ES2409032T3 - Formulaciones liofilizadas de vwf recombinante - Google Patents

Abstract

Formulación farmacéutica estable liofilizada de un factor von Willebrand recombinante (rVWF) que comprende: (a) un rVWF; (b) uno o más agentes tampón; (c) uno o más aminoácidos; (d) uno o más agentes estabilizantes; y (e) uno o más tensioactivos, preparándose dicha formulación mediante la liofilización de una solución que comprende: (a) dicho rVWF, comprendiendo un polipéptido seleccionado de entre el grupo consistente en: a) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº 3; b) un análogo, fragmento o variante de a) capaz de causar la aglutinación de las plaquetas estabilizadas en presencia de ristocetina o de unirse al Factor VIII; c) un polipéptido codificado por el nucleótido dee SEQ ID Nº 1; d) un análogo, fragmento o variante de c) capaz de causar la aglutinación de las plaquetas estabilizadas en presencia de ristocetina o de unirse al Factor VIII; y e) un polipéptido codificado por un nucleótido que se hibrida con el polinucleótido de SEq ID Nº 1 bajo condiciones de hibridación moderadamente restrictivas; (b) comprendiendo dicho tampón un agente tampón del pH en un rango de aproximadamente 0,1 mM y aproximadamente 500 mM y con un pH de aproximadamente 2,0 a aproximadamente 12,0; (c) estando presente dicho aminoácido a una concentración de aproximadamente 1 a aproximadamente 500 mM; (d) estando presente dicho agente estabilizante a una concentración de aproximadamente 0,1 a aproximadamente1.000 mM; y (e) estando presente dicho tensioactivo a una concentración de aproximadamente 0,01 g/l a 0,5 g/l.

Description

Formulaciones liofilizadas de VWF recombinante

CAMPO DE LA INVENCIÓN

En general, la invención se refiere a formulaciones de VWF recombinante liofilizadas y a métodos para obtener una composición liofilizada que comprende VWF recombinante.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El factor Von Willebrand (VWF) es una glicoproteína circulante del plasma en forma de una serie de multímeros cuyas dimensiones varían entre unos 500 y 20.000 kD. Las formas multiméricas de VWF están compuestas por subunidades de polipeptídicas de 250 kD unidas entre sí por enlaces disulfuro. El VWF media en la adhesión inicial de las plaquetas al subendotelio de la pared del vaso dañado. Tan sólo los multímeros de mayor tamaño presentan actividad hemostática. Se asume que las células endoteliales secretan formas poliméricas de VWF de gran tamaño y que aquellas formas del VWF que tienen un menor peso molecular (VWF de bajo peso molecular) proceden de la escisión proteolítica. Los multímeros de mayor masa molecular se almacenan en los cuerpos de Weibel-Pallade de las células endoteliales, liberándose bajo estimulación.

El VWF es sintetizado por las células endoteliales y megacariocitos como prepro-VWF, que en gran medida consiste en dominios repetidos. Al producirse la escisión del péptido de señal, el pro-VWF se dimeriza a través de enlaces disulfuro en su terminal-C. Los dímeros sirven como protómeros para la multimerización, que está controlada por los enlaces disulfuro existentes entre los terminales libres de los extremos. La formación de los multímeros va seguida de la eliminación proteolítica de la secuencia del propéptido (Leyte y col., Biochem. J. 274 (1991), 257-261).

El producto de traducción primario predicho a partir del ADNc (cDNA) clonado de VWF es un polipéptido precursor de 2.813 residuos (prepro-VWF). El prepro-VWF consiste en un péptido señal de 22 aminoácidos y un propéptido de 741 aminoácidos, comprendiendo el VWF maduro 2.050 aminoácidos (Ruggeri Z.A. y Ware J., FASEB J., 308-316 (1993)).

Los defectos del VWF son la causa de la enfermedad de Von Willebrand (VWD), que se caracteriza por un fenotipo de sangrado más o menos pronunciado. La VWD de tipo 3 es la variedad más grave, en ella el VWF está completamente ausente, y la VWD de tipo 1 se refiere a una pérdida cuantitativa de VWF, pudiendo ser su fenotipo muy leve. La VWD tipo 2 se refiere a defectos cualitativos de la VWF y puede ser tan grave como la VWD tipo 3. La VWD tipo 2 presenta muchas sub-variedades, algunas de las cuales están asociadas a la pérdida o reducción de multímeros de alto peso molecular. El síndrome de Von Willebrand tipo 2a (VWS-2A) se caracteriza por una pérdida de multímeros de tamaño grande e intermedio. El VWS-2B se caracteriza por la pérdida de los multímeros de mayor peso molecular. En la técnica actual se conocen otras enfermedades y trastornos relacionados con el VWF.

Las patentes US Nº 6.531.577, 7.166.709, así como la Patente Europea EP 152 312 describen formulaciones de VWF obtenidas a partir de plasma. No obstante, además de las cuestiones relativas a la cantidad y la pureza del VWF obtenido a partir del plasma, también existe un riesgo de transmisión sanguínea de patógenos (por ejemplo virus, variantes de la Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (vECJ)). También es sabido que el VWF forma agregados en condiciones de estrés.

Así, en la técnica existe la necesidad de desarrollar una formulación farmacéutica estable que comprenda VWF recombinante.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona formulaciones útiles para la liofilización de VWF recombinante, que resultan en una composición farmacéutica muy estable. La composición farmacéutica estable es útil como agente terapéutico para el tratamiento de pacientes que padecen trastornos o enfermedades que pueden beneficiarse de la administración de VWF recombinante.

En una realización, se proporciona una formulación farmacéutica estable liofilizada de un factor von Willebrand recombinante (rVWF) según la reivindicación 1.

En otra realización, el rVWF incluye la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID Nº 3. En otra realización de la invención, el agente tampón se selecciona de entre el grupo consistente en citrato, glicina, histidina, HEPES, Tris y sus combinaciones. En otra realización, el agente tampón es citrato. En diversas realizaciones, el pH está en el rango de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 8,0, aproximadamente 6,5 a aproximadamente 7,5 o es de aproximadamente 7,3. En otra realización, el pH está en torno a 7,3.

En otra realización, el aminoácido mencionado anteriormente se selecciona de entre el grupo consistente en glicina, histidina, prolina, serina, alanita y arginina. En otra realización, la concentración de aminoácido se sitúa entre aproximadamente 0,5 mM y aproximadamente 300 mM. En otra realización adicional, el aminoácido es glicina a una concentración de aproximadamente 15 mM.

En una realización de la invención, el rVWF comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº 3, el agente tampón es citrato y el pH es de aproximadamente 7,3; siendo el aminoácido glicina a una concentración de aproximadamente 15 mM.

En otra realización adicional de la invención, el o los agentes estabilizantes anteriormente mencionados se seleccionan de entre el grupo consistente en manitol, lactosa, sorbitol, xilitol, sacarosa, trehalosa, manosa, maltosa, lactosa, glucosa, rafinosa, celobiosa, gentiobiosa, isomaltosa, arabinosa, glucosamina, fructosa y combinaciones de estos agentes estabilizantes. En una realización, los agentes estabilizantes son trehalosa a una concentración de aproximadamente 10 g/l y manitol a una concentración de aproximadamente 20 g/l.

En otra realización adicional de la invención, el agente tensioactivo mencionado se selecciona de entre el grupo consistente en digitonina, Triton X-100, Triton X-114, TWEEN-20, TWEEN-80 y combinaciones de los mismos. En otra realización, el agente tensioactivo es TWEEN-80 a aproximadamente 0,01 g/l.

En otra realización de la invención, el rVWF comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID Nº 3, siendo el agente tampón citrato a una concentración de aproximadamente 15 mM y a un pH de aproximadamente 7,3; siendo el aminoácido glicina a una concentración de aproximadamente 15 mM; siendo los agentes estabilizadores trehalosa a una concentración de aproximadamente 10 g/l y manitol a una concentración de aproximadamente 20 g/l.; y siendo el agente tensioactivo TWEEN-80 a una concentración de aproximadamente 0,1 g/l.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1: análisis ANCOVA de la actividad del pool de VWF:RCo en lotes evaluador en cuanto a su

estabilidad (almacenados a 5ºC ± 3ºC). Figura 2: muestra el incremento de la humedad residual en el rVWF FDP almacenado a 5ºC ± 3ºC. Figura 3: muestra el incremento de la humedad residual en el rVWF FDP almacenado a 40ºC ± 2ºC.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Definición de términos

A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en este documento tienen el significado normalmente entendido por el experto en el campo técnico al cual pertenece la presente invención. Las siguientes referencias facilitan al experto una definición general de muchos de los términos utilizados en esta invención: Singleton y col., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY (2d ed. 1994); THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY (Walker ed., 1988); THE GLOSSARY OF GENETICS, 5TH ED., R. Rieger y col. (eds.), Springer Verlag (1991); y Hale y Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY (1991).

Todas las publicaciones, solicitudes de patentes, patentes y otras referencias citadas en este documento quedan incorporadas al mismo en su totalidad por referencia, en la medida en que ello no se oponga a lo aquí descrito.

Debe tenerse en cuenta que, tal y como se utilizan en esta especificación y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un," "una," y "el" incluyen las referencias al plural, a menos que el contexto lo exija claramente en otro sentido.

Tal y como se utilizan en el presente documento, los siguientes términos tendrán los significados que se les atribuyen, a menos que se especifique en otro sentido.

El término “que comprende”, en relación con un compuesto péptido, significa que un compuesto puede incluir

aminoácidos adicionales tanto en el terminal amino de la secuencia dada como en el carboxilo o en ambos. Por supuesto, estos aminoácidos adicionales no deberían interferir de forma significativa con la actividad del compuesto.

En lo que respecta a una composición de la presente invención, el término “que comprende” significa que una

composición puede incluir componentes adicionales. Dichos componentes adicionales no deberían interferir significativamente con la actividad de la composición.

El término “farmacológicamente activo” significa que se ha determinado que una sustancia descrita como tal tiene una actividad que afecta a un parámetro médico (por ejemplo, pero sin que ello constituya una limitación, sobre la presión sanguínea, el recuento de glóbulos rojos, los niveles de colesterol) o a una situación de enfermedad (por ejemplo, pero sin que ello constituya una limitación, cáncer, trastornos autoinmunes).

En la forma utilizada en este documento, los términos "expresar," "que expresa" y "expresión" significan permitir o hacer que se manifieste la información que contiene un gen o secuencia de ADN, por ejemplo produciendo una proteína, mediante la activación de las funciones celulares que participan en la transcripción y traducción del correspondiente gen o secuencia de ADN. Una secuencia de ADN se expresa en o mediante una célula para formar un "producto de expresión, como una proteína" También puede decirse que el propio producto de expresión, por ejemplo la proteína resultante, está "expresado". Un producto de expresión puede caracterizarse como intracelular, extracelular o secretado. El término "intracelular" significa en el interior de una célula. El término "extracelular" significa en el exterior de una célula, como una proteína transmembrana. Una sustancia es “secretada” por una célula si aparece en cantidades significativas en el exterior de la célula procedente de algún punto situado sobre o en el interior de la misma.

Tal y como se utiliza en este documento, un “polipéptido” se refiere a un polímero compuesto por residuos aminoácidos, variantes estructurales, variantes estructurales relacionadas ocurrentes en estado natural y análogos sintéticos de los mismos no ocurrentes de forma natural, unidos mediante enlaces peptídicos. Los polipéptidos

sintéticos se preparan, por ejemplo, utilizando un sintetizador de polipéptidos automatizado. El témino “proteína” se

refiere habitualmente a grandes polipéptidos. El término "péptido" suele referirse a polipéptidos cortos.

Tal y como se utiliza aquí, un "fragmento" de un polipéptido se refiere a cualquier porción de un polipéptido o proteína más pequeño que el producto completo de expresión del polipéptido o la proteína.

Tal y como se utiliza aquí, un "análogo" se refiere a cualesquiera dos o más polipéptidos con una estructura sustancialmente similar y que presentan la misma actividad biológica, pero con diversos grados de actividad, que la molécula completa o que un fragmento de la misma. Los análogos difieren en la composición de sus secuencias de aminoácidos en función de una o más mutaciones que implican la sustitución, deleción, inserción y/o adición de uno

o más aminoácidos, con otros aminoácidos. Las sustituciones pueden ser conservadoras o no conservadoras, en función de la afinidad físico-química o funcional del aminoácido que está siendo sustituido y del aminoácido que lo sustituye.

Tal y como se utiliza aquí, “variante” se refiere a un polipéptido, proteína o análogo de los mismos modificado de forma que incluya grupos químicos adicionales que normalmente no forman parte de la molécula. Dichos grupos pueden modular la solubilidad de la molécula, su absorción, vida media, etc. Alternativamente, los grupos pueden reducir la toxicidad de la molécula y eliminar o atenuar cualquier efecto secundario no deseable de la misma, etc. Los grupos capaces de mediar dichos efectos se describen en la obra de Remington Pharmaceutical Sciences (1980). Los procedimientos para el acoplamiento de dichos grupos a una molécula son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, y sin limitación, en uno de los aspectos, la variante es un factor de coagulación sanguínea con una modificación química que confiere una vida media más prolongada in vivo a la proteína. En diversos aspectos, los polipéptidos están modificados por glicosilación, pegilación y/o polisialización.

VWF Recombinante

Las secuencias de polinucleótidos y aminoácidos del prepro-VWF se indican en las SEQ ID Nº 1 y 2 respectivamente, y están disponibles bajo los números de acceso del GenBank NM_000552 y NP_000543 respectivamente. La secuencia de aminoácidos correspondiente a la proteína madura del VWF se indica en la SEq ID Nº 3 (correspondiente a los aminoácidos 764-2.813 de la secuencia de aminoácidos de longitud total del prepro-VWF).

Una forma de rVWF útil tiene al menos la propiedad de estabilizar in vivo, es decir de enlazar, al menos una molécula de Factor VIII (FVIII) y opcionalmente de presentar un patrón de glicosilación que resulta farmacológicamente aceptable. Ejemplos específicos de ello son el VWF sin el dominio A2, lo que le confiere mayor resistencia a la proteolisis (Lankhof y col., Thromb. Haemost. 77: 1008-1013, 1997) y un fragmento de VWF desde Val 449 a Asn 730 que incluye el dominio de enlace lb de la glicoproteína, así como puntos de enlace de colágeno y heparina (Pietu y col., Biochem. Biophys. Res. Commun. 164: 1339-1347, 1989). En uno de sus aspectos, la determinación de la capacidad de un VWF para estabilizar al menos una molécula de FVIII en mamíferos con deficiencias de VWF se lleva a cabo mediante los métodos conocidos en la técnica.

El rVWF de la presente invención se obtiene por cualquier método conocido en la técnica. Un ejemplo específico se describe en el documento WO86/06096, publicado el 23 de octubre de 1986, así como en la solicitud de patente US Nº 07/559.509, del 23 de julio de 1990, que queda incorporada por referencia al presente documento, en relación con los métodos de obtención de VWF recombinante. Así, se conocen en la técnica métodos para (i) producir ADN recombinante por ingeniería genética, es decir mediante transcripción inversa de ARN y/o amplificación de ADN, (ii) introducir ADN recombinante en células eucarióticas o procarióticas por transfección, por ejemplo electroporación o microinyección, (iii) cultivar las células transformadas, por ejemplo de forma continua o en lotes, (iv) expresar el VWF, por ejemplo de forma constituyente o mediante inducción y (v) aislar el VWF, por ejemplo a partir del medio de cultivo o recolectando las células transformadas, a fin de (vi) obtener rVWF purificado, por ejemplo mediante cromatografía de intercambio aniónico o de afinidad. En uno de los aspectos, se obtiene un VWF recombinante en células huésped transformadas utilizando técnicas de ADN recombinante bien conocidas. Por ejemplo, las secuencias que codifican el polipéptido pueden ser escindidas del ADN utilizando las enzimas de restricción adecuadas. Alternativamente, la molécula de ADN se sintetiza, en otro de los aspectos, utilizando técnicas de síntesis química, como el método del fosforamidato. Asimismo, en otro aspecto adicional de la invención, se utiliza una combinación de estas técnicas.

La invención también proporciona vectores que codifican los polipéptidos de la invención en un huésped adecuado. El vector comprende un nucleótido que codifica el polipéptido que se encuentra enlazado operativamente a las secuencias adecuadas de control de la expresión. Son bien conocidos diversos métodos para llevar a cabo este enlace operativo, tanto antes como después de la inserción del polinucleótido en el vector. Las secuencias de control de la expresión incluyen promotores, activadores, potenciadores, operadores, sitios de enlace ribosomales, señales de inicio, señales de parada, señales de poliadenilación y otras señales relacionadas con el control de la transcripción de la traducción. El vector resultante que incluye el polinucleótido se utiliza para transformar un huésped adecuado. Esta transformación puede realizarse por métodos bien conocidos en la técnica.

Para la práctica de esta invención puede emplearse cualquiera de las muchas y bien conocidas células huésped. La selección de un huésped particular depende de diversos factores reconocidos por la técnica, entre ellos, por ejemplo, la compatibilidad con el vector de expresión seleccionado, la toxicidad de los péptidos codificados por la molécula de ADN, la tasa de transformación, la facilidad de recuperación de los péptidos, las características de expresión, la bio-seguridad y el coste. Debe conseguirse un equilibrio entre todos estos factores, quedando bien entendido que no todas las células huésped resultan igualmente efectivas para la expresión de una secuencia de ADN específica. Dentro de estas directrices generales, entre las células huésped microbianas útiles se encuentran, sin limitación, bacterias, levaduras y otras células de cultivos de hongos, insectos, plantas, mamíferos (incluyendo seres humanos) u otros organismos huéspedes bien conocidos en la técnica.

Las células huésped transformadas se cultivan en condiciones convencionales de fermentación de forma que se expresen los compuestos deseados. Dichas condiciones de fermentación son bien conocidas en la técnica. Por último, los polipéptidos se purifican del medio de cultivo o de las propias células huésped a por métodos bien conocidos en la técnica.

Dependiendo de la célula huésped utilizada para expresar un compuesto de la invención, opcionalmente se encuentran grupos carbohidrato (oligosacáridos) unidos a puntos conocidos como sitios de glicosilación en proteínas. En general, los oligosacáridos con enlaces tipo O- están unidos a residuos serina (Ser) o treonina (Thr), mientras que los oligosacáridos con enlaces tipo N- se unen a residuos asparagina (Asn) cuando éstos forman parte de la secuencia Asn-X-Ser/Thr, siendo X cualquier aminoácido excepto prolina. Preferentemente X es uno de los 19 aminoácidos naturales sin contar la prolina. Las estructuras de los oligosacáridos con enlaces tipo N- y O- y los residuos de azúcar que se encuentran en cada uno de los tipos son diferentes. Un tipo de azúcar que suele encontrarse habitualmente en los oligosacáridos con enlaces tanto de tipo N-como O- es el ácido Nacetilneuramínico (ácido siálico). El ácido siálico suele ser el residuo terminal de los oligosacáridos con enlaces tipo N- y tipo O- y, debido a su carga negativa, en uno de los aspectos confiere propiedades ácidas al compuesto glicosilado. Dichos sitios pueden estar incorporados en el enlazante de los compuestos de la presente invención, y son preferiblemente glicosilados por una célula durante la producción recombinante de los compuestos polipeptídicos (por ejemplo en células mamíferas como CHO, BHK, COS). En otros aspectos, dichos sitios están glicosilados por procedimientos sintéticos o semi-sintéticos conocidos en la técnica.

Alternativamente, los compuestos se obtienen mediante métodos sintéticos utilizando, por ejemplo, técnicas de síntesis en fase sólida. En la técnica se conocen técnicas adecuadas, entre las que se incluyen las descritas en Merrifield (1973), Chem. Polypeptides, pp. 335-61 (Katsoyannis y Panayotis eds.); Merrifield (1963), J. Am. Chem. Soc. 85: 2149; Davis y col. (1985), Biochem. Intl. 10: 394-414; Stewart y Young (1969), Solid Phase Peptide Synthesis; US Pat. Nº 3.941.763; Finn y col. (1976), The Proteins (3rd ed.) 2: 105-253; y Erickson y col. (1976), The Proteins (3ª ed.) 2: 257-527. La síntesis en fase sólida es la técnica preferida para la obtención de péptidos individuales, ya que resulta el método más rentable de obtención de péptidos individuales de tamaño reducido.

Fragmentos, variantes y análogos de VWF

En la técnica se conocen diversos métodos para la preparación de fragmentos de polipéptidos, variantes o análogos.

Los fragmentos de un polipéptido se preparan utilizando, sin limitación, técnicas de escisión enzimática (por ejemplo tripsina, quimotripsina) y también con medios recombinantes para generar fragmentos polipeptídicos con una secuencia de aminoácidos específica. Los fragmentos de polipéptido pueden generarse de forma que incluyan una región de la proteína con una actividad específica, tal como un dominio de multimerización o cualquier otro dominio de VWF identificable conocido en la técnica.

Se bien conocidos diversos métodos para la obtención de análogos de polipéptidos. Los análogos de secuencias de aminoácidos de un polipéptido pueden ser análogos de sustitución, de inserción, de adición o de deleción. Los análogos de deleción, incluyendo los fragmentos polipéptidos, carecen de uno o más residuos de la proteína nativa que no resultan esenciales para la función o actividad inmunogénica. Los análogos de inserción implican la adición de aminoácidos, por ejemplo en un punto no terminal del polipéptido. Por ejemplo, este análogo puede incluir, sin limitación, la inserción de un epítopo inmunorreactivo o de simplemente un único residuo. Los análogos de adición, incluyendo los fragmentos polipéptidos, incluyen la adición de uno o más aminoácidos en cualquiera o en ambos extremos de una proteína, incluyendo por ejemplo proteínas de fusión. También se contemplan combinaciones de los análogos anteriormente mencionados.

En general, los análogos de sustitución intercambian un aminoácido del tipo que salvaje por otro, en uno o más puntos de la proteína, pudiendo diseñarse para que modulen una o más propiedades del polipéptido sin que se pierdan por completo otras funciones o propiedades. En uno de los aspectos, las sustituciones son conservadoras. "Sustitución conservadora de aminoácidos" es la sustitución de un aminoácido por un aminoácido que tenga una cadena lateral o carácter químico similar. Entre los aminoácidos similares para la realización de sustituciones conservadoras se incluyen aquellos que incluyen una cadena lateral ácida (ácido glutámico, ácido aspártico); una cadena lateral básica (arginina, lisina, histidina); una cadena lateral amida polar (glutamina, asparagina); una cadena lateral alifática e hidrófoba (leucina, isoleucina, valina, alanina, glicina); una cadena lateral aromática (fenilalanina, triptófano, tirosina); una cadena lateral pequeña (glicina, alanina, serina, treonina, metionina); o una cadena lateral hidroxilada alifática (serina, treonina).

En uno de los aspectos de la invención, los análogos son esencialmente homólogos o esencialmente idénticos al VWF recombinante del que proceden. Entre los análogos se incluyen aquellos que retienen al menos una parte de la actividad biológica del polipéptido natural, por ejemplo la actividad de coagulación sanguínea.

Entre las variantes de polipéptidos contempladas se incluyen, sin limitación, polipéptidos modificados químicamente por técnicas como ubiquinación, glicosilación, incluyendo polisialación, conjugación con agentes terapéuticos o de diagnóstico, etiquetado, fijación al polímero covalente como pegilación (derivatización con polietilenglicol), introducción de enlaces no hidrolizables e inserción o sustitución por síntesis química de aminoácidos como ornitina que no suelen encontrarse en las proteínas humanas. Las variantes conservan las mismas o esencialmente las mismas propiedades de enlace de las moléculas no modificadas de la invención. Dicha modificación química puede incluir el enlace directo o indirecto (por ejemplo, mediante un enlazante) de un agente al polipéptido de VWF. En caso de una fijación indirecta, se contempla la posibilidad de que el enlazante pueda ser hidrolizable o no hidrolizable.

En uno de los aspectos, la preparación de análogos polipeptídicos pegilados comprende las etapas de (a) hacer reaccionar el polipéptido con polietilenglicol (como éster reactivo o derivado aldehído de PEG) bajo condiciones que permitan que el polipéptido del constructo de enlace se fije a uno o más grupos PEG, y (b) obtener los productos de reacción. En general, las condiciones de reacción óptimas para las reacciones de acilación se determinan en función de parámetros conocidos y del resultado deseado. Por ejemplo, cuanto mayor sea la proporción PEG/proteína, mayor será el porcentaje de producto polipegilado. En algunas realizaciones, el constructo de enlace posee una sola variedad de PEG en el extremo N-. El polietilenglicol (PEG) puede fijarse al factor de coagulación sanguínea para, por ejemplo, facilitar una mayor vida media in vivo. El PEG puede tener cualquier peso molecular adecuado, pudiendo ser tipo lineal o ramificado. El peso molecular medio del PEG oscila entre aproximadamente 2 kDa y aproximadamente 100 kDa, entre aprox. 5 kDa a aprox. 50 kDa, o entre unos 5 kDa y unos 10 kDa. En ciertos aspectos, los grupos PEG se unen al factor de coagulación sanguínea vía acilación o alquilación reductora, a través de un grupo reactivo natural o modificado de la fracción PEG (por ejemplo un grupo aldehído, amino, tiol o éster) que se une a un grupo reactivo presente en el factor de coagulación sanguínea (por ejemplo un grupo aldehido, amino o éster) o mediante cualquier otra técnica conocida.

En la Publicación de Patente US 20060160948, Fernandes y Gregoriadis; Biochim. Biophys. Acta 1341: 26-34, 1997 y en Saenko y col., Haemophilia 12:42-51, 2006 se describen métodos de preparación de polipétidos polisialilados. Brevemente, se agita una solución de ácido colomínico (CA) que contiene NaIO4 0,1M en la oscuridad a temperatura ambiente para oxidar el CA. La solución activada de CA se dializa en oscuridad en una solución tampón de fosfato sódico 0,05M, por ejemplo con un pH de 7,2, y esta solución se añade a una solución de rVWF y se incuba durante 18 h en oscuridad a temperatura ambiente, agitando suavemente. Opcionalmente, los reactivos libres pueden separarse del conjugado de rVWF y ácido polisiálico, por ejemplo mediante ultrafiltrado/diafiltrado. La conjugación del rVWF con el ácido polisiálico se consigue utilizando glutaraldehído como reactivo de reticulación (Migneault y col., Biotechniques 37: 790-796, 2004).

En otro aspecto de la invención también se contempla que un polipéptido según la invención sea una proteína de fusión con un segundo agente que sea un polipéptido. En una realización, el segundo agente, que es un polipéptido, puede ser, sin limitación, una enzima, un factor de crecimiento, un anticuerpo, una citoquina, una quimioquina, un receptor de superficie celular, el dominio extracelular de un receptor de superficie celular, una molécula de adhesión celular o un fragmento o dominio activo de una de las proteínas anteriormente descritas. En una realización relacionada, el segundo agente es un factor de coagulación sanguínea, como Factor VIII, Factor VII, Factor IX. La proteína de fusion que se contempla se obtiene por técnicas químicas o recombinantes bien conocidas en la técnica.

En otro de los aspectos también se contempla que los polipéptidos prepro-VWF y pro-VWF proporcionen beneficios terapéuticos a las formulaciones de la presente invención. Por ejemplo, la patente US Nº 7.005.502 describe una preparación farmacéutica que comprende cantidades sustanciales de pro-VWF, lo que induce a la generación de trombina in vitro. Además de fragmentos recombinantes y biológicamente activos, variantes u otros análogos del VWF maduro natural, la presente invención contempla el uso de fragmentos recombinantes y biológicamente activos, variantes o análogos de prepro-VWF (SEQ ID Nº 2) o de polipéptidos de pro-VWF (residuos aminoácidos 23 a 764 de la SEQ ID Nº 2) en las formulaciones aquí descritas.

El experto en la materia podrá generar con facilidad fragmentos de codificación de polinucleótidos, variantes y análogos de la molécula natural que posean la misma actividad biológica o una actividad biológica similar a la de la molécula natural. En diversos aspectos, estos polinucleótidos se preparan utilizando técnicas PCR, digestión/ligadura de la molécula de codificación del ADN y similares. De este modo, el experto en la técnica será capaz de generar modificaciones básicas únicas de la cadena de ADN para obtener un codón alterado y una mutación sustitutiva, utilizando cualquier método conocido en la técnica, incluyendo sin limitación, mutagénesis específica de sitio. Tal y como se utiliza aquí, la frase "condiciones de hibridación moderadamente rigurosas” significa, por ejemplo, hibridación a 42ºC en formamida al 50% y lavado a 60ºC en 0,1xSSC, 0,1% SDS. El experto comprenderá que la variación de dichas condiciones se produce en función de la longitud y del contenido base de nucleótido GC de las secuencias a hibridar. Las fórmulas habituales en la técnica son válidas para determinar las condiciones exactas de hibridación. Véase Sambrook y col., 9.47-9.51 en Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989).

Liofilización

En uno de los aspectos de la invención, las formulaciones que comprenden un polipéptido de VWF conforme a la invención se liofilizan antes de su administración. La liofilización se lleva a cabo mediante las técnicas habituales en la industria y debería optimizarse para la composición a desarrollar [Tang y col., Pharm Res. 21:191-200, (2004), y Chang y col., Pharm Res. 13:243-9 (1996)].

En uno de los aspectos, un ciclo de liofilización consta de tres fases: congelación, secado primario y secado secundario [A.P. Mackenzie, Phil Trans R Soc London, Ser B, Biol 278:167 (1977)]. En la etapa de congelación, la solución se enfría para iniciar la formación de hielo. Igualmente, esta fase induce la cristalización del agente espesante. El hielo se sublima en la etapa de secado primario, que se lleva a cabo reduciendo la presión de la cámara por debajo de la presión de vapor del hielo, utilizando vacío, e introduciendo calor para fomentar la sublimación. Por último, se elimina el agua absorbida o aprisionada en la fase de secado secundario bajo presión reducida en la cámara y elevada temperatura del revestimiento. Con el proceso se obtiene un material conocido como torta liofilizada. Posteriormente, la torta puede reconstituirse con agua esterilizada o con un disolvente adecuado para su inyección.

El ciclo de liofilización no determina sólo la condición física final de los excipientes, sino que también afecta a otros parámetros, como el tiempo de reconstitución, el aspecto, la estabilidad y el contenido en humedad final. La estructura de la composición en el estado de congelación va evolucionando a través de diversas transiciones (por ejemplo, transiciones cristalinas, humectación y cristalizaciones) que se producen a temperaturas específicas, pudiendo utilizarse para comprender y optimizar el proceso de liofilización. La temperatura de transición vítra (Tg y/o

Tg’) puede aportar información acerca del estado físico de un soluto, pudiendo determinarse mediante calorimetría diferencial de barrido (DSC). Tg y Tg’ constituyen un importante parámetro a tener en cuenta a la hora de diseñar el ciclo de liofilización. Por ejemplo, la temperatura Tg’ es un factor importante para el secado primario. Asimismo, en el estado seco, la temperatura de transición vítrea facilita información acerca de la temperatura de almacenamiento del producto final.

Formulaciones y excipientes en general

Los excipientes son aditivos que enriquecen o mejoran la estabilidad y la presentación de un producto farmacéutico (por ejemplo, una proteína). Independientemente del motivo de su inclusión, los excipientes constituyen un componente integrante de una formulación y, por tanto, deben ser seguros y bien tolerados por los pacientes. En el caso de los medicamentos proteínicos, la selección de los excipientes reviste especial importancia, ya que pueden afectar tanto a la eficacia como a la inmunogenicidad del medicamento. Por ello, deben desarrollarse formulaciones de proteínas con una selección adecuada de excipientes que aporten una estabilidad, seguridad y comerciabilidad adecuadas.

En uno de los aspectos, una formulación liofilizada comprende al menos una o más soluciones tampón, un agente espesante y un estabilizante. En este aspecto, se evalúa el uso de un tensioactivo, que se selecciona cuando la agregación durante la fase de liofilización o durante la reconstitución adquiere gran importancia. Se incluye un agente tampón adecuado para mantener la formulación dentro de unos rangos de pH estables durante la liofilización. En la Tabla A se muestra una comparación de los componentes excipientes contemplados para las formulaciones de proteína líquidas y liofilizadas.

Tabla A Componentes excipiente para formulaciones de proteína liofilizadas

Excipiente

Función en la formulación liofilizada

Amortiguador

Mantiene el pH de la formulación durante la liofilización y la reconstitución

Agente de tonicidad/ estabilizante

Los estabilizadores incluyen crio-y líoprotectores. Entre los ejemplos se incluyen polioles, azúcares y polímeros. Los crioprotectores protegen las proteínas frente a las tensiones de la congelación. Los líoprotectores estabilizan las proteínas en el estado de secado-congelación

Agente espesante

Se utiliza para mejorar la elegancia del producto e impedir reventones. Aporta resistencia estructural a la torta liofilizada. Entre los ejemplos destacan manitol y glicina.

Tensioactivo

Se utiliza si es importante la agregación durante el proceso de liofilización. Puede servir para reducir los tiempos de reconstitución. Entre los ejemplos se incluyen Polisorbato 20 y 80 No suele utilizarse, ya que las reacciones moleculares de la torta lio se retrasan notablemente.

Iones metálicos/ quelantes

Pueden incluirse si se incluye un ión metálico específico únicamente como cofactor, o en caso de que se precise el metal para la actividad de la proteasa. En general no se precisan agentes quelantes en las formulaciones lío.

Conservante

Únicamente para formulaciones multidosis Aporta protección frente al crecimiento microbiano Suele incluirse en el disolvente de reconstitución (por ejemplo, bWFI)

El principal problema planteado a la hora de desarrollar formulaciones proteínicas es estabilizar el producto frente a las tensiones producidas durante la fabricación, el transporte y el almacenamiento. La función de los excipientes de la formulación es aportar estabilización frente a dichas tensiones. Los excipientes también pueden utilizarse para reducir la viscosidad de las formulaciones de proteínas a alta concentración, a fin de permitir su administración y aumentar la comodidad del paciente. En general, los excipientes pueden clasificarse según los mecanismos con los que estabilizan las proteínas frente a las diversas tensiones físicas y químicas. Algunos excipientes se utilizan para mitigar los efectos de una tensión específica o para regular una sensibilidad concreta de una proteína específica. Otros presentan efectos más generales sobre la estabilidad física y covalente de las proteínas. Los excipientes que aquí se describen están organizados por su tipo químico o por su papel funcional en las formulaciones. Se facilitan breves descripciones de los modos de estabilización al comentar cada uno de ellos.

Teniendo en cuenta la información y las orientaciones aquí facilitadas, el experto en la materia sabrá qué cantidad o rango de excipiente puede incluirse en cualquier formulación específica para lograr una formulación biofarmacéutica según la invención que promueva la preservación de la estabilidad del producto biofarmacéutico (por ejemplo, una proteína). Por ejemplo, la cantidad y tipo de una sal a incluirse en una formulación biofarmacéutica de la invención se selecciona en función de la osmolalidad deseada (es decir, isotónica, hipotónica o hipertónica) de la solución final, así como de la cantidad y la osmolalidad de otros componentes a ser incluidos en la formulación.

A modo de ejemplo, la isotonicidad puede conseguirse mediante la inclusión de aproximadamente un 5% de sorbitol, mientras que se precisa un 9% de un excipiente a base de sacarosa para conseguirla. La selección de la cantidad o rango de las concentraciones de uno o más excipientes que pueden incluirse en una formulación biofarmacéutica de la invención se ha ilustrado anteriormente al hacer referencia a las sales, polioles y azúcares. No obstante, el experto en la materia entenderá que las consideraciones que aquí se describen y que se ilustran en referencia a excipientes específicos son igualmente aplicables a todos los tipos de combinaciones de excipientes, incluyendo, por ejemplo, sales, aminoácidos, otros agentes de tonicidad, tensioactivos, estabilizantes, espesantes, crioprotectores, lioprotectores, antioxidantes, iones metálicos, quelantes y/o conservantes.

Igualmente, cuando se menciona un excipiente específico expresándolo en concentración molar, el experto en la materia entenderá que también se contempla el porcentaje equivalente (%) p/v (por ejemplo, gramos de sustancia en una muestra de solución/ml de solución) x 100%) de solución.

Por supuesto, el experto en la materia entenderá que las concentraciones de los excipientes que aquí se describen comparten interdependencia dentro de una formulación específica. A modo de ejemplo, la concentración de un espesante puede reducirse, por ejemplo, cuando se da una elevada concentración proteínica o cuando hay una elevada concentración de estabilizante. Además, el experto en la materia entenderá que, para mantener la isotonicidad de una formulación específica que carece de espesantes, la concentración de un estabilizantes se ajustaría en consecuencia (es decir, se utilizaría una cantidad “tonificante” de estabilizante). Los excipientes más habituales son bien conocidos en la técnica y pueden encontrarse en Powell y col., Compendium of Excipients for Parenteral Formulations (1998), PDA J. Pharm. Sci. Technology, 52:238-311.

Soluciones y agentes tampón

En general se observa que una formulación de proteína farmacológicamente activa muestra su máxima estabilidad en un estrecho rango de valores de pH. Este rango de pH de estabilidad óptima debe identificarse en una fase temprana, durante los estudios previos a la formulación. Para ello resultan útiles diversos métodos, como los estudios de estabilidad acelerada y los estudios de selección calorimétrica (Remmele R.L. Jr. Y col., Biochemistry, 38(16): 5241-7 (1999)). Una vez finalizada una formulación, la proteína debe fabricarse y mantenerse dutante todo el tiempo restante hasta su caducidad. Por ello, se utilizan casi siempre agentes tampón para controlar el pH de la formulación.

La capacidad de tamponar del agente tampón es máxima cuando el pH es equivalente al pKa y disminuye a medida que el pH aumenta o disminuye alejándose de dicho valor. El noventa por ciento de la capacidad tampón se encuentra a una unidad de pH de su pKa. La capacidad tampón también aumenta proporcionalmente con la concentración de la solución tampón.

Deben tenerse en cuenta diversos factores a la hora de seleccionar una solución tampón. En primer lugar, y lo más importante, debe definir la especie tampón y su concentración en función de su pKa y del pH deseado de la formulación. También reviste igual importancia el asegurarse de que la solución tampón es compatible con la proteína y con los demás excipientes de la formulación y que no cataliza ninguna reacción de degradación. Un tercer e importante aspecto a tener en cuenta es la sensación de picor e irritación que puede provocar la solución tampón tras su administración. Por ejemplo, se sabe que el citrato causa irritación cuando se inyecta (Laursen T. y col., Basic Clin Pharmacol Toxicol., 98(2): 218-21 (2006)). El potencial de irritación es mayor en el caso de los medicamentos administrados vía subcutánea (SC) o intramuscular (IM), donde la solución con el medicamento permanece en el mismo lugar durante un período de tiempo relativamente más largo que si se administra vía iv, en la que la formulación se disuelve rápidamente en la sangre tras su administración. En el caso de las formulaciones administradas directamente por infusión iv, debe controlarse la cantidad total de solución tampón (y de cualquier otro componente de la formulación). Debe prestarse especial cuidado al hecho de que los iones potasio administrados en forma de solución tampón fosfato potásico pueden inducir efectos cardiovasculares en un paciente (Hollander-Rodríguez JC. Y col., Am. Fam. Physician., 73(2): 283-90 (2006)).

Las soluciones tampón correspondientes a formulaciones liofilizadas requieren especia atención. Algunas soluciones tampón, como el fosfato sódico, pueden cristalizar fuera de la fase amorfa proteínica durante la congelación, con los consiguientes cambios de pH. Otras soluciones tampón comunes, como acetato e imidazol, pueden sublimarse o evaporarse durante el proceso de liofilización, alterando así el pH de la formulación durante la liofilización o tras la reconstitución.

El sistema tampón presente en las composiciones se selecciona de forma que sea fisiológicamente compatible y mantenga el pH deseado de la formulación farmacéutica. En una realización, el pH de la solución oscila entre 2,0 y 12,0. Por ejemplo, el pH de la solución puede ser de 2,0, 2,3, 2,5, 2,7, 3,0, 3,3, 3,5, 3,7, 4,0, 4,3, 4,5, 4,7, 5,0, 5,3, 5,5, 5,7, 6,0, 6,3, 6,5, 6,7, 7,0, 7,3, 7,5, 7,7, 8,0, 8,3, 8,5, 8,7, 9,0, 9,3, 9,5, 9,7, 10,0, 10,3, 10,5, 10,7, 11,0, 11,3, 11,5, 11,7 o 12,0.

El compuesto tampón del pH puede estar presente en cualquier cantidad adecuada para mantener el pH de la formulación en un nivel predeterminado. En una realización, la concentración de tampón de pH oscila entre 0,1 mM y 500 mM (1M). Por ejemplo, se prevé que el agente tampón del pH tenga una concentración de al menos 0,1, 0,5, 0,7, 0,8 0,9, 1,0, 1,2, 1,5, 1,7, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200 o 500 mM.

Entre los ejemplos de agentes tampón utilizados para tamponar la solución de acuerdo con lo aquí recogido se incluyen, sin limitación, ácidos orgánicos, glicina, histidina, glutamato, succinato, fosfato, fosfato, citrato o Tris, HEPES y aminoácidos o mezclas de aminoácidos, incluyendo sin limitación aspartato, histidina y glicina. En una realización de la presente invención, el agente tampón es citrato.

Estabilizantes y espesantes

En un aspecto de las presentes formulaciones farmacéuticas, se añade un estabilizante (o una combinación de estabilizantes) para impedir o reducir la agregación y la degradación química inducidas por el almacenamiento. Una solución que aparece turbia u opaca tras su reconstitución indica que la proteína ha precipitado o que al menos se ha agregado. El término “estabilizante” se refiere a un excipiente capaz de impedir la agregación o degradación física (por ejemplo autolisis, deamidación, oxidación, etc.) en estado acuoso. Entre los estabilizantes contemplados se encuentran, sin limitación, sacarosa, trehalosa, manosa, maltosa, lactosa, glucosa, rafinosa, celobiosa, gentiobiosa, isomaltosa, arabinosa, glucosamina, fructosa, manitol, sorbitol, glicina, arginina·HCl, compuestos polihidroxi, incluyendo polisacáridos como dextrano, almidón, hidroxietilalmidón, ciclodextrinas, N-metilpirolideno, celulosa y ácido hialurónico, cloruro sódico [Carpenter y col., Develop. Biol. Standard 74:225, (1991)]. En estas formulaciones, el estabilizante se incorpora a una concentración de aproximadamente 0,1, 0,5, 0,7, 0,8 0,9, 1,0, 1,2, 1,5, 1,7, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 700, 900 o 1.000 mM. En una realización de la presente invención, como agentes estabilizantes se utilizan manitol y trehalosa.

Si se desea, las formulaciones también incluyen cantidades adecuadas de agentes reguladores del espesor y la osmolaridad. Los agentes espesantes incluyen, por ejemplo y sin limitación, manitol, glicina y sacarosa, polímeros como dextrano, polivinilpirolidona, carboximetilcelulosa, lactosa, sorbitol, trehalosa o xilitol. En una realización, el espesante utilizado es manitol. El agente espesante se incorpora en una concentración de aproximadamente 0,1, 0,5, 0,7, 0,8 0,9, 1,0, 1,2, 1,5, 1,7, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 700, 900 o 1.000 mM.

Tensioactivos

Las proteínas tienen una elevada tendencia a interactuar con las superficies, lo que las hace susceptibles a la absorción y desnaturalización por contacto aire-líquido, vial-líquido y líquido-líquido (aceite de silicona). Se ha constatado que esta vía de degradación es inversamente dependiente de la concentración proteínica y tiene como resultado la formación de agregados proteínicos solubles e insolubles o la pérdida de proteína de la solución debido a la adsorción en las superficies. Además de la adsorción a la superficie del envase, la degradación inducida por la superficie se exacerba por la agitación física, como sucedería durante el transporte y la manipulación del producto.

Los agentes tensioactivos suelen utilizarse en las formulaciones de proteínas para impedir la degradación inducida por la superficie. Los agentes tensioactivos son moléculas anfipáticas con la peculiaridad de competir ventajosamente con las proteínas por las posiciones de interacción. Las partes hidrófobas de las moléculas tensioactivas ocupan las posiciones de interacción (por ejemplo aire/líquido), mientras que las partes hidrófilas de las moléculas siguen estando orientadas hacia el disolvente. A una concentración suficiente (en general en torno a la concentración micelar crítica del detergente), la capa superficial de las moléculas tensioactivas impede la adsorción de las moléculas de proteína por interacción. Por tanto, se reduce al mínimo la degradación inducida por la superficie. Los tensioactivos aquí contemplados incluyen, sin limitación, ésteres de ácidos grasos polietoxilatos de sorbitano, es decir polisorbato 20 y polisorbato 80. Ambos sólo difieren en la longitud de la cadena alifática que aporta el carácter hidrófobo a las moléculas, C-12 y C-18 respectivamente. Así, el polisorbato-80 es más superficialmente activo y tiene una concentración micelar crítica inferior a la de los polisorbatos-20.

Los detergentes también pueden afectar a la estabilidad conformacional termodinámica de las proteínas. Una vez más, los efectos de un excipiente detergente dado serán específicos de la proteína. Por ejemplo, se ha demostrado que los polisorbatos reducen la estabilidad de ciertas proteínas y aumentan la estabilidad de otras. La desestabilización de las proteínas por detergente puede racionalizarse en términos de las colas hidrofóbicas de las moléculas de detergente, que pueden asumir un enlace específico con estados proteínicos parcial o totalmente desplegados. Este tipo de interacciones puede provocar un cambio en el equilibrio conformacional hacia estados proteínicos más expandidos (es decir aumentando la exposición de las partes hidrofóbicas de la molécula proteínica como complemento al polisorbato del enlace). Alternativamente, si el estado nativo de la proteína presenta algunas superficies hidrofóbicas, el enlace del detergente con el estado nativo puede estabilizar dicha conformación.

Otro aspecto de los polisorbatos es que son inherentemente susceptibles de degradación oxidativa. A menudo, y como materias primas, contienen suficiente cantidad de peróxidos para provocar la oxidación de las cadenas laterales de los residuos proteínicos, especialmente de la metionina. La posibilidad de daños por oxidación derivados de la adición del estabilizante subraya el hecho de que en las formulaciones debe utilizarse la concentración efectiva más baja de excipiente. En el caso de los tensioactivos, la concentración efectiva para una proteína dada dependerá del mecanismo de estabilización.

También se añaden tensioactivos en cantidad adecuada para impedir fenómenos de agregación relacionados con la superficie durante la congelación y el secado [Chang B., J. Pharm. Sci. 85:1325, (1996)]. Así, entre los ejemplos de tensioactivos se encuentran, sin limitación, tensioactivos aniónicos, catiónicos, no iónicos, zwitteriónicos y anfotéricos obtenidos de aminoácidos naturales. Entre los tensioactivos aniónicos se encuentran, sin limitación, laurilsulfato sódico, sulfosuccinato de dioctilo y sulfonato de dioctil-sodio, ácido quenodesoxicólico, sal sódica de Nlauroilsarcosina, sulfato de dodecil-litio, sal sódica de ácido 1-octanosulfónico, colato sódico hidratado, desoxicolato sódico y sal sódica de ácido glicodesoxicólico. Entre los tensioactivos catiónicos se encuentran, sin limitación, cloruro de benzalconio o cloruro de bencetonio, cloruro de cetilpiridinio monohidrato y bromuro de hexadeciltrimetilamonio. Los tensioactivos zwitteriónicos incluyen, sin limitación, CHAPS, CHAPSO, SB3-10 y SB3

12. Los tensioactivos no iónicos incluyen, sin limitación, digitonina, Triton X-100, Triton X114, TWEEN-20, y TWEEN

80. Los tensioactivos también incluyen, sin limitación, lauromacrogol 400, polioxil 40 estearato, aceite de ricino polietoxilado 10, 40, 50 y 60, glicerol monoestearato, polisorbato 40, 60, 65 y 80, leicitina de soja y otros fosfolípidos, como dioleoil-fosfatidil-colina (DOPC), dimiristoil fosfatidilglicerol (DMPG), dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC) y dioleilfosfatidilglicerol (DOPG); ésteres de sacarosa, metilcelulosa y carboximetilcelulosa de ácidos grasos. Por tanto, también se facilitan composiciones que comprenden estos tensioactivos, tanto individualmente como en forma de mezcla en diferentes proporciones. En una realización de la presente invención, el tensioactivo es TWEEN-80. En las presentes formulaciones, el tensioactivo se incorpora en una concentración de entre 0,01 y 0,5 g/l. En las formulaciones facilitadas, la concentración del tensioactivo es de 0,005, 0,01, 0,02, 0,03, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 o 1,0 g/l.

Sales

Con frecuencia se añaden sales para aumentar la fuerza iónica de la formulación, que puede resultar importante para la solubilidad de la proteína, la estabilidad física y la isotonicidad. Las sales pueden afectar a la estabilidad física de las proteínas de muchas formas. Los iones pueden estabilizar el estado nativo de las proteínas uniéndose a los residuos cargados de la superficie de la proteína. Alternativamente, las sales pueden estabilizar el estado desnaturalizado uniéndose a grupos peptídicos a lo largo del esqueleto proteico (-CONH-). Las sales también pueden estabilizar la conformación nativa de la proteína blindando las interacciones electrostáticas repulsivas entre residuos de una molécula de proteína.

Las sales para las formulaciones de proteínas también pueden blindar las interacciones electrostáticas atractivas entre las moléculas de proteínas, que pueden provocar agregación e insolubilidad. En las formulaciones facilitadas, la concentración de sal oscila entre 0,1, 1, 10, 20, 30, 40, 50, 80, 100, 120, 150, 200, 300 y 500 mM.

Otros componentes excipientes comunes

Aminoácidos

Los aminoácidos se han utilizado ampliamente en formulaciones de proteínas como tampones, espesantes, estabilizantes y antioxidantes. Así, en un aspecto de la invención se utiliza histidina y ácido glutámico para tamponar las formulaciones proteicas en el rango de pH de 5,5 -6,5 y 4,0 -5,5 respectivamente. El grupo imidazol de la histidina tiene un pKa = 6,0 y el grupo carboxilo de la cadena lateral del ácido glutámico tiene un pKa de 4,3 lo que convierte a estos aminoácidos en adecuados para tamponar en sus respectivos rangos de pH. El ácido glutámico resulta en estos casos especialmente útil. La histidina suele encontrarse en las formulaciones proteicas comerciales, siendo este aminoácido una alternativa al citrato, un tampón que resulta irritante cuando se inyecta. Es interesante saber que la histidina tiene un efecto estabilizante con respecto a la agregación cuando se utiliza en concentraciones elevadas en presentaciones líquidas y liofilizadas (Chen B. y col., Pharm Res., 20(12): 1952-60 (2003)). También se ha observado que la histidina reduce la viscosidad de una formulación con elevada concentración proteica. No obstante, en el mismo estudio, los autores observaron una mayor agregación y decoloración en las formulaciones que contienen histidina durante los estudios de congelación/descongelación del anticuerpo en contenedores de acero inoxidable. Otra precaución que ha de tenerse en relación con la histidina es que sufre foto-oxidación en presencia de iones metálicos (Tomita M. y col., Biochemistry, 8(12): 5149-60 (1969)). La utilización de metionina como antioxidante en las formulaciones parece prometedora; se ha observado que resulta efectiva contra diversas causas de estrés oxidativo (Lam XM y col., J Pharm Sci., 86(11): 1250-5 (1997)).

En diversos aspectos se proporcionan formulaciones que incluyen uno o más de los aminoácidos glicina, prolina, serina, arginina y alanina, que se ha demostrado estabilizan las proteínas mediante el mecanismo de exclusión preferencial. La glicina también se utiliza normalmente como agente espesante en formulaciones liofilizadas. La arginina ha demostrado ser un agente muy eficaz para inhibir la agregación, utilizándose en formulaciones líquidas y liofilizadas.

En las formulaciones proporcionadas, la concentración de aminoácido está entre 0,1, 1, 10, 20, 30, 40, 50, 80, 100, 120, 150, 200, 300 y 500 mM. En una realización de la presente invención, el aminoácido es glicina.

Antioxidantes

La oxidación de los residuos proteicos tiene diversas causas. Más allá de la adición de antioxidantes específicos, la prevención de daños oxidativos en la proteína implica un cuidadoso control de diversos factores durante el proceso de fabricación y almacenamiento del producto, por ejemplo el oxígeno atmosférico, la temperatura, la exposición a la luz y la contaminación química. Por tanto, la invención contempla el uso de antioxidantes farmacéuticos, incluyendo, sin limitación, agentes reductores, captadores de oxígeno/radicales libres o agentes quelantes. Los antioxidantes de las formulaciones de proteínas terapéuticas son, en uno de los aspectos, solubles en agua y permanecen activos durante toda la vida útil del producto. Los agentes reductores y captadores de oxígeno/radicales libres funcionan eliminando las especies de oxígeno activas de la solución. Los agentes quelantes, como EDTA, son efectivos por su unión a trazas metálicas contaminantes que promueven la formación de radicales libres. Por ejemplo, se utilizó EDTA en la formulación líquida de factor de crecimiento de fibroblasto ácido para inhibir la oxidación de los residuos cisteína catalizada por iones metálicos.

Además de la efectividad de numerosos excipientes a la hora de impedir la oxidación de la proteína, debe tenerse en cuenta el potencial de los propios antioxidantes para inducir otros cambios físicos o covalentes en la proteína. Por ejemplo, los agentes reductores pueden provocar la ruptura de los enlaces disulfuro intramoleculares, lo que puede provocar una mezcla de disulfuros. En presencia de iones metálicos de transición, se ha demostrado que el ácido ascórbico y el EDTA fomentan la oxidación de la metionina en diversas proteínas y péptidos (Akers MJ y Defelippis MR., Peptides and Proteins as Parenteral Solutions. En: Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins. Sven Frokjaer, Lars Hovgaard, editors. Pharmaceutical Science. Taylor and Francis, UK (1999)); Fransson J.R., J. Pharm. Sci. 86(9): 4046-1050 (1997); Yin J, y col., Pharm Res., 21(12): 2377-83 (2004)). Se ha indicado que el tiosulfato sódico reduce los niveles de oxidación de la metionina inducida por la luz y la temperatura en rhuMab HER2; no obstante, en este estudio también se comunica la formación de un aducto de tiosulfato y proteína (Lam XM, Yang JY y col., J Pharm Sci. 86(11): 1250-5 (1997)). Se selcciona el antioxidante adecuado en función de las tensiones y sensibilidades específicas de la proteína. Los antioxidantes contemplados en ciertos aspectos de la invención incluyen, sin limitación, agentes reductores y captadores de oxígeno/radicales libres, EDTA y tiosulfato sódico.

Iones metálicos

En general, los iones metálicos de transición no resultan deseables en las formulaciones proteicas, ya que pueden catalizar las reacciones de degradación física y química de las proteínas. No obstante, se incluyen iones metálicos específicos en las formulaciones cuando son cofactores de las proteínas y en formulaciones proteicas en suspensión cuando forman complejos de coordinación (por ejemplo, suspensión de insulina en zinc). Recientemente se ha propuesto la uilización de iones magnesio (10 -120 mM) para inhibir la isomerización del ácido aspártico, que se convierte en ácido isoaspártico (WO 2004039337).

Dos ejemplos donde los iones metálicos confieren estabilidad o mayor actividad a las proteínas son desoxirribonucleasa humana (rhDNAsa, Pulmozyme®) y Factor VIII. En el caso de la rhDNAsa, los iones Ca+2 (hasta 100 mM) aumentaron la estabilidad de la enzima mediante un sitio de enlace específico (Chen B. y col., J Pharm Sci., 88(4): 477-82 (1999)). De hecho, la eliminación de los iones calcio en la solución con EGTA provocó un aumento de la desamidación y la agregación. No obstante, este efecto se observó sólo con los iones Ca+2; se observó que otros cationes divalentes, Mg+2, Mn+2 y Zn+2 desestabilizaban la rhDNAsa. Se observaron efectos similares en el caso del Factor VIII. Los iones Ca+2ySr+2 estabilizaron la proteína, mientras otros, como Mg+2, Mn+2 y Zn+2, Cu+2 y Fe+2 desestabilizaron la enzima (Fatouros A. y col., Int. J. Pharm., 155, 121-131 (1997)). En un estudio independiente realizado con Factor VIII, se observó un importante incremento de la tasa de agregación en presencia de iones Al+3 (Derrick TS y col., J. Pharm. Sci., 93(10): 2549-57 (2004)). Los autores señalan que otros excipientes, como las sales tampón, suelen contaminarse con iones Al+3 e ilustran la necesidad de utilizar excipientes de calidad adecuada en los productos formulados.

Conservantes

Los conservantes son necesarios cuando se utilizan formulaciones parenterales multiusos que implican más de una extracción del mismo recipiente. Su principal función es inhibir el crecimiento microbiano y garantizar la esterilidad del producto durante toda la vida útil o período de validez del producto farmacéutico. Entre los conservantes más habitualmente utilizados se encuentran, sin limitación, alcohol bencílico, fenol y m-cresol. Aunque los conservantes se utilizan desde hace mucho tiempo, el desarrollo de formulaciones proteicas que incluyen conservantes puede resultar un problema. Los conservantes presentan casi siempre un efecto desestabilizante (agregación) en las proteínas y esto ha pasado a ser uno de los principales factores que limitan su utilización en formulaciones proteicas multidosis (Roy S. y col., J Pharm Sci., 94(2): 382-96 (2005)).

Hasta ahora, la mayoría de los fármacos a base de proteínas se formulan para su uso tan sólo una vez. No obstante, cuando se da la posibilidad de formulaciones multidosis, éstas tienen la ventaja añadida de que permiten que el paciente se sienta cómodo y aumentan su comerciabilidad. Un buen ejemplo lo constituye la hormona del crecimiento humano (hGH), en la que el desarrollo de formulaciones que incluyen conservantes ha llevado a la comercialización de presentaciones en el formato más cómodo de plumas inyectables multiusos. Al menos cuatro de dichos dispositivos en forma de pluma y que contienen formulaciones de hGH que incluyen conservantes están actualmente disponibles en el mercado. Norditropin® (líquido, Novo Nordisk), Nutropin AQ® (líquido, Genentech) y Genotropin (liofilizado – cartucho bicámara, Pharmacia & Upjohn) contienen fenol, mientras que Somatrope® (Eli Lilly) se formula con m-cresol.

Deben tenerse en cuenta diversos aspectos durante el desarrollo de la formulación en formatos de dosificación con conservantes. Debe optimizarse la concentración efectiva del conservante en el producto farmacéutico. Esto requiere comprobar un conservante determinado en el formato de dosificación a unos rangos de concentración que confieran actividad antimicrobiana sin comprometer la estabilidad de la proteína. Por ejemplo, se comprobaron con éxito tres conservantes durante el desarrollo de una formulación líquida del receptor de interleucina-1 (Tipo I) utilizando la calorimetría de barrido diferencial (DSC). Los conservantes se ordenaron por rangos en función de su impacto sobre la estabilidad a las concentraciones normalmente utilizadas en los productos comerciales (Remmele RL Jr. Y col., Pharm Res., 15(2): 200-8 (1998)).

El desarrollo de formulaciones líquidas que incluyen conservantes resulta más problemático que el de las formulaciones liofilizadas. Los productos liofilizados pueden liofilizarse sin conservantes y reconstituirse con un disolvente que contenga el conservante cuando vayan a utilizarse. De este modo se reduce el período durante el cual el conservante está en contacto con la proteína, reduciendo significativamente los riesgos de estabilidad asociados. En el caso de las formulaciones líquidas, han de mantenerse la estabilidad y la eficacia del conservante duante toda la vida útil del producto (18-24 meses). Un punto importante a destacar es que la eficacia del conservante debe demostrarse en la formulación final que contiene el fármaco activo y todos los componentes excipientes.

Algunos conservantes pueden provocar reacciones en el punto de inyección, lo que constituye otro factor a tener en cuenta a la hora de elegir un conservante. En los ensayos clínicos centrados en la evaluación de los conservantes y los tampones en norditropina, se observó que la percepción del dolor era inferior en el caso de las formulaciones con fenol y alcohol bencílico en comparación con las formulaciones con m-cresol (Kappelgaard A.M., Horm Res. 62 Suppl 3:98-103 (2004)). Lo que resulta interesante es que, entre los conservantes utilizados con mayor frecuencia, el alcohol bencílico posee propiedades anestésicas (Minogue SC. y Sun DA., Anesth Analg., 100(3): 683-6 (2005)). En diversos aspectos, el uso de conservantes aporta ciertos beneficios que compensan cualquier efecto secundario.

Métodos de preparación

La presente invención también contempla métodos de preparación de formulaciones farmacéuticas.

Los métodos actuales comprenden adicionalmente una o más de las etapas siguientes: añadir a la mezcla un agente estabilizante tal como se describe aquí antes de la liofilización y añadir a dicha mezcla al menos un agente seleccionado de entre un agente espesante, un agente regulador de la osmolaridad y un tensioactivo, cada uno de ellos de acuerdo con lo aquí descrito, antes de la liofilización.

La práctica habitual de reconstitución de los materiales liofilizados consiste en añadir nuevamente un volumen de agua pura o de agua esterilizada inyectable (WFI) (que normalmente equivale al volumen eliminado durante la liofilización), aunque a veces se utilizan soluciones disueltas de agentes antibacterianos en la producción de fármacos para su administración parenteral [Chen, Drug Development and Industrial Pharmacy, 18:1311-1354 (1992)]. Así, se proporcionan diversos métodos para preparar composiciones reconstituidas de rVWF, que comprenden la fase de añadir un disolvente a una composición de rVWF liofilizado según la invención.

El material liofilizado puede reconstituirse como una solución acuosa. Pueden utilizarse diversos vehículos acuosos, por ejemplo agua esterilizada inyectable, agua con conservantes para su utilización multidosis o agua con la cantidad adecuada de tensioactivos (por ejemplo, una solución acuosa con el compuesto activo en un agregado en polvo, junto con excipientes adecuados para la obtención de suspensiones acuosas). En diversos aspectos, dichos excipientes son agentes de suspensión, por ejemplo, y sin limitación, carboximetilcelulosa sódica, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, alginato sódico, polivinilpirrolidona, goma tragacanto y goma arábiga; los dispersantes o humectantes son fosfolípidos de origen natural, por ejemplo, y sin limitación, leicitina, o productos de condensación de un óxido de alquileno con ácidos grasos, por ejemplo, y sin limitación, estearato de polioxietileno, o productos de condensación de óxido de etileno con alcoholes alifáticos de cadena larga, por ejemplo, y sin limitación, heptadecaetilenoxicetanol, o productos de condensación de óxido de etileno con ésteres parciales obtenidos a partir de ácidos grasos y un hexitol, como monooleato de polioxietilensorbitol, o productos de condensación de óxido de etileno con ésteres parciales obtenidos de anhídridos de ácidos grasos y anhídridos de hexitol, por ejemplo, y sin limitación, monooleato del polioxietilensorbitano. En diversos aspectos, las suspensiones acuosas también contienen uno o más conservantes, por ejemplo, y sin limitación, p-hidroxibenzoato de etilo o de n-propilo.

Administración

En un aspecto, para la administración de las composiciones a seres humanos o animales de ensayo, las composiciones comprenden uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables. Las frases “farmacéuticamente” o “farmacológicamente” aceptables se refieren a entidades y composiciones moleculares que son estables, inhiben la degradación de la proteína, como la agregación y los productos de escisión, y además no provocan reacciones alérgicas o adversas de otro tipo cuando se administran utilizando vías bien conocidas en la técnica, como se describe a continuación. El término “vehículos farmacéuticamente aceptables” incluye todo tipo de disolventes clínicamente útiles, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción y similares, incluyendo los agentes anteriormente descritos.

Las formulaciones farmacéuticas se administran vía oral, tópica, transdérmica o parenteral, mediante esprays inhaladores, vía vaginal, rectal o mediante inyección intracraneal. El término parenteral tal como se utiliza aquí incluye técnicas de inyección subcutánea, intravenosa, intramuscular, intracisternal o de infusión. También se contempla la administración por inyección intravenosa, intradérmica, intramuscular, intramamaria, intraperitoneal, intratecal, retrobulbar, intrapulmonar, y/o por implante quirúrgico en un emplazamiento específico. En general, las composiciones están esencialmente libres de pirógenos, así como de otras impurezas que podrían resultar peligrosas para el receptor.

La administración única o múltiple de las composiciones se lleva a cabo con los niveles de dosis y regímenes seleccionados por el facultativo. Para prevenir o tratar la enfermedad, la dosis adecuada depende del tipo de enfermedad a tratar, como se ha definido anteriormente, de la gravedad y del curso de la enfermedad, de si el medicamento se administra con fines preventivos o terapéuticos, de la terapia anterior, del historial clínico del paciente y su respuesta al medicamento y del criterio del facultativo encargado.

Kits

Como un aspecto adicional, la invención incluye kits que comprenden una o más composiciones liofilizadas empaquetadas de forma que se facilite su utilización para su administración a los pacientes. En una realización, dicho kit incluye la formulación farmacéutica descrita en este documento (por ejemplo, una composición que comprende una proteína o péptido terapéuticos), envasada en un recipiente tal como una botella o en un recipiente precintado, con una etiqueta fijada al recipiente o incluida en el envase que describe el uso de la composición a la hora de implementar el método. En una realización, la formulación farmacéutica está envasada en el recipiente de forma que la cantidad de espacio libre del recipiente (es decir, la cantidad de aire entre la formulación líquida y la parte superior del envase) es muy pequeña. Preferiblemente, la cantidad de espacio libre es desdeñable (es decir, prácticamente inexistente). En una realización, el kit consta de un primer envase que contiene una composición con una proteína o péptido terapéuticos y de un segundo envase que contiene una solución fisiológicamente aceptable para la reconstitución de la composición. En un aspecto, la formulación farmacéutica está envasada en forma de unidad monodosis. El kit puede incluir también un dispositivo adecuado para la administración de la formulación farmacéutica de acuerdo con una vía de administración específica. Preferiblemente, el kit contiene una etiqueta que describe la utilización de las formulaciones farmacéuticas.

Dosis

El régimen de dosificación correspondiente a un método de tratamiento de uno de los trastornos aquí descritos será el determinado por el médico, teniendo en cuenta diversos factores que modifican la acción de los medicamentos, como la edad, condición, peso corporal, sexo y régimen alimenticio del paciente, gravedad de cualquier infección, duración de la administración y otros factores clínicos. A modo de ejemplo, una dosis típica de un VWF recombinante conforme a la presente invención es de aproximadamente 50 U/kg, lo que equivale a 500 µg/kg.

En un aspecto de la invención, las formulaciones de la invención se administran mediante un bolo inicial, seguido de una infusión continua para mantener los niveles terapéuticos circulantes del producto farmacéutico. En otro ejemplo, el compuesto de la invención se administra como dosis única. El experto en la materia optimizará rápidamente las dosificaciones efectivas y los regímenes de administración determinados por la práctica médica recomendada y la situación clínica de cada paciente concreto. La frecuencia de dosificación depende de los parámetros farmacocinéticos de los agentes y la vía de administración. El xperto en la materia determinará la formulación farmacéutica óptima en función de la vía de administración y de la dosis deseada (véase por ejemplo Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., 1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042, páginas 1435-1712, cuyos postulados quedan incorporados por referencia al presente documento). Dichas formulaciones influyen sobre el estado físico, la estabilidad y la frecuencia de administración in vivo de los agentes administrados. Dependiendo de la vía de administración, se calcula la dosis adecuada en función del peso corporal, de la superficie corporal o de las dimensiones del órgano. Pueden determinarse las dosis adecuadas mediante la utilización de ensayos conocidos para la determinación de las dosis a nivel sanguíneo junto con los datos dosis/respuesta adecuados. El régimen de dosificación definitivo viene determinado por el médico teniendo en cuenta los diversos factores que modifican la acción de los fármacos, por ejemplo la actividad específica del fármaco, la gravedad de la lesión y la respuesta del paciente, la edad, condición, peso corporal, sexo y régimen alimenticio del paciente, la gravedad de cualquier infección, duración de la administración y otros factores clínicos. A medida que se lleven a cabo los estudios, se dispondrá de información adicional relativa a los niveles de dosificación adecuados y la duración del tratamiento para diversas enfermedades y condiciones.

Los siguientes ejemplos no pretenden ser limitativos, sino tan sólo ilustrar realizaciones específicas de la invención.

Ejemplo 1: Experimentos de agitación

Para determinar la cantidad de precipitación de rVWF en diversas formulaciones, se comprobó el alcance de la agregación del rVWF tras una agitación turbulenta bajo diversas condiciones.

Como se muestra en la Tabla 1 siguiente, se evaluaron diferentes formulaciones de rVWF en una solución tampón de citrato 20 mM con un pH 7,3. Los experimentos de agitación habían sido diseñados para simular condiciones de estrés mecánico. Se agitaron de 1 a 2 ml de cada formulación con un agitador de laboratorio durante 10 minutos a

1.200 rpm.

Tabla 1

Lio.25

Lisina Histidina Glicina Serina Manitol PEG1500 Tween80 Sacarosa Trehalosa Rafinosa

18

30mM. 5g/l

19

30mM 5g/l

20

30mM 5g/l

21

30mM 5g/l

22

30mM 5g/l

23

30mM 5g/l

24

30mM 5g/l

25

30mM 5g/l

26

30mM 0,1 g/l

27

30mM 0,1 g/l

28

30mM 0,1 g/l

29

30mM 0,1 g/l

30

30mM 5g/l 5g/l

31

30mM 5g/l 5g/l

32

30mM 5g/l 5g/l

33

30mM 5g/l 5g/l

34

30mM 5g/l 0,1 g/l

35

30mM 5g/l 0,1 g/l

36

30mM 5g/l 0,1 g/l

37

30mM 5g/l 0,1 g/l

38

30mM 5g/l 5g/l 0,1 g/l

39

30mM 5g/l 5g/l 0,1 g/l

40

30mM 5g/l 5g/l 0,1 g/l

41

30mM 5g/l 5g/l 0,1 g/l

42

5g/l

43

5g/l

44

5g/l

45

5g/l

46

5g/L 5 g/l

47

5 g/l 5 g/l

48

5 g/l 5 g/l

49

5 g/l 5 g/l

50

5g/L 0,1 g/l

51

0,1 g/l 5 g/l

52

0,1 g/l 5 g/l

53

0,1 g/l 5 g/l

La evaluación de los agregados visibles de VWF se llevó a cabo de acuerdo con el esquema que se muestra a continuación. Los “agregados visibles” en la mayoría de los casos consisten en fibras gelatinosas cuyas dimensiones oscilan entre 100 nm y 1-2 cm.

ESQUEMA Los resultados de la prueba de agitación se muestran en la Tabla 2 siguiente:

Partículas

A

Sin partículas

B

Varias partículas, raramente visibles (puntos)

B1

Muchas partículas, raramente visibles (puntos)

C

Varias partículas, fácilmente visibles (fibras)

D

Muchas partículas, fácilmente visibles (fibras)

E

Partículas visibles (fibras >1mm)

El

Esponjoso con precipitado (nadantes en la superficie)

E2

Gelatinoso

Tabla 2

Muestras Lio. 25

Lisina Histidina Glicina Serina Manitol PEG 1500 Tween 80 Agitado 1-2 ml a 1.200 rpm 30 min

18

30mM 5g/l E1

19

30mM 5 g/l E1

20

30mM 5 g/l E1

21

30 mM 5 g/l E1

22

30mM 5 g/l E1

23

30mM 5 g/l E1

24

30mM 5 g/l E1

25

30mM 5 g/l E1

26

30mM. 0,1 g/l E2 grande

27

30mM 0,1 g/l E2 grande

28

30mM 0,1 g/l E2 -6mm

29

30mM 0,1 g/l E2 -3mm

30

30mM 5 g/l 5 g/l El

31

30mM 5 g/l 5 g/l El

32

30mM 5 g/l 5 g/l El

33

30mM 5 g/l 5 g/l El

34

30mM 5 g/l 0,1 g/l B1

35

30mM 5 g/l 0,1 g/l B

36

30mM 5 g/l 0,1 g/l E2 grande

37

30mM 5 g/l 0,1 g/l E2 grande

38

30mM 5 g/l 5 g/l 0,1 g/l D

39

30mM 5 g/l 5 g/l 0,1 g/l D

40

30mM 5 g/l 5 g/l 0,1 g/l B

41

30mM 5 g/l 5 g/l 0,1 g/l B

En resumen, los experimentos de agitación que se describen anteriormente indican que los mejores resultados son 5 los aportados por las formulaciones que contienen Tween-80 y manitol (es decir, la menor cantidad de agregación).

Ejemplo 2: Experimentos de congelación y descongelación

Los experimentos de congelación y descongelación se diseñan para evaluar el impacto de las tensiones provocadas por congelaciones y descongelaciones repetidas. Además de las formulaciones descritas anteriormente para los experimentos de agitación (Tabla 1), se evaluaron las siguientes formulaciones (Tabla 3 y Tabla 4):

Tabla 3

Muestras de Lio. 25

Manitol PEG 1500 Tween 80 Sacarosa Trehalosa Rafinosa

42

5 g/l

43

5 g/l

44

5 g/l

45

5 g/l

46

5 g/l 5 g/l

47

5 g/l

48

5 g/l

49

5 g/l

50

5 g/l 0,1 g/l

51

0,1 g/l 5 g/l

52

0,1 g/l 5 g/l

53

0,1 g/l 5 g/l

Tabla 4

Muestras Lio. 25

Lisina Histidina Glicina Serina Manitol PEG 1500 Tween80 Sacarosa Trehalosa Rafinosa

76

20 g/l 0,2 g/l 20 g/l

77

20 g/l 0,2 g/l 10 g/l

78

20 g/l 0,2 g/l 10 g/l

79

15mM 20 g/l 0,2 g/l 20 g/l

80

15mM 20 g/l 0,2 g/l 10 g/l

81

15mM 20 g/l 0,2 g/l 10 g/l

82

15mM 15mM 20 g/l 0,2 g/l 20 g/l

83

15mM 15mM 20 g/l 0,2 g/l 10 g/l

84

15mM 15mM 20 g/l 0,2 g/l 10 g/l

85

15mM 15mM 20 g/l 5 g/l 0,2 g/l

86

15mM 15mM 20 g/l 5 g/l 0,2 g/l 10 g/l

87

15mM 15mM 20 g/l 15 g/l 0,2 g/l 10 g/l

88

15mM 15mM 20 g/l 0,2 g/l 5 g/l

89

15mM 15mM 20 g/l 0,2 g/l 15 g/l

90

15mM 20 g/l 0,2 g/l 15 g/l

92

15mM 15mM 20 g/l 0,2 g/l 10 g/l

93

30mM 20 g/l 0,2 g/l 10 g/l

94

30mM 20 g/l 0,2 g/l 10 g/l

95

30mM 20 g/l 0,2 g/l 10 g/l

96

30mM 20 g/l 0,2 g/l 10 g/l

97

15mM 20 g/l 0,2 g/l 10 g/l

98

15mM 15mM 20 g/l 0,2 g/l 10 g/l

99

15mM 15mM 20 g/l 0,2 g/l 5 g/l

100

15mM 20 g/l 0,2 g/l 10 g/l

15mM

20 g/l 0,2 g/l 10 g/l

Todas las formulaciones se congelaron a -20ºC en un congelador durante aproximadamente 1 hora, descongelándose después a temperatura ambiente. Los resultados se muestran en la Tabla 5.

Tabla 5

Muestras Lio 25

Lisina Histidina Glicina Serina Manitol PEG1500 Tween-80 Sacarosa Trehalosa Rafinosa Cong./descong.(4 veces) Cong/descong.(10 veces)

18

30mM 5g/l E1 15

19

30mM 5 g/l E1

19

20

30mM 5 g/l C

20

21

30mM 5 g/l C

21

22

30mM 5 g/l C

22

23

30mM 5 g/l C/B 1

23

24

30mM 5 g/l C

24

25

30mM 5 g/l C

25

26

30mM 0,1g/l B

26

27

30mM 0,1g/l B-B 1

27

28

30mM 0,1g/l B

28

29

30mM 0,1g/l E

29

30

30mM 5 g/l 5 g/l E

30

31

30mM 5 g/l 5 g/l D

31

32

30mM 5 g/l 5 g/l B1-C

32

33

30mM 5 g/l 5 g/l C/D

33

34

30mM 5 g/l 0,1g/l E2 (rest. B)

34

35

30mM 5 g/l 5 g/l E

35

36

30mM 5 g/l 5 g/l E

36

37

30mM 5 g/l 5 g/l B

37

38

30mM 5 g/l 5 g/l 5 g/l B

38

39

30mM 5 g/l 5 g/l 5 g/l B

39

40

30mM 5 g/l 5 g/l 5 g/l B

40

41

30mM 5 g/l 5 g/l 0,1g/l A

41

42

5 g/l D

42

43

5 g/l D

43

Muestras Lio 25

Lisina Histidina Glicina Serina Manitol PEG1500 Tween-80 Sacarosa Trehalosa Rafinosa Cong./descong.(4 veces) Cong/descong.(10 veces)

44

5 g/l E1

44

45

5 g/l E1

45

46

5 g/l 5 g/l D

46

47

5 g/l 5 g/l D

47

48

5 g/l 5 g/l D-E

48

49

5 g/l 5 g/l E

49

50

5 g/l 0,1g/l B1

50

51

0,1g/l 5 g/l C-D

51

52

0,1 g/l 5 g/l B1

52

53

0,1 g/l 5 g/l B1

53

Como puede observarse de loa anterior, los mejores resultados (es decir, la menor cantidad de agregación) se consiguieron con trehalosa.

Ejemplo 3: Experimentos de liofilización

Los experimentos de liofilización se diseñan para evaluar la capacidad de las diferentes formulaciones para permitir

5 la formación de una torta lío que se disuelva en menos de 10 minutos y tenga como resultado una solución transparente. También se llevó a cabo un estudio acelerado de estabilidad para demostrar que no se producían pérdidas significativas de actividad biológica.

Las formulaciones mostradas en la Tabla 6 siguiente se liofilizaron con un liofilizador de nitrógeno TS20002 siguiendo las instrucciones del fabricante. El tiempo total de liofilización fue de aproximadamente 72 horas. Cada 10 una de las formulaciones que se muestran a continuación contenía igualmente 20 g/l de manitol y 0,1 g/l de Tween

80.

Tabla 6

Lio. 26

Citrato HEPES Glicina Histidina Acetato Tris Fosfato Lisina Histidina Glicina Trehalosa Rafinosa

1

15mM 10 g/l

2

15mM 15mM 10 g/l

3

15mM 15mM 10 g/l

4

15mM 15mM 10 g/l

5

15mM 15mM 15mM 10 g/l

6

15mM 30mM 10 g/l

7

15mM 10 g/l

8

15mM 15mM 10 g/l

9

15mM 10 g/l

10

15mM 15mM 10 g/l

11

15mM 15mM 10 g/l

12

15mM 15mM 10 g/l

13

15mM 15mM 15mM 10 g/l

14

15mM 15mM 15mM 10 g/l

15

15mM 10 g/l

16

15mM 15mM 10 g/l

17

15mM 10 g/l

18

15mM 15mM 10 g/l

19

15mM 15mM 15mM 10 g/l

20

15mM 15mM 15mM 10 g/l

21

15mM 15mM 15mM 10 g/l

Los resultados de los experimentos de liofilización se muestran en la Tabla 7 siguiente.

Tabla 7

Tampón

- Excipentes - - -

Lio. 26

Citrato HEPES Glicina Histidina Acetato Tris Fosfato Lisina Histidina Glicina Trehalosa Rafinosa

2

15mM 15mM 10 g/l

3

15mM 15mM 10 g/l

4

15mM 15mM 10 g/l

5

15mM 15mM 15mM 10 g/l

6

15mM 30mM 10 g/l

7

15mM 10 g/l

8

15mM 15mM 10 g/l

9

15mM 10 g/l

10

15mM 15mM 10 g/l

11

15mM 15mM 10 g/l

12

15mM 15mM 10 g/l

13

15mM 15mM 15mM 10 g/l

14

15mM 15mM 15mM 10 g/l

15

15mM 10 g/l

16

15mM 15mM 10 g/l

17

15mM 10 g/l

18

15mM 15mM 10 g/l

19

15mM 15mM 15mM 10 g/l

20

15mM 15mM 15mM 10 g/l

21

15mM 15mM 15mM 10 g/l

Como se ha demostrado anteriormente, la solución más transparente se consigue con una solución tampón citrato o HEPES en combinación con un aminoácido.

Para evaluar la estabilidad del rVWF liofilizado reconstituido, se llevaron a cabo ensayos VWF:Ag y VWF:RCo. VWF:Ag corresponde a la cantidad de VWF que puede detectarse en una prueba ELISA especifica de VWF

5 utilizando un anticuerpo anti-VWF, mientras que VWF:RCo corresponde a la cantidad de VWF que provoca la aglutinación de plaquetas estabilizadas en presencia de ristocetina. Las muestras se almacenaron a 40ºC. Asumiendo la aplicabilidad de la ecuación de Arrhenius, la estabilidad a un mes a 40ºC es equivalente a la de aproximadamente un año a 4ºC. Los resultados de los experimentos de estabilidad se muestran en las Tablas 8 y 9 siguientes.

10 Tabla 8

Semanas a 40ºC

formulación VWF:Ag

0 4 5 8

1

121,1 89,8 113,0 106,6

2

121,8 102,0 114,0 112,8

3

119,9 102,0 105,,0 112,7

4

117,3 100,0 108,0 114,4

5

121,2 98,2 117,0 114,9

6

123,8 96,6 107,0 -

7

135,2 96,6 112,0 112,4

8

130,6 82,2 108,0 115,7

9

112,0 89,5 109,0 107,0

10

122,4 87,1 106,0 107,7

11

119,3 97,5 115,0 114,2

12

124,2 109,0 109,0 103,4

13

110,2 92,3 106,0 112,4

14

108,9 107,0 103,0 109,0

Tabla 9

Semanas a 40ºC

formulación rVWF:Ag

0 4 5 8

1

86 102 97,0 93,0

2

84 97 88,0 89,0

3

85 100 87,0 93,0

4

102 81,0 98,0

5

85 89 88,0 98,0

6

83 102 88,0

7

92 97,0 95,0

8

88 94 90,0 104,0

9

93 91 97,0 100,0

10

95 87 87,0 87,0

11

86 93 89,0 99,0

12

84 91 89,0 95,0

13

88 87 96,0 89,0

14

90 91 86,0 92,0

La desviación estándar correspondiente al ensayo ELISA oscila entre un 10 y un 20%. Los resultados anteriores 15 indican que todas las formulaciones sometidas al ensayo tienen una adecuada estabilidad durante 8 semanas a 40ºC.

Se llevaron a cabo experimentos adicionales de estabilidad en los que se utilizaron diferentes aminoácidos en las formulaciones (por ejemplo, glicina, lisina o histidina a 15 mM o 20 mM) y donde se modificaba la solución tampón citrato (por ejemplo, 15, 20 o 25 mM). Como se ha descrito anteriormente, la estabilidad del rVWF se supervisó 20 utilizando el ensayo de actividad VWF:RCo. Incluso al cabo de 13 meses no se observaron diferencias importantes para los valores de actividad VWF:RCo de las muestras de estabilidad rVWF almacenadas a 40ºC. Se evaluó la importancia de las mediciones mediante un Test-t. La precisión intermedia del ensayo se determinó calculando el Coeficiente de Varianza. En todas las series de los datos de estabilidad el CV se mantuvo por debajo del 20% cumpliendo el criterio de validación de CV<20%. En función de cuanto antecede puede deducirse que el rVWF es 25 estable en todos los sistemas con solución tampón citrato sometidos a ensayo, independientemente de la molaridad del tampón y de los aminoácidos añadidos. El rVWF sigue manteniendo la estabilidad al menos durante 13 meses,

incluso aunque se almacene a 40ºC. La determinación de la potencia mediante el ensayo de actividad VWF:RCo muestra una adecuada precisión intermedia, con unos valores de CV por debajo de 20%.

Así, teniendo en cuenta los datos que se presentan en este documento, se ha propuesto una formulación de rVWF que incluye 15 mM de citrato (Na3 Citrato x 2 H2O), 15 mM de glicina, 10 g/l de trehalosa, 20 g/l de manitol y 0,1 g/l 5 de Tween-80, con un pH de 7,3.

Ejemplo 4: Estabilidad a largo plazo

Pruebas aceleradas y de estabilidad a largo plazo

Se llevaron a cabo estudios de evaluación de la estabilidad del producto farmacéutico final rVWF (FDP) almacenado de acuerdo con las condiciones de almacenamiento recomendadas y restrictivas. Los datos de las condiciones de

10 almacenamiento restrictivas garantizan que las desviaciones en materia de temperatura no afectarán a la calidad del FDP rVWF y se utilizarán para extrapolar la condición aceptable a la caducidad del material en ausencia de datos de estabilidad en tiempo y condiciones reales.

Las actuales especificaciones dictan una humedad residual ≤ 3,0% (determinada mediante el Método de Karl Fischer). Los lotes rVWFF#4FC, rVWFF#5FC, rVWFF#6FC y rVWFF#7FC se lanzaron con unos niveles de

15 humedad del 1,2%, 1,3%, 1,2%, y 1,5% respectivamente. En función de la experiencia anterior con otros productos con configuraciones de vial y tapón similares, se espera que cualquier lote de rVWF lanzado con una humedad residual de aproximadamente un 1,3% se atenga a los límites de la especificación de ≤ 3,0% al término de la vida útil propuesta (es decir, 24 meses a la temperatura de almacenamiento prevista de 5ºC ± 3ºC).

Los estudios de estabilidad a largo plazo en las condiciones de almacenamiento recomendadas (es decir, 5ºC ± 3ºC)

20 y a temperaturas elevadas (es decir, 40ºC ± 2ºC) se llevaron a cabo con cuatro lotes FDP rVWF fabricados. Estos estudios han aportado datos suficientes para comparar la estabilidad de los lotes clínicos individuales.

El protocolo de estabilidad, incluyendo una descripción de los ensayos indicadores de estabilidad y los criterios de aceptación de estabilidad, pueden encontrarse en la Tabla 10, la cual también contiene información relacionada cono los lotes de FDP rVWF evaluados en los estudios de estabilidad.

25 Tabla 10

Cond.almacenamiento (ºC)

Nº de lote Intervalos de prueba completados (y completos)

5ºC ± 3ºC

rVWF#1 FC 0, 1, 2, 3, 6, 9, 12, 18, 24 meses

30ºC

rVWF#1 FC 0, 1, 3, 6 meses

5ºC ± 3ºC

rVWF#2FC 0, 1, 2, 3, 6, meses

5ºC ± 3ºC

rVWF#3FC 0, 2, 3, 6, 9, 12, 18, 24 meses

30ºC

rVWF#3FC 0, 0.5, 1, 2, 3, 6 meses

40ºC

rVWF#3FC 0, 0.5, 1, 2, 3 meses

5ºC ± 3ºC

rVWF#4FC 0, 1, 6, 9, 12, 18, 24, (30) meses

40ºC

rVWF#4FC 0, 1, 2, 3, 6, 9 meses

5ºC ± 3ºC

rVWF#5FC 0, 1,2, 3, 6, 9, 12, 18, (24, 30) meses

40ºC

rVWF#5FC 0, 1, 2, 3 6, 9 meses

5ºC ± 3ºC

rVWF#6FC 0, 1, 2, 3, 6, 9, 12, (18, 24, 30) meses

40ºC

rVWF#6FC 0, 1, 2, 3, 6, 9 meses

5ºC ± 3ºC

rVWF#7FC 0, 1, 2, 3, 6, 9, 12, (18, 24, 30) meses

40ºC

rVWF#7FC 0, 1, 2, 3, 6, 9 meses

Resumen y comentarios acerca de la estabilidad global (24 meses)

Los datos de estabilidad del FDP rVWF presentados constan de:

1. Datos de 24 meses de estudios a largo plazo a 5ºC ± 3ºC (ensayo completo) y datos intermedios de 6 meses a 30 30ºC ± 2ºC (ensayo completo) del lote rVWF#1FC;

2.

Datos de 6 meses a 5ºC ± 3ºC (ensayo completo) del lote rVWF#2FC;

3.

Datos de 24 meses de estudios a largo plazo a 2ºC-8ºC (ensayo completo), datos de 6 meses a 30ºC ± 2ºC y datos de 3 meses a 40ºC ± 2ºC (ensayo completo) del lote rVWF#3FC;

4.

Datos de estabilidad a 24 meses a 5ºC ± 3ºC y datos de 9 meses a 40ºC ± 2ºC del lote rVWFF#4FC;

35 5. Datos de estabilidad a 24 meses a 5ºC ± 3ºC y datos de 9 meses a 40ºC ± 2ºC del lote rVWFF#5FC;

6.

Datos de estabilidad a 12 meses a 5ºC ± 3ºC y datos a 9 meses a 40ºC ± 2ºC del lote rVWFF#6FC; y

7.

Datos de estabilidad a 12 meses a 5ºC ± 3ºC y datos a 9 meses a 40ºC ± 2ºC del lote rVWFF#7FC.

La variación observada en la humedad residual de los lotes rVWFF#4FC, rVWFF#5FC, rVWFF#6FC y rVWFF#7FC permaneció muy por debajo del criterio de aceptación de ≤ 3%, y no afecta a la actividad funcional (VWF:RCo). No se produjeron cambios reseñables en los resultados de estabilidad para las técnicas analíticas cualitativas (es decir, aspecto, análisis SDS-PAGE, etc.) para que los lotes fabricados fuesen adecuados para su uso en estudios clínicos

5 y no clínicos. Igualmente, no se observó tendencia alguna en la disminución de la estabilidad para el análisis total de proteínas, el análisis VWF:Ag o el número observado de multímeros de VWF durante el almacenamiento.

Las variaciones en la proporción de actividad VWF:RCo frente a la actividad VWF:Ag y los datos VWF:RCo presentados en relación con los lotes rVWF#1FC, rVWF#2FC y rVWF#3FC se debieron probablemente a la variación en el método de ensayo, al hecho de que los resultados de la prueba individual de estabilidad de

10 VWF:RCo eran datos obtenidos a partir de una sola determinación de una muestra de estabilidad, y/o datos obtenidos con la metodología de ensayo no acorde con Ph. Eur. Todos los hitos de tiempo de ensayo correspondientes a los lotes no clínicos con posterioridad al cambio de la metodología del ensayo por una metodología de ensayo conforme a Ph.Eur. se sometieron a la prueba utilizando la nueva metodología de ensayo y la original.

15 El FDP rVWF fabricado a gran escala presentaba características similares a las de los lotes de FDP rVWF fabricados a escala experimental. Estos lotes FDP rVWF mantuvieron la actividad de VWF:RCo durante un período de hasta 24 meses de almacenamiento a 5ºC ± 3ºC No se produjeron cambios en el patrón del multímero VWF en las muestras de los lotes a gran escala actualmente estables, incluso al cabo de 6 meses de almacenamiento a 30ºC ± 2ºC o de 9 meses de almacenamiento a 40ºC ± 2ºC. La Tabla 11 muestra los resultados de VWF:RCo, VWF:Ag y

20 del patrón del multímero de VWF de los lotes rVWF#4FC, rVWF#5FC, rVWF#6FC y rVWF#7FC almacenados en unas condiciones de estrés de 40ºC ± 2ºC. Los resultados indican su estabilidad en condiciones de almacenamiento a temperatura elevada durante 9 meses, lo que puede extrapolarse a una vida útil de más de 3 años a temperatura ambiente, o incluso más prolongada en condiciones de refrigeración.

Tabla 11

Datos de estabilidad de rVWF#4FC a 40ºC ± 2ºC

Atributo

Especificación Resultados al cabo de (meses)

0

1 2 3 6 9

Act. VWF:RCo [U/m)]" 11

70-150 130 117 118 127 132 142

VWF:Ag ELISA (U/ml)

Resultado informe 86 87 79 81 79 86

Análisis multímero VWF

Resultado informe 21 20 20 20 21 18

Datos de estabilidad de rVWF#5FC a 40ºC ± 2ºC

Actividad VWF:RCo [U/ml]'

70-150 107 119 120 116 132 134

VWF:Ag ELISA (U/ml)

Resultado informe 94 86 84 91 90 79

Análisis multímero VWF

Resultado informe 20 20 18 19 20 19

Datos de estabilidad de rVWF#6FC a 40ºC ± 2ºC

Actividad VWF:RCo [U/ml]'

70-150 118 111 126 129 130 119

VWF:Ag ELISA (U/ml)

Resultado informe 85 95 86,3 73,5 80,8 70,3

Análisis multímero VWF

Resultado informe 20 19 20 20 20 n.t.

Datos de estabilidad de rVWF#7FC a 40ºC ± 2ºC

Actividad VWF:RCo [U/ml]1

70-150 111 115 122 105 99 112

VWF:Ag ELISA (U/ml)

Resultado informe 87,3 85,3 77,5 68,8 75 73,8

Análisis multímero VWF

Resultado informe 21 20 20 19 19 19

Un análisis de covarianza (análisis ANCOVA) demostró que la diferencia en las pendientes de las líneas de regresión (lotes rVWFF#4FC, rVWFF#5FC, rVWFF#6FC y rVWFF#7FC almacenados a 5ºC ± 3ºC) no era significativa (p = 0,906), lo que permite agrupar los datos de actividad VWF:RCo como se describe en ICH Q1A (R2). La diferencia en la elevación de las líneas de tendencia de los lotes individuales tampoco es significativa. La 30 extrapolación de la pendiente agrupada del caso menos favorable, como se muestra en la Figura 1, muestra que los intervalos de confianza se mantienen dentro de los criterios de aceptación para un mínimo de 24 meses. El intervalo de menor confianza para la curva media disminuye hasta el 80% de la actividad inicial a los 51 meses (80% es también la máxima diferencia entre la potencia estimada y la potencia establecida para el Factor Humano von Willebrand en Ph.Eur). La pendiente agrupada del caso menos favorable muestra una disminución mensual de

35 0,0344 U VWF:RCo. Esta comparación demuestra que las características de estabilidad de la FDP rVWF y específicamente que la actividad de VWF:RCo no experimentaron alteraciones como resultado de los cambios acaecidos en el proceso de producción. La extrapolación anterior respalda la ampliación de la vida útil provisional de la FDP rVWF a 24 meses cuando se almacena a la temperatura de almacenamiento recomendada.

La transferencia de humedad desde el tapón al producto liofilizado depende del material del tapón y se ve afectada

40 por la humedad residual del tapón tras su esterilización, la humedad a la que se almacena la muestra y la tasa intrínseca de transferencia de la humedad del tapón. La humedad residual de los lotes rVWFF#4FC, rVWFF#5FC, rVWFF#6FC y rVWFF#7FC almacenados a 5ºC ± 3ºC alcanzó niveles comparables (sin que fuese significativa la diferencia en la comparación de las pendientes, siendo p = 0,734), como se muestra en la Figura 2. Los lotes almacenados en condiciones de temperatura elevada, de 40ºC ± 2ºC también mostraron un incremento comparable de la humedad residual a lo largo de 9 meses (Figura 3). El análisis ANCOVA demuestra en este caso que la diferencia en la pendiente de las líneas de regresión es comparable (p = 0,546). La Figura 3 muestra la extrapolación

5 de las pendientes agrupadas del caso menos favorable hasta 24 meses.

Estos datos resultan suficientes para respaldar el uso de los lotes rVWFF#6FC y rVWFF#7FC durante el período correspondiente al período de caducidad descrito de 24 meses cuando se almacenan a 5ºC ± 3ºC.

Condiciones de almacenamiento propuestas y vida útil

Las condiciones de almacenamiento recomendadas para la FDP rVWF son de 5ºC ± 3ºC. Por tanto, se propone una

10 vida útil provisional de 24 meses para la FDP rVWF cuando se almacena en las condiciones de almacenamiento recomendadas. Probablemente, la vida útil de los lotes FDP rVWF puede ampliarse aún más, en función de los datos adicionales que han de generarse para períodos de almacenamiento más prolongados.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Schnecker y col.

<120> FORMULACIONES DE VWF RECOMBINANTE LIOFILIZADO 5 <130> 31315/44042A

<150> US-61/107,273

<151> 2008-10-21

<160> 3

<170> Patentln version 3.5 10 <210> 1

<211> 8833 <212> DNA <213> Homo sapiens

<400> 1

Claims (14)

1. REIVINDICACIONES

   1. Formulación farmacéutica estable liofilizada de un factor von Willebrand recombinante (rVWF) que comprende: (a) un rVWF; (b) uno o más agentes tampón; (c) uno o más aminoácidos; (d) uno o más agentes estabilizantes; y (e) uno o más tensioactivos, preparándose dicha formulación mediante la liofilización de una solución que comprende:

   (a) dicho rVWF, comprendiendo un polipéptido seleccionado de entre el grupo consistente en: a) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº 3; b) un análogo, fragmento o variante de a) capaz de causar la aglutinación de las plaquetas

   estabilizadas en presencia de ristocetina o de unirse al Factor VIII; c) un polipéptido codificado por el nucleótido dee SEQ ID Nº 1; d) un análogo, fragmento o variante de c) capaz de causar la aglutinación de las plaquetas

   estabilizadas en presencia de ristocetina o de unirse al Factor VIII; y e) un polipéptido codificado por un nucleótido que se hibrida con el polinucleótido de SEq ID Nº 1 bajo condiciones de hibridación moderadamente restrictivas;

   (b)

   comprendiendo dicho tampón un agente tampón del pH en un rango de aproximadamente 0,1 mM y aproximadamente 500 mM y con un pH de aproximadamente 2,0 a aproximadamente 12,0;

   (c)

   estando presente dicho aminoácido a una concentración de aproximadamente 1 a aproximadamente 500 mM;

   (d)

   estando presente dicho agente estabilizante a una concentración de aproximadamente 0,1 a aproximadamente1.000 mM; y

   (e)

   estando presente dicho tensioactivo a una concentración de aproximadamente 0,01 g/l a 0,5 g/l.

2. 2.

   Formulación según la reivindicación 1, caracterizada porque el rVWF comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº 3.

3. 3.

   Formulación según la reivindicación 1, caracterizada porque el agente tampón se selecciona de entre el grupo consistente en citrato, glicina, histidina, HEPES, Tris y combinaciones de los mismos.

4. 4.

   Formulación según la reivindicación 1, caracterizada porque el pH de la solución está en el rango de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 8,0, por ejemplo aproximadamente 6,5 a aproximadamente 7,5, tal como 7,3.

5. 5.

   Formulación según la reivindicación 1, caracterizada porque el agente tampón de la solución es citrato y el pH es aproximadamente 7,3.

6. 6.

   Formulación según la reivindicación 1, caracterizada porque el aminoácido se selecciona de entre el grupo consistente en glicina, histidina, prolina, serina, alanina y arginina.

7. 7.

   Formulación según la reivindicación 6, caracterizada porque el aminoácido está presente en un rango de concentración de aproximadamente 0,5 mM a aproximadamente 300 mM en la solución.

8. 8.

   Formulación segúne la reivindicación 7, caracterizada porque el aminoácido es glicina a una concentración de aproximadamente 15 mM en la solución.

9. 9.

   Formulación según la reivindicación 1, caracterizada porque el rVWF comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº 3, el agente tampón de la solución es citrato y el pH es aproximadamente 7,3; y porque el aminoácido es glicina a una concentración de aproximadamente 15 mM en la solución.

10. 10.

    Formulación según la reivindicación 1, caracterizada porque el o los agentes estabilizantes se seleccionan de entre el grupo consistente en manitol, lactosa, sorbitol, xilitol, sacarosa, trehalosa, manosa, maltosa, lactosa, glucosa, rafinosa, celobiosa, gentiobiosa, isomaltosa, arabinosa, glucosamina, fructosa y combinaciones de los mismos.

11. 11.

    Formulación según la reivindicación 10, caracterizada porque los agentes estabilizantes son trehalosa a una concentración de aproximadamente 10 g/l en la solución y manitol a una concentración de aproximadamente 20 g/l en la solución.

12. 12.

    Formulación según la reivindicación 1, caracterizada porque el tensioactivo se selecciona de entre el grupo

    5 consistente en digitonina, Triton X-100, Triton X-114, TWEEN-20, TWEEN-80 y combinaciones de los mismos.

13. 13.

    Formulación según la reivindicación 12, caracterizada porque el tensioactivo es TWEEN-80 a una concentración de aproximadamente 0,01 g/l en la solución.

14. 14.

    Formulación según la reivindicación 1, caracterizada porque el rVWF comprende la secuencia de

    10 aminoácidos de SEQ ID Nº 3, el agente tampón de la solución es citrato a una concentración aproximadamente 15 mM con un pH de aproximadamente 7,3, el aminoácido es glicina a una concentración aproximadamente 15 mM en la solución, los agentes estabilizantes son trehalosa a una concentración en solución de aproximadamene 10 g/l y manitol a una concentración en solución de aproximadamente 20 g/l y el tensioactivo es TWEEN-80 a aproximadamente 0,1 g/l en la solución.

    Figura 1 Figura 2 Figura 3