ES2333000T3

ES2333000T3 - Manganexo superoxido dismutasa humana modificada y sus usos.

Info

Publication number: ES2333000T3
Application number: ES03706586T
Authority: ES
Inventors: Aldo Mancini
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2002-02-28
Filing date: 2003-02-27
Publication date: 2010-02-16
Anticipated expiration: 2023-02-27
Also published as: AU2003208771A1; WO2003072768A8; DK1481056T3; CY1109524T1; PT1481056E; SI1481056T1; ITMI20020404A1; ATE441703T1; WO2003072768A3; AU2003208771A8; WO2003072768A2; EP1481056A2; ITMI20020404A0; EP1481056B1; DE60329084D1

Abstract

Un procedimiento para la preparación de una manganeso dismutasa humana segregada (hMnSOD), que comprende las siguientes etapas: i) crecimiento de células LSA (número de depósito DSMZ 2029) en medio exento de proteínas durante al menos 24 horas y la recolección del medio acondicionado; ii) purificación de la manganeso superóxido dismutasa a partir del medio acondicionado por cromatografía de inmunoafinidad con un anticuerpo anti-hMnSOD.

Description

Manganeso superóxido dismutasa humana modificada y sus usos.

Estado de la técnica

Los radicales superóxido, especies de oxígeno muy reactivas, se generan en células aeróbicas como productos de desecho del metabolismo oxidativo y, si se acumulan en cantidades excesivas, pueden provocar daños irreversibles en las estructuras esenciales para la función celular. En condiciones fisiológicas, las células están protegidas de estos compuestos por un grupo de metaloproteínas, la superóxido dismutasa, que cataliza la dismutación de radicales superóxido a peróxido de hidrógeno, que se convierte en oxígeno molecular mediante la acción de la catalasa. Los diversos tipos de superóxido dismutasa difieren entre sí en la porción metálica y/o proteica. En células eucariotas, se han identificado la superóxido dismutasa de cobre/cinc (SOD Cu/Zn), localizada principalmente en el citoplasma, y la superóxido dismutasa extracelular (ECSOD) y la manganeso superóxido dismutasa (MnSOD), con localización principalmente mitocondrial. Las superóxido dismutasas son enzimas de notable interés farmacológico por su potencial papel en la prevención y reparación de todas las patologías que implican un daño oxidativo. Como ejemplo, se ha propuesto que estas enzimas pueden ser útiles en la prevención de tumores, en la prevención de daños que derivan de la reperfusión de tejidos isquémicos, en el tratamiento de estados inflamatorios, en la prevención y tratamiento de daños que derivan de radiaciones UV, y en la reducción de efectos citotóxicos y cardiotóxicos de terapias anti-
tumorales.

Por ejemplo, Zhong W. y col. en Oncogene, 1997, 14: 481-490 describe que la sobreexpresión de MnSOD reduce el fenotipo maligno en una línea celular de glioma humano (U118) y Wispe J.R. y col. en Biochimica et Biophysica Acta, 1989, 30-36 describe la expresión recombinante de ADNc de MnSOD y la purificación de MnSOD a partir de hígado de conejo.

La manganeso superóxido dismutasa es de interés terapéutico particular por su localización en la mitocondria, conocida por representar la fuente endógena principal de radicales superóxido. La secuencia completa del ADNc de la manganeso superóxido dismutasa fue identificada en los 80 y se encuentra en SwissProt con el número de acceso P04179 (Beck y col., Nucleic Acid Res. 16(13) 6224, 1988) y en el GenBank con el número de acceso NM_00636. La proteína codificada por el ADNc ha sido identificada, entre otros, por Wispè y col. Biochim. Biophyis. Acta, 1989, 994: 30-36.

Posteriormente se han descrito numerosas variantes alélicas de esta enzima y han sido revisadas con el número de acceso en el GenBank.

Después de la identificación de los genes, debido a su potencial interés terapéutico, se han establecido diversos procedimientos para obtener la manganeso superóxido dismutasa humana por medio de técnicas recombinantes, como por ejemplo, aquéllas descritas en la patente EP0284105 o en la patente de EE.UU. 5246847.

En la solicitud de patente WO/18147, enviada por el solicitante, se ha descrito una nueva línea celular derivada de liposarcoma humano, denominada LSA, que produce una proteína capaz de inhibir selectivamente la división celular de células tumorales epiteliales sensibles a estrógenos. Además, se ha descrito una nueva proteína, denominada p1LSA, con una secuencia de aminoácidos homóloga a la de la proteína (de choque térmico) Hsp27.

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Resumen de la invención

Los autores de la presente invención sorprendentemente han encontrado que se puede purificar una proteína con actividad citotóxica contra células tumorales a partir del medio acondicionado por células LSA. La proteína purificada es reconocida por anticuerpos anti-manganeso superóxido dismutasa humana (hMnSOD), pero a diferencia de la hMnSOD de tipo silvestre, se segrega en lugar de estar principalmente localizada en la mitocondria. Adicionalmente, dicha proteína está caracterizada por un peso molecular diferente de la proteína de tipo silvestre y que abarca entre
28-33 kDa en SDS-PAGE.

Además, el autor de la presente invención ha encontrado que la nueva hMnSOD obtenida a partir del medio de cultivo celular, no sólo es capaz de una actividad citotóxica selectiva y específica contra células tumorales, sino que también estimula la curación de lesiones cutáneas provocadas por agresiones químicas, físicas o biológicas.

La presente invención se refiere a un procedimiento simple y barato para purificar la hMnSOD anteriormente mencionada a partir del medio acondicionado procedente de células LSA mediante etapas secuenciales de cromatografía en columna.

Además, la presente invención se refiere a compuestos farmacéuticos que contienen la hMnSOD modificada de la invención para la prevención y terapia de tumores, para la curación de úlceras y lesiones cutáneas o para la prevención y tratamiento de lesiones por radiación ionizante.

Descripción de las figuras

La Figura 1 representa una SDS-PAGE (carriles 1 y 2) y una transferencia de Western (carriles 3 a 6) llevadas a cabo en condiciones reductoras y colocadas juntas. Para teñir las proteínas se usó Gold-Comassie después de la SDS-PAGE. Carril 1: marcadores de pesos moleculares, carril 2: medio de cultivo celular acondicionado concentrado a 100x en tampón fosfato a pH 7,4 (tampón fosfato salino). Para la transferencia de Western, se usó para la detección un anticuerpo de oveja anti-hMnSOD (Calbiochem) (carriles 3, 4, 5 y 6). Carriles 3 y 4: preparación de la MnSOD humana modificada según la invención (carril 3) o después del tratamiento con un anticuerpo anti-hMnSOD y Proteína-G-Sepharose (carril 4), carril 6: paso a través de la segunda columna de Q-Sepharose, carril 7: paso a través de la columna Sephacryl-75.

La Figura 2 SDS-PAGE de mhMnSOD purificada cromatográficamente por FPLC. El sobrenadante acondicionado del LSA se concentró 10X y se cargó en SDS-PAGE (carril 2); Carril 1: marcadores de pesos moleculares con unos pesos moleculares que corresponden, de arriba abajo a: 97, 31,5, 21,5, 16,5 kDa. Carril 3 y 4: mhMnSOD tal y como eluye después de la primera etapa cromatográfica (Q-Sepharose); carril 5 y 6: mhMnSOD tal y como eluye después de la etapa de filtración en gel (S-75); carril 7 y 8: mhMnSOD tal y como eluye después de la segunda etapa cromatográfica (Q-Sepharose); carril 9: transferencia de Western con un anticuerpo de oveja anti-hMnSOD realizada después de la cromatografía.

La Figura 3 Caracterización biológica de las fracciones cromatográficas. Se muestran células MCF7 después de 24 horas de incubación en presencia de: (A) paso a través de la segunda columna de Q-Sepharose (B) una muestra procedente de las fracciones que contienen la hMnSOD modificada eluida de la segunda columna de Q-Sepharose (C) una muestra de las fracciones eluida de la segunda columna de Q-Sepharose y que no contiene la hMnSOD.

La Figura 4 Efecto antitumoral in vivo de la mhMnSOD. Se muestra la diferencia en el crecimiento de tumor de mama en un ratón BalbC-F-C3H sin tratar (panel A superior) o tratado con la hMnSOD modificada de la invención (panel B inferior). En particular, no se produjo un incremento de la masa tumoral entre 1 y 4 cm de diámetro (panel A) cuando un tumor del mismo diámetro inicial se trató durante 15 días con la hMnSOD modificada de la invención (panel B): la masa del tumor no pareció aumentar y el tejido tumoral era completamente necrótico.

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Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a la preparación de una manganeso superóxido dismutasa humana modificada que se segrega.

En el presente documento "superóxido dismutasa" designa una enzima capaz de catalizar la reacción de dismutación de radicales superóxido a peróxido de hidrógeno y oxígeno muscular.

En el presente documento "manganeso superóxido dismutasa humana" designa una metaloproteína capaz de formar complejos con manganeso, compuesta de una o más cadenas polipeptídicas, en la que el monómero tiene la secuencia de aminoácidos depositada en el GenBank con el número de acceso P04179 (Beck y col., Nucleic Acid Res. 16(13) 6224, 1988) y en el GenBank con el número de acceso NM_00636. El ADNc que codifica la proteína ha sido identificado, entre otros, por Wispè y col. Biochim. Biophyis. Acta, 1989, 994: 30-36. La forma madura de esta MnSOD humana, en lo sucesivo denominada hMnSOD o hMnSOD "tipo silvestre" tiene un peso molecular de 24 kDa aproximadamente.

La "manganeso superóxido dismutasa humana modificada", en lo sucesivo denominada mhMnSOD, designa una manganeso superóxido dismutasa humana que contiene modificaciones estructurales que le permiten ser secretada, a diferencia de la forma natural correspondiente y presenta un amplio abanico de actividades descritas con detalle en la siguiente solicitud. La mhMnSOD preferentemente es oligomérica y el monómero está caracterizado por un peso molecular que abarca entre 28 y 33 kDa, preferentemente de 30 kDa aproximadamente en una SDS-PAGE.

En el presente documento, la "forma natural" o de tipo silvestre de la hMnSOD designa una hMnSOD que presenta la compartimentación subcelular típica de la forma silvestre, es decir, localizada en la mitocondria y denominada en el presente documento hMnSOD.

Además, como se muestra en la Figura 2 y 3, la mhMnSOD de la invención es reconocida por anticuerpos policlonales contra la hMnSOD "tipo silvestre" humana. La propiedad particular de la mhMnSOD de la invención de ser secretada en medio de cultivo hace posible obtener grandes cantidades mediante procedimientos de purificación simples, rápidos y baratos. En particular, la mhMnSOD de la invención se obtiene cultivando células LSA hasta subconfluencia en medio exento de suero que carece de otras proteínas durante al menos 24 horas, preferentemente durante al menos una semana, o incluso más preferentemente durante al menos 30 días, recogiendo el medio acondicionado, preferentemente a diario y sustituyéndolo con medio de cultivo fresco, seguido de una etapa de purificación en la que la hMnSOD se separa del medio acondicionado mediante técnicas cromatográficas basadas en intercambio iónico o inmunoafinidad.

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Preferentemente, la purificación de la mhMnSOD comprende las siguientes etapas:

a): Concentración del medio de cultivo celular en tampón que tiene un pH que abarca entre 6 y 9 unidades;

b): aplicación del medio de cultivo celular concentrado a una columna cromatográfica de intercambio iónico que tiene como fase estacionaria un grupo de intercambio aniónico fuerte y la elución con un gradiente salino lineal en tampón con un pH entre 6 y 9;

c): recolección e identificación de las fracciones que contienen la manganeso superóxido dismutasa humana modificada;

d): reunión de las fracciones recogidas y su aplicación a una columna cromatográfica de filtración en gel con una fase estacionaria que separa en el intervalo de 20.000 a 40.000 Da, seguido de la elución con un tampón que tiene un intervalo de pH entre 6 y 9;

e): recolección e identificación de las fracciones que contienen la manganeso superóxido dismutasa humana modificada;

f): opcionalmente, la purificación adicional de la mhMnSOD reuniendo las fracciones recogidas y su aplicación a una columna cromatográfica de inmunoafinidad con un anticuerpo anti-hMnSOD unido a la fase estacionaria, seguido de la elución con una disolución salina capaz de romper la interacción entre la fase estacionaria con el anticuerpo y la mhMnSOD unida en un tampón con un pH entre 6 y 9 y la posterior identificación de la actividad MnSOD;

g): recolección e identificación de las fracciones que contienen la manganeso superóxido dismutasa humana modificada.

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Según un procedimiento de purificación alternativo, la etapa f) se puede sustituir por una etapa f') en la que las fracciones que contienen la hMnSOD se aplican a una columna cromatográfica de intercambio iónico con una fase de intercambio aniónico fuerte como fase estacionaria, y se eluye con un gradiente salino discontinuo en un tampón que tiene un pH entre 6 y 9.

En otro procedimiento alternativo, la hMnSOD de la invención se puede obtener directamente a partir del medio acondicionado por LSA o a partir de las fracciones activas eluidas procedentes de la primera columna cromatográfica por cromatografía de inmunoafinidad con anticuerpos anti-hMnSOD. En el primer caso, el medio acondicionado se puede aplicar directamente a la columna cromatográfica sin la etapa de concentración. Además, el procedimiento de la invención puede incluir, después de la purificación, una etapa de desalación y concentración por medio de técnicas conocidas en la materia, como por ejemplo, diafiltración, diálisis y ultrafiltración. Preferentemente, la diálisis de lleva a cabo frente a una disolución isotónica que tiene un pH de 7,5, preferentemente PBS.

La línea celular LSA está depositada en el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) con el número de acceso 2029. Preferentemente, en la etapa a) el medio acondicionado se concentra entre 10 y 100 veces usando técnicas muy conocidas por aquellos expertos en la materia, por ejemplo, ultrafiltración.

La fase estacionaria de las columnas cromatográficas de intercambio iónico usadas en las etapas b) y f') preferentemente es una matriz que tiene como grupo funcional un grupo amino cuaternario que es un intercambiador aniónico. Particularmente preferida en dichas columnas es la fase estacionaria representada por la matriz comercial denominada Q-Sepharose (Pharmacia). En la etapa d), la columna cromatográfica de filtración en gel contiene una fase estacionaria, preferentemente con un rango de separación entre 3 x 10^{3} y 7 x 10^{4} Da, particularmente la matriz comercial denominada Superdex 75 (Pharmacia).

En la etapa f), la columna de inmunoafinidad contiene como fase estacionaria una matriz capaz de conjugarse con un anticuerpo, preferentemente Proteína-G-Sepharose o Sepharose preactivada con CnBr, por ejemplo, CNBr-activated 4 Sepharose Fast Flow (Amersham Parmacia Biotech).

Preferentemente, un anticuerpo policlonal está unido a la fase estacionaria, por ejemplo, el anticuerpo de oveja anti-hMnSOD producido en Calbiochem u otros anticuerpos anti-MnSOD conocidos.

Antes de aplicar la muestra, todas las columnas cromatográficas usadas se pre-equilibran con un tampón que tiene las mismas características del tampón de muestra o del tampón que se usará para la elución.

Después de la aplicación de la muestra, las columnas se tratan para eliminar las interacciones no específicas, por ejemplo, lavándolas con varios volúmenes de tampón de carga, como es sabido en la materia.

Preferentemente, en las etapas a), b), d), f) y f) del procedimiento de la invención, los tampones usados tienen un pH comprendido entre 7,4 y 8.

La elución procedente de la primera columna cromatográfica de intercambio iónico, en la etapa b), preferentemente se realiza usando como eluyente un gradiente lineal de cloruro sódico entre 0,1 y 1 M. La elución de la segunda columna cromatográfica de intercambio iónico en la etapa f) preferentemente se lleva a cabo mediante un gradiente discontinuo.

Un gradiente discontinuo particularmente preferido es aquel obtenido a partir de los siguientes tampones de elución: A: TRIS 10 mM pH = 8 + EDTA 1 mM y B: Tampón A + NaCl 1 M.

Preferentemente, la elución se lleva a cabo en los primeros 100 minutos con un gradiente del 0 al 60% de tampón A y en los siguientes 20 minutos con un gradiente del 40 al 100% de tampón B.

La elución de la columna de inmunoafinidad alternativa preferentemente se lleva a cabo usando una disolución de cloruro sódico 0,5 M.

En las etapas c), e) y g), la identificación de las fracciones que contienen la hMnSOD se puede llevar a cabo usando ensayos inmunológicos, conocidos por aquellos expertos en la materia, que requieren de un anticuerpo anti-hMnSOD, como por ejemplo transferencia de Western, mientras que un ejemplo de ensayo enzimático es el método de Winterbourn (Beyer W.F. y col. Phosphate inhibition of the Copper and Zinc containing Super-Oxide Dismutase: A re-examination Biochemistry, 1986, Vol. 25. Páginas 6084-6088) basado en la propiedad de la superóxido dismutasa de inhibir la reducción de la sal "Nitro-blue de tetrazolio". Alternativamente, la presencia de mhMnSOD en las fracciones eluidas de las columnas cromatográficas se puede detectar mediante ensayos biológicos, tales como aquellos que evalúan la actividad citotóxica de las fracciones sobre líneas celulares tumorales como la línea celular MCF-7 de adenocarcinoma de mama humano, células tumorales primarias o células tumorales humanas procedentes de melanoma, carcinoma gástrico, carcinoma pancreático, carcinoma ovárico, mesotelioma pleúrico, en los que la actividad indica la presencia de hMnSOD.

Como se describirá con más detalle en los ejemplos siguientes, la hMnSOD modificada de la invención presenta una actividad farmacológica de interés particular. Por tanto, una forma de realización adicional de la presente invención se refiere al uso farmacéutico de la hMnSOD, que comprende la preparación a partir del sobrenadante de células LSA según el procedimiento de la invención, para su uso como medicamento. Esa mhMnSOD es reconocida por anticuerpos anti-hMnSOD.

En particular, la mhMnSOD muestra una actividad citotóxica selectiva in vitro contra líneas celulares tumorales y es capaz de inducir muy rápidamente la necrosis in vivo de masas tumorales, como se ha demostrado en un modelo de ratón. Siendo su acción específica sólo contra células tumorales, se asume que carece completamente de toxicidad y que sus potenciales efectos adversos son menores que aquellos inducidos por las terapias antitumorales conocidas.

El autor también ha encontrado que la mhMnSOD sorprendentemente es capaz, como resultado de su aplicación tópica, de inducir la curación de lesiones cutáneas tales como úlceras por decúbito, úlceras tórpidas, quemaduras cutáneas provocadas por agentes químicos (ácidos o bases) o físicos (calor, radiación ionizante). Por tanto, en una forma de realización adicional la invención proporciona el uso de una mhMnSOD preparada según la invención para proteger a animales y humanos de la radiación, preferentemente de la radiación ionizante.

En particular se ha encontrado que la aplicación de un ungüento que contiene el 10% en p/p de hMnSOD de la invención, tres veces al día, da como resultado la curación casi completa de este tipo de lesiones en menos de 30 días. Además, dicho ungüento ha demostrado ser particularmente adecuado para uso cosmético, siendo extremadamente eficaz en la reducción de arrugas cutáneas, la reducción y neutralización de la inflamación cutánea, en la reconstitución apropiada de la tonicidad cutánea y subcutánea, en la restauración de la firmeza de la piel, en la prevención de posibles lesiones cutáneas, como por ejemplo, sabañones.

La presente invención por tanto se refiere al uso de la hMnSOD modificada de la invención para la preparación de un medicamento para la curación de lesiones cutáneas tales como úlceras por decúbito, úlceras tórpidas y quemaduras.

Además, la hMnSOD de la invención ha demostrado ser eficaz en el tratamiento de individuos expuestos a radiaciones ionizantes y en la preservación de órganos para transplante. Por tanto, la invención también se refiere al uso de dicha mhMnSOD para preparar un medicamento para el tratamiento de las patologías anteriormente mencionadas. La invención se explicará con más detalle por medio de los siguientes ejemplos, a los cuales, naturalmente, no está limitada.

Ejemplo 1

Aislamiento de manganeso superóxido dismutasa humana modificada a partir del medio de cultivo acondicionado por células LSA

1a) Se crecieron células LSA en medio de Ham, que contiene F12, el 5% de suero fetal bovino (FCS), hasta una confluencia del 80%. Después de lavar con PBS, las células se incubaron en medio F12, sin FCS u otros mitógenos, durante 30 días aproximadamente, durante los cuales las células continuaron proliferando con un tiempo de duplicación de 90 horas (el tiempo de duplicación es de 48 horas en presencia de suero). A partir del quinto día de la privación de suero, se recogió cada día el medio acondicionado, que contiene proteínas segregadas por las células LSA, y se reemplazó con medio fresco.

Cinco litros del medio acondicionado se concentraron en PBS a pH 7,4 hasta un volumen de 500 ml por ultrafiltración a través de filtros Amicon con un tamaño límite de 3000 Da. El medio concentrado obtenido por este procedimiento se analizó mediante SDS-PAGE desnaturalizante. Después de la tinción en gel con Gold-Comassie se pueden observar numerosas bandas de proteínas, como se muestra en la Figura 1, carril 2.

El medio concentrado se aplicó a una columna de intercambio iónico que tiene como fase estacionaria Q-Sepharose y una longitud de 1 cm y 2 cm de diámetro, pre-equilibrada en TRIS 100 mM pH 7,5.

A continuación se llevó a cabo la elución con un gradiente de cloruro sódico 0,1-1 M en tampón TRIS 100 mM a pH 7,5 a una velocidad de flujo de 1 ml por minuto.

Se recogieron fracciones de 1 ml y se sometieron a ensayo para la actividad citotóxica de células MCF-7 procedentes de adenocarcinoma de mama como se describe en el Ejemplo 2.

Las fracciones positivas, entre la 31 y la 35, se reunieron, se aplicaron a una columna cromatográfica de filtración en gel Superdex-75 (Pharmacia) de 2 cm de diámetro y 5 cm de longitud y se eluyeron con tampón PBS (tampón fosfato salino).

Se recogieron fracciones de 1 ml y se sometieron a ensayo para la actividad citotóxica usando el ensayo anterior. Las fracciones positivas número 11, 12, y 13, se reunieron y se analizó una muestra que contiene 30 \mug de proteínas por SDS-PAGE en condiciones reductoras. Con la tinción Gold-Comassie se observó una banda heterogénea con un tamaño en torno a los 30 kDa. Se llevó a cabo una cromatografía de intercambio aniónico más en Q-Sepharose. Las fracciones biológicamente activas se sometieron adicionalmente a análisis de transferencia con un anticuerpo anti-hMnSOD que reaccionó con la proteína purificada identificando el producto como una hMnSOD modificada con un peso molecular superior al de la MnSOD conocida (véase Figura 2 y Figura 3).

La secuencia C-terminal de la proteína separada del gel se analizó por espectroscopia de masas y por degradación de Edman identificando la siguiente secuencia: AIWNVINWENVTER.

La búsqueda de homología en el banco de datos NCBI se llevó a cabo usando el software ProFound. La secuencia identificada corresponde a la hMnSOD (número de acceso en el GenBank P04179) entre el aminoácido 203 y el aminoácido 216.

Para separar la hMnSOD identificada de otras proteínas, se llevó a cabo una cromatografía de inmunoafinidad usando Proteína-G-Sepharose unida a un anticuerpo de oveja anti-hMnSOD (Calbiochem) como fase estacionaria, usando una columna cromatográfica de 1 cm de diámetro y 2 cm de longitud. Después de cargar las fracciones biológicamente activas, la columna se lavó con tampón Tris para eliminar las interacciones no específicas, y se eluyó con cloruro sódico 0,5 M en tampón Tris a pH 7,5. Se recogieron fracciones de 1 ml y se analizaron para la actividad citotóxica. Las fracciones activas se reunieron y se analizó una muestra que contiene 30 \mug de proteína aproximadamente por SDS-PAGE, como anteriormente. Se encontró una única banda de 30 kDa.

1b) Se ha establecido un procedimiento alternativo al descrito en el Ejemplo 1a, en el que se obtuvo la purificación de la mhMnSOD a partir de las fracciones activas de la filtración en gel por cromatografía de intercambio iónico en gradiente discontinuo (gradiente escalonado).

En detalle, las fracciones activas eluidas procedentes de la columna de filtración en gel se aplicaron a una columna cromatográfica de intercambio iónico que tienen las mismas características que la columna pre-equilibrada en Tris
10 mM a pH 8 usada en el Ejemplo 1a.

Se prepararon las siguientes disoluciones tampón:

\quad: A = Tris 10 mM a pH 8 + EDTA 1 mM

\quad: B = Tampón A + NaCl 1 M

La elución se llevó a cabo en los primeros 100 minutos con un gradiente lineal del 0% al 60% de Tampón A y el 100% al 40% de Tampón B. Durante los siguientes 20 minutos la elución se llevó a cabo con un gradiente lineal del 40% al 100% de Tampón B y del 60% al 0% de tampón A.

Se recogieron fracciones de 1 ml y se analizaron para la actividad citotóxica.

Las fracciones activas 13, 14 y 15 se reunieron.

En la Figura 3 y en la Figura 3 se muestran la SDS-PAGE y la transferencia de Western de la mhMnSOD purificada, de 30 kDa aproximadamente.

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Ejemplo 2

Evaluación de la actividad de la hMnSOD modificada sobre líneas de células tumorales

Se reunieron las fracciones que contienen la mhMnSOD eluida de la columna de intercambio iónico, como se describe en el Ejemplo 1b, y se analizaron para su actividad citotóxica en células MCF-7 de adenocarcinoma de mama humano, líneas de células tumorales derivadas de otros órganos tales como pulmón, páncreas, estómago, mesotelio pleúrico y melanoma, y sobre líneas de células no tumorales tales como células de epitelio humano MCF-10, fibroblastos (POF) y queratinocitos (Ha-Cat).

En cada pocillo, se usaron 50 \mul de las fracciones reunidas que contienen la hMnSOD en un volumen de 250 \mul, correspondientes a una concentración final de hMnSOD entre 10 y 50 \mug/ml.

Como control se usaron el paso a través de una segunda columna cromatográfica de intercambio iónico, y una muestra de fracciones eluidas que carecen de manganeso superóxido dismutasa.

La Figura 3 muestra los resultados obtenidos en células MCF-7, que no presenta ningún efecto en células tratadas con el paso a través de la segunda columna de intercambio iónico (panel A), o con fracciones que no contienen manganeso superóxido dismutasa eluida de la misma columna (panel C); las fracciones reunidas blancas que contienen manganeso superóxido dismutasa ejercían citotoxicidad sobre las células MCF-7 (panel B). Como control adicional de que el efecto citotóxico era debido a la mhMnSOD, se mezclaron 100 \mul de la disolución de superóxido dismutasa con 30 \mul de un anticuerpo de oveja anti-hMnSOD (Calbiochem). A continuación se añadieron a la mezcla 50 \mul de resina Proteína-G-Sepharose pre-equilibrada en PBS a pH 7,5 y se incubó durante tres horas a temperatura ambiente en un agitador rotatorio de manera continua. A continuación el sobrenadante se recuperó por centrifugación. Se analizó una muestra del sobrenadante por transferencia de Western, usando para la detección anticuerpo de oveja anti-hMnSOD (Calbiochem). Como se ilustra en la Figura 1, carril 3, el sobrenadante estaba completamente agotado de mhMnSOD. El sobrenadante no era tóxico para las células MCF-7, que indica que la molécula tóxica biológicamente activa es, de hecho, la hMnSOD modificada.

Ejemplo 3

Evaluación de la actividad antitumoral de la hMnSOD modificada in vivo

La actividad antitumoral de la hMnSOD mostrada en el Ejemplo 2 se estimó en ratones Balb-c-fC-3H que presentan carcinomas mamarios inducidos con el virus de Bittner. En detalle, a los ratones se les inyectó subcutáneamente durante 10 días en la región peritumoral con 200 \mul de disolución estéril que contiene 25 ng/ml de hMnSOD o, como control, con 200 \mul de disolución fisiológica. Después de 15 días todos los ratones se sacrificaron por dislocación cervical y se examinaron por necroscopia. Al final del experimento, los tumores mamarios aparecieron completamente necróticos en todos los ratones tratados (véase Figura 4, panel B) y no había metástasis presente en el pulmón. En vez de eso, en los ratones no tratados, las masas tumorales habían crecido hasta cuatro veces el tamaño inicial (véase Figura 4, panel B) y se encontraron grandes focos metastáticos en los pulmones.

También se realizó durante el tratamiento un análisis por ultrasonidos a todos los animales para controlar las variaciones de densidad de las masas tumorales.

Los resultados de este examen demuestran que las masas tumorales experimentaron licuefacción en los animales tratados, a diferencia de los animales no tratados, en los que permanecieron sólidos y sin necrosis.

Ejemplo 4

Identificación in vitro de actividad citotóxica sinérgica entre la hMnSOD modificada y el cisplatino

Se realizaron curvas de crecimiento en células MCF-7 para comparar la actividad citotóxica de la hMnSO a la del cisplatino. En detalle, se trataron células MCF-7 con cisplatino (25 \muM) o hMnSOD (25 ng/ml), o con una mezcla de cisplatino (25 \muM) y hMnSOD (25 ng/ml).

Las células tratadas con cisplatino solo o con hMnSOD sola murieron a los 5-6 días. Sin embargo, las células tratadas tanto con cisplatino como con hMnSOD murieron en sólo 24 horas. De manera notable, en el último experimento, o cuando las dos moléculas se usaron de manera individual, no se originaron clones resistentes. Los resultados obtenidos indican la presencia de una actividad citotóxica sinérgica entre las dos moléculas.

Ejemplo 5

Composición para preparaciones tópicas

Se diluyeron 10 mg de hMnSOD purificada a partir de medio de cultivo acondicionado con células LSA y se mezclaron, con agitación, con 1 kg de vaselina hidrófila. A continuación una crema preparada mediante este procedimiento se dividió en alícuotas de 100 g y se almacenaron en recipientes adecuados. Esta crema es estable a temperatura ambiente y activa durante seis meses.

Claims

1. Un procedimiento para la preparación de una manganeso dismutasa humana segregada (hMnSOD), que comprende las siguientes etapas:

i): crecimiento de células LSA (número de depósito DSMZ 2029) en medio exento de proteínas durante al menos 24 horas y la recolección del medio acondicionado;

ii): purificación de la manganeso superóxido dismutasa a partir del medio acondicionado por cromatografía de inmunoafinidad con un anticuerpo anti-hMnSOD.

2. Un procedimiento según la reivindicación 1 en el que dicha etapa ii) comprende las siguientes operaciones:

a): concentración opcional del medio acondicionado con células LSA en un tampón con un pH entre 6 y 9;

b): aplicación del medio acondicionado concentrado a una columna cromatográfica de intercambio iónico que tiene como fase estacionaria un grupo de intercambio aniónico fuerte y la elución con un gradiente salino lineal en tampón con un pH entre 6 y 9;

c): identificación y recolección de las fracciones que contienen la manganeso superóxido dismutasa humana modificada;

d): reunión de las fracciones recogidas y su carga en una columna cromatográfica de filtración en gel con una fase estacionaria que tiene un intervalo de separación de 20.000 a 40.000 Da, y la elución con un tampón que tiene un pH entre 6 y 9;

e): identificación y recolección de las fracciones que contienen la manganeso superóxido dismutasa humana modificada;

f): carga de las fracciones sobre una columna cromatográfica de inmunoafinidad con un anticuerpo anti-hMnSOD unido a la fase estacionaria y la elución de la hMnSOD segregada con una disolución salina capaz de romper la interacción entre el anticuerpo sobre la fase estacionaria y la hMnSOD unida en un tampón con un pH entre 6 y 9.

3. Un procedimiento según la reivindicación 2 que comprende adicionalmente la desalación y concentración.

4. Un procedimiento según las reivindicaciones 2 y 3, en el que en la etapa a) el medio se concentra de 10 a
100 veces.

5. Un procedimiento según las reivindicaciones 2-4, en el que en la etapa b) dicho intercambiador aniónico sobre la fase estacionaria tiene un grupo amino cuaternario como grupo funcional.

6. Un procedimiento según la reivindicación 5, en el que dicha fase estacionaria es Q-Sepharose.

7. Un procedimiento según las reivindicaciones 2 a 6 en el que en la etapa b) dicho gradiente salino lineal es un gradiente lineal de cloruro sódico entre 0,1 M y 1 M.

8. Un procedimiento según las reivindicaciones 2-7, en el que en la etapa d) la fase estacionaria tiene un intervalo de separación entre 3 x 10^{3} y 7 x 10^{4} Da.

9. Un procedimiento según la reivindicación 8, en el que dicha fase estacionaria es Superdex 75.

10. Un procedimiento según las reivindicaciones 2-9, en el que en la etapa f) la fase estacionaria es Proteína-G-Sepharose o Sepharose preactivada con CnBr.

11. Un procedimiento según las reivindicaciones 2 a 14, en el que en la etapa f) el anticuerpo unido a la fase estacionaria es un anticuerpo policlonal.

12. Un procedimiento según la reivindicación 11, en el que en la etapa g) la elución se lleva a cabo con NaCl
0,5 M.

13. Un procedimiento según las reivindicaciones 2 a 12, en el que en las etapas a), b), d) y g) dicho tampón tiene un pH comprendido entre 7,4 y 8.

14. Un procedimiento según las reivindicaciones 2 a 13, en el que en las etapas c), y e) la identificación de las fracciones que contienen la manganeso superóxido dismutasa humana se lleva a cabo mediante ensayos inmunológicos, biológicos o enzimáticos.

15. Un procedimiento según la reivindicación 14, en el que dicho ensayo inmunológico se lleva a cabo mediante transferencia de Western.

16. El procedimiento según la reivindicación 15, en el que dicha prueba biológica consiste en la puesta a prueba de las fracciones obtenidas para la actividad citotóxica sobre células tumorales, en la que dicha actividad indica la presencia de una superóxido dismutasa humana.

17. El procedimiento según la reivindicación 16, en el que dicha línea celular es la línea celular MCF-7 de adenocarcinoma.

18. Un procedimiento según la reivindicación 14, en el que dicho ensayo enzimático consiste en la puesta a prueba de las fracciones obtenidas por su capacidad para inhibir la reducción de la sal de Nitro-blue de tetrazolio.

19. Un procedimiento para la preparación de un medicamento para la curación de lesiones cutáneas que comprende la preparación de una manganeso dismutasa humana segregada (hMnSOD) según las reivindicaciones 1-18.

20. Un procedimiento según la reivindicación 19, en el que dichas lesiones cutáneas son úlceras por decúbito, úlceras tórpidas y quemaduras.