ES2338492T3 - Polipeptidos wips y aplicaciones terapeuticas de los mismos. - Google Patents

Abstract

Polipéptido WISP-2 para su utilización en un procedimiento para el tratamiento de daños celulares o en tejidos de cartílago en un trastorno cartilaginoso degenerativo.

Description

Polipéptidos WISP y aplicaciones terapéuticas de los mismos.

Campo de la invención

La presente invención se refiere de manera general a métodos de utilización de polipéptidos WISP en el tratamiento de trastornos cartilaginosos degenerativos y diversas condiciones de tipo inmunológico.

Antecedentes de la invención

El factor de crecimiento de tejido conectivo (CTGF) es un factor de crecimiento inducido en fibroblastos por muchos factores, incluyendo TGF-\beta, y resulta esencial para la capacidad de TGF-\beta de inducir el crecimiento independiente de anclaje (AIG), una propiedad de las células transformadas. Se descubrió el CTGF en un intento para identificar el tipo de dímeros de factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) presente en el medio de cultivo de células endoteliales, y se relaciona inmunológica y biológicamente con PDGF. Ver la patente US nº 5.408.040. CTGF también es mitogénica y quimiotáctica de células, y de esta manera los factores de crecimiento en esta familia se cree que desempeñan un papel en el desarrollo, crecimiento y reparación normales del tejido humano.

Se han aislado, clonado, secuenciado y caracterizado como pertenecientes a la familia del gen CCN siete proteínas relacionadas con CTGF, incluyendo el ortólogo de pollo de Cyr61, CEF10, CTGF humano, de ratón y de Xenopus laevis, y Nov humano, de pollo y de Xenopus laevis (Oemar y Luescher, Arterioscler. Thromb. Vas. Biol. 17:1483-1489, 1997). El gen codificante de Cyr61 se ha encontrado que estimula la angiogénesis, el crecimiento tumoral y la vascularización (Babic et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:6355-6360, 1998). El gen nov se expresa en el riñón esencialmente en el estadio embrionario, y se han detectado alteraciones de la expresión de nov, en comparación con la expresión en el riñón normal, tanto en nefroblastomas aviares como en tumores de Wilms humanos (Martinerie et al., Oncogene 9:2729-2732, 1994). Wt1 regula negativamente la expresión humana de nov, regulación negativa que podría representar un elemento crucial en la nefrogénesis normal y tumoral (Martinerie et al., Oncogene 12:1479-1492, 1996). Recientemente se ha propuesto que los genes de CTGF, nov y cyr61, que codifican proteínas secretadas que contienen secuencias conservadas y motivos de IGFBP en los extremos N-terminales de los mismos y se unen a IGFs con baja afinidad, son otros miembros de la superfamilia de IGFBP, junto con el mac25/IGFBP-7 de baja afinidad (Yamanaka et al., J. Biol. Chem. 272:30729-30734, 1997) y las IGFBPs 1-6 de alta afinidad. CTGF bajo esta proposición se denominaría IGFBP-8 (Kim et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:12981-12986, 1997).

Los diferentes miembros de la familia de CCN interaccionan con diversas macromoléculas solubles y asociadas a la matriz, en particular glucoconjugados sulfatados (Holt et al., J. Biol. Chem. 265:2852-2855, 1990). Esta interacción ha sido utilizada para purificar Cyr61 y CTGF mediante cromatografía de afinidad en heparina-agarosa (Frazier et al., J. Invest. Dermatol. 107:404-411, 1996; Kireeva et al., Mol. Cell. Biol. 16:1326-1334, 1996). Cyr61 resulta secretada y se encuentra asociada tanto a la matriz extracelular como a la superficie celular debido a la afinidad del mismo para el heparán sulfato (Yang et al., Cell. Growth Diff. 2:351-357, 1991).

Recientemente, se ha encontrado una proteína en el ratón denominada ELM1 que se expresa en células de capacidad metastásica reducida (Hashimoto et al., J. Exp. Med. 187:289-296, 1996). El gen elm1, un homólogo de ratón de WISP-1, dado a conocer posteriormente, es otro miembro de la familia de CTGF, Cyr61/Cef10 y el gen sobreexpresado del neuroblastoma, y suprime el crecimiento tumoral in vivo y la metástasis de las células de melanoma murino K-1735. Otro artículo reciente sobre rCop-1, el ortólogo de rata de WISP-2 indicado posteriormente, describe la pérdida de expresión de este gen tras la transformación celular (Zhang et al., Mol. Cell. Biol. 18:6131-6141, 1998).

Los miembros de la familia de CCN (con la excepción de nov) son genes sensibles al crecimiento temprano inmediato que se cree regulan la proliferación celular, diferenciación, embriogénesis y cicatrización de heridas. La homología de secuencias entre miembros de la familia del gen CCN es bastante elevada; sin embargo, las funciones de estas proteínas in vitro van desde la estimulatoria del crecimiento (la CTGF humana) hasta la inhibidora del crecimiento (Nov de pollo y posiblemente también hCTGF). Además, está indicada la utilidad de algunas moléculas homólogas en la prevención de la desmoplasia, la formación de estroma de tejido conectivo altamente celular y excesiva asociada con algunos cánceres, y lesiones fibróticas asociadas a diversos trastornos de la piel, tales como escleroderma, queloide, fascitis eosinofílica, fascitis nodular y contractura de Dupuytren. Además, recientemente se ha demostrado que CTGF se expresa en el estroma fibroso de los tumores mamarios, sugiriendo que la formación de estroma en el cáncer implica la inducción de factores de crecimiento fibroproliferativos similares a los de la reparación de heridas. El CTGF humano también se expresa a niveles muy altos en las lesiones ateroescleróticas avanzadas, pero no en las arterias normales, sugiriendo que podría desempeñar un papel en la ateroesclerosis (Oemar y Luescher,
supra).

Los Wnts se encuentran codificados por una familia génica amplia los miembros de la cual se han encontrado en ascáridos, insectos, peces cartilaginosos y vertebrados (Holland et al., Dev. Suppl., 125-133, 1994). Se cree que los Wnts funcionan en una diversidad de procesos del desarrollo y fisiológicos debido a que muchas especies diversas presentan múltiples genes Wnt conservados (McMahon, Trends Genet. 8:236-242, 1992; Nusse y Varmus, Cell 69:1073-1087, 1992). Los genes Wnt codifican glucoproteínas secretadas que se cree funcionan como señales paracrinas y autocrinas en varios tipos celulares primitivos (McMahon, supra, 1992; Nusse y Varmus, supra, 1992). La familia del factor de crecimiento Wnt incluye más de diez genes identificados en el ratón (Wnt-1, -2, -3A, -3B, -5A, -5B, -6, -7A, -8A, -8B, -10B, -11, -12 y -13) (ver, por ejemplo, Gavin et al., Genes Dev. 4:2319-2332, 1990; Lee et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:2268-2272, 1995; Christiansen et al., Mech. Dev. 51:341-350, 1995) y por lo menos nueve genes identificados en el ser humano (Wnt-1, -2, -3, -5A, -7A, -7B, -8B, -10B y -11) mediante clonación de ADNc (ver, por ejemplo, Vant Veer et al., Mol. Cell. Biol. 4:2532-2534, 1984).

El protooncogén Wnt-1 (int-1) originalmente se identificó en tumores mamarios inducidos por el virus del tumor mamario de ratón (MMTV) debido a una inserción de una secuencia de ADN vírico (Nusse y Varmus, Cell 31:99-109, 1982). En ratones adultos, el nivel de expresión de ARNm de Wnt-1 se detecta únicamente en los testículos durante estadios tardíos del desarrollo espermático. La proteína Wnt-1 presenta aproximadamente 42 kDa y contiene una región aminoterminal hidrofóbica que podría funcionar como secuencia de señal para la secreción (Nusse y Varmus, supra, 1992). La expresión de Wnt-2/irp se detecta en tejidos fetales y adultos de ratón y la distribución del mismo no se solapa con el patrón de expresión de Wnt-1. Wnt-3 se encuentra asociado con la tumorigénesis mamaria del ratón. La expresión de Wnt-3 en embriones de ratón se detecta en los tubos neurales y en los gérmenes de las extremidades. Se detectan transcritos de Wnt-5a en las extremidades anteriores y posteriores en desarrollo entre los días 9,5 y 14,5 y los niveles más altos se concentran en el ectodermo apical en la punta distal de las extremidades (Nusse y Varmus, supra, 1992). Recientemente, se ha descrito un factor de crecimiento Wnt denominado Wnt-x (patente WO nº 95/17416) junto con la detección de la expresión de Wnt-x en tejidos óseos y en células derivadas de hueso. También se describe el papel de Wnt-x en el mantenimiento de los osteoblastos maduros y la utilización del factor de crecimiento Wnt-x como agente terapéutico o en el desarrollo de otros agentes terapéuticos para tratar las enfermedades de tipo óseo.

Wnts podría desempeñar un papel en la señalización celular local. Algunos estudios bioquímicos han demostrado que gran parte de la proteína Wnt secretada puede encontrarse asociada con la superficie celular o con la matriz extracelular, y no libremente difundible en el medio (Papkoff y Schryver, Mol. Cell. Biol. 10:2723-2730, 1990; Bradley y Brown, EMBO J. 9:1569-1575, 1990).

Los estudios de mutaciones de los genes Wnt indican un papel para Wnts en el control del crecimiento y la formación de patrones de los tejidos. En Drosophila, wingless (wg) codifica un gen relacionado con Wnt (Rijsewik et al., Cell 50:649-657, 1987) y las mutaciones wg alteran el patrón del ectodermo embrionario, la neurogénesis y el crecimiento del disco imaginal (Morata y Lawerence, Dev. Biol. 56:227-240, 1977; Baker, Dev. Biol. 125:96-108, 1988; Klingensmith y Nusse, Dev. Biol. 166:396-414, 1994). En Caenorhabditis elegans, lin-44 codifica un homólogo de Wnt que resulta necesario para las divisiones celulares asimétricas (Herman y Horvitz, Development 120:1035-1047, 1994). Las mutaciones knock-out en ratones han demostrado que Wnts resulta esencial para el desarrollo cerebral (McMahon y Bradley, Cell 62:1073-1085, 1990; Thomas y Cappechi, Nature 346:847-850, 1990) y el crecimiento de los primordios embrionarios de los riñones (Stark et al., Nature 372:679-683, 1994), del germen de la cola (Takada et al., Genes Dev. 8:174-189, 1994) y de las extremidades (Parr y McMahon, Nature 374:350-353, 1995). La sobreexpresión de Wnts en la glándula mamaria puede resultar en la hiperplasia mamaria (McMahon, supra, 1992; Nusse y Varmus, supra, 1992) y en el desarrollo alveolar precoz (Bradbury et al., Dev. Biol. 170:553-563, 1995).

Wnt-5a y Wnt-5b se expresan en el mesodermo posterior y lateral y en el mesodermo extraembrionario del embrión murino de día 7-8 (Gavin et al., supra, 1990). Estos dominios embrionarios contribuyen a la región AGM y a los tejidos del saco del vitelo del que se derivan precursores hematopoyéticos multipotentes y HSCs (Dzierzak y Medvinsky, Trends Genet. 11:359-366, 1995; Zon et al. En: Gluckman y Coulombel, editores, Colloque, INSERM 235:17-22, 1995, presentado en la Joint International Workshop on Foetal and Neonatal Hematopoiesis and Mechanism of Bone Marrow Failure, París, Francia, 3-6 de abril, 1995; Kanatsu y Nishikawa, Development 122:823-830, 1996. Se han detectado Wnt-5a, Wnt-10b y otros Wnts en gérmenes de las extremidades, indicando posibles funciones en el desarrollo y formación de patrones del microambiente óseo temprano, tal como se ha demostrado para Wnt-7b (Gavin et al., supra, 1990; Christiansen et al., Mech. Devel. 51:341-350, 1995; Parr y McMahon, supra, 1995).

La ruta de transducción de señales Wnt/Wg desempeña un papel importante en el desarrollo biológico del organismo y se ha implicado en varios cánceres humanos. Esta ruta también incluye el gen supresor tumoral, APC. Las mutaciones en el gen APC se asocian al desarrollo de formas esporádicas y heredadas del cáncer colorrectal humano. La señal Wnt/Wg conduce a la acumulación de beta-catenina/Armadillo en la célula, resultando en la formación de un complejo de transcripción bipartito consistente de beta-catenina y un miembro de la familia de factor de unión a intensificador linfoide/factor de transcripción de caja HMG de factor de células T (LEF/TCF). Este complejo se transloca hasta el núcleo, donde puede activar la expresión de genes cadena debajo de la señal Wnt/Wg, tales como los genes engrailed and Ultrabithorax en Drosophila.

Para una revisión de Wnt, ver Cadigan y Nusse, Genes & Dev. 11:3286-3305, 1997.

Pennica et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 95:14717-14722, 1998, describen la clonación y la caracterización de dos genes, WISP-1 y WISP-2, que resultan regulados positivamente en la línea de células epiteliales mamarias de ratón C57MG transformadas por Wnt-1, y un tercer gen relacionado, WISP-3. Pennica et al. Informan de que estos genes WISP pueden encontrarse cadena debajo de la señales de Wnt-1 y que los niveles aberrantes de expresión de WISP en el cáncer de colon podrían desempeñar un papel en la tumorigénesis de colon. Recientemente se ha identificado WISP-1 como gen regulado por \beta-catenina y la caracterización de la actividad oncogénica del mismo ha demostrado que WISP-1 podría contribuir a la tumorigénesis mediada por \beta-catenina (Xu et al., Gene & Develop. 14:585-595, 2000). La sobreexpresión de WISP-1 en células renales de rata normales (NRK-49F) indujo la transformación morfológica, el crecimiento celular acelerado e incrementó la densidad de saturación. Además, estas células formaban tumores con facilidad al inyectarse en ratones desnudos, sugiriendo que WISP-1 podría desempeñar algún papel en la tumorigénesis (Xu et al., supra, 2000).

Hurvitz et al., Nature Genetics 23:94-97, 1999, proporcionan un estudio que incluye WISP3, en el que se encontró que nueve mutaciones diferentes de WTSP3 en individuos no emparentados se encontraban asociadas a un trastorno esquelético autosómico recesivo, la displasia pseudorreumatoide progresiva (PPD). Hurvitz et al. observaron la expresión de WISP3 mediante PCR-RT en sinoviocitos, condrocitos de cartílago articular y células progenitoras mesenquimales derivadas de médula ósea.

La solicitud de patente PCT nº WO98/21236 publicada el 22 de mayo, 1998, da a conocer el gen 3 del factor de crecimiento de tejido conectivo humano (CTGF-3) codificante de un miembro de 26 kD de la superfamilia de factores de crecimiento. La patente nº WO98/21236 da a conocer que la secuencia de aminoácidos de CTGF-3 se dedujo de un clon de ADNc de osteoblastos humanos, y que CTGF-3 se expresaba en múltiples tejidos, tales como ovario, testículos, corazón, pulmón, músculo esquelético, médula adrenal, córtex adrenal, timo, próstata, intestino delgado y colon.

Varios investigadores han documentado cambios en la composición de proteoglicano en neoplasmas. Especialmente, un fenómeno bien reconocido en una diversidad de tumores malignos es la producción marcada de proteoglicano condroitín sulfato. Además, se ha demostrado que la expresión de decorina, un proteoglicano que contiene dermatán sulfato, presenta una correlación elevada con la malignidad de los carcinomas humanos (Adany et al., J. Biol. Chem. 265:11389-11396, 1990; Hunzlemann et al., J. Invest. Dermatol. 104:509-513, 1995). Recientemente, se ha demostrado que la decorina suprime el crecimiento de varios carcinomas (Santra 1997). Aunque no se entiende totalmente la función de la decorina en el desarrollo tumorigénico, se ha propuesto que la expresión de decorina en el estroma peritumoral podría reflejar una respuesta regional de las células de tejido conectivo del huésped frente a las células neoplásicas invasoras (Ständer et al., Gene Therapy 5:1187-1194, 1999).

Para una revisión reciente de diversos miembros de la familia del factor de crecimiento de tejido conectivo/61 rico en cisteínas/nefroblastoma sobreexpresado (CNN) y las propiedades y actividades respectivas, ver Brigstock, Endocrine Reviews 20:189-206, 1999.

Los trastornos cartilaginosos degenerativos describen una colección de enfermedades caracterizadas por anormalidades de degeneración o metabólicas de los tejidos conectivos que pueden manifestarse en dolor, rigidez y limitación del movimiento de las partes corporales afectadas. El origen de estos trastornos puede ser, por ejemplo, patológico o como resultado de traumatismo o lesión.

La osteoartritis (OA), también conocida como osteoartrosis o enfermedad articular degenerativa, típicamente es el resultado de una serie de procesos degenerativos localizados que afectan a la estructura articular y resultan en dolor y en función disminuida. La OA con frecuencia se ve acompañada de un componente de inflamación local que puede acelerar la destrucción de las articulaciones. La OA se caracteriza por la rotura de la superficie articuladora lisa de cartílago, con pérdida temprana de proteoglicanos (PG) y colágenos, seguida de la formación de hendiduras y fibrilación y finalmente por la pérdida de grosor completo de cartílago. Entre los síntomas de la OA se incluyen dolor local en las articulaciones afectadas, especialmente tras la utilización. Con el progreso de la enfermedad, los síntomas pueden progresar a una sensación de dolor continuo, incomodidad local y alteraciones cosméticas, tales como la deformidad de la articulación afectada.

En contraste con la naturaleza localizada de la OA, la artritis reumatoide (RA) es una enfermedad inflamatoria sistémica que probablemente se inicia en el sinovio, los tejidos circundantes del espacio articular. La RA es un trastorno autoinmunológico crónico caracterizado por la sinovitis simétrica de la articulación y típicamente afecta articulaciones diartrodiales pequeñas y grandes, conduciendo a la progresiva destrucción de las mismas. A medida que progresa la enfermedad, los síntomas de la RA también pueden incluir fiebre, pérdida de peso, adelgazamiento de la piel, implicación multiorgánica, escleritis, úlceras corneales, formación de nódulos subcutáneos o subperiosteales y muerte prematura. Aunque la causa o causas u orígenes de la RA y de la OA son claramente diferentes, los citoquinas y los enzimas implicadas en la destrucción del cartílago aparentemente son similares.

Se cree que los factores de crecimiento de péptidos resultan importantes reguladores del crecimiento del cartílago y del comportamiento de la célula cartilaginosa (condrocito) (es decir, diferenciación, migración, división y síntesis o degradación de la matriz) (F.S. Chen et al., Am. J. Orthop. 26:396-406, 1997). Entre los factores de crecimiento que han sido propuestos anteriormente para estimular la reparación del cartílago se incluyen el factor de crecimiento similar a insulina (IGF-1) (Osborn, J. Orthop. Res. 7:35-42, 1989; Florini y Roberts, J. Gerontol. 35:23-30, 1980); el factor de crecimiento fibroblástico básico (bFGF) (Toolan et al., J. Mat. Res. 41:244-50, 1998; Sah et al., Arch. Biochem. Biophys. 308:137-47, 1994); la proteína morfogenética ósea (BMP) (Sato y Urist, Clin. Orthop. Relat. Res. 183:180-87, 1984; Chin et al., Arthritis Rheum. 34:314-24, 1991), y el factor beta de crecimiento transformante (TGF-beta) (Hill y Logan, Prog. Growth Fac. Res. 4:45-68, 1992; Guerne et al., J. Cell Physiol. 158:476-84, 1994; Van der Kraan et al., Ann. Rheum. Dis. 51:643-47, 1992).

El factor de crecimiento similar a insulina (IGF-1) estimula tanto la síntesis de matriz como la proliferación celular en cultivo (K. Osborn, J. Orthop. Res. 7:35-42, 1989) y la insuficiencia de IGF-1 puede presentar un papel etiológico en el desarrollo de la osteoartritis (R.D. Coutts et al., Instructional Course Lect. 47:487-94, Amer. Acad. Orthop. Surg., Rosemont, IL, 1997). Algunos estudios indican que las concentraciones séricas de IGF-1 son más bajas en pacientes osteoartríticos que en los grupos de control, mientras que otros estudios no han encontrado ninguna diferencia. Sin embargo, tanto los niveles séricos de IGF-1 como la respuesta de los condrocitos a IGF-1 se reducen con la edad (J.R. Florini y S.B. Roberts, J. Gerontol. 35:23-30, 1980). De esta manera, tanto la disponibilidad reducida de IGF-1 como la respuesta disminuida de los condrocitos a IGF-1 pueden contribuir a la homeostasis del cartílago y conducir a la degeneración con la edad.

Se ha propuesto IGF-1 para el tratamiento o prevención de la osteoartritis. La administración intraarticular de IGF-1 en combinación con pentosán polisulfato sódico (un inhibidor de la actividad catabólica en condrocitos) causó una apariencia histológica mejorada y niveles prácticamente normales de enzimas degradativos (metaloproteinasas neutras y colagenasa), inhibidores tisulares de metaloproteinasa y colágeno matricial (R.A. Rogachefsky et al., Ann. NY Acad. Sci. 732:889-95, 1994). La utilización de IGF-1 solo o como adyuvante con otros factores de crecimiento para estimular la regeneración de cartílago ha sido descrita en las patentes WO nº 91/19510, WO nº 92/13565, US nº 5.444.047 y EP nº 434.652.

Las proteínas morfogenéticas óseas (BMPs) son miembros de la gran familia de factores del crecimiento del factor beta de crecimiento transformante (TGF-\beta). Los estudios in vitro e in vivo han demostrado que BMP induce la diferenciación de las células mesenquimales en condrocitos (K. Sato y M. Urist, Clin. Orthop. Relat. Res. 183:180-87, 1984). Además, el factor de crecimiento esquelético y los factores de crecimiento derivados de cartílago presentan efectos sinérgicos con BMP, debido a que la combinación de estos factores de crecimiento con BMP y hormona del crecimiento inicia la diferenciación de las células mesenquimales. La proliferación posterior de las células diferenciadas resulta estimulada por otros factores (D.J. Hill y A. Logan, Prog. Growth Fac. Res. 4:45-68, 1992).

El factor beta de crecimiento transformante (TGF-\beta) está producido por osteoblastos, condrocitos, plaquetas, linfocitos activados y otras células (R.D. Coutts, supra). TGF-\beta puede presentar propiedades tanto estimuladoras como inhibidoras sobre la síntesis de matriz y la proliferación celular dependiendo de la célula diana, la dosis y las condiciones de cultivo celular (P. Guerne et al., J. Cell Physiol. 158:476-84, 1994; H. Van Beuningen et al., Ann. Rheum. Dis. 52:185-91, 1993; P. Van der Kraan et al., Ann. Rheum. Dis. 51:643-47, 1992). Además, al igual que con IGF-1, se reduce la respuesta de TGF-\beta con la edad (P. Guerne et al., J. Cell Physiol. 158:476-84, 1994). Sin embargo, TGF-\beta es un estimulador más potente de la proliferación de condrocitos que otros factores de crecimiento, incluyendo el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), bFGF e IGF-1 (Guerne et al., supra) y puede estimular la producción de proteoglicanos por parte de los condrocitos. TGF-\beta también regula negativamente los efectos de las citoquinas que estimulan el catabolismo de los condrocitos (Van der Kraan et al., supra). In vivo, TGF-\beta también induce la proliferación y la diferenciación de las células mesenquimales para formar condrocitos e incrementa la reparación de defectos de grosor parcial en el cartílago articular del conejo (E.B. Hunziker y L. Rosenberg, Trans. Orthopaed. Res. Soc. 19:236, 1994).

Aunque algunos investigadores se han focalizado en la utilización de determinados factores de crecimiento para reparar cartílago o tejido cartilaginoso, otros se han centrado en inhibir la actividad de las moléculas que inducen la destrucción de cartílago y/o la inhibición de la síntesis de matriz. Una de dichas moléculas es la citoquina IL-1 alfa, que presenta efectos perjudiciales sobre varios tejidos dentro de la articulación, incluyendo la generación de inflamación sinovial y la regulación positiva de metaloproteinasas de matriz y la expresión de prostaglandinas (V. Baragi et al., J. Clin. Invest. 96:2454-60, 1995; V.M. Baragi et al., Osteoarthritis Cartilage 5:275-82, 1997; C.H. Evans et al., J. Keukoc. Biol. 64:55-61, 1998; C.H. Evans y P.D. Robbins, J. Rheumatol. 24:2061-63, 1997; R. Kang et al., Biochem. Soc. Trans 25:533-37, 1997; R. Kang et al., Osteoarthritis Cartilage 5:139-43, 1997). Un medio de antagonizar IL-1 alfa es mediante el tratamiento con antagonista soluble del receptor de IL-1 (IL-1ra), una proteína de origen natural que evita la unión de IL-1 al receptor de la misma, inhibiendo de esta manera efectos tanto directos como indirectos de IL-1 sobre el cartílago. En mamíferos, únicamente una proteasa, denominada interleuquina 1beta-convertasa (ICE) puede generar específicamente IL-1alfa activa madura. La inhibición de ICE se ha demostrado que bloquea la producción de IL-1alfa y puede enlentecer la degeneración artrítica (revisada por Martel-Pelletier, J. et al., Front. Biosci. 4:d694-703). El antagonista soluble del receptor de IL-1 (IL-1ra), una proteína de origen natural que puede inhibir los efectos de IL-1 al impedir que IL-1 interaccione con los condrocitos, también se ha demostrado que resulta eficaz en modelos animales de artritis y en la actualidad se investigando para su capacidad de prevenir la incidencia o la progresión de la artritis. Otras citoquinas, tales como IL-1beta, el factor alfa de necrosis tumoral, el interferón gamma, IL-6 e IL-8 se han asociado a la activación incrementada de células sinoviales similares a fibroblastos, condrocitos y/o macrófagos. La inhibición de estas citoquinas puede resultar terapéuticamente beneficiosa en la prevención de la inflamación y la destrucción de cartílago. Las moléculas que inhiben la actividad de TNF-alfa se ha demostrado que presentan efectos beneficiosos sobre las articulaciones de pacientes con artritis reumatoide.

Se cree que la degradación de la matriz de cartílago se debe al corte de las moléculas de la matriz (proteoglicanos y colágenos) por proteasas (revisada por Woessner JF Jr., "Proteases of the extracellular matrix", en Mow, V., Ratcliffe, A. (editores): Structure and Function of Articular Cartilage, Boca Raton, FL, CRC Press, 1994, y Smith, R.L., Front. en: Biosci. 4:d704-712. Aunque los enzimas clave implicados en la rotura de la matriz todavía no han sido claramente identificados, las metaloproteinasas de matriz (MMPs) y las "agrecanasas" aparentemente desempeñan papeles cruciales en la destrucción de las articulaciones. Además, también pueden encontrarse implicados los miembros de la familia serina y cisteína de proteinasas (por ejemplo las catepsinas y la uroquinasa o el activador tisular del plasminógeno (uPA y tPA). La plasmina, el activador uroquinasa del plasminógeno (uPA) y el activador tisular del plasminógeno (tPA) pueden desempeñar un papel importante en la ruta de activación de las metaloproteinasas. La evidencia conecta el grupo estrechamente relacionado de las catepsinas B, L y S a la degradación de la matriz, y el nivel de estas catepsinas se encuentra algo incrementado en la OA. Muchas citoquinas, incluyendo IL-1, TNF-alfa y LIF, inducen la expresión de MMP en condrocitos. La inducción de MMPs puede encontrarse antagonizada por TGF-\beta e IL-4 y resultar potenciada, por lo menos en conejos, por FGF y PDGF. Tal como muestran algunos estudios animales, los inhibidores de estas proteasas (MMPs y agrecanasas) también podrían proteger por lo menos parcialmente los tejidos articulares frente a daños in vivo.

El óxido nítrico (NO) también podría desempeñar un papel sustancial en la destrucción de cartílago (Ashok et al., Curr. Opin. Rheum. 10:263-268, 1998). Al contrario que el cartílago normal, que no produce NO a menos que resulte estimulado por citoquinas, tales como IL-1, el cartílago obtenido de articulaciones osteoartríticas produce grandes cantidades de óxido nítrico durante más de 3 días en cultivo a pesar de la ausencia de estímulos añadidos. Además, la inhibición de la producción de NO se ha demostrado que previene la destrucción de cartílago mediada por IL-1 y la muerte de condrocitos, así como la progresión de la osteoartritis en modelos animales.

Descripción resumida de la invención

Los solicitantes inesperadamente han descubierto que los polipéptidos WISP presentan actividades útiles, tales como la capacidad de estimular o incrementar la diferenciación o proliferación de los condrocitos, y de esta manera, los polipéptidos WISP pueden resultar útiles para el tratamiento, reparación o protección del cartílago, incluyendo el cartílago dañado como resultado de un trastorno y/o lesión cartilaginosa.

En una realización, la presente invención se refiere a un procedimiento in vitro o ex vivo para el tratamiento del cartílago dañado como resultado de un trastorno cartilaginoso, que comprende poner en contacto dicho cartílago con una cantidad eficaz del polipéptido WISP-2 y a la utilización del polipéptido WISP-2 en la preparación de un medicamento para el tratamiento de cartílago dañado como resultado de un trastorno cartilaginoso. Entre los polipéptidos WISP contemplados para la utilización en la invención se incluyen polipéptidos WISP-2 y variantes de los mismos, indicados posteriormente. Opcionalmente, el cartílago es cartílago articular, y la cantidad de polipéptido WISP-2 utilizado es una cantidad terapéuticamente eficaz. En una realización preferente, el trastorno cartilaginoso es osteoartritis o artritis reumatoide. Los procedimientos pueden llevarse a cabo ex vivo, mediante la puesta en contacto de dicho tejido de cartílago con una cantidad eficaz de polipéptido WISP-2 en cultivo y después trasplantando el tejido de cartílago tratado en el mamífero. Además, los procedimientos y usos pueden llevarse a cabo mediante la utilización de polipéptido WISP-2 individualmente como agente terapéutico, o en combinación con una cantidad eficaz de un agente de cartílago u otra técnica terapéutica. Por ejemplo, el polipéptido WISP-2 puede utilizarse en combinación con cualquier técnica quirúrgica estándar de cartílago. El polipéptido WISP-2 puede administrarse antes, después y/o simultáneamente con la técnica quirúrgica estándar de cartílago.

En una realización adicional, la presente invención se refiere a un procedimiento in vitro o ex vivo para el tratamiento de cartílago dañado por lesión o para la prevención de un daño inicial o daños continuos, que comprende poner en contacto dicho cartílago con una cantidad eficaz de polipéptido WISP-2 y la utilización del polipéptido WISP-2 en la preparación de un medicamento para el tratamiento de cartílago dañado por lesión o para la prevención del daño inicial o continuo. Más específicamente, la lesión tratada es microscópica o contundente, una fractura condral, una fractura osteocondral, o daños a tendones, meniscos o ligamentos. En un aspecto específico, la lesión puede ser el resultado de tensión mecánica excesiva u otra inestabilidad biomecánica resultante de una lesión deportiva u obesidad. Alternativamente, la presente invención se refiere a un procedimiento in vitro o ex vivo de tratar o facilitar la reparación de fracturas óseas, que comprende poner en contacto la región de la lesión ósea con una cantidad eficaz de polipéptido WISP-2 o la utilización de polipéptido WISP-2 en dicho tratamiento.

En otra realización, la invención se refiere a un procedimiento in vitro o ex vivo de potenciación, estimulación o estimulación de la diferenciación de condrocitos o células precursoras de condrocito mediante la puesta en contacto de los condrocitos o células precursoras de condrocito con una cantidad eficaz de polipéptido WISP-2.

En otra realización, la presente invención se refiere a un kit o producto de fabricación, que comprende el polipéptido WISP-2 y un portador, excipiente y/o estabilizante (por ejemplo un tampón) empaquetado convenientemente. El kit o producto preferentemente contiene instrucciones para utilizar el polipéptido WISP para tratar el cartílago dañado o para prevenir el daño inicial o continuo al cartílago como resultado de un trastorno cartilaginoso. Alternativamente, el kit puede contener instrucciones para utilizar el polipéptido WISP para tratar un trastorno cartilaginoso.

Entre otras realizaciones más particulares de la presente invención se incluyen procedimientos in vitro o ex vivo de tratar células o tejido de cartílago de mamífero, que comprenden poner en contacto células o tejido de cartílago de mamífero dañado por un trastorno cartilaginoso degenerativo (o dañado por una lesión) con una cantidad eficaz de polipéptido WISP-2 o la utilización de polipéptido WISP-2 para dicho tratamiento, en el que dicho polipéptido WISP es un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en:

a)

un polipéptido WISP-2 que comprende los aminoácidos 24 a 250 de SEC ID nº 10,

b)

un polipéptido WISP-2 que comprende los aminoácidos 1 a 250 de la SEC ID nº 10,

c)

un polipéptido WISP-2 que presenta una identidad de por lo menos el 90% con el polipéptido a) o b), y

d)

un fragmento biológicamente activo del polipéptido a) o b).

En el caso de que el polipéptido WISP-2 presente una identidad de por lo menos el 90% con el polipéptido a) o b), dicho polipéptido WISP-2 estimula la proliferación o diferenciación de los condrocitos. Alternativamente, en el caso de que el polipéptido WISP-2 sea un fragmento biológicamente activo del polipéptido WISP-2 de a) o b), dicho fragmento biológicamente activo estimula la proliferación o diferenciación de los condrocitos. Los polipéptidos WISP indicados anteriormente pueden unirse a una o más moléculas de polietilenglicol. Opcionalmente los polipéptidos WISP pueden unirse a una etiqueta epítopo o a una molécula de inmunoglobulina. En los procedimientos, el cartílago puede ser un cartílago articular, y el trastorno cartilaginoso degenerativo puede ser artritis reumatoide u osteoartritis.

Breve descripción de los dibujos

Las figuras 1A-1G muestran la unión de WISP-1 a diferentes líneas celulares. Las células se sembraron en cámaras estériles montadas sobre portaobjetos y se cultivaron durante la noche. Al día siguiente, se bloquearon los sitios de unión no específica y las células se incubaron con 1 nM de mWISP-1-IgG (1A y 1B) o sin mWISP-1-IgG (1C) durante 1 hora. Las células se lavaron, se fijaron y la unión de WISP-1-IgG se detectó mediante inmunofluorescencia utilizando un anticuerpo IgG antihumano biotinilado y se siguió el procedimiento de amplificación indirecta de sustrato tiramida utilizando estreptavidina conjugada con FITC. En 1A, se agrupan las líneas celulares a las que se unió mWISP-1-IgG. El dibujo representa la señal fluorescente típica observada sobre una superficie de células NRK tras la unión de mWISP-1-IgG. En 1B, se agrupan las líneas celulares a las que no se unió mWISP-1-IgG. El dibujo representa la señal fluorescente típica observada sobre superficies de células RAG tras la unión de mWISP-1-IgG. El dibujo en 1C representa l señal fluorescente típica observada sobre superficies de células NRK cuando se omite mWISP-1-IgG del procedimiento de unión. Se dejó que se calentasen hasta la temperatura ambiente secciones de tumor de colon humano montadas en portaobjetos y se lavaron, se saturaron y se incubaron durante 1 hora en HBS-C/BSA al 3% y 1 nM de WISP-1-Fc (1D y 1E). En paralelo, se llevó a cabo la detección inmunofluorescente de vimentina en secciones contiguas tal como se describe en el Ejemplo 1 (1F y 1G).

Las figuras 2A-2B muestran la unión de mWISP-1-IgG a medio condicionado de fibroblastos de piel humana. Se preparó medio condicionado libre de suero de fibroblastos de piel humana tal como se describe en la sección titulada "Purificación de factores de unión de WISP-1". Se recubrieron por duplicado pocillos de microtitulación con cincuenta microlitros de medio condicionado. Los sitios de unión no específica se saturaron mediante incubación con HBS-C que contenía BSA al 3% y los pocillos se incubaron durante 2 horas con mWISP-1-IgG. Los pocillos se lavaron y se incubaron durante 1 hora con Fc' anti-IgG humana conjugada con peroxidasa de rábano picante. Tras 6 lavados con HBS-C que contenía BSA al 0,3%, la señal se visualizó utilizando un sustrato cromogénico de peroxidasa de rábano picante. La reacción se detuvo con ácido fosfórico 1 M y se midió la DO a 450 nm. La fig. 2A muestra la unión de 1 nM de mWISP-1-IgG a pocillos recubiertos con diluciones en serie de medio condicionado; la fig. 2B muestra la unión de diluciones en serie de mWISP-1-IgG a pocillos recubiertos con 0,5 \mul de medio condicionado de fibroblasto de piel humana.

Las figuras 3A-3B muestran la unión de mWISP-1-IgG a un factor sensible condroitinasa B de medio condicionado de fibroblastos de piel humana. En la fig. 3A, se recubrieron por duplicado pocillos de microtitulación con cincuenta microlitros de medio condicionado y se saturaron los sitios de unión no específica mediante incubación con HBS-C que contenía BSA al 3%. Se incubó WISP-1-IgG 1 nM durante 2 horas en ausencia o en presencia de NaCl 1 M, EDTA 100 mM o Tween-20 al 0,05%. Los pocillos se lavaron y se incubaron durante 1 hora con Fc' anti-IgG humana conjugada con peroxidasa de rábano picante. Tras 6 lavados con HBS-C que contenía BSA al 0,3%, la señal se visualizó utilizando un sustrato cromogénico de peroxidasa de rábano picante. La reacción se detuvo con ácido fosfórico 1 M y se midió la DO a 450 nm. En la fig. 3B, se añadieron a los pocillos recubiertos 50 \mul de HBS-C que contenían 0,5 U/ml de condroitinasa ABC (Ch ABC), 0,5 U/ml de condroitinasa AC II (Ch AC II), 0,5 U/ml de condroitinasa B (Ch B), 0,5 U/ml de condroitinasa C (Ch C), 0,5 U/ml de condroitín-4-sulfatasa (Ch-4-Sulf), 0,5 U/ml de condroitín-6-sulfatasa (Ch-6-Sulf), 0,5 U/ml de heparinasa (Hep), 0,5 U/ml de hialuronidasa (Hyal), 0,5 U/ml de neuraminidasa (Neuram) o 100 \mug/ml de proteinasa K (Prot K) y se incubaron durante 2 horas a 37ºC. Los pocillos se lavaron extensivamente, los sitios de unión no específica se saturaron y se incubó 1 nM de mWISP-1-IgG durante 2 horas a temperatura ambiente. Los pocillos se lavaron y se midió la unión de WISP-1-IgG.

Las figuras 4A-4B muestran la purificación de factores de unión de WISP-1 a partir de medio condicionado de fibroblastos de piel humana. En la fig. 4A, el medio condicionado libre de suero procedente de fibroblastos de piel humana se recogió tras tres días de cultivo, se concentró, se transfirió a un tampón que contenía Tris-HCl 20 mM, pH 7,4 y NaCl 300 mM y se aplicó en una columna de cromatografía de intercambio aniónico de Q-sefarosa. La columna se lavó y las proteínas retenidas se desorbieron con un gradiente creciente de NaCl. La presencia de factor de unión de WISP-1 se analizó en cada fracción utilizando un ensayo de unión de fase sólida. En la fig. 4B, la fracción 15 (indicada con un "*" en la fig. 4A) se incubó a 37ºC durante 2 horas en presencia (+) o en ausencia (-) de 0,1 U de condroitinasa ABC. Las muestras se separaron mediante SDS-PAGE bajo condiciones reductoras y los geles se tiñeron con plata. Las bandas indicadas se identificaron mediante espectroscopía de masas.

Las figuras 5A-5B muestra la unión de WISP-1 a decorina y a biglicano. En la fig. 5A, se recubrieron pocillos de microtitulación con diluciones en serie de decorina (círculos negros) o biglicano (círculos blancos). Los sitios de unión no específica se saturaron y se incubaron 0,25 nM de mWISP-1-IgG durante 2 horas. Los pocillos se lavaron y se incubaron con Fc' anti-IgG humana conjugada con peroxidasa de rábano picante (2 \mug/ml) durante 1 hora. Tras 6 lavados con PBS que contenía Tween-20 al 0,05%, se desarrolló una señal mediante incubación de un sustrato cromogénico. El desarrollo de color se detuvo mediante la adición de ácido fosfórico 1 M y se midió la D.O. a 450 nm. En la fig. 5B, se recubrieron pocillos de placas de microtitulación con cincuenta mililitros de medio condicionado de fibroblastos de piel humana. Los sitios de unión no específica se saturaron y se incubaron 0,25 nM de WISP-1-IgG en presencia de diversas concentraciones de decorina (círculos negros) o biglicano (círculos blancos) durante 2 horas. Se evaluó la unión de mWISP-1-IgG tal como se describe en la fig. 5A.

La fig. 6 muestra la unión de mWISP-1-IgG a glucosaminoglicanos. Se preparó medio condicionado libre de suero de fibroblastos de piel humana tal como se describe posteriormente en los Ejemplos. Se recubrieron pocillos de microplacas durante la noche a 4ºC con cincuenta \mul de medio condicionado., se saturaron los sitios de unión no específica y los pocillos se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente con 0,5 nM de WISP-1-IgG en presencia de diversas concentraciones de diferentes glucosaminoglicanos. Los pocillos se lavaron, se desarrolló una señal utilizando un sustrato cromogénico y se midió la D.O. a 450 nm. Condroitín sulfato A (círculos negros); dermatán sulfato (círculos blancos); condroitín sulfato C (triángulos negros); condroitín sulfato D (triángulos blancos); condroitín sulfato E (cuadrados negros); heparina (X); heparán sulfato (cuadrados blancos).

Las figuras 7A-7I muestran que el dermatán sulfato compite por la unión de WISP-1 con los fibroblastos de piel humana. Se sembraron fibroblastos de piel humana en cámaras estériles montadas sobre portaobjetos. Los sitios de unión no específica se saturaron y se incubó 1 nM de WISP-1-IgG durante 1 hora a temperatura ambiente en ausencia (7A) o en presencia (7B) de 50 \mug/ml de condroitín sulfato A ("CSA"), dermatán sulfato ("DS"); (7C), condroitín sulfato C ("CS C"); (7D), condroitín sulfato D ("CS D"); (7E), condroitín sulfato E ("CS E")(7F); heparina ("Hep") (7G) o heparán sulfato ("HS") (7H). Las células se lavaron y se fijaron y se detectó la unión de WISP-1-IgG mediante inmunofluorescencia utilizando un anticuerpo anti-IgG humano biotinilado y se finalizó el procedimiento indirecto de amplificación de sustrato tiramida con estreptavidina conjugada con FITC. La intensidad de fluorescencia relativa de imágenes digitales adquiridas se midió mediante análisis morfométrico (7I).

Las figuras 8A-8G muestran que la unión de WISP-1 a fibroblastos de piel humana resulta bloqueada por la digestión de la superficie celular con condroitinasa B. Se incubaron fibroblastos de piel humana durante 2 horas a 37ºC en ausencia (8A) o en presencia de 0,1 U de condroitinasa ABC (Ch ABC); (8B), condroitinasa B ("Ch B"); (8C), condroitinasa C ("Ch C"); (8D), heparinasa ("Hep") (8E). Las células se lavaron, se saturaron los sitios de unión no específica y se incubó 1 nM de WISP-1-IgG durante 1 hora a temperatura ambiente. Tras 3 lavados, las células se fijaron y se detectó la unión de WISP-1-IgG mediante inmunofluorescencia utilizando un anticuerpo anti-IgG humano biotinilado y se finalizó el procedimiento indirecto de amplificación de sustrato tiramida con estreptavidina conjugada con FITC. La fig. 8F representa un control negativo en el que se utilizaron células no digeridas aunque se omitió mWISP-1-IgG del procedimiento de unión. La intensidad de fluorescencia relativa de las imágenes digitales adquiridas (8G) se midió mediante análisis morfométrico.

Las figuras 9A-9D muestran que la decorina y el biglicano compiten por la unión de WISP-1 a fibroblastos de piel humana. Se sembraron fibroblastos de piel humana en cámaras estériles montadas sobre portaobjetos y se saturaron los sitios de unión no específica. Se incubó un nanomolar de mWISP-1-IgG durante 1 hora a temperatura ambiente en presencia de 1 mg/ml de decorina (9A) o biglicano (9B) o en ausencia de competidores añadidos (9C). Las células se lavaron y se fijaron, y la unión de WISP-1-IgG se detectó mediante inmunofluorescencia utilizando un anticuerpo anti-IgG humana biotinilado y se finalizó el procedimiento indirecto de amplificación de sustrato tiramida con estreptavidina conjugada con FITC. La intensidad de fluorescencia relativa de las imágenes digitales adquiridas se midió mediante análisis morfométrico (9D).

La figura 10 muestra la adhesión de diferentes mutantes de células CHO a WISP-1. Se introdujeron las células en PBS que contenía EDTA 2 mM y después se lavaron y se resuspendieron en Ham-F12/LGDMEM (50:50) libre de suero que contenía BSA al 1%. Se añadió suspensión celular a pocillos de microtitulación recubiertos con WISP-1 y se incubó a 37ºC durante 2 horas. Los pocillos se lavaron 3X con PBS, se extrajeron los sobrenadantes y se contó el número de células adherentes utilizando CyQUANT de Molecular Probes. Se utilizó la adhesión de células CHO-K1 a pocillos de microtitulación recubiertos con WISP-1 como indicador de 100% y todos los valores se corrigieron para la adhesión no específica a pocillos de microtitulación recubiertos con BSA.

La figura 11 muestra la adhesión de fibroblastos de piel humana a WISP-1. Se introdujeron las células en PBS que contenía EDTA 15 mM y después se lavaron y se resuspendieron en Ham-F12/LGDMEM (50:50) libre de suero que contenía BSA al 1%. Se añadió suspensión celular a los pocillos de microtitulación en ausencia o en presencia de 100 \mug/ml de dermatán sulfato (es decir, condroitín sulfato B) o heparina. Tras 2 horas a 37ºC, los pocillos se lavaron 3X con PBS, se extrajo el sobrenadante y se contó el número de células adherentes mediante tinción con cristal violeta. Todos los valores se corrigieron para la adhesión no específica a los pocillos de microtitulación recubiertos con BSA.

La figura 12 muestra los resultados de un ensayo de diferenciación de condrocitos.

La figura 13 muestra los resultados de un ensayo de tinción de colágeno II.

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La figura 14 muestra los resultados de un ensayo de degradación de la matriz de cartílago. Los datos ilustrados muestran que WISP-3 reduce la degradación de la matriz del cartílago. Se trataron explantes de cartílago articular con medio solo (-)' o con 150 ng/ml de WISP-3 (WISP-3) o en medio con IL-1alfa (1 ng/ml) solo (+) o con IL-1alfa más WISP-3 (WISP3+) durante 3 días. Se determinó la degradación de la matriz de cartílago mediante la medición de la cantidad de proteoglicanos en el medio utilizando el ensayo DMMB.

Las figuras 15A-15B muestran que WISP-1 inhibe la degradación de la matriz del cartílago y la producción de óxido nítrico. Los explantes de cartílago articular se trataron con medio solo (-) o con WISP-1 1,1 nM (WISP1-) o en medio con IL-1alfa (1 ng/ml) solo o con IL-1alfa con WISP-1 (WISP1+) durante 3 días. En la fig. 15A, se determinó la degradación de la matriz del cartílago mediante la medición de la cantidad de proteoglicanos en el medio utilizando el ensayo DMMB. En la fig. 15B, se determinó la producción de óxido nítrico (NO) mediante la medición de la cantidad de NO en el medio utilizando la reacción de Griess.

La figura 16 muestra el fenotipo esquelético de ratones transgénicos que sobreexpresan WISP-2. Se muestran secciones histológicas del fémur de ratones de 14 semanas de tipo salvaje (panel derecho) o transgénicos (panel izquierdo), que sobreexpresan WISP-2 en sus músculos esqueléticos. Obsérvese la expansión de las zonas de cartílago hialino, es decir la placa de crecimiento y el cartílago articular, en los ratones transgénicos en comparación con las de los ratones de tipo salvaje. Además, se observa la presencia de áreas de matriz de cartílago en el hueso cortical de los ratones transgénicos, pero no en el de los ratones de tipo salvaje.

La figura 17 muestra las secuencias de aminoácidos de WISP-1-IgG humano (SEC ID nº 1), WISP-1-IgG de ratón (SEC ID nº 2), WISP-1 humano de "tipo salvaje" (SEC ID nº 3), WISP-1 de ratón de "tipo salvaje" (SEC ID nº 4) y etiqueta de IgG humana (SEC ID nº 5).

La figura 18 muestra las secuencias de aminoácidos de WISP-3-IgG (SEC ID nº 6), WISP-3-IgG "alternativo" (SEC ID nº 7), WISP-3 (SEC ID nº 8) y WISP-3-"empalme 5' largo" (SEC ID nº 9).

La figura 19 muestra la secuencia de aminoácidos de WISP-2 humano (SEC ID nº 10).

Descripción detallada de la invención I. Definiciones

La expresión "polipéptido WISP" se refiere a la familia de proteínas WISP de secuencia nativa humanas y de ratón y a las variantes indicadas en la presente invención los genes de las cuales resultan inducidas por lo menos por Wnt-1. Esta expresión incluye WISP-2 y las variantes del mismo. Estas proteínas WISP-2 se describen adicionalmente después y en la solicitud de patente PCT nº WO99/21998, publicada el 6 de mayo de 1999, y en Pennica et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 95:14717-14722, 1998.

Las expresiones "polipéptido WISP-1", "homólogo de WISP-1" y variantes gramaticales de las mismas, tal como se utilizan en la presente invención, comprenden proteína WISP-1 de secuencia nativa y variantes (que se definen adicionalmente en la presente invención). El polipéptido WISP-1 puede aislarse a partir de una diversidad de fuentes, tales como de tipos tisulares humanos o de otra fuente, o pueden prepararse mediante procedimientos de recombinación o de síntesis, o mediante cualquier combinación de estas técnicas y otras similares.

Las expresiones "polipéptido WISP-2", "homólogo de WISP-2", "PRO261" y "polipéptido PRO261" y las variantes gramaticales de las mismas, tal como se utilizan en la presente invención, comprenden proteína WISP-2 de secuencia nativa y variantes (que se definen adicionalmente en la presente invención). El polipéptido WISP-2 puede aislarse a partir de una diversidad de fuentes, tales como de tipos tisulares humanos o de otra fuente, o puede prepararse mediante procedimientos de recombinación o de síntesis, o mediante cualquier combinación de estas técnicas y otras similares.

Las expresiones "polipéptido WISP-3", "homólogo de WISP-3" y las variantes gramaticales de las mismas, tal como se utilizan en la presente invención, comprenden proteína WISP-3 de secuencia nativa y variantes (que se definen adicionalmente en la presente invención). El polipéptido WISP-3 puede aislarse a partir de una diversidad de fuentes, tales como de tipos tisulares humanos o de otra fuente, o pueden prepararse mediante procedimientos de recombinación o de síntesis, o mediante cualquier combinación de estas técnicas y otras similares.

La expresión "polipéptido WISP-1 de secuencia nativa" comprende un polipéptido que presenta la misma secuencia de aminoácidos que un polipéptido WISP-1 derivado de la naturaleza. Estos polipéptidos WISP-1 de secuencia nativa pueden aislarse de la naturaleza o pueden producirse mediante medios recombinantes o sintéticos. La expresión "polipéptido WISP-1 de secuencia nativa" comprende específicamente formas truncadas o secretadas de origen natural de un polipéptido WISP-1 dado a conocer en la presente invención, formas variantes de origen natural (por ejemplo, formas procesadas ("spliced") alternativamente o variantes de procesamiento ("splice")) y variantes alélicas de origen natural de un polipéptido WISP-1. El polipéptido WISP-1 de secuencia nativa puede ser un polipéptido WISP-1 humano de secuencia nativa maduro o de longitud completa que comprende los aminoácidos 23 a 367 de la SEC ID nº 3 de la presente invención (también proporcionado anteriormente en las figuras 3A y 3B (SEC ID nº 3) mostradas en WO99/21998, publicada el 6 de mayo de 1999) o los aminoácidos 1 a 367 de la SEC ID nº 3 de la presente invención (proporcionados anteriormente en las figuras 3A y 3B (SEC ID nº 4) mostradas en la patente nº WO99/21998), respectivamente, con o sin una metionina N-terminal. Opcionalmente, el polipéptido WISP-1 humano comprende la secuencia contigua de aminoácidos 23 a 367 o los aminoácidos 1 a 367 de la SEC ID nº 3 de la presente invención. Opcionalmente, el polipéptido WISP-1 humano se encuentra codificado por una secuencia polinucleótida que presenta la secuencia de nucleótidos codificante del depósito ATCC nº 209533.

El polipéptido WISP-1 de secuencia nativa puede ser un polipéptido WISP-1 humano de secuencia nativa maduro o de longitud completa que comprende los aminoácidos 23 a 367 o 1 a 367 de la SEC ID nº 3 de la presente invención, en el que el residuo valina en la posición 184 o el residuo alanina en la posición 202 ha sido/han sido cambiados por un residuo isoleucina o serina, respectivamente, con o sin una metionina N-terminal. El polipéptido WISP-1 de secuencia nativa puede ser un polipéptido WISP-1 humano de secuencia nativa maduro o de longitud completa que comprende los aminoácidos 23 a 367 o 1 a 367 de la SEC ID nº 3 de la presente invención, en el que el residuo valina en la posición 184 y el residuo alanina en la posición 202 ha sido/han sido cambiados por un residuo isoleucina o serina, respectivamente, con o sin una metionina N-terminal. El polipéptido WISP-1 de secuencia nativa puede ser un polipéptido WISP-1 de ratón de secuencia nativa maduro o de longitud completa que comprende los aminoácidos 23 a 367 de la SEC ID nº 4 de la presente invención (proporcionados anteriormente en la figura 1 (SEC ID nº 11) mostrada en WO99/21998), o los aminoácidos 1 a 367 de la SEC ID nº 4 de la presente invención (proporcionados anteriormente en la figura 1 (SEC ID nº 12) mostrada en WO99/21998), respectivamente, con o sin una metionina N-terminal.

El polipéptido WISP-1 de secuencia nativa puede ser uno que es codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende una de las variantes de la secuencia WISP-1 procesada ("spliced") humana u otras variantes de secuencia nativa, incluyendo las SEC ID nº 23, 24, 25, 26, 27, 28 ó 29 mostradas en WO99/21998, con o sin una metionina N-terminal.

La expresión "polipéptido WISP-2 de secuencia nativa" o la expresión "polipéptido PRO261 de secuencia nativa" comprende un polipéptido que presenta la misma secuencia de aminoácidos que un polipéptido WISP-2 derivado de la naturaleza. Dichos polipéptidos WISP-2 de secuencia nativa pueden aislarse de la naturaleza o pueden producirse por medios recombinantes o sintéticos. La expresión "polipéptido WISP-2 de secuencia nativa" comprende específicamente formas truncadas o secretadas de origen natural de un polipéptido WISP-2 dadas a conocer en la presente invención, formas variantes de origen natural (por ejemplo formas procesadas ("spliced") alternativamente o variantes de procesamiento ("splice")) y variantes alélicas de origen natural de un polipéptido WISP-2. En una realización de la presente invención, el polipéptido WISP-2 de secuencia nativa es un polipéptido WISP-2 humano de secuencia nativa maduro o de longitud completa que comprende los aminoácidos 1 a 24 hasta 250 de la SEC ID nº 10 de la presente invención (proporcionado anteriormente en la figura 4 (SEC ID nº 15, 16 y 56 a 77) mostrada en WO99/21998), que incluye los aminoácidos 24 a 250 y los aminoácidos 1 a 250 de la SEC ID nº 10 de la presente invención, con o sin una metionina N-terminal. Opcionalmente, el polipéptido WISP-2 humano comprende la secuencia contigua de aminoácidos 24 a 250 o los aminoácidos 1 a 250 de la SEC ID nº 10 de la presente invención. Opcionalmente el polipéptido WISP-2 humano es codificado por una secuencia de polinucleótidos que presenta la secuencia de nucleótidos codificante del depósito ATCC nº 209391. En otra realización de la presente invención, el polipéptido WISP-2 de secuencia nativa es un polipéptido WISP-2 de ratón de secuencia nativa maduro o de longitud completa que comprende los aminoácidos 1 a 24 hasta 251 de la figura 2 (SEC ID nº 19, 20 y 78 a 99) mostrada en nº WO99/21998, que incluye los aminoácidos 24 a 251 y los aminoácidos 1 a 251 de la figura 2 (SEC ID nº 19 y 20, respectivamente) mostrada en WO99/21998, con o sin una metionina N-terminal.

La expresión "polipéptido WISP-3 de secuencia nativa" comprende un polipéptido que presenta la misma secuencia de aminoácidos que un polipéptido WISP-3 derivado de la naturaleza. Estos polipéptidos WISP-3 de secuencia nativa pueden aislarse de la naturaleza o pueden producirse por medios recombinantes o sintéticos. La expresión "polipéptido WISP-3 de secuencia nativa" comprende específicamente formas de origen natural truncadas u otras formas de un polipéptido WISP-3 dado a conocer en la presente invención, formas variantes de origen natural (por ejemplo formas alternativamente procesadas o variantes de procesamiento) y variantes alélicas de origen natural de un polipéptido WISP-3. El polipéptido WISP-3 de secuencia nativa puede ser un polipéptido WISP-3 humano de secuencia nativa maduro o de longitud completa que comprende los aminoácidos 34 a 372 de la SEC ID nº 9 de la presente invención (proporcionado anteriormente en las figuras 6A y 6B (SEC ID nº 32) de la patente nº WO99/21998) o los aminoácidos 1 a 372 de la SEC ID nº 9 de la presente invención (proporcionada anteriormente en las figuras 6A y 6B (SEC ID nº 33) de la patente nº WO99/21998), respectivamente, con o sin una metionina N-terminal. El polipéptido WISP-3 de secuencia nativa puede ser un polipéptido WISP-3 humano de secuencia nativa maduro o de longitud completa, que comprende los aminoácidos 16 a 354 de la SEC ID nº 8 de la presente invención (proporcionada anteriormente en las figuras 7A y 7B (SEC ID nº 36) mostradas en la patente nº WO99/21998) o los aminoácidos 1 a 354 de la SEC ID nº 8 (proporcionada anteriormente en las figuras 7A y 7B (SEC ID nº 37) mostradas en la patente nº WO99/21998), respectivamente, con o sin una metionina N-terminal. Opcionalmente, el polipéptido WISP-3 humano comprende la secuencia contigua de aminoácidos 34 a 372 o los aminoácidos 1 a 372 de la SEC ID nº 9 de la presente invención. Opcionalmente el polipéptido WISP-3 humano comprende la secuencia contigua de aminoácidos 16 a 354 o 1 a 354 de la SEC ID nº 8 de la presente invención. Opcionalmente el polipéptido WISP-3 humano se encuentra codificado por una secuencia polinucleótida que presenta la secuencia de nucleótidos codificante del depósito ATCC nº 209707.

La expresión "variante de WISP-1" se refiere a un polipéptido WISP-1 activo tal como se define posteriormente que presenta una identidad de secuencia de aminoácidos de por lo menos aproximadamente 80%, preferentemente de por lo menos aproximadamente 85%, más preferentemente de por lo menos aproximadamente 90%, todavía más preferentemente de por lo menos aproximadamente 95% con el polipéptido WISP-1 humano maduro que presenta la secuencia de aminoácidos deducida de los aminoácidos 23 a 367 de la SEC ID nº 3, y/o con el polipéptido WISP-1 humano de longitud completa que presenta la secuencia de aminoácidos deducida de los aminoácidos 1 a 367 de la SEC ID nº 3, y/o con el polipéptido WISP-1 maduro de ratón que presenta la secuencia de aminoácidos deducida que se muestra en la fig. 1 (SEC ID nº 11) proporcionada en la patente nº WO99/21998, y/o con el polipéptido WISP-2 de ratón de longitud completa que presenta la secuencia de aminoácidos deducida mostrada en la fig. 1 (SEC ID nº 12) de la patente nº WO99/21998. Entre dichas variantes se incluyen, por ejemplo, los polipéptidos WISP-1 en los que se han añadido o se han delecionado uno o más residuos aminoácidos (es decir, fragmentos) del extremo N-terminal o C-terminal de las secuencias maduras o de longitud completa de la SEC ID nº 3, incluyendo variantes de otras especies, aunque se excluye el polipéptido WISP-1 de secuencia nativa.

Las expresiones "variante de WISP-2" o "variante PRO261" se refieren a un polipéptido WISP-2 activo tal como se define posteriormente que presenta una identidad de secuencia de aminoácidos de por lo menos aproximadamente 80%, preferentemente de por lo menos aproximadamente 85%, más preferentemente de por lo menos aproximadamente 90%, todavía más preferentemente de por lo menos aproximadamente 95%, con el polipéptido WISP-2 maduro humano que presenta la secuencia de aminoácidos deducida putativa de aminoácidos 24 a 250 de la SEC ID nº 10 y/o con el polipéptido WISP-2 de longitud completa humano que presenta la secuencia de aminoácidos deducida de aminoácidos 1 a 250 de la SEC ID nº 10 y/o con el polipéptido WISP-2 maduro de ratón que presenta la secuencia de aminoácidos deducida putativa mostrada en la fig. 2 (SEC ID nº 19) de la patente nº WO99/21998 y/o con el polipéptido WISP-2 de longitud completa de ratón que presenta la secuencia de aminoácidos deducida mostrada en la fig. 2 (SEC ID nº 20) de la patente nº WO99/21998. Entre dichas variantes se incluyen, por ejemplo, los polipéptidos WISP-2 en los que se han añadido o se han delecionado uno o más residuos aminoácidos (es decir fragmentos) del extremo N-terminal o C-terminal de las secuencias maduras de longitud completa y maduras de SEC ID nº 10, incluyendo variantes de otras especies, aunque excluye el polipéptido WISP-2 de secuencia nativa.

El término "variante de WISP-3" se refiere a un polipéptido WISP-3 activo tal como se define posteriormente que presenta una identidad de secuencia de aminoácidos de por lo menos aproximadamente 80%, preferentemente de por lo menos aproximadamente 85%, más preferentemente de por lo menos aproximadamente 90%, todavía más preferentemente de por lo menos aproximadamente 95%, con el polipéptido WISP-3 maduro humano que presenta la secuencia de aminoácidos deducida de aminoácidos 34 a 372 de la SEC ID nº 9 y/o con el polipéptido WISP-3 de longitud completa humana que presenta la secuencia de aminoácidos deducida de aminoácidos 1 a 372 de SEC ID nº 9 y/o con el polipéptido WISP-3 maduro humano que presenta la secuencia de aminoácidos deducida de aminoácidos 16 a 354 de SEC ID nº 8 o con el polipéptido WISP-3 de longitud completa humano que presenta la secuencia de aminoácidos deducida de aminoácidos 1 a 354 de SEC ID nº 8. Entre dichas variantes se incluyen, por ejemplo, los polipéptidos WISP-3 en los que se han añadido o se han delecionado uno o más residuos aminoácidos (es decir fragmentos) del extremo N-terminal o C-terminal de las secuencias de longitud completa o maduras de SEC ID nº 9 o SEC ID nº 8, incluyendo variantes de otras especies, aunque excluye el polipéptido WISP-3 de secuencia nativa.

La expresión "porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos" con respecto a las secuencias de polipéptido WISP identificadas en la presente invención se define como el porcentaje de residuos aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos aminoácidos en dichas secuencias WISP identificadas en la presente invención, tras alinear las secuencias e introducir los huecos, en caso necesario, para conseguir el máximo porcentaje de identidad de secuencia, y no considerando cualquier sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencias. La alineación con fines de determinar el porcentaje de identidad de secuencias de aminoácidos puede conseguirse de diversas maneras que se encuentran comprendidas dentro de los conocimientos del experto en la materia, por ejemplo utilizando software informático disponible públicamente, tal como BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 o Megaligh (DNASTAR). Los expertos en la materia pueden determinar los parámetros apropiados para mediar la alineación, incluyendo cualquier algoritmo necesario para conseguir la alineación máxima a lo largo de la longitud completa de las secuencias que se comparan. Sin embargo, a los fines de la presente invención los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos se obtienen mediante la utilización del programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2. El autor del programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2 es Genentech, Inc., y el código fuente ha sido presentado junto con la documentación para el usuario en la U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559, donde se encuentra registrado bajo el nº de registro U.S. Copyright TXU510087. El programa ALIGN-2 se encuentra disponible públicamente a través de Genentech, Inc., South San Francisco, California. El programa ALIGN-2 debe compilarse para su uso en un sistema operativo UNIX, preferentemente UNIX digital V4.0D. Todos los parámetros de comparación de secuencias son fijados por el programa ALIGN-2 y no varían.

La expresión "condiciones restrictivas" se refiere a aquellas condiciones que: (1) utilizan una fuerza iónica reducida y una temperatura elevada para el lavado, cloruro sódico 0,015 M/citrato sódico 0,0015 M/dodecil sulfato sódico al 0,1% a 50ºC; (2) utilizando durante la hibridación un agente desnaturalizante, tal como formamida, formamida al 50% (v/v) con albúmina de suero bovino al 0,1%/Ficoll al 0,1%/polivinilpirrolidona al 0,1%/tampón fosfato sódico 50 mM a pH 6,5 con cloruro sódico 750 mM, citrato sódico 75 mM a 42ºC; (3) utilizan formamida al 50%, 5 x SSC (NaCl 0,75 M, citrato sódico 0,075 M), fosfato sódico 50 mM (pH 6,8), pirofosfato sódico al 0,1%, 5 x solución de Denhardt, ADN de esperma de salmón sonicado (50 \mug/ml), SDS al 0,1% y dextrán sulfato al 10% a 42ºC, con lavados a 42ºC en 0,2 x SSC y SDS al 0,1%, o (4) utilizan un tampón de dextrán sulfato al 10%, 2 x SSC (cloruro sódico/citrato sódico) y formamida al 50% a 55ºC, seguido de un lavado de alta astringencia consistente de 0,1 x SSC que contiene EDTA a 55ºC.

Las "condiciones moderadamente restrictivas" se describen en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) e incluyen la utilización de una solución de lavado y condiciones de hibridación (por ejemplo temperatura, fuerza iónica y porcentaje de SDS) menos restrictivas que las indicadas anteriormente. Un ejemplo de condición moderadamente restrictiva es la incubación durante la noche a 37ºC en una solución que comprende formamida al 20%, 5 x SSC (NaCl 150 mM, citrato trisódico 15 mM), fosfato sódico 50 mM (pH 7,6), 5 x solución de Denhardt, dextrán sulfato al 10% y 20 mg/ml de ADN de esperma de salmón fragmentado desnaturalizado, seguido del lavado de los filtros en 1 x SSC a una temperatura de entre aproximadamente 37ºC y 50ºC. El experto en la materia conocerá cómo ajustar la temperatura, fuerza iónica, etc., según resulte necesario para adaptarse a factores tales como la longitud de la sonda y similares.

La expresión "aislado" cuando se utiliza para describir los diversos polipéptidos dados a conocer en la presente invención se refiere a un polipéptido que ha sido identificado y separado y/o recuperado de un componente del ambiente natural del mismo. Los componentes contaminantes del ambiente natural son materiales que típicamente interferirían con los usos diagnósticos o terapéuticos del polipéptido, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteicos o no proteicos. En realizaciones preferentes, el polipéptido se purifica (1) en un grado suficiente para obtener por lo menos 15 residuos aminoácidos de secuencia N-terminal o de secuencia interna mediante la utilización de un secuenciador de taza giratoria, o (2) hasta la homogeneidad mediante SDS-PAGE bajo condiciones no reductoras o reductoras utilizando azul de Coomassie o, preferentemente, tinción de plata. La expresión "polipéptido aislado" incluye polipéptido in situ dentro de células recombinantes, debido a que por lo menos un componente del ambiente natural de WISP no se encontrará presente. Sin embargo, ordinariamente se prepara polipéptido aislado mediante por lo menos una etapa de purificación.

La expresión "secuencias de control" se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia codificante operablemente ligada en un organismo huésped particular. Las secuencias de control que resultan adecuadas para procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia operadora y un sitio de unión ribosómica. Es conocido que las células eucarióticas utilizan promotores, señales de poliadenilación e intensi-
ficadores.

Un ácido nucleico se encuentra "operablemente ligado" cuando se sitúa en una relación funcional con otra secuencia de ácidos nucleicos. Por ejemplo, el ADN de una presecuencia o líder secretorio se encuentra operablemente ligado a ADN para un polipéptido si se expresa en forma de preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o intensificador se encuentra operablemente ligado a una secuencia codificante si afecta a la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión ribosómica se encuentra operablemente ligado a una secuencia codificante si se sitúa de manera que facilita la traducción. Generalmente la expresión "operablemente ligado" se refiere a que las secuencias de ADN que se unen son contiguas y, en el caso de un líder secretorio, contiguas y en el mismo marco de lectura. Sin embargo, los intensificadores no son necesariamente contiguos. El ligamiento se lleva a cabo mediante ligación en sitios de restricción convenientes. Si dichos sitios no existen, se utilizan los adaptadores oligonucleótidos sintéticos o línkers según la práctica convencional.

Un "liposoma" es una vesícula pequeña compuesta de diversos tipos de lípidos, fosfolípidos y/o surfactante que resulta útil para la administración de un fármaco (tal como los polipéptidos WISP y las variantes WISP dadas a conocer en la presente invención) en un mamífero. Los componentes del liposoma comúnmente se disponen en formación de bicapa, similar a la disposición de los lípidos en las membranas biológicas.

Tal como se utiliza en la presente invención, el término "inmunoadhesina" designa las moléculas similares a anticuerpos que combinan la especificidad de unión de una proteína heteróloga (una "adhesina") con las funciones efectoras de los dominios constantes de inmunoglobulina. Estructuralmente las inmunoadhesinas comprenden una fusión de una secuencia de aminoácidos con la especificidad de unión deseada que es diferente del sitio de reconocimiento y unión de antígeno de un anticuerpo (es decir, es "heteróloga") y una secuencia de dominio constante de inmunoglobulina. La parte adhesina de una molécula de inmunoadhesina típicamente es una secuencia de aminoácidos contigua que comprende por lo menos el sitio de unión de un receptor o de un ligando. La secuencia de dominio constante de inmunoglobulina en la inmunoadhesina puede obtenerse a partir de cualquier inmunoglobulina, tal como los subtipos IgG-1, IgG-2, IgG-3 o IgG-4, IgA (incluyendo IgA-1 e IgA-2), IgE, IgD o IgM.

Los términos "activo" o "actividad" en el contexto de los polipéptidos WISP o las variantes WISP de la invención se refiere a la forma o formas de proteínas de la invención que conservan las actividades biológicas y/o inmunológicas de un polipéptido WISP nativo o de origen natural, en los que actividad "biológica" se refiere a una función biológica (inhibidora o estimuladora) causada por un polipéptido WISP nativo o de origen natural diferente de la capacidad de servir como antígeno en la producción de un anticuerpo contra un epítopo antigénico presente en un polipéptido nativo o de origen natural de la invención. De manera similar, actividad "inmunológica" se refiere a la capacidad de servir como antígeno en la producción de un anticuerpo contra un epítopo antigénico presente en un polipéptido nativo o de origen natural de la invención.

La expresión "actividad biológica" en el contexto de un polipéptido WISP o variante WISP de la presente invención se utiliza para referirse a la capacidad de dichas moléculas de estimular la regeneración y/o de prevenir la destrucción de cartílago o de potenciar o estimular la diferenciación o proliferación de los condrocitos (es decir, la diferenciación de una célula precursora en condrocito maduro). Opcionalmente el cartílago es cartílago articular y la regeneración y/o destrucción del cartílago se asocia con una lesión o con un trastorno cartilaginoso degenerativo. Por ejemplo, dicha actividad biológica puede cuantificarse mediante la inhibición de la liberación de proteoglicano (PG) del cartílago articular, el incremento de la síntesis de PG en el cartílago articular, la inhibición de la producción de NO, etc.

La expresión "trastorno cartilaginoso" se refiere de manera general a una enfermedad que se manifiesta en síntomas de dolor, rigidez y/o limitación de movimiento de las partes corporales afectadas. Se encuentra comprendido dentro del alcance de la expresión "trastorno cartilaginoso", "trastorno cartilaginoso degenerativo", un trastorno caracterizado, por lo menos en parte, por la degeneración o alteración metabólica de tejidos conectivos del cuerpo, incluyendo no sólo las articulaciones o estructuras relacionadas, incluyendo músculos, bursae (membrana sinovial), tendones y tejido fibroso, sino también la placa de crecimiento. En una realización, la expresión incluye "trastorno del cartílago articular" que se caracteriza por la rotura de la superficie lisa del cartílago articular y la degradación de la matriz del cartílago. Entre las patologías adicionales se incluyen la producción de óxido nítrico y la inhibición o la reducción de la síntesis de matriz.

Se encuentra comprendido dentro del alcance de la expresión "trastorno del cartílago articular" la osteoartritis (OA) y la artritis reumatoide (RA). La OA se caracteriza por la destrucción asimétrica localizada del cartílago en la misma medida que los alargamientos óseos palpables en los márgenes articulares. La OA típicamente afecta a las articulaciones interfalángicas de las manos, a la primera articulación carpometacarpal, a las caderas, a las rodillas, a la columna vertebral y a algunas articulaciones en la parte media del pie, mientras que las articulaciones grandes, tales como los tobillos, codos y hombros tienden a no resultar afectados. La OA puede encontrarse asociada a enfermedades metabólicas, tales como hemocromatosis y alcaptonuria, anormalidades del desarrollo, tales como displasia del desarrollo de las caderas (dislocación congénita de las caderas), discrepancias en la longitud de las extremidades, incluyendo artritis por traumatismo e inflamatoria, tal como gota, artritis séptica, artritis neuropática. La OA también puede desarrollarse tras una inestabilidad biomecánica prolongada, tal como la resultante de lesiones deportivas o de obesidad.

La artritis reumatoide (RA) es un trastorno autoinmunológico sistémico crónico caracterizado por la sinovitis simétrica de las articulaciones y típicamente afecta a articulaciones diartroides tanto pequeñas como grandes. A medida que la RA progresa, los síntomas pueden incluir fiebre, pérdida de peso, adelgazamiento de la piel, implicación multiorgánica, escleritis, úlceras corneales, formación de nódulos subcutáneos o subperiosteales e incluso la muerte prematura. Los síntomas de la RA con frecuencia aparecen durante la juventud y pueden incluir vasculitis, atrofia de piel y músculo, nódulos subcutáneos, linfadenopatía, esplenomegalia, leucopenia y anemia crónica.

Además, la expresión "trastorno cartilaginoso degenerativo" puede incluir el lupus sistémico eritematoso y la gota, la amiloidosis o síndrome de Felty. Además, la expresión cubre la degradación del cartílago y la destrucción asociada a artritis soriásica, osteoartrosis, inflamación aguada (por ejemplo artritis por Yersinia, artritis pirofosfato, artritis gotosa (artritis urica), artritis séptica), artritis asociada a traumatismo, colitis ulcerosa (por ejemplo la enfermedad de Cröhn), esclerosis múltiple, diabetes (insulino-dependiente y no insulino-dependiente), obesidad, artritis de células gigantes y síndrome de Sjögren.

Entre los ejemplos de otras enfermedades inmunológicas e inflamatorias, por lo menos algunas de las cuales resultan tratables mediante los procedimientos de la invención, se incluyen artritis crónica juvenil, espondiloartropatías, esclerosis sistémica (escleroderma), miopatías inflamatorias idiopáticas (dermatomiositis, polimiositis), síndrome de Sjögren, vasculitis sistémica, sarcoidosis, anemia hemolítica autoinmunológica (pancitopenia inmunológica, hemoglobinuria nocturna paroxística), trombocitopenia autoinmunológica (púrpura trombocitopénica idiopática, trombocitopenia mediada inmunológicamente), tiroiditis (enfermedad de Grave, tiroiditis de Hashimoto, tiroiditis linfocítica juvenil, tiroiditis atrófica), enfermedades inflamatorias autoinmunológicas (por ejemplo encefalomielitis alérgica, esclerosis múltiple, diabetes mellitus insulino-dependiente, uveoretinitis autoinmunológica, tirotoxicosis, escleroderma, lupus sistémica eritematoso, artritis reumatoide, enfermedad intestinal inflamatoria (por ejemplo la enfermedad de Crohn, colitis ulcerosos, enteritis regional, ileitis distal, enteritis granulomatosa, ileitis regional, ileitis terminal), enfermedad tiroidea autoinmunológica, anemia perniciosa y rechazo del aloinjerto, diabetes mellitus, enfermedad renal mediada inmunológica (glomerulonefritis, nefritis tubulointersticial), enfermedades desmielinizantes de los sistemas nerviosos central y periférico, tales como esclerosis múltiple, polineuropatía idiopática desmielinizante o síndrome de Guillain-Barré y polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, enfermedades hepatobiliares, tales como hepatitis infecciosa (hepatitis A, B, C, D, E y otros virus no hepatotrópicos), hepatitis activa crónica autoinmunológica, cirrosis biliar primaria, hepatitis granulomatosa y colangitis esclerosante, enfermedad intestinal inflamatoria (colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn), enteropatía sensible al gluten y enfermedad de Whipple, enfermedades de la piel autoinmunológicas y mediadas inmunológicamente, incluyendo enfermedades bullosas de la piel, eritema multiforme y dermatitis por contacto, soriasis, enfermedades alérgicas, tales como asma, rinitis alérgica, dermatitis atópica, hipersensibilidad alimentaria y urticaria, enfermedades inmunológicas de los pulmones, tales como neumonías eosinofílicas, fibrosis pulmonar idiopática y neumonitis por hipersensibilidad, incluyendo enfermedades víricas, tales como SIDA (infección por VIH), hepatitis A, B, C, D y E, herpes, etc., infecciones bacterianas, infecciones fúngicas, infecciones protozoáricas, infecciones parasitarias y por virus sincitial respiratorio, virus de inmunodeficiencia, etc.) y trastornos alérgicos, tales como hipersensibilidad por anafilaxis, asma, rinitis alérgica, dermatitis atópica, conjuntivitis vernal, eczema, urticaria y alergias alimentarias, etc.

El "tratamiento" es una intervención realizada con la intención de prevenir el desarrollo o la alteración de la patología de un trastorno. Por consiguiente, el término "tratamiento" se refiere tanto al tratamiento terapéutico como a las medidas profilácticas o preventivas, en las que el objetivo es prevenir o enlentecer (reducir) la condición o trastorno patológico tratado. Entre aquellos pacientes que requieren tratamiento se incluyen aquellos que ya presentan el trastorno, así como aquellos en los que debe prevenirse el trastorno. En el tratamiento de un trastorno cartilaginoso degenerativo, un agente terapéutico puede reducir o incrementar directamente la magnitud de la respuesta de un componente patológico del trastorno, o hacer que la enfermedad sea más susceptible al tratamiento con otros agentes terapéuticos, por ejemplo antibióticos, antifúngicos, agentes antiinflamatorios, quimioterapéuticos, etc.

La expresión "cantidad eficaz" es la concentración mínima de polipéptido WISP que causa, induce o resulta en una mejora o reparación detectable del cartílago dañado o una protección medible frente a la destrucción continua o inducida del cartílago en una muestra aislada de matriz de cartílago (por ejemplo la retención de los proteoglicanos en la matriz, la inhibición de la liberación de proteoglicanos de la matriz, la estimulación de la síntesis de proteoglicanos). Además, una "cantidad terapéuticamente eficaz" es la concentración (cantidad) mínima de polipéptido WISP administrada en un mamífero que resultaría eficaz para por lo menos atenuar un síntoma patológico (por ejemplo causar, inducir o resultar en una mejora o reparación detectable del cartílago articular dañado o causar, inducir o resultar en una protección medible frente a la destrucción continua o inicial de cartílago, la mejora en el intervalo de movimiento, la reducción del dolor, etc.) que se produce como resultado de la lesión o de un trastorno cartilaginoso degenerativo.

El "agente cartilaginoso" puede ser un factor de crecimiento, citoquina, molécula pequeña, anticuerpo, trozo de ARN o ADN, partícula vírica, péptido o compuesto químico que presenta un efecto beneficioso sobre el cartílago, incluyendo péptidos factores de crecimiento, antagonistas del catabolismo y factores osteoinflamatorios, sinovio-inflamatorios o antiinflamatorios. Alternativamente, el "agente cartilaginoso" puede ser un péptido factor de crecimiento, tal como cualquiera de entre los factores de crecimiento fibroblástico (por ejemplo FGF-1, FGF-2, ... FGF-21, etc.), IGFs (I y II), TGF-\betas (1-3), BMPs (1-7) o miembros de la familia de factores de crecimiento epidérmico, tales como EGF, HG-EGF, TGF-\beta, que incrementaría la respuesta reparativa intrínseca del cartílago, por ejemplo mediante la alteración de la proliferación, diferenciación, migración, adhesión o producción de matriz por parte de los condrocitos. Alternativamente, un "agente cartilaginoso" puede ser un factor que antagoniza el catabolismo del cartílago (por ejemplo el antagonista del receptor de IL-1 (IL-1ra), inhibidores del NO, inhibidores de la IL-1-beta convertasa (ICE), factores que inhiben la actividad de IL-6, IL-8, LIF, IFN-gamma o TNF-alfa, tetraciclinas y variantes de los mismos, inhibidores de la apoptosis, inhibidores de MMP, inhibidores de agrecanasa, inhibidores de serina proteinasas y cisteína proteinasas, tales como catepsinas y uroquinasa o activador del plasminógeno tisular (uPA y tPA). Alternativamente, el agente cartilaginoso incluye factores que actúan indirectamente sobre el cartílago afectando el hueso subyacente (es decir, osteofactores, por ejemplo bisfosfonatos u osteoprotegerina) o el sinovio circundante (es decir, factores sinoviales) o factores antiinflamatorios (por ejemplo anti-TNF-alfa (incluyendo anticuerpos anti-TNF-alfa, tales como Remicade®, así como inmunoadhesinas de receptor de TNF, tales como Enbrel®), IL-Ira, IL-4, IL-10, IL-13, NSAIDs). Para una revisión de ejemplos de agente cartilaginoso, ver Martel-Pelletier et al., Front. Biosci. 4:d694-703, 1999; Hering, T.M., Front. Biosci. 4:d743-761, 1999.

La administración "crónica" se refiere a la administración del factor o factores de modo continuo, al contrario que en un modo agudo, de manera que se mantiene el efecto (actividad) terapéutico inicial durante un periodo de tiempo prolongado.

La administración "intermitente" es el tratamiento que se realiza no consecutivamente sin interrupción, sino que es de naturaleza cíclica.

El término "mamífero" para los fines del tratamiento se refiere a cualquier animal clasificado como mamífero, incluyendo el ser humano, animales domésticos y de granja, y animales de zoológico, de competición o mascotas, tales como perros, caballos, gatos, vacas, cerdos, hámsters, etc. Preferentemente el mamífero es el ser humano.

La administración "combinada" con uno o más agentes terapéuticos adicionales incluye la administración simultánea (concurrente) y consecutiva en cualquier orden.

Entre los "portadores" tal como se utilizan en la presente invención se incluyen portadores, excipientes o estabilizantes farmacéuticamente aceptables que no resultan tóxicos para la célula o el mamífero expuesto a los mismos a las dosis y concentraciones utilizadas. Con frecuencia el portador fisiológicamente aceptable es una solución acuosa de pH tamponado. Entre los ejemplos de portadores fisiológicamente aceptables se incluyen tampones, tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes, incluyendo el ácido ascórbico; polipéptidos de peso molecular reducido (inferior a aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos, incluyendo glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes, tales como EDTA; alcoholes de azúcar, tales como manitol o sorbitol; contraiones formadores de sales, tales como sodio; y/o surfactantes no iónicos, tales como TWEEN®, polietilenglicol (PEG) y PLORONICS® y ácido hialurónico (HA).

II. Procedimientos y composiciones de la invención

De acuerdo con los procedimientos de la presente invención, pueden utilizarse diversos polipéptidos WISP para el tratamiento de trastornos cartilaginosos degenerativos, así como otras diversas condiciones inmunológicas y de tipo inmunológico. Entre dichos polipéptidos WISP se incluyen los polipéptidos a los que se hace referencia en la presente invención como WISP-2, y variantes de los mismos (así como proteínas de fusión de los mismos, tales como formas etiquetas con epítopo o constructos de fusión de Ig de los mismos). Los polipéptidos WISP pueden utilizarse in vivo como medicamentos, así como ex vivo. Opcionalmente los polipéptidos WISP se utilizan en la forma de composiciones farmacéuticas, descritas en más detalle posteriormente.

Entre los trastornos cartilaginosos degenerativos contemplados por la invención se incluyen la artritis reumatoide (RA). La RA es una enfermedad degenerativa autoinmunológica sistémica que puede causar roturas simétricas del sinovio de articulaciones diartroidales tanto grandes como pequeñas. A medida que progresa la enfermedad, los síntomas de la RA pueden incluir fiebre, pérdida de peso, adelgazamiento de la piel, implicación multiorgánica, escleritis, úlceras corneales, formación de nódulos subcutáneos o subperiosteales y muerte prematura. Los síntomas de la RA típicamente aparecen durante la juventud, las manifestaciones extraarticulares pueden afectar a cualquier sistema de órganos y la destrucción de la articulación es simétrica y se produce en articulaciones tanto grandes como pequeñas. Entre los síntomas extraarticulares se incluyen vasculitis, atrofia de piel y músculo, nódulos subcutáneos, linfadenopatía, esplenomegalia, leucopenia y anemia crónica. La RA tiende a ser de naturaleza heterogénea con una expresión variable de la enfermedad y se asocia a la formación de factor reumatoide sérico en 90% de los pacientes en algún momento del curso de la enfermedad. Los pacientes de RA típicamente también presentan un sistema inmunológico hiperactivo. La mayoría de personas con RA presentan una susceptibilidad genética asociada a la activación incrementada de las moléculas del complejo de histocompatibilidad mayor de clase II en monocitos y macrófagos. Estas moléculas de complejo de histocompatibilidad se encuentran implicadas en la presentación de antígeno a células T activadas que portan receptores de estas moléculas de clase II. La predisposición genética a la RA se basa en la prevalencia del antígeno leucocitario altamente conservado DR subtipos Dw4, Dw14 y Dw15 en pacientes humanos con enfermedad muy severa.

La osteoartritis (OA) es otro trastorno cartilaginoso degenerativo que implica una enfermedad localizada que afecta el cartílago articular y el hueso y resulta en dolor y función articular disminuida. La OA puede clasificarse en dos tipos: primaria y secundaria. La OA primaria se refiere al espectro de enfermedades articulares degenerativas para las que no se ha determinado ninguna etiología subyacente. Típicamente la articulación afectada por la OA primaria son las articulaciones interfalángicas de las manos, las primeras articulaciones carpometacarpales, las caderas, las rodillas, la columna vertebral y algunas articulaciones en la parte media del piel. Las articulaciones grandes, tales como tobillos, codos y hombros tienden a no resultar afectadas en la OA primaria. Por el contrario, la OA secundaria con frecuencia se produce como resultado de una lesión o traumatismo definido. La artritis secundaria también puede observarse en individuos con enfermedades metabólicas, tales como hemacromatosis y alcaptonuria, anormalidades del desarrollo, tales como displasia del desarrollo de las caderas (dislocación congénita de la caderas) y discrepancias en la longitud de las extremidades, obesidad, artritis inflamatorias, tales como artritis reumatoide o gota, artritis séptica y artritis neuropática.

La degradación asociada a la OA presenta una apariencia inicial de deshilachamiento y fibrilación de la superficie del cartílago articular a medida que se pierden los proteoglicanos de la matriz. Con el uso continuo de la articulación, progresa la fibrilación de la superficie, los defectos penetran más profundamente en el cartílago y se pierden fragmentos de tejido cartilaginoso. Además, el hueso subyacente al cartílago (hueso subcondral) se engrosa y, a medida que se pierde cartílago, el hueso progresiva y lentamente se encuentra más expuesto. Con la destrucción asimétrica del cartílago, pueden producirse desfiguraciones. Los nódulos óseos, denominados osteofitos, con frecuencia se forman en la periferia de la superficie del cartílago y ocasionalmente crecen sobre las áreas erosionadas contiguas. Si la superficie de estas excrecencias óseas se encuentra permeada, puede producirse el crecimiento vascular hacia fuera y provocar la formación de tapones de tejido que contienen fibrocartílago.

Debido a que el cartílago es avascular, la lesión producida en la capa de cartílago pero que no penetra en el hueso subcondral deja el trabajo de reparación a los condrocitos residentes, que presentan poco potencial intrínseco para la replicación. Sin embargo, cuando penetra en el hueso subcondral, el suministro vascular del mismo permite que tenga lugar un proceso trifásico de reparación. El cartílago subóptimo que se sintetiza en respuesta a este tipo de lesión, denominado en la presente invención "fibrocartílago" debido a la matriz fibrosa del mismo, presenta propiedades bioquímicas y mecánicas subóptimas, y de esta manera se ve sometido a desgaste y destrucción adicionales. En una articulación enferma o dañada, la liberación incrementada de metaloproteinasas (MMPs), tales como colagenasas, gelatinasas, estromelisinas, agrecanasas y otras proteasas, conduce al adelgazamiento y pérdida adicionales del cartílago. Los estudios in vitro han demostrado que las citoquinas, tales como IL-Ialfa, IL-1beta, TNF-alfa, PDGF, GM-CSF, IFN-gamma, TGF-beta, LIF, IL-2 e IL-6, IL-8 puede alterar la actividad de las células sinoviales similares a fibroblastos, macrófagos, células T y/o osteoclastos, sugiriendo que estas citoquinas pueden regular la renovación de la matriz de cartílago in vivo.

Las propiedades mecánicas del cartílago se encuentran determinadas por la composición bioquímica del mismo. Aunque la arquitectura del colágeno contribuye a la resistencia ténsil y rigidez del cartílago, la compresibilidad (o elasticidad) se debe al componente proteoglicano del mismo. En el cartílago articular sano, el colágeno de tipo II predomina (comprendiendo aproximadamente 90% a 95%), sin embargo, también se encuentran presentes cantidades más pequeñas de colágeno de tipos V, VI, IX y XI. Entre los proteoglicanos (PG) de cartílago se incluyen PG agregantes hidrodinámicamente grandes con glucosaminoglicanos sulfatados unidos covalentemente, así como PG no agregante hidrodinámicamente de menor tamaño, tal como decorina, biglicano y lumicano.

Las lesiones del cartílago pueden clasificarse en tres categorías: (1) microlesiones o traumatismo contundente, (2) fracturas condrales y (3) fracturas osteocondrales.

Las microlesiones en los condrocitos y en la matriz del cartílago puede estar causada por un solo impacto, por traumatismo contundente repetido o por la utilización continua de una articulación biomecánicamente inestable. Los cambios metabólicos y bioquímicos, tales como aquellos observados en las etapas tempranas de la artritis degenerativa pueden replicarse en modelos animales que implican la carga repetitiva del cartílago articular (Radin et al., Clin. Orthop. Relat. Res. 131:288-93, 1978). Estos experimentos, junto con el patrón diferenciado de pérdida de cartílago observado en las articulaciones artríticas, subraya el papel que desempeña la carga biomecánica en la pérdida de homeostasis y la integridad del cartílago articular en la enfermedad (Radin et al., J. Orthop. Res. 2:221-234, 1984; Radin et al., Semin Arthritis Rheum. (suppl. 2)21:12-21, 1991; Wei et al., Acta Orthop. Scand. 69:351-357, 1998. Aunque los condrocitos inicialmente pueden ser capaces de reabastecer la matriz de cartílago con proteoglicanos a una tasa basal, el daño concurrente a la red de colágeno puede incrementar la tasa de pérdida y resultar en la degeneración irreversible (Buckwalter et al., J. Am. Acad. Orthop. Surg. 2:192-201, 1994).

Las fracturas condrales se caracterizan por la rotura de la superficie articular sin violación de la placa subcondral. Se produce la necrosis de los condrocitos en el sitio de la lesión, seguido del incremento de la actividad mitótica y metabólica de los condrocitos supervivientes en los límites de la lesión, que conduce al revestimiento de las grietas de la superficie articular con tejido fibroso. El incremento de la actividad de los condrocitos es transitorio, y la respuesta de reparación resulta en una cantidad y calidad insuficientes de nuevos componentes de la matriz.

Las fracturas osteocondrales, el más grave de los tres tipos de daño existentes, son lesiones que cruzan el límite de la placa subcondral subyacente. En este tipo de lesión, la presencia de vasculatura subcondral induce la respuesta de tres fases observada típicamente en tejidos vasculares: (1) necrosis, (2) inflamación, y (3) reparación. Inicialmente la lesión se rellena con sangre y coágulos. El coágulo de fibrina resultante activa una respuesta inflamatoria y se convierte en tejido de reparación vascularizado, y los diversos componentes celulares liberan factores de crecimiento y citoquinas, incluyendo factor beta de crecimiento transformante (TGF-beta), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), proteínas morfogénicas óseas y factores de crecimiento similares a insulina I y II (Buckwalter et al., J. Am. Acad. Orthop. Surg. 2:191-201, 1994).

La respuesta de reparación inicial asociada a las fracturas osteocondrales se caracteriza por el reclutamiento, proliferación y diferenciación de precursores en condrocitos. Se depositan células madre mesenquimales en la red de fibrina, que finalmente se convierte en una zona fibrocartilaginosa (F. Shapiro et al., J. Bone Joint Surg. 75:532-53, 1993; N. Mitchell y N. Shepard, J. Bone Joint Surg. 58:230-33, 1976). Estas células madre, que se cree proceden de la médula ósea subyacente y no de la superficie articular contigua, se diferencian progresivamente en condrocitos. A las seis a ocho semanas de la lesión, el tejido de reparación contiene células similares a condrocitos en una matriz de proteoglicanos y colágeno predominantemente de tipo II, con algo de colágeno de tipo I (T. Furukawa et al., J. Bone Joint Surg. 62:79-89, 1980; J. Cheung et al., Arthritis Rheum. 23:211-19, 1980; S.O. Hjertquist y R. Lemperg, Calc. Tissue Res. 8:54-72, 1971). Sin embargo, esta matriz recién depositada degenera, y el tejido condroide es sustituido por tejido más fibroso y fibrocartílago y un desplazamiento en la síntesis de colágeno de tipo II a tipo I (H.S. Cheung et al., J. Bone Joint Surg. 60:1076-81, 1978; D. Hamerman, "Prospects for medical intervention in cartilage repair", Joint cartilage degradation: Basic and clinical aspects, editores Woessner JF et al., 1993; Shapiro et al., J. Bone Joint Surg. 75:532-53, 1993; N. Mitchell y N. Shepard, J. Bone Joint Surg. 58:230-33, 1976; S.O. Hjertquist y R. Lemperg, Calc. Tissue Res. 8:54-72, 1971). Entre los cambios degenerativos tempranos se incluyen la fibrilación superficial, el agotamiento de los proteoglicanos, la clonación y muerte de condrocitos y la fisuración vertical de capas superficiales hacia capas profundas. Un año tras la lesión, el tejido de reparación es una mezcla de fibrocartílago y cartílago hialino, con una cantidad sustancial de colágeno de tipo I, que no se encuentra en cantidades apreciables en cartílago articular normal (T. Furukawa et al., J. Bone Joint Surg. 62:79-89, 1980).

Aunque la inflamación aparentemente no es el suceso iniciador en la osteoartritis, sí se produce inflamación en las articulaciones osteoartríticas. Las células inflamatorias (es decir, monocitos, macrófagos y neutrófilos) que invaden el revestimiento sinovial tras la lesión y durante la inflamación producen metaloproteinasas, así como citoquinas catabólicas que pueden contribuir a la liberación adicional de enzimas degradativos. Aunque la inflamación y destrucción articular no muestran una correlación perfecta en todos los modelos animales de artritis, agentes como IL-4, IL-10 e IL-13 que inhiben la inflamación también reducen la patología de cartílago y hueso en animales artríticos (revisado en Martel-Pelletier, J. Et al., Front. Biosci. 4:d694-703). La aplicación de agentes que inhiben las citoquinas inflamatorias pueden enlentecer la progresión de la OA contrarrestando la sinovitis local que se produce en los pacientes de OA.

La OA implica no sólo la degeneración del cartílago articular, conduciendo a la condensación ósea, sino también al remodelado extensivo del hueso subcondral, resultando en la denominada esclerosis de este tejido. Estos cambios óseos con frecuencia se ven acompañados por la formación de quistes subcondrales como resultado de la resorción focal. Algunos agentes que inhiben la resorción ósea, es decir la osteoprotegerina o los bisfosfonatos, han ofrecido resultados prometedores en modelos animales de artritis (Kong et al., Nature 402:304-308, 1999).

En el lupus sistémico eritematoso, el mediador central de la enfermedad es la producción de anticuerpos autoreactivos contra autoproteínas/tejidos y la producción posterior de inflamación mediada inmunológicamente. Estos anticuerpos median directa o indirectamente en el daño a los tejidos. Aunque no se ha demostrado que los linfocitos T se encuentren directamente implicados en el daño a los tejidos, los linfocitos T resultan necesarios para el desarrollo de anticuerpo autoreactivos. La génesis de la enfermedad es, de esta manera, dependiente de los linfocitos T. Resultan afectados clínicamente múltiples órganos y sistemas, incluyendo riñón, pulmón, sistema musculoesquelético, sistema mucocutáneo, ojo, sistema nervioso central, sistema cardiovascular, tracto gastrointestinal, médula ósea y sangre.

La artritis crónica juvenil es una enfermedad inflamatoria idiopática crónica que con frecuencia se inicia antes de los 16 años de edad y que presenta algunas similitudes con la RA. Algunos pacientes que son positivos para el factor reumatoide se clasifican como de artritis reumatoide juvenil. La enfermedad se subclasifica en tres categorías principales: pauciarticular, poliarticular y sistémica. La artritis puede ser severa y conduce a la anquilosis de las articulaciones y el retraso del crecimiento. Entre otras manifestaciones se incluyen la uveitis anterior crónica y la amiloidosis sistémica.

Las espondiloartropatías son un grupo de trastornos con algunas características clínicas comunes y la asociación común con la expresión del producto génico HLA-B27. Entre los trastornos se incluyen: espondilitis anquilosante, síndrome de Reiter (artritis reactiva), artritis asociada a la enfermedad intestinal inflamatoria, espondilitis asociada a soriasis, espondiloartropatía de aparición juvenil y espondiloartropatía no diferenciada. Entre las características diferenciadoras se incluyen sacroileitis con o sin espondilitis, artritis asimétrica inflamatoria, asociación con HLA-B27 (un alelo definido serológicamente del locus HLA-B del MHC de clase I), inflamación ocular y ausencia de autoanticuerpos asociados con otra enfermedad reumatoide. La célula más implicada como clave para la inducción de la enfermedad es el linfocito T CD8+, una célula con diana el antígeno presentado por las moléculas del MHC de clase I. Las células T CD8+ pueden reaccionar contra el alelo HLA-B27 del MHC de clase I como si fuera un péptido foráneo expresado por las moléculas del MHC de clase I. Las células T CD8+ pueden reaccionar contra el alelo HLA-B27 del MHC de clase I como si fuera un péptido foráneo expresado por moléculas del MHC de clase I. Se ha planteado la hipótesis de que un epítopo de HLA-B27 podría imitar un epítopo antigénico bacteriano o microbiano e inducir de esta manera una respuesta de células T CD8+.

Los polipéptidos WISP utilizados en la invención pueden prepararse mediante cualquier procedimiento adecuado, incluyendo técnicas de expresión recombinante. La tecnología de expresión recombinante es bien conocida por el experto en la materia, y se describen materiales y métodos opcionales en la solicitud de patente PCT nº WO99/21998. Opcionalmente los polipéptidos WISP se expresan utilizando células huésped como células CHO, células de E. coli o células de levadura. Los polipéptidos WISP pueden comprender polipéptidos de longitud completa (definidos en la presente invención) o formas variantes de los mismos, así como otras formas modificadas de los polipéptidos WISP (tal como mediante fusión o unión a una inmunoglobulina, etiqueta epítopo, cremallera de leucina u otro polímero no proteico).

Las moléculas de inmunoadhesina se encuentran contempladas para la utilización en los procedimientos de la presente invención. Las inmunoadhesinas WISP pueden comprender diversas formas de WISP, tal como el polipéptido de longitud completa, así como formas variantes o fragmentarias del mismo. En una realización, la molécula puede comprender una fusión de WISP con una inmunoglobulina o una región particular de una inmunoglobulina. Para una forma bivalente de la inmunoadhesina, dicha fusión podría ser a la región Fc de una molécula de IgG. Para la producción de fusiones de inmunoglobulina, ver también la patente US nº 5.428.130, publicada el 27 de junio de 1995, y Chamow et al., TIBTECH 14:52-60, 1996.

En otra realización, el polipéptido WISP puede modificarse covalentemente mediante la unión del polipéptido a uno de entre una diversidad de polímeros no proteicos, por ejemplo polietilenglicol (PEG), polipropilenglicol o polioxialquilenos, de la manera descrita en las patentes US nº 4.640.835, nº 4.496.689, nº 4.301.144, nº 4.670.417, nº 4.791.192 o nº 4.179.337. Estas formas pegiladas del polipéptido WISP pueden prepararse utilizando técnicas conocidas de la técnica.

Las formas de cremallera de leucina de estas moléculas también se encuentran contempladas por la invención. La expresión "cremallera de leucina" es una expresión de la técnica utilizada para referirse a una secuencia rica en leucinas que intensifica, estimula o regula la dimerización o trimerización de la pareja de fusión de la misma (por ejemplo la secuencia o molécula a la que se fusiona o une la cremallera de leucina). Se han descrito en la técnica diversos polipéptidos cremallera de leucina. Ver, por ejemplo, Landschulz et al., Science 240:1759, 1988; patente nº US 5.716.805, patente nº WO 94/10308; Hoppe et al., FEBS Letters 344:1991, 1994; Maniatis et al., Nature 341:24, 1989. Los expertos en la materia apreciarán que una secuencia de cremallera de leucina puede fusionarse en el extremo 5' o 3' del polipéptido WISP.

Los polipéptidos WISP de la presente invención también pueden modificarse de manera que formen moléculas quiméricas mediante la fusión del polipéptido receptor a otro polipéptido o secuencia de aminoácidos heterólogo. Preferentemente dicho polipéptido heterólogo o secuencia de aminoácidos heteróloga es una que actúa oligomerizando la molécula quimérica. En una realización, dicha molécula quimérica comprende una fusión del polipéptido WISP con un polipéptido etiqueta que proporciona un epítopo al que puede unirse selectivamente un anticuerpo anti-etiqueta. La etiqueta epítopo generalmente se sitúa en el extremo amino-terminal o carboxi-terminal del polipéptido. La presencia de dichas formas etiquetadas con epítopo del polipéptido WISP puede detectarse utilizando un anticuerpo contra el polipéptido de etiqueta. Además, la provisión de la etiqueta epítopo permite que el polipéptido WISP se purifique fácilmente mediante purificación por afinidad utilizando un anticuerpo anti-etiqueta u otro tipo de matriz de afinidad que se una a la etiqueta epítopo. Son conocidos de la técnica diversos polipéptidos etiqueta y sus anticuerpos respectivos. Entre los ejemplos se incluyen etiquetas polihistidina (poli-his) o poli-histidina-glicina (poli-his-gly); el polipéptido etiqueta HA de la gripe y su anticuerpo 12CA5 [Field et al., Mol. Cell. Biol. 8:2159-2165, 1988], la etiqueta c-myc y los anticuerpos del mismo 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 y 9E10 [Evan et al., Molecular and Cellular Biology 5:3610-3616, 1985] y la etiqueta glucoproteína D (gD) del virus herpes simplex y su anticuerpo [Paborsky et al., Protein Engineering 3(6):547-553, 1990]. Entre otros polipéptidos etiqueta se incluyen el péptido Flag [Hopp et al., BioTechnology 6:1204-1210, 1988] , el péptido epítopo KT3 [Martin et al., Science 255:192-194, 1992], un péptido epítopo \alpha-tubulina [Skinner et al., J. Biol. Chem. 266:15163-15166, 1991] y la etiqueta péptido de la proteína del gen 10 de T7 [Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6393-6397, 1990].

Pueden prepararse formulaciones de polipéptidos WISP utilizables con la invención mediante la mezcla del polipéptido WISP con el grado de pureza deseado con portadores, excipientes o estabilizantes farmacéuticamente aceptables opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edición, Osol, A., editor, 1980]. Estas formulaciones terapéuticas pueden encontrarse en forma de formulaciones liofilizadas o de soluciones acuosas. Los portadores, excipientes o estabilizantes aceptables no son tóxicos para los receptores a las dosis y concentraciones utilizadas, e incluyen tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes, incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencil amonio, cloruro de hexametonio, cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, fenol, alcohol butílico o bencílico; alquil parabenes, tales como metilparabén o propilparabén; catecol, resorcinol, ciclohexano, 3-pentanol y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (inferior a aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos, incluyendo glucosa, manosa, dextrinas o hialuronano; agentes quelantes, tales como EDTA; azúcares, tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales, tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo complejos de Zn-proteína), y/o surfactantes no iónicos, tales como TWEEN®, PLURONICS® o polietilenglicol (PEG).

Los polipéptidos WISP también pueden prepararse mediante encapsulamiento en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo microcápsulas de hidroximetilcelulosa o de gelatina y microcápsulas e poli-(metilmetacrilato), respectivamente. Dichas preparaciones pueden administrarse en sistemas de administración de fármaco coloidal (por ejemplo liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Dichas técnicas se dan a conocer en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edición (o más reciente), Osol A., editor, 1980.

En el caso de que se desee la administración de liberación sostenida o prolongada de los polipéptidos WISP en una formulación con características de liberación adecuadas para el tratamiento de cualquier enfermedad o trastorno que requiera la administración de dichos polipéptidos, se encuentra contemplado el microencapsulamiento. El microencapsulamiento de proteínas recombinantes para la liberación sostenida ha sido llevado a cabo con éxito. Ver, por ejemplo, Johnson et al., Nat. Med. 2:795-799, 1996; Yasuda, Biomed. Ther. 27:1221-1223, 1993; Hora et al., Bio/Technology 8:755-758, 1990; Cleland, "Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems", en: Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell y Newman, editores (Plenum Press: New York, 1995), páginas 439-462; patentes WO nº 97/03692, nº 96/40072, nº 96/07399 y patente US nº 5.654.010.

Entre los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida se incluyen las matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen la molécula activa; matrices que se encuentran en la forma de artículos conformados, por ejemplo películas o microcápsulas. Entre los ejemplos de matrices de liberación sostenida se incluyen uno o más polianhídridos (por ejemplo las patentes US nº 4.891.225, nº 4.767.628), poliésteres, tales como poliglicólidos, poliláctidos y poliláctido-co-glicólidos (por ejemplo las patentes US nº 3.773.919, nº 4.767.628 y nº 4.530.840; Kulkarni et al., Arch. Surg. 93:839, 1966), poliaminoácidos, tales como polilisina, polímeros y copolímeros de óxido de polietileno, acrilatos de óxido de polietileno, poliacrilatos, acetatos de etilén-vinilo, poliamidas, poliuretanos, poliortoésteres, poliacetilnitrilos, polifosfacenos e hidrogeles de poliéster (por ejemplo poli(2-hidroxietil-metacrilato) o poli(alcohol vinílico), celulosa, acetatos de celulosa acil-sustituidos, poliuretanos no degradables, poliestirenos, cloruro de polivinilo, fluoruro de polivinilo, poli(vinilimidazol), poliolefinas clorosulfonadas, óxido de polietileno, copolímeros de ácido L-glutámico y gamma-etil-L-glutamato, acetato de etilenvinilo no degradable, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico, tales como LUPRON DEPOT® (microesferas inyectables compuestas de copolímero ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprólido) y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Aunque algunos polímeros, tales como acetato de etilenvinilo y ácido láctico-ácido glicólico, permiten la liberación de moléculas durante más de 100 días, determinados hidrogeles liberan proteínas durante periodos de tiempo más cortos. Son polímeros no biodegradables adicionales que pueden utilizarse: polietileno, polivinilpirrolidona, acetato de etilenvinilo, polietilenglicol, butirato-acetato de celulosa y propionato-acetato de celulosa.

Alternativamente, formulaciones de liberación sostenida pueden estar compuestas de materiales biológicos degradables. Los polímeros biodegradables son formulaciones de fármaco atractivas debido a su biocompatibilidad, elevada respuesta a la degradación específica y facilidad para incorporar el fármaco activo en la matriz biológica. Por ejemplo, el ácido hialurónico (HA) puede reticularse y utilizarse como vehículo de administración polimérico hinchable para materiales biológicos (patente US nº 4.957.744; Valle et al., Polym. Mater. Sci. Eng. 62:731-735, 1991). También se ha preparado polímero de HA injertado con polietilenglicol como matriz mejorada de administración que reduce tanto la fuga no deseada de fármaco como la desnaturalización asociada con el almacenamiento de largo plazo en condiciones fisiológicas (Kazuteru, M., J. Controlled Release 59:77-86, 1999). Son polímeros biodegradables adicionales que pueden utilizarse: poli(caprolactona), polianhídridos, poliaminoácidos, poliortoésteres, policianoacrilatos, poli(fosfazinas), poli(fosfodiésteres), poliesteramidas, polidioxanonas, poliacetales, policetales, policarbonatos, poliortocarbonatos, poliuretanos degradables y no tóxicos, polihidroxilbutiratos, polihidroxivaleratos, polialquilenoxalatos, polialquilensuccinatos, poli(ácido málico), quitina y quitosano.

Alternativamente, pueden utilizarse hidrogeles biodegradables como vehículos de administración de liberación controlada para materiales biológicos y fármacos. Mediante la elección apropiada de macrómeros, pueden producirse membranas con un abanico de permeabilidades, tamaños de poro y tasas de degradación adecuados para una amplia diversidad de biomoléculas.

Alternativamente, los sistemas de administración de liberación sostenida para materiales biológicos y fármacos pueden estar compuestos de dispersiones. Las dispersiones pueden clasificarse adicionalmente como suspensiones o emulsiones. En el contexto de los vehículos de administración para materiales biológicos, las suspensiones son una mezcla de partículas sólidas de tamaño muy reducido que se dispersan (más o menos uniformemente) en un medio líquido. Las partículas sólidas de una suspensión pueden presenta un tamaño comprendido entre unos cuantos nanómetros y cientos de micrómetros, y entre ellas se incluyen microesferas, microcápsulas y nanoesferas. Por otra parte, las emulsiones son una mezcla de dos o más líquidos inmiscibles que se mantienen en suspensión gracias a una cantidad reducida de emulsionante. Los emulsionantes forman una película interfacial entre los líquidos inmiscibles y también se conocen como surfactantes o detergentes. Las formulaciones en emulsión pueden ser tanto de aceite en agua (o/w), en las que el agua se encuentra en una fase continua mientras que el aceite o la grasa se encuentra en dispersión, como de agua en aceite (w/o), en las que el aceite se encuentra en una fase continua mientras que el agua se encuentra en dispersión. Se da a conocer un ejemplo de una formulación de liberación sostenida adecuada en la patente WO nº 97/25563. Además, las emulsiones para la utilización con materiales biológicos incluyen múltiples emulsiones, microemulsiones, microgotas y liposomas. Las microgotas son vesículas fosfolipídicas unilamelares que consisten de una capa esférica de lípido con una fase aceite en el interior, por ejemplo las patentes US nº 4.622.219 y nº 4.725.442. Los liposomas son vesículas fosfolipídicas preparadas mediante la mezcla de lípidos polares insolubles en agua y una solución acuosa.

Alternativamente, las formulaciones de liberación sostenida de polipéptidos WISP pueden desarrollarse utilizando ácido poli-láctico-co-glicólico (PLGA), un polímero que muestra un fuerte grado de biocompatibilidad y un amplio rango de propiedades biodegradables. Los productos de degradación del PLGA, los ácidos láctico y glicólico, resultan rápidamente eliminados del cuerpo humano. Además, la degradabilidad de este polímero puede ajustarse de meses a años dependiendo de su peso molecular y composición. Para más información ver Lewis, "Controlled Release of Bioactive Agentes from Lactide/Glycolide polymer", en: Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems, M. Chasin y R. Langeer, editores (Marcel Dekker: New York, 1990), páginas 1 a 41.

Los polipéptidos encapsulados o los polipéptidos en formulación de liberación prolongada pueden administrarse formulando el polipéptido con "sales metálicas polivalentes solubles en agua" que sean no tóxicas a la concentración y temperatura de liberación. Entre los "metales polivalentes" ejemplares se incluyen los cationes siguientes: Ca^{2+}, Mg^{2+}, Zn^{2+}, Fe^{2+}, Fe^{3+}, Cu^{2+}, Sn^{2+}, Sn^{4+}, Al^{2+} y Al^{3+}. Entre los aniones ejemplares que forman sales solubles en agua con los cationes metálicos polivalentes anteriores se incluyen aquellos formados por ácidos inorgánicos y/o ácidos orgánicos. Estas sales solubles en agua presentan solubilidad en agua (a 20ºC) de por lo menos aproximadamente 20 mg/ml, alternativamente 100 mg/ml, alternativamente 200 mg/ml.

Entre los ácidos inorgánicos adecuados que pueden utilizarse para formar las "sales metálicas polivalentes solubles en agua" se incluyen los ácidos hidroclórico, sulfúrico, nítrico, tiociánico y fosfórico. Entre los ácidos orgánicos adecuados que pueden utilizarse se incluyen los ácidos carboxílicos alifáticos y los ácidos aromáticos (por ejemplo los ácidos monocarboxílicos, dicarboxílicos y tricarboxílicos alifáticos). Entre las sales metálicas polivalentes solubles en agua utilizadas comúnmente que pueden utilizarse para ayudar a estabilizar los polipéptidos encapsulados de la presente invención se incluyen, por ejemplo: (1) las sales metálicas de ácido inorgánico de haluros (por ejemplo cloruro de zinc, cloruro de calcio), sulfatos, nitratos, fosfatos y tiocianatos, (2) las sales metálicas de ácido carboxílico alifático: acetato de calcio, acetato de zinc, propionato de calcio, glicolato de zinc, lactato de calcio, lactato de zinc y tartrato de zinc, y (3) las sales metálicas de ácido carboxílico aromáticas de benzoato (por ejemplo benzoato de zinc) y los salicilatos.

Para que las formulaciones puedan utilizarse para la administración in vivo, deben ser estériles. La formulación puede esterilizarse fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estériles, antes o después de la liofilización y reconstitución. Las composiciones terapéuticas de la presente invención generalmente se introducen en un recipiente que presente una abertura de acceso estéril, por ejemplo una bolsa o vial de solución intravenosa que presente un tapón perforable con una aguja de inyección hipodérmica.

Para el tratamiento del mamífero in vivo, la vía de administración corresponde a procedimientos conocidos, por ejemplo la inyección o infusión por vías intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intraarterial, intralesional o intraarticular, la administración tópica, o mediante un medio de liberación sostenida o de liberación prolongada. Opcionalmente el compuesto activo o formulación se inyecta directamente o localmente en la región cartilaginosa o articulación afectada. El tratamiento contemplado por la invención también puede adoptar la forma de terapia
génica.

Las dosis y concentraciones de fármaco deseadas de las composiciones farmacéuticas utilizables con la presente invención pueden variar dependiendo del uso particular contemplado. La determinación de la dosis o vía de administración apropiados se encuentra bien comprendido dentro de los conocimientos del médico ordinario. Los experimentos animales pueden proporcionar directrices fiables para la determinación de las dosis eficaces para la terapia en el ser humano. El escalado entre especies de las dosis eficaces puede llevarse a cabo siguiendo los principios establecidos por Mordenti, J. y Chappell, W., "The use of interspecies scaling in toxicokinetics", en: Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi et al., editores, Pergamon Press, New York, 1989, páginas 42 a 96.

En el caso de que se utilice la administración in vivo de polipéptidos WISP, las cantidades de dosis normales pueden encontrarse comprendidas entre aproximadamente 10 ng/kg y 100 mg/kg de peso corporal de mamífero o más al día, preferentemente entre aproximadamente 1 \mug/kg/día y 10 mg/kg/día, dependiendo de la vía de administración. Las directrices sobre las dosis y procedimientos de administración particulares se proporcionan en la literatura; ver, por ejemplo, las patentes US nº 4.657.760, nº 5.206.344 o nº 5.225.212. Se prevé que diferentes formulaciones resultarán eficaces para diferentes tratamientos y diferentes trastornos, y que la administración destinada al tratamiento de un órgano o tejido específico podría requerir la administración de una manera diferente que en otro órgano o tejido.

Las formulaciones utilizadas en la presente invención también pueden contener más de un compuesto activo según resulte necesario para la indicación particular bajo tratamiento, preferentemente aquéllas con actividades complementarias que no presenten efectos negativos mutuos. El polipéptido WISP puede administrarse en combinación con un agente citotóxico, citoquina o agente inhibidor del crecimiento. Dichas moléculas se encuentran presentes en combinaciones y cantidades que resultan eficaces para el propósito pretendido. Puede resultar deseable administrar también anticuerpos contra otras enfermedades inmunológicas asociadas o contra antígenos asociados a tumores, tales como anticuerpos que se unen a CD20, CD11a, CD40, CD18, ErbB2, EGFR, ErbB3, ErbB4 o factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF). Alternativamente, o adicionalmente, pueden coadministrarse en el paciente dos o más anticuerpos que se unen al mismo antígeno o a dos o más antígenos diferentes dados a conocer en la presente invención. En ocasiones puede resultar beneficioso administrar también una o más citoquinas en el paciente. En una realización, los polipéptidos de la invención se coadministran con un agente inhibidor del crecimiento. Por ejemplo, el factor inhibidor del crecimiento puede administrarse en primer lugar, seguido de un polipéptido WISP de la invención. Pueden administrarse todavía otros agentes en combinación con el polipéptido WISP, por ejemplo agentes tales como decorina o biglicano. También se contempla la administración simultánea o la administración secuencial.

El presente procedimiento también puede administrarse en combinación con cualquier técnica quirúrgica de cartílago estándar. Las técnicas quirúrgicas estándar son procedimientos quirúrgicos que se utilizan comúnmente para manipulaciones terapéuticas del cartílago, incluyendo el afeitado del cartílago, la condroplastia de abrasión, la reparación con láser, desbridamiento, condroplastia, microfractura con o sin penetración del hueso subcondral, mosaicoplastia, aloinjertos celulares de cartílago, autoinjertos de células madre, injertos de cartílago costal, estimulación química, estimulación eléctrica, autoinjertos pericondrales, autoinjertos periosteales, andamiajes del cartílago, autoinjertos o aloinjertos de la cápsula (osteoarticular) u osteotomía. Estas técnicas se describen y se comentan en más detalle en Frenkel et al., Front. Bioscience 4:d671-685, 1999.

En una realización preferente, los polipéptidos WISP se utilizan en combinación con cirugía de microfracturas. Las técnicas de cirugía de microfracturas son conocidas de la técnica y generalmente implican el fresado quirúrgico hasta la cavidad de la médula ósea en el mamífero. A continuación se forman coágulos de fibrina, rellenando el defecto en el cuerpo del mamífero. Posteriormente se forma fibrocartílago.

Se contempla que los polipéptidos WISP se utilicen para tratar cartílago o células condrocitas ex vivo. Este tratamiento ex vivo puede resultar útil en trasplantes y particularmente en el trasplante autólogo. Por ejemplo, el tratamiento de células o uno o más tejidos que contienen dicho cartílago o células condrocitas con polipéptido WISP, y opcionalmente con una o más otras terapias, tal como se ha descrito anteriormente, puede utilizarse para regenerar tejido de cartílago o inducir la diferenciación de células condrocitas precursoras antes del trasplante en un mamífero receptor.

Las células, tejido o tejidos que contienen cartílago o células condrocitas en primer lugar se obtienen a partir de un mamífero donante. Las células, tejido o tejidos pueden obtenerse quirúrgicamente y preferentemente se obtienen de manera aséptica. Las células, tejido o tejidos seguidamente se tratan con polipéptido WISP y opcionalmente con una o más otras terapias, tal como se ha descrito anteriormente.

Las células, tejido o tejidos tratados seguidamente pueden infusionarse o trasplantarse en un mamífero receptor. El mamífero receptor puede ser el mismo individuo que el mamífero donante o puede ser un mamífero diferente, heterólogo.

Puede realizarse con facilidad el seguimiento del progreso o de la eficacia de las terapias descritas en la presente invención utilizando técnicas convencionales y ensayos conocidos por el experto en la materia.

La actividad o efectos de los polipéptidos WISP indicados en la presente invención sobre el cartílago o los condrocitos puede determinarse sin necesidad de experimentación excesiva utilizando diversos ensayos in vitro o in vivo. A título de ejemplo, a continuación se describen algunos de dichos ensayos.

En un ensayo, puede someterse a ensayo el potencial sintético y profiláctico de los polipéptidos WISP sobre el cartílago intacto. Con este fin, se miden la síntesis y degradación de proteoglicano (PG) y la liberación de óxido nítrico en explantes de cartílago articular tratado. Los proteoglicanos son el segundo mayor componente de material orgánico en el cartílago articular (Kuettner, K.E. et al., Articular Cartilage Biochemistry, Raven Press, New York, USA, 1986, página 456; Muir, H., Biochem. Soc. Tran. 11:613-622, 1983; Hardingham, T.E., Biochem. Soc. Trans. 9:489-497, 1981. Debido a que los proteoglicanos ayudan a determinar las propiedades físicas y químicas del cartílago, la reducción de los PGs del cartílago que se produce durante la degeneración de la articulación conduce a la pérdida de rigidez compresiva y de elasticidad, un incremento de la permeabilidad hidráulica, un contenido de agua incrementado (hinchado) y cambios en la organización de los demás componentes extracelulares, tales como los colágenos. De esta manera, la pérdida de PG es una etapa temprana en la progresión de los trastornos cartilaginosos degenerativos, una que perturba adicionalmente la estabilidad biomecánica y bioquímica de la articulación. Los PGs en el cartílago articular han sido extensivamente estudiados debido a su probable papel en el crecimiento y la enfermedad esquelética (Mow, V.C. y Ratcliffe, A., Biomaterials 13:67-97, 1992). La degradación de los proteoglicanos, que se encuentra incrementada en las articulaciones enfermas, puede medirse mediante la cuantificación de los PGs liberados en el medio por explantes de cartílago articular utilizando el ensayo colorimétrico con DMMB (Farndale y Buttle, Biochem. Biophys. Acta 883:173-177, 1985). La incorporación de ^{35}S-sulfato en los proteoglicanos se utiliza para medir la síntesis de proteoglicanos.

La evidencia que asocia la interleuquina-1alfa, IL-1beta y las enfermedades cartilaginosas degenerativas es abundante. Por ejemplo, los niveles elevados de IL-1alfa (Pelletier, J.P. et al., "Cytokines and inflammation in cartilage degradation", en: Osteoarthritic Edition of Rheumatic Disease Clinics of North America, editores R.W. Moskowitz, Philadelphia, W.D. Saunders Company, 1993, páginas 545-568) y los receptores de IL-1 (Martel-Pelletier et al., Arthritis Rheum. 35:530-540, 1992) se han encontrado en articulaciones enfermas, y la IL-1alfa induce la degradación de la matriz de cartílago e inhibe la síntesis de nuevas moléculas de matriz (Baragi et al., J. Clin. Invest. 96:2454-60, 1995; Baragi et al., Osteoarthritis Cartilage 5:275-82, 1997; Evans et al., J. Leukoc. Biol. 64:55-61, 1998; Evans et al., J. Rheumatol. 24:2061-63, 1997; Kang et al., Biochem. Soc. Trans. 25:533-37, 1997; Kang et al., Osteoarthritis Cartilage 5:139-43, 1997). Debido a la asociación entre IL-1alfa y estados de enfermedad, el polipéptido WISP también puede someterse a ensayo para la presencia de IL-1alfa. La capacidad del polipéptido WISP no sólo de presentar efectos positivos sobre el cartílago, sino también de contrarrestar los efectos catabólicos de IL-1alfa es evidencia fuerte del efecto protector mostrado por el polipéptido WISP. Además, dicha actividad sugiere que el polipéptido WISP podría inhibir la degradación que se produce en las condiciones artríticas, debido a que los sucesos catabólicos iniciados por IL-1alfa también resultan inducidos por muchas otras citoquinas, y debido a que el antagonismo de la actividad de IL-1alfa se
ha demostrado que reduce la progresión de la osteoartritis (Arend, W.P. et al., Ann. Rev. Immunol. 16:27-55, 1998).

La producción de óxido nítrico (NO) puede inducirse en el cartílago con citoquinas catabólicas, tales como IL-1 (Palmer, RMJ et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 193:398-405, 1993). Se ha implicado el NO en la destrucción de la articulación que se produce en las condiciones artríticas (Ashok et al., Curr. Opin. Rheum. 10:263-268, 1998). Al contrario que el cartílago normal (no enfermo o no lesionado), el cartílago osteoartrítico produjo cantidades significativas de óxido nítrico ex vivo, incluso en ausencia de estímulos añadidos, tales como interleuquina-1 o lipopolisacárido (LPS). Los modelos animales in vivo sugieren que la inhibición de la producción de óxido nítrico reduce la progresión de la artritis (Pelletier, JP et al., Arthritis Rheum. 7:1275-86, 1998; van de Loo et al., Arthritis Rheum. 41:634-46, 1998; Stichtenoth, D.O. y Frolich, J.C., Br. J. Rheumatol. 37:246-57, 1998). In vitro, el óxido nítrico ejerce efectos perjudiciales sobre la función de los condrocitos, incluyendo la inhibición de la síntesis de colágeno y de proteoglicano, la inhibición de la adhesión a la matriz extracelular y el incremento de la muerte celular (apoptosis). Se observan concentraciones más altas de nitrito en líquido sinovial procedente de pacientes osteoartríticos que en líquido procedente de pacientes de artritis reumatoide (Renoux et al., Osteoarthritis Cartilage 4:175-179, 1996). Además, los modelos animales sugieren que la inhibición de la producción de óxido nítrico reduce la progresión de la artritis (Pelletier, J.P. et al., Arthritis Rheum. 7:1275-86, 1998; van de Loo et al., Arthritis Rheum. 41:634-46, 1998; Stichtenoth, D.O. y Frolich, J.C., Br. J. Rheumatol. 37:246-57, 1998). Debido a que el NO también presenta efectos sobre otras células, la presencia de NO dentro de la articulación podría incrementar la vasodilatación y la permeabilidad, potenciar la liberación de citoquinas por parte de los leucocitos, y estimular la actividad angiogénica. Debido a que el NO probablemente desempeña un papel tanto en componentes erosivos como inflamatorios de las enfermedades articulares, un factor que redujese la producción de óxido nítrico probablemente resultaría beneficioso para el tratamiento de los trastornos cartilaginosos degenerativos.

El ensayo para medir la producción de óxido nítrico se basa en el principio de que el 2,3-diaminonaftaleno (DAN) reacciona con nitrito bajo condiciones ácidas, formando 1-(H)-naftotriazol, un producto fluorescente. Debido a que NO resulta rápidamente metabolizado para formar nitrito (NO_{2}^{-1}) y nitrato (NO_{3}^{-1}), la detección de nitrito es un medio para detectar (aunque subestimando) el NO real producido por el cartílago.

También puede examinarse la capacidad de un polipéptido WISP de incrementar, estimular o mantener la viabilidad de los condrocitos en cultivos en ausencia de suero o de otros factores de crecimiento. En primer lugar se preparan los condrocitos articulares mediante la eliminación de la matriz extracelular y se cultivan en una monocapa, que se cree que aproxima etapas posteriores de trastornos del cartílago cuando la matriz se ha reducido. El ensayo es colorimétrico y mide la actividad metabólica de las células en cultivo basándose en la capacidad de las células viables de cortar la sal tetrazolio amarilla MTT para formar cristales formazán de color violeta. Esta reacción celular de reducción implica los cofactores nucleótidos de piridina NADH y NADPH (Berridge, M.V. y Tan, A.S., Arch. Biochem. Biophys. 303:474, 1993). El producto solubilizado se cuantifica espectrofotométricamente en un lector de ELISA.

Todavía otro ensayo examina los efectos de los polipéptidos WISP sobre la síntesis de proteoglicano en patellae (cápsulas rotulares) de ratones. Este ensayo utiliza cartílago intacto (incluyendo el hueso subyacente) y de esta manera somete a ensayo factores bajo condiciones que aproximan el ambiente in vivo del cartílago. Se añaden compuestos a las rótulas in vitro, o se inyectan en articulaciones de la rodilla in vivo previamente al análisis de la síntesis de proteoglicano en rótulas ex vivo. Tal como ha sido demostrado anteriormente, las rótulas tratadas in vivo muestran cambios claros en la síntesis de PG ex vivo (Van den Berg et al., Rheum. Int. 1:165-9, 1982, Vershure, P.J. et al., Ann. Heum. Dis. 53:455-460, 1994; y Van de Loo et al., Arthrit. Rheum. 38:164-172, 1995). En este modelo, la articulación contralateral de cada animal puede utilizarse como control.

Puede utilizarse un modelo de cobaya para medir los efectos de los polipéptidos WISP sobre la estimulación de la síntesis de PG y la inhibición de la liberación de PG en explantes de cartílago articular procedentes de una cepa de cobayas, Dunkin Hartley (DH), que desarrolla espontáneamente osteoartritis de rodilla (OA). La mayoría de demás modelos animales que causan la degradación articular de progresión rápida son más similares a la OA secundaria que a la OA primaria humana, de progresión más lenta. Debido a que el altamente reproducible patrón de degradación del cartílago en estos cobayas resulta similar al observado en el trastorno humano, el cobaya DH es un modelo animal bien aceptado para la osteoartritis (Young et al., "Osteoarthritis", Spontaneous animal models of human disease, vol. 2, páginas 257-261, Acad. Press, New York, 1979; Bendele et al., Arthritis Rheum. 34:1180-1184; Bendele et al., Arthritis Rheum. 31:561-565, 1988; Jimenez et al., Laboratory Animal Sciences 47(6):598-601, 1997; Wei et al., Acta Orthop. Scand. 69:351-357, 1998). Inicialmente estos animales desarrollan OA leve que resulta detectable por la presencia de cambios histológicos mínimos. Sin embargo, la enfermedad progresa y a las 16-18 meses de edad, se observa degeneración articular moderada a severa dentro de las articulaciones. Como resultado, el efecto del polipéptido WISP sobre la matriz de cartílago de los cobayas DH sobre la progresión de la enfermedad resultaría indicativo del efecto terapéutico del compuesto en el tratamiento de la OA en las diferentes etapas de destrucción de la articulación.

Los cambios metabólicos asociados a la diabetes mellitus (diabetes) podrían afectar otros sistemas orgánicos y musculoesqueléticos del organismo afectado. Por ejemplo, en el ser humano, la incidencia de lesiones y trastornos musculoesqueléticos se incrementa con la aparición de la diabetes, y la diabetes se considera un factor de riesgo de desarrollo de artritis.

Puede inducirse un síndrome similar a la diabetes en animales mediante la administración de estreptozotocina (STZ) (Portha B. et al., Diabetes Metab. 15:61-75, 1989). Mediante la eliminación de las células pancreáticas que producen insulina, la STZ reduce la cantidad de insulina sérica en los animales tratados. La diabetes inducida por STZ se asocia con atrofia y depresión del contenido de colágeno de los tejidos conectivos, incluyendo piel, hueso y cartílago (Craig, R.G. et al., Biochim. Biophys. Acta 1402:250-260, 1998). En este ensayo, las rótulas de ratones tratados con STZ se incubaron en presencia del polipéptido WISP y se analizó la síntesis de matriz resultante. La capacidad del polipéptido WISP de incrementar o restaurar el nivel de síntesis de PG al de los controles no tratados es indicativa del potencial terapéutico.

En otra realización de la invención, se proporcionan kits y productos de fabricación que contienen materiales útiles para diagnosticar o tratar los trastornos indicados anteriormente. El producto de fabricación comprende un recipiente y unas instrucciones. Entre los recipientes adecuados se incluyen, por ejemplo, botellas, viales, jeringas y probetas. Los recipientes pueden formarse a partir de una diversidad de materiales, tales como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composición que resulta eficaz para diagnosticar o tratar el trastorno cartilaginoso degenerativo, y puede presentar una abertura de acceso estéril (por ejemplo el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que presente un tapón perforable con una aguja de inyección hipodérmica). El agente activo en la composición típicamente es un polipéptido WISP. La composición puede comprender uno o más ingredientes cualesquiera dados a conocer en la presente invención. Las instrucciones en el recipiente o asociadas al mismo indican que la composición se utiliza para diagnosticar o tratar la condición de elección. Por ejemplo, las instrucciones podrían indicar que la composición resulta eficaz para el tratamiento de osteoartritis, artritis, artritis reumatoide o cualquier otro trastorno cartilaginoso degenerativo. El producto de fabricación puede comprender además un segundo recipiente que comprenda un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Alternativamente, la composición puede contener cualquiera de los portadores, excipientes y/o estabilizantes indicados en la presente invención. Puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringas e impresos en el paquete con instrucciones de utilización.

Los ejemplos siguientes se ofrecen únicamente con fines de ilustración y no pretenden limitar el alcance de la presente invención en modo alguno.

Ejemplos

Los reactivos disponibles comercialmente a los que se hace referencia en los ejemplos se utilizaron siguiendo las instrucciones del fabricante a menos que se indique lo contrario. El origen de las células identificadas en los ejemplos siguientes, y en toda la especificación, con los números de acceso de la ATCC es la American Type Culture Collection, Manassas, VA. A menos que se indique lo contrario, la presente invención utiliza procedimientos estándares de tecnología de ADN recombinante, tales como aquellos descritos anteriormente en la presente invención y en los libros de texto siguientes: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y., 1989; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y., 1989; Innis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc., N.Y., 1990; Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, 1988; Gait, M.J., Oligonucleotide Synthesis, IRL Press, Oxford, 1984; R.I. Freshney, Animal Cell Culture, 1987; Coligan et al., Current Protocols in Immunology, 1991.

Ejemplo 1

En los ensayos descritos a continuación, se utilizaron los métodos y materiales siguientes:

Materiales: el condroitín sulfato A procedente de tráquea bovina, el condroitín sulfato C procedente de cartílago de tiburón, la hialuronidasa (EC 3.2.1.45) de testículos bovinos y la condroitinasa AC II (EC 4.2.2.5) de Artherobacter aurenscens se adquirieron de Calbiochem (San Diego). El condroitín sulfato B, la heparina y el heparán sulfato de mucosa intestinal porcina, la decorina y el biglicano de cartílago articular bovino, la condroitinasa C, la condroitinasa B y la heparinasa I (EC 4.2.2.7) de Flavobacterium hepanium se obtuvieron de Sigma. El condroitín sulfato D de cartílago de tiburón y el condroitín sulfato E de cartílago de calamar se adquirieron de United States Biological (Swampscott, MA). La neuraminidasa (EC 3.2.2.18) de Vibrio cholera, la condroitinasa ABC (EC 4.2.2.4) libre de proteasa de Proteus vulgaris, tabletas de cóctel de inhibidores de proteasa libre de EDTA completo y BSA fracción V ultralibre de ácidos grasos se adquirieron de Roche Molecular Biochemicals (Indianapolis, IN). La condroitín-4-sulfatasa (EC 3.1.6.9) y la condroitín-6-sulfatasa (EC 3.1.6.10) de Proteus vulgaris eran de ICN Biomedicals (Aurora, OI). La IgG antihumana de cabra conjugada con peroxidasa de rábano picante y biotinilada y la IgG anticabra específica de fragmento Fc y biotinilada se adquirieron de Jackson ImmunoResearch (Costa Mesa, CA). La proteinasa K (EC 3.4.21.14) lista para utilizar, la estreptavidina conjugada con rojo de Tejas y el anticuerpo monoclonal antivimentina (clon Vim 3B4) eran de Dako (Carpinteria, CA). El diacetato de 5-clorometilfluoresceína (5-CFDA) y Hoechst 33342 se adquirieron de Molecular Probes (Eugene, OR). El kit Renaissance de amplificación indirecta de TSA se adquirió de NEN Life Science Products (Boston, MA). Los medios de montaje Vectashield e IgG antiratón de caballo biotinilado se obtuvieron de Vector (Burlingame, CA).

Se clonó WISP-1 murino de longitud completa (Pennica et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 95:14717-14722, 1998; patente WO nº 99/21998) en un vector de expresión codificante de la región Fc de IgG1 humana corriente debajo de la secuencia de WISP-1 tal como se ha descrito anteriormente para TNFR1 (Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 88:10535-10539, 199). La proteína de fusión recombinante resultante (WISP-1-Fc) se sintetizó en un sistema de expresión baculovirus utilizando células de insecto Sf9 y se purificó hasta la homogeneidad a partir de medio condicionado libre de suero mediante cromatografía de afinidad en una columna de flujo rápido de proteína A-sefarosa (Pharmacia Biotech., Suecia). Las proteínas no adsorbidas se eluyeron con tampón fosfato sódico 50 mM que contenía NaCl 1 M. Se eluyó WISP-1-Fc con glicina 100 mM pH 2,5 y el pH se neutralizó con 0,1 volúmenes de Tris-HCl 3 M, pH 8. Tras la diálisis (Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, 150 mM), la proteína purificada se concentró mediante ultrafiltración utilizando Centriprep-30 (Millipore Corp., Bedford, MA) y la pureza se estimó mediante SDS-PAGE y tinción con plata. Los experimentos se repitieron por lo menos tres veces con tres lotes diferentes de proteína expresada y se purificaron en diferentes tiempos, obteniendo resultados similares.

Cultivo celular: se obtuvieron de la American Type Culture Collection, Manassas, Virginia, NRK (fibroblastos renales de rata normales), Hs 597.Sk (fibroblastos de piel humana normales), Hs 839.T (fibroblastos de melanoma de piel humana), Hs 908.Sk (fibroblastos de melanoma de piel humana), COLO 320DM (células de adenocarcinoma de colon humano), RAG (células de adenocarcinoma renal de ratón), 293 (células epiteliales renales humanas), HUVEC (células endoteliales de vena umbilical humana) y WM-266-4 (células epiteliales de melanoma de piel humana). Las células se mantuvieron en medio de Eagle modificado por Dulbecco bajo en glucosa/Ham F-12 (1:1) suplementado con FBS al 10% a 37ºC bajo 5% de CO_{2}.

Unión celular: las células se sembraron en portaobjetos con cámaras de plástico de 8 pocillos y se mantuvieron durante la noche a 37ºC, 5% de CO_{2}. Al día siguiente, las células se lavaron con PBS y los pocillos se bloquearon durante 30 minutos a temperatura ambiente con BSA al 3% en tampón HBS-C (Hepes 25 mM, pH 7,2, NaCl 150, CaCl_{2} 3 mM, MgSO_{4} 3 mM, KCl 5 mM, cóctel completo de inhibidores de proteasa). En los casos en que se indica, las células se lavaron y se incubaron durante 2 horas a 37ºC con 0,1 U de los diferentes lisados previamente al bloqueo (ver Vacherot et al., J. Biol. Chem. 274:7741-7747, 1999). Las células se incubaron con mWISP-1-IgG 1 nM durante 1 hora a temperatura ambiente, se lavaron y se incubaron con 0,2 \mug/ml de Fc de IgG antihumano biotinilado en HBS-C/BSA al 3% durante 30 minutos a temperatura ambiente. La señal se amplificó utilizando el kit de amplificación indirecta de TSA (NEN Dupont) siguiendo las instrucciones del fabricante. Tras una incubación de 30 minutos con 1:200 de estreptavidina conjugada con FITC (DAKO), los portaobjetos se montaron utilizando Vectashield que contenía 1 \mug/ml de Hoechst 33342 (Molecular Probes) y se visualizaron bajo un microscopio de fluorescencia Nikon Eclipse 800. Las imágenes se captaron utilizando una cámara enfriada Photometrics 300 CCD. La medición de la intensidad de fluorescencia de las células se realizó tal como se ha descrito anteriormente, con modificaciones (Szurdoki et al., Anal. Biochem. 291:219-228, 2001). Brevemente, se captaron imágenes de un mínimo de tres campos separados que contenían una media de 90 células y se almacenaron en forma de archivos electrónicos. Se definió el umbral como la intensidad más baja del 1% de píxels más brillantes en un control negativo ejecutado sin WISP-1-Fc. La señal fluorescente para una población celular se definió como la intensidad total de píxels superior al umbral dividido por el número de células.

Ensayo de unión en fase sólida: se diluyeron proteínas en 50 \mul (volumen total) de PBS, se aplicaron en pocillos de microtitulación de poliestireno y se incubaron a 4ºC durante la noche. Al día siguiente, los pocillos se lavaron tres veces con 300 \mul de HBS-c que contenía BSA al 0,3% y se bloquearon los sitios de unión no específica durante 1 hora a temperatura ambiente con 200 \mul de HBS-C/BSA al 3%. El tampón se aspiró y se incubaron 50 \mul de WISP-1-IgG 0,5 nM en HBS-C/BSA al 3% durante 2 horas a temperatura ambiente. Los pocillos se lavaron y se incubaron durante 1 hora con 50 \mul de 2 \mug/ml de Fc de IgG antihumano de cabra conjugado con peroxidasa de rábano picante en HBS-C/BSA al 3%. Al final de la incubación, los pocillos se lavaron 6 veces con 200 \mul de PBS que contenía Tween-20 al 0,05% y la señal se visualizó utilizando 100 \mul del sustrato cromogénico peroxidasa de rábano picante TMB (KPL). La reacción se detuvo con 100 \mul de ácido fosfórico 1 M y se midió la DO a 450 nm. Se determinó la unión no específica de WISP-1-Fc en incubaciones paralelas omitiendo el recubrimiento de los pocillos de microtitulación. No se generó señal al omitir WISP-1-Fc.

Purificación de factores de unión de WISP-1: se ciclaron cada 3 días fibroblastos de piel humana entre suero que contenía medio de cultivo y suero libre del mismo. El medio condicionado libre de suero se concentró en una centrífuga Centriprep-30 (Millipore, Bedford, MA). A continuación, se cambió el tampón mediante la adición secuencial de Tris-HCl 20 mM, pH 7,4, NaCl 300 mM y concentrando nuevamente. El concentrado (150 \mug proteína/ml) se congeló instantáneamente y se almacenó a -80ºC hasta la utilización. El medio condicionado concentrado se descongeló, se filtró y se aplicó en una columna de intercambio aniónico Mono Q equilibrada en Tris-HCl 20 mM, pH 7,4, que contenía NaCl 300 mM. La columna se lavó y las proteínas adsorbidas se eluyeron utilizando un gradiente lineal de NaCl (300 mM a 2 M) en el mismo tampón. Se analizaron fracciones de 500 \mul para la actividad de unión de WISP-1.

Identificación de proteínas mediante espectrometría de masas: las fracciones que contenían actividad de unión de WISP-1 se agruparon, se desnaturalizaron, se redujeron y se aplicaron en un SDS-PAGE de gradiente 4% a 15% de acrilamida con o sin una incubación previa durante 2 horas a 37ºC con 0,1 U de condroitinasa ABC. Los geles se tiñeron con plata y las bandas de proteína que demostraron un cambio de movilidad tras la digestión con condroitinasa ABC se extrajeron y se digirieron in situ con tripsina tal como han descrito anteriormente Amott et al., Electrophoresis 19:968-980, 1998. Los péptidos trípticos se extrajeron y se analizaron mediante cromatografía líquida microcapilar en fase reversa-espectrometría de masas. Se cargaron mezclas de péptidos en columnas capilares de sílice fundido de 10 cm de longitud, 100 \mum de d.i., rellenas de perlas C18 de 5 \mum (238MBS5; Vydac, Hesperia, CA) y se eluyeron con un gradiente de acetonitrilo directamente en la fuente de ionización por microelectropulverización de un espectrómetro de masas de atrapamiento de iones (LCQ; Thermoquest, San Jose, CA). Se obtuvo un caudal de 500 nl/minuto mediante un desdoblamiento previo a la columna a partir de 25 \mul/minuto proporcionados por la HPLC (Ultra PlusII; Microtech Scientic, Sunnyvale, CA; Arnott et al., supra). La adquisición dependiente de datos automatizada de los espectros de masas proporcionó los datos de masa molecular (MS) y de secuencias (MS/MS) para los péptidos a medida que eluyeron de la columna. Las proteínas se identificaron mediante correlación de los datos de MS/MS con entradas en una base de datos de secuencias de proteína no redundantes utilizando el programa Sequest (Gatlin, C., Eng, J., Cross, S., Detter, J. Y Yates III, Analytical Chemistry 72:757-763, 2000). Se confirmaron las correspondencias de proteínas mediante interpretación manual de los espectros.

Inmunofluorescencia: se dejó que secciones de tumor de colon humano montadas en portaobjetos alcanzasen la temperatura ambiente, se fijaron con etanol al 70% durante 10 minutos y los sitios de unión no específica se saturaron con PBS/BSA al 3% que contenía 1,5% de suero normal durante 20 minutos. Las secciones se incubaron durante 1 hora con 0,125 microgramos/ml de anticuerpo antivimentina, se lavaron con PBS y se incubaron adicionalmente durante 30 minutos con 2 microgramos/ml de anticuerpo IgG antiratón biotinilado. La señal se amplificó utilizando el kit de amplificación indirecta de TSA siguiendo las instrucciones del fabricante. Tras una incubación de 30 minutos con 1:1000 de estreptavidina conjugada con rojo de Tejas, los portaobjetos se montaron utilizando Vectashield que contenía 1 microgramo/ml de Hoechst 33342 y se visualizaron en un microscopio de fluorescencia Nikon Eclipse 800. Las imágenes se captaron utilizando una cámara enfriada Photometrics 300 CCD. El control negativo ejecutado en ausencia de anticuerpo primario no reveló tinción fluorescente.

La detección inmunofluorescente de decorina en fibroblastos de piel humana se ejecutó utilizando un protocolo similar. Se sembraron 8 x 10^{3} células en portaobjetos con cámaras estériles y se cultivaron durante la noche. Al día siguiente, las células se lavaron y se incubaron a 37ºC durante 15 minutos con medio fresco que contenía 5 microgramos/ml de 5-CFDA. Tras lavar, los sitios de unión no específica se saturaron con HBS-C/BSA al 3% durante 30 minutos a temperatura ambiente. A continuación, las células se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con 1:4000 de anticuerpo anti-decorina humana de oveja en HBS-C/BSA al 0,1%. Las células se lavaron, se fijaron con paraformaldehído al 4%/PBS durante 10 minutos, se lavaron y se incubaron adicionalmente durante 30 minutos con 2 microgramos/ml de IgG antioveja biotinilado. La señal se amplificó utilizando el kit de amplificación indirecta de TSA. Tras una incubación de 30 minutos con 1:1000 de estreptavidina conjugada con rojo de Tejas, los portaobjetos se montaron utilizando Vectashield que contenía 1 microgramo/ml de Hoechst 33342 y se visualizaron en un microscopio de fluorescencia Nikon Eclipse 800. Las imágenes se captaron utilizando una cámara enfriada Photometrics 300 CCD. El control negativo ejecutado en ausencia de anticuerpo primario no reveló tinción fluorescente.

Procedimientos analíticos: se llevó a cabo SDS-PAGE según Laemli, Nature 227:680-685, 1970, utilizando un aparato de electroforesis en gel en lámina vertical Mini-PROTEAN II de Bio-Rad. Se determinó la masa molecular aparente utilizando los estándares de intervalos amplios de peso molecular de Bio-Rad. La proteína se determinó utilizando el reactivo Dye Reagent de ensayo de proteínas por tinción de plata de Bio-Rad y estándar de albúmina sérica bovina.

A. Unión de WISP-1 a diversas líneas celulares y a secciones de tumor de colon humano

Se analizó la unión de WISP-1 de ratón recombinante quimérico que portaba una etiqueta fragmento Fc de inmunoglobulina humana de diversas células en cultivo. Las células se sembraron en portaobjetos con cámara estéril y se cultivaron durante la noche. Al día siguiente, se bloquearon los sitios de unión no específica y las células se incubaron con 1 nM de mWISP-1-IgG o con mWISP-1-IgG durante 1 hora. Las células se lavaron, se fijaron y se detectó la unión de WISP-1-IgG mediante inmunofluorescencia utilizando un anticuerpo anti-IgG humana biotinilado y se realizó el seguimiento del procedimiento de amplificación indirecta de sustrato tiramida con estreptavidina conjugada con FITC.

Tal como se resume en la figura 1, la unión de WISP-1 únicamente podía observarse en la superficie de las líneas celulares fibroblásticas. A título de ejemplo, se ilustra la unión de WISP-1 a célula NRK (figura 1A). Además, la proteína también se unió a fibroblastos de origen rata o humano, fuesen normales o procedentes de melanoma de piel. Por otra parte, no pudo detectarse señal fluorescente al utilizar adenocarcinoma renal de ratón, adenocarcinoma de colon humano, células epiteliales de riñón humano, células endoteliales de vena umbilical humana o células epiteliales de melanoma de la piel humana. A título de ejemplo, se ilustra la unión de WISP-1 a células RAG (figura 1B). No pudo detectarse ninguna señal al omitir la adición de WISP-1 o al utilizar un anticuerpo secundario biotinilado no relacionado (figura 1C).

Se evaluó la unión de WISP-1 a secciones de tumor de colon humano utilizando procedimientos de unión de ligando in situ. Se permitió que secciones de tumor de colon humano montadas en portaobjetos alcanzasen la temperatura ambiente y se incubaron inmediatamente durante 4 minutos en ácido acético 35 mM (pH 3,5) que contenía CaCl_{2} 3 mM, MgSO_{4} 3 mM, KCl 5 mM y NaCl 1 M. A continuación, los portaobjetos se lavaron en HBS-C (Hepes 25 mM, pH 7,2, NaCl 150 mM, CaCl_{2} 3 mM, MgSO_{4} 3 mM, KCl 5 mM, cóctel completo de inhibidores de proteasa) que contenía sacarosa 32 mM y los sitios de unión no específica se bloquearon durante 20 minutos en HBS-C que contenía BSA al 3%, suero de cabra normal al 1,5% y sacarosa 32 mM. Los sitios de unión para avidina y biotina se bloquearon utilizando el kit de bloqueo de avidina/biotina de Vector (Burlingame, CA). Los portaobjetos se incubaron durante 1 hora en HBS-C/BSA al 3% y 1 nM de WISP-1-Fc, se lavaron tres veces durante 1 minuto cada vez con HBS-C frío (4ºC)/BSA al 1% y se fijaron durante 10 minutos en PBS/paraformaldehído al 4%. Los portaobjetos se incubaron con 0,2 microgramos/ml de anticuerpo anti-IgG humana de cabra biotinilado, Fc-específico en HBS-C/BSA al 3% durante 30 minutos, se lavaron y se fijaron en PBS/paraformaldehído al 4% durante 10 minutos. La señal se amplificó utilizando el kit de amplificación indirecta de TSA siguiendo las instrucciones del fabricante. La reacción se detuvo mediante tres lavados de 4 minutos en TBS/BSA al 0,1%. Los portaobjetos se incubaron durante 30 minutos con estreptavidina conjugada con FITC (1:1000) en TBS/BSA al 0,1% y se lavaron en TBS que contenía Tween-20 al 0,05%. Las secciones se montaron utilizando medio de montaje Vectashield que contenía 1 microgramo/ml de Hoechst 33342 y se visualizaron en un microscopio de fluorescencia Nikon Eclipse 800.

Aunque la tinción con vimentina reveló la presencia de células mesenquimales tanto en tumor como en la mucosa normal (ver las figuras 1F y 1G), la unión in situ de WISP-1 se limitó al estroma peritumoral (figura 1D). No se observó unión a las células epiteliales del tumor ni a mucosa normal (figuras 1D y 1E).

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B. WISP-1 se une a medio condicionado con fibroblastos de piel humana

Con el fin de examinar si se secretaba o se desprendía un factor de unión de WISP-1 de la superficie de los fibroblastos de piel humana, se llevó a cabo un ensayo de unión en fase sólida. Se recogió medio condicionado libre de suero procedente de fibroblastos de piel humana (preparados tal como se ha descrito anteriormente), se concentró y se utilizó para recubrir placas de microtitulación incubadas durante la noche. Se recubrieron por duplicado pocillos de microtitulación con cincuenta microlitros de medio condicionado. Los sitios de unión no específica se saturaron mediante incubación con HBS-C que contenía BSA al 3% y los pocillos se incubaron durante 2 horas con mWISP-1-IgG. Tras bloquear los sitios de unión no específica, los pocillos en primer lugar se incubaron con WISP-1 y después con un anticuerpo anti-IgG humano conjugado con peroxidasa de rábano picante. Los pocillos se lavaron y se incubaron durante 1 hora con Fc' anti-IgG humana conjugada con peroxidasa de rábano picante. Tras 6 lavados con HBS-C que contenía BSA al 0,3%, la señal se visualizó utilizando un sustrato cromogénico peroxidasa de rábano picante. La reacción se detuvo con ácido fosfórico 1 M y se midió la DO a 450 nm. La fig. 2A muestra la unión de 1 nM de mWISP-1-IgG a pocillos recubiertos con diluciones en serie de medio condicionado, y la fig. 2B muestra la unión de diluciones en serie de mWISP-1-IgG a pocillos recubiertos con 0,5 \mug de medio condicionado con fibroblastos de piel humana. La unión fue proporcional a la cantidad de medio recubierto y a la concentración de WISP-1 añadida, indicando que los fibroblastos de piel humana producen factores de unión de WISP-1 solubles.

Tal como se observa en la figura 3A, la interacción entre WISP-1 y el medio condicionado se eliminó en presencia de NaCl 1 M. La presencia de EDTA 100 mM únicamente redujo parcialmente la unión, mientras que la presencia de Tween-20 al 0,05% no presentó ningún efecto. Se concluyó que la unión de WISP-1 al material recubierto dependía de cationes y presentaba un componente iónico. La posibilidad de que el factor de unión fuese un proteoglicano seguidamente se investigó mediante el tratamiento de los pocillos recubiertos con diversas liasas antes de evaluar la unión de WISP-1. El tratamiento del material recubierto con condroitinasa C, condroitín-6-sulfatasa, heparinasa o neuraminidasa no alteró la unión de WISP-1 en comparación con el control (fig. 3B). Sin embargo, la digestión con condroitinasa AC II o con hialuronidasa redujo parcialmente la unión. Finalmente, el tratamiento con condroitinasa ABC, condroitinasa B, condroitín-4-sulfatasa o proteinasa K eliminó la unión de WISP-1 a los pocillos recubiertos. La especificidad de la condroitinasa B y la condroitín-4-sulfatasa indica que los componentes dermatán sulfato resultan esenciales para la unión de WISP-1. Además, la sensibilidad de la interacción con una proteinasa K indica que el factor de unión presenta un componente proteico. Los resultados sugieren que WISP-1 se une a un proteoglicano secretado que contiene dermatán sulfato.

Los tratamientos de condroitinasa ABC y de condroitinasa B eliminaron completamente la unión, mientras que el tratamiento con condroitinasa C no presentó ningún efecto. La condroitinasa B corta el dermatán sulfato en el enlace beta-D-galactosamina-ácido L-idurónico. La especificidad de este enzima demuestra el requisito de ácido idurónico para la unión de WISP-1. Los tratamientos con condroitinasa AC II o con hialuronidasa únicamente redujeron parcialmente la unión. Ello podría indicar que la cadena glucosaminoglicano responsable de la interacción de WISP-1 consistía de un copolímero dermatán sulfato-condroitín sulfato. Mediante el corte de los enlaces galactosamínicos susceptibles, dichos enzimas podrían haber eliminado partes de la cadena glucosaminoglicano que contenían residuos de ácido idurónico. El tratamiento con condroitín-4-sulfatasa eliminó completamente la unión, mientras que condroitín-6-sulfatasa no alteró la interacción. Ello indica la necesidad de un grupo sulfato en la posición 4 de la N-acetilgalactosamina para la interacción. El tratamiento con heparinasa no presentó ningún efecto, indicando que la unión no requiere que el ácido idurónico se encuentre sulfatado en la posición 2. El tratamiento con proteinasa K eliminó la unión, sugiriendo que el glucosaminoglicano responsable de la interacción se encuentra unido a un núcleo de proteína que podría desengancharse de los pocillos mediante degradación proteolítica. En conjunto estos resultados apoyan la conclusión de que un motivo que contiene ácido idurónico de la cadena glucosaminoglicano de un proteoglicano media en la unión de WISP-1 a medio condicionado por fibroblastos de piel humana.

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C. Purificación e identificación del factor de unión de WISP-1

Con el fin de purificar el facto responsable de la unión de WISP-1, el medio condicionado libre de suero procedente de fibroblastos de piel humana se recogió tras tres días de cultivo, se concentró, se transfirió a un tampón que contenía Tris-HCl 20 mM, pH 7,4, NaCl 300 mM y se aplicó en una columna de cromatografía de intercambio aniónico Q-sefarosa. La columna se lavó y las proteínas retenidas se desorbieron con una concentración creciente de NaCl. La presencia de un factor de unión de WISP-1 se analizó en cada fracción utilizando un ensayo de unión en fase sólida, y los resultados se muestran en la figura 4A. Además, la fracción 15 (indicada por un "*" en la figura 4A) se incubó a 37ºC durante 2 horas en presencia (+) o en ausencia (-) de 0,1 U de condroitinasa ABC. Las muestras se separaron mediante SDS-PAGE bajo condiciones reductoras y los geles se tiñeron con plata. Las bandas indicadas se identificaron mediante espectrometría de masas (figura 4B).

Las bandas observadas en 46, 60 y 70 kDa corresponden a decorina, mientras que la banda en 44 kDa se identificó como biglicano (la banda en 230 kDa aparentemente era una mezcla de decorina y biglicano). Las bandas observadas en los diferentes pesos moleculares probablemente corresponden a biglicano y decorina que contienen cadenas glucosaminoglicano digeridas incompletamente que se generaron durante el tratamiento con condroitinasa ABC. Los resultados demuestran que WISP-1 se une a los dos proteoglicanos que contienen dermatán sulfato, biglicano y decorina.

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D. WISP-1 se une a decorina y a biglicano

Con el fin de demostrar la interacción directa de WISP-1 con decorina y biglicano, se llevó a cabo un ensayo de unión en fase sólida. Se recubrieron pocillos de microtitulación incubados durante la noche con decorina y con biglicano. Los sitios de unión no específica se saturaron y se incubaron 0,25 nM de mWISP-1-IgG durante 2 horas. Los pocillos se lavaron y se incubaron con Fc' anti-IgG humana conjugada con peroxidasa de rábano picante (2 \mug/ml) durante 1 hora. Tras 6 lavados con PBS que contenía Tween-20 al 0,05%, se desarrolló una señal mediante la incubación de un sustrato cromogénico. Se detuvo el desarrollo del color mediante la adición de ácido fosfórico 1 M y se midió la D.O. a 450 nm.

Tal como se ilustra en la figura 5A, las curvas correspondientes a la unión de WISP-1 a decorina y a biglicano son muy similares y son proporcionales a la cantidad de proteína recubierta. De manera similar, se evaluó la capacidad de la decorina y el biglicano de inhibir la unión de WISP-1 a medio condicionado con fibroblastos de piel humana.

Se recubrieron pocillos de placas de microtitulación con cincuenta microlitros de medio condicionado con fibroblastos de piel humana. Los sitios de unión no específica se saturaron y se incubaron 0,25 nM de WISP-1-IgG en presencia de diversas concentraciones de decorina (círculos negros) o biglicano (círculos blancos) (figura 5B) durante 2 horas. Se evaluó la unión de mWISP-1-IgG tal como se ha descrito anteriormente. Tal como se observa en la figura 5B, la unión de WISP-1 al medio condicionado con fibroblastos de piel humana se redujo gradualmente en presencia de concentraciones crecientes de decorina y de biglicano. La decorina y el biglicano proporcionaron curvas de competición similares, mostrando una inhibición del 50% de la unión de WISP-1 con 70 \mug/ml de decorina y con 105 \mug/ml de biglicano.

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E. WISP-1 se une a los glucosaminoglicanos

Con el fin de comprender si la especificidad de la interacción de WISP-1 con los proteoglicanos se encontraba limitada al dermatán sulfato, se evaluó la unión de WISP-1 al medio condicionado con fibroblastos de piel humana en presencia de diversos proteoglicanos. Se preparó medio condicionado libre de suero de fibroblastos de piel humana tal como se ha descrito anteriormente. Se recubrieron pocillos de microplacas incubadas durante la noche a 4ºC con cincuenta \mul de medio condicionado, los sitios de unión no específica se saturaron y los pocillos se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente con 0,5 nM de WISP-1-IgG en presencia de diversas concentraciones de diferentes glucosaminoglicanos. Los pocillos se lavaron, se desarrolló una señal utilizando un sustrato cromogénico y se midió la D.O. a 450 nm. La figura 6 muestra: condroitín sulfato A (círculos negros), dermatán sulfato (círculos blancos), condroitín sulfato C (triángulos negros), condroitín sulfato D (triángulos blancos), condroitín sulfato E (cuadrados negros), heparina (X), heparán sulfato (cuadrados blancos).

Tal como se muestra en la figura 6, la unión de WISP-1 se reduce proporcionalmente a la presencia de concentraciones crecientes de diversos proteoglicanos. La unión de WISP-1 alcanzó el 50% de la unión máxima con 3 \mug/ml de dermatán sulfato, 10,5 \mug/ml de condroitín sulfato D o heparina, 30 \mug/ml de condroitín sulfato E, 75 \mug/ml de heparán sulfato, 105 \mug/ml de condroitín sulfato A. La presencia de condroitín sulfato C no redujo la unión de WISP-1. Estos datos demuestran que la interacción de WISP-1 con glucosaminoglicano resulta suficiente para mediar en la unión del mismo a medio condicionado con fibroblastos de piel humana. Además, indica que WISP-1 muestra una mayor especificidad para dermatán sulfato que cualquier otro glucosaminoglicano sometido a ensayo.

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F. La unión de WISP-1 a fibroblastos de piel humana resulta inhibida por dermatán sulfato

Con el fin de determinar la importancia de los proteoglicanos que contienen dermatán sulfato para la unión de WISP-1 a la superficie celular, se llevó a cabo un análisis de unión celular en presencia de diversos glucosaminoglicanos. Se sembraron fibroblastos de piel humana en portaobjetos con cámaras estériles. Los sitios de unión no específica se saturaron y se incubó 1 nM de WISP-1-IgG durante 1 hora a temperatura ambiente en ausencia (fig. 7A) o en presencia de 50 \mug/ml de condroitín sulfato A (fig. 7B), heparina (fig. 7G) o heparán sulfato (fig. 7H). Las células se lavaron y se fijaron, y la unión de WISP-1-IgG se detectó mediante inmunofluorescencia utilizando un anticuerpo anti-IgG humana biotinilado y el procedimiento de amplificación indirecta de sustrato tiramida finalizado con estreptavidina conjugada con FITC.

En ausencia de glucosaminoglicano añadido, la unión de WISP-1 a la superficie celular dio lugar a una fuerte tinción fluorescente. El condroitín sulfato C y el condroitín sulfato D redujeron la unión de WISP-1 en aproximadamente 20% y 46%, respectivamente, mientras que el condroitín sulfato A, el condroitín sulfato E, el heparán sulfato o la heparina redujeron la interacción en aproximadamente 60% a 70% (figura 7I). Por otra parte, en presencia de 50 \mug/ml de dermatán sulfato, la unión de WISP-1 a la superficie de fibroblastos de piel humana fue eliminada. Conjuntamente, estos resultados demuestran que WISP-1 presenta una afinidad más elevada para el dermatán sulfato y que esta interacción podría ser responsable de la unión de WISP-1 a la superficie celular.

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G. La unión de WISP-1 a fibroblastos de piel humana resulta eliminada mediante la digestión de la superficie celular con condroitinasa B

Aunque WISP-1 interacciona con los glucosaminoglicanos y con proteoglicanos pequeños que contienen dermatán sulfato, todavía no se ha determinado si interacciona con la superficie celular mediante el mismo tipo de interacción. Con el fin investigar esta posibilidad, se analizó la unión de WISP-1 a la superficie de fibroblastos de piel humana tratados con diferentes glucosaminoglicano liasas. Los fibroblastos de piel humana se incubaron durante 2 horas a 37ºC en ausencia (fig. 8A) o en presencia de 0,1 U de condroitinasa ABC (fig. 8B), condroitinasa B (fig. 8C), condroitinasa C (fig. 8D), heparinasa (fig. 8E) o en ausencia de mWISP-1 (FIG. 8F). Las células se lavaron, los sitios de unión no específica se saturaron y se incubó 1 nM de mWISP-1-IgG durante 1 hora a temperatura ambiente. Tras 3 lavados, las células se fijaron y se detectó la unión de mWISP-1-IgG mediante inmunofluorescencia utilizando un anticuerpo anti-IgG humano biotinilado y el procedimiento de amplificación indirecta de sustrato tiramida finalizado con estreptavidina conjugada con FITC.

Tal como se muestra en la fig. 8A, la unión de WISP-1 a la superficie de fibroblastos de piel humana sin tratar dio lugar a una fuerte señal fluorescente. Al tratar las células con condroitinasa ABC o condroitinasa B, se redujo la unión de WISP-1 a un nivel comparable al control negativo, en el que se había omitido WISP-1 (figuras 8B, C y D, respectivamente). Por otra parte, la unión de WISP-1 a las células tratadas con condroitinasa C o con heparinasa no mostró ninguna modificación en términos de distribución o de intensidad (figura 8, paneles D y E, respectivamente). Estos resultados indican que la unión de WISP-1 a la superficie celular de los fibroblastos de piel humana se encuentra mediada por un proteoglicano que contiene dermatán sulfato.

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H. La decorina y el biglicano bloquean la unión de WISP-1 a fibroblastos de piel humana

La unión de WISP-1 a fibroblastos de piel humana se evaluó en presencia o en ausencia de un exceso de decorina o de biglicano. Se sembraron fibroblastos de piel humana en portaobjetos con cámara estéril y se saturaron los sitios de unión no específica. Se incubó un nanomolar de mWISP-IgG durante 1 hora a temperatura ambiente en presencia de 1 mg/ml de decorina (fig. 9A), biglicano (fig. 9B) o en ausencia de competidores añadidos (fig. 9C). Las células se lavaron y se fijaron y se detectó la unión de WISP-1-IgG mediante inmunofluorescencia utilizando un anticuerpo anti-IgG humana biotinilado y el procedimiento de amplificación indirecta de sustrato tiramida se finalizó con estreptavidina conjugada con FITC.

Tal como se muestra en la figura 9, la presencia de decorina o de biglicano bloqueó parcialmente la interacción de WISP-1 con los fibroblastos de piel humana. Aunque la inhibición era significativa (aproximadamente de 88% y de 94%), incluso a la concentración más elevada sometida a ensayo (1 mg/ml) no pudo impedirse por completo la unión. Ello puede explicarse por la capacidad de la decorina y del biglicano de interaccionar con colágeno presente en la matriz extracelular de la célula.

La decorina y el biglicano son miembros de una familia de proteoglicanos pequeños ricos en leucina presentes en la matriz extracelular de los tejidos conectivos. La forma secretada de decorina consiste de una proteína nuclear de 36.319 Da (Krusius et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 83:7683-7687, 1986) y una única cadena de glucosaminoglicano de dermatán sulfato unida a una serina en posición 4 (Scott, PG, Dermatan Sulfate Proteoglycans: Chemistry, Biology, Chemical Pathology, Portoland Press, London, Inglaterra, 1993). La forma secretada de biglicano consiste de una proteína nuclear de 37.983 Da sustituida con dos cadenas de glucosaminoglicano, una de dermatán sulfato y una de condroitín sulfato (Fisher et al., J. Biol. Chem. 264:4571-4576, 1989). Las proteínas nucleares de biglicano y decorina comparten una identidad de aproximadamente 55% de los aminoácidos. El peso molecular de la proteína nuclear de decorina y de biglicano corresponde al peso molecular teórico de las dos bandas a las que se ha hecho referencia anteriormente que presentan la movilidad electroforética mayor tras el tratamiento con condroitinasa ABC. Las bandas de migración lenta corresponderían a cadenas de glucosaminoglicano parcialmente digeridas que portan decorina y biglicano.

La decorina se colocaliza con las fibrillas de fibronectina en la superficie de los fibroblastos de piel humana (Schmidt, G., Robenek, H., Harrach, B., Glossl, J., Nolte, V., Hormann, H., Richter, H. y Kresse, H., J. Cell Biol. 104:1683-1691, 1987). Resulta posible que la interacción de WISP-1 con la superficie celular se encuentre mediada por decorina unida a la matriz extracelular. Mediante la utilización de inmunofluorescencia, se confirmó en los ensayos anteriormente indicados la presencia de decorina en la superficie de los fibroblastos de piel humana. Además, se demostró que la decorina y el biglicano redujeron significativamente la unión de WISP-1 a la superficie celular. La interacción de decorina y de biglicano con los fibroblastos de piel humana probablemente evitó la inhibición completa de la unión de WISP-1. Conjuntamente estos resultados demuestran que la decorina puede actuar como sitio de unión de superficie celular para WISP-1.

Se demostró que varios proteoglicanos asociados con la membrana celular o la matriz extracelular contenían ácido idurónico. En consecuencia, resulta posible que WISP-1 interaccione con proteoglicano de condroitín sulfato o de heparán sulfato que presente motivos iduronato. Además, el contenido de ácido idurónico de la cadena glucosaminoglicano de diferentes proteoglicanos se ha demostrado que varía según la distribución en tejidos de los mismos. Por ejemplo, la decorina y el biglicano de la piel contienen aproximadamente 80% de ácido idurónico, mientras que en el cartílago contienen sólo 40% (Choi et al., J. Biol. Chem. 264:2876-2884, 1989). Las cadenas glucosaminoglicano del biglicano y de la decorina de hueso y de cartílago nasal bovino no contienen iduronato y por lo tanto son condroitín sulfato (Fisher et al., J. Biol. Chem. 262:9702-9708, 1987; Heinegard et al., Biochem. J. 3:2042-2051, 1981). Además, se ha informado de que el tratamiento de TGF-\beta induce una reducción de 10% a 15% del contenido de ácido idurónico de las cadenas laterales de decorina y de biglicano (Malmström, A. et al., Dermatan Sulfate Proteoglycans: Chemistry, Biology, Chemical Pathology, Portoland Press, London, Inglaterra, 1993). En consecuencia, posiblemente la modificación del contenido de ácido idurónico de la cadena glucosaminoglicano de los proteoglicanos modula la interacción de WISP-1.

Es conocido que el biglicano y la decorina interaccionan con una diversidad de proteínas de la matriz extracelular, citoquinas y receptores de superficie celular (para una revisión ver Hocking et al., Matrix Biol. 17:1-19, 1998, y Lozzo, R.V., J. Biol. Chem. 274:18843-18846, 1999). La decorina y el biglicano interaccionan con el factor \beta de crecimiento transformante (TGF-\beta), regulando negativamente la actividad biológica del mismo (Hildebrand et al., Biochem. J. 302:527-534, 1994). Además, se ha demostrado que la decorina reduce los niveles de ARNm y de síntesis de proteína TGF-\beta in vitro (Stander et al., Gene Therapy 5:1187-1194, 1998). Por otra parte, la expresión de la decorina se encuentra regulada negativamente por TGF-\beta en diversas células y organismos (Lozzo, Ann. Rev. Biochem. 67:609-652, 1998). La región promotora del gen de la decorina contiene un elemento regulado TGF-\beta-negativo. Este elemento regulado TGF-\beta-negativo se ha observado en varios genes proteasa regulados negativamente por TGF-\beta y podría funcionar suprimiendo la expresión del gen de la decorina (Lozzo, Experientia 49:447-455, 1993). Además, la expresión de la decorina se encuentra bien correlacionado con la malignidad del carcinoma humano (Adany et al., J. Biol. Chem. 265:11389-11396, 1990; Hunzlemann et al., J. Invest. Sermatol. 104:509-513, 1995). Se ha observado que se encontraba deprimido en muchos tejidos tumorales (Lozzo, supra, 1993) y que se había perdido en varias líneas de células tumorales (Lozzo et al., FASEB J. 10:598-614, 1996). Sin embargo, la expresión de la decorina se encuentra incrementada en el estroma tumoral (Adany et al., supra, 1991; Lozzo, supra, 1993; Brown et al., Clin. Cancer Res. 5:1041-1056, 1999). La decorina podría ser un potente regulador negativo del TGF-\beta liberado por el tumor para facilitar la carcinogénesis y la progresión del tumor. Debido a que se ha demostrado que la decorina suprime directamente el crecimiento de varios carcinomas a través de mecanismos dependientes e independientes de TGF- \beta, se ha propuesto que la expresión de la misma en el estroma peritumoral podría reflejar una respuesta regional de las células de tejido conectivo del huésped frente a las células neoplásicas invasoras (Stander et al., supra, 1999).

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Ejemplo 2 Adhesión de las células CHO a WISP-1 y a otras proteínas ECM

Se mantuvieron las líneas celulares CHO siguientes (identificadas por el número ATCC) en Ham-F12/LGDMEM (50:50) que contenía FBS al 10%:

1

Se recubrieron placas Maxisorp con 50 \mul de mWISP-1-IgG (5 \mug/ml) o con BSA al 3% (fracción V, ultralibre de ácidos grasos; Boehringer Mannheim) en solución en PBS a 4ºC durante la noche. Al día siguiente, el contenido de los pocillos se aspiró y los pocillos se bloquearon con 200 \mul de PBS/BSA al 3% durante 1 hora a temperatura ambiente. Las células se introdujeron en PBS que contenía EDTA 2 mM, y los grupos se rompieron utilizando una pipeta y después se centrifugaron a 1000 rpm durante 10 minutos. Se extrajo el sobrenadante, y las células se lavaron dos veces con Ham-F12 libre de suero/LGDMEM (50:50) que contenía BSA al 1%.

Las células se resuspendieron a una densidad de 25 x 10^{5} células/ml en Ham-F12/LGDMEM (50:50) libre de suero que contenía BSA al 1%. Se añadieron 50 \mul de Ham-F12 libre de suero/LGDMEM (50:50)/BSA al 1% a cada pocillo, seguido de 50 \mul de suspensión celular. Las placas se incubaron durante 2 horas a 37ºC sin tapa. Posteriormente los pocillos se lavaron 3X con PBS y tras extraer por completo el sobrenadante, las placas se almacenaron a -70ºC.

Las placas se descongelaron y se añadió Molecular Probes CyQUANT (Molecular Probes). Se midió la fluorescencia a 480 nm-520 nm.

Se muestran los resultados en la figura 10.

Se utilizaron líneas celulares CHO mutantes con alteraciones de la síntesis de glucosaminoglicano para verificar el papel de los proteoglicanos en la adhesión celular a WISP-1. Tal como se muestra en la figura 10, no se observó que ninguna de las líneas de células CHO completamente deficientes para la síntesis de glucosaminoglicano (CHO pgs A y CHO pgs B) se adhiriese a WISP-1. Este resultado indica que la adhesión de las células CHO a WISP-1 depende totalmente de las cadenas laterales de glucosaminoglicano del proteoglicano. Por otra parte, las líneas de células CHO que carecen de heparán sulfato (CHO pgsD) o que sintetizan un heparán sulfato infrasulfatado, mostraron una reducción de 40% en la adhesión a WISP-1 en comparación con CHO-K1, que sintetiza un proteoglicano normal. Ello demuestra que el proteoglicano de heparán sulfato de las células CHO es responsable sólo en parte de la adhesión celular a WISP-1 y que la sulfatación del mismo resulta necesaria para su actividad. En consecuencia, el proteoglicano de dermatán sulfato que es la fracción remanente del proteoglicano de CHO pgs D y CHO pgs E debería ser responsable de la mayor parte de la adhesión de las células CHO a WISP-1.

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Ejemplo 3 Adhesión de los fibroblastos de piel humana a WISP-1 y a otras proteínas ECM

Se mantuvieron fibroblastos de piel humana (ATCC; CRL 7356) en Ham F-12/LGDMEM (50:50) que contenía FBS al 10%. Se recubrieron placas Maxisorp con 50 \mul de las proteínas (identificadas posteriormente) en solución en PBS a 4ºC durante la noche.

2

Al día siguiente, se aspiró el contenido de los pocillos y estos se saturaron con 200 \mul de PBS/BSA al 3% durante 1 hora a temperatura ambiente. Las células se introdujeron en PBS que contenía EDTA 15 mM, y los grupos se rompieron utilizando una pipeta. La suspensión celular se filtró en un filtro de 45 \mum y se centrifugó a 1000 rpm durante 10 minutos.

Se extrajo el sobrenadante y las células se lavaron dos veces con Ham-F12 libre de suero/LGDMEM (50:50) que contenía BSA al 1%. Las células se resuspendieron a una densidad de 3 x 10^{5} células/ml con Ham-F12 libre de suero/LGDMEM (50:50)/BSA al 1%, junto con 100 \mug/ml de dermatán sulfato (condroitín sulfato B procedente de mucosa intestinal porcina; Sigma), 100 \mug/ml de heparina (mucosa intestinal porcina; Sigma) o sin adición. Las placas se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente. A continuación, se añadieron 50 \mul de suspensión celular a cada pocillo y se incubaron 2 horas a 37ºC sin tapas. Posteriormente los pocillos se lavaron 3X con PBS. Se llevó a cabo la tinción con cristal violeta durante 30 minutos. A continuación, las placas se lavaron en agua. Se midió la D.O. a 570 nm.

Se muestran los resultados en la figura 11.

Los datos sugieren que, aunque el valor es inferior al de los controles positivos (adhesión a colágeno I y a colágeno II), los fibroblastos de piel humana se adhieren a pocillos recubiertos con WISP-1 (figura 11). La presencia de 100 \mug/ml de heparina o de 100 \mug/ml de dermatán sulfato redujo la adhesión celular a WISP-1 en 30% o 70%, respectivamente. En condiciones similares, la adhesión celular a colágeno I y II no cambió significativamente. Estos resultados indican que la adhesión de los fibroblastos de piel humana a WISP-1 se encuentra medida por un mecanismo diferente que la adhesión al colágeno I y al colágeno II. También indica que, aunque el proteoglicano que contiene heparina puede participar en este fenómeno, la adhesión de los fibroblastos de piel humana a WISP-1 se encuentra mediada principalmente por proteoglicano de dermatán sulfato.

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Ejemplo 4 Ensayo de rediferenciación de condrocitos

Se llevó a cabo un experimento con el fin de determinar los efectos de diversas concentraciones de polipéptidos WISP-1 sobre la diferenciación de los condrocitos. Con el fin de cultivar los condrocitos, se digirió cartílago articular con enzimas que eliminan la matriz extracelular. De esta manera, el ambiente celular en este sistema de cultivo puede ser similar al observado en etapas posteriores de los trastornos del cartílago en los que se ha eliminado la matriz y las células condrocitas tienden a revertir a un fenotipo "inmaduro".

Se diseccionaron asépticamente las articulaciones metacarpofalángicas de cerdos hembra de 4 a 6 meses de edad, y se extrajo el cartílago articular cortando a mano libre procurando evitar el hueso subyacente. Estos fragmentos de cartílago seguidamente se digirieron en tripsina al 0,05% en F12 de Ham libre de suero durante 25 minutos a 37ºC. El medio se drenó y se descartó, y el cartílago se digirió en colagenasa B al 0,3% en medio F12 de Ham libre de suero durante treinta minutos a 37ºC. Se drenó el medio y se descartó, y el cartílago se digirió durante la noche en colagenasa B al 0,06% en F12 de Ham + suero fetal bovino al 10%. A continuación, las células se filtraron a través de un filtro de nilon de 70 micrómetros en medio F12 de Ham sin suero. Las células aisladas se sembraron a una densidad de 25.000 células/cm^{2} en F12 de Ham que contenía FBS al 10% y 4 \mug/ml de gentamicina.

El medio de cultivo se cambio cada treinta días y las células se sembraron nuevamente a una densidad de 25.000 células/cm^{2} cada cinco días. El día 12, las células se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 5.000 células/pocillo en 100 \mul del mismo medio sin suero y se añadieron 100 \mul de WISP-1-IgG humano (ver la figura 17) a una dilución del 1%, proporcionando un volumen final de 200 \mul/pocillo. Tras 5 días a 37ºC, se tomó una fotografía de cada pocillo utilizando un microscopio invertido con platina motorizada. Se determinó morfológicamente el estado de diferenciación utilizando el programa Metamorph de Universal Imaging Corporation. En cada fotografía, se seleccionaron según tamaño y forma las células redondas, correspondientes a condrocitos rediferenciados, mientras que las células aplanadas, que presentaban un fenotipo desdiferenciado, se eliminaron. A continuación, se calculó el área total cubierta por las células seleccionadas en una fotografía y se comparó con un control positivo (condrocitos rediferenciados por staurosporina) y a un control negativo (células sin tratar).

El cálculo e interpretación de los resultados se llevó a cabo de la manera siguiente:

Cálculo de los resultados:

Y = área de condrocitos

Índice de rediferenciación = [(Y-Y_{control \ negativo}) / (Y_{control \ positivo} - Y_{control \ negativo})] * 100

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Interpretación de los resultados:

Cuanto mayor es el índice de rediferenciación, mejor estimulará la molécula de WISP la rediferenciación de los condrocitos.

Nivel de corte de los resultados: índice de rediferenciación > 40 --> resultado positivo.

Se muestran los resultados en la fig. 12.

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Ejemplo 5 Ensayo de tinción de colágeno II

El colágeno II es un marcador preferente para los condrocitos. Tras dejar condrocitos porcinos primarios en cultivo durante 10 días para "des-diferenciarse" en células mesenquimales, las células tienden a perder la expresión de colágeno II. Se llevó a cabo el ensayo de diferenciación de condrocitos descrito anteriormente, en el que se trataron pocillos por triplicado para los controles (+) y (-) y por duplicado para cada una de las proteínas siguientes durante 5 días:

3

(Los constructos de polipéptido WISP se prepararon utilizando una etiqueta His N-terminal unida a cada polipéptido WISP).

Tras tomar las fotografías utilizando el microscopio invertido (tal como se describe en el Ejemplo 4), las células se fijaron en alcohol etílico al 70% durante 15 minutos a temperatura ambiente, y después se lavaron 3x con PBS. Las placas se bloquearon con PBS/BSA al 3% durante 60 minutos a una densidad de 200 \mul/pocillo. Los pocillos tratados se trataron con anti-colágeno II de ratón (Neomarker-5-B2.5) en PBS/BSA al 3% durante 1 hora a temperatura ambiente, haciendo correr una dilución de 1:2000. Las placas se lavaron nuevamente 3x con PBS/BSA al 0,1%.

Tras el lavado, las placas se incubaron con 1:1000 de antiratón biotinilado Vector en PBS/BSA al 0,1% durante 30 minutos a temperatura ambiente.

A continuación, las placas se lavaron 3X durante 2 minutos en PBS.

Las células se fijaron en paraformaldehído al 4% en PBS durante 10 minutos a temperatura ambiente, y después se lavaron con TBS (Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM, pH 8) + BSA al 0,3%, 2X durante 3 minutos (500 \mul/pocillo). A continuación, se incubó con HRP-estreptavidina de Dupont 1:1000 en TBS + BSA al 1% durante 30 minutos (100 \mul/pocillo). Después se realizaron lavados con TBS + BSA al 0,1%, 3X durante 4 minutos (500 \mul/pocillo). Seguidamente, se incubó con tiramida biotinilada durante 10 minutos 1:50 en diluyente de amplificación (NEN Dupont) (100 \mul/pocillo). Tras la incubación se realizaron lavados con TBS + BSA al 0,1%, 3X durante 4 minutos (500 \mul/pocillo).

En la incubación siguiente, se añadió FITC-estreptavidina de DAKO en TBS en HBS-C- + BSA al 1% durante 30 minutos (100 \mul/pocillo). A continuación, se realizó un lavado breve en PBS. Finalmente, se añadió Hoechst 1:1000 en PBS (100 \mul/pocillo) y después se evaluó bajo un microscopio invertido.

Se muestran los datos en la figura 13. Los controles positivos (staurosporina e IGF-1) se tiñeron fuertemente para colágeno II, mientras que el control negativo no mostró tinción alguna. Las células tratadas con 100 nM de WISP-1 o WISP-2 o WISP-3 mostraron una fuerte tinción positiva para colágeno II. Estos datos indican que las proteínas WISP estimulan la rediferenciación de los condrocitos porcinos primarios en cultivo.

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Ejemplo 6 Ensayo de explante de cartílago articular

Se llevó a cabo un experimento con el fin de examinar el potencial tanto sintético como profiláctico de los polipéptidos WISP sobre la renovación de la matriz del cartílago. Se determinó este potencial midiendo la síntesis y degradación de la matriz (es decir, los proteoglicanos), así como la producción de óxido nítrico, en el cartílago articular. Estos parámetros se evaluaron en presencia y en ausencia de interleuquina-alfa. Los explantes de cartílago articular presentan varias ventajas sobre las células primarias en cultivo. En primer lugar, y tal vez crucialmente, las células en explantes permanecen incluidas en la arquitectura de los tejidos producida in vivo. En segundo lugar, estos explantes resultan fenotípicamente estables durante varias semanas ex vivo, tiempo durante el que son capaces de mantener la homeostasis de los tejidos. Finalmente, al contrario que las células primarias, los explantes pueden utilizarse para medir la degradación de la matriz. Para montar los explantes de cartílago, debe diseccionarse y triturarse el cartílago articular, resultando en la rotura de la red de colágeno y la liberación de los proteoglicanos en el medio de cultivo. Este sistema imita
de esta manera condiciones degenerativas, tales como la artritis, en las que se elimina progresivamente la matriz.

Se diseccionaron asépticamente tal como se ha descrito anteriormente las articulaciones metacarpofalángicas de cerdos hembra de 4 a 6 meses de edad. El cartílago se trituró, se lavó y se cultivó en masa durante por lo menos 24 horas a 37ºC y 5% de CO_{2} en medio para explantes, es decir medio LG DMEM libre de suero (SF)/F12 con BSA al 0,1%, 100 U/ml de penicilina/estreptomicina (Gibco), L-glutamina 2 mM, piruvato sódico 0,1 mM (Gibco), 20 \mug/ml de gentamicina (Gibco) y 1,25 mg/l de anfotericina B. Se prepararon alícuotas del cartílago articular en tubos de Micronics (aproximadamente 55 mg por tubo) y se incubaron durante por lo menos 24 horas en el medio anterior. Se recolectaron los medios y se añadió medio nuevo (solo o con polipéptido WISP (constructos de fusión con IgG) en diversos puntos del tiempo (0, 24, 48 y 72 horas).

Se recolectó el medio en diversos puntos del tiempo y después se sometió a ensayo para el contenido de proteoglicano utilizando el ensayo colorimétrico de azul de 1,9-dimetilmetileno (DMMB) de Farndale y Buttle, Biochim. Biophys. Acta 883:173-177, 1985, tal como se ha descrito anteriormente. Se utilizó la liberación de PG a las 0 horas como medición de línea base y cualquier muestra con liberación especialmente elevada o reducida se descartó previamente al tratamiento con polipéptido WISP-1. Para todos los tratamientos los resultados representan la media de 5 muestras independientes.

A las 48 horas del primer tratamiento, se añadió ^{35}S-sulfato a los explantes de cartílago a una concentración final de 10 \muCi/ml junto con medio fresco (con o sin el compuesto de ensayo). Tras 12 a 17 horas más de incubación a 37ºC, se extrajo el medio y se reservó para análisis posteriores de PG y de óxido nítrico (NO). Los explantes de cartílago se lavaron dos veces con medio para explantes y se digirieron durante la noche a 50ºC en un volumen de reacción de 900 ml de EDTA 10 mM, fosfato sódico 0,1 M y 1 mg/ml de proteinasa K (Gibco BRL). Se mezcló la reacción de digestión (2:1) con cloruro de cetilpiridinio al 10% p/v (Sigma) para precipitar los proteoglicanos y se centrifugó a 1000xg durante 15 minutos. Se extrajo el sobrenadante y se añadió ácido fórmico (500 ml, Sigma) para disolver los pellets. A continuación, se transfirieron las muestras a viales que contenían 10 ml de líquido de centelleo (ICN) y se leyeron en un contador de centelleo.

Tras 72 horas, los explantes de cartílago articular restantes se digirieron tal como se ha descrito anteriormente y se sometieron a ensayo para el contenido de proteoglicanos utilizando el ensayo colorimétrico de DMMB (indicado anteriormente).

Al tratar explantes de cartílago articular con WISP-3 (fig. 14) o con WISP-1 (fig. 15A), se redujo la degradación de matriz de cartílago tanto de nivel basal como inducida por IL-1alfa. Además, WISP-1 inhibió la producción de óxido nítrico tanto basal como inducida por IL-1alfa (fig. 15B).

Estos resultados muestran que los polipéptidos WISP pueden proteger frente al catabolismo del cartílago. Dado que se observan niveles elevados tanto de óxido nítrico como de IL-1alfa en las articulaciones enfermas, la capacidad de los polipéptidos WISP de bloquear la actividad de IL-1alfa y la producción de óxido nítrico sugiere que los polipéptidos WISP pueden reducir el grado de daño de los tejidos en las articulaciones artríticas.

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Ejemplo 7 Ratones transgénicos que expresan WISP-2

Con el fin de someter a ensayo el efecto de los polipéptidos WISP in vivo, se crearon ratones transgénicos que sobreexpresan WISP-2 en sus músculos en virtud del promotor de cadena ligera de la miosina. Los transgénicos se crearon utilizando técnicas conocidas de la técnica (Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Beddington et al., Cold Spring Harbor Press, 1994; Transgenic Animal Technology: A Laboratory Handbook, Academic Press, New York, 1994). Se examinaron los huesos de estos ratones a las 14 semanas de edad mediante histología estándar. Tras el sacrificio de los animales, los huesos se fijaron en formalina tamponada al 4%, seguido de descalcificación en Formical^{TM} durante 4 a 8 horas. A continuación, las muestras se procesaron para la inclusión en parafina y para la eva-
luación histológica. Se realizaron secciones cada tres micrómetros de espesor y se tiñeron con hematoxilina-eosina.

Tal como se muestra en la figura 16, los compartimientos de cartílago hialino (es decir, la placa de crecimiento y el cartílago articular) aparentemente se encuentran expandidos. Estos resultados son consistentes con los resultados presentados en los Ejemplos anteriormente, mostrando la capacidad de los polipéptidos WISP de inducir la diferenciación de las células de cartílago y de inhibir la degradación de la matriz de cartílago. De esta manera, los polipéptidos WISP pueden presentar efectos potentes sobre el tejido cartilaginoso in vivo. El tratamiento de un individuo artrítico con un polipéptido que presenta dicha actividad, es decir una que incrementa la cantidad de cartílago, podría prevenir la discapacidad y la destrucción de la articulación que se produce en los pacientes de artritis.

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Referencias citadas en la descripción

Esta lista de referencias citadas por el solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad al respecto.

Documentos de patente citados en la descripción

\bullet US 5408040 A [0002]

\bullet WO 9640072 A [0095]

\bullet WO 9517416 A [0008]

\bullet WO 9607399 A [0095]

\bullet WO 9821236 A [0016]

\bullet US 5654010 A [0095]

\bullet WO 9119510 A [0024]

\bullet US P4891225 A [0096]

\bullet WO 9213565 A [0024]

\bullet US 4767628 A [0096]

\bullet US 5444047 A [0024]

\bullet US P3773919 A [0096]

\bullet EP 434652 A [0024]

\bullet US P4767628 A [0096]

\bullet WO 9921998 A [0038] [0042] [0043] [0044] [0045]

\bullet US P4530840 A [0096]

{}\hskip0.2cm [0047] [0048] [0088] [0129]

\bullet US P4957744 A [0097]

\bullet US 5428130 A [0089]

\bullet WO 9725563 A [0099]

\bullet US 4640835 A [0090]

\bullet US P4622219 A [0099]

\bullet US 4496689 A [0090]

\bullet US P4725442 A [0099]

\bullet US 4301144 A [0090]

\bullet US 4657760 A [0106]

\bullet US 4670417 A [0090]

\bullet US 5206344 A [0106]

\bullet US 4791192 A [0090]

\bullet US 5225212 A [0106]

\bullet US 4179337 A [0090]

\bullet EP 01987803 A [0192][0193]

\bullet US 5716805 A [0091]

\bullet US 0132124 W [0192][0193]

\bullet WO 9410308 A [0091]

\bullet US 60241222 B [0192][0193]

\bullet WO 9703692 A [0095]

Documentos no procedentes de patentes citados en la descripción

\bulletOemar; Luescher. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 1997, vol. 17, 1483-1489 [0003]

\bulletBabic et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, vol. 95, 6355-6360 [0003]

\bulletMartinerie et al. Oncogene, 1994, vol. 9, 2729-2732 [0003]

\bulletMartinerie et al. Oncogene, 1996, vol. 12, 1479-1492 [0003]

\bulletYamanaka et al. J. Biol. Chem., 1997, vol. 272, 30729-30734 [0003]

\bulletKim et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, vol. 94, 12981-12986 [0003]

\bulletHolt. J. Biol. Chem., 1990, vol. 265, 2852-2855 [0004]

\bulletFrazier et al. J. Invest. Dermatol., 1996, vol. 107, 404-411 [0004]

\bulletKireeva et al. Mol. Cell. Biol., 1996, vol. 16, 1326-1334 [0004]

\bulletYang et al. Cell. Growth Diff., 1991, vol. 2, 351-357 [0004]

\bulletHashimoto et al. J. Exp. Med., 1998, vol. 187, 289-296 [0005]

\bulletZhang et al. Mol. Cell. Biol., 1998, vol. 18, 6131-6141 [0005]

\bulletHolland et al. Dev. Suppl., 1994, 125-133 [0007]

\bulletMcMahon. Trends Genet., 1992, vol. 8, 236-242 [0007]

\bulletNusse; Varmus. Cell, 1992, vol. 69, 1073-1087 [0007]

\bulletGavin et al. Genes Dev., 1990, vol. 4, 2319-2332 [0007]

\bulletLee et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, vol. 92, 2268-2272 [0007]

\bulletChristiansen et al. Mech. Dev., 1995, vol. 51, 341-350 [0007]

\bulletVant Veer et al. Mol. Cell. Biol., 1984, vol. 4, 2532-2534 [0007]

\bulletNusse; Varmus. Cell, 1982, vol. 31, 99-109 [0008]

\bulletPapkoff; Schryver. Mol. Cell. Biol., 1990, vol. 10, 2723-2730 [0009]

\bulletBradley; Brown. EMBO J., 1990, vol. 9, 1569-1575 [0009]

\bulletRijsewik et al. Cell, 1987, vol. 50, 649-657 [0010]

\bulletMorata; Lawerence. Dev. Biol., 1977, vol. 56, 227-240 [0010]

\bulletBaker. Dev. Biol., 1988, vol. 125, 96-108 [0010]

\bulletKlingensmith; Nusse. Dev. Biol., 1994, vol. 166, 396-414 [0010]

\bulletHerman; Horvitz. Development, 1994, vol. 120, 1035-1047 [0010]

\bulletMcMahon; Bradley. Cell, 1990, vol. 62, 1073-1085 [0010]

\bulletThomas; Cappechi. Nature, 1990, vol. 346, 847-850 [0010]

\bulletStark et al. Nature, 1994, vol. 372, 679-683 [0010]

\bulletTakada et al. Genes Dev., 1994, vol. 8, 174-189 [0010]

\bulletParr; McMahon. Nature, 1995, vol. 374, 350-353 [0010]

\bulletBradbury et al. Dev. Biol., 1995, vol. 170, 553-563 [0010]

\bulletDzierzak; Medvinsky. Trends Genet., 1995, vol. 11, 359-366 [0011]

\bullet Joint International Workshop on Foetal and Neonatal Hematopoiesis and Mechanism of Bone Marrow Failure. Zon et al. Colloque, INSERM. 03 April 1995, vol. 235, 17-22 [0011]

\bulletKanatsu; Nishikawa. Development, 1996, vol. 122, 823-830 [0011]

\bulletChristiansen et al. Mech. Devel., 1995, vol. 51, 341-350 [0011]

\bulletCadigan; Nusse. Genes Dev., 1997, vol. 11, 3286-3305 [0013]

\bulletPennica et al. Proc. Natl. Acad. Sci., 1998, vol. 95, 14717-14722 [0014] [0038] [0129]

\bulletXu et al. Gene & Develop., 2000, vol. 14, 585-595 [0014]

\bulletHurvitz et al. Nature Genetics, 1999, vol. 23, 94-97 [0015]

\bulletAdany et al. J. Biol. Chem., 1990, vol. 265, 11389-11396 [0017] [0161]

\bulletHunzlemann et al. J. Invest. Dermatol., 1995, vol. 104, 509-513 [0017]

\bulletStänder et al. Gene Therapy, 1999, vol. 5, 1187-1194 [0017]

\bulletBrigstock. Endocrine Reviews, 1999, vol. 20, 189-206 [0018]

\bullet F. S. Chen et al. Am J. Orthop., 1997, vol. 26, 396-406 [0022]

\bulletOsborn. J. Orthop. Res., 1989, vol. 7, 35-42 [0022]

\bulletFlorini; Roberts. J. Gerontol., 1980, vol. 35, 23-30 [0022]

\bulletToolan et al. J. Biomec. Mat. Res., 1998, vol. 41, 244-50 [0022]

\bulletSah et al. Arch. Biochem. Biophys., 1994, vol. 308, 137-47 [0022]

\bulletSato; Urist. Clin. Orthop. Relat. Res., 1984, vol. 183, 180-87 [0022]

\bulletChin et al. Arthritis Rheum., 1991, vol. 34, 314-24 [0022]

\bulletHill; Logan. Prog. Growth Fac. Res, 1992, vol. 4, 45-68 [0022]

\bulletGuerne et al. J. Cell Physiol., 1994, vol. 158, 476-84 [0022]

\bullet Van der Kraan et al. Ann. Rheum. Dis., 1992, vol. 51, 643-47 [0022]

\bullet K. Osborn. J. Orthop. Res., 1989, vol. 7, 35-42 [0023]

\bullet R.D. Coutts et al. Instructional Course Lect. Amer. Acad. Orthop. Surg, 1997, vol. 47, 487-94 [0023]

\bullet J.R. Florini; S.B. Roberts. J. Gerontol., 1980, vol. 35, 23-30 [0023]

\bullet R.A. Rogachefsky et al. Ann. NY Acad. Sci., 1994, vol. 732, 889-95 [0024]

\bullet K. Sato; M. Orist. Clin. Orthop. Relat. Res., 1984, vol. 183, 180-87 [0025]

\bullet D.J. Hill; A Logan. Prog. Growth Fac. Res., 1992, vol. 4, 45-68 [0025]

\bullet P. Guerne et al. J. Cell Physiol., 1994, vol. 158, 476-84 [0026]

\bullet H. Van Beuningen et al. Ann. Rheum. Dis., 1993, vol. 52, 185-91 [0026]

\bullet P. Van der Kraan et al. Ann. Rheum. Dis., 1992, vol. 51, 643-47 [0026]

\bullet P. Guerne et al. J. Cell Physiol, 1994, vol. 158, 476-84 [0026]

\bullet E.B. Hunziker; L. Rosenberg. Trans. Orthopaed. Res. Soc., 1994, vol. 19, 236 [0026]

\bullet V. Baragi et al. J. Clin. Invest., 1995, vol. 96, 2454-60 [0027]

\bullet V.M. Baragi et al. Osteoarthritis Cartilage, 1997, vol. 5, 275-82 [0027]

\bullet C.H. Evans et al. J. Keukoc. Biol., 1998, vol. 64, 55-61 [0027]

\bullet C.H Evans; P.D. Robbins. J. Rheumatol., 1997, vol. 24, 2061-63 [0027]

\bullet R. Kang et al. Biochem. Soc. Trans., 1997, vol. 25, 533-37 [0027]

\bullet R. Kang et al. Osteoarthritis Cartilage, 1997, vol. 5, 139-43 [0027]

\bulletMartel-Pelletier J. et al. Front. Biosci., vol. 4, d694-703 [0027] [0083]

\bullet Proteases of the extracellular matrix. Woessner JF Jr. Structure and Function of Articular Cartilage. CRC Press, 1994 [0028]

\bulletSmith R.L. Front. In Biosci., vol. 4, d704-712 [0028]

\bulletAshok et al. Curr. Opin. Rheum., 1998, vol. 10, 263-268 [0029] [0117]

\bulletSambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 [0052]

\bulletRadin et al. Clin. Orthop. Relat. Res., 1978, vol. 131, 288-93 [0079]

\bulletRadin et al. J Orthop Res., 1984, vol. 2, 221-234 [0079]

\bulletRadin et al. Semin Arthritis Rheum, 1991, vol. 21 (2), 12-21 [0079]

\bulletWei et al. Acta Orthor Scand, 1998, vol. 69, 351-357 [0079]

\bulletBuckwalter et al. J. Am. Acad. Orthop. Surg., 1994, vol. 2, 192-201 [0079]

\bulletBuckwalter et al. J. Am. Acad. Orthop. Surg., 1999, vol. 2, 191-201 [0081]

\bullet F. Shapiro et al. J. Bone Joint Surg., 1993, vol. 75, 532-53 [0082]

\bullet N. Mitchell; N. Shepard. J. Bone Joint Surg., 1976, vol. 58, 230-33 [0082]

\bullet T. Furukawa et al. J. Bone Joint Surg., 1980, vol. 62, 79-89 [0082]

\bullet J. Cheung et al. Arthritis Rheum., 1980, vol. 23, 211-19 [0082]

\bullet S.O. Hjertquist; R. Lemperg. Calc. Tissue Res., 1971, vol. 8, 54-72 [0082]

\bullet H.S. Cheung et al. J. Bone Joint Surg., 1978, vol. 60, 1076-81 [0082]

\bullet Prospects for medical intervention in cartilage repair. D. Hamerman et al. Joint cartilage degradation: Basic and clinical aspects. 1993 [0082]

\bulletShapiro et al. J. Bone Joint Surg., 1993, vol. 75, 532-53 [0082]

\bulletKong et al. Nature, 1999, vol. 402, 304-308 [0084]

\bulletChamow et al. TIBTECH, 1996, vol. 14, 52-60 [0089]

\bulletLandschulz et al. Science, 1988, vol. 240, 1759 [0091]

\bulletHoppe et al. FEBS Letters, 1994, vol. 344, 1991 [0091]

\bulletManiatis et al. Nature, 1989, vol. 341, 24 [0091]

\bulletField et al. Mol. Cell. Biol., 1988, vol. 8, 2159-2165 [0092]

\bulletEvan et al. Molecular and Cellular Biology, 1985, vol. 5, 3610-3616 [0092]

\bulletPaborsky et al. Protein Engineering, 1990, vol. 3 (6), 547-553 [0092]

\bulletHopp et al. BioTechnology, 1988, vol. 6, 1204-1210 [0092]

\bulletMartin et al. Science, 1992, vol. 255, 192-194 [0092]

\bulletSkinner et al. J. Biol. Chem., 1991, vol. 266, 15163-15166 [0092]

\bulletLutz-Freyermuth et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, vol. 87, 6393-6397 [0092]

\bulletRemington's Pharmaceutical Sciences. 1980 [0093] [0094]

\bulletJohnson et al. Nat. Med., 1996, vol. 2, 795-799 [0095]

\bulletYasuda. Biomed. Ther., 1993, vol. 27, 1221-1223 [0095]

\bulletHora et al. Bio/Technology, 1990, vol. 8, 755-758 [0095]

\bullet Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems. Cleland. Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach. Plenum Press, 1995, 439-462 [0095]

\bulletKulkarni et al. Arch. Surg., 1966, vol. 93, 839 [0096]

\bulletValle et al. Polym. Mater. Sci. Eng., 1991, vol. 62, 731-735 [0097]

\bulletKazuteru, M. J. Controlled Release, 1999, vol. 59, 77-86 [0097]

\bullet Controlled Release of Bioactive Agents from Lactide/Glycolide polymer. Lewis. Biogradable Polymers as Drug Delivery Systems. Marcel Dekker, 1990, 1-41 [0100]

\bullet The use of interspecies scaling in toxicokinetics. Mordenti, J.; Chappell, W. et al. Toxicokinetics and New Drug Development. Pergamon Press, 1989, 42-96 [0105]

\bulletFrenkel et al. Front. Bioscience, 1999, vol. 4, d671-685 [0108]

\bulletKuettner, K.E. et al. Articular Cartilage Biochemistry. Raven Press, 1986, 456 [0115]

\bulletMuir, H. Biochem. Soc. Tran., 1983, vol. 11, 613-622 [0115]

\bulletHardingham, T.E. Biochem. Soc. Trans., 1981, vol. 9, 489-497 [0115]

\bulletMow, V.C.; Ratcliffe, A. Biomaterials, 1992, vol. 13, 67-97 [0115]

\bulletFarndale; Buttle. Biochem. Biophys. Acta, 1985, vol. 883, 173-177 [0115]

\bullet Cytokines and inflammation in cartilage degradation. Pelletier JP et al. Osteoarthritic Edition of Rheumatic Disease Clinics of North America. W.D. Saunders Company, 1993, 545-568 [0116]

\bulletMartel-Pelletier et al. Arthritis Rheum., 1992, vol. 35, 530-540 [0116]

\bulletBaragi et al. J. Clin. Invest., 1995, vol. 96, 2454-60 [0116]

\bulletBaragi et al. Osteoarthritis Cartilage, 1997, vol. 5, 275-82 [0116]

\bulletEvans et al. J. Leukoc. Biol., 1998, vol. 64, 55-61 [0116]

\bulletEvans et al. J. Rheumatol., 1997, vol. 24, 2061-63 [0116]

\bulletKang et al. Biochem. Soc. Trans., 1997, vol. 25, 533-37 [0116]

\bulletKang et al. Osteoarthritis Cartilage, 1997, vol. 5, 139-43 [0116]

\bulletArend, W.P. et al. Ann. Rev. Immunol., 1998, vol. 16, 27-55 [0116]

\bulletPalmer, RMJ et al. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1993, vol. 193, 398-405 [0117]

\bulletPelletier, JP et al. Arthritis Rheum., 1998, vol. 7, 1275-86 [0117]

\bullet van de Loo et al. Arthritis Rheum., 1998, vol. 41, 634-46 [0117]

\bulletStichtenoth, D.O.; Frolich J.C. Br. J. Rheumatol., 1998, vol. 37, 246-57 [0117]

\bulletRenoux et al. Osteoarthritis Cartilage, 1996, vol. 4, 175-179 [0117]

\bulletPelletier, J.P. et al. Arthritis Rheum., 1998, vol. 7, 1275-86 [0117]

\bulletStichtenoth, D.O.; Frolich, J.C. Br. J. Rheumatol., 1998, vol. 37, 246-57 [0117]

\bulletBerridge, M.V.; Tan, A.S. Arch. Biochem. Biophys., 1993, vol. 303, 474 [0119]

\bullet Van den Berg et al. Rheum. Int., 1982, vol. 1, 165-9 [0120]

\bulletVershure, P.J. et al. Ann. Heum. Dis., 1994, vol. 53, 455-460 [0120]

\bullet Van de Loo et al. Arthrit. Rheum., 1995, vol. 38, 164-172 [0120]

\bullet Spontaneous animal models of human disease. Young et al. Osteoarthritis. Acad. Press, 1979, vol. 2, 257-261 [0121]

\bulletBendele et al. Arthritis Rheum., vol. 34, 1180-1184 [0121]

\bulletBendele et al. Arthritis Rheum., 1988, vol. 31, 561-565 [0121]

\bulletJimenez et al. Laboratory Animal Sciences, 1997, vol. 47 (6), 598-601 [0121]

\bulletWei et al. Acta Orthop Scand, 1998, vol. 69, 351-357 [0121]

\bulletPortha B. et al. Diabete Metab., 1989, vol. 15, 61-75 [0123]

\bulletCraig, R.G. et al. Biochim. Biophys. Acta, 1998, vol. 1402, 250-260 [0123]

\bulletSambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Press, 1989 [0126]

\bulletAusubel et al. Current Protocols in Molecular Biology. Green Publishing Associates and Wiley Interscience, 1989 [0126]

\bulletInnis et al. PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. Academic Press, Inc, 1990 [0126]

\bulletHarlow et al. Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Press, 1988 [0126]

\bulletGait, M.J. Oligonucleotide Synthesis. IRL Press, 1984 [0126]

\bullet R.I. Freshney. Animal Cell Culture, 1987 [0126]

\bulletColigan et al. Current Protocols in Immunology, 1991 [0126]

\bulletAshkenazi et al. Proc. Natl. Acad. Sci., 1991, vol. 88, 10535-10539 [0129]

\bulletVacherot et al. J. Biol. Chem., 1999, vol. 274, 7741-7747 [0131]

\bulletSzurdoki et al. Anal. Biochem., 2001, vol. 291, 219-228 [0131]

\bulletArnott et al. Electrophoresis, 1998, vol. 19, 968-980 [0134]

\bulletGatlin, C.; Eng, J.; Cross, S.; Detter, J.; Yates III. Analytical Chemistry, 2000, vol. 72, 757-763 [0134]

\bulletLaemli. Nature, 1970, vol. 227, 680-685 [0137]

\bulletKrusius et al. Proc. Natl. Acad. Sci., 1986, vol. 83, 7683-7687 [0158]

\bulletScott, PG. Dermatan Sulfate Proteoglycans:Chemistry, Biology, Chemical Pathology. Portoland Press, 1993 [0158]

\bulletFisher et al. J. Biol. Chem., 1989, vol. 264, 4571-4576 [0158]

\bulletSchmidt, G.; Robenek, H.; Harrach, B.; Glossl, J.; Nolte, V.; Hormann, H.; Richter, H.; Kresse, H. J. Cell. Biol, 1987, vol. 104, 1683-1691 [0159]

\bulletChoi et al. J. Biol. Chem., 1989, vol. 264, 2876-2884 [0160]

\bulletFisher et al. J. Biol. Chem., 1987, vol. 262, 9702-9708 [0160]

\bulletHeinegard et al. Biochem. J., 1981, vol. 3, 2042-2051 [0160]

\bulletMalmström, A et al. Dermatan Sulfate Proteoglycans: Chemistry, Biology, Chemical Pathology. Portoland Press, 1993 [0160]

\bulletHocking et al. Matrix Biol., 1998, vol. 17, 1-19 [0161]

\bulletIozzo, R.V. J. Biol. Chem., 1999, vol. 274, 18843-18846 [0161]

\bulletHildebrand et al. Biochem. J., 1994, vol. 302, 527-534 [0161]

\bulletStander et al. Gene Therapy, 1998, vol. 5, 1187-1194 [0161]

\bulletIozzo. Ann. Rev. Biochem., 1998, vol. 67, 609-652 [0161]

\bulletIozzo. Experientia, 1993, vol. 49, 447-455 [0161]

\bulletHunzlemann et al. J. Invest. Sermatol., 1995, vol. 104, 509-513 [0161]

\bulletIozzo et al. FASEB J., 1996, vol. 10, 598-614 [0161]

\bulletBrown et al. Clin. Cancer Res., 1999, vol. 5, 1041-1056 [0161]

\bulletFarndale; Buttle. Biochim. Biophys. Acta, 1985, vol. 883, 173-177 [0185]

\bulletBeddington et al. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Press, 1994 [0190]

\bullet Transgenic Animal Technology: A Laboratory Handbook. Academic Press, 1994 [0190]

<110> GENENTECH, INC.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<120> MÉTODOS DE TRATAMIENTO QUE UTILIZAN POLIPÉPTIDOS WISP

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<130> LCW/FP6512750

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> EP 01987803.2

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 2001-10-12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> PCT/US01/32124

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 2001-10-12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> US 60/241.222

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 2000-10-16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn version 3.3

\vskip1.000000\baselineskip

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<210> 1

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<211> 595

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 1

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8

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<210> 2

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<211> 595

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<212> PRT

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<213> Mus musculus

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<400> 2

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9

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<210> 3

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<211> 367

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 3

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14

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<210> 4

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<211> 367

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<212> PRT

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<213> Mus musculus

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<400> 4

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17

18

19

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<210> 5

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<211> 228

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 5

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20

21

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<210> 6

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<211> 600

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 6

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22

23

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25

26

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<210> 7

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<211> 582

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 7

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27

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29

30

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<210> 8

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<211> 354

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 8

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31

32

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<210> 9

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<211> 372

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 9

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34

35

36

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<210> 10

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<211> 250

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 10

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37

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LISTADO DE SECUENCIAS

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<110> GENENTECH, INC.

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<120> MÉTODOS DE TRATAMIENTO QUE UTILIZAN POLIPÉPTIDOS WISP

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<130> LCW/FP6512750

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<150> EP 01987803.2

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<151> 2001-10-12

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<150> PCT/US01/32124

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<151> 2001-10-12

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\vskip0.400000\baselineskip

<150> US 60/241.222

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<151> 2000-10-16

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\vskip0.400000\baselineskip

<160> 10

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<170> PatentIn version 3.3

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<210> 1

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<211> 595

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 1

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40

41

42

43

44

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<210> 2

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<211> 595

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<212> PRT

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<213> Mus musculus

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<400> 2

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45

46

47

48

49

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<210> 3

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<211> 367

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 3

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50

51

52

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<210> 4

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<211> 367

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<212> PRT

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<213> Mus musculus

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<400> 4

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53

54

55

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<210> 5

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<211> 228

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 5

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56

57

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<210> 6

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<211> 600

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 6

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58

59

60

61

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<210> 7

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<211> 582

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 7

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62

63

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65

66

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<210> 8

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<211> 354

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 8

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67

68

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<210> 9

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<211> 372

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 9

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70

71

72

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<210> 10

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<211> 250

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 10

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73

74

75

Claims (35)

1. Polipéptido WISP-2 para su utilización en un procedimiento para el tratamiento de daños celulares o en tejidos de cartílago en un trastorno cartilaginoso degenerativo.

2. Utilización del polipéptido WISP-2 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de daños celulares o en tejidos de cartílago en un trastorno cartilaginoso degenerativo.

3. Polipéptido WISP-2 para su utilización según la reivindicación 1 o la utilización según la reivindicación 2, en el que dicho cartílago es cartílago articular.

4. Polipéptido WISP-2 para su utilización según la reivindicación 1 o la utilización según la reivindicación 2, en el que el trastorno cartilaginoso degenerativo es artritis reumatoide u osteoartritis.

5. Polipéptido WISP-2 para su utilización o la utilización según la reivindicación 4, en el que el trastorno cartilaginoso degenerativo es artritis reumatoide.

6. Polipéptido WISP-2 para su utilización o la utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho polipéptido WISP es un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en:

(a)

un polipéptido WISP-2 que comprende los aminoácidos 24 a 250 de la SEC ID nº 10;

(b)

un polipéptido WISP-2 que comprende los aminoácidos 1 a 250 de la SEC ID nº 10;

(c)

un polipéptido WISP-2 que presenta una identidad de por lo menos el 90% con el polipéptido (a) o (b); en el que dicho polipéptido WISP-2 estimula la proliferación o la diferenciación de condrocitos; y

(d)

un fragmento biológicamente activo del polipéptido WISP-2 de (a) o (b), en el que dicho fragmento biológicamente activo estimula la proliferación o la diferenciación de condrocitos.

7. Polipéptido WISP-2 para su utilización o la utilización según la reivindicación 6, en el que dicho polipéptido WISP-2 comprende los aminoácidos 24 a 250 de la SEC ID nº 10.

8. Polipéptido WISP-2 para su utilización o la utilización según la reivindicación 6, en el que dicho polipéptido WISP-2 se encuentra unido a una o más moléculas de polietilenglicol.

9. Polipéptido WISP-2 para su utilización o la utilización según la reivindicación 6, en el que dicho polipéptido WISP-2 se encuentra unido a una etiqueta epítopo o a una molécula de inmunoglobulina.

10. Polipéptido WISP-2 para su utilización o la utilización según la reivindicación 6, en el que el polipéptido WISP-2 o el medicamento son para el contacto con células o tejido de cartílago de mamífero en cultivo previamente al trasplante en un mamífero.

11. Polipéptido WISP-2 para su utilización o la utilización según la reivindicación 6, en el que el polipéptido WISP-2 está comprendido en una composición que comprende además, o el medicamento comprende además, un portador farmacéuticamente aceptable.

12. Procedimiento in vitro o ex vivo para tratar células o tejido de cartílago de mamífero, que comprende poner en contacto células o tejido de cartílago de mamífero dañados por un trastorno cartilaginoso degenerativo con una cantidad eficaz de polipéptido WISP, en el que dicho polipéptido WISP es un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en:

(a)

un polipéptido WISP-2 que comprende los aminoácidos 24 a 250 de la SEC ID nº 10;

(b)

un polipéptido WISP-2 que comprende los aminoácidos 1 a 250 de la SEC ID nº 10;

(c)

un polipéptido WISP-2 que presenta una identidad de por lo menos el 90% con el polipéptido de (a) o (b), en el que dicho polipéptido WISP-2 estimula la proliferación o la diferenciación de condrocitos; y

(d)

un fragmento biológicamente activo del polipéptido WISP-2 de (a) o (b), en el que dicho fragmento biológicamente activo estimula la proliferación o la diferenciación de condrocitos.

13. Procedimiento según la reivindicación 12, en el que dicho polipéptido WISP-2 comprende los aminoácidos 24 a 250 de la SEC ID nº 10.

14. Procedimiento según la reivindicación 12, en el que dicho polipéptido WISP-2 se encuentra unido a una o más moléculas de polietilenglicol.

15. Procedimiento según la reivindicación 12, en el que dicho polipéptido WISP-2 se encuentra unido a una etiqueta epítopo o a una molécula de inmunoglobulina.

16. Procedimiento según la reivindicación 12, en el que dicho cartílago es cartílago articular.

17. Procedimiento según la reivindicación 12, en el que el trastorno cartilaginoso degenerativo es artritis reumatoide u osteoartritis.

18. Procedimiento según la reivindicación 17, en el que el trastorno cartilaginoso degenerativo es artritis reumatoide.

19. Procedimiento según la reivindicación 12, en el que el polipéptido WISP se encuentra incluido en un portador farmacéuticamente aceptable.

20. Polipéptido WISP-2 para su utilización en un procedimiento para el tratamiento de una lesión celular o en tejido de cartílago de mamífero, en el que dicho polipéptido WISP-2 es un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en:

(a)

un polipéptido WISP-2 que comprende los aminoácidos 24 a 250 de la SEC ID nº 10;

(b)

un polipéptido WISP-2 que comprende los aminoácidos 1 a 250 de la SEC ID nº 10;

(c)

un polipéptido WISP-2 que presenta una identidad de por lo menos el 90% con el polipéptido de (a) o (b); en el que dicho polipéptido WISP-2 estimula la proliferación o la diferenciación de condrocitos; y

(d)

un fragmento biológicamente activo del polipéptido WISP-2 de (a) o (b), en el que dicho fragmento biológicamente activo estimula la proliferación o la diferenciación de condrocitos.

21. Utilización de polipéptido WISP para la preparación de un medicamento para el tratamiento de una lesión celular o en tejido de cartílago de mamífero, en el que dicho polipéptido WISP es un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en:

(a)

un polipéptido WISP-2 que comprende los aminoácidos 24 a 250 de la SEC ID nº 10;

(b)

un polipéptido WISP-2 que comprende los aminoácidos 1 a 250 de la SEC ID nº 10;

(c)

un polipéptido WISP-2 que presenta una identidad de por lo menos el 90% con el polipéptido de (a) o (b); en el que dicho polipéptido WISP-2 estimula la proliferación o la diferenciación de condrocitos; y

(d)

un fragmento biológicamente activo del polipéptido WISP-2 de (a) o (b), en el que dicho fragmento biológicamente activo estimula la proliferación o la diferenciación de condrocitos.

22. Polipéptido WISP-2 para su utilización según la reivindicación 20 o la utilización según la reivindicación 21, en el que la lesión es una microdaño o un traumatismo por contusión, una fractura condral, una fractura osteocondral o daño en menisco, tendón o ligamento.

23. Polipéptido WISP-2 para su utilización según la reivindicación 20 o la utilización según la reivindicación 21, en el que dicho polipéptido WISP está destinado a la administración en un mamífero mediante inyección en dichas células o tejido de cartílago o en una articulación del mamífero.

24. Polipéptido WISP-2 para su utilización según la reivindicación 20 o la utilización según la reivindicación 21, en el que dicho polipéptido WISP-2 comprende los aminoácidos 24 a 250 de la SEC ID nº 10.

25. Polipéptido WISP-2 para su utilización según la reivindicación 20 o la utilización según la reivindicación 21, en el que dicho polipéptido WISP-2 se encuentra unido a una o más moléculas de polietilenglicol.

26. Polipéptido WISP-2 para su utilización según la reivindicación 20 o la utilización según la reivindicación 21, en el que dicho polipéptido WISP-2 se encuentra unido a una etiqueta epítopo o a una molécula de inmunoglobulina.

27. Polipéptido WISP-2 para su utilización según la reivindicación 20 o la utilización según la reivindicación 21, en el que el polipéptido WISP-2 o el medicamento es para el contacto con células o tejido de cartílago de mamífero en cultivo previamente al trasplante en un mamífero.

28. Polipéptido WISP-2 para su utilización según la reivindicación 20 o la utilización según la reivindicación 21, en el que el polipéptido WISP-2 está comprendido en una composición que comprende además, o el medicamento comprende además, un portador farmacéuticamente aceptable.

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29. Procedimiento in vitro o ex vivo para tratar células o tejido de cartílago de mamífero, que comprende poner en contacto células o tejido de cartílago de mamífero dañados por lesión con una cantidad eficaz de polipéptido WISP, en el que dicho polipéptido WISP es un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en:

(a)

un polipéptido WISP-2 que comprende los aminoácidos 24 a 250 de la SEC ID nº 10;

(b)

un polipéptido WISP-2 que comprende los aminoácidos 1 a 250 de la SEC ID nº 10;

(c)

un polipéptido WISP-2 que presenta una identidad de por lo menos el 90% con el polipéptido de (a) o (b), en el que dicho polipéptido WISP-2 estimula la proliferación o la diferenciación de condrocitos; y

(d)

un fragmento biológicamente activo del polipéptido WISP-2 de (a) o (b), en el que dicho fragmento biológicamente activo estimula la proliferación o la diferenciación de condrocitos.

30. Procedimiento según la reivindicación 29, en el que la lesión es un microdaño o un traumatismo por contusión, una fractura condral, una fractura osteocondral o daño en el menisco, tendón o ligamento.

31. Procedimiento según la reivindicación 29, en el que dicho polipéptido WISP-2 comprende los aminoácidos 24 a 250 de la SEC ID nº 10.

32. Procedimiento según la reivindicación 29, en el que dicho polipéptido WISP-2 se encuentra unido a una o más moléculas de polietilenglicol.

33. Procedimiento según la reivindicación 29, en el que el polipéptido WISP-2 se encuentra unido a una etiqueta epítopo o a una molécula de inmunoglobulina.

34. Procedimiento según la reivindicación 29, en el que el polipéptido WISP se encuentra incluido en un portador farmacéuticamente aceptable.

35. Producto de fabricación que comprende: (a) un recipiente que contiene una composición que resulta eficaz para tratar un trastorno cartilaginoso, en el que la composición comprende una cantidad eficaz de polipéptido WISP-2 para tratar un trastorno cartilaginoso, y (b) instrucciones para utilizar dicho polipéptido WISP para tratar un trastorno cartilaginoso.