ES2339912B1

ES2339912B1 - Metodo para la deteccion y/o cuantificacion de esporos de clostridiumtyrobutyricum mediante citometria de flujo.

Info

Publication number: ES2339912B1
Application number: ES200803355A
Authority: ES
Inventors: Maria Lavilla Martin; Miguel Calvo Rebollar; Maria Lourdes Sanchez Paniagua; Ruth De Luis Perez; Maria Dolores Perez Cabreras
Original assignee: Universidad de Zaragoza
Current assignee: Universidad de Zaragoza
Priority date: 2008-11-25
Filing date: 2008-11-25
Publication date: 2011-03-22
Anticipated expiration: 2028-11-25
Also published as: ES2339912A1

Abstract

Método para la detección y/o cuantificación de esporos de Clostridium tyrobutyricum mediante citometría de flujo.

La presente invención se encuadra dentro del sector del control de alimentos y en concreto, dentro del sector de los métodos de detección de microorganismos en alimentos basados en la utilización de técnicas inmunoquímicas. Más concretamente, la invención se basa en un método para la detección y/o cuantificación de esporos de Clostridium tyrobutyricum mediante la concentración de los esporos de una muestra láctea, la formación de complejos junto con anticuerpos policlonales específicos anti-esporo conjugados con un fluorocromo y la detección de dichos complejos mediante citometría de flujo.

Description

Estado de la técnica anterior

Clostridium tyrobutyricum es un bacilo Gram (+), anaerobio estricto, capaz de metabolizar el lactato como fuente de carbono. Sus condiciones óptimas de crecimiento son a una temperatura de 35ºC, a un pH de 5,8 y con bajos niveles de sal en los quesos, es termorresistente y bajo condiciones desfavorables, es capaz de esporular. La endospora es liberada cuando la célula vegetativa se degrada.

El hábitat principal de estas bacterias es el suelo, en estas condiciones, las bacterias contienen una endospora (esporo) que ingresa al tracto intestinal de la vaca por medio del alimento en el que crece la bacteria y esporula. Posteriormente los esporos, eliminados por los animales con las heces, contaminan el medio, de aquí pasan a la leche en el momento del ordeño y cuando ésta se utiliza para elaborar queso, y si las condiciones son favorables, pueden llegar a producir células de Clostridium tyrobutyricum vegetativas que producen cambios indeseables (hinchazón tardía) en la calidad organoléptica de los quesos debido a la fermentación butírica que tiene lugar.

La hinchazón tardía depende del número inicial de esporos de Clostridium tyrobutyricum presentes en la leche. Se ha establecido que el número de esporos necesarios en leche para causar hinchazón tardía en queso Suizo y variedades de queso Gouda es de 1 a 5 esporas/ml (Hull et al., (1992) Australian Journal of Dairy Technology 47: 91-94).

La fermentación butírica es un grave problema en la fabricación de quesos de pasta dura y semidura, que ocasiona pérdidas de millones de euros en el sector cada año. Dicho problema se manifiesta a lo largo de la maduración del queso y provoca un defecto conocido como la "hinchazón tardía". En España, una parte importante de la producción quesera se ve afectada potencialmente por este problema (Rilla et al., 2003. International Journal of Food Microbiology 85 (1): 23-33.; González et al., 2007. Food Control 18 (6): 716-722.; Anónimo (2007a). Resolución de 11 de Julio de 2007, del Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria. Boletín Oficial de España 208: 36181-36182). El principal agente responsable de la fermentación butírica es Clostridium tyrobutyricum (Bergère y Sivelä, 1990. Bulletin of the International Dairy Federation 251: 15-23), una bacteria Gram positiva, formadora de esporos, anaerobia estricta y no patógena para humanos y animales (Wiedmann et al., 2000. Encyclopedia of Food Microbiology. Robinson RK, Batt CA y Patel PD (Editores), Academic Press, London, pp: 451-458), que procede fundamentalmente de los ensilados. Los esporos de Clostridium tyrobutyricum contaminan la leche y permanecen en ella hasta que se utiliza para la elaboración del queso, dado que el tratamiento térmico de pasteurización que recibe la leche, previamente, es insuficiente para inactivar los esporos (Franciosa et al., 1999. Journal of Food Protection. 62: 867-871).

A lo largo de la maduración del queso se produce la germinación de los esporos, seguida de una multiplicación de las formas vegetativas, que metabolizan el lactato y liberan como productos de la fermentación, gas (H_{2} y CO_{2}) y ácido butírico (Rosen et al., 1989. Milchwissenschaft. 44 (6): 355-357; Herlin y Christiansson, 1993. Milchwissenschaft. 48 (12): 686-690). Como consecuencia, se pueden producir también defectos organolépticos en el queso como mal olor y sabor, debidos a la presencia de ácido butírico (Bergère y Favreau, 1987. Sciences des Aliments. 7 (nº hors-serie VII): 89-98).

Los métodos actuales de análisis utilizados para la detección de esporos de Clostridium tyrobutyricum son de varios tipos, en el de tipo microbiológico se tardan 7 días en obtener un resultado, tiempo en el que la leche ha sido ya utilizada en la elaboración de queso. Para evitar la fermentación se añade lisozima de huevo a la leche destinada a la producción de quesos madurados, con carácter preventivo y de forma generalizada, pero éste es un producto enzimático de elevado coste.

Los métodos inmunoquímicos presentan un límite de detección de hasta 30 esporos/ml. Para llegar a detectar los esporos con estos límites de detección, se concentran éstos mediante técnicas como la filtración en membrana de 0,45 micrómetros (WO8806734 A1).

Existen otros métodos de detección de Clostridium tyrobutyricum que consisten en técnicas de amplificación por PCR de fragmentos de ADN de genes específicos como por ejemplo el gen de la flagelina (López-Enríquez et al., (2007) Applied and Environmental Microbiology 73(11): 3747-3751). La detección de esporos de Clostridium tyrobutyricum mediante esta técnica tiene límites de detección similares al propuesto en la presente invención pero supone diversas etapas complejas de extracción del ADN de los esporos puesto que es conocido que los esporos de las bacterias esporulantes tienen unas cubiertas que las hacen resistentes a numerosas condiciones adversas. Debido a la estructura de las cubiertas de los esporos, para extraer el contenido de ácidos nucleicos son necesarios tratamientos prolongados y complejos con detergentes y enzimas que digieran las cubiertas. Esta serie de pasos hacen de éste método de detección un método complejo que, en el caso de que los esporos hayan desarrollado cubiertas más resistentes de lo habitual, la no extracción de ADN de todos los esporos puede suponer una infravaloración en la detección.

Teniendo en cuenta que el agente causante del problema de hinchazón tardía es la forma esporulada, la eficacia del método descrito por López-Enríquez et al. (2007) depende, en primer lugar, de un tratamiento óptimo de las muestras para conseguir acceder al ADN pero, además, en segundo lugar, de la eficacia de la amplificación por PCR (dependiente de muchos factores incluyendo la presencia de inhibidores).

Explicación de la invención

La presente invención se basa en un método para la detección y/o cuantificación de esporos de Clostridium tyrobutyricum mediante la concentración de los esporos de una muestra láctea, la formación de complejos junto con anticuerpos policlonales específicos anti-esporo conjugados con un fluorocromo y la detección de dichos complejos mediante citometría de flujo.

Mediante este método se consigue un efecto sorprendente ya que se mejora considerablemente el límite de detección de otros métodos basados en técnicas de inmunodetección (en el mejor de los casos 30 esporos/ml). En la presente invención se obtiene un resultado inesperado al conseguirse un límite de detección de 5-10 esporos/ml de leche mediante etapas sencillas; la selección de las fracciones de la leche que contienen los esporos, el tratamiento de estas fracciones para evitar el enmascaramiento de los esporos, la concentración de los esporos y su detección mediante citometría de flujo tras formar los complejos esporos-anticuerpos-fluorocromo. Además, mediante el método descrito en la presente invención se consiguen límites de detección similares a los obtenidos con métodos más complejos y con mayor número de inconvenientes como es el caso de los métodos basados en técnicas de PCR citadas en el estado de la técnica. Es conocido que los esporos de las bacterias esporulantes tienen unas cubiertas que las hacen resistentes a numerosas condiciones adversas, lo que permite a estos microorganismos colonizar ambientes cuando las condiciones son favorables. Debido a la estructura de las cubiertas de los esporos, para extraer el contenido de ácidos nucleicos es necesario un tratamiento prolongado y complejo con detergentes y enzimas que digieran las cubiertas.

Teniendo en cuenta que el agente causante del problema de hinchazón tardía es la forma esporulada, el método de la presente invención permite detectar de forma específica los esporos de Clostridium tyrobutyricum sin los problemas que pueden encontrar técnicas basadas en la extracción del ADN contenido en los esporos, más rápida y mejorando los límites de detección de las técnicas inmunoquímicas del estado de la técnica.

El término esporos hace referencia a las formas de resistencia que adoptan las bacterias, en el caso de esta invención, de la especie Clostridium tyrobutyricum ante condiciones ambientales desfavorables. Este término se utiliza como sinónimo de esporas.

En este sentido, un primer aspecto de la presente invención se refiere a un método de detección y/o cuantificación de esporos de Clostridium tyrobutyricum que comprende:

a.: Obtener una muestra láctea,

b.: seleccionar la fase grasa y/o la fase sedimento de la muestra del apartado (a),

c.: tratar la fase grasa y/o la fase sedimento del apartado (b), al menos, con un tensioactivo y una proteasa,

d.: concentrar los esporos presentes en el producto obtenido en el apartado (c),

e.: añadir anticuerpos policlonales anti-esporo de Clostridium tyrobutyricum conjugados con un fluorocromo, al producto obtenido en (d) y

f.: medir la dispersión de luz y la fluorescencia emitida por el complejo esporo-anticuerpo-fluorocromo obtenido en (e) mediante citometría de flujo.

La muestra láctea puede obtenerse por cualquier medio manual o mecánico. La muestra láctea puede ser cualquier tipo de derivado de la leche, incluyendo el queso.

El término "fase grasa" tal como se entiende en la presente invención es la parte de la leche representada por las grasas que forman parte de su composición. La fase grasa suele formar agregados o glóbulos grasos.

El término "fase sedimento" tal como se entiende en la presente invención es la parte de la leche representada por los compuestos insolubles o que pueden sedimentar.

La selección de la fase grasa y/o la fase sedimento se lleva a cabo por medio de técnicas físicas y/o químicas que permitan su separación del resto de componentes de la leche. Preferiblemente la citada selección se lleva a cabo por medio de centrifugación.

Las fases grasa y/o sedimento descritas anteriormente se tratan mediante un tensioactivo y una proteasa. Tal como se demuestra en los ejemplos correspondientes de la presente invención, los esporos se encuentran en la fase grasa y sedimento de la leche a juzgar por los recuentos comparados respecto con la leche desnatada. Además, el tratamiento de la muestra láctea con tensioactivo y proteasa, previo a su unión con los anticuerpos anti-esporo, se hace necesario ya que los esporos parecen agregarse e interaccionar con algunos componentes de la leche, principalmente con los glóbulos grasos, quedando "enmascarados" en partículas de diferente tamaño al que corresponde a los esporos y generando por tanto lecturas de dispersión de luz que tienen valores diferentes de la dispersión generada por los propios esporos. El tensioactivo tiene la función de provocar la emulsión de los glóbulos grasos. Los tensoactivos o tensioactivos son sustancias que influyen por medio de la tensión superficial en la superficie de contacto entre dos fases, facilitando la mezcla de las grasas con otros componentes de la solución, eliminando así la agregación de las grasas en forma
de glóbulos. Por otro lado, la proteasa destruye las proteínas que pudieran interferir con la detección de los esporos.

La concentración de los esporos se lleva a cabo por medio de cualquier técnica física y/o química que permita la separación de los mismos del resto de componentes de la muestra. Preferiblemente dicha concentración se lleva a cabo mediante la centrifugación de la muestra tratada según el apartado (c) del método, el desechado del sobrenadante y la resuspensión de la materia precipitada en un volumen de una solución adecuada, como por ejemplo tampón PBS.

Para la obtención de anticuerpos policlonales anti-esporo de Clostridium tyrobutyricum es necesario inyectar en un animal, como por ejemplo un conejo, esporos de Clostridium tyrobutyricum para inmunizarlo. Con este propósito, se realizan inyecciones subcutáneas con una suspensión de esporos de Clostridium tyrobutyricum. Unas semanas más tarde, los conejos se reinyectan con una cantidad igual de esporos, preferiblemente después de tres semanas. A continuación se efectúa una sangría de prueba y se comprueba la presencia de anticuerpos por el método de inmunodotting, preferiblemente dos semanas después de la segunda inoculación de esporos. Para las sangrías sucesivas, los animales se dejan recuperar durante varias semanas, preferiblemente dos semanas, repitiéndose las inoculaciones cada mes aproximadamente.

Los anticuerpos policlonales anti-esporo de Clostridium tyrobutyricum son unidos, preferiblemente por conjugación, con un fluorocromo.

Un fluorocromo es una molécula química que absorbe luz a una determinada longitud de onda (energía) y emite a una longitud superior (menor energía). El espectro de absorción o excitación es el rango sobre el que un fluorocromo absorbe luz, y el espectro de emisión es el rango sobre el que un fluorocromo emite luz. Cuando un fluorocromo interacciona con la luz de excitación procedente del láser emite energía radiante. Debido a que parte de la energía se utiliza para la absorción, la luz emitida es de menor energía que la luz de excitación, es decir la longitud de onda emitida es mayor y de esta manera se puede llevar a cabo una lectura de la intensidad de fluorescencia a la longitud de onda máxima de emisión.

La citometría de flujo es una técnica de análisis celular multiparamétrico cuyo fundamento se basa en hacer pasar una suspensión de partículas (células, esporos, etc.) alineadas y de una en una por delante de un haz de láser focalizado. El impacto de cada célula con el rayo de luz produce señales que corresponden a diferentes parámetros de la célula y que son recogidos por distintos detectores. Estos detectores convierten dichas señales en señales electrónicas que posteriormente serán digitalizadas para permitir la medida simultánea de varios parámetros en un mismo esporo. Estos parámetros son:

- Parámetros relacionados con características intrínsecas del esporo, como su tamaño y forma.

- Parámetros relacionados con características antigénicas de cada célula.

Por lo tanto la citometría de flujo ofrece información acerca de las características antigénicas y/o por sus características morfológicas de tamaño y complejidad con la que se puede identificar un esporo llevando a cabo la extracción adecuada, concentración y marcado de los mismos con un fluorocromo.

Las señales producidas por la interacción de los esporos con el haz de luz son de dos tipos:

- Señales de dispersión: La dispersión resulta de la interacción de la luz con una partícula que produce un cambio de dirección (no de la longitud de onda) en todas las direcciones del espacio. Las características morfológicas que determinan la dispersión de la luz son fundamentalmente el tamaño celular, la forma y complejidad de las cubiertas de los esporos. En los citómetros de flujo se miden dos fracciones de dispersión:

- FSC (Forward Scatter Cytometry) es la luz dispersada en ángulo cónico pequeño (0-10º) que casi coincide con la dirección de la luz incidente. Es una medida proporcional al tamaño del esporo que produce la dispersión.

- SSC (Side Scatter Cytometry) es la luz dispersada en ángulo recto. Es una medida que indica la forma y complejidad.

Las lecturas de las señales de dispersión producidas son representadas de forma habitual por medio de citogramas. Las lecturas recibidas se representan formando agrupaciones homogéneas de puntos y su posición dentro del citograma depende de sus características físicas de dispersión (SSC/FSC). En los citogramas de dispersión, los esporos se colocan en relación a su tamaño (FSC) y a la complejidad de su núcleo y citoplasma (SSC). Si en un citograma de dispersión X corresponde a FSC (tamaño), las lecturas de esporos ubicados más a la derecha indicarán un tamaño más grande y las ubicadas la izquierda, más pequeño. Si Y corresponde a SSC (complejidad), las lecturas de esporos ubicadas más arriba indicarán mayor complejidad de los esporos que las ubicadas más abajo. Es decir, a mayor valor de X y de Y, los esporos serán más grandes y complejos, y a menor X y menor Y los esporos serán más pequeños y menos complejos. En definitiva, cada tipo de esporo (por lo que respecta a la presente invención) tiene unos valores definidos SSC y FSC.

Además de las características anteriores, para poder identificar un esporo de la especie Clostridium tyrobutyricum es necesario unirlos a una molécula de forma específica e inequívoca. Para ello, tal como se ha descrito anteriormente y tal como se detalla en los ejemplos correspondientes, se sintetizan anticuerpos policlonales anti-esporo y se conjugan a un fluorocromo. La formación del complejo específico esporo-anticuerpo-fluorocromo emitirá una señal de fluorescencia procedente de los citados complejos, siendo la cantidad de señal de fluorescencia emitida proporcional a la cantidad de esporos unidos específicamente a un anticuerpo que reconoce un antígeno específico del citado esporo.

Una realización preferida del principal aspecto de la invención es un método donde la muestra láctea es leche.

Por una parte, en las explotaciones ligadas al pastoreo y a la producción de forrajes conservados de cultivos herbáceos se emplean dos formas de conservación de dichos forrajes: el henificado y el ensilado. Un mal manejo de los silos tanto en el proceso de realización como en la conservación, puede provocar la contaminación del mismo con microorganismos indeseables que luego, a través de la alimentación, pasarían a la leche de los ganados.

Por otra parte, la fermentación butírica es un grave problema en la fabricación de quesos de pasta dura y semidura. El principal agente responsable de la fermentación butírica es Clostridium tyrobutyricum. Los esporos de Clostridium tyrobutyricum contaminan la leche y permanecen en ella hasta que se utiliza para la elaboración del queso en el que se produce la germinación de los esporos, seguida de una multiplicación de las formas vegetativas, que metabolizan el lactato y liberan como productos de la fermentación, gas (H_{2} y CO_{2}) y ácido butírico. Como consecuencia, se pueden producir también defectos organolépticos como mal olor y sabor, debidos a la presencia de ácido butírico.

Otra realización preferida es un método donde el tensioactivo es no iónico y la proteasa es proteinasa K. Preferiblemente el tensioactivo no iónico es Tritón X-100 (C_{14}H_{22}O(C_{2}H_{4}O)_{n} donde el número promedio de unidades de óxido de etileno se estima en 9 ó 10).

En otra realización preferida más del método, los anticuerpos policlonales se conjugan o bien con el fluorocromo isocianato de fluoresceína o bien con el fluorocromo 2,3,5,6-tetrafluorofenilo.

Otra realización preferida es un método donde la intensidad de fluorescencia emitida por el complejo esporo-anticuerpo-fluorocromo es de entre 12 y 10000 unidades arbitrarias (u.a) de fluorescencia y la dispersión de luz es de entre 270 y 8600 u.a. para SSC y de entre 8 y 210 u.a. para FSC. Los parámetros de dispersión de luz indican el tamaño y la forma de los esporos de Clostridium tyrobutyricum, de tal forma que los intervalos seleccionados indican que el tamaño y forma de los esporos que se están detectando corresponden a esporos de Clostridium tyrobutyricum o muy similares. Para detectar de forma inequívoca estos esporos, además de tener en cuenta los valores de los parámetros SSC y FSC, se tiene en cuenta intensidad de la fluorescencia emitida por el complejo esporo-anticuerpo-fluorocromo. De esta forma, las lecturas de dispersión de luz e intensidad de fluorescencia que entren dentro de los intervalos descritos, indicarán que corresponden a esporos de Clostridium tyrobutyricum.

En una realización más preferida del método, la dispersión de luz es de entre 515 y 4500 para SSC y de entre 10 y 135 para FSC.

Otra realización preferida es un método donde la intensidad de fluorescencia emitida por el complejo esporo-anticuerpo-fluorocromo es de entre 12 y 1000 unidades de fluorescencia arbitraria cuando los anticuerpos policlonales se unen con el fluorocromo isocianato de fluoresceína. Otra realización preferida más es un método donde la intensidad de fluorescencia emitida por el complejo esporo-anticuerpo-fluorocromo es de entre 140 y 10000 unidades de fluorescencia arbitraria cuando los anticuerpos policlonales se unen con el fluorocromo 2,3,5,6-tetrafluorofenilo.

Otro aspecto de la presente invención es un kit para la detección de esporos de Clostridium tyrobutyricum que comprende anticuerpos policlonales anti-esporo de Clostridium tyrobutyricum unidos con un fluorocromo, un tensioactivo no iónico y una proteasa.

En este kit pueden incluirse instrucciones para la interpretación de las lecturas llevadas a cabo mediante la citometría de flujo así como otros componentes, ambos descritos en este apartado.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Las siguientes figuras y ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

Descripción de las figuras

Fig 1. Muestra la calibración de los parámetros de detección en función de FSC y SSC y selección de la ventana de análisis, con una escala lineal (A) y con una escala logarítmica (B).

Fig 2. Muestra las gráficas de puntos obtenidas del tampón sin esporos (A) y del análisis de suspensiones de 10^{5} esporos/mL de las cepas de Clostridium tyrobutyricum CECT 4011 (B), CECT 4012 (C) y una cepa salvaje aislada de queso (D).

Los histogramas de la derecha muestran la fluorescencia asociada a la región R1 delimitada para la población de esporos en la nube de puntos correspondiente. En los ejes de abcisas se representa la intensidad de la señal de fluorescencia, en función del número de eventos (en el eje de ordenadas) que presentan dicha intensidad.

Fig 3. Muestra los histogramas obtenidos del análisis de suspensiones de 10^{5} esporos/mL de Clostridium tyrobutyricum CECT 4011, incubados con anticuerpos pre-inmunes (pico negro) y anticuerpos específicos (pico gris), marcados con FITC (A), o con Alexa Fluor (ver ejemplos) (B).

Fig 4. Muestra los histogramas en 3D de las reacciones cruzadas de los anticuerpos anti-esporos de C. tyrobutyricum conjugados con FITC (A) y Alexa Fluor (B) con una suspensión de 10^{5} esporos o células/mL de 1. C. acetobutylicum CECT 508, 2. C. butyricum CECT 361, 3. Geobacillus stearothermophilus CECT 4516, 4. Lactobacillus plantarum CECT 220 y 5. C. sporogenes CECT 892. Como referencia, también se muestra el histograma procedente del análisis de una suspensión de Clostridium tyrobutyricum CECT 4011 a la misma concentración que las demás (6).

Fig 5. Muestra las gráficas de puntos obtenidas del análisis de una suspensión de 10^{5} esporos/mL de C. tyrobutyricum CECT 4011 (A) y C. sporogenes CECT 892 (B).

Fig 6. Muestra los análisis de las fracciones de la leche contaminada artificialmente con esporos de Clostridium tyrobutyricum: sedimento (1), grasa (2) y leche desnatada (3), sin esporos (A) y con esporos (10^{5} esporos/mL), marcados con FITC (B) o Alexa Fluor (ver ejemplos) (C). En los ejes de abcisas se representa la intensidad de la señal de fluorescencia, en función del número de eventos (en el eje de ordenadas) que presentan dicha intensidad.

Fig 7. Muestra la gráfica de puntos obtenida del análisis de dos muestras de leche contaminadas artificialmente con esporos de C. tyrobutyricum (10^{5} esporos/mL de leche), una muestra tratada con Tritón X-100 y proteinasa K (A) y otra sin tratar (B).

Fig 8. Muestra las gráficas de puntos e histograma asociados obtenidos del análisis de una suspensión de
esporos.

La suspensión de esporos (0,5 mL de PBS) se obtiene concentrando 100 mL de leche con una concentración inicial de 10 esporos/ml, y es incubada con anticuerpos específicos anti-esporos de Clostridium tyrobutyricum marcados con FITC (A) y con Alexa Flúor (ver ejemplos) (B). En los ejes de abcisas se representa la intensidad de la señal de fluorescencia, en función del número de eventos (en el eje de ordenadas) que presentan dicha intensidad.

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Ejemplos

A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos que describen el método de detección de esporas de Clostridium tyrobutyricum en una muestra de leche.

Ejemplo 1 Obtención de antisueros y aislamiento de los anticuerpos específicos

A cada conejo se le inoculó 0,5 ml de una suspensión de esporos (10^{8} esporos/mL) en tampón NaCl 0,15 M, K_{2}HPO_{4}/KH_{2}PO_{4} 10 mM, pH 7,4 (SSF), emulsionada con un volumen igual de adyuvante completo de Freund, en diez inyecciones subcutáneas en el lomo. A las cuatro semanas se realizó de nuevo una inoculación con una solución de esporos de la misma concentración, pero emulsionada en este caso con adyuvante incompleto de Freund. A los quince días de esta inoculación se llevó a cabo una sangría de prueba y se comprobó la presencia de anticuerpos en el suero sanguíneo. Si esta prueba resultaba positiva, los animales se sangraban realizando una pequeña incisión en la vena marginal de la oreja. Para las sangrías sucesivas, los animales se dejaron recuperar durante 15 días, repitiéndose las inoculaciones cada 30 días aproximadamente.

Para aislar los anticuerpos anti-esporos de C. tyrobutyricum, se preparó un inmunoadsorbente a partir de dichos esporos mediante insolubilización con glutaraldehído según el método de Avrameas y Ternynck (1967), adaptado para los esporos. Para ello, 10 mL de suero pre-inmune de conejo o de oveja, según el caso, se dializaron frente a tampón NaH_{2}PO_{4}/Na_{2}HPO_{4} 0,1 M, pH 7,0, y posteriormente se les añadieron los esporos de C. tyrobutyricum lavados con el mismo tampón de diálisis, hasta una concentración de 10^{8} esporos/mL. A dicha mezcla se le añadieron lentamente y con agitación muy suave 5 mL de una solución acuosa de glutaraldehído al 2,5% (v/v) y después se dejó gelificar en reposo durante 4 horas a temperatura ambiente. El gel formado se dispersó en tampón fosfato sódico 0,2 M, se homogeneizó y se centrifugó a 2000 \times g durante 15 minutos. El lavado se repitió hasta que la absorbancia del sobrenadante a 280 nm fue menor de 0,030.

Seguidamente, el gel se resuspendió con una solución de glicina-HCl 0,1 M, NaCl 0,5 M, pH 2,8, se dejó incubar durante 15 minutos y se volvió a centrifugar en las mismas condiciones. Finalmente, se equilibró con tampón fosfato potásico 0,1 M, pH 7,4 con azida sódica al 0,01% (p/v) como conservante.

Los anticuerpos anti-esporos se obtuvieron incubando 5 mL del antisuero con 10 mL del correspondiente insolubilizado con agitación suave durante 2 horas a temperatura ambiente. Después, el gel se introdujo en una columna y se lavó con tampón NaH_{2}PO_{4}/Na_{2}HPO_{4} 0,05 M, NaCl 0,5 M, pH 7,4 hasta que la absorbancia del excluido a 280 nm fue menor de 0,030. Tras el lavado, los anticuerpos específicos se eluyeron con tampón glicina-HCl 0,1 M, pH 3,1 y las fracciones eluidas se neutralizaron inmediatamente con volúmenes previamente calculados de Tris-HCl 0,5 M, pH 8,5. Por último, el eluido se concentró mediante centrifugación en conitos de ultrafiltración de punto de corte de 100.000 Da y se dializó frente a suero fisiológico.

Para el aislamiento de la fracción IgG del suero preinmune de conejo se llevó a cabo una doble precipitación selectiva mediante sulfato amónico. A un volumen determinado de suero se le añadió una solución EDTA 2 mM y (NH_{4})_{2}SO_{4} saturado siguiendo la proporción 2:3 (v/v) y se dejó incubar durante 20 minutos en agitación a 4ºC. Tras la incubación, la mezcla se centrifugó a 6000 \times g durante 15 minutos y se descartó el sobrenadante. El precipitado se resuspendió en PBS, en la mitad del volumen original de suero, y se volvió a centrifugar. El sobrenadante se transfirió a un nuevo tubo y se realizó una segunda precipitación con (NH_{4})_{2}SO_{4} en las mismas condiciones que la primera. Tras la segunda incubación, las proteínas precipitadas se sedimentaron de nuevo mediante centrifugación y se resuspendieron en PBS en un volumen correspondiente a un cuarto del volumen de suero original. Finalmente, las IgG aisladas se dializaron frente a PBS durante 48 horas con la finalidad de eliminar cualquier resto de (NH_{4})_{2}SO_{4} y se conservaron a -20ºC hasta su utilización.

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Ejemplo 2 Conjugación de los anticuerpos con moléculas fluorogénicas 2.1. Conjugación de los anticuerpos con FITC

Para la conjugación de los anticuerpos específicos anti esporos de Clostridium tyrobutyricum con isotiocianato de fluoresceína (FITC, de sus siglas en inglés) se siguió el protocolo especificado en Hermanson (1996) (Hermanson (1996). Bioconjugate Techniques. Academic Press, San Diego, CA, EEUU, 488-489).

Los anticuerpos se dializaron frente a tampón carbonato sódico 0,1 M, pH 9,0 y se concentraron hasta una concentración de al menos 2 mg/mL. Por otra parte, el isotiocianato de fluoresceína se disolvió, a una concentración de 1 mg/mL, en DMSO, protegiéndolo de la luz, así como en todos los pasos posteriores. Seguidamente, a 1 mL de la solución de inmunoglobulinas, se le añadieron muy lentamente 100 \muL de la solución de FITC. La mezcla se homogeneizó suavemente y se dejó incubar a 4ºC durante toda la noche con agitación muy suave.

Para bloquear las moléculas de FICT que no se habían unido a los anticuerpos se añadió una solución de cloruro amónico 1 M hasta obtener una concentración final en el tubo de la reacción de 50 mM. Con el fin de aumentar la estabilidad de las proteínas, se añadió glicerol hasta una concentración final del 5%. La mezcla se incubó durante 2 horas a 4ºC con agitación muy suave.

Por último, para eliminar el FITC libre y el resto de sales añadidas a la reacción, se cromatografió la muestra con una columna de Sephadex G-25 (PD-10 Columns) Para ello, la muestra con los anticuerpos conjugados con FITC se llevó hasta un volumen final de 2,5 mL con PBS y se aplicó a la columna. La elución se realizó con PBS y el eluído se recogió en fracciones de aproximadamente 1 mL, midiéndose su absorbancia a 280 nm. Las fracciones con una absorbancia a 280 nm mayor que 0,1 se mezclaron para obtener una concentración de anticuerpos conjugados homogénea. Finalmente, los anticuerpos conjugados con fluoresceína se conservaron en alícuotas de 100 \muL en congelación a -20ºC y protegidos de la luz hasta su uso.

La cantidad de moléculas de fluoresceína unidas a cada molécula de anticuerpo (F/P ratio) se determinó midiendo la absorbancia del conjugado a 280 nm (máximo de absorción de la proteína) y a 495 nm (máximo de absorción de la fluoresceína), (Haugland, (2000). Antibody conjugates for cell biology, In Current Protocols in Cell Biology, vol 2. Bonifacino, J, Dasso, M, Harford, J. Lippincott-Schwartz J. y Yamada, K. (Eds). John Wiley & Sons, New York, NY, EEUU, pp 16.5.1-16.5.2). Los valores óptimos del ratío F/P deben encontrarse entre 4 y 7 moléculas de fluoresceína por molécula de anticuerpo.

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2.2. Conjugación de los anticuerpos con Alexa Fluor® 488

Para la unión de los anticuerpos a la molécula fluorescente Alexa Fluor®, se utilizó el éster 2,3,5,6-tetrafluorofenilo de dicha molécula (Alexa Fluor® 488 5-TFP ester, Invitrogen, Barcelona, España), siguiendo el protocolo propuesto por Haugland (2000). Los anticuerpos se dializaron frente a 0,1 M NaHCO_{3}, pH 9,0, y su concentración se ajustó a 10 mg/mL. Un volumen de 1 mL de dicha solución de anticuerpos se mezcló con 100 \muL del fluorocromo (10 mg/mL en DMSO). La mezcla se incubó durante 90 minutos a temperatura ambiente, protegida de la luz.

Posteriormente, para eliminar las moléculas de fluorocromo libres, se pasó la muestra por una columna Sephadex G-25. Las fracciones con los anticuerpos conjugados se mezclaron para obtener una concentración de anticuerpos conjugados homogénea, y se conservaron en alícuotas de 100 \muL y protegidos de la luz a -20ºC hasta su uso.

La cantidad de moléculas de fluorocromo unidas a cada molécula de anticuerpo se determinó midiendo la absorbancia del conjugado a 280 nm y a 495 nm. Los valores óptimos del ratio F/P deben encontrarse entre 6 y 8 moléculas de 2,3,5,6-tetrafluorofenilo por molécula de anticuerpo.

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Ejemplo 3 Calibración del citómetro de flujo

Para ello, se utilizó un citómetro de flujo equipado con un láser de argón (488 nm), y el programa de análisis utilizado fue el CellQuest v. 3.1. El número de eventos analizados varió entre 5.000 y 30.000 eventos, en función de la aplicación.

Para la puesta a punto de los parámetros de medida del citómetro de flujo y de los parámetros intrínsecos de los esporos en cuanto a la dispersión de la luz (FSC y SSC), se prepararon muestras a partir de una suspensión de esporos en cultivo puro, con una concentración de 10^{5} esporos/mL en PBS.

Durante el análisis de la muestra de esporos, utilizando el programa CELLQuest v 3.1, se obtuvo una ventana en forma de nube de puntos relacionando el parámetro FSC (Forward scatter o dispersión frontal) y el parámetro SSC (Side scatter o dispersión lateral), y se calibraron los parámetros de medida del citómetro de forma que se pudiera diferenciar la población de esporos con respecto a otros elementos, como los restos celulares presentes en la suspensión.

Una vez definida la región de análisis correspondiente a los esporos (denominada R1), se definió un histograma, asociado a dicha región, que representaba el número de eventos analizados en función de la intensidad de fluorescencia verde (FL1-H) que presentan.

Para establecer la intensidad de fluorescencia mínima, por encima de la cual las muestras se iban a considerar positivas, se tomaron muestras con la misma concentración de esporos en PBS, que se incubaron respectivamente con 10 \muL de inmunoglobulinas procedentes de sueros preinmunes marcadas con FITC o Alexa Fluor durante 30 minutos a temperatura ambiente y en oscuridad. Posteriormente, las muestras se centrifugaron durante 5 minutos a 10.000 \times g y los esporos sedimentados se resuspendieron en 1 mL de PBS. El proceso de lavado se repitió dos veces y finalmente las muestras de esporos marcados con las correspondientes moléculas fluorescentes se resuspendieron en 1 mL de PBS y se les hizo pasar por el citómetro de flujo.

El nivel mínimo de fluorescencia para que una muestra fuera considerada positiva se estableció como la máxima intensidad de fluorescencia que presentaron los esporos marcados con las inmunoglobulinas procedentes del suero pre-inmune (señal inespecífica). Cualquier intensidad mayor (señal específica), quedó englobada en la región "positiva" del histograma, definida de la manera descrita, a la que denominamos M1.

En resumen, para que una muestra una vez incubada con los anticuerpos específicos fuera considerada positiva para la presencia de esporos de Clostridium tyrobutyricum, la relación de sus parámetros FSC y SSC debían estar incluidos en R1 en la nube de puntos.

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Ejemplo 4 Detección de los esporos de Clostidium tyrobutyricum 4.1 Tratamiento y análisis de las muestras de leche

Para un estudio preliminar de la detección de los esporos en muestras de leche, se prepararon muestras de 1 mL de leche que se contaminaron con concentraciones conocidas de esporos, desde 10^{5} esporos/mL hasta 10 esporos/mL y se dejaron incubar durante 24 horas en refrigeración. Posteriormente, las muestras se centrifugaron y las fracciones de la leche (sedimento, leche desnatada y grasa) se separaron en tubos diferentes y se trataron con Tritón X-100 al 10% (v/v) y proteinasa K (50 \mug/mL), a 37ºC durante 45 minutos. Los esporos presentes en las muestras se recuperaron por centrifugación, se resuspendieron en 1 mL de PBS y se incubaron con 10 \muL de los anticuerpos específicos anti-esporos marcados con FITC o Alexa Fluor, durante 30 minutos a temperatura ambiente. Tras dos lavados con PBS, como se ha descrito anteriormente, finalmente se resuspendieron en 1 mL de PBS y las muestras se analizaron en el citómetro de flujo.

También se realizaron ensayos con un volumen de muestra de 100 mL de leche, y se procedió de manera similar a la descrita con anterioridad. En este caso, se contaminaron las muestras de leche cruda con 10^{3} esporos (10 esporos/mL), incubándose durante 24 horas en refrigeración. Las muestras se centrifugaron y se recogieron juntas las fracciones de grasa y sedimento, eliminando la leche desnatada, y se trataron con Tritón X-100 y proteinasa K. Los esporos se sedimentaron mediante centrifugación, se marcaron con los anticuerpos como anteriormente, y finalmente se resuspendieron en 0,5 mL de PBS, analizando la muestra en el citómetro de flujo.

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4.2. Calibración base

Debido a que no se tenía experiencia previa en el análisis de esporos bacterianos por citometría de flujo, fue necesario establecer los parámetros para la discriminación de los esporos de Clostridium tyrobutyricum en función de su perfil de FSC y SSC. De esta forma se obtuvo un adecuado ajuste de las diversas intensidades de señal obtenidas, estableciéndose una calibración base sobre la cual trabajar en los siguientes ensayos.

En la Fig 1 se puede observar la mejor calibración base seleccionada. Dado que en una escala lineal (Fig 1A), no es posible la discriminación de los esporos del resto de los componentes de la suspensión, los detectores de luz frontal (forward scatter, FSC) y luz lateral (side scatter, SSC) se establecieron en una escala logarítmica (Fig 1B).

En función de los resultados de los análisis de la suspensión de esporos mediante los parámetros FSC y SSC, se dibujó una ventana de análisis (R1), de modo que quedaran incluidos en ella los eventos correspondientes a los esporos (Fig 1B), restringiendo el análisis sólo a dicha población. El resto de las partículas en suspensión, mayoritariamente restos celulares presentes en la muestra, y de menor tamaño que los esporos, quedaron incluidas en una segunda ventana de análisis (R2).

Una vez fijados los parámetros de tamaño y complejidad para la discriminación de los esporos del resto de partículas en suspensión, se determinaron los niveles de autofluorescencia (ruido de fondo) procedentes del propio instrumento, de los reactivos o de los propios esporos. Para ello, se dibujó un histograma, asociado a la región donde se localizan los esporos (R1), que relacionaba la intensidad de fluorescencia con el número de eventos que presentaban dicha fluorescencia. El detector apropiado para medir la emisión de las moléculas fluorescentes utilizadas (FITC y Alexa Fluor® 488), se ajustó en una escala logarítmica.

En la Fig 2, se muestran los histogramas de fluorescencia asociados a los eventos presentes en la región R1, perteneciente a los esporos de Clostridium tyrobutyricum CECT 4011, CECT 4012 y a los procedentes de la cepa salvaje, en los que se observa la ausencia de autofluorescencia asociada a los esporos. Asimismo, también se representa la gráfica de puntos y el histograma asociado, obtenidos tras el análisis en el citómetro de flujo del tampón utilizado (PBS) sin esporos, como control negativo (ausencia de esporos).

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4.3. Detección de los esporos con los anticuerpos específicos

Una vez que las condiciones del ensayo en cuanto a tamaño, complejidad y autofluorescencia de los esporos quedaron determinadas, se evaluó la capacidad de unión de los anticuerpos específicos a los esporos, en suspensiones de éstos en PBS. Como control negativo, se incubaron suspensiones de esporos con inmunoglobulinas (anticuerpos) procedentes de un suero pre-inmune conjugados con las mismas moléculas fluorescentes utilizadas para marcar los anticuerpos específicos.

En la Fig 3 se observan los histogramas obtenidos para los esporos de la cepa tipo (Clostridium tyrobutyricum CECT 4011), incubados con los anticuerpos específicos anti-esporos, conjugados con FITC o con Alexa Fluor. Como referencia, los histogramas derivados del análisis de los esporos marcados con los anticuerpos pre-inmunes se muestran en el mismo histograma.

Como se observa en las dos figuras, aunque aparece cierta señal de fluorescencia al analizar los esporos incubados con los anticuerpos pre-inmunes, la intensidad de dicha señal es siempre inferior a la obtenida con los anticuerpos específicos.

A la vista de estos resultados, se estableció en el histograma un marcador, denominado M1, que define el intervalo de intensidad de la señal de fluorescencia dentro del cual la muestra será considerada positiva. El punto inicial de dicho marcador se estableció al final del pico de fluorescencia obtenido con los anticuerpos pre-inmunes, asegurando así la especificidad de la señal. De esta manera, cualquier señal de fluorescencia obtenida dentro de la región M1, se debería exclusivamente a la interacción de los esporos con los anticuerpos específicos, y no a otras interacciones inespecíficas.

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Además, se comprobó que los anticuerpos específicos conjugados reaccionaron de igual forma con las tres cepas de Clostridium tyrobutyricum, y que la señal obtenida siempre apareció dentro de la región M1. En todos los casos, más del 99% de los eventos que aparecieron dentro de la región R1 (correspondiente a los esporos) fueron marcados por los anticuerpos y por lo tanto, presentaron fluorescencia.

Los resultados obtenidos mostraron que la señal producida por los esporos cuando se marcan con los anticuerpos conjugados con el fluorocromo Alexa, aparecía en el histograma desplazada hacia la derecha, respecto a la señal obtenida con los anticuerpos conjugados con FITC, lo que indica que la primera molécula emite una mayor intensidad de fluorescencia. Este comportamiento se observó para todas las cepas analizadas de Clostridium tyrobutyricum. Debido a esta diferencia en la intensidad de la señal, el marcador M1, definido tanto para el conjugado con FITC (M1) como para el conjugado con Alexa (M1') fue también diferente, como se observa en la Fig 3. Así, el marcador definido para la señal obtenida utilizando los conjugados con Alexa apareció desplazado a la derecha en el histograma. Según el análisis estadístico derivado de los resultados representados en los histogramas, la intensidad media de fluorescencia resultante al utilizar los anticuerpos conjugados con FITC fue de 120-150 unidades arbitrarias de fluorescencia, frente a una intensidad media de 850 cuando se utilizaron los conjugados con Alexa.

Por otro lado, y de la misma manera que en los experimentos de reconocimiento de los esporos de Clostridium tyrobutyricum, se llevaron a cabo una serie de análisis para evaluar por citometría de flujo el comportamiento de los conjugados anti-esporos, frente a otras especies bacterianas analizadas (Fig 4). Las especies analizadas fueron las mismas que las utilizadas para el estudio de la inmunoreactividad cruzada de los antisueros anti-esporos de C. tyrobutyricum por ELISA.

Los resultados muestran una pequeña reactividad de los anticuerpos anti-C. tyrobutyricum con los esporos de C. sporogenes, especie que mostró un pequeño pico de fluorescencia dentro de la región M1, especialmente con los anticuerpos conjugados con FITC. Sin embargo, teniendo en cuenta que la suspensión analizada de este microorganismo contenía una concentración de 10^{5} esporos/mL, el número de eventos obtenido dentro del pico fue muy bajo comparado con el pico obtenido para la suspensión de esporos de C. tyrobutyricum analizada a la misma concentración y en las mismas condiciones.

Esto se debe a que la nube de puntos FSC/SSC obtenida para Clostridium sporogenes, fue completamente diferente a la obtenida por Clostridium tyrobutyricum (Fig 5), de forma que al analizar la primera especie, la mayoría de eventos correspondientes a la población de esporos, aparecieron fuera de la región R1, por lo que los recuentos y la fluorescencia asociados a esa región fueron, en consecuencia, mucho menores que para C. tyrobutyricum.

Las otras especies del género Clostridium, C. butyricum y C. acetobutylicum, no mostraron ninguna reacción con los anticuerpos conjugados, no apareciendo ningún pico de fluorescencia en el histograma. Para el resto de microorganismos analizados, como Geobacillus stearothermophilus y Lactobacillus plantarum el pico de fluorescencia observado se localizó en todo momento fuera de la región M1, especialmente en las suspensiones marcadas con los anticuerpos conjugados con el fluorocromo Alexa.

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4.4. Detección de los esporos de Clostridium tyrobutyricum en leche

Finalmente, una vez analizado el marcado de los esporos con los anticuerpos conjugados en una suspensión con tampón, se evaluó la posibilidad de utilizar la citometría de flujo para la detección de esporos de Clostridium tyrobutyricum en muestras de leche cruda de vaca. Para ello, varias muestras de 1 mL de leche entera se contaminaron artificialmente con concentraciones conocidas de esporos. Tras una incubación de 24 horas en refrigeración, las muestras se centrifugaron y las tres fracciones obtenidas, sedimento, leche desnatada y grasa, se trataron por separado con Tritón X-100 y proteinasa K, y se marcaron con los anticuerpos conjugados correspondientes.

Los resultados del análisis por citometría de flujo de estas muestras de leche se muestran en la Fig 6. Se utilizaron como control negativo las fracciones de leche sin esporos, incubadas tanto con anticuerpos conjugados con Alexa como conjugados con FITC. Los resultados correspondientes a las gráficas de puntos indican la presencia de algunos eventos dentro de la región R1, mostrando parámetros SSC y FSC similares a los esporos de Clostridium tyrobutyricum. Sin embargo, los histogramas de fluorescencia asociados a dichos eventos (Fig 6A) mostraron recuentos muy bajos con una señal de fluorescencia de intensidad débil, que se localizó fuera de la zona M1, especialmente en el caso de los anticuerpos marcados con Alexa (M1').

Los resultados obtenidos en el análisis de los esporos en las tres fracciones de la leche separadas por centrifugación, utilizando anticuerpos específicos conjugados con FITC y con Alexa, se muestran en la Fig 6B y 6C, respectivamente. Como se observa en las figuras, los mayores recuentos se obtuvieron principalmente en la grasa y en el sedimento, indicando que los esporos se concentran mayoritariamente en estas dos fracciones y no en la leche desnatada. Los picos de fluorescencia, asociados a la región R1 de la nube de puntos, aparecieron dentro de la región M1 en el histograma, por lo que los anticuerpos fueron capaces de reconocer a los esporos también en la leche, tras el tratamiento de digestión con detergente y proteasa.

La realización de un análisis adicional de una muestra de leche contaminada con esporos, sin tratar con detergente y proteasa, dejó patente la necesidad de este tratamiento de la leche, previo al marcado con los anticuerpos. Como se ve en la Fig 7, el perfil SSC y FSC de la muestra fue completamente diferente al de las muestras tratadas. Se observa la diferencia en el tamaño de las partículas, y la práctica ausencia de eventos asociados a R1 en la segunda ventana, que dificulta la detección de los esporos en las muestras de leche sin tratar, incluso con una elevada contaminación, puesto que para este análisis se utilizó una concentración de 10^{5} esporos/mL.

Esta diferencia en ambas gráficas, en función del tratamiento de la leche, se debe probablemente a la agregación e interacción de los esporos con algunos componentes de la leche, principalmente con los glóbulos grasos, quedando "enmascarados" en partículas de diferente tamaño al que corresponde a los esporos como se determinó en los análisis realizados en tampón (R1).

Con la finalidad de determinar el límite de detección del método de citometría de flujo descrito para la detección de la presencia de esporos de Clostridium tyrobutyricum en la leche, varias muestras de 1 mL de leche se contaminaron con concentraciones decrecientes de esporos, desde 10^{5} esporos/mL hasta 10 esporos/mL. Estas muestras se trataron de la misma manera a la descrita anteriormente y se incubaron con los correspondientes anticuerpos conjugados. El análisis de dichas muestras por citometría de flujo mostró la presencia de un pico de fluorescencia detectable, que indicaba la presencia de esporos, incluso a concentraciones de 10^{3} esporos/mL. En este caso, el citómetro tuvo que ser recalibrado en cuanto al número de eventos adquiridos en total, delimitando el recuento a 2500 eventos en R1 en lugar de los 10000 eventos que se evaluaron en el global de la ventana en los análisis realizados previamente.

Debido a que la concentración de esporos de Clostridium tyrobutyricum en las muestras reales de leche es habitualmente baja, y a que el límite de detección del ensayo mediante citometría de flujo se encontraba en 10^{3} esporos/mL, se utilizó la distribución de los esporos en la grasa y en el sedimento, para concentrar los esporos presentes en una muestra de leche de mayor volumen, antes del tratamiento con tensioactivo y proteasa.

Así, 100 mL de leche entera cruda de vaca se contaminaron con 10^{3} esporos, resultando por lo tanto una concentración final de 10 esporos/mL. Tras la centrifugación de los 100 mL de leche, la grasa y el sedimento se separaron de la leche desnatada y se juntaron y trataron con Tritón X-100 y proteinasa K, de la misma manera que en las muestras anteriormente analizadas. Los esporos se sedimentaron mediante centrifugación, se resuspendieron en 1 mL de PBS y se incubaron con los anticuerpos correspondientes marcados con los fluorocromos FITC o Alexa Fluor. Tras dos lavados con PBST, se resuspendieron en 0,5 mL de PBS, por lo que la concentración fue finalmente 200 veces superior a la añadida originalmente a la leche.

El análisis por citometría de flujo de las fracciones de la leche cruda dio los resultados que se muestran en la Fig 8. Tanto en las muestras marcadas con anticuerpos conjugados con FITC como en las marcadas con Alexa, se observa claramente un pico de fluorescencia que aparece dentro de la región M1, indicando la presencia de eventos que corresponden con los esporos. Como control, se trataron muestras de leche sin esporos y se analizaron de la misma manera, no mostrando ningún pico de fluorescencia asociada a la región de los esporos.

Claims

1. Método de detección y/o cuantificación de esporos de Clostridium tyrobutyricum que comprende:

a.: Obtener una muestra láctea,

e.: añadir anticuerpos policlonales anti-esporo de Clostridium tyrobutyricum unidos con un fluorocromo, al producto obtenido en (d) y

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2. Método según la reivindicación 1 donde la muestra láctea es leche.

3. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 donde el tensioactivo es no iónico y la proteasa es proteinasa K.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 donde los anticuerpos policlonales se conjugan o bien con el fluorocromo isotiocianato de fluoresceína o bien con el fluorocromo 2,3,5,6-tetrafluorofenilo.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 donde la intensidad de fluorescencia emitida por el complejo esporo-anticuerpo-fluorocromo es de entre 12 y 10000 unidades arbitrarias (u.a.) de fluorescencia y la dispersión de luz es de entre 270 y 8600 u.a para SSC (Side scatter cytometry) y de entre 8 y 210 u.a. para FSC (Forward scatter cytometry).

6. Método según la reivindicación 5 donde la dispersión de luz es de entre 515 y 4500 u.a. para SSC y de entre 10 y 135 u.a. para FSC.

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 5 ó 6 donde la intensidad de fluorescencia emitida por el complejo esporo-anticuerpo-fluorocromo es de entre 12 y 1000 u.a. de fluorescencia cuando los anticuerpos policlonales se unen con el fluorocromo isotiocianato de fluoresceína.

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 5 ó 6 donde la intensidad de fluorescencia emitida por el complejo esporo-anticuerpo-fluorocromo es de entre 140 y 10000 u.a. de fluorescencia cuando los anticuerpos policlonales se unen con el fluorocromo 2,3,5,6-tetrafluorofenilo.

9. Kit para la detección de esporos de Clostridium tyrobutyricum que comprende anticuerpos policlonales anti-esporo de Clostridium tyrobutyricum conjugados con un fluorocromo, un tensioactivo y una proteasa.