ES2337989T3

ES2337989T3 - Nuevas proteinas asociadas a la muerte de la familia thap y rutas par4 relacionadas implicadas en el control de la apoptosis.

Info

Publication number: ES2337989T3
Application number: ES02796602T
Authority: ES
Inventors: Jean-Philippe Girard; Myriam Roussigne; Sophia Kossida; Francois Amalric; Thomas Clouaire
Original assignee: ENDOCUBE Sas; Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Current assignee: ENDOCUBE Sas; Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date: 2001-12-18
Filing date: 2002-12-10
Publication date: 2010-05-03
Anticipated expiration: 2022-12-10
Also published as: AU2002361385B2; CA2471777A1; US20030186337A1; ATE451387T1; DE60234713D1; EP1458754B1; JP2005527191A; WO2003051917A3; JP2010158248A; EP1458754A2; AU2002361385A1; US7572886B2; WO2003051917A2; US20100021482A1

Abstract

Un método para identificar un compuesto de ensayo que modula las actividades mediadas por THAP ("THanatos-Associated Protein", proteína asociada a la muerte), que comprende: poner en contacto un polipéptido de la familia THAP, o su fragmento biológicamente activo, con un compuesto de ensayo, en el que dicho polipéptido de la familia THAP comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una coincidencia de aminoácidos del 70% con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3; y determinar si dicho compuesto de ensayo modula selectivamente la actividad de dicho polipéptido de la familia THAP, o su fragmento biológicamente activo, en el que una determinación de que dicho compuesto de ensayo modula selectivamente la actividad de dicho polipéptido indica que dicho compuesto de ensayo es un modulador candidato de actividades mediadas por THAP.

Description

Nuevas proteínas asociadas a la muerte de la familia THAP y rutas PAR4 relacionadas implicadas en el control de la apoptosis.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a genes y proteínas del miembro de la familia THAP ("THanatos-Associated Protein", proteína asociada a la muerte) THAP1, y sus usos. En particular, la invención se refiere a polipéptidos THAP1 que comprenden un dominio THAP, la modulación de actividades mediadas por THAP, y la identificación de compuestos que modulan estas actividades.

Antecedentes

Se requiere la coordinación de la proliferación celular y la muerte celular para el desarrollo normal y la homeostasis de tejidos en organismos multicelulares. Un defecto en la coordinación normal de estos dos procesos es un requisito fundamental para la tumorigénesis.

El avance a través del ciclo celular está muy regulado y requiere pasar por numerosos puntos de control (para un informe, véase Hunter, 1993). El alcance de la muerte celular está fisiológicamente controlado mediante la activación de una vía suicida programada que produce una forma morfológicamente reconocible de muerte denominada apoptosis (Jacobson et al., 1997; Vaux et al., 1994). Tanto señales extracelulares, como el factor de necrosis tumoral, como señales intracelulares, como p53, pueden inducir la muerte celular apoptótica. Aunque se han identificado muchas proteínas implicadas en la apoptosis o del ciclo celular, los mecanismos mediante los cuales se coordinan estos dos procesos no están bien comprendidos.

Está comprobado que las moléculas que modulan la apoptosis tienen un potencial para tratar una amplia gama de trastornos relacionados con la muerte celular y la proliferación celular. Por ejemplo, estas moléculas pueden utilizarse para inducir la muerte celular para el tratamiento de cánceres, para inhibir la muerte celular para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas, y para inhibir o inducir la muerte celular para regular la angiogénesis. Sin embargo, debido a que muchas vías biológicas que controlan el ciclo celular y la apoptosis aún no se han aclarado, existe la necesidad de identificar dianas biológicas para el desarrollo de moléculas terapéuticas para el tratamiento de estos trastornos.

Cuerpo nucleares de PML

Los cuerpos nucleares de PML (PML-NB), también conocidos como POD (dominios oncogénicos PML), ND10 (dominio nuclear 10) y cuerpos Kr, son dominios subnucleares discretos que están específicamente alterados en células de leucemia promielocítica aguda (APL), un subtipo diferenciado de leucemia mieloide humana (Maul et al., 2000; Ruggero et al., 2000; Zhong et al., 2000a). Su nombre deriva de su componente proteínico estudiado más a fondo, la proteína de la leucemia promielocítica (PML), una proteína inducible por IFN de dedo RING codificada por un gen clonado originariamente como el compañero de translocación cromosómica t(15;17) del locus del receptor del ácido retinoico (RAR) en APL. En células APL, la presencia de la proteína de fusión leucemogénica, PML-RAR, conduce a la alteración de los PML-NB y a la deslocalización de PML y otras proteínas de PML-NB para formar estructuras nucleares aberrantes (Zhong et al., 2000a). El tratamiento de líneas celulares y de pacientes APL con ácido retinoico, que induce la degradación de la oncoproteína PML-RAR, produce la relocalización de PML y otros componentes NB hacia los PML-NB y la remisión completa de la enfermedad clínica, respectivamente. Por tanto, la desregulación de los PML-NB por PML-RAR parece desempeñar un papel crítico en la tumorigénesis. El análisis de ratones, en los que el gen PML se altera mediante recombinación homóloga, ha revelado que la PML actúa como supresor tumoral in vivo (Wang et al., 1998a), que es esencial para múltiples vías apoptóticas (Wang et al., 1998b). Los ratones y las células pml -/- están protegidos frente a la apoptosis inducida por Fas, TNF\alpha, ceramidas e IFN, así como frente a la apoptosis inducida por daños en el ADN. Sin embargo, los mecanismos moleculares a través de los cuales la PML modula la respuesta a estímulos proapoptóticos no se entienden bien (Wang et al., 1998b; Quignon et al., 1998). Estudios recientes indican que la PML puede participar en las vías de la apoptosis dependiente de p53 e independiente de p53 (Guo et al., 2000; Fogal et al., 2000). La apoptosis inducida por lesiones en el ADN dependiente de p53, la activación transcripcional por p53 y la inducción de genes diana p53 están afectadas en células primarias PML -/- (Guo et al., 2000). La PML interacciona físicamente con p53 y actúa como coactivador transcripcional para p53. Este papel coactivador de la PML es absolutamente dependiente de su capacidad para reclutar p53 en los PML-NB (Guo et al., 2000; Fogal et al., 2000). La existencia de un diálogo entre las vías de supresión del crecimiento dependientes de PML y de p53 implica un papel importante de los PML-NB y de las proteínas asociadas a PML-NB como moduladores de las funciones de p53. Además de p53, el factor proapoptótico Daxx puede ser otro mediador importante de actividades proapoptóticas PML (Ishov et al., 1999; Zhong et al., 2000b; Li et al., 2000). La Daxx se identificó originariamente por su capacidad para potenciar la muerte celular inducida por Fas. La Daxx interacciona con PML y se localiza preferentemente en el núcleo en donde se acumula en los PML-NB (Ishov et al., 1999; Zhong et al., 2000b; Li et al., 2000). La inactivación de PML produce la deslocalización de Daxx de los PML-NB y la completa abrogación de la actividad proapoptótica de Daxx (Zhong et al., 2000b). En fechas recientes se ha descubierto que Daxx posee una fuerte actividad represora transcripcional (Li et al., 2000). Reclutando Daxx hacia los PML-NB, la PML puede inhibir la represión transcripcional mediada por Daxx permitiendo, con ello, la expresión de ciertos genes proapoptóticos.

Los PML-NB contienen varias otras proteínas además de Daxx y p53. Éstas incluyen los autoantígenos Sp100 (Sternsdorf et al., 1999) y la proteína relacionada con Sp100 (Bloch et al., 1999), el supresor de tumores de retinoblastona pRB (Alcalay et al., 1998), el coactivador transcripcional CBP (LaMorte et al., 1998), la ADN helicasa del síndrome de Bloom BLM (Zhong et al., 1999), y el modificador de tipo ubiquitina pequeño SUMO-1 (también conocido como sentrina-1 o PIC1; para informes recientes, véase Yeh et al., 2000; Melchior, 2000; Jentsch y Pyrowolakis, 2000). La modificación covalente de PML por SUMO-1 (sumoilación) parece desempeñar un papel crítico en la acumulación de PML en los NB (Muller et al., 1998) y el reclutamiento de otros componentes NB hacia PML-NB (Ishov et al., 1999; Zhong et al., 2000c).

Respuesta a la apoptosis-4 de próstata

La respuesta a la apoptosis-4 de próstata (PAR4) es una proteína de 38 kDa identificada originariamente como el producto de un gen específicamente sobrerregulado en células de tumor de próstata que están sufriendo apoptosis (para un informe, véase Rangnekar, 1998; Mattson et al., 1999). En coherencia con el papel importante de PAR4 en la apoptosis, la inducción de PAR4 en células cultivadas sólo se detecta durante la apoptosis, y se ha demostrado que la expresión ectópica de PAR4 en células NIH-3T3 (Diaz-Meco et al., 1996), neuronas (Guo et al., 1998), cáncer de próstata y células de melanoma (Sells et al., 1997) sensibiliza a estas células frente a estímulos apoptóticos. Además, la infrarregulación de PAR4 es crítica para el avance y la supervivencia tumoral inducidos por ras (Barradas et al., 1999), y la supresión de la producción de PAR4 con tecnología antisentido evita la apoptosis en varios sistemas (Sells et al., 1997; Guo et al., 1998), incluyendo diferentes modelos de trastornos neurodegenerativos (Mattson et al., 1999), lo cual enfatiza aún más el papel crítico de PAR4 en la apoptosis. En el carboxi-terminal, PAR4 contiene un domino de cremallera de leucina (Par4LZ, aminoácidos 290-332), y un dominio de muerte parcialmente solapante (Par4DD, aminoácidos 258-332). La deleción de esta parte carboxi-terminal abroga la función proapoptótica de PAR4 (Diaz-Meco et al., 1996; Sells et al., 1997; Guo et al., 1998). Por otra parte, la sobreexpresión del dominio de muerte/cremallera de leucina de PAR4 actúa de una manera negativa dominante para evitar la apoptosis inducida por PAR4 de longitud completa (Sells et al., 1997; Guo et al., 1998). El dominio de muerte/cremallera de leucina de PAR4 media en la interacción de PAR4 con otras proteínas reconociendo dos tipos diferentes de motivos: dedos de cinc de la proteína supresora del tumor de Wilms WT1 (Johnstone et al., 1996) y las isoformas atípicas de la proteína quinasa C (Díaz-Meco et al., 1996), y un dominio rico en arginina de la quinasa de tipo DAP (proteína asociada a la muerte) Dlk (Page et al., 1999). Entre estas interacciones, la unión de PAR4 a aPKC y la inhibición resultante de su actividad enzimática es de particular importancia funcional, porque se sabe que las aPKC desempeñan un papel clave en la supervivencia celular y se ha demostrado que su sobreexpresión abroga la capacidad de PAR4 para inducir la apoptosis (Díaz-Meco et al., 1996; Berra et al., 1997).

SLC/CCL21

La quimioquina SLC/CCL21 (también denominada SLC, CK\beta, 6Cquina y éxodo-2) es un miembro de la subfamilia de beta-quimioquinas CC. La SLC/CCL21 contiene las cuatro cisteínas conservadas características de las beta-quimioquinas, más dos cisteínas adicionales en su dominio carboxi-terminal inusualmente largo. El ADNc de SLC/CCL21 humano codifica una proteína precursora altamente básica de 134 restos aminoácidos con un péptido señal de 23 restos aminoácidos que se rompe para formar la proteína madura predicha de 111 restos aminoácidos. El ANDc de SLC/CCL21 de ratón codifica una proteína de 133 restos aminoácidos con un péptido señal de 23 restos que se rompe para generar la proteína madura de 110 restos. La SLC/CCL21 humana y de ratón están altamente conservadas, mostrando una coincidencia de secuencia de aminoácidos del 86%. El gen para la SLC/CCL21 humana se ha localizado en el cromosoma 9p13 en lugar del cromosoma 17, en el que se concentran los genes de muchas quimioquinas CC humanas. La localización del gen SLC/CCL21 está dentro de una región de aproximadamente 100 kb, al igual que el gen de MIP-3 beta/ELC/CCL19, otra quimioquina CC recientemente identificada. Se sabía que la SLC/CCL21 se expresa en gran medida en tejidos linfoides a nivel del ARNm y que es quimioatrayente para linfocitos T y B (Nagira, et al. (1997), J. Biol. Chem., 272:19518-19524; Hromas, et al. (1997), J. Immunol. 159:2554-2558; Hedrick, et al. (1997), J. Immunol. 159:1589-1593; Gunn, et al. (1998), Proc. Natl. Acad. Sci. 95:258-263). La SLC/CCL21 también induce la adhesión de linfocitos a la molécula de adhesión intracelular-1 y detiene las células rodantes (Campbell, et al. (1988), Science, 279:381-384). Todas las anteriores propiedades son coherentes con el papel de SLC/CCL21 para regular el tráfico de linfocitos a través de tejidos linfoides. A diferencia de la mayoría de las quimioquinas CC, la SLC/CCL21 no es quimiotáctica para monocitos. Sin embargo, se ha indicado que inhibe la formación de colonias de progenitores hematopoyéticos de una manera dependiente de la dosis (Hromas et al. (1997), J. Immunol., 159:2554-2558).

La quimioquina SLC/CCL21 es un ligando para el receptor de quimioquinas CCR7 (Rossi et al. (1997), J. Immunol. 158:1033; Yoshida et al. (1997), J. Biol. Chem. 272:13803; Yoshida et al. (1998), J. Biol. Chem., 273:7118; Campbell et al. (1998), J. Cell Biol., 141:,1053). El CCR7 se expresa sobre células T y células dendríticas (DC), lo cual es coherente con la acción quimiotáctica de SLC/CCL21 por linfocitos y por DC maduras. Tanto las células T CD4^{+} y CD8^{+} de memoria (CD45RO^{+}) e indiferenciadas (CD45RA^{+}) expresan el receptor CCR7 (Sallusto et al. (1999), Nature 401:708). Dentro de la población de células T de memoria, la expresión de CCR7 discrimina entre células T con función efectora que pueden migrar hacia tejidos inflamados (CCR7') y células T que requieren un estímulo secundario antes de mostrar funciones efectoras (CCR7') (Sallusto et al. (1999), Nature 401:708). A diferencia de la DC maduras, las DC inmaduras no expresan CCR7 ni responde a la acción quimiotáctica de CCL21 (Sallusto et al. (1998), Eur. J. Immunol., 28:2760; Dieu et al. (1998), J. Exp. Med. 188:373).

Una función clave de CCR7 y sus dos ligandos SLC/CCL21 y MIP3b/CCL19 se ve facilitada por el reclutamiento y la retención de células hacia órganos linfoides secundarios para estimular una eficaz exposición del antígeno a las células T. Ratones deficientes en CCR7 muestran órganos secundarios mal desarrollados y muestran una distribución irregular de linfocitos dentro de los nódulos linfáticos, los parches de Peyer y las cubiertas linfoides periarteriolares esplénicas (Forster et al. (1999), Cell, 99:23). Estos animales tienen respuestas de células T primarias gravemente alteradas debido en gran medida a la incapacidad de DC interdigitante para migrar hacia los nódulos linfáticos (Forster et al. (1999), Cell, 99:23). Los descubrimientos globales hasta la fecha apoyan la idea de que CCR7 y sus dos ligandos, CCL19 y CCL21, son reguladores clave de las respuestas de células T a través de su control de las interacciones de células T/DC. El CCR7 es una importante molécula reguladora con un papel instructivo para determinar la migración de células hacia órganos linfoides secundarios (Forster et al. (1999), Cell, 99:23; Nakano et al. (1998), Blood,
91:2886).

Sumario de la invención THAP1 (proteína asociada a la muerte-1)

En los últimos años, los inventores se han centrado en la caracterización molecular de nuevos genes expresados en las células endoteliales especializadas (HEVEC) de vénulas endoteliales superiores postcapilares (Girard y Springer, 1995a; Girard y Springer, 1995b; Girard et al., 1999). En la presente invención, indican el análisis de THAP1 (proteína asociada a la muerte-1), una proteína que se localiza hacia los PML-NB. La selección de dos híbridos de un banco de ADNc de HEVEC con un cebo de THAP1 conducen a la identificación de un compañero de interacción exclusivo, la proteína proapoptótica PAR4. También se ha descubierto que la PAR4 se acumula en los PML-NB, y el transporte dirigido del complejo THAP1/PAR4 hacia los PML-NB es mediado por PML. De manera similar a PAR4, THAP1 es un polipéptido proapoptótico. Su actividad proapoptótica requiere un nuevo motivo de proteína en la parte amino-terminal denominado dominio THAP. Juntos, estos resultados definen una nueva vía de PML-NB para la apoptosis que implica el complejo proapoptótico THAP1/PAR4.

La presente invención incluye genes, proteínas y vías biológicas implicados en la apoptosis. En algunas realizaciones, los genes, las proteínas y las vías descritos en la presente pueden utilizarse para el desarrollo de productos terapéuticos de polipéptidos, ácidos nucleicos o moléculas pequeñas.

La presente invención proporciona un nuevo motivo de proteína, el dominio THAP, que consiste en los aminoácidos 1-89 de SEQ ID NO:3. Los presentes inventores primero identificaron el dominio THAP como un motivo de proteína de 90 restos en la parte amino-terminal de THAP1 y que es esencial para la actividad proapoptótica de THAP1. La THAP (proteína asociada a la muerte-1), determinada por los presentes inventores, es un polipéptido proapoptótico que forma un complejo con la proteína proapoptótica PAR4 y se localiza en dominios subnucleares discretos conocidos como cuerpos nucleares PML. Sin embargo, el dominio THAP también define una nueva familia de proteínas, la familia THAP, y los inventores también proporcionan al menos doce miembros diferenciados en el genoma humano (THAP-0 a THAP11), todos los cuales contienen un dominio THAP (de forma típica 80-90 aminoácidos) en su parte amino-terminal. Por consiguiente, en la presente se proporcionan moléculas de ácidos nucleicos, incluyendo en particular las secuencias completas de ADNc, que codifican la THAP1, sus porciones que codifican el dominio THAP de THAP1 o sus polipéptidos homólogos, así como polipéptidos codificados por el gen THAP1. Por tanto, la invención también incluye ensayos de diagnóstico y de actividad, y usos en productos terapéuticos, para la proteína THAP1 o sus porciones, así como ensayos de selección de fármacos para identificar compuestos capaces de inhibir (o estimular) la actividad proapoptótica de THAP1.

En un ejemplo de un miembro de la familia THAP, se determina que THAP1 es un polipéptido inductor de la apoptosis expresado en células endoteliales humanas (HEVEC), que proporciona la caracterización de las secuencias de THAP requeridas para la actividad apoptótica en el polipéptido THAP1. En otros aspectos, la invención también se dirige a la interacción de THAP1 con la proteína proapoptótica PAR4 y con PML-NB, incluyendo métodos para modular las interacciones de THAP1/PAR4 para el tratamiento de una enfermedad. La invención también se refiere a la interacción entre PAR4 y PML-NB, a productos de diagnóstico para la detección de dicha interacción (o localización), y a la modulación de dichas interacciones para el tratamiento de una enfermedad.

Los compuestos que modulan las interacciones entres THAP1 y una molécula diana de la familia THAP, el dominio THAP o una molécula diana del dominio THAP, o una proteína PAR4 y PML-NB, pueden utilizarse para inhibir (o estimular) la apoptosis de diferentes tipos celulares en diversas enfermedades humanas. Por ejemplo, estos compuestos pueden utilizarse para inhibir o estimular la apoptosis de células endoteliales en enfermedades dependientes de la angiogénesis incluyendo, pero sin limitarse a cáncer, enfermedades cardiovasculares, enfermedades inflamatorias, y para inhibir la apoptosis de neuronas en trastornos neurodegenerativos agudos y crónicos incluyendo, pero sin limitarse a enfermedad de Alzheimer, de Parkinson y de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica, encefalitis de VIH, ictus, ataques epilépticos.

También son parte de la invención las sondas o los cebadores oligonucleotídicos que se hibridan específicamente con un ADN genómico o una secuencia de ADNc de THAP1, así como los métodos de amplificación y de detección de ADN que emplean dichas sondas y cebadores.

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Los fragmentos de THAP incluyen fragmentos codificados por ácidos nucleicos que comprenden al menos 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500 ó 1000 nucleótidos consecutivos de SEQ ID NO:160, o polipéptidos que comprenden al menos 8, 10, 12, 15; 20, 25, 30, 40, 50, 100, 150 ó 200 aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO:3.

Otro aspecto de la invención incluye vectores recombinantes que comprenden la secuencia de ácido nucleico descrita anteriormente, y en particular vectores recombinantes que comprenden una secuencia reguladora de THAP1 o una secuencia que codifica una proteína THAP1, un dominio THAP, fragmentos de THAP1, homólogos de THAP1, así como células hospedantes y animales no humanos transgénicos que comprenden dichas secuencias de aminoácidos o vectores recombinantes.

Otro aspecto de la invención se refiere a métodos para la selección de sustancias o moléculas que inhiben o aumentan la expresión del gen THAP1, así como métodos para la selección de sustancias o moléculas que interaccionan con y/o inhiben o aumentan la actividad de un polipéptido THAP1.

Según otro aspecto, la presente invención proporciona un medicamento que comprende una cantidad eficaz de THAP1, o su fragmento de unión a SLC/CCL21, junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los medicamentos descritos en la presente pueden ser útiles para el tratamiento y/o la profilaxis.

Relacionado con otro aspecto, la invención se refiere en particular al uso de THAP1, sus homólogos y sus fragmentos, o su fragmento de unión a SLC/CCL21, para la preparación de un medicamento como agente antiinflamatorio. El THAP1 y sus fragmentos serán útiles para el tratamiento de trastornos mediados por SLC/CCL21.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método de detección que comprende las etapas de proporcionar una molécula de unión a la quimioquina SLC/CCL21, que es THAP1, o su fragmento de unión a SLC/CCL21, poner en contacto la molécula THAP1 de unión a SLC/CCL21 con una muestra, y detectar una interacción de la molécula THAP1 de unión a SLC/CCL21 con la quimioquina SLC/CCL21 en la muestra.

En un ejemplo, la invención puede utilizarse para detectar la presencia de la quimioquina SLC/CCL21 en una muestra biológica. De manera útil, la molécula THAP1 de unión a SLC/CCL21 puede ser inmovilizada sobre un soporte sólido, por ejemplo como una fusión THAP1/Fc.

Según otro aspecto, la presente invención proporciona un método para inhibir la actividad de la quimioquina SLC/CCL21 en una muestra, comprendiendo dicho método poner en contacto la muestra con una cantidad eficaz de una molécula de unión a la quimioquina SLC/CCL21, que es una proteína THAP1 o su fragmento de unión a SLC/CCL21.

En otros aspectos, la invención proporciona una proteína THAP1 purificada, o su fragmento de unión a SLC/
CCL21, o una fusión de THAP1/Fc, para su uso en un método o en un medicamento como se describe en la presente; y un kit que comprende dicha proteína THAP1 purificada o su fragmento.

La invención también contempla el uso de fragmentos de la proteína THAP1, teniendo dichos fragmentos propiedades de unión a la quimioquina SLC/CCL21. Los fragmentos pueden ser péptidos derivados de la proteína. El uso de dichos péptidos puede ser preferido al uso de una proteína completa o de una parte sustancial de una proteína, por ejemplo debido a la inmunogenicidad reducida de un péptido comparado con una proteína. Estos péptidos pueden prepararse mediante una diversidad de técnicas, incluyendo técnicas de ADN recombinante y métodos químicos sintéticos.

También será evidente que las proteínas THAP para su uso en la invención pueden prepararse mediante una diversidad de formas, en particular como proteínas recombinantes en una diversidad de sistemas de expresión. Puede utilizarse cualquier sistema convencional, como sistemas de expresión de baculovirus o sistemas de expresión de líneas celulares de mamífero.

Otros aspectos de la invención se describen en los siguientes puntos:

1. Un método para identificar un compuesto de ensayo que modula las actividades mediadas por THAP (proteína asociada a la muerte), que comprende:

poner en contacto un polipéptido de la familia THAP, o su fragmento biológicamente activo, con un compuesto de ensayo, en el que dicho polipéptido de la familia THAP comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una coincidencia de aminoácidos del 70% con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3; y

determinar si dicho compuesto de ensayo modula selectivamente la actividad de dicho polipéptido de la familia THAP, o su fragmento biológicamente activo, en el que una determinación de que dicho compuesto de ensayo modula selectivamente la actividad de dicho polipéptido indica que dicho compuesto de ensayo es un modulador candidato de actividades mediadas por THAP.

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2. El método del punto 1, en el que dicha actividad mediada por THAP se selecciona del grupo que consiste en la interacción con una proteína diana de la familia THAP, la unión a un ácido nucleico, la unión a PAR-4 (respuesta a la apoptosis-4 de próstata), la unión a SLC (quimioquina linfoide secundaria), la unión a PML (proteína de la leucemia promielocítica), la unión a un polipéptido que se encuentra en PML-NB (cuerpos nucleares de proteína de la leucemia promielocítica), la localización hacia PML-NB, el transporte dirigido de una proteína diana de la familia THAP hacia PML-NB, y la inducción de la apoptosis.

3. El método del punto 2, en el que dicha actividad mediada por THAP es la unión a PAR-4.

4. El método del punto 2, en el que dicha actividad mediada por THAP es la unión a SLC.

5. El método del punto 2, en el que dicha actividad mediada por THAP es la inducción de la apoptosis.

6. El método del punto 2, en el que dicho ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:140-159.

7. El método del punto 1, en el que dicha coincidencia de aminoácidos se determina utilizando un algoritmo seleccionado del grupo que consiste en XBLAST (X-Basic Local Alignment Search Tool) con los parámetros puntuación = 50 y longitud de palabra = 3, BLAST con huecos (Basic Local Alignment Search Tool) con los parámetros por defecto de XBLAST, y BLAST con los parámetros por defecto de XBLAST.

8. Un polipéptido de dominio THAP seleccionado del grupo que consiste en los aminoácidos 1-89 de SEQ ID NO:3, u homólogos que tienen una coincidencia de aminoácidos de al menos 70% con éste, en el que dicho polipéptido de dominio THAP se une a un ácido nucleico.

9. El polipéptido de dominio THAP del punto 8, en el que dicha coincidencia de aminoácidos se determina utilizando un algoritmo seleccionado del grupo que consiste en XBLAST con los parámetros puntuación = 50 y longitud de palabra = 3, BLAST con huecos con los parámetros por defecto de XBLAST, y BLAST con los parámetros por defecto de XBLAST.

10. El polipéptido de dominio THAP del punto 8, en el que dicho ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:140-159.

11. Un ácido nucleico que codifica el polipéptido de dominio THAP del punto 8, o su complemento.

12. Un polipéptido de dominio de unión a PAR4 seleccionado del grupo que consiste en los aminoácidos 143-192 de SEQ ID NO:3, u homólogos que tienen una coincidencia de aminoácidos de al menos 70% con éste, en el que dicho polipéptido de dominio de unión a PAR4 se une a PAR4.

13. El polipéptido de dominio de unión a PAR4 del punto 12, en el que dicha coincidencia de aminoácidos se determina utilizando un algoritmo seleccionado del grupo que consiste en XBLAST con los parámetros puntuación = 50 y longitud de palabra = 3, BLAST con huecos con los parámetros por defecto de XBLAST, y BLAST con los parámetros por defecto de XBLAST.

14. Un ácido nucleico que codifica el polipéptido de dominio de unión a PAR4 del punto 12, o su complemento.

15. Un polipéptido de dominio de unión a SLC seleccionado del grupo que consiste en los aminoácidos 143-213 de SEQ ID NO:3, u homólogos que tienen una coincidencia de aminoácidos de al menos 70% con éste, en el que dicho polipéptido de dominio de unión a SLC se une a SLC.

16. El polipéptido de dominio de unión a SCL del punto 15, en el que dicha coincidencia de aminoácidos se determina utilizando un algoritmo seleccionado del grupo que consiste en XBLAST con los parámetros puntuación = 50 y longitud de palabra = 3, BLAST con huecos con los parámetros por defecto de XBLAST, y BLAST con los parámetros por defecto de XBLAST.

17. Un ácido nucleico que codifica el polipéptido de dominio de unión a SLC del punto 15, o su complemento.

18. Una proteína de fusión que comprende una región Fc de una inmunoglobulina condensada con un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los aminoácidos 143-213 de SEQ ID NO:3, y sus homólogos que tienen una coincidencia de aminoácidos de al menos 30%.

19. Una proteína THAP oligomérica que comprende una pluralidad de polipéptidos THAP, en la que cada polipéptido THAP se selecciona del grupo que consiste en los aminoácidos 143-213 de SEQ ID NO:3, u homólogos que tienen una coincidencia de aminoácidos de al menos 70% con éste.

20. Un medicamento que comprende una cantidad eficaz de un polipéptido de dominio de unión a SLC que consiste en los aminoácidos 143-213 de SEQ ID NO:3, u homólogos que tienen una coincidencia de aminoácidos de al menos 70% con éste, junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

21. Un polipéptido de dominio de dimerización de THAP, seleccionado del grupo que consiste en los aminoácidos 143-192 de SEQ ID NO:3, u homólogos que tienen una coincidencia de aminoácidos de al menos 70% con éste, en el que dicho polipéptido de dominio de dimerización de THAP se une a un polipéptido de la familia THAP.

22. El polipéptido de dominio de dimerización de THAP del punto 21, en el que dicha coincidencia de aminoácidos se determina utilizando un algoritmo seleccionado del grupo que consiste en XBLAST con los parámetros puntuación = 50 y longitud de palabra = 3, BLAST con huecos con los parámetros por defecto de XBLAST, y BLAST con los parámetros por defecto de XBLAST.

23. Un ácido nucleico que codifica el polipéptido de dominio de dimerización de THAP del punto 21, o su complemento.

24. Un vector de expresión que comprende un promotor unido operablemente a un ácido nucleico de uno cualquiera de los puntos 11, 14, 17 ó 23.

25. El vector de expresión del punto 24, en el que dicho promotor es un promotor que no está unido operablemente a dicho ácido nucleico en un genoma natural.

26. Una célula hospedante que comprende el vector de expresión de uno cualquiera de los puntos 24 ó 25.

27. Un método para identificar un inhibidor candidato de un polipéptido de la familia THAP, un inhibidor candidato de la apoptosis, o un compuesto candidato para el tratamiento de un trastorno proliferativo celular, comprendiendo dicho método:

poner en contacto un polipéptido de la familia THAP que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3, o un fragmento que comprende un tramo de al menos 6 aminoácidos contiguos de un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3, con un compuesto de ensayo; y

determinar si dicho compuesto se une selectivamente a dicho polipéptido, en el que una determinación de que dicho compuesto se une selectivamente a dicho polipéptido indica que dicho compuesto es un inhibidor candidato de un polipéptido de la familia THAP, un inhibidor candidato de la apoptosis, o un compuesto candidato para el tratamiento de un trastorno proliferativo celular.

28. Un método para identificar un inhibidor candidato de la apoptosis, un compuesto candidato para el tratamiento de un trastorno proliferativo celular, o un inhibidor candidato de un polipéptido de la familia THAP de SEQ ID NO:3 o un fragmento que comprende un tramo de al menos 6 aminoácidos contiguos de un polipéptido según SEQ ID NO:3, comprendiendo dicho método:

poner en contacto dicho polipéptido de la familia THAP con un compuesto de ensayo; y

determinar si dicho compuesto inhibe selectivamente al menos una actividad biológica seleccionada del grupo que consiste en la interacción con una proteína diana de la familia THAP, la unión a una secuencia de ácido nucleico, la unión a PAR-4, la unión a SLC, la unión a PML, la unión a un polipéptido que se encuentra en PML-NB, la localización hacia PML-NB, el transporte dirigido de una proteína diana de la familia THAP hacia PML-NB, y la inducción de la apoptosis, en el que una determinación de que dicho compuesto inhibe selectivamente al menos una de dichas actividades biológicas de dicho polipéptido indica que dicho compuesto es un inhibidor candidato de un polipéptido de la familia THAP, un inhibidor candidato de la apoptosis, o un compuesto candidato para el tratamiento de un trastorno proliferativo celular.

29. Un método para identificar un inhibidor candidato de la apoptosis, un compuesto candidato para el tratamiento de un trastorno proliferativo celular, o un inhibidor candidato de un polipéptido de la familia THAP de SEQ ID NO:3 o un fragmento que comprende un tramo de al menos 6 aminoácidos contiguos de un polipéptido según SEQ ID NO:3, comprendiendo dicho método:

poner en contacto una célula que comprende dicho polipéptido de la familia THAP con un compuesto de ensayo; y

\newpage

30. Un método para identificar un modulador candidato de la actividad de la familia THAP, comprendiendo dicho método:

proporcionar un polipéptido de la familia THAP de SEQ ID NO:3 o un fragmento que comprende un tramo de al menos 6 aminoácidos contiguos de un polipéptido según SEQ ID NO:3; y

proporcionar un polipéptido diana de la familia THAP o su fragmento; y

determinar si un compuesto de ensayo modula selectivamente la capacidad de dicho polipéptido de la familia THAP para unirse a dicho polipéptido diana de la familia THAP, en el que una determinación de que dicho compuesto de ensayo modula selectivamente la capacidad de dicho polipéptido de la familia THAP para unirse a dicho polipéptido diana de la familia THAP indica que dicho compuesto es un modulador candidato de la actividad de la familia THAP.

31. El método del punto 30, en el que dicho polipéptido de la familia THAP se proporciona por un primer vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido de la familia THAP de SEQ ID NO:3, o un fragmento que comprende un tramo contiguo de al menos 6 aminoácidos contiguos de un polipéptido según SEQ ID NO:3, y en el que dicho polipéptido diana de la familia THAP se proporciona por un segundo vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido diana de la familia THAP o su fragmento.

32. El método del punto 30, en el que dicha actividad de la familia THAP es una actividad de apoptosis.

33. El método del punto 30, en el que dicha proteína diana de la familia THAP es PAR-4.

34. El método del punto 30, en el que dicho polipéptido de la familia THAP es una proteína THAP1, THAP-2 o THAP-3, y dicha proteína diana de la familia THAP es PAR-4.

35. El método del punto 30, en el que dicha proteína diana de la familia THAP es SLC.

36. Un método para modular la apoptosis en una célula, que comprende modular la actividad de una proteína de la familia THAP.

37. El método del punto 36, en el que dicha proteína de la familia THAP comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3 o su fragmento biológicamente activo.

38. El método del punto 36, en el que la modulación de la actividad de una proteína de la familia THAP comprende modular la interacción de una proteína de la familia THAP y una proteína diana de la familia THAP.

39. El método del punto 36, en el que la modulación de la actividad de una proteína de la familia THAP comprende modular la interacción de una proteína de la familia THAP y una proteína PAR4.

40. Un método para identificar un activador candidato de un polipéptido de la familia THAP, un activador candidato de la apoptosis, o un compuesto candidato para el tratamiento de un trastorno proliferativo celular, comprendiendo dicho método:

poner en contacto un polipéptido de la familia THAP que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:3, o un fragmento que comprende un tramo de al menos 6 aminoácidos contiguos de un polipéptido que comprende aminoácidos de SEQ ID NO:3, con un compuesto de ensayo; y

determinar si dicho compuesto se une selectivamente a dicho polipéptido, en el que una determinación de que dicho compuesto se une selectivamente a dicho polipéptido indica que dicho compuesto es un activador candidato de un polipéptido de la familia THAP, un activador candidato de la apoptosis, o un compuesto candidato para el tratamiento de un trastorno proliferativo celular.

41. Un método para identificar un activador candidato de la apoptosis, un compuesto candidato para el tratamiento de un trastorno proliferativo celular, o un activador candidato de un polipéptido de la familia THAP de SEQ ID NO:3 o un fragmento que comprende un tramo de al menos 6 aminoácidos contiguos de un polipéptido según SEQ ID NO:3, comprendiendo dicho método:

determinar si dicho compuesto activa selectivamente al menos una actividad biológica seleccionada del grupo que consiste en la interacción con una proteína diana de la familia THAP, la unión a una secuencia de ácido nucleico, la unión a PAR-4, la unión a SLC, la unión a PML, la unión a un polipéptido que se encuentra en PML-NB, la localización hacia PML-NB, el transporte dirigido de una proteína diana de la familia THAP hacia PML-NB, y la inducción de la apoptosis, en el que una determinación de que dicho compuesto activa selectivamente al menos una de dichas actividades biológicas de dicho polipéptido indica que dicho compuesto es un activador candidato de un polipéptido de la familia THAP, un activador candidato de la apoptosis, o un compuesto candidato para el tratamiento de un trastorno proliferativo celular.

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42. Un método para identificar un activador candidato de la apoptosis, un compuesto candidato para el tratamiento de un trastorno proliferativo celular, o un activador candidato de un polipéptido de la familia THAP de SEQ ID NO:3 o un fragmento que comprende un tramo de al menos 6 aminoácidos contiguos de un polipéptido según SEQ ID NO:3, comprendiendo dicho método:

43. El uso de un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 143-213 de SEQ ID NO:3, o un homólogo que tienen una coincidencia de aminoácidos de al menos 70% con éste, para la preparación de un medicamento para mejorar un trastorno asociado con la actividad SLC en un individuo.

44. El uso del punto 43, en el que dicho polipéptido comprende una proteína de fusión que comprende una región Fc de una inmunoglobulina condensada con un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 143-213 de SEQ ID NO:3.

45. El uso del punto 43, en el que dicho polipéptido comprende una proteína THAP oligomérica que comprende una pluralidad de polipéptidos que comprenden cada uno una secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 143-213 de SEQ ID NO:3.

46. El uso de una proteína de la familia THAP que comprende una secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 143-213 de SEQ ID NO:3, o un homólogo que tienen una coincidencia de aminoácidos de al menos 70% con éste, para la preparación de un medicamento para modular la angiogénesis en un individuo.

47. El uso del punto 46, en el que dicha proteína de la familia THAP comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3 o su fragmento biológicamente activo.

48. El uso del punto 46, en el que dicha modulación es la inhibición.

49. El uso del punto 46, en el que dicha modulación es la inducción.

50. El uso de una proteína de la familia THAP que comprende una secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 143-213 de SEQ ID NO:3, o un homólogo que tienen una coincidencia de aminoácidos de al menos 70% con éste, para la preparación de un medicamento para reducir la muerte celular en un individuo.

51. El uso del punto 50, en el que dicha proteína de la familia THAP comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3 o su fragmento biológicamente activo.

52. El uso según el punto 50, en el que la actividad de dicha proteína de la familia THAP es inhibida en el SNC.

53. El uso de una proteína de la familia THAP que comprende una secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 143-213 de SEQ ID NO:3, o un homólogo que tienen una coincidencia de aminoácidos de al menos 70% con éste, para la preparación de un medicamento para reducir la inflamación o un trastorno inflamatorio en un individuo.

54. El uso del punto 53, en el que dicha proteína de la familia THAP comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3 o su fragmento biológicamente activo.

55. El uso de una proteína de la familia THAP que comprende una secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 143-213 de SEQ ID NO:3, o un homólogo que tienen una coincidencia de aminoácidos de al menos 70% con éste, para la preparación de un medicamento para reducir el alcance del cáncer en un individuo.

56. El uso del punto 55, en el que dicha proteína de la familia THAP comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3 o su fragmento biológicamente activo.

57. El uso del punto 55, en el que el aumento de la actividad de dicha proteína de la familia THAP que comprende una secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 143-213 de SEQ ID NO:3, o un homólogo que tienen una coincidencia de aminoácidos de al menos 70% con éste, induce la apoptosis, inhibe la división celular, inhibe el potencial metastásico, reduce la carga tumoral, aumenta la sensibilidad a quimioterapia o radioterapia, mata una célula de cáncer, inhibe el crecimiento de un célula de cáncer, mata una célula endotelial, inhibe el crecimiento de una célula endotelial, inhibe la angiogénesis, o induce la regresión tumoral.

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Breve descripción de los dibujos

La figura 1A ilustra un alineamiento de secuencias de aminoácidos de polipéptidos ortólogos de THAP1 humana (hTHAP1 (SEQ ID NO:3)) y THAP1 de ratón (mTHAP1 (SEQ ID NO:3)). Los restos aminoácidos idénticos se indican con un asterisco.

La figura 1B representa la estructura primaria del polipéptido THAP1 humano. Se indican las posiciones del dominio THAP, la región rica en prolina (PRO) y la secuencia de localización nuclear bipartita (NLS).

La figura 2 representa los resultados de un análisis de la transferencia Northern de la expresión de ARNm de THAP1 en 12 tejidos humanos. Cada carril contiene 2 \mug de ARN poli-A^{+} aislado de los tejidos humanos indicados. La transferencia se hibridó, bajo condiciones rigurosas, con una sonda de ADNc de THAP marcada con ^{32}P, y se expuso a -70ºC durante 72 horas.

La figura 3A ilustra la interacción entre THAP1 y PAR4 en un sistema de dos híbridos de levadura. En particular, la THAP1 se une a Par4 de tipo salvaje (Par4) y al dominio de muerte de Par4 que contiene la cremallera de leucina (Par4DD) (aminoácidos 250-342 de PAR4), pero no a un mutante de deleción de Par4 que carece del dominio de muerte (PAR4\Delta) (aminoácidos 1-276 de PAR4). Un (+) indica unión, mientras que un (-) indica carencia de unión.

La figura 3B muestra la unión de THAP1 marcada con ^{35}S-metionina traducida in vitro a un polipéptido de fusión de GST-Par4DD. La Par4DD se expresó como una proteína de fusión de GST y después se purificó en una matriz de afinidad de glutatión-Sepharose. El GST actuó como control negativo. La entrada representa 1/10 del material utilizado en el ensayo de unión.

La figura 4A ilustra la interacción entre PAR4 y varios mutantes de deleción de THAP in vitro e in vivo. Cada mutante de deleción THAP1 se ensayó para la unión a PAR o PAR4DD en un sistema de dos híbridos de levadura (cebo de dos híbridos), a PAR4DD en ensayos en matriz sólida de GST (in vitro) y a myc-Par4DD en células endoteliales humanas primarias (in vivo). Un (+) indica unión, mientras que un (-) indica carencia de unión.

La figura 4B muestra la unión de varios mutantes de deleción de THAP1 marcada con ^{35}S-metionina traducida in vitro a un polipéptido de fusión de GST-Par4DD. La Par4DD se expresó como una proteína de fusión de GST y después se purificó en una matriz de afinidad de glutatión-Sepharose. El GST actuó como control negativo. La entrada representa 1/10 del material utilizado en el ensayo de unión.

La figura 5A ilustra un alineamiento de secuencias de aminoácidos de ortólogos del dominio de unión a Par4 de THAP1 humana (SEQ ID NO:117) y THAP1 de ratón (SEQ ID NO:116) con los de la ZIP quinasa de ratón (SEQ ID NO:115), otro compañero de unión de Par4. También se indica un sitio de unión a Par4 consenso rico en arginina (SEQ ID NO:15) derivado de este alineamiento.

La figura 5B muestra la estructura primaria del polipéptido THAP1 de tipo salvaje y dos mutantes THAP1 (THAP1\Delta(QRCRR) y THAP1 RR/AA). El THAP1\Delta(QRCRR) es un mutante de deleción que tiene una deleción de aminoácidos en las posiciones 168-172 de THAP1 (SEQ ID NO:3), mientras que THAP RR/AA es un mutante que tiene las dos argininas colocadas en las posiciones de los aminoácidos 171 y 172 de THAP1 (SEQ ID NO:3) reemplazadas por alaninas. Se resumen los resultados obtenidos en el sistema de dos híbridos de levadura con los cebos de Par4 y Par4DD (cebos de dos híbridos), en los ensayos en matriz sólida de GST con GST-Par4DD (in vitro) y en el ensayo de interacción in vivo con myc-Par4DD en células endoteliales humanas primarias (in vivo).

La figura 6A es una gráfica que compara los niveles de apoptosis en células transfectadas con los vectores de expresión GFP-APSK1, GFP-Par4 o GFP-THAP1. La apoptosis se cuantifica mediante tinción con DAPI de los núcleos apoptóticos, 24 h después de la extracción de suero. Los valores son la media de tres experimentos independientes.

La figura 6B es una gráfica que compara los niveles de apoptosis en células transfectadas con los vectores de expresión GFP-APSK1 o GFP-THAP1. La apoptosis se cuantifica mediante tinción con DAPI de los núcleos apoptóticos, 24 h después de la adición de TNF-\alpha. Los valores son la media de tres experimentos independientes.

La figura 7A muestra la unión de THAP1 marcada con ^{35}S-metionina traducida in vitro (ts) o THAP1\DeltaTHAP (\Delta) a un polipéptido de fusión de GST-Par4DD. La Par4DD se expresó como una proteína de fusión de GST y después se purificó en una matriz de afinidad de glutatión-Sepharose. El GST actuó como control negativo. La entrada representa 1/10 del material utilizado en el ensayo de unión.

La figura 7B es una gráfica que compara la actividad proapoptótica de THAP1 con un mutante THAP1 que tiene su dominio THAP (aminoácidos 1-90 de SEQ ID NO:3) delecionado. El porcentaje de células apoptóticas en fibroblastos 3T3 de ratón que sobreexpresan GFP-ASPSK1 (control), GRP-THAP1 (THAP1) o GFP-THAP1\DeltaTHAP (THAP1\DeltaTHAP) se determinó contando los núcleos apoptóticos después de una tinción con DAPI. Los valores son la media de tres experimentos independientes.

La figura 8 muestra la estructura primaria de doce proteínas THAP humanas. El dominio THAP (color gris) está localizado en el amino-terminal de cada una de las doce proteínas THAP humanas. El cuadrado negro en THAP1, THAP2 y THAP3 indica una secuencia de localización nuclear, rica en restos básicos, que se conserva en las tres proteínas. Se indica el número de aminoácidos en cada proteína THAP; (*) indica que la proteína no es de longitud completa.

La figura 9A muestra un alineamiento de secuencias de aminoácidos del dominio THAP de THAP humana (hTHAP1, SEQ ID NO:123) con el dominio de unión a ADN de la transposasa del elemento P de Drosophila melanogaster (dmTransposasa, SEQ ID NO:124). Los restos idénticos están marcados dentro de los rectángulos negros y los restos conservados en cuadrados grises. También se muestra una secuencia consenso del dominio THAP (SEQ ID NO:125).

La figura 9B muestra un alineamiento de secuencias de aminoácidos de los dominios THAP de doce miembros de la familia THAP humana (HTHAP1, SEQ ID NO:126; hTHAP2, SEQ ID NO:131; hTHAP3, SEQ ID NO:127; hTHAP4, SEQ ID NO:130; hTHAP5, SEQ ID NO:128; hTHAP6, SEQ ID NO:135; hTHAP7, SEQ ID NO:133; hTRAP8, SEQ ID NO:129; hTHAP9, SEQ ID NO:134; hTHAP10, SEQ ID NO:137; HTHAP11, SEQ ID NO:136; hTHAP0, SEQ ID NO:132) con el dominio de unión a ADN de la transposasa del elemento P de Drosophila melanogaster (dmTransposasa, SEQ ID NO:138). Los restos conservados entre al menos siete de las trece secuencias se marcan dentro de rectángulos. Los rectángulos negros indican restos idénticos, mientras que los rectángulos grises muestran aminoácidos similares. Las líneas discontinuas representan huecos introducidos para alinear las secuencias. También se muestra una secuencia consenso del dominio THAP (SEQ ID NO:139).

La figura 9C muestra un alineamiento de secuencias de aminoácidos de 95 secuencias de dominios THAP diferenciadas, incluyendo hTHAP1 a hTHAP11 y hTHAP0 (SEQ ID NO:3-14, listados secuencialmente empezando desde arriba), con 83 dominios THAP de otras especies (SEQ ID NO:1-98, listados secuencialmente comenzando con la secuencia indicada como sTHAP1 y terminando con la secuencia indicada como ceNP_498747.1), que se identificaron realizando una selección en las basas de datos EST y GenBank genómica con secuencias THAP humanas. Los restos conservados en al menos 50% de las secuencias se indican dentro de rectángulos. Los rectángulos negros indican restos idénticos, mientras que los rectángulos grises muestran aminoácidos similares. Las líneas discontinuas representan huecos introducidos para alinear secuencias. Se indican las especies: Homo sapiens (h); Sus scrofa (s); Bos taurus (b); Mus musculus (m); Rattus norvegicus (r); Gallus gallus (g); Xenopus laevi (x); Danio rerio (z); Oryzias latipes (o); Drosophila melanogaster (dm); Anopheles gambiae (a); Bombyx mori (bm); Caenorhabditis.eligans (ce). También se muestra una secuencia consenso (SEQ ID NO:2). Los aminoácidos subrayados en la secuencia consenso son restos que están conservados en las 95 secuencias de THAP.

La figura 10A muestra un alineamiento de secuencias de aminoácidos de las secuencias de las proteínas THAP1 (SEQ ID NO:3), THAP2 (SEQ ID NO:4) y THAP3 (SEQ ID NO:5) humanas. Los restos conservados en al menos dos de las tres secuencias se indican dentro de rectángulos. Los rectángulos negros indican restos idénticos, mientras que los rectángulos grises muestran aminoácidos similares. Las líneas discontinuas representan huecos introducidos para alinear secuencias. Las regiones que se corresponden al dominio THAP, el dominio de unión a PAR4, y la señal de localización nuclear (NLS) también se indican.

La figura 10B muestra la estructura primaria de THAP1, THAP2 y THAP3 humanas y los resultados de interacciones de dos híbridos entre cada proteína THAP y Par4 o el dominio de muerte de Par4 (Par4DD) en el sistema de dos híbridos de levadura.

La figura 10C muestra la unión de THAP2 y THAP3 marcadas con ^{35}S-metionina traducidas in vitro al polipéptido de fusión GST-Par4DD. La Par4DD se expresó como una proteína de fusión de GST y después se purificó en una matriz de afinidad de glutatión-Sepharose. El GST actuó como control negativo. La entrada representa 1/10 del material utilizado en el ensayo de unión.

La figura 11A es una gráfica que compara los niveles de apoptosis en células transfectadas con los vectores de expresión GFP-APSK1, GFP-THAP2 o GFP-THAP3. La apoptosis se cuantifica mediante tinción con DAPI de los núcleos apoptóticos, 24 h después de la extracción de suero. Los valores son la media de dos experimentos representativos independientes.

La figura 11B es una gráfica que compara los niveles de apoptosis en células transfectadas con los vectores de expresión GFP-APSK1, GFP-THAP2 o GFP-THAP3. La apoptosis se cuantifica mediante tinción con DAPI de los núcleos apoptóticos, 24 h después de la adición de TNF\alpha. Los valores son la media de dos experimentos independientes.

La figura 12 ilustra los resultados obtenidos mediante la selección de diferentes mutantes de THAP1 en un sistema de dos híbridos de levadura con un cebo de SLC/CCL21. Se muestra la estructura primaria de cada mutante de deleción de THAP1 que se ensayó. Los 70 restos carboxi-terminales de THAP1 (aminoácidos 143-213) son suficientes para la unión a la quimioquina SLC/CCL21.

La figura 13 ilustra la interacción de THAP1 con SLC/CCL21 de tipo salvaje y con un mutante de SLC/CCL21 delecionado de la extensión carboxi-terminal básica (SLC/CCL21\DeltaCOOH). La interacción se analizó en el sistema de dos híbridos de levadura con un cebo de THAP1 e in vitro utilizando ensayos en matriz sólida de GST con GST-THAP1.

La figura 14 muestra micrografías de células endoteliales humanas primarias transfectadas con las construcciones de expresión GFP-THAP0, 1, 2, 3, 6, 7, 8, 10, 11 (fluorescencia verde). Para revelar la localización nuclear de las proteínas THAP humanas, los núcleos se contratiñeron con DAPI (azul). La barra es igual a \mum.

La figura 15A es un alineamiento estructural derivado del enhebrado entre el dominio THAP de THAP1 humana (THAP1) (aminoácidos 1-81 de SEQ ID NO:3) y el dominio de unión a ADN del receptor \beta tiroideo (NLLB) (SEQ ID NO:121). Los códigos de color son idénticos a los descritos en la figura 15D.

La figura 15B muestra un modelo de la estructura tridimensional del dominio THAP de la THAP1 humana basado en su homología con la estructura cristalográfica del receptor \beta tiroideo. Los códigos de color son idénticos a los descritos en la figura 15D.

La figura 15C muestra un modelo de la estructura tridimensional del dominio de unión a ADN de la transposasa de Drosophila (DmTRP) basado en su homología con la estructura cristalográfica del dominio de unión al ADN del receptor de glucocorticoides. Los códigos de color son idénticos a los descritos en la figura 15D.

La figura 15D es un alineamiento estructural derivado del enhebrado entre el dominio de unión a ADN de la transposasa de Drosophila melanogaster (DmTRP) (SEQ ID NO:120) y el dominio de unión a ADN del receptor de glucocorticoides (GLUA) (SEQ ID NO:122). Según las secuencias y estructuras de las figuras 15A-15C, los códigos de color son los siguientes: el marrón indica restos en \alpha-hélice; el índigo indica restos en cadena \beta; el rojo indica los ocho restos Cys conservados en NLLB y GLUA o los tres restos Cys comunes a -THAP1 y DmTRP; el magenta indica otros restos Cys en THAP1 o DmTRP; el cian indica los restos implicados en las redes de interacciones hidrófobas coloreadas en THAP1 o DmTRP.

La figura 16A ilustra los resultados obtenidos por la selección de varios mutantes de THAP1 diferentes en un sistema de dos híbridos de levadura con un cebo de THAP1. Se muestra la estructura primaria de cada mutante de deleción de THAP1 que se ensayó. Un (+) indica unión, mientras que un (-) indica carencia de unión.

La figura 16B muestra la unión de varios mutantes de deleción de THAP1 marcados con ^{35}S-metionina traducidos in vitro a un polipéptido de fusión de GST-THAP1. La THAP1 de tipo salvaje se expresó como una proteína de fusión de GST y después se purificó en una matriz de afinidad de glutatión-Sepharose. El GST actuó como control negativo. La entrada representa 1/10 del material utilizado en el ensayo de unión.

La figura 17A es un gel de agarosa que muestra dos fragmentos de ADNc de THAP1 diferenciados obtenidos mediante RT-PCR. Los dos ADNc de THAP1 diferenciados tienen una longitud de aproximadamente 400 y 600 nucleótidos.

La figura 17B muestra el fragmento de 400 nucleótidos que se corresponde con una isoforma cortada y empalmada de manera alternativa del ADNc de THAP1 humano que carece del exón 2 (nucleótidos 273-468 de SEQ ID NO:160).

La figura 17C es un análisis de la transferencia Western que muestra que la segunda isoforma de THAP1 humana (THAP1b) codifica una proteína THAP1 truncada (THAP1 C3) que carece del dominio amino-terminal de THAP.

La figura 18A muestra un sitio de unión a ADN específico reconocido por el dominio THAP de la THAP1 humana. El dominio THAP reconoce las secuencias diana de ADN GGGCAA o TGGCAA organizadas de manera preferente como repeticiones directas con un espaciamiento de 5 nucleótidos (DR-5). La secuencia consenso es 5'-GGGCAAnnnnnTGGCAA-3' (SEQ ID NO:149). El consenso DR-5 se generó mediante el examen de 9 ácidos nucleicos unidos por THAP1 (SEQ ID NO:140-148, comenzando secuencialmente desde arriba).

La figura 18B muestra un segundo sitio de unión a ADN específico reconocido por el dominio THAP de la THAP1 humana. El dominio THAP reconoce repeticiones invertidas con un espaciamiento de 11 nucleótidos (ER-11) que tienen una secuencia consenso 5'-TTGCCAnnnnnGGGCAA-3' (SEQ ID NO:159). El consenso ER-11 se generó mediante el examen de 9 ácidos nucleicos unidos por THAP1 (SEQ ID NO:150-158, comenzando secuencialmente desde arriba).

Descripción detallada de la invención Vías biológicas de THAP y PAR4

Como se mencionó anteriormente, los inventores han descubierto una nueva clase de proteínas implicadas en la apoptosis. Después, los inventores también han relacionado a un miembro de esta nueva clase con otra vía de la apoptosis (PAR4), y después han relacionado a ambas vías con los PML-NB. Además, los inventores también han relacionado ambas vías con las células endoteliales, proporcionando una gama de tratamientos terapéuticos nuevos y potencialmente selectivos. En particular, se ha descubierto que THAP1 (proteína asociada a la muerte-1) se localiza hacia los PML-NB. Además, la selección de dos híbridos de un banco de ADNc de HEVEC con el cebo de THAP1 conduce a la identificación de un compañero de interacción exclusivo, la proteína proapoptótica PAR4. Se ha descubierto que la PAR4 también se acumula en los PML-NB. El transporte dirigido del complejo THAP1/PAR4 a los PML-NB es mediado por PML. De manera similar al PAR4, la THAP1 tiene actividad proapoptótica. Esta actividad incluye un nuevo motivo en la parte amino-terminal denominado dominio THAP. Juntos, estos resultados definen una nueva vía de PML-NB para la apoptosis que implica al complejo proapoptótico de THAP1/PAR4.

Miembros de la familia THAP y sus usos

En la presente se describen polinucleótidos que codifican una familia de polipéptidos proapoptóticos THAP-0 a THAP11, y sus usos para la modulación de actividades relacionadas con la apoptosis y otras actividades mediadas por THAP. De manera específica, en la presente se proporciona THAP1, que forma un complejo con la proteína proapoptótica PAR4 y se localiza en dominios subnucleares discretos denominados cuerpos nucleares de PML. Además, los polipéptidos de la familia THAP pueden utilizarse para alterar o para modificar de otra forma la biodisponibilidad de SLC/CCL21 (SLC).

La presente invención también incluye un nuevo motivo de proteínas, el dominio THAP, que se encuentra en un dominio de 89 aminoácidos en la parte amino-terminal de THAP1, y que está implicado en la actividad proapoptótica de THAP1. El dominio THAP define una nueva familia de proteínas, la familia THAP, con al menos doce miembros diferenciados en el genoma humano (THAP-0 A THAP11), que contienen todos un dominio THAP en su parte amino-terminal. Por consiguiente, en la presente se describen moléculas de ácidos nucleicos, incluyendo secuencias genómicas y, en particular, secuencias de ADNc completas, que codifican miembros de la familia THAP, así como los correspondientes productos de la traducción, ácidos nucleicos que codifican dominios THAP, sus homólogos, ácidos nucleicos que codifican al menos 10, 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100, 150 ó 200 aminoácidos consecutivos, hasta el punto de que dicho tramo es coherente con la SEQ ID NO: particular, de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:160-175.

La THAP1 se ha identificado basándose en su expresión en HEV, vénulas postcapilares especializadas que se encuentran en tejidos linfoides y tejidos no linfoides durante enfermedades inflamatorias crónicas que soportan un alto nivel de extravasación de linfocitos desde la sangre. Un elemento importante en la clonación de ADNc de THAP1 de HEVEC fue el desarrollo de protocolos para obtener ARN de HEVEC, puesto que las HEVEC no son capaces de mantener su fenotipo fuera de su medio nativo durante más de unas pocas horas. Se desarrolló un protocolo en el que se obtiene el ARN total de HEVEC recién purificadas de amígdalas humanas. Las HEVEC muy purificadas se obtuvieron mediante una combinación de procedimientos mecánicos y enzimáticos, reducción inmunomagnética y selección positiva. Las amígdalas se picaron finamente con tijeras sobre un tamiz de acero, se digirieron con una mezcla de enzimas de colagenasa/dispasa, y las células contaminadas no deseadas entonces se retiraron utilizando reducción inmunomagnética. Entonces se seleccionaron las HEVEC mediante selección positiva inmunomagnética con esferas magnéticas conjugadas con el anticuerpo específico de HEV MECA-79. A partir de estas HEVEC, que eran 98% positivas a MECA-79, se empleó 1 \mug de ARN total para generar ADNc de longitud completa para la clonación de ADNc de THAP1 y el análisis de RT-PCR.

Tal como se emplean en la presente, las expresiones "ácidos nucleicos" y "molécula de ácido nucleico" incluyen moléculas de ADN (por ejemplo, ADNc o ADN genómico) y moléculas de ARN (por ejemplo, ARNm) y análogos del ADN o ARN generados utilizando análogos de nucleótidos. La molécula de ácido nucleico puede ser monocatenaria o bicatenaria, pero preferiblemente es ADN bicatenario. En la presente memoria, la expresión "secuencia de nucleótidos" puede emplearse para denominar indistintamente un polinucleótido o un ácido nucleico. Más concretamente, la expresión "secuencia de nucleótidos" incluye el material nucleico en sí mismo y, por tanto, no está restringida a la información de la secuencia (es decir, la sucesión de letras elegidas entre las cuatro letras de las bases) que caracteriza bioquímicamente una molécula de ARN o ARN específica. Además, en la presente se utilizan las expresiones "ácidos nucleicos", "oligonucleótidos" y "polinucleótidos" de manera intercambiable.

Una molécula de ácido nucleico "aislada" es aquella que está separada de otras moléculas de ácidos nucleicos que están presentes en la fuente natural del ácido nucleico. Preferiblemente, un ácido nucleico "aislado" está exento de secuencias que flanquean al ácido nucleico (es decir, las secuencias en los extremos 5' y 3' del ácido nucleico) en la naturaleza en el ADN genómico del organismo del cual deriva el ácido nucleico. Por ejemplo, en diversas realizaciones, la molécula de ácido nucleico de la familia THAP aislada puede contener menos de aproximadamente 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb o 0,1 kb de secuencias de nucleótidos que flanquean a la molécula de ácido nucleico en la naturaleza en el ADN genómico de la célula de la cual se deriva el ácido nucleico. Además, una molécula de ácido nucleico "aislada", como una molécula de ADNc, puede estar sustancialmente exenta de otro material celular, o del medio de cultivo cuando se produce mediante técnicas recombinantes, o sustancialmente exenta de precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetiza de modo químico. Una molécula de ácido nucleico descrita en la presente, por ejemplo una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:160-175, o una porción de ésta, puede aislarse utilizando técnicas de biología molecular convencionales y la información de la secuencia proporcionada en la presente. Utilizando toda o una porción de la secuencia del ácido nucleico de SEQ ID NO:160-175 como sonda de hibridación, pueden aislarse moléculas de ácidos nucleicos de la familia THAP empleando técnicas de hibridación y clonación convencionales (por ejemplo, como se describe en Sambrook, J., Fritsh, E. F., y Maniatis, T., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2ª, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989).

Además, una molécula de ácido nucleico que incluya toda o una porción de, por ejemplo, SEQ ID NO:160-175, puede aislarse mediante la reacción en cadena de polimerasa (PCR) utilizando cebadores oligonucleotídicos sintéticos diseñados basándose en la secuencia de SEQ ID NO:160-175.

Un ácido nucleico de la invención puede amplificarse utilizando ADNc, ARNm o, como alternativa, ADN genómico como molde, y cebadores oligonucleotídicos apropiados según las técnicas de amplificación de PCR convencionales. El ácido nucleico amplificado de esta manera puede clonarse en un vector apropiado y caracterizarse mediante el análisis de la secuencia de ADN. Además, los oligonucleótidos que se corresponden con las secuencias de nucleótidos de la familia THAP puede prepararse mediante técnicas sintéticas convencionales, por ejemplo utilizando un sintetizador de ADN automático.

Tal como se emplea en la presente, la expresión "se hibrida con" describe condiciones para una hibridación de rigurosidad moderada o de rigurosidad alta, preferiblemente cuando las condiciones de hibridación y de lavado permiten que las secuencias de nucleótidos sean al menos 60% homólogas entre sí para permanecer hibridadas entre sí. Preferiblemente, las condiciones son tales que las secuencias que son al menos 70%, más preferiblemente al menos aproximadamente 80%, aún más preferiblemente al menos aproximadamente 85%, 90%, 95% o 98% homólogas entre sí, permanecen hibridadas entre sí de forma típica. Las condiciones rigurosas son conocidas por los expertos en la técnica y pueden encontrarse en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Un ejemplo preferido no limitante de condiciones de hibridación rigurosas son las siguientes: la etapa de hibridación se realiza a 65ºC en presencia de 6 x tampón SSC, 5 x disolución de Denhardt, SDS al 0,5% y ADN de esperma de salmón 100 \mum/ml. Tras la etapa de hibridación se producen cuatro etapas de lavado:

- dos lavados durante 5 min, preferiblemente a 65ºC en 2 x tampón SSC y SDS al 0,1%;

- un lavado durante 30 min, preferiblemente a 65ºC en 2 x tampón SSC y SDS al 0,1%;

- un lavado durante 10 min, preferiblemente a 65ºC en 0,1 x tampón SSC y SDS al 0,1%;

siendo estas condiciones de hibridación adecuadas para una molécula de ácido nucleico con una longitud de aproximadamente 20 nucleótidos. Se apreciará que las condiciones de hibridación descritas anteriormente se adaptarán según la longitud del ácido nucleico deseado, siguiendo técnicas muy conocidas por los expertos en la técnica, por ejemplo pueden adaptarse según las indicaciones descritas en Hames B.D. y Higgins S.J. (1985), Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach, Hames y Higgins ed., IRL Press, Oxford; y Current Protocols in Molecular Biolog (supra). Preferiblemente, una molécula de ácido nucleico aislada de la invención que se hibrida bajo condiciones rigurosas con una secuencia de SEQ ID NO:160-175 se corresponde con una molécula de ácido nucleico natural. Tal como se emplea en la presente, una molécula de ácido nucleico "natural" se refiere a una molécula de ARN o ADN que tiene una secuencia de nucleótidos que aparece en la naturaleza (por ejemplo, codifica una proteína
natural).

Para determinar el porcentaje de homología de dos secuencias de aminoácidos o de dos ácidos nucleicos, las secuencias se alinean para lograr una comparación óptima (por ejemplo, pueden introducirse huecos en la secuencia de una primera secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico para un alineamiento óptimo con una segunda secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico, y las secuencias no homólogas pueden no tomarse en cuenta para la comparación). En una realización preferida, la longitud de una secuencia de referencia alineada para la comparación es al menos 30%, preferiblemente al menos 40%, más preferiblemente al menos 50%, aún más preferiblemente al menos 60%, y aún más preferiblemente al menos 70%, 80%, 90% o 95% de la longitud de la secuencia de referencia (por ejemplo, cuando se alinea una segunda secuencia, por ejemplo con una secuencia de aminoácidos de THAP1 de SEQ ID NO:3 que tiene 213 restos aminoácidos, al menos 50, preferiblemente al menos 100, más preferiblemente al menos 200 restos aminoácidos, o cuando se alinea una segunda secuencia con la secuencia de ADNc de THAP1 de SEQ ID NO:160 que tiene 2173 nucleótidos o los nucleótidos 202-835 que codifican los aminoácidos de la proteína THAP1, preferiblemente al menos 100, preferiblemente al menos 200, más preferiblemente al menos 300, aún más preferiblemente al menos 400, y aún más preferiblemente al menos 500, 600, al menos 700, al menos 800, al menos 900, al menos 1000, al menos 1200, al menos 1400, al menos 1600, al menos 1800, o al menos 2000 nucleótidos). Los restos aminoácidos o los nucleótidos en las correspondientes posiciones de aminoácidos o posiciones de nucleótidos entonces se comparan. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo resto aminoácido o nucleótido que en la correspondiente posición en la segunda secuencia, entonces las moléculas son homólogas en esas posiciones (es decir, tal como se emplea en la presente, la "coincidencia" de aminoácidos o ácidos nucleicos es equivalente a la "homología" de aminoácidos o ácidos nucleicos). El porcentaje de homología entre dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, % de homología = número (nº) de posiciones idénticas/número total (nº) de posiciones 100).

La comparación de las secuencias y la determinación del porcentaje de homología entre dos secuencias puede realizarse utilizando un algoritmo matemático. Un ejemplo preferido no limitante de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de secuencias es el algoritmo de Karlin y Altschul (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:2264-2268, modificado como en Karlin y Altschul (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-5877. Este algoritmo se incorpora en los programas NBLAST y XBLAST (versión 2.0) de Altschul, et al. (1990), J. Mol. Biol., 215:403-410. Pueden realizarse búsquedas de nucleótidos BLAST con el programa NBLAST, puntuación = 100, longitud de palabra = 12, para obtener secuencias de nucleótidos homólogas a las moléculas de ácidos nucleicos de la familia THAP de la invención. Las búsquedas de proteínas BLAST pueden realizarse con el programa XBLAST, puntuación = 50, longitud de palabra = 3, para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a las moléculas de proteínas de la familia THAP de la invención. Para obtener alineamientos con huecos para comparaciones, puede utilizarse BLAST con huecos como se describe en Altschul et al. (1997), Nucleic Acids Research, 25(17):3389-3402. Cuando se utiliza BLAST y BLAST con huecos, pueden utilizarse los parámetros por defecto de los respectivos programas (por ejemplo, XBLAST y NBLAST) (véase, www.ncbi.nlm.nih.gov). Otro ejemplo preferido no limitante de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de secuencias es el algoritmo de Myers y Miller, CABIOS (1989). Este algoritmo se incorpora en el programa ALIGN (versión 2.0), que es parte del paquete informático de alineamiento de secuencias GCG. Cuando se utiliza el programa ALIGN para comparar secuencias de aminoácidos puede utilizarse una tabla de pesos de restos PAM120, una penalización de longitud de hueco de 12, y una penalización de hueco de 4.

El término "polipéptido" se refiere a un polímero de aminoácidos independientemente de la longitud del polímero; por tanto, dentro de la definición de polipéptido se incluyen los péptidos, los oligopéptidos y las proteínas. Además este término no especifica ni excluye las modificaciones tras la expresión de los polipéptidos, por ejemplo los polipéptidos que incluyen la unión covalente de grupos glicosilo, grupos acetilo, grupos fosfato, grupos lipídicos y similares se incluyen expresamente en el término polipéptido. También se incluyen dentro de la definición los polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (incluyendo, por ejemplo, aminoácidos no naturales, aminoácidos que sólo se encuentran en la naturaleza en un sistema biológico no relacionado, aminoácidos modificados procedentes de sistemas de mamífero, etc.), polipéptidos con enlaces sustituidos, así como otras modificaciones conocidas en la técnica, tanto naturales como no naturales.

Una proteína "aislada" o "purificada", o su porción biológicamente activa, está sustancialmente exenta de material celular u otras proteínas contaminantes procedentes de la fuente celular o tisular de la cual se deriva el polipéptido THAP1, o su fragmento biológicamente activo o su homólogo, o está sustancialmente exenta de precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetiza de modo químico. La expresión "sustancialmente exento de material celular" incluye preparaciones de una proteína según la invención (es decir, un polipéptido THAP1 o su fragmento biológicamente activo o su homólogo) en la que la proteína está separada de los componentes celulares de las células de las cuales se aísla o se produce de manera recombinante. En una realización, la expresión "sustancialmente exento de material celular" incluye preparaciones de una proteína según la invención que tienen menos de aproximadamente 30% (en peso seco) de proteína diferente de la proteína de la familia THAP (también denominada en la presente "proteína contaminante"), más preferiblemente menos de aproximadamente 20% de una proteína diferente de la proteína según la invención, aún más preferiblemente menos de aproximadamente 10% de una proteína diferente de la proteína según la invención, y lo más preferiblemente menos de aproximadamente 5% de una proteína diferente de la proteína según la invención. Cuando la proteína según la invención o su porción biológicamente activa se produce de modo recombinante, preferiblemente también está sustancialmente exenta de medio de cultivo, es decir, el medio de cultivo representa menos de aproximadamente 20%, más preferiblemente menos de aproximadamente 10%, y lo más preferiblemente menos de aproximadamente 5% del volumen de la preparación de proteína.

La expresión "sustancialmente exento de precursores químicos u otros productos químicos" incluyen preparaciones de un polipéptido THAP1, o su fragmento biológicamente activo o su homólogo, en la que la proteína está separada de los precursores químicos u otros productos químicos que están implicados en la síntesis de la proteína. En una realización, la expresión "sustancialmente exento de precursores químicos u otros productos químicos" incluye preparaciones de una proteína THAP1 que tiene menos de aproximadamente 30% (en peso seco) de precursores químicos o de productos químicos que no pertenecen a la familia THAP, más preferiblemente menos de aproximadamente 20% de precursores químicos o de productos químicos que no pertenecen a la familia THAP ni al domino THAP, aún más preferiblemente menos de aproximadamente 10% de precursores químicos o de productos químicos que no pertenecen a la familia THAP ni al domino THAP, y lo más preferiblemente menos de aproximadamente 5% de precursores químicos o de productos químicos que no pertenecen a la familia THAP ni al domino THAP.

La expresión "polipéptido recombinante" se emplea en la presente para indicar polipéptidos que se han diseñado artificialmente y que comprenden al menos dos secuencias polipeptídicas que no se encuentran como secuencias polipeptídicas contiguas en su medio natural inicial, o se refieren a polipéptidos que se han expresado a partir de un polinucleótido recombinante.

Por consiguiente, otro aspecto de la invención se refiere a anticuerpos anti-THAP1. El término "anticuerpo", tal como se emplea en la presente, se refiere a moléculas de inmunoglobulina y porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina, es decir, moléculas que contienen un sitio de unión al antígeno que se une específicamente (inmunorreacciona) con un antígeno, como un polipéptido de la familia THAP o de dominio THAP, o su fragmento biológicamente activo o su homólogo. Los ejemplos de porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulinas incluyen fragmentos F(ab) y F(ab')_{2} que pueden generarse tratando el anticuerpo con una enzima, como pepsina. La invención proporciona anticuerpos policlonales y monoclonales que se unen con un polipéptido THAP1, o su fragmento biológicamente activo o su homólogo. La expresión "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpo monoclonal", tal como se emplea en la presente, se refiere a una población de moléculas de anticuerpo que contiene sólo una especie de un sitio de unión al antígeno que es capaz de inmunorreaccionar con un epitopo particular de un polipéptido THAP1. Por tanto, una composición de anticuerpo monoclonal muestra, de forma típica, una única afinidad de unión por una proteína THAP1 particular con la que inmunorreacciona.

PAR4

Como se mencionó anteriormente, la proteína de respuesta a la apoptosis-4 de próstata (PAR4) es una proteína de 38 kDa identificada originariamente como el producto de un gen específicamente sobrerregulado en células de tumor de próstata que están sufriendo apoptosis (para un informe, véase Rangnekar, 1998; Mattson et al., 1999). Para las secuencias de ácidos nucleicos y de aminoácidos de PAR4, véase Johnstone et al., Mol. Cell. Biol., 16 (12), 6945-6956 (1996); y GenBank nº de registro U63809 (SEQ ID NO:118).

Tal como se emplea de manera intercambiable en la presente, una "actividad PAR4", una "actividad biológica de una PAR4" o una "actividad funcional de una PAR4" se refieren a una actividad ejercida por una molécula de proteína, de polipéptido o de ácido nucleico PAR4 determinada in vivo o in vitro, según técnicas convencionales. En una realización, una actividad PAR4 es una actividad directa, como una asociación con una molécula diana de PAR4 o, lo más preferiblemente, una actividad de inducción de la apoptosis, o de inhibición de la proliferación celular o del ciclo celular. Tal como se emplea en la presente, una "molécula diana" es una molécula con la que se une o interacciona una proteína PAR4 en la naturaleza, de forma que se logra una función mediada por PAR4. Un ejemplo de una molécula diana de PAR4 es una proteína de la familia THAP, como THAP1 o THAP2, o una proteína de PML-NB. Una molécula diana de PAR4 puede ser una proteína o un polipéptido de PAR4 o una molécula que no es PAR4. Por ejemplo, una molécula diana de PAR4 puede ser una molécula de proteína que no es PAR4. Como alternativa, una actividad PAR4 es una actividad indirecta, como una actividad mediada por la interacción de la proteína PAR4 con una molécula diana de PAR4 de forma que la molécula diana modula una actividad celular corriente abajo (por ejemplo, la interacción de una molécula de PAR4 con una molécula diana de PAR4 puede modular la actividad de esa molécula diana sobre una vía de señalización intracelular).

La unión o la interacción con una molécula diana de PAR4 (como THAP1/PAR4 descrita en la presente) o con otras dianas puede detectarse utilizando, por ejemplo, un ensayo basado en dos híbridos en levadura para encontrar fármacos que alteren la interacción del cebo de PAR4 con la presa diana (por ejemplo, PAR4), o un ensayo de interacción in vitro con PAR4 recombinante y proteínas diana (por ejemplo THAP1 y PAR4).

SLC/CCL21 (SLC) Papeles biológicos de SLC

Las señales que median en la infiltración de células T durante las enfermedades autoinmunológicas de células T no están bien entendidas. La SLC/CCL21 (SEQ ID NO:119) es muy potente y muy específica para atraer la migración de células T. En un primer momento se pensó que se expresaba sólo en órganos linfoides secundarios, dirigiendo las células T indiferenciadas hacia áreas de presentación de antígenos. Sin embargo, utilizando la inmunohistología se descubrió que la expresión de CCL21 estaba muy inducida en células endoteliales de enfermedades de la piel infiltrantes autoinmunológicas de células T (Christopherson et al. (2002), Blood, publicación electrónica anterior a la publicación impresa). En estas enfermedades de la piel de células T ninguna otra quimioquina de células T es inducida sistemáticamente. También se descubrió que el receptor para CCL21, CCR7, se expresaba en gran medida en la células T infiltrantes, la mayoría de las cuales expresa el fenotipo CD45Ro de memoria. Por tanto, las células endoteliales de vénulas inflamadas que expresan SLC/CCL21 en enfermedades de la piel autoinmunológicas infiltrantes de células T desempeñan un papel clave en la regulación de la migración de células T hacia esos tejidos.

Existe una serie de enfermedades autoinmunológicas diferentes en las que la expresión inducida de SLC/CCL21 en células endoteliales puede provocar el reclutamiento anómalo de células T desde la circulación hacia sitios de inflamación patológica. Por ejemplo, la quimioquina SLC/CCL21 parece ser importante para la infiltración aberrante de células T en la encefalomielitis autoinmunológica experimental (EAE), un modelo animal para la esclerosis múltiple (Alt et al. (2002), Eur. J. Immunol., 32:2133-2144). La migración de células T autoagresivas a través de la barrera hematoencefálica (BBB) está implicada críticamente en el inicio de la EAE. Se sugirió la implicación directa de quimioquinas en este proceso por la observación de que es necesaria la señalización mediada por proteína G para estimular la potenciación de la adhesión de células T encefalitogénicas sobre el endotelio de BBB in vivo. Una búsqueda de quimioquinas presentes en la BBB, mediante hibridaciones in situ e inmunohistoquímica, reveló la expresión de las quimioquinas linfoides CCL19/ECL y CCL21/SLC en vénulas rodeadas de células inflamatorias (Alt et al. (2002), Eur. J. Immunol., 32:2133-2144). Su expresión tiene su paralelo en la presencia de su receptor común CCR7 en células inflamatorias en secciones del cerebro y de la médula espinal de ratones afectados de EAE. Las células T encefalitogénicas muestran la expresión sobre la superficie de CCR7 y presentan quimiotaxis específica hacia CCL19 o CCL21 de una manera dependiente de la concentración y de una manera sensible a la toxina pertussis, comparable a los linfocitos indiferenciados in vitro. Ensayos de unión sobre secciones congeladas de cerebros EAE mostraron una implicación funcional de CCL19 y CCL21 en la potenciación de la adhesión de linfocitos T encefalitogénicos a vénulas inflamadas en el cerebro (Alt et al. (2002), Eur. J. Immunol., 32:2133-2144). Tomados conjuntamente, estos datos sugieren que las quimioquinas linfoides CCL19 y CCL21, además de regular el transporte de linfocitos hacia tejido linfoide secundario, están implicados en la migración de linfocitos T hacia el sistema nervioso central inmunoprivilegiado durante la inmunovigilancia y la inflamación crónica.

Otras enfermedades en las que se ha observado la expresión inducida de SLC/CCL21 en células endoteliales venulares incluyen la artritis reumatoide (Page et al. (2002), J. Immunol., 168:5333-5341) y la diabetes autoinmunológica experimental (Hjelmstrom et al. (2000), Am. J. Path., 156:1133-1138). Por tanto, la quimioquina SLC/CCL21 puede ser una importante diana farmacológica en enfermedades autoinmunológicas de células T. Los inhibidores de SLC/CCL21 pueden ser agente eficaces para tratar estas enfermedades infiltrantes de células T interfiriendo con el reclutamiento anómalo de células T desde la circulación hacia sitios de inflamación patológica por células endoteliales que expresan SLC/CCL21. La reducción en la migración de células T hacia tejidos implicados reduciría los daños infligidos por células T que se observan en estas enfermedades.

La formación de tejido linfoide ectópico es una características de muchas enfermedades inflamatorias crónicas, incluyendo la artritis reumatoide, las enfermedades del intestino inflamatorias (enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa), diabetes autoinmunológica, enfermedades de la piel inflamatorias crónicas (liquen plano, psoriasis, ...), tiroiditis de Hashimoto, síndrome de Sjogren, linfomas gástricos y enfermedad hepática inflamatoria crónica (Girard y Springer (1995), Immunol. Today, 16:449-457; Takemura et al. (2001), J. Immunol., 167:1072-1080; Grant et al. (2002), Am. J. Pathol., 2002 160:1445-1455; Yoneyama et al. (2001), J. Exp. Med., 193:35-49).

Se ha demostrado que la expresión ectópica de SLC/CCL21 induce la neogénesis linfoide, en enfermedades inflamatorias de ratón y humanas. En ratones, se ha descubierto que la expresión transgénica de SLC/CCL21 en el páncreas (Fan et al. (2000), J. Immunol., 164:3955-3959; Chen et al. (2002), J. Immunol., 168:1001-1008; Luther et al. (2002), J. Immunol., 169:424-433), un tejido no linfoide, es suficiente para el desarrollo y la organización de tejido linfoide ectópico a través del reclutamiento diferencial de linfocitos T y B y la inducción de vénulas endoteliales superiores, vasos sanguíneos especializados para la migración de linfocitos (Girard y Springer (1995), Immunol. Today, 16:449-457). En el ser humano, se ha demostrado que la expresión hepática de SLC/CCL21 estimula el desarrollo de vénulas endoteliales superiores y tejido linfoide asociado a portales en la enfermedad hepática inflamatoria crónica (Grant et al. (2002), Am. J. Pathol., 2002 160:1445-1455; Yoneyama et al. (2001), J. Exp. Med., 193:35-49). La enfermedad hepática inflamatoria crónica colangitis esclerosante primaria (PSC) está asociada con la inflamación portal y con el desarrollo de tejido neolinfoide en el hígado. Se ha indicado que más del 70% de pacientes con PSC tienen una historia de enfermedad del intestino inflamatoria y una fuerte inducción de SLC/CCL21 sobre el endotelio vascular CD34(+) en tejido linfoide asociado a portales en PSC (Grant et al. (2002), Am. J. Pathol., 2002, 160:1445-1455). Por contraste, el CCL21 está ausente en el endotelio de vasos linfáticos LYVE-1(+). Los linfocitos intrahepáticos en PSC incluyen una población de células T CCR7(+), de las cuales sólo la mitad expresa CD45RA y responden al CCL21 en ensayos de migración. La expresión de CCL21 en asociación con la molécula de adhesión celular adresina mucosal-1 en tractos portales en PSC puede estimular el reclutamiento y la retención de linfocitos mucosales CCR7(+), que conduce al establecimiento de la inflamación portal crónica y del tejido linfoide asociado a portales crónico. Estos descubrimientos están apoyados por estudios en un modelo animal de inflamación hepática crónica, que han demostrado que anticuerpos anti-SLC/CCL21 evitan el desarrollo de vénulas endoteliales superiores y de tejido linfoide asociado a portales (Yoneyama et al. (2001), J. Exp. Med., 193:35-49).

La inducción de la quimioquina SLC/CCL21 en un sitio de inflamación puede convertir la lesión de un estado agudo a un estado crónico con el correspondiente desarrollo de tejido linfoide ectópico. Por tanto, el bloqueo de la actividad de la quimioquina SLC/CCL21 en las enfermedades inflamatorias crónicas puede tener un significativo valor terapéutico.

Tal como se emplea en la presente, "SLC/CCL21" y "SLC" son sinónimos.

Miembros de la familia THAP que comprenden un dominio THAP

Basándose en la aclaración de una actividad biológica de la proteína THAP1 en la apoptosis descrita en la presente, los inventores han identificado y posteriormente han caracterizado un nuevo motivo de proteína, denominado en la presente dominio THAP. El dominio THAP ha sido identificado por los presentes inventores en varios otros polipéptidos, como se describirá en la presente. El conocimiento de la estructura y de la función del dominio THAP permite realizar ensayos de selección que pueden utilizarse para la preparación o la selección de medicamentos capaces de modular la interacción con una molécula diana de la familia THAP, de modular el ciclo celular y la proliferación celular, de inducir la apoptosis o de potenciar o participar en la inducción de la apoptosis.

Tal como se emplea de manera intercambiable en la presente, una proteína o un polipéptido de la familia THAP, o un miembro de la familia THAP, se refiere a un polipéptido THAP1 que tiene un dominio THAP como se describe en la presente. Tal como se menciona, los inventores han proporcionado varios miembros específicos de la familia THAP. Por consiguiente se describen otras proteínas o polipéptidos THA, como un polipéptido THAP-0, THAP1, THAP-2, THAP-3, THAP-4, THAP-5, THAP-6, THAP-7, THAP-8, THAP-9, THAP10 o THAP11.

Tal como se emplea de manera intercambiable en la presente, una "actividad de la familia THAP", una "actividad biológica de un miembro de la familia THAP" o una "actividad funcional de un miembro de la familia THAP" se refieren a una actividad ejercida por una molécula de polipéptido o de ácido nucleico de THAP1, o su fragmento biológicamente activo o su homólogo, que comprende THAP1 determinada in vivo o in vitro, según técnicas convencionales. En una realización, una actividad de la familia THAP es una actividad directa, como una asociación con una molécula diana de la familia THAP o, lo más preferiblemente, una actividad de inducción de la apoptosis, o una inhibición de la proliferación celular o del ciclo celular. Tal como se emplea en la presente, una "molécula diana de la familia THAP" es una molécula con la que se une o interacciona una proteína de la familia THAP en la naturaleza, de forma que se logra una función mediada por la familia THAP. Un ejemplo de una molécula diana de la familia THAP puede ser otra proteína o polipéptido de la familia THAP que sea sustancialmente idéntico o que comparta una similitud estructural (por ejemplo, que forme un dímero o un multímero). En otro ejemplo, una molécula diana de la familia THAP puede ser una molécula de proteína que no comprenda la familia THAP, o una molécula no propia, como por ejemplo un receptor del dominio de muerte. La unión o la interacción con una molécula diana de la familia THAP (como THAP1/PAR4 descrita en la presente) o con otras dianas puede detectarse utilizando, por ejemplo, un ensayo basado en dos híbridos en levadura para encontrar fármacos que alteren la interacción del cebo de familia THAP con la presa diana (por ejemplo, PAR4), o un ensayo de interacción in vitro con proteínas de la familia THAP recombinantes y proteínas diana (por ejemplo THAP1 y PAR4). En otro ejemplo, una molécula diana de la familia THAP puede ser una molécula de ácido nucleico. Por ejemplo, una molécula diana de la familia THAP puede ser ADN.

Como alternativa, una actividad de la familia THAP puede ser una actividad indirecta, como una actividad mediada por la interacción de una proteína de la familia THAP con una molécula diana de la familia THAP de forma que la molécula diana modula una actividad celular corriente abajo (por ejemplo, la interacción de una molécula de la familia THAP con una molécula diana de la familia THAP puede modular la actividad de esa molécula diana sobre una vía de señalización intracelular).

La actividad de la familia THAP no se limita a la inducción de una actividad apoptótica, sino que también puede implicar potenciar la actividad apoptótica. Puesto que los dominios de muerte pueden mediar en las interacciones de proteína-proteína, incluyendo las interacciones con otros dominios de muerte, la actividad de la familia THAP puede implicar transducir una señal citocida.

Los ensayos para detectar la apoptosis son muy conocidos. En un ejemplo preferido, un ensayo se basa en la apoptosis inducida por la retirada del suero en una línea celular 3T3 con la expresión regulada por tetraciclina de un miembro de la familia THAP que comprenda un dominio THAP. También se describen otros ejemplos no limitantes.

En un ejemplo, un polipéptido THAP1, o su fragmento biológicamente activo o su homólogo, pueden ser la región mínima de un polipéptido que es necesaria y suficiente para la generación de señales de muerte citotóxicas. También se proporcionan ejemplos de ensayos para la actividad apoptótica en la presente.

En realizaciones específicas, PAR4 es una molécula diana de THAP1 y/o THAP2 preferida. En otro aspecto, una molécula diana de THAP1 es una proteína de PML-NB.

En otros aspectos, el dominio THAP o un polipéptido de la familia THAP comprende un dominio de unión a ADN.

En otros aspectos, una actividad de la familia THAP se detecta evaluando cualquiera de las siguientes actividades: (1) la mediación en la apoptosis o la proliferación celular cuando se expresa o se introduce en una célula, lo más preferiblemente la inducción o la potenciación de la apoptosis y/o lo más preferiblemente la reducción de la proliferación celular; (2) la mediación en la apoptosis o la proliferación celular de una célula endotelial; (3) la mediación en la apoptosis o la proliferación celular de una célula hiperproliferativa; (4) la mediación en la apoptosis o la proliferación celular de una célula del SNC, preferiblemente una célula neuronal o glial; (5) una actividad determinada en un animal seleccionada del grupo que consiste en la mediación, preferiblemente la inhibición, de la angiogénesis, la mediación, preferiblemente la inhibición, de la inflamación, la inhibición del potencial metastásico de tejido canceroso, la reducción de la carga tumoral, el aumento de la sensibilidad a la quimioterapia o la radioterapia, la muerte de una célula de cáncer, la inhibición del crecimiento de una célula de cáncer, o la inducción de la regresión tumoral; o (6) la interacción con una molécula diana de la familia THAP o una molécula diana del dominio THAP, preferiblemente la interacción con una proteína o un ácido nucleico. La detección de actividad de la familia de THAP también puede comprender detectar cualquier criterio de valoración terapéutico adecuado analizado en la presente en la sección titulada "Métodos de tratamiento". La actividad de la familia THAP puede evaluarse in vitro (ensayo basado o no en células) o in vivo dependiendo del tipo y del formato del ensayo.

Se ha identificado un dominio THAP en la región N-terminal de la proteína THAP1, desde aproximadamente el aminoácido 1 a aproximadamente el aminoácido 89 de SEQ ID NO:3, basándose en el análisis de la secuencia y en ensayos funcionales. También se ha identificado un dominio THAP en THAP2 a THAP0 de SEQ ID NO:1-14. Sin embargo, se apreciará que un dominio THAP funcional puede ser sólo una pequeña porción de la proteína, de aproximadamente 10 aminoácidos a aproximadamente 15 aminoácidos, o de aproximadamente 20 aminoácidos a aproximadamente 25 aminoácidos, o de aproximadamente 30 aminoácidos a aproximadamente 35 aminoácidos, o de aproximadamente 40 aminoácidos a aproximadamente 45 aminoácidos, o de aproximadamente 50 aminoácidos a aproximadamente 55 aminoácidos, o de aproximadamente 60 aminoácidos a aproximadamente 70 aminoácidos, o de aproximadamente 80 aminoácidos a aproximadamente 90 aminoácidos, o de aproximadamente 100 aminoácidos de longitud. Como alternativa, la actividad de polipéptido de dominio THAP o de la familia THAP, como se definió anteriormente, puede requerir una porción más larga de la proteína nativa, que puede ser definida por la interacción de proteína-proteína, por la unión al ADN, por ensayos celulares o por alineamiento de secuencias. Una porción de un polipéptido que contiene el dominio THAP de aproximadamente 110 aminoácidos a aproximadamente 115 aminoácidos, o de aproximadamente 120 aminoácidos a aproximadamente 130 aminoácidos, o de aproximadamente 140 aminoácidos a aproximadamente 150 aminoácidos, o de aproximadamente 160 aminoácidos a aproximadamente 170 aminoácidos, o de aproximadamente 180 aminoácidos a aproximadamente 190 aminoácidos, o de aproximadamente 200 aminoácidos a aproximadamente 250 aminoácidos, o de aproximadamente 300 aminoácidos a aproximadamente 350 aminoácidos, o de aproximadamente 400 aminoácidos a aproximadamente 450 aminoácidos, o de aproximadamente 500 aminoácidos a aproximadamente 600 aminoácidos, hasta el grado en que dicha longitud sea coherente con la SEQ ID NO:, o la proteína de longitud completa, por ejemplo la proteína de longitud completa de SEQ ID NO:3, puede requerirse para la función. Otras proteínas de longitud completa se muestran en SEQ ID NO:1, 2 ó 4-114.

Tal como se analiza, la invención incluye un nuevo dominio de proteína. Por consiguiente, en la presente se describe un miembro de la familia THAP que comprende un polipéptido que tiene al menos una secuencia de dominio THAP en la proteína o la correspondiente molécula de ácido nucleico, preferiblemente una secuencia de dominio THAP que se corresponde con SEQ ID NO:1-2. Un miembro de la familia THAP puede comprender una secuencia de aminoácidos con una longitud de al menos 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80 a 90 restos aminoácidos, de los cuales al menos aproximadamente 50-80%, preferiblemente al menos aproximadamente 60-70%, más preferiblemente al menos aproximadamente 65%, 75% o 90% de los restos aminoácidos son aminoácidos idénticos o similares al dominio consenso de THAP de SEQ ID NO:1-2.

La coincidencia o la similitud puede determinarse utilizando cualquier algoritmo deseado, incluyendo los algoritmos y los parámetros para determinar la homología que se describen en la presente.

Opcionalmente, un polipéptido de la familia THAP que contiene un dominio THAP comprende una secuencia de localización nuclear (NLS). Tal como se emplea en la presente, la expresión secuencia de localización nuclear se refiere a una secuencia de aminoácidos que permite localizar o transportar un polipéptido de la familia THAP al núcleo celular. Una secuencia de localización nuclear en general comprende al menos aproximadamente 10, preferiblemente aproximadamente 13, preferiblemente aproximadamente 16, más preferiblemente aproximadamente 19, y aún más preferiblemente aproximadamente 21, 23, 25, 30, 35 ó 40 restos aminoácidos. Como alternativa, un polipéptido de la familia THAP puede comprender la deleción de una parte o de todo el NLS, o una sustitución o inserción en una secuencia NLS, de forma que el polipéptido de la familia THAP modificado no se localice ni se transporte al núcleo celular.

Las proteínas aisladas descritas en la presente, preferiblemente polipéptidos de la familia THAP o de dominio THAP, o sus fragmentos biológicamente activos o sus homólogos, tienen una secuencia de aminoácidos suficientemente homóloga con la secuencia de aminoácidos consenso de SEQ ID NO:1-2. Tal como se emplea en la presente, la expresión "suficientemente homólogo" se refiere a una primera secuencia de aminoácidos o de nucleótidos que contiene un número suficiente o mínimo de restos aminoácidos o nucleótidos idénticos o equivalentes (por ejemplo, un resto aminoácido que tenga una cadena lateral similar) con una segunda secuencia de aminoácidos o de nucleótidos, de forma que la primera y la segunda secuencia de aminoácidos o de nucleótidos comparten motivos o dominios estructurales comunes y/o una actividad funcional común. Por ejemplo, las secuencias de aminoácidos o de nucleótidos que comparten dominios estructurales comunes tienen al menos una coincidencia de aproximadamente 30-40%, preferiblemente una coincidencia de al menos aproximadamente 40-50%, más preferiblemente de al menos aproximadamente 50-60%, y aún más preferiblemente una coincidencia de al menos aproximadamente 60-70%, 70-80%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% o 99,8% a lo largo de las secuencias de aminoácidos de los dominios, y que contienen al menos uno, y preferiblemente dos motivos o dominios estructurales, se definen en la presente como suficientemente homólogas. Además, las secuencias de aminoácidos o de nucleótidos que comparten una coincidencia de al menos aproximadamente 30%, preferiblemente de al menos aproximadamente 40%, más preferiblemente de al menos aproximadamente 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% o 99,8%, y que comparten una actividad funcional común se definen en la presente como suficientemente homólogas.

Además, en la presente se describen polipéptidos de la familia THAP, así como sus fragmentos, sus ácidos nucleicos complementarios y los ácidos nucleicos capaces de hibridarse con ellos bajo condiciones rigurosas.

THAP-0 a THAP11

Como se mencionó anteriormente, los inventores han identificado varios miembros de la familia THAP, incluyendo THAP-0, THAP1, THAP-2, THAP-3, THAP-4, THAP-5, THAP-6, THAP-7, THAP-8, THAP-9, THAP10 y THAP11.

Ácidos nucleicos de THAP1

La secuencia codificadora de THAP1 humana, que tiene una longitud de aproximadamente 639 nucleótidos que se muestra en SEQ ID NO:160, codifica una proteína que tienen una longitud de aproximadamente 213 restos aminoácidos. Un aspecto de la invención se refiere a moléculas de ácidos nucleicos purificadas o aisladas que codifican proteínas THAP1 o sus porciones biológicamente activas, como se describe a continuación en la presente, así como sus fragmentos de ácidos nucleicos. Dichos ácidos nucleicos pueden utilizarse, por ejemplo, en métodos terapéuticos y ensayos de selección de fármacos, como se describe a continuación en la presente.

El gen THAP1 humano se localiza en los cromosomas 8, 18, 11.

La proteína THAP1 comprende un dominio THAP en los aminoácidos 1-89, cuyo papel en la apoptosis se demuestra a continuación en la presente. La proteína THAP1 comprende un motivo de homología de gamma-interferón en los aminoácidos 136-169 de la THAP1 humana (NYTVEDTMHQRKRIHQLEQQVEKLRKKLKTAQQR) (SEQ ID NO:178), que muestra 41% de coincidencia en un solapamiento de 34 restos con el gamma-interferón (aminoácidos 98-131). Los PML-NB están muy relacionados con el gamma-IFN, y muchos componentes de PML-NB son inducidos por el gamma-IFN, teniendo elementos de respuesta a gamma-IFN en los promotores de los correspondientes genes. La proteína THAP1 también incluye una secuencia de localización nuclear en los aminoácidos 146-165 de la THAP1 humana (RKRIHQLEQQVEKLRKKLKT) (SEQ ID NO:179). Esta secuencia es responsable de la localización de THAP1 en el núcleo. Tal como se demuestra en los ejemplos proporcionados en la presente, los mutantes de deleción de THAP1 que carecen de esta secuencia ya no se localizan en el núcleo celular. La proteína THAP1 también comprende un motivo de unión a PAR4 ((LE(X)_{14}QRXRRQXR(X)_{11}QR/KE) (SEQ ID NO:180). El núcleo de este motivo se ha definido experimentalmente mediante mutagénesis específica dirigida a sitio y mediante comparación con una quinasa de tipo ZIP/DAP de ratón (otro compañero de unión de PAR4). Se solapa con los aminoácidos 168-175 de la THAP1 humana pero el motivo también puede incluir unos pocos restos cadena arriba y cadena abajo.

Se han identificado EST que corresponden a THAP1, y pueden incluirse o excluirse específicamente de los ácidos nucleicos de la invención. Los EST, como se indica a continuación con el número de registro, proporcionan pruebas de la distribución tisular para TRAP1 como sigue: AL582975 (células B del linfoma de Burkitt); BG708372 (hipotálamo); BG563619 (hígado); BG497522 (adenocarcinoma); BG616699 (hígado); BE932253 (cabeza-cuello); AL530396 (células de neuroblastoma).

Un objeto de la invención es un ácido nucleico purificado, aislado o recombinante que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:160, sus secuencias complementarias y sus fragmentos. La invención también se refiere a un ácido nucleico purificado o aislado que comprende un polinucleótido que tiene una coincidencia de nucleótidos de al menos 95% con un polinucleótido de SEQ ID NO:160, de forma ventajosa una coincidencia de nucleótidos de 99%, preferiblemente una coincidencia de nucleótidos de 99,5%, y lo más preferiblemente una coincidencia de nucleótidos de 99,8% con un polinucleótido de SEQ ID NO:160, o su secuencia complementaria o su fragmento biológicamente activo. Otro objeto de la invención se refiere a ácidos nucleicos purificados, aislados o recombinantes que comprenden un polinucleótido que se hibrida, bajo las condiciones rigurosas definidas en la presente, con un polinucleótido de SEQ ID NO:160, o su secuencia complementaria o su variante o su fragmento biológicamente activo. En otras realizaciones, los ácidos nucleicos de la invención incluyen polinucleótidos aislados, purificados o recombinantes que comprenden un tramo contiguo de al menos 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500 ó 1000 nucleótidos de SEQ ID NO:160, o sus complementos.

También se incluye un polinucleótido de ácido nucleico purificado, aislado o recombinante que codifica un polipéptido THAP1 de la invención, como se describe a continuación en la presente.

En otro aspecto preferido, la invención se refiere a moléculas de ácidos nucleicos purificadas o aisladas que codifican una porción o un variante de una proteína THAP1, en la que la porción o el variante muestra una actividad THAP1 de la invención. Preferiblemente, dicha porción o variante es una porción o un variante de una proteína THAP1 de longitud completa natural. En un ejemplo, la invención proporciona un polinucleótido que comprende, que consiste esencialmente en, o que consiste en un tramo contiguo de al menos 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500 ó 1000 nucleótidos de SEQ ID NO:160, en el que dicho ácido nucleico codifica una porción o un variante de THAP1 que tiene una actividad THAP1 descrita en la presente. En otras realizaciones, la invención se refiere a un polinucleótido que codifica una porción de THAP1 que consiste en los aminoácidos 8-20, 20-50, 50-70, 60-100, 100-150, 150-200, 200-205 ó 205-212 de SEQ ID NO:3, o su variante, en el que dicha porción de THAP1 muestra una actividad THAP1 descrita en la presente.

La secuencia de SEQ ID NO:160 se corresponde con el ADNc de THAP1 humano. Este ADNc comprende secuencias que codifican la proteína THAP1 humana (es decir, "la región codificadora", de los nucleótidos 202 a 840, así como secuencias no traducidas 5' (nucleótidos 1-201) y secuencias no traducidas 3' (nucleótidos 841 a 2173).

También incluidos en los ácidos nucleicos de THAP1 de la invención están las moléculas de ácidos nucleicos que son complementarias con los ácidos nucleicos de THAP1 descritos en la presente. Preferiblemente, un ácido nucleico complementario es suficientemente complementario con la secuencia de nucleótidos que se muestra en SEQ ID NO:160, de modo que puede hibridarse con la secuencia de nucleótidos que se muestra en SEQ ID NO:160, formando con ello un dúplex estable.

Otro objeto de la invención es un ácido nucleico purificado, aislado o recombinante que codifica un polipéptido THAP1 que comprende, que consiste esencialmente en, o que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3 o sus fragmentos, en el que la molécula de ácido nucleico aislada codifica uno o más motivos seleccionados del grupo que consiste en un dominio THAP, una región de unión a la diana de THAP1, una señal de localización nuclear y un motivo de homología de gamma-interferón. Preferiblemente, dicha región de unión a la diana de THAP1 es una región de unión a PAR4 o una región de unión al ADN. Por ejemplo, el ácido nucleico purificado, aislado o recombinante puede comprender un ADN genómico o su fragmento que codifica el polipéptido de SEQ ID NO:3 o su fragmento, o un ADNc que consiste, que consiste esencialmente o que comprende la secuencia de SEQ ID NO:160 o sus fragmentos, en la que la molécula de ácido nucleico aislada codifica uno o más motivos seleccionados del grupo que consiste en un dominio THAP, una región de unión a la diana de THAP1, una señal de localización nuclear y un motivo de homología de gamma-interferón. Cualquier combinación de dichos motivos también puede especificarse. Preferiblemente, dicha región de unión a la diana de THAP1 es una región de unión a PAR4 o una región de unión al ADN. Los ácidos nucleicos particularmente preferidos de la invención incluyen ácidos nucleicos de THAP1 aislados, purificados o recombinantes que comprenden, que consisten esencialmente en, o que consisten en un tramo contiguo de al menos 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200 ó 300 nucleótidos de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en los intervalos de posiciones de nucleótidos de 607 a 708, de 637 a 696, y de 703 a 747 de SEQ ID NO:160. En realizaciones preferidas, un ácido nucleico de THAP1 codifica un polipéptido THAP1 que comprende al menos dos dominios funcionales THAP1, como por ejemplo un dominio THAP y una región de unión a PAR4.

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En otras realizaciones preferidas, un ácido nucleico de THAP1 comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio THAP que tiene la secuencia de aminoácidos consenso de la fórmula de SEQ ID NO:1-2. Un ácido nucleico de THAP1, como se describe en la presente, también puede codificar un dominio THAP en el que al menos aproximadamente 95%, 90%, 85%, 50-80%, preferiblemente al menos aproximadamente 60-70%, más preferiblemente al menos aproximadamente 65% de los restos aminoácidos son aminoácidos idénticos o similares a la secuencia consenso del dominio THAP (SEQ ID NO:1-2). En la presente también se describen polinucleótidos aislados, purificados y recombinantes que codifican un polipéptido que comprende un tramo contiguo de al menos 6 aminoácidos, preferiblemente al menos 8 ó 10 aminoácidos, más preferiblemente al menos 15, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80 ó 90 aminoácidos según la fórmula de SEQ ID NO:1-2.

La secuencia de aminoácidos determinada a partir de la clonación del gen THAP1 permite la generación de sondas y cebadores diseñados para su uso para identificar y/o clonar otros miembros de la familia THAP1 (por ejemplo, que comparten los nuevos dominios funcionales), así como homólogos de THAP1 de otras especies.

Un fragmento de ácido nucleico que codifica una "porción biológicamente activa de una proteína THAP1" puede prepararse aislando una porción de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:160, que codifica un polipéptido que tiene una actividad biológica THAP1 (las actividades biológicas de las proteínas THAP1 descritas en la presente), expresando la porción codificada de la proteína THAP1 (por ejemplo, mediante expresión recombinante in vitro o in vivo) y evaluando la actividad de la porción codificada de la proteína THAP1.

La invención incluye también moléculas de ácidos nucleicos que se diferencian de las secuencias de nucleótidos de THAP1 de la invención debido a la degeneración del código genético y que codifican las mismas proteínas y fragmentos de THAP1 de la invención.

Además de las secuencias de THAP1 descritas anteriormente, los expertos en la técnica apreciarán que pueden existir polimorfismos de secuencia de ADN que conduzcan a cambios en las secuencias de aminoácidos de las proteínas THAP1 dentro de una población (por ejemplo, la población humana). Este polimorfismo genético puede existir entre individuos dentro de una población debido a la variación alélica natural. Estas variaciones alélicas naturales pueden producir, de forma típica, una varianza del 1-5% en la secuencia de nucleótidos de un gen THAP1.

Las moléculas de ácidos nucleicos que corresponden a los variantes alélicos naturales y los homólogos de los ácidos nucleicos de THAP1 de la invención pueden aislarse basándose en su homología con los ácidos nucleicos de THAP1 descritos en la presente utilizando ADNc descritos en la presente, o su porción, como sonda de hibridación según técnicas de hibridación convencionales bajo condiciones de hibridación rigurosas.

Pueden utilizarse sondas basadas en las secuencias de nucleótidos de THAP1 para detectar transcritos o secuencias genómicas que la codifiquen o que codifiquen proteínas homólogas. En realizaciones preferidas, la sonda también comprende un grupo marcador unido a ella, por ejemplo el grupo marcador puede ser un radioisótopo, un compuesto fluorescente, una enzima, o un cofactor enzimático. Estas sondas pueden utilizarse como parte de un kit de ensayo de diagnóstico para identificar células o tejidos que no expresen bien una proteína THAP1, como por ejemplo midiendo el nivel de un ácido nucleico que codifica THAP1 en una muestra de células de un sujeto, por ejemplo detectando los niveles de ARNm de THAP1 o determinando si un gen de THAP1 genómico se ha mutado o delecionado.

Polipéptidos THAP1

La expresión "polipéptidos THAP1" se emplea en la presente para incluir todas las proteínas y los polipéptidos de la presente invención. También forman parte de la invención los polipéptidos codificados por los polinucleótidos de la invención, así como los polipéptidos de fusión que comprenden dichos polipéptidos. La invención incluye proteínas THAP1 de seres humanos, incluyendo proteínas THAP1 aisladas o purificadas que consisten en, que consisten esencialmente en, o que comprenden la secuencia de SEQ ID NO:3.

La invención se refiere al polipéptido codificado por una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:160, su secuencia complementaria o su fragmento.

La presente invención incluye polipéptidos aislados, purificados y recombinantes que comprenden un tramo contiguo de al menos 6 aminoácidos, preferiblemente de al menos 8 a 10 aminoácidos, más preferiblemente de al menos 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50 ó 100 aminoácidos de SEQ ID NO:3. En otras realizaciones preferidas, el tramo contiguo de aminoácidos comprende el sitio de una mutación o de una mutación funcional, incluyendo una deleción, adición, intercambio o truncamiento de los aminoácidos en la secuencia de la proteína THAP1. La invención también se refiere al polipéptido codificado por las secuencias de nucleótidos de THAP1 de la invención, o su secuencia complementaria o su fragmento.

Un aspecto de la invención se refiere a proteínas THAP1 aisladas y sus porciones biológicamente activas, así como fragmentos polipeptídicos adecuados para su uso como inmunógenos para generar anticuerpos anti-THAP1. En una realización, pueden aislarse proteínas THAP1 nativas de fuentes celulares o tisulares mediante un esquema de purificación apropiado utilizando técnicas de purificación de proteínas convencionales. En otra realización, las proteínas THAP1 se producen mediante técnicas de ADN recombinante. Como alternativa a la expresión recombinante, una proteína o un polipéptido THAP1 puede sintetizarse de modo químico utilizando técnicas de síntesis peptídica convencionales.

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De forma típica, las porciones biológicamente activas comprenden un dominio o un motivo con al menos una actividad de la proteína THAP1. La presente invención también incluye porciones o fragmentos aislados, purificados y recombinantes de un polipéptido THAP1 que comprenden un tramo contiguo de al menos 6 aminoácidos, preferiblemente de al menos 8 a 10 aminoácidos, más preferiblemente de al menos 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100 ó 200 aminoácidos de SEQ ID NO:3. También se incluyen polipéptidos THAP1 que comprenden entre 10 y 20, entre 20 y 50, entre 30 y 60, entre 50 y 100, o entre 100 y 200 aminoácidos de SEQ ID NO:3. En otras realizaciones preferidas, el tramo contiguo de aminoácidos comprende el sitio de una mutación o de una mutación funcional, incluyendo una deleción, adición, intercambio o truncamiento de los aminoácidos en la secuencia de la proteína THAP1.

Una proteína THAP1 biológicamente activa puede comprender, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 5, 10, 20 ó 30 cambios de aminoácidos de la secuencia de SEQ ID NO:3, o puede codificar una proteína THAP1 biológicamente activa que comprende al menos 1%, 2%, 3%, 5%, 8%, 10% o 15% de cambios en los aminoácidos de la secuencia de SEQ ID NO:3.

En una realización preferida, la proteína THAP1 comprende, consiste esencialmente en, o consiste en un dominio THAP en las posiciones de los aminoácidos 1 a 89 mostrados en SEQ ID NO:3, o sus fragmentos o variantes. En otros aspectos, un polipéptido THAP1 comprende una región de unión a la diana de THAP1, una señal de localización nuclear y/o un motivo de homología de gamma-interferón. Preferiblemente, una región de unión a la diana de THAP1 es una región de unión a PAR4 o una región de unión al ADN. La invención también se refiere al polipéptido codificado por las secuencias de nucleótidos de THAP1 de la invención, o su secuencia complementaria o su fragmento. Por tanto, la presente invención también incluye polipéptidos aislados, purificados y recombinantes que comprenden, que consisten esencialmente en, o que consisten en un tramo contiguo de al menos 6 aminoácidos, preferiblemente de al menos 8 a 10 aminoácidos, más preferiblemente de al menos 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 70, 80, 90 ó 100 aminoácidos de una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las posiciones de 1 a 90, de 136 a 169, de 146 a 165, y de 168 a 175 de SEQ ID NO:3. También se incluyen en la presente invención los ácidos nucleicos aislados, purificados, que codifican un polipéptido THAP1 que comprenden, que consisten esencialmente en, o que consisten en un dominio THAP en las posiciones de los aminoácidos de 1 a 90 que aparecen en SEQ ID NO:3, o sus fragmentos o variantes.

En otras realizaciones, la proteína THAP1 es sustancialmente homóloga con las secuencias de SEQ ID NO:3, y mantiene la actividad funcional de la proteína THAP1, pero se diferencia en la secuencia de aminoácidos debido a la variación alélica natural o la mutagénesis, como se describe a continuación en la presente. Por consiguiente, en otra realización, la proteína THAP1 es una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que comparte más de aproximadamente 60%, pero menos del 100% de homología con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3, y que mantiene la actividad funcional de las proteínas THAP1 de SEQ ID NO:3, respectivamente. Preferiblemente, la proteína es al menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% o 99,8% homóloga con SEQ ID NO:3, pero no es idéntica a SEQ ID NO:3. Preferiblemente, la THAP1 es menos que idéntica (por ejemplo, coincidencia de 100%) a una THAP1 natural. El porcentaje de homología puede determinarse como se detalla a continuación.

Ácidos nucleicos de THAP-2 a THAP11 y THAP-0

Como se mencionó, la invención proporciona varios miembros de la familia THAP. En la presente se describen las THAP1, THAP-2, THAP-3, THAP-4, THAP-5, THAP-6, THAP-7, THAP-8, THAP-9, THAP10, THAP11 y THAP-0. Las secuencias de nucleótidos de humano y de ratón que se corresponden con las secuencias de ADNc humanas se listan en SEQ ID NO:161-171; y las secuencias de aminoácidos humanas se listan respectivamente en SEQ ID NO:4-14. También se incluyen los ortólogos de dichas secuencias de la familia THAP, incluyendo ortólogos de ratón, rata, cerdo y otros ortólogos, cuyas secuencias de aminoácidos se listan en SEQ ID NO:16-114, y las secuencias de ADNc se listan en SEQ ID NO:172-175.

THAP-2

El ADNc de THAP-2 humana, que tiene una longitud de aproximadamente 1302 nucleótidos y se muestra en SEQ ID NO:161, codifica una proteína que tiene una longitud de aproximadamente 228 restos aminoácidos, que se muestra en SEQ ID NO:4. El gen de THAP-2 humana se localiza en los cromosomas 12 y 3. La proteína THAP-2 comprende un dominio THAP en los aminoácidos 1 a 89. El análisis de las secuencias expresadas (se indican los números de registro, que pueden estar incluidas o excluidas específicamente de los ácidos nucleicos de la invención) en las bases de datos sugiere que la THAP-2 se expresa como sigue: BG677995 (carcinoma de células escamosas); AV718199 (hipotálamo); B1600215 (hipotálamo); AI208780 (NHT de testículo de Soares); BE566995 (línea celular de carcinoma); A1660418 (reunido de timo).

THAP-3

El ADNc de THAP-3 humana, que tiene una longitud de aproximadamente 1995 nucleótidos se muestra en SEQ ID NO:162. El gen de THAP-3 humana se localiza en el cromosoma 1. La proteína THAP-3 comprende un dominio THAP en los aminoácidos 1 a 89. El análisis de las secuencias expresadas (se indican los números de registro, que pueden estar incluidas o excluidas específicamente de los ácidos nucleicos de la invención) en las bases de datos sugiere que la THAP-3 se expresa como sigue: BG700517 (hipocampo); BI460812 (testículos); BG707197 (hipotálamo); AW960428 (-); BG437177 (carcinoma de células grandes); BE962820 (adenocarcinoma); BE548411 (línea celular de carcinoma cervical); AL522189 (células de neuroblastoma); BE545497 (línea celular de carcinoma cervical); BE280538 (coriocarcinoma); BI086954 (cérvix); BE744363 (línea celular de adenocarcinoma); y BI549151 (hipocampo).

THAP-4

El ADNc de THAP-4 humana, mostrado como una secuencia que tiene una longitud de 1999 nucleótidos y se muestra en SEQ ID NO:163, codifica una proteína que tiene una longitud de aproximadamente 577 restos aminoácidos, que se muestra en SEQ ID NO:6. La proteína THAP-4 comprende un dominio THAP en los aminoácidos 1 a 90. El análisis de las secuencias expresadas (se indican los números de registro, que pueden estar incluidas o excluidas específicamente de los ácidos nucleicos de la invención) en las bases de datos sugiere que la THAP-4 se expresa como sigue: AL544881 (placenta); BE384014 (melanoma melanótico); AL517205 (células de neuroblastoma); BG394703 (retinoblastoma); BG472327 (retinoblastoma); BI196071 (neuroblastoma); BE255202 (retinoblastoma); BI017349 (tumor pulmonar); BF972153 (línea celular de leiomiosarcoma); BG116061 (línea celular de adenocarcinoma duodenal); AL530558 (células de neuroblastoma); AL520036 (células de neuroblastoma); AL559902 (células B del linfoma de Burkitt); AL534539 (cerebro fetal); BF686560 (línea celular de leiomiosarcoma); BF345413 (oligodendroglioma anaplásico con pérdida de 1 p/19q); BG117228 (línea celular de adenocarcinoma); BG490646 (carcinoma de células grandes); y BF769104 (tumor epidérmico).

THAP-5

El ADNc de THAP-5 humana, mostrado como una secuencia que tiene una longitud de 1034 nucleótidos y se muestra en SEQ ID NO:164, codifica una proteína que tiene una longitud de aproximadamente 239 restos aminoácidos, que se muestra en SEQ ID NO:7. El gen de THAP-5 humana se localiza en el cromosoma 7. La proteína THAP-5 comprende un dominio THAP en los aminoácidos 1 a 90. El análisis de las secuencias expresadas (se indican los números de registro, que pueden estar incluidas o excluidas específicamente de los ácidos nucleicos de la invención) en las bases de datos sugiere que la THAP-5 se expresa como sigue: BG575430 (línea celular de adenocarcinoma mamario); BI545812 (hipocampo); BI560073 (testículos); BG530461 (carcinoma embrionario); BF244164 (glioblastoma); BI461364 (testículos); AW407519 (células B del centro germinal); BF103690 (carcinoma embrionario); y BF939577 (riñón).

THAP-6

El ADNc de THAP-6 humana, mostrado como una secuencia que tiene una longitud de 2291 nucleótidos y se muestra en SEQ ID NO:165, codifica una proteína que tiene una longitud de aproximadamente 222 restos aminoácidos, que se muestra en SEQ ID NO:8. El gen de THAP-6 humana se localiza en el cromosoma 4. La proteína THAP-6 comprende un dominio THAP en los aminoácidos 1 a 90. El análisis de las secuencias expresadas (se indican los números de registro, que pueden estar incluidas o excluidas específicamente de los ácidos nucleicos de la invención) en las bases de datos sugiere que la THAP-6 se expresa como sigue: AV684783 (carcinoma hepatocelular); AV698391 (carcinoma hepatocelular); B1560555 (testículos); AV688768 (carcinoma hepatocelular); AV692405 (carcinoma hepatocelular); y AV696360 (carcinoma hepatocelular).

THAP-7

El ADNc de THAP-7 humana, mostrado como una secuencia que tiene una longitud de 1242 nucleótidos y se muestra en SEQ ID NO:166, codifica una proteína que tiene una longitud de aproximadamente 309 restos aminoácidos, que se muestra en SEQ ID NO:9. El gen de THAP-7 humana se localiza en el cromosoma 22q11.2. La proteína THAP-7 comprende un dominio THAP en los aminoácidos 1 a 90. El análisis de las secuencias expresadas (se indican los números de registro, que pueden estar incluidas o excluidas específicamente de los ácidos nucleicos de la invención) en las bases de datos sugiere que la THAP-7 se expresa como sigue: BI193682 (línea celular de carcinoma epiteloide); BE253146 (retinoblastoma); BE622113 (melanoma melanótico); BE740360 (línea celular de adenocarcinoma); BE513955 (linfoma de Burkitt); AL049117 (testículos); BF952983 (nerviosas normales); AW975614 (-); BE273270 (adenocarcinoma de células renales); BE738428 (glioblastoma); BE388215 (línea celular de adenocarcinoma de endometrio); BF762401 (est. de colon); y BG329264 (retinoblastoma).

THAP-8

El ADNc de THAP-8 humana, mostrado como una secuencia que tiene una longitud de 1383 nucleótidos y se muestra en SEQ ID NO:167, codifica una proteína que tiene una longitud de aproximadamente 274 restos aminoácidos, que se muestra en SEQ ID NO:10. El gen de THAP-8 humana se localiza en el cromosoma 19. La proteína THAP-8 comprende un dominio THAP en los aminoácidos 1 a 92. El análisis de las secuencias expresadas (se indican los números de registro, que pueden estar incluidas o excluidas específicamente de los ácidos nucleicos de la invención) en las bases de datos sugiere que la THAP-8 se expresa como sigue: BG703645 (hipocampo); BF026346 (melanoma melanótico); BE728495 (melanoma melanótico); BG334298 (melanoma melanótico); y BE390697 (línea celular de adenocarcinoma de endometrio).

THAP-9

El ADNc de THAP-9 humana, mostrado como una secuencia que tiene una longitud de 693nucleótidos y se muestra en SEQ ID NO:168, codifica una proteína que tiene una longitud de aproximadamente 231 restos aminoácidos, que se muestra en SEQ ID NO:11. La proteína THAP-9 comprende un dominio THAP en los aminoácidos 1 a 92. El análisis de las secuencias expresadas (se indican los números de registro, que pueden estar incluidas o excluidas específicamente de los ácidos nucleicos de la invención) en las bases de datos sugiere que la THAP-9 se expresa como sigue: AA333595 (embrión de 8 semanas).

THAP10

El ADNc de THAP10 humana, mostrado como una secuencia que tiene una longitud de 771 nucleótidos y se muestra en SEQ ID NO:169, codifica una proteína que tiene una longitud de aproximadamente 257 restos aminoácidos, que se muestra en SEQ ID NO:12. El gen de THAP10 humana se localiza en el cromosoma 15. La proteína THAP10 comprende un dominio THAP en los aminoácidos 1 a 90. El análisis de las secuencias expresadas (se indican los números de registro, que pueden estar incluidas o excluidas específicamente de los ácidos nucleicos de la invención) en las bases de datos sugiere que la THAP10 se expresa como sigue: AL526710 (células de neuroblastoma); AV725499 (hipotálamo); AW966404 (-); AW296810 (pulmón); y AL557817 (células T de la leucemia de células T).

THAP11

El ADNc de THAP11 humana, mostrado como una secuencia que tiene una longitud de 942 nucleótidos y se muestra en SEQ ID NO:170, codifica una proteína que tiene una longitud de aproximadamente 314 restos aminoácidos, que se muestra en SEQ ID NO:13. El gen de THAP11 humana se localiza en el cromosoma 16. La proteína THAP11 comprende un dominio THAP en los aminoácidos 1 a 90. El análisis de las secuencias expresadas (se indican los números de registro, que pueden estar incluidas o excluidas específicamente de los ácidos nucleicos de la invención) en las bases de datos sugiere que la THAP11 se expresa como sigue: AU142300 (retinoblastoma); BI261822 (línea celular de linfoma); BG423102 (adenocarcinoma de células renales); y BG423864 (riñón).

THAP-0

El ADNc de THAP-0 humana, mostrado como una secuencia que tiene una longitud de 2283 nucleótidos y se muestra en SEQ ID NO:171, codifica una proteína que tiene una longitud de aproximadamente 716 restos aminoácidos, que se muestra en SEQ ID NO:14. El gen de THAP-0 humana se localiza en el cromosoma 11. La proteína THAP-0 comprende un dominio THAP en los aminoácidos 1 a 90. El análisis de las secuencias expresadas (se indican los números de registro, que pueden estar incluidas o excluidas específicamente de los ácidos nucleicos de la invención) en las bases de datos sugiere que la THAP-0 se expresa como sigue: BE713222 (cabeza-cuello); BE161184 (cabeza-cuello); AL119452 (amígdala); AU129709 (teratocarcinoma); AW965460 (-); AW965460 (-); AW958065 (-);y BE886885 (leiomiosarcoma).

Un ácido nucleico variante de THAP-2 a THAP11 o THAP-0 puede codificar, por ejemplo, una proteína THAP-2 a THAP11 o THAP-0 biológicamente activa que comprende al menos 1, 2, 3, 5, 10, 20 ó 30 cambios en los aminoácidos con respecto a la respectiva secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:4-14, 17-21, 23-40, 42-56, 58-98 y 100-114, o puede codificar una proteína THAP-2 a THAP11 o THAP-0 biológicamente activa que comprende al menos 1%, 2%, 3%, 5%, 8%, 10% o 15% cambios en aminoácidos con respecto a la respectiva secuencia de SEQ ID NO:4-14, 17-21, 23-40, 42-56, 58-98 y 100-114.

Las secuencias de SEQ ID NO:4-14 se corresponden con los ADN de THAP-2 a THAP11 y THAP-0 humana, respectivamente. Las SEQ ID NO:17-21, 23-40, 42-56, 58-98, 100-114 se corresponden con ortólogos de ratón, rata, cerdo y otros ortólogos.

Incluidas también en los ácidos nucleicos de THAP-2 a THAP11 y THAP-0 de la invención están las moléculas que son complementarias con los ácidos nucleicos de THAP-2 a THAP11 o THAP-0 descritos en la presente. Preferiblemente, un ácido nucleico complementario es suficientemente complementario con la respectiva secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO:161-171 y 173-175 de forma que puede hibridarse con dicha secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO:161-171 y 173-175, formando con ello un dúplex estable.

Otro objeto de la invención es un ácido nucleico purificado, aislado o recombinante que codifica un polipéptido THAP-2 a THAP11 y THAP-0 que comprende, que consiste esencialmente en, o que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:4-14, 17-21, 23-40, 42-56, 58-98, 100-114 o sus fragmentos, en la que la molécula de ácido nucleico aislada codifica un dominio THAP o una región de unión a la diana de THAP-2 a THAP11 y THAP-0. Preferiblemente, dicha región de unión a la diana es una región de unión a proteínas, preferiblemente una región de unión a PAR4, o preferiblemente dicha región de unión a la diana es una región de unión al ADN. Por ejemplo, el ácido nucleico purificado, aislado o recombinante puede comprender un ADN genómico o su fragmento, que codifica un polipéptido que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:4-14, 17-21, 23-40, 42-56, 58-98, 100-114 o su fragmento. Como alternativa, el ácido nucleico purificado, aislado o recombinante puede comprender un ADNc que consiste en, que consiste esencialmente en, o que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:4-14, 17-21, 23-40, 42-56, 58-98, 100-114 o sus fragmentos, en la que la molécula de ácido nucleico aislada codifica un dominio THAP o una región de unión a la diana de THAP-2 a THAP11 y THAP-0. En realizaciones preferidas, un ácido nucleico de THAP-2 a THAP11 y THAP-0 codifica un polipéptido THAP-2 a THAP11 y THAP-0 que comprende al menos dos dominios funcionales THAP-2 a THAP11 y THAP-0, como por ejemplo un dominio THAP y una región de unión a la diana de THAP-2 a THAP11 y THAP-0.

Los ácidos nucleicos particularmente preferidos de la invención incluyen ácidos nucleicos de THAP-2 a THAP11 y THAP-0 aislados, purificados o recombinantes que comprenden, que consisten esencialmente en, o que consisten en un tramo contiguo de al menos 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200 ó 250 nucleótidos de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las posiciones de los nucleótidos que codifican los aminoácidos pertinentes, como se ofrece en SEQ ID NO:161-171 y 173-175.

En otra realización preferida, un ácido nucleico de THAP-2 a THAP11 y THAP-0 comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio THAP que tiene la secuencia de aminoácidos consenso de la fórmula de SEQ ID NO:1-2. Un ácido nucleico de THAP-2 a THAP11 y THAP-0 también puede codificar un dominio THAP en el que al menos aproximadamente 95%, 90%, 85%, 50-80%, preferiblemente al menos 60-70%, más preferiblemente al menos aproximadamente 65% de los restos aminoácidos son aminoácidos idénticos o similares al dominio consenso THAP (SEQ ID NO:1-2). La presente invención también incluye polinucleótidos aislados, purificados y recombinantes que codifican un polipéptido que comprende un tramo contiguo de al menos 6 aminoácidos, preferiblemente al menos 8 ó 10 aminoácidos, más preferiblemente al menos 15, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80 ó 90 aminoácidos de SEQ ID NO:1-2.

La secuencia de nucleótidos determinada a partir de la clonación de los genes THAP-2 a THAP11 y THAP-0 permite la generación de sondas y de cebadores diseñados para su uso para identificar y/o clonar otros miembros de la familia THAP, en particular secuencias relacionadas con THAP-2 a THAP11 y THAP-0 (por ejemplo, que comparten los nuevos dominios funcionales), así como homólogos de THAP-2 a THAP11 y THAP-0 de otras especies.

Puede prepararse un fragmento de ácido nucleico que codifica una porción biológicamente activa de una proteína THAP-2 a THAP11 y THAP-0 aislando una porción de una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:161-171 y 173-175, que codifica un polipéptido que tiene una actividad biológica de THAP-2 a THAP11 y THAP-0 (las actividades biológicas de las proteínas de la familia THAP descritas en la presente), expresando la porción codificada de la proteína THAP-2 a THAP11 y THAP-0 (por ejemplo, mediante expresión recombinante in vitro o in vivo), y evaluando la actividad de la porción codificada de la proteína THAP-2 a THAP11 y THAP-0.

La invención también incluye moléculas de ácidos nucleicos que se diferencian de las secuencias de nucleótidos de THAP-2 a THAP11 y THAP-0 de la invención debido a la degeneración del código genético y que codifican la misma proteína THAP-2 a THAP11 y THAP-0, o su fragmento, de la invención.

Además de las secuencias de nucleótidos de THAP-2 a THAP11 y THAP-0 descritas anteriormente, los expertos en la técnica apreciarán que pueden existir polimorfismos de secuencia de ADN que conduzcan a cambios en las secuencias de aminoácidos de las respectivas proteínas THAP-2 a THAP11 y THAP-0 dentro de una población (por ejemplo, la población humana). Este polimorfismo genético puede existir entre individuos dentro de una población debido a la variación alélica natural. Estas variaciones alélicas naturales pueden producir, de forma típica, una varianza del 1-5% en la secuencia de nucleótidos de un gen THAP-2 a THAP11 y THAP-0 concreto.

Las moléculas de ácidos nucleicos que corresponden a los variantes alélicos naturales y los homólogos de los ácidos nucleicos de THAP-2 a THAP11 y THAP-0 de la invención pueden aislarse basándose en su homología con los ácidos nucleicos de THAP-2 a THAP11 y THAP-0 descritos en la presente utilizando los ADNc descritos en la presente, o su porción, como sonda de hibridación según técnicas de hibridación convencionales bajo condiciones de hibridación rigurosas.

Pueden utilizarse sondas basadas en las secuencias de nucleótidos de THAP-2 a THAP11 y THAP-0 para detectar transcritos o secuencias genómicas que la codifiquen o que codifiquen proteínas homólogas. En realizaciones preferidas, la sonda también comprende un grupo marcador unido a ella, por ejemplo el grupo marcador puede ser un radioisótopo, un compuesto fluorescente, una enzima, o un cofactor enzimático. Estas sondas pueden utilizarse como parte de un kit de ensayo de diagnóstico para identificar células o tejidos que no expresen bien una proteína THAP-2 a THAP11 y THAP-0, como por ejemplo midiendo el nivel de un ácido nucleico que codifica THAP-2 a THAP11 y THAP-0 en una muestra de células de un sujeto, por ejemplo detectando los niveles de ARNm de THAP-2 a THAP11 y THAP-0 o determinando si un gen de THAP-2 a THAP11 y THAP-0 genómico se ha mutado o delecionado.

Polipéptidos THAP-2 a THAP11 y THAP-0

La expresión "polipéptidos THAP-2 a THAP11 y THAP-0" se emplea en la presente para incluir todas las proteínas y los polipéptidos de la presente invención relacionados con THAP-2, THAP-3, THAP-4, THAP-5, THAP-6, THAP-7, THAP-8, THAP-9, THAP10, THAP11 y THAP0. También forman parte de la invención los polipéptidos codificados por los polinucleótidos de la invención, así como los polipéptidos de fusión que comprenden dichos polipéptidos. La invención incluye proteínas THAP-2 a THAP11 y THAP-0 de seres humanos, incluyendo proteínas THAP-2 a THAP11 y THAP-0 aisladas o purificadas que consisten en, que consisten esencialmente en, o que comprenden una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:4-14, 17-21, 23-40, 42-56, 58-98, y 100-114.

La invención se refiere al polipéptido codificado por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:161-171, 172-1175 y su secuencia complementaria o su fragmento.

La presente invención incluye polipéptidos aislados, purificados y recombinantes que comprenden un tramo contiguo de al menos 6 aminoácidos, preferiblemente de al menos 8 a 10 aminoácidos, más preferiblemente de al menos 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100, 150, 200, 300 ó 500 aminoácidos, hasta el grado de que dicho tramo es coherente con la SEQ ID NO: concreta, de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:4-14, 17-21, 23-40, 42-56, 58-98, y 100-114. En otras realizaciones preferidas, el tramo contiguo de aminoácidos comprende el sitio de una mutación o de una mutación funcional, incluyendo una deleción, adición, intercambio o truncamiento de los aminoácidos en la secuencia de la proteína THAP-2 a THAP11 y THAP-0.

Un aspecto de la invención se refiere a proteínas THAP-2 a THAP11 y THAP-0 aisladas y sus porciones biológicamente activas, así como a fragmentos polipeptídicos adecuados para su uso como inmunógenos para generar anticuerpos anti-THAP-2 a THAP11 y THAP-0. En una realización, pueden aislarse proteínas THAP-2 a THAP11 y THAP-0 nativas de fuentes celulares o tisulares mediante un esquema de purificación apropiado utilizando técnicas de purificación de proteínas convencionales. En otra realización, las proteínas THAP-2 a THAP11 y THAP-0 se producen mediante técnicas de ADN recombinante. Como alternativa a la expresión recombinante, una proteína o un polipéptido THAP-2 a THAP11 y THAP-0 puede sintetizarse de modo químico utilizando técnicas de síntesis peptídica convencionales.

Las porciones biológicamente activas de una proteína THAP-2 a THAP11 y THAP-0 incluyen péptidos que comprenden secuencias de aminoácidos suficientemente homólogas con o derivadas de la secuencia de aminoácidos de la proteína THAP-2 a THAP11 y THAP-0, por ejemplo una secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO:4-14, 17-21, 23-40, 42-56, 58-98, o 100-114, que incluya menos aminoácidos que la respectiva proteína THAP-2 a THAP11 y THAP-0 de longitud completa, y que muestre al menos una actividad de la proteína THAP-2 a THAP11 y THAP-0. La presente invención también incluye porciones o fragmentos aislados, purificados y recombinantes de un polipéptido THAP-2 a THAP11 y THAP-0 que comprenden un tramo contiguo de al menos 6 aminoácidos, preferiblemente de al menos 8 a 10 aminoácidos, más preferiblemente de al menos 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100, 150, 200, 300 ó 500 aminoácidos hasta el grado de que dicho tramo es coherente con la SEQ ID NO: concreta, de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:4-14, 17-21, 23-40, 42-56, 58-98, y 100-114. También se incluyen polipéptidos THAP-2 a THAP11 y THAP-0 que comprenden entre 10 y 20, entre 20 y 50, entre 30 y 60, entre 50 y 100, o entre 100 y 200 aminoácidos de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:4-14, 17-21, 23-40, 42-56, 58-98, y 100-114. En otras realizaciones preferidas, el tramo contiguo de aminoácidos comprende el sitio de una mutación o de una mutación funcional, incluyendo una deleción, adición, intercambio o truncamiento de los aminoácidos en la secuencia de la proteína THAP-2 a THAP11 y THAP-0.

Una proteína THAP-2 a THAP11 y THAP-0 biológicamente activa puede comprender, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 5, 10, 20 ó 30 cambios de aminoácidos de la secuencia de SEQ ID NO:4-14, 17-21, 23-40, 42-56, 58-98, o 100-114, o puede codificar una proteína THAP-2 a THAP11 y THAP-0 biológicamente activa que comprende al menos 1%, 2%, 3%, 5%, 8%, 10% o 15% de cambios en los aminoácidos de la secuencia de SEQ ID NO:4-14, 17-21, 23-40, 42-56, 58-98, o 100-114.

En una realización preferida, la proteína THAP-2 comprende, consiste esencialmente en, o consiste en un dominio THAP THAP-2, que preferiblemente tiene la secuencia de aminoácidos de las posiciones de los aminoácidos 1 a 89 mostrados en SEQ ID NO:4, o sus fragmentos o variantes. La invención también se refiere al polipéptido codificado por las secuencias de nucleótidos de THAP-2 de la invención, o su secuencia complementaria o su fragmento. Por tanto, la presente invención también incluye polipéptidos aislados, purificados y recombinantes que comprenden, que consisten esencialmente en, o que consisten en un tramo contiguo de al menos 6 aminoácidos, preferiblemente de al menos 8 a 10 aminoácidos, más preferiblemente de al menos 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 70, 80 u 89 aminoácidos de una secuencia que comprende las posiciones de los aminoácidos 1 a 89 de SEQ ID NO:4. En otro aspecto, un polipéptido THAP-2 puede comprender un dominio THAP en el que al menos aproximadamente 95%, 90%, 85%, 50-80%, preferiblemente al menos aproximadamente 60-70%, más preferiblemente al menos aproximadamente 65% de los restos aminoácidos son aminoácidos idénticos o similares al dominio consenso THAP (SEQ ID NO:1-2). También se incluyen en la presente invención los ácidos nucleicos aislados, purificados, que codifican un polipéptido THAP-2 que comprenden, que consisten esencialmente en, o que consisten en un dominio THAP en las posiciones de los aminoácidos de 1 a 89 que aparecen en SEQ ID NO:4, o sus fragmentos o variantes. Preferiblemente, dicho polipéptido THAP-2 comprende un dominio de unión a PAR4 y/o un dominio de unión a ADN.

En una realización preferida, la proteína THAP-3 comprende, consiste esencialmente en, o consiste en un dominio THAP THAP-3, que preferiblemente tiene la secuencia de aminoácidos de las posiciones de los aminoácidos 1 a 89 mostrados en SEQ ID NO:5, o sus fragmentos o variantes. La invención también se refiere al polipéptido codificado por las secuencias de nucleótidos de THAP-3 de la invención, o su secuencia complementaria o su fragmento. Por tanto, la presente invención también incluye polipéptidos aislados, purificados y recombinantes que comprenden, que consisten esencialmente en, o que consisten en un tramo contiguo de al menos 6 aminoácidos, preferiblemente de al menos 8 a 10 aminoácidos, más preferiblemente de al menos 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 70, 80 u 89 aminoácidos de una secuencia que comprende las posiciones de los aminoácidos 1 a 89 de SEQ ID NO:5. En otro aspecto, un polipéptido THAP-3 puede comprender un dominio THAP en el que al menos aproximadamente 95%, 90%, 85%, 50-80%, preferiblemente al menos aproximadamente 60-70%, más preferiblemente al menos aproximadamente 65% de los restos aminoácidos son aminoácidos idénticos o similares al dominio consenso THAP (SEQ ID NO:1-2). También se incluyen en la presente invención los ácidos nucleicos aislados, purificados, que codifican un polipéptido THAP-3 que comprenden, que consisten esencialmente en, o que consisten en un dominio THAP en las posiciones de los aminoácidos de 1 a 89 que aparecen en SEQ ID NO:5, o sus fragmentos o variantes. Preferiblemente, dicho polipéptido THAP-3 comprende un dominio de unión a PAR4 y/o un dominio de unión a ADN.

En una realización preferida, la proteína THAP-4 comprende, consiste esencialmente en, o consiste en un dominio THAP THAP-4, que preferiblemente tiene la secuencia de aminoácidos de las posiciones de los aminoácidos 1 a 90 mostrados en SEQ ID NO:6, o sus fragmentos o variantes. La invención también se refiere al polipéptido codificado por las secuencias de nucleótidos de THAP-4 de la invención, o su secuencia complementaria o su fragmento. Por tanto, la presente invención también incluye polipéptidos aislados, purificados y recombinantes que comprenden, que consisten esencialmente en, o que consisten en un tramo contiguo de al menos 6 aminoácidos, preferiblemente de al menos 8 a 10 aminoácidos, más preferiblemente de al menos 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 70, 80 ó 90 aminoácidos de una secuencia que comprende las posiciones de los aminoácidos 1 a 90 de SEQ ID NO:6. En otro aspecto, un polipéptido THAP-4 puede comprender un dominio THAP en el que al menos aproximadamente 95%, 90%, 85%, 50-80%, preferiblemente al menos aproximadamente 60-70%, más preferiblemente al menos aproximadamente 65% de los restos aminoácidos son aminoácidos idénticos o similares al dominio consenso THAP (SEQ ID NO:1-2). También se incluyen en la presente invención los ácidos nucleicos aislados, purificados, que codifican un polipéptido THAP-4 que comprenden, que consisten esencialmente en, o que consisten en un dominio THAP en las posiciones de los aminoácidos de 1 a 90 que aparecen en SEQ ID NO:6, o sus fragmentos o variantes.

En una realización preferida, la proteína THAP-5 comprende, consiste esencialmente en, o consiste en un dominio THAP THAP-5, que preferiblemente tiene la secuencia de aminoácidos de las posiciones de los aminoácidos 1 a 90 mostrados en SEQ ID NO:7, o sus fragmentos o variantes. La invención también se refiere al polipéptido codificado por las secuencias de nucleótidos de THAP-5 de la invención, o su secuencia complementaria o su fragmento. Por tanto, la presente invención también incluye polipéptidos aislados, purificados y recombinantes que comprenden, que consisten esencialmente en, o que consisten en un tramo contiguo de al menos 6 aminoácidos, preferiblemente de al menos 8 a 10 aminoácidos, más preferiblemente de al menos 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 70, 80 ó 90 aminoácidos de una secuencia que comprende las posiciones de los aminoácidos 1 a 90 de SEQ ID NO:7. En otro aspecto, un polipéptido THAP-5 puede comprender un dominio THAP en el que al menos aproximadamente 95%, 90%, 85%, 50-80%, preferiblemente al menos aproximadamente 60-70%, más preferiblemente al menos aproximadamente 65% de los restos aminoácidos son aminoácidos idénticos o similares al dominio consenso THAP (SEQ ID NO:1-2). También se incluyen en la presente invención los ácidos nucleicos aislados, purificados, que codifican un polipéptido THAP-5 que comprenden, que consisten esencialmente en, o que consisten en un dominio THAP en las posiciones de los aminoácidos de 1 a 90 que aparecen en SEQ ID NO:7, o sus fragmentos o variantes.

En una realización preferida, la proteína THAP-6 comprende, consiste esencialmente en, o consiste en un dominio THAP THAP-6, que preferiblemente tiene la secuencia de aminoácidos de las posiciones de los aminoácidos 1 a 90 mostrados en SEQ ID NO:8, o sus fragmentos o variantes. La invención también se refiere al polipéptido codificado por las secuencias de nucleótidos de THAP-5 de la invención, o su secuencia complementaria o su fragmento. Por tanto, la presente invención también incluye polipéptidos aislados, purificados y recombinantes que comprenden, que consisten esencialmente en, o que consisten en un tramo contiguo de al menos 6 aminoácidos, preferiblemente de al menos 8 a 10 aminoácidos, más preferiblemente de al menos 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 70, 80 ó 90 aminoácidos de una secuencia que comprende las posiciones de los aminoácidos 1 a 90 de SEQ ID NO:8. En otro aspecto, un polipéptido THAP-6 puede comprender un dominio THAP en el que al menos aproximadamente 95%, 90%, 85%, 50-80%, preferiblemente al menos aproximadamente 60-70%, más preferiblemente al menos aproximadamente 65% de los restos aminoácidos son aminoácidos idénticos o similares al dominio consenso THAP (SEQ ID NO:1-2). También se incluyen en la presente invención los ácidos nucleicos aislados, purificados, que codifican un polipéptido THAP-6 que comprenden, que consisten esencialmente en, o que consisten en un dominio THAP en las posiciones de los aminoácidos de 1 a 90 que aparecen en SEQ ID NO:8, o sus fragmentos o variantes.

En una realización preferida, la proteína THAP-7 comprende, consiste esencialmente en, o consiste en un dominio THAP THAP-7, que preferiblemente tiene la secuencia de aminoácidos de las posiciones de los aminoácidos 1 a 90 mostrados en SEQ ID NO:9, o sus fragmentos o variantes. La invención también se refiere al polipéptido codificado por las secuencias de nucleótidos de THAP-7 de la invención, o su secuencia complementaria o su fragmento. Por tanto, la presente invención también incluye polipéptidos aislados, purificados y recombinantes que comprenden, que consisten esencialmente en, o que consisten en un tramo contiguo de al menos 6 aminoácidos, preferiblemente de al menos 8 a 10 aminoácidos, más preferiblemente de al menos 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 70, 80 ó 90 aminoácidos de una secuencia que comprende las posiciones de los aminoácidos 1 a 90 de SEQ ID NO:9. En otro aspecto, un polipéptido THAP-7 puede comprender un dominio THAP en el que al menos aproximadamente 95%, 90%, 85%, 50-80%, preferiblemente al menos aproximadamente 60-70%, más preferiblemente al menos aproximadamente 65% de los restos aminoácidos son aminoácidos idénticos o similares al dominio consenso THAP (SEQ ID NO:1-2). También se incluyen en la presente invención los ácidos nucleicos aislados, purificados, que codifican un polipéptido THAP-7 que comprenden, que consisten esencialmente en, o que consisten en un dominio THAP en las posiciones de los aminoácidos de 1 a 90 que aparecen en SEQ ID NO:9, o sus fragmentos o variantes.

En una realización preferida, la proteína THAP-8 comprende, consiste esencialmente en, o consiste en un dominio THAP THAP-8, que preferiblemente tiene la secuencia de aminoácidos de las posiciones de los aminoácidos 1 a 92 mostrados en SEQ ID NO:10, o sus fragmentos o variantes. La invención también se refiere al polipéptido codificado por las secuencias de nucleótidos de THAP-8 de la invención, o su secuencia complementaria o su fragmento. Por tanto, la presente invención también incluye polipéptidos aislados, purificados y recombinantes que comprenden, que consisten esencialmente en, o que consisten en un tramo contiguo de al menos 6 aminoácidos, preferiblemente de al menos 8 a 10 aminoácidos, más preferiblemente de al menos 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 70, 80 ó 90 aminoácidos de una secuencia que comprende las posiciones de los aminoácidos 1 a 92 de SEQ ID NO:10. En otro aspecto, un polipéptido THAP-8 puede comprender un dominio THAP en el que al menos aproximadamente 95%, 90%, 85%, 50-80%, preferiblemente al menos aproximadamente 60-70%, más preferiblemente al menos aproximadamente 65% de los restos aminoácidos son aminoácidos idénticos o similares al dominio consenso THAP (SEQ ID NO:1-2). También se incluyen en la presente invención los ácidos nucleicos aislados, purificados, que codifican un polipéptido THAP-8 que comprenden, que consisten esencialmente en, o que consisten en un dominio THAP en las posiciones de los aminoácidos de 1 a 92 que aparecen en SEQ ID NO:10, o sus fragmentos o variantes.

En una realización preferida, la proteína THAP-9 comprende, consiste esencialmente en, o consiste en un dominio THAP THAP-9, que preferiblemente tiene la secuencia de aminoácidos de las posiciones de los aminoácidos 1 a 92 mostrados en SEQ ID NO:11, o sus fragmentos o variantes. La invención también se refiere al polipéptido codificado por las secuencias de nucleótidos de THAP-9 de la invención, o su secuencia complementaria o su fragmento. Por tanto, la presente invención también incluye polipéptidos aislados, purificados y recombinantes que comprenden, que consisten esencialmente en, o que consisten en un tramo contiguo de al menos 6 aminoácidos, preferiblemente de al menos 8 a 10 aminoácidos, más preferiblemente de al menos 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 70, 80 ó 90 aminoácidos de una secuencia que comprende las posiciones de los aminoácidos 1 a 92 de SEQ ID NO:11. En otro aspecto, un polipéptido THAP-9 puede comprender un dominio THAP en el que al menos aproximadamente 95%, 90%, 85%, 50-80%, preferiblemente al menos aproximadamente 60-70%, más preferiblemente al menos aproximadamente 65% de los restos aminoácidos son aminoácidos idénticos o similares al dominio consenso THAP (SEQ ID NO:1-2). También se incluyen en la presente invención los ácidos nucleicos aislados, purificados, que codifican un polipéptido THAP-9 que comprenden, que consisten esencialmente en, o que consisten en un dominio THAP en las posiciones de los aminoácidos de 1 a 92 que aparecen en SEQ ID NO:11, o sus fragmentos o
variantes.

En una realización preferida, la proteína THAP10 comprende, consiste esencialmente en, o consiste en un dominio THAP THAP10, que preferiblemente tiene la secuencia de aminoácidos de las posiciones de los aminoácidos 1 a 90 mostrados en SEQ ID NO:12, o sus fragmentos o variantes. La invención también se refiere al polipéptido codificado por las secuencias de nucleótidos de THAP10 de la invención, o su secuencia complementaria o su fragmento. Por tanto, la presente invención también incluye polipéptidos aislados, purificados y recombinantes que comprenden, que consisten esencialmente en, o que consisten en un tramo contiguo de al menos 6 aminoácidos, preferiblemente de al menos 8 a 10 aminoácidos, más preferiblemente de al menos 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 70, 80 ó 90 aminoácidos de una secuencia que comprende las posiciones de los aminoácidos 1 a 90 de SEQ ID NO:12. En otro aspecto, un polipéptido THAP10 puede comprender un dominio THAP en el que al menos aproximadamente 95%, 90%, 85%, 50-80%, preferiblemente al menos aproximadamente 60-70%, más preferiblemente al menos aproximadamente 65% de los restos aminoácidos son aminoácidos idénticos o similares al dominio consenso THAP (SEQ ID NO:1-2). También se incluyen en la presente invención los ácidos nucleicos aislados, purificados, que codifican un polipéptido THAP10 que comprenden, que consisten esencialmente en, o que consisten en un dominio THAP en las posiciones de los aminoácidos de 1 a 90 que aparecen en SEQ ID NO:12, o sus fragmentos o variantes.

En una realización preferida, la proteína THAP11 comprende, consiste esencialmente en, o consiste en un dominio THAP THAP11, que preferiblemente tiene la secuencia de aminoácidos de las posiciones de los aminoácidos 1 a 90 mostrados en SEQ ID NO:13, o sus fragmentos o variantes. La invención también se refiere al polipéptido codificado por las secuencias de nucleótidos de THAP11 de la invención, o su secuencia complementaria o su fragmento. Por tanto, la presente invención también incluye polipéptidos aislados, purificados y recombinantes que comprenden, que consisten esencialmente en, o que consisten en un tramo contiguo de al menos 6 aminoácidos, preferiblemente de al menos 8 a 10 aminoácidos, más preferiblemente de al menos 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 70, 80 ó 90 aminoácidos de una secuencia que comprende las posiciones de los aminoácidos 1 a 90 de SEQ ID NO:13. En otro aspecto, un polipéptido THAP11 puede comprender un dominio THAP en el que al menos aproximadamente 95%, 90%, 85%, 50-80%, preferiblemente al menos aproximadamente 60-70%, más preferiblemente al menos aproximadamente 65% de los restos aminoácidos son aminoácidos idénticos o similares al dominio consenso THAP (SEQ ID NO:1-2). También se incluyen en la presente invención los ácidos nucleicos aislados, purificados, que codifican un polipéptido THAP11 que comprenden, que consisten esencialmente en, o que consisten en un dominio THAP en las posiciones de los aminoácidos de 1 a 90 que aparecen en SEQ ID NO:13, o sus fragmentos o
variantes.

En una realización preferida, la proteína THAP-0 comprende, consiste esencialmente en, o consiste en un dominio THAP THAP-0, que preferiblemente tiene la secuencia de aminoácidos de las posiciones de los aminoácidos 1 a 90 mostrados en SEQ ID NO:14, o sus fragmentos o variantes. La invención también se refiere al polipéptido codificado por las secuencias de nucleótidos de THAP-0 de la invención, o su secuencia complementaria o su fragmento. Por tanto, la presente invención también incluye polipéptidos aislados, purificados y recombinantes que comprenden, que consisten esencialmente en, o que consisten en un tramo contiguo de al menos 6 aminoácidos, preferiblemente de al menos 8 a 10 aminoácidos, más preferiblemente de al menos 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 70, 80 ó 90 aminoácidos de una secuencia que comprende las posiciones de los aminoácidos 1 a 90 de SEQ ID NO:14. En otro aspecto, un polipéptido THAP-0 puede

Evaluación de polipéptidos, métodos para obtener polipéptidos y ácidos nucleicos variantes

Cada término mencionado en las siguientes realizaciones que esté precedido por el término "THAP" se refiere al polipéptido de la presente invención, es decir, THAP1, a menos que THAP1 se mencione específicamente en las siguientes realizaciones.

Se apreciará que caracterizando la función de los polipéptidos de la familia THAP, la invención proporciona además métodos para ensayar la actividad o para obtener fragmentos funcionales y variantes de secuencias de nucleótidos de la familia THAP y de dominio THAP que implican proporcionar un ácido nucleico de la familia THAP o de dominio THAP variante o modificado, y evaluar si un polipéptido codificado por éstos muestra una actividad de la familia THAP de la invención. Por tanto, se incluye un método para evaluar la función de un polipéptido de la familia THAP o de dominio THAP que comprende: (a) proporcionar un polipéptido de la familia THAP o de dominio THAP, o su fragmento biológicamente activo o su homólogo; y (b) ensayar dicho polipéptido de la familia THAP o de dominio THAP, o su fragmento biológicamente activo o su homólogo, para una actividad de la familia THAP. Puede utilizarse cualquier formato apropiado, incluyendo formatos exentos de células, basados en células o in vivo. Por ejemplo, dicho ensayo puede comprender expresar un ácido nucleico de la familia THAP o de dominio THAP en una célula hospedante y observar una actividad de la familia THAP en dicha célula. En otro ejemplo, un polipéptido de la familia THAP o de dominio THAP, o su fragmento biológicamente activo o su homólogo, se introduce en una célula y se observa una actividad de la familia THAP. La actividad de la familia THAP puede ser cualquier actividad como se describe en la presente, incluyendo (1) la mediación en la apoptosis o la proliferación celular cuando se expresa o se introduce en una célula, lo más preferiblemente la inducción o la potenciación de la apoptosis y/o lo más preferiblemente la reducción de la proliferación celular; (2) la mediación en la apoptosis o la proliferación celular de una célula endotelial; (3) la mediación en la apoptosis o la proliferación celular de una célula hiperproliferativa; (4) la mediación en la apoptosis o la proliferación celular de una célula del SNC, preferiblemente una célula neuronal o glial; o (5) una actividad determinada en un animal seleccionada del grupo que consiste en la mediación, preferiblemente la inhibición, de la angiogénesis, la mediación, preferiblemente la inhibición, de la inflamación, la inhibición del potencial metastásico de tejido canceroso, la reducción de la carga tumoral, el aumento de la sensibilidad a la quimioterapia o la radioterapia, la muerte de una célula de cáncer, la inhibición del crecimiento de una célula de cáncer, o la inducción de la regresión tumoral.

Además de los variantes alélicos naturales de las secuencias THAP1 que puedan existir en la población, los expertos en la técnica apreciarán que pueden introducirse cambios mediante mutación en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:160, conduciendo con ello a cambios en la secuencia de aminoácidos de la proteína THAP1 codificada, alterando o no la capacidad funcional de las proteínas THAP1.

Se contemplan varios tipos de variantes, incluyendo 1) aquellos en los que uno o más de los restos aminoácidos están sustituidos por un resto aminoácido conservado o no conservado, y este resto aminoácido sustituido puede estar codificado o no por el código genético, o 2) aquellos en los que uno o más de los restos aminoácidos incluyen un grupo sustituyente, o 3) aquellos en los que el polipéptido THAP1 mutado está condensado con otro compuesto, como un compuesto para aumentar la semivida del polipéptido (por ejemplo, polietilenglicol), o 4) aquellos en los que los aminoácidos adicionales están condensados al polipéptido THAP1 mutado, como una secuencia conductora o secretora, o una secuencia que se emplea para la purificación del polipéptido THAP1 mutado o una secuencia de preproteína. Se considera que estos variantes están dentro del alcance de los expertos en la técnica.

Por ejemplo, pueden realizarse sustituciones de nucleótidos que conduzcan a sustituciones de aminoácidos en la secuencia de SEQ ID NO:160 que no cambien sustancialmente la actividad biológica de la proteína. Un resto aminoácido puede alterarse con respecto a la secuencia de tipo salvaje que codifica un polipéptido THAP1, o su fragmento biológicamente activo o su homólogo, sin alterar la actividad biológica. En general, se predice que los restos aminoácidos que se conservan dentro de la familia THAP de proteínas que contienen el dominio THAP descritas en la presente, sean menos susceptibles a la alteración. Además, otros restos aminoácidos conservados pueden ser aminoácidos que están conservados entre las proteínas de la familia THAP descritas en la presente.

En un aspecto, la invención se refiere a moléculas de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos de la familia THAP o de dominio THAP, o sus fragmentos biológicamente activos o sus homólogos, que contienen cambios en restos aminoácidos que no son esenciales para la actividad. Estas proteínas de la familia THAP se diferencian en la secuencia de aminoácidos de la secuencia SEQ ID NO:3, pero mantienen la actividad biológica. En una realización, la molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína, en la que la proteína comprende una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente 60% homóloga con una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO:3. Preferiblemente, la proteína codificada por la molécula de ácido nucleico es al menos aproximadamente 65-70% homóloga con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3, más preferiblemente comparte al menos aproximadamente 75-80% de coincidencia con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3, aún más preferiblemente comparte al menos aproximadamente 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99,8% de coincidencia con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3.

En otro aspecto, la invención se refiere a moléculas de ácidos nucleicos que codifican proteínas de la familia THAP que contienen cambios en los restos aminoácidos que produzcan una mayor actividad biológica, o una actividad biológica modificada. En otro aspecto, la invención se refiere a moléculas de ácidos nucleicos que codifican proteínas de la familia THAP que contienen cambios en restos aminoácidos que son esenciales para una actividad de la familia THAP. Estas proteínas de la familia THAP se diferencian en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3 y muestra una reducción o esencialmente carecen de una o más actividades de la familia THAP. La invención también incluye un polipéptido THAP1, o su fragmento biológicamente activo o su homólogo, que puede ser útil como mutante negativo dominante de un polipéptido THAP1.

Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido de la familia THAP o de dominio THAP, o su fragmento biológicamente activo o su homólogo, que es homóloga con una proteína de SEQ ID NO:3 puede crearse introduciendo una o más sustituciones, adiciones o deleciones de nucleótidos en los aminoácidos de SEQ ID NO:3, de forma que una o o más sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos se introducen en la proteína codificada. Las mutaciones pueden introducirse en SEQ ID NO:3 mediante técnicas convencionales, como mutagénesis específica dirigida a sitio y mutagénesis mediada por PCR. Por ejemplo, pueden realizarse sustituciones de aminoácidos conservadoras en uno o más restos aminoácidos no esenciales predichos. Una "sustitución de aminoácidos conservadora" es aquella en que el resto aminoácido se reemplaza por un resto aminoácido que tiene una cadena lateral similar. En la técnica se han definido familias de restos aminoácidos que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Por tanto, un resto aminoácido no esencial predicho en un polipéptido de la familia THAP o de dominio THAP, o su fragmento biológicamente activo o su homólogo, puede ser reemplazado por otro resto aminoácido de la misma familia de cadenas laterales. Como alternativa, en otra realización, pueden introducirse mutaciones aleatoriamente a lo largo o en parte de una secuencia codificadora de la familia THAP o de dominio THAP, como mediante mutagénesis de saturación, y los mutantes resultantes pueden seleccionarse para una actividad biológica de la familia THAP para identificar mutantes que conserven la actividad. Después de la mutagénesis de SEQ ID NO:3, la proteína codificada puede expresarse de manera recombinante y puede determinarse la actividad de la proteína.

En una realización preferida, un polipéptido de la familia THAP o de dominio THAP mutante, o su fragmento biológicamente activo o su homólogo, codificado por un polipéptido de la familia THAP o de dominio THAP, o su fragmento biológicamente activo o su homólogo, de un ácido nucleido de dominio THAP de la invención puede ensayarse para una actividad de la familia THAP en cualquier ensayo adecuado, proporcionándose ejemplos en la presente.

La invención también proporciona proteínas quiméricas o de fusión de la familia THAP o de dominio THAP. Tal como se emplea en la presente, una "proteína quimérica" o una "proteína de fusión" de la familia THAP o de dominio THAP comprende un polipéptido de la familia THAP o de dominio THAP de la invención unido operativamente, preferiblemente condensado dentro del marco, con un polipéptido que no es de la familia THAP ni de dominio THAP. En una realización preferida, una proteína de fusión de la familia THAP o de dominio THAP comprende al menos una porción biológicamente activa de una proteína de la familia THAP o de dominio THAP. En otra realización preferida, una proteína de fusión de la familia THAP comprende al menos dos porciones biológicamente activas de una proteína de la familia THAP. Por ejemplo, en una realización, la proteína de fusión es una proteína de fusión de la familia THAP-GST, en la que las secuencias de la familia THAP están condensadas con el C-terminal de las secuencias GST. Estas proteínas de fusión pueden facilitar la purificación de polipéptidos de la familia THAP recombinantes. En otra realización, la proteína de fusión es una proteína de la familia THAP que contiene una secuencia señal heteróloga en su N-terminal, como por ejemplo para permitir una localización celular deseada en una célula hospedante concreta.

Las proteínas de fusión de la familia THAP o de dominio THAP de la invención pueden incorporarse en composiciones farmacéuticas y administrarse a un sujeto in vivo. Además, las proteínas de fusión de la familia THAP o de dominio THAP de la invención pueden utilizarse como inmunógenos para producir anticuerpos anti-familia THAP o anti-dominio THAP en un sujeto, para purificar ligandos de la familia THAP o de dominio THAP, y en ensayos de selección para identificar moléculas que inhiben la interacción de la familia THAP o del dominio THAP con una molécula diana de la familia THAP o de dominio THAP.

Además, también pueden obtenerse porciones peptidílicas aisladas de las proteínas de la familia THAP o de dominio THAP concretas seleccionando péptidos producidos de manera recombinante producidos a partir del correspondiente fragmento de ácido nucleico que codifica dichos péptidos. Además, pueden sintetizarse fragmentos de modo químico utilizando técnicas conocidas en la técnica, como la química de t-Boc o f-Moc en fase sólida de Merrifield convencional. Por ejemplo, una proteína de la familia THAP o de dominio THAP de la presente invención puede dividirse arbitrariamente en fragmentos con una longitud deseada sin que se solapen los fragmentos, o preferiblemente se dividen en fragmentos solapantes de una longitud deseada. Los fragmentos pueden producirse (de manera recombinante o mediante síntesis química) y ensayarse para identificar aquellos fragmentos peptidílicos que pueden actuar como agonistas o antagonistas de una actividad de una proteína de la familia THAP, como mediante ensayos de microinyección o ensayos de unión de proteína in vitro. En una realización ilustrativa, las porciones peptidílicas de una proteína de la familia THAP, como una región de unión de la diana de la familia THAP o de dominio THAP (por ejemplo, PAR4 en el caso de THAP1, THAP-2 y THAP3), puede ensayarse para una actividad de la familia THAP mediante su expresión como proteínas de fusión de tiorredoxina, cada una de las cuales contiene un fragmento discreto de la proteína de la familia THAP (véanse, por ejemplo, las patentes de EEUU 5.270.181 y 5.292.646; y la publicación PCT WO94/02502).

La presente invención también se refiere a variantes de proteínas de la familia THAP o de dominio THAP que actúan como miméticos de la familia THAP o del dominio THAP, o como inhibidores de la familia THAP o del dominio THAP. Pueden generarse variantes de proteínas de la familia THAP o de dominio THAP mediante mutagénesis, por ejemplo mutaciones puntuales discretas o truncamiento de una proteína de la familia THAP o de dominio THAP. Un agonista de una proteína de la familia THAP o de dominio THAP puede mantener sustancialmente la misma, o un subconjunto, de actividades biológicas de una forma natural de una proteína de la familia THAP o de dominio THAP. Un antagonista de una proteína de la familia THAP o de dominio THAP puede inhibir una o más actividades de la forma natural de la proteína de la familia THAP o de dominio THAP, por ejemplo inhibiendo competitivamente la asociación de una proteína de la familia THAP o de dominio THAP con una molécula diana de la familia THAP. Por tanto, pueden provocarse efectos biológicos específicos mediante un tratamiento con un variante de función limitada. En una realización, pueden identificarse variantes de una proteína de la familia THAP o de dominio THAP que actúen como agonistas de la familia THAP o del dominio THAP (miméticos) o como antagonistas de la familia THAP o del dominio THAP, seleccionando bancos combinatorios de mutantes, por ejemplo mutantes de truncamiento, de una proteína de la familia THAP o de dominio THAP para la actividad agonista o antagonista de la proteína de familia THAP o de dominio THAP. En una realización, se genera un banco variado de variantes de la familia THAP mediante mutagénesis combinatoria a nivel de los ácidos nucleicos y que está codificado por un banco de genes variados. Un banco variado de variantes de la familia THAP puede producirse, por ejemplo acoplando enzimáticamente una mezcla de oligonucleótidos sintéticos en secuencias génicas, de forma que un conjunto degenerado de secuencias de la familia THAP potenciales puede expresarse como polipéptidos individuales o, como alternativa, como un conjunto de proteínas de fusión más grandes (por ejemplo, para la presentación de fagos) que contienen el conjunto de secuencias de la familia THAP. Existe una diversidad de métodos que pueden usarse para producir bancos de variantes de la familia THAP potenciales a partir de secuencias olingonucleotídicas degeneradas. Puede realizarse la síntesis química de una secuencia génica degenerada en un sintetizador de ADN automático, y el gen sintético después puede acoplarse en un vector de expresión apropiado. El uso de un conjunto degenerado de genes permite conseguir, en una mezcla, todas las secuencias que codifican el conjunto deseado de secuencias de la familia THAP potenciales.

Además, pueden emplearse bancos de fragmentos de una secuencia codificadora de una proteína de la familia THAP o de dominio THAP para generar una población variada de fragmentos de la familia THAP o de dominio THAP para la busqueda y posterior selección de variantes de una proteína de la familia THAP o de dominio THAP. En una realización, un banco de fragmentos de secuencia codificadora puede generarse tratando un fragmento de PCR bicatenario de una secuencia codificadora de la familia THAP con una nucleasa bajo condiciones en que se produce una mella sólo aproximadamente una vez por molécula, desnaturalizando el ADN bicatenario, renaturalizando el ADN para formar un ADN bicatenario que puede incluir parejas sentido/antisentido procedentes de diferentes productos con mella, retirando las porciones monocatenarias de los dúplex reformados mediante un tratamiento con nucleasa S1, y acoplando el banco de fragmentos resultantes en un vector de expresión. Mediante este método puede derivarse un banco de expresión que codifica fragmentos N-terminales, C-terminales e internos de diversos tamaños de la proteína de la familia THAP.

Pueden utilizarse proteínas de la familia THAP o de dominio THAP modificadas para objetivos como potenciar la eficacia terapéutica o profiláctica, o la estabilidad (por ejemplo la caducidad ex vivo y la resistencia a la degradación proteolítica in vivo). Estos péptidos modificados, cuando se diseñan para que mantengan al menos una actividad de la forma natural de la proteína, se consideran equivalentes funcionales de la proteína de la familia THAP o de dominio THAP descrita con más detalle en la presente. Estos péptidos modificados pueden producirse, por ejemplo mediante sustitución, deleción o adición de aminoácidos.

Puede determinarse con facilidad si un cambio en la secuencia de aminoácidos de un péptido da como resultado un homólogo de la familia THAP o de dominio THAP funcional (por ejemplo, funcional en el sentido de que actúe para imitar o antagonizar la forma de tipo salvaje) evaluando la capacidad del péptido variante para producir una respuesta en células de una manera similar a la proteína de la familia THAP o de dominio THAP de tipo salvaje, o si inhibe competitivamente dicha respuesta. Los péptidos en que se ha producido más de un reemplazo pueden ensayarse con facilidad de la misma manera.

Esta invención también contempla un método para generar conjuntos de mutantes combinatorios de las proteínas de la familia THAP o de dominio THAP descritas en la presente, así como mutantes de truncamiento y de fragmentación, y es especialmente útil para identificar secuencias variantes potenciales que sean funcionales para unirse a una proteína de la familia THAP o de dominio THAP pero que se diferencien del tipo salvaje de la proteína, por ejemplo en eficacia, potencia y/o semivida intracelular. Un objetivo para seleccionar dichos bancos combinatorios es, por ejemplo, aislar nuevos homólogos de la familia THAP o de dominio THAP que actúen como agonista o antagonista de las actividad biológicas de la proteína de tipo salvaje o, como alternativa, que posean nuevas actividades en conjunto. Por ejemplo, la mutagénesis puede producir homólogos de la familia THAP que tengan una semividas intracelulares muy diferentes a la correspondiente proteína de tipo salvaje. La proteína alterada puede hacerse más estable o menos estable a la degradación proteolítica u otros procesos celulares que producen la destrucción, o una inactivación de otro modo, de una proteína de la familia THAP. Estos homólogos de la familia THAP, y los genes que los codifican, pueden utilizarse para alterar la envuelta de expresión de una proteína de la familia THAP recombinante concreta modulando la semivida de la proteína recombinante. Por ejemplo, una semivida corta puede generar unos efectos biológicos más transitorios asociados con una proteína de la familia THAP recombinante concreta y, cuando forma parte de un sistema de expresión inducible, puede permitir un control más estricto de los niveles de proteínas recombinantes dentro de una célula. Como antes, dichas proteínas y en particular sus construcciones de ácidos nucleicos recombinantes puede utilizarse en protocolos de terapia génica.

En una realización ilustrativa de este método, las secuencias de aminoácidos para una población de homólogos de la familia THAP u otras proteínas relacionadas se alinea, preferiblemente para estimular la mayor homología posible. Esta población de variantes puede incluir, por ejemplo, homólogos de la familia THAP para una o más especies, u homólogos de la familia THAP procedentes de la misma especie pero que se diferencian debido a mutaciones. Los aminoácidos que aparecen en cada posición de las secuencias alineadas se seleccionan para crear un conjunto degenerado de secuencias combinatorias. Existen muchas formas mediante las cuales el banco de homólogos de la familia THAP potenciales puede generarse a partir de una secuencia oligonucleotídica degenerada. La síntesis química de una secuencia génica degenerada puede realizarse en un sintetizador de ADN automático, y los genes sintéticos entonces pueden acoplarse en un gen apropiado para la expresión. El objetivo de un conjunto degenerado de genes es proporcionar, en una mezcla, todas las secuencias que codifican un conjunto deseado de secuencias de la familia THAP potenciales. La síntesis de oligonucleótidos degenerados es muy conocida en la técnica (véase, por ejemplo, Narang, S.A. (1983), Tetrahedron, 393; Itakura et al. (1981), Recombinant DNA, Proc 3rd Cleveland Sympos. Macromolecules, ed. AG Walton, Amsterdam: Elsevier, pp. 273-289; Itakura et al. (1984), Annu. Rev. Biochem., 53:323; Itakura et al. (1984), Science, 198:1056; Ike et al. (1983), Nucleic Acid Res., 11:477. Estas técnicas se han empleado en la evolución dirigida de otras proteínas (véase, por ejemplo, Scott et al. (1990), Science, 249:386-390; Roberts et al. (1992), PNAS, 89:2429-2433; Devlin et al. (1990), Science 249: 404-406; Cwirla et al. (1990), PNAS, 87:6378-6382; así como las patentes de EEUU nº 5.223.409, 5.198.346, y 5.096.815).

Como alternativa, pueden utilizarse otras formas de mutagénesis para generar un banco combinatorio, en particular cuando otros homólogos naturales aún no se han secuenciado. Por ejemplo, pueden generarse homólogos de la familia THAP (formas agonistas y antagonistas) y aislarse a partir de un banco mediante selección, por ejemplo utilizando mutagénesis de barrido de alanina y similares (Ruf et al. (1994), Biochemistry, 33:1565-1572; Wang et al. (1994), J. Biol. Chem., 269:3095-3099; Balint et al. (1993), Gene, 137:109-118; Grodberg et al. (1993), Eur. J Biochem., 218:597-601; Nagashima et al. (1993), J. Biol. Chem., 268:2888-2892; Lowman et al. (1991), Biochemistry, 30:10832-10838; y Cunningham et al. (1989), Science, 244:1081-1085), mediante mutagénesis de barrido de conectores (Gustin et al. (1993), Virology, 193:653-660; Brown et al. (1992), Mol. Cell Biol., 12:2644-2652; McKnight et al. (1982), Science, 232:316); mediante mutagénesis de saturación (Meyers et al. (1986), Science, 232:613); mediante mutagénesis de PCR (Leung et al. (1989), Method Cell. Mol. Biol., 1: 1-19); o mediante mutagénesis aleatoria (Miller et al. (1992), A Short Course in Bacterial Genetics, CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY; y Greener et al. (1994), Strategies in Mol. Biol., 7:32-34).

Se conoce una amplia gama de técnicas en la técnica para seleccionar productos génicos de bancos combinatorios fabricados mediante mutaciones puntuales, así como para seleccionar bancos de ADNc para productos génicos que tengan cierta propiedad. Estas técnicas serán adaptables, en general, para la selección rápida de bancos génicos generados mediante mutagénesis combinatoria de proteínas de la familia THAP. Las técnicas más ampliamente utilizadas para seleccionar grandes bancos de genes comprenden, de forma típica, clonar el banco génico en vectores de expresión replicables, transformar las células apropiadas con el banco resultante de vectores, y expresar los genes combinatorios bajo condiciones en que la detección de una actividad deseada facilita un aislamiento relativamente fácil del vector que codifica el gen cuyo producto se detecta.

Cada uno de los ensayos ilustrativos que se describen a continuación puede adaptarse a un análisis de alta capacidad de procesamiento, necesario para seleccionar grandes cantidades de secuencias de la familia THAP o de dominio THAP degeneradas creadas mediante técnicas de mutagénesis combinatoria. En un ensayo de selección, los productos génicos candidatos se presentan sobre la superficie de una célula o partícula vírica, y se detecta la capacidad de las células o partículas víricas particulares para unirse a una molécula diana de la familia THAP (proteína o ADN) a través de este producto génico, en un ensayo de inmunoplaqueteo ("panning"). Por ejemplo, el banco de genes puede clonarse en el gen para una proteína de la membrana superficial de una célula bacteriana, y la proteína de fusión resultante se detecta mediante inmunoplaqueteo (Ladner et al., documento WO 88/06630; Fuchs et al. (1991), BiolTechnology, 9:1370-1371; y Goward et al. (1992), TIBS, 18:136 140). De una manera similar, puede utilizarse una diana de la familia THAP marcada de modo fluorescente para detectar homólogos de la familia THAP potencialmente funcionales. Las células pueden examinarse de modo visual y separarse mediante un microscopio de fluorescencia, o cuando la morfología de las células lo permita pueden separarse mediante un selector de células activado por fluorescencia.

En una realización alternativa, el banco de genes se expresa como una proteína de fusión sobre la superficie de una partícula vírica. Por ejemplo, en el sistema de fagos filamentosos, las secuencias peptídicas extrañas pueden expresarse sobre la superficie de un fago infeccioso, confiriendo con ello dos beneficios. En primer lugar, puesto que estos fagos pueden aplicarse a matrices de afinidad a concentraciones muy altas, puede seleccionarse un gran número de fagos al mismo tiempo. En segundo lugar, puesto que cada fago infeccioso muestra el producto del gen combinatorio sobre su superficie, si un fago concreto se recupera de una matriz de afinidad con bajo rendimiento, el fago puede amplificarse mediante otra ronda de infección. El grupo de fagos filamentosos de E. coli M13, fd y fl, casi idénticos, son los que más a menudo se emplean en los bancos de presentación de fagos, puesto que cualquiera de las proteínas de le envuelta del fago gIII o gVIII puede utilizarse para generar proteínas de fusión sin romper la encapsidación final de la partícula vírica ((Ladner et al., publicación PCT WO 90/02909; Garrard et al., publicación PCT WO 92/09690; Marks et al. (1992), J. Biol. Chem., 267:16007-16010; Griffiths et al. (1993), EMBO J., 12:725-734; Clackson et al. (1991), Nature 352:624-628; y Barbas et al. (1992), PNAS 89:4457-4461). En una realización ilustrativa, el sistema de anticuerpos de fagos recombinantes (RPAS, Pharmacia nº de catálogo 27-9400-01) puede modificarse con facilidad para ser utilizado en la expresión de los bancos combinatorios de la familia THAP, y el banco de fagos de la familia THAP puede someterse a inmunoplaqueteo sobre una molécula diana de la familia THAP inmovilizada (proteínas de fusión de GST-diana de la familia THAP inmovilizadas o ADN inmovilizado con glutatión). Unas rondas sucesivas de amplificación de fagos e inmunoplaqueteo pueden enriquecer en gran medida para homólogos de la familia THAP que conserven la capacidad de unirse a la diana de THAP y que posteriormente pueden seleccionarse para actividades biológicas en ensayos automáticos, para distinguir entres agonistas y antagonistas.

La invención también proporciona la identificación y la reducción a un tamaño mínimo funcional de dominios de la familia THAP, en particular de un dominio THAP de la familia THAP concreta, para generar miméticos, por ejemplo agentes peptídicos o no peptídicos, que sean capaces de romper la unión de un polipéptido de la presente invención con una molécula diana de la familia THAP (proteína o ADN). Por tanto, estas técnicas mutagénicas, como se describieron anteriormente, también son útiles para cartografiar los determinantes de proteínas de la familia THAP que participen en interacciones de proteína-proteína o de proteína-ADN implicadas, por ejemplo en la unión a un ADN o proteína diana de la familia THAP o de dominio THAP. Como ilustración, los restos críticos de una proteína de la familia THAP que están implicados en el reconocimiento molecular de la diana de la familia THAP pueden determinarse y utilizarse para generar peptidomiméticos derivados de la diana 13P de la familia THAP que inhiben competitivamente la unión de la proteína de la familia THAP a la diana de la familia THAP. Empleando, por ejemplo, mutagénesis de barrido para cartografiar los restos aminoácidos de una proteína de la familia THAP particular implicada en la unión a una diana de la familia THAP, pueden generarse compuestos peptidomiméticos que imiten a esos restos en la unión a una diana de la familia THAP y que, mediante la inhibición de la unión de la proteína de la familia THAP a la molécula diana de la familia THAP, pueden interferir con la función de una proteína de la familia THAP en la regulación transcripcional de uno o más genes. Por ejemplo, pueden generarse análogos de péptidos hidrolizables de estos restos utilizando péptidos retroinversos (por ejemplo, véanse las patentes de EEUU 5.116.947 y 5.219.089; y Pallai et al. (1983), Int. J. Pept. Protein. Res., 21:84-92), benzodiazepina (por ejemplo, véase Freidinger et al., en Peptides: Chemistry and Biology, G.R. Marshall ed., ESCOM Publisher: Leiden, Países Bajos, 1988), azepina (por ejemplo, véase Huffman et al., en Peptides-Chemistry and Biology, G.R. Marshall ed., ESCOM Publisher: Leiden, Países Bajos, 1988), anillos de gamma-lactama sustituida (Garvey et al., in Peptides: Chemistry and Biology, G.R. Marshall ed., ESCOM Publisher: Leiden, Países Bajos, 1988), pseudopéptidos de ceto-metileno (Ewenson et al. (1986), J. Med. Chem., 29:295; y Ewenson et al., 3n Peptides: Structure and Function (Proceedings of the 9th American Peptide Symposium) Pierce Chemical Co. Rockland, IL, 1985), núcleos de dipéptidos de P-vuelta (Nagai et al. (1985), Tetrahedron Lett., 26:647; y Sato et al. (1986), J. Chem. Soc. Perkin Trans., 1: 123 1), y P-aminoalcoholes (Gordon et al. (1985), Biochem. Biophys Res. Commun., 126:419; y Dann et al. (1986), Biochem. Biophys. Res. Commun., 134:71).

Una proteína de la familia THAP o de dominio THAP aislada, o su porción o fragmentos, puede utilizarse como inmunógeno para generar anticuerpos que se unan a proteínas de la familia THAP o de dominio THAP utilizando técnicas convencionales para la preparación de anticuerpos policlonales y monoclonales. Puede utilizarse una proteína de la familia THAP de longitud completa o, como alternativa, la invención proporciona fragmentos peptídicos antigénicos de proteínas de la familia THAP o de dominio THAP para su uso como inmunógenos. Cualquier fragmento de la proteína de la familia THAP o de dominio THAP que contenga al menos un determinante antigénico puede utilizarse para generar anticuerpos. El péptido antigénico de una proteína de la familia THAP o de dominio THAP comprende al menos 8 restos aminoácidos de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3, e incluye un epitopo de una proteína de la familia THAP o de dominio THAP, de forma que un anticuerpo generado contra el péptido forma un complejo inmunológico específico con una proteína de la familia THAP o de dominio THAP. Preferiblemente, el péptido antigénico comprende al menos 10 restos aminoácidos, más preferiblemente al menos 15 restos aminoácidos, aún más preferiblemente al menos 20 restos aminoácidos, y lo más preferiblemente al menos 30 restos aminoácidos.

Los epítopos preferidos incluidos en el péptido antigénico son las regiones de una proteína de la familia THAP o de dominio THAP que están localizadas sobre la superficie de la proteína, por ejemplo, regiones hidrófilas.

Un inmunógeno de una proteína de la familia THAP o de dominio THAP se emplea de forma típica para preparar anticuerpos inmunizando un sujeto apropiado (por ejemplo, un conejo, una cabra, un ratón u otro mamífero) con el inmunógeno. Una preparación de inmunógeno apropiada puede contener, por ejemplo, una proteína de la familia THAP o de dominio THAP expresada de modo recombinante, o un polipéptido de la familia THAP o de dominio THAP sintetizado de modo químico. La preparación también puede contener un adyuvante, como adyuvante completo o incompleto de Freund, o un aguente inmunoestimulador similar. La inmunización de un sujeto adecuado con una preparación de una proteína de la familia THAP o de dominio THAP inmunogénica induce una respuesta de anticuerpos policlonales a la proteína de la familia THAP o de dominio THAP.

La invención se refiere a composiciones de anticuerpos, policlonales o monoclonales, capaces de unirse de modo selectivo a, o de unir de modo selectivo, un polipéptido que contiene un epitopo que comprende un tramo contiguo de al menos 6 aminoácidos, preferiblemente al menos 8 ó 10 aminoácidos, más preferiblemente al menos 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100 o más de 100 aminoácidos de una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las posiciones de los aminoácidos 1 a aproximadamente 90 de SEQ ID NO:3. La invención también se refiere a un anticuerpo purificado o aislado capaz de unirse de modo específico a una proteína de la familia THAP o de dominio THAP mutada, o a su fragmento o variante, que comprenda un epitopo de la proteína de la familia THAP o de dominio THAP mutada.

Formas oligoméricas de THAP1

Ciertas realizaciones de la presente invención incluyen polipéptidos THAP1 en forma de oligómeros, como dímeros, triméros u oligómeros superiores. Los oligómeros pueden estar formados por enlaces disulfuro entre los restos cisteína sobre diferentes polipéptidos THAP1, por ejemplo. En otras realizaciones, los oligómeros comprenden de dos a cuatro polipéptidos THAP1 unidos mediante interacciones covalentes o no covalentes entre restos peptídicos condensados al polipéptido THAP1. Estos restos peptídicos pueden ser conectores peptídicos (espaciadores), o péptidos que tengan la propiedad de estimular la oligomerización. Las cremalleras de leucina y ciertos polipéptidos derivados de anticuerpos son algunos péptidos que pueden estimular la oligomerización de polipéptidos THAP1 unidos a ellos. En la presente se proporcionan secuencias de ADN que codifican oligómeros de THAP1, o proteínas de fusión que son componentes de dichos oligómeros.

En una realización de la invención, el THAP1 oligomérico puede comprender dos o más polipéptidos THAP1 unidos a través de conectores peptídicos. Los ejemplos incluyen los conectores peptídicos descritos en la patente de EEUU nº 5.073.627. Puede producirse proteínas de fusión que comprenden múltiples polipéptidos THAP1 separados mediante conectores peptídicos utilizando la tecnología de ADN recombinante convencional.

Otro método para preparar oligómeros de THAP1 implica el uso de una cremallera de leucina. Los dominios de cremalleras de leucina son péptidos que estimulan la oligomerización de las proteínas en las que se encuentran. Las cremalleras de leucina se identificaron originariamente en varias proteínas de unión a ADN (Landschulz et al., Science, 240:1759, 1988), y desde entonces se han descubierto en una diversidad de proteínas diferentes. Entre las cremalleras de leucina conocidas se encuentran péptidos naturales y sus derivados que dimerizan o trimerizan. Los ejemplos de dominios de cremallera de leucina adecuados para producir oligómeros de THAP1 están los descritos en la publicación internacional WO 94/10308. Las proteínas de fusión recombinantes que comprenden un polipéptido THAP1 condensado con un péptido que dimeriza o trimeriza en disolución se expresan en células hospedantes adecuadas, y la THAP1 oligomérica soluble resultante se recupera del sobrenadante del cultivo.

En algunas realizaciones de la invención, se crea un dímero de THAP1 condensando THAP1 a un polipéptido de la región Fc derivado de un anticuerpo, de una manera que no afecte sustancialmente la unión de la THAP1 a la quimioquina SCL/CCL21. La preparación de proteínas de fusión que comprenden polipéptidos heterólogos condensados con diversas porciones de polipéptidos derivados de anticuerpos (incluyendo la región Fc) se ha descrito, por ejemplo, por Ashkenazi et al. (1991), PNAS, 88:10535; Bym et al. (1990), Nature 344:667; y Hollenbaugh y Aruffo, "Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins", en Current Protocols in Immunology, sup. 4, pp. 10.19.1-10.19-11, 1992. Se deja que las proteínas de fusión de THAP1/Fc se ensamblen como las moléculas de anticuerpos, tras lo cual se forman enlaces disulfuro intercatenarios entre los polipéptidos Fc, produciendo THAP1 divalente. Se han utilizado proteínas de fusión de receptores de TNF y Fc similares (véase, por ejemplo, Moreland et al. (1997), N. Engl. J. Med., 337(3):141-147; van der Poll et al. (1997), Blood, 89(10):3727-3734; y Ammann et al. (1997), J. Clin. Invest., 99(7):1699-1703), para tratar la artritis reumatoide. También se han fabricado derivados solubles de glicoproteínas de la superficie celular en la superfamilia de genes de inmunoglobulinas que consisten en un dominio extracelular de la glicoproteína de la superficie celular condensada con una región constante de inmunoglobulina (Fc) (véase, por ejemplo, Capon, D.J. et al. (1989), Nature, 337:525-531; y Capon, patentes de EEUU nº 5.116.964 y 5.428.130 [construcciones CD4-IgG1]; Linsley, P.S. et al. (1991), J. Exp. Med., 173:721-730 [una construcción CD28-IgG1 y una construcción B7-1-IgG1]; y Linsley, P.S. et al. (1991), J. Exp. Med., 174:561-569 y la patente de EEUU nº 5.434.131 [una CTLA4-IgG1]). Estas proteínas de fusión han demostrado ser útiles para modular interacciones de receptor-ligando.

Algunas realizaciones se refieren a proteínas de fusión de THAP-inmunoglobulina y a fusiones del dominio de unión a SLC de THAP con moléculas de inmunoglobulina o sus fragmentos. Dichas fusiones pueden producirse utilizando métodos convencionales, por ejemplo creando un vector de expresón que codifique la proteína THAP1 de unión a la quimioquina SLC/CCL21 condensada con el polipéptido del anticuerpo e insertando el vector en un hospedante celular adecuado. Un polipéptido Fc adecuado es el polipéptido de la región Fc nativa derivado de una IgG1 humana, que se describe en la publicación internacional WO 93/10151. Otro polipéptido Fc es la muteína Fc descrita en la patente de EEUU nº 5.457.035. La secuencia de aminóacidos de la muteína es idéntica a la de la secuencia Fc nativa presentada en la publicación internacional WO 93/10151, excepto que el aminoácido 19 se ha cambiado de Leu a Ala, el aminoácido 20 se ha cambiado de Leu a Glu, y el aminoácido 22 se ha cambiado de Gly a Ala. Esta muteína Fc muestra una afinidad reducida por los receptores de inmunoglobulinas.

También pueden emplearse los fragmentos de unión a SLC de la THAP1 humana, en lugar de la proteína completa, en los métodos de la invención. Los fragmentos pueden ser menos inmunogénicos que las correspondientes proteínas de longitud completa. La capacidad de un fragmento para unirse a la quimioquina SLC puede determinarse utilizando un ensayo convencional. Los fragmentos pueden prepararse mediante cualquiera de una serie de métodos convencionales. Por ejemplo, una secuencia de ADN deseada puede sintetizarse de modo químico o puede producirse mediante digestión con endonucleasas de restricción de una secuencia de ADN clonada de longitud completa y aislarse mediante electroforesis en geles de agarosa. Pueden emplearse conectores que contengan sitios de ruptura por endonucleasas de restricción para insertar el fragmento de ADN deseado en un vector de expresión, o el fragmento puede digerirse en sitios de ruptura naturales. También puede emplearse la reacción en cadena de polimerasa (PCR) para aislar una secuencia de ADN que codifique un fragmento de proteína deseada. Se emplean oligonucleótidos que definen los terminales del fragmento deseado como cebadores 5' y 3' en el procedimiento de PCR. Además, pueden utilizarse técnicas de mutagénesis conocidas para insertar un codón de fin en un punto deseado, por ejemplo inmediatamente cadena abajo del codón para el último aminoácido del fragmento deseado.

En otras realizaciones, la THAP1 o su fragmento biológicamente activo, por ejemplo un dominio de unión a SLC de THAP1, puede sustituirse por la porción variable de una cadena pesada o ligera de un anticuerpo. Si se fabrican proteínas de fusión con las cadenas pesada y ligera de un anticuerpo, es posible formar un oligómero de THAP1 con al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve, o más de nueve polipéptidos THAP1.

En algunas realizaciones de la presente invención, puede proporcionarse la unión de THAP-SLC para disminuir la disponibilidad biológica de SLC o para alterar de otra forma la actividad de SLC. Por ejemplo, pueden utilizarse polipéptidos de la familia THAP, dominios de unión a SLC de polipéptidos de la familia THAP, oligómeros de THAP, y proteínas de fusión de dominio de unión a SLC de THAP1-inmunoglobulina de la invención para interaccionar con una terapia de SLC para evitar, con ello, que realice su papel biológico normal. En algunas realizaciones, el polipéptido THAP completo (SEQ ID NO:3) puede utilizarse para unirse a SLC. En otras realizacoines, pueden utilizarse fragmentos de THAP1, como el dominio de unión a SLC de THAP1 (aminoácidos 143-213 de SEQ ID NO:3) para unirse a SLC. Estos fragmentos pueden tener al menos 8, al menos 10, al menos 12, al menos 15, al menos 20, al menos 25, al menos 30, al menos 35, al menos 40, al menos 45, al menos 50, al menos 55, al menos 60, al menos 65, al menos 70, al menos 80, al menos 90, al menos 100, al menos 110, al menos 120, al menos 130, al menos 140, al menos 150, al menos 160, al menos 170, al menos 180, al menos 190, al menos 200, al menos 210 o al menos 213 aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO:3. En algunas realizaciones, los fragmentos pueden tener al menos 8, al menos 10, al menos 12, al menos 15, al menos 20, al menos 25, al menos 30, al menos 35, al menos 40, al menos 45, al menos 50, al menos 55, al menos 60, al menos 65 o al menos 70 aminoácidos consecutivos de los aminoácidos 143-213 de SEQ ID NO:3. Los polipéptidos de la familia THAP que pueden ser capaces de unirse a SLC, por ejemplo THAP2-11 y THAP0 o sus fragmentos biológicamente activos, también pueden utilizarse para unirse a SLC para disminuir su disponibilidad biológica o para alterar de otra forma la actividad de esta quimioquina.

En algunas realizaciones, puede utilizarse una pluralidad de proteínas de la familia THAP, como una fusión de dos o más proteínas THAP1 o sus fragmentos, que comprendan un dominio de unión a SLC (aminoácidos 143-213 de SEQ ID NO:3) para unirse a SLC. Por ejemplo, pueden generarse oligómeros que comprenden fragmentos de THAP1 de un tamaño de al menos 8, al menos 10, al menos 12, al menos 15, al menos 20, al menos 25, al menos 30, al menos 35, al menos 40, al menos 45, al menos 50, al menos 55, al menos 60, al menos 65 o al menos 70 aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO:3 (aminoácidos 143-213). Los fragmentos de aminoácidos que comprende el oligómero de THAP pueden tener la misma longitud o tener longitudes diferentes. En algunas realizaciones, la proteína THAP1 completa, o sus porciones biológicamente activas, pueden condensarse para formar un oligómero capaz de unirse a SLC. Los polipéptidos de la familia THAP que pueden ser capaces de unirse a SLC, por ejemplo THAP2-11 y THAP0, los polipéptidos de la familia THAP de SEQ ID NO:16-114, o sus fragmentos biológicamente activos, también pueden utilizarse para crear oligómeros que se unen a SLC para disminuir su disponibilidad biológica o para alterar de otra forma la actividad de esta quimioquina.

Según otra realización de la presente invención, pueden condensarse proteínas de la familia THAP, como THAP1 o una porción de THAP1 que comprenda un dominio de unión a SLC (aminoácidos 143-213 de SEQ ID NO:3) a una inmunoglobulina o su porción. La porción puede ser una inmunoglobulina completa, como IgG, IgM, IgA o IgE. Además, pueden condensarse porciones de inmunoglobulinas, como un dominio Fc de la inmunoglobulina, con un polipéptido de la familia THAP, como THAP1, sus fragmentos o sus oligómeros. Los fragmentos de THAP1 pueden estar formados, por ejemplo, por al menos 8, al menos 10, al menos 12, al menos 15, al menos 20, al menos 25, al menos 30, al menos 35, al menos 40, al menos 45, al menos 50, al menos 55, al menos 60, al menos 65 o al menos 70 aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO:3 (aminoácidos 143-213). En algunas realizaciones, los polipéptidos de la familia THAP que pueden ser capaces de unirse a SLC, por ejemplo THAP2-11 y THAP0, los polipéptidos de la familia THAP de SEQ ID NO:16-114, o sus fragmentos biológicamente activos, también pueden utilizarse para formar una fusión con una inmunoglobulina que se una a SLC para disminuir su disponibilidad biológica o para alterar de otra forma la actividad de esta quimioquina.

Según otro aspecto de la invención, pueden incorporarse polipéptidos de la familia THAP, dominios de unión a SLC de polipéptidos de la familia THAP, oligómeros de THAP, y proteínas de fusión de dominio de unión a SLC de THAP1-inmunoglobulina de la invención a composiciones farmacéuticas. Estas composiciones farmacéuticas pueden utilizarse para disminuir la biodisponibilidad y la funcionalidad de SLC. Por ejemplo, pueden administrarse polipéptidos de la familia THAP, dominios de unión a SLC de polipéptidos de la familia THAP, oligómeros de THAP, y proteínas de fusión de dominio de unión a SLC de THAP1-inmunoglobulina de la presente invención a un sujeto para inhibir la interacción entre SLC y su receptor, como CCR7, sobre la superficie de células, para suprimir con ello las respuestas mediadas por SLC. La inhibición de la quimioquina SLC puede ser útil desde el punto de vista terapéutico para el tratamiento de trastornos inflamatorios o proliferativos, así como para modular (por ejemplo estimular o inhibir) la diferenciación celular, la proliferación celular y/o la muerte celular.

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En otra realización de la presente invención, pueden utilizarse polipéptidos de la familia THAP, dominios de unión a SLC de polipéptidos de la familia THAP, oligómeros de THAP, y proteínas de fusión de dominio de unión a SLC de THAP1-inmunoglobulina de la presente invención para detectar la presencia de SLC en una muestra biológica y en ensayos de selección para identificar moléculas que inhiban la interacción de THAP1 con SLC. Estos ensayos de selección son similares a los descritos a continuación para las interacciones de PAR-THAP.

Ciertos aspectos de la presente invención se refieren a un método para identificar un compuesto de ensayo que module actividades mediadas por THAP. En algunos casos, la actividad mediada por THAP es la unión a SLC. Los compuestos de ensayo que afecten a la unión de THAP-SLC pueden identificarse utilizando un método de selección en el que un polipéptido de la familia THAP, o su fragmento biológicamente activo, se pone en contacto con un compuesto de ensayo. En algunas realizaciones, el polipéptido de la familia THAP comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una coincidencia de al menos 30% con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:2. Se determina si el compuesto de ensayo modula la unión de SLC con un polipéptido de la familia THAP, como THAP1 (SEQ ID NO:3) determinando si el compuesto de ensayo modula la actividad del polipéptido de la familia THAP, o su fragmento biológicamente activo. Los fragmentos biológicamente activos de un polipéptido de la familia THAP pueden tener una longitud de al menos 5, al menos 8, al menos 10, al menos 12, al menos 15, al menos 18, al menos 20, al menos 25, al menos 30, al menos 35, al menos 40, al menos 45, al menos 50, al menos 60, al menos 70, al menos 80, al menos 90, al menos 100, al menos 110, al menos 120, al menos 130, al menos 140, al menos 150, al menos 160, al menos 170, al menos 180, al menos 190, al menos 200, al menos 210, al menos 220 o al menos más de 220 aminoácidos. Una determinación de que el compuesto de ensayo modula la actividad de dicho polipéptido indica que el compuesto de ensayo es un modulador candidato de actividades mediadas por THAP.

Aunque los polipéptidos de la familia THAP, los dominios de unión a SLC de polipéptidos de la familia THAP, los oligómeros de THAP, y las proteínas de fusión de dominio de unión a SLC de THAP1-inmunoglobulina pueden utilizarse para las interacciones con SLC mencionadas anteriormente, se apreciará que pueden utilizarse los homólogos de los polipéptidos de la familia THAP, de los dominios de unión a SLC de polipéptidos de la familia THAP, de los oligómeros de THAP, y de las proteínas de fusión de dominio de unión a SLC de THAP1-inmunoglobulina en lugar de los polipéptidos de la familia THAP, los dominios de unión a SLC de polipéptidos de la familia THAP, los oligómeros de THAP, y las proteínas de fusión de dominio de unión a SLC de THAP1-inmunoglobulina. Por ejemplo, pueden utilizarse homólogos que tengan una coincidencia de al menos aproximadamente 30-40%, preferiblemente al menos aproximadamente 40-50% de coincidencia, más preferiblemente al menos aproximadamente 50-60%, y aún más preferiblemente al menos aproximadamente 60-70%, 70-80%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% o 99,8% de coincidencia a través de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:3, o sus porciones.

Sondas y cebadores

Pueden prepararse sondas y cebadores de la invención mediante cualquier método adecuado, por ejemplo mediante clonación y restricción de las secuencias apropiadas y la síntesis química directa mediante un método como el método de fosfodiéster de Narang S.A. et al. (Methods Enzymol., 1979, 68:90-98), el método de fosfodiéster de Brown E.L. et al. (Methods Enzymol., 1979, 68:109-151), el método de dietilfosforamidita de Beaucage et al. (Tetrahedron Lett., 1981, 22:1859-1862) y el método del soporte sólido descrito en el documento EP 0707592.

Las sondas de detección son, en general, secuencias de ácidos nucleicos o análogos de ácidos nucleicos sin carga, como por ejemplo ácidos nucleicos de péptidos que se describen en la solicitud de patente internacional WO 92/20702, los análogos de morfolino que se describen en las patentes de EEUU nº 5.185.444. 5.034.506 y 5.142.047. Si se desea, puede hacerse que la sonda sea "no extendible", o sea que no puedan añadirse más dNTP a la sonda. En sí mismos, los análogos normalmente son no extendibles, y las sondas de ácidos nucleicos pueden hacerse no extendibles modificando el extremo 3' de la sonda, de tal forma el grupo hidroxilo ya no pueda participar en el alargamiento. Por ejemplo, el extremo 3' de la sonda puede funcionalizarse con el marcador de captura o de detección para con ello consumir o bloquear de otra forma el grupo hidroxilo.

Cualquiera de los polinucleótidos de la presente invención puede marcarse, si se desea, incorporando cualquier marcador conocido en la técnica que pueda detectarse por medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos o químicos. Por ejemplo, los marcadores útiles incluyen sustancias radiactivas (incluyendo ^{32}P, ^{35}S, ^{3}H, ^{125}I), tintes fluorescentes (incluyendo 5-bromodesoxiuridina, fluoresceína, acetilaminofluoreno, digoxigenina) o biotina. Preferiblemente, los polinucleótidos se marcan en sus extremos 3' y 5'. Los ejemplos de marcaje no radiactivo de fragmentos de ácidos nucleicos se describen en Urdea et al. (Nucleic Acids Research, 11:4937-4957, 1988) o Sánchez-Pescador et al. (J. Clin. Microbiol., 26(10):1934-1938, 1988). Además, las sondas según la presente invención pueden tener características estructurales de manera que permitan la amplificación de señales, siendo estas características estructurales, por ejemplo, sondas de ADN ramificadas como las descritas por Urdea et al. (Nucleic Acids Symp. Ser., 24:197-200, 1991) o en la patente europea nº EP 0225807 (Chiron).

También puede utilizarse un marcador para capturar el cebador, para facilitar la inmovilización del cebador o de un producto de la extensión del cebador, como ADN amplificado, sobre un soporte sólido. Un marcador de captura se une a los cebadores o las sondas y puede ser un miembro de unión específica que forma una pareja de unión con el miembro de unión específica del reactivo en fase sólida (por ejemplo biotina y estreptavidina). Por tanto, dependiendo del tipo de marcador que porta un polinucleótido o una sonda, puede emplearse para capturar o para detectar el ADN diana. Además, se entenderá que los polinucleótidos, los cebadores o las sondas proporcionados en la presente pueden, en sí mismos, actuar como marcador de captura. Por ejemplo, en el caso en que un miembro de unión del reactivo en fase sólida es una secuencia de ácido nucleico, puede seleccionarse de manera que se una a una porción complementaria de un cebador o una sonda para inmovilizar, con ello, el cebador o la sonda sobre la fase sólida. En los casos en que una sonda polinucleotídica en sí misma actúe como el miembro de unión, los expertos en la técnica reconocerán que la sonda contendrá una secuencia o "cola" que no es complementaria con la diana. En el caso en que un cebador polinucleotídico en sí mismo actúe como el marcador de captura, al menos una porción del cebador podrá hibridarse con un ácido nucleico sobre una fase sólida. Las técnicas de marcaje de ADN son muy conocidas por los expertos en la técnica.

Las sondas de la presente invención son útiles para una serie de objetivos. Pueden utilizarse, de modo notable, para la hibridación Southern con ADN genómico. Las sondas también pueden utilizarse para detectar productos de la amplificación de PCR. También pueden emplearse para detectar apareamientos erróneos en el gen o ARNm de la familia THAP utilizando otras técnicas.

Cualquiera de los ácidos nucleicos, polinucleótidos, cebadores y sondas de la presente invención pueden inmovilizarse de modo conveniente sobre un soporte sólido. Los soportes sólidos son conocidos por los expertos en la técnica e incluyen las paredes de los pocillos de una bandeja de reacción, tubos de ensayo, esferas de poliestireno, esferas magnéticas, tiras de nitrocelulosa, membranas, micropartículas, como partículas de látex, eritrocitos de oveja (u otro animal), duracitos y otros. El soporte sólido no es crítico, y puede ser seleccionado por los expertos en la técnica. Por tanto, las partículas de látex, las micropartículas, las esferas magnéticas o no magnéticas, las membranas, los tubos de plástico, las paredes de pocillos de microvaloración, los chips de vidrio o silicio, los eritrocitos de oveja (u otro animal adecuado) y los duracitos son todos ejemplos adecuados. Los métodos adecuados para inmovilizar ácidos nucleicos sobre fases sólidas incluyen interacciones iónicas, hidrófobas, covalentes y similares. Un soporte sólido, tal como se emplea en la presente, se refiere a cualquier material que sea insoluble, o que pueda hacerse insoluble mediante una reacción posterior. El soporte sólido puede elegirse por su capacidad intrínseca para atraer e inmovilizar el reactivo de captura. Como alternativa, la fase sólida puede retener otro receptor que tenga la capacidad de atraer e inmovilizar el reactivo de captura. Este otro receptor puede incluir una sustancia cargada que tenga una carga opuesta con respecto al reactivo de captura en sí mismo o con respecto a una sustancia cargada conjugada con el reactivo de captura. Como otra alternativa, la molécula receptora puede ser cualquier miembro de unión específica que esté inmovilizado (unido) sobre el soporte sólido y que tenga la capacidad de inmovilizar el reactivo de captura a través de una reacción de unión específica. La molécula receptora permite la unión indirecta del reactivo de captura a un material de soporte sólido antes de realizar el ensayo o durante la realización del ensayo. Por tanto, la fase sólida puede ser una superficie de plástico, de plástico derivatizado, de metal magnético o no magnético, de vidrio o de silicio de un tubo de ensayo, pocillo de microvaloración, lámina, esfera, micropartícula, chip, eritrocito de oveja (u otro animal adecuado), duracito y otras configuraciones conocidas por los expertos en la técnica. Los ácidos nucleicos, polinucleótidos, sondas y cebadores de la invención pueden unirse o inmovilizarse sobre un soporte sólido de manera individual o en grupos de al menos 2, 5, 8, 10, 12, 15, 20 ó 25 polinucleótidos diferenciados de la invención sobre soportes sólidos individuales. Además, pueden unirse polinucleótidos diferentes de los de la invención al mismo soporte sólido como uno o más polinucleótidos de la invención.

Cualquier polinucleótido proporcionado en la presente puede unirse, en áreas solapantes o en localizaciones aleatorias sobre un soporte sólido. Como alternativa, los polinucleótidos de la invención pueden unirse en una disposición ordenada, en la que cada polinucleótido está unido a una región diferenciada del soporte sólido que no se solape con el sitio de unión de cualquier otro polinucleótido. Preferiblemente, esta disposición ordenada de polinucleótidos se diseña para que sea "direccionable", en la que las localizaciones particulares se registran y se puede acceder a ellas como parte de un procedimiento de ensayo. Las disposiciones de polinucleótidos direccionables comprenden, de forma típica, una pluralidad de diferentes sondas oligonucleotídicas que están acopladas a una superficie de un sustrato en diferentes localizaciones conocidas. El conocimiento de la localización precisa de cada localización de polinucleótido hace que estas disposiciciones "direccionables" sean particularmente útiles en ensayos de hibridación. Puede emplearse cualquier tecnología de disposiciones direccionables conocida en la técnica con los polinucleótidos de la invención. Una realización particular de estas disposiciones de polinucleótidos se conoce como Genechip, y se ha descrito en general en la patente de EEUU 5.143.854; publicaciones PCT WO 90/15070 y 92/10092.

Vectores de expresión recombinante y células hospedantes

Otro aspecto de la invención se refiere a vectores, preferiblemente vectores de expresión, que contienen un ácido nucleico que codifica un polipéptido de la familia THAP o de dominio THAP, o su fragmento biológicamente activo o su homólogo.

Los vectores pueden tener un uso particular para la preparación de una proteína recombinante de la invención, o para su uso en una terapia génica. La terapia génica presenta un medio para administrar un polipéptido de la familia THAP o de dominio THAP, o su fragmento biológicamente activo o su homólogo, a un sujeto que lo necesite para regular la apoptosis para el tratamiento de un trastorno.

Tal como se emplea en la presente, el término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al cual se ha unido. Un tipo de vector es un "plásmido", lo cual se refiere a un bucle de ADN bicatenario circular en el que pueden acoplarse más segmentos de ADN. Otro tipo de vector es un vector vírico, en el que pueden acoplarse más segmentos de ADN en el genoma vírico. Ciertos vectores son capaces de una replicación autónoma en una célula hospedante en la que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen de la replicación bacteriano y vectores de mamífero episómicos). Otros vectores (por ejemplo, vectores de mamífero no episómicos) se integran en el genoma de una célula hospedante tras su introducción en la célula hospedante, y por tanto se replican junto con el genoma del hospedante. Además, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los cuales están unidos operativamente. Estos vectores se denominan en la presente "vectores de expresión". En general, los vectores de expresión de utilidad en las técnicas de ADN recombinante a menudo están en forma de plásmidos. En la presente memoria, "plásmido" y "vector" pueden utilizarse de manera intercambiable, puesto que el plásmido es la forma de vector utilizada más común. Sin embargo, la invención pretende incluir estas otras formas de vectores de expresión, como vectores víricos (por ejemplo, retrovirus, adenovirus y virus adenoasociados defectuosos en la replicación), que tienen funciones equivalentes.

Los vectores de expresión recombinante de la invención comprenden un ácido nucleico de la familia THAP o de dominio THAP de la invención en una forma adecuada para la expresión del ácido nucleico en una célula hospedante, lo cual significa que los vectores de expresión recombinantes incluyen una o más secuencias reguladoras, seleccionadas basándose en las células hospedantes que se van a utilizar para la expresión, que están unidas operablemente a la secuencia de ácido nucleico que se va a expresar. Dentro de un vector de expresión recombinante, "unido operablemente" significa que la secuencia de nucleótidos de interés está unida a la secuencia o secuencias reguladoras de una manera que permite la expresión de la secuencia de nucleótidos (por ejemplo, en un sistema de transcripción/traducción in vitro o en una célula hospedante cuando el vector se introduce en la célula hospedante). La expresión "secuencia reguladora" pretende incluir promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación). Estas secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, 185, Academic Press, San Diego, California (1990). Las secuencias reguladoras incluyen las que dirigen la expresión constitutiva de una secuencia de nucleótidos en muchos tipos de células hospedantes, y las que dirigen la expresión de la secuencia de nucleótidos sólo en ciertas células hospedantes (por ejemplo, secuencias reguladoras específicas de tejidos). Los expertos en la técnica apreciarán que el diseño del vector de expresión puede depender de factores como la elección de la célula hospedante que se va a transformar, el nivel de expresión de la proteína deseada, etc. Los vectores de expresión de la invención pueden introducirse en células hospedantes para producir con ello proteínas o péptidos, incluyendo proteínas o péptidos de fusión, codificadas por los ácidos nucleicos como se describen en la presente (por ejemplo, proteínas de la familia THAP, formas mutantes de proteínas de la familia THAP, proteínas de fusión, o fragmentos de cualquiera de las proteínas anteriores, etc.).

Los vectores de expresión recombinantes de la invención pueden diseñarse para la expresión de un polipéptido de la familia THAP o de dominio THAP, o su fragmento biológicamente activo o su homólogo, en células procariotas o eucariotas. Por ejemplo pueden expresarse proteínas de la familia THAP o de dominio THAP en células bacterianas, como E. coli, células de insecto (utilizando vectores de expresión de baculovirus), células de levadura o células de mamífero. Las células hospedantes adecuadas se analizan más a fondo en Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, 185, Academic Press, San Diego, California (1990). Como alternativa, el vector de expresión recombinante puede transcribirse y traducirse in vitro, por ejemplo utilizando secuencias reguladoras promotoras de T7 y T7 polimerasa.

La expresión de las proteínas en procariotas se realiza, de modo más frecuente, en E. coli con vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles que dirigen la expresión de proteínas de fusión o que no son de fusión. Los vectores de fusión añaden un número de aminoácidos a una proteína codificada en ellos, normalmente en el amino-terminal de la proteína recombinante. Estos vectores de fusión, de forma típica, sirven para tres objetivos: 1) aumentar la expresión de la proteína recombinante; 2) aumentar la solubilidad de la proteína recombinante; y 3) ayudar a la purificación de la proteína recombinante actuando como ligando en una purificación por afinidad. A menudo, en vectores de expresión de fusión, se introduce un sitio de ruptura proteolítica en la confluencia del resto de fusión y la proteína recombinante para permitir la separación de la proteína recombinante del resto de fusión después de la purificación de la proteína de fusión. Estas enzimas, y sus secuencias de reconocimiento cognadas, incluyen el factor Xa, la trombina y la enteroquinasa. Los vectores de expresión de fusión típicos incluyen pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith, D.B. y Johnson, K.S. (1988), Gene, 67:31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, Mass.) y pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, N.J.), que condensan la glutatión S-transferasa (GST), la proteína E de unión a maltosa, o la proteína A, respectivamente, a la proteína recombinante diana.

Las proteínas de fusión purificadas pueden utilizarse en ensayos de actividad de la familia THAP (por ejemplo, ensayos directos o ensayos competitivos descritos en detalle a continuación), o para generar anticuerpos específicos para las proteínas de la familia THAP o de dominio THAP, por ejemplo. En una realización preferida, una proteína de fusión de la familia THAP o de dominio THAP expresada en un vector de expresión retrovírico de la presente invención puede utilizarse para infectar células de la médula ósea que después se transplantan en receptores irradiados. La patología del sujeto receptor entonces se estudia después de que haya pasado un tiempo suficiente (por ejemplo, seis semanas).

Los ejemplos de vectores de expresión de E. coli que no son de fusión, inducibles adecuados incluyen pTrc (Amann et al. (1988), Gene, 69:301-315) y pET 11d (Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, 185, Academic Press, San Diego, California (1990), 60-89). La expresión del gen diana a partir del vector pTrc se basa en la transcripción de la ARN polimerasa del hospedante a partir de un promotor de fusión trp-lac híbrido. La expresión del gen diana a partir del vector pET 11d se basa en la transcripción de un promotor de fusión T7 gn 10-lac mediada por una ARN polimerasa vírica coexpresada (T7 gn 1). Esta polimerasa vírica es suministrada por las cepas hospedantes BL21 (DE3) o HMS174 (DE3) a partir de un profago residente que porta un gen T7 gn 1 bajo el control transcripcional del promotor lacUV 5.

Una estrategia para maximizar la expresión de proteínas recombinantes en E. coli es expresar la proteína en una bacteria hospedante con una capacidad reducida de romper proteolíticamente la proteína recombinante (Gottesman, S., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, 185, Academic Press, San Diego, California (1990), 119-128). Otra estrategia es alterar la secuencia del ácido nucleico que se va a insertar en un vector de expresión, de modo que los codones individuales para cada aminoácido son los que se emplean preferentemente en E. coli (Wada et al. (1992), Nucleic Acids Res., 20:2111-2118). Esta alteración de las secuencias de los ácidos nucleicos de la invención puede realizarse mediante técnicas de síntesis de ADN convencionales.

En otra realización, el vector de expresión de la familia THAP es un vector de expresión de levadura. Los ejemplos de vectores para su expresión en la levadura S. cerivisae incluyen pYepSec 1 (Baldari, et al. (1987), EMBO J., 6:229-234), pMFa (Kurjan y Herskowitz (1982), Cell, 30:933-943), pJRY88 (Schultz et al. (1987), Gene, 54:113-123), pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, California), y picZ (InVitrogen Corp, San Diego, California).

Como alternativa, las proteínas de la familia THAP o de dominio THAP pueden expresarse en células de insecto utilizando vectores de expresión de baculovirus. Los vectores de baculovirus disponibles para la expresión de proteínas en células de insecto cultivadas (por ejemplo, células Sf9) incluyen la serie pAc (Smith et al. (1983), Mol. Cell Biol., 3:2156-2165) y la serie pVL (Lucklow y Summers (1989), Virology, 170:31-39). En realizaciones particularmente preferidas, las proteínas de la familia THAP se expresan según Karniski et al., Am. J. Physiol. (1998), 275: F79-87.

En otra realización, un ácido nucleico de la invención se expresa en células de mamífero utilizando un vector de expresión de mamífero. Los ejemplos de vectores de expresión de mamífero incluyen pCDM8 (Seed, B. (1987), Nature, 329:840) y pMT2PC (Kaufman et al. (1987), EMBO J., 6:187-195). Cuando se utilizan en células de mamífero, las funciones de control del vector de expresión a menudo son proporcionadas por elementos reguladores víricos. Por ejemplo, los promotores de uso común se derivan de polioma, adenovirus 2, citomegalovirus y virus de simio 40. Para otros sistemas de expresión adecuados para células procariotas y eucariotas, véanse los capítulos 16 y 17 de Sambrook, J., Fritsh, E. F., y Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989. En otra realización, el vector de expresión de mamífero recombinante es capaz de dirigir la expresión del ácido nucleico preferentemente en un tipo de célula concreta (por ejemplo, se emplean elementos reguladores específicos de tejidos para expresar el ácido nucleico). Los elementos reguladores específicos de tejidos son conocidos en la técnica y se describen con más detalle a continuación.

La invención también proporciona un vector de expresión recombinante que comprende una molécula de ADN de la invención clonada en el vector de expresión en una orientación antisentido. Es decir, la molécula de ADN está unida operablemente a una secuencia reguladora de una manera que permite la expresión (mediante la transcripción de la molécula de ADN) de una molécula de ARN que es antisentido al ARNm de la familia THAP. Pueden elegirse unas secuencias reguladoras unidas operativamente a un ácido nucleico clonado en la orientación antisentido que dirijan la expresión continua de la molécula de ARN antisentido en una diversidad de tipos celulares, por ejemplo promotores y/o potenciadores víricos, o pueden elegirse unas secuencias reguladoras que dirijan la expresión constitutiva directa, específica de tejidos o específica de tipos celulares de ARN antisentido. El vector de expresión antisentido puede estar en forma de un plásmido, fágmido o virus atenuado recombinante en el que se producen ácidos nucleicos antisentido bajo el control de una región reguladora de alta eficacia, cuya actividad puede determinarse por el tipo de célula en que se introduce el vector. Para un análisis de la regulación de la expresión génica utilizando genes antisentido, véase Weintraub,
H. et al., Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews-Trends in Genetics, vol. 1(1), 1986.

Otro aspecto de la invención se refiere a células hospedantes en las que se ha introducido un vector de expresión recombinante de la invención. Las expresiones "célula hospedante" y "célula hospedante recombinante" se utilizan de modo intercambiable en la presente. Se entiende que dichos términos se refieren no sólo a la célula sujeto particular sino a la progenie o a la progenie potencial de dicha célula. Debido a que pueden producirse ciertas modificaciones en las generaciones posteriores debidas a mutaciones o a influencias del entorno, esta progenie, de hecho, puede no ser idéntica a la célula progenitora, pero aún se incluye dentro del alcance de la expresión utilizada en la presente.

Una célula hospedante puede ser cualquier célula procariota o eucariota. Por ejemplo, una proteína de la familia THAP puede expresarse en células bacterianas, como E. coli, células de insecto, levaduras o células de mamífero (como células de ovario de hámster chino (CHO) o células COS o células humanas). Otras células hospedantes adecuadas son conocidas por los expertos en la técnica, incluyendo células 3T3 de ratón, como se describe más a fondo en los ejemplos.

El ADN del vector puede introducirse en células procariotas o eucariotas mediante técnicas de transformación o transfección convencionales. Tal como se emplean en la presente, los términos "transformación" y "transfección" pretenden indicar una diversidad de técnicas reconocidas en la técnica para introducir un ácido nucleico extraño (por ejemplo, ADN) en una célula hospedante, incluyendo coprecipitación con fosfato de calcio o cloruro de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, lipofección o electroporación. Los métodos adecuados para transformar o transfectar células hospedantes se pueden encontrar en Sambrook, J. (Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2ª, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989) y otros manuales de laboratorio.

Para la transfección estable de células de mamífero, se sabe que, dependiendo del vector de expresión y de la técnica de transfección utilizados, sólo una pequeña fracción de células puede integrar el ADN extraño en su genoma. Para identificar y seleccionar estos integrados, un gen que codifica un marcador seleccionable (por ejemplo, la resistencia a antibióticos) se introduce en general en las células hospedantes junto con el gen de interés. Los marcadores seleccionables preferidos son aquellos en que confieren resistencia a fármacos, como G418, higromicina y metotrexato. Puede introducirse un ácido nucleico que codifique un marcador seleccionable en una célula hospedante en el mismo vector que codifica la proteína de la familia THAP, o puede introducirse en un vector separado. Las células transfectadas de modo estable con el ácido nucleico introducido pueden identificarse mediante selección con fármacos (por ejemplo, las células que han incorporado el gen del marcador seleccionable sobrevivirán, mientras que las otras células morirán).

Una célula hospedante de la invención, como una célula hospedante procariota o eucariota en cultivo, puede utilizarse para producir (es decir, expresar) una proteína de la familia THAP. Por consiguiente, la invención proporciona métodos para producir una proteína de la familia THAP utilizando células hospedantes de la invención. En una realización, el método comprende cultivar la célula hospedante de la invención (en la que se ha introducido un vector de expresión recombinantes que codifica una proteína de la familia THAP) en un medio adecuado, de forma que se produce una proteína de la familia THAP. En otra realización, el método comprende también aislar una proteína de la familia THAP del medio o de la célula hospedante.

En otra realización, la invención incluye un método que comprende proporcionar una célula capaz de expresar un polipéptido de la familia THAP o de dominio THAP, o su fragmento biológicamente activo o su homólogo, cultivar dicha célula en un medio adecuado de manera que se produce la proteína de la familia THAP o de dominio THAP, y aislar o purificar la proteína de la familia THAP o de dominio THAP del medio o de la célula.

Las células hospedantes de la invención también pueden utilizarse para producir animales transgénicos no humanos, como para el estudio de trastornos en los que estén implicadas las proteínas de la familia THAP. Por ejemplo, en una realización, una célula hospedante de la invención es un oocito fertilizado o una célula pluripotencial embriónica en la que se han introducido secuencias codificadoras de la familia THAP o de dominio THAP. Estas células hospedantes entonces pueden utilizarse para crear animales transgénicos no humanos en los que se han introducido secuencias de la familia THAP o de dominio THAP exógenas en su genoma, o animales recombinantes homólogos en los que se han alterado secuencias de la familia THAP o de dominio THAP endógenas. Estos animales son útiles para estudiar la función y/o la actividad de un polipéptido de la familia THAP o de dominio THAP o su fragmento, y para identificar y/o evaluar moduladores de una actividad de la familia THAP o de dominio THAP. Tal como se emplea en la presente, un "animal transgénico" es un animal no humano, preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un roedor como una rata o un ratón, en el que una o más de las células del animal incluye un transgén. Otros ejemplos de animales transgénicos incluyen primates no humanos, ovejas, perros, vacas, cabras, pollos, anfibios, etc. Un transgén es un ADN exógeno que se integra en el genoma de una célula a partir de la cual se desarrolla un animal transgénico y que permanece en el genoma del animal maduro, dirigiendo con ello la expresión de un producto génico codificado en uno o más tipos celulares o tejidos del animal transgénico. Tal como se emplea en la presente, un "animal recombinante homólogo" es un animal no humano, preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un ratón, en el que un gen de la familia THAP o de dominio THAP endógeno se ha alterado mediante recombinación homóloga entre el gen endógeno y una molécula de ADN exógena introducida en una célula del animal, por ejemplo una célula embrionaria del animal, antes del desarrollo del animal. Los métodos para generar animales transgénicos mediante manipulación y microinyección de embriones, en particular animales como ratones, se han convertido en algo convencional en la técnica y se describen, por ejemplo, en las patentes de EEUU nº 4.736.866 y 4.870.009, ambas de Leder et al., patente de EEUU nº 4.873.191 de Wagner et al., y en Hogan, B., Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986).

Vectores de terapia génica

Los vectores preferidos para la administración a un sujeto pueden construirse según métodos muy conocidos. Los vectors comprenderán elementos reguladores (por ejemplo, promotores, potenciadores, etc.) capaces de dirigir la expresión del ácido nucleico en la célula diana. Por tanto, cuando se utiliza una célula humana, resulta preferible colocar la región codificadora del ácido nucleico en una posición adyacente a un promotor y bajo el control de éste que sea capaz de ser expresado en una célula humana.

En diversas realizaciones, el promotor génico inmediatamente temprano de citomegalovirus humano (CMV), el promotor temprano de SV40, la repetición terminal larga del virus del sarcoma de Rous, la actina P, el promotor de la insulina de rata y la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa pueden utilizarse para obtener un alto nivel de expresión de la secuencia codificadora de interés. También se contempla el uso de otros promotores celulares de mamífero o víricos o de fagos bacterianos que son muy conocidos en la técnica por lograr la expresión de una secuencia codificadora de interés, con la condición de que los niveles de expresión sean suficientes para un objetivo dado. Empleando un promotor con propiedades bien conocidas se puede optimizar el nivel y el patrón de expresión de la proteína de interés tras la transfección o la transformación.

La selección de un promotor que se regula en respuesta a señales fisiológicas o sintéticas específicas puede permitir la expresión inducible del producto génico. Por ejemplo, en el caso en que la expresión de un transgén o de transgenes, cuando se emplea un vector multicistrónico, sea tóxica para las células en las que se produce el vector, puede resultar deseable prohibir o reducir la expresión de uno o más de los transgenes. Varios sistemas de promotores inducibles están disponibles para la producción de vectores víricos en los que el producto del transgén puede ser tóxico.

El sistema de ecdisona (Invitrogen, Carlsbad, CA) es uno de estos sistemas. Este sistema está diseñado para permitir la expresión regulada de un gen de interés en células de mamífero. Consiste en un mecanismo de expresión fuertemente regulada que virtualmente no permite un nivel de expresión basal del transgén salvo con una inducibilidad de más de 200 veces. El sistema está basado en el receptor de ecdisona heterodimérico de Drosophila, y cuando la ecdisona o un análogo, como muristerona A, se une al receptor, el receptor activa un promotor para activar la expresión del transgén cadena abajo. Se logran unos altos niveles de transcritos de ARNm. En este sistema, ambos monómeros del receptor heterodimérico se expresan constitutivamente a partir de un vector, mientras que el promotor que responde a la ecdisona que conduce la expresión del gen de interés está en otro plásmido. Por tanto, la modificación de este tipo de sistema en el vector de transferencia del gen de interés sería útil. La cotransfección de plásmidos que contienen el gen de interés y los monómeros de los receptores en la línea celular productora entonces permitiría la producción del vector de transferencia del gen sin la expresión de un transgén potencialmente tóxico. En el momento apropiado, la expresión del transgén podría activarse con ecdisona o muristerona A. Otro sistema inducible que puede ser útil es el sistema Tet-Off o Tet-On (Clontech, Palo Alto, CA), desarrollado originariamente por Gossen y Bujard (Gossen y Bujard, 1992; Gossen et al., 1995). Este sistema también permite regular unos niveles altos de expresión del gen en respuesta a la tetraciclina o a derivados de la tetraciclina, como doxiciclina. En el sistema Tet-On, la expresión génica se activa en presencia de doxiciclina, mientras que en el sistema Tet-Off, la expresión génica se activa en ausencia de doxiciclina. Estos sistemas están basados en dos elementos reguladores derivados del operón de resistencia a la tetraciclina de E. coli, la secuencia operadora de tetraciclina a la cual se une el represor de tetraciclina, y la proteína represora de tetraciclina. El gen de interés se clona en un plásmido detrás de un promotor que tiene elementos de respuesta a la tetraciclina presentes en él. Un segundo plásmido contiene un elemento regulador, denominado el transactivador controlado por tetraciclina, que está compuesto, en el sistema Tet-Off, del dominio VP16 del virus del herpes simplex y el represor de tetraciclina de tipo salvaje.

Por tanto, en ausencia de doxiciclina, la transcripción está constitutivamente activada. En el sistema Tet-OnTm, el represor de tetraciclina no es de tipo salvaje y en presencia de doxiciclina activa la transcripción. Para la producción de vectores para la terapia génica, el sistema Tet-Off sería preferible, de manera que puedan cultivarse las células productoras en presencia de tetraciclina o de doxiciclina y se evite la expresión de un transgén potencialmente tóxico, pero cuando el vector se introduce en un paciente, la expresión génica estará constitutivamente activada.

En algunas circunstancias, puede resultar deseable regular la expresión de un transgén en un vector de terapia génica. Por ejemplo, pueden utilizarse diferentes promotores víricos con diferentes potencias de actividad dependiendo del nivel de expresión deseado. En células de mamífero, a menudo se utiliza el promotor inmediato temprano de CMV para proporcionar una fuerte activación transcripcional. También se han utilizado versiones modificadas del promotor de CMV que son menos potentes cuando se desean unos niveles reducidos de expresión del transgén. Cuando se desea la expresión de un transgén en células hematopoyéticas a menudo se utilizan promotores retrovíricos, como los LTR de MLV o MMTV. Otros promotores víricos que pueden emplearse dependiendo del efecto deseado incluyen SV40, RSV LTR, VIH-1 y HfV-2 LTR, promotes de adenovirus como los de la región E1A, E2A o MLP, AAV LTR, virus del mosaico de la coliflor, HSV-TK y virus del sarcoma aviar.

De manera similar, pueden utilizarse promotores específicos de tejidos para realizar la transcripción en tejidos o células específicos para reducir la toxicidad potencial o los efectos indeseables en tejidos que no son la diana. Por ejemplo, pueden utilizarse promotores como PSA, probasina, ácido prostático fosfatasa o calicreína glandular específica de la próstata (hK2) para dirigir la expresión génica en la próstata. De modo similar, pueden utilizarse los siguientes promotores para dirigir la expresión génica en otros tejidos.

Los promotores específicos de tejidos incluyen (a) en el páncreas: insulina, elastina, amilasa, pdr-I, pdx-I, glucoquinasa; (b) en el hígado: albúmina PEPCK, potenciador de HBV, alfa-fetoproteína, apolipoproteína C, alfa-I antitripsina, vitelogenina, NF-AB, transtiretina; (c) en el músculo esquelético: cadena H de miosina, creatina quinasa muscular, distrofina, calpaína p94, alfa-actina esquelética, troponina 1 rápida; (d) en la piel: queratina K6, queratina KI; (e) en el pulmón: CFTR, citoqueratina humana IS (K 18), proteínas tensioactivas pulmonares A, B y C, CC-10, Pi; (f) en el músculo liso: sm22 alfa, SM-alfa-actina; (g) en el endotelio: endotelina-I, E-selectina, factor de von Willebrand, TIE (Korhonen et al., 1995), KDR/flk-I; (h) en melanocitos: tirosinasa; (i) en el tejido adiposo: lipoproteína lipasa (Zechner et al., 1988), adipsina (Spiegelman et al., 1989), acetil-CoA carboxilasa (Pape y Kim, 1989), glicerofosfato deshidrogenasa (Dani et al., 1989), adipocito P2 (Hunt et al., 1986); y (j) en la sangre: P-globina.

En ciertas indicaciones, puede resultar deseable activar la transcripción en momentos específicos después de la administración del vector de terapia génica. Esto puede lograrse con promotores como los que son regulables por hormonas o citoquinas. Por ejemplo, en aplicaciones de terapia génica en las que la indicación es en un tejido gonadal en el que producen o al que se dirigen esteroides específicos, el uso de promotores regulados por andrógenos o estrógenos puede resultar ventajoso. Estos promotores que son regulables por hormonas incluyen MMTV, MT-1, ecdisona y RuBisco. Se espera que otros promotores regulables por hormonas, como los que responden a hormonas tiroideas, pituitarias y adrenales, sean útiles en la presente invención. Los promotores que responden a citoquinas y proteínas inflamatorias que pueden utilizarse incluyen quininógeno K y T (Kageyama et al., 1987), c-fos, TNF-alfa, proteína reactiva C (Arcone et al., 1988), haptoglobina (Oliviero et al., 1987), amiloide A2 sérico, C/EBP alfa, IL-1, IL-6 (Poli y Cortese, 1989), complemento C3 (Wilson et al., 1990), IL-8, glicoproteína ácida alfa-1 (Prowse y Baumann, 1988), alfa-1 antitipsina, lipoproteína lipasa (Zechner et al., 1988), angiotensinógeno (Ron et al., 1991), fibrinógeno, c-jun (inducible por forbol ésteres, TNF-alfa, radiación UV, ácido retinoico, y peróxido de hidrógeno), colagenasa (inducida por forbol ésteres y ácido retinoico), metalotioneína (inducible por metales pesados y glucocorticoides), estromelisina (inducible por forbol éster, interleuquina-1 y EGF), alfa-2 macroglobulina y alfa-1 antiquimotripsina.

Se prevé que los promotores regulables por el ciclo celular sean útiles en la presente invención. Por ejemplo, en un vector de terapia génica bicistrónico, el uso de un promotor de CMV fuerte para dirigir la expresión de un primer gen, como p16, que detiene las células en la fase G1, puede ser seguido de la expresión de un segundo gen, como p53, bajo el control de un promotor que es activo en la fase G1 del ciclo celular, proporcionando con ello un "segundo impacto" que empujaría a la célula hacia la apoptosis. Pueden utilizarse otros promotores como los de diversas ciclinas, PCNA, galectina-3, E2FI, p53 y BRCAI.

También pueden utilizarse promotores específicos de tumores, como osteocalcina, elemento de respuesta a la hipoxia (HRE), NIAGE-4, CEA, alfa-fetoproteína, GRP78/BiP y tirosinasa para regular la expresión génica en células tumorales. Otros promotores que pueden utilizarse según la presente invención incluyendo los promotores regulables por Lac, inducibles por quimioterapia (por ejemplo, MDR), e inducibles por calor (hipertermia), inducibles por radiación (por ejemplo, EGR (Joki et al., 1995)), alfa-inhibina, ARN pol III ARNt met y otros promotores de aminoácidos, U1 ARNsn (Bartlett et al., 1996), MC-1, PGK, alfa-actin y alfa-globina. Muchos otros promotores que pueden utilizarse se listan en Walther y Stein (1996).

Se prevé que cualquiera de los promotores anteriores, solos o en combinación entre sí, pueden ser útiles según la presente invención dependiendo de la acción deseada.

Además, esta lista de promotores no debe considerarse exhaustiva o limitante; los expertos en la técnica sabrán que otros promotores pueden utilizarse junto con los ácidos nucleicos de la familia THAP o de dominio THAP y los métodos descritos en la presente.

1. Potenciadores

Los potenciadores son elementos genéticos que aumentan la transcripción desde un promotor localizado en una posición distante sobre la misma molécula de ADN. Los potenciadores se organizan como los promotores. Es decir, están compuestos de muchos elementos individuales, cada uno de los cuales se une a una o más proteínas transcripcionales. La distinción básica entre potenciadores y promotores es operativa. Una región potenciadora en su conjunto debe ser capaz de estimular la transcripción a distancia; esto no tiene por qué ser cierto para una región promotora o sus elementos componentes. Por otra parte, un promotor debe tener uno o más elementos que dirigen el inicio de la síntesis de ARN en un sitio concreto y en una orientación concreta, mientras que los potenciadores no tienen estas especificidades. Los promotores y los potenciadores a menudo se solapan y son contiguos, y a menudo parece que tienen una organización modular similar.

A continuación se presenta una lista de promotores además de los promotores específicos de tejidos listados anteriormente, promotores/potenciadores celulares y promotores/potenciadores inducibles que pueden utilizarse en combinación con el ácido nucleico que codifica un gen de interés en una construcción de expresión (lista de potenciadores, tabla 1). Además, también puede usarse cualquier combinación de promotor/potenciador (como en la base de datos de promotores eucariotas EPDB) para dirigir la expresión del gen. Las células eucariotas pueden apoyar la transcripción citoplásmica de ciertos promotores bacterianos si se proporciona la polimerasa bacteriana apropiada, como parte del complejo de administración o como una construcción de expresión genética adicional.

Los potenciadores adecuados incluyen: cadena pesada de inmunoglobulina; cadena ligera de inmunoglobulina; receptor de células T; HLA DQ (x y DQ beta); beta-interferón; interleuquina-2; receptor de la interleuquina-2; MHC de clase II 5; MHC de clase II HLA-DRalfa; beta-actina; creatina quinasa muscular; prealbúmina (transtiretina); elastasa I; metalotioneína; colagenasa; gen de la albúmina; alfa-fetoproteína; globina; beta-globina; e-fos; c-HA-ras; insulina; molécula de adhesión de células neurales (NCAM); alfa-aI-antitripsina; histona H2B (TH2B); colágeno de tipo I de ratón; proteínas reguladas por glucosa (GRP94 y GRP78); hormona del crecimiento de rata; amiloide A sérico humano (SAA); troponina 1 (TN 1); factor del crecimiento derivado de plaquetas; distrofia muscular de Duchenne; SV40; polioma; retrovirus; virus THAPiloma; virus de la hepatitis B; virus de la inmunodeficiencia humana; citomegalovirus; y virus de la leucemia de gibones.

TABLA 1

1

En realizaciones preferidas de la invención, la construcción de expresión comprende un virus o una construcción modificada derivada de un genoma vírico. La capacidad de ciertos virus para entrar en las células a través de una endocitosis mediada por receptores y para integrarse en el genoma de la célula hospedante y expresar los genes víricos de manera estable y eficaz han hecho que sean unos candidatos atractivos para la transferencia de genes extraños hacia células de mamífero (Ridgeway, 1988; Nicolas y Rubenstein, 1988; Baichwal y Sugden, 1986; Temin, 1986). Los primeros virus utilizados como vectores génicos fueron virus de ADN, incluyendo los papovavirus (virus de simio 40, virus del papiloma bovino, y polioma) (Ridgeway, 1988; Baichwal y Sugden, 1986) y adenovirus (Ridgeway, 1988; Baichwal y Sugden, 1986). Éstos tienen una capacidad relativamente baja para secuencias de ADN extrañas y tienen un espectro de hospedantes restringido.

Además, su potencial oncogénico y sus efectos citopáticos en células permisivas hacen surgir problemas acerca de su seguridad. Pueden alojar sólo hasta 8 kB de material genético extraño pero pueden ser introducidos con facilidad en una diversidad de líneas celulares y animales de laboratorio (Nicolas y Rubenstein, 1988; Temin, 1986).

(iii) Señales de poliadenilación

Cuando se emplea un inserto de ADNc, se desea de forma típica incluir una señal de poliadenilación para que se realice la poliadenilación adecuada del transcrito del gen. Se cree que la naturaleza de la señal de poliadenilación no es crucial para la práctica satisfactoria de la invención, y cualquier secuencia de este tipo puede utilizarse, como las señales de poliadenilación de la hormona del crecimiento humana o bovina y de SV40. También se contempla, como elemento del módulo de expresión, un terminador. Estos elementos pueden actuar para potenciar los niveles de mensaje y para minimizar la lectura a través del módulo hacia otras secuencias.

Construcciones antisentido

La expresión "ácido nucleico antisentido" pretende referirse a los oligonucleótidos complementarios con las secuencias de bases del ADN y ARN. Los oligonucleótidos antisentido, cuando se introducen en una célula diana, se unen específicamente a su ácido nucleico diana e interfieren con la transcripción, el procesamiento del ARN, el transporte y/o la traducción. La utilización de ADN bicatenario (bc) con oligonucleótidos conduce a la formación de una triple hélice; la utilización con ARN conduce a la formación de una doble hélice.

Pueden diseñarse construcciones antisentido para que se unan al promotor y a otras regiones de control, exones, intrones o incluso los límites de exón-intrón de un gen. Las construcciones de ARN antisentido o los ADN que codifican dichos ARN antisentido pueden emplearse para inhibir la transcripción o la traducción de genes o ambos dentro de una célula hospedante, in vitro o in vivo, como por ejemplo dentro de un animal hospedante, incluyendo un sujeto humano. Las secuencias de ácidos nucleicos que comprenden nucleótidos complementarios son aquellas que son capaces de un apareamiento de bases según las reglas de la complementariedad de Watson y Crick convencionales. Es decir, las purinas más grandes aparearan las bases con las pirimidinas más pequeñas para formar sólo combinaciones de guanina apareada con citosina (G:C) y adenina apareada con timina (A:T) en el caso del ADN, adenina apareada con uracilo (A:U) en el caso del ARN.

Tal como se emplea en la presente, el término "complementario" y la expresión "secuencias antisentido" significan secuencias de ácidos nucleicos que son sustancialmente complementarias a lo largo de su longitud completa y que tienen muy pocos desapareamientos. Por ejemplo, las secuencias de ácidos nucleicos con una longitud de quince bases pueden ser complementarias cuando tienen un nucleótido complementario en trece o catorce posiciones, con un único o dos desapareamientos. Naturalmente, las secuencias de ácidos nucleicos que son "completamente complementarias" serán secuencias de ácidos nucleicos que son totalmente complementarias a lo largo de su longitud completa y que no tienen desapareamientos de bases.

Aunque puede emplearse toda o parte de la secuencia génica en el contexto de la construcción antisentido, estadísticamente cualquier secuencia con una longitud de 17 bases se producirá sólo una vez en el genoma humano y, por tanto, es suficiente para especificar una secuencia diana exclusiva.

Aunque los oligómeros más cortos son más fáciles de fabricar y aumentan la accesibilidad in vivo, numerosos otros factores están implicados en la determinación de la especificidad de la hibridación. La afinidad de unión y la especificidad de secuencia de un oligonucleótido con su diana complementaria aumenta cuando aumenta la longitud. Se contempla que se van a utilizar oligonucleótidos de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ó mas pares de bases. Se puede determinar con facilidad si un ácido nucleico antisentido dado es eficaz para dirigirse al correspondiente gen de la célula hospedante sencillamente ensayando las construcciones in vitro para determinar si la función del gen endógeno se ve afectada o si la expresión de genes relacionados que tienen una secuencia complementaria se ve afectada.

En ciertas realizaciones se puede desear emplear construcciones antisentido que incluyan otros elementos, por ejemplo las que incluyen C-5 propinpirimidinas.

Los oligonucleótidos que contienen análogos de C-5 propina de uridina y citidina han demostrado unirse al ARN con alta afinidad y también que son potentes inhibidores antisentido de la expresión génica (Wagner et al., 1993).

Construcciones de ribozimas

Como alternativa a la administración dirigida de antisentido, pueden utilizarse ribozimas dirigidas. El término "ribozima" se refiere a una enzima basada en ARN capaz de dirigirse y romper secuencias de bases particulares en ADN y ARN de oncogenes. Las ribozimas pueden dirigirse directamente a las células en forma de oligonucleótidos de ARN que incorporan secuencias de ribozima, o pueden introducirse en la célula como una construcción de expresión que codifica el ARN ribozimico deseado. Las ribozimas pueden utilizarse y aplicarse de una manera bastante similar a la descrita para los ácidos nucleicos antisentido.

Métodos de transferencia de genes

Para mediar en el efecto de la expresión de un transgén en una célula será necesario transferir las construcciones de expresión terapéuticas de la presente invención a una célula. Esta sección proporciona un análisis de los métodos y las composiciones para la producción vírica y la transferencia de genes vírica, así como de métodos de transferencia de genes no víricos.

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(i) Transferencia mediada por un vector vírico

El gen de la familia THAP se incorpora en una partícula infecciosa vírica para mediar en la transferencia de genes hacia una célula. Otras construcciones de expresión que codifican otros agentes terapéuticos como se describe en la presente también pueden transferirse mediante la transducción vírica utilizando partículas víricas infecciosas, por ejemplo mediante la transformación con un vector de adenovirus de la presente invención como se describe a continuación en la presente. Como alternativa, puede emplearse un virus retrovírico o de papiloma bovino, permitiendo ambos la transformación permanente de una célula hospedante con el gen o los genes de interés. Por tanto, en un ejemplo, la infección vírica de células se emplea para administrar genes terapéuticamente significativos a una célula. De modo típico, el virus sencillamente se expone a la célula hospedante apropiada bajo condiciones fisiológicas, permitiendo la captación del virus. Aunque un ejemplo es un adenovirus, los presentes métodos pueden emplearse, de modo ventajoso, con otros vectores víricos o no víricos, como se analiza a continuación.

2. Adenovirus

Los adenovirus son particularmente adecuados para su uso como vector de transferencia de genes debido a su genoma de ADN de tamaño medio, su facilidad de manipulación, su alta valoración, su amplia gama de células diana y su alta infectividad. El genoma vírico de aproximadamente 36 kB está unido mediante repeticiones terminales invertidas (ITR) de 100-200 pares de bases (pb), en las que están contenidos elementos de acción cis necesarios para la replicación y la encapsidación del ARN vírico. Las regiones temprana ("early", E) y tardía ("late", L) del genoma que contienen diferentes unidades de transcripción se dividen cuando comienza la replicación del ADN vírico.

La región EI (EIA y EIB) codifica proteínas responsables de la regulación de la transcripción del genoma vírico y unos pocos genes celulares. La expresión de la región E2 (E2A y E2B) da como resultado la síntesis de proteínas para la replicación del ADN vírico.

Estas proteínas están implicadas en la replicación del ADN, la expresión tardía de genes y la desactivación de la célula hospedante (Renan, 1990). Los productos de los genes tardíos (L1, L2, U, L4 y L5), incluyendo la mayoría de las proteínas de la cápsida vírica, se expresan sólo después de un significativo procesamiento de un único transcrito primario producido por el promotor tardío principal (MLP). El MLP (localizado a 16,8 unidades de mapa) es particularmente eficaz durante la fase tardía de la infección, y todos los ARNm producidos desde este promotor poseen una secuencia conductora tripartita (TL) 5' que los hacen ser los ARNm preferidos para la traducción.

Para que un adenovirus se optimice para la terapia génica, es necesario maximizar la capacidad portadora de manera que puedan incluirse grandes segmentos de ADN. También es muy deseable reducir la toxicidad y la reacción inmunológica asociada con ciertos productos adenovíricos. Los dos objetivos son, hasta cierto punto, coincidentes porque la eliminación de los genes adenovíricos sirve para ambos. Practicando la presente invención es posible lograr estos objetivos mientras que se mantiene la capacidad para manipular las construcciones terapéuticas con facilidad relativa.

El gran desplazamiento del ADN es posible porque los elementos cis necesarios para la replicación del ADN vírico están todos localizados en las repeticiones terminales invertidas (ITR) (100-200 pb) en cualquier extremo del genoma vírico lineal. Los plásmidos que contienen ITR pueden replicarse en presencia de un adenovirus no defectuoso (Hay et al., 1984). Por tanto, la inclusión de estos elementos en un vector adenovírico debería permitir la replicación.

Además, la señal de encapsidación para la encapsidación vírica se localiza entre 194-385 pb (0,5-1,1 unidades de mapa) en el extremo izquierdo del genoma vírico (Hearing et al., 1987). Esta señal imita el sitio de reconocimiento de proteínas en el ADN del bacteriófago k en el que una secuencia específica cerca del extremo izquierdo, pero fuera de la secuencia del extremo cohesivo, media en la unión a proteínas que es necesaria para la inserción del ADN en la estructura de cabeza. Los vectores de sustitución de Ad han demostrado que un fragmento de 450 pb (0-1,25 unidades de mapa) en el extremo izquierdo del genoma vírico puede dirigir la encapsidación en células 293 (Levrero et al., 1991).

Previamente, se ha demostrado que ciertas regiones del genoma adenovírico pueden ser incorporadas al genoma de células de mamífero y que los genes codificados por ellas pueden expresarse. Estas líneas celulares son capaces de soportar la replicación de un vector adenovírico que sea deficiente en la función adenovírica codificada por la línea celular. También ha habido informes sobre la complementación de vectores adenovíricos deficientes en la replicación por vectores "auxiliares", por ejemplo virus de tipo salvaje o mutantes condicionalmente defectuosos.

Los vectores adenovíricos deficientes en la replicación pueden complementarse, en trans, por virus auxiliares. Sin embargo, esta observación por sí sola no permite el aislamiento de vectores deficientes en la replicación, puesto que la presencia de un virus auxiliar, necesaria para proporcionar las funciones replicativa, contaminaría cualquier preparación. Por tanto, se necesita otro elemento adicional que añada especificidad a la replicación y/o la encapsidación del vector deficiente en la replicación. Este elemento, tal como se proporciona en la presente invención, se deriva de la función de encapsidacón del adenovirus.

Se ha demostrado que existe una señal de encapsidación para el adenovirus en el extremo izquierdo del mapa del adenovirus convencional (Tibbetts, 1997). Estudios posteriores han demostrado que un mutante con una deleción en la región EIA (194-358 pb) del genoma creció mal incluso en una línea celular que complementaba la función temprana (EIA) (Hearing y Shenk, 1983). Cuando se recombinó un ADN adenovírico compensatorio (0-353 pb) en el extremo derecho del mutante, el virus se encapsidó con normalidad. Otros análisis mutacionales identificaron un elemento corto, repetido, dependiente de la posición en el extremo izquierdo del genoma de Ad5. Se descubrió que una copia de la repetición era suficiente para una encapsidación eficaz si estaba presente en cualquiera de los extremos del genoma, pero no cuando se movía hacia el interior de la molécula de ADN de Ad5 (Hearing et al., 1987).

Mediante la utilización de versiones mutadas de la señal de encapsidación, es posible crear virus auxiliares que se encapsidan con eficacias variables. De forma típica, las mutaciones son mutaciones puntuales o deleciones. Cuando se cultivan virus auxiliares con baja eficacia de encapsidación en células auxiliares, el virus se encapsida, aunque a velocidades reducidas comparado con el virus de tipo salvaje, permitiendo con ello la propagación del auxiliar. Sin embargo, cuando estos virus auxiliares se cultivan en células junto con virus que contiene señales de encapsidación de tipo salvaje, las señales de encapsidación de tipo salvaje son reconocidas preferentemente frente a las versiones mutadas. Dada una cantidad limitante de factor de encapsidación, los virus que contienen las señales de tipo salvaje se encapsidan selectivamente cuando se compara con los auxiliares. Si la preferencia es lo suficientemente grande, deberían lograrse cepas que se aproximen a la homogeneidad.

3. Retrovirus

Los retrovirus son un grupo de virus de ARN monocatenarios caracterizados por la capacidad para convertir su ARN en ADN bicatenario en células infectadas por un proceso de transcripción inversa (Coffin, 19990). El ADN resultante entonces se integra de forma estable en los cromosomas celulares como un provirus y dirige la síntesis de proteínas víricas.

La integración produce la retención de las secuencias génicas víricas en la célula receptora y sus descendientes. El genoma retrovírico contiene tres genes, gag, pol y env, que codifican las proteínas de la cápsida, la enzima polimerasa y los componentes de la envuelta, respectivamente. Una secuencia que se encuentra cadena arriba desde el gen gag, denominada T, actúa como una señal para la encapsidación del genoma en viriones. Dos secuencias repetidas terminales largas (LTR) están presentes en los extremos 5' y 3' del genoma vírico. Éstas contienen secuencias promotoras y potenciadoras fuertes y también son necesarias para la integración en el genoma de la célula hospedante (Coffin, 1990).

Para construir un vector retrovírico, un ácido nucleico que codifica un promotor se inserta en el genoma vírico en lugar de ciertas secuencias víricas para producir un virus que es defectuoso en la replicación. Para producir viriones, se construye una línea celular de encapsidación que contiene los genes gag, pol y env pero sin los componentes LTR y T (Mann et al., 1983). Cuando se introduce un plásmido recombinante que contiene ADNc humano, junto con las secuencias retrovíricas LTR y T en esta línea celular (mediante precipitación de fosfato de calcio, por ejemplo), la secuencia T permite que el transcrito de ARN del plásmido recombinante sea encapsidado en partículas víricas, que entonces se segregan hacia el medio de cultivo (Nicolas y Rubenstein, 1988; Temin, 1986; Mann et al., 1983). El medio que contiene los retrovirus recombinantes se recoge, opcionalmente se concentra, y se emplea para la transferencia de genes. Los vectores retrovíricos con capaces de infectar una amplia variedad de tipos celulares. Sin embargo, la integración y la expresión estable de muchos de tipos de retrovirus requiere la división de las células hospedantes (Paskind et al., 1975).

Una estrategia diseñada para permitir el transporte dirigido específico de vectores de retrovirus se ha desarrollado recientemente, basándose en la modificación química de un retrovirus mediante la adición química de restos galactosa a la envuelta vírica. Esta modificación puede permitir la interacción específica de células, como hepatocitos, a través de receptores de asialoglicoproteínas, si esto se desea. Se ha diseñado una estrategia diferente para dirigir retrovirus recombinantes en la que se emplean anticuerpos biotinilados contra una proteína de la envuelta retrovírica y contra un receptor celular específico. Los anticuerpos se acoplaron a través de los componentes de biotina utilizando estreptavidina (Roux et al., 1989). Utilizando anticuerpos contra los antígenos de clase I y de clase II del complejo de histocompatibilidad principal, se demostró la infección de una diversidad de células humanas que portan estos antígenos en la superficie con un virus ecotrópico in vitro (Roux et al., 1989).

4. Virus adenoasociados

Los AAV utilizan un ADN monocatenario lineal de aproximadamente 4700 pares de bases. Repeticiones terminales invertidas flanquean el genoma. Dos genes están presentes dentro del genoma, produciendo una serie de productos génicos diferenciados. El primero, el gen cap, produce tres proteínas de virión diferentes (VP), denominadas VP-1, VP-2 y VP-3.

El segundo, el gen rep, codifica cuatro proteínas no estructurales (NS). Uno o más de estos productos del gen rep es responsable de transactivar la transcripción de AAV.

Los tres promotores en AAV se denominan empleando su localización, en unidades de mapa, en el genoma. Éstos son, de izquierda a derecha, p5, p19 y p40. La transcripción produce seis transcritos, dos que se inician en cada uno de los tres promotores, estando uno de cada pareja roto.

El sitio de ruptura, derivado de las unidades de mapa 42-46, es el mismo para cada trascrito. Las cuatro proteínas no estructurales aparentemente se derivan del más largo de los transcritos, y tres proteínas del virión surgen todas del transcrito más pequeño.

El AAV no está asociado con ningún estado patológico en seres humanos. De manera interesante, para la replicación eficaz, el AAV requiere una funciones "auxiliares" de virus como el virus del herpes simplex I y II, el citomegalovirus, el virus de la pseudorrabia y, por supuesto, del adenovirus.

El auxiliar mejor caracterizado es el adenovirus, y muchas funciones "tempranas" de este virus han demostrado ayudar a la replicación del AAV. Se cree que un bajo nivel de expresión de las proteína rep de AAV mantiene en jaque la expresión estructural del AAV y se cree que una infección con el virus auxiliar elimina este bloqueo.

Las repeticiones terminales del vector AAV pueden obtenerse mediante digestión con endonucleasas de restricción de AAV o un plásmido como p201, que contiene un genoma de AAV modificado (Samulski et al., 1987), o mediante otros métodos conocidos por los expertos en la técnica incluyendo, pero sin limitarse a las síntesis química o enzimática de las repeticiones terminales basándose en la secuencia publicada de AAV. Los expertos en la técnica pueden determinar, mediante métodos muy conocidos como el análisis de las deleciones, la secuencia mínima o parte de los ITR de AAV que son requeridos para permitir la función, es decir, la integración estable y específica de sitio.

Los expertos en la técnica también pueden determinar cuáles son las pequeñas modificaciones de la secuencia que pueden tolerarse mientras se mantiene la capacidad de las repeticiones terminales para dirigir la integración estable y específica de sitio.

Se ha demostrado que los vectores basados en AAV son vehículos seguros y eficaces para la administración de genes in vitro, y estos vectores se están desarrollando y ensayando en etapas preclínicas y clínicas para una amplia gama de aplicaciones en terapias génicas potenciales, tanto ex vivo como in vivo (Carter y Flotte, 1996; Chattedee et al., 1995; Ferrari et al., 1996; Fisher et al., 1996; Flotte et al., 1993; Goodman et al., 1994; Kaplitt et al., 1994; 1996, Kessler et al., 1996; Koeberl et al., 1997; Mizukami et al., 1996; Xiao et al., 1996).

La transferencia de genes eficaz mediada por AAV y su expresión en el pulmón ha conducido a ensayos clínicos para el tratamiento de la fibrosis quística (Carter y Flotte, 1996; Flotte et al., 1993). De manera similar, las perspectivas para el tratamiento de la distrofia muscular mediante la administración de genes mediada por AAV del gen de la distrofina al músculo esquelético, de la enfermedad de Parkinson mediante la administración del gen de la tirosina hidroxilasa al cerebro, de la hemofilia B mediante la administración del gen del factor IX al hígado, y potencialmente del infarto de miocardio mediante la administración del gen del factor del crecimiento endotelial vascular al corazón, parecen prometedoras puesto que la expresión de transgenes mediada por AAV en estos órganos ha demostrado recientemente ser muy eficaz (Fisher et al., 1996; Flotte et al., 1993; Kaplitt et al., 1994; 1996; Koeberl et al., 1997; McCown et al., 1996; Ping et al., 1996; y Xiao et al., 1996).

5. Otros vectores víricos

Pueden emplearse otros vectores víricos como construcciones de expresión en la presente invención. Los vectores derivados de virus como el virus de vaccinia (Ridgeway, 1988; Baichwal y Sugden, 1986; Coupar et al., 1988) y el virus de la hepatitis B también se han desarrollado y son útiles en la presente invención. Ofrecen varias características atractivas para diversas células de mamífero (Friedmann, 1989; Ridgeway, 1988; Baichwal y Sugden, 1986; Coupar et al., 1988; y Horwich et al., 1990).

Con el reciente reconocimiento de nuevos virus de la hepatitis B defectuosos, se ha alcanzado una nueva percepción de la relación entre estructura y función de diferentes secuencias víricas. Estudios in vitro han demostrado que el virus puede mantener la capacidad para la encapsidación dependiente de auxiliares y la transcripción inversa a pesar de la deleción de hasta 80% de su genoma (Horwich et al., 1990). Esto sugiere que grandes porciones del genoma pueden ser reemplazadas por material genético extraño. Chang et al., han introducido recientemente el gen de la cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) en el genoma del virus de la hepatitis B de pato en lugar de las secuencias codificadoras de la polimerasa, de superficie y de presuperficie. Se cotransfectó con el virus de tipo salvaje en una línea celular de hepatoma aviar. El medio de cultivo que contenía altas valoraciones del virus recombinante se empleó para inferctar hepatocitos de patito primarios. Se detectó la expresión estable del gen CAT durante al menos 24 días después de la transfección (Chang et al., 1991).

En otras realizaciones de la presente invención, los ácidos nucleicos que se van a administrar se alojan dentro de un virus infeccioso que se modificado para que exprese un ligando de unión específico. La partícula vírica por tanto se unirá específicamente a los receptores cognados de la célula diana y administrará los contenidos a la célula. Recientemente se ha desarrollado una nueva estrategia diseñada para permitir el transporte dirigido específico de vectores retrovíricos basándose en la modificación química de un retrovirus mediante la adición química de restos lactosa a la envuelta vírica. Esta modificación puede permitir la infección específica de hepatocitos a través de receptores de sialoglicoproteínas.

Se ha diseñado otra estrategia para la administración dirigida de retrovirus recombinantes, en la que se emplean anticuerpos biotinilados contra una proteína de la envuelta retrovírica y contra un receptor celular específico. Los anticuerpos se acoplaron a través de los componentes de biotina utilizado estreptavidina (Roux et al., 1989). Utilizando anticuerpos contra los antígenos de clase I y de clase II del complejo de histocompatibilidad principal, se demostró la infección de una diversidad de células humanas que portan estos antígenos en la superficie con un virus ecotrópico in vitro (Roux et al., 1989).

(ii) Transferencia no vírica

Las construcciones de ADN de la presente invención en general se administran a una célula. En ciertas situaciones, el ácido nucleico que se va a transferir no es infeccioso, y puede transferirse utilizando métodos no víricos.

Varios métodos no víricos para la transferencia de construcciones de expresión hacia células de mamífero son contemplados por la presente invención. Éstos incluyen la precipitación con fosfato de calcio (Graham y Van Der Eb, 1973; Chen y Okayama, 1987; Rippe et al., 1990) DEAE-dextrano (Gopal, 1985), electroporación (Tur Kaspa et al., 1986; Potter et al., 1984), microinyección directa (Harland y Weintraub, 1985), liposomas cargados de ADN (Nicolau y Sene, 1982; Fraley et al., 1979), sonicación de células (Fechheimer et al., 1987), bombardeo de genes utilizando microproyectiles de alta velocidad (Yang et al., 1990), y transfección mediada por receptores (Wu y Wu, 1987; Wu y Wu, 1988).

Cuando la construcción se ha introducido en la célula, el ácido nucleico que codifica el gen terapéutico puede colocarse y expresarse en diferentes sitios. En ciertas realizaciones, el ácido nucleico que codifica el gen terapéutico puede integrarse de modo estable en el genoma de la célula. Esta integración puede ser en una localización y orientación cognadas a través de una recombinación homóloga (reemplazamiento de genes), o puede integrarse en una localización aleatoria no específica (aumento de genes). En otras realizaciones, el ácido nucleico puede mantenerse de forma estable en la célula como un segmento separado, episómico de ADN. Estos segmentos de ácido nucleico o "episomas" codifican secuencias suficientes para permitir el mantenimiento y la replicación independiente o en sincronía con el ciclo de la célula hospedante.

La manera en que la construcción de expresión se dirige a una célula y el sitio en que permanece el ácido nucleico en la célula dependen del tipo de construcción de expresión empleada.

En una realización concreta de la invención, la construcción de expresión puede estar atrapada en un liposoma. Los liposomas son estructuras vesiculares caracterizadas por una membrana en bicapa de fosfolípidos y un medio acuoso interno. Los liposomas multilaminares tienen múltiples capas de lípidos separadas por un medio acuoso. Se forman de manera espontánea cuando los fosfolípidos están suspendidos en un exceso de disolución acuosa. Los componentes lipídicos sufren una autorredisposición antes de la formación de las estructuras cerradas y atrapan el agua y los solutos disueltos entre las bicapas lipídicas (Ghosh y Bachhawat, 1991). La adición de ADN a liposomas catiónicos provoca una transición topológica desde los liposomas a glóbulos condensados de líquido-cristalinos ópticamente birrefringentes (Radler et al., 1997). Estos complejos de ADN-lípidos son vectores no víricos potenciales para su uso en terapia génica.

La administración de ácidos nucleicos mediada por liposomas y la expresión de ADN extraño in vitro ha tenido mucho éxito. Utilizando el gen de la P-lactamasa, Wong et al. (1980) han demostrado la viabilidad del transporte mediado por liposomas y la expresión de ADN extraño en embrión de pollo cultivado, HeLa, y células de hepatoma. Nicolau et al. (1987) llevaron a cabo con éxito la transferencia de genes mediada por liposomas en ratas después de una inyección intravenosa. También se incluyen diversas estrategias comerciales que implican la tecnología de la "lipofección".

En ciertas realizaciones de la invención, el liposoma puede forma un complejo con un virus de hemaglutinina (HVJ). Se ha demostrado que esto facilita la fusión con la membrana celular y estimula la entrada en la célula de ADN encapsulado en liposomas (Kaneda et al., 1989).

En otras realizaciones, el liposma puede formar un complejo o puede emplearse junto con proteínas cromosómicas nucleares no histónicas (HMG-1) (Kato et al., 1991). En otras realizaciones, el liposoma puede formar un complejo o puede emplearse junto con HVJ y HMG-1. Puesto que dichas construcciones de expresión se han empleado con éxito en la transferencia y la expresión de ácidos nucleicos in vitro e in vivo, éstas son aplicables en la presente invención.

Otros sistemas de transporte de vectores que pueden emplearse para transportar un ácido nucleico que codifica un gen terapéutico a las células son los vehículos de transporte mediados por receptores. Estos aprovechan la captación selectiva de macromoléculas mediante una endocitosis mediada por receptores que se produce en casi todas las células eucariotas. Debido a la distribución específica del tipo celular de diversos receptores, el transporte puede ser muy específico (Wu y Wu, 1993).

Los vehículos de transporte de genes mediados por receptores consisten en general en dos componentes: un ligando específico del receptor celular y un agente de unión al ADN. Se han empleado varios ligandos para la transferencia de genes mediada por receptores. Los ligandos que se han caracterizado más a fondo son el asialoorosomucoide (ASOR) (Wu y Wu, 1987) y la transferrina (Wagner et al., 1990).

En fechas recientes, se ha empleado una neoglicoproteína sintética que reconoce el mismo receptor que ASOR como vehículo de transporte de genes (Ferkol et al., 1993; Perales et al., 1994) y también se ha empleado el factor del crecimiento epidérmico (EGF) para administrar genes a células de carcinoma escamoso (Myers, documento EPO 027308).

En otras realizaciones, el vehículo de transporte puede comprender un ligando y un liposoma. Por ejemplo, Nicolau et al. (1987) emplearon una lactosilceramida, un asialgangliósido con galactosa terminal, incorporado en liposomas y observaron un aumento en la captación del gen de la insulina por hepatocitos. Por tanto, es factible que un ácido nucleico que codifica un gen terapéutico también pueda ser transportado específicamente a un tipo celular como células de próstata, epiteliales o tumorales, por una serie de sistemas de receptor-ligando con o sin liposomas. Por ejemplo, el antígeno específico de próstata humano (Watt et al., 1986) puede utilizarse como receptor para el transporte mediado de un ácido nucleico en tejido de próstata.

En otra realización de la invención, la construcción de expresión puede consistir sencillamente en ADN recombinante desnudo o plásmidos. La transferencia de la construcción puede realizarse mediante cualquiera de los métodos mencionados anteriormente que permeabilizan física o químicamente la membrana celular. Esto es aplicable en particular para la transferencia in vivo; sin embargo también puede aplicarse para un uso in vivo. Dubensky et al. (1984) han inyectado con éxito ADN de poliornavirus en forma de precipitados de CaPO4 en el hígado y el bazo de ratones adultos y recién nacidos, demostrando una replicación vírica activa y una inyección aguda.

Benvenisty y Neshif (1986) también han demostrado que la inyección intraperitoneal directa de plásmidos precipitados con CaPO4 da como resultado la expresión de los genes transfectados. Se prevé que un ADN que codifica un CAM también pueda transferirse de una manera similar in vivo y expresar CAM.

Otra realización de la invención para transferir una construcción de expresión de ADN desnudo a células puede implicar el bombardeo de partículas. Este método depende de la capacidad para acelerar microproyectiles revestidos con ADN hasta una alta velocidad permitiendo que atraviesen las membranas celulares y entren en las células sin matarlas (Klein et al., 1987). Se han desarrollado varios dispositivos para acelerar partículas pequeñas. Uno de estos dispositivos se basa en una descarga de alto voltaje para generar una corriente eléctrica, que a su vez proporciona la fuerza motriz (Yang et al., 1990). Los microproyectiles utilizados han consistido en sustancias biológicamente inertes, como wolframio o esferas de oro.

Anticuerpos

Pueden prepararse anticuerpos policlonales anti-familia THAP o anti-dominio THAP como se describió anteriormente inmunizando a un sujeto adecuado con un inmunógeno de la familia THAP o de dominio THAP. La valoración del anticuerpo anti-familia THAP o anti-dominio THAP en el sujeto inmunizado puede controlarse a lo largo del tiempo mediante técnicas convencionales, como con un ensayo inmunoabsorbente de enzimas ligados (ELISA) utilizando una proteína de la familia THAP o de dominio THAP inmovilizada. Si se desea, las moléculas de anticuerpo dirigidas contra la familia THAP pueden aislarse a partir de un mamífero (por ejemplo de la sangre) y después purificarse mediante técnicas conocidas, como una cromatografía de proteína A, para obtener la fracción de IgG. En un momento apropiado después de la inmunización, por ejemplo cuando las valoraciones de los anticuerpos anti-familia THAP son las más altas, pueden obtenerse células productoras de anticuerpos a partir del sujeto y utilizarse para preparar anticuerpos monoclonales mediante técnicas convencionales, como las descritas en las siguientes referencias bibliográficas: la técnica del hibridoma descrita originariamente por Kohler y Milstein (1975), Nature 256:495-497) (véase también, Brown et al. (1981), J. Immunol., 127:539-546; Brown et al. (1980), J. Biol. Chem., 255:4980-4983; Yeh et al. (1976), PNAS, 76:2927-2931; y Yeh et al. (1982), Int. J. Cancer, 29:269-275), la técnica más reciente de hibridoma de células B humano (Kozbor et al. (1983), Immunol. Today, 4:72), la técnica del hibridoma de EBV (Cole et al. (1985), Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96) o técnicas de trioma. La tecnología para producir hibridomas de anticuerpos monoclonales es muy conocida (véase, en general, R.H. Kenneth, en Monoclonal Antibodies: A New Dimension In Biological Analyses, Plenum Publishing Corp., Nueva York, N.Y. (1980); E.A. Lerner (1981), Yale J. Biol. Med., 54:387-402; M.L. Gefter et al. (1977), Somatic Cell Genet., 3:231-236). Brevemente, una línea celular inmortal (de forma típica un mieloma) se fusiona con linfocitos (de forma típica esplenocitos) de un mamífero inmunizado con un inmunógeno de la familia THAP como se describió anteriormente, y los sobrenadantes de los cultivos de las células de hibridoma resultantes se seleccionan para identificar un hibridoma que produzca un anticuerpo monoclonal que se una a la familia THAP.

Cualquiera de muchos protocolos conocidos utilizados para fusionar linfocitos y líneas celulares inmortalizadas puede aplicarse con el fin de generar un anticuerpo monoclonal anti-familia THAP o anti-dominio THAP (véase, por ejemplo, G. Galfre et al. (1977), Nature, 266:55052; Gefter et al., Somatic Cell Genet., citado supra; Lerner, Yale J. Biol. Med., citado supra; Kenneth, Monoclonal Antibodies, citado supra). Además, los expertos en la técnica apreciarán que existen muchas variaciones de dichos métodos que también podrían ser útiles. De forma típica, la línea celular inmortal (por ejemplo una línea celular de mieloma) se deriva de la misma especie de mamífero que los linfocitos. Por ejemplo, pueden fabricarse hibridomas murinos fusionando linfocitos de un ratón inmunizado con una preparación inmunogénica de la presente invención con una línea celular de ratón inmortalizada. Las líneas celulares inmortales preferidas son las líneas celulares de mieloma que son sensibles a un medio de cultivo que contenga hipoxantina, aminopterina y timidina ("medio HAT"). Puede utilizarse cualquiera de una serie de líneas celulares de mieloma como compañero de fusión según técnicas convencionales, por ejemplo las líneas de mieloma P3-NSI/1-Ag4-1, P3-x63-Ag8.653 o Sp2/O-Agl4. Estas líneas de mieloma están disponibles en ATCC. De forma típica, las células de mieloma de ratón sensibles a HAT se fusionan con esplenocitos de ratón utilizando polietilenglicol ("PEG"). Las células de hibridoma que resultan de la fusión entonces se seleccionan utilizando un medio HAT, que mata a las células no fusionadas y a las células de mieloma fusionadas no productivas (los esplenocitos no fusionados mueren después de varios días porque no están transformados). Las células de hibridoma que producen un anticuerpo monoclonal de la invención se detectan mediante la selección de los sobrenadantes de los cultivos de hibridoma para detectar anticuerpos que se unen a una proteína de la familia THAP o de dominio THAP, por ejemplo utilizando un ensayo ELISA convencional.

Como alternativa a la preparación de hibridomas que segregan anticuerpos monoclonales, puede identificarse un anticuerpo monoclonal anti-familia THAP o anti-dominio THAP y aislarse seleccionando un banco de inmunoglobulinas combinatorio recombinante (por ejemplo un banco de presentación de fagos de anticuerpos) con una proteína de la familia THAP o de dominio THAP para aislar, con ello, miembros del banco de inmunoglobulinas que se unen a proteínas de la familia THAP o de dominio THAP. Los kits para generar y seleccionar bancos de presentación de fagos están disponibles en el mercado (por ejemplo, el sistema de anticuerpos de fagos recombinantes de Pharmacia, nº de catálogo 27-9400-01; y el kit de presentación de fagos de Stratagene SurfZAP.TM., nº de catálogo 240612). Además, pueden encontrarse ejemplos de métodos y reactivos particularmente adecuados para su uso en la generación y la selección de un banco de presentación de anticuerpos, por ejemplo en Ladner et al., patente de EEUU nº 5.223.409; Kang et al., publicación internacional PCT nº WO 92/18619; Dower et al., publicación internacional PCT nº WO 91/17271; Winter et al., publicación internacional PCT nº WO 92/20791; Markland et al., publicación internacional PCT nº WO 92/15679; Breitling et al., publicación internacional PCT nº WO 93/01288; McCafferty et al., publicación internacional PCT nº WO 92/01047; Garrard et al., publicación internacional PCT nº WO 92/09690; Ladner et al., publicación internacional PCT nº WO 90/02809; Fuchs et al. (1991), Bio/Technology, 9:1370-1372; Hay et al. (1992), Hum. Antibod. Hybridomas, 3:81-85; Huse et al. (1989), Science 246:1275-1281; Griffiths et al. (1993), EMBO J., 12:725-734; Hawkins et al. (1992), J. Mol. Biol., 226:889-896; Clarkson et al. (1991), Nature, 352:624-628; Gram et al. (1992), PNAS, 89:3576-3580; Garrad et al. (1991), Bio/Technology, 9:1373-1377; Hoogenboom et al. (1991), Nuc. Acid Res.,
19:4133-4137; Barbas et al. (1991), PNAS 88:7978-7982; y McCafferty et al., Nature (1990), 348:552-554.

Además, anticuerpos recombinantes anti-familia THAP o anti-dominio THAP, como anticuerpos monoclonales quiméricos y humanizados, que comprenden porciones humanas y no humanas, que pueden fabricarse utilizando técnicas de ADN recombinante convencionales, están dentro del alcance de la invención. Estos anticuerpos quiméricos y humanizados pueden producirse mediante técnicas de ADN recombinante conocidas en la técnica, por ejemplo utilizando métodos descritos en Robinson et al., solicitud internacional nº PCT/US86/02269; Akira et al., solicitud de patente europea 184.187; Taniguchi, M., solicitud de patente europea 171496; Morrison et al., solicitud de patente europea 173,494; Neuberger et al., publicación internacional PCT nº WO 86/01533; Cabilly et al., patente de EEUU nº 4.816.567; Cabilly et al., solicitud de patente europea 125.023; Better et al. (1988), Science, 240:1041-1043; Liu et al. (1987), PNAS, 84:3439-3443; Liu et al. (1987), J. Immunol., 139:3521-3526; Sun et al. (1987), PNAS, 84:214-218; Nishimura et al. (1987), Canc. Res., 47:999-1005; Wood et al. (1985), Nature, 314:446-449; y Shaw et al. (1988), J. Natl. Cancer Inst., 80:1553-1559); Morrison, S.L. (1985), Science, 229:1202-1207; Oi et al. (1986), BioTechniques, 4:214; Winter, patente de EEUU nº 5.225.539; Jones et al. (1986), Nature, 321:552-525; Verhoeyan et al. (1988), Science, 239:1534; y Beidler et al. (1988), J. Immunol., 141:4053-4060.

Un anticuerpo anti-familia THAP o anti-dominio THAP (por ejemplo un anticuerpo monoclonal) puede utilizarse para aislar una proteína de la familia THAP o de dominio THAP mediante técnicas convencionales, como cromatografía de afinidad o inmunoprecipitación. Por ejemplo, un anticuerpo anti-familia THAP puede facilitar la purificación de la familia THAP natural de células y de compuestos de la familia THAP producidos de modo recombinante expresados en células hospedantes. Además, un anticuerpo anti-familia THAP puede utilizarse para detectar una proteína de la familia THAP (por ejemplo en un lisado celular o en un sobrenadante celular) para evaluar la abundancia y el patrón de expresión de la proteína de la familia THAP. Los anticuerpos anti-familia THAP pueden utilizarse de manera diagnóstica para controlar los niveles de proteínas en tejidos como parte de un procedimiento de ensayo clínico, por ejemplo para determinar la eficacia de un régimen de tratamiento dado. La detección puede verse facilitada por el acoplamiento (es decir, la unión física) del anticuerpo a una sustancia detectable. Los ejemplos de sustancias detectables incluyen diversas enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes, y materiales radiactivos. Los ejemplos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina, galactosidasa o acetilcolinesterasa; los ejemplos de complejos de grupos prostéticos adecuados incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; los ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilaminafluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un material luminiscente incluyen luminol; los ejemplos de materiales bioluminiscentes incluyen luciferasa, luciferina, y aequorina; y los ejemplos de materiales radiactivos adecuados incluyen ^{125}I, ^{131}I, ^{35}S o ^{3}H.

Ensayos de selección de fármacos

La invención proporciona un método (también denominado en la presente "ensayo de selección") para identificar moduladores, es decir candidatos o compuestos de ensayo o agentes (por ejemplo, preferiblemente moléculas pequeñas pero también péptidos, peptidomiméticos u otros fármacos) que se unen a las proteínas de la familia THAP o de dominio THAP, que tienen un efecto inhibidor o activador sobre, por ejemplo, la expresión de la familia THAP o preferiblemente una actividad de la familia THAP, o que tienen un efecto inhibidor o activador sobre, por ejemplo, la actividad de una molécula diana de la familia THAP. En algunas realizaciones, las moléculas pequeñas pueden generarse utilizando la química combinatoria o pueden obtenerse a partir de un banco de productos naturales. Los ensayos pueden estar basados en células, no basados en células o pueden ser ensayos in vivo. Los ensayos de selección de fármacos pueden ser ensayos de unión o, más preferentemente, ensayos funcionales como se describe a continuación.

En general, cualquier actividad adecuada de una proteína de la familia THAP puede detectarse en un ensayo de selección de fármacos, incluyendo: (1) la mediación en la apoptosis o la proliferación celular cuando se expresa o se introduce en una célula, lo más preferiblemente la inducción o la potenciación de la apoptosis y/o lo más preferiblemente la reducción de la proliferación celular; (2) la mediación en la apoptosis o la proliferación celular de una célula endotelial; (3) la mediación en la apoptosis o la proliferación celular de una célula hiperproliferativa; (4) la mediación en la apoptosis o la proliferación celular de una célula del SNC, preferiblemente una célula neuronal o glial; (5) una actividad indicativa de una función biológica en un animal seleccionada del grupo que consiste en la mediación, preferiblemente la inhibición, de la angiogénesis, la mediación, preferiblemente la inhibición, de la inflamación, la inhibición del potencial metastásico de tejido canceroso, la reducción de la carga tumoral, el aumento de la sensibilidad a la quimioterapia o la radioterapia, la muerte de una célula de cáncer, la inhibición del crecimiento de una célula de cáncer, o la inducción de la regresión tumoral; o (6) la interacción con una molécula diana de la familia THAP o una molécula diana del dominio THAP, preferiblemente la interacción con una proteína o un ácido nucleico.

La invención también proporciona un método (también denominado en la presente "ensayo de selección") para identificar moduladores, es decir, candidatos o compuestos de ensayo o agentes (por ejemplo, preferiblemente moléculas pequeñas pero también péptidos, peptidomiméticos u otros fármacos) que se unen a las proteínas THAP1, PAR4 o PLM-NB, y que tienen un efecto inhibidor o activador sobre PAR4 o el reclutamiento o unión de THAP1 a o la asociación con PML-NB o la interacción, como la unión, de SLC con un polipéptido de la familia THAP o una respuesta celular a SLC que está mediada por un polipéptido de la familia THAP.

En una realización, la invención proporciona ensayos para seleccionar candidatos o compuestos de ensayo que son moléculas diana para un polipéptido de la familia THAP o de dominio THAP, o su fragmento biológicamente activo o su homólogo. En otra realización, la invención proporciona ensayos para seleccionar candidatos o compuestos de ensayo que se unen o modulan la actividad de un polipéptido de la familia THAP o de dominio THAP, o su fragmento biológicamente activo o su homólogo.. Los compuestos de ensayo de la presente invención pueden obtenerse utilizando cualquiera de una serie numerosa de estrategias en los métodos de bancos combinatorios conocidas en la técnica, incluyendo bancos biológicos; bancos en fase sólida o en fase de disolución paralelos espacialmente direccionables; métodos de bancos sintéticos que requieren la desconvolución; el método del banco de "una esfera-un compuesto"; y métodos de bancos sintéticos que emplean la selección por cromatografía de afinidad. La estrategia del banco biológico se emplea con bancos de péptidos, mientras que las otras cuatro estrategias son aplicables a compuestos de bancos de moléculas pequeñas, de oligómeros no peptídicos, o peptídicos (Lam, K.S. (1997), Anticancer Drug Des., 12:145).

En la técnica pueden encontrarse ejemplos de métodos para la síntesis de bancos moleculares, por ejemplo en DeWitt et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 90:6909; Erb et al. (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:11422; Zuckermann et al. (1994), J. Med. Chem., 37:2678; Cho et al. (1993), Science 261:1303; Carrell et al. (1994), Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 33:2059; Carell et al. (1994), Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 33:2061; y en Gallop et al. (1994), J. Med. Chem., 37:1233.

Los bancos de compuestos pueden presentarse en disolución (por ejemplo, Houghten (1992), Biotechniques
13:412-421), o sobre esferas (Lam (1991), Nature 354:82-84), chips (Fodor (1993), Nature 364:555-556), bacterias (Ladner, patente de EEUU nº 5.223.409), esporas (Ladner, patente de EEUU nº '409), plásmidos (Cull et al. (1992), Proc Natl Acad Sci USA, 89:1865-1869) o sobre fagos (Scott y Smith (1990), Science, 249:386-390); (Devin (1990), Science, 249:404-406); (Cwirla et al. (1990), Proc. Natl. Acad. Sci., 87:6378-6382); (Felici (1991), J. Mol. Biol., 222:301-310); (Ladner supra.).

También se puede determinar la capacidad del compuesto de ensayo para inhibir o aumentar la actividad de un polipéptido de la familia THAP, por ejemplo acoplando el polipéptido de la familia THAP o de dominio THAP, o su fragmento biológicamente activo o su homólogo, con un marcador de radioisótopo o enzimático, de forma que la unión del polipéptido de la familia THAP o de dominio THAP, o su fragmento biológicamente activo o su homólogo, con su molécula diana cognada puede determinarse detectando el polipéptido de la familia THAP o de dominio THAP marcado, o su fragmento biológicamente activo o su homólogo en un complejo. Por ejemplo, los compuestos (por ejemplo, un polipéptido de la familia THAP o de dominio THAP, o su fragmento biológicamente activo o su homólogo) puede marcarse con ^{125}I, ^{35}S, ^{14}C o ^{3}H, directa o indirectamente, y el radioisótopo puede detectarse mediante recuento directo de la radioemisión o mediante recuento de centelleo. Como alternativa, los compuestos pueden marcarse de modo enzimático, por ejemplo con peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina, o luciferasa, y el marcador enzimático puede detectarse mediante la determinación de la conversión de un sustrato apropiado en un producto. Por ejemplo, el grado de la formación del complejo puede medirse mediante la inmunoprecipitación del complejo o realizando una electroforesis en gel.

Dentro del alcance de la invención está también la determinación de la capacidad de un compuesto (por ejemplo, un polipéptido de la familia THAP o de dominio THAP, o su fragmento biológicamente activo o su homólogo) para interaccionar con su molécula diana cognada sin el marcaje de ninguno de los compuestos que reaccionan. Por ejemplo, puede utilizarse un microfisiómetro para detectar la interacción de un compuesto con su molécula diana cognada sin marcar el compuesto ni la molécula diana (McConnell, H.M. et al. (1992), Science, 257:1906-1912). Un microfisiómetro, como un citodetector, es un instrumento analítico que mide la velocidad a la que una célula acidifica su entorno utilizando un detector potenciométrico direccionable por la luz (LAPS). Los cambios en esta velocidad de acidificación pueden utilizarse como indicador de la interacción entre el compuesto y la molécula diana cognada.

En una realización preferida, el ensayo comprende poner en contacto una célula que expresa un polipéptido de la familia THAP o de dominio THAP, o su fragmento biológicamente activo o su homólogo, con una molécula diana de la proteína de la familia THAP o de dominio THAP para formar una mezcla de ensayo, poner en contacto la mezcla de ensayo con un compuesto de ensayo, y determinar la capacidad del compuesto de ensayo para inhibir o aumentar la actividad del polipéptido de la familia THAP o de dominio THAP, o su fragmento biológicamente activo o su homólogo, en el que la determinación de la capacidad del compuesto de ensayo para inhibir o aumentar la actividad de un polipéptido de la familia THAP o de dominio THAP, o su fragmento biológicamente activo o su homólogo, comprende determinar la capacidad del compuesto de ensayo para inhibir o aumentar una actividad biológica de la célula que expresa el polipéptido de la familia THAP.

En otra realización, el ensayo comprende poner en contacto una célula que expresa un polipéptido de la familia THAP o de dominio THAP, o su fragmento biológicamente activo o su homólogo, con un compuesto de ensayo, y determinar la capacidad del compuesto de ensayo para inhibir o aumentar la actividad del polipéptido de la familia THAP o de dominio THAP, o su fragmento biológicamente activo o su homólogo, en el que la determinación de la capacidad del compuesto de ensayo para inhibir o aumentar la actividad de un polipéptido de la familia THAP o de dominio THAP, o su fragmento biológicamente activo o su homólogo, comprende determinar la capacidad del compuesto de ensayo para inhibir o aumentar una actividad biológica de la célula que expresa el polipéptido de la familia THAP.

En otra realización preferida, el ensayo comprende poner en contacto una célula que responde a un polipéptido de la familia THAP o de dominio THAP, o su fragmento biológicamente activo o su homólogo, con una proteína de la familia THAP o su porción biológicamente activa, para formar una mezcla de ensayo, poner en contacto la mezcla de ensayo con un compuesto de ensayo, y determinar la capacidad del compuesto de ensayo para modular la actividad de la proteína de la familia THAP, o su porción biológicamente activa, en el que la determinación de la capacidad del compuesto de ensayo para modular la actividad de las proteínas de la familia THAP, o su porción biológicamente activa, comprende determinar la capacidad del compuesto de ensayo para modular una actividad biológica de la célula que responde al polipéptido de la familia THAP (por ejemplo, determinar la capacidad del compuesto de ensayo para modular una actividad de un polipéptido de la familia THAP).

En otra realización, un ensayo es un ensayo basado en células, que comprende poner en contacto una célula que expresa una molécula diana de la familia THAP (es decir, una molécula con la que interacciona un polipéptido de la familia THAP) con un compuesto de ensayo, y determinar la capacidad del compuesto de ensayo para modular (por ejemplo, estimular o inhibir) la actividad de una molécula diana de la familia THAP. La determinación de la capacidad del compuesto de ensayo para modular la actividad de una molécula diana de la familia THAP puede realizarse, por ejemplo, determinando la capacidad del polipéptido de la familia THAP o de dominio THAP, o su fragmento biológicamente activo o su homólogo, para unirse o interaccionar con la molécula diana de la familia THAP.

La determinación de la capacidad del polipéptido de la familia THAP o de dominio THAP, o su fragmento biológicamente activo o su homólogo, para unirse o interaccionar con la molécula diana de la familia THAP puede realizarse mediante uno de los métodos descritos anteriormente para determinar la unión directa. En una realización preferida, la determinación de la capacidad del polipéptido de la familia THAP o de dominio THAP, o su fragmento biológicamente activo o su homólogo, para unirse o interaccionar con la molécula diana de la familia THAP puede lograrse determinando la actividad de la molécula diana. Por ejemplo, la actividad de la molécula diana puede determinarse poniendo en contacto la molécula diana con el polipéptido de la familia THAP o de dominio THAP, o su fragmento biológicamente activo o su homólogo, y midiendo la inducción de un segundo mensajero celular de la diana (es decir, Ca^{2+} intracelular, diacilglicerol, IP_{3}, etc.), detectando la actividad citalítica/enzimática de la diana y el sustrato adecuado, detectando la inducción de un gen indicador (que comprende un elemento regulador que responde a la diana unido operativamente con un ácido nucleico que codifica un marcador detectable, por ejemplo luciferasa), o detectando una respuesta celular regulada por la diana, por ejemplo la transducción de señales o interacciones de proteína:proteína.

En otra realización, un ensayo de la presente invención es un ensayo exento de células en el que un polipéptido de la familia THAP o de dominio THAP, o su fragmento biológicamente activo o su homólogo, se pone en contacto con un compuesto de ensayo y se determina la capacidad del compuesto de ensayo para unirse al polipéptido de la familia THAP o de dominio THAP, o su fragmento biológicamente activo o su homólogo. La unión del compuesto de ensayo al polipéptido de la familia THAP o de dominio THAP, o su fragmento biológicamente activo o su homólogo, puede determinarse directa o indirectamente como se describió anteriormente. En una realización preferida, el ensayo incluye poner en contacto el polipéptido de la familia THAP o de dominio THAP, o su fragmento biológicamente activo o su homólogo, con un compuesto conocido que se une al polipéptido de la familia THAP (por ejemplo, una molécula diana de la familia THAP) para formar una mezcla de ensayo, poner en contacto la mezcla de ensayo con un compuesto de ensayo, y determinar la capacidad del compuesto de ensayo para interaccionar con un polipéptido de la familia THAP o de dominio THAP, o su fragmento biológicamente activo o su homólogo, en la que la determinación de la capacidad del compuesto de ensayo para interaccionar con una proteína de la familia THAP comprende determinar la capacidad del compuesto de ensayo para unirse preferentemente con un polipéptido de la familia THAP o de dominio THAP, o su fragmento biológicamente activo o su homólogo, comparada con el compuesto conocido.

En otra realización, el ensayo es un ensayo exento de células, en el que un polipéptido de la familia THAP o de dominio THAP, o su fragmento biológicamente activo o su homólogo, se pone en contacto con un compuesto de ensayo y se determina la capacidad del compuesto de ensayo para modular (por ejemplo, estimular o inhibir) la actividad del polipéptido de la familia THAP o de dominio THAP, o su fragmento biológicamente activo o su homólogo. La determinación de la capacidad del compuesto de ensayo para modular la actividad de una proteína de la familia THAP puede lograrse, por ejemplo, determinando la capacidad del polipéptido de la familia THAP o de dominio THAP, o su fragmento biológicamente activo o su homólogo, para unirse a una molécula diana de la familia THAP mediante uno de los métodos descritos anteriormente para determinar la unión directa. La determinación de la capacidad del polipéptido de la familia THAP o de dominio THAP, o su fragmento biológicamente activo o su homólogo, para unirse a una molécula diana de la familia THAP también puede lograrse utilizando un tecnología como el análisis de interacción biomolecular (BIA) a tiempo real (Sjolander, S. y Urbaniczky, C. (1991), Anal. Chem., 63:2338-2345; y Szabo et al. (1995), Curr. Opin. Struct. Biol., 5:699-705). Tal como se emplea en la presente, "BIA" es una tecnología para estudiar las interacciones bioespecíficas a tiempo real, sin marcar ninguno de los compuestos que interaccionan (por ejemplo, BIAcore). Los cambios en el fenómeno óptico de la resonancia de plasmón de superficie (SPR) pueden utilizarse como una indicación de reacciones a tiempo real entre las moléculas biológicas.

En una realización alternativa, puede determinarse la capacidad del compuesto de ensayo para modular la actividad de un polipéptido de la familia THAP o de dominio THAP, o su fragmento biológicamente activo o su homólogo, determinando la capacidad del polipéptido de la familia THAP o de dominio THAP, o su fragmento biológicamente activo o su homólogo, para modular también la actividad de un efector cadena abajo (por ejemplo un componente de la vía de transducción de señales mediada por el factor del crecimiento) de una molécula diana de la familia THAP. Por ejemplo, puede determinarse la actividad de la molécula efectora sobre una diana apropiada, o la unión del efector a una diana apropiada como se describió previamente.

En otra realización, el ensayo exento de células implica poner en contacto un polipéptido de la familia THAP o de dominio THAP, o su fragmento biológicamente activo o su homólogo, con un compuesto conocido que se une a la proteína de la familia THAP para formar una mezcla de ensayo, poner en contacto la mezcla de ensayo con un compuesto de ensayo, y determinar la capacidad del compuesto de ensayo para interaccionar con la proteína de la familia THAP, en el que la determinación de la capacidad del compuesto de ensayo para interaccionar con la proteína de la familia THAP comprende determinar la capacidad del polipéptido de la familia THAP o de dominio THAP, o su fragmento biológicamente activo o su homólogo, para unirse preferentemente o modular la actividad de una molécula diana de la familia THAP.

Los ensayos exentos de células de la presente invención pueden utilizarse con formas solubles y/o unidas a la membrana de proteínas aisladas (por ejemplo, un polipéptido de la familia THAP o de dominio THAP, o su fragmento biológicamente activo o su homólogo, o moléculas a las cuales se unen las dianas de la familia THAP). En el caso de ensayos exentos de células en los que se emplea una forma unida a la membrana de una proteína aislada, puede resultar deseable utilizar un agente solubilizante, de manera que la forma unida a la membrana de la proteína aislada se mantenga en disolución. Los ejemplos de dichos agentes solubilizantes incluyen detergentes no iónicos, como n-octilglucósido, n-dodecilglucósido, n-dodecilmaltósido, octanoil-N-metilglucamida, decanoil-N-metilglucamida, Triton.RTM.X-100, Triton.RTM.X-114, Thesit.RTM, isotridecipoli(etilenglicol éter)_{n}, sulfonato de 3-[(3-colamidopropil)dimetilamino)-1-propano (CHAPS), sulfonato de 3-[(3-colamidopropil)dimetilamino)-2-hidroxi-1-propano (CHAPSO), o sulfonato de N-dodecil=N,N-dimetil-3-amonio-1-propano.

En más de una realización de los anteriores métodos de ensayo de la presente invención, puede resultar deseable inmovilizar un polipéptido de la familia THAP o de dominio THAP, o su fragmento biológicamente activo o su homólogo, o su molécula diana, para facilitar la separación de las formas complejadas y no complejadas de una o ambas proteínas, así como para hacer que el ensayo sea automático. La unión de un compuesto de ensayo con un polipéptido de la familia THAP o de dominio THAP, o su fragmento biológicamente activo o su homólogo, o la interacción de una proteína de la familia THAP con una molécula diana en presencia y ausencia de un compuesto candidato, puede realizarse en cualquier recipiente adecuado para contener los reactivos. Los ejemplos de dichos recipientes incluyen placas de microvaloración, tubos de ensayo y tubos de microcentrífuga. En una realización, puede proporcionarse una proteína de fusión que añade un dominio que permite que una o ambas proteínas se unan a una matriz. Por ejemplo, proteínas de fusión de glutation-S-transferasa/familia THAP o proteínas de fusión de glutation-S-transferasa/diana pueden adsorberse sobre esferas de glutatión-Sepharose (Sigma Chemical, St. Louis, Mo.) o placas de microvaloración derivatizadas con glutatión, que entonces se combinan con el compuesto de ensayo o el compuesto del ensayo y la proteína diana o la proteína de la familia THAP no adsorbida, y la mezcla se incuba bajo condiciones que conducen a la formación de complejos (por ejemplo, a condiciones fisiológicas para sal y pH). Tras la incubación, las esferas o los pocillos de las placas de microvaloración se lavan para eliminar cualquier componente no unido, la matriz se inmoviliza en el caso de las esferas, se determina el complejo de manera directa o indirecta, por ejemplo como se describió anteriormente. Como alternativa, los complejos pueden disociarse de la matriz y determinarse el nivel de unión o actividad del polipéptido de la familia THAP utilizando técnicas convencionales.

Otras técnicas para inmovilizar proteínas sobre matrices también pueden utilizarse en los ensayos de selección de la invención. Por ejemplo, una proteína de la familia THAP o una molécula diana de la familia THAP puede inmovilizarse utilizando una conjugación de biotina y estrepatividina. La proteína de la familia THAP o las moléculas diana de la familia THAP biotiniladas pueden prepararse a partir de biotina-NHS (N-hidroxisuccinimida) utilizando técnicas muy conocidas en la técnica (por ejemplo, el kit de biotinilacion de Pierce Chemicals, Rockford, IL), e inmovilizarse en los pocillos de placas de 96 pocillos revestidos con estreptavidina (Pierce Chemical). Como alternativa, anticuerpos reactivos con una proteína o una molécula diana de la familia THAP, pero que no interfieren con la unión de la proteína de la familia THAP a su molécula diana, pueden derivatizarse en los pocillos de la placa, y la diana o la proteína de la familia THAP no unida queda atrapada en los pocillos mediante conjugación de anticuerpos. Los métodos para detectar estos complejos, además de los descritos anteriormente para los complejos inmovilizados con GST, incluyen la inmunodetección de complejos utilizando anticuerpos reactivos con la proteína o la molécula diana de la familia THAP, así como los ensayos de enzimas ligados que se basan en la detección de una actividad enzimática asociada con la proteína o la molécula diana de la familia THAP.

En otra realización, se identifican moduladores de la expresión de polipeptidos de la familia THAP o de dominio THAP, en un método en que una célula se pone en contacto con un compuesto candidato y se determina la expresión de la proteína o el ARNm de polipéptidos de la familia THAP o de dominio THAP en la célula. El nivel de expresión de la proteína o el ARNm de polipéptidos de la familia THAP o de dominio THAP en presencia del compuesto candidato se compara con el nivel de expresión de la proteína o el ARNm de polipéptidos de la familia THAP o de dominio THAP en ausencia del compuesto candidato. El compuesto candidato entonces puede identificarse como un modulador de la expresión del polipéptido de la familia THAP basándose en esta comparación. Por ejemplo, cuando la expresión de la proteína o el ARNm de polipéptidos de la familia THAP o de dominio THAP es mayor (mayor estadísticamente significativo) en presencia del compuesto candidato que en su ausencia, el compuesto candidato se identifica como un estimulador de la expresión de la proteína o el ARNm de polipéptidos de la familia THAP o de dominio THAP. Como alternativa, cuando la expresión de la proteína o el ARNm de polipéptidos de la familia THAP o de dominio THAP es menor (menor estadísticamente significativo) en presencia del compuesto candidato que en su ausencia, el compuesto candidato se identifica como un inhibidor de la expresión de la proteína o el ARNm de polipéptidos de la familia THAP o de dominio THAP. El nivel de expresión de la proteína o el ARNm de polipéptidos de la familia THAP o de dominio THAP en las células puede determinarse mediante los métodos descritos en la presente para detectar una proteína o ARNm de polipéptidos de la familia THAP o de dominio THAP.

En otro aspecto de la invención, el polipéptido de la familia THAP o de dominio THAP, o su fragmento biológicamente activo o su homólogo, puede utilizarse como "proteína cebo" en un ensayo de dos híbridos o en un ensayo de tres híbridos utilizando los métodos descritos anteriormente para ser utilizados en los ensayos de interacciones de polipéptido de la familia THAP/PAR4, para identificar otras proteínas que se unen o interaccionan con un polipéptido de la familia THAP ("proteínas de unión a la familia THAP" o "pu-familia THAP") y que están implicadas en la actividad de polipéptidos de la familia THAP. Es probable que estas proteínas de unión a la familia THAP o al dominio THAP también estén implicadas en la propagación de señales por proteínas de la familia THAP o de dominio THAP, o dianas de las proteínas de la familia THAP o de dominio THAP, como por ejemplo elementos cadena abajo de una vía de señalización mediada por polipéptidos de la familia THAP o de dominio THAP. Como alternativa, es probable que estas proteínas de unión a la familia THAP sean inhibidores de polipéptidos de la familia THAP.

Ensayos de unión de THAP/ADN

En otra realización de la invención se proporciona un método para identificar compuestos que interfieren con la actividad de unión a ADN de la familia THAP, que comprende las etapas de: poner en contacto una proteína de la familia THAP, o su porción, inmovilizada sobre un soporte sólido, con un compuesto de ensayo y con fragmentos de ADN, o poner en contacto un fragmento de ADN inmovilizado sobre un soporte sólido con un compuesto de ensayo y con una proteína de la familia THAP. La unión entre el ADN y la proteína THAP, o su porción, se detecta, en el que una disminución en la unión del ADN, cuando se compara con la unión al ADN en ausencia del compuesto de ensayo, indica que el compuesto de ensayo es un inhibidor de la actividad de unión al ADN de la familia THAP, y un aumento en la unión al ADN, cuando se compara con la unión al ADN en ausencia del compuesto de ensayo, indica que el compuesto de ensayo es un inductor o que restablece la actividad de unión al ADN de la familia THAP. Como se analiza a continuación, los fragmentos de ADN pueden seleccionarse para que sean específicos para el ADN diana de la proteína de la familia THAP obtenido, por ejemplo, como se describe en el ejemplo 20, o puede ser un ADN diana de la familia THAP no específico. Los métodos para detectar interacciones de proteína-ADN son muy conocidos en la técnica, e incluyen los ensayos de desplazamiento de la movilidad electroforética (EMSA) más comúnmente utilizados, o mediante unión de filtro (Zabel et al. (1991), J. Biol. Chem., 266:252; y Okamoto y Beach (1994), EMBO J., 13: 4816). Hay disponibles otros ensayos que pueden adaptarse a una detección y cuantificación de alta capacidad de procesamiento de la unión de ADN específica y no específica (Amersham, N.J. y Gal, S. et al., 6th Ann. Conf. Soc. Biomol. Screening, 6-9 sept. 2000, Vancouver, B.C.).

En un primer aspecto, un ensayo de selección implica identificar compuestos que interfieren con la actividad de unión al ADN de la familia THAP sin conocer previamente las secuencias de unión de la familia THAP específicas. Por ejemplo, una proteína de la familia THAP se pone en contacto con un compuesto de ensayo y con un banco de oligonucleótidos, o con una muestra de fragmentos de ADN no seleccionados basándose en las secuencias de ADN específicas. Preferiblemente, la proteína de la familia THAP se inmoviliza sobre un soporte sólido (como una matriz o una columna). El ADN no unido se separa del ADN que está unido a la proteína de la familia THAP, y el ADN que está unido a la proteína de la familia THAP se detecta y puede cuantificarse mediante medios conocidos en la técnica. Por ejemplo, el fragmento de ADN se marca con un marcador detectable, como un marcador radiactivo, un resto colorimétrico o un resto fluorescente. Las técnicas para marcar de esta manera el ADN son muy conocidas en la técnica.

El ADN que está unido a la proteína de la familia THAP, o a su porción, se separa del ADN no unido mediante inmunoprecipitación con anticuerpos que son específicos para la proteína de la familia THAP o su porción. El uso de dos anticuerpos anti-familia THAP monoclonales diferentes puede producir una inmunoprecipitación más completa que utilizando cada uno por separado. La cantidad de ADN que está en el inmunoprecipitado puede cuantificarse mediante cualquier medio conocido en la técnica. Las proteínas de la familia THAP, o sus porciones, que se unen al ADN también pueden detectarse mediante ensayos de desplazamiento de gel (Tan, Cell, 62:367, 1990), ensayos de protección de nucleasas, o ensayos de interferencia de metilasa.

Otro objeto de la invención es proporcionar métodos para identificar compuestos que restablecen la capacidad de proteínas de la familia THAP mutantes, o sus porciones, para unirse a secuencias de ADN. En una realización, se proporciona un método para seleccionar agentes para su uso en terapia, que comprende: medir la cantidad de unión de una proteína de la familia THAP, o su porción, que es codificada por un gen mutante que se encuentra en células de un paciente, con moléculas de ADN, preferiblemente oligonucleótidos aleatorios o fragmentos de ADN procedentes de un banco de ácidos nucleicos; medir la cantidad de unión de dicha proteína de la familia THAP, o su porción, a dichas moléculas de ácidos nucleicos en presencia de una sustancia de ensayo; y comparar la cantidad de unión de la proteína de la familia THAP, o su porción, en presencia de dicha sustancia de ensayo con la cantidad de unión de la proteína de la familia THAP en ausencia de dicha sustancia de ensayo, siendo una sustancia que aumenta la cantidad de unión un candidato para su uso en terapias.

En otra realización de la invención, pueden aislarse oligonucleótidos que restablecen la capacidad de proteínas de la familia THAP mutantes, o sus porciones, para unirse a una secuencia de unión consenso o secuencias adaptables. La proteína de la familia THAP mutante, o su porción, y oligonucleótidos aleatorios se añaden a un soporte sólido sobre el cual están inmovilizados fragmentos de ADN específicos de la familia THAP. Los oligonucleótidos que se unen al soporte sólido se recuperan y se analizan. Aquellos cuya unión al soporte sólido depende de la presencia de la proteína de la familia THAP mutante presumiblemente están unidos al soporte mediante la unión a la proteína mutante, restableciendo su conformación.

Si se desea, la unión específica puede distinguirse de la unión no específica mediante cualquier medio conocido en la técnica. Por ejemplo, las interacciones de unión específica son más fuertes que las interacciones de unión no específica. Por tanto, la mezcla de incubación puede someterse a cualquier agente o condición que desestabilice las interacciones de proteína/ADN, de manera que la reacción de unión específica es la que se detecta de forma predominante. Como alternativa, como se indica más específicamente a continuación, puede añadirse un competidor no específico, como dI-dC, a la mezcla de incubación. Si el ADN que contiene los sitios específicos está marcado y el competidor no está marcado, entonces las reacciones de unión específicas serán las que se detecten predominantemente tras medir el ADN marcado.

Según otra realización de la invención, después de la incubación de la proteína de la familia THAP, o su fragmento, con fragmentos de ADN específicos, todos los componentes del lisado celular que no se unen a los fragmentos de ADN se eliminan. Esto puede lograrse, entre otras formas, empleando fragmentos de ADN que están unidos a un soporte polimérico insoluble, como agarosa, celulosa y similares. Después de la unión, todos los componentes no unidos pueden lavarse, rompiendo la proteína de la familia THAP, o su porción, unida al ADN/soporte sólido. La proteína de la familia THAP, o su porción, puede cuantificarse mediante cualquier medio conocido en la técnica. Puede determinarse utilizando un ensayo inmunológico, como un ELISA, RIA o transferencia Western.

En otra realización de la invención, se proporciona un método para identificar compuestos que se unen específicamente a secuencias de ADN específicas de la familia THAP, que comprende las etapas de: poner en contacto un fragmento de ADN específico de la familia THAP inmovilizado sobre un soporte sólido con un compuesto de ensayo y con una proteína de la familia THAP de tipo salvaje, o su porción, para unir la proteína de la familia THAP de tipo salvaje, o su porción, al fragmento de ADN; determinar la cantidad de proteína de la familia THAP de tipo salvaje que está unida al fragmento del ADN, sugiriendo la inhibición de la unión de la proteína de la familia THAP de tipo salvaje por el compuesto de ensayo, con respecto a un control que carece del compuesto de ensayo, la unión del compuesto de ensayo a las secuencias de unión al ADN específicas de la familia THAP.

Otro objeto de la invención es proporcionar métodos para identificar compuestos que restablecen la capacidad de proteínas de la familia THAP mutantes, o sus porciones, para unirse a secuencias de unión a ADN específicas. En una realización, se proporciona un método para seleccionar agentes para su uso en terapias, que comprende: medir la cantidad de unión de una proteína de la familia THAP, o su porción, que está codificada por un gen mutante que se encuentra en las células de un paciente, a una molécula de ADN que comprende más de un monómero de una secuencia de nucleótidos diana de la familia THAP específica; medir la cantidad de unión de dicha proteína de la familia THAP a dicha molécula de ácido nucleico en presencia de una sustancia de ensayo; y comparar la cantidad de unión de la proteína de la familia THAP en presencia de dicha sustancia de ensayo con la cantidad de unión de la proteína de la familia THAP, o su porción, en ausencia de dicha sustancia de ensayo, siendo una sustancia de ensayo que aumenta la cantidad de unión un candidato para su uso en terapias.

En otra realización de la invención se proporciona un método para seleccionar agentes para su uso en terapia, que comprende: poner en contacto una célula transfectada con una sustancia de ensayo, conteniendo dicha célula transfectada una proteína de la familia THAP, o su porción, que es codificada por un gen mutante que se encuentra en las células de un paciente, y una construcción de un gen indicador que comprende un gen indicador que codifica un producto ensayable y una secuencia que se adapta a un sitio de unión al ADN de la familia THAP, en el que dicha secuencia está cadena arriba y es adyacente a dicho gen indicador; y determinar si la cantidad de expresión de dicho gen indicador es alterada por la sustancia de ensayo, siendo una sustancia de ensayo que altera la cantidad de expresión de dicho gen indicador un candidato para su uso en terapia.

En otra realización, se proporciona un método para seleccionar agentes para su uso en terapia, que comprende: añadir ribonucleótidos de ARN polimerasa y una proteína de la familia THAP, o su porción, a una construcción de transcripción, comprendiendo dicha construcción de transcripción un gen indicador que codifica un producto ensayable y una secuencia se adapta a un sitio de unión consenso de la familia THAP, estando dicha secuencia cadena arriba y adyacente a dicho gen indicador, realizándose dicha etapa de adición en presencia y en ausencia de una sustancia de ensayo; determinar si la cantidad de transcripción de dicho gen indicador es alterada por la presencia de dicha sustancia de ensayo, siendo una sustancia de ensayo que altera la cantidad de transcripción de dicho gen indicador un candidato para su uso en terapia.

Según la presente invención, los compuestos que tienen actividad de la familia THAP son aquellos que forman complejos de modo específico con un sitio de unión al ADN específico de la familia THAP. Los oligonucleótidos y los análogos nucleotídicos que contienen oligonucleótidos también se contemplan entre los compuestos que son capaces de formar complejos con un sitio de unión al ADN específico de la familia THAP.

6. Otros ensayos para modular la actividad de polipéptidos de la familia THAP in vivo

Se apreciará que cualquier ensayo adecuado que permita la detección de un polipéptido de la familia THAP o de dominio THAP puede utilizarse. Los ejemplos de ensayos para ensayar la interacción de proteínas, la unión de ácidos nucleicos o la modulación de la apoptosis en presencia o en ausencia de un compuesto de ensayo se describen a continuación en la presente. Por tanto, la invención incluye un método para identificar un modulador de un polipéptido de la familia THAP candidato (por ejemplo, activador o inhibidor), comprendiendo dicho método:

a) proporcionar una célula que comprende un polipéptido de la familia THAP o de dominio THAP, o su fragmento biológicamente activo o su homólogo;

b) poner en contacto dicha célula con un compuesto de ensayo; y

c) determinar si dicho compuesto modula de forma selectiva (por ejemplo, activa o inhibe) una actividad de un polipéptido de la familia THAP, preferiblemente una actividad proapoptótica, o la unión a una diana de la familia THAP o de dominio THAP, en el que la determinación de que dicho compuesto modula de forma selectiva (por ejemplo, activa o inhibe) la actividad de dicho polipéptido indica que dicho compuesto es un modulador candidato (por ejemplo, un activador o un inhibidor, respectivamente) de dicho polipéptido. Preferiblemente, la diana de la familia THAP o de dominio THAP es una proteína o un ácido nucleico.

Preferiblemente, la célula es una célula que se ha transfectado con un vector de expresión recombinante que codifica un polipéptido de la familia THAP o de dominio THAP, o su fragmento biológicamente activo o su homólogo.

En la presente se describen varios ejemplos de ensayos para la detección de la apoptosis, en la sección titulada "Ensayos de apoptosis". En la presente se describen varios ejemplos de ensayos para la detección de interacciones de dianas de la familia THAP o de dominio THAP, incluyendo ensayos para la detección de interacciones de proteínas y unión a ácidos nucleicos.

En un ejemplo de un ensayo para la actividad de apoptosis, se proporciona un ensayo de selección de alta capacidad de procesamiento para moléculas que abrogan o estimulan la actividad proapoptótica de un polipéptido de la familia THAP, basado en la apoptosis estimulada por la retirada del suero en una línea celular 3T3 con la expresión regulada por tetraciclina de un polipéptido de la familia THAP o de dominio THAP, o su fragmento biológicamente activo o su homólogo. Las células apoptóticas pueden detectarse mediante marcaje TUNEL en microplacas de 96 ó 384 pocillos. Puede realizarse un ensayo de selección de fármacos con las líneas como se describe en el ejemplo 13. Las células 3T3, que previamente se han utilizado para analizar la actividad proapoptótica de PAR4 (Díaz-Meco et al., 1996; Berra et al., 1997), pueden transfectarse con vectores de expresión que codifican un polipéptido de la familia THAP o de dominio THAP, permitiendo la expresión ectópica del polipéptido de la familia THAP. Después se ensaya la respuesta apoptótica a la retirada del suero en presencia de un compuesto de ensayo, permitiendo la identificación de compuestos de ensayo que potencian o inhiben la capacidad del polipéptido de la familia THAP o de dominio THAP para inducir la apoptosis. Las células transfectadas se privan de suero y las células con núcleos apoptóticos se cuentan. Los núcleos apoptóticos pueden contarse mediante tinción con DAPI y ensayos TUNEL in situ.

B. Otros ensayos de interacción del polipéptido de la familia THAP/diana de THAP

En métodos ejemplificados, se describen ensayos de interacción de THAP/diana de THAP en el contexto de THAP1 y la diana de THAP Par4. Sin embargo, se apreciará que los ensayos para seleccionar moduladores de otros miembros de la familia THAP o de dominio THAP y otras moléculas diana de THAP pueden realizarse sustituyendo THAP1 y Par4 en los métodos que aparecen a continuación. Por ejemplo, en algunas realizaciones se identifican moduladores que afectan a la interacción entre un polipéptido de la familia THAP y SLC.

Como se demuestra en los ejemplos 4, 5, 6 y 7, y en las figuras 3, 4 5, los inventores han demostrado, utilizando varios métodos experimentales, que la THAP1 interacciona con la proteína proapoptótica Par4. En particular, se ha demostrado que THAP1 interacciona con Par4 de tipo salvaje (Par4) y con un dominio de muerte de Par4 (Par4DD) en un sistema de dos híbridos de levadura. Las células de levadura se cotransformaron con BD7-THAP1 y los vectores de expresión AD7-Par4, AD7, AD7-Par4DD o AD7-Par4. Se seleccionaron los transformantes en medio que carecía de histidina y adenina. Se obtuvieron idénticos resultados con una cotransformación de AD7-THAP1 con BD7-Par4, BD7, BD7-Par4DD o BD7-Par4.

Los inventores también han demostrado la unión in vitro de THAP1 a GST-Par4DD. El Par4DD se expresa como una proteína de fusión de GST, purificada sobre glutatión-Sepharose y empleada como una matriz de afinidad para la unión in vitro de THAP1 marcada con ^{35}S-metionina traducida. El GST actuó como control negativo.

Además, los inventores han demostrado que THAP1 interacciona con Par4DD y SLC in vivo. Se cotransfectaron los vectores de expresión Myc-Par4DD y GFP-THAP1 en células endoteliales humanas primarias. El Myc-Par4DD se tiñó con anticuerpo anti-myc monoclonal. Fluorescencia verde, GFP-THAP1; fluorescencia roja, Par4DD.

Por tanto, la invención incluye ensayos para la identificación de moléculas que modulan (estimulan o inhiben) la unión de un polipéptido de la familia THAP/PAR4. En realizaciones preferidas, la invención incluyen ensayos para la identificación de moléculas que modulan (estimulan o inhiben) la unión de THAP1/PAR4 o la unión de THAP1/SLC.

Cuatro ejemplos de ensayos de selección de alta capacidad de procesamiento incluyen:

1) un ensayo basado en dos híbridos en levaduras para encontrar fármacos que rompan la interacción del cebo de la familia THAP con PAR4 o SLC como presa;

2) un ensayo de interacción in vitro que emplea un polipéptido de la familia THAP recombinante y proteínas PAR4 o SLC;

3) un ensayo de unión basado en chips que emplea un polipéptido de la familia THAP recombinante y proteínas PAR4 o SLC;

4) un ensayo basado en células de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) que emplea un polipéptido de la familia THAP y proteínas PAR4 o SLC condensadas con proteínas fluorescentes.

Por tanto, la invención incluye un método para identificar un modulador de la interacción de un polipéptido de la familia THAP/PAR4 o SLC candidato, comprendiendo dicho método:

a) proporcionar un polipéptido de la familia THAP o de dominio THAP, o su fragmento biológicamente activo o su homólogo, y un polipéptido PAR4 o SLC, o su fragmento;

b) poner en contacto dicho polipéptido de la familia THAP o de dominio THAP con un compuesto de ensayo; y

c) determinar si dicho compuesto modula de modo selectivo (por ejemplo, activa o inhibe) la actividad de interacción de la familia THAP/PAR4 o SLC.

También se incluye un método que comprende:

a) proporcionar una célula que comprende un polipéptido de la familia THAP o de dominio THAP, o su fragmento biológicamente activo o su homólogo, y un polipéptido PAR4 o SLC, o su fragmento;

b) poner en contacto dicha célula con un compuesto de ensayo; y

En general puede utilizarse cualquier ensayo adecuado para la detección de la interacción de proteína-proteína.

En un ejemplo, un polipéptido de la familia THAP o de dominio THAP, o su fragmento biológicamente activo o su homólogo, puede utilizarse como "proteína cebo", y una proteína PAR4 o SLC puede utilizarse como "proteína presa" (o viceversa) en un ensayo de dos híbridos (véase, por ejemplo, la patente de EEUU nº 5.283.317; Zervos et al. (1993), Cell, 72:223-232; Madura et al. (1993), J. Biol. Chem., 268:12046-12054; Bartel et al. (1993), Biotechniques, 14:920-924; Iwabuchi et al. (1993), Oncogene, 8:1693-1696; y Brent, documento WO 94/10300). El sistema de dos híbridos está basado en la naturaleza modular de la mayoría de los factores de transcripción, que consisten en dominios de activación y de unión al ADN separables. Brevemente, el ensayo utiliza dos diferentes construcciones de ADN. En una construcción, el gen que codifica un polipéptido de la familia THAP o de dominio THAP, o su fragmento biológicamente activo o su homólogo, se condensa con un gen que codifica un dominio de unión al ADN de un factor de la transcripción conocido (por ejemplo, GAL-4). En la otra construcción, el gen que codifica un polipéptido de la familia THAP o de dominio THAP, o su fragmento biológicamente activo o su homólogo ("presa" o "muestra") se condensa con un gen que codifica el dominio de activación del factor de la transcripción conocido. Si las proteínas de "cebo" y de "presa" son capaces de interaccionar in vivo, formando un complejo de polipéptido de la familia THAP/PAR4, los dominios de activación y de unión al ADN del factor de la transcripción se aproximan mucho. Esta proximidad permite la transcripción de un gen indicador (por ejemplo, LacZ) que está unido operablemente a un sitio regulador de la transcripción que responde al factor de la transcripción. La expresión del gen indicador puede detectarse, y las colonias celulares que contienen el factor de la transcripción funcional pueden aislarse y utilizarse para obtener el gen clonado que codifica la proteína que interacciona con la proteína de la familia THAP. Por tanto, este ensayo puede realizarse en presencia o en ausencia de un compuesto de ensayo, por lo cual puede detectarse la modulación de la interacción del polipéptido de la familia THAP/PAR4 o SLC por una menor transcripción o una falta de transcripción del gen indicador.

En otros ejemplos, pueden realizarse ensayos de interacción del polipéptido de la familia THAP/PAR4 o SLC in vitro, describiéndose varios ejemplos a continuación en la presente. Por ejemplo, un polipéptido de la familia THAP o de dominio THAP recombinante, o su fragmento biológicamente activo o su homólogo, se pone en contacto con una proteína PAR4 o SLC recombinante, o su porción biológicamente activa, y se determina la capacidad de la proteína PAR4 o SLC para unirse a la proteína de la familia THAP. La unión del compuesto de proteína PAR4 o SLC a la proteína de la familia THAP puede determinarse de modo directo o indirecto, como se describe en la presente. En una realización preferida, el ensayo incluye poner en contacto el polipéptido de la familia THAP o de dominio THAP, o su fragmento biológicamente activo o su homólogo, con una proteína PAR4 o SLC que se une a una proteína de la familia THAP (por ejemplo, una molécula diana de la familia THAP) para formar una mezcla de ensayo, poner en contacto la mezcla de ensayo con un compuesto de ensayo, y determinar la capacidad del compuesto de ensayo para interaccionar con una proteína de la familia THAP, en el que la determinación de la capacidad del compuesto de ensayo para interaccionar con una proteína de la familia THAP comprende determinar la capacidad del compuesto de ensayo para unirse preferentemente a un compuesto de la familia THAP o a su porción biológicamente activa, cuando se compara con la proteína PAR4 o SLC. Por ejemplo, la etapa de determinar la capacidad del compuesto de ensayo para interaccionar con una proteína del familia THAP puede comprender determinar la capacidad del compuesto para desplazar Par4 o SLC de un complejo de proteína de la familia THAP/Par4 o SLC, formando con ello un complejo de proteína de la familia THAP/compuesto. Como alternativa, se apreciará que también es posible determinar la capacidad del compuesto de ensayo para interaccionar con una proteína PAR4 o SLC, en el que la determinación de la capacidad del compuesto de ensayo para interaccionar con una proteína PAR4 o SLC comprende determinar la capacidad del compuesto de ensayo para unirse preferentemente a PAR4 o SLC, o a su porción biológicamente activa, comparado con la proteína de la familia THAP. Por ejemplo, la etapa de la determinación de la capacidad del compuesto de ensayo para interaccionar con una proteína de la familia THAP puede comprender determinar la capacidad del compuesto para desplazar a Par4 o SLC de un complejo de proteína de la familia THAP/Par4 o SLC, formando con ello un complejo de proteína de la familia THAP/compuesto.

Ensayos para modular el tráfico de polipéptido de la familia THAP y/o Par4 en los cuerpos nucleares de PML (PML-NB)

Como se demuestra en los ejemplos 8 y 9, los inventores han demostrado, utilizando varios métodos experimentales, que THAP1 y Par4 se localizan en los PML-NB.

Los inventores han demostrado que THAP1 es una nueva proteína asociada con los cuerpos nucleares de PML. Una tinción de inmunofluorescencia doble demuestra la colocalización de THAP1 con proteínas de PML-NB, PML y Daxx. Células endoteliales humanas primarias se transfectaron con un vector de expresión GFP-THAP1; la PML y Daxx endógenas se tiñeron con anticuerpos anti-PML monoclonales y anti-Daxx policlonales, respectivamente.

Los inventores también han demostrado que Par4 es un nuevo componente de PML-NB que se colocaliza con THAP1 in vivo mediante varios experimentos. En un experimento, una tinción de inmunofluorescencia doble revela la colocalización de Par4 y PML en los PML-NB de células endoteliales humanas primarias o fibroblastos. La PAR4 y PML endógenas se tiñeron con anticuerpos anti-PML monoclonales y anti-PML policlonales, respectivamente. En otro experimento, la tinción doble reveló la colocalización de Par4 y THAP1 en células que expresan GFP-THAP1 ectópico. Células endoteliales humanas primarias o fibroblastos se transfectaron con un vector de expresión GFP-THAP1; la Par4 endógena se tiñó con anticuerpos anti-Par4 policlonales.

Los inventores también han demostrado que PML recluta el complejo THAP1/Par4 hacia los PML-NB. Una tinción de inmunofluorescencia triple muestra la colocalización de THAP1, Par4 y PML en células que sobreexpresan PML y la ausencia de colocalización en células que expresan Sp100 ectópico. Células HeLa se cotransfectaron con GFP-THAP1 y los vectores de expresión HA-PML o HA-SP100; los HA-PML o HA-SP100 y la Par4 endógena se tiñeron con anticuerpos anti-HA monoclonales y anti-Par4 policlonales, respectivamente.

C. Ensayos para modular el tráfico de proteínas de la familia THAP en cuerpos nucleares de PML

Se proporcionan ensayos para la identificación de fármacos que modulan (estimulan o inhiben) la unión de proteínas de la familia THAP o de dominio THAP, en particular THAP1, a proteínas de PML-NB o la localización hacia PML-NB. En general, puede utilizarse cualquier ensayo adecuado para la detección de una interacción de proteína-proteína. Dos ejemplos de ensayos de selección de alta capacidad de procesamiento incluyen: 1) un ensayo basado en dos híbridos en levaduras para descubrir compuestos que rompan la interacción del cebo de THAP1 con la presa de proteínas de PML-NB; y 2) ensayos de interacción in vitro que emplean proteínas de PML-NB y THAP1 recombinantes. Estos ensayos pueden realizarse como se describió anteriormente con respecto a los ensayos de la familia THAP/Par4, excepto que se emplean proteínas de PML-NB en lugar de Par4. La unión puede ser detectada, por ejemplo, entre una proteína de la familia THAP y una proteína de PML o una proteína asociada a PML, como daxx, sp100, sp140, p53, pRB, CBP, BLM o SUMO-1.

Otros ensayos cuyos métodos convencionales son muy conocidos incluyen ensayos para identificar moléculas que modulan, en general inhiben, la colocalización de THAP1 con PML-NB. La detección puede realizarse utilizando un marcador adecuado, como un anticuerpo anti-THAP1, y un anticuerpo que permite la detección de una proteína de PML-NB.

D. Ensayos para modular el tráfico de PAR4 en los cuerpos de PML

Se proporcionan ensayos para la identificación de fármacos que modulan (estimulan o inhiben) la unión de PAR4 a proteínas de PML-NB o la localización hacia PML-NB. En general puede utilizarse cualquier ensayo adecuado para la detección de una interacción de proteína-proteína. Dos ejemplos de ensayos de selección de alta capacidad de procesamiento incluyen: 1) un ensayo basado en dos híbridos en levaduras para descubrir fármacos que rompan la interacción del cebo de PAR4 con la presa de proteína de PML-NB; y 2) ensayos de interacción in vitro que emplean un proteínas PAR4 y PML-NB recombinantes. Estos ensayos pueden realizarse como se describió anteriormente con respecto a los ensayos de polipéptidos de la familia THAP/Par4, excepto que se utiliza la proteína de PML-NB en lugar del polipéptido de la familia THAP. La unión puede detectarse, por ejemplo, entre una proteína Par4 y una proteína de PML o una proteína asociada a PML, como daxx, sp100, sp140, p53, pRB, CBP, BLM o SUMO-1.

Otros ensayos cuyos métodos convencionales son muy conocidos incluyen ensayos para identificar moléculas que modulan, en general inhiben, la colocalización de PAR4 con PML-NB. La detección puede realizarse utilizando un marcador adecuado, como un anticuerpo anti-PAR4, y un anticuerpo que permite la detección de una proteína de PML-NB.

Esta invención se refiere también a nuevos agentes identificados mediante los ensayos de selección descritos anteriormente y a procesos para producir estos agentes mediante el uso de estos ensayos. Por consiguiente, en una realización, la presente invención incluye un compuesto o agente que puede obtenerse mediante un método que comprende las etapas de uno cualquiera de los ensayos de selección mencionados anteriormente (por ejemplo, ensayos basados en células o ensayos exentos de células). Por ejemplo, en una realización, la invención incluye un compuesto o agente que puede obtenerse mediante un método que comprende poner en contacto una célula que expresa una molécula diana de la familia THAP con un compuesto de ensayo, y determinar la capacidad del compuesto de ensayo para unirse o modular la actividad de la molécula diana de la familia THAP. En otra realización, la invención incluye un compuesto o agente que puede obtenerse mediante un método que comprende poner en contacto una célula que expresa una molécula diana de la familia THAP con una proteína de la familia THAP, o su porción biológicamente activa, para formar una mezcla de ensayo, poner en contacto la mezcla de ensayo con un compuesto de ensayo, y determinar la capacidad del compuesto de ensayo para interaccionar o modular la actividad de la molécula diana de la familia THAP. En otra realización, la invención incluye un compuesto o agente que puede obtenerse mediante un método que comprende poner en contacto una proteína de la familia THAP, o su porción biológicamente activa, con un compuesto de ensayo y determinar la capacidad del compuesto de ensayo para unirse o modular (por ejemplo, estimular o inhibir) la actividad de la proteína de la familia THAP, o su porción biológicamente activa. En otra realización, la presente invención incluye un compuesto o agente que puede obtenerse mediante un método que comprende poner en contacto una proteína de la familia THAP, o su porción biológicamente activa, con un compuesto conocido que se une a la proteína de la familia THAP para formar una mezcla de ensayo, poner en contacto la mezcla de ensayo con un compuesto de ensayo, y determinar la capacidad del compuesto de ensayo para interaccionar o modular la actividad de la proteína de la familia THAP.

Por consiguiente, dentro del alcance de la invención está utilizar también un agente identificado como se describe en la presente en un modelo animal apropiado. Por ejemplo, un agente identificado como se describe en la presente (por ejemplo, un agente modulador de la familia THAP o de dominio THAP, una molécula de ácido nucleico antisentido de la familia THAP o de dominio THAP, un anticuerpo específico de la familia THAP o del dominio THAP, o un compañero de unión de la familia THAP o del dominio THAP) puede utilizarse en un modelo animal para determinar la eficacia, la toxicidad, o los efectos secundarios de un tratamiento con dicho agente. Como alternativa, un agente identificado como se describe en la presente puede utilizarse en un modelo animal para determinar el mecanismo de acción de dicho agente. Además, esta invención se refiere a usos de agentes nuevos identificados mediante los ensayos de selección descritos anteriormente para los tratamientos descritos en la presente.

La presente invención también se refiere a usos de agentes nuevos identificados mediante los ensayos de selección descritos anteriormente para el diagnóstico, la prognósis y los tratamientos descritos en la presente. Por consiguiente, dentro del alcance de la presente invención está la utilización de dichos agentes en el diseño, la formulación, la síntesis, la fabricación y/o la producción de un fármaco o una composición farmacéutica para su uso en el diagnóstico, la prognósis y los tratamientos descritos en la presente. Por ejemplo, en una realización, la presente invención incluye un método para sintetizar o producir un fármaco o una composición farmacéutica haciendo referencia a la estructura y/o propiedades de un compuesto que puede obtenerse mediante uno de los ensayos de selección descritos anteriormente. Por ejemplo, un fármaco o una composición farmacéutica puede sintetizarse basándose en la estructura y/o las propiedades de un compuesto que puede obtenerse mediante un método en el que una célula que expresa una molécula de la familia THAP se pone en contacto con un compuesto de ensayo y se determina la capacidad del compuesto de ensayo para unirse o modular la actividad de a molécula diana de la familia THAP. En otro ejemplo de realización, la presente invención incluye un método para sintetizar o producir un fármaco o una composición farmacéutica basada en la estructura y/o las propiedades de un compuesto que puede obtenerse mediante un método en el que una proteína de la familia THAP, o su porción biológicamente activa, se pone en contacto con un compuesto de ensayo y se determina la capacidad del compuesto de ensayo para unirse o modular (por ejemplo, estimular o inhibir) la actividad de la proteína de la familia THAP, o su porción biológicamente activa.

E. Ensayos de apoptosis

Se apreciará que puede utilizarse cualquier ensayo de la apoptosis adecuado para evaluar la actividad apoptótica de un polipéptido de la familia THAP o de dominio THAP, o su fragmento biológicamente activo o su homólogo.

La apoptosis puede reconocerse por un patrón característico de cambios morfológicos, bioquímicos y moleculares. Las células que sufren apoptosis tienen un aspecto encogido y redondeado; también puede observarse que se desprenden de la placa de cultivo. Los cambios morfológicos implican un patrón característico de condensación de la cromatina y el citoplasma que puede identificarse con facilidad en el microscopio. Cuando se tiñen con un tinte de unión al ADN, por ejemplo H33258, las células apoptóticas muestran unos núcleos condensados y puntuados típicos en lugar de los núcleos homogéneos y redondos.

Una característica de la apoptosis es la endonucleolisis, un cambio molecular en el que el ADN nuclear inicialmente se degrada en las secciones conectoras de los nucleosomas para producir fragmentos equivalentes a nucleosomas únicos y múltiples. Cuando estos fragmentos de ADN se someten a una electroforesis en gel revelan una serie de bandas de ADN que están colocadas a una distancia aproximadamente igual entre sí en el gel. La diferencia de tamaño entre las dos bandas que están juntas es aproximadamente la longitud de un nucleosoma, es decir, 120 pares de bases. Esta disposición característica de las bandas de ADN se denomina escalera de ADN e indica la apoptosis de la célula. Las células apoptóticas pueden identificarse mediante métodos de citometría de flujo basados en las medidas del contenido en ADN, una mayor sensibilidad del ADN a la desnaturalización, o unas propiedades de dispersión de la luz alteradas. Estos métodos son muy conocidos en la técnica y se contemplan en la invención.

Pueden detectarse las rupturas anómalas del ADN características de la apoptosis mediante cualquier medio conocido en la técnica. En una realización preferida, las rupturas del ADN se marcan con dUTP biotinilado (b-dUTP). Como se describe en la patente de EEUU nº 5.897.999, las células se fijan y se incuban en presencia de dUTP biotinilado con transferasa terminal exógena (ensayo de ADN transferasa terminal; ensayo TdT) o con ADN polimerasa (ensayo de traducción de mella; ensayo NT). El dUTP biotinilado se incorpora en el cromosoma en los lugares en que se reparan las rupturas de ADN anómalas, y se detecta con fluoresceína conjugada con avidina bajo microscopía de fluorescencia.

Evaluación de la actividad de polipéptidos de la familia THAP, de dominio THAP y PAR4

Para evaluar los ácidos nucleicos y los polipéptidos de la invención, el indicador de la apoptosis que se evalúa en el método de selección de la invención puede ser sustancialmente cualquier indicador de la viabilidad de la célula. Como ejemplo, el indicador de la viabilidad puede seleccionarse del grupo que consiste en el número de células, la refractilidad de las células, la fragilidad de las células, el tamaño de las células, el número de vacuolas celulares, una tinción que distinga las células vivas de las células muertas, una tinción con azul de metileno, el tamaño del capullo, la localización del capullo, la morfología nuclear, y la tinción nuclear. Otros indicadores de la viabilidad y combinaciones de indicadores de la viabilidad descritos en la presente son conocidos en la técnica y pueden utilizarse en el método de selección de la invención.

El estado de la muerte celular puede evaluarse basándose en la integridad del ADN. Los ensayos para esta determinación incluyen ensayar el ADN sobre un gel de agarosa para identificar la ruptura del ADN en escaleras de oligonucleosomas, y detectar de modo inmunohistoquímico los extremos mellados del ADN marcando el extremo libre del ADN con fluoresceína o UTP conjugado con peroxidasa de rábano mediante la transferasa terminal. Normalmente, también puede estudiarse la morfología nuclear mediante tinción con yoduro de propidio (PI). Estos tres ensayos (escalera de ADN, marcaje terminal y marcaje con PI) son medidas brutas y son buenas para las células que ya están muertas o están en la etapa final de la muerte.

En un ejemplo preferido, un ensayo de la apoptosis se basa en la apoptosis inducida por la retirada del suero en una línea celular 3T3 con la expresión regulada por tetraciclina de un polipéptido de la familia THAP o de dominio THAP, o su fragmento biológicamente activo o su homólogo. La detección de la células apoptóticas se realiza marcando con TUNEL las células en microplacas de 96 o 384 pocillos. Este ejemplo se describe más a fondo en el ejemplo 13.

En otros aspectos, los ensayos pueden ensayar la generación de señales de muerte citotóxicas, respuestas antivíricas (Tartaglia et al. (1993), Cell, 74(5):845-531), y/o la activación de esfingomielinasa ácida (Wiegmann et al. (1994), Cell, 78(6):1005-15) cuando la proteína de la familia THAP es sobreexpresada o se expresa de forma ectópica en las células. Los ensayos para la modulación de la apoptosis también se pueden realizar en células neuronales y en linfocitos, por ejemplo, cuando se sabe que la retirada de un factor induce al suicidio celular, como se demuestra en las células neuronales que requieren el factor del crecimiento neuronal para sobrevivir (Martin, D.P. et al. (1988), J. Cell Biol., 106, 829-844) y en linfocitos que dependen de una linfoquina específica para vivir (Kyprianou, N. e Isaacs, J.T. (1988), Endrocrinology, 122:552-562).

Fusiones de marcador-polipéptido de la familia THAP o de dominio THAP en ensayos celulares

En un método puede utilizarse un vector de expresión que codifica el polipéptido de la familia THAP o de dominio THAP, o su fragmento biológicamente activo o su homólogo, para evaluar la capacidad del polipéptido de la invención para inducir la apoptosis en células. Si se desea, un polipéptido de la familia THAP o de dominio THAP puede condensarse con un marcador detectable para facilitar la identificación de las células que expresan el polipéptido de la familia THAP o de dominio THAP, o su fragmento biológicamente activo o su homólogo. Por ejemplo, un variante de GFP de Aequoria victoria, la proteína fluorescente verde potenciada (EGFP) puede utilizarse en la producción de proteínas de fusión (CLONTECH Laboratories, Inc., 1020 East Meadow Circle, Palo Alto, California 94303), que también se describe en la patente de EEUU nº 6.191.269.

La secuencia de ADN del polipéptido de la familia THAP o de dominio THAP se condensa dentro del marco mediante la inserción del ADNc que codifica el polipéptido de la familia THAP o de dominio THAP en el sitio SalI-BamHI del plásmido pEGFP-NI (GenBank nº de registro U55762). Las células se transfectan de modo transitorio mediante el método óptimo para la célula que se está ensayando (CaPO^{4} o lipofectina). La expresión del polipéptido de la familia THAP o de dominio THAP y la inducción de la apoptosis se estudia utilizando un microscopio de fluorescencia a las 24 h y 48 h después de la transfección. La apoptosis puede evaluarse mediante el método TUNEL (que implica el marcaje en el extremo 3' de ADN de criterio morfológico y/o nuclear roto) (Cohen et al. (1984), J. Immunol., 132:38-42). Cuando la selección emplea un polipéptido de fusión que comprenda un polipéptido de la familia THAP o de dominio THAP y un polipéptido indicador (por ejemplo, EGFP), la apoptosis puede evaluarse mediante la detección de la localización nuclear del polipéptido indicador en cuerpos nucleares fragmentados o cuerpos apoptóticos. Por ejemplo, cuando se emplea un polipéptido de fusión de EGFP-polipéptido de la familia THAP o de dominio THAP, la distribución de la fluorescencia asociada con EGFP-polipéptido de la familia THAP o de dominio THAP en las células apoptóticas será idéntica a la distribución de los tintes DAPI o Hoechst 33342, que se emplean de modo convencional para detectar los cambios en el ADN nuclear asociados con la apoptosis (Cohen et al., supra). Se evalúa un mínimo de 100 células que muestren una característica fluorescencia de EGFP mediante microscopía de fluorescencia. La apoptosis se puntúa como fragmentación nuclear, cuerpos apoptóticos marcados, y hervido citoplásmico. Las características de la fragmentación nuclear son particularmente visibles cuando la fusión de EGFP-polipéptido de la familia THAP o de dominio THAP se condensa en cuerpos apoptóticos.

Puede ensayarse la capacidad de los polipéptidos de la familia THAP o de dominio THAP para experimentar la localización nuclear y para inducir la apoptosis mediante la expresión transitoria en células de riñón 293 humanas. Si se demuestra que son susceptibles a una apoptosis inducida por la familia THAP o el dominio THAP, las células 293 pueden actuar como una selección inicial conveniente para los polipéptidos de la familia THAP o de dominio THAP, o sus fragmentos biológicamente activos o sus homólogos, que probablemente induzcan la apoptosis en otras células (por ejemplo, células endoteliales o células de cáncer). En un ejemplo de protocolo, células 293 se transfectan con vectores plasmídicos que expresan una proteína de fusión de EGFP-familia THAP o dominio THAP. Aproximadamente 5*10^{6} células 293 en placas de 100 mm se transfectan con 10 g de ADN plasmídico utilizando el método del fosfato de calcio. Los plásmidos utilizados comprenden el potenciador/promotor de CMV y una secuencia codificadora de EGFP-familia THAP o dominio THAP. La apoptosis se evalúa 24 h después de la transfección mediante tinción con TUNEL y DAPI. Las células transfectadas con el vector de EGFP-familia THAP o dominio THAP se evalúan mediante microscopía de fluorescencia con la observación de la típica agregación nuclear del marcador EGFP como indicación de la apoptosis. Si son apoptóticas, la distribución de la señal de EGFP en las células que expresan el EGFP-familia THAP o dominio THAP será idéntica a la distribución de los tintes DAPI o Hoechst 33342, que se emplean de modo convencional para detectar los cambios en el ADN nuclear asociados con la apoptosis (Cohen et al., supra).

También puede ensayarse la capacidad de los polipéptidos de la familia THAP o de dominio THAP, o sus fragmentos biológicamente activos o sus homólogos, para inducir la apoptosis mediante ensayos de expresión en células de cáncer humanas, por ejemplo las disponibles en NCI. El tipo de vector (por ejemplo plasmídico, retrovírico o de virus sinbis) puede seleccionarse basándose en la eficacia de un tipo celular dado. Después del periodo indicado, las células se evalúan para detectar señales morfológicas de la apoptosis, incluyendo la agregación de EGFP-familia THAP o dominio THAP en cuerpos apoptóticos nucleares. Las células se cuentan bajo un microscopio de fluorescencia y se puntúan según la presencia o la ausencia de señales apoptóticas, o las células se puntúan mediante un ensayo de TUNEL fluorescente y se encuentran en un citómetro de flujo. La apoptosis se expresa como el porcentaje de células que muestran los cambios avanzados típicos de la apoptosis.

Las células del panel de NCI de células tumorales incluyen, por ejemplo:

- cáncer de colon, en la expresión se utiliza un vector de expresión retrovírico, realizándose la evaluación de la apoptosis 96 h después de la infección (líneas celulares KM12; HT-29; SW-620; COLO205; HCT-5; HCC 2998; HCT-116);

- tumores del SNC, en la expresión se utiliza un vector de expresión retrovírico, realizándose la evaluación de la apoptosis 96 h después de la infección (líneas celulares SF-268, astrocitoma; SF-539, glioblastoma; SNB-19, gliblastoma; SNB-75, astrocitoma; y U251, glioblastoma;

- células de leucemia, en la expresión se utiliza un vector de expresión retrovírico, realizándose la evaluación de la apoptosis 96 h después de la infección (líneas celulares CCRF-CEM, leucemia linfocítica aguda (ALL); K562, leucemia mielógena aguda (AML); MOLT-4, ALL; SR, inmunoblastoma de células grandes; y RPMI 8226, mieloblastoma);

- cáncer de próstata, en la expresión se utiliza un vector de expresión retrovírico, realizándose la evaluación de la apoptosis 96 h después de la infección (PC-3);

- cáncer de riñón, en la expresión se utiliza un vector de expresión retrovírico, realizándose la evaluación de la apoptosis 96 h después de la infección (líneas celulares 768-0; UO-31; TK10; ACHN);

- cáncer de piel, en la expresión se utiliza un vector de expresión retrovírico, realizándose la evaluación de la apoptosis 96 h después de la infección (melanoma) (líneas celulares SKMEL-28; M14; SKMEL-5; MALME-3);

- cáncer de pulmón, en la expresión se utiliza un vector de expresión retrovírico, realizándose la evaluación de la apoptosis 96 h después de la infección (líneas celulares HOP-92; NCI-H460; HOP-62; NCI-H522; NCI-H23; A549; NCI-H226; EKVX; NCI-H322);

- cáncer de mama, en la expresión se utiliza un vector de expresión retrovírico, realizándose la evaluación de la apoptosis 96 h después de la infección (líneas celulares MCF-7; T-47D; MCF-7/ADR; MDAMB43; MDAMB23; MDA-N; BT-549);

- cáncer de ovario, en la expresión se utiliza un protocolo y un vector de expresión retrovírico, o un protocolo y un vector de expresión vírico Sindbis, realizándose la evaluación de la apoptosis 96 h después de la infección con el retrovirus, o 24 h después de la infección con los vectores víricos Sindbis (líneas celulares OVCAR-8; OVCAR-4; IGROV-1; OVCAR-5; OVCAR3; SK-OV-3).

En otro ejemplo representativo, puede ensayarse la susceptibilidad de las células de un melanoma maligno a la apoptosis inducida por un polipéptido de la familia THAP o de dominio THAP, o su fragmento biológicamente activo o su homólogo en varios tipos celulares de melanoma conocidos: melanoma humano WM 266-4 (ATCC CRL-1676); melanoma maligno humano A-375 (ATCC CRL-1619); melanoma maligno humano A2058 (ATCC CRL-11147); melanoma maligno humano SKMEL-31 (ATCC HTB-73); melanoma maligno humano RPMI-7591 ATCC HTB-66 (metástasis hacia el nódulo linfático). Los aislados de melanoma primarios también pueden ensayarse. Además se ensayan células K-562 de leucemia mielógena crónica humana (ATCC CCL-243), y células de riñón humano 293 (ATCC CRL-1573) (células embrionarias primarias transformadas). Los fibroblastos dérmicos primarios humanos normales y los fibroblastos de rata-1 actúan como controles. Todas las líneas celulares de melanoma son metastásicas basándose en su aislamiento a partir de metástasis o de nódulos metastásicos. Se emplea una estrategia de expresión transitoria para evaluar la inducción de una apoptosis mediada por un polipéptido de la familia THAP o de dominio THAP sin artefactos asociados con una selección prolongada. Un vector de expresión que codifica la proteína de fusión EGFP-polipéptido de la familia THAP o de dominio THAP descrito a continuación puede utilizarse para facilitar la identificación de las células que expresan el polipéptido de la familia THAP o de dominio THAP. Las células se infectan de modo transitorio mediante el método óptimo para la célula que se está ensayando (CaPO^{4} o lipofectina). La expresión del polipéptido de la familia THAP o de dominio THAP y la inducción de la apoptosis se estudia utilizando un microscopio de fluorescencia a las 24 h y 48 h después de la transfección. Se evalúa un mínimo de 100 células que muestren una característica fluorescencia de EGFP mediante microscopía de fluorescencia. La apoptosis se puntúa como fragmentación nuclear, cuerpos apoptóticos marcados, y hervido citoplásmico. Las características de la fragmentación nuclear son particularmente visibles cuando la fusión de EGFP-polipéptido de la familia THAP o de dominio THAP se condensa en cuerpos apoptóticos.

En otro ejemplo, puede ensayarse la susceptibilidad de las células endoteliales a la apoptosis inducida por un polipéptido de la familia THAP o de dominio THAP, o su fragmento biológicamente activo o su homólogo, en varios tipos de células endoteliales conocidos: HUVEC (células endoteliales de vena umbilical humanas; BioWhittaker-Clonetics, 8830 Biggs Ford Road, Walkersville, MD 21793-0127, nº de catálogo CC-2519), HMVEC-L (células endoteliales microvasculares humanas del pulmón; BioWhittaker-Clonetics, 8830 Biggs Ford Road, Walkersville, MD 21793-0127, nº de catálogo CC-2527), HMVEC-d (células endoteliales microvasculares humanas de la dermis; BioWhittaker-Clonetics, 8830 Biggs Ford Road, Walkersville, MD 21793-0127, nº de catálogo CC-2543). Éstos y otros tipos de células endoteliales pueden ser útiles como modelos para proporcionar una indicación de la capacidad de los polipéptidos de la familia THAP o de dominio THAP para inducir la apoptosis en estrategias terapéuticas para la regulación de la angiogénesis. Se emplea una estrategia de expresión transitoria para evaluar la inducción de la apoptosis mediada por un polipéptido de la familia THAP o de dominio THAP sin artefactos asociados con una selección prolongada. Un vector de expresión que codifica la proteína de fusión EGFP-polipéptido de la familia THAP o de dominio THAP descrito a continuación puede utilizarse para facilitar la identificación de las células que expresan el polipéptido de la familia THAP o de dominio THAP. Las células se infectan de modo transitorio mediante el método óptimo para la célula que se está ensayando (CaPO^{4} o lipofectina). La expresión del polipéptido de la familia THAP o de dominio THAP y la inducción de la apoptosis se estudia utilizando un microscopio de fluorescencia a las 24 h y 48 h después de la transfección. Se evalúa un mínimo de 100 células que muestren una característica fluorescencia de EGFP mediante microscopía de fluorescencia. La apoptosis se puntúa como fragmentación nuclear, cuerpos apoptóticos marcados, y hervido citoplásmico. Las características de la fragmentación nuclear son particularmente visibles cuando la fusión de EGFP-polipéptido de la familia THAP o de dominio THAP se condensa en cuerpos apoptóticos.

En otro ejemplo, un procedimiento de ensayo de transfección transitoria es similar al previamente descrito para detectar la apoptosis inducida por la enzima IL-1-beta-conversora (Miura et al., Cell, 75:653-660 (1993); Kumar et al., Genes Dev., 8:1613-1626 (1994); Wang et al., Cell, 78:739-750 (1994); y patente de EEUU nº 6.221.615). Un día antes de la transfección, células (por ejemplo, células de rata-1) se cultivan en placas de 24 pocillos a 3,5*10^{4} células/pocillo. Al día siguiente, las células se transfectan con un plásmido marcador que codifica beta-galactosidasa, en combinación con un plásmido de expresión que codifica un polipéptido de la familia THAP o de dominio THAP, mediante el procedimiento de la lipofectamina (Gibco/BRL). A las 24 horas después de la transfección, las células se fijan y se tiñen con X-Gal para detectar la expresión de beta-galatosidasa en células que reciben ADN plasmídico (Miura et al., supra). El número de células azules se cuenta mediante examen microscópico y se puntúa como vivas (células azules lisas) o muertas (células azules redondas). La actividad de muerte celular del polipéptido de la familia THAP o de dominio THAP en este ensayo se manifiesta por una gran reducción en el número de células azules obtenidas con relación a la cotransfección con el plásmido beta-gal con un vector de expresión control (es decir, sin inserto de ADNc del polipéptido de la familia THAP o de dominio THAP).

En otro ejemplo, los ensayos de cotransfección con beta-galactosidasa pueden utilizarse para la determinación de la muerte celular. El ensayo se realiza como se describe (Hsu, H. et al. (1995), Cell, 81,495-504; Hsu, H. et al. (1996a), Cell, 84, 299-308; y Hsu, H. et al. (1996b), Inmunity, 4, 387-396; y la patente de EEUU nº 6.242.569). Las células transfectadas se tiñen con XgaI como se describe en Shu, H.B. et al. (1995), J. Cell Sci., 108, 2955-2962). El número de células azules en ocho campos de visión de una placa de 35 mm se determina mediante recuento. Se muestra el número medio de un experimento representativo.

Los ensayos para la apoptosis también pueden realizarse empleando cualquier marcador biológico de la apoptosis adecuado. A continuación se describen varios métodos.

En un aspecto, pueden realizarse estudios fluorocitométricos del estado de la muerte celular. La tecnología utilizada en los estudios fluorocitométricos emplea la identificación de las células en tres fases diferentes del ciclo celular: G_{1}, S y G_{2}. Esto se realiza sobre todo mediante la tinción de una cantidad de ADN con marcaje de yoduro de propidio. Puesto que la población celular que se está muriendo contiene la misma cantidad de ADN que sus homólogos vivos en cualquiera de las tres fases del ciclo celular, no hay manera de distinguir entre las dos poblaciones celulares. Se puede realizar un marcaje doble para la positividad frente a un marcador biológico de la apoptosis (por ejemplo, terminina Tp30, patente de EEUU nº 5.783.667) y una tinción con yoduro de propidio (PI) al mismo tiempo. Las mediciones de los índices de marcaje para el marcador biológico de la apoptosis y la tinción con PI pueden utilizarse conjuntamente para obtener las fracciones exactas de las células en G_{1} que están vivas y que se están muriendo. Pueden realizarse estimaciones similares para las poblaciones celulares en fase S y en fase G_{2}.

En este ensayo, las células se procesan para la fijación con formaldehído y la extracción con Triton al 0,05%. Después los especímenes celulares se incuban con un anticuerpo monoclonal contra un marcador de la apoptosis durante la noche a temperatura ambiente o a 37ºC durante una hora. A esto le sigue otra incubación con anticuerpo antiratón de cabra marcado con fluoresceína, y la posterior incubación con tinción con yoduro de propidio. Los especímenes celulares completamente procesados entonces se evalúan mediante medidas fluorocitométricas de intensidad de fluorescencia (marcador de la apoptosis) y marcaje con rodamina (PI) sobre una base de una sola célula, con la misma población celular de manera simultánea.

En otro aspecto, es posible evaluar el efecto inhibidor sobre el crecimiento celular mediante la inducción terapéutica de la apoptosis. Un método habitual para determinar si un fármaco quimioterapéutico concreto puede inhibir el crecimiento de células cancerosas es estudiar el tamaño de una población celular en cultivo, midiendo la reducción en el número o el tamaño de las colonias, o midiendo el crecimiento de las colonias en agar blando, o la formación de tumores in vivo en ratones atímicos, aunque estos procedimientos requieren un tiempo para el desarrollo de las colonias o del tumor que sea suficientemente largo como para que sean detectables. Los experimentos implicados en estas estrategias en general requieren una planificación a gran escala y múltiples repeticiones con un lapso de tiempo experimental largo (al menos tres semanas). A menudo, estos ensayos no toman en cuenta el hecho de que un fármaco puede no estar inhibiendo el crecimiento celular sino matando a las células, una consecuencia más favorable necesaria para el tratamiento quimioterapéutico del cáncer. Por tanto, los ensayos para la evaluación de la actividad de la apoptosis pueden implicar el uso de un marcador biológico o bioquímico específico para células quiescentes, no en ciclo o no proliferativas. Por ejemplo, un anticuerpo monoclonal puede utilizarse para evaluar la población no proliferativa de células en un tejido dado cuando produce una medición, de manera indirecta, del componente proliferativo de un tumor o una masa celular. Esta detección puede combinarse con un marcador biológico o bioquímico (por ejemplo, anticuerpos) para detectar el conjunto de la población celular que se está muriendo, proporcionando una evaluación potente y rápida de la eficacia de cualquier fármaco dado para la contención del crecimiento de células cancerosas. Las aplicaciones pueden realizarse con facilidad a nivel microscópico de inmunofluorescencia con células cultivadas o secciones de tejido.

En otros aspectos, puede utilizarse un marcador biológico o bioquímico para evaluar la intervención farmacológica sobre la inhibición de la frecuencia de la muerte celular en enfermedades degenerativas. Para enfermedades degenerativas como la enfermedad de Alzheimer o la enfermedad de Parkinson, estas pérdidas pueden deberse a la activación prematura del programa de muerte celular en neuronas. En la osteoporosis, la pérdida celular puede deberse a un equilibrio inapropiado entre las células de osteoblastos y de osteoclastos, debido a que el proceso de muerte celular programada es demasiado activo, matando a más células de las que puede permitirse el tejido óseo. Un fenómeno relacionado también puede producirse en el proceso de la curación de heridas, el transplante de tejidos y el crecimiento celular en el glomérulo durante una infección renal, en el que el equilibrio entre las poblaciones de células vivas y que están muriendo es una cuestión esencial para el estado de salud del tejido, y se describe más a fondo en la sección titulada "Métodos de tratamiento". Una evaluación rápida de las poblaciones de células que están muriendo puede realizarse a través de mediciones inmunohistoquímicas y bioquímicas de un marcador biológico o bioquímico de la apoptosis en tejidos degenerativos. En un ejemplo, un marcador biológico o bioquímico puede utilizarse para evaluar el estado de muerte celular en oligodendrocitos asociados con la esclerosis múltiple. Se produce una tinción positiva de un anticuerpo monoclonal contra un marcador de la apoptosis (como Tp30, patente de EEUU nº 5.783.667) en oligodendrocitos humanos cultivados que se están muriendo. El acontecimiento de muerte celular programada se activa en estos oligodendrocitos mediante la privación total del suero, o mediante un tratamiento con el factor de necrosis tumoral (TNF).

En general, un marcador biológico o bioquímico también puede utilizarse para evaluar el estado de muerte celular en estudios farmacológicos en modelos animales. En fechas recientes se ha considerado que intentar controlar una velocidad de muerte celular reducida, en el caso del cáncer, o una mayor velocidad de muerte celular, en el caso de la neurodegeneración, como un nuevo modo de intervención en la enfermedad. Se están desarrollando numerosas estrategias mediante la intervención con fármacos conocidos o mediante terapia génica, comenzando desde la base de corregir el proceso de muerte celular programada alterado, con el concepto de mantener una masa celular equilibrada en cualquier tejido dado. Para estas intervenciones terapéuticas, el puente entre los estudios en células cultivadas y los ensayos clínicos son los estudios animales, es decir, el éxito en una intervención con modelos animales, en animales de laboratorio habituales o en ratones transgénicos que porten fenotipos "knock-out" o de sobreexpresión. Por tanto, un marcador biológico o bioquímico de la apoptosis, como un anticuerpo para una proteína específica de la apoptosis, es una herramienta útil para estudiar el estado de muerte apoptótica en términos del cambio en el número de células que se están muriendo en animales normales y experimentalmente manipulados. En este contexto, la invención, como herramienta de diagnóstico para evaluar el estado de muerte celular, puede ayudar a determinar la eficacia y la potencia de un fármaco o una estrategia terapéutica génica.

Tal como se analiza, se proporcionan métodos para evaluar la actividad de miembros de la familia THAP y de tratamientos terapéuticos que actúan sobre miembros de la familia THAP o vías biológicas relacionadas. Sin embargo, en otros aspectos, los mismos métodos pueden utilizarse para la evaluación de la apoptosis en general, cuando se emplea un miembro de la familia THAP como marcador biológico de la apoptosis. Por tanto, la invención también proporciona métodos de diagnóstico y de ensayo que emplean un miembro de la familia THAP como marcador de la muerte celular o de la actividad apoptótica. En la presente también se proporcionan otros ensayos de diagnóstico en la sección titulada "Usos de diagnóstico y prognosis".

Usos de las composiciones en los métodos de tratamiento

Un gran cuerpo de evidencias recogido de los experimentos realizados con estrategias moduladoras de la apoptosis sugiere que los tratamientos que actúan sobre proteínas que inducen la apoptosis o que reducen la proliferación celular pueden ofrecer nuevos métodos de tratamiento para una amplia gama de trastornos. Los usos de las composiciones en los métodos de tratamiento según la invención pueden actuar de una diversidad de maneras, dada la nueva función proporcionada por una serie de proteínas, y la conexión de varias vías biológicas.

En la presente se proporcionan usos de las composiciones en métodos de tratamiento basados en la funcionalización de los miembros de la familia THAP. Los polipéptidos de la familia THAP o de dominio THAP, o sus fragmentos biológicamente activos o sus homólogos, como se describe a continuación en la presente, pueden ser útiles para la modulación de la apoptosis o de la proliferación celular.

Los usos de las composiciones en los métodos de tratamiento implican actuar sobre una molécula de la invención (es decir, un polipéptido miembro de la familia THAP, una diana de la familia THAP, o PAR4 o una diana de PAR4). Se incluyen métodos que implican la modulación de la actividad de un polipéptido de la familia THAP, la actividad de una diana de la familia THAP, o la actividad de par4 o de una diana de PAR4. Esta modulación (aumento o disminución) de la actividad puede realizarse de una manera de vías adecuadas, varias de las cuales se han descrito en la presente solicitud.

Por ejemplo, los usos de las composiciones en los métodos de tratamiento puede implicar modular una "actividad de la familia THAP", una "actividad biológica de un miembro de la familia THAP" o una "actividad funcional de un miembro de la familia THAP". La modulación de la actividad de la familia THAP puede implicar modular una asociación con una molécula diana de la familia THAP (por ejemplo, la asociación de THAP1, THAP2 o THAP3 con Par4 o la asociación de THAP1, THAP2 o THAP3 con una proteína de PML-NB), o preferiblemente cualquier otra actividad seleccionada del grupo que consiste en: (1) la mediación en la apoptosis o la proliferación celular cuando se expresa o se introduce en una célula, lo más preferiblemente la inducción o la potenciación de la apoptosis y/o lo más preferiblemente la reducción de la proliferación celular; (2) la mediación en la apoptosis o la proliferación celular de una célula endotelial; (3) la mediación en la apoptosis o la proliferación celular de una célula hiperproliferativa; (4) la mediación en la apoptosis o la proliferación celular de una célula del SNC, preferiblemente una célula neuronal o glial; o (5) una actividad determinada en un animal seleccionada del grupo que consiste en la mediación, preferiblemente la inhibición, de la angiogénesis, la mediación, preferiblemente la inhibición, de la inflamación, la inhibición del potencial metastásico de tejido canceroso, la reducción de la carga tumoral, el aumento de la sensibilidad a la quimioterapia o la radioterapia, la muerte de una célula de cáncer, la inhibición del crecimiento de una célula de cáncer, o la inducción de la regresión tumoral. La detección de una actividad de la familia THAP también puede comprender detectar cualquier criterio de valoración terapéutico asociado con un trastorno de enfermedad analizado en la presente.

En otro ejemplo, los usos de las composiciones en los métodos de tratamiento puede implicar la modulación de "actividad PAR4", una "actividad biológica de PAR4" o una "actividad funcional de PAR4". La modulación de la actividad PAR4 puede implicar modular una asociación con una molécula diana de PAR4 (por ejemplo, THAP1, THAP2, THAP3 o una proteína de PML-NB), o lo más preferiblemente una actividad inductora o potenciadora (por ejemplo, transducción de señales) de la apoptosis de PAR4, o la inhibición de la proliferación celular o del ciclo celular.

Los usos de las composiciones en los métodos de tratamiento pueden implicar modular el reclutamiento, la unión o la asociación de proteínas a PML-NB, o modular de otra manera la actividad de PML-NB. La presente invención también proporciona usos de las composiciones en métodos para modular la actividad PAR4, que comprenden modular las interacciones de PAR4 con proteínas de la familia THAP, y PAR4 y PML-NB, así como modular una actividad de la familia THAP, que comprende modular, por ejemplo, las interacciones de THAP1 con PML-NB. La invención incluye la inhibición o el aumento del reclutamiento de THAP1, o PAR4 hacia PML-NB. Evitando la unión de THAP1 o de PAR4, o de ambos, a PML-NB se puede aumentar la biodisponibilidad de THAP1 y/o PAR4, proporcionando con ello un método para aumentar la actividad THAP1 y/o PAR4. La invención también incluye inhibir o aumentar la unión de una proteína de la familia THAP (como THAP1) o PAR4 a PML-NB u otra proteína asociada con PML-NB, como una proteína seleccionada del grupo que consiste en PAR4 daxx, sp100, sp140, p53, pRB, CBP, BLM o SUMO-1. Por ejemplo, la invención incluye modular la actividad PAR4 evitando la unión de THAP1 a PAR4, o evitando el reclutamiento o la unión de PAR4 a los PML-NB.

Los usos de las composiciones en los métodos y composiciones terapéuticos de la invención puede implicar (1) la modulación de la apoptosis o la proliferación celular, lo más preferiblemente la inducción o la potenciación de la apoptosis y/o lo más preferiblemente la reducción de la proliferación celular; (2) la modulación de la apoptosis o la proliferación celular de una célula endotelial; (3) la modulación de la apoptosis o la proliferación celular de una célula hiperproliferativa; (4) la modulación de la apoptosis o la proliferación celular de una célula del SNC, preferiblemente una célula neuronal o glial; (5) la inhibición del potencial metastásico de tejido canceroso, la reducción de la carga tumoral, el aumento de la sensibilidad a la quimioterapia o la radioterapia, la muerte de una célula de cáncer, la inhibición del crecimiento de una célula de cáncer, o la inducción de la regresión tumoral; o (6) la interacción con una molécula diana de la familia THAP o una molécula diana del dominio THAP, preferiblemente la interacción con una proteína o un ácido nucleico. Los usos de las composiciones en los métodos también pueden implicar mejorar un síntoma o un trastorno, como se describe a continuación en la presente.

Terapia antiapoptótica

Las moléculas de la invención (por ejemplo, las que se obtienen utilizando los métodos de selección descritos en la presente, los mutantes negativos dominantes, los anticuerpos, etc.) que inhiben la apoptosis también se espera que sean útiles en el tratamiento y/o la prevención de enfermedades. Las enfermedades en las que sería deseable prevenir la apoptosis incluyen enfermedades neurodegenerativas, como la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la esclerosis lateral amiotrófica, la retinitis pigmentosa y la degeneración cerebelar; mielodisplasias, como anemia aplásica; enfermedades isquémicas, como infarto de miocardio e ictus; enfermedades hepáticas, como hepatitis alcohólica, hepatitis B y hepatitis C; enfermedades de las articulaciones, como osteoartritis; aterosclerosis, etc. El inhibidor de la apoptosis de la presente invención preferiblemente se emplea especialmente como agente para la profilaxis
o el tratamiento de una enfermedad neurodegenerativa (véase también Adams, J.M., Science, 281:1322 (1998)).

Incluida dentro de los inhibidores de la apoptosis, según se describen en la presente, está en general cualquier molécula que inhiba la actividad de un polipéptido de la familia THAP o de dominio THAP, o su fragmento biológicamente activo o su homólogo, una proteína diana de la familia THAP, o PAR4 (en particular las interacción de PAR4/proteína de PML-NB). Los inhibidores de polipéptidos de la familia THAP o de dominio THAP pueden incluir, por ejemplo, anticuerpos, péptidos, análogos de la familia THAP o de dominio THAP dominantes negativos, moléculas pequeñas, ribozimas o ácidos nucleicos antisentido. Estos inhibidores pueden ser particularmente ventajosos para el tratamiento de trastornos neurodegenerativos. Se prefieren particularmente inhibidores que afecten a la unión de una proteína de la familia THAP a una proteína diana de la familia THAP, y los inhibidores que afectan a la actividad de unión al ADN de una proteína de la familia THAP.

En otros aspectos preferidos, la invención proporciona inhibidores de la actividad de la familia THAP incluyendo, pero sin limitarse a moléculas que interfieren o inhiben las interacciones de las proteínas de la familia THAP con PAR4, para el tratamiento de trastornos relacionados con células endoteliales y trastornos neurodegenerativos. En la bibliografía se encuentran un apoyo a esto, puesto que PAR4 parece desempeñar un papel clave en la apoptosis neuronal en diversas enfermedades neurodegenerativas (Guo et al., 1998; Mattson et al., 2000; Mattson et al., 1999; Mattson et al., 2001). Por tanto, la THAP1, que se expresa en el cerebro y se asocia con PAR4, también puede desempeñar un papel clave en la apoptosis neuronal. Los fármacos que inhiben a la familia THAP y/o inhiben la formación de complejos de familia THAP/PAR4 pueden conducir al desarrollo de nuevas estrategias preventivas y terapéuticas para los trastornos neurodegenerativos.

Regulación de la apoptosis en células endoteliales

La invención también proporciona usos de las composiciones en métodos para regular la angiogénesis en un sujeto que se espera que sean útiles para el tratamiento del cáncer, las enfermedades cardiovasculares y las enfermedades inflamatorias. Se espera que un inductor de la apoptosis de células inmortalizadas sea útil para suprimir la tumorigénesis y/o la metástasis en tumores malignos. Los ejemplos de tumores malignos incluyen leucemia (por ejemplo leucemia mielocítica, leucemia linfocítica, como linfoma de Burkitt), carcinoma del tracto digestivo, carcinoma de pulmón, carcinoma de páncreas, carcinoma de ovario, carcinoma de útero, tumor cerebral, melanoma maligno, otros carcinomas, y sarcomas. Los presentes inventores han aislado ADNc de THAP1 y PAR4 a partir de células endoteliales humanas, y se sabe que PAR4 y PML se expresan predominantemente en células endoteliales de vasos sanguíneos (Boghaert et al. (1997), Cell Growth Differ., 8(8):881-890; Terris B. et al. (1995), Cancer Res., 55(7):1590-1597, 1995), lo cual sugiere que los PML-NB y el recién asociado complejo proapoptótico de THAP1/PAR4 pueden ser un regulador principal de la apoptosis de células endoteliales in vivo y, por tanto, constituyen una diana terapéutica atractiva para enfermedades dependientes de la angiogénesis. Por ejemplo, las vías de THAP1 y PAR4 pueden permitir tratamientos selectivos que regulen (por ejemplo, estimulen o inhiban) la angiogénesis.

En un primer aspecto, la invención proporciona usos de las composiciones en métodos para inhibir la apoptosis de células endoteliales, administrando un inhibidor de THAP1 o PAR4, u opcionalmente un inhibidor de la interacción de THAP1/PAR4, u opcionalmente un inhibidor de la actividad de unión al ADN de THAP1. Como se describe a continuación en la presente, el dominio THAP está implicado en la actividad proapoptótica de THAP1. La deleción del dominio THAP abroga la actividad proapoptótica de THAP1 en fibroblastos 3T3 de ratón, como se muestra en el ejemplo 11. Además, como se describe a continuación en la presente, la deleción de los restos 168-172 o el reemplazamiento de los restos 171-172 abroga la unión de THAP1 a PAR4 in vitro e in vivo, y da como resultado la falta de reclutamiento de PAR4 por THAP1 hacia los PML-NB. Para PAR4, se requiere (y es suficiente) el dominio de cremallera de leucina para la unión a THAP1.

La inhibición de la apoptosis de células endoteliales puede mejorar la angiogénesis y la vasculogénesis en pacientes con isquemia y también puede interferir con la remodelación vascular desregulada focal, un mecanismo clave para el avance de la enfermedad aterosclerótica.

En otro aspecto, la invención proporciona usos de las composiciones en métodos para inducir la apoptosis de células endoteliales administrando, por ejemplo, un polipéptido de la familia THAP biológicamente activo, como THAP1, un polipéptido de dominio THAP o un polipéptido PAR4, o su fragmento biológicamente activo o su homólogo, o un estimulador de THAP1 o PAR4. La estimulación de la apoptosis de células endoteliales puede evitar o inhibir la angiogénesis y, por tanto, limitar la neovascularización no deseada de tumores o tejidos inflamados (véase, Dimmeler y Zeiher, Circulation Research, 2000, 87:434-439).

Angiogénesis

La angiogénesis se define en un organismo adulto como la formación de nuevos vasos sanguíneos mediante un proceso de brote desde vasos preexistentes. Esta neovascularización implica la activación, la migración y la proliferación de células endoteliales y está dirigida por varios estímulos, entre ellos el esfuerzo de cizallamiento. Bajo condiciones fisiológicas normales, los seres humanos o los animales sufren angiogénesis sólo en situaciones específicas muy restringidas. Por ejemplo, la angiogénesis normalmente se observa en la curación de heridas; el desarrollo fetal y embrionario, y la formación del cuerpo lúteo, el endometrio y la placenta. Las moléculas de la invención pueden tener una actividad inhibidora o inductora endotelial, teniendo la capacidad para inhibir o inducir la angiogénesis en general.

Se cree que la angiogénesis controlada e incontrolada se desarrollan de una manera similar. Las células endoteliales y los pericitos, rodeados de la membrana basal, forman vasos sanguíneos capilares. La angiogénesis comienza con la erosión de la membrana basal por enzimas liberadas por células endoteliales y leucocitos. Las células endoteliales, que tapizan el lumen de los vasos sanguíneos, entonces sobresalen a través de la membrana basal. Los estimulantes angiogénicos inducen a las células endoteliales a que migren a través de la membrana basal erosionada. Las células migrantes forma un "brote" desde el vaso sanguíneo de origen, en el que las células endoteliales sufren mitosis y proliferan. Los brotes endoteliales se funden entre sí para formar bucles capilares, creando un nuevo vaso sanguíneo.

Se produce una angiogénesis persistente y no regulada en múltiples estados de enfermedad, metástasis tumorales y crecimiento anómalo de células endoteliales, y apoya los daños patológicos que se observan en estos trastornos. Los diversos estados de enfermedad patológicos en los que está presente una angiogénesis no regulada se han agrupado como enfermedades dependientes de la angiogénesis o asociadas a la angiogénesis. Por tanto, un objeto de la presente invención es proporcionar métodos y composiciones para tratar enfermedades y procesos que están mediados por la angiogénesis incluyendo, pero sin limitarse a hemangioma, tumores sólidos, leucemia, metástasis, telangiectasia, psoriasis, escleroderma, granuloma piogénico, angiogénesis miocárdica, neovascularización de placas, colaterales coronarios, angiogénesis de extremidades isquémicas, enfermedades corneales, rubeosis, glaucoma neovascular, retinopatía diabética, fibroplastia retrolental, artritis, neovascularización diabética, degeneración macular, curación de heridas, úlcera péptica, fracturas, queloides, vasculogénesis, hematopoyesis, ovulación, menstruación y placentación.

(i) Terapia antiangiogénica

En un aspecto, la invención proporciona terapias antiangiogénicas como tratamientos potenciales para una amplia variedad de enfermedades, incluyendo el cáncer, la arteriosclerosis, la obesidad, la artritis, las úlceras duodenales, la psoriasis, los trastornos de la piel proliferativos, los trastornos cardiovasculares y la neovascularización ocular anómala provocada, por ejemplo, por la diabetes (Folkman, Nature Medicine, 1:27 (1995), y Folkman, Seminars in Medicine of the Beth Israel Hospital, Boston, New England Journal of Medicine, 333:1757 (1995)). Se cree que las terapias antiangiogénicas actúan inhibiendo la formación de nuevos vasos sanguíneos.

Por tanto, la presente invención proporciona usos de las composiciones en métodos y composiciones para tratar enfermedades y procesos mediados por una angiogénesis no deseada e incontrolada, mediante la administración a un ser humano o a un animal de una composición que comprende un polipéptido de la familia THAP o de dominio THAP sustancialmente purificado, o su fragmento biológicamente activo o su homólogo o su derivado, en una dosificación suficiente para inhibir la angiogénesis, la administración de un vector capaz de expresar un ácido nucleico que codifica una proteína de la familia THAP o de dominio THAP, o la administración de cualquier otro inductor de la expresión o la actividad de una proteína de la familia THAP o de dominio THAP. La presente invención es particularmente útil para tratar o para reprimir el crecimiento de tumores. La administración de un ácido nucleico o una proteína de la familia THAP o de dominio THAP u otro inductor a un ser humano o a un animal con tumores metastatizados prevascularizados evitará el crecimiento o la expansión de estos tumores. La actividad de la familia THAP puede utilizarse junto con otras composiciones y procedimientos para el tratamiento de enfermedades. Por ejemplo, un tumor puede tratarse de forma convencional con cirugía, radiación o quimioterapia, combinada con una proteína de la familia THAP o de dominio THAP, y después puede administrarse una proteína de la familia THAP o de dominio THAP al paciente para extender la inactividad de micrometástasis y para estabilizar cualquier tumor primario residual.

En un ejemplo preferido, una actividad de la familia THAP, preferiblemente una actividad THAP, se emplea para el tratamiento de la artritirs, por ejemplo de la artritis reumatoide. La artritis reumatoide se caracteriza por una inflamación simétrica, poliarticular de las articulaciones con tapiz sinovial, y puede implicar a tejidos extraarticulares, como el pericardio, el pulmón y los vasos sanguíneos.

(ii) Terapia angiogénica

En otro aspecto, los inhibidores de la actividad de proteínas de la familia THAP, en particular de la actividad THAP1, pueden utilizarse como antiapoptóticos y, por tanto, como una terapia angiogénica. Las terapias angiogénicas son tratamientos potenciales para estimular la curación de heridas y para estimular el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos para evitar los que están ocluidos. Por tanto, las terapias proangiogénicas pueden potencialmente aumentar o sustituir las cirugías de by-pass y la angioplastia de balón (PTCA). Por ejemplo, con respecto a la neovascularización para evitar vasos sanguíneos ocluidos, una "cantidad terapéuticamente eficaz" es una cantidad que da como resultado la formación de nuevos vasos sanguíneos que pueden transportar al menos parte de la sangre que normalmente pasaría a través del vaso bloqueado.

La proteína de la familia THAP de la presente invención puede utilizarse, por ejemplo, para generar anticuerpos que pueden utilizarse como inhibidores de la apoptosis. Los anticuerpos pueden ser anticuerpos policlonales o anticuerpos monoclonales. Además, estos anticuerpos que se unen específicamente con la proteína de la familia THAP pueden utilizarse en métodos y kits de diagnóstico que son muy conocidos por los expertos en la técnica para detectar o cuantificar la proteína de la familia THAP en un fluido corporal. Los resultados de estos ensayos pueden utilizarse para diagnosticar o predecir la aparición o recurrencia de un cáncer y otras enfermedades mediadas por la angiogénesis.

Se apreciará que otros inhibidores de las proteínas de la familia THAP y de dominio THAP también pueden utilizarse en las terapias angiogénicas incluyendo, por ejemplo, moléculas pequeñas, ácidos nucleicos antisentido, proteínas o péptidos de la familia THAP y de dominio THAP dominantes negativos identificados utilizando los anteriores métodos.

A la vista de las aplicaciones en las terapias angiogénicas y antiangiogénicas, las moléculas de la invención puede tener una actividad inhibidora o inductora endotelial, teniendo la capacidad de inhibir o inducir la angiogénesis en general. Se apreciará que los métodos para evaluar dicha capacidad son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, evaluar las propiedades antiangiogénicas como la capacidad para inhibir el crecimiento de células endoteliales capilares bovinas en cultivo en presencia del factor del crecimiento de fibroblastos.

Debe entenderse que se contempla que la presente invención incluye cualquier derivado de los polipéptidos de la familia THAP o de dominio THAP, y sus fragmentos biológicamente activos y sus homólogos, que tienen actividad apoptótica o inhibidora endotelial. La presente invención incluye proteínas de la familia THAP o de dominio THAP de longitud completa, derivados de proteínas de la familia THAP o de dominio THAP, y fragmentos biológicamente activos de las proteínas de la familia THAP o de dominio THAP. Éstos incluyen proteínas con una actividad de proteína de la familia THAP que tienen sustituciones de aminoácidos o que tienen azúcares u otras moléculas unidas a grupos funcionales aminoácidos. Los métodos también contemplan el uso de genes que codifican una proteína de la familia THAP y proteínas que son expresadas por estos genes.

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Tal como se analiza, en la presente se describen varios usos de composiciones en los métodos para administrar un modulador a un sujeto que necesita tratamiento incluyendo, por ejemplo, moduladores de molécula pequeña, ácidos nucleicos que se incluyen a través de vectores de terapia génica, y polipéptidos que incluyen miméticos de péptidos, polipéptidos activos, polipéptidos dominantes negativos y anticuerpos. Por tanto, se apreciará que los moduladores de la invención identificados según los métodos de la sección titulada "Ensayos de selección de fármacos" pueden también ensayarse en modelos celulares o animales para su capacidad para mejorar o prevenir un trastorno que implica a un polipéptido de la familia THAP, en particular THAP1, interacciones de THAP1, THAP2 o THAP3/PAR4, la unión al ADN de la familia THAP o las interacciones PAR4/PML-NB. De forma similar, los ácidos nucleicos, los polipéptidos y los vectores (por ejemplo, víricos) también puede evaluarse de una manera similar.

Un "individuo" tratado mediante los métodos de esta invención es un vertebrado, en particular un mamífero (incluyendo modelos animales de una enfermedad humana, animales de granja, animales para el deporte y mascotas), y de forma típica un ser humano.

Un "tratamiento" se refiere a una intervención clínica para intentar alterar el curso natural del individuo que se está tratando, y puede realizarse con un objetivo profiláctico o durante el curso de la patología clínica. Los efectos deseables incluyen prevenir la aparición o la recurrencia de una enfermedad, el alivio de los síntomas, la disminución de cualquier consecuencia patológica directa o indirecta de la enfermedad, como una hiperrespuesta, inflamación o necrosis, la disminución de la velocidad de avance de la enfermedad, la mejora o el paliamiento del estado de enfermedad, y la remisión o una prognosis mejorada. La "patología" asociada con un trastorno de enfermedad es aquello que comprometa el bienestar, la fisiología normal o la calidad de vida del individuo afectado.

El tratamiento se realiza administrando una cantidad eficaz de un inhibidor o un activador del polipéptido de la familia THAP. Una "cantidad eficaz" es una cantidad suficiente para lograr un resultado clínico beneficioso o deseado, y puede administrarse en una o más dosis.

Los criterios para evaluar la respuesta a las modalidades terapéuticas que emplean las composiciones lipídicas de esta invención vienen dictados por el trastorno específico, medidos según procedimientos médicos convencionales apropiados para el trastorno.

Composiciones farmacéuticas

Los compuestos capaces de inhibir una actividad de la familia THAP, preferiblemente moléculas pequeñas pero también incluyen péptidos, moléculas de ácidos nucleicos de la familia THAP, proteínas de la familia THAP, y anticuerpos anti-familia THAP (también denominados en la presente "compuestos activos") de la invención pueden incorporarse en composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración. Estas composiciones comprenden, de forma típica, un vehículo farmacéuticamente aceptable. Tal como se emplea en la presente, la expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" pretende incluir cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y de retraso en la absorción y similares, compatibles con la administración farmacéutica. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es muy conocido en la técnica. Excepto si un medio o agente convencional es incompatible con el compuesto activo, se contempla su uso en las composiciones. También pueden incorporarse otros compuestos activos en las
composiciones.

Una composición farmacéutica de la invención se formula para que sea compatible con su vía de administración prevista. Los ejemplos de vías de administración incluyen la vía parenteral, por ejemplo intravenosa, intradérmica, subcutánea, oral (por ejemplo, inhalación), transdérmica (tópica), transmucósica, y rectal. Las disoluciones o suspensiones utilizadas para la aplicación parenteral, intradérmica o subcutánea pueden incluir los siguientes componentes: un diluyente estéril, como agua para inyección, disolución salina, aceites no volátiles, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes sintéticos; agentes antibacterianos, como alcohol bencílico o metilparabenos; antioxidantes, como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes, como ácido etilendiaminotetraacético; tampones, como acetatos, citratos o fosfatos, y agentes para el ajuste de la tonicidad, como cloruro de sodio o dextrosa. El pH puede ajustarse con ácidos o bases, como ácido clorhídrico o hidróxido de sodio. La preparación parenteral puede encerrarse en ampollas, jeringas desechables o viales de dosis múltiple fabricados de vidrio o plástico.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para un uso inyectable incluyen disoluciones acuosas estériles (cuando son solubles en agua) o dispersiones y polvos estériles para la preparación improvisada de disoluciones o dispersiones inyectables estériles. Para la administración intravenosa, los vehículos adecuados incluyen disolución salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremophor EL\alpha (BASF, Parsipanny, NJ) o disolución salina tamponada con fosfato (PBS). En todos los casos, la composición debe ser estéril y debe ser fluida hasta el grado en que pueda inyectarse con facilidad. Debe ser estable bajo las condiciones de fabricación y conservación, y debe conservarse frente a la acción contaminante de microorganismos, como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares) y sus mezclas adecuadas. Puede mantenerse la fluidez apropiada, por ejemplo, mediante el uso de un revestimiento como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de una dispersión y mediante el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de microorganismos puede lograrse mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo azúcares, polialcoholes como manitol, sorbitol, cloruro de sodio en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede lograrse incluyendo en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo monoestearato de aluminio y
gelatina.

Cuando el compuesto activo es una proteína, un péptido o un anticuerpo anti-familia THAP pueden prepararse disoluciones inyectables estériles incorporando el compuesto activo (por ejemplo) en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes enumerados anteriormente, seguido de una esterilización por filtración. En general, se preparan dispersiones incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de disoluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son un secado al vacío y una liofilización, que produce un polvo de los ingredientes activos más cualquier otro ingrediente deseado a partir de una disolución previamente esterilizada por filtración que los contenía.

Las composiciones orales en general incluyen un diluyente inerte o un vehículo comestible. Pueden estar encerradas en cápsulas de gelatina o prensadas en comprimidos. Para la administración terapéutica oral, el compuesto activo puede incorporarse con excipientes y utilizarse en forma de comprimidos, trociscos o cápsulas. Para la administración mediante inhalación, los compuestos se administran en forma de un pulverizado en aerosol a partir de un recipiente o dispensador presurizado que contenga un propelente adecuado, por ejemplo un gas como dióxido de carbono, o un nebulizador. La administración sistémica también puede ser por medios transmucósicos o transdérmicos. Para la administración transmucósica o transdérmica, en la formulación se emplean penetrantes apropiados para la barrera que se va a permear. Dichos penetrantes son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo para la administración transmucósica, detergentes, sales biliares y derivados del ácido fusídico. La administración transmucósica puede realizarse mediante el uso de pulverizados nasales o supositorios. Para la administración transdérmica, los compuestos activos se formulan en ungüentos, bálsamos, geles o cremas como se conoce en la técnica. Más preferiblemente, el compuesto activo se administra a un sujeto mediante inyección intravenosa.

En una realización, los compuestos activos se preparan con vehículos que protegerán al compuesto frente a la rápida eliminación del cuerpo, como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes y sistemas de administración microencapsulados. Pueden utilizarse polímeros biodegradables y biocompatibles, como acetato de etilenvinilo, polianhídridos, poli(ácido glicólico), colágeno, poliortoésteres y poli(ácido láctico). Los métodos para la preparación de dichas formulaciones serán evidentes para los expertos en la técnica. Los materiales también pueden obtenerse en el mercado en Alza Corporation y Nove Pharmaceticals, Inc. También pueden utilizarse suspensiones liposómicas (incluyendo liposomas dirigidos a infectar células con anticuerpos monoclonales contra antígenos víricos) como vehículos farmacéuticamente aceptables. Éstos pueden prepararse según métodos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo como se describe en la patente de EEUU nº 4.522.811.

Resulta especialmente ventajoso formular las composiciones orales o preferiblemente parenterales en una forma de dosificación unitaria para facilitar la administración y la uniformidad de la dosificación. La forma de dosificación unitaria, tal como se emplea en la presente, se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificación unitaria para el sujeto que se va a tratar; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. La especificación para las formas de dosificación unitarias de la invención vienen dictadas y dependen directamente de las características exclusivas del compuesto activo y del efecto terapéutico particular que se va a lograr, y las limitaciones inherentes en la técnica de componer dicho compuesto activo para el tratamiento de individuos.

La toxicidad y la eficacia terapéutica de dichos compuestos puede determinarse mediante procedimientos farmacéuticos convencionales en cultivos celulares o en animales experimentales, por ejemplo para determinar la LD50 (la dosis letal para 50% de la población) y la ED50 (la dosis terapéuticamente eficaz en 50% de la población). La proporción de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y puede expresarse como la proporción LD50/ED50. Se prefieren los compuestos que muestren grandes índices terapéuticos. Aunque pueden utilizarse compuestos que muestren efectos secundarios tóxicos, debe tenerse cuidado para diseñar un sistema de administración que dirija dichos compuestos al sitio del tejido afectado para minimizar el daño potencial a células no infectadas y, con ello, reducir los efectos secundarios.

Los datos obtenidos a partir de ensayos de cultivos celulares y de estudios animales pueden utilizarse para formular una variedad de dosificaciones para su uso en seres humanos. La dosificación de dichos compuestos se encuentra preferiblemente en el intervalo de concentraciones en circulación que incluyen la ED50 con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo, dependiendo de la forma de dosificación empleada y de la vía de administración utilizada. Para cualquier compuesto utilizado en el método de la invención, la dosis terapéuticamente eficaz puede estimarse inicialmente a partir de ensayos de cultivos celulares. Una dosis puede formularse en modelos animales para lograr un intervalo de concentración plasmática en circulación que incluya la ID50 (es decir, la concentración del compuesto de ensayo que logra una inhibición semimáxima de los síntomas) según se determina en un cultivo celular. Esta información puede utilizarse para determinar, de forma más precisa, las dosis útiles en seres humanos. Los niveles en plasma pueden medirse, por ejemplo, mediante una cromatografía líquida de alta resolución.

Las composiciones farmacéuticas pueden incluirse en un recipiente, paquete o dispensador junto con instrucciones para la administración.

Usos de diagnóstico y prognosis

Las moléculas de ácidos nucleicos, las proteínas, los homólogos de proteínas y los anticuerpos descritos en la presente pueden utilizarse en uno o más de los siguientes métodos: ensayos de diagnóstico, ensayos de prognosis, ensayos clínicos de control, y farmacogenética; y en selección de fármacos y métodos de tratamiento (por ejemplo, terapeúticos y profilácticos), como se describe a continuación en la presente.

La invención proporciona ensayos de diagnóstico y de prognosis para detectar a miembros de la famlia THAP, como se describe a continuación. También se proporcionan ensayos de diagnóstico y de prognosis para detectar las interacciones entre miembros de la familia THAP y moléculas diana de la familia THAP. En un ejemplo preferido, un miembro de la familia THAP es THAP1, THAP2 o THAP3, y la diana de la familia THAP es PAR4 o una proteína de PML-NB.

La invención también proporciona ensayos de diagnóstico y de prognosis para detectar la localización de THAP1 y/o PAR4 o su asociación con PML-NB, o su asociación o unión con una proteína asociada a PML-NB, como daxx, sp100, sp140, p53, pRB, CBP, BLM o SUMO-1. En un método preferido, la invención proporciona la detección de la localización de PAR4 o su asociación con PML-NB. En otro aspecto, la invención proporciona la detección de una actividad de unión de un ácido nucleico de la familia THAP.

Las moléculas de ácidos nucleicos aisladas de la invención pueden utilizarse, por ejemplo, para detectar un ARNm de un polipéptido de la familia THAP (por ejemplo, en una muestra biológica) o una alteración genética en un gen de la familia THAP, y para modular una actividad de un polipéptido de la familia THAP, como se describe a continuación. Las proteínas de la familia THAP pueden utilizarse para tratar trastornos caracterizados por una producción insuficiente o excesiva de una proteína de la familia THAP o de moléculas diana de la familia THAP. Además, las proteínas de la familia THAP pueden utilizarse para seleccionar moléculas diana de la familia THAP naturales, para seleccionar fármacos o compuestos que modulan, preferiblemente inhiben una actividad de la familia THAP, así como para tratar trastornos caracterizados por una producción insuficiente o excesiva de una proteína de la familia THAP o la producción de formas de la proteína de la familia THAP que tienen una actividad menor o aberrante comparadas con la proteína de la familia THAP de tipo salvaje. Además, pueden utilizarse anticuerpos anti-familia THAP para detectar y aislar proteínas de la familia THAP, para regular la biodisponibilidad de proteínas de la familia THAP, y para modular una actividad de la familia THAP.

Por consiguiente, una realización de la presente invención implica un método para utilizar (por ejemplo, un ensayo de diagnóstico, un ensayo de prognosis, o un método de tratamiento profiláctico/terapéutico) en el que una molécula de la presente invención (por ejemplo, una proteína de la familia THAP, un ácido nucleico de la familia THAP, o más preferiblemente un inhibidor o activador de la familia THAP) se emplea, por ejemplo, para diagnosticar, realizar una prognosis y/o tratar una enfermedad y/o trastorno en el que está indicada cualquiera de las actividades de la familia THAP mencionadas anteriormente. En otra realización, la presente invención implica un método de uso (por ejemplo, un ensayo de diagnóstico, un ensayo de prognosis, o un método de tratamiento profiláctico/terapéutico), en el que una molécula de la presente invención (por ejemplo, una proteína de la familia THAP, un ácido nucleico de la familia THAP, o un inhibidor o activador de la familia THAP) se emplea, por ejemplo, para el diagnóstico, la prognosis y/o el tratamiento de sujetos, preferiblemente un sujeto humano, en el que cualquiera de las actividad mencionadas anteriormente está patológicamente perturbada. En una realización preferida, los métodos de uso (por ejemplo, un ensayo de diagnóstico, un ensayo de prognosis, o un método de tratamiento profiláctico/terapéutico) implican administrar a un sujeto, preferiblemente un sujeto humano, una molécula de la presente invención (por ejemplo, una proteína de la familia THAP, un ácido nucleico de la familia THAP, o un inhibidor o activador de la familia THAP) para el diagnóstico, la prognosis y/o el tratamiento terapéutico. En otra realización, los métodos de uso (por ejemplo, un ensayo de diagnóstico, un ensayo de prognosis, o un método de tratamiento profiláctico/terapéutico) implican administrar a un sujeto humano una molécula de la presente invención (por ejemplo, una proteína de la familia THAP, un ácido nucleico de la familia THAP, o un inhibidor o activador de la familia THAP),

Por ejemplo, la invención incluye un método para determinar si un miembro de la familia THAP se expresa en una muestra biológica, que comprende: a) poner en contacto dicha muestra biológica con: ii) un polinucleótido que se hibrida bajo condiciones rigurosas con un ácido nucleico de la familia THAP; o iii) un polipéptido detectable (por ejemplo, un anticuerpo) que se une selectivamente con un polipéptido de la familia THAP; y b) detectar la presencia o la ausencia de hibridación entre dicho polinucleótido y una especie de ARN dentro de dicha muestra, o la presencia o la ausencia de unión de dicho polipéptido detectable con un polipéptido dentro de dicha muestra. Una detección de dicha hibridación o de dicha unión indica que dicho miembro de la familia THAP se expresa dentro de dicha muestra. Preferiblemente, el polinucleótido es una sonda, y en el método dicha hibridación se detecta detectando la presencia de un producto de la amplificación que comprende dicha secuencia de cebador, o el polipéptido detectable es un anticuerpo.

También se incluye un método para determinar si un mamífero, preferiblemente un ser humano, tiene un nivel elevado o reducido de expresión de un miembro de la familia THAP, que comprende: a) proporcionar una muestra biológica de dicho mamífero; y b) comparar la cantidad de un polipéptido de la familia THAP o de una especie de ARN de la familia THAP que codifica un polipéptido de la familia THAP dentro de dicha muestra biológica con un nivel detectado o esperado en una muestra control. Una mayor cantidad de dicho polipéptido de la familia THAP o de dicha especie de ARN de la familia THAP dentro de dicha muestra biológica, comparado con dicho nivel detectado o esperado en dicha muestra control, indica que dicho mamífero tiene un nivel elevado de expresión de la familia THAP, y una menor cantidad de dicho polipéptido de la familia THAP o de dicha especie de ARN de la familia THAP dentro de dicha muestra biológica, comparado con dicho nivel detectado o esperado en dicha muestra control, indica que dicho mamífero tiene un nivel reducido de expresión de un miembro de la familia THAP.

La presente invención también se refiere al campo de la medicina predictiva en que se emplean ensayos de diagnóstico, de prognosis y ensayos clínicos de control para fines de prognosis (predictivos) para así tratar a un individuo de forma profiláctica. Por consiguiente, un aspecto de la presente invención se refiere a ensayos de diagnóstico para determinar la proteína de la familia THAP y/o la expresión de un ácido nucleico, así como una actividad de la familia THAP, en el contexto de una muestra biológica (por ejemplo, sangre, suero, células, tejido) para así determinar si un individuo está afectado de una enfermedad o trastorno, o está en riesgo de desarrollar un trastorno, asociado con la expresión o la actividad aberrante de la familia THAP. La invención también proporciona ensayos de prognosis (o predictivos) para determinar si un individuo está en riesgo de desarrollar un trastorno asociado con una actividad, con la expresión de un ácido nucleico o con una proteína de la familia THAP. Por ejemplo, pueden ensayarse mutaciones en el gen de la familia THAP en una muestra biológica. Estos ensayos pueden utilizarse para objetivos de prognosis o predictivos para así tratar de forma profiláctica a un individuo antes de la aparición de un trastorno caracterizado o asociado con una actividad, con la expresión de un ácido nucleico o con una proteína de la familia THAP.

Por consiguiente, los métodos de la presente invención pueden aplicarse en general a enfermedades relacionadas con la regulación de la apoptosis incluyendo, pero sin limitarse a trastornos caracterizados por una proliferación no deseada de células o en general un control aberrante de la diferenciación, por ejemplo trastornos neoplásicos o hiperplásicos, así como trastornos relacionados con la proliferación o la falta de proliferación de células endoteliales, trastornos inflamatorios y trastornos neurodegenerativos.

Ensayos de diagnóstico

Un ejemplo de método para detectar la presencia (cuantitativa o no) o la ausencia de una proteína o un ácido nucleico de la familia THAP en una muestra biológica implica obtener una muestra biológica de un sujeto de ensayo y poner en contacto la muestra biológica con un compuesto o un agente capaz de detectar una proteína o un ácido nucleico de la familia THAP (por ejemplo, ARNm, ADN genómico) que codifica una proteína de la familia THAP de forma que la presencia de la proteína o el ácido nucleico de la familia THAP se detecta en la muestra biológica. Un agente preferido para detectar un ARNm o un ADN genómico de la familia THAP es una sonda de ácido nucleico marcada capaz de hibridarse con un ARNm o un ADN genómico de la familia THAP. La sonda de ácido nucleico puede ser, por ejemplo, un ácido nucleico de la familia THAP de longitud completa, como el ácido nucleico de SEQ ID NO:160, como un ácido nucleico de al menos 15, 30, 50, 100, 250, 400, 500 ó 1000 nucleótidos de longitud y suficiente para hibridarse de forma específica bajo condiciones rigurosas con un ARNm o un ADN genómico de la familia THAP o una porción de un ácido nucleico de la familia THAP. Otras sondas adecuadas para su uso en los ensayos de diagnóstico de la invención se describen en la presente.

En realizaciones preferidas, el método del caso se caracteriza porque comprende, en general, detectar, en una muestra de tejido del sujeto (por ejemplo, un paciente humano), la presencia o la ausencia de una lesión genética caracterizada por al menos uno de (i) una mutación de un gen que codifica una de las proteínas de la familia THAP del caso, o (ii) la expresión errónea de un gen de la familia THAP. Como ilustración, dichas lesiones genéticas pueden ser detectadas determinando la existencia de al menos uno de (i) una deleción de uno o más nucleótidos de un gen de la familia THAP, (ii) la adición de uno o más nucleótidos a dicho gen de la familia THAP, (iii) una sustitución de uno o más nucleótidos de un gen de la familia THAP, (iv) una redisposición cromosómica bruta o amplificación de un gen de la familia THAP, (v) una alteración bruta en el nivel de transcritos de ARN mensajero de un gen de la familia THAP, (vi) la modificación aberrante de un gen de la familia THAP, como del patrón de metilación del ADN genómico, (vii) la presencia de un patrón de ruptura de tipo no salvaje del transcrito de ARN mensajero de un gen de la familia THAP, y (viii) un nivel de tipo no salvaje de una proteína diana de la familia THAP.

Un agente preferido para detectar una proteína de la familia THAP es un anticuerpo capaz de unirse a una proteína de la familia THAP, preferiblemente un anticuerpo con un marcador detectable. Los anticuerpos pueden ser policlonales, o más preferiblemente monoclonales. Puede utilizarse un anticuerpo intacto, o su fragmento (por ejemplo, Fab o
F(ab')_{2}). El término "marcado", con respecto a la sonda o el anticuerpo, pretende incluir el marcaje directo de la sonda o del anticuerpo mediante acoplamiento (es decir, unión física) de una sustancia detectable a la sonda o el anticuerpo, así como el marcaje indirecto de la sonda o del anticuerpo mediante reactividad con otro reactivo que está directamente marcado. Los ejemplos de marcaje indirecto incluyen la detección de un anticuerpo primario utilizando un anticuerpo secundario marcado de modo fluorescente y una sonda de ADN de marcaje terminal con biotina, de manera que pueda detectarse con estreptavidina marcada de modo fluorescente. La expresión "muestra biológica" pretende incluir tejidos, células y fluidos biológicos aislados a partir de un sujeto, así como tejidos, células y fluidos presentes dentro de un sujeto. Es decir, el método de detección de la invención puede utilizarse para detectar un ADN genómico, una proteína o un ARNm de la familia THAP en una muestra biológica in vitro, así como in vivo. Por ejemplo, las técnicas in vitro para la detección de un ARNm de la familia THAP incluyen hibridaciones Northern e hibridaciones in situ. Las técnicas in vitro para la detección de una proteína de la familia THAP incluyen ensayos inmunoabsorbentes de enzimas ligados (ELISA), transferencias Western, inmunoprecipitaciones e inmunofluorescencia. Las técnicas in vitro para la detección de un ADN de la familia THAP incluyen hibridaciones Southern. Además, las técnicas in vivo para la detección de una proteína de la familia THAP incluyen introducir en un sujeto un anticuerpo anti-familia THAP marcado. Por ejemplo, el anticuerpo puede estar marcado con un marcador radiactivo cuya presencia y localización en un sujeto puede detectarse mediante técnicas de formación de imágenes
convencionales.

En otro ejemplo de realización, pueden detectarse patrones de metilación aberrantes de un gen de la familia THAP digiriendo el ADN genómico de una muestra de un paciente con una o más endonucleasas de restricción que son sensibles a la metilación y para las cuales existen sitios de reconocimiento en el gen de la familia THAP (incluyendo las secuencias flanqueantes e intrónicas). Véase, por ejemplo, Buiting et al. (1994), Human Mol. Genet., 3:893-895. El ADN digerido se separa mediante electroforesis en gel y se hibrida con sondas derivadas, por ejemplo, de secuencias genómicas o de ADNc. El estado de metilación del gen de la familia THAP puede determinarse mediante la comparación del patrón de restricción generado de una muestra de ADN con el de un patrón de metilación
conocida.

Además, pueden utilizarse construcciones génicas como las descritas en la presente para ensayos de diagnóstico para determinar si el crecimiento o el estado de diferenciación celular ya no depende de la función reguladora de una proteína de la familia THAP, por ejemplo, para determinar el fenotipo de una célula transformada. Este conocimiento puede tener beneficios de prognosis y terapéuticos. Como ilustración, puede obtenerse una muestra de células procedentes del tejido de un paciente y dispersarse en un medio de cultivo celular apropiado, se puede provocar que una porción de las células en la muestra exprese una proteína de la familia THAP recombinante o una proteína diana de la familia THAP, por ejemplo mediante transfección con un vector de expresión descrito en la presente, o que aumente la expresión o la actividad de una proteína de la familia THAP endógena o una proteína diana de la familia THAP, y se evalúa el posterior crecimiento de las células. La ausencia de un cambio en el fenotipo de las células a pesar de la expresión de la proteína de la familia THAP o de la proteína diana de la familia THAP puede ser indicativa de una carencia de dependencia de las vías reguladoras celulares que incluyen a la proteína de la familia THAP o a la proteína diana de la familia THAP, por ejemplo la transcripción mediada por la familia THAP o por una diana de la familia THAP. Dependiendo de la naturaleza del tejido de interés, la muestra puede estar en forma de células aisladas, por ejemplo, a partir de una muestra de sangre, una muestra de células exfoliadas, una muestra aspirada con una aguja fina, o una muestra de tejido de biopsia. Cuando la muestra inicial es una masa sólida, la muestra de tejido puede triturarse o dispersarse de otra forma de manera que las células pueden cultivarse, como se conoce en la técnica.

En otra realización, se proporciona un ensayo de diagnóstico que detecta la capacidad de un producto de un gen de la familia THAP, por ejemplo aislado de una célula de biopsia, para unirse a otras proteínas celulares. Por ejemplo, sería deseable detectar mutantes de la familia THAP que, aunque se expresen a niveles apreciables en la células, sean defectuosos cuando se unen a una proteína diana de la familia THAP (que tiene una afinidad de unión disminuida o aumentada). Estos mutantes pueden surgir, por ejemplo, de mutaciones, por ejemplo mutaciones puntuales, que puede resultar poco factible detectar mediante las técnicas de secuenciación de ADN de diagnóstico o mediante los inmunoensayos descritos anteriormente. Por consiguiente, la presente invención contempla también ensayos de selección de diagnóstico que comprenden, en general, clonar uno o más genes de la familia THAP a partir de células de muestra, y expresar los genes clonados bajo condiciones que permiten la detección de una interacción entre el producto del gen recombinante y una proteína diana, por ejemplo el gen THAP1 y una proteína PAR4 diana o una proteína de PML-NB. Como será evidente a partir de la descripción de los diversos ensayos de selección de fármacos que aparecen a continuación, puede utilizarse una amplia gama de técnicas para determinar la capacidad de una proteína de la familia THAP para unirse a otros componentes celulares. Estas técnicas pueden emplearse para detectar mutaciones en un gen de la familia THAP que produzcan proteínas mutantes con una mayor o menor afinidad de unión con una proteína diana de la familia THAP, con relación a la familia THAP de tipo salvaje. A la inversa, decidiendo cuál de la proteína diana de la familia THAP y la proteína de la familia THAP es el "cebo" y cuál se deriva de la muestra del paciente, el ensayo del caso también puede utilizarse para detectar mutantes de la proteína diana de la familia THAP que tienen una mayor o menor afinidad de unión por una proteína de la familia THAP con relación a una forma de tipo salvaje de la proteína diana de la familia THAP.

En un ejemplo de realización, puede proporcionarse una proteína PAR4 o de PML-NB (por ejemplo, de tipo salvaje) como una proteína inmovilizada (una "diana"), como mediante el uso de proteínas de fusión de GST y placas de microvaloración tratadas con glutatión. Un gen THAP1 (un gen de "muestra") se amplifica a partir de células de una muestra de un paciente, por ejemplo mediante PCR, se acopla en un vector de expresión, y se transforma en una célula hospedante apropiada. La proteína THAP1 producida de modo recombinante entonces se pone en contacto con la proteína PAR4 o PML-NB inmovilizada, por ejemplo como un lisado o una preparación semipurificada, el complejo se lava, y la cantidad de complejo de proteína PAR4 o PML-NB/THAP1 se determina y se compara con un nivel de complejo de tipo salvaje formado en un control. La detección puede realizarse, por ejemplo, mediante un inmunoensayo utilizando anticuerpos contra la forma de tipo salvaje de la proteína THAP1, o en virtud de un marcador proporcionado clonando la muestra del gen THAP1 en un vector que proporciona la proteína como una proteína de fusión que incluye un marcador detectable. Por ejemplo, puede proporcionarse un epitopo myc como parte de una proteína de fusión con la muestra del gen THAP1. Estas proteínas de fusión, además de proporcionar un marcador detectable, también pueden permitir la purificación de la proteína THAP1 de la muestra de lisado antes de la aplicación a la diana inmovilizada. En otra realización del ensayo de selección del caso, puede utilizarse el ensayo de dos híbridos, descrito en los ejemplos adjuntos, para detectar mutaciones en un gen de la familia THAP o en un gen diana de la familia THAP que alteren la formación de complejos entre estas dos proteínas.

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Por consiguiente, la presente invención proporciona un método conveniente para detectar mutantes de los genes de la familia THAP que codifican proteínas que son incapaces de interaccionar físicamente con una proteína "cebo" diana de la familia THAP, basándose dicho método en la detección de la reconstitución de un activador transcripcional de una forma dependiente de la familia THAP/diana de la familia THAP.

En una realización, la muestra biológica contiene moléculas de proteínas de un sujeto de ensayo. Como alternativa, la muestra biológica puede contener moléculas de ARNm del sujeto de ensayo o moléculas de ADN genómico del sujeto de ensayo. Una muestra biológica preferida es una muestra de suero aislada mediante medios convencionales de un sujeto. En otra realización, los métodos implican además obtener una muestra biológica control procedente de un sujeto control, poner en contacto la muestra control con un compuesto o agente capaz de detectar una proteína, un ARNm o un ADN genómico de la familia THAP, de forma que la presencia de una proteína, un ARNm o un ADN genómico de la familia THAP es detectada en la muestra biológica, y comparar la presencia de una proteína, un ARNm o un ADN genómico de la familia THAP en la muestra control con la presencia de una proteína, un ARNm o un ADN genómico de la familia THAP en la muestra de ensayo. La invención también incluye kits para detectar la presencia de una proteína, un ARNm o un ADN genómico de la familia THAP en una muestra biológica. Por ejemplo, el kit puede comprender un compuesto o agente marcado capaz de detectar proteína, un ARNm o un ADN genómico de la familia THAP en una muestra biológica; un medio para determinar la cantidad de un miembro de la familia THAP en la muestra; y un medio para comparar la cantidad del miembro de la familia THAP en la muestra con un patrón. El compuesto o el agente pueden estar envasados en un recipiente adecuado. El kit también puede comprender instrucciones para utilizar el kit para detectar una proteína o un ácido nucleico de la familia THAP.

En ciertas realizaciones, la detección implica el uso de una sonda/cebador en una reacción en cadena de polimerasa (PCR) (véase, por ejemplo, las patentes de EEUU nº 4.683.195 y 4.683.203), como PCR de anclaje o RACE PCR o, como alternativa, en una reacción en cadena de acoplamiento (LCR) (véase, por ejemplo, Landegren et al. (1988), Science, 241:1077-1080; y Nakazawa et al. (1994), PNAS, 91:360-364), siendo esta última particularmente útil para detectar mutaciones puntuales en el gen de la familia THAP (véase Abravaya et al. (1995), Nucleic Acids Res., 23:675-682). Este método puede incluir las etapas de recoger una muestra de células de un paciente, aislar el ácido nucleico (por ejemplo, genómico, ARNm o ambos) de las células en la muestra, poner en contacto la muestra de ácido nucleico con uno o más cebadores que se hibridan de forma específica con un gen de la familia THAP bajo condiciones que hacen que se produzca la hibridación y la amplificación del gen de la familia THAP (si está presente), y detectar la presencia o la ausencia de un producto de la amplificación, o detectar el tamaño del producto de la amplificación y comparar la longitud con una muestra control. Se anticipa que puede ser deseable utilizar la PCR y/o la LCR como etapa de amplificación preliminar junto con una cualquiera de las técnicas utilizadas para detectar mutaciones descritas en la presente.

Los ensayos de genotipificación para el diagnóstico en general requieren la amplificación previa de la región del ADN que porta el marcador bialélico de interés. Sin embargo, también están disponibles métodos de detección ultrasensible que no requieren amplificación. Los métodos conocidos por los expertos en la técnica que pueden utilizarse para detectar polimorfismos bialélicos incluyen métodos como análisis de transferencia por puntos convencionales, análisis de polimorfismos conformacionales monocatenarios (SSCP) descritos por Orita et al., PNAS, 86:2766-2770 (1989), eletroforesis en gradiente de gel desnaturalizante (DGGE), análisis de heterodúplex, detección de ruptura de desapareamiento, y otras técnicas convencionales como se describe en Sheffield et al. (1991), White et al. (1992), y Grompe et al. (1989 y 1993) (Sheffield, V.C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 49:699-706 (1991); White, M.B. et al., Genomics, 12:301-306 (1992); Grompe, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:5855-5892 (1989); y Grompe, M., Nature Genetics, 5:111-117 (1993)). Otro método para determinar la identidad del nucleótido presente en un sitio polimórfico particular emplea un derivado nucleotídico resistente a exonucleasa especializado como se describe en la patente de EEUU 4.656.127. A continuación se describen otros métodos.

El nucleótido presente en un sitio polimórfico puede determinarse mediante métodos de secuenciación. En una realización preferida, las muestras de ADN se someten a una amplificación de PCR antes de la secuenciación, como se describió anteriormente. Los métodos de secuenciación de ADN se describen en "Sequencing Of Amplified Genomic DNA And Identification Of Single Nucleotide Polymorphisms". Preferiblemente, el ADN amplificado se somete a unas reacciones de secuenciación con terminadores de didesoxi automáticas utilizando un protocolo de secuenciación de ciclo de tinte-cebador. El análisis de la secuencia permite la identificación de la base presente en el sitio del marcador bialélico.

En los métodos de microsecuenciación, el nucleótido en el sitio polimórfico en el ADN diana se detecta mediante una reacción de extensión de cebador de un único nucleótido. Este método implica cebadores de microsecuenciación apropiados que se hibridan justo cadena arriba de la base polimórfica de interés en el ácido nucleico diana. Se emplea una polimerasa para extender específicamente el extremo 3' del cebador con un único ddNTP (terminador de cadena) complementario con el nucleótido en el sitio polimórfico. Después se determina la identidad del nucleótido incorporado mediante cualquier forma adecuada. De forma típica, las reacciones de microsecuenciación se realizan utilizando ddNTP fluorescentes, y los cebadores de microsecuenciación extendidos se analizan mediante electroforesis sobre máquinas de secuenciación ABI 377 para determinar la identidad del nucleótido incorporado como se describe en el documento EP 412883. Como alternativa, puede utilizarse la electroforesis capilar para procesar un número mayor de ensayos de manera simultánea. Pueden emplearse diferentes estrategias para el marcaje y la detección de ddNTP. Se ha descrito un método de detección en fase homogénea basado en la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia en Chen y Kwok (1997),y Chen y Kwok (Nucleic Acids Research, 25:347-353 1997), y Chen et al. (Proc. Natl. Acad Sci. USA, 94/20, 10756-10761,1997). En este método, fragmentos de ADN genómico amplificados que contienen sitios polimórficos se incuban con un cebador marcado con 5'-fluoresceína en presencia de didesoxirribonucleósidos trifosfato marcados con un tinte alélico y una Taq polimerasa modificada. El cebador marcado con tinte se extiende una base con el terminador-tinte específico para el alelo presente en el molde. Al final de la reacción de genotipificación, se analizan las intensidades de fluorescencia de los dos tintes en la mezcla de reacción directamente sin separación ni purificación. Todas estas etapas pueden realizarse en el mismo tubo y los cambios en la fluorescencia pueden controlarse a tiempo real. Como alternativa, el cebador extendido puede analizarse mediante espectrometría de masas MALDI-TOFF. La base en el sitio polimórfico se identifica mediante la masa añadida al cebadro de microsecuenciación (véase Haff y Smirnov, 1997, Genome Research, 7:378-388, 1997). En otro ejemplo, Pastinen et al. (Genome Research, 7:606-614, 1997)) describen un método para la detección múltiplex de polimorfismos de un único nucleótido en el que se aplica el principio de microsecuenciación en fase sólida a un formato de matriz de oligonucleótidos. A continuación se describen matrices de alta densidad de sondas de ADN unidas a un soporte sólido (chips de ADN).

Otros ensayos incluyen ensayos de detección de desapareamientos, basados en la especificidad de polimerasas y ligasas. Las reacciones de polimerización implican requisitos particularmente rigurosos para el correcto apareamiento de las bases en el extremo 3' del cebador de amplificación, y la unión de dos oligonucleótidos hibridados con una secuencia de ADN diana es bastante sensible a los desapareamientos cercanos al sitio de acoplamiento, especialmente al extremo 3'.

Un método preferido para determinar la identidad del nucleótido presente en un alelo implica la hibridación de ácidos nucleicos. Puede utilizarse cualquier ensayo de hibridación que incluyen hibridación Southern, hibridación Northern, hibridación de transferencia por puntos e hibridación en fase sólida (véase, Sambrook, et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2ª, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y., 1989)). La hibridación se refiere a la formación de una estructura en dúplex por dos ácidos nucleicos monocatenarios debido al apareamiento de bases complementarias. La hibridación puede producirse entre cadenas de ácidos nucleicos exactamente complementarias o entre cadenas de ácidos nucleicos que contienen pequeñas regiones de desapareamiento. Pueden diseñarse sondas específicas que se hibridan con una forma de un marcador bialélico y no con la otra y, por tanto, son capaces de discriminar entre diferentes formas alélicas. Las sondas específicas de alelos a menudo se utilizan en parejas, mostrando un miembro de la pareja un apareamiento perfecto con una secuencia diana que contiene el alelo original, y mostrando el otro un apareamiento perfecto con la secuencia diana que contiene el alelo alternativo. Las condiciones de hibridación deberían ser suficientemente rigurosas para que exista una diferencia significativa en la intensidad de hibridación entre los alelos, y preferiblemente una respuesta esencialmente binaria, por lo cual una sonda se hibrida sólo con uno de los alelos. Las condiciones de hibridación rigurosas y específicas de secuencia, bajo las cuales una sonda se hibrida sólo con la secuencia diana exactamente complementaria son muy conocidas en la técnica (Sambrook et al., 1989). La detección de los dúplex híbridos puede realizarse mediante una serie de métodos. Diversos formatos de ensayo de detección son muy conocidos y utilizan marcadores detectables unidos a la diana o a la sonda para permitir la detección de los dúplex híbridos. De forma típica, los dúplex de hibridación se separan de los ácidos nucleicos no hibridados y entonces se detectan los marcadores unidos a los dúplex. Además, los formatos de ensayo heterogéneos convencionales son adecuados para detectar los híbridos utilizando los marcadores presentes en los cebadores y las sondas (véase Landegren U. et al., Genome Research, 8:769-776,1998).

Los ensayos de hibridación basados en matrices de oligonucleótidos se basan en las diferencias en la estabilidad de hibridación de oligonucleótidos cortos con variantes de la secuencia diana perfectamente apareados y desapareados. El acceso eficaz a la información del polimorfismo se obtiene mediante una estructura básica que comprende matrices de alta densidad de sondas oligonucleotídicas unidas a un soporte sólido (por ejemplo, el chip) en posiciones seleccionadas. Pueden producirse chips de diversos formatos para su uso en la detección de polimorfismos bialélicos personalizados mediante Affymetrix (GeneChip), Hyseq (HyChip and HyGnostics), y Protogene Laboratories.

En general, estos métodos emplean matrices de sondas oligonucleotídicas que son complementarias con segmentos de la secuencia del ácido nucleico diana de un individuo cuyas secuencias diana incluyen un marcador polimórfico. El documento EP 785280 describe una estrategia de embaldosado para la detección de polimorfismos de un único nucleótido. Brevemente, las matrices en general pueden "embaldosarse" para un gran número de polimorfismos específicos, lo que se describe también en la solicitud PCT nº WO 95/11995. Tras finalizar la hibridación con la secuencia diana y lavar la matriz, la matriz se somete a un barrido para determinar la posición sobre la matriz a la cual se hibrida la secuencia diana. Los datos de la hibridación de la matriz barrida entonces se analizan para identificar qué alelo o alelos del marcador bialélico están presentes en la muestra. La hibridación y el barrido pueden realizarse como se describe en la solicitud PCT nº WO 92/10092 y WO 95/11995 y patente de EEUU nº 5.424.186. Los soportes sólidos y los polinucleótidos de la presente invención unidos a soportes sólidos se describen también en "Sondas y cebadores oligonucleotídicos".

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Ejemplos Ejemplo 1 Aislamiento del ADNc de THAP1 en una selección de dos híbridos con la quimioquina SLC/CCL21

En un esfuerzo para definir la función de las nuevas proteínas de HEVEC y las vías celulares implicadas, los inventores utilizaron diferentes cebos para seleccionar un banco de ADNc de dos híbridos generado a partir de células endoteliales HEV humanas microvasculares (HEVEC). Las HEVEC se purificaron a partir de amígdalas humanas mediante una selección inmunomagnética con el anticuerpo monoclonal MECA-79 como se ha descrito previamente (Girard y Springer (1995), Immunity 2:113-123). El kit de construcción de un banco de ADNc de PCR SMART (Clontech, Palo Alto, CA, EEUU) se utilizó en primer lugar para generar ADNc de longitud completa a partir de 1 \mug de ARN total de HEVEC. El ADNc de HEVEC cebado con oligo-dT entonces se digirió con SfiI y se clonó direccionalmente en pGAD424-Sfi, un vector de dos híbridos generado insertando un conector SfiI (5'-GAATTCGGCCAT
TATGGCCTGCAGGATCCGGCCGCCTCGGCCCAGGATCC-3') (SEQ ID NO:181) entre los sitios de clonación EcoRI y BamHI de pGAD424 (Clontech). El banco de dos híbridos de ADNc de pGAD424-HEVEC resultante (tamaño medio del inserto > 1 kb, aproximadamente 3 x 10^{6} clones independientes) se amplificó en E. coli. Para identificar compañeros de proteínas potenciales de la quimioquina SLC/6Cquina, se realizó una selección del banco de ADNc de HEVEC de dos híbridos utilizando como cebo un ADNc que codifica la forma madura de la SLC/CCL21 humana (aminoácidos 24-134, GenBank nº de registro NP_002980, SEQ ID NO:182), se amplificó mediante PCR a partir de ARN de HEVEC con los cebadores hSLC.5' (5'-GCGGGATCCGTAGTGATGGAGGGGCTCAGGACTGTTG-3') (SEQ ID NO:183) y hSLC.3' (5'-GCGGGATCCCTATGGCCCTTTAGGGGTCTGTGACC-3') (SEQ ID NO:184), se digirió con BamHI y se insertó en el sitio de clonación BamHI del vector pGBT9 del sistema 2 de dos híbridos
MATCHMAKER (Clontech). Brevemente, el pGBT9-SLC se cotransformó con el banco de ADNc de pGAD424-HEVEC en la cepa de levadura Y190 (Clontech). Se seleccionaron 1,5 x 10^{7} transformantes de levadura y se seleccionaron las interacciones de proteínas positivas mediante auxotrofía de His. Las placas se incubaron a 30ºC durante 5 días. El ADN plasmídico se extrajo de las colonias positivas y se utilizó para verificar la especificidad de la interacción mediante una cotransformación en AH109 con pGBT9-SLC o los cebos control pGBT9, pGBT9-lamina. Se caracterizaron ocho clones independientes en esta selección de dos híbridos. Se descubrió que correspondían a un ADNc humano exclusivo que codifica una nueva proteína humana de 213 aminoácidos, denominada THAP1, que muestra una coincidencia del 93% con su ortólogo de ratón (figura 1A). Los únicos motivos perceptibles en la secuencia de proteína predicha de THAP1 fueron un dominio corto rico en prolina en la parte media, y una secuencia de localización nuclear consenso (NLS) en la parte carboxi terminal (figura 1B). Las búsquedas en bases de datos con la secuencia THAP1 no revelaron ninguna similitud significativa con proteínas previamente caracterizadas, con la excepción de los primeros 90 aminoácidos que pueden definir un nuevo motivo de proteína asociado con la apoptosis, denominado en lo sucesivo dominio THAP (véase la figura 1B, figuras 9A-9C, y figura 10).

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Ejemplo 2 Transferencia Northern

Para determinar la distribución tisular del ARNm de THAP1, se realizó un análisis de la transferencia Northern de 12 tejidos humanos diferentes (figura 2). Se hibridaron múltiples transferencias Northern de tejidos humanos
(CLONTECH) según las instrucciones del fabricante. La sonda era un producto de PCR que se corresponde con el ORF de THAP, marcado con ^{32}P con el sistema de marcaje Prime-a-Gene (PROMEGA). Se detectó una banda de ARNm de 2,2 kb en el cerebro, corazón, músculo esquelético, riñón, hígado y placenta. Además de la banda principal de 2,2 kb se detectaron bandas de peso molecular menor que es probableg que se correspondan con un corte y empalme alternativo o una poliadenilación del pre-ARNm de THAP1. La presencia de ARNm de THAP1 en muchos tejidos diferentes sugiere que la THAP1 tiene una distribución tisular amplia, aunque no ubicua, en el cuerpo humano.

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Ejemplo 3 Análisis de la localización subcelular de THAP1

Para analizar la localización subcelular de la proteína THAP1, el ADNc de THAP1 se condensó con la secuencia codificador de GFP (proteína fluorescente verde). La región codificadora de longitud completa de THAP1 se amplificó mediante PCR a partir de ADNc de HEVEC con los cebadores 2HMR10 (5'-CCGAATTCAGGATGGTG
CAGTCCTGCTCCGCCT-3') (SEQ ID NO:185) y 2HMR9 (5'-CGCGGATCCTGCTGGTACTTCAACTATTTCAAA
GTAGTC-3') (SEQ ID NO:186), se digirió con EcoRI y BamHI, y se clonó dentro del marco cadena abajo del ORF de la proteína fluorescente verde potenciada (EGFP) en el vector pEGFP.C2 (Clontech) para generar pEGFP.C2-THAP1. La construcción de expresión GFP/THAP1 entonces se transfectó en células endoteliales primarias humanas de la vena umbilical (HUVEC, PromoCell, Heidelberg, Alemania). Las HUVEC se cultivaron en medio ECGM completo (PromoCell, Heidelberg, Alemania), se cultivaron en cubreobjetos y se transfectaron de modo transitorio en medio RPMI utilizando el reactivo de transfección GeneJammer según las instrucciones del fabricante (Stratagene, La Jolla, CA, EEUU). Un análisis mediante microscopía de fluorescencia 24 h después reveló que la proteína de fusión GFP/THAP1 se localiza exclusivamente en el núcleo con una distribución difusa y una acumulación en motas, mientras que la GFP sola muestra sólo una tinción difusa a través de toda la célula. Para investigar la identidad de los dominios con forma de mota con los que se asocia GFP/THAP1, los inventores utilizaron la microscopía de inmunofluorescencia indirecta para estudiar la posible localización de las motas nucleares que contenían GFP/THAP1 con dominios nucleares conocidos (factorías de replicación, centros de corte y empalme, cuerpos nucleares).

Las células transfectadas con las construcciones de expresión marcadas con GFP se dejaron crecer durante 24 h a 48 h en cubreobjetos. Las células se lavaron dos veces con PBS, se fijaron durante 15 min a temperatura ambiente en PBS que contenía formaldehído al 3,7% y se lavaron de nuevo con PBS antes de la neutralización con NH_{4}Cl 50 mM en PBS durante 5 min a temperatura ambiente. Tras otro lavado con PBS, las células se permeabilizaron durante 5 min a temperatura ambiente en PBS que contenía Triton-X100 al 0,1% y se lavaron de nuevo con PBS. Las células permeabilizadas entonces se bloquearon con PBS-BSA (PBS con albúmina de suero bovina al 1%) durante 10 min y después se incubaron durante 2 h a temperatura ambiente con los siguientes anticuerpos primarios diluidos en PBS-BSA: anticuerpos policlonales de conejo contra Daxx humana (1/50, M-112, Santa Cruz Biotechnology) o anticuerpos monoclonales de ratón anti-PML (IgG1 de ratón, 1/30, mAb PG-M3 de Dako, Glostrup, Dinamarca). Las células se lavaron tres veces durante 5 min a temperatura ambiente en PBS-BSA y se incubaron durante 1 h con anticuerpos secundarios de IgG anti-conejo o anti-ratón de cabra conjugados con Cy3 (fluorescencia roja) (1/1000, Amersham Pharmacia Biotech), diluidos en PBS-BSA. Después de un lavado extenso en PBS, las muestras se secaron al aire y se montaron en Mowiol. Las imágenes se registraron en un microscopio de barrido de láser confocal Leica. Las señales de fluorescencia de GFP (verde) y Cy3 (roja) se registraron de modo secuencial para idénticos campos de imagen para evitar las réplicas entre los canales.

Este análisis reveló que la tinción con GFP-THAP1 muestra un solapamiento completo con el patrón de tinción obtenido con anticuerpos dirigidos contra PML. La colocalización de GFP/THAP1 y PML se observó en núcleos con pocos PML-NB (menos de diez) y en núcleos con un gran número de PML-NB. Se realizó una tinción de inmunofluorescencia indirecta con anticuerpos dirigidos contra Daxx, otro componente bien caracterizado de los PML-NB, para confirmar la asociación de GFP/THAP1 con los PML-NB. Los inventores descubrieron una colocalización completa de GFP/THAP1 y Daxx en los PML-NB. Juntos, estos resultados revelan que la THAP1 es una nueva proteína asociada a los PML-NB.

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Ejemplo 4 Identificación de proteínas que interaccionan con THAP1 en HEVEC humanas: ensayo de dos híbridos La THAP1 forma un complejo con la proteína proapoptótica PAR4

Para identificar compañeros de proteína potenciales de THAP1, se realizó una selección en un banco de ADNc de HEVEC de dos híbridos utilizando como cebo el ADNc de longitud completa de THAP1 humana insertado en el vector pGBKT7 del sistema 3 de dos híbridos MATCHMAKER (Clontech). Brevemente, la región codificadora de longitud completa de THAP1 se amplificó mediante PCR a partir de ADNc de HEVEC con los cebadores 2HMR10 (5'-CC
GAATTCAGGATGGTGCAGTCCTGCTCCGCCT-3') (SEQ ID NO:187) y 2HMR9 (5'-CGCGGATCCTGCTGG
TACTTCAACTATTTCAAAGTAGTC-3') (SEQ ID NO:188), se digirió con EcoRI y BamHI, y se clonó dentro del marco cadena abajo del dominio de unión de Gal4 (Gal4-BD) en el vector pGBKT7 para generar pGBKT7-THAP1. El pGBKT7-THAP1 entonces se cotransfectó con el banco de ADNc de pGAD424-HEVEC en la cepa de levadura AH109 (Clontech). Se seleccionaron 1,5 x 10^{7} transformantes de levadro y se seleccionaron las interacciones de proteína positiva mediante doble auxotrofía de His y Ade según las instrucciones del fabricante (sistema 3 de dos híbridos MATCHMAKER, Clontech). Las placas se incubaron a 30ºC durante 5 días. El ADN plasmídico se extrajo de estas colonias positivas y se usó para verificar la especificidad de la interacción mediante cotransformación en AH109 con pGBKT7-THAP1 o los cebos control pGBKT7, pGBKT7-lamina y pGBKT7-hevina. Se obtuvieron tres clones que interaccionaban de modo específico con THAP1 en la selección; la secuenciación de estos clones reveló tres plásmidos del banco idénticos que se correspondían con un ADNc parcial que codifica los últimos 147 aminoácidos (posiciones 193-342) de la proteína proapoptótica humana PAR4 (figura 3A). Se confirmó la interacción positiva entre THAP1 y Par4 utilizando un cebo de Par4 de longitud completa (pGBKT-Par4) y una presa (pGADT7-Par4). La Par4 humana de longitud completa se amplificó mediante PCR a partir de ADNc de timo humano (Clontech), con los cebadores Par4.8 (5'-GCGGAATTCATGGCGACCGGTGGCTACCGGACC-3') (SEQ ID NO:189) y Par4.5 (5'-GCGGGATCCCTCTACCTGGTCAGCTGACCCACAAC-3') (SEQ ID NO:190), se digirió con EcoRI y BamHI, y se clonó en los vectores pGBKT7 y pGADT7 para generar pGBKT7-Par4 y pGADT7-Par4. Se confirmó la interacción positiva entre THAP1 y Par4 mediante una cotransformación de AH109 con pGBKT7-THAP1 y pGADT7-Par4 o pGBKT7-Par4 y pGADT7-THAP1, y se seleccionaron los transformantes mediante una dobles auxotrofía de His y Ade según las instrucciones del fabricante (sistema 3 de dos híbridos MATCHMAKER, Clontech). Para generar el pGADT7-THAP1, se amplificó la región codificadora de longitud completa de THAP1 a partir de ADNc de
HEVEC con los cebadores 2HMR10 (5'-CCGAATTCAGGATGGTGCAGTCCTGCTCCGCCT-3') (SEQ ID NO:191) y 2HMR9 (5'-CGCGGATCCTGCTGGTACTTCAACTATTTCAAAGTAGTC-3') (SEQ ID NO:192), se digirió con EcoRI y BamHI, y se clonó dentro del marco cadena abajo del dominio de activación de Gal-4 (Gal4-AD) en el vector de dos híbridos pGADT7 (Clontech).

Después los inventores estudiaron si el dominio de muerte/cremallera de leucina en el extremo C-terminal de Par4, que previamente había demostrado estar implicado en la unión de Par4 a WT-1 y aPKC, era necesario para la interacción entre THAP1 y Par4. Se construyeron dos mutantes de Par4 para este fin, Par4\Delta y Par4DD. El Par4\Delta carece del dominio de muerte/cremallera de leucina, mientras que Par4DD contiene este dominio. Se construyeron los pGBKT7-Par4\Delta (aminoácidos 1-276) y pGADT7-Par4\Delta subclonando un fragmento EcoRI-BgIII de pGADT7-Par4 en los sitios EcoRI y BamHI de pGBKT7 y pGADT7. El Par4DD (aminoácidos 250-342) se amplificó mediante PCR, utilizando pGBKT7-Par4 como molde, con los cebadores Par4.4 (5'-CGCGAATTCGCCATCATGGGGTTCCCTA
GATATAACAGGGATGCAA-3') (SEQ ID NO:193) y Par4.5, y se clonó en los sitios EcoRI y BamHI de pGBKT7 y pGADT7 para obtener pGBKT7-Par4DD y pGADT7-Par4DD. Se ensayó la interacción de dos híbridos entre los mutantes de THAP1 y Par4 mediante una cotransformación de AH109 con pGBKT7-THAP1 y pGADT7-Par4D o pGADT7-Par4DD, y se realizó una selección de los transformantes mediante auxotrofía doble de His y Ade según las instrucciones del fabricante (sistema 3 de dos híbridos MATCHMAKER, Clontech). Los inventores descubrieron que el dominio de muerte/cremallera de leucina de Par4 (Par4DD) no sólo es necesario sino que es suficiente para la interacción con THAP1 (figura 3A). Se obtuvieron resultados similares cuando se realizaron experimentos de dos híbridos en la orientación opuesta utilizando Par4 o mutantes de Par4 (Par4\Delta y Par4DD) como cebos en lugar de THAP1 (figura 3A).

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Ejemplo 5 Ensayo de interacción in vitro de THAP1/Par4

Para confirmar la interacción observada en levaduras, se realizaron ensayos en matriz sólida de GST in vitro. La Par4DD, expresada como una proteína de fusión marcada con GST e inmovilizada sobre glutatión-Sepharose, se incubó con THAP1 traducida in vitro radiomarcada. Para generar el vector de expresión de GST-Par4DD, se amplificó Par4DD (aminoácidos 250-342) mediante PCR con los cebadores Par4.10 (5'-GCCGGATCCGGGTTCCCTAGATA
TAACAGGGATGCAA-3') (SEQ ID NO:194) y Par4.5, y se clonó dentro del marco cadena abajo del ORF de la glutatión S-transferasa, en el sitio BamHI del vector de expresión procariota pGEX-2T (Amersham Pharmacia Biotech, Saclay, Francia). La proteína de fusión GST-Par4DD (aminoácidos 250-342) codificada por el plásmido pGEX-2T-Par4DD y la proteína GST control codificada por el plásmido pGEX-2T, entonces se expresaron en E. coli DH5\alpha y se purificaron mediante cromatografía de afinidad con glutatión-Sepharose según las instrucciones del fabricante (Amersham Pharmacia Biotech). Se determinó el rendimiento de las proteínas utilizadas en ensayos en matriz sólida de GST mediante una electroforesis en gel de poliarilamida-SDS (PAGE) y un análisis de la tinción con azul de Coomassie. Se generó la THAP1 traducida in vitro con el sistema de lisado de reticulocitos acoplado a TNT (Promega, Madison, WI, EEUU) utilizando el vector pGBKT7-THAP1 como molde. Se incubaron 25 \mul de THAP1 de tipo salvaje marcada con ^{35}S con proteína GST-Par4 o GST inmovilizadas durante la noche a 4ºC, en el siguiente tampón de unión: NaPO_{4} 10 mM, pH 8,0, NaCl 140 mM, MgCl_{2} 3 mM, dithiothreitol (DTT) 1 mM, NP40 al 0,05%, y fluoruro de fenilmetilsulfonilo 0,2 mM (PMSF), vanadato de Na 1 mM, \beta-glicerofosfato 50 mM, quimotripsina 25 \mug/ml, aprotinina 5 \mug/ml, leupeptina 10 \mug/ml. Las esferas entonces se lavaron 5 veces en 1 ml de tampón de unión. Las proteínas unidas se eluyeron con 2 X tapón de muestra de SDS-PAGE de Laemmli, se fraccionaron mediante SDS al 10%-PAGE y se visualizaron mediante fluorografía utilizando Amplify (Amersham Pharmacia Biotech). Tal como se esperaba, GST/Par4DD interacciona con THAP1 (figura 3B). Por contraste, la THAP1 no interaccionó con las esferas de GST.

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Ejemplo 6 Ensayo de interacción in vivo de THAP1/Par4

Para proporcionar aún más pruebas de la interacción fisiológica entre THAP1 y Par4 se investigaron las interacciones in vivo entre THAP1 y PAR4. Para este objetivo, se empleó la microscopía de inmunofluorescencia confocal para analizar la localización subcelular de Par4DD marcado con epitopos en células endoteliales humanas primarias cotransfectadas de forma transitoria con el vector de expresión eucariota pEF-mycPar4DD y los vectores de expresión de GFP o GFP-THAP1 (pEGFP.C2 y pEGFP.C2-THAP1, respectivamente). Para generar el pEF-mycPar4DD, se amplificó mycPar4DD (aminoácidos 250-342) mediante PCR utilizando pGBKT7-Par4DD como molde, con los cebadores myc.BD7 (5'-GCGCTCTAGAGCCATCATGGAGGAGCAGAAGCTGATC-3') (SEQ ID NO:195) y Par4.9 (5'-CTTGCGGCCGCCTCTACCTGGTCAGCTGACCCACAAC-3') (SEQ ID NO:196), y se clonó en los sitios XbaI y NotI del vector de expresión pEF-BOS (Mizushima y Nagata, Nucleic Acids Research, 18:5322, 1990). Se cultivaron células endoteliales humanas primarias de vena umbilical (HUVEC, PromoCell, Heidelberg, Alemania) en medio ECGM completo (PromoCell, Heidelberg, Alemania), se cultivaron en cubreobjetos y se transfectaron de modo transitorio en medio RPMI que utiliza un reactivo de transfección GeneJammer según las instrucciones del fabricante (Stratagene, La Jolla, CA, EEUU). Las células cotransfectadas con pEF-mycPar4DD y las construcciones de expresión marcadas con GFP se cultivaron durante 24 h a 48 h en cubreobjetos. Las células se lavaron dos veces con PBS, se fijaron durante 15 min a temperatura ambiente en PBS que contenía formaldehído al 3,7%, y se lavaron de nuevo con PBS antes de la neutralización con NH_{4}Cl 50 mM en PBS durante 5 min a temperatura ambiente. Tras otro lavado con PBS, las células se permeabilizaron durante 5 min a temperatura ambiente en PBS que contenía Triton-X100 al 0,1% y se lavaron de nuevo con PBS. Las células permeabilizadas entonces se bloquearon con PBS-BSA (PBS con albúmina de suero bovina al 1%) durante 10 min y después se incubaron durante 2 h a temperatura ambiente con anticuerpo monoclonal de ratón anti-epitopo myc (IgG1 de ratón, 1/200, Clontech) diluido en PBS-BSA. Las células se lavaron tres veces durante 5 min a temperatura ambiente en PBS-BSA y se incubaron durante 1 h con anticuerpos secundarios anti-ratón de cabra conjugados con Cy3 (fluorescencia roja) (1/1000, Amersham Pharmacia Biotech), diluidos en PBS-BSA. Después de un lavado extenso en PBS, las muestras se secaron al aire y se montaron en Mowiol. Las imágenes se registraron en un microscopio de barrido de láser confocal Leica. Las señales de fluorescencia de GFP (verde) y Cy3 (roja) se registraron de modo secuencial para idénticos campos de imagen para evitar las réplicas entre los canales.

En células transfectadas de modo transitorio con los vectores de expresión pEF-mycPar4DD y GFP, se descubrió que myc-Par4DD expresada ectópicamente se acumulaba en el citoplasma y en el núcleo de la mayoría de las células. Por contraste, la cotransfección transitoria de los vectores de expresión pEF-mycPar4DD y GFP-THAP1 desplaza en gran medida el myc-Par4DD desde una localización difusa citosólica y nuclear hasta una asociación preferente con los PML-NB. El efecto de GFP-THAP1 sobre la localización de myc-Par4DD es específico, puesto que no se observó con GFP-APS quinasa-1 (APSK-1), una enzima nuclear no relacionada con THAP1 ni con la apoptosis [Besset et al., FASEB J., 14:345-354, 2000]. Este último resultado demuestra que GFP-THAP1 recluta al myc-Par4DD hacia los PML-NB y proporciona pruebas in vivo de una interacción directa de THAP1 con la proteína proapoptótica Par4.

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Ejemplo 7 Identificación de un nuevo motivo de unión a Par4 rico en arginina

Para identificar las secuencias que median en la unión de THAP1 a Par4, se generó una serie de construcciones de deleción de THAP. Se amplificaron mutantes de deleción amino-terminales (THAP1-C1, -C2, -C3) y carboxi-terminales (THAP1-N1, -N2, -N3) (figura 4A) mediante PCR utilizando el plásmido pEGFP.C2-THAP1 como molde y los siguientes cebadores: 2HMR12 (5'-GCGGAATTCAAAGAAGATCTTCTGGAGCCACAGGAAC-3') (SEQ ID NO:197) y 2HMR9 (5'-CGCGGATCCTGCTGGTACTTCAACTATTTCAAAGTAGTC-3') (SEQ ID NO:198) para THAP1-C1 (aminoácidos 90-213); PAPM2 (5'-GCGGAATTCATGCCGCCTCTTCAGACCCCTGT
TAA-3') (SEQ ID NO:199) y 2HMR9 para THAP1-C2 (aminoácidos 120-213); PAPM3 (5'-GCGGAATTCATG
CACCAGCGGAAAAGGATTCATCAG-3') (SEQ ID NO:200) y 2HMR9 para THAP1-C3 (aminoácidos 143-213); 2HMR10 (5'-CCGAATTCAGGATGGTGCAGTCCTGCTCCGCCT-3') (SEQ ID NO:201) y 2HMR17 (5'-GCGG
GATGCCTTGTCATGTGGCTCAGTACAAAGAAATAT-3') (SEQ ID NO:202) para THAP1-N1 (aminoácidos 1-90); 2HMR10 y PAPN2 (5'-CGGGATCCTGTGCGGTCTTGAGCTTCTTTCTGAG-3') (SEQ ID NO:203) para
THAP1-N2 (aminoácidos 1-166); y 2HMR10 y PAPN3 (5'-GCGGGATCCGTCGTCTTTCTCTTTCTGGAAGTGA
AC-3') (SEQ ID NO:204) para THAP1-N3 (aminoácidos 1-192).

Los fragmentos de PCR obtenidos de esta manera se digirieron con EcoRI y BamHI, y se clonaron dentro del marco cadena abajo del dominio de unión de Gal4 (Ga14-BD) en el vector de dos híbridos pGBKT7 (Clontech) para generar pGBKT7-THAP1-C1, -C2, -C3, -N1, -N2 o -N3, o cadena abajo del ORF de la proteína fluorescente verde potenciada (EGFP) en el vector pEGFP.C2 (Clontech) para generar pEGFP.C2-THAP1-C1, -C2, -C3, -N1, -N2 o -N3.

Se ensayó la interacción de dos híbridos entre mutantes de THAP1 y Par4DD mediante la cotransformación de AH109 con pGBKT7-THAP1-C1, -C2, -C3, -N1, -N2 o -N3 y pGADT7-Par4DD, y se seleccionaron los transformantes mediante auxotrofía doble de His y Ade según las instrucciones del fabricante (sistema 3 de dos híbridos MATCHMAKER, Clontech). La interacción de dos híbridos positiva con Par4DD se observó con los mutantes THAP1-C1, -C2, -C3, y -N3 pero no con los mutantes THAP1-N1 y -N2, lo cual sugiere que el sitio de unión a Par4 está entre los restos 143 y 192 de THAP1.

También se ensayaron los mutantes de THAP1 en el ensayo de interacción de THAP1/Par4 in vitro. Se generaron mutantes de THAP1 traducidos in vitro con el sistema de lisado de reticulocitos acoplado a TNT (Promega, Madison, WI, EEUU) utilizando el vector pGBKT7-THAP1-C1, -C2, -C3, -N1, -N2 o -N3 como molde. Se incubaron 25 \mul de cada mutante de THAP1 marcado con ^{35}S con proteína GST-Par4 o GST inmovilizadas durante la noche a 4ºC, en el siguiente tampón de unión: NaPO_{4} 10 mM, pH 8,0, NaCl 140 mM, MgCl_{2} 3 mM, dithiothreitol (DTT) 1 mM, NP40 al 0,05%, y fluoruro de fenilmetilsulfonilo 0,2 mM (PMSF), vanadato de Na 1 mM, \beta-glicerofosfato 50 mM, quimotripsina 25 \mug/ml, aprotinina 5 \mug/ml, leupeptina 10 \mug/ml. Las esferas entonces se lavaron 5 veces en 1 ml de tampón de unión. Las proteínas unidas se eluyeron con 2 X tapón de muestra de SDS-PAGE de Laemmli, se fraccionaron mediante SDS al 10%-PAGE y se visualizaron mediante fluorografía utilizando Amplify (Amersham Pharmacia Biotech). Tal como se esperaba, THAP1-C1, -C2, -C3 y -N3 interaccionan con GST/Par4DD (figura 4B). Por contraste, THAP1-N1 y -N2 no interaccionan con las esferas de GST/Par4DD.

Por último, también se analizó la actividad de unión a Par4 de los mutantes de THAP1 mediante el ensayo de interacción de THAP1/Par4 in vivo como se describió en el ejemplo 6, utilizando los vectores de expresión pEF-mycPar4DD y pEGFP.C2-THAP1-C1, -C2, -C3, -N1, -N2 o -N3.

Se obtuvieron resultados fundamentalmente idénticos con los tres ensayos de interacción de THAP1/Par4 (figura 4A). Es decir, el sitio de unión a Par4 se encuentra entre los restos 143 y 192 de la THAP1 humana. La comparación de esta región con el dominio de unión a Par4 de la ZIP quinasa de ratón, otra proteína que interacciona con Par4, reveló la existencia de un motivo de secuencia rica en arginina conservada (SEQ ID NO:205, 263 y 15) que puede corresponder al sitio de unión a Par4 (figura 5a). Se generaron mutaciones en este motivo de secuencia rica en arginina mediante mutagénesis dirigida específica de sitio. Estos dos mutantes nuevos, THAP1 RR/AA (reemplazamiento de los restos R171A y R172A) y THAP1\DeltaQRCRR (deleción de los restos 168-172), se generaron mediante dos rondas sucesivas de PCR utilizando pEGFP.C2-THAP1 como molde, y los cebadores 2HMR10 y 2HMR9 junto con los cebadores RR:4A-1 (5'-CCGCACAGCAGCGATGCGCTGCTCAAGAACGGCAGCTTG-3') (SEQ ID NO:206) y RR/AA-2 (5'-CAAGCTGCCGTTCTTGAGCAGCGCATCGCTGCTGTGCGG-3') (SEQ ID NO:207) para el mutante THAP1 RR/AA, o los cebadores \DeltaRR-1 (5'-GCTCAAGACCGCACAGCAAGAACGGCAGCTTG-3') (SEQ ID NO:208) y \DeltaRR-2 (5'-CAAGCTGCCGTTCTTGCTGTGCGGTCTTGAGC-3') (SEQ ID NO:209) para el mutante THAP1\DeltaQRCRR. Los fragmentos de PCR resultantes se digirieron con EcoRI y BamHI, y se clonaron dentro del marco cadena abajo del dominio de unión a Gal4 (Gal4-BD) en el vector de dos híbridos pGBKT7 (Clontech) para generar pGBKT7-THAP1-RR/AA y -\Delta(QRCRR), o cadena abajo del ORF de la proteína fluorescente verde potenciada (EGFP) en el vector pEGFP.C2 (Clontech) para generar pEGFP.C2-THAP1-RR/AA y -\Delta(QRCRR). Los mutantes de THAP1 THAP1 RR/AA y THAP1\DeltaQRCRR entonces se ensayaron en los tres ensayos de interacción de THAP1/Par4 (ensayo de dos híbridos, ensayo de interacción de THAP1/Par4 in vitro, ensayo de interacción de THAP1/Par4 in vivo) como se describió anteriormente para los mutantes THAP1-C1,-C2, -C3, -N1, -N2 o -N3. Este análisis reveló que los dos mutantes eran deficientes para la interacción con Par4 en los tres ensayos (figura 5B), indicando que el nuevo motivo de secuencia rica en arginina, identificado por los inventores, es un nuevo motivo de unión a Par4.

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Ejemplo 8 PAR4 es un nuevo componente de los PML-NB que se colocaliza con THAP1 in vivo

Después se deseó determinar si PAR4 se colocaliza con THAP1 in vivo para proporcionar más pruebas de la interacción fisiológica entre THAP1 y PAR4. En primer lugar se analizó la localización subcelular de Par4 en células endoteliales humanas primarias. Se realizó una microscopía de inmunofluorescencia confocal utilizando anticuerpos anti-PAR4 purificados por afinidad (Sells et al., 1997; Guo et al., 1998) en células endoteliales HUVEC fijadas con metanol/acetona, que hace que los componentes de PML-NB sean accesibles a los anticuerpos (Stemsdorf et al., 1997). Las células se fijaron en metanol durante 5 min a -20ºC, seguido de una incubación en acetona fría a -20ºC durante 30 seg. Las células permeabilizadas entonces se bloquearon con PBS-BSA (PBS con albúmina de suero bovina al 1%) durante 10 min y después se incubaron durante 2 h a temperatura ambiente con anticuerpos policlonales de conejo contra Par4 humana (1/50, R-334, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EEUU) y con anticuerpos monoclonales de ratón anti-PML (IgG1 de ratón, 1/30, mAb PG-M3 de Dako, Glostrup, Dinamarca). Las células se lavaron tres veces durante 5 min a temperatura ambiente en PBS-BSA y se incubaron durante 1 h con anticuerpos secundarios de IgG anti-conejo de cabra conjugados con Cy3 (fluorescencia roja) (1/1000, Amersham Pharmacia Biotech), e IgG anti-ratón de cabra marcado con FITC (1/40, Zymed Laboratories Inc., San Francisco, CA, EEUU), diluidos en PBS-BSA. Después de un lavado extenso en PBS, las muestras se secaron al aire y se montaron en Mowiol. Las imágenes se registraron en un microscopio de barrido de láser confocal Leica. Las señales de fluorescencia de GFP (verde) y Cy3 (roja) se registraron de modo secuencial para idénticos campos de imagen para evitar las réplicas entre los canales. Este análisis muestra una asociación de la inmurreactividad de PAR4 con estructuras nucleares con forma de punto, además de una tinción difusa nucleoplásmica y citoplásmica. Una inmunotinción doble con anticuerpos anti-PML reveló que los focos de PAR4 se colocalizan perfectamente con los PML-NB en los núcleos celulares. La colocalización de Par4 con GFP-THAP1 en los PML-NB se analizó en células HUVEC transfectadas que expresan GFP-THAP1 ectópico. Las HUVEC se cultivaron en medio ECGM completo (PromoCell, Heidelberg, Alemania), se cultivaron en cubreobjetos y se transfectarod de modo transitorio con la construcción de expresión de GFP/THAP1 (pEGFP.C2-THAP1) en medio RPMI utilizando el reactivo de transfección GeneJammer según las instrucciones del fabricante (Stratagene, La Jolla, CA, EEUU). Un análisis de las células transfectadas mediante microscopía de inmunofluorescencia indirecta 24 h después, con anticuerpos anti-Par4 de conejo, reveló que todos los focos de PAR4 endógenos se colocalizan con GFP-THAP1 ectópico en los PML-NB, confirmando también la asociación del complejo de THAP1/PAR4 con los PML-NB in vivo.

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Ejemplo 9 PML recluta el complejo THAP1/PAR4 hacia los PML-NB

Puesto que se ha demostrado que PML desempeña un papel crítico en el ensamblaje de los PML-NB mediante el reclutamiento de otros componentes, lo siguiente que se quería hacer era determinar si PML desempeña un papel en el reclutamiento del complejo de THAP1/PAR4 hacia los PML-NB. Para este objetivo, se empleó la observación de que la PAR4 endógena y el GFP-THAP1 ectópico no se acumulan en los PML-NB en células HeLa humanas. Se cotransfectaron vectores de expresión para GFP-THAP1 y HA-PML (o HA-SP100) en estas células y se analizó la localización de PAR4 endógena, GFP-THAP1 y HA-PML (o HA-SP100) mediante microscopía confocal de triple tinción.

Se cultivaron células HeLa humanas (ATCC) en medio de Eagle modificado de Dulbecco suplementado con suero de ternera fetal al 10% y penicilina-estreptomicina al 1% (todos de Life Technologies, Grand Island, NY, EEUU), se colocaron en cubreobjetos, y se transfectaron de modo transitorio con el método del fosfato de calcio, utilizando 2 \mug de ADN plasmídico de pEGFP.C2-THAP1 y pcDNA.3-HA.PML3 o pSG5-HA-Sp100 (un obsequio del doctor Dejean, Institut Pasteur, París, Francia). El pcDNA.3-HA-PML3 se construyó subclonando un fragmento BglII-BamHI de pGADT7-HA-PML3 en el sitio BamHI del vector de expresión pcDNA3 (Invitrogen, San Diego, CA, EEUU). Para generar pGADT7-HA-PML3, el ORF de PML3 se amplificó mediante PCR, utilizando pACT2-PML3 (un obsequio del doctor De Thé, París, Francia) como molde, con los cebadores PML-1 (5'-GCGGGATCCCTAAATTA
GAAAGGGGTGGGGGTAGCC-3') (SEQ ID NO:210) y PML-2 (5'-GCGGAATTCATGGAGCCTGCACCCGCCC
GATC-3') (SEQ ID NO:211), y se clonó en los sitios EcoRI y BamHI de pGADT7.

Célula HeLa transfectadas con las construcciones de expresión marcadas con GFP y marcadas con HA se cultivaron durante 24 h a 48 h en cubreobjetos. Las células se lavaron dos veces con PBS, se fijaron en metanol durante 5 min a -20ºC, seguido de una incubación en acetona fría a 20ºC durante 30 seg. Las células permeabilizadas entonces se bloquearon con PBS-BSA (PBS con albúmina de suero bovina al 1%) durante 10 min y después se incubaron durante 2 h a temperatura ambiente con los siguientes anticuerpos primarios diluidos en PBS-BSA: anticuerpos policlonales de conejo contra Par4 humana (1/50, R-334, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EEUU) y anticuerpo monoclonal de ratón anti-marcador HA (IgG1 de ratón, 1/1000, mAb 16B12 de BabCO, Richmond, CA, EEUU). Las células entonces se lavaron tres veces durante 5 min a temperatura ambiente en PBS-BSA y se incubaron durante 1 h con anticuerpos secundarios de IgG anti-conejo de cabra conjugados con Cy3 (fluorescencia roja) (1/1000, Amersham Pharmacia Biotech), y conjugado de IgG anti-ratón de cabra-Alexa Fluor-B33 (fluorescencia azul) (1/100, Molecular Probes, Eugene, OR, EEUU), diluidos en PBS-BSA. Después de un lavado extenso en PBS, las muestras se secaron al aire y se montaron en Mowiol. Las imágenes se registraron en un microscopio de barrido de láser confocal Leica. Las señales de fluorescencia de GFP (verde), Cy3 (roja) y Alexa 663 (azul) se registraron de modo secuencial para idénticos campos de imagen para evitar las réplicas entre los canales.

En células HeLa transfectadas con HA-PML, PAR4 endógeno y GFP-THAP1 fueron reclutados hacia PML-NB, mientras que en células transfectadas con HA-SP100, tanto PAR4 como GFP-THAP1 mostraron una tinción difusa sin una acumulación en los PML-NB. Estos descubrimientos indican que el reclutamiento del complejo de THAP1/PAR4 hacia los PML-NB depende de PML pero no de SP100.

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Ejemplo 10 THAP1 es un polipéptido inductor de la apoptosis THAP1 es un nuevo factor proapoptótico

Puesto que PML y PML-NB se han conectado a la regulación de la muerte celular y que PAR4 es un factor proapoptótico bien establecido, se estudió si la THAP1 puede modular la supervivencia celular. Células 3T3 de ratón, que previamente se habían empleado para analizar la actividad proapoptótica de PAR4 (Díaz-Meco et al., 1996; Berra et al., 1997), se transfectaron con los vectores de expresión para GFP-THAP1, GFP-PAR4 y como control negativo GFP-APS quinasa 1 (APSK-1), una enzima nuclear no relacionada con THAP1 ni con la apoptosis (Girard et al., 1998; Besset et al., 2000). Después se determinó si la expresión ectópica de THAP1 potencia la respuesta apoptótica a la retirada del suero. Las células transfectadas se privaron de suero durante hasta 24 horas y se contaron las células con núcleos apoptóticos, revelados mediante tinción con DAPI y un ensayo TUNEL in situ.

Ensayos de muerte celular: Se sembraron fibroblastos 3T3-TO de ratón en cubreobjetos en placas de 12 pocillos con una confluencia del 40% al 50% y se transfectaron de forma transitoria con vectores de expresión de GFP o GFP-proteína de fusión utilizando el reactivo de lipofectamina Plus (Life Technologies) según las instrucciones del suministrador. Después de 6 h a 37ºC se retiró la mezcla de ADN-lípidos y se dejó que las células se recuperasen en medio completo durante 24 h. Se indujo la privación de suero de las células transfectadas de modo transitorio cambiando el medio a suero al 0%, y se evaluó la cantidad de células apoptóticas positivas a GFP 24 h después de la inducción de la privación de suero. Las células se fijaron en PBS que contenía formaldehído al 3,7% y se permeabilizaron con Triton-X100 al 0,1% como se describió con la inmunofluorescencia, y se puntuó la apoptosis mediante tinción TUNEL (marcaje terminal de mella de dUTP mediado por desoxinucleotidil transferasa terminal) y/o DAPI (4,6-diamidino-2-fenilindol) in situ de los núcleos apoptóticos que muestran condensación nuclear. La reacción TUNEL se realizó durante 1 h a 37ºC utilizando un kit de detección de muerte celular in situ, rojo TMR (Roche Diagnostics, Meylan, Francia). La tinción con DAPI con una concentración final de 0,2 g/ml se realizó durante 10 min a temperatura ambiente. Se puntuaron al menos 100 células para cada punto experimental utilizando un microscopio de fluorescencia.

Los niveles basales de la apoptosis en presencia de suero varían de 1-3%. Veinticuatro horas después de la retirada del suero, se descubrió que la apoptosis era del 18% en células 3T3 no transfectadas y en células 3T3 que sobreexpresan GFP-APSK-1. Los niveles de apoptosis inducida por la retirada del suero aumentaron significativamente hasta aproximadamente 70% y 65% en células que sobreexpresan GFP-PAR4 y GFP-THAP1, respectivamente (figura 6A). Estos resultados demuestran que THAP1, de forma similar a PAR4, es un polipéptido que induce la apoptosis.

Se realizaron ensayos de apoptosis inducida por TNF\alpha incubando células transfectadas de forma transitoria en medio completo que contenía 30 ng/ml de mTNF\alpha (R & D, Minneapolis, MN, EEUU) durante 24 h. La apoptosis se puntuó como se describió para la apoptosis inducida por la retirada del suero. Los resultados se muestran en la figura 6B. Tal como se muestra en la figura 6B, la THAP1 induce la apoptosis.

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Ejemplo 11 El dominio THAP es fundamental para la actividad proapoptótica de THAP1

Para determinar el papel del dominio THAP amino-terminal (aminoácidos 1 a 89) en la actividad funcional de THAP1, se generó un mutante THAP1 que tiene el dominio THAP delecionado (THAP1\DeltaTHAP). El THAP\DeltaTHAP (aminoácidos 90-213) se amplificó mediante PCR, utilizando pEGFP.C2-THAP1 como molde, con los cebadores 2HMR12 (5'-GCGGAATTCAAAGAAGATCTTCTGGAGCCACAGGAAC-3') (SEQ ID NO:212) y 2HMR9 (5'-CGCGGATCCTGCTGGTACTTCAACTATTTCAAAGTAGTC-3') (SEQ ID NO:213), se digirió con EcoRI y BamHI, y se clonó en los vectores pGBKT7 y pEGFP-C2, para generar los vectores de expresión pGBKT7-THAP1\DeltaTHAP y pEGFP.C2-THAP1\DeltaTHAP. Entonces se analizó el papel del dominio THAP en la localización hacia los PML-NB, la unión a Par4, o la actividad proapoptótica de THAP1.

Para analizar la localización subcelular de THAP1\DeltaTHAP, se transfectó la construcción de expresión GFP/
THAP1\DeltaTHAP en células endoteliales primarias humanas de vena umbilical (HUVEC, PromoCell, Heidelberg, Alemania). Las HUVEC se cultivaron en medio ECGM completo (PromoCell, Heidelberg, Alemania), se colocaron en cubreobjetos y se transfectaron de modo transitorio en medio RPMI utilizando el reactivo de transfección GeneJammer según las instrucciones del fabricante (Stratagene, La Jolla, CA, EEUU). Las células transfectadas se cultivaron durante 487 h en cubreobjetos. Las células entonces se lavaron dos veces con PBS, se fijaron durante 15 min a temperatura ambiente en PBS que contenía formaldehído al 3,7% y se lavaron de nuevo con PBS antes de la neutralización con NH_{4}Cl 50 mM en PBS durante 5 min a temperatura ambiente. Tras otro lavado con PBS, las células se permeabilizaron durante 5 min a temperatura ambiente en PBS que contenía Triton-X100 al 0,1% y se lavaron de nuevo con PBS. Las células permeabilizadas entonces se bloquearon con PBS-BSA (PBS con albúmina de suero bovina al 1%) durante 10 min y después se incubaron durante 2 h a temperatura ambiente con anticuerpo monoclonal de ratón anti-PML (IgG1 de ratón, 1/30, mAb PG-M3 de Dako, Glostrup, Dinamarca) diluido en PBS-BSA. Las células entonces se lavaron tres veces durante 5 min a temperatura ambiente en PBS-BSA y se incubaron durante 1 h con anticuerpos secundarios de IgG anti-ratón de cabra conjugados con Cy3 (fluorescencia roja) (1/1000, Amersham Pharmacia Biotech), diluidos en PBS-BSA. Después de un lavado extenso en PBS, las muestras se secaron al aire y se montaron en Mowiol. Las imágenes se registraron en un microscopio de barrido de láser confocal Leica. Las señales de fluorescencia de GFP (verde) y Cy3 (roja) se registraron de modo secuencial para idénticos campos de imagen para evitar las réplicas entre los canales.

Este análisis reveló que la tinción de GFP-THAP1\DeltaTHAP muestra un solapamiento completo con el patrón de tinción obtenido con anticuerpos dirigidos contra PML, indicando que el dominio THAP no es necesario para la localización de THAP1 hacia los PML-NB.

Para estudiar el papel del dominio THAP en la unión a Par4, se realizaron ensayos en matriz sólida de GST in vitro. La Par4DD, expresada como una proteína de fusión marcada con GST e inmovilizada sobre glutatión-Sepharose, se incubó con THAP1\DeltaTHAP traducida in vitro radiomarcada. Se generó la THAP1\DeltaTHAP traducida in vitro con el sistema de lisado de reticulocitos acoplado a TNT (Promega, Madison, WI, EEUU) utilizando el vector pGBKT7-THAP1\DeltaTHAP como molde. Se incubaron 25 \mul de THAP1\DeltaTHAP marcada con ^{35}S con proteína GST-Par4 o GST inmovilizadas durante la noche a 4ºC, en el siguiente tampón de unión: NaPO_{4} 10 mM, pH 8,0, NaCl 140 mM, MgCl_{2} 3 mM, dithiothreitol (DTT) 1 mM, NP40 al 0,05%, y fluoruro de fenilmetilsulfonilo 0,2 mM (PMSF), vanadato de Na 1 mM, \beta-glicerofosfato 50 mM, quimotripsina 25 \mug/ml, aprotinina 5 \mug/ml, leupeptina 10 \mug/ml. Las esferas entonces se lavaron 5 veces en 1 ml de tampón de unión. Las proteínas unidas se eluyeron con 2 X tapón de muestra de SDS-PAGE de Laemmli, se fraccionaron mediante SDS al 10%-PAGE y se visualizaron mediante fluorografía utilizando Amplify (Amersham Pharmacia Biotech).

Este análisis reveló que THAP1\DeltaTHAP interacciona con GST/Par4DD, indicando que el dominio THAP no está implicado en la interacción de THAP1/Par4 (figura 7A).

Para estudiar el papel del dominio THAP en la actividad proapoptótica de THAP1 se realizaron ensayos de muerte celular en células 3T3 de ratón. Se sembraron fibroblastos 3T3-TO de ratón en cubreobjetos en placas de 12 pocillos con una confluencia del 40% al 50% y se transfectaron de forma transitoria con vectores de expresión de proteínas de fusión GFP-ASK1, GFP-THAP1 o GFP-THAP1\DeltaTHAP utilizando el reactivo de lipofectamina Plus (Life Technologies) según las instrucciones del suministrador. Después de 6 h a 37ºC se retiró la mezcla de ADN-lípidos y se dejó que las células se recuperasen en medio completo durante 24 h. Se indujo la privación de suero de las células transfectadas de modo transitorio cambiando el medio a suero al 0%, y se evaluó la cantidad de células apoptóticas positivas a GFP 24 h después de la inducción de la privación de suero. Las células se fijaron en PBS que contenía formaldehído al 3,7% y se permeabilizaron con Triton-X100 al 0,1% como se describió con la inmunofluorescencia, y se puntuó la apoptosis mediante tinción TUNEL (marcaje terminal de mella de dUTP mediado por desoxinucleotidil transferasa terminal) y/o DAPI (4,6-diamidino-2-fenilindol) in situ de los núcleos apoptóticos que muestran condensación nuclear. La reacción TUNEL se realizó durante 1 h a 37ºC utilizando un kit de detección de muerte celular in situ, rojo TMR (Roche Diagnostics, Meylan, Francia). La tinción con DAPI con una concentración final de 0,2 \mug/ml se realizó durante 10 min a temperatura ambiente. Se puntuaron al menos 100 células para cada punto experimental utilizando un microscopio de fluorescencia.

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Veinticuatro horas después de la retirada del suero, se descubrió que la apoptosis era del 18% en células 3T3 no transfectadas y en células 3T3 que sobreexpresan GFP-APSK-1. Los niveles de apoptosis inducida por la retirada del suero aumentaron significativamente hasta aproximadamente 70% en células que sobreexpresan GFP-THAP1. La deleción del dominio THAP abroga la mayor parte de este efecto, puesto que la apoptosis inducida por la retirada del suero se redujo hasta 28% en células que sobreexpresaban GFP-THAP1\DeltaTHAP (figura 7B). Estos resultados indican que el dominio THAP, aunque no es necesario para la localización de THAP1 en PML-NB ni para la unión a PAR4, es esencial para la actividad proapoptótica de THAP1.

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Ejemplo 12 El dominio THAP define una nueva familia de proteínas, la familia THAP

Para descubrir nuevas proteínas humanas homólogas con THAP1 y/dominios que contienen THAP, se realizó una búsqueda en las bases de datos GenBank no redundante, de EST humana y del borrador del genoma humano en the National Center for Biotechnology Information (www.ncbi.nlm.nih.gov) con las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de THAP1, utilizando los programas BLASTN, TBLASTN y BLASTP (Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W. y Lipman, D.J. (1990), Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol., 215: 403-410). Esta etapa inicial permite identificar 12 proteínas diferenciadas que contienen THAP humanas (hTHAP0 a hTHAP11; figura 8). En el caso de secuencias de longitud parcial, se empleó un ensamblaje de EST solapantes junto las predicciones génicas sobre sus correspondientes clones de ADN genómico GENESCAN (Burge, C. y Karlin, S. (1997), Prediction of complete gene structures in human genomic DNA, J. Mol. Biol., 268:78-94) y GENEWISE (Jareborg, N., Birney, E. y Durbin, R (1999), Comparative analysis of noncoding regions of 77 orthologous mouse and human gene pairs, Genome Res., 9:815-824) para definir las proteínas THAP de longitud completa humanas, así como sus correspondientes ADNc y genes. Se empleó CLUSTALW (Higgins, D.G., Thompson, J.D. y Gibson, T.J. (1996), Using CLUSTAL for multiple sequence alignments, Methods Enzymol., 266:383-402) para realizar el alineamiento de 12 dominios de THAP humana con el dominio de unión al ADN de la transposasa del elemento P de Drosophila (Lee, C.C., Beall, E.L., y Rio, D.C. (1998), EMBO J., 17:4166-74), que se coloreó utilizando el programa informático Boxshade (www.ch.embnet.org/software/BOX__form.html) (véanse las figuras 9A y 9B). Se empleó una estrategia equivalente a la descrita anteriormente para identicar los ortólogos de ratón, rata, cerdo y diversos otros ortólogos de las proteínas THAP humanas (figura 9C). Juntas, las estrategias in silico y experimentales han conducido al descubrimiento de 12 miembros humanos diferenciados (hTHAP0 a hTHAP11) de la familia THAP de factores proapoptóticos (figura 8).

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Ejemplo 13 THAP2 y THAP3 interaccionan con Par4

Para evaluar si THAP2 y THAP3 son capaces de interaccionar con Par-4, se realizaron ensayos de dos híbridos utilizando un cebo de Par-4 de tipo salvaje (figura 10B) y ensayos en matriz sólida de GST in vitro (figura 10C), como se describió anteriormente (ejemplos 4 y 5). Como se muestra en las figuras 10B y 10C, THAP2 y THAP3 son capaces de interaccionar con Par-4. Un alineamiento de secuencias que muestra la comparación del dominio THAP y el dominio de unión a PAR4 entre THAP1, THAP2 y THAP3 se muestra en la figura 10A.

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Ejemplo 14 THAP2 y THAP3 son capaces de inducir la apoptosis

Se realizaron análisis de la apoptosis inducida por suero o TNF\alpha como se describió anteriormente (ejemplo 190) en células transfectadas con los vectores de expresión GFP-APSK1, GFP-THAP2 o GFP-THAP3. La apoptosis se cuantificó mediante tinción con DAPI de los núcleos apoptóticos 24 horas después de la retirada del suero o la adición de TNF\alpha. Los resultados se muestran en la figura 11A (retirada del suero) y la figura 11B (TNF\alpha). Estos resultados indican que THAP-2 y THAP3 inducen la apoptosis.

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Ejemplo 15 Identificación del dominio de unión a la quimioquina SLC/CCL21 de THAP1 humana

Para identificar el dominio de unión a la quimioquina SLC/CCL21 de THAP1 humana se generó una serie de construcciones de deleción de THAP como se describe en el ejemplo 7.

Se ensayó la interacción de dos híbridos entre mutantes de THAP1 y la quimioquina SLC/CCL21 mediante la cotransformación de AH109 con pGADT7-THAP1-C1, -C2, -C3, -N1, -N2 o -N3 y pGBKT7-SLC/CCL21, y se seleccionaron los transformantes mediante auxotrofía doble de His y Ade según las instrucciones del fabricante (sistema 3 de dos híbridos MATCHMAKER, Clontech). Se generó el vector pGBKT7-SLC/CCL21 subclonando el fragmento BamHI de SLC/CCL21 de pGBT9-SLC (véase el ejemplo 1) en el sitio de clonación exclusivo BamHI del vector pGBKT7 (Clontech). Se observó una interacción de dos híbridos positiva con la quimioquina SLC/CCL21 con los mutantes THAP1-C1, -C2, -C3, pero no con los mutantes THAP1-N1, -N2 y -N3, lo cual sugiere que el dominio de unión
a la quimioquina SLC/CCL21 de la THAP1 humana se encuentra entre los restos 143 y 213 de THAP1 (figura 12).

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Ejemplo 16 Ensayo de interacción de THAP1/quimioquina SLC-CCL21 in vitro

Para confirmar la interacción observada en el sistema de dos híbridos de levadura, se realizaron ensayos en matriz sólida de GST in vitro. La THAP1, expresada como una proteína de fusión marcada con GST e inmovilizada sobre glutatión-Sepharose, se incubó con SLC-CCL21 traducida in vitro radiomarcada.

Para generar el vector de expresión de GST-THAP1, se amplificó la región codificadora de longitud completa de THAP1 (aminoácidos 1-213) mediante PCR a partir del ADNc de HEVEC con los cebadores 2HMR8 (5'-CGCG
GATCCGTGCAGTCCTGCTCGGCCTACGGC-3') (SEQ ID NO:214) y 2HMR11 (5'-CCGAATTCTTATGCTGG
TACTTCAACTATTTCAAAGTAG-3') (SEQ ID NO:215), se digirió con BamHI y EcoRI, y se clonó dentro del marco cadena abajo del ORF de la glutatión S-transferasa, entre los sitios BamHI y EcoRI del vector de expresión procariota pGEX-2T (Amersham Pharmacia Biotech, Saclay, Francia). La proteína de fusión GST-THAP1 codificada por el plásmido pGEX-2T-THAP1 y la proteína GST control codificada por el plásmido pGEX-2T entonces se expresaron en E. coli DH5\alpha y se purificaron mediante cromatografía de afinidad con glutatión-Sepharose según las instrucciones del fabricante (Amersham Pharmacia Biotech). Se determinó el rendimiento de las proteínas utilizadas en ensayos en matriz sólida de GST mediante una electroforesis en gel de poliarilamida-SDS (PAGE) y un análisis de la tinción con azul de Coomassie.

Se generó la SCL/CCL21 traducida in vitro con el sistema de lisado de reticulocitos acoplado a TNT (Promega, Madison, WI, EEUU) utilizando el vector pGBKT7-SCL/CCL21 como molde (véase el ejemplo 15). Se incubaron 25 \mul de SCL/CCL21 de tipo salvaje marcada con ^{35}S con proteínas GST-THAP1 o GST inmovilizadas durante la noche a 4ºC, en el siguiente tampón de unión: NaPO_{4} 10 mM, pH 8,0, NaCl 140 mM, MgCl_{2} 3 mM, dithiothreitol (DTT) 1 mM, NP40 al 0,05%, y fluoruro de fenilmetilsulfonilo 0,2 mM (PMSF), vanadato de Na 1 mM, \beta-glicerofosfato 50 mM, quimotripsina 25 \mug/ml, aprotinina 5 \mug/ml, leupeptina 10 \mug/ml. Las esferas entonces se lavaron 5 veces en 1 ml de tampón de unión. Las proteínas unidas se eluyeron con 2 X tapón de muestra de SDS-PAGE de Laemmli, se fraccionaron mediante SDS al 10%-PAGE y se visualizaron mediante fluorografía utilizando Amplify (Amersham Pharmacia Biotech). Tal como se esperaba, GST/THAP1 interacciona con SCL/CCL21 (figura 13). Por contraste, SCL/CCL21 no interaccionó con las esferas GST.

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Ejemplo 17 Identificación del dominio de unión a THAP1 sobre la quimioquina humana SLC/CCL21

Para determinar el sitio de unión a THAP1 sobre la quimioquina humana SLC/CCL21 se generó un mutante de deleción de SLC/CCL21 (SLC/CCL21\DeltaCOOH) que carece de la extensión carboxi-terminal básica específica de SLC (aminoácidos 102-134; GenBank, nº de registro NP_002980). Este mutante SLC/CCL21\DeltaCOOH, que conserva el dominio de unión al receptor de quimioquina CCR7 de SLC/CCL21 (aminoácidos 24-101) se empleó en ensayos de dos híbridos de levadura con cebo de THAP1 y en ensayos en matriz sólida de GST in vitro con GST-THAP1.

Para los ensayos de dos híbridos, se cotransformaron células de levadura con los vectores de expresión BD7-THAP1 y AD7-SLC/CCL21 o AD7-SLC/CCL21\DeltaCOOH. Los vectores de expresión AD7-SLC/CCL21 o AD7-SLC/CCL21\DeltaCOOH se generaron subclonando un fragmento BamHI (que codifica los aminoácidos 24-134 de SLC) o un fragmento BamHI-PstI (que codifica los aminoácidos 24-102 de SLC) de pGKT7-SLC/CCL21 (véase el ejemplo 15) en el vector de expresión pGADT7 (Clontech). Los transformantes se seleccionaron en medio que carecía de histidina y adenina. La figura 13 muestra que SLC/CCL21 de tipo salvaje y los mutantes de delección SLC/CCL21\DeltaCOOH pueden unirse a THAP1. Se obtuvieron idénticos resultados mediante la cotransformación de AD7-THAP1 con BD7-SLC/CCL21 o BD7-SLC/CCL21\DeltaCOOH.

Se realizaron ensayos en matriz sólida de GST, utilizando SLC/CCL21\DeltaCOOH traducido in vitro generado con el sistema de lisado de reticulocitos acoplado a TNT (Promega, Madison, WI, EEUU) utilizando el vector pGBKT7-SLC/CCL21\DeltaCOOH como molde como se describe en el ejemplo 16. La figura 13 muestra que SLC/CCL21 de tipo salvaje y los mutantes de delección SLC/CCL21\DeltaCOOH pueden unirse a THAP1.

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Ejemplo 18 Preparación de proteínas de fusión de THAP1/Fc

Este ejemplo describe la preparación de proteínas de fusión que comprenden THAP1 o el dominio de unión a SLC/CCL21 de THAP1 condensados con un polipéptido de la región Fc derivado de un anticuerpo.

Se construye un vector de expresión que codifica una proteína de fusión de THAP1/Fc como sigue.

Brevemente, la región codificadora de longitud completa de la THAP1 humana (SEQ ID NO:3, aminoácidos -1 a 213) o el dominio de unión a la quimioquina SLC/CCL21 de THAP1 humana (SEQ ID NO:3, aminoácidos -143 a 213) se amplificó mediante PCR. Los oligonucleótidos empleados como cebadores 5' en la PCR contienen otra secuencia a añade un sitio de restricción NotI cadena arriba. El cebador 3' incluye otra secuencia que codifica los primeros dos aminoácidos de un polipéptido Fc, y una secuencia a añade un sitio de restricción BglII cadena abajo de las secuencias de THAP1 y Fc. Se emplea un vector recombinante que contiene el ADNc de THAP1 humana como molde en la PCR, que se realiza según procedimientos convencionales. El ADN amplificado se digiere con NotI y BgIII, y los fragmentos deseados se purifican mediante electroforesis en gel de agarosa.

Un fragmento de ADN que codifica la región Fc de un anticuerpo IgG1 humano se aísla digiriendo un vector que contiene ADN que codifica Fc clonado con BgIII y NotI. La BgIII rompe en un sitio BgIII exclusivo introducido cerca del extremo 5' de la secuencia codificadora de Fc, de forma que el sitio BgIII incluye los codones para los aminoácidos tres y cuatro del polipéptido Fc. La NotI rompe cadena debajo de la secuencia codificadora de Fc. La secuencia de nucleótidos del ADNc que codifica el polipéptido Fc, junto con la secuencia de aminoácidos codificada, puede encontrarse en la publicación internacional nº WO 93/10151.

En un acoplamiento de tres vías, el ADN que codifica THAP1 (o el dominio de unión a SLC/CCL21 de THAP1) y el ADN que codifica Fc descritos anteriormente se insertan en un vector de expresión que se ha digerido con NotI y se ha tratado con una fosfatasa para minimizar la recirculación de cualquier vector de ADN sin un inserto. Un ejemplo de un vector que puede utilizarse en pCD406 (descrito en McMahan et al., EMBO J., 10:2821, 1991), que es un vector de expresión de mamífero que también es capaz de replicarse en E. coli.

Las células de E. coli entonces se transfectan con la mezcla de acoplamiento, y se aíslan los vectores recombinantes deseados. Los vectores codifican los aminoácidos -1 a 213 de la secuencia THAP1 (SEQ ID NO:3) o los aminoácidos -143 a 213 de la secuencia de THAP1 de SEQ ID NO:3, condensados con el N-terminal del polipéptido Fc. El polipéptido Fc codificado se extiende desde la región bisagra N-terminal hasta el C-terminal nativo, es decir, es una región Fc de anticuerpo fundamentalmente de longitud completa.

Entonces se transfectan células CV-1/EBNA-1 con el recombinante deseado aislado de E. coli. Las células CV-1/EBNA-1 (ATCC CRL 10478) pueden transfectarse con los vectores recombinantes mediante procedimientos convencionales. La línea celular CV-1/EBNA-1 se deriva de la línea celular de riñón de mono verde africano CV-1 (ATCC CCL 70), como se describe en McMahan et al. (1991), EMBO J., 10:2821. Las células transfectadas se cultivan para permitir la expresión transitoria de las proteínas de fusión de THAP/Fc o de dominio de unión a la quimioquina SLC/CCL21 de THAP1/Fc, que se segregan hacia el medio de cultivo. Las proteínas segregadas contienen la forma madura de THAP1 o el dominio de unión a la quimioquina SLC/CCL21 de THAP1, condensados con el polipéptido Fc. Se cree que las proteínas de fusión de THAP/Fc o de dominio de unión a la quimioquina SLC/CCL21 de THAP1/Fc forman dímeros, en los que dos de estas proteínas de fusión se unen mediante enlaces disulfuro que se forman entre sus restos Fc. Las proteínas de fusión de THAP/Fc o de dominio de unión a la quimioquina SLC/CCL21 de THAP1/Fc pueden recuperarse del medio de cultivo mediante cromatografía de afinidad en una columna de cromatografía que porta proteína A.

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Ejemplo 19 El dominio THAP define una familia de factores nucleares

Para determinar la localización subcelular de diferentes proteínas de THAP humanas, se transfectó una serie de construcciones de expresión de GFP-THAP en células endoteliales humanas primarias. De acuerdo con las posibles funciones de las proteínas THAP como factores de unión al ADN, se descubrió que todas las proteínas THAP humanas analizadas (THAP0, 1, 2, 3, 6, 7, 8, 10, 11) se localizan preferentemente en el núcleo celular (figura 14). Además de su localización nuclear difusa, algunas proteínas THAP también muestran una asociación con estructuras subnucleares diferenciadas: los nucleólos para THAP2 y THAP3, y los cuerpos nucleares puntuados para THAP7, THAP8 y THAP11. Una microscopía de inmunofluorescencia indirecta con anticuerpos anti-PML revela que los cuerpos nucleares de THAP8 y THAP11 se colocalizan con los PML-NB. Aunque los cuerpos nucleares de THAP7 a menudo aparecen en asociación cercana con los PML-NB, nunca se colocalizan.

El análisis de la localización subcelular de las proteínas de fusión de GFP-THAP se realizó como se describió anteriormente (ejemplo 3). Las construcciones de GFP-THAP se generaron como sigue: la región codificadora de THAP0 humana se amplificó mediante PCR a partir de ADNc de HEVEC con los cebadores THAP0-1 (5'-GCCGAATT
CATGCCGAACTTCTGCGCTGCCCCC-3') (SEQ ID NO:216) y THAP0-2 (5'-CGCGGATCCTTAGGTTATTTTC
CACAGTTTCGGAATTATC-3') (SEQ ID NO:217), se digirió con EcoRI y BamHI, y se clonó en los mismos sitios del vector pEGFP-C2, para generar pEGFPC2-THAP0; la región codificadora de las THAP2, 3, 7, 6 y 8 humanas se amplificó mediante PCR, respectivamente a partir del clon nº 3606376 de Image con los cebadores THAP2-1 (5'-GCGCTGCAGCAAGCTAAATTTAAATGAAGGTACTCTTGG-3') (SEQ ID NO:218) y THAP2-2 (5'-GCGA
GATCTGGGAAATGCCGACCAATTGCGCTGCG-3') (SEQ ID NO:219), y se digirió con BglII y PstI, a partir del clon nº 4813302 y nº 3633743 de Image con los cebadores THAP3-1 (5'-AGAGGATCCTTAGCTCTGCTGCTCTGG
CCCAAGTC-3') (SEQ ID NO:220), THAP3-2 (5'-AGAGAATTCATGCCGAAGTCGTGCGCGGCCCG-3') (SEQ ID NO:221) y los cebadores THAP7-1 (5'-GCGGAATTCATGCCGCGTCACTGCTCCGCCGC-3') (SEQ ID NO:
222), THAP7-2 (5'-GCGGGATCCTCAGGCCATGCTGCTGCTCAGCTGC-3') (SEQ ID NO:223), y se digirió con EcoRI y BamHI, a partir del clon nº 757753 de Image con los cebadores THAP6-1 (5'-GCGAGATCTCGATGGT
GAAATGCTGCTCCGCCATTGGA-3') (SEQ ID NO:224) y THAP6-2 (5'-GCGGGATCCTCATGAAATATAGTCC
TGTTCTATGCTCTC-3') (SEQ ID NO:225) y se digirió con BglII y BamHI, y partir del clon nº 4819178 de Image con los cebadores THAP8-1 (5'-GCGAGATCTCGATGCCCAAGTACTGCAGGGCGCCG-3') (SEQ ID NO:226) y THAP8-2 (5'-GCGGAATTCTTATGCACTGGGGATCCGAGTGTCCAGG-3') (SEQ ID NO:227), y se digirió con BglII y EcoRI y clonados dentro del marco cadena debajo del ORF de la proteína fluorescente verde potenciada (EGFP) en el vector pEGFPC2 (Clontech) digerido con las mismas enzimas para generar pEGFPC2-THAP2, -THAP3, -THAP7, -THAP6 y -THAP8; la región codificadora de THAP10 y THAP11 humanas se amplificó mediante PCR de ADNc de HeLa, respectivamente con los cebadores THAP10-1 (5'-GCGGAATTCATGCCGGCCCG
TrGTGTGGCCGC-3') (SEQ ID NO:228), THAP10-2 (5'-GCGGGATCCTTAACATGTTTCTTCTTTCACCTGTA
CAGC-3') (SEQ ID NO:229) y se digiró con EcoRI y BamHI, y con los cebadores THAP11-1 (5'-GCGAGATCTC
GATGCCTGGCTTTACGTGCTGCGTGC-3') (SEQ ID NO:230) y THAP11-2 (5'-GCGGAATTCTCACATTCCGTG
CTTCTTGCGGATGAC-3') (SEQ ID NO:231), se digirió con BglII y EcoRI, y se clonó en los mismos sitios del vector pEGFP-C2 vector, para generar pEGFPC2-THAP10 y THAP11.

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Ejemplo 20 El dominio THAP comparte similitudes estructurales con el dominio de unión al ADN de los receptores de hormonas nucleares

Para intentar realizar un modelo de la estructura tridimensional del dominio THAP se buscó en la base de datos cristalográfica PDB. Puesto que la detección de la homología de secuencia es más sensible y selectiva cuando también se utiliza la información de la estructura secundaria, se buscaron homólogos estructurales del dominio THAP de la THAP1 humana utilizando el programa de enhebrado SeqFold (Olszewski et al. (1999), Theor. Chem. Acc., 101, 57-61) que combina el alineamiento de secuencias y de estructuras secundarias. La estructura cristalográfica del DBD del receptor \beta de la hormona tiroidea (código PDB: 2NLL) produjo la mejor puntuación de la búsqueda y se empleó el alineamiento estructural resultante, mostrado en la figura 15A, para derivar un modelo basado en la homología del dominio THAP a partir de la THAP1 humana (figura 15B). Nótese que la distribución de los restos Cys en el dominio THAP no se aparea totalmente con la del DBD del receptor \beta de la hormona tiroidea (figura 15A) y, por tanto, no permite la formación de los dos dedos de Zn "de tipo C4" característicos (color rojo en la figura 15A). Sin embargo, una red de interacciones de apilamiento entre restos aromáticos/hidrófobos o de las partes alifáticas de las cadenas laterales de lisina asegura la estabilidad de la estructura del domino THAP (color cian en las figuras 15A y 15B). De forma interesante, el mismo método de enhebrado aplicado independientemente en el DBD de la transposasa del elemento P de Drosophila identifica la estructura cristalográfica del DBD del receptor de glucocorticoides (código PDB: 1GLU) como la mejor puntuación. De la misma manera, se empleó el alineamiento estructural resultante, mostrado en la figura 15D, para construir un modelo del DBD de la transposasa (figura 15C). Nótese la presencia de un núcleo hidrófobo equivalente al del dominio THAP (color cian en las figuras 15C y 15D). Todos los dominios de unión al ADN de los receptores nucleares se pliegan en un patrón típico que se basa principalmente en dos \alpha-hélices que interaccionan, insertándose la primera en el surco principal del ADN diana. Los resultados del enhebrado y de la formación del modelo indican que el dominio THAP y el DBD de la transposasa del elemento P de Drosophila probablemente comparten una topología común que es similar al del DBD de los receptores
nucleares.

La formación de modelos moleculares se realizó utilizando los módulos InsightII, SeqFold, Homology y Discover del programa informático de formación de modelos moleculares (versión 98) Accelrys (San Diego, CA), empleado en una terminal de trabajo Silicon Graphics 02. Se aseguró una óptima predicción de la estructura secundaria de los dominios de la proteína problema mediante el método DSC dentro de SeqFold. Los alineamientos de la estructura secundaria derivados del enhebrado se emplearon como entrada para la formación de modelos de homología, que se realizó según un protocolo previamente descrito (Manival et al. (2001), Nucleic Acids Res., 29:2223-2233). La validez de los modelos se comprobó mediante un análisis de Ramachandran y la verificación de la coherencia del plegamiento como se ha indicado previamente (Manival et al. (2001), Nucleic Acids Res., 29:2223-2233).

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Ejemplo 21 Dominio de homodimerización de THAP1 humana

Para identificar las secuencias que median en la homodimerización de THAP1, se generó una serie de construcciones de deleción de THAP1 como se describe en el ejemplo 7.

Se ensayó la interacción de dos híbridos entre mutantes de THAP1 y THAP1 de tipo salvaje mediante una cotransformación de AH109 con pGADT7-THAP1-C1, -C2, -C3, -N1, -N2 o -N3 y pGBKT7-THAP1 de tipo salvaje y se seleccionaron los transformantes mediante auxotrofía doble de His y Ade según las instrucciones del fabricante (sistema 3 de dos híbridos MATCHMAKER 3, Clontech). Se observó una interacción de dos híbridos positiva con la THAP1 de tipo salvaje con los mutantes THAP1-C1, -C2, -C3, y -N3, pero no con los mutantes THAP1-N1 y -N2, lo cual sugiere que el dominio de homodimerización de THAP1 se encuentra entre los restos 143 y 192 de THAP1 (figura 16A).

Para confirmar los resultados obtenidos en levaduras también se ensayaron mutantes de THAP1 en ensayos en matriz sólida de GST in vitro. La THAP1 de tipo salvaje, expresada como una proteína de fusión marcada con GST e inmovilizada sobre glutatión-Sepharose, se incubó con mutantes de THAP1 traducidos in vitro radiomarcados. Se generaron los mutantes de THAP1 traducidos in vitro con el sistema de lisado de reticulocitos acoplado a TNT (Promega, Madison, WI, EEUU) utilizando el vector pGADT7-THAP1-C1, -C2, -C3, -N1, -N2 o -N3 como molde. Se incubaron 25 \mul de cada mutante de THAP1 marcado con ^{35}S con proteína GST o GST-THAP1 de tipo salvaje inmovilizadas durante la noche a 4ºC, en el siguiente tampón de unión: NaPO_{4} 10 mM, pH 8,0, NaCl 140 mM, MgCl_{2} 3 mM, dithiothreitol (DTT) 1 mM, NP40 al 0,05%, y fluoruro de fenilmetilsulfonilo 0,2 mM (PMSF), vanadato de Na 1 mM, \beta-glicerofosfato 50 mM, quimotripsina 25 \mug/ml, aprotinina 5 \mug/ml, leupeptina 10 \mug/ml. Las esferas entonces se lavaron 5 veces en 1 ml de tampón de unión. Las proteínas unidas se eluyeron con 2 X tapón de muestra de SDS-PAGE de Laemmli, se fraccionaron mediante SDS al 10%-PAGE y se visualizaron mediante fluorografía utilizando Amplify (Amersham Pharmacia Biotech). Tal como se esperaba, THAP1-C1, -C2, -C3, y -N3 interaccionan con GST/THAP1 (figura 16B). Por contraste, THAP1-N1 y -N2 no interaccionan con las esferas GST/THAP1. Por tanto, se obtuvieron unos resultados fundamentalmente idénticos con los dos ensayos de interacciones de THAP1/THAP1: el dominio de homodimerización THAP1 de THAP1 se encuentra entre los restos 143 y 192 de la THAP1 humana.

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Ejemplo 22 Isoforma de corte y empalme alternativo de la THAP 1 humana

Se han descubierto dos ADNc de THAP1 diferenciados, THAP1a and THAP1b (figura 17A). Estos variantes de corte y empalmen se amplificaron mediante PCR de ADNc de HEVEC con los cebadores 2HMR10 (5'-CC
GAATTCAGGATGGTGCAGTCCTGCTCCGCCT-3') (SEQ ID NO:232) y 2HMR9 (5'-CGCGGATCCTGCTGG
TACTTCAACTATTTCAAAGTAGTC-3') (SEQ ID NO:233), se digirieron con EcoRI y BamHI, y se clonaron dentro del marco cadena arriba del ORF de la proteína fluorescente verde potenciada (EGFP) en el vector pEGFP.N3 (Clontech) para generar pEGFP.N3-THAP1a y pEGFP-THAP1b. La secuenciación del ADN reveló que la isoforma de ADNc de THAP1b carece del exón 2 (nucleótidos 273-468) del gen de la THAP1 humana (figura 17B). Esta isoforma de corte y empalme alternativo de la THAP1 humana (ARNm de aproximadamente 2 kb) también se observó en muchos otros tejidos mediante un análisis de la transferencia Northern (véase la figura 2). Las construcciones de expresión THAP1a/GFP y THAP1b/GFP entonces se transfectaron en células COS 7 (ATCC) y se analizó la expresión de las proteínas de fusión mediante transferencia Western con anticuerpos anti-GFP. Los resultados se muestran en la figura 17C que demuestra que la segunda isoforma de la THAP1 humana (THAP1b) codifica una proteína THAP1 truncada (THAP1 C3) que carece de una porción sustancial del extremo amino-terminal (aminoácidos 1-142 de SEQ ID NO:3).

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Ejemplo 23 Ensayo de selección de alta capacidad de procesamiento para moduladores de la actividad proapoptótica de polipéptidos de la familia THAP

Se ha desarrollado un ensayo de selección de alta capacidad de procesamiento para moléculas que abrogan o estimulan la actividad proapoptótica de polipéptidos de la familia THAP, basado en la apoptosis inducida por la retirada del suero en una línea celular 3T3 con la expresión regulada con tetraciclina de un polipéptido de la familia THAP.

En un ejemplo preferido, el ADNc de THAP1 con una secuencia marcadora myc dentro del marco se amplificó mediante PCR utilizando pGBKT7-THAP1 como molde, con los cebadores myc.BD7 (5'-GCGCTCTAGAGCCAT
CATGGAGGAGCAGAAGCTGATC-3') (SEQ ID NO:234) y 2HMR15 (5'-GCGCTCTAGATTATGCTGGTACTT
CAACTATTTCAAAGTAG-3') (SEQ ID NO:235), y se clonaron cadena debajo de un promotor regulado por tetraciclina en el vector plasmídico pTRE (Clontech, Palo Alto, CA), utilizando el sitio de restricción XbaI, para genera el plásmido pTRE-mycTHAP1. Para establecer línes celulares estables 3T3-TO-mycTHAP1, se sembraron fibroblastos 3T3-TO de ratón (Clontech) con una confluencida del 40% al 50% y se cotransfectaron con el plásmido pREP4 (Invitrogen), que contiene un gen de resistencia a la higromicina B, y el vector de expresión de mycTHAP1 (pTRF-mycTHAP1) a una proporción de 1:10, utilizando el reactivo de lipofectamina Plus (Life Technologies) según las instrucciones del suministrador. Las células transfectadas se seleccionaron en medio que contenía higromicina B (250 U/ml; Calbiochem) y tetraciclina (2 ug/ml; Sigma). Se seleccionaron varias colonias resistentes y se analizan para la expresión de mycTHAP1 mediante inmunofluorescencia indirecta utilizando un anticuerpo monoclonal anti-epitopo myc (IgG1 de ratón, 1/200, Clontech). Una línea celular 3T3-TO estable que expresa mycTHAP1 (3T3-TO-mycTHAP1) se seleccionó y se cultivó en medio de Eagle modificado de Dulbecco suplementado con suero de ternera fetal al 10%, penicilina-estreptomicina al 1% (todos de Life Technologies, Grand Island, NY, EEUU) y tetraciclina (2 ug/ml; Sigma). La inducción de la expresión de THAP1 en esta línea celular 3T3-TO-mycTHAP1 se obtuvo 48 h después de la retirada de la tetraciclina en el medio completo.

Puede realizarse un ensayo de selección de fármacos utilizando la línea celular 3T3-TO-mycTHAP1 como sigue. Se cultivan células 3T3-TO-mycTHAP1 en microplacas de 96 ó 384 pocillos y se induce la expresión de THAP1 mediante la retirada de la tetraciclina en el medio completo. Cuarenta y ocho horas después, se ensaya la respuesta apoptótica a la retirada del suero en presencia de un compuesto de ensayo, permitiendo la identificación de compuestos de ensayos que potencian o que inhiben la capacidad del polipéptido THAP1 para inducir la apoptosis. Se induce la privación de suero de las células 3T3-TO-mycTHAP1 cambiando el medio a suero al 0%, y se evaluó la cantidad de células con núcleos apoptóticos 24 h después de la inducción de la privación de suero mediante tinción TUNEL en microplacas de 98 ó 384 pocillos. Las células se fijaron en PBS que contenía formaldehído al 3,7% y se permeabilizaron con Triton-X100 al 0,1%, y se puntuó la apoptosis mediante tinción TUNEL in situ (marcaje terminal de mella de dUTP mediado por desoxinucleotidil transferasa terminal) de los núcleos apoptóticos durante 1 h a 37ºC utilizando un kit de detección de muerte celular in situ, rojo TMR (Roche Diagnostics, Meylan, Francia). Entonces se cuantifica la intensidad de fluorescencia roja TMR en cada pocillo para identificar los compuestos de ensayo que modifican la señal de fluorescencia y, por tanto, que potencian o inhiben la actividad proapoptótica de THAP1.

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Ejemplo 24 Ensayo de selección de dos híbridos de alta capacidad de procesamiento de fármacos que modulan la interacción de polipéptido de la familia THAP/proteína diana de la familia THAP

Para identificar fármacos que modulan las interacción de THAP/Par4 o THAP1/SLC puede utilizarse un ensayo de selección de alta capacidad de procesamiento basado en dos híbridos.

Como se describe en el ejemplo 17, pueden cultivarse células de levadura AH109 (Clontech) cotransformadas con los plásmidos pGBKT7-THAP1 y pGADT7-Par4 o pGADT7-SLC en placas de 384 pocillos en medio selectivo que carece de histidina y adenina, según las instrucciones del fabricante (sistema 3 de dos híbridos MATCHMAKER, Clontech).

El crecimiento de los transformantes en medio que carece de histidina y adenina depende absolutamente de la interacción de dos híbridos de THAP/Par4 o THAP1/SLC y, por tanto, los fármacos que interrumpan la unión de THAP/Par4 o THAP1/SLC inhibirán el crecimiento de las células de levadura.

Se añaden moléculas pequeñas (5 mg ml^{-1} en DMSO, Chembridge) utilizando matrices de 384 varillas de plástico (Genetix). Las placas se incuban durante 4 a 5 días a 30ºC y las moléculas pequeñas que inhiben el crecimiento de las células de levadura mediante la interrupción de la interacción de dos híbridos de THAP/Par4 o THAP1/SLC se seleccionan para su posterior análisis.

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Ejemplo 25 Ensayo de alta capacidad de procesamiento in vitro para identificar inhibidores de la interacción de polipéptido de la familia THAP/proteína diana de la familia THAP

Para identificar moduladores de molécula pequeña con función THAP, se emplea una selección de alta capacidad de procesamiento basada en la polarización de la fluorescencia (FP) para controlar el desplazamiento de una proteína THAP1 marcada de modo fluorescente desde un dominio de unión de THAP a glutatión-S-transferasa (GST) recombinante de una proteína de fusión de Par4 (Par4DD) o una proteína de fusión GST-SLC/CCL21 recombinante.

Los ensayos se realizan fundamentalmente como se indica en Degterev et al., Nature Cell Biol., 3: 173-182 (2001) and Dandliker et al., Methods Enzymol., 74: 3-28 (1981). El ensayo puede calibrarse valorando un péptido THAP1 marcado con verde de Oregón con cantidades crecientes de proteínas GST-Par4DD o GST-SLC/CCL21. La unión del péptido viene acompañada de un aumento en la polarización (mP, milipolarización).

Los polipéptidos THAP1 y PAR4 y las fusiones de GST pueden producirse como se describió previamente. El péptido THAP1 se expresa y se purifica utilizando un kit de expresión QIA (Qiagen) según las instrucciones del fabricante. Brevemente, la secuencia codificadora de THAP1 completa se amplifica mediante PCR utilizando pGBKT7-THAP1 como molde, con los cebadores 2HMR8 (5'-CGCGGATCCGTGCAGTCCTGCTCCGCCTACGGC-3') (SEQ ID NO:236) y 2HMR9 (5'-CGCGGATCCTGCTGGTACTTCAACTATTTCAAAGTAGTC-3') (SEQ ID NO:237), y se clonó en el sitio BamHI del vector pQE30 (Qiagen). El plásmido pQE30-HisTHAP1 resultante se tranforma en la cepa de E. coli M15 (Qiagen). La proteína THAP1 marcada con 6xMs se purifica a partir de los cuerpos de inclusión en una columna de Ni-agarosa (Qiagen) bajo condiciones desnaturalizantes, y el eluato se empleó para ensayos de interacción in vitro. Para producir la proteína de fusión GST-Par4DD, se amplificó Par4DD (aminoácido 250-342) mediante PCR con los cebadores Par4.10 (5'-GCCGGATCCGGGTTCCCTAGATATAACAGGGATGCAA-3') (SEQ ID NO:238) y Par4.5 (5'-GCGGGATCCCTCTACCTGGTCAGCTGACCCACAAC-3') (SEQ ID NO:239), y se clonó dentro del marco cadena abajo del ORF de la glutatión-S-transferasa (GST) en el sitio BamHI del vector de expresión procariota pGEX-2T (Amersham Pharmacia Biotech, Saclay, Francia). De forma similar, para producir la proteína de fusión GST-SLC/CCL21, la forma madura de la SLC/CCL21 humana (aminoácidos 24-134) se amplificó mediante PCR con los cebadores hSLCbam.5' (5'-GCGGGATCCAGTGATGGAGGGGCTCAGGACTGTTG-3') (SEQ ID NO:240) y hSLCbam.3' (5'-GCGGGATCCCTATGGCCCTTTAGGGGTCTGTGACC-3') (SEQ ID NO:241), se digirió con BamHI y se insertó en el sitio de clonación BamHI del vector pGEX-2T. Las proteínas de fusión GST-Par4DD (aminoácidos 250-342) y GST-SLC/CCL21 (aminoácidos 24-134) se expresaron en E. coli DH5\alpha (supE44, DELTAlacU169 (801cZdeltaM15), hsdR17, recA1, enda1, gyrA96, thi1, reIA 1) y se purificaron mediante cromatografía de afinidad con glutatión-Sepharse según las instrucciones del suministrador (Amersham Pharmacia Biotech).

Para la selección de moléculas pequeñas, el péptido THAP1 se marca con verde de Oregón de succinimidilo (Molecultar Probes, Oregon) y se purifica mediante HPLC. Se añade el péptido THAP1 marcado 33 mM, proteínas GST-Par4DD o GST-SLC/CCL21 2 \muM, gamm-globulina bovina al 0,1% (Sigma) y ditriotreitol 1 mM mezclados con PBS, pH 7,2 (Gibco) a placas negras de 384 pocillos (Lab Systems) con Multidrop (Lab Systems). Se transferien las moléculas pequeñas (5 mg ml^{-1} en DMSO; Chembridge) utilizando matrices de 384 varillas de plástico (Genetix). Las placas se incuban durante 1-2 horas a 25ºC y se determinan los valores de FP con un lector de placas Analyst (LJL Biosystems).

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Ejemplo 26 Ensayo con chips de alta capacidad de procesamiento para identificar inhibidores de la interacción de polipéptido de la familia THAP/proteína diana de la familia THAP

Puede utilizarse un ensayo de unión basado en chips de Degterev et al. (2001), Nature Cell Biol., 3:173-182, utilizando THAP sin marcar y proteína diana de la familia THAP para identificar moléculas capaces de interferir con las interacciones de la familia THAP y diana de la familia THAP, que proporciona una alta sensibilidad y evita la interferencia potencial de restos marcados. En este ejemplo, el dominio de unión a THAP1 de una proteína Par4 (Par4DD) o SLC/CCL21 se unen covalentemente con un chip de ionización/desorción de láser con superficie potenciada (SELDI), y se controla la unión de la proteína THAP1 sin marcar a la proteína inmovilizada en presencia de un compuesto de ensayo mediante espectrometría de masas.

La proteína THAP1, las proteínas de fusión GST-Par4DD y GST-SLC/CCL21 recombinantes se preparan como se describe en el ejemplo 25. La proteína GST-Par4DD o GST-SLC/CCL21 recombinante purificada se acopla a través de su amina primaria con superficies de chips SELDI derivatizadas con carbonildiimidazol (Ciphergen). La proteína THAP1 se incuba en un volumen total de 1 \mul durante 12 horas a 4ºC en una cámara humidificada para permitir la unión a cada punto del chip SELDI, después se lava con tampones alternantes de pH alto y de pH bajo (acetato de sodio 0,1M que contiene NaCl 0,5 M, seguido de HEPES 0,01 M, pH 7,3). Las muestras se sumergen en una matriz de ácido alfa-ciano-4-hidroxicinnámico y se analizaron para la masa mediante espectrometría de masas de tiempo de vuelo de ionización de desorción de láser asistida por matriz (MALDI-TOF). Se recogen medias de 100 disparos de láser a un ajuste constante en 20 puntos de cada muestra.

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Ejemplo 27 Ensayo celular de alta capacidad de procesamiento para identificar inhibidores de la interacción de polipéptido de la familia THAP/proteína diana de la familia THAP

Se realiza un ensayo de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) entre proteínas THAP1 y PAR4 o SLC/CCL21 condensadas con proteínas fluorescentes. El ensayo puede realizarse como se describe en Majhan et al., Nature Biotechnology, 16:547-552 (1998), y Degterev et al., Nature Cell Biol., 3: 173-182 (2001).

La proteína THAP1 se condensa con la proteína fluorescente cian (CFP) y la proteína PAR4 o SLC/CCL21 se condensa con la proteína fluorescente amarilla (YFP). Pueden construirse vectores que contengan proteínas de la familia THAP y proteínas diana de la familia THAP fundamentalmente como se describe en Majhan et al. (1998). Se genera un vector de expresión de THAP-1-CFP subclonando un ADNc de THAP1 en el vector pECFP-N1 (Clontech). Se generan vectores de expresión de PAR4-YFP o SLC/CCL21-CYP subclonando un ADNc de PAR4 o SLC/CCL21 en el vector pEYFP-N1 (Clontech).

Los vectores se cotransfectan en células HEK-293 y las células se tratan con compuestos de ensayo. Las células HEK-293 se transfectan con los vectores de expresión de THAP-1-CFP y PAR4-YFP o SLC/CCL21-YFP utilizando LipofectAMINE Plus (Gibco) o TransLT-1 (PanVera). Veinticuatro horas después las células se tratan con los compuestos de ensayo y se incuban durante varios periodos de tiempo, preferiblemente hasta 48 horas. Las células se recogen en PBS, opcionalmente suplementado con compuesto de ensayo, y se determina la fluorescencia con un fluorímetro C60 (PTI) o un lector de placas Wallac. La fluorescencia en las muestras que expresan por separado THAP-1-CFP y PAR4-YFP o SLC/CCL21-YFP se suman y se emplean para estimar el valor FRET en ausencia de unión de THAP-1/PAR4 o THAP1/SLC/CCL21.

El grado de FRET entre CFP e YFP se determina como la proporción entre la fluorescencia a 527 nm y la de 475 nm después de una excitación a 433 nm. La cotransfección de la proteína THAP-1 y la proteína PAR4 o SLC/CCL21 produce un aumento en la proporción de FRET frente a una proporción de FRET de referencia de 1,0 (determinada utilizando muestras que expresan las proteínas por separado). Un cambio en la proporción de FRET tras el tratamiento con un compuesto de ensayo (frente a la observada después de una cotransfección en ausencia de un compuesto de ensayo) indica que un compuesto es capaz de modular la interacción de la proteína THAP-1 y la proteína PAR4 o SLC/CCL21.

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Ejemplo 28 Ensayo in vitro para identificar dianas de ADN de polipéptidos de la familia THAP

Se determinó la especificidad de unión al ADN de THAP1 utilizando un método de selección de oligonucleótidos aleatorio que permite un análisis no sesgado de los sitios de unión seleccionados por el dominio THAP de la proteína THAP a partir de una agrupación aleatoria de sitios posibles. El método se realizó fundamentalmente como se describe en Bouvet (2001), Methods Mol. Biol., 148:603-10. Véase también Pollack y Treisman (1990), Nuc. Acid Res., 18:6197-6204; Blackwell y Weintraub (1990), Science, 250: 104-1110; Ko y Engel (1993), Mol. Cell. Biol., 13:4011-4022; Merika y Orkin (1993), Mol. Cell. Biol., 13: 3999-4010; y Krueger y Morimoto (1994), Mol. Cell. Biol., 14:7592-7603).

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Expresión y purificación del dominio THAP recombinante

Un fragmento de ADNc que codifica el dominio THAP de la THAP-1 humana (aminoácidos 1-90, SEQ ID NO:3) se clonó mediante PCR utilizando como molde pGADT7-THAP-1 (véase el ejemplo 4) con los siguientes cebadores 5'-GCGCATATGGTGCAGTCCTGCTCCGCCTACGGC-3' (SEQ ID NO:242) y 5'-GCGCTCGAGTTTCTTGT
CATGTGGCTCAGTACAAAG-3' (SEQ ID NO:243). El producto de la PCR se clonó como un fragmento NdeI-XhoI en el vector de expresión procariota pET-21c (Novagen), dentro del marco con una secuencia que codifica un marcador de His carboxi-terminal, para generar pET-21c-THAP.

Para la expresión de THAP-His6, el pET-21c-THAP se transformó en la cepa de Escherichia coli BL-21 pLysS. La bacterias se cultivaron a 37ºC hasta una densidad óptica a 600 nm de 0,6, y se indujo la expresión de la proteína añadiendo isopropil-\beta-D-tiogalactósido (Sigma) a una concentración final de 1 mM y se continuó la incubación durante 4 horas.

Las células se recogieron mediante centrifugación y se resuspendieron en tampón A enfriado en hielo (fosfato de sodio 50 mM, pH 7,5, NaCl 300 mM, \beta-mercaptoetanol al 0,1%, imidazol 10 mM). Las células se lisaron mediante sonicación y el lisado se aclaró mediante centrifugación a 12000 g durante 45 min. El sobrenadante se cargó sobre una columna de agarosa Ni-NTA (Quiagen) equilibrada en tampón A. Después de lavar con tampón A y tampón B con imidazol 40 mM, la proteína se eluyó con tampón B (igual que el tampón A pero contiene \beta-mercaptoetanol al 0,05% e imidazol 250 mM).

Las fracciones que contenían THAP-His6 se reunieron y se aplicaron a una columna de filtración en gel Superdex 75 equilibrada en tampón C (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, DTT 1 mM). Las fracciones que contenían la proteína THAP-His6 se reunieron, se concentraron con dispositivos de filtro YM-3 de Amicon y se conservaron a 4ºC o congeladas a -80ºC en tampón C que contenía glicerol al 20%. La pureza de la muestra se evaluó mediante electroforesis en gel de SDS-poliarilamina (PAGE) y análisis de la tinción con azul de Coomassie. Se comprobó la integridad estructural de la preparación de proteínas mediante espectrometría de masas ESI y cartografiado de masas de péptidos utilizando un espectrómetro de masas MALDI-TOF. La concentración de proteínas se determinó con un ensayo de proteínas Bradford.

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Selección de oligonucleótidos aleatoria

Según el protocolo SELEX descrito en Bouvet (2001), Methods Mol. Biol., 148:603-610, se sintetizó un oligonucleótido de 62 pb que tiene la siguiente secuencia: 5'-TGGGCACTATTTATATCAAC-N25-AATGTCGTTGGTGGC
CC-3' (SEQ ID NO:244), en la que N es cualquier nucleótido, y cebadores complementarios a cada extremo. El cebador P es: 5'-ACCGCAAGCTTGGGCACTATTTATATCAAC-3' (SEQ ID NO:245), y el cebador R es 5'-GGTCTA
GAGGGCCACCAACGCATT-3' (SEQ ID NO:246). Se hace que el oligonucleótido 62-mero sea bicatenario mediante PCR utilizando los cebadores P y R, generando una agrupación aleatoria de 80 pb.

Se incubaron aproximadamente 250 ng de THAP-His6 con esferas magnéticas Ni-NTA en tampón NT2 (Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, NaCl 100 mM, NP-40 al 0,05%) durante 30 min a 4ºC sobre un rodillo. Las esferas se lavaron 2 veces con 500 \mul de tampón NT2 para eliminar la proteína no unida. La THAP-His6 inmovilizada se incubó con la agrupación aleatoria de ADN de 80 pb bicatenario (de 2 a 5 \mug) en 100 \mul de tampón de unión (Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, NaCl 100 mM, NP-40 al 0,05%, EDTA 0,5 mM, BSA 100 \mug/ml, y de 20 a 50 \mug de poli(dI-dC) durante 10 min a temperatura ambiente. Las esferas entonces se lavaron 6 veces con 500 \mul de tampón NT2. Entonces el complejo de proteína/ADN se sometió a una extracción con fenol/cloroformo y una precipitación con etanol, utilizando 10 \mug de glucógeno como vehículo. Entonces se amplificó aproximadamente una quinta parte del ADN recuperado mediante 15 a 20 ciclos de PCR y se empleó para la siguiente ronda de selección. Después de 8 rondas de selección, la concentración de NaCl aumentó progresivamente hasta 150 mM.

Después de 12 rondas de selección con THAP-His6, las agrupaciones de oligonucleótidos amplificados se digirieron con XbaI y HindIII y se clonaron en pBluescript II KS- (Stratagene) y los clones individuales se secuenciaron utilizando el kit de terminadores Big Dye (Applied Biosystems).

Los resultados del análisis de la secuencia demostraron que el dominio THAP de la THAP1 humana es un dominio de unión a ADN específico de sitio. Se dedujeron dos secuencias consenso a partir del alineamiento de dos conjuntos de secuencias de nucleótidos obtenidas del anterior procedimiento SELEX (cada conjunto contiene 9 secuencias de ácidos nucleicos). En particular, se descubrió que el dominio THAP reconoce las secuencias diana de ADN
GGGCAA o TGGCAA preferiblemente organizadas como repeticiones directas con un espaciamento de 5 nucleótidos (motivos DR-5). La secuencia consenso es GGGCAAnnnnnTGGCAA (SEQ ID NO:149). Además, THAP reconoce repeticiones invertidas con un espaciamento de 11 nucleótidos (motivos ER-11) que tienen una secuencia consenso TTGCCAnnnnnnnnnnnGGGCAA (SEQ ID NO:159). Aunque las secuencias GGGCAA y TGGCAA constituyen los sitios de unión al ADN del dominio THAP preferentes, las secuencias GGGCAT, GGGCAG y TGGCAG también son secuencias diana de ADN reconocidas por el dominio THAP.

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Ejemplo 29 Ensayo de alta capacidad de procesamiento in vitro para identificar inhibidores de las interacciones de polipéptidos de la familia THAP o de la familia THAP con dianas de ADN no específicas

Se realizan ensayos de alta capacidad de procesamiento para la detección y la cuantificación de la unión a ADN no específica de THAP1 utilizando un ensayo de proximidad de centelleo. Los materiales están disponibles en Amersham (Piscataway, NJ), y los ensayos pueden realizarse según Gal S. et al., 6th Ann. Conf. Soc. Biomol. Screening, 6-9 sept. 2000, Vancouver, B.C.).

Se preparan sondas de ADN bicatenario aleatorias y se marcan utilizando [^{3}H]TTP y transferasa terminal hasta una actividad específica adecuada (por ejemplo, aproximadamente 420 i/mmol). Se prepara la proteína THAP1 o su porción y se determina la cantidad de proteína THAP1 o su porción mediante ELISA. Para el desarrollo del ensayo, pueden realizarse ensayos de desplazamiento de la movilidad electroforética (EMSA) para seleccionar los parámetros de ensayo apropiados. Para el ensayo de alta capacidad de procesamiento, se combinan ADN marcado con ^{3}H, anticuerpo monoclonal anti-THAP1, y THAP1 en tampón de unión (HEPES, pH 7,5, EDTA, DTT, sulfato de amonio 10 mM, KCl, y Tween-20). El ensayo se configura en una placa de 96 pocillos convencional y se incuba a temperatura ambiente durante 5 a 30 minutos, seguido de la adición de 0,5 a 2 mg de esferas SPA de proteína A de PVT en 50-100 \mul de tampón de unión. Se mide la radiactividad unida a las esferas SPA utilizando un contador de microplacas TopCount^{TM} (Packard Biosciences, Meriden, CT).

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Ejemplo 30 Ensayo de alta capacidad de procesamiento in vitro para identificar inhibidores de las interacciones de polipéptidos de la familia THAP o de la familia THAP con dianas de ADN específicas

Se realizan ensayos de alta capacidad de procesamiento para la detección y la cuantificación de la unión al ADN específica de THAP1 utilizando un ensayo de proximidad de centelleo. Los materiales están disponibles en Amersham (Piscataway, NJ), y los ensayos pueden realizarse según Gal S. et al., 6th Ann. Conf. Soc. Biomol. Screening, 6-9 sept. 2000, Vancouver, B.C.).

Se preparan sondas de ADN b icatenarias específicas de THAP1 que se corresponden con las secuencias de unión al ADN de THAP1 según el ejemplo 20. Las sondas se marcan utilizando [^{3}H]TTP y transferasa terminal hasta una actividad específica adecuada (por ejemplo, aproximadamente 420 i/mmol). Se prepara la proteína THAP1 o su porción y se determina la cantidad de proteína THAP1 o su porción mediante ELISA. Para el desarrollo del ensayo, pueden realizarse ensayos de desplazamiento de la movilidad electroforética (EMSA) para seleccionar los parámetros de ensayo apropiados. Para el ensayo de alta capacidad de procesamiento, se combinan ADN marcado con ^{3}H, anticuerpo monoclonal anti-THAP1, 1 \mug de ADN no específico (poli-dAdt bicatenario o monocatenario), y la proteína THAP1 o su porción en tampón de unión (HEPES, pH 7,5, EDTA, DTT, sulfato de amonio 10 mM, KCl, y Tween-20). El ensayo se configura en una placa de 96 pocillos convencional y se incuba a temperatura ambiente durante 5 a 30 minutos, seguido de la adición de 0,5 a 2 mg de esferas SPA de proteína A de PVT en 50-100 \mul de tampón de unión. Se mide la radiactividad unida a las esferas SPA utilizando un contador de microplacas TopCount^{TM} (Packard Biosciences, Meriden, CT).

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Ejemplo 31 Preparación de composiciones de anticuerpos

Se obtiene la proteína THAP1 sustancialmente pura o su porción. La concentración de proteína en la preparación final se ajusta, por ejemplo, mediante concentración en un dispositivo de filtro Amicon, hasta el nivel de unos pocos microgramos por ml. Entonces pueden prepararse anticuerpos monoclonales o policlonales contra la proteína como sigue: pueden producirse anticuerpos monoclonales mediante anticuerpos monoclonales de fusión de hibridomas contra epitopos de la proteína THAP1 o su porción a partir de hibridomas murinos según el método clásico de Kohler y Milstein (Nature, 256: 495, 1975) o métodos derivados de éste (véase Harlow y Lane, Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, pp. 53-242, 1988).

Brevemente, un ratón se inocula varias veces con unos pocos microgramos de la proteína THAP1 o su porción a lo largo de un periodo de varias semanas. El ratón entonces se sacrifica, y se aíslan las células productoras de anticuerpos del bazo. Las células del bazo se fusionan mediante polietilenglicol con células de mieloma de ratón, y el exceso de células no fusionadas se destruye mediante el crecimiento del sistema en medio selectivo que comprende aminopterina (medio HAT). Las células que se fusionaron con éxito se diluyen y se colocan partes alícuotas de la dilución en los pocillos de una placa de microvaloración en las que continúa el crecimiento del cultivo. Se identifican los clones que producen anticuerpos mediante la detección del anticuerpo en el fluido sobrenadante de los pocillos mediante procedimientos de inmunoensayo, como ELISA, como se describió originariamente en Engvall, E., Meth. Enzymol., 70:419 (1980). Los clones positivos seleccionados pueden expandirse y su producto de anticuerpo monoclonal se recoge antes del uso. Los procedimientos detallados para la producción de anticuerpos monoclonales se describe en Davis, L. et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier, Nueva York, sección 21-2.

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Producción de anticuerpos policlonales mediante inmunización

Puede prepararse un antisuero policlonal que contenga anticuerpos contra epitopos heterogéneos en la proteína THAP1 o su porción, inmunizando un animal no humano adecuado con la proteína THAP1 o su porción, que puede estar o no modificada para potenciar la inmunogenicidad. Se selecciona un animal no humano adecuado, preferiblemente un mamífero no humano. Por ejemplo, el animal puede ser un ratón, una rata, un conejo, una cabra o un caballo. Como alternativa, puede utilizarse una preparación de proteínas bruta que se ha enriquecido para la THAP1 o su porción, para generar anticuerpos. Estas proteínas, fragmentos o preparaciones se introducen en el mamífero no humano en presencia de un adyuvante apropiado (por ejemplo hidróxido de aluminio, RIBI, etc.) que es conocido en la técnica. Además, la proteína, el fragmento o la preparación puede pretratarse con un agente que aumente la antigenicidad; estos agentes son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, albúmina de suero bovina metilada (mBSA), albúmina de suero bovina (BSA), antígeno de la superficie de la hepatitis B, y hemocianina de lapa de agujero (KLH). Se recoge el suero del animal inmunizado, se trata y se ensaya según procedimientos conocidos. Si el suero contiene anticuerpos policlonales contra epitopos no deseados, los anticuerpos policlonales pueden purificarse mediante cromatografía de inmunoafinidad.

La producción de anticuerpos policlonales se ve afectada por muchos factores relacionados con el antígeno y con la especie hospedante. Además, los animales hospedantes varían en su respuesta al sitio de la inoculación y la dosis, dando como resultado unas dosis inadecuadas o excesivas de antígeno una baja valoración en suero. Las dosis pequeñas (a nivel de ng) de antígeno administradas en múltiples sitios intradérmicos parecen ser las más fiables. Las técnicas para producir y procesar antisueros policlonales son conocidas en la técnica; véase, por ejemplo, Mayer y Walker (1987). Un protocolo de inmunización eficaz puede encontrarse en Vaitukaitis, J. et al., J. Clin. Endocrinol. Metab., 33: 988-991 (1971). Pueden realizarse inyecciones de refuerzo a intervalos regulares, y el antisuero se recoge cuando su valoración de anticuerpos, determinada de modo semicuantitativo por ejemplo mediante inmunodifusión doble en agar contra concentraciones conocidas del antígeno, comienza a disminuir. Véase, por ejemplo, Ouchterlony, O. et al., capítulo 19, en: Handbook of Experimental Immunology, D. Wier (ed.), Blackwell (1973). La concentración meseta de anticuerpo normalmente está en el intervalo de 0,1 a 0,2 mg/ml de suero (aproximadamente 12: M). La afinidad del antisuero por el antígeno se determina preparando curvas de unión competitiva como se describe, por ejemplo, en Fisher, D., capítulo 42, en: Manual of Clinical Immunology, 2ª ed. (Rose y Friedman, eds.), Amer. Soc. For Microbiol., Washington, D. C. (1980).

Las preparaciones de anticuerpos preparadas según el protocolo monoclonal o policlonal son útiles en inmunoensayos cuantitativos que determinan las concentraciones de sustancias que portan antígenos en muestras biológicas; o también se emplean de forma semicuantitativa o cualitativa para identificar la presencia del antígeno en una muestra biológica. Los anticuerpos también pueden utilizarse en composiciones terapéuticas para matar células que expresan la proteína o para reducir los niveles de la proteína en el cuerpo.

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Referencias bibliográficas

En la presente solicitud se han citado numerosas referencias bibliográficas y de patentes.

Para algunas referencias, la cita completa está en el cuerpo del texto. Para otras referencias, la cita en el cuerpo del texto es del autor y del año, siendo la cita completa la siguiente:

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<110> Endocube SAS

\hskip1cm

Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS)

\hskip1cm

Girard, Jean-Philippe

\hskip1cm

Roussigne, Myriam

\hskip1cm

Kossida, Sophia

\hskip1cm

Amalric, Francois

\hskip1cm

Clouaire, Thomas

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<120> NUEVAS PROTEÍNAS ASOCIADAS A LA MUERTE DE LA FAMILIA THAP Y RUTAS PAR4 RELACIONADAS IMPLICADAS EN EL CONTROL DE LA APOPTOSIS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<130> G3138 PCT (BIOBANK.009VPC)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<140> Desconocido

\vskip0.400000\baselineskip

<141> 2002-12-10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> US 60/341,997

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 2001-12-18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 263

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<170> FastSEQ para Windows Versión 4,0

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 74

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Consenso del dominio THAP

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> INSEGURO

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 2-5, 7-21, 23-31, 33-49, 51-52, 55-73

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = cualquiera de los veinte aminoácidos

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

3

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 81

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Consenso del dominio THAP

\vskip0.400000\baselineskip

<221> INSEGURO

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 3-4, 6-7, 11-21, 24, 27-35, 37-41, 43-53, 56, 59-62, 64-71,74-75, 80

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = cualquiera de los veinte aminoácidos

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 213

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 228

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

6

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 239

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

7

8

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 577

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

9

10

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 395

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

11

1100

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 222

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

12

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 309

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 274

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

14

15

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 903

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

16

17

18

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 257

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

19

1900

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 314

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

20

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 761

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

21

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia del consenso para el dominio de union PAR4 DE THAP

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> INSEGURO

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(38)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = Cualquier aminoácido

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 73

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Sus scrofa

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 99

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Sus scrofa

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 103

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Sus scrofa

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

26

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 99

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Sus scrofa

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

27

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 92

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

28

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 75

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

29

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 91

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

30

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 90

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

31

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 92

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

32

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 95

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

33

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

34

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 103

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

35

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 90

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

36

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 96

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

37

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus norvegicus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

38

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 85

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus norvegicus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

39

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 70

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus norvegicus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

40

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus norvegicus

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

41

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 103

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus norvegicus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

42

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 90

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus norvegicus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

43

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 96

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus norvegicus

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

44

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 94

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Gallus gallus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

45

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 94

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Gallus gallus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

46

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 102

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Gallus gallus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Gallus gallus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\vskip1.000000\baselineskip

48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 90

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Xenopus laevi

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\vskip1.000000\baselineskip

49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 103

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Xenopus laevi

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\vskip1.000000\baselineskip

50

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 90

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Xenopus laevi

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\vskip1.000000\baselineskip

51

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 99

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Xenopus laevi

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\vskip1.000000\baselineskip

52

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 90

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Xenopus laevi

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

\vskip1.000000\baselineskip

53

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 105

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Xenopus laevi

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54

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<210> 47

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<211> 104

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<212> PRT

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<213> Xenopus laevi

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<400> 47

55

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<210> 48

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<211> 102

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<212> PRT

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<213> Xenopus laevi

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<400> 48

56

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<210> 49

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<211> 104

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<212> PRT

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<213> Xenopus laevi

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<400> 49

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57

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<210> 50

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<211> 99

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<212> PRT

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<213> Xenopus laevi

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<400> 50

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58

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<210> 51

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<211> 104

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<212> PRT

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<213> Xenopus laevi

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<400> 51

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59

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<210> 52

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<211> 84

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<212> PRT

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<213> Xenopus laevi

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<400> 52

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60

61

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<210> 53

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<211> 104

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<212> PRT

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<213> Xenopus laevi

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<400> 53

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62

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<210> 54

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<211> 104

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<212> PRT

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<213> Xenopus laevi

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<400> 54

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63

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<210> 55

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<211> 105

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<212> PRT

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<213> Xenopus laevi

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<400> 55

64

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<210> 56

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<211> 107

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<212> PRT

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<213> Xenopus laevi

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<400> 56

65

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<210> 57

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<211> 91

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<212> PRT

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<213> Danio rerio

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66

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<210> 58

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<211> 103

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<212> PRT

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<213> Danio rerio

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<400> 58

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67

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<210> 59

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<211> 90

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<212> PRT

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<213> Danio rerio

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<400> 59

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68

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<210> 60

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<211> 96

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<212> PRT

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<213> Danio rerio

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<211> 99

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<212> PRT

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<213> Danio rerio

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<212> PRT

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<213> Danio rerio

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<211> 105

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<212> PRT

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<213> Danio rerio

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<211> 99

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<212> PRT

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<213> Danio rerio

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<400> 64

73

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<210> 65

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<211> 66

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<212> PRT

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<213> Danio rerio

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<210> 66

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<212> PRT

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<213> Danio rerio

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<211> 93

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<212> PRT

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<213> Danio rerio

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<210> 68

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<211> 97

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<212> PRT

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<213> Danio rerio

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<210> 69

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<211> 90

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<212> PRT

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<213> Danio rerio

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78

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<210> 70

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<211> 107

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<212> PRT

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<213> Danio rerio

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<400> 70

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79

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<210> 71

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<211> 89

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<212> PRT

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<213> Danio rerio

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<400> 71

80

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<210> 72

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<211> 105

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<212> PRT

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<213> Danio rerio

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<400> 72

81

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 73

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<211> 96

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<212> PRT

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<213> Danio rerio

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<400> 73

82

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 74

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<211> 91

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Danio rerio

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<400> 74

83

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<210> 75

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 84

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<212> PRT

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<213> Danio rerio

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<400> 75

84

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<210> 76

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 95

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<212> PRT

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<213> Oryzias latipes

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<400> 76

85

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 77

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<211> 90

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<212> PRT

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<213> Oryzias latipes

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<400> 77

86

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<210> 78

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<211> 94

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<212> PRT

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<213> Oryzias latipes

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<400> 78

87

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<210> 79

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<211> 92

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Drosophila melanogaster

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<400> 79

88

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<210> 80

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<211> 90

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<212> PRT

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<213> Drosophila melanogaster

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 80

89

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 81

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 104

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Drosophila melanogaster

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<400> 81

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90

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<210> 82

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 96

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<212> PRT

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<213> Drosophila melanogaster

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<400> 82

\vskip1.000000\baselineskip

91

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<210> 83

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 96

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<212> PRT

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<213> Drosophila melanogaster

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<400> 83

92

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<210> 84

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 87

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<212> PRT

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<213> Drosophila melanogaster

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<400> 84

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<210> 85

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<211> 92

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<212> PRT

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<213> Anopheles gambiae

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<400> 85

94

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<210> 86

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<211> 108

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<212> PRT

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<213> Anopheles gambiae

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<400> 86

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95

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<210> 87

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<211> 100

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<212> PRT

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<213> Anopheles gambiae

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 87

96

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 88

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 95

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<212> PRT

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<213> Anopheles gambiae

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 88

97

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<210> 89

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<211> 107

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<212> PRT

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<213> Anopheles gambiae

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 89

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98

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 90

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 104

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<212> PRT

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<213> Anopheles gambiae

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<400> 90

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99

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 91

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 95

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<212> PRT

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<213> Anopheles gambiae

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<400> 91

100

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<210> 92

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<211> 97

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<212> PRT

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<213> Anopheles gambiae

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<400> 92

101

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 93

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 92

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<212> PRT

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<213> Bombyx mori

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<400> 93

102

103

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 94

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<211> 96

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<212> PRT

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<213> Bombyx mori

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 94

\vskip1.000000\baselineskip

104

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 95

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 89

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<212> PRT

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<213> Caenorhabditis elegans

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 95

\vskip1.000000\baselineskip

105

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 96

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 100

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Caenorhabditis elegans

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 96

\vskip1.000000\baselineskip

106

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 97

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 86

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Caenorhabditis elegans

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 97

\vskip1.000000\baselineskip

107

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 98

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 97

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Caenorhabditis elegans

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 98

\vskip1.000000\baselineskip

108

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 99

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 210

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Mus musculus

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 99

109

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 100

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<211> 217

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<212> PRT

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<213> Mus musculus

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 100

110

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 101

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 218

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

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<400> 101

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111

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 102

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 205

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 102

\vskip1.000000\baselineskip

112

113

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 103

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 186

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 103

114

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<210> 104

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<211> 194

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<212> PRT

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<213> Mus musculus

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<400> 104

115

1150

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<210> 105

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 305

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Mus musculus

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 105

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116

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 106

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<211> 305

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Mus musculus

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<400> 106

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117

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<210> 107

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<211> 652

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<212> PRT

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<213> Mus musculus

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 107

118

119

120

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<210> 108

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<211> 180

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<212> PRT

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<213> Rattus norvegicus

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<220>

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<223> RAT THAP

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\vskip0.400000\baselineskip

<221> INSEGURO

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<222> 95

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<223> Xaa = cualquiera de los veinte aminoácidos

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<400> 108

121

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<210> 109

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<211> 82

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<212> PRT

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<213> Rattus norvegicus

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 109

122

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<210> 110

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<211> 309

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<212> PRT

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<213> Rattus norvegicus

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<212> PRT

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<213> Rattus norvegicus

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<400> 111

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124

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<212> PRT

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<213> Sus scrofa

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125

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<212> PRT

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<213> Sus scrofa

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> INSEGURO

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<222> 57, 124, 192

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = cualquiera de los veinte aminoácidos

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<400> 113

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126

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<210> 114

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<212> PRT

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<213> Sus scrofa

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127

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<212> PRT

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<213> Mus musculus

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<400> 115

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<211> 45

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<212> PRT

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<213> Mus musculus

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<400> 116

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<210> 117

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<211> 45

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<210> 118

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<211> 342

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 118

131

132

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 119

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 134

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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133

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<210> 120

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<211> 766

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<212> PRT

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<213> Drosophila melanogaster

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<400> 120

134

135

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<210> 121

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 103

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 121

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<210> 122

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<211> 81

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 122

137

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<210> 123

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<211> 89

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 123

138

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 124

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 85

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Drosophila melanogaster

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 124

139

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 125

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<211> 58

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Consenso del dominio THAP

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\vskip0.400000\baselineskip

<221> INSEGURO

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<222> 2-3, 7, 9, 13-17, 19, 21-23, 25-26, 28, 35, 38-39, 41, 45-50, 52, 55-56

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = cualquiera de los veinte aminoácidos

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<400> 125

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140

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<211> 89

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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141

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<210> 127

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 89

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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142

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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143

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<211> 92

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<211> 90

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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145

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<210> 131

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<211> 89

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 131

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<210> 132

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<211> 90

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<210> 133

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<211> 97

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<210> 134

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<211> 92

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 134

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<210> 135

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<211> 96

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<212> PRT

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<213> Homo sappiens

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<210> 136

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<211> 90

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 136

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<210> 137

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<211> 90

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 137

152

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<210> 138

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<211> 85

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<212> PRT

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<213> Drosophila melanogaster

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<400> 138

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<210> 139

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<211> 63

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Consenso del dominio THAP

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<221> INSEGURO

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<222> 4-5, 7, 9-10, 12, 15-20, 22, 24, 32, 35, 38-39, 42-43, 46-47, 49-51, 53-61, 63

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<223> Xaa = cualquiera de los veinte aminoácidos

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<400> 139

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<211> 17

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> DR-5-related sequence

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<400> 140

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17

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<211> 17

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Secuencia relacionada con DR-5

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<400> 141

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<211> 17

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Secuencia relacionada con DR-5

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<400> 142

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17

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<220>

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<223> DR-5-related sequence

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<211> 17

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<212> DNA

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<220>

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<223> Secuencia relacionada con DR-5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 144

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gggccagttc gttgcaa

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 145

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia relacionada con DR-5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 145

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gggcatgtac tggcaa

\hfill

16

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 146

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia relacionada con DR-5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 146

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gggcaactgt gggcaa

\hfill

16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 147

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia relacionada con DR-5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 147

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gggcaacact actggcaa

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 148

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia relacionada con DR-5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 148

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gggcaaagta ctggcaa

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 149

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<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> DR-5 consensus sequence

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> INSEGURO

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 7-11

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n = cualquiera de los cuatro nucleótidos

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 149

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gggcaannnn ntggcaa

\hfill

17

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 150

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia relacionada con ER-11

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 150

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttgccagtac taagtgtggg caa

\hfill

23

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 151

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia relacionada con ER-11

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 151

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctgccagtac atagtgtggg caa

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 152

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia relacionada con ER-11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 152

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttgccagtac taagtgtggg caa

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 153

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia relacionada con ER-11

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 153

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctgccagtag atactgtggg caa

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 154

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia relacionada con ER-11

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 154

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttgccagtag ttaggtgtgg gcga

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 155

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia relacionada con ER-11

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 155

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttgccagtag ttagtgtggg caa

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 156

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia relacionada con ER-11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 156

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttgccagtac ctactaaggg caa

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 157

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia relacionada con ER-11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 157

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttgccagtag ttagtgtggg cag

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 158

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia relacionada con ER-11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 158

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctgccagtag taagtgtggg cag

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 159

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ER-11 consensus sequence

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> INSEGURO

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 7-17

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n = cualquiera de los cuatro nucleótidos

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 159

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttgccannnn nnnnnnnggg caa

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 160

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 642

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 160

\vskip1.000000\baselineskip

155

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 161

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 687

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 161

\vskip1.000000\baselineskip

157

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 162

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 720

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 162

\vskip1.000000\baselineskip

158

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 163

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1734

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 163

\vskip1.000000\baselineskip

159

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 164

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1188

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 164

\vskip1.000000\baselineskip

160

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 669

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 165

\vskip1.000000\baselineskip

161

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 930

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 166

\vskip1.000000\baselineskip

162

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 167

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 825

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 167

\vskip1.000000\baselineskip

163

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 168

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 3171

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 168

\vskip1.000000\baselineskip

164

165

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 169

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 774

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 169

\vskip1.000000\baselineskip

166

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 170

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 945

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 170

\vskip1.000000\baselineskip

167

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 171

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2286

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 171

\vskip1.000000\baselineskip

168

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<210> 172

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 633

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 172

\vskip1.000000\baselineskip

169

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 173

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 654

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 173

\vskip1.000000\baselineskip

170

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 174

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 657

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 174

\vskip1.000000\baselineskip

171

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 175

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 558

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 175

\vskip1.000000\baselineskip

172

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 176

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1719

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 176

\vskip1.000000\baselineskip

173

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 177

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 878

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 177

\vskip1.000000\baselineskip

174

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 178

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Motivo de homología del interferon gamma de THAP1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 178

\vskip1.000000\baselineskip

175

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 179

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de localización nuclear de THAP1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 179

\vskip1.000000\baselineskip

176

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 180

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia consenso para el dominio de unión PAR4 DE THAP

\vskip0.400000\baselineskip

<221> INSEGURO

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 3-16, 19, 23, 24, 25-35

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = cualquiera de los veinte aminoácidos

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = Arg o Lys

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 180

\vskip1.000000\baselineskip

177

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 181

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 181

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaattcggcc attatggcct gcaggatccg gccgcctcgg cccaggatcc

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 182

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 111

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 182

\vskip1.000000\baselineskip

178

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 183

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 183

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgggatccg tagtgatgga ggggctcagg actgttg

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 184

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 184

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgggatccc tatggccctt taggggtctg tgacc

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 185

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 185

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccgaattcag gatggtgcag tcctgctccg cct

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 186

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 186

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgcggatcct gctggtactt caactatttc aaagtagtc

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 187

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

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<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 187

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccgaattcag gatggtgcag tcctgctccg cct

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 188

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 188

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgcggatcct gctggtactt caactatttc aaagtagtc

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 189

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 189

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcggaattca tggcgaccgg tggctaccgg acc

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 190

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 190

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgggatccc tctacctggt cagctgaccc acaac

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 191

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 191

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccgaattcag gatggtgcag tcctgctccg cct

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 192

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 192

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgcggatcct gctggtactt caactatttc aaagtagtc

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 193

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 193

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgcgaattcg ccatcatggg gttccctaga tataacaggg atgcaa

\hfill

46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 194

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 194

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gccggatccg ggttccctag atataacagg gatgcaa

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 195

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 195

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgctctaga gccatcatgg aggagcagaa gctgatc

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 196

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 196

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cttgcggccg cctctacctg gtcagctgac ccacaac

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 197

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 197

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcggaattca aagaagatct tctggagcca caggaac

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 198

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 198

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgcggatcct gctggtactt caactatttc aaagtagtc

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 199

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 199

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcggaattca tgccgcctct tcagacccct gttaa

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 200

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 200

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcggaattca tgcaccagcg gaaaaggatt catcag

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 201

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 201

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccgaattcag gatggtgcag tcctgctccg cct

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 202

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 202

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgggatccc ttgtcatgtg gctcagtaca aagaaatat

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 203

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 203

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgggatcctg tgcggtcttg agcttctttc tgag

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 204

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 204

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgggatccg tcgtctttct ctttctggaa gtgaac

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 205

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia consenso para el dominio de unión PAR4 de THAP

\vskip0.400000\baselineskip

<221> INSEGURO

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 3-14, 17, 21, 23-33, 35

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = cualquiera de los veinte aminoácidos

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 205

179

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 206

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 206

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccgcacagca gcgatgcgct gctcaagaac ggcagcttg

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 207

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 207

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

caagctgccg ttcttgagca gcgcatcgct gctgtgcgg

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 208

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 208

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gctcaagacc gcacagcaag aacggcagct tg

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 209

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 209

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

caagctgccg ttcttgctgt gcggtcttga gc

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 210

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 210

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgggatccc taaattagaa aggggtgggg gtagcc

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 211

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 211

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcggaattca tggagcctgc acccgcccga tc

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 212

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 212

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcggaattca aagaagatct tctggagcca caggaac

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 213

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 213

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgcggatcct gctggtactt caactatttc aaagtagtc

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 214

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 214

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgcggatccg tgcagtcctg ctccgcctac ggc

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 215

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 215

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccgaattctt atgctggtac ttcaactatt tcaaagtag

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 216

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 216

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gccgaattca tgccgaactt ctgcgctgcc ccc

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 217

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 217

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgcggatcct taggttattt tccacagttt cggaattatc

\hfill

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 218

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 218

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgctgcagc aagctaaatt taaatgaagg tactcttgg

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 219

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 219

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgagatctg ggaaatgccg accaattgcg ctgcg

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 220

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 220

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agaggatcct tagctctgct gctctggccc aagtc

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 221

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 221

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agagaattca tgccgaagtc gtgcgcggcc cg

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 222

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 222

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcggaattca tgccgcgtca ctgctccgcc gc

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 223

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 223

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgggatcct caggccatgc tgctgctcag ctgc

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 224

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 224

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgagatctc gatggtgaaa tgctgctccg ccattgga

\hfill

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 225

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 225

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgggatcct catgaaatat agtcctgttc tatgctctc

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 226

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 226

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgagatctc gatgcccaag tactgcaggg cgccg

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 227

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 227

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcggaattct tatgcactgg ggatccgagt gtccagg

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 228

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 228

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcggaattca tgccggcccg ttgtgtggcc gc

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 229

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 229

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgggatcct taacatgttt cttctttcac ctgtacagc

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 230

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 230

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgagatctc gatgcctggc tttacgtgct gcgtgc

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 231

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 231

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcggaattct cacattccgt gcttcttgcg gatgac

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 232

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 232

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccgaattcag gatggtgcag tcctgctccg cct

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 233

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 233

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgcggatcct gctggtactt caactatttc aaagtagtc

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 234

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 234

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgctctaga gccatcatgg aggagcagaa gctgatc

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 235

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 235

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgctctaga ttatgctggt acttcaacta tttcaaagta g

\hfill

41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 236

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 236

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgcggatccg tgcagtcctg ctccgcctac ggc

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 237

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 237

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgcggatcct gctggtactt caactatttc aaagtagtc

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 238

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 238

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gccggatccg ggttccctag atataacagg gatgcaa

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 239

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 239

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgggatccc tctacctggt cagctgaccc acaac

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 240

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 240

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgggatcca gtgatggagg ggctcaggac tgttg

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 241

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 241

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgggatccc tatggccctt taggggtctg tgacc

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 242

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 242

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgcatatgg tgcagtcctg ctccgcctac ggc

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 243

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 243

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgctcgagt ttcttgtcat gtggctcagt acaaag

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 244

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 62

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido

\vskip0.400000\baselineskip

<221> INSEGURO

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 21-45

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n = cualquiera de los cuatro nucleótidos

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 244

180

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 245

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 245

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

accgcaagct tgggcactat ttatatcaac

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 246

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 246

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggtctagagg gccaccaacg catt

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 247

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2173

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 247

\vskip1.000000\baselineskip

181

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 248

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1302

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 248

182

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 249

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1995

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 249

183

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 250

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1999

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 250

\vskip1.000000\baselineskip

184

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 251

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1398

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 251

\vskip1.000000\baselineskip

185

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 252

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2291

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 252

\vskip1.000000\baselineskip

186

187

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 253

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1242

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 253

188

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 254

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1383

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 254

\vskip1.000000\baselineskip

189

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 255

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 3627

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 255

190

1901

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 256

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 771

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 256

\vskip1.000000\baselineskip

191

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 257

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 942

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 257

\vskip1.000000\baselineskip

192

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 258

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2283

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 258

\vskip1.000000\baselineskip

193

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 259

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 986

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 259

194

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 260

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1515

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 260

195

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 261

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1120

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 261

196

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 262

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 558

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 262

197

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 263

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia consenso para el dominio de unión PAR4 de THAP

\vskip0.400000\baselineskip

<221> INSEGURO

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 3-15, 18, 22, 24-34, 36

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = cualquiera de los veinte aminoácidos

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 263

198

Claims

1. Un método para identificar un compuesto de ensayo que modula las actividades mediadas por THAP ("THanatos-Associated Protein", proteína asociada a la muerte), que comprende:

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2. El método de la reivindicación 1, en el que dicha actividad mediada por THAP se selecciona del grupo que consiste en la interacción con una proteína diana de la familia THAP, la unión a un ácido nucleico, la unión a PAR-4 (respuesta a la apoptosis-4 de próstata), la unión a SLC (quimioquina linfoide secundaria), la unión a PML (proteína de la leucemia promielocítica), la unión a un polipéptido que se encuentra en PML-NB (cuerpos nucleares de proteína de la leucemia promielocítica), la localización hacia PML-NB, el transporte dirigido de una proteína diana de la familia THAP hacia PML-NB, y la inducción de la apoptosis.

3. El método de la reivindicación 2, en el que dicha actividad mediada por THAP es la unión a PAR-4.

4. El método de la reivindicación 2, en el que dicha actividad mediada por THAP es la unión a SLC.

5. El método de la reivindicación 2, en el que dicha actividad mediada por THAP es la inducción de la apoptosis.

6. El método de la reivindicación 2, en el que dicho ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:140-159.

7. El método de la reivindicación 1, en el que dicha coincidencia de aminoácidos se determina utilizando un algoritmo seleccionado del grupo que consiste en XBLAST (X-Basic Local Alignment Search Tool) con los parámetros puntuación = 50 y longitud de palabra = 3, BLAST con huecos (Basic Local Alignment Search Tool) con los parámetros por defecto de XBLAST, y BLAST con los parámetros por defecto de XBLAST.

9. El polipéptido de dominio THAP de la reivindicación 8, en el que dicha coincidencia de aminoácidos se determina utilizando un algoritmo seleccionado del grupo que consiste en XBLAST con los parámetros puntuación = 50 y longitud de palabra = 3, BLAST con huecos con los parámetros por defecto de XBLAST, y BLAST con los parámetros por defecto de XBLAST.

10. El polipéptido de dominio THAP de la reivindicación 8, en el que dicho ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:140-159.

11. Un ácido nucleico que codifica el polipéptido de dominio THAP de la reivindicación 8, o su complemento.

12. Un polipéptido de dominio de unión a PAR4 seleccionado del grupo que consiste en los aminoácidos 143-192 de SEQ ID NO:3, u homólogos que tienen una coincidencia de aminoácidos de al menos 70% con éste, n el que dicho polipéptido de dominio de unión a PAR4 se une a PAR4.

13. El polipéptido de dominio de unión a PAR4 de la reivindicación 12, en el que dicha coincidencia de aminoácidos se determina utilizando un algoritmo seleccionado del grupo que consiste en XBLAST con los parámetros puntuación = 50 y longitud de palabra = 3, BLAST con huecos con los parámetros por defecto de XBLAST, y BLAST con los parámetros por defecto de XBLAST.

14. Un ácido nucleico que codifica el polipéptido de dominio de unión a PAR4 de la reivindicación 12, o su complemento.

\newpage

16. El polipéptido de dominio de unión a SCL de la reivindicación 15, en el que dicha coincidencia de aminoácidos se determina utilizando un algoritmo seleccionado del grupo que consiste en XBLAST con los parámetros puntuación = 50 y longitud de palabra = 3, BLAST con huecos con los parámetros por defecto de XBLAST, y BLAST con los parámetros por defecto de XBLAST.

17. Un ácido nucleico que codifica el polipéptido de dominio de unión a SLC de la reivindicación 15, o su complemento.

22. El polipéptido de dominio de dimerización de THAP de la reivindicación 21, en el que dicha coincidencia de aminoácidos se determina utilizando un algoritmo seleccionado del grupo que consiste en XBLAST con los parámetros puntuación = 50 y longitud de palabra = 3, BLAST con huecos con los parámetros por defecto de XBLAST, y BLAST con los parámetros por defecto de XBLAST.

23. Un ácido nucleico que codifica el polipéptido de dominio de dimerización de THAP de la reivindicación 21, o su complemento.

24. Un vector de expresión que comprende un promotor unido operablemente a un ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 11, 14, 17 ó 23.

25. El vector de expresión de la reivindicación 24, en el que dicho promotor es un promotor que no está unido operablemente a dicho ácido nucleico en un genoma natural.

26. Una célula hospedante que comprende el vector de expresión de una cualquiera de las reivindicaciones 24 ó 25.

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proporcionar un polipéptido diana de la familia THAP o su fragmento; y determinar si un compuesto de ensayo modula selectivamente la capacidad de dicho polipéptido de la familia THAP para unirse a dicho polipéptido diana de la familia THAP, en el que una determinación de que dicho compuesto de ensayo modula selectivamente la capacidad de dicho polipéptido de la familia THAP para unirse a dicho polipéptido diana de la familia THAP indica que dicho compuesto es un modulador candidato de la actividad de la familia THAP.

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31. El método de la reivindicación 30, en el que dicho polipéptido de la familia THAP se proporciona por un primer vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido de la familia THAP de SEQ ID NO:3, o un fragmento que comprende un tramo contiguo de al menos 6 aminoácidos contiguos de un polipéptido según SEQ ID NO:3, y en el que dicho polipéptido diana de la familia THAP se proporciona por un segundo vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido diana de la familia THAP o su
fragmento.

32. El método de la reivindicación 30, en el que dicha actividad de la familia THAP es una actividad de apoptosis.

33. El método de la reivindicación 30, en el que dicha proteína diana de la familia THAP es PAR-4.

34. El método de la reivindicación 30, en el que dicho polipéptido de la familia THAP es una proteína THAP-1, THAP-2 o THAP-3, y dicha proteína diana de la familia THAP es PAR-4.

35. El método de la reivindicación 30, en el que dicha proteína diana de la familia THAP es SLC.

37. El método de la reivindicación 36, en el que dicha proteína de la familia THAP comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3 o su fragmento biológicamente activo.

38. El método de la reivindicación 36, en el que la modulación de la actividad de una proteína de la familia THAP comprende modular la interacción de una proteína de la familia THAP y una proteína diana de la familia THAP.

39. El método de la reivindicación 36, en el que la modulación de la actividad de una proteína de la familia THAP comprende modular la interacción de una proteína de la familia THAP y una proteína PAR4.

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44. El uso de la reivindicación 43, en el que dicho polipéptido comprende una proteína de fusión que comprende una región Fc de una inmunoglobulina condensada con un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 143-213 de SEQ ID NO:3.

45. El uso de la reivindicación 43, en el que dicho polipéptido comprende una proteína THAP oligomérica que comprende una pluralidad de polipéptidos que comprenden cada uno una secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 143-213 de SEQ ID NO:3.

47. El uso de la reivindicación 46, en el que dicha proteína de la familia THAP comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3 o su fragmento biológicamente activo.

48. El uso de la reivindicación 46, en el que dicha modulación es la inhibición.

49. El uso de la reivindicación 46, en el que dicha modulación es la inducción.

51. El uso de la reivindicación 50, en el que dicha proteína de la familia THAP comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3 o su fragmento biológicamente activo.

54. El uso de la reivindicación 53, en el que dicha proteína de la familia THAP comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3 o su fragmento biológicamente activo.

56. El uso de la reivindicación 55, en el que dicha proteína de la familia THAP comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3 o su fragmento biológicamente activo.

57. El uso de la reivindicación 55, en el que el aumento de la actividad de dicha proteína de la familia THAP que comprende una secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 143-213 de SEQ ID NO:3, o un homólogo que tienen una coincidencia de aminoácidos de al menos 70% con éste, induce la apoptosis, inhibe la división celular, inhibe el potencial metastásico, reduce la carga tumoral, aumenta la sensibilidad a quimioterapia o radioterapia, mata una célula de cáncer, inhibe el crecimiento de un célula de cáncer, mata una célula endotelial, inhibe el crecimiento de una célula endotelial, inhibe la angiogénesis, o induce la regresión tumoral.