rh.2

<400> 39

<210> 40

<211> 729

<212> PRT

<213> proteína de cápside de virus adeno-asociado de Rhesus, rh.37

<400> 40

<210> 41

<211> 736

<212> PRT

<213> proteína de cápside de virus adeno-asociado de Rhesus, rh.8

<400> 41

<210> 42

<211> 735

<212> PRT

<213> proteína de cápside de virus adeno-asociado, hu.29

<400> 42

<210> 43

<211> 738

<212> PRT

<213> proteína de cápside de virus adeno-asociado de Rhesus, rh.64

<400> 43

<210> 44

<211> 737

<212> PRT

<213> proteína de cápside de virus adeno-asociado de Rhesus, rh.48

<400> 44

<210> 45

<211> 736

<212> PRT

<213> proteína de cápside de virus adeno-asociado, hu.44

<400> 45

<210> 46

<211> 735

<212> PRT

<213> proteína de cápside de ch.5

<400> 46

<210> 47

<211> 737

<212> PRT

<213> proteína de cápside de virus adeno-asociado de Rhesus, rh.67

<400> 47

<210> 48

<211> 738

<212> PRT

<213> proteína de cápside de virus adeno-asociado de Rhesus, rh.56

<400> 48

<210> 49

<211> 737

<212> PRT

<213> proteína de cápside de virus adeno-asociado de Rhesus, rh.54

<400> 49

<210> 50

<211> 736

<212> PRT

<213> proteína de cápside de virus adeno-asociado, hu.48

<400> 50

Claims (7)

1. REIVINDICACIONES

   1.- Un vector de virus adeno-asociado (AAV) que tiene una cápside AAVrh48 (rh48.2) modificada, comprendiendo dicha cápside modificada la secuencia de aminoácido de SEQ ID Núm. 44, la cual ha sido modificada para que contenga una asparagina en la posición 304 de residuo de aminoácido, que de forma nativa es una serina.
2. 2.- El vector de AAV conforme a la reivindicación 1, en el que la cápside AARrh48 está además modificada para que contenga un ácido glutámico en la posición 217 de residuo de aminoácido de SEQ ID Núm. 44, que de forma nativa es una lisina.
3. 3.- El vector de AAV conforme a la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que dicho vector porta un transgén que codifica un producto de gen bajo el control de secuencias reguladoras que dirigen expresión del producto en una célula anfitrión.
4. 4.- Una composición que comprende un vector de AAV conforme a una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, y un portador fisiológicamente compatible.
5. 5.- Un vector de AAV conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o una composición conforme a la reivindicación 4, para su uso en el suministro de un producto de gen a un sujeto.
6. 6.- Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una cápside AAVrh48 modificada, que tiene la secuencia de aminoácido de SEQ ID Núm. 44, la cual ha sido modificada para que contenga una asparagina en la posición 304 de residuo de aminoácido, que es de forma nativa una serina.
7. 7.- La molécula de ácido nucleico conforme a la reivindicación 6, en la que la cápside AAVrh48 está además modificada para que contenga un ácido glutámico en la posición 217 de residuo de aminoácido de SEQ ID Núm. 44, que es de forma nativa una lisina.